ES2930537T3 - Regulación de la transcripción guiada por ARN - Google Patents

Regulación de la transcripción guiada por ARN Download PDF

Info

Publication number
ES2930537T3
ES2930537T3 ES19197844T ES19197844T ES2930537T3 ES 2930537 T3 ES2930537 T3 ES 2930537T3 ES 19197844 T ES19197844 T ES 19197844T ES 19197844 T ES19197844 T ES 19197844T ES 2930537 T3 ES2930537 T3 ES 2930537T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
dna
cell
target nucleic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19197844T
Other languages
English (en)
Inventor
George M Church
Prashant G Mali
Kevin M Esvelt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harvard College
Original Assignee
Harvard College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College filed Critical Harvard College
Application granted granted Critical
Publication of ES2930537T3 publication Critical patent/ES2930537T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Se proporcionan métodos para modular la expresión de un ácido nucleico diana en una célula, incluida la introducción en la célula de un primer ácido nucleico extraño que codifica uno o más ARN complementarios al ADN, donde el ADN incluye el ácido nucleico diana, la introducción en la célula de un segundo ácido nucleico extraño ácido que codifica una proteína Cas9 sin nucleasa que se une al ADN y es guiada por uno o más ARN, introduciendo en la célula un tercer ácido nucleico extraño que codifica una proteína o dominio regulador de la transcripción, en el que uno o más ARN, la nucleasa- se expresan la proteína Cas9 nula y la proteína o dominio regulador de la transcripción, en donde uno o más ARN,la proteína Cas9 sin nucleasa y la proteína o el dominio regulador de la transcripción co-localizan en el ADN y donde la proteína o el dominio regulador de la transcripción regula la expresión del ácido nucleico diana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Regulación de la transcripción guiada por ARN
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los sistemas CRISPR-Cas de bacterias y arqueas se basan en ARN guía cortos en complejos con proteínas Cas para dirigir la degradación de secuencias complementarias presentes en el ácido nucleico extraño invasor. Véase Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-ARNcr ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011); y Bhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011). Una reconstitución in vitro reciente del sistema CRISPR de tipo II de S. pyogenes demostró que ARNcr (“ARN CRISPR”) fusionado con un ARNtracr normalmente codificado en trans (“ARN CRISPR transactivante”) es suficiente para dirigir la proteína Cas9 a escindir, de forma específica de secuencia, secuencias de ADN diana que coincidan con el ARNcr. La expresión de un ARNg homólogo a un sitio diana da como resultado el reclutamiento y la degradación de Cas9 del ADN diana. Véase H. Deveau et al., Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (febrero de 2008).
Mali et al. (Science, “Supplementary Materials for RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9", 339, 1-36, 2013) dan a conocer la utilización de ARN guía para dirigirse a Cas9 en células humanas.
CARACTERÍSTICAS
Se proporciona una invención según las reivindicaciones adjuntas.
Según un aspecto, se proporciona un procedimiento in vitro o ex vivo de alteración de un ácido nucleico diana de ADN de doble cadena en una célula que incluye introducir en la célula un primer ácido nucleico extraño que codifica dos o más ARN guía, teniendo cada ADN guía una secuencia de espaciador, una secuencia pareja (“mate”) de tracr y una secuencia tracr, e hibridándose una porción de la secuencia tracr a la secuencia pareja de tracr y uniéndose la secuencia pareja de tracr mediante una secuencia de ácido nucleico enlazador y siendo cada secuencia de espaciador complementaria a un sitio adyacente en el ácido nucleico diana de ADN, introducir en la célula un segundo ácido nucleico extraño que codifica, como mínimo, una proteína nickasa Cas9 que tiene un dominio de nucleasa inactivo y que está guiada por los dos o más ARN guía, en el que los dos o más ARN guía y la, como mínimo, una proteínas nickasa Cas9 se expresan y en el que la, como mínimo, una proteína nickasa Cas9 se colocaliza con dos de los dos o más ARN al ácido nucleico diana de ADN y mella el ácido nucleico diana de ADN dando como resultado dos mellas adyacentes, en el que las dos mellas adyacentes están en diferentes cadenas del ADN de doble cadena y crean una ruptura de doble cadena.
Según un aspecto, la célula es una célula eucariota. Según un aspecto, la célula es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal. Según un aspecto, la célula es una célula de mamífero.
Según un aspecto, el ARN tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 nucleótidos. Según un aspecto, el ARN tiene entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 nucleótidos.
Según un aspecto, los ARN guía son fusiones ARNtracr-ARNcr. Según un aspecto los ARN guía incluyen una secuencia de espaciador y una secuencia pareja de tracr. Los ARN guía también pueden incluir una secuencia tracr, una porción de la cual se hibrida a la secuencia pareja de tracr. Los ARN guía también pueden incluir una secuencia de ácido nucleico enlazador que una la secuencia pareja de tracr y la secuencia tracr para producir la fusión ARNtracr-ARNcr. La secuencia de espaciador se une al ADN diana, tal como mediante hibridación.
Según un aspecto, los ARN guía incluyen una secuencia de espaciador truncada. Según un aspecto, el ARN guía incluye una secuencia de espaciador truncada que tiene un truncamiento de 1 base en el extremo 5' de la secuencia de espaciador. Según un aspecto, el ARN guía incluye una secuencia de espaciador truncada que tiene un truncamiento de 2 bases en el extremo 5' de la secuencia de espaciador. Según un aspecto, el ARN guía incluye una secuencia de espaciador truncada que tiene un truncamiento de 3 bases en el extremo 5' de la secuencia de espaciador. Según un aspecto, el ARN guía incluye una secuencia de espaciador truncada que tiene un truncamiento de 4 bases en el extremo 5' de la secuencia de espaciador. Por consiguiente, la secuencia de espaciador puede tener un truncamiento de 1 a 4 bases en el extremo 5' de la secuencia de espaciador.
Según ciertas realizaciones, la secuencia de espaciador puede incluir entre aproximadamente 16 y aproximadamente 20 nucleótidos que se hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana. Según ciertas realizaciones, la secuencia de espaciador puede incluir aproximadamente 20 nucleótidos que se hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana.
Según ciertos aspectos, la secuencia de ácido nucleico enlazador puede incluir entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6 ácidos nucleicos.
Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 60 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 64 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 65 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 66 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 67 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 68 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 69 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 70 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 80 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 90 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 100 y aproximadamente 500 ácidos nucleicos.
Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 60 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 64 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 65 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 66 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 67 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 68 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 69 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 70 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 80 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 90 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos. Según ciertos aspectos, la secuencia tracr puede incluir entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200 ácidos nucleicos.
En la figura 5B se representa un ARN guía de ejemplo.
Según un aspecto, el ADN es ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno.
Según un aspecto, las dos mellas adyacentes en diferentes cadenas del ADN de doble cadena dan como resultado una unión de extremos no homólogos. Según un aspecto, las dos mellas adyacentes en diferentes cadenas del ADN de doble cadena están desplazadas entre sí. Según un aspecto, las dos mellas adyacentes en diferentes cadenas del ADN de doble cadena están desplazadas entre sí y dan como resultado una unión de extremos no homólogos. Según un aspecto, el procedimiento incluye, además, introducir en la célula un tercer ácido nucleico extraño que codifica una secuencia de ácido nucleico donante en el que las dos mellas dan como resultado una recombinación homóloga del ácido nucleico diana con la secuencia de ácido nucleico donante.
Según un aspecto, las dos o más mellas adyacentes están en cadenas diferentes del ADN de doble cadena y crean una ruptura de doble cadena que da como resultado la fragmentación del ácido nucleico diana impidiendo así la expresión del ácido nucleico diana.
Según un aspecto, se proporciona una célula que incluye un primer ácido nucleico extraño que codifica dos o más ARN guía, teniendo cada ARN guía una secuencia de espaciador, una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr, e hibridándose una parte de la secuencia tracr con la secuencia pareja de tracr y estando la secuencia pareja de tracr y la secuencia tracr unidas por una secuencia de ácido nucleico enlazador y siendo cada secuencia de espaciador complementaria a un sitio adyacente en un ácido nucleico diana de ADN de doble cadena, y un segundo ácido nucleico extraño que codifica, como mínimo, una proteína nickasa Cas9 que tiene un dominio de nucleasa inactivo, y en la que dos de los dos o más ARN guía y la, como mínimo, una proteína nickasa Cas9 son miembros de un complejo de colocalización para el ácido nucleico diana de ADN, en la que el complejo de colocalización puede mellar el ácido nucleico diana de ADN, lo que da como resultado dos mellas adyacentes en cadenas diferentes del ADN de doble cadena y crear una ruptura de doble cadena.
Según un aspecto, la célula es una célula eucariota. Según un aspecto, la célula es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal. Según un aspecto, la célula es una célula de mamífero.
Según un aspecto, el ARN incluye entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 nucleótidos. Según un aspecto, el a Rn incluye entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 nucleótidos.
Según un aspecto, el ácido nucleico diana está asociado con una enfermedad o trastorno perjudicial.
Según un aspecto, los dos o más ARN son ARN guía. Según un aspecto, los dos o más ARN son fusiones ARNtracr-ARNcr.
Según un aspecto, el ácido nucleico diana de ADN es un ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno.
Características y ventajas adicionales de ciertas realizaciones de la presente invención se harán más evidentes en la siguiente descripción de las realizaciones y dibujos de las mismas, y a partir de las reivindicaciones.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
El expediente de patente o solicitud contiene dibujos ejecutados en color. La Oficina proporcionará copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con los dibujos en color previa solicitud y pago de la tasa correspondiente. Las anteriores y otras características y ventajas de las presentes realizaciones se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción detallada de realizaciones ilustrativas tomadas junto con los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1A y la figura 1B son esquemas de la activación de la transcripción guiada por ARN. La figura 1C es un diseño de una construcción de indicador (“reporter”). La figura 1D muestra datos que demuestran que las fusiones Cas9N-VP64 muestran activación de la transcripción guiada por ARN según el ensayo mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, fluorescence-activated cell sorting) y ensayos de inmunofluorescencia (IF). La figura IF muestra datos del ensayo mediante FACS e IF que demuestran la activación de la transcripción específica de la secuencia de ARNg a partir de construcciones de indicadores en presencia de Cas9N, MS2-VP64 y ARNg que contienen los sitios de unión de aptámero MS2 adecuados. La figura 1F representa datos que demuestran la inducción de la transcripción por ARNg individuales y ARNg múltiples.
La figura 2A representa una metodología para evaluar el escenario de la dirección a diana de complejos Cas9-ARNg y TALE. La figura 2B representa datos que demuestran que un complejo Cas9-ARNg es, en promedio, tolerante a 1-3 mutaciones en sus secuencias diana. La figura 2C representa datos que demuestran que el complejo Cas9-ARNg es en gran medida insensible a las mutaciones puntuales, excepto aquellas localizadas en la secuencia PAM. La figura 2D representa datos del gráfico de calor que demuestran que la introducción de 2 apareamientos incorrectos (“mismatches”) de base perjudica significativamente la actividad del complejo Cas9-ARNg. La figura 2E representa los datos que demuestran que un TALE de 18 unidades monoméricas es, en promedio, tolerante a 1-2 mutaciones en su secuencia diana. La figura 2F representa datos que demuestran que el TALE de 18 unidades monoméricas es, similar a los complejos Cas9-ARNg, en gran medida insensible al apareamiento incorrecto de base simple en su diana. La figura 2G representa datos del gráfico de calor que demuestran que la introducción de 2 apareamientos incorrectos de bases perjudica significativamente la actividad de TALE de 18 unidades monoméricas. La figura 3A representa un esquema de un diseño de ARN guía. La figura 3B representa datos que muestran la tasa porcentual de unión de extremos no homólogos para mellas desplazadas que conducen a salientes en 5' y mellas desplazadas que conducen a salientes en 3'. La figura 3C representa datos que muestran la tasa porcentual de dirección a diana para mellas desplazadas que conducen a salientes en 5' y mellas desplazadas que conducen a salientes en 3'.
La figura 4A es un esquema de un residuo de coordinación de metal en RuvC PDB ID: 4EP4 (azul) posición D7 (izquierda), un esquema de dominios de endonucleasa HNH de PDB ID: 3M7K (naranja) y 4H9D (cian) que incluye un ion Mg coordinado (esfera gris) y ADN de 3M7K (púrpura) (centro) y una lista de mutantes analizados (derecha). La figura 4B representa datos que muestran actividad nucleasa indetectable para los mutantes de Cas9 m3 y m4, y también sus respectivas fusiones con VP64.
La figura 4C es un estudio a mayor resolución de los datos de la figura 4B.
La figura 5A es un esquema de un ensayo de recombinación homóloga para determinar la actividad de Cas9-ARNg. La figura 5B representa los ARN guía con inserciones de secuencias aleatorias y la tasa porcentual de recombinación homóloga.
La figura 6A es un esquema de los ARN guía para el gen OCT4. La figura 6B representa la activación de la transcripción de una construcción de indicador de promotor-luciferasa. La figura 6C representa la activación de la transcripción a través de qPCR de genes endógenos.
La figura 7A es un esquema de los ARN guía para el gen REX1. La figura 7B representa la activación de la transcripción de una construcción de indicador de promotor-luciferasa. La figura 7C representa la activación de la transcripción a través de qPCR de genes endógenos.
La figura 8A representa en forma esquemática un flujo de procesamiento de análisis de especificidad de alto nivel para el cálculo de los niveles de expresión normalizados. La figura 8B representa datos de distribuciones de porcentajes de sitios de unión por números de apareamientos incorrectos generados dentro de una biblioteca de construcciones sesgadas. Izquierda: Distribución teórica. Derecha: Distribución observada de una biblioteca de construcciones TALE real. La figura 8C representa datos de distribuciones de porcentajes de recuentos de etiquetas agregados a sitios de unión por números de apareamientos incorrectos. Izquierda: Distribución observada de la muestra de control positivo. Derecha: Distribución observada de una muestra en la que se indujo un TALE no de control.
La figura 9A representa datos para el análisis del escenario de dirección a diana de un complejo Cas9-ARNg que muestra tolerancia a 1-3 mutaciones en su secuencia diana. La figura 9B representa datos para el análisis del escenario de dirección a diana de un complejo Cas9-ARNg que muestra insensibilidad a mutaciones puntuales, excepto aquellas localizadas en la secuencia PAM. La figura 9C representa datos del gráfico de calor para el análisis del escenario de dirección a diana de un complejo Cas9-ARNg que muestra que la introducción de apareamientos incorrectos de 2 bases perjudica significativamente la actividad. La figura 9D representa datos de un ensayo de HR mediado por nucleasa que confirma que el PAM previsto para Cas9 de S. pyogenes es NGG y también Na G.
La figura 10A representa datos de un ensayo de HR mediado por nucleasa que confirma que los TALE de 18 unidades monoméricas toleran múltiples mutaciones en sus secuencias diana. La figura 10B representa los datos del análisis del escenario de dirección a diana de TALE de 3 tamaños diferentes (18 unidades monoméricas, 14 unidades monoméricas y 10 unidades monoméricas). La figura 10C representa datos para TALE de 10 unidades monoméricas que muestran una resolución de apareamientos incorrectos de base simple cercanos. La figura 10D representa datos del gráfico de calor para TALE de 10 unidades monoméricas que muestran una resolución de apareamientos incorrectos de base simple cercanos.
La figura 11A representa ARN guía diseñados. La figura 11B representa la tasa porcentual de unión de extremos no homólogos para diversos ARN guía.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se describe la utilización de proteínas de unión a ADN para colocalizar proteínas o dominios reguladores de la transcripción al ADN de una manera para regular un ácido nucleico diana. Tales proteínas de unión a ADN son fácilmente conocidas por los expertos en la materia para unirse al ADN para diversos fines. Dichas proteínas de unión a ADN pueden ser de origen natural. Las proteínas de unión a ADN incluidas incluyen aquellas que pueden ser guiadas por ARN, denominado en el presente documento ARN guía. El ARN guía y la proteína de unión a ADN guiada por ARN forman un complejo de colocalización en el ADN. La proteína de unión a ADN puede ser una proteína de unión a ADN sin nucleasa. La proteína de unión a ADN sin nucleasa puede resultar de la alteración o modificación de una proteína de unión a ADN que tiene actividad de nucleasa. Tales proteínas de unión a ADN que tienen actividad de nucleasa son conocidas por los expertos en la materia e incluyen proteínas de unión a ADN de origen natural que tienen actividad de nucleasa, tales como las proteínas Cas9 presentes, por ejemplo, en sistemas CRISPR de tipo II. Estas proteínas Cas9 y los sistemas CRISPR de tipo II están bien documentados en la técnica. Véase Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, vol. 9, junio de 2011, págs. 467-477 incluyendo toda la información complementaria.
Proteínas de unión a ADN de ejemplo que tienen actividad de nucleasa funcionan para mellar o cortar ADN de doble cadena. Tal actividad de nucleasa puede resultar de la proteína de unión a ADN que tiene una o más secuencias polipeptídicas que presentan actividad de nucleasa. Dichas proteínas de unión a ADN de ejemplo pueden tener dos dominios de nucleasa separados con cada dominio responsable de cortar o mellar una cadena particular del ADN de doble cadena. Las secuencias polipeptídicas de ejemplo que tienen actividad de nucleasa conocidas por los expertos en la materia incluyen el dominio relacionado con la nucleasa McrA-HNH y el dominio de nucleasa similar a RuvC. Por consiguiente, proteínas de unión a ADN de ejemplo son aquellas que en la naturaleza contienen uno o más del dominio relacionado con la nucleasa McrA-HNH y el dominio de nucleasa similar a RuvC. Según ciertos aspectos, la proteína de unión a ADN se altera o se modifica de otro modo para inactivar la actividad de nucleasa. Tal alteración o modificación incluye alterar uno o más aminoácidos para inactivar la actividad de nucleasa o el dominio de nucleasa. Dicha modificación incluye eliminar la secuencia polipeptídica o las secuencias polipeptídicas que muestran actividad nucleasa, es decir, el dominio de nucleasa, de manera que la secuencia polipeptídica o las secuencias polipeptídicas que muestran actividad de nucleasa, es decir, el dominio de nucleasa, están ausentes de la proteína de unión a ADN. Otras modificaciones para inactivar la actividad de nucleasa serán fácilmente evidentes para un experto en la materia basándose en la presente divulgación. Por consiguiente, una proteína de unión a ADN sin nucleasa incluye secuencias polipeptídicas modificadas para inactivar la actividad de nucleasa o la eliminación de una secuencia o secuencias polipeptídicas para inactivar la actividad de nucleasa. La proteína de unión a ADN sin nucleasa conserva la capacidad de unirse al ADN aunque la actividad de nucleasa se haya inactivado. Por consiguiente, la proteína de unión a ADN incluye la secuencia o secuencias polipeptídicas requeridas para la unión al ADN, pero puede carecer de una o más o todas las secuencias de nucleasa que presentan actividad de nucleasa. Por consiguiente, la proteína de unión a ADN incluye la secuencia o secuencias polipeptídicas requeridas para la unión al ADN, pero puede tener inactivadas una o más o todas las secuencias de nucleasa que presentan actividad de nucleasa.
Según un aspecto, una proteína de unión a ADN que tiene dos o más dominios de nucleasa se puede modificar o alterar para inactivar todos menos uno de los dominios de nucleasa. Una proteína de unión a ADN modificada o alterada de este tipo se denomina proteína nickasa de unión a ADN, en la medida en que la proteína de unión a ADN corta o mella sólo una cadena de ADN de doble cadena. Cuando está guiada por ARN a ADN, la proteína nickasa de unión a ADN se denomina proteína nickasa de unión a ADN guiada por ARN.
Una proteína de unión a ADN de ejemplo es una proteína de unión a ADN guiada por ARN de un sistema CRISPR de tipo II que carece de actividad de nucleasa. Una proteína de unión a ADN de ejemplo es una proteína Cas9 sin nucleasa. Una proteína de unión a ADN de ejemplo es una proteína nickasa Cas9.
En S. pyogenes, Cas9 genera una ruptura de doble cadena de extremos romos 3 pb cadena arriba del motivo adyacente al protoespaciador (PAM, protospacer-adjacent motif) a través de un proceso mediado por dos dominios catalíticos en la proteína: un dominio HNH que escinde la cadena complementaria del ADN y un dominio similar a RuvC que escinde la cadena no complementaria. Véase Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012). Se sabe que las proteínas Cas9 existen en muchos sistemas CRISPR de tipo II, incluidos los siguientes, tal como se identifica en la información complementaria de Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, vol. 9, junio de 2011, págs. 467-477: Methanococcus maripaludis C7; Corynebacterium diphtheriae; Corynebacterium efficiens YS-314; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Kitasato; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Bielefeld; Corynebacterium glutamicum R; Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385; Mycobacterium abscessus ATCC 19977; Nocardia farcinica IFM10152; Rhodococcus erythropolis PR4; Rhodococcus jostii RHA1; Rhodococcus opacus B4 uid36573; Acidothermus cellulolyticus 11B; Arthrobacter chlorophenolicus A6; Kribbella flavida Ds M 17836 uid43465; Thermomonospora curvata DSM 43183; Bifidobacterium dentium Bd1; Bifidobacterium longum DJO10A; Slackia heliotrinireducens DSM 20476; Persephonella marina EX H1; Bacteroides fragilis NCTC 9434; Capnocytophaga ochracea DSM 7271; Flavobacterium psychrophilum JIP02 86; Akkermansia muciniphila ATCC BAA 835; Roseiflexus castenholzii DSM 13941; Roseiflexus RS1; Synechocystis PCC6803; Elusimicrobium minutum Pei191; uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs D17; Fibrobacter succinogenes S85; Bacillus cereus ATCC 10987; Listeria innocua; Lactobacillus casei; Lactobacillus rhamnosus GG; Lactobacillus salivarius UCC118; Streptococcus agalactiae A909; Streptococcus agalactiae NEM316; Streptococcus agalactiae 2603; Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124; Streptococcus equi zooepidemicus MGCS10565; Streptococcus gallolyticus UCN34 uid46061; Streptococcus gordonii Challis subst CH1; Streptococcus mutans NN2025 uid46353; Streptococcus mutans; Streptococcus pyogenes M1 GAS; Streptococcus pyogenes MGAS5005; Streptococcus pyogenes MGAS2096; Streptococcus pyogenes MGAS9429; Streptococcus pyogenes MGAS10270; Streptococcus pyogenes MGAS6180; Streptococcus pyogenes MGAS315; Streptococcus pyogenes SSI-1; Streptococcus pyogenes MGAS10750; Streptococcus pyogenes NZ131; Streptococcus thermophiles CNRZ1066; Streptococcus thermophiles LMD-9; Streptococcus thermophiles LMG 18311; Clostridium botulinum A3 Loch Maree; Clostridium botulinum B Eklund 17B; Clostridium botulinum Ba4 657; Clostridium botulinum F Langeland; Clostridium cellulolyticum H10; Finegoldia magna ATCC 29328; Eubacterium rectale ATCC 33656; Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma mobile 163K; Mycoplasma penetrans; Mycoplasma synoviae 53; Streptobacillus moniliformis DSM 12112; Bradyrhizobium BTAi1; Nitrobacter hamburgensis X14; Rhodopseudomonas palustris BisB18; Rhodopseudomonas palustris BisB5; Parvibaculum lavamentivorans DS-1; Dinoroseobacter shibae DFL 12; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI; Azospirillum B510 uid46085; Rhodospirillum rubrum ATCC 11170; Diaphorobacter TPSY uid29975; Verminephrobacter eiseniae EF01-2; Neisseria meningitides 053442; Neisseria meningitides alpha14; Neisseria meningitides Z2491; Desulfovibrio salexigens DSM 2638; Campylobacter jejuni doylei 269 97; Campylobacter jejuni 81116; Campylobacter jejuni; Campylobacter lari RM2100; Helicobacter hepaticus; Wolinella succinogenes; Tolumonas auensis DSM 9187; Pseudoalteromonas atlantica T6c; Shewanella pealeana ATCC 700345; Legionella pneumophila Paris; Actinobacillus succinogenes 130Z; Pasteurella multocida; Francisella tularensis novicida U112 ; Francisella tularensis holarctica; Francisella tularensis FSC 198; Francisella tularensis tularensis; Francisella tularensis WY96-3418; and Treponema denticola ATCC 35405. Por consiguiente, los aspectos de la presente divulgación se refieren a una proteína Cas9 presente en un sistema CRISPR de tipo II, que se ha convertido en sin nucleasa o que se ha convertido en nickasa, tal como se describe en el presente documento.
La proteína Cas9 puede denominarse por un experto en la materia en la bibliografía Csn1. A continuación se muestra la secuencia de la proteína Cas9 de S. pyogenes que es objeto de los experimentos descritos en el presente documento. Véase Deltcheva et al., Nature 471,602-607 (2011).
MDKKYSIGLD1GTNSVGWAVJTDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLLGALLFDSGETAE ATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFG NF/DEY AYHEKYPTTYHLRKKLVD STDK ADLRLIYL A LAHM1K FRGFIFLIEGDLNP DN SD VDKLF1QLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRREENEIAQLPGEKKNGLFGN LIALSLGLTPNFRSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYA GYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQ1HLGELH AILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEE VVDKGASAQSFTERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFL SGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVE1SGVEDRFNASLGTYHDLLKI IKDKDF LDN EEN EDIEED1VETLTLFE DREMFEERLKTY AFLLFDDKV MKQEKRRRYTGWG RLSRKLINGIRDKQSGKTJLDFLKSDGFANRNFMQL1HDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSL HEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRER MKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDH IYPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNYPSEEYVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL TKAFRGGL.SELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQ1LDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKS KLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFYYGDYKVYDVR K MIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTETTLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDF ATVRKVLSMPQYNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTYA YSVLVVAKVEKGKSKKEKSVKELLG1TIMERSSFEKNPIDFEEAKGYKEVKKDE1IKLPK YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVN FLYLASHYEKLKGSPEDMEQKQLFVE QHKFTYLDEIIEQTSEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENTIFrLFTLTNLGA PAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQS1TGLYETRIDLSQLGGD-
La actividad de nucleasa de Cas9 se reduce, se reduce sustancialmente o se elimina alterando el dominio de nucleasa RuvC o el dominio de nucleasa HNH. El dominio de nucleasa RuvC puede estar inactivado. El dominio de nucleasa HNH puede estar inactivado. El dominio de nucleasa RuvC y el dominio de nucleasa HNH pueden estar inactivados. Se proporcionan proteínas Cas9 en las que el dominio de nucleasa RuvC y el dominio de nucleasa HNH están inactivados. Las proteínas Cas9 sin nucleasa se proporcionan en la medida en que el dominio de nucleasa RuvC y el dominio de nucleasa HNH están inactivados. Se proporciona una nickasa Cas9 en la que el dominio de nucleasa RuvC o bien el dominio de nucleasa HNH está inactivado, dejando así el dominio de nucleasa restante activo para la actividad de nucleasa. De esta manera, sólo se corta o mella una cadena del ADN de doble cadena. Se pueden proporcionar proteínas Cas9 sin nucleasa, en las que uno o más aminoácidos en Cas9 se alteran o eliminan de otro modo para proporcionar proteínas Cas9 sin nucleasa. Según un aspecto, los aminoácidos incluyen D10 y H840. Véase Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012). Los aminoácidos pueden incluir D839 y N863. Uno o más o todos de D10, H840, D839 y H863 pueden estar sustituidos con un aminoácido que reduce, elimina sustancialmente o elimina la actividad de nucleasa. Uno o más o todos de D10, H840, D839 y H863 pueden estar sustituidos con alanina. Una proteína Cas9 que tiene uno o más o todos de D10, H840, D839 y H863 sustituidos con un aminoácido que reduce, elimina sustancialmente o elimina la actividad de nucleasa, tal como alanina, se denomina Cas9 sin nucleasa. o Cas9N (“nuclease-null Cas9’) y presenta actividad de nucleasa reducida o eliminada, o la actividad de nucleasa está ausente o sustancialmente ausente dentro de los niveles de detección. La actividad de nucleasa para una Cas9N puede ser indetectable utilizando ensayos conocidos, es decir, por debajo del nivel de detección de ensayos conocidos.
La proteína Cas9 sin nucleasa puede incluir homólogos y ortólogos de la misma que conservan la capacidad de la proteína para unirse al ADN y ser guiada por el ARN. La proteína Cas9 sin nucleasa incluye la secuencia que se establece para Cas9 de origen natural de S. pyogenes y que tiene uno o más o todos de D10, H840, D839 y H863 sustituidos con alanina y secuencias de proteínas que tienen, como mínimo, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de homología con la misma y siendo una proteína de unión a ADN, tal como una proteína de unión a ADN guiada por ARN.
La proteína Cas9 sin nucleasa incluye la secuencia que se establece para Cas9 de origen natural de S. pyogenes excepto la secuencia de proteína del dominio de nucleasa RuvC y el dominio de nucleasa HNH y también secuencias de proteína que tienen, como mínimo, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de homología con la misma y siendo una proteína de unión a ADN, tal como una proteína de unión a ADN guiada por ARN. La proteína puede incluir la secuencia de proteína responsable de la unión al ADN, por ejemplo, para la colocalización con el ARN guía y la unión al ADN y las secuencias de proteína homólogas a la misma, y no es necesario que incluya las secuencias de proteína para el dominio de nucleasa RuvC y el dominio de nucleasa HNH (en la medida en que no sea necesario para la unión al ADN), ya que estos dominios se pueden inactivar o bien tener eliminada la secuencia de proteína de la proteína Cas9 de origen natural para producir una proteína Cas9 sin nucleasa.
Para los fines de la presente divulgación, la figura 4A representa residuos de coordinación de metales en estructuras proteicas conocidas con homología con Cas9. Los residuos se etiquetan basándose en su posición en la secuencia Cas9. Izquierda: estructura de RuvC, PDB ID: 4EP4 (azul), la posición D7, que corresponde a D10 en la secuencia Cas9, se resalta en una posición de coordinación de ion Mg. Medio: Estructuras de dominios de endonucleasa HNH de ID de PDB: 3M7K (naranja) y 4H9D (cian) que incluyen un ion Mg coordinado (esfera gris) y ADN de 3M7K (púrpura). Los residuos D92 y N113 en las posiciones D53 y N77 de 3M7K y 4H9D, que tienen homología de secuencia con los aminoácidos D839 y N863 de Cas9, se muestran como barras. Derecha: Lista de mutantes producidos y analizados para actividad de nucleasa: Cas9 de tipo salvaje; Cas9m1 que sustituye alanina por D10; Cas9m2 que sustituye alanina por D10 y alanina por H840; Cas9m3 que sustituye alanina por D10, alanina por H840 y alanina por D839; y Cas9m4 que sustituye alanina por D10, alanina por H840, alanina por D839 y alanina por N863. Tal como se muestra en la figura 4B, los mutantes de Cas9: m3 y m4, y también sus respectivas fusiones con VP64, mostraron una actividad de nucleasa indetectable tras la secuenciación profunda en los loci diana. Los gráficos muestran la frecuencia de mutación frente a la posición genómica, con las líneas rojas que delimitan la diana ARNg. La figura 4C es un examen de mayor resolución de los datos de la figura 4B y confirma que el escenario de mutaciones muestra un perfil comparable al de los loci no modificados.
Se describe un sistema Cas9-ARNg diseñado que permite la regulación del genoma guiada por ARN en células humanas mediante el anclaje de dominios de activación de la transcripción a un Cas9 sin nucleasa o bien a ARN guías. Una o más proteínas o dominios reguladores de la transcripción (dichos términos se utilizan indistintamente) se pueden unir o conectar de otro modo a un Cas9 deficiente en nucleasa o uno o más ARN guía (ARNg). Los dominios reguladores de la transcripción corresponden a loci diana. Por consiguiente, se describen procedimientos y materiales para localizar dominios reguladores de la transcripción en loci diana fusionando, conectando o uniendo dichos dominios a Cas9N o al ARNg.
Se describe una proteína de fusión Cas9N capaz de la activación de la transcripción. Un dominio de activación de VP64 (véase Zhang et al., Nature Biotechnology 29, 149-153 (2011)) se puede unir, fusionar, conectar o anclar de otro modo al extremo C de Cas9N. Se puede proporcionar el dominio regulador de la transcripción al sitio del ADN genómico diana mediante la proteína Cas9N. Se puede proporcionar una Cas9N fusionada con un dominio regulador de la transcripción dentro de una célula junto con uno o más ARN guía. La Cas9N con el dominio regulador de la transcripción fusionado al mismo se une al ADN genómico diana o cerca del mismo. El uno o más ARN guía se unen al ADN genómico diana o cerca del mismo. El dominio regulador de la transcripción regula la expresión del gen diana. Una fusión Cas9N-VP64 activó la transcripción de construcciones indicadoras cuando se combinó con secuencias de dirección a diana de ARNg cerca del promotor, mostrando así una activación de la transcripción guiada por ARN.
Se describe una proteína de fusión de ARNg capaz de la activación de la transcripción. Un dominio de activación VP64 se puede unir, fusionar, conectar o anclar de otro modo al ARNg. El ARNg puede proporcionar el dominio regulador de la transcripción al sitio del ADN genómico diana. Se puede proporcionar un ARNg fusionado con un dominio regulador de la transcripción dentro de una célula junto con una proteína Cas9N. La Cas9N se une al ADN genómico diana o cerca del mismo. El uno o más ARN guía con la proteína o dominio regulador de la transcripción fusionado a los mismos se unen al ADN genómico diana o cerca del mismo. El dominio regulador de la transcripción regula la expresión del gen diana. Una proteína Cas9N y un ARNg fusionados con un dominio regulador de la transcripción activaron la transcripción de construcciones indicadoras, mostrando así una activación de la transcripción guiada por ARN.
Los anclajes de ARNg capaces de la regulación de la transcripción se construyeron identificando qué regiones del ARNg tolerarán modificaciones mediante la inserción de secuencias aleatorias en el ARNg y analizando la función de Cas9. Los ARNg que portan inserciones de secuencias aleatorias en el extremo 5' de la porción de ARNcr o bien en el extremo 3' de la porción de ARNtracr de un ARNg quimérico conservan la funcionalidad, mientras que las inserciones en la porción de armazón de ARNtracr del ARNg quimérico dan como resultado la pérdida de función. Véase la figura 5A-B que resume la flexibilidad de ARNg para inserciones de bases aleatorias. La figura 5A es un esquema de un ensayo de recombinación homóloga (HR, homologous recombination) para determinar la actividad de Cas9-ARNg. Tal como se muestra en la figura 5B, los ARNg que tienen inserciones de secuencias aleatorias en el extremo 5' de la porción de ARNcr o bien en el extremo 3' de la porción de ARNtracr de un ARNg quimérico conservan la funcionalidad, mientras que las inserciones en la porción de armazón de ARNtracr del ARNg quimérico dan como resultado pérdida de función. Los puntos de inserción en la secuencia de ARNg están indicados por nucleótidos rojos. Sin desear limitarse a la teoría científica, el aumento de la actividad tras las inserciones de bases aleatorias en el extremo 5' puede deberse al aumento de la semivida del ARNg más largo.
Para unir VP64 al ARNg, se añadieron dos copias del bucle de tallo de ARN de unión a la proteína de la cubierta del bacteriófago MS2 al extremo 3' del ARNg. Véase Fusco et al., Current Biology. CB13, 161-167 (2003). Estos ARNg quiméricos se expresaron junto con Cas9N y la proteína de fusión MS2-VP64. Se observó activación de la transcripción específica de secuencia a partir de construcciones de indicadores en presencia de los 3 componentes.
La figura 1A es un esquema de la activación de la transcripción guiada por ARN. Tal como se muestra en la figura 1A, para generar una proteína de fusión Cas9N capaz de activar la transcripción, el dominio de activación VP64 se ancló directamente al extremo C de Cas9N. Tal como se muestra en la figura 1B, para generar fijaciones de ARNg capaces de activación de la transcripción, se añadieron dos copias del bucle de tallo de ARN de unión a la proteína de la cubierta del bacteriófago MS2 al extremo 3' del ARNg. Estos ARNg quiméricos se expresaron junto con la proteína de fusión Cas9N y MS2-VP64. La figura 1C muestra el diseño de construcciones de indicadores utilizadas para ensayar la activación de la transcripción. Los dos indicadores portan sitios diana de ARNg distintos y comparten un sitio diana TALE-TF de control. Tal como se muestra en la figura 1D, las fusiones Cas9N-VP64 muestran activación de la transcripción guiada por ARN según lo analizado mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y los ensayos de inmunofluorescencia (IF). Específicamente, mientras que el TALE-TF de control activó los dos indicadores, la fusión Cas9N-VP64 activa los indicadores de una manera específica de secuencia de ARNg. Tal como se muestra en la figura 1E, tanto en FACS como en IF se observó la activación de la transcripción específica de la secuencia de ARNg a partir de construcciones de indicadores solo en presencia de todos los 3 componentes: Cas9N, MS2-VP64 y ARNg que portan los sitios de unión al aptámero MS2 apropiados.
Se describen procedimientos para regular genes endógenos utilizando Cas9N, uno o más ARNg y una proteína o dominio regulador de la transcripción. Un gen endógeno puede ser cualquier gen deseado, denominado en el presente documento gen diana. Los genes diana para la regulación incluían ZFP42 (REX1) y POU5F1 (OCT4), que son genes estrictamente regulados implicados en el mantenimiento de la pluripotencia. Tal como se muestra en la figura 1F, se diseñaron, para el gen REX1, 10 ARNg dirigidos a un tramo de ~5 kb de ADN cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción (los sitios hipersensibles a la ADNasa están resaltados en verde). La activación de la transcripción se ensayó utilizando una construcción de indicador de promotor-luciferasa (véase Takahashi et al., Cell 131 861-872 (2007)) o directamente a través de qPCR (quantitative PCR) de los genes endógenos.
La figura 6A-C está dirigida a la regulación de OCT4 guiada por ARN utilizando Cas9N-VP64. Tal como se muestra en la figura 6A, se diseñaron, para el gen OCT4, 21 ARNg dirigidos a un tramo de ADN de ~5 kb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Los sitios hipersensibles a la ADNasa están resaltados en verde. La figura 6B muestra la activación de la transcripción utilizando una construcción de indicador de promotor-luciferasa. La figura 6C muestra la activación de la transcripción directamente a través de qPCR de los genes endógenos. Si bien la introducción de ARNg individuales estimuló modestamente la transcripción, múltiples ARNg actuaron de manera sinérgica para estimular una activación de la transcripción múltiple robusta.
La figura 7A-C está dirigida a la regulación de REX1 guiada por ARN utilizando aptámeros Cas9N, MS2-VP64 y ARNg+2X-MS2. Tal como se muestra en la figura 7A, se diseñaron, para el gen REX1, 10 ARNg dirigidos a un tramo de ADN de ~5 kb cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Los sitios hipersensibles a la ADNasa están resaltados en verde. La figura 7B muestra la activación de la transcripción utilizando una construcción de indicador de promotor-luciferasa. La figura 7C muestra la activación de la transcripción directamente a través de qPCR de los genes endógenos. Si bien la introducción de ARNg individuales estimuló modestamente la transcripción, múltiples ARNg actuaron de manera sinérgica para estimular una activación de la transcripción múltiple robusta. La ausencia de los aptámeros 2X-MS2 en el ARNg no da como resultado la activación de la transcripción. Véase Maeder et al., Nature Methods 10, 243-245 (2013) y Perez-Pinera et al., Nature Methods 10, 239-242 (2013).
Por consiguiente, se pueden utilizar múltiples ARN guía con una proteína Cas9N y una proteína o dominio regulador de la transcripción para regular la expresión de un gen diana.
Los enfoques de anclaje de Cas9 y ARNg fueron eficaces, mostrando el primero una potencia ~ 1,5-2 veces mayor. Esta diferencia probablemente se deba al requisito de un ensamblaje de complejo de 2 componentes en lugar de un ensamblaje complejo de 3 componentes. Sin embargo, el enfoque de anclaje de ARNg en principio permite que diferentes dominios efectores sean reclutados por distintos ARNg siempre que cada ARNg utilice un par de interacción de ARN-proteína diferente. Véase Karyer-Bibens et al. Biology of the Cell / Under the Auspices of the European Cell Biology Organization 100, 125-138 (2008). Se pueden regular diferentes genes diana utilizando ARN guía específico y una proteína Cas9N genérica, es decir, la misma proteína Cas9N o una similar para diferentes genes diana. Son posibles procedimientos de regulación génica múltiple utilizando la misma Cas9N o una similar.
La edición de genes diana utilizando las proteínas Cas9N y los ARN guía proporciona ingeniería genética y epigenética múltiple de células humanas. Siendo la dirección a diana de Cas9-ARNg un problema (véase Jiang et al., Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)), se proporcionan procedimientos para interrogar en profundidad la afinidad de Cas9 para un espacio muy grande de variaciones de la secuencia diana. Por consiguiente, los aspectos de la presente invención proporcionan una lectura directa de alto rendimiento de la dirección a diana de Cas9 en células humanas, al tiempo que evitan las complicaciones introducidas por la toxicidad de corte y la reparación mutagénica de ADNdc incurridas por las pruebas de especificidad con Cas9 activa en nucleasa nativa.
Se describe la utilización de proteínas o sistemas de unión a ADN, en general, para la regulación de la transcripción de un gen diana. Un experto en la materia identificará fácilmente de sistemas de unión a ADN de ejemplo. Dichos sistemas de unión a ADN no necesitan tener ninguna actividad de nucleasa, tal como ocurre con la proteína Cas9 de origen natural. Por consiguiente, tales sistemas de unión a ADN no necesitan tener inactivada la actividad de nucleasa. Un sistema de unión a ADN es TALE. Como herramienta de edición del genoma, generalmente se utilizan dímeros TALE-FokI, y para la regulación del genoma, las fusiones TAEL-VP64 han demostrado ser altamente eficaces. La especificidad de TALE se evaluó utilizando la metodología que se muestra en la figura 2A. Se diseña una biblioteca de construcciones en la que cada elemento de la biblioteca comprende un promotor mínimo que impulsa una proteína fluorescente dTomato. Cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción m, se inserta una etiqueta de transcripción aleatoria de 24 pb (A/C/G), mientras que dos sitios de unión a TF se colocan cadena arriba del promotor: uno es una secuencia de ADN constante compartida por todos los elementos de la biblioteca, y el segundo es una característica variable que contiene una biblioteca “sesgada” de sitios de unión que están diseñados para abarcar una gran colección de secuencias que presentan muchas combinaciones de mutaciones fuera de la secuencia diana para la unión a la cual se diseñó el complejo de direccionamiento de ADN programable. Esto se consigue utilizando oligonucleótidos degenerados diseñados para portar frecuencias de nucleótidos en cada posición, de modo que el nucleótido de la secuencia diana aparece con una frecuencia del 79 % y cada uno de los demás nucleótidos aparece con una frecuencia del 7 %. Véase Patwardhan et al., Nature Biotechnology 30, 265-270 (2012). A continuación, la biblioteca de indicadores se secuencia para revelar las asociaciones entre las etiquetas de transcripción de dTomato de 24 pb y su sitio diana "sesgado" correspondiente en el elemento de la biblioteca. La gran diversidad de etiquetas de transcripción asegura que el intercambio de etiquetas entre diferentes dianas será extremadamente raro, mientras que la construcción sesgada de las secuencias diana significa que los sitios con pocas mutaciones se asociarán con más etiquetas que los sitios con más mutaciones. A continuación, la transcripción de los genes indicadores de dTomato se estimula con un TF de control diseñado para unirse al sitio de ADN compartido o con el TF diana que se diseñó para unirse al sitio diana. La abundancia de cada etiqueta de transcripción expresada se mide en cada muestra mediante la realización de ARNsec (“seqRNA") en las células estimuladas, que luego se mapean de nuevo a sus sitios de unión correspondientes utilizando la tabla de asociación establecida anteriormente. Se espera que el TF de control excite a todos los miembros de la biblioteca por igual, dado que su sitio de unión se comparte entre todos los elementos de la biblioteca, mientras que se espera que el TF diana desvíe la distribución de los miembros expresados hacia aquellos a los que se dirige como diana preferentemente. Esta suposición se utiliza en la etapa 5 para calcular un nivel de expresión normalizado para cada sitio de unión dividiendo los recuentos de etiquetas obtenidos para el TF diana por los obtenidos para el TF de control.
Tal como se muestra en la figura 2B, el escenario de dirección a diana de un complejo Cas9-ARNg revela que, en promedio, es tolerante a 1-3 mutaciones en sus secuencias diana. Tal como se muestra en la figura 2C, el complejo Cas9-ARNg también es en gran medida insensible a las mutaciones puntuales, excepto aquellas localizadas en la secuencia PAM. En particular, estos datos revelan que el PAM previsto para la Cas9 de S. pyogenes no es solo NGG sino también NAG. Tal como se muestra en la figura 2D, la introducción de apareamientos incorrectos de 2 bases perjudica significativamente la actividad del complejo Cas9-ARNg, sin embargo, solo cuando estos se localizan en las 8-10 bases más cercanas al extremo 3' de la secuencia diana del ARNg (en el gráfico de calor, las posiciones de la secuencia diana están etiquetadas del 1 al 23 empezando desde el extremo 5').
La tolerancia mutacional de otra herramienta de edición del genoma ampliamente utilizada, los dominios TALE, se determinó utilizando el ensayo de especificidad de la transcripción descrito en el presente documento. Tal como se muestra en la figura 2E, los datos de TALE fuera de la diana para un TALE de 18 unidades monoméricas revelan que puede tolerar en promedio de 1-2 mutaciones en su secuencia diana y no puede activar una gran mayoría de variantes de apareamientos incorrectos de 3 bases en sus dianas. Tal como se muestra en la figura 2F, el TALE de 18 unidades monoméricas es similar a los complejos Cas9-ARNg, en gran medida insensible a los apareamientos incorrectos de base simple en su diana. Tal como se muestra en la figura 2G, la introducción de 2 apareamientos incorrectos de bases perjudica significativamente la actividad de TALE de 18 unidades monoméricas. La actividad de TALE es más sensible a los apareamientos incorrectos más cercanos al extremo 5' de su secuencia diana (en el gráfico de calor, las posiciones de la secuencia diana están etiquetadas de 1 a 18 empezando desde el extremo 5').
Los resultados se confirmaron utilizando experimentos dirigidos a diana en un ensayo de nucleasa que es el objeto de la figura 10A-C dirigido a evaluar el escenario de dirección a diana por TALE de diferentes tamaños. Tal como se muestra en la figura 10A, utilizando un ensayo de HR mediado por nucleasa, se confirmó que los TALE de 18 unidades monoméricas toleran múltiples mutaciones en sus secuencias diana. Tal como se muestra en la figura 10B, utilizando el enfoque descrito en la figura 2, se analizó el escenario de dirección a diana de TALE de 3 tamaños diferentes (18 unidades monoméricas, 14 unidades monoméricas y 10 unidades monoméricas). Los TALE más cortos (14 unidades monoméricas y 10 unidades monoméricas) son progresivamente más específicos en su dirección a diana, pero también reducen su actividad en casi un orden de magnitud. Tal como se muestra en la figura 10C y 10D, los TALE de 10 unidades monoméricas muestran una resolución cercana de apareamientos incorrectos de base simple, perdiendo casi toda la actividad frente a las dianas que contienen 2 apareamientos incorrectos (en el gráfico de calor, las posiciones de la secuencia diana están etiquetadas del 1 al 10 empezando desde el extremo 5'). En conjunto, estos datos implican que la ingeniería de TALE más cortos puede generar una mayor especificidad en las aplicaciones de ingeniería del genoma, mientras que el requisito de dimerización de Fokl en las aplicaciones de nucleasas TALE es esencial para evitar el efecto fuera de la diana. Véase Kim et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 1156-1160 (1996) y Pattanayak et al., Nature Methods 8, 765-770 (2011).
La figura 8A-C está dirigida al flujo de procesamiento de análisis de especificidad de alto nivel para el cálculo de niveles de expresión normalizados ilustrados con ejemplos a partir de datos experimentales. Tal como se muestra en la figura 8A, las bibliotecas de construcciones se generan con una distribución sesgada de secuencias de sitios de unión y etiquetas de 24 pb de secuencias aleatorias que se incorporarán en las transcripciones del gen indicador (arriba). Las etiquetas transcritas están muy degeneradas, por lo que deberían asignarse de muchas a una a las secuencias de unión de Cas9 o TALE. Las bibliotecas de construcciones se secuencian (tercer nivel, izquierda) para establecer qué etiquetas coexisten con los sitios de unión, lo que da como resultado una tabla de asociación de sitios de unión frente a etiquetas transcritas (cuarto nivel, izquierda). Se pueden secuenciar múltiples bibliotecas de construcciones creadas para diferentes sitios de unión a la vez utilizando códigos de barras de biblioteca (indicados aquí por los colores azul claro y amarillo claro; niveles 1 -4, izquierda). A continuación, se transfecta una biblioteca de construcciones en una población de células y se induce un conjunto de diferentes factores de transcripción Cas9/ARNg o TALE en muestras de las poblaciones (segundo nivel, derecha). Siempre se induce una muestra con un activador TALE fijo dirigido a una secuencia de sitio de unión fija dentro de la construcción (nivel superior, cuadro verde); esta muestra sirve como control positivo (muestra verde, también indicada con un signo ). Los ADNc generados a partir de las moléculas de ARNm indicador en las muestras inducidas se secuencian, a continuación, y se analizan para obtener recuentos de etiquetas para cada etiqueta en una muestra (tercer y cuarto nivel, derecha). De la misma forma que con la secuenciación de la biblioteca de construcciones, múltiples muestras, entre las que se incluye el control positivo, se secuencian y analizan juntas añadiendo códigos de barras de muestras. Aquí, el color rojo claro indica una muestra que no es de control que se ha secuenciado y analizado con el control positivo (verde). Debido a que en cada lectura solo aparecen las etiquetas transcritas y no los sitios de unión de la construcción, a continuación, la tabla de asociación de sitio de unión frente a etiqueta obtenida a partir de la secuenciación de la biblioteca de construcciones se utiliza para computar los recuentos totales de etiquetas expresadas a partir de cada sitio de unión en cada muestra (quinto nivel). Los cómputos para cada muestra de control no positivo se convierten, a continuación, en niveles de expresión normalizados para cada sitio de unión dividiéndolos por los cómputos obtenidos en la muestra de control positivo. En las figuras 2B y 2E, y en la figura 9A y la figura 10B se proporcionan ejemplos de gráficos de niveles de expresión normalizados por números de apareamientos incorrectos. En este flujo de proceso general no se cubren varios niveles de filtrado de etiquetas erróneas, para etiquetas que no se pueden asociar con una biblioteca de construcciones y para etiquetas aparentemente compartidas con múltiples sitios de unión. La figura 8B representa distribuciones de ejemplo de porcentajes de sitios de unión por números de apareamientos incorrectos dentro de una biblioteca de construcciones sesgada. Izquierda: Distribución teórica. Derecha: Distribución observada a partir de una biblioteca de construcciones TALE real. La figura 8C representa distribuciones de ejemplo de porcentajes de recuentos de etiquetas agregados a sitios de unión por números de apareamientos incorrectos. Izquierda: Distribución observada a partir de la muestra de control positivo. Derecha: Distribución observada a partir de una muestra en la que se indujo un TALE no de control. Como el TALE de control positivo se une a un sitio fijo en la construcción, la distribución de recuentos de etiquetas agregados refleja de cerca la distribución de sitios de unión en la figura 8B, mientras que la distribución está desviada hacia la izquierda para la muestra TALE no de control porque los sitios con menos apareamientos incorrectos inducen niveles de expresión más altos. Abajo: El cálculo del enriquecimiento relativo entre estos dividiendo los recuentos de etiquetas obtenidos para el TF diana por los obtenidos para el TF de control revela el nivel de expresión promedio frente al número de mutaciones en el sitio diana.
Estos resultados se reafirman aún más por los datos de especificidad generados utilizando un complejo Cas9-ARNg diferente. Tal como se muestra en la figura 9A, un complejo Cas9-ARNg diferente es tolerante a 1-3 mutaciones en su secuencia diana. Tal como se muestra en la figura 9B, el complejo Cas9-ARNg también es en gran parte insensible a las mutaciones puntuales, excepto aquellas localizadas en la secuencia PAM. Tal como se muestra en la figura 9C, la introducción de apareamientos incorrectos de 2 bases, sin embargo, perjudica significativamente la actividad (en el gráfico de calor, las posiciones de la secuencia diana están etiquetadas de 1 a 23 empezando desde el extremo 5'). Tal como se muestra en la figura 9D, se confirmó utilizando un ensayo de HR mediado por nucleasa que el PAM previsto para Cas9 de S. pyogenes es NGG y también NAG.
Debido a que la sinergia entre múltiples complejos es un factor en la activación del gen diana por parte de Cas9N-VP64, las aplicaciones de regulación de la transcripción de Cas9N son naturalmente bastante específicas, ya que los eventos de unión fuera de la diana individuales deberían tener un efecto mínimo. Según un aspecto, las mellas desplazadas se utilizan en procedimientos de edición del genoma. Una gran mayoría de mellas rara vez dan como resultado eventos de NHEJ (véase Certo et al., Nature Methods 8, 671-676 (2011)) minimizando así los efectos de mellas fuera de la diana. Por el contrario, la inducción de mellas desplazadas para generar rupturas de doble cadena (DSB, double stranded breaks) es muy eficaz para inducir la alteración de genes. Según ciertos aspectos, los salientes de 5' generan eventos de NHEJ más significativos en comparación con los salientes de 3'. De manera similar, los salientes de 3' favorecen los eventos de HR sobre los de NHEJ, aunque el número total de eventos de HR es significativamente menor que cuando se genera un saliente de 5'. Por consiguiente, se proporcionan procedimientos para utilizar mellas para la recombinación homóloga y mellas desplazadas para generar rupturas de doble cadena para minimizar los efectos de la actividad de Cas9-ARNg fuera de la diana.
La figura 3A-C está dirigida al mellado de desplazamiento múltiple (“multiplex off-set nicking’) y a los procedimientos para reducir la unión fuera de la diana con los ARN guía. Tal como se muestra en la figura 3A, el indicador de semáforo se utilizó para analizar simultáneamente los eventos de HR y NHEJ tras la introducción de mellas o rupturas diana. Los eventos de escisión de ADN resueltos a través de la ruta HDR restauran la secuencia GFP, mientras que la NHEJ mutagénica provoca cambios de marco que hacen que la GFP esté fuera de marco y la secuencia mCherry cadena abajo en marco. Para el ensayo, se diseñaron 14 ARNg que cubrían un tramo de ADN de 200 pb: 7 dirigidos a la cadena sentido (U1-7) y 7 a la cadena antisentido (D1-7). Utilizando el mutante Cas9D10A, que mella la cadena complementaria, se utilizaron diferentes combinaciones bidireccionales de los ARNg para inducir un intervalo de salientes en 5' o 3' programados (se indican los sitios de mella para los 14 ARNg). Tal como se muestra en la figura 3B, la inducción de mellas desplazadas para generar rupturas de doble cadena (DSB) es muy eficaz para inducir la alteración de genes. En particular, las mellas desplazadas que conducen a salientes en 5' dan como resultado más eventos de NHEJ en lugar de salientes en 3'. Tal como se muestra en la figura 3C, la generación de salientes en 3' también favorece la proporción de eventos de HR sobre de NHEJ, pero el número total de eventos de HR es significativamente menor que cuando se genera un saliente en 5'.
La figura 11A-B está dirigida a NHEJ mediada por nickasa Cas9D10A. Tal como se muestra en la figura 11A, el indicador de semáforo se utilizó para ensayar eventos de NHEJ tras la introducción de mellas o rupturas de doble cadena dirigidas. Brevemente, tras la introducción de eventos de escisión de ADN, si la ruptura pasa por NHEJ mutagénica, la GFP se traduce fuera del marco y las secuencias mCherry cadena abajo se procesan en el marco, lo que da como resultado una fluorescencia roja. Se diseñaron 14 ARNg que cubrían un tramo de ADN de 200 pb: 7 dirigidos a la cadena sentido (U1-7) y 7 a la cadena antisentido (D1-7). Tal como se muestra en la figura 11B, se observó que, a diferencia de la Cas9 de tipo salvaje que da como resultado DSB y NHEJ robusta en todas las dianas, la mayoría de las mellas (que utilizan el mutante Cas9D10A) rara vez dan como resultado eventos de NHEJ. Los 14 sitios están ubicados dentro de un tramo contiguo de ADN de 200 pb y se observaron diferencias de más de 10 veces en las eficiencias de dirección a diana.
Entre los procedimientos para modular la expresión de un ácido nucleico diana en una célula se incluyen la introducción de uno o más, dos o más o una pluralidad de ácidos nucleicos extraños en la célula. Los ácidos nucleicos extraños introducidos en la célula codifican un ARN guía o varios ARN guía, una proteína o proteínas Cas9 sin nucleasa y una proteína o dominio regulador de la transcripción. Juntos, un ARN guía, una proteína Cas9 sin nucleasa y una proteína o dominio regulador de la transcripción se denominan complejo de colocalización, tal como un experto en la materia entiende esta expresión en la medida en que el ARN guía, la proteína Cas9 sin proteasa y la proteína o dominio regulador de la transcripción se unen al ADN y regulan la expresión de un ácido nucleico diana. Los ácidos nucleicos extraños introducidos en la célula pueden codificar un ARN guía o varios ARN guía y una proteína nickasa Cas9. Juntos, un ARN guía y una proteína nickasa Cas9 se denominan complejo de colocalización, tal como un experto en la materia entiende esta expresión en la medida en que el ARN guía y la proteína nickasa Cas9 se unen al ADN y mellan un ácido nucleico diana.
Las células, según la presente divulgación, incluyen cualquier célula en la que se puedan introducir y expresar ácidos nucleicos extraños, tal como se describe en el presente documento. Debe entenderse que los conceptos básicos de la presente divulgación descritos en el presente documento no están limitados por el tipo de célula. Las células, según la presente divulgación, incluyen células eucariotas, células procariotas, células animales, células vegetales, células fúngicas, células de arqueas, células eubacterianas y similares. Las células incluyen células eucariotas, tales como células de levadura, células vegetales y células animales. Las células particulares incluyen células de mamífero. Además, las células incluyen cualquiera en la que sería beneficioso o deseable regular un ácido nucleico diana. Dichas células pueden incluir aquellas que son deficientes en la expresión de una proteína particular que conduce a una enfermedad o afección perjudicial. Dichas enfermedades o afecciones perjudiciales son fácilmente conocidas por los expertos en la materia. El ácido nucleico responsable de expresar la proteína particular puede ser la diana de un activador de la transcripción, dando como resultado una regulación al alza del ácido nucleico diana y la expresión correspondiente de la proteína particular. De esta manera, se proporciona un tratamiento terapéutico.
Los ácidos nucleicos diana incluyen cualquier secuencia de ácido nucleico para la que un complejo de colocalización, tal como se describe en el presente documento, puede ser útil para regular o mellar. Los ácidos nucleicos diana incluyen genes. Para los fines de la presente divulgación, el ADN, tal como el ADN de doble cadena, puede incluir el ácido nucleico diana y un complejo de colocalización puede unirse al ADN o colocalizarse de otro modo con el mismo en el ácido nucleico diana, junto al mismo o cerca del mismo y de una manera en la que el complejo de colocalización puede tener un efecto deseado sobre el ácido nucleico diana. Dichos ácidos nucleicos diana pueden incluir ácidos nucleicos endógenos (o de origen natural) y ácidos nucleicos exógenos (o extraños). Un experto en la materia, basándose en la presente divulgación, podrá identificar o diseñar fácilmente ARN guía y proteínas Cas9 que se colocalizan con un ADN que incluye un ácido nucleico diana. Un experto en la materia será capaz, además, de identificar proteínas o dominios reguladores de la transcripción que igualmente se colocalizan con un ADN que incluye un ácido nucleico diana. El ADN incluye ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno.
Los ácidos nucleicos extraños (es decir, aquellos que no forman parte de la composición de ácidos nucleicos naturales de una célula) pueden introducirse en una célula utilizando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia para dicha introducción. Tales procedimientos incluyen transfección, transducción, transducción viral, microinyección, lipofección, nucleofección, bombardeo con nanopartículas, transformación, conjugación y similares. Un experto en la materia comprenderá y adaptará fácilmente dichos procedimientos utilizando fuentes bibliográficas fácilmente identificables.
Las proteínas o los dominios reguladores de la transcripción que son activadores de la transcripción incluyen VP16 y VP64 y otras fácilmente identificables por los expertos en la materia basándose en la presente divulgación.
Las enfermedades y afecciones perjudiciales son aquellas caracterizadas por la pérdida anormal de expresión de una proteína particular. Dichas enfermedades o afecciones perjudiciales pueden tratarse mediante la regulación al alza de la proteína particular. Una enfermedad o afección perjudicial se puede tratar donde el complejo de colocalización, tal como se describe en el presente documento, se asocia o se une de otro modo al ADN que incluye un ácido nucleico diana, y el activador de la transcripción del complejo de colocalización regula al alza la expresión del ácido nucleico diana. Por ejemplo, la regulación al alza de PRDM16 y otros genes que promueven la diferenciación de la grasa parda y el aumento de la captación metabólica se puede utilizar para tratar el síndrome metabólico o la obesidad. La activación de genes antiinflamatorios es útil en la autoinmunidad y en enfermedades cardiovasculares. La activación de genes supresores de tumores es útil en el tratamiento del cáncer. Un experto en la materia identificará fácilmente tales enfermedades y afecciones perjudiciales basándose en la presente divulgación.
Los siguientes ejemplos se exponen como representativos de la presente divulgación. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente divulgación, ya que estas y otras realizaciones equivalentes serán evidentes a la vista de la presente divulgación, las figuras y las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLO I
Mutantes de Cas9
Se buscaron secuencias homólogas a Cas9 con estructura conocida para identificar mutaciones candidatas en Cas9 que pudieran suprimir la actividad natural de sus dominios RuvC y HNH. Utilizando HHpred (sitio web mundial toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred), se consultó la secuencia completa de Cas9 contra el banco de datos de proteínas completo (“Protein Data Bank”) (enero de 2013). Esta búsqueda devolvió dos endonucleasas HNH diferentes que tenían una homología de secuencia significativa con el dominio HNH de Cas9; PacI y una supuesta endonucleasa (ID de PDB: 3M7K y 4H9D, respectivamente). Estas proteínas se examinaron para encontrar residuos implicados en la coordinación de iones de magnesio. A continuación, se identificaron los residuos correspondientes en el alineamiento de secuencias con Cas9. Se identificaron dos cadenas laterales de coordinación de Mg en cada estructura que se alinearon con el mismo tipo de aminoácido en Cas9. Son 3M7K D92 y N113, y 4H9D D53 y N77. Estos residuos correspondieron a Cas9 D839 y N863. También se informó de que las mutaciones de los residuos de PacI D92 y N113 a alanina hicieron que la nucleasa fuera deficiente catalíticamente. Las mutaciones Cas9 D839A y N863A se realizaron basándose en este análisis. Además, HHpred también predice la homología entre Cas9 y el extremo N de un RuvC de Thermus thermophilus (PDB ID: 4EP4). Esta alineación de secuencias cubre la mutación D10A previamente informada que elimina la función del dominio RuvC en Cas9. Para confirmar esto como una mutación apropiada, los residuos de unión a metales se determinaron como tal como anteriormente. En 4EP4, D7 ayuda a coordinar un ion de magnesio. Esta posición tiene una homología de secuencia correspondiente a Cas9 D10, lo que confirma que esta mutación ayuda a eliminar la unión a metales y, por tanto, la actividad catalítica del dominio Cas9 RuvC.
EJEMPLO II
Construcción de plásmidos
Los mutantes de Cas9 se generaron utilizando el kit Quikchange (Agilent technologies). Las construcciones de expresión de ARNg diana (1) se ordenaron directamente como gBlocks individuales de IDT y se clonaron en el vector pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen); o (2) se sintetizaron a medida por Genewiz; o (3) se ensamblaron utilizando el ensamblaje de Gibson de oligonucleótidos en el vector de clonación de ARNg (plásmido No. 41824). Los vectores para el ensayo indicador de HR que implicaba una GFP rota se construyeron mediante ensamblaje por PCR de fusión de la secuencia de la GFP que portaba el codón de terminación y el fragmento adecuado ensamblado en el lentivector EGIP de Addgene (plásmido No. 26777). A continuación, estos lentivectores se utilizaron para establecer las líneas estables del indicador de la GFP. Los TALEN utilizados en este estudio se construyeron utilizando protocolos estándar. Véase Sanjana et al., Nature Protocols 7, 171-192 (2012). Las fusiones de Cas9N y MS2 VP64 se realizaron utilizando procedimientos de protocolo de fusión de PCR estándar. Las construcciones de promotor de luciferasa para OCT4 y REX1 se obtuvieron de Addgene (plásmido No. 17221 y plásmido No. 17222).
EJEMPLO III
Cultivo celular y transfecciones
Las células HEK 293T se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Dulbecco’s modified Eagle’s médium, Invitrogen) con alto contenido de glucosa suplementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, fetal bovine serum, Invitrogen), penicilina/estreptomicina (pen/estrep, Invitrogen) y aminoácidos no esenciales (NEAA, non-essential amino acids, Invitrogen). Las células se mantuvieron a 37 °C y el 5 % de CO2 en una incubadora humidificada.
Las transfecciones que implicaban ensayos de nucleasa fueron las siguientes: se transfectaron 0,4 x 106 células con 2 |xg de plásmido Cas9, 2 |xg de ARNg y/o 2 |xg de plásmido donante de ADN utilizando Lipofectamine 2000 según los protocolos del fabricante. Las células se recogieron 3 días después de la transfección y se analizaron por FACS, o bien para el ensayo directo de cortes genómicos, se extrajo el ADN genómico de ~1 X 106 células utilizando el kit DNAeasy (Qiagen). Para estos, se llevó a cabo una PCR para amplificar la región de dirección a la diana con ADN genómico derivado de las células y los amplicones se secuenciaron en profundidad con MiSeq Personal Sequencer (Illumina) con una cobertura de > 200.000 lecturas. Los datos de secuenciación se analizaron para estimar las eficiencias de NHEJ.
Para transfecciones que implicaban ensayos de activación de la transcripción: se transfectaron 0,4 x 106 células con (1) 2 |xg de plásmido Cas9N-VP64, 2 |xg de ARNg y/o 0,25 |xg de construcción de indicador; o (2) 2 |xg de plásmido Cas9N, 2 |xg de MS2-VP64, 2 |xg de ARNg-2XMS2aptámero y/o 0,25 |xg de construcción de indicador. Las células se recogieron 24-48 horas después de la transfección y se analizaron mediante FACS o procedimientos de inmunofluorescencia, o se extrajo su ARN total y estos se analizaron posteriormente mediante RT-PCR. Aquí se utilizaron sondas taqman estándar de Invitrogen para OCT4 y REX1, con normalización para cada muestra realizada contra GAPDH.
Para transfecciones que implicaban ensayos de activación de la transcripción para el perfil de especificidad de los complejos Cas9-ARNg y los TALE: se transfectaron 0,4 x 106 células con (1) 2 |xg de plásmido Cas9N-VP64, 2 |xg de ARNg y 0,25 |xg de biblioteca de indicadores; o (2) 2 |xg de plásmido TALE-TF y 0,25 |xg de biblioteca de indicadores; o (3) 2 |xg de plásmido TF de control y 0,25 |xg de biblioteca de indicadores. Las células se recogieron 24 horas después de la transfección (para evitar que la estimulación de los indicadores estuviera en modo de saturación). La extracción de ARN total se realizó utilizando el kit RNAeasy-plus (Qiagen) y la RT-PCR estándar se realizó con Superscript-III (Invitrogen). Las bibliotecas para la secuenciación de próxima generación se generaron mediante amplificación por PCR dirigida de las etiquetas de transcripción.
EJEMPLO IV
Análisis computacional y de secuencias para el cálculo de los niveles de expresión de indicadores Cas9-TF y TALE-TF
El flujo lógico de alto nivel para este proceso se representa en la figura 8A, y en el presente documento se brindan detalles adicionales. Para obtener detalles sobre la composición de la biblioteca de construcciones, véase las figuras 8A (nivel 1) y 8B.
Secuenciación: para los experimentos de Cas9, las secuencias de la biblioteca de construcciones (figura 8A, nivel 3, izquierda) y de ADNc del gen indicador (figura 8A, nivel 3, derecha) se obtuvieron como lecturas finales emparejadas superpuestas de 150 pb en un Illumina MiSeq, mientras que para los experimentos de TALE, las correspondientes secuencias se obtuvieron como lecturas finales emparejadas no superpuestas de 51 pb en un Illumina HiSeq.
Procesamiento de secuencias de la biblioteca de construcciones: Alineación: para los experimentos de Cas9, se utilizó novoalign V2.07.17 (sitio web mundial novocraft.com/main/index/php) para alinear lecturas emparejadas con un conjunto de secuencias de referencia de 250 pb que correspondían a 234 pb de las construcciones flanqueadas por los pares de códigos de barras de la biblioteca de 8 pb (véase la figura 8A, tercer nivel, izquierda). En las secuencias de referencia proporcionadas a novoalign, las regiones de sitio de unión de Cas9 degeneradas de 23 pb y las regiones de etiqueta de transcripción degeneradas de 24 pb (véase la figura 8A, primer nivel) se especificaron como Ns, mientras que los códigos de barras de la biblioteca de construcciones se proporcionaron explícitamente. Para los experimentos de TALE, se utilizaron los mismos procedimientos excepto que las secuencias de referencia tenían una longitud de 203 pb y las regiones de sitio de unión degeneradas tenían una longitud de 18 pb frente a 23 pb. Verificación de validez: salida de Novoalign para archivos compuestos en los que las lecturas izquierda y derecha para cada par de lectura se alinearon individualmente con las secuencias de referencia. Solo los pares de lectura que estaban alineados de manera única con la secuencia de referencia se sometieron a condiciones de validez adicionales, y solo se retuvieron los pares de lectura que cumplieron todas estas condiciones. Las condiciones de validez incluían:
(i) Cada uno de los dos códigos de barras de la biblioteca de construcciones debe alinearse en, como mínimo, 4 posiciones con un código de barras de la secuencia de referencia, y los dos códigos de barras deben coincidir con el par de códigos de barras para la misma biblioteca de construcciones.
(ii) Todas las bases que se alinean con las regiones N de la secuencia de referencia deben ser llamadas por novoalign como As, Cs, Gs o Ts. Téngase en cuenta que ni para los experimentos de Cas9 ni de TALE, las lecturas izquierda y derecha se superpusieron en una región N de referencia, por lo que no surgió la posibilidad de llamadas novoalign ambiguas de estas bases de N. (iii) Del mismo modo, no deben aparecer inserciones o deleciones llamadas por novoalign en estas regiones. (iv) No debe aparecer Ts en la región de la etiqueta de transcripción (ya que estas secuencias aleatorias se generaron solo a partir de As, Cs y Gs). Los pares de lectura para los que se violó alguna de estas condiciones se recopilaron en un archivo de par de lectura rechazado. Estas verificaciones de validez se implementaron utilizando secuencias de Script en Perl personalizadas.
Procesamiento de la secuencia de ADNc del gen indicador de la muestra inducida: Alineación: SeqPrep (descargado del sitio web mundial github.com/jstjohn/SeqPrep) se utilizó por primera vez para fusionar los pares de lectura superpuestos en el segmento común de 79 pb, después de lo cual se utilizó novoalign (versión anterior) para alinear estos segmentos comunes de 79 pb como lecturas únicas no emparejadas con un conjunto de secuencias de referencia (véase la figura 8A, tercer nivel, derecha) en las que (tal como para la secuenciación de la biblioteca de construcciones) la etiqueta de transcripción degenerada de 24 pb se especificó como Ns mientras que se proporcionaron los códigos de barras de muestra explícitamente. Las regiones de secuencia de TALE y ADNc de Cas9 correspondían a las mismas regiones de ADNc de 63 pb flanqueadas por pares de secuencias de código de barras de muestra de 8 pb. Verificación de validez: se aplicaron las mismas condiciones que para la secuenciación de bibliotecas de construcciones (véase arriba), excepto que: (a) aquí, debido a la fusión previa de SeqPrep de los pares de lectura, el procesamiento de validez no tuvo que filtrar las alineaciones únicas de ambas lecturas en un par de lectura, sino solo alineaciones únicas de las lecturas combinadas. (b) Solo aparecieron etiquetas de transcripción en las lecturas de secuencias de ADNc, de modo que el procesamiento de validez solo aplicó estas regiones de etiquetas de las secuencias de referencia y no también a una región separada del sitio de unión.
Ensamblaje de la tabla de sitios de unión frente a asociaciones de etiquetas de transcripción: Se utilizó Perl personalizado para generar estas tablas a partir de las secuencias de bibliotecas de construcciones validadas (figura 8A, cuarto nivel, izquierda). Aunque las secuencias de etiquetas de 24 pb compuestas de bases A, C y G deberían ser esencialmente únicas en una biblioteca de construcciones (probabilidad de compartir = ~2,8e-11 ), el análisis inicial del sitio de unión frente a las asociaciones de etiquetas reveló que una fracción no despreciable de las secuencias de etiqueta fue, de hecho, compartida por múltiples secuencias de unión, probablemente causadas principalmente por una combinación de errores de secuencia en las secuencias de unión, o errores de síntesis de oligos en los oligos utilizados para generar las bibliotecas de construcciones. Además de compartir etiquetas, las etiquetas que se encontraron asociadas con sitios de unión en pares de lectura validados también pueden encontrarse en el archivo de rechazo de par de lectura de la biblioteca de construcciones si no estaba claro, debido a apareamientos incorrectos en el código de barras, de qué biblioteca de construcciones podrían provenir. Finalmente, las propias secuencias de etiquetas pueden contener errores de secuencia. Para hacer frente a estas fuentes de error, las etiquetas se categorizaron con tres atributos: (i) segura frente a insegura, donde insegura significaba que la etiqueta se podía encontrar en el archivo de par de lectura rechazado de la biblioteca de construcción; compartida frente a no compartida, donde compartida significaba que la etiqueta se encontró asociada con múltiples secuencias de sitios de unión, y 2+ frente a 1 solo, donde 2+ significaba que la etiqueta aparecía, como mínimo, dos veces entre las secuencias de la biblioteca de construcciones validadas y, por lo tanto, se suponía que era menos probable que contuviera errores de secuencia. La combinación de estos tres criterios produjo 8 clases de etiquetas asociadas con cada sitio de unión, la clase más segura (pero menos abundante) que comprende solo etiquetas seguras, no compartidas, 2+; y la clase menos segura (pero más abundante) que comprende todas las etiquetas independientemente de la seguridad, el uso compartido o el número de apariciones. Cálculo de los niveles de expresión normalizados: Se utilizó código Perl personalizado para implementar las etapas indicadas en la figura 8A, niveles 5-6. En primer lugar, los recuentos de etiquetas obtenidos para cada muestra inducida se agregaron para cada sitio de unión, utilizando la tabla de sitios de unión frente a etiquetas de transcripción calculada previamente para la biblioteca de construcciones (véase la figura 8C). Para cada muestra, los recuentos de etiquetas agregados para cada sitio de unión se dividieron, a continuación, por los recuentos de etiquetas agregados para la muestra de control positivo para generar niveles de expresión normalizados. Las consideraciones adicionales relevantes para estos cálculos incluyeron:
1. Para cada muestra, se encontró un subconjunto de etiquetas "novedosas" entre las secuencias de genes de ADNc con la validez verificada que no se pudieron encontrar en la tabla de asociación de sitios de unión frente a etiqueta de transcripción. Estas etiquetas se ignoraron en los cálculos posteriores.
2. Las agregaciones de recuentos de etiquetas descritas anteriormente se realizaron para cada una de las ocho clases de etiquetas descritas anteriormente en la tabla de asociación de sitios de unión frente a etiquetas de transcripción. Debido a que los sitios de unión en las bibliotecas de construcciones estaban sesgados para generar secuencias similares a una secuencia central con frecuencia, pero las secuencias con números crecientes de apareamientos incorrectos eran cada vez más raras, los sitios de unión con pocos apareamientos incorrectos generalmente se agregaron a un gran número de etiquetas, mientras que los sitios de unión con más apareamientos incorrectos se agregaron a números más pequeños. De este modo, aunque la utilización de la clase de etiqueta más segura era generalmente deseable, la evaluación de los sitios de unión con dos o más apareamientos incorrectos podría basarse en números pequeños de etiquetas por sitio de unión, lo que hace que los recuentos y las proporciones seguras sean menos fiables estadísticamente, incluso si las propias etiquetas fuesen más fiables. En tales casos, se utilizaron todas las etiquetas. Cierta compensación por esta consideración se obtiene del hecho de que el número de recuentos de etiquetas agregados separados para n posiciones de apareamientos incorrectos creció con el número de combinaciones de posiciones de
apareamientos incorrectos (igual a w 3 ” ), y así aumenta espectacularmente con n; de este modo, los promedios de recuentos de etiquetas agregados para diferentes números n de apareamientos incorrectos (que se muestran en las figuras 2b, 2e y en las figuras 9A y 10B) se basan en un conjunto estadísticamente muy grande de recuentos de etiquetas agregados para n > 2.
3. Finalmente, el sitio de unión integrado en las bibliotecas de construcciones TALE fue de 18 pb y las asociaciones de etiquetas se asignaron basándose en estas secuencias de 18 pb, pero se realizaron algunos experimentos con TALE programados para unir regiones centrales de 14 pb o 10 pb dentro de las regiones del sitio de unión de las construcciones de 18 pb. Al calcular los niveles de expresión para estos TALE, las etiquetas se agregaron a los sitios de unión basándose en las regiones correspondientes de los sitios de unión de 18 pb en la tabla de asociación, de modo que se ignoraron los apareamientos incorrectos del sitio de unión fuera de esta región.
EJEMPLO V
Regulación de SOX2 y NANOG guiada por ARN utilizando Cas9N-VP64
El enfoque de anclaje de ARNgs (ARN de guía simple modificado con aptámero) (sgRNA, aptamer-modified single guide RNA) descrito en el presente documento permite que distintos ARNgs recluten diferentes dominios efectores siempre que cada ARNgs utilice un par de interacción de ARN-proteína diferente, lo que permite la regulación génica múltiple utilizando la misma proteína Cas9N. Para los genes SOX2 de la figura 12A y Na NOG de la figura 12B, se diseñaron 10 ARNgs dirigidos a un tramo de ADN de ~1 kb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción. Los sitios hipersensibles a la ADNasa están resaltados en verde. Se ensayó la activación de la transcripción mediante qPCR de los genes endógenos. En ambos casos, mientras que la introducción de ARNg individuales estimuló modestamente la transcripción, múltiples ARNg actuaron sinérgicamente para estimular una activación de la transcripción múltiple robusta. Los datos son medias /- SEM (N=3). Tal como se muestra en la figura 12A-B, dos genes adicionales, SOX2 y NANOG, se regularon a través de dirección a diana de ARNgs dentro de un tramo cadena arriba de ~1 kb de ADN promotor. Los ARNgs próximos al sitio de inicio de la transcripción dieron como resultado una activación de genes robusta.
EJEMPLO VI
Evaluación del escenario de dirección a diana de los complejos Cas9-ARNg
Utilizando el enfoque descrito en la figura 2, se analizó el escenario dirección a diana de dos complejos Cas9-ARNg adicionales (figura 13A-C) y (figura 13D-F). Los dos ARNg tienen perfiles de especificidad muy diferentes con ARNg2 tolerando hasta 2-3 apareamientos incorrectos y ARNg3 solo hasta 1. Estos aspectos se reflejan tanto en el apareamiento incorrecto de una base (figura 13B, 13E) como en los gráficos de apareamiento incorrecto de dos bases (figura 13C, 13F). En las figuras 13C y 13F, los pares de apareamientos incorrectos de bases para los que no se disponía de datos suficientes para calcular un nivel de expresión normalizado se indican como cajas grises que contienen una “x”, mientras que, para mejorar la visualización de datos, los pares de apareamientos incorrectos cuyos niveles de expresión normalizados son valores atípicos que superan la parte superior de la escala de colores se indican como cajas amarillas que contienen un asterisco “*”. Los símbolos de significación estadística son: *** para P < 0,0005/n, ** para P < 0,005/n, * para P < 0,05/n y N.S. (No significativo) para P>= 0,05/n, donde n es el número de comparaciones (véase la tabla 2).
EJEMPLO VII
Validaciones, especificidad del ensayo de indicador
Tal como se muestra en la figura 14A-C, los datos de especificidad se generaron utilizando dos complejos ARNgs:Cas9 diferentes. Se confirmó que el ensayo era específico para el ARNgs que se estaba evaluando, ya que un ARNgs mutante correspondiente no podía estimular la biblioteca de indicadores. Figura 14A: Se evaluó el perfil de especificidad de dos ARNg (de tipo salvaje y mutante; las diferencias de secuencia se resaltan en rojo) utilizando una biblioteca de indicadores diseñada contra la secuencia diana de ARNg de tipo salvaje. Figura 14B: se confirmó que este ensayo era específico para el ARNg que se estaba evaluando (datos de la figura 13D representados gráficamente de nuevo), ya que el ARNg mutante correspondiente no puede estimular la biblioteca de indicadores. Los símbolos de significación estadística son: *** para P < 0,0005/n, ** para P < 0,005/n, * para P < 0,05/n y N.S. (No significativo) para P>= 0,05/n, donde n es el número de comparaciones (véase la tabla 2). Diferentes ARNgs pueden tener diferentes perfiles de especificidad (figuras 13A, 13D), específicamente, ARNgs2 tolera hasta 3 apareamientos incorrectos y ARNgs3 solo hasta 1. La mayor sensibilidad a los apareamientos incorrectos se localizó en el extremo 3' del espaciador, aunque también se observó que los apareamientos incorrectos en otras posiciones afectaban a la actividad.
EJEMPLO VIII
Validaciones, apareamientos incorrectos de ARNg de base simple y doble
Tal como se muestra en la figura 15A-D, se confirmó mediante experimentos dirigidos a diana que los apareamientos incorrectos de base simple dentro de los 12 pb del extremo 3' del espaciador en los ARNsg analizados dieron como resultado una dirección a diana detectable. Sin embargo, los apareamientos incorrectos de 2 pb en esta región dieron como resultado una pérdida significativa de actividad. Utilizando un ensayo de nucleasa, se probaron 2 ARNg independientes: ARNg2 (figura 15A-B) y ARNg3 (figura 15C-D) que tenían apareamientos incorrectos de base simple o doble (resaltados en rojo) en la secuencia de espaciador frente a la diana. Se confirmó que los apareamientos incorrectos de una sola base dentro de los 12 pb del extremo 3' del espaciador en los ARNg analizados dan como resultado una dirección a diana detectable; sin embargo, los apareamientos incorrectos de 2 pb en esta región dan como resultado una pérdida de actividad rápida. Estos resultados resaltan aún más las diferencias en los perfiles de especificidad entre diferentes ARNg según los resultados de la figura 13. Los datos son medias /- SEM (N=3).
EJEMPLO IX
Validaciones, truncamientos de ARNg en 5'
Tal como se muestra en la figura 16A-D, los truncamientos en la porción 5' del espaciador dieron como resultado la retención de la actividad del ARNgs. Utilizando un ensayo de nucleasa, se probaron 2 ARNg independientes: ARNg1 (figura 16A-B) y ARNg3 (figura 16C-D) que portan truncamientos en el extremo 5' de su espaciador. Se observó que los truncamientos en 5' de 1-3 pb se toleran bien, pero las deleciones más grandes conducen a la pérdida de actividad. Los datos son medias /- SEM (N=3).
EJEMPLO X
Validaciones, PAM de S. pyogenes
Tal como se muestra en la figura 17A-B, se confirmó utilizando un ensayo de HR mediado por nucleasa que el PAM para Cas9 de S. pyogenes es NGG y también NAG. Los datos son medias /- SEM (N=3). Según una investigación adicional, se escaneó un conjunto generado de aproximadamente 190 K dianas Cas9 en exones humanos que no tenían dianas NGG alternativas que compartieran los últimos 13 nt de la secuencia diana para detectar la presencia de sitios NAG alternativos o sitios NGG con apareamiento incorrecto en los 13 nt previos. Se descubrió que solo el 0,4 % no tenía tales dianas alternativas.
EJEMPLO XI
Validaciones, mutaciones de TALE
Utilizando un ensayo de HR mediado por nucleasa (figura 18A-B) se confirmó que los TALE de 18 unidades monoméricas toleran múltiples mutaciones en sus secuencias diana. Tal como se muestra en la figura 18A-B, ciertas mutaciones en el medio de la diana conducen a una mayor actividad de TALE, según se determina a través de experimentos dirigidos a diana en un ensayo de nucleasa.
EJEMPLO XII
Especificidad del monómero TALE frente a la especificidad de la proteína TALE
Para desacoplar el papel de los dirresiduos variables de repetición (RVD, repeat-variable diresidues) individuales, se confirmó que la elección de RVD contribuyó a la especificidad de la base, pero la especificidad de TALE también es una función de la energía de unión de la proteína en su conjunto. La figura 19A-C muestra una comparación de la especificidad del monómero TALE frente a la especificidad de la proteína TALE. Figura 19A: Utilizando una modificación del enfoque descrito en la figura 2, se analizó el escenario de selección de 2 TALE-TF de 14 unidades monoméricas que contenía un conjunto contiguo de 6 repeticiones NI o 6 NH. En este enfoque, se creó una biblioteca reducida de indicadores que portaban una secuencia degenerada de 6 unidades monoméricas en el medio y se utilizó para analizar la especificidad de TALE-TF. Figura 19B-C: En ambos casos, se observó que la secuencia diana esperada está enriquecida (es decir, una que porta 6 As para las repeticiones NI y 6 Gs para las repeticiones NH). Cada uno de estos TALE todavía tolera 1-2 apareamientos incorrectos en la secuencia diana central de 6 unidades monoméricas. Si bien la elección de los monómeros contribuye a la especificidad de la base, la especificidad de TALE también es una función de la energía de unión de la proteína en su conjunto. Según un aspecto, los TALE de ingeniería más cortos o los TALE que portan una composición de monómeros de alta y baja afinidad dan como resultado una mayor especificidad en las aplicaciones de ingeniería genómica y la dimerización de Fokl en las aplicaciones de nucleasas permite una mayor reducción de los efectos fuera de la diana cuando se utilizan TALE más cortos.
EJEMPLO XIII
Mellas desplazadas, locus nativo
La figura 20A-B muestra los datos relacionados con mellas desplazadas. En el contexto de la edición del genoma, se crearon mellas desplazadas para generar DSB. Una gran mayoría de mellas no dan como resultado indeles mediados por unión de extremos no homólogos (NHEJ, non-homologous end joining) y, por tanto, cuando se inducen mellas desplazadas, los eventos de mellas simples fuera de la diana probablemente darán como resultado tasas de indel muy bajas. La inducción de mellas desplazadas para generar DSB es eficaz para inducir la interrupción del gen tanto en los loci indicadores integrados como en el locus genómico AAVS1 nativo. Figura 20A: Se estableció como diana el locus AAVS1 nativo con 8 ARNg que cubrían un tramo de ADN de 200 pb: 4 dirigidos a la cadena con sentido (s1-4) como diana y 4 a la cadena antisentido (as1-4) como diana. Utilizando el mutante Cas9D10A, que mella la cadena complementaria, se utilizaron diferentes combinaciones bidireccionales de los ARNg para inducir un rango de salientes en 5' o 3' programados. Figura 20B: Utilizando un ensayo basado en la secuenciación de Sanger, se observó que mientras que los ARNg simples no inducían eventos detectables de NHEJ, la inducción de mellas desplazadas para generar DSB es muy eficaz para inducir la interrupción de genes. En particular, las mellas desplazadas que conducen a salientes en 5' dan como resultado más eventos de NHEJ en lugar de salientes en 3'. El número de clones de secuenciación de Sanger se resalta por encima de las barras, y las longitudes previstas de los salientes se indican debajo de las leyendas correspondientes del eje x.
EJEMPLO XIV
Mellas desplazadas, perfiles de NHEJ
La figura 21A-C está dirigida a mellas desplazadas y a perfiles de NHEJ. Se muestran los resultados representativos de la secuenciación de Sanger de tres combinaciones diferentes de mellas desplazadas con las posiciones de los ARNg de dirección a diana resaltados por cajas. Además, según el modelo estándar para la reparación mediada por recombinación homóloga (HR), la ingeniería de salientes en 5' a través de mellas desplazadas generó eventos de NHEJ más robustos que los salientes en 3' (figura 3B). Además de una estimulación de NHEJ, se observó una inducción robusta de HR cuando se crearon los salientes en 5'. La generación de salientes en 3' no dio como resultado una mejora de las tasas de HR (figura 3C).
EJEMPLO XV
Tabla 1
Dianas de ARNg para la regulación de genes endógenos
Se enumeran las dianas en los promotores REX1, OCT4, SOX2 y NANOG utilizados en los experimentos de activación mediados por Cas9-ARNg.
NombredeARNg DianadeARNg
REXl 1 ctggcggatcactcgcggtt agg
REX1 2 ccteggcctccaaaagtgct agg
REXl 3 acgctgattcctgcagatca g g g
REXl 4 ccaggaatacgtatccacca g g g
REXl 5 : gccacacccaagcgatcaaa tgg
REXl 6 aaataatacattctaaggta agg
REXl 7 gctactggggaggctgaggc agg
REXl 8 tagcaaracagtcacattaa tgg
REXl 9 ctcatgcgatccccccgtct cgg
REXl 10 ccgggcagagagtgaacgcg cgg
OCT4 1 ttccttccctctcccgtgct tgg
OCT4 2 tctctgcaaagcccctggag agg
OCT4 3 aatgcagttgccgagtgcag tgg
OCT4 4 ■cctcagcctcctaaagtgct ggg
OCT45 gagtccaaatcctctttact agg
OCT46 gagtgtetggatttgggata agg
OCT47 cagcacctcatctcccagtg agg
OCT48 tctaaaacccagggaatcat g g g
OCT49 cacaaggcagccagggatcc agg
OCT410 gatggcaagctgagaaacac tgg
OCT411 tgaaatgcacgcatacaatt agg
OCT4 12 ccagtccagacctggccttc tgg
OCT413 cccagaaaaacagaccctga agg
OCT414 aagggttgagcacttgttta gg g
OCT415 atgtctgagttttggttgag agg
OCT416 ggtcccttgaaggggaagta g g g
OCT417 ■fcggcagtctactcttgaaga tgg
OCT4 18 ggcacagtgccagaggtctg tgg
OCT4 19 taaaaataaaaaaactaaca ggg
OCT420 tctgfcgggggacctgcactg agg
OCT421 qqccagagqtcaaggctagt g g g
SOX2 1 cacgaccgaaacccttctta cgg
SOX2 2 gttgaatgaagacagtctag tgg
SOX2 3 taagaacagagcaagttacg tgg
30X2 4 tgtaaggtaagagaggagag cgg
SOX2 5 tgacacaccaactcctgcac tgg
30X2 6 tttacccacttccttcgaaa agg
SOX2 7 gtggctggcaggctggctct gg g
SOX2 8 ctcccccggcctcccccgcg cgg
SOX2 9 caaaacccggcagcgaggct ggg
SOX2 10 aggagccgccgcgcgctgat tgg
NñNCG 1 cacacacacccacacgagat gg g
NANOG 2 gaagaagctaaagagccaga gg g
NANOG 3 atgagaatttcaataacctc agg
NANOG 4 tcccgctctgttgcccaggc tgg
NANOG 5 cagacacccaccaecatgcg tgg
NANOG 6 tcccaatttactgggattac agg
NANOG 7 tgatttaaaagttggaaacg tgg
NANOG 8 tetagttccccacctagtct gg g
NANOG 9 gattaactgagaattcacaa g gg
NANOG 10 cgccaggaggggtgggtcta agg
EJEMPLO XVI
Tabla 2
Resumen del análisis estadístico de los datos de especificidad de Cas9-ARNg y TALE Tabla 2(a) Valores P para comparaciones de niveles de expresión normalizados de activadores TALE o Cas9-VP64 que se unen a secuencias diana con números particulares de mutaciones del sitio diana. Los niveles de expresión normalizados se han indicado mediante diagramas de caja en las figuras indicadas en la columna Figura, donde las cajas representan las distribuciones de estos niveles por números de apareamientos incorrectos del sitio diana. Los valores P se calcularon utilizando pruebas t para cada par consecutivo de números de apareamientos incorrectos en cada diagrama de caja, donde las pruebas t eran pruebas t de una o dos muestras (véase Procedimientos). La significación estadística se evaluó utilizando umbrales de valor P corregidos por Bonferroni, donde la corrección se basó en el número de comparaciones dentro de cada diagrama de caja. Los símbolos de significación estadística son: *** para P < 0,0005/n, ** para P < 0,005/n, * para P < 0,05/n y N.S. (no significativo) para P>= 0,05/n, donde n es el número de comparaciones. Tabla 2(b) Caracterización estadística de la región semilla en la figura 2D: log10(valores P) que indican el grado de separación entre los valores de expresión para la unión de Cas9N VP64+ARNg a las secuencias diana con dos mutaciones para aquellos pares de posición mutados dentro de las regiones semilla candidatas en el extremo 3' del sitio diana de 20 pb frente a todos los demás pares de posiciones. La mayor separación, indicada por el mayor -log10 (valores P) (resaltado arriba), se encuentra en los últimos 8-9 pb del sitio diana. Estas posiciones se pueden interpretar como que indican el comienzo de la región "semilla" de este sitio diana. Véase la sección "Caracterización estadística de la región semilla" en Procedimientos para obtener información sobre cómo se calcularon los valores P.
Figure imgf000021_0001
EJEMPLO XVII
Secuencias de proteínas y ARN en los ejemplos.
A. Las secuencias de las construcciones del activador Cas9N-VP64 basadas en el mutante m4 se muestran a continuación. Se construyeron tres versiones con los formatos de proteína de fusión Cas9m4VP64 y Cas9m4VP64N que mostraron la mayor actividad. También se construyeron los vectores correspondientes para los mutantes m3 y m2 (figura 4A) (los dominios NLS y VP64 están resaltados).
>Cas9m4VP64 gccaccATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGCTATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGG GCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAAT ACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGG AGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAA AGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGA CTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAG CGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAA CCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTT GATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGG GACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTT ACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAA TCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCC TGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACC CCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAG ACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGA
TGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATG AGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAA GTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGC GGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGAC GGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGC ACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCC TCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGA AAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAG ATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAA GTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATA AAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCAC AGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGC ATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGG AAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACT CTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGA TCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACAT TCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAA CGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGC GCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACA AGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAA CTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCA CAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCC CAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAG TAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAA CTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGT ATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTT CAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGAT CAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGCTGCTATCGTGCCCCAGT CTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAgcTAGA GGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGG CGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAG GCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTG TTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACAC CAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCT AAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACA ATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAA AAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTT AGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTC
TTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACA AGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGT TAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAG GAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGG ATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGG AAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGA TCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTC AAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCC GGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGC CCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCT CCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGAT GAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAAC CTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGG CAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAA GTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGA CGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCT CAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGAGGCCAG
GCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACCT CGACATGCTCGGCAGTGACGCCCTTGATGATTTCGACCTGGACATGCTGATTAACTCT AGATGA
Secuencias >Cas9m4VP64N gccaccATGCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGAAGGGGGATGGACAAGAAGTACTCCA TTGGGCTCGCTATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAA GGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAA GAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTC AAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAG GAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGG AGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATAT CGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAA GCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCAT ATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGC GATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGA ACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAA ATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCT GTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCG ACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCG
CCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAA GCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTT TGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGA TCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATT TTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTA AAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATC CCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCT ACCC CTTTTTGA A AGAT AAC AGGGA A A AGATTGAGA A A ATC CTC AC ATTT C GGAT AC C CTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAA TCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCT GCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGG TGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAG GTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAG AAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCA AAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGA GGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGAC AAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCC TTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCT CTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCG GCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCT GGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATG ACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAG TCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTG CAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAG AATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAAC AGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAAT CCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTAC TACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTC TCCGACTACGACGTGGCTGCTATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGA TAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAgcTAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCA GAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTG ATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGT TGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGC ACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACT GATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAG GACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCT ACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGA ATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAG
TCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAA CAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCC GGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCG GAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCAC GCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTA CAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGT CAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCAT CGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTT CCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGG GCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTA TCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCA GCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGA ATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTAC AATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTT ACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACA GAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAAT TACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCT GACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGAGGCCAGCGGTTCCGGACGGGCTGACGCATTG GACGATTTTGATCTGGATATGCTGGGAAGTGACGCCCTCGATGATTTTGACCTTGACA TGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACCTCGACATGCTCGGCAGTGACGCCCTT GATGATTTCGACCTGGACATGCTGATTAACTCTAGATGA
>Cas9m4VP64C gccaccATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGCTATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGG GCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAAT ACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGG AGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAA AGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGA
CGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAA CCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTT GATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGG GACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTT ACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAA TCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCC TGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACC CCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAG ACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGA TGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATG AGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAA GTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGC GGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGAC GGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGC ACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCC TCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGA AAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAG ATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAA GTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATA AAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCAC AGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGC ATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGG AAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACT CTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGA TCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACAT TCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAA CGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGC GCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACA AGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAA CTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCA CAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCC CAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAG TAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAA CTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGT ATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTT CAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGAT CAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGCTGCTATCGTGCCCCAGT CTTTTCTC A AAGATGATTCT ATTG ATA ATA A AGTGTTG AC A AGATCCGATA A AgcT AGA GGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGG CGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAG GCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTG TTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACAC CAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCT AAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACA ATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAA AAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTT AGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTC
TTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACA AGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGT TAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAG GAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGG ATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGG AAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGA TCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTC AAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCC GGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGC CCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCT CCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGAT GAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAAC CTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGG CAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAA GTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGA CGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCT CAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGAGGCCAG CGGTTCCGGACGGGCTGACGCATTGGACGATTTTGATCTGGATATGCTGGGAAGTGAC GCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACCT CGACATGCTCGGCAGTGACGCCCTTGATGATTTCGACCTGGACATGCTGATTAACTCT AGAGCGGCCGCAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAA GGTAG ATC CA AA AA AGAA G AGAAAGGTAG AT ACGGC CGC ATAG
B. A continuación se proporcionan las secuencias de las construcciones del activador de MS2 y el vector principal de ARNg correspondiente con dominios de aptámero 2X MS2 (NLS, VP64, espaciador de ARNg y dominios de bucle de tallo de ARN de unión a MS2 están resaltados). Se construyeron dos versiones de la primera con el formato de proteína de fusión MS2v p 64N que muestra la mayor actividad.
>MS2v P64N gccaccATGGGACCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGGCGGCCGCTTCTAGAATGGCTTCTAA CTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCA AGCAACTTCGCTAACGGGATCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTT ACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAA AGTCGAGGTGCCTAAAGGCGCCTGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCA ATTTTCGCCACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAA AAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACGAGGCCA GCGG nCCG G ACGGGCTGACGCATTGGACG ATTTTGATCTGG ATATGCTGGG AAGTG A
CGCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACC TCGACATGCTCGGCAGTGACGCCC TTGATGATTTC GACCTGGACATGCTGATTAACTCT AGATGA
>MS2v P64N
gccaccATGGGACCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGGCGGCCGCTTCTAGAATGGCTTCTAA CTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCA AGCAACTTCGCTAACGGGATCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTT ACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAA AGTCGAGGTGCCTAAAGGCGCCTGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCA ATTTTCGCCACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAA AAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACGAGGCCA GCGGTTCCGGACGGGCTGACGCATTGGACGATTTTGATCTGGATATGCTGGGAAGTGA CGCCCTCGATGATTTTGACCTTGACATGCTTGGTTCGGATGCCCTTGATGACTTTGACC TCGACATGCTCGGCAGTGACGCCCTTGATGATTTCGACCTGGACATGCTGATTAACTCT AGAGCGGCCGCAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAA GGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATACGGCCGCATAG
>ARNg2XMS2 TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAG GTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACA AGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACA AAATACGTGACGT AGAAAGT AATAATTTCTTGGGTAGTTTGC AGTTTT AAAATTATGTT TTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTA TATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGNNNlsiNNNNNNNNNMNNNNNNGTTTTAGAG CTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACC GAGTCGGTGCTCTGCAGGTCGACTCTAGAA \ C ATGAGGATC/ CCCATGTC TGCAGTA TTCCCGGGTTCATTAGATCCTAAGGTACCTAATTGCCTAGAAAACATGAi ¡GATCACí <
C. Las secuencias de indicador de activación de la transcripción basadas en fluorescencia de dTomato se enumeran a continuación (las secuencias de la diana de TF de control ISceI, las dianas de ARNg, el promotor minCMV y la etiqueta FLAG de dTomato están resaltadas).
>Indicador 1 de TF
y .a ;< cías a \< a g g g 'i a \ a g t g t c c c c t c c a c c c í 'a c a g t g g g g c g a g g t a g g c c í t g TACGGTGGGAGC íCCTATATAAC iC 'AGAGCT CGTTTAG’T GAACCG7 CAGATCGCCTGGAG AATTCgccaccatgGACTACAAGGATGACGACGATAAAACTTCCGGTGGCGGACTGGGTTC CA C(’Ci’l ( jAGCAAGGGCCrAGGAGGl’( ATí AAAÍJAGTTCATGCGí 'TTCA AGGTí JCGC,AT GGAGGGCTCCATGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCC CTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTT CGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCAC CCCGCCGACATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGC GCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCA GGACGGCACGCTGATCTACAAGGTGAAGATGCGCGGCACCAACTTCCCCCCCGACGG CCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCC
c c g c g a c g g c g t g c t g a a g g g c g a g a t c :c a c c a g g c c c t g a a g c t g a a g g a c g g c :g g CCACTACCTGGTGGAGTTCAAGACCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACTGCCC GGCTACTACTACGTGGACACCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCA TCGTGGAACAGTACGAGCGCTCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTACGGCATCÍGA CGAGCTGTACAAGT AA
>Indicador 2 de TF
IAG f >( íATAACAGGC i A AIAGTGGGGCC ACTAí í GGACA G( j A7TGGCGAGGT AGGCGTG TACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTrTAGTGAACCGTCAGATCG( CTGGAG AATTCgccaccatgGACTACAAGGATGAC(3ACGATAAAACTTCCGGTGGCGGACTGGGTTC CACCCiTGAGCAAGGGCGAGGAGGTCATCAAAGAGrrCATGCGCTTCAAGGTGCGCAT GGAGGG CTCCATGA A CGGCCA CGAGTTCG AG ATCG AGGGCGAGGGC'GAGGGCC'GCCC C TACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACC AAGGGCGGCCCC CTGCCCTT C GCCTGGGAt ATCCTGTÍ CC( CCAGTTCATGTACGGCTC(‘’AAGGCGT \CGTGAAGCA( ( CCGC CGACATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCC "TTCCO GAGGGC1TCAAGTGGGAGC GCGTGATGA A( ITCGAGG.\CGC1-CGGTCTG<i FGAÍ:CG1 GACCCAGí iACTCÍ T ( í ’CTGCA GGACGC iC ACGCTGATC' IAC AAGGTC i A AGATG CGCGC íC ACCA A C I TC CCC< '‘CCGAC :GG (C C CG IA ATGCAGAAGAAGAC'CAlGGGCTGGGAGGCCTCCAf CGAGCGCCTGTACCC C CGCGACGGCC. rGCTGAAGGGCGAGATCCAC CAGGC*C CTGAAGCTGAAGGAC GGCGG C'CACTACCTGGTGGAGTTCAAGACCATCTACATGGCCAAGAACiCCCGTGCAACyGCCC CiCíCTACTACTACGTGGACACCAACiCTGGACATCACCTCCCACAACGACKrACTACACCA TCGTGGAACAGTACGAGCGCTCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTACGGCATGGA CGAGCTGTACAAGT AA

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento in vitro o ex vivo para alterar un ácido nucleico diana de ADN de doble cadena en una célula que comprende
introducir en la célula un primer ácido nucleico extraño que codifica dos o más ARN guía, teniendo cada ARN guía una secuencia de espaciador, una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr, e hibridándose una porción de la secuencia tracr con la secuencia pareja de tracr y estando la secuencia pareja de tracr unida por una secuencia de ácido nucleico enlazador y siendo cada secuencia de espaciador complementaria a un sitio adyacente en el ácido nucleico diana de ADN,
introducir en la célula un segundo ácido nucleico extraño que codifica, como mínimo, una proteína nickasa Cas9 que tiene un dominio de nucleasa inactivo y que está guiada por los dos o más ARN guía, y
en el que los dos o más ARN guía y la, como mínimo, una proteína nickasa Cas9 se expresan y en el que la, como mínimo, una proteína nickasa Cas9 se colocaliza con dos de los dos o más ARN al ácido nucleico diana de ADN y mella el ácido nucleico diana de ADN dando como resultado dos mellas adyacentes, en el que las dos mellas adyacentes están en cadenas diferentes del ADN de doble cadena y crean una ruptura de doble cadena.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que las dos mellas adyacentes sobre cadenas diferentes del ADN de doble cadena dan como resultado una unión de extremos no homólogos.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que las dos mellas adyacentes sobre cadenas diferentes del ADN de doble cadena están desplazadas entre sí.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que las dos mellas adyacentes sobre cadenas diferentes del ADN de doble cadena están desplazadas entre sí y dan como resultado una unión de extremos no homólogos.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1, que incluye, además, introducir en la célula una secuencia de ácido nucleico donante en el que las dos mellas dan como resultado una recombinación homóloga del ácido nucleico diana con la secuencia de ácido nucleico donante.
6. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dos ARN guía se colocalizan con la proteína nickasa Cas9 al ácido nucleico diana de ADN, lo que da como resultado una mella desplazada con salientes en 5', y
en el que se introduce una secuencia de ácido nucleico donante en la célula y la secuencia de ácido nucleico donante se inserta en el ácido nucleico diana en la mella desplazada mediante recombinación homóloga.
7. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la célula es una célula eucariota.
8. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que:
i) la célula es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal;
ii) el ARN guía incluye entre 10 y 500 nucleótidos;
iii) el ARN guía incluye entre 20 y 100 nucleótidos;
iv) el ácido nucleico diana está asociado con una enfermedad o trastorno perjudicial;
v) el ARN guía es una fusión ARNtracr-ARNcr; o
vi) el ácido nucleico diana de ADN es ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno.
9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la secuencia tracr incluye entre 100 y 500 nucleótidos.
10. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que las dos mellas adyacentes dan como resultado la fragmentación del ácido nucleico diana impidiendo así la expresión del ácido nucleico diana.
11. Célula que comprende
un primer ácido nucleico extraño que codifica dos o más ARN guía, teniendo cada ARN guía una secuencia de espaciador, una secuencia pareja de tracr y una secuencia tracr, e hibridándose una porción de la secuencia tracr con la secuencia pareja de tracr y estando la secuencia pareja de tracr y la secuencia tracr unidas por una secuencia de ácido nucleico enlazador y siendo cada secuencia de espaciador complementaria a un sitio adyacente en un ácido nucleico diana de ADN de doble cadena, y
un segundo ácido nucleico extraño que codifica, como mínimo, una proteína nickasa Cas9 que tiene un dominio de nucleasa inactivo, y en la que dos de los dos o más ARN guía y la, como mínimo, una proteína nickasa Cas9 son miembros de un complejo de colocalización para el ácido nucleico diana de ADN, en la que el complejo de colocalización puede mellar el ácido nucleico diana de ADN dando como resultado dos mellas adyacentes sobre cadenas diferentes del ADN de doble cadena y crear una ruptura de doble cadena.
12. Célula, según la reivindicación 11, en la que la célula es una célula eucariota.
13. Célula, según la reivindicación 11, en la que:
i) la célula es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal;
ii) el ARN guía incluye entre 10 y 500 nucleótidos;
iii) el ARN guía incluye entre 20 y 100 nucleótidos;
iv) el ácido nucleico diana está asociado con una enfermedad o trastorno perjudicial;
v) el ARN guía es una fusión ARNtracr-ARNcr; o
vi) el ácido nucleico diana de ADN es ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno.
ES19197844T 2013-06-04 2014-06-04 Regulación de la transcripción guiada por ARN Active ES2930537T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361830787P 2013-06-04 2013-06-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2930537T3 true ES2930537T3 (es) 2022-12-16

Family

ID=52008736

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19197844T Active ES2930537T3 (es) 2013-06-04 2014-06-04 Regulación de la transcripción guiada por ARN

Country Status (15)

Country Link
US (2) US11981917B2 (es)
EP (3) EP3003392B1 (es)
JP (5) JP6621738B2 (es)
KR (3) KR102282990B1 (es)
CN (2) CN113846096A (es)
AU (3) AU2014274939B2 (es)
BR (1) BR112015030491A8 (es)
CA (2) CA2914638A1 (es)
ES (1) ES2930537T3 (es)
IL (3) IL284773B2 (es)
MX (2) MX2015016798A (es)
MY (2) MY197877A (es)
RU (2) RU2756865C2 (es)
SG (3) SG10201913068PA (es)
WO (1) WO2014197568A2 (es)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
CN110643600A (zh) * 2012-10-23 2020-01-03 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna的***及其用途
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
MX2015007550A (es) 2012-12-12 2017-02-02 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas.
EP3553174A1 (en) * 2012-12-17 2019-10-16 President and Fellows of Harvard College Rna-guided human genome engineering
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
KR102282990B1 (ko) 2013-06-04 2021-07-28 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
JP6702858B2 (ja) 2013-06-17 2020-06-03 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ウイルス成分を使用して障害および疾患をターゲティングするためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系および組成物の送達、使用および治療上の適用
EP4245853A3 (en) * 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
EP3011029B1 (en) 2013-06-17 2019-12-11 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
AU2014281028B2 (en) 2013-06-17 2020-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Delivery and use of the CRISPR-Cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
ES2681622T3 (es) * 2013-09-18 2018-09-14 Kymab Limited Métodos, células y organismos
US9834791B2 (en) 2013-11-07 2017-12-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
CN111206032A (zh) 2013-12-12 2020-05-29 布罗德研究所有限公司 用于基因组编辑的crispr-cas***和组合物的递送、用途和治疗应用
SG10201804973TA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Compositions and Methods of Use of Crispr-Cas Systems in Nucleotide Repeat Disorders
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
DK3116997T3 (da) 2014-03-10 2019-08-19 Editas Medicine Inc Crispr/cas-relaterede fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af lebers kongenitale amaurose 10 (lca10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US10323073B2 (en) 2014-03-20 2019-06-18 UNIVERSITé LAVAL CRISPR-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof
US11242525B2 (en) 2014-03-26 2022-02-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating sickle cell disease
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
NZ728437A (en) 2014-08-27 2018-02-23 Caribou Biosciences Inc Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
JP7068821B2 (ja) 2014-12-03 2022-05-17 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するガイドｒｎａ
WO2016094867A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016094874A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
AU2016246450B2 (en) 2015-04-06 2022-03-17 Agilent Technologies, Inc. Chemically modified guide RNAs for CRISPR/Cas-mediated gene regulation
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
AU2016253150B2 (en) 2015-04-24 2022-04-21 Editas Medicine, Inc. Evaluation of Cas9 molecule/guide RNA molecule complexes
EP3294896A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
AU2016276702B2 (en) 2015-06-09 2022-07-28 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for improving transplantation
US9790490B2 (en) * 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
CN108290933A (zh) 2015-06-18 2018-07-17 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
US10648020B2 (en) 2015-06-18 2020-05-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
AU2016326711B2 (en) 2015-09-24 2022-11-03 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve CRISPR/Cas-mediated genome editing
CN108513575A (zh) 2015-10-23 2018-09-07 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器及其用途
GB2559526B (en) 2015-11-03 2021-02-17 Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US20190264186A1 (en) * 2016-01-22 2019-08-29 The Broad Institute Inc. Crystal structure of crispr cpf1
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
CN116200465A (zh) 2016-04-25 2023-06-02 哈佛学院董事及会员团体 用于原位分子检测的杂交链反应方法
EP3604527B1 (en) * 2016-06-02 2021-05-12 Sigma-Aldrich Co., LLC Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
WO2017216771A2 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Genesis Technologies Limited Crispr-cas system, materials and methods
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
SG11201908658TA (en) 2017-03-23 2019-10-30 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
AU2017407272B2 (en) * 2017-03-30 2024-06-13 Kyoto University Method for inducing exon skipping by genome editing
WO2018201086A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2018227114A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Editas Medicine, Inc. Engineered cas9 nucleases
CN107266583B (zh) * 2017-06-27 2021-02-09 深圳大学 一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的方法
EP3652312A1 (en) 2017-07-14 2020-05-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
CA3089331A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
GB201813011D0 (en) 2018-08-10 2018-09-26 Vib Vzw Means and methods for drought tolerance in crops
DE112020001342T5 (de) 2019-03-19 2022-01-13 President and Fellows of Harvard College Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
WO2023039586A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing

Family Cites Families (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4123610A (en) 1977-03-09 1978-10-31 The United States Government Nucleic acid crosslinking agent and affinity inactivation of nucleic acids therewith
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US4981985A (en) 1987-10-20 1991-01-01 Trustees Of The University Of Pennsylvania Synthesis of photolabile chelators for multivalent cations
US4844617A (en) 1988-01-20 1989-07-04 Tencor Instruments Confocal measuring microscope with automatic focusing
US5151189A (en) 1990-09-17 1992-09-29 Gelman Sciences, Inc. Cationic charge modified microporous membrane
WO1993016176A1 (en) 1992-02-13 1993-08-19 Bio-Metric Systems, Inc. Immobilization of chemical species in crosslinked matrices
US5594235A (en) 1993-06-17 1997-01-14 Ultrapointe Corporation Automated surface acquisition for a confocal microscope
US5578832A (en) 1994-09-02 1996-11-26 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
SE9400522D0 (sv) 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5830708A (en) 1995-06-06 1998-11-03 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods for production of a naturally secreted extracellular matrix
US6284284B1 (en) 1995-06-06 2001-09-04 Advanced Tissue Sciences, Inc. Compositions and methods for production and use of an injectable naturally secreted extracellular matrix
CN1195872C (zh) 1996-06-06 2005-04-06 林克斯治疗公司 通过连接经编码的衔接子进行测序
US5948617A (en) 1997-06-13 1999-09-07 Biospeparations, Inc. Methods of in situ hybridization
US6083726A (en) 1998-02-03 2000-07-04 Lucent Technologies, Inc. Methods for polynucleotide synthesis and articles for polynucleotide hybridization
ATE423314T1 (de) 1998-06-24 2009-03-15 Illumina Inc Dekodierung von matrixartig-angeordneten sensoren durch mikropartikel
WO2000050642A1 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Caliper Technologies Corp. Sequencing by incorporation
US6534266B1 (en) 1999-04-22 2003-03-18 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Assay of transcription sites by multi-fluor fish
US20020015952A1 (en) 1999-07-30 2002-02-07 Anderson Norman G. Microarrays and their manufacture by slicing
AU8015300A (en) 1999-10-12 2001-04-23 Ohio State University, The Reactive polymeric valve, dispensing devices and methods using same
WO2001037266A1 (en) 1999-11-17 2001-05-25 The Research Foundation Of State University Of New York Three dimensional data storage device and method for reading
EP1263773A4 (en) 2000-03-14 2005-08-31 Active Motif OLIGONUCLEOTIDE ANALOGUES, METHODS OF SYNTHESIS AND METHODS OF IMPLEMENTATION
ATE364722T1 (de) 2000-06-02 2007-07-15 Bayer Corp Verfahren zum nachweis und zur lokalisierung von genen in situ durch hybridisierung einer verzweigten dna
AU3090102A (en) 2000-12-14 2002-06-24 Gen Probe Inc Method and kit for enhancing the association rates of polynucleotides
EP2801624B1 (en) 2001-03-16 2019-03-06 Singular Bio, Inc Arrays and methods of use
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
US20060248349A1 (en) 2001-09-24 2006-11-02 Rathjen Alicemarie G Method for preparing and using personal and genetic profiles
WO2003031591A2 (en) 2001-10-10 2003-04-17 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
GB2382137A (en) 2001-11-20 2003-05-21 Mats Gullberg Nucleic acid enrichment
US20090246879A1 (en) 2002-12-20 2009-10-01 Callida Genomics Materials and Methods Relating to Nano-Tags and Nano-Brands
EP1590477B1 (en) 2003-01-29 2009-07-29 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US8105771B2 (en) 2003-02-26 2012-01-31 Callida Genomics, Inc. Random array DNA analysis by hybridization
CN102135661B (zh) 2003-05-20 2014-06-04 卢西德有限公司 用于对患者身体所选位置进行成像的共焦显微镜
US7255994B2 (en) 2003-06-10 2007-08-14 Applera Corporation Ligation assay
US7193054B2 (en) 2003-08-26 2007-03-20 University Of Rochester Nanofabrication using actin filaments
WO2005049851A2 (en) 2003-11-14 2005-06-02 University Of Utah Research Foundation Methods, articles, and compositions for identifying oligonucleotides
US7381529B2 (en) 2003-12-31 2008-06-03 Intel Corporation Methods and compositions for detecting nucleic acids using scanning probe microscopy and nanocodes
JP2007526772A (ja) 2004-02-27 2007-09-20 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ インサイチュー配列決定用ポロニー蛍光ビーズ
US20050191687A1 (en) 2004-02-27 2005-09-01 Tianxin Wang Method for multiplexed analyte detection
WO2006076017A2 (en) 2004-04-30 2006-07-20 Applera Corporation Methods and kits for identifying target nucleotides in mixed populations
US20060024711A1 (en) 2004-07-02 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for nucleic acid amplification and sequence determination
US7253947B2 (en) 2004-10-07 2007-08-07 New York University Portable automated confocal microscope
KR101176245B1 (ko) * 2004-11-09 2012-08-22 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 ＨＩＦ－１ａ 발현의 억제를 위한 효능적 ＬＮＡ 올리고뉴클레오티드
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
ITRM20050068A1 (it) 2005-02-17 2006-08-18 Istituto Naz Per Le Malattie I Metodo per la rivelazione di acidi nucleici di agenti patogeni batterici o di parassiti nelle urine.
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
US20060234261A1 (en) 2005-03-08 2006-10-19 Pierce Niles A Colorimetric readout of hybridization chain reaction
US20070020650A1 (en) 2005-04-01 2007-01-25 Avak Kahvejian Methods for detecting proteins
AU2006336403A1 (en) 2005-04-08 2007-08-02 Mycosol, Inc. Stilbazium research assays
EP1910537A1 (en) 2005-06-06 2008-04-16 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
US7842793B2 (en) 2005-06-14 2010-11-30 The California Institute Of Technology Methods of making nucleic acid nanostructures
EP1907571B1 (en) 2005-06-15 2017-04-26 Complete Genomics Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
CN104673903B (zh) 2005-06-20 2018-11-13 领先细胞医疗诊断有限公司 检测单个细胞中的核酸和鉴定异质大细胞群中罕见细胞的方法
US8486621B2 (en) 2005-08-11 2013-07-16 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid-based matrixes
US20100015607A1 (en) 2005-12-23 2010-01-21 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
US7864996B2 (en) 2006-02-17 2011-01-04 Lucid, Inc. System for macroscopic and confocal imaging of tissue
US20090220968A1 (en) 2006-03-10 2009-09-03 President And Fellows Of Harvard College Methods and Apparatus for Near Field Irradiation
GB0605584D0 (en) 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
US20070231823A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Mckernan Kevin J Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing
US8975216B2 (en) 2006-03-30 2015-03-10 Pacific Biosciences Of California Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same
US8241573B2 (en) 2006-03-31 2012-08-14 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
CA2649725A1 (en) 2006-04-19 2007-10-25 Applera Corporation Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing
US7964347B2 (en) 2006-06-15 2011-06-21 Krassen Dimitrov Labels for electronic detection of individual molecules and methods for their detection
EP2057435A4 (en) 2006-06-23 2011-04-20 Life Technologies Corp SYSTEMS AND METHOD FOR COOLING IN DEVICES FOR BIOLOGICAL ANALYSIS
US7745129B1 (en) 2006-07-12 2010-06-29 Kenneth David Schatz Methods for sequencing of a necleic acid
US20100009868A1 (en) 2006-09-11 2010-01-14 The Arizona Board of Regents a body corporate acti ng for and behalf of Arizona State university Self-Assembled Combinatorial Encoding Nanoarrays for Multiplexed Biosensing
US20090208965A1 (en) 2006-10-25 2009-08-20 Ikonisys, Inc. Automated method for detecting cancers and high grade hyperplasias
US9201063B2 (en) 2006-11-16 2015-12-01 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
GB2457402B (en) 2006-12-01 2011-10-19 Univ Columbia Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US20080269068A1 (en) 2007-02-06 2008-10-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplex decoding of sequence tags in barcodes
DK2126130T3 (en) 2007-03-02 2015-06-29 Dupont Nutrition Biosci Aps CULTURES WITH IMPROVED phage resistance
US8145677B2 (en) 2007-03-27 2012-03-27 Faleh Jassem Al-Shameri Automated generation of metadata for mining image and text data
EP2155770B1 (en) 2007-05-16 2013-10-16 California Institute of Technology A versatile nucleic acid hairpin motif for programming biomolecular self-assembly pathways
ES2559313T3 (es) 2007-06-19 2016-02-11 Stratos Genomics Inc. Secuenciación de ácidos nucleicos de alto rendimiento por expansión
WO2009018576A1 (en) 2007-08-02 2009-02-05 Biodesic Compositions and methods for analyte detection and quantitation
JP2010539982A (ja) 2007-10-01 2010-12-24 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー チェイスライゲーション配列決定法
CA2701726A1 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Halcyon Molecular Sequencing nucleic acid polymers with electron microscopy
US20090139311A1 (en) 2007-10-05 2009-06-04 Applied Biosystems Inc. Biological Analysis Systems, Devices, and Methods
WO2009065093A2 (en) 2007-11-17 2009-05-22 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Use of stem cells for wound healing
CN101586150B (zh) 2008-05-23 2016-09-28 陕西佰美基因股份有限公司 检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途
WO2010011961A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
CN102171234A (zh) 2008-08-05 2011-08-31 康奈尔大学 光交联核酸水凝胶
CA2733609C (en) 2008-08-14 2018-03-06 Nanostring Technologies, Inc. Stable nanoreporters
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US20100087325A1 (en) 2008-10-07 2010-04-08 Illumina, Inc. Biological sample temperature control system and method
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
US8309306B2 (en) 2008-11-12 2012-11-13 Nodality, Inc. Detection composition
EP3587594B1 (en) 2008-12-19 2022-04-13 President and Fellows of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
JP4528345B2 (ja) 2009-01-28 2010-08-18 シャープ株式会社 動画再生装置、動画再生方法、動画再生方法をコンピュータで実現するためのプログラム及びそのプログラムを記録した記録媒体
FR2948475A1 (fr) 2009-07-24 2011-01-28 Bionext Procede de caracterisation d'objets tridimensionnels
US8431151B2 (en) 2009-08-06 2013-04-30 Syracuse University Antimicrobial nanostructured hydrogel web containing silver
AU2010306862B2 (en) 2009-10-13 2015-08-27 Bruker Spatial Biology, Inc. Protein detection via nanoreporters
CA2778249C (en) 2009-11-03 2018-12-04 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative nuclease protection sequencing (qnps)
US9089512B2 (en) 2009-12-18 2015-07-28 President And Fellows Of Harvard College Active scaffolds for on-demand drug and cell delivery
WO2011100617A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Life Technologies Corporation Nucleic acid, biomolecule and polymer identifier codes
WO2011112634A2 (en) 2010-03-08 2011-09-15 California Institute Of Technology Molecular indicia of cellular constituents and resolving the same by super-resolution technologies in single cells
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
GB201004292D0 (en) 2010-03-15 2010-04-28 Olink Ab Assay for localised detection of analytes
PL2556171T3 (pl) 2010-04-05 2016-04-29 Prognosys Biosciences Inc Oznaczenia biologiczne kodowane przestrzennie
EP2569425B1 (en) 2010-05-10 2016-07-06 The Regents of The University of California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
WO2011143583A1 (en) 2010-05-13 2011-11-17 Illumina, Inc. Binding assays for markers
HUE037359T2 (hu) 2010-07-09 2018-08-28 Cergentis B V A fontos V3-D genom-régió szekvenálási stratégiái
WO2012056440A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Nanodoc Ltd. COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING EXPRESSION BY A SPECIFIC ENDOGENOUS miRNA
WO2012058638A2 (en) 2010-10-29 2012-05-03 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid nanostructure barcode probes
US8859201B2 (en) 2010-11-16 2014-10-14 Nabsys, Inc. Methods for sequencing a biomolecule by detecting relative positions of hybridized probes
BR112013020773B1 (pt) 2011-02-15 2023-01-24 Leica Biosystems Newcastle Limited Método para a detecção localizada in situ de rna, método para a determinação da presença e da localização de uma sequência genética e método para a localização e/ou detecção in situ de um rna específico
JP5687514B2 (ja) 2011-02-17 2015-03-18 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸配列解析装置
EP2500436B1 (en) 2011-03-17 2016-05-25 Institut Pasteur Method, probe and kit for DNA in situ hybridation and use thereof
US20150086981A1 (en) 2011-05-04 2015-03-26 Genovoxx Gmbh Nucleoside-triphosphate conjugate and methods for the use thereof
US9617598B2 (en) 2011-05-27 2017-04-11 President And Fellows Of Harvard College Methods of amplifying whole genome of a single cell
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
PL222511B1 (pl) 2011-06-08 2016-08-31 Międzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komórkowej W Warszawie Endorybonukleazy dsRNA
CA2850509C (en) 2011-10-14 2023-08-01 President And Fellows Of Harvard College Sequencing by structure assembly
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
DK2836226T3 (en) 2012-02-24 2017-09-18 Hutchinson Fred Cancer Res COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TREATING HEMOGLOBINOPATHY
GB2504240B (en) 2012-02-27 2015-05-27 Cellular Res Inc Compositions and kits for molecular counting of nucleic acids
AU2013225950B2 (en) 2012-02-29 2018-02-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
DK3401400T3 (da) * 2012-05-25 2019-06-03 Univ California Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering
SG196730A1 (en) 2012-07-16 2014-02-13 Agency Science Tech & Res Methods for reading data from a storage medium using a reader and storage devices
US11225683B2 (en) 2012-07-20 2022-01-18 Lsi Medience Corporation Photocoupling method using probe containing photoresponsive nucleic acids
EP2880171B1 (en) 2012-08-03 2018-10-03 The Regents of The University of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
EP2885670B1 (en) 2012-08-15 2021-01-27 Lucid, Inc. Systems and methods for imaging tissue
CN102908119A (zh) 2012-09-26 2013-02-06 温州医学院眼视光研究院 一种共焦扫描成像***及其像差控制方法
CN110643600A (zh) * 2012-10-23 2020-01-03 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna的***及其用途
JP6620018B2 (ja) 2012-12-06 2019-12-11 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， ＬＬＣ Ｃｒｉｓｐｒに基づくゲノム修飾および制御
CN105658796B (zh) 2012-12-12 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分***、方法以及组合物
MX2015007550A (es) * 2012-12-12 2017-02-02 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas.
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
PT2896697E (pt) 2012-12-12 2015-12-31 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3553174A1 (en) 2012-12-17 2019-10-16 President and Fellows of Harvard College Rna-guided human genome engineering
CN113005148A (zh) 2013-01-16 2021-06-22 爱默蕾大学 Cas9-核酸复合物及其相关用途
US9411930B2 (en) 2013-02-01 2016-08-09 The Regents Of The University Of California Methods for genome assembly and haplotype phasing
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US9330295B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Brown University Spatial sequencing/gene expression camera
CA2907198C (en) 2013-03-15 2019-12-10 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
DK2992115T3 (da) 2013-04-30 2020-06-02 California Inst Of Techn Multipleksmærkning af molekyler ved stregkodning med sekventiel hybridisering
US10510435B2 (en) 2013-04-30 2019-12-17 California Institute Of Technology Error correction of multiplex imaging analysis by sequential hybridization
CA2913865C (en) * 2013-05-29 2022-07-19 Cellectis A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
KR102282990B1 (ko) 2013-06-04 2021-07-28 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3058091B1 (en) 2013-10-18 2020-03-25 The Broad Institute, Inc. Spatial and cellular mapping of biomolecules in situ by high-throughput sequencing
WO2015089473A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
GB201401885D0 (en) 2014-02-04 2014-03-19 Olink Ab Proximity assay with detection based on hybridisation chain reaction (HCR)
EP3108218A4 (en) 2014-02-21 2017-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Expansion microscopy
KR102105236B1 (ko) 2014-11-21 2020-04-28 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 무효소 및 무증폭 시퀀싱
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
ES2934982T3 (es) 2015-03-30 2023-02-28 Becton Dickinson Co Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios
GB2559526B (en) 2015-11-03 2021-02-17 Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US10386300B2 (en) 2015-12-21 2019-08-20 Verily Life Sciences Llc Spectrally and spatially multiplexed fluorescent probes for in situ cell labeling
WO2017161251A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 President And Fellows Of Harvard College Methods for detecting and identifying genomic nucleic acids
CA3029625A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 California Institute Of Technology Fractional initiator hybridization chain reaction
CN117551741A (zh) 2017-03-31 2024-02-13 乌尔蒂维尤股份有限公司 Dna-抗原交换和扩增

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021045153A (ja) 2021-03-25
SG11201509962QA (en) 2016-01-28
RU2015156198A (ru) 2017-07-14
NZ715280A (en) 2021-06-25
CA2914638A1 (en) 2014-12-11
BR112015030491A8 (pt) 2022-07-26
MY177814A (en) 2020-09-23
MY197877A (en) 2023-07-22
AU2020203977A1 (en) 2020-07-02
EP3603679A1 (en) 2020-02-05
RU2690935C2 (ru) 2019-06-06
RU2019114706A3 (es) 2020-09-25
BR112015030491A2 (pt) 2017-07-25
IL242959B (en) 2021-08-31
EP3003392A2 (en) 2016-04-13
KR102512979B1 (ko) 2023-03-22
JP2016521554A (ja) 2016-07-25
AU2014274939A1 (en) 2016-01-07
MX2021009672A (es) 2021-09-08
MX2015016798A (es) 2016-10-26
IL284773B1 (en) 2023-05-01
EP4159243A1 (en) 2023-04-05
IL284773B2 (en) 2023-09-01
KR20160014036A (ko) 2016-02-05
NZ753950A (en) 2021-09-24
US20230131972A1 (en) 2023-04-27
RU2015156198A3 (es) 2018-05-08
JP2022166077A (ja) 2022-11-01
JP6621738B2 (ja) 2019-12-18
JP2019122384A (ja) 2019-07-25
US20240175057A1 (en) 2024-05-30
NZ753951A (en) 2021-09-24
EP3003392B1 (en) 2019-10-23
AU2021221488B2 (en) 2024-03-28
CN113846096A (zh) 2021-12-28
AU2020203977B2 (en) 2021-05-27
US11981917B2 (en) 2024-05-14
EP3003392A4 (en) 2017-05-03
WO2014197568A2 (en) 2014-12-11
SG10201710030QA (en) 2018-01-30
SG10201913068PA (en) 2020-02-27
JP2024012387A (ja) 2024-01-30
IL284773A (en) 2021-08-31
RU2756865C2 (ru) 2021-10-06
CN105451778B (zh) 2021-08-03
WO2014197568A3 (en) 2015-03-12
AU2021221488A1 (en) 2021-09-16
CA3176690A1 (en) 2014-12-11
CN105451778A (zh) 2016-03-30
RU2019114706A (ru) 2019-10-11
KR20230042154A (ko) 2023-03-27
JP7119055B2 (ja) 2022-08-16
KR102282990B1 (ko) 2021-07-28
EP3603679B1 (en) 2022-08-10
JP7376650B2 (ja) 2023-11-08
AU2014274939B2 (en) 2020-03-19
KR20210095235A (ko) 2021-07-30
JP7036511B2 (ja) 2022-03-15
IL302205A (en) 2023-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2930537T3 (es) Regulación de la transcripción guiada por ARN
US10767194B2 (en) RNA-guided transcriptional regulation
AU2020200163C1 (en) Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing
NZ753950B2 (en) Rna-guided transcriptional regulation
NZ715280B2 (en) Rna-guided transcriptional regulation
NZ753951B2 (en) Rna-guided transcriptional regulation