ES2929010T3 - Conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende anticuerpo modificado - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a: un conjugado de anticuerpo-fármaco en el que un anticuerpo modificado, que contiene un motivo de una estructura específica en un extremo del anticuerpo, se acopla a un fármaco a través de un enlazador; y una composición que contiene el mismo y, específicamente, a: un conjugado de fármaco-anticuerpo modificado (mADC) que comprende un anticuerpo modificado acoplado al extremo C-terminal de la cadena pesada o cadena ligera para tener un rendimiento de conjugación de fármaco notablemente mayor; y una composición que contiene el mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende anticuerpo modificado
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco en el que un anticuerpo modificado que comprende un motivo que tiene una estructura específica al final del anticuerpo se conjuga con un fármaco a través de un enlazador, y una composición que comprende el mismo, y más particularmente a un conjugado de anticuerpo modificado-fármaco (mADC, por sus siglas en inglés) que comprende un anticuerpo modificado que tiene un rendimiento de conjugación con fármaco significativamente mayor debido a un motivo unido al extremo carboxilo de cadena pesada o cadena ligera del anticuerpo, y a una composición que comprende el mismo.
Antecedentes de la técnica
Los fármacos que se usan en quimioterapias contra el cáncer con frecuencia muestran toxicidad, concretamente, toxicidad en la médula ósea, toxicidad en las mucosas y neurotoxicidad. Por tanto, se requiere crear agentes contra el cáncer que muestren especificidad para las células cancerosas al tiempo que muestran una fuerte actividad anticancerosa y son más seguros. Se han creado de diversas formas agentes contra el cáncer que tienen efectos secundarios reducidos al tiempo que actúan de manera específica sobre las células cancerosas.
En este sentido, actualmente se están estudiando agentes terapéuticos basados en anticuerpos que se unen específicamente a dianas, es decir, antígenos que se expresan de manera específica en enfermedades concretas, de manera más activa entre los biofarmacéuticos. En particular, se precisa para identificar antígenos relacionados con tumores que se expresan específicamente en la superficie de las células cancerosas. Hoy en día, se utilizan ampliamente métodos para diagnosticar y tratar tumores usando anticuerpos que se unen a estos antígenos para inhibir el crecimiento de células cancerosas o inducir la apoptosis, es decir, anticuerpos contra el cáncer, y sus perspectivas de futuro también son muy brillantes.
Aunque estos anticuerpos contra el cáncer tienen una especificidad de diana muy alta, sus efectos sobre la eliminación de células cancerosas son menores en muchos casos que los fármacos citotóxicos convencionales (agentes contra el cáncer), es decir, fármacos contra el cáncer. Por este motivo, en muchos casos, estos anticuerpos contra el cáncer se usan en terapia de combinación con fármacos citotóxicos y otros fármacos para inhibir el crecimiento de células cancerosas. Los fármacos contra el cáncer muestran una citotoxicidad significativamente mayor que los anticuerpos contra el cáncer, pero tienen un bajo nivel de especificidad de diana para las células cancerosas y, por lo tanto, muestran efectos secundarios muy altos en comparación con los agentes terapéuticos contra el cáncer. Por lo tanto, la terapia de combinación de un anticuerpo contra el cáncer y un fármaco contra el cáncer muestra un efecto terapéutico mayor que la administración individual de cada fármaco, pero tiene limitaciones fundamentales en el sentido de que siempre se producen los efectos secundarios del fármaco contra el cáncer.
Adicionalmente, los fármacos contra el cáncer tienen una citotoxicidad muy alta y, por esta razón, entre estos medicamentos contra el cáncer, los fármacos que pueden usarse solos como agentes terapéuticos contra el cáncer se limitan a fármacos basados en taxol o fármacos basados en cisplatino, que tienen una toxicidad relativamente baja. La mayoría de los fármacos contra el cáncer son prácticamente imposibles de recetar como medicamentos únicos, debido a su alta citotoxicidad. Cuando un fármaco contra el cáncer que no se puede utilizar como terapia única se conjuga con un anticuerpo que tiene una especificidad de diana muy alta para las células cancerosas, el fármaco contra el cáncer se puede suministrar únicamente a las células cancerosas diana sin efectos secundarios en las células normales. Por tanto, los conjugados de anticuerpo-fármaco están atrayendo la atención como un método capaz de aumentar la eficacia terapéutica de los fármacos contra el cáncer que antes no se podían utilizar.
Los conjugados de anticuerpo-fármaco que se comercializan actualmente incluyen Adcetris®, un agente terapéutico para el tratamiento del linfoma de Hodgkin, y Kadcyla®, un agente terapéutico para el tratamiento del cáncer de mama metastásico. Estos conjugados de anticuerpo y fármaco tienen una estructura en la que un anticuerpo se conjuga con un inhibidor de tubulina que se une a la tubulina, un microtúbulo intracelular implicado en el proceso de división celular para inhibir la división celular, inhibiendo de este modo el crecimiento y la división del cáncer. Los conjugados de anticuerpo-fármaco tienen una estructura en la que un fármaco se conjuga con la lisina de un anticuerpo (Kadcyla), o una estructura en la que un fármaco se conjuga con un grupo cisteína obtenido mediante la reducción de un enlace disulfuro entre una cadena pesada y un cadena pesada o entre una cadena pesada y una cadena ligera, que mantiene la estabilidad estructural del anticuerpo (Adcetris). En el método de conjugación de los fármacos contra el cáncer utilizados en estos conjugados de anticuerpo-fármaco de primera generación, el número de fármacos conjugados por anticuerpo no puede controlarse, y se producen isómeros posicionales con diferentes sitios de conjugación del fármaco incluso en conjugados de anticuerpo-fármaco que tienen el mismo número de fármacos conjugados. El número de fármacos conjugados por anticuerpo es un factor que influye no solo en la citotoxicidad del conjugado de anticuerpofármaco, sino también la estabilidad del conjugado de anticuerpo-fármaco, la posibilidad de formación de agregados, y similares. En general, a medida que aumenta el número de fármacos conjugados, la estabilidad del propio anticuerpo disminuye y aumenta la posibilidad de formación de agregados.
Adicionalmente, para los conjugados de anticuerpo-fármaco de primera generación, el número de fármacos conjugados por anticuerpo no se puede controlar y, por tanto, el número de fármacos conjugados por anticuerpo tiene un valor medio. Por ejemplo, para Kadcyla, el número de fármacos conjugados por anticuerpo tiene una distribución de 1 a 8, el número medio de fármacos conjugados es de 3,5. Incluso en conjugados de anticuerpo-fármaco que tienen el mismo número de fármacos conjugados, las características de los conjugados de anticuerpo-fármaco pueden variar dependiendo de los sitios de conjugación del fármaco. Si un fármaco se conjuga cerca de Fab o cerca de la bisagra de Fc, la estabilidad del anticuerpo o la reactividad antígeno-anticuerpo también puede reducirse debido a una diferencia en su afinidad de unión por el antígeno o el receptor de Fcy o FcRn. A medida que aumenta el número de fármacos conjugados por anticuerpo, el número de isómeros posicionales con diferentes sitios de conjugación del fármaco también aumenta proporcionalmente, y este resultado puede tener un impacto significativo en el mantenimiento de las propiedades uniformes de los conjugados de anticuerpo y fármaco entre lotes de producción.
Por lo tanto, en los últimos años, se han creado varias técnicas de conjugación para la conjugación de fármacos en sitios específicos con el fin de superar las desventajas de los conjugados de anticuerpo-fármaco de primera generación como se ha descrito anteriormente. Genetech creó una técnica para conjugar un fármaco utilizando la tecnología ThioMab, en la que se introduce un grupo cisteína reemplazando el aminoácido de un anticuerpo, y luego el fármaco se conjuga de forma específica de sitio con el grupo cisteína introducido. Esto mostró que el conjugado de anticuerpofármaco obtenido por conjugación de fármaco específica de sitio tenía mejor actividad in vivo que los conjugados de anticuerpo-fármaco de primera generación (Junutula et al., Nature Biotechnology, 2008, 26, 925-932). La conjugación específica de sitio es un método de conjugación de fármacos que emplea enzimas proteicas que tienen una especificidad para sustrato muy alta, y también se ha intentado por diversas compañías.
Se informó que una cantidad deseada de fármacos podría conjugarse de manera específica de sitio con un anticuerpo mediante métodos, incluida la conjugación específica de sitio empleando la enzima generadora de formilglicina (Drake et al., Bioconjugate Chemistry, 2014, 25, 1331-1341), conjugación empleando glutamina transferasa (Strop et al., Chemistry & Biology, 2013, 2o, 161-167) y similares. Sin embargo, estos métodos de conjugación que emplean enzimas proteicas tienen la desventaja de que la conjugación se realiza en presencia de una cantidad excesiva de un fármaco a 37 °C durante 72 horas o porque se requiere una alta concentración de una enzima de conjugación.
Un método de conjugación que emplea un aminoácido no natural, que es otro método de conjugación específica de sitio, se basa en una tecnología capaz de introducir una cadena lateral ausente en un aminoácido natural en una proteína mediante la síntesis de un ARNt capaz de introducir un aminoácido no natural en la proteína a través de un mutante de ARNt sintetasa (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 56-61). En virtud de este método, un fármaco puede conjugarse en un sitio deseado mediante la conjugación específica de sitio con el resto de aminoácido no natural introducido (zimmerman et. Al, Bioconjugate Chem. 2014, 25, 351-361). Sin embargo, este método requiere una tarea muy difícil que controla la ruta de traducción a través de una técnica de ingeniería genética muy avanzada.
Esta conjugación específica de sitio requiere una gran cantidad de tiempo y coste para una reacción de conjugación específica de sitio, porque el sistema de transcripción debe modificarse utilizando una técnica de ingeniería genética compleja o debe agregarse una cantidad excesiva de una enzima de conjugación. En vista del concepto básico de los conjugados de anticuerpo-fármaco, por el cual el anticuerpo sirve como un vehículo que suministra específicamente el fármaco contra el cáncer a las células cancerosas y el fármaco debe permanecer unido de forma estable al anticuerpo hasta que se suministre a las células cancerosas, no se pueden evitar las preguntas sobre si es necesaria la producción de un conjugado de anticuerpo-fármaco mediante el uso de este método de conjugación complicado, que consume mucho tiempo y es costoso. Un método de conjugación que tenga una alta eficiencia económica y sea capaz de lograr una conjugación específica de sitio en la producción de un conjugado de anticuerpo-fármaco puede ser una excelente alternativa que puede superar las limitaciones no solo del método de conjugación convencional para producir los conjugados de anticuerpo-fármaco de primera generación, sino también del método de conjugación específica de sitio recientemente propuesto.
Los conjugados de anticuerpo-fármaco presentan significativamente mejores eficacias in vitro e in vivo en comparación con los fármacos de anticuerpos convencionales. Sin embargo, los resultados de algunas pruebas clínicas realizadas para el uso de conjugados de anticuerpo-fármaco como agentes terapéuticos de primera línea no lograron mostrar la diferencia de utilidad clínica significativa en comparación con la terapia de combinación de un agente terapéutico de anticuerpo monoclonal y un fármaco químico sintético (http://www. roche.com/media/store/releases/medcor-2014-12-19.htm). Estos resultados pueden actuar como una gran restricción en la eficiencia económica de los conjugados de anticuerpo-fármaco, teniendo en cuenta que los conjugados de anticuerpo-fármaco necesitan costes terapéuticos significativamente más altos que los fármacos sintéticos, así como los agentes terapéuticos de anticuerpos monoclonales. En este sentido, parece que los métodos de conjugación específica de sitio mencionados anteriormente implican serios problemas para proporcionar una eficiencia económica que permita que los conjugados de anticuerpofármaco se usen como agentes terapéuticos de primera línea.
El documento KR 2013 0097669 A divulga un conjugado de variante de anticuerpo-fármaco (mADC) que puede transferir con precisión un fármaco a células diana con alta especificidad de un anticuerpo y potenciar el efecto del tratamiento, en donde la variante de anticuerpo se prepara conjugando un motivo que contiene un resto de cisteína de fórmula estructural 1 (Xa-[(M_Cys)_n-Xb_n]_n) al final de un anticuerpo original.
Con estos antecedentes técnicos, los presentes inventores han reconocido que existe una necesidad desesperada de creación de un conjugado de anticuerpo-fármaco que se produzca mediante una reacción de conjugación específica de sitio que sea superior en términos de eficiencia económica a una reacción de conjugación convencional. Para satisfacer esta necesidad, los presentes inventores han creado un anticuerpo modificado que comprende un motivo peptídico que incluye un motivo de unión a iones metálicos, y han descubierto que el anticuerpo modificado hace posible lograr una conjugación específica de sitio y, al mismo tiempo, tiene un rendimiento de conjugación de fármaco significativamente mejor. La presente divulgación pretende proporcionar un conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene excelentes efectos contra el cáncer in vivo debido a la conjugación específica de sitio y, al mismo tiempo, puede producirse de una manera más económica.
Divulgación de la invención
Problema técnico
La presente divulgación se ha realizado para resolver los problemas descritos anteriormente, y es un objeto de la presente divulgación proporcionar un anticuerpo que tenga un sitio de unión a fármaco formado al unir un motivo que tiene una estructura específica a un anticuerpo original. En lo sucesivo en el presente documento, este tipo de anticuerpo se denominará anticuerpo modificado. Este anticuerpo modificado se produce mediante la modificación de un anticuerpo modificado convencional que tiene un motivo de unión a iones metálicos y tiene un mayor rendimiento de conjugación con fármacos al tiempo que conserva la propiedad de conjugación específica de sitio. La presente divulgación también proporciona un método para producir un conjugado de anticuerpo-fármaco y un fármaco contra el cáncer utilizando este anticuerpo modificado.
Solución técnica
Las realizaciones de la presente invención se reflejan en las reivindicaciones independientes 1 y 12. Las realizaciones preferentes de la presente invención se reflejan en las reivindicaciones dependientes 2 a 11. Para conseguir el objeto anterior, la presente divulgación proporciona un conjugado de anticuerpo-fármaco en el que un anticuerpo modificado que comprende un motivo, en un extremo del anticuerpo, está unido a un fármaco por un enlazador:
en donde el motivo comprende
[Mmotivo1 ]n1-Xb-[Mmotivo2]n2
en donde:
El Mmotivo1 comprende una secuencia de ACGHA (SEQ ID NO: 1) o AHGCA (SEQ ID NO: 2), y Mmotivo2 comprende una secuencia de Ax GHA (SEQ ID NO: 3) o AHGXA (SEQ ID NO: 4), en donde X en la SEQ ID NO: 3 o 4 comprende un resto de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina (S), alanina (A), treonina (T), tirosina (Y), ácido aspártico (D), lisina (K) y fenilalanina (F);
Xb es 0; y
n1 y n2 son cada uno un número entero de 1.
La presente divulgación también proporciona una composición para prevenir o tratar el cáncer, que comprende el conjugado de anticuerpo-fármaco descrito anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los resultados de SDS-PAGE de muestras obtenidas al conjugar MC-vc-PAB-MMAE a cada uno de FM2, FM2b (número de lote: 4390f), FM2b (número de lote: 5698f), FM2a, FM2L y FM1, que son variantes de anticuerpos que se dirigen al receptor de folato. El fármaco se conjugó con un motivo que contenía cisteína introducido en la cadena pesada del anticuerpo y apareció como dos bandas en la cadena pesada cerca de 50 kDa en SDS-PAGE.
La figura 2 muestra los resultados de SDS-PAGE de muestras obtenidas al conjugar br-vc-PAB-MMAE (que es un conjugado de enlazador de fármacos obtenido al conectar MMAE a bromoacetamida) a cada uno de FM2, FM2b, FM2a, FM2L y FM1, que son variantes de anticuerpos que se dirigen al receptor de folato. El fármaco se conjugó con un motivo que contenía cisteína introducido en la cadena pesada del anticuerpo y apareció como dos bandas en la cadena pesada cerca de 50 kDa en SDS-PAGE.
La figura 3 muestra los resultados de un ensayo de inhibición del crecimiento celular realizado utilizando células KB que sobreexpresan el receptor de folato. Compara la actividad inhibidora del crecimiento celular entre el anticuerpo original Fwt, el conjugado de anticuerpo modificado-fármaco FM2-D2 (un conjugado de anticuerpo modificado (FM2)-fármaco (m Ma E) que tiene un DAR de 2), y FM2b-D2 (o FM2b-S-D2) (un conjugado de anticuerpo modificado (FM2b-S)-fármaco (MMAE) que tiene una Da r de 2). f M2-D2 y FM2b-D2 muestran casi la misma actividad intracelular.
La figura 4 muestra los resultados de un ensayo de inhibición del crecimiento celular realizado utilizando células KB que sobreexpresan el receptor de folato. Muestra actividad inhibidora del crecimiento celular entre FM2b-S-D2, FM2b-F-D2 y FM2b-Y-D2. FM2b-S-D2, FM2b-F-D2 y FM2b-Y-D2 muestran casi la misma actividad intracelular. La figura 5 muestra los resultados de medir los cambios en el número de fármacos conjugados (DAR) y la formación de agregados después de almacenar FM2b-S-D2, FM2b-F-D2, FM2b-K-D2 y FM2b-Y-D2 a 25 °C y 50 °C durante 0, 1, 3, 5, 7 y 14 días. A 25 °C, apenas se observaron cambios en DAR y monómero, pero a 50 °C, se observó que el contenido de DAR2 disminuyó y se formó un agregado con el tiempo. Sin embargo, no se observaron diferencias en el cambio de DAR y la formación de agregados entre las variantes.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende generalmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los métodos experimentales, que se describirán a continuación, son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica.
Un conjugado de anticuerpo-fármaco requiere que el fármaco contra el cáncer permanezca unido de forma estable al anticuerpo hasta que el fármaco contra el cáncer se administre a las células cancerosas diana. El fármaco contra el cáncer administrado a las células cancerosas diana debe liberarse del anticuerpo y debe inducir la muerte de las células cancerosas. Para este fin, el fármaco contra el cáncer debe unirse de forma estable al anticuerpo mediante un enlazador y esta estructura de fármaco-enlazador debe tener suficiente citotoxicidad para que el fármaco induzca la muerte de las células cancerosas cuando se libere en las células cancerosas. Adicionalmente, el fármaco debe conjugarse de manera específica de sitio con el anticuerpo, y el conjugado de anticuerpo-fármaco debe tener eficacia contra el cáncer y mostrar uniformidad en su proceso de producción.
Para este fin, los presentes inventores demostraron que un fármaco podía conjugarse en un sitio específico introduciendo un péptido que incluía un motivo de unión a iones metálicos en el extremo carboxilo de un anticuerpo, y que podía lograrse una relación uniforme de conjugación anticuerpo-fármaco (patente coreana n.° 1541764). Por lo tanto, se demostró que, si bien el fármaco se unía de forma específica de sitio al anticuerpo modificado, se mantenían las características del anticuerpo original, y el conjugado de fármaco-anticuerpo podía presentar una especificidad de diana y un efecto farmacológico muy elevados. Sin embargo, debido al coste de producción significativamente alto del conjugado de fármaco-anticuerpo en comparación con los tratamientos con fármacos sintéticos o anticuerpos monoclonales, se requiere con urgencia aumentar la eficiencia económica aumentando el rendimiento de conjugación del fármaco.
Por consiguiente, en la presente divulgación, se intentó demostrar que la relación de conjugación de fármaco a anticuerpo se puede aumentar significativamente mediante el uso de un anticuerpo modificado que comprende un motivo peptídico que incluye un motivo de unión a iones metálicos, es decir, según la secuencia y la estructura primaria del motivo de unión a iones metálicos introducido en el extremo del anticuerpo original.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco en el que un anticuerpo modificado que comprende un motivo, representado por la siguiente fórmula estructural (1), al final del anticuerpo, está unido a un fármaco mediante un enlazador:
Fórmula estructural (1)
Xa-[Mmotivo1 ]n1-Xb-[Mmotivo2]n2
en donde:
El Mmotivo1 y Mmotivo2 comprende cada uno independientemente una secuencia de cualquiera de ACGHA (SEQ ID NO: 1), AHGCA (SEQ ID NO: 2), AXGHA (SEQ ID NO: 3) y AHGXA (SEQ ID NO: 4), en donde X en la SEQ ID NO: 3 o 4 comprende un resto de aminoácido que no sea cisteína;
Xa y Xb son cada uno independientemente un péptido que consiste en de 0 a 20 restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en A (alanina), S (serina) y G (glicina); y n1 y n2 son cada uno un número entero que varía de 1 a 10.
El motivo representado por la fórmula estructural anterior (1) es un péptido que comprende un motivo CGH que es un motivo de unión a iones metálicos. El motivo CGH tiene una estructura representada por la siguiente fórmula 1: Fórmula (1)
Figure imgf000006_0001
en donde M representa un ion metálico y R representa un resto de aminoácido que no sea cisteína, preferentemente alanina.
En el motivo según la presente divulgación, el Mmotivo1 y Mmotivo2 comprende cada uno ACGHA (SEQ ID NO: 1) que comprende alanina ubicada en el extremo carboxilo y en el extremo amino del mismo, o AXGHA (SEQ ID NO: 3) obtenida reemplazando la cisteína de ACGHA con un resto de aminoácido que no sea cisteína. El motivo conserva la propiedad de unión a iones metálicos incluso cuando las posiciones del extremo amino y el extremo carboxilo de cada uno de Mmotivo1 y Mmotivo2 están invertidas y, por lo tanto, AHGCA (SEQ ID NO: 2) o AHGXA (SEQ ID NO: 4) que tienen las posiciones invertidas del extremo amino y el extremo carboxilo en ACGHA (SEQ ID NO: 1) o AXGHA (SEQ ID NO:
3) se encuentran dentro del alcance del Mmotivo1 o Mmotivo2 del motivo según la presente divulgación.
Mmotivo1 y Mmotivo2 en el motivo según la presente divulgación pueden comprender la misma secuencia o secuencias diferentes.
En un ejemplo de la presente divulgación, cuando el Mmotivo1 o mmotivo2 corresponde a AXGHA o AHGXA, X en AXGHA o AHGXA puede ser un resto de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina (S), alanina (A), treonina (T), tirosina (Y), ácido aspártico (D), lisina (K) y fenilalanina (F).
En un ejemplo de la presente divulgación, se encontró que el caso donde Mmotivo2 comprende AXGHA (SEQ ID NO: 3) y X en AXGHA es un resto de aminoácido que no es cisteína, puede mostrar una mayor capacidad de conjugación a fármacos que el caso en el que Mmotivo2 comprende ACGHA. Cuando el Mmotivo2 corresponde a AXGHA, X en AXGHA puede ser un resto de aminoácido que no sea cisteína, por ejemplo, un resto de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina (S), alanina (A), treonina (T), tirosina (Y), ácido aspártico (D), lisina (K) y fenilalanina (F).
El número de restos de aminoácidos de Xa es 0, el motivo no incluirá Xa , y el motivo Mmotivo1 se une directamente al anticuerpo.
Xb es un enlazador para conectar Mmotivo1 y Mmotivo2 entre sí, y es un péptido que consiste en de 0 a 20 restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en A (alanina), S (serina) y G (glicina). Si el número de restos de aminoácidos de Xb es 0, el motivo no incluirá Xb, y Mmotivo1 y Mmotivo2 pueden unirse directamente al anticuerpo. El número de restos de aminoácidos de Xb puede ser más de uno, dos, tres, cuatro, o cinco. Por ejemplo, el número de restos de aminoácidos de Xb puede ser de 2 a 20, 2 a 18, 2 a 16, 2 a 14, 2 a 12, 2 a 10, 2 a 8, 2 a 6, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10.
n1 y n2 representan el número de repeticiones de Mmotivo1 y Mmotivo2, respectivamente, y cada uno es un número entero de 1. Los n1 y n2 son cada uno ser 1, y en este caso, Mmotivo1 y Mmotivo2, que comprenden la secuencia de una cualquiera de ACGHA (SEQ ID NO: 1), AHGCA (SEQ ID NO: 2), AXGHA (SEQ ID NO: 3) y AHGXA (SEQ ID NO: 4), pueden conectarse entre sí sin el enlazador Xb o mediante el enlazador Xb. Por ejemplo, la estructura [Mmotivo1]n1-Xb-[Mmotivo2]n2 puede ser ACGHAACGHA (SEQ ID NO: 5), ACGHAAHGCA (SEQ ID NO: 6), ACGHAAXGHA (SEQ ID NO: 7), ACGHAAHGXA (SEQ ID NO: 8), AHGCAAHGCA (SEQ ID NO: 9), AHGCAACGHA (SEQ ID NO: 10), AHGCAAXGHA (SEQ ID NO: 11), AHGCAAHGXA (SEQ ID NO: 12), AXGHAAXGHA (SEQ ID NO: 13), AXGHAACGHA (SEQ ID NO:
14), AXGHAAHGCA (SEQ ID NO: 15), AXGHAAHGXA (SEQ ID NO: 16), AHGXAAHGXA (SEQ ID NO: 17), AHGXAACGHA (SEQ ID NO: 18), AHGXAAHGCA (SEQ ID NO: 19), o AHGXAAXGHA (SEQ ID NO: 20), si el enlazador Xb no está presente, y los motivos que comprenden esencialmente C (cisteína) para la conjugación con el fármaco pueden seleccionarse como Mmotivo1 y Mmotivo2.
La estructura M[motivo1]n1-Xb-[Mmotivo2]n2 puede ser ACGHAASGHA (SEQ ID NO: 21), ACGHAAHGSA (SEQ ID NO: 22), AHGCAASGHA (SEQ ID NO: 23), AHGCAAHGSA (SEQ ID NO: 24), ASGHAASGHA (SEQ ID NO: 25), ASGHAACGHA (SEQ ID NO: 26), ASGHAAHGCA (SEQ ID NO: 27), ASGHAAHGSA (SEQ ID NO: 28), AHGSAHGSA (SEQ ID NO: 29), AHGSAACGHA (SEQ ID NO: 30), AHGSAAGCA (SEQ ID NO: 31), o AHGSAASGHA (SEQ ID NO:
32), que comprende serina en la posición X de las SEQ ID NO: de 7, 8, 11 a 20 que comprende X, por ejemplo, si X es serina (S) cuando el enlazador Xb no está presente.
La estructura M[motivo1]n1-Xb-[Mmotivo2]n2 puede ser ACGHAAAGHA (SEQ ID NO: 33), ACGHAAHGAA (SEQ ID NO: 34), AHGCAAAGHA (SEQ ID NO: 35), AHGCAAHGAA (SEQ ID NO: 36), AAGHAAAGHA (SEQ ID NO: 37), AAGHAACGHA (SEQ ID NO: 38), AAGHAAHGCA (SEQ ID NO: 39), AAGHAAHGAA (SEQ ID NO: 40), AHGAAAHGAA (SEQ ID NO: 41), AHGAAACGHA (SEQ ID NO: 42), AHGAAAHGCA (SEQ ID NO: 43), o AHGAAAAGHA (SEQ ID NO: 44) cuando, por ejemplo, X es alanina (A) si el enlazador Xb no está presente.
La estructura M[motivo1]n1-Xb-[Mmotivo2]n2 puede ser ACGHAATGHA (SEQ ID NO: 45), ACGHAAHGTA (SEQ ID NO: 46), AHGCAATGHA (SEQ ID NO: 47), AHGCAAHGTA (SEQ ID NO: 48), ATGHAATGHA (SEQ ID NO: 49), ATGHAACGHA (SEQ ID NO: 50), ATGHAHGCA (SEQ ID NO: 51), ATGHAAHGTA (SEQ ID NO: 52), AHGTAAHGTA (SEQ ID NO: 53), AHGTAACGHA (SEQ ID NO: 54), AHGTAAHGCA (SEQ ID NO: 55), o AHGTAATGHA (SEQ ID NO: 56), por ejemplo, si X es treonina (T) cuando el enlazador Xb no está presente.
La estructura M[motivo1]n1-Xb-[Mmotivo2]n2 puede ser ACGHAAYGHA (SEQ ID NO: 57), ACGHAAHGYA (SEQ ID NO: 58), AHGCAAYGHA (SEQ ID NO: 59), AHGCAAHGYA (SEQ ID NO: 60), AYGHAAYGHA (SEQ ID NO: 61), AYGHAACGHA (SEQ ID NO: 62), AYGHAAHGCA (SEQ ID NO: 63), AYGHAAHGYA (SEQ ID NO: 64), AHGYAAHGYA (SEQ ID NO: 65), AHGYAACGHA (SEQ ID NO: 66), AHGYAAHGCA (SEQ ID NO: 67), o AHGYAAYGHA (Se Q ID NO: 68), por ejemplo, si X es tirosina (Y) cuando el enlazador Xb no está presente.
La estructura M[motivo1]n1-Xb-[Mmotivo2]n2 puede ser ACGHAADGHA (SEQ ID NO: 69), ACGHAAHGDA (SEQ ID NO: 70), AHGCAADGHA (SEQ ID NO: 71), AHGCAAHGDA (SEQ ID NO: 72), ADGHAADGHA (SEQ ID NO: 73), ADGHAACGHA (SEQ ID NO: 74), ADGHAAHGCA (SEQ ID NO: 75), ADGHAAHGDA (SEQ ID NO: 76), AHGDAAHGDA (SEQ ID NO: 77), AHGDAACGHA (SEQ ID NO: 78), AHGDAAHGCA (SEQ ID NO: 79), o AHGDAADGHA (SEQ ID NO: 80) cuando, por ejemplo, X es ácido aspártico (D) si el enlazador Xb no está presente.
La estructura M[motivo1]n1-Xb-[Mmotivo2]n2 puede ser ACGHAAKGHA (SEQ ID NO: 81), ACGHAAHGKA (SEQ ID NO: 82), AHGCAAKGHA (SEQ ID NO: 83), AHGCAAHGKA (SEQ ID NO: 84), AKGHAAKGHA (SEQ ID NO: 85), AKGHAACGHA (SEQ ID NO: 86), AKGHAAHGCA (SEQ ID NO: 87), AKGHAAHGKA (SEQ ID NO: 88), AHGKAAHGKA (SEQ ID NO: 89), AHGKAACGHA (SEQ ID NO: 90), AHGKAAHGCA (SEQ ID NO: 91), o AHGKAAKGHA (Se Q ID NO: 92), por ejemplo, si X es lisina (K) cuando el enlazador Xb no está presente.
La estructura M[motivo1]n1-Xb-[Mmotivo2]n2 puede ser ACGHAAFGHA (SEQ ID NO: 93), ACGHAAHGFA (SEQ ID NO: 94), AHGCAAFGHA (SEQ ID NO: 95), AHGCAAHGFA (SEQ ID NO: 96), AFGHAAFGHA (SEQ ID NO: 97), AFGHAACGHA (SEQ ID NO: 98), AFGHAAHGCA (SEQ ID NO: 99), AFGHAAHGFA (SEQ ID NO: 100), AHGFAAHGFA (SEQ ID NO: 101), AHGFAACGHA (SEQ ID NO: 102), AHGFAHGCA (SEQ ID NO: 103), o AHGFAAFGHA (SEQ ID NO: 104), por ejemplo, si X es fenilalanina (F) cuando el enlazador Xb no está presente.
Preferentemente, n1 y n2 son cada uno 1, y el enlazador Xb puede no estar presente. En este caso, el motivo puede comprender una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5 a 104.
El motivo puede estar unido al extremo C de la cadena pesada o de la cadena ligera del anticuerpo, particularmente al extremo C de la cadena pesada, proporcionando así un anticuerpo modificado que tiene un rendimiento de conjugación del fármaco significativamente mayor o un conjugado de fármaco que comprende el mismo. Al aumentar el rendimiento de conjugación del fármaco, se puede aumentar el rendimiento de producción del conjugado de anticuerpo-fármaco. El fármaco conjugado con alto rendimiento puede suministrarse específicamente a las células cancerosas diana por medio del anticuerpo modificado, aumentando así los efectos terapéuticos. Adicionalmente, debido al alto rendimiento de conjugación del conjugado de anticuerpo-fármaco, puede reducirse el coste de producción del conjugado de anticuerpo-fármaco como agente terapéutico.
El motivo se puede fusionar directamente con el anticuerpo original mediante un enlace amida. Como alternativa, el grupo funcional terminal del motivo puede unirse químicamente al grupo funcional terminal del anticuerpo original. Como alternativa, el motivo también se puede unir al anticuerpo original de una manera mediada por un enlazador usando un enlazador que une el grupo funcional terminal del motivo y un fármaco.
El enlazador puede configurarse para conectar un resto específico en el motivo al fármaco y puede tener un sitio reactivo que tenga un grupo electrófilo que reaccione con un resto nucleófilo (p. ej., cisteína) presente en el motivo del anticuerpo modificado. El enlazador puede comprender, por ejemplo, un grupo funcional reactivo, un aminoácido y un espaciador de autoescisión, que se unen al motivo.
El grupo funcional puede ser i) un grupo maleimida, un grupo acetamida, o derivados de los mismos, ii) un grupo aziridina, un grupo de haluro de arilo, un grupo acriloílo o derivados de los mismos, o iii) un grupo reactivo alquilante, un grupo reactivo arilante, disulfuro de piridilo, ácido tionitrobenzoico o derivados de los mismos. De manera específica, el enlazador puede estar en forma de i) un grupo poliimida maleimida o su ácido valina-citrulina-para-anilina benzoico (PABA) derivado; o ii) un grupo acetamida o su ácido valina-citrulina-para-anilina benzoico derivado(PABA), pero sin limitarse a los mismos.
La unión del resto de cisteína a un fármaco por parte del enlazador se puede realizar usando un método conocido, por ejemplo, alquilación, intercambio de disulfuro o reacción de transtioesterificación. Esto permite que el fármaco se conjugue al anticuerpo por el grupo tiol del resto de cisteína en el motivo.
En una realización de la presente divulgación, un grupo maleimida que generalmente se usa para unir tiol y un enlazador se usa para conjugar de manera específica un fármaco con cisteína, porque la reactividad nucleófila del grupo tiol de un resto de cisteína para el grupo maleimida es aproximadamente 1000 veces mayor que la de otro grupo funcional de aminoácido presente en una proteína, por ejemplo, el grupo amino o el grupo amino aminoterminal de un resto de lisina. Por lo tanto, se puede observar que en el caso de un conjugado de anticuerpo modificado-fármaco basado en un grupo maleimida o su derivado, o un grupo acetamida o su derivado, por ejemplo, un grupo bromoacetamida o un grupo yodoacetamida, la cisteína se une al fármaco mediante un enlace tioéter.
El anticuerpo puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado. Adicionalmente, los anticuerpos modificados tales como anticuerpos biespecíficos o fragmentos de los anticuerpos, también se pueden utilizar en la presente divulgación. Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento del anticuerpo" se refiere a un fragmento que al menos conserva una afinidad de unión a un antígeno. Los ejemplos del fragmento de anticuerpo incluyen anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 , Fd, scFv, anticuerpos de dominio, minicuerpos, anticuerpos monocatenarios (scAb), derivados de regiones constantes de anticuerpos y anticuerpos artificiales basados en armazones proteicos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se puede seleccionar del grupo que consiste en IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
El anticuerpo puede tener una afinidad y especificidad de unión para específicamente, antígenos específicos del cáncer, proteínas receptoras de la superficie celular, proteínas de la superficie celular, proteínas transmembranarias, proteínas de señalización, reguladores de supervivencia celular, reguladores de proliferación celular, moléculas asociadas con el desarrollo o la diferenciación de tejidos, linfocinas, citocinas, moléculas implicadas en la regulación del ciclo celular, moléculas implicadas en la vasculogénesis o moléculas asociadas con la angiogénesis. Por ejemplo, el anticuerpo puede tener una afinidad de unión por una o más dianas seleccionadas del grupo que consiste en, pero sin limitación:
(1) BMPRIB (receptor de tipo IB de proteína morfogenética ósea; número de registro de GenBank NM_001203); (2 ) E16 (LAT1, SLC7A5; número de registro de GenBank NM_003486);
(3) STEAP1 (antígeno epitelial de próstata de seis transmembrana; número de registro de GenBank NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUC16; número de registro de GenBank AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina; número de registro de GenBank NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de transportadores de soluto 34 (fosfato de sodio), miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II; número de registro de GenBank NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, Se Ma 5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y similar a tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B; número de registro de GenBank AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, gen del ADNc RIKEN 2700050C12; número de registro de GenBank AY358628);
(9) ETBR (receptor de endotelina de tipo B; número de registro de GenBank AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315; número de registro de GenBank NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado con cáncer de próstata, proteína 1 asociada con cáncer de próstata, antígeno epitelial de próstata 2 de seis transmembrana, proteína seis transmembrana de la próstata; número de registro de GenBank AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, receptor potencial transitorio del canal de cationes, subfamilia M, miembro 4; número de registro de GenBank NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma; número de registro de GenBank NP_003203 o NM_003212);
(14) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein-Barr) o Hs.73792; número de registro de GenBank M26004);
(15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (beta asociada a inmunoglobulina), B29; número de registro de GenBank NM_000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (dominio SH2 que contiene la proteína de anclaje a fosfatasa 1a), SPAP1B, SpAp 1C; número de registro de GenBank NM_030764);
(17) HER2 (número de registro de GenBank M11730);
(18 ) receptor ErbB seleccionado entre EGFR, HER3 y HER4
(19 ) NCA (número de registro de GenBank M18728);
(20 ) MDP (número de registro de GenBank BC017023);
(21 ) IL20R a (número de registro de GenBank AF184971);
(22 ) Brevican (número de registro de GenBank AF229053);
(23) EphB2R (número de registro de GenBank NM_004442);
(24 ) ASLG659 (número de registro de GenBank AX092328);
(25) PSCA (número de registro de GenBank AJ297436);
(26) GEDA (número de registro de GenBank AY260763);
(27 ) BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, receptor de BLyS, BR3; NP_443177.1);
(28 ) CD22 (isoforma CD22-B del receptor de linfocitos B; NP-001762.1);
(29) CD79a (CD79A, CD79a, alfa asociada a inmunoglobulina, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moléculas de IgM, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B; número de registro de GenBank NP_001774.1); (30) CXCR5 (receptor 1 del linfoma de Burkitt, un receptor acoplado a proteína G que se activa por la quimiocina CXCL 13, actúa en la migración de linfocitos y la defensa humoral, tiene un papel en la infección por VIH-2 y quizás en la aparición de SIDA, linfoma, mieloma y leucemia; número de registro de GenBank NP_001707.1);
(31) HLA-DOB (subunidad beta de la molécula de clase II de MHC (antígeno Ia) que se une a péptidos y los presenta a linfocitos T CD4+; número de registro de GenBank NP_002111.1);
(32) P2X5 (canal de iones 5 activado por ligando P2X de receptor prurinérgico, un canal de iones activado por ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión sináptica y la neurogénesis, y su deficiencia puede contribuir a la fisiopatología de la inestabilidad idiopática del detrusor; número de registro de GenBank NP_002552.2); (33) Cd 72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B, Lyb-2; número de registro de GenBank NP_001773.1); (34) LY64 (antígeno linfocitario 64 (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activación y la apoptosis de linfocitos B, la pérdida de función se asocia con una actividad aumentada de la enfermedad en pacientes con lupus eritematoso sistémico; número de registro de GenBank NP_005573.1);
(35) FcRH1 (proteína 1 similar al receptor Fc, un supuesto receptor del dominio Fc de inmunoglobulina que contiene dominios similares a Ig de tipo C2 e ITAM, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B; número de registro de GenBank NP_443170.1);
(36) IRTA2 (superfamilia del receptor de translocación 2 asociado a inmunoglobulina, un supuesto inmunorreceptor con posibles papeles en el desarrollo de linfocitos B y la linfomagénesis; la desregulación del gen por translocación se produce en algunas neoplasias malignas de linfocitos B; número de registro de GenBank NP_112571.1); (37) TENB2 (supuesto proteoglicano transmembrana, relacionado con la familia de factores de crecimiento EGF/heregulina y folistatina); número de registro de GenBank AF179274);
(38) MAGE-C1/CT7 (proteína sobreexpresada en cáncer testicular);
(39) receptor de andrógenos, PTEN, peptidasa 3 relacionada con la calicreína humana (proteína sobreexpresada en cáncer de próstata);
(40) CD20;
(41) CD30;
(42) CD33;
(43) CD52;
(44) EpCam;
(45) CEA;
(46) gpA33;
(47) mucinas;
(48) TAG-72;
(49) anhidrasa carbónica IX;
(50) PSMA;
(51) receptor de folato (familia de proteínas sobreexpresadas por el gen FOLR. Tiene una afinidad de unión por el ácido fólico y libera intracelularmente 5-metiltetrahidrofolato);
(52) gangliósidos (GD2, GD3, GM2);
(53) hidrato/sacárido Lewis-Y;
(54) VEGF;
(55) VEGFR;
(56) aVb3;
(57) a5b1;
(58) ERB3;
(59) c-MET;
(60) EphA3;
(61) TRAIL-R1, TRAIL-R2;
(62) RANKL;
(63) FAP; y
(64) tenascina.
En una realización de la presente divulgación, un anticuerpo (farletuzumab) que se une a un receptor de folato que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 115 y una cadena ligera de s Eq ID NO: 116 se usó como anticuerpo original. Se produjeron varios anticuerpos modificados con diversas secuencias y reordenamientos de motivos peptídicos introduciendo motivos de unión a iones metálicos en el extremo de la cadena pesada del anticuerpo original, y luego se midió la diferencia en el rendimiento de conjugación del fármaco entre los anticuerpos modificados. El anticuerpo modificado puede comprender una o más cadenas pesadas seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 117 a 121.
Adicionalmente, en otro ejemplo de la presente divulgación, se usó un anticuerpo (trastuzumab) que se unía específicamente a Her2 como anticuerpo original. Se produjeron varios anticuerpos modificados con diversas secuencias y reordenamientos de motivos peptídicos introduciendo motivos de unión a iones metálicos en el extremo de la cadena pesada del anticuerpo original, y luego se midió la diferencia en el rendimiento de conjugación del fármaco entre los anticuerpos modificados.
Como resultado, en conjugados de anticuerpo-fármaco según la presente divulgación, se demostró que cuando el motivo se introdujo en farletuzumab y trastuzumab, estos anticuerpos tenían el nivel equivalente de rendimiento de conjugación de fármacos. Por tanto, el motivo según la presente descripción puede usarse como tecnología de plataforma para conjugar un fármaco con un anticuerpo en la producción de conjugados de anticuerpo-fármaco, independientemente del tipo de anticuerpo.
En una realización, el anticuerpo puede comprender tanto la región variable del anticuerpo original o el anticuerpo modificado como la CH1, CH2 y CH3 de IgG2 o IgG4. Por ejemplo, el anticuerpo puede usar la VH y la VL de farletuzumab, o trastuzumab, o su anticuerpo modificado, y puede comprender la CH1, CH2 y CH3 de IgG2 o IgG4. Por ejemplo, la región variable del anticuerpo farletuzumab puede comprender la región variable de cadena pesada de s Eq ID NO: 122 y/o la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 123.
En otra realización, el anticuerpo puede comprender tanto el Fab del anticuerpo original o el anticuerpo modificado como el Fc de IgG2 o IgG4. De manera específica, puede comprender una fusión de la región Fab de farletuzumab, trastuzumab, o su anticuerpo modificado con la región Fc de IgG2 o IgG4. Por ejemplo, el Fab del anticuerpo farletuzumab puede comprender la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 122 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 124 que comprende la CH1 y/o la SEQ ID NO: 124. El anticuerpo trastuzumab puede comprender la cadena pesada de SEQ ID NO: 127 y/o la cadena ligera de SEQ ID NO: 128.
Un fármaco que se une al anticuerpo modificado de la presente divulgación puede ser cualquier fármaco que tenga efectos terapéuticos sobre enfermedades. Particularmente, es preferentemente un fármaco terapéutico contra el cáncer que tiene el efecto de inhibir la proliferación de células tumorales.
El fármaco puede conjugarse con un grupo cisteína o un grupo serina de un motivo introducido en el extremo del anticuerpo modificado.
De manera específica, un fármaco que se puede utilizar en el conjugado de anticuerpo modificado-fármaco de la presente divulgación comprende cualquier compuesto, resto o grupo que tiene un efecto citotóxico o citostático, y ejemplos de los mismos incluyen: (i) agentes quimioterapéuticos capaces de actuar como inhibidores de la microtubulina, inhibidores mitóticos, inhibidores de topoisomerasa o intercaladores de ADN; (ii) toxinas proteicas capaces de actuar como enzimas; (iii) micro-ARN (miARN), ARNip o ARNhc, que pueden inhibir la expresión de un oncogén específico; y (iv) radioisótopos.
Dicho fármaco puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en, pero sin limitación a los mismos, maitansinoide, auristatina, aminopterina, actinomicina, bleomicina, talisomicina, camptotecina, N8-acetil espermidina, 1-(2 cloroetil)-1,2-dimetilsulfonilhidrazida, esperamicina, etopósido, 6-mercaptopurina, dolastatina, tricoteceno, caliqueamicina, taxano, metotrexato, vincristina, vinblastina, doxorrubicina, melfalán, mitomicina A, mitomicina C, clorambucilo, duocamicina, enzimas nucleolíticas, toxinas de origen bacteriano, vegetal o animal, cisplatino, irinotecán, paclitaxel y docetaxel.
En algunas realizaciones, el fármaco puede comprender uno o más grupos nucleófilos seleccionados del grupo que consiste en amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y grupos arilhidrazida, que puede reaccionar con el enlazador y un grupo electrófilo en el reactivo enlazador para formar un enlace covalente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición terapéutica que comprende el conjugado de anticuerpo-fármaco descrito anteriormente como principio activo. En la composición, el fármaco conjugado con un conjugado de anticuerpo modificado-fármaco puede ser un agente citotóxico, inhibidor de la proliferación celular, un agente quimioterapéutico, un inhibidor inmunitario, un agente antiinflamatorio o similares, pero sin limitarse a los mismos. En tratamiento contra el cáncer, el uso del conjugado de anticuerpo-fármaco para el suministro local de un fármaco que destruye o inhibe las células tumorales permite el suministro dirigido del resto del fármaco a las células tumorales mediante interacciones anticuerpo-antígeno y la acumulación intracelular del resto del fármaco.
La presente divulgación también proporciona un método para inhibir la proliferación de células diana con cáncer, enfermedad autoinmunitaria, inflamatoria o infecciosa poniéndose en contacto con las células diana utilizando un conjugado de anticuerpo modificado-fármaco como principio activo.
El cáncer que se puede tratar según la presente divulgación puede ser uno o más seleccionados entre, pero sin limitación, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer de ano, cáncer de las trompas de Falopio, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer de uréter, carcinoma de células renales, cáncer de pelvis renal y cáncer del sistema nervioso central. En un ejemplo específico, la proliferación de células KB cancerosas amplificadas con receptor de folato se puede inhibir poniendo en contacto el conjugado de anticuerpo modificado-fármaco con las células in vitro. Por tanto, es evidente que el método de la invención de inhibir la proliferación de células diana usando el conjugado de anticuerpo modificado-fármaco como principio activo tiene el efecto de destruir células relacionadas con la enfermedad descrita anteriormente o de reducir e inhibir la tasa de proliferación de las células.
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos o científicos tal como se usan en el presente documento tienen los mismos significados que entienden aquellos que tienen conocimientos habituales en el campo técnico al que pertenece la presente divulgación. Además, se omitirá en el presente documento la descripción detallada de la misma construcción y el efecto como los de la técnica anterior.
Ejemplos
En lo sucesivo en el presente documento, la presente divulgación se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Será obvio para una persona con experiencia habitual en la materia que estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente divulgación, y se pueden realizar diversas modificaciones y cambios dentro del alcance de la presente invención como se define en las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Construcción del vector de expresión pAV4
Para la clonación de vectores de expresión, se utilizó un pAV4, que se creó mejorando el vector original pSGHV0 (número de registro de GenBank AF285183) según el uso previsto para poder utilizarse en la producción de anticuerpos en el campo industrial. Cuando una proteína humana se expresa utilizando bacterias tal como E. coli, se sobreexpresa en las células, pero hay proteínas difíciles de obtener como sustancias fisiológicamente activas. Por lo tanto, el vector original es un vector de investigación creado con el propósito de expresar extracelularmente la proteína de interés fisiológicamente activa utilizando células animales y purificar fácilmente la proteína expresada. Sin embargo, ya que existen diversas restricciones sobre el uso de este vector en la producción industrial, este vector se mejoró para que pudiera utilizarse en el campo industrial, para utilizar un alto nivel de expresión, que es la mayor ventaja de este vector, en la producción. Adicionalmente, en el caso de los anticuerpos, dos proteínas (una cadena pesada y una cadena ligera) deben coexpresarse, y por esta razón, se creó un vector adecuado para este fin.
Ejemplo 2: Construcción de vectores para que el anticuerpo original tenga afinidad de unión por el receptor de folato y el anticuerpo modificado comprenda el motivo ACGHA de unión a iones modificado
Para construir un vector de anticuerpo original (Fwt) que tenga afinidad de unión por el receptor de folato, un ADNc que codifica una cadena pesada de SEQ ID NO: 125 y un ADNc que codifica una cadena ligera de SEQ ID NO: 126 se sintetizaron como secuencias con codones optimizados para maximizar sus expresiones en células CHO. Estos genes se clonaron en XhoI/NotI y ApaI/SmaI del vector pAV4, respectivamente, construyendo así un vector de anticuerpo original (pFwt).
T l 11 n i min i l ni r Fw
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2-1: Construcción del anticuerpo FM2 modificado a partir del anticuerpo original Fwt que se une al receptor de folato
Para construir el anticuerpo FM2 modificado (Fwt-ACGHAACGHA) (SEQ ID NO: 5), FM2) que tiene dos motivos de unión a iones metálicos (ACGHA) a partir de Fwt, la amplificación por PCR se realizó utilizando el vector del anticuerpo original Fwt (pFwt) como plantilla, un cebador directo XhoI-Q5-F (5'-GCTCCTCGAGGCCACCATGGGATGGAGCTGT ATCATCC-3': SEQ ID NO: 105) y un cebador inverso M2 (5'-CCATGCGGCCGCTCATTTAGGCATGGCCA CAAGCAGCATGGCCACAGGCACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3': SEQ ID NO: 106). El nucleótido amplificado se escindió con dos enzimas de restricción (XhoI y NotI) en los extremos y se unió con el vector de expresión pFwt que tiene sitios de escisión de XhoI/NotI, construyendo así un vector de anticuerpo modificado (pFM2).
2-2: Construcción del anticuerpo FM1 modificado que se une al receptor de folato
Para construir el anticuerpo trastuzumab modificado FM1 (Fwt-GGGACGHA, pFM1) que tiene solo un motivo de unión a iones metálicos (ACGHA), la amplificación por PCR se realizó mediante el método de mutagénesis dirigida al sitio (Enzynomics co Ltd., kit de mutagénesis dirigida al sitio EzChange, Ez004S) utilizando el FM2 construido anteriormente como plantilla, un cebador directo (5'-GCTCCTCGAGGCCACCATGGGATGGAGCTGT ATCATCC-3': SEQ ID NO: 107) y un cebador inverso (5'-CCATGCGGCCGCTCATTTAGGCATGGCC ACAAGCA CCTC CACCACCCGGAGACAGGGAGA-3': SEQ ID n O: 108). El nucleótido amplificado se escindió con dos enzimas de restricción (XhoI y NotI) en los extremos y se unió con el vector de expresión pFwt que tiene sitios de escisión de XhoI/NotI, construyendo así un vector de anticuerpo modificado (pFM1).
2-3: Construcción del anticuerpo FM2L modificado que se une al receptor de folato
Para construir el anticuerpo FM2L modificado (Fwt-ACGHAGGGACGHA, pFM2L) que comprende motivos de unión a iones metálicos (ACGHA) conectados por un enlazador que consiste en 3 restos de aminoácidos, la PCR se realizó mediante el método de mutagénesis dirigida al sitio (Enzynomics co Ltd., kit de mutagénesis dirigida al sitio EzChange, Ez004S) utilizando el anticuerpo FM2 modificado construido anteriormente como plantilla, un cebador directo (5'-GCTCCTCGAGGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCC-3': SEQ ID NO: 109) y un cebador inverso (5'-CCATGCGGCCGCTCATTTAGGCATGGCCACAAGCACCTCCACCAGCATGGCCACAGGCACC CGGAGACAGGGAGAGGC-3': SEQ ID NO: 110), añadiendo así un enlazador de glicina entre dos motivos de unión de iones metálicos. El nucleótido amplificado se escindió con dos enzimas de restricción (XhoI y NotI) en los extremos y se unió con el vector de expresión pFwt que tiene sitios de escisión de XhoI/NotI, construyendo así un vector de anticuerpo modificado (pFM2L).
2-4: Construcción del anticuerpo FM2a modificado que se une al receptor de folato
Para construir un anticuerpo FM2a modificado (Fwt-ASGHAACGHA) (SEQ ID NO: 26), pFM2a) que tiene solo un motivo de unión a iones metálicos reemplazando la cisteína interna en ACGHAACGHA (s Eq ID NO: 5), que consiste en dos motivos de unión a iones metálicos presentes en el anticuerpo FM2 modificado, con serina, la PCR se realizó utilizando el anticuerpo FM2 modificado construido anteriormente como plantilla, un cebador directo (5'-GCTCCTCGAGGCCACCATGGGATGGAGCTGT ATCATCC-3': SEQ ID NO: 111) y un cebador inverso (5'-CAGATTGCGGCCGCTCATTAGGCATGGCCACAAGCAGCATGGCCTG AGGCACCCGGAGACAGG-3': SEQ ID NO: 112), reemplazando así la cisteína interna con serina. El nucleótido amplificado se escindió con dos enzimas de restricción (XhoI y NotI) en los extremos y se unió con el vector de expresión pFwt que tiene sitios de escisión de XhoI/NotI, construyendo así un vector de anticuerpo modificado (pFM2a)
2-5: Construcción del anticuerpo FM2b modificado que se une al receptor de folato
Para construir un anticuerpo FM2b modificado (Fwt-ACGHAASGHA (SEQ ID NO: 21), pFM2b) que tiene solo un motivo de unión a iones metálicos reemplazando la cisteína externa en ACGHAACGHA, que consiste en dos motivos de unión a iones metálicos presentes en el anticuerpo FM2 modificado, con serina, la PCR se realizó mediante el método de mutagénesis dirigida al sitio (Enzynomics co Ltd., kit de mutagénesis dirigida al sitio EzChange, Ez004S) utilizando el anticuerpo FM2 modificado construido anteriormente como plantilla, un cebador directo (5'-GCTCCTCGAGGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCC-3': SEQ ID NO: 113) y un cebador inverso (5'-CAGATTGCGGCCGCTCATTAGGCATGGCCTGAAGCAGCATGGCCACA GGCACCCGGAGACAGG-3': SEQ ID NO: 114), reemplazando así la cisteína exterior con serina. El nucleótido amplificado se escindió con dos enzimas de restricción (XhoI y NotI) en los extremos y se unió con el vector de expresión pFwt que tiene sitios de escisión de XhoI/NotI, construyendo así un vector de anticuerpo modificado (pFM2b)
[Tabla 2] Anticuerpo FM
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Ejemplo 3: Expresión y purificación del anticuerpo original Fwt que se une al receptor de folato y anticuerpos modificados
Usando células de ovario de hámster chino (CHO-K1), se analizó la expresión de proteínas de Fwt y sus anticuerpos modificados con motivos de unión a iones metálicos (FM1, FM2, FM2L, FM2a y FM2b), construidos en el ejemplo 2. CHO-K1 se cultivó en DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) que contenía FBS (suero fetal bovino) al 10 % y un antibiótico en una estufa de incubación con CO2 al 5 % a 37 °C. El día antes de la introducción de Fwt y sus vectores de expresión de anticuerpos modificados, las células se inocularon en una placa de cultivo de 100 mm a una concentración de 5 x 106 células/ml y se cultivaron, y luego se mantuvo una mezcla de 800 pl de DMEM sin FBS y 10 |jg de Fwt o cada vector de expresión de anticuerpos modificados a temperatura ambiente durante 1 minuto, y a continuación se mezcló con 20 jg de PEI (polietilenimina, lineal, Polysciences Inc (n.° de cat.: 23966, PM~25.000)), seguido de incubación a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 a 15 minutos. En ese momento, las células cultivadas antes de un día se lavaron con PBS y se añadieron 6 ml de medio DMEM nuevo a las mismas. El Fwt o su vector de expresión de anticuerpos modificados, incubado a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, se añadió a la placa de cultivo. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y se les añadió medio IMDM sin FBS (n.° de cat. 12200-028, Gibco, Medio de Dulbecco modificado de Iscove), seguido por el análisis de la expresión de proteínas.
El Fwt y sus anticuerpos modificados con motivos de unión a iones metálicos se purificaron de la siguiente manera. De manera específica, para purificar el Fwt y sus anticuerpos modificados con motivos de unión a iones metálicos secretados en los medios de cultivo celular, cada uno de los medios de cultivo se centrifugó y se extrajeron las células, después de lo cual se recogió el sobrenadante, inyectado en una columna de HP con proteína A HiTrap (GE Healthcare, EE. UU.) equilibrada con tampón de equilibrio. Después, el sobrenadante se lavó suficientemente con tampón de equilibrio, después de lo cual se alteró el pH mediante la adición de tampón de glicina (glicina 100 mM, pH 2,8), eluyendo así la proteína. La solución resultante se dializó contra tampón fosfato y luego se concentró usando Vivaspin20 (Sartorius, EE. UU.), y finalmente, se obtuvo proteína altamente purificada.
Ejemplo 4: Producción de conjugados de anticuerpo-fármaco por reacción entre el anticuerpo modificado de Fwt, el grupo maleimida y la cisteína
En la presente divulgación, MMAE se conjugó con el anticuerpo Fwt modificado, produciendo así un conjugado FMx (variante con motivos de unión a iones metálicos de Fwt)-MMAE. La monometil auristatina E (conocida como MMAE; véase la fórmula 2 a continuación), un derivado conjugable de auristatina, se une a un grupo maleamida, que se une selectivamente a un grupo tiol, a través de valina-citurulina, que se degrada por la proteasa en las células, y ácido para-anilina benzoico (PABA), que es un grupo espaciador de autoescisión.
Fórmula 2
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Esta estructura unida generalmente se denomina MC (ácido maleimido caproico)-VC (valina-citurulina)-PAB-MMAE y auristatina, un compuesto altamente citotóxico, que se sabe que tiene un valor de CI50 de 200 a 300 pM en el ensayo de inhibición de la proliferación celular.
En la presente divulgación, se agregaron 3 equivalentes del agente reductor TCEP por equivalente de anticuerpo modificado purificado y se dejó reaccionar a 4 °C durante 30 minutos para reducir el grupo tiol, y luego se le agregaron 3 equivalentes de MC-vc-PAB-MMAE. y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de un exceso de cisteína y el exceso de MC-vc-PAB-MMAE y el TCEP se eliminó por centrifugación, filtración y diálisis en solución salina tamponada con fosfato, produciendo así el FMx-MC-vc-PAB-MMAE purificado resultante.
El rendimiento de la conjugación con la cadena pesada de cada anticuerpo modificado se muestra en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3: R n imi n n i n n ni r m ifi r v l r maleimida
Figure imgf000014_0002
Como puede observarse en la tabla 3 anterior, el rendimiento de la conjugación del fármaco con la cadena pesada difirió significativamente entre los anticuerpos modificados. Los anticuerpos modificados, entre los que se incluyen FM1, FM2, FM2a y FM2L, mostraron un rendimiento de conjugación de aproximadamente 63 a 66 % en condiciones de conjugación de fármacos, mientras que FM2b mostró un rendimiento de conjugación de fármacos muy alto del 97,5 %. FM2b mostró rendimientos de conjugación sustancialmente similares en muestras recogidas de dos lotes de transfección transitoria diferentes.
Ejemplo 5: Producción de conjugados de anticuerpo-fármaco por reacción entre el anticuerpo modificado de Fwt, Grupo bromoacetamida y cisteína
En este ejemplo, los conjugados de anticuerpo-fármaco se produjeron por conjugación con el grupo tiol de la cisteína a través de un grupo bromoacetamida. La bromoacetamida se unió a MMAE a través de valina-citurulina, que se degrada por la proteasa en las células, y ácido para-anilina benzoico (PABA), que es un grupo espaciador de autoescisión, y MMAE se conjugó a cada anticuerpo modificado mediante la unión entre bromoacetamida y un grupo tiol. El conjugado producido se denominó br (bromoacetamida)-VC (valina-citurulina)-PAB-MMAE.
En la presente divulgación, se agregaron 3 equivalentes del agente reductor TCEP por equivalente de anticuerpo modificado purificado y se dejó reaccionar a 4 °C durante 30 minutos para reducir el grupo tiol, y luego se le agregaron 3 equivalentes de br-vc-PAB-MMAE. y se dejó reaccionar a 37 °C durante 2 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de un exceso de cisteína y el exceso de br-vc-PAB-MMAE y el TCEP se eliminó por centrifugación, filtración y diálisis en solución salina tamponada con fosfato, produciendo así la FMxacetamida-vc-PAB-MMAE purificada resultante.
El rendimiento de la conjugación con la cadena pesada de cada anticuerpo modificado se muestra en la tabla 4 a continuación.
Tabla 4: Ren imi n l n i n n i r m ifi r v l r r moacetamida
Figure imgf000015_0001
Como puede observarse en la tabla 4 anterior, en el rendimiento de la conjugación del fármaco a la cadena pesada entre los anticuerpos modificados, FM2b muestra un rendimiento de conjugación significativamente excelente en comparación con otros anticuerpos modificados. Incluso en la reacción de conjugación a través del grupo yodoacetamida, FM2b muestra un rendimiento de conjugación significativamente excelente en comparación con otros anticuerpos modificados.
Tabla 5: Ren imi n l n i n ni r m ifi r v l r oacetamida
Figure imgf000015_0002
Ejemplo 6: Producción de anticuerpos de trastuzumab modificados
Según el método utilizado en el ejemplo 2 anterior, se produjo un anticuerpo modificado introduciendo un motivo de unión a iones metálicos que incluía cisteína en el extremo carboxiterminal de trastuzumab.
6-1. Construcción del anticuerpo HM2 Modificado a partir de trastuzumab
Para construir el anticuerpo HM2 modificado (HR-ACGHAACGHA (SEQ ID NO: 5), HM2) que tiene dos motivos de unión a iones metálicos (ACGHA) a partir de trastuzumab, la amplificación por PCR se realizó utilizando el vector con trastuzumab del anticuerpo original (pHR) como plantilla, un cebador directo XhoI-Q5-F (5'-GCTCCTCGAGGCCACCATGGGATGGAGCTGT ATCATCC-3': SEQ ID NO: 111) y un cebador inverso M2 (5'-CCATGCGGCCGCTCATTTAGGCATGGCCA CAAGCAGCATGGCCACAGGCACCCGGAGACAGGGAGAGGC-3': SEQ ID NO: 112). El nucleótido amplificado se escindió con dos enzimas de restricción (Xhol y Notl) en los extremos y se unió con el vector de expresión pHR que tiene sitios de escisión de XhoI/NotI, construyendo así un vector de anticuerpo modificado (pHM2).
6-2. Construcción del anticuerpo HM2a Modificado a partir de trastuzumab
Para construir un anticuerpo HM2a modificado (HRASGHAACGHA (SEQ ID NO: 26), pHM2a) que tiene solo un motivo de unión a iones metálicos reemplazando la cisteína interna en ACGHAACGHA (SEQ ID NO: 5), que consiste en dos motivos de unión a iones metálicos presentes en el anticuerpo HM2 modificado, con serina, la PCR se realizó utilizando el anticuerpo HM2 modificado construido anteriormente como plantilla, un cebador directo (5'-GCTCCTCGAGGCCACCATGGGATGGAGCTGT ATCATCC-3': SEQ ID NO: 111) y un cebador inverso (5'-CAGATTGCGGCCGCTCATTAGGCATGGCCACAAGCAGCATGGCCTG AGGCACCCGGAGACAGG-3': SEQ ID NO: 112), reemplazando así la cisteína interna con serina. El nucleótido amplificado se escindió con dos enzimas de restricción (XhoI y NotI) en los extremos y se unió con el vector de expresión pHR que tiene sitios de escisión de XhoI/NotI, construyendo así un vector de anticuerpo modificado (pHM2a).
6-3. Construcción del anticuerpo HM2b Modificado a partir de trastuzumab
Para construir un anticuerpo HM2b modificado (HRACGHAASGHA (SEQ ID NO: 21), pHM2b) que tiene solo un motivo de unión a iones metálicos reemplazando la cisteína externa en ACGHAACGHA, que consiste en dos motivos de unión a iones metálicos presentes en el anticuerpo HM2 modificado, con serina, la PCR se realizó mediante el método de mutagénesis dirigida al sitio (Enzynomics co Ltd., kit de mutagénesis dirigida al sitio EzChange, Ez004S) utilizando el anticuerpo HM2 modificado construido anteriormente como plantilla, un cebador directo (5'-GCTCCTCGAGGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCC-3': SEQ ID NO: 113) y un cebador inverso (5'-CAGATTGCGGCCGCTCATTAGGCATGGCCTGAAGCAGCATGGCCACA GGCACCCGGAGACAGG-3': SEQ ID NO: 114), reemplazando así la cisteína exterior con serina. El nucleótido amplificado se escindió con dos enzimas de restricción (XhoI y NotI) en los extremos y se unió con el vector de expresión pHR que tiene sitios de escisión de XhoI/NotI, construyendo así un vector de anticuerpo modificado (pHM2b).
Ejemplo 7: Expresión y purificación de anticuerpos de trastuzumab modificados
Utilizando células de ovario de hámster chino (CHO-K1), se analizó la expresión de proteínas de los anticuerpos de trastuzumab modificados (HM2, HM2a, HM2b), construidos en el ejemplo 6. CHO-K1 se cultivó en DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) que contenía FBS (suero fetal bovino) al 10 % y un antibiótico en una estufa de incubación con CO2 al 5 % a 37 °C. El día antes de la introducción de Fwt y sus vectores de expresión de anticuerpos modificados, las células se inocularon en una placa de cultivo de 100 mm a una concentración de 5 x 106 células/ml y se cultivaron, y luego se mantuvo una mezcla de 800 j l de DMEM sin FBS y 10 |jg de Fwt o cada vector de expresión de anticuerpos modificados a temperatura ambiente durante 1 minuto, y a continuación se mezcló con 20 jg de PEI (polietilenimina, lineal, Polysciences Inc (n.° de cat.: 23966, MW de aproximadamente 25.000)), seguido de incubación a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 a 15 minutos. En ese momento, las células cultivadas antes de un día se lavaron con PBS y se añadieron 6 ml de medio DMEM nuevo a las mismas. El Fwt o su vector de expresión de anticuerpos modificados, incubado a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, se añadió a la placa de cultivo. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y se les añadió medio IMDM sin FBS (n.° de cat. 12200-028, Gibco, Medio de Dulbecco modificado de Iscove), seguido por el análisis de la expresión de proteínas.
Los anticuerpos modificados se purificaron de la siguiente manera. De manera específica, para purificar los anticuerpos modificados secretados en los medios de cultivo celular, cada uno de los medios de cultivo se centrifugó y se extrajeron las células, después de lo cual se recogió el sobrenadante, inyectado en una columna de HP con proteína A HiTrap (GE Healthcare, EE. UU.) equilibrada con tampón de equilibrio. Después, el sobrenadante se lavó suficientemente con tampón de equilibrio, después de lo cual se alteró el pH mediante la adición de tampón de glicina (glicina 100 mM, pH 2,8), eluyendo así la proteína. La solución resultante se dializó contra tampón fosfato y luego se concentró usando Vivaspin20 (Sartorius, Ee . UU.), y finalmente, se obtuvo proteína altamente purificada.
Ejemplo 8: Producción de conjugados de anticuerpo-fármaco por conjugación de MC-vc-PAB-MMAE con anticuerpos de trastuzumab modificados
En la presente divulgación, se produjeron conjugados de HMx (variante de trastuzumab con motivo de unión a iones metálicos)-MMAE conjugando MMAE con los anticuerpos de trastuzumab modificados producidos en los ejemplos 6 y 7. En la presente divulgación, se agregaron 3 equivalentes del agente reductor TCEP por equivalente de anticuerpo modificado purificado y se dejó reaccionar a 4 °C durante 30 minutos para reducir el grupo tiol, y luego se le agregaron 2,5 equivalentes de MC-vc-PAB-MMAE. y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de un exceso de cisteína y el exceso de MC-vc-PAB-MMAE y el TCEP se eliminó por centrifugación, filtración y diálisis en solución salina tamponada con fosfato, produciendo así el FMx-MC-vc-PAB-MMAE purificado resultante.
El rendimiento de la conjugación con la cadena pesada de cada anticuerpo modificado se muestra en la tabla 6 a continuación.
Tabla 6: Rendimiento de conjugación con cada anticuerpo modificado a través del grupo maleimida Anticuerpo modificado HM2 HM2a HM2b
Rendimiento de
conjugación 55,5 % 62,4 % 85,5 %
Como puede observarse en la tabla 6 anterior, el rendimiento de la conjugación del fármaco con la cadena pesada difirió significativamente entre los anticuerpos modificados. Los anticuerpos modificados, HM2 y HM2a, mostraron un rendimiento de conjugación de aproximadamente el 55 al 62 % en las mismas condiciones de conjugación del fármaco, mientras que HM2b mostró un rendimiento de conjugación de fármacos muy alto del 85,5 %. Estos resultados indican que incluso cuando la secuencia de M2b se introduce no solo en farletuzumab, sino también en otros anticuerpos, el rendimiento de la conjugación también es alto.
Ejemplo 9: Producción de anticuerpos modificados por reemplazo de serina en la secuencia de M2b (ACGHAASGHA; SEQ ID NO: 21
De los ejemplos anteriores, se pudo observar que M2b (ACGHAASGHA) obtenido reemplazando la cisteína interna en el motivo de unión a iones metálicos M2 (ACGHAACGHA) con serina mostró una capacidad de conjugación de fármacos significativamente mayor que la secuencia de M2. Para examinar si este sitio de reemplazo de serina muestra el mismo efecto incluso en el reemplazo de otros aminoácidos, se produjeron anticuerpos modificados reemplazando este sitio con varios restos de aminoácidos.
Tabla 7: Anticuerpos modificados obtenidos reemplazando el sitio de serina de la secuencia de M2b con otros restos de aminoácidos
Figure imgf000017_0001
Cada uno de los anticuerpos modificados que tienen las secuencias carboxiterminales que se muestran en la tabla 7 anterior se introdujo en FM2b o FM2b-S, produciendo así anticuerpos modificados, incluyendo FM2b-A, FM2b-T, FM2b-Y, FM2b-D, FM2b-K y FM2b-F.
Ejemplo 10: Producción de conjugados de anticuerpo-fármaco por conjugación de MC-vc-PAB-MMAE con anticuerpos de Fm2b modificados
En la presente divulgación, los conjugados de FM2b-X-MMAE se produjeron conjugando MMAE con el anticuerpo FM2b-X modificado (X = A, T, Y, D, K, o F) producido en el ejemplo 9. En la presente divulgación, se agregaron 3 equivalentes del agente reductor TCEP por equivalente de anticuerpo modificado purificado y se dejó reaccionar a 4 °C durante 30 minutos para reducir el grupo tiol, y luego se le agregaron 2,5 equivalentes de MC-vc-PAB-MMAE. y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de un exceso de cisteína y el exceso de MC-vc-PAB-MMAE y el TCEP se eliminó por centrifugación, filtración y diálisis en solución salina tamponada con fosfato, produciendo así FM2b-X-MC-vc-PAB-MMAE purificado resultante.
El rendimiento de la conjugación con la cadena pesada de cada anticuerpo modificado se muestra en la tabla 8 a continuación.
Tabl : R n imi n n DAR2 r l n i n M -v -PAB-MMAE n ni r FM2 -X m ifi ados
Figure imgf000017_0002
Como puede observarse en la tabla 8 anterior, incluso cuando el sitio interno de la serina de la secuencia de M2b ACGHAASGHA se reemplazó con otros restos de aminoácidos, se obtuvieron resultados similares a los mostrados por FM2b.
Ejemplo 11: Purificación del conjugado de anticuerpo-fármaco con DAR de 2
Los conjugados de anticuerpo modificado-fármaco producidos en el ejemplo 4 anterior tenían diferentes números de fármacos conjugados por anticuerpo modificado (relación de fármaco a anticuerpo; DAR), y por ello, no sería fácil comparar la citotoxicidad del fármaco in vitro. Por lo tanto, para purificar conjugados de anticuerpo modificado-fármaco que tengan la misma DAR, los conjugados de anticuerpo modificado-fármaco se purificaron mediante cromatografía hidrófoba. Usando cromatografía en columna de fenilo, se purificaron conjugados de anticuerpo modificado-fármaco que tenían una DAR de 2. La columna se equilibró con tampón (que contenía succinato de sodio 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 5,0) y, a continuación, cada conjugado de anticuerpo modificado-fármaco se inyectó en la columna. La columna se lavó con el mismo tampón y luego se le añadió el tampón que contenía acetonitrilo al 30 % y el conjugado de anticuerpo modificado-fármaco se eluyó según la DAR. El conjugado de anticuerpo modificado-fármaco eluido se sometió a diálisis en tampón (que contenía succinato de sodio 10 mM, sacarosa 30 mM, pH 6,0).
Ejemplo 12: Prueba para determinar la estabilidad de los conjugados de anticuerpo-fármaco in vitro
Como se describe en los ejemplos 9, 10 y 11 anteriores, se produjeron FM2b-S-D2, FM2b-F-D2, FM2b-K-D2 y FM2b-Y-D2, que son conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden dos fármacos MC-vc-PAB-MMAE. Cada uno de los conjugados de anticuerpo-fármaco producidos se incubó a temperaturas de 25 °C y 50 °C, se midió el cambio en el número de fármacos conjugados y el cambio en la agregación.
Para cada conjugado de anticuerpo-fármaco, se prepararon 12 muestras de prueba en cada una de las concentraciones de 1 mg/ml y 110 ml. Para cada conjugado de anticuerpo-fármaco, se midieron los cambios en la DAR y la pureza de monómeros al tiempo que se almacenaron 6 muestras a 25 °C y las 6 muestras restantes se almacenaron a 60 °C durante 0, 1, 3, 5, 7 y 14 días. A 25 °C, se observó una disminución en el contenido de DAR2 de aproximadamente 1,5-2 % en cada muestra, y se observó una disminución en la pureza de monómeros de aproximadamente 0,3-4 % en cada muestra, pero la diferencia en el contenido de DAR2 y la pureza de monómeros entre las muestras no fue significativa. Los cambios en el contenido de DAR2 y la pureza de monómeros, observados a 50 °C, fueron mayores que los valores observados a 25 °C, pero la diferencia entre las muestras no fue significativa. Esto sugiere que las diferencias entre las variantes de anticuerpos no eran significativas.
Tabla 9: Contenido de monómeros de FM2b-S-D2, FM2b-F-D2, FM2b-K-D2 y FM2b-Y-D2 los días 0, 1, 3, 5, 7 y 15 en condiciones^ de almacenamiento de 25 °C 50 °C
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Tabla 10: Contenidos de DAR2 de FM2b-S-D2, FM2b-F-D2, FM2b-K-D2 y FM2b-Y-D2 los días 0, 1, 3, 5, 7 y 15 en condiciones de almacenamiento de 25 °C 50 °C
Figure imgf000018_0002
Ejemplo 13: Prueba para determinar la inhibición del crecimiento celular in vitro
Para comparar las capacidades de inhibición del crecimiento celular in vitro de los conjugados de anticuerpo modificado-fármaco, se realizó una prueba de inhibición del crecimiento celular utilizando células KB que sobreexpresan el receptor de folato. Las células KB se diluyeron en medio DMEM/F12 que contenía FBS al 10 % y, a continuación, se añadieron 100 pl de la dilución celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células/pocillo. A continuación, la placa de pocillos se incubó en una estufa de incubación con dióxido de carbono al 5 % a 37 °C durante 24 horas para unir las células a la placa. Cada muestra de prueba se diluyó en medio y luego se agregó a cada pocillo a concentraciones de 6,45 nM, 3,23 nM, 1,61 nM, 0,806 nM, 0,403 nM, 0,202 nM, 0,101 nM, 0,0504 nM, 0,0252 nM y 0,0126 nM, y también se añadió medio (sin fármaco) a un pocillo de control. Después de 5 días de incubación, se añadieron 20 pl/pocillo de reactivo CellTiter 96-AQueous One Solution [ensayo basado en MTS; MTS forma formazán púrpura por deshidrogenasa de células vivas, y el crecimiento se mide por la cantidad de formazán púrpura producido] a cada pocillo y luego se incubó en una estufa de incubación a 37 °C durante 2 horas. El lisado celular se midió mediante un espectrómetro de absorción a una D.O. de 490 nm, determinando así la viabilidad (%).
13-1: Prueba de comparación de la actividad inhibidora del crecimiento celular entre FM2-D2 y FM2b-D2 (o FM2b-S-D2)
Se prepararon anticuerpo original Fwt, FM2-D2 (un conjugado de anticuerpo modificado (FM2)-fármaco (MMAE) que tiene una DAR de 2) y FM2b-D2 (un anticuerpo modificado (FM2b)-fármaco (MMAE) que tiene una DAR de 2), obtenidos conjugando MMAE en los ejemplos anteriores y realizando la purificación para tener el mismo DAR y las células KB se trataron con cada uno de los conjugados preparados, después de lo cual se comparó la actividad inhibidora del crecimiento celular del fármaco entre los conjugados.
Como se puede observar en la figura 3, los conjugados de anticuerpo-fármaco (FM2-D2 y FM2b-D2) mostraron efectos contra el cáncer significativamente mejores que el anticuerpo original. FM2-D2 y FM2b-D2 mostraron casi el mismo efecto inhibidor contra el crecimiento de células cancerosas. Estos resultados indican que cuando los conjugados de anticuerpo modificado-fármaco tienen la misma DAR, no hay diferencia en la actividad inhibidora de células

Claims (64)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de anticuerpo-fármaco en el que un anticuerpo modificado que comprende un motivo, en un extremo del anticuerpo, que está unido a un fármaco por un enlazador, en donde el motivo comprende [Mmotivo1]n1-Xb-[Mmotivo2]n2, en el que Mmotivo1 comprende una secuencia de ACGHA (SEQ ID NO: 1) o AHGCA (SEQ ID NO: 2); y Mmotivo2 comprende una secuencia de AXGHA (SEQ ID NO: 3) o AHGXA (SEQ ID NO: 4), en donde X en la SEQ ID NO: 3 o 4 comprende un resto de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina (S), alanina (A), treonina (T), tirosina (Y), ácido aspártico (D), lisina (K) y fenilalanina (F), en donde Xb es 0; y n1 y n2 son cada uno un número entero de 1.
2. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el motivo representado por la fórmula (1) estructural anterior comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 21 a 24, 33 a 36, 45 a 48, 57 a 60, 69 a 72, 81 a 84, 93 a 96.
3. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el motivo se introduce en el extremo carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo.
4. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el enlazador comprende un grupo funcional reactivo, que se une al motivo, un aminoácido y un espaciador de autoescisión.
5. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el fármaco es uno o más seleccionado entre maitansinoide, auristatina, aminopterina, actinomicina, bleomicina, talisomicina, camptotecina, N8-acetil espermidina, 1-(2 cloroetil)-1,2-dimetilsulfonilhidrazida, esperamicina, etopósido, 6-mercaptopurina, dolastatina, tricoteceno, caliqueamicina, taxano, metotrexato, vincristina, vinblastina, doxorrubicina, melfalán, mitomicina A, mitomicina C, clorambucilo, duocamicina, enzimas nucleolíticas, toxinas de origen bacteriano, vegetal o animal, cisplatino, irinotecán, paclitaxel y docetaxel.
6. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es uno o más seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado.
7. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
8. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo tiene una afinidad y especificidad de unión por antígenos específicos de cáncer, proteínas receptoras de la superficie celular, proteínas de la superficie celular, proteínas transmembranarias, proteínas de señalización, reguladores de supervivencia celular, reguladores de proliferación celular, moléculas asociadas con el desarrollo o la diferenciación de tejidos, linfocinas, citocinas, moléculas implicadas en la regulación del ciclo celular, moléculas implicadas en la vasculogénesis o moléculas asociadas con la angiogénesis.
9. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo tiene una afinidad de unión por una o más dianas seleccionadas del grupo que consiste en:
(1) BMPRIB (receptor de tipo IB de proteína morfogenética ósea; número de registro de GenBank NM_001203); (2 ) E16 (LAT1, SLC7A5; número de registro de GenBank NM_003486);
(3) STEAP1 (antígeno epitelial de próstata de seis transmembrana; número de registro de GenBank NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUC16; número de registro de GenBank AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina; número de registro de GenBank NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de transportadores de soluto 34 (fosfato de sodio), miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II; número de registro de GenBank NM _006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, Se Ma 5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y similar a tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmático corto, (semaforina) 5B; número de registro de GenBank AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, gen del ADNc RIKEN 2700050C12; número de registro de GenBank AY358628);
(9) ETBR (receptor de endotelina de tipo B; número de registro de GenBank AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315; número de registro de GenBank NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado con cáncer de próstata, proteína 1 asociada con cáncer de próstata, antígeno epitelial de próstata 2 de seis transmembrana, proteína seis transmembrana de la próstata; número de registro de GenBank AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, receptor potencial transitorio del canal de cationes, subfamilia M, miembro 4; número de registro de GenBank NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma; número de registro de GenBank NP_003203 o NM_003212);
(14) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein-Barr) o Hs.73792; número de registro de GenBank M26004);
(15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (beta asociada a inmunoglobulina), B29; número de registro de GenBank NM_000626);
(16) FcRH2 (lFGP4, IRTA4, SPAP1A (dominio SH2 que contiene la proteína de anclaje de fosfatasa la), SPAP1B, SpAp IC; número de registro de GenBank NM_030764);
(17) HER2 (número de registro de GenBank M11730);
(18) receptor ErbB seleccionado entre EGFR, HER3 y HER4
(19 ) NCA (número de registro de GenBank M18728);
(20 ) MDP (número de registro de GenBank BC017023);
(21 ) IL20R a (número de registro de GenBank AF184971);
(22 ) Brevican (número de registro de GenBank AF229053);
(23 ) EphB2R (número de registro de GenBank NM_004442);
(24 ) ASLG659 (número de registro de GenBank AX092328);
(25 ) PSCA (número de registro de GenBank AJ297436);
(26 ) GEDA (número de registro de GenBank AY260763);
(27 ) BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, receptor de BLyS, BR3; NP_443177.1);
(28 ) CD22 (isoforma CD22-B del receptor de linfocitos B; NP-001762.1);
(29) CD79a (CD79A, CD79a, alfa asociada a inmunoglobulina, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moléculas de IgM, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B; número de registro de GenBank NP_001774.1);
(30) CXCR5 (receptor 1 del linfoma de Burkitt, un receptor acoplado a proteína G que se activa por la quimiocina CXCL 13, actúa en la migración de linfocitos y la defensa humoral, tiene un papel en la infección por VIH-2 y quizás en la aparición de SIDA, linfoma, mieloma y leucemia; número de registro de GenBank NP_001707.1);
(31) HLA-DOB (subunidad beta de la molécula de clase II de MHC (antígeno la) que se une a péptidos y los presenta a linfocitos T CD4+; número de registro de GenBank NP_002111.1);
(32) P2X5 (canal de iones 5 activado por ligando P2X de receptor prurinérgico, un canal de iones activado por ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión sináptica y la neurogénesis, y su deficiencia puede contribuir a la fisiopatología de la inestabilidad idiopática del detrusor; número de registro de GenBank NP_002552.2);
(33) Cd 72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B, Lyb-2; número de registro de GenBank NP_001773.1);
(34) LY64 (antígeno linfocitario 64 (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activación y la apoptosis de linfocitos B, la pérdida de función se asocia con una actividad aumentada de la enfermedad en pacientes con lupus eritematoso sistémico; número de registro de GenBank NP_005573.1);
(35) FcRH1 (proteína 1 similar al receptor Fc, un supuesto receptor del dominio Fc de inmunoglobulina que contiene dominios similares a Ig de tipo C2 e ITAM, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B; número de registro de GenBank NP_443170.1);
(36) IRTA2 (superfamilia del receptor de translocación 2 asociado a inmunoglobulina, un supuesto inmunorreceptor con posibles papeles en el desarrollo de linfocitos B y la linfomagénesis; la desregulación del gen por translocación se produce en algunas neoplasias malignas de linfocitos B; número de registro de GenBank NP_112571.1);
(37) TENB2 (supuesto proteoglicano transmembrana, relacionado con la familia de factores de crecimiento EGF/heregulina y folistatina); número de registro de GenBank AF179274);
(38) MAGE-C1/CT7 (proteína sobreexpresada en cáncer testicular);
(39) receptor de andrógenos, PTEN, peptidasa 3 relacionada con la calicreína humana (proteína sobreexpresada en cáncer de próstata);
(40) CD20;
(41) CD30;
(42) CD33;
(43) CD52;
(44) EpCam;
(45) CEA;
(46) gpA33;
(47) mucinas;
(48) TAG-72;
(49) anhidrasa carbónica IX;
(50) PSMA;
(51) receptor de folato (familia de proteínas sobreexpresadas por el gen FOLR. Tiene una afinidad de unión por el ácido fólico y libera intracelularmente 5-metiltetrahidrofolato);
(52) gangliósidos (GD2, GD3, GM2);
(53) hidrato/sacárido Lewis-Y;
(54) VEGF;
(55) VEGFR;
(56) aVb3;
(57) a5bl;
(58) ERB3;
(59) c-MET;
(60) EphA3;
(61) TRAIL-R1, TRAIL-R2;
(62) RANKL;
(63) FAP; y
(64) tenascina.
10. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende la región variable y la CH1, CH2 y CH3 de IgG2 o IgG4, o el Fab (del anticuerpo modificado) y el Fc de IgG2 o IgG4.
11. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el fármaco está conjugado con el resto de cisteína o X en el motivo.
12. Una composición para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer, que comprende el conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 como principio activo.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050276812A1 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
US20100111856A1 (en) * 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
EP2185188B1 (en) * 2007-08-22 2014-08-06 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
WO2012170969A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
AU2013222935B2 (en) * 2012-02-24 2016-03-10 Alteogen Inc. Modified antibody in which motif comprising cysteine residue is bound, modified antibody-drug conjugate comprising the modified antibody, and production method for same

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