ES2928689T3 - Sistema de plásmidos - Google Patents

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Florian Sonntag
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Abstract

La presente invención se refiere a sistemas de dos plásmidos, plásmidos auxiliares y/o plásmidos vectoriales para producir vectores AAV recombinantes (rAAV). La invención se refiere además a métodos que usan, o usos de, los sistemas de dos plásmidos, plásmidos auxiliares y/o plásmidos vectores de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de plásmidos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a sistemas de dos plásmidos y/o plásmidos auxiliares para producir vectores AAV recombinantes (rAAV). La invención se refiere además a métodos que usan los sistemas de dos plásmidos y/o plásmidos auxiliares de la invención, o a sus usos.
Antecedentes de la invención
Los vectores de virus adenoasociados recombinantes ("recombinant adeno-associated virus", rAAV) tienen un potencial considerable para la terapia génica debido a su prometedor perfil de seguridad y su capacidad para transducir muchos tejidos in vivo. Sin embargo, la producción sigue siendo bastante difícil y compleja y el aumento de escala de la producción a escala industrial se ha logrado solo en un grado limitado. Una de las razones de esto es que la producción de rAAV depende de una coinfección con un virus auxiliar para propagarse y establecer un ciclo de vida productivo. La infección de células con un virus auxiliar competente para la replicación, por ejemplo, un adenovirus, para la producción de rAAV tiene la desventaja de que las cepas de rAAV resultantes están contaminadas con virus auxiliar, lo cual requiere realizar etapas de eliminación de virus validados en el proceso de purificación posterior.
Por este motivo, el uso de la coinfección por adenovirus suele evitarse proporcionando las funciones auxiliares adenovirales pertinente en un plásmido que se cotransfecta junto con varios otros plásmidos que contienen las funciones Rep y Cap de AAV, y el "genoma del vector" de rAAV, es decir, el ácido nucleico heterólogo que comprende la "carga útil" genética del rAAV, flanqueado por las secuencias de repetición terminal invertida (ITR) que aseguran la encapsidación del ácido nucleico heterólogo dentro de las partículas virales producidas. Por ejemplo, Emmerling et al. (2016), en la sección 3.1.2 describe sistemas de cuatro plásmidos en los que las funciones Rep, Cap y auxiliar adenoviral se proporcionan cada una en plásmidos separados, junto con el genoma del vector en un cuarto plásmido. La síntesis de plásmidos es un factor importante del aumento del coste de los productos, y el uso de cuatro plásmidos, todos los cuales deben ingresar a la misma célula para que la producción de rAAV se produzca en esa célula, es una desventaja desde un punto de vista económico y de eficacia.
En la sección 3.1.3 de Emmerling et al. (2016) se menciona un sistema de dos plásmidos, en el que un plásmido contiene Rep, Cap y el genoma del vector, proporcionándose las funciones adenovirales en el segundo plásmido. En este sentido, debe señalarse que una de las principales preocupaciones de las agencias reguladoras de medicamentos con respecto a la seguridad de los productos basados en virus, ya sea para virus oncolíticos o vectores de transferencia de genes, es la generación de retromutantes similares al tipo salvaje mediante la recombinación de la información genética contenida en los materiales de partida, por ejemplo, en este caso, tras la transfección de las células de producción con plásmidos que portan colectivamente esta información. Los acontecimientos de recombinación entre los plásmidos pueden dar como resultado la generación de los denominados virus competentes para la replicación ("replication competent", rc) (en el caso de AAV, de partículas de AAV competentes para la replicación (rcAAV)). Cuando Rep y Cap están presentes en el mismo plásmido, existe el riesgo de que se produzcan niveles inaceptables de rcAAV por recombinación intramolecular o intermolecular (dependiendo de qué plásmido porta el ITR-ácido nucleico heterólogo-ITR).
Tal disposición de plásmido también es económicamente subóptima cuando se desea cambiar a un genoma de vector diferente (es decir, un ácido nucleico heterólogo de interés; módulo de transgén), o para cambiar a un serotipo de cápside diferente (es decir, un gen Cap diferente) que podría ser deseable en el caso de que se busque un tropismo de tejido diferente. En cualquier caso, será necesario sintetizar un nuevo plásmido (Rep-Cap-genoma del vector), siendo el coste de cada síntesis en parte una función de la longitud del plásmido, a lo que contribuye el gen Rep (invariable).
A modo de antecedentes adicionales: (i) el documento US 2005/080027 divulga la producción optimizada de vectores virales derivados de parovirus en células de producción y encapsidación mediante infección por hsv o tratamiento con inhibidores de metilación del ADN; (ii) el documento US 2003/103939 divulga virus adenoasociados seudotipados y sus usos; y (iii) el documento CN 108048483 describe un sistema de vector HAdV-5 de adenovirus recombinante de tipo replicación y su aplicación.
Con el fin de satisfacer la demanda actual de material de vector rAAV para ensayos clínicos y suministros para el mercado, los siguientes objetivos aún no se han logrado: (a) la mejora del perfil de seguridad y calidad de los vectores rAAV para cumplir las exigencias reglamentarias sobre la calidad de los vectores; (b) una economía mejorada de la fabricación de rAAV en términos del coste de los materiales de partida para una campaña de fabricación determinada, así como el coste del cambio entre campañas; (c) unos altos rendimientos de producción de rAAV; y (d) el control sobre la proporción de partículas de rAAV producidas que contienen ("llenas") o que carecen ("vacías") de un genoma de vector recombinante completo.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un sistema de dos plásmidos para la fabricación de rAAV, en el que al menos algunas de las funciones del gen auxiliar de adenovirus se combinan con Rep de AAV en un plásmido, y Cap de AAV se combina con el genoma del vector rAAV en un segundo plásmido. El sistema de dos plásmidos "Rep-Cap transdivididos" es mejor que los sistemas conocidos, puesto que logra una combinación de economía mejorada que surge del formato más sencillo y flexible, con atributos de seguridad y calidad mejorados, además de otras ventajas sorprendentes como se describe en este documento.
En consecuencia, la invención incluye los siguientes aspectos:
[1] Un plásmido auxiliar que comprende al menos un gen rep de virus adenoasociado (AAV) que codifica al menos una proteína Rep de AAV funcional y al menos un gen de virus auxiliar, y que no comprende un gen cap que codifica un conjunto funcional de proteínas Cap.
[2] Un sistema de dos plásmidos que comprende el plásmido auxiliar de [1] y un vector plasmídico.
[3] El sistema de dos plásmidos de [2], en el que:
(i) el vector plasmídico comprende:
(a) un gen cap de AAV que codifica al menos una proteína Cap de AAV funcional; o
(b) al menos un promotor del gen cap de AAV, un sitio de clonación unido operativamente al promotor del gen cap de AAV y un módulo de expresión flanqueado en al menos un lado por una repetición terminal invertida ("inverted terminal repeat", ITR);
en el que el vector plasmídico no comprende un gen rep que codifica una proteína Rep funcional y el módulo de expresión comprende un transgén unido operativamente al menos a un elemento de control regulador; y/o (ii) la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico está entre 1:1 y 1:4.
[4] El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de uno cualquiera de los aspectos anteriores, en el que dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 52 funcional, al menos un gen que codifica una proteína Rep 40 funcional y un gen que codifica una proteína Rep 68 funcional.
[5] El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de uno cualquiera de los aspectos anteriores, en el que: (i) dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 52 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 52 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 1000 nucleótidos de longitud de los nucleótidos 993-2186 de SEQ ID NO:1, o con un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV; y/o
(ii)
(a) dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 40 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 40 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 800 nucleótidos de longitud de un tramo de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 993-2252 menos los nucleótidos 1907-2227 de SEQ ID NO:1, o con tramos de nucleótidos correspondientes en un serotipo diferente de AAV; y/o
(b) dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 40 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 40 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 1100 nucleótidos de longitud de los nucleótidos 993-2252 de SEQ ID NO:1, o con un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV; y/o
(iii) dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 68 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 68 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 1500 nucleótidos de longitud de un tramo de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 321-2252 menos los nucleótidos 1907­ 2227 de SEQ ID NO:1, o con tramos de nucleótidos correspondientes en un serotipo diferente de AAV.
[6] El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de uno cualquiera de los aspectos anteriores, en el que: (i) el plásmido auxiliar no comprende un gen que codifica una proteína Rep 78 funcional; y/o
(ii) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 1800 nucleótidos correspondientes a un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendido dentro de los nucleótidos 321-2186 de SEQ ID NO:1 o dentro de un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV; y/o
(iii) dicho al menos un gen rep de AAV no comprende un promotor p40 interno funcional; y/o
(iv) el plásmido auxiliar no comprende un tramo contiguo de la secuencia del gen cap exclusivamente de más de 60 nucleótidos.
[7] El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de uno cualquiera de los aspectos anteriores, en el que: (i) el plásmido auxiliar comprende al menos un gen de virus auxiliar y dicho al menos un gen de virus auxiliar comprende un ácido nucleico asociado a virus ("viral associated", VA), un gen E2A y un gen E4; y/o
(ii) el plásmido auxiliar comprende al menos un gen de virus auxiliar y dicho al menos un gen de virus auxiliar comprende un ácido nucleico VA, un gen E2A y un gen E4, y el gen E4 no está ubicado entre el ácido nucleico VA y el gen E2A; y/o
(iii) el plásmido auxiliar comprende al menos un gen de virus auxiliar y el plásmido auxiliar tiene una longitud de entre 12000 pb y 15000 pb; y/o
(iv) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 3000 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 194-3620 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus; y/o
(v) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 60 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 4032-4100 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus; y/o
(vi) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 350 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 4051-4413 de SEQ ID NO:1, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV.
[8] El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de uno cualquiera de los aspectos anteriores, en el que: (i) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 600 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 2301-2947 de SEQ ID NO:1, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV; y/o
(ii) el plásmido auxiliar comprende al menos un gen de virus auxiliar y dicho al menos un gen de virus auxiliar comprende un ácido nucleico VA, un gen E2A y un gen E4, y el ácido nucleico VA, el gen E2A y el gen E4 están comprendidos dentro de una porción contigua de menos de 10000 nucleótidos; y/o
(iii) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 22000 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 10619-32756 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus; y/o
(iv) el plásmido auxiliar y/o el vector plasmídico no comprende un sitio de unión a Rep artificial.
[9] El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de uno cualquiera de los aspectos anteriores, en el que el plásmido auxiliar comprende al menos un gen del virus auxiliar y dicho al menos un gen del virus auxiliar está comprendido en un tramo contiguo del plásmido que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 8000 nucleótidos de longitud de SEQ ID NO:4.
[10] El sistema de dos plásmidos de uno cualquiera de [2]-[9], en el que:
(i) el vector plasmídico comprende al menos un promotor del gen cap de AAV, que comprende un promotor p40 de AAV, un promotor p5 y un promotor p19; y/o
(ii) el vector plasmídico no comprende codones de iniciación de la traducción prescindibles; y/o
(iii) el vector plasmídico comprende una región promotora que comprende uno o más promotores, y en la región promotora:
(a) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 321-323 de SEQ
Figure imgf000004_0001
ID NO:1 están ausentes; (b) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 766-768 de SEQ
Figure imgf000004_0002
ID NO:1 no son ATG; (c) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 955-957 de SEQ
Figure imgf000004_0003
ID NO:1 están ausentes; (d) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 993-995 de SEQ ID NO:1 están ausentes; y (e) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1014-1016 de SEQ ID NO:1 están ausentes; y/o (iv) el vector plasmídico comprende un esqueleto de menos de 3000 nucleótidos de longitud.
[11] El sistema de dos plásmidos de [10(iii)(b)], en el que los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 766­ 768 de SEQ ID NO:1 son ATT.
[12] Un método para producir una preparación de AAV recombinante que comprende:
(a) obtener el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico como se define en uno cualquiera de [1]-[11];
(b) transfectar una célula huésped con el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico como se define en uno cualquiera de [1]-[11]; y
(c) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de AAV recombinante.
[13] El método de [12]:
(i) que comprende además una etapa de recolección del AAV recombinante para proporcionar una preparación de AAV recombinante; y/o
(ii) en el que la preparación de a Av recombinante comprende un nivel bajo de AAV competente para la replicación (rcAAV); y/o
(iii) en el que el nivel de rcAAV medido es menor que 1 rcAAV en 107 AAV recombinantes, menor que 1 rcAAV en 109 AAV recombinantes, o menor que 1 rcAAV en 1010 AAV recombinantes; y/o
(iv) en el que la preparación de AAV recombinante comprende un nivel bajo de rcAAV y el nivel de rcAAV es menor que el nivel de rcAAV producido utilizando un método equivalente, excepto que el vector plasmídico comprende al menos un gen rep de AAV y al menos un gen cap de AAV; y/o
(v) comprende una etapa de seleccionar una proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico en el que la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico se selecciona o ajusta a una proporción que permite al usuario obtener la proporción deseada de partículas llenas a totales o el rendimiento alto o deseado del vector AAV recombinante; y/o
(vi) en el que la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico se selecciona o ajusta a una proporción que logra un rendimiento máximo de AAV recombinante con el rendimiento mínimo de partículas vacías alcanzable con dicho rendimiento máximo de AAV recombinante; y/o
(vii) en el que la proporción deseada de partículas llenas a totales es una proporción de partículas llenas a totales que es al menos el 20 % o al menos el 30 % de la proporción de partículas llenas a totales lograda utilizando un método equivalente con una proporción de plásmido auxiliar al vector plasmídico de 1,8:1; y/o (viii) que comprende además una etapa de purificación del AAV recombinante.
Descripción de las figuras
La figura 1 proporciona un esquema del genoma de AAV nativo que muestra transcritos de Rep y Cap (VP1-3) solapantes y la posición de p5, promotores p19 y p40. ITR = repetición terminal invertida.
La figura 2 proporciona un esquema del plásmido auxiliar construido como se describe en el ejemplo 1, con un recuadro que muestra los genes rep, incluidos p5, promotores p19 y p40. Las cruces sobre "p40" indican que estos promotores se han vuelto no funcionales. El área rayada en el gen rep 52/40 indica la presencia de la secuencia del intrón que se corta y empalma en el transcrito rep 52, pero se corta fuera del transcrito rep 40. Ori = origen de replicación bacteriano. KanR = gen de resistencia a la kanamicina. Obsérvese que las características respectivas del plásmido no se muestran a escala.
La figura 3 proporciona un esquema del vector plasmídico construido como se describe en el esquema del plásmido auxiliar construido como ejemplo 1, con un recuadro que muestra el gen cap y la región promotora secuencia arriba que incluye los promotores p5, p19 y p40. Las cruces sobre "ATG" y "gTg " indican que estos posibles codones de iniciación de la traducción se han delecionado. Ori = origen de replicación bacteriano. KanR = gen de resistencia a la kanamicina. ITR = repetición terminal invertida. Obsérvese que las características respectivas del plásmido no se muestran a escala.
La figura 4 proporciona esquemas que muestran vectores plasmídicos: (A) contiene un gen cap y un sitio de clonación múltiple, flanqueado por ITR, para la clonación en un módulo de expresión; (B) contiene un gen cap y un sitio de clonación múltiple para la clonación en un módulo de expresión flanqueado por ITR; (C) contiene un módulo de expresión, flanqueado por ITR, y un sitio de clonación múltiple, secuencia abajo de una región promotora que contiene los promotores p5, p19 y p40, para la clonación en un gen cap; (D) contiene un sitio de clonación múltiple, flanqueado por ITR, para la clonación en un módulo de expresión y otro sitio de clonación múltiple, secuencia abajo de una región promotora que contiene los promotores p5, p19 y p40, para la clonación en un gen cap; (E) contiene un sitio de clonación múltiple para la clonación en un módulo de expresión flanqueado por ITR y otro sitio de clonación múltiple, secuencia abajo de una región promotora que contiene los promotores p5, p19 y p40, para la clonación en un gen cap.
La figura 5 proporciona los resultados del análisis de rAAV producido y ensayado como se describe en el ejemplo 2. (A) Título de partículas por ml medido mediante ELISA anticápside en rAAV producido usando el sistema de dos plásmidos en proporciones variables de plásmido auxiliar:vector plasmídico a niveles constantes de ADN plasmídico total. "no divididos" = sistema de dos plásmidos con funciones Rep y Cap en el mismo plásmido, utilizado en relación de plásmido módulo de expresión auxiliar de AdV:rep-cap 1,6:1. "Ctrl" = control negativo: plásmido auxiliar transfectado con pUC19 en lugar de vector plasmídico. (B) Título del genoma del vector (vg) por ml medido por qPCR que amplifica una secuencia dentro del promotor del módulo de expresión en las muestras de rAAV de (A). (C) Proporción de vg (de B) a las partículas totales (de A), expresada como "% de llenas", es decir, el número de vg como porcentaje del número de partículas. Nota: 1,0E+12 = 1,0 * 1012. Las barras de error muestran la desviación estándar del análisis por triplicado de las muestras.
La figura 6 muestra la cuantificación de rAAV en diferentes lotes de rAAV. Se analizó el contenido de rcAAV en tres lotes diferentes de rAAV que contenían el mismo módulo de transgén (que codifica el factor IX).
La figura 7 muestra la modulación de los rendimientos y la proporción de partículas llenas a totales mediante la modificación de la proporción de plásmidos. Se ensayaron seis proporciones de plásmidos diferentes para el sistema de dos plásmidos en la producción de rAAV. Las proporciones molares de plásmido de A a F son 3:1, 1,8:1, 1:1,5, 1:2, 1:3 y 1:5, respectivamente. Los rendimientos del genoma del virus se determinaron mediante qPCR específica del módulo del transgén. Los rendimientos de la cápside se determinaron mediante ELISA específico de cápside. Las proporciones de partículas llenas a totales se calcularon en función de los resultados de qPCR y ELISA.
La figura 8 muestra los rendimientos del genoma del virus para cuatro transgenes diferentes en el sistema de encapsidación de dos plásmidos. Se usaron cuatro transgenes diferentes para la encapsidación de rAAV. Se realizaron dos experimentos de encapsidación independientes para cada transgén. Los rendimientos se cuantificaron utilizando qPCR específicas de módulo de transgén.
La figura 9 muestra la producción de rAAV aplicando diferentes serotipos de cap o variantes de cap sintéticas. El rAAV se generó aplicando la proporción de plásmido molar idéntica, cinco serotipos de cap diferentes/variantes de cap sintéticas y el mismo módulo transgénico. Los rendimientos del genoma del virus se determinaron mediante qPCR específica de módulo de transgén.
Descripción detallada
Definiciones generales
A menos que se definan de otra manera, los términos y las expresiones científicos y técnicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden normalmente los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención.
En general, la expresión "que incluye" se utiliza para significar "que incluye, entre otros/otras". Por ejemplo, la expresión "un plásmido auxiliar que comprende al menos un gen rep" debe interpretarse en el sentido de que el plásmido auxiliar tiene al menos un gen rep, pero el plásmido auxiliar puede comprender componentes adicionales, tales como genes adicionales.
En algunas realizaciones de la invención, la expresión "que comprende" reemplaza a la expresión "que consiste en" o la expresión "que consiste fundamentalmente en". La expresión "que consiste en" pretende ser limitante. Por ejemplo, la expresión "un plásmido auxiliar que consiste en un gen rep" debe entenderse que significa que el plásmido auxiliar tiene un gen rep y ningún otro material genético. De forma análoga, la expresión "un plásmido auxiliar que consiste fundamentalmente en un gen rep" debe entenderse que significa que el plásmido auxiliar tiene un gen rep y no comprende componentes adicionales que afecten materialmente a la función del plásmido auxiliar. Por ejemplo, un plásmido auxiliar que consiste fundamentalmente en un gen rep no contendrá ningún otro gen, pero podría contener otro material genético, como espaciadores.
Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en este documento y pretenden referirse a una cadena polimérica de aminoácidos de cualquier longitud.
Para los fines de la presente invención, para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias (tales como dos secuencias polinucleotídicas o dos secuencias polipeptídicas), las secuencias se alinean con fines de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una primera secuencia para un alineamiento óptimo con una segunda secuencia). Luego se comparan los nucleótidos o los aminoácidos en cada posición. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces los aminoácidos o los nucleótidos son idénticos en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones en la secuencia de referencia x 100).
Normalmente, la comparación de secuencias se lleva a cabo a lo largo de la secuencia de referencia. Por ejemplo, si el usuario desea determinar si un secuencia concreta ("de ensayo") es 95 % idéntica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:1 sería la secuencia de referencia. Para evaluar si una secuencia es al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO:1 (un ejemplo de una secuencia de referencia), los expertos llevarían a cabo un alineamiento a lo largo de la SEQ ID NO:1 e identificarían cuántas posiciones en la secuencia de ensayo son idénticas a las de SEQ ID NO:1. Si al menos el 80 % de las posiciones son idénticas, la secuencia de ensayo es al menos el 80 % idéntica a la SEQ ID NO:1. Si la secuencia es más corta que la SEQ ID NO:1, los huecos o posiciones que faltan deben considerarse posiciones no idénticas.
Los expertos en la materia conocen diferentes programas informáticos que están disponibles para determinar la homología o la identidad entre dos secuencias. Por ejemplo, puede realizarse la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias mediante un algoritmo matemático. En una realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
En el presente documento, el término "plásmido" pretende indicar una molécula de ácido nucleico que puede replicarse independientemente de un cromosoma celular. El término "plásmido" pretende abarcar moléculas de ácido nucleico circulares y moléculas de ácido nucleico lineales. Además, el término "plásmido" pretende abarcar plásmidos bacterianos, pero también cósmidos, minicírculos (Nehlsen, K., Broll S., Bode, J. (2006), Gene Ther. Mol. Biol., 10:233-244; Kay, M.A., He, C.-Y, Chen, Z.-N. (2010), Nature Biotechnology, 28:1287-1289) y minicuerdas (Nafissi N., Alqawlaq S., Lee E.A., Foldvari M., Spagnuolo P.A., Slavcev R.A. (2014), Mol. Ther. Nucleic Acids, 3:e165). Opcionalmente, el plásmido es una molécula de ácido nucleico circular. Opcionalmente, el plásmido es una molécula de ácido nucleico de origen bacteriano.
El término "auxiliar" no pretende ser limitante. En consecuencia, un "plásmido auxiliar" es cualquier plásmido que: (i) comprende al menos un gen rep que codifica al menos una proteína Rep funcional y no comprende un gen cap que codifica una proteína Cap funcional; o
(ii) comprende al menos un gen de virus auxiliar y no comprende un gen cap que codifica una proteína Cap funcional, y dicho al menos un gen de virus auxiliar está comprendido en un tramo contiguo del plásmido que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 6000, al menos 7000 o al menos 8000 nucleótidos de longitud de SEQ ID NO:4. La expresión "vector plasmídico" no pretende ser limitante. En consecuencia, un "vector plasmídico" es cualquier plásmido que:
(i) es adecuado para usar junto con un plásmido auxiliar en un sistema de dos plásmidos de la invención; o (ii) comprende:
(a) un gen cap que codifica al menos una proteína Cap funcional; o
(b) al menos un promotor del gen cap, un sitio de clonación unido operativamente al promotor del gen cap y un módulo de expresión flanqueado en al menos un lado por una ITR;
en el que el vector plasmídico no comprende un gen rep que codifica una proteína Rep funcional y el módulo de expresión comprende un transgén unido operativamente al a menos un elemento de control regulador.
La expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o sus análogos. Preferentemente, el plásmido está formado por desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Incluso más preferentemente, el plásmido está formado por desoxirribonucleótidos, es decir, el plásmido es una molécula de ADN.
La expresión "tipo salvaje" y el término "nativo" son sinónimos y se refieren a genes presentes en el genoma de una cepa/serotipo de AAV o adenovirus, o a proteínas codificadas por genes presentes en el genoma de una cepa/serotipo de AAV o adenovirus.
Ensayo de producción de AAV
En un ensayo de producción de AAV, el usuario puede determinar si un determinado plásmido o sistema de dos plásmidos de "ensayo" son eficaces para producir rAAV a un nivel similar a un plásmido o sistema de dos plásmidos de "referencia" como sigue.
El usuario proporciona un sistema de dos plásmidos de "referencia" que comprende un "plásmido auxiliar de referencia" y un "vector plasmídico de referencia".
Por ejemplo, el usuario proporciona un plásmido auxiliar de referencia que comprende genes auxiliares de adenovirus 5 de tipo salvaje que codifican E2A, E4 y VA ARN I y II, es decir, los genes auxiliares de adenovirus comprendidos en SEQ ID n O:2. Los detalles de las posiciones de los ácidos nucleicos en SEQ ID NO:2 que codifican estos genes se exponen con más detalle a continuación bajo el encabezado "Al menos un gen auxiliar de virus". El plásmido auxiliar también comprende un gen rep de tipo salvaje que codifica Rep 40, Rep 52, Rep 68 y Rep 78 y los promotores de rep p5, p19 y p40, es decir, las secuencias comprendidas dentro de los nucleótidos 2002252 de SEQ ID NO:1.
El usuario proporciona un vector plasmídico de referencia que comprende un gen cap de tipo salvaje unido operativamente a un promotor del gen cap de tipo salvaje que comprende p5, p19 y p40, es decir, el gen cap comprendido en SEQ ID NO:1 (nucleótidos 5961-8171 de SEQ ID NO:1). El vector plasmídico comprende además un transgén flanqueado por dos ITR de AAV2, es decir, las ITR comprendidas en los nucleótidos 1-145 y 4535-4679 de SEQ ID NO:1.
A continuación, el usuario proporciona un sistema de dos plásmidos de "ensayo" que comprende un "plásmido auxiliar de ensayo" y un "vector plasmídico de ensayo" que se basan en el sistema de dos plásmidos de referencia, pero tiene un solo cambio relacionado con una característica que los usuarios desean analizar. Por ejemplo, si el usuario desea saber si una determinada proteína rep es funcional, el usuario podría extraer el gen rep del "plásmido auxiliar de referencia" y reemplazarlo con la proteína rep de ensayo para proporcionar un "plásmido auxiliar de ensayo".
Luego, el usuario comparará la capacidad del sistema de dos plásmidos de referencia y el sistema de dos plásmidos de ensayo para permitir la producción de rAAV. Para ello, el usuario puede transfectar un primer conjunto de células huésped adecuadas (como las células HEK293T que expresan el gen E1A/B, de modo que el plásmido auxiliar no necesita comprender un gen E1A/B) con el sistema de dos plásmidos de referencia, y un segundo conjunto de células huésped idénticas con el sistema de dos plásmidos de ensayo e incubar las células huésped durante un período de tiempo adecuado para que se produzca la producción de AAV. El rendimiento del AAV recombinante producido a partir del sistema de dos plásmidos de referencia y el sistema de dos plásmidos de ensayo se puede recolectar y medir mediante qPCR para cuantificar el número de genomas del vector. Por ejemplo, puede usarse qPCR para determinar el número de casos de moléculas de ácido nucleico que comprenden un componente del genoma del vector, como una secuencia promotora, que se producen en las células huésped transfectadas con el sistema de dos plásmidos de ensayo en comparación con las células huésped transfectadas con el sistema de dos plásmidos de referencia. Como alternativa, se puede determinar el rendimiento comparativo de partículas, por ejemplo, mediante un ELISA anticápside.
Un ensayo de producción de AAV adecuado se describe en el ejemplo 2.
Sistema de dos plásmidos
La presente invención proporciona un sistema de dos plásmidos que comprende un plásmido auxiliar y un vector plasmídico, en el que el plásmido auxiliar comprende al menos un gen rep de AAV que codifica al menos una proteína Rep de AAV funcional y al menos un gen de virus auxiliar, y no comprende un gen cap que codifica una proteína Cap funcional.
El sistema de dos plásmidos es útil para producir rAAV. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos es adecuado para su uso en la producción de rAAV. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos es para producir rAAV. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos es para producir rAAV adecuados para su uso en terapia génica. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos es para producir rAAV para su uso en terapia génica.
La expresión "sistema de dos plásmidos" se refiere a un sistema que comprende dos plásmidos y puede usarse sin necesidad de plásmidos adicionales para producir rAAV. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos se puede utilizar para producir rAAV sin necesidad de un virus auxiliar, como adenovirus. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos se puede utilizar para producir rAAV sin necesidad de material genético procedente de una célula huésped, opcionalmente con la excepción de un gen que codifica E1A/B. Sin embargo, el sistema puede comprender componentes adicionales que no sean plásmidos. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos no comprende un virus auxiliar. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos de la invención comprende toda la información genética necesaria para la producción de rAAV. Por ejemplo, el sistema de dos plásmidos de la invención puede comprender al menos un gen rep de AAV, al menos un gen cap de AAV y al menos un gen auxiliar. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos de la invención comprende toda la información genética necesaria requerida para la producción de rAAV adecuados para su uso en terapia génica. Por ejemplo, el sistema de dos plásmidos de la invención puede comprender al menos un gen rep de AAV, al menos un gen cap de AAV, al menos un gen auxiliar y un módulo de expresión que comprende un transgén unido operativamente al menos a un elemento de control regulador. Sin embargo, en realizaciones, el sistema de dos plásmidos de la invención puede carecer de un gen cap funcional (necesario para la producción de rAAV) y/o un módulo de expresión que comprende un transgén unido operativamente al menos a un elemento de control regulador (necesario para la producción de rAAV adecuados para su uso en terapia génica).
Es una ventaja de la presente invención que un gen cap de AAV y/o un transgén en el plásmido del vector puedan cambiarse por otros para tratar diferentes trastornos genéticos. Opcionalmente, por lo tanto, el sistema de dos plásmidos de la invención puede comprender toda la información genética necesaria para la producción de rAAV excepto un gen cap funcional, y en tales realizaciones, el sistema de dos plásmidos de la invención puede comprender un sitio adecuado para la clonación en un gen cap de AAV. Dicho sitio puede comprender un sitio de clonación adyacente a un promotor del gen cap de AAV. El sitio adecuado para la clonación en un gen cap de AAV estará presente en el vector plasmídico. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos de la invención comprende toda la información genética necesaria para la producción de rAAV adecuados para su uso en terapia génica excepto un gen cap funcional y un módulo de expresión que comprende un transgén y un elemento de control regulador, en el que dicho sistema de dos plásmidos comprende un sitio adecuado para la clonación en un gen cap de AAV (tal como un promotor del gen cap de AAV y un sitio de clonación unido operativamente, es decir, adyacente, al promotor del gen cap de AAV) y un sitio adecuado para la clonación en un módulo de expresión (tal como un sitio de clonación flanqueado por una o más ITR). Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos de la invención comprende toda la información genética necesaria para la producción de rAAV adecuados para su uso en terapia génica excepto un módulo de expresión que comprende un transgén y un elemento de control regulador, en el que dicho sistema de dos plásmidos comprende un sitio adecuado para la clonación en un módulo de expresión (tal como un sitio de clonación flanqueado por una o más ITR). En tales casos, el sitio adecuado para la clonación en un gen cap de AAV y el sitio adecuado para la clonación en un módulo de expresión estarán presentes en el vector plasmídico. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos de la invención comprende los siguientes componentes divididos entre el vector plasmídico y el plásmido auxiliar:
- al menos un gen rep de AAV que codifica al menos una proteína Rep de AAV funcional;
- al menos un gen de virus auxiliar;
- un gen cap de AAV que codifica al menos una proteína funcional de la cápside de AAV, o un promotor del gen cap de AAV y un sitio de clonación unido operativamente al promotor del gen cap de AAV;
- al menos una ITR; y
- un módulo de expresión que comprende un transgén unido operativamente al menos a un elemento de control regulador, o un sitio adecuado para la clonación en un módulo de expresión flanqueado en al menos un lado por una ITR (es decir, adyacente a esta).
El vector plasmídico puede comprender:
(a) un gen cap de AAV que codifica al menos una proteína Cap de AAV funcional; o
(b) al menos un promotor del gen cap de AAV, un sitio de clonación unido operativamente al promotor del gen cap de AAV, y un módulo de expresión flanqueado en al menos un lado por una ITR;
en el que el vector plasmídico no comprende un gen rep que codifica una proteína Rep funcional y el módulo de expresión comprende un transgén unido operativamente al a menos un elemento de control regulador.
El plásmido auxiliar comprende al menos un gen rep de AAV que codifica al menos una proteína Rep de AAV funcional y al menos un gen de virus auxiliar, y no comprende un gen cap que codifica una proteína Cap funcional. Opcionalmente, la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico es de entre 3:1 y 1:10, entre 1,5:1 y 1:9, entre 1,4:1 y 1:8, entre 1,3:1 y 1:7, entre 1,2:1 y 1:6, entre 1,1:1 y 1:5, entre 1:1 y 1:4, o entre 1:1,5 y 1:3. Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos comprende un exceso molar de vector plasmídico en comparación con el plásmido auxiliar.
Como se expone con más detalle a continuación, la alteración de la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico se puede usar para controlar la proporción de partículas llenas a totales (o la proporción de cápsides/partículas que están llenas) producidas durante la producción de rAAV, o para aumentar el rendimiento de rAAV producido durante la producción de rAAV.
Mediante la expresión "proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico" se entiende una proporción molar, es decir, la proporción entre el número de moles de plásmido auxiliar presente y el número de moles de vector plasmídico presente. Puede proporcionarse una proporción dada de plásmido auxiliar a vector plasmídico simplemente mezclando el plásmido auxiliar y el vector plasmídico en una proporción molar apropiada.
Plásmido auxiliar
La presente invención proporciona un plásmido auxiliar que comprende al menos un gen rep de AAV que codifica al menos una proteína Rep de AAV funcional y al menos un gen de virus auxiliar, y que no comprende un gen cap que codifica una proteína Cap funcional.
La presente invención se refiere a un sistema mejorado de dos plásmidos que es adecuado para producir rAAV. Un plásmido auxiliar que comprende al menos un gen rep de AAV que codifica al menos una proteína Rep de AAV funcional y no comprende un gen cap que codifica una proteína Cap funcional puede ser ventajoso para usar en un sistema de dos plásmidos mejorado de este tipo. Tanto los genes rep como los genes cap son necesarios para producir rAAV. Sin embargo, los plásmidos y los sistemas de dos plásmidos de la invención están dispuestos de tal manera que los genes rep y cap no están ambos presentes en un único plásmido (configuración "transdivisión"). Es difícil asegurarse de que el plásmido auxiliar no comprenda tanto un gen rep como un gen cap, ya que los genes nativos cap y rep de AAV se solapan y, por lo tanto, es difícil separarlos, mientras se mantiene suficiente material genético para permitir la producción de la proteína completa. Sin embargo, es ventajoso dividir los genes rep y los genes cap entre un plásmido auxiliar y un vector plasmídico, ya que aumenta el número de acontecimientos de recombinación necesarios para formar rcAAV.
El AAV solo puede propagarse en presencia de un virus auxiliar que codifica proteínas que ayudan en la propagación de AAV. Sin embargo, el cultivo de AAV en presencia de un virus auxiliar no es ventajoso, ya que los virus auxiliares pueden ser líticos para las células, incluidas las células huésped utilizadas para cultivar AAV.
Además, si se utilizan virus auxiliares en la producción de productos de rAAV, como rAAV para su uso en terapia génica, el virus auxiliar puede contaminar el producto. Como alternativa a la coinfección con virus auxiliares, como el adenovirus, los genes necesarios del virus auxiliar pueden proporcionarse en un plásmido transfectado. Para las células huésped que expresan los genes adenovirales E1A/B (como las células HEK293T), los genes auxiliares adenovirales necesarios restantes codifican E4, E2A y VA ARN I y II. Si bien estos genes están distribuidos a lo largo de un largo tramo del genoma adenoviral, los presentes inventores han determinado que pueden eliminarse grandes tramos de nucleótidos no codificantes que separan los genes genómicos sin afectar a la expresión de los genes. Por lo tanto, los inventores han diseñado una región mínima de gen auxiliar que es SEQ ID NO:4. El uso de una región mínima de gen auxiliar de este tipo en un plásmido para la producción de rAAV es ventajoso, ya que permite al usuario utilizar un plásmido más pequeño que es menos costoso de producir y más fácil de transfectar a la célula.
Al menos un gen rep de AAV
El plásmido auxiliar comprende al menos un gen rep de AAV que codifica al menos una proteína Rep de AAV funcional. El AAV comprende una región del gen rep de AAV que codifica cuatro proteínas Rep de AAV (Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40). La región del gen está bajo el control de los promotores p5 y p19. Cuando se utiliza el promotor p5, se transcribe un gen que codifica Rep 78 y Rep 68. Rep 78 y Rep 68 son dos variantes de corte y empalme alternativas (Rep 78 comprende un intrón que se elimina en Rep 68). De forma análoga, cuando se usa el promotor p19, se transcribe un gen que codifica Rep 52 y Rep 40. Rep 52 y Rep 40 son variantes de corte y empalme alternativas (Rep 52 comprende un intrón que se elimina en Rep 40).
Se sabe que las cuatro proteínas Rep de AAV están implicadas en la replicación y la encapsidación del genoma viral y son, por lo tanto, útiles en la producción de rAAV.
No es necesario que estén presentes las cuatro proteínas Rep de AAV. Opcionalmente, sin embargo, dicho al menos un gen rep de AAV codifica una proteína Rep grande (Rep 78 o Rep 68) y una proteína Rep de AAV pequeña (Rep 52 o Rep 40). Rep 78 puede ser tóxica para las células, y Rep 78 no necesita estar presente para que tenga lugar la replicación de AAV. En realizaciones en las que dicho al menos un gen rep de AAV no codifica Rep 78, dicho al menos un gen rep de AAV preferentemente codifica Rep 68. En consecuencia, el plásmido auxiliar puede comprender al menos un gen rep de AAV que codifica:
(a) una proteína Rep 52 funcional;
(b) una proteína Rep 40 funcional; y/o
(c) una proteína Rep 68 funcional.
Una proteína Rep de AAV "funcional" es una proteína que permite la producción de partículas de AAV.
Concretamente, se cree que Rep 78 o Rep 68 (las proteínas Rep de AAV grandes) están implicadas en la replicación del genoma de AAV, y se cree que Rep 52 y Rep 40 (las proteínas Rep de AAV pequeñas) están implicadas en la encapsidación del genoma de AAV en una cápside. Está dentro de las capacidades de los expertos determinar si una proteína Rep de AAV dada es funcional. Los expertos simplemente necesitan determinar si la proteína Rep de AAV facilita la producción de AAV utilizando un ensayo de producción de AAV como se describió anteriormente. En este caso, el sistema de dos plásmidos de ensayo comprenderá un plásmido auxiliar que comprende la proteína Rep de AAV cuya "funcionalidad" debe determinarse y, por lo demás, el sistema de dos plásmidos de ensayo utilizado será idéntico al sistema de dos plásmidos de referencia.
En una realización, dicho al menos un gen rep de AAV del plásmido auxiliar codifica una proteína Rep de AAV "funcional". Si la proteína Rep de AAV facilita la producción de rAAV en un nivel de al menos el 25 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del nivel facilitado por la proteína Rep AAV de tipo salvaje, es decir, si el rendimiento de los genomas del vector rAAV producidos es de al menos un 25 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % del rendimiento de los genomas del vector rAAV producidos utilizando el sistema de dos plásmidos de referencia. Preferentemente, dicho al menos un gen rep de AAV del plásmido auxiliar es funcional si facilita la producción de rAAV a un nivel de al menos el 80 % del nivel facilitado por la proteína Rep de AAV de tipo salvaje.
En general, una proteína Rep de AAV solo podrá facilitar al producción de rAAV si es compatible con las ITR que rodean el genoma del AAV que se va a encapsidar. Es posible que algunas proteínas Rep de AAV solo puedan encapsidar material genómico (como un módulo de expresión) cuando está flanqueado por una o más ITR del mismo serotipo que la proteína Rep de AAV. Otras proteínas Rep de AAV son compatibles entre sí, lo que significa que pueden encapsidar material genómico que está flanqueado por una o más ITR de un serotipo diferente. Por ejemplo, en el caso de un sistema de dos plásmidos, se prefiere que la proteína Rep de AAV sea capaz de facilitar la replicación y la encapsidación de un módulo de expresión comprendido dentro del vector plasmídico, y que tal proteína Rep de AAV sea compatible con al menos una ITR que flanquea el módulo de expresión (es decir, que sea capaz de replicarse y encapsidar el módulo de expresión flanqueado al menos en un lado por una ITR).
Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 52 funcional, al menos un gen que codifica una proteína Rep 40 funcional y un gen que codifica una proteína Rep 68 funcional.
El plásmido auxiliar puede comprender dos genes que codifican una proteína Rep 40 funcional. En una realización, dicho al menos un gen rep de AAV comprende dos genes que codifican una proteína Rep 40 funcional. Por ejemplo, el plásmido auxiliar puede comprender dos genes rep de AAV que están separados en el plásmido. El primero de los dos genes rep de AAV separados podría codificar Rep 68 (por ejemplo, usando el promotor p5 o un promotor diferente situado cerca de la posición normal del promotor p5 en el gen rep de AAV) y Rep 40 (por ejemplo, usando el promotor p19 o un promotor diferente situado cerca de la posición normal del promotor p19). El segundo de los dos genes rep de AAV separados podría codificar Rep 52 y Rep 40. Rep 52 y Rep 40 son variantes de corte y empalme alternativas.
51 el plásmido auxiliar comprende dos genes que codifican una proteína Rep 40, uno de los dos genes que codifica una proteína Rep 40 funcional puede comprender un intrón. En una realización, ambos genes que codifican una proteína Rep 40 funcional comprenden un intrón. Sin embargo, en una realización preferida, solo uno de los genes que codifica una proteína Rep 40 funcional comprende un intrón. Por ejemplo, si el usuario desea evitar dicho al menos un gen rep de AAV que codifica Rep 78, el gen rep de AAV puede dividirse mediante duplicación parcial en dos genes. Un gen podría comprender nucleótidos correspondientes al gen rep de AAV nativo de longitud completa con la secuencia correspondiente al intrón eliminado. Tal gen codificaría Rep 68 y Rep 40, pero no codificaría ni Rep 78 ni Rep 52, ya que una porción de cada una de las proteínas Rep 78 y Rep 52 es codificada por la secuencia que actúa como un intrón en el contexto de Rep 40. El segundo gen podría comprender nucleótidos correspondientes a la región del gen rep de AAV nativo secuencia abajo del promotor p19, que codificaría Rep 52 (intrón cortado y empalmado) y Rep 40 (intrón eliminado).
SEQ ID NO:1 proporciona la secuencia del genoma de AAV2 de tipo salvaje, y los nucleótidos 321-2252 de SEQ ID NO:1 codifican las cuatro proteínas Rep de AAV. El gen rep de AAV de longitud completa (nucleótidos 321-2252) codifica las cuatro proteínas Rep de AAV (Rep 78 y Rep 68 a partir del promotor p5, y Rep 52 y Rep 40 a partir del promotor p19). Un tramo más corto del gen rep de AAV secuencia abajo del promotor p19 (nucleótidos 993-2252) codifica Rep 52 y Rep 40 solamente (es decir, este tramo del gen rep de AAV se extiende desde el final del promotor p19 hasta el final del gen). Los nucleótidos 1907-2227 de SEQ ID NO:1 corresponden a un intrón. Rep 78 y Rep 52 comprenden aminoácidos codificados por el intrón, pero Rep 68 y Rep 40 son variantes de corte y empalme alternativas que no comprenden aminoácidos codificados por el intrón. La relación entre el gen rep de AAV y las cuatro proteínas Rep de AAV se muestra en la figura 1.
Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar comprende un gen que codifica una proteína Rep 52 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 52 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 800, al menos 900, al menos 1000 o al menos 1100 nucleótidos de longitud de los nucleótidos 993-2186 de SEQ ID NO:1, o con un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV.
Está dentro de las capacidades de los el experto en la materia determinar si un tramo concreto (de ensayo) de nucleótidos es un "tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV". Todo lo que se requiere es que los expertos en la materia alineen el tramo de nucleótidos de ensayo con el genoma del serotipo de referencia (es decir, SEQ ID NO:1). Si el tramo de nucleótidos de ensayo tiene más del 90 % de identidad con un tramo de nucleótidos contiguo de la misma longitud en SEQ ID NO:1, el tramo contiguo es un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV. Lo mismo se aplica en el caso de secuencias de adenovirus (excepto que aquí el serotipo de referencia es SEQ ID NO:2).
Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 40 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 40 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 600, al menos 700, al menos 800 o al menos 900 nucleótidos de longitud de un tramo de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 993-2252 menos los nucleótidos 1907-2227 de SEQ ID NO:1, o con tramos de nucleótidos correspondientes en un serotipo diferente de AAV. Por tanto, dicho gen que codifica Rep 40 tiene al menos la identidad especificada anteriormente con un tramo de nucleótidos teórico que consiste en los nucleótidos 993-1906 de SEQ ID NO:1 inmediatamente yuxtapuestos con los nucleótidos 2228-2252 de SEQ ID NO:1 (5'-[993-1906]-[2228-2252]-3') o con un tramo de nucleótidos teórico de un serotipo de AAV diferente.
Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV comprende al menos un gen que codifica una proteína Rep 40 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 40 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 900, al menos 1000, al menos 1100 o al menos 1200 nucleótidos de longitud de los nucleótidos 993-2252 de SEQ ID NO:1, o con un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV.
Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 68 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 68 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 1000, al menos 1400, al menos 1500 o al menos 1600 nucleótidos de longitud de un tramo de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 321-2252 menos los nucleótidos 1907-2227 de SEQ ID NO:1, o con tramos de nucleótidos correspondientes en un serotipo diferente de AAV. Por tanto, tal gen que codifica Rep 68 tiene al menos la identidad especificada anteriormente con un tramo de nucleótidos teórico que consiste en los nucleótidos 321-1906 de SEQ ID NO:1 inmediatamente yuxtapuestos con los nucleótidos 2228-2252 de SEQ ID NO:1 (5'-[321-1906]-[2228-2252]-3'), o con un tramo de nucleótidos teórico de un serotipo de AAV diferente.
Dado que Rep 68 no comprende ningún aminoácido codificado por el intrón (nucleótidos 1907-2227), el gen que codifica una proteína Rep 68 funcional no necesita comprender los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1907-2227. De hecho, la exclusión de los nucleótidos 1907-2227 de dicho al menos un gen rep de AAV asegura que Rep 78 no se codifique (ya que Rep 78 comprende aminoácidos codificados por el intrón). Preferentemente, el plásmido auxiliar no comprende un gen que codifica una proteína Rep 78 funcional.
Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica las proteínas Rep 68 y Rep 40 funcionales, en el que dicho gen comprende un ácido nucleico que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 1400, 1500, 1600 o 1700 nucleótidos de longitud de los siguientes tramos de la secuencia de AAV2 nativa (SEQ ID NO:1) colocados en yuxtaposición inmediata desde 5' a 3': 200-1906; 2228-2309, o con tramos yuxtapuestos de nucleótidos correspondientes de un serotipo diferente de AAV.
Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica las proteínas Rep 52 y Rep 40 funcionales, en el que dicho gen comprende un ácido nucleico que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 1300, 1400, 1500 o 1600 nucleótidos de longitud del siguiente tramo de la secuencia de AAV2 nativa (SEQ ID NO:1): 658-2300, o con un tramo de nucleótidos correspondiente de un serotipo diferente de AAV.
Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV comprende un tramo de nucleótidos que codifican las proteínas Rep 68, Rep 52 y Rep 40 funcionales, en el que dicho tramo comprende un ácido nucleico que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 3000, 3200, 3300 o 3400 nucleótidos de longitud de los siguientes tramos de la secuencia de AAV2 nativa (SEQ ID NO:1) colocados en yuxtaposición inmediata desde 5' a 3': 200-1906; 2228-2309; 658-2300, o con tramos yuxtapuestos de nucleótidos correspondientes de un serotipo diferente de AAV.
Opcionalmente, el sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 1700, al menos 1800, o 1866 nucleótidos correspondientes a un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendido dentro de los nucleótidos 321-2186 de SEQ ID NO:1, o dentro de un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV. El tramo de nucleótidos contiguo comprendido dentro de los nucleótidos 321-2186 corresponde a Rep 78.
En algunas realizaciones, dicho al menos un gen rep no comprende un promotor p40 interno funcional. El gen rep/cap nativo comprende un promotor p40 (D.J. Pereira y N. Muzyczka (1997), J. Virol., 71:1747-1756). El promotor p40 dirige la expresión del gen cap, pero no es necesario para la expresión de los genes rep. Un promotor p40 funcional es aquel que es capaz de dirigir la expresión del gen cap.
Puede determinarse si un promotor p40 dado es funcional o no ensayando su capacidad para dirigir la expresión de una proteína (usando un ensayo de expresión). Por ejemplo, el usuario puede preparar un vector de "referencia" que comprende un promotor p40 nativo (como el de los nucleótidos 1710-1827 de SeQ ID NO:1) secuencia arriba de una proteína indicadora, como GFP. A continuación, el usuario puede preparar un vector de "ensayo" que es idéntico al vector de referencia, excepto que el promotor p40 nativo se reemplaza por el promotor p40 cuya funcionalidad se va a analizar (el promotor p40 de "ensayo"). Los dos vectores pueden transfectarse en células huésped adecuadas y las células huésped pueden incubarse en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína indicadora. El nivel de proteína indicadora expresada en las células huésped podría medirse, por ejemplo, mediante espectroscopía de fluorescencia. El nivel de expresión del vector de referencia (correspondiente al nivel de expresión dirigido por el promotor p40 nativo) puede compararse luego con el nivel de expresión del vector de ensayo (correspondiente al nivel de expresión dirigido por el promotor de ensayo).
Se considerará que un promotor p40 es funcional si dirige la expresión a un nivel de al menos el 40 % de la expresión dirigida por el promotor p40 nativo. Opcionalmente, un promotor funcional de p40 dirige la expresión a un nivel de al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 % de la expresión dirigida por el promotor p40 nativo. Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV no comprende un promotor p40 interno funcional si no comprende una secuencia correspondiente al promotor p40 (por ejemplo, los nucleótidos 1710-1827 de SEQ ID NO:1) que dirige la expresión a un nivel de al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, o al menos el 95 % de la expresión dirigida por el promotor p40 nativo.
Los promotores P40 que carecen de "caja TATA" no son funcionales. El promotor p40 comprende una caja TATA que comienza en una posición correspondiente a la posición 1823 de SEQ ID NO:1. Por tanto, el plásmido auxiliar que no comprende un promotor p40 interno funcional puede comprender uno o más promotores p40 en los que las cajas TATA están mutadas para hacer que el promotor p40 no sea funcional. Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV no comprende un nucleótido T en una posición correspondiente a la posición 1823 de SEQ ID NO:1. Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV comprende un nucleótido C en una posición correspondiente a la posición 1823 de SEQ ID NO:1. Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV no comprende AAG en las posiciones correspondientes a las posiciones 1826-1828 de SEQ ID NO:1. Opcionalmente, dicho al menos un gen rep de AAV comprende CTC en las posiciones correspondientes a las posiciones 1826-1828 de SEQ ID NO:1. Ausencia de un gen cap
Un plásmido auxiliar de la invención no comprende un gen cap que codifique un conjunto funcional de proteínas Cap.
En el AAV nativo (tal como un AAV que tiene un genoma como se expone en SEQ ID NO:1), los genes cap de AAV y rep de AAV se solapan. Concretamente, el promotor p40, que dirige la expresión del gen cap de AAV, está presente dentro del gen rep de AAV. Por tanto, cualquier plásmido auxiliar que codifique proteínas Rep de AAV comprenderá nucleótidos del gen cap de AAV. Sin embargo, un plásmido auxiliar de la invención no comprende un tramo de nucleótidos que codifica un conjunto funcional de proteínas Cap. Concretamente, un plásmido auxiliar de la invención puede no comprender un tramo significativo de la secuencia de nucleótidos que sea exclusivamente la secuencia del gen cap de AAV. La expresión "secuencia del gen cap exclusivamente" pretende referirse a la secuencia del gen que codifica una porción de una proteína Cap, pero que no codifica una porción de una proteína Rep de AAV, por ejemplo, los nucleótidos 2253-4410 de SEQ ID nO:1.
Las proteínas Cap de AAV (VP1, VP2 y VP3; ver figura 1) son proteínas que se ensamblan para formar una cápside que rodea el genoma viral. Por tanto, un gen que codifica un conjunto funcional de proteínas Cap de AAV es un gen que codifica proteínas Cap de AAV capaces de ensamblarse para encapsidar un genoma viral.
A conjunto "funcional" de proteínas Cap de AAV es un conjunto que es suficiente para la encapsidación de AAV. Está dentro de las capacidades de los expertos determinar si el producto de un gen Cap de AAV es funcional. Los expertos simplemente necesitan determinar si las proteínas Cap de AAV codificadas facilitan la producción de AAV usando un ensayo de producción de AAV como se describió anteriormente. En este caso, el sistema de dos plásmidos de ensayo comprenderá un vector plasmídico que comprende el gen cap de AAV que codifica las proteínas cuya "funcionalidad" debe determinarse y, por lo demás, el sistema de dos plásmidos de ensayo utilizado será idéntico al sistema de dos plásmidos de referencia. El plásmido auxiliar no comprende un gen cap que codifica un conjunto funcional de proteínas Cap si no comprende ningún material genético correspondiente a un gen cap, o si cualquier gen cap presente en el plásmido auxiliar codifica proteínas que facilitan la producción de AAV en un nivel por debajo del 10 % del nivel facilitado por el producto del gen cap de tipo salvaje, es decir, si el rendimiento de rAAV producido es inferior al 10 % del rendimiento de rAAV producido utilizando el sistema de dos plásmidos de referencia.
En general, un gen cap funcional tiene más de 250 nucleótidos de longitud. En consecuencia, el plásmido auxiliar, que no comprende un gen cap que codifica un conjunto funcional de proteínas Cap, no puede comprender un tramo contiguo de la secuencia del gen cap exclusivamente de más de 250 nucleótidos, de más de 100 nucleótidos, o de más de 60 nucleótidos. Como se ha analizado anteriormente, el gen cap de AAV y el gen rep de AAV se solapan en el AAV nativo. Opcionalmente, el plásmido auxiliar no comprende un tramo contiguo de la secuencia del gen cap exclusivamente de más de 60 nucleótidos. Opcionalmente, el plásmido auxiliar no comprende un gen cap que codifica una proteína VP1 funcional. Opcionalmente, el plásmido auxiliar comprende una parte de la secuencia del gen cap, y la parte de la secuencia del gen cap no codifica un conjunto de proteínas Cap funcionales. El plásmido auxiliar puede comprender una porción de la secuencia del gen cap de AAV, siempre que no codifique un conjunto funcional de proteínas Cap de AAV. Siempre que la parte de la secuencia del gen cap de AAV no sea funcional, se requerirán múltiples acontecimientos de recombinación para proporcionar un rcAAV.
Al menos un gen de virus auxiliar
El plásmido auxiliar comprende al menos un gen de virus auxiliar. El AAV solo puede propagarse en presencia de un virus auxiliar. Los ejemplos de virus auxiliares incluyen adenovirus y virus del herpes.
Sin embargo, como se ha expuesto anteriormente, el cultivo de AAV en presencia de un virus auxiliar no es ventajoso, ya que los virus auxiliares pueden ser líticos para las células, incluidas las células huésped utilizadas para cultivar AAV. Además, si se utilizan virus auxiliares en la producción de productos de rAAV, tal como vectores de terapia génica, el virus auxiliar puede contaminar el producto. Como alternativa a la coinfección con virus auxiliares como el adenovirus, los genes necesarios del virus auxiliar pueden proporcionarse en un plásmido transfectado. Para las células huésped que expresan los genes adenovirales E1A/B (como las células HEK293T), los genes auxiliares necesarios restantes son E4, E2A y VA ARN I y II (un ácido nucleico VA). Si bien estos genes están distribuidos a lo largo de un largo tramo del genoma adenoviral, los presentes inventores han determinado que pueden eliminarse grandes tramos de nucleótidos no codificantes que separan los genes genómicos sin afectar a la expresión de los genes. Por lo tanto, los inventores han diseñado una región mínima de gen auxiliar que es SEQ ID nO:4. SEQ ID NO:4 contiene el ácido nucleico VA y el complemento inverso (como está presente en un plásmido bicatenario) de un gen E2A y un gen E4. El uso de una región mínima de gen auxiliar de este tipo en un plásmido para la producción de rAAV es ventajoso, ya que permite al usuario utilizar un plásmido más pequeño que es menos costoso de producir y más fácil de transfectar a la célula.
Los plásmidos auxiliares de la invención comprenden al menos un gen de virus auxiliar. Preferentemente, los plásmidos auxiliares de la invención comprenden suficientes genes auxiliares para permitir la replicación y la encapsidación de AAV. Puede evaluarse si un plásmido auxiliar comprende o no suficientes genes auxiliares para facilitar la producción de AAV usando un ensayo de producción de aAv como se describió anteriormente. En este caso, el sistema de dos plásmidos de ensayo comprenderá un plásmido auxiliar que comprende los genes auxiliares cuya capacidad para facilitar la producción de AAV se va a analizar y, por lo demás, el sistema de dos plásmidos de ensayo utilizado será idéntico al sistema de dos plásmidos de referencia. En una realización, se considerará que los productos del gen auxiliar facilitan la producción de AAV si facilitan la producción de rAAV en un nivel de al menos el 25 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del nivel facilitado por genes auxiliares adenovirales que codifican E4, E2A y VA ARN I y II, es decir, si el rendimiento de rAAV producido es de al menos un 25 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % del rendimiento de rAAV producido utilizando el sistema de dos plásmidos de referencia. Preferentemente, se considerará que los productos del gen auxiliar facilitan la producción de AAV si facilitan la producción de rAAV en un nivel de al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del nivel facilitado por genes auxiliares adenovirales que codifican E4, E2A y VA ARN I y II.
Dado que los plásmidos auxiliares codifican los genes necesarios para permitir la producción eficiente de AAV, no se requiere la adición de un virus auxiliar.
Opcionalmente, dicho al menos un gen de virus auxiliar es un gen de adenovirus. El adenovirus es un virus que se sabe que ayuda a la propagación de AAV (Xiao et al. (1998), J. Virol., 72:2224-2232). Opcionalmente, dicho al menos un gen de virus auxiliar es un gen de adenovirus 5 o un gen de adenovirus 2. El genoma del adenovirus 5 se expone en SEQ ID NO:2, y el genoma del adenovirus 2 se expone en SEQ ID NO:3. En consecuencia, los genes auxiliares pueden comprender un tramo de nucleótidos presentes en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3, o un tramo de nucleótidos correspondiente en otro serotipo de adenovirus.
Los genes auxiliares de los adenovirus codifican E1A, E1B, E4, E2A y VA ARN I y II.
E1A es codificado por los nucleótidos 560-1545 del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2). Los nucleótidos 560-1545 contienen un intrón del nucleótido 1113 al nucleótido 1228. Este intrón no es fundamental, por lo que un gen E1A que comprende los nucleótidos 560-1112 y 1229-1545 de SEQ ID NO:2 codificaría una proteína E1A funcional.
E1B es en realidad dos proteínas E1B 19K y E1B 55K, que trabajan juntas para bloquear la apoptosis en células infectadas con adenovirus. E1B es codificado por los nucleótidos 1714-2244 (E1B 19K) y por los nucleótidos 2019­ 3509 (E1B 55 K) del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2).
E4 es codificado por varios marcos de lectura abiertos ("open reading frames", ORF) diferentes del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2). E4 ORF 6/7 es codificado por los nucleótidos 32914-34077, que comprenden un intrón entre los nucleótidos 33193 y 33903. Este intrón no es fundamental, por lo que un E4 Or F 6/7 que comprende los nucleótidos 32914-33192 y 33904-34077 de SEQ ID NO:2 es suficiente. E4 34K es codificado por los nucleótidos 33193-34077 del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2). E4 ORF 4 es codificado por los nucleótidos 33998-34342 del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2). E4 ORF 3 es codificado por los nucleótidos 34353-34703 del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2). E4 ORF B es codificado por los nucleótidos 34700 a 35092 del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2). E4 ORF 1 es codificado por los nucleótidos 35140-35526 del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2).
Una proteína E4 funcional puede comprender solo aminoácidos codificados por los ORF 6 y 7, ya que solo los aminoácidos codificados por los ORF 6 y 7 son necesarios para la actividad. Opcionalmente, por lo tanto, la proteína E4 funcional comprende una secuencia polipeptídica codificada por todos o por una parte significativa de los ORF 6 y 7. Opcionalmente, la proteína E4 funcional no comprende una secuencia polipeptídica codificada por todos o por una parte de los ORF 1-4 y 34K. Sin embargo, los aminoácidos codificados por los ORF 1-3 y 34K mejoran la actividad de la proteína E4, por lo que, en algunas realizaciones, la proteína e4 funcional comprende aminoácidos codificados por los ORF 1-7.
El gen E2 (E2A) es codificado por los nucleótidos 22443-24032 del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2).
El VA ARN I y II es codificado por los nucleótidos 10589-11044 del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2).
Se cree que E1B y E4 mejoran la acumulación de ARNm de AAV, y se cree que el E2A y VA ARN I y II mejoran el corte y empalme y la traducción del ARNm de AAV. E1B, E4 y E2A son proteínas codificadas por genes presentes en el genoma del adenovirus, mientras que el ácido nucleico VA codifica dos transcritos de ARN conocidos como VA ARN I y VA ARN II. Los transcritos en sí son funcionales en la célula y nunca se traducen en secuencias de aminoácidos. Se apreciará, por lo tanto, que el ácido nucleico VA no codifica una proteína, pero sí "codifica" o "se corresponde con" un ARN, es decir, aunque se usa el término "codificar", el ácido nucleico VA es una secuencia de ácido nucleico no traducida.
De los cinco genes de adenovirus, es posible no incluir E1A o E1B en el plásmido auxiliar, ya que algunas líneas de células huésped (como las células HEK293) expresan uno o más de E1A o E1B de forma constitutiva. Opcionalmente, por lo tanto, el plásmido auxiliar no comprende un gen que codifica una proteína E1A/B adenoviral funcional.
En una realización, dicho al menos un gen del virus auxiliar comprende:
(a) un ácido nucleico VA (asociado a virus) que codifica los VA ARN I y II funcionales;
(b) un gen E2A que codifica una proteína E2A funcional; y/o
(c) un gen E4 que codifica una proteína E4 funcional.
Opcionalmente, dicho al menos un gen del virus auxiliar comprende un ácido nucleico VA, un gen E2A y un gen E4. Un VA ARN I y II, una proteína E2A o una proteína E4 "funcionales" pueden facilitar la producción de AAV. Está dentro de las habilidades de los expertos determinar si un VA ARN I y II, una proteína E2A o una proteína E4 es funcional. Los expertos simplemente necesitan determinar si el VA ARN I y II, la proteína E2A o la proteína E4 facilitan la producción de AAV utilizando un ensayo de producción de AAV como se describió anteriormente. En este caso, el sistema de dos plásmidos de ensayo comprenderá un plásmido auxiliar que comprende el VA ARN I y II, la proteína E2A o la proteína E4 cuya "funcionalidad" debe determinarse y, por lo demás, el sistema de dos plásmidos de ensayo utilizado será idéntico al sistema de dos plásmidos de referencia. En una realización, se considerará que el VA a Rn I y II, la proteína E2A o la proteína E4 son "funcionales" si facilitan la producción de rAAV a un nivel de al menos el 25 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del nivel facilitado por el tipo salvaje (por ejemplo, como se encuentra en el adenovirus 5; SEQ ID NO:2) de VA ARN I y II, proteína e2a o proteína E4, es decir, si el rendimiento de rAAV producido es de al menos un 25 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % del rendimiento de rAAV producido utilizando el sistema de dos plásmidos de referencia. Preferentemente, se considerará que la proteína E4 es "funcional" si facilita la producción de rAAV a un nivel de al menos el 70 %, al menos un 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del nivel facilitado por la proteína E4 de tipo salvaje.
Opcionalmente, el gen E4 no se encuentra entre el ácido nucleico VA y el gen E2A, es decir, la secuencia del plásmido es tal que la secuencia del gen E4 no aparece en el plásmido entre la secuencia de ácido nucleico VA y la secuencia del gen E2A. Opcionalmente, el gen E2A se encuentra entre el ácido nucleico VA y el gen E4.
El plásmido auxiliar es de bicatenario y cualquiera de los genes comprendidos en el plásmido auxiliar puede estar presente en una orientación "directa" o "inversa". Por ejemplo, el gen E4 puede comprender los nucleótidos 22443­ 24032 del genoma del adenovirus 5 (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2) o puede comprender el complemento inverso de los nucleótidos 22443-24032. Por tanto, en todos los casos de la solicitud en los que se haga referencia a un plásmido "que comprende" una determinada secuencia de ácido nucleico, las referencias deben interpretarse como que abarcan realizaciones en las que el plásmido comprende el complemento inverso de la secuencia de ácido nucleico.
Los presentes inventores han demostrado que eliminar todo o parte del tramo de nucleótidos presentes en las posiciones 10595-10619 en el genoma del adenovirus (por ejemplo, el genoma de SEQ ID NO:2) reduce significativamente (en aproximadamente un 50 %) la actividad del VA ARN I y II codificados por el ácido nucleico VA. Es ventajoso evitar esta reducción de la actividad.
En consecuencia, en una realización, el ácido nucleico VA tiene un nivel de actividad que tiene al menos un 75%, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o entre un 95 % y un 100 % de la actividad de un ácido nucleico VA de tipo salvaje del adenovirus 5. Opcionalmente, el nivel de actividad del ácido nucleico VA se determina midiendo el rendimiento de rAAV, por ejemplo, utilizando el ensayo de producción de AAV descrito anteriormente. En una realización, el ácido nucleico VA comprende una secuencia contigua al menos un 95 %, al menos 98 %, o 100 % idéntica a un tramo de al menos 15 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos, o 26 nucleótidos de los nucleótidos 10595-10619 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus.
Opcionalmente, el gen E2A está unido operativamente a un promotor que comprende una secuencia contigua al menos un 96 %, al menos 98 %, o 100 % idéntica a un fragmento de al menos 60, al menos 70, al menos 80 o 100 nucleótidos de los nucleótidos 27037-27136 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus.
La expresión del gen E4 está dirigida por un promotor (denominado "promotor E4" en el presente documento), correspondiente a las posiciones 35585-35848 de la SEQ ID NO:2. Los nucleótidos correspondientes a 35793-35848 del genoma del adenovirus 5 (tal como un genoma de SEQ ID NO:2) son necesarios para que el promotor sea completamente activo. Opcionalmente, por lo tanto, el gen E4 está unido operativamente a un promotor E4 que tiene al menos el 50 %, al menos el 70 %, o al menos el 90 % de la actividad de un promotor de tipo salvaje de adenovirus 5. La actividad del promotor E4 puede determinarse analizando su capacidad para dirigir la expresión de una proteína.
Puede determinarse si un promotor E4 dado es capaz o no de dirigir la expresión del gen E4 usando un ensayo de producción de AAV como se describió anteriormente. Específicamente, si el promotor E4 puede dirigir la expresión del gen E4, facilitará la producción de AAV. En este caso, el sistema de dos plásmidos de ensayo comprenderá un vector plasmídico que comprende el gen E4 y un promotor del gen E4 cuya capacidad para facilitar la producción de AAV se va a analizar, y por lo demás, el sistema de dos plásmidos de ensayo utilizado será idéntico al sistema de dos plásmidos de referencia. En una realización, se considerará que el promotor E4 tiene al menos un 25 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, o al menos un 90 % de la actividad de un promotor E4 de tipo salvaje del adenovirus 5 si facilita la producción de rAAV a un nivel de al menos el 25 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, o al menos el 90 % del nivel facilitado por un promotor del gen E4 de tipo salvaje, es decir, si el rendimiento de rAAV producido es de al menos un 50 %, al menos un 70 %, o al menos un 90 % del rendimiento de rAAV producido usando el sistema de dos plásmidos de referencia. Preferentemente, se considerará que el promotor e4 facilita la producción de AAV si facilita la producción de rAAV en un nivel de al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % del rendimiento de rAAV producido utilizando el sistema de dos plásmidos de referencia.
Reducir el tamaño del plásmido auxiliar
Los presentes inventores han determinado que hay una cantidad significativa de secuencia de ácido nucleico de gen no auxiliar entre las diferentes secuencias de genes auxiliares en el adenovirus 5 nativo, y que una parte sustancial de esta secuencia de ácido nucleico se puede eliminar sin afectar significativamente el nivel de expresión y la función de las proteínas codificadas por las secuencias de genes auxiliares. En consecuencia, los inventores han logrado definir una región de gen auxiliar con un tamaño reducido, y esta puede incluirse en el plásmido auxiliar para reducir su tamaño. Tener una región de gen auxiliar de tamaño reducido es ventajoso, ya que permite reducir el tamaño total del plásmido auxiliar. Los plásmidos más pequeños son más baratos de producir y más fáciles de introducir en las células huésped.
En consecuencia, el plásmido auxiliar puede tener menos de 25000 pb, menos de 20000 pb, menos de 15000 pb, menos de 14500 pb, entre 10000 pb y 25000 pb, entre 10000 pb y 20000 pb, entre 12000 pb y 15000 pb, o aproximadamente 14021 pb de longitud.
De forma análoga, dicho al menos un gen del virus auxiliar comprende un ácido nucleico VA, un gen E2A y un gen E4, y el ácido nucleico VA, el gen E2A y el gen E4 están comprendidos dentro de un tramo de nucleótidos contiguo en el plásmido auxiliar de menos de 15000, menos de 12000, menos de 10000, menos de 9000 o menos de 8500 nucleótidos.
En SEQ ID NO:4 se expone un ejemplo de una región de gen auxiliar con un tamaño reducido. La región de gen auxiliar es una región contigua del plásmido que comienza en el primer nucleótido que codifica un gen auxiliar y termina en el último nucleótido que codifica un gen auxiliar. Opcionalmente, la región de gen auxiliar comprende una secuencia que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 6000 nucleótidos, al menos 7000 o al menos 8000 nucleótidos de longitud de SEQ ID NO:4, es decir, dicho al menos un gen del virus auxiliar está comprendido en un tramo contiguo del plásmido que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 6000 nucleótidos, al menos 7000 nucleótidos, o al menos 8000 nucleótidos de longitud de SEQ ID NO:4. Opcionalmente, la región de gen auxiliar consiste en una secuencia que tiene al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 6000 nucleótidos, al menos 7000 o al menos 8000 nucleótidos de longitud de SEQ ID NO:4, es decir, dicho al menos un gen del virus auxiliar está comprendido en un tramo contiguo del plásmido que consiste en una secuencia con al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 6000 nucleótidos, al menos 7000 nucleótidos, o al menos 8000 nucleótidos de longitud de SEQ ID NO:4.
Los presentes inventores han identificado regiones específicas del genoma del adenovirus 5 que pueden excluirse del plásmido auxiliar.
En una realización, el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 2000, al menos 2500, al menos 3000, o 3427 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendido dentro de los nucleótidos 194-3620 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus. En una realización, el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 50, al menos 60, o 69 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendido dentro de los nucleótidos 4032-4100 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus.
En una realización, el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 15000, al menos 20000, al menos 22000, o 22137 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendido dentro de los nucleótidos 10619-32755 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus.
En una realización, el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 15000, al menos 20000, al menos 21000, o 21711 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendido dentro de los nucleótidos 11045-32755 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus.
De forma análoga, los inventores han identificado regiones del genoma AAV2 que no necesitan incluirse en el plásmido auxiliar y, en consecuencia, pueden excluirse con el fin de minimizar el tamaño del plásmido auxiliar. En consecuencia, en una realización, el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 200, al menos 300, al menos 350, o 363 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendido dentro de los nucleótidos 4051-4413 de SEQ ID NO:1, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV. De forma análoga, en una realización, el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 400, al menos 500, al menos 600, o 647 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendido dentro de los nucleótidos 2301-2947 de SEQ ID NO:1, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV.
Sitios de unión a rep artificial
Las proteínas rep se unen a un sitio de unión a rep ("rep binding site", RBS), que es una secuencia de ácido nucleico que tiene una secuencia de consenso de GCTCGCTCGCTCGCTC (McCarty, D.M. et al. (1994), J. Virol., 68(8): 4988-4997)). En consecuencia, un sitio de unión a rep es una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con GCTCGCTCGCTCGCTC. Se puede determinar si una secuencia de ácido nucleico (secuencia de ácido nucleico de ensayo) comprende un sitio de unión a rep, por ejemplo, determinar si una secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que tiene homología con GCTCGCTCGCTCGCTC, utilizando un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética ("electrophoretic mobility shift assay", EMSA). La secuencia de ácido nucleico de ensayo se aplica a un primer pocillo de un gel adecuado para usar en electroforesis, y una mezcla de la secuencia de ácido nucleico de ensayo y las proteínas Rep68/Rep78 se aplica a un segundo pocillo del gel. Si la secuencia de ácido nucleico de ensayo comprende un sitio de unión a rep, esto provocará un desplazamiento en la movilidad de la secuencia de ácido nucleico en el pocillo que comprende las proteínas Rep68/Rep78 en comparación con el pocillo que carece de las proteínas Rep68/Rep78.
La unión de proteínas Rep a RBS aberrantes podría dar como resultado una recombinación no homóloga mediada por Rep entre diferentes secuencias que comprenden RBS, dando como resultado secuencias de fusión no deseadas. Por ejemplo, las proteínas Rep podrían unirse al RBS en las ITR de AAV y cualquier RBS presente en un esqueleto de plásmido bacteriano, lo que da como resultado la fusión de las secuencias del esqueleto del plásmido en una ITR. Esto podría dar como resultado una replicación y una encapsidación mejoradas de dichas secuencias de fusión no deseadas.
En consecuencia, se prefiere que los únicos RBS presentes en los plásmidos de la invención correspondan a los RBS presentes en a Av de tipo salvaje (lo cual permite que las proteínas Rep realicen su función normal). Sin embargo, cuando se construye un plásmido, es posible que esté presente un RBS, ya sea en el esqueleto del plásmido o en cualquier otra parte del plásmido en secuencias no derivadas de AAV, y dichas secuencias se consideran RBS "artificiales' o "aberrantes" y deben evitarse/eliminarse.
Una fuente común de RBS artificiales en plásmidos es del esqueleto del plásmido. El esqueleto del plásmido es la secuencia bacteriana necesaria para amplificar los plásmidos en las células huésped bacterianas. El esqueleto del plásmido puede ser la región del plásmido que no se deriva de adenovirus o AAV o que no está situada entre dos ITR derivadas de AAV. Opcionalmente, el esqueleto del vector plasmídico abarca cualquier nucleótido excepto el gen cap, un promotor (región) unido operativamente al gen cap, ITR y el módulo de expresión. Opcionalmente, el esqueleto del plásmido auxiliar abarca cualquier nucleótido excepto al menos un gen auxiliar y los elementos reguladores asociados derivados del adenovirus, dicho al menos un gen rep y los elementos reguladores asociados derivados de AAV, y uno o más promotores unidos operativamente a dicho al menos un gen rep. En una realización, el plásmido auxiliar y/o el vector plasmídico comprende un esqueleto, y el esqueleto plasmídico no comprende un RBS artificial. Opcionalmente, el plásmido auxiliar y el vector plasmídico comprenden cada uno un esqueleto, y ninguno de los esqueletos plasmídicos comprende un RBS artificial.
En consecuencia, en una realización, el plásmido auxiliar y/o el vector plasmídico no comprende un RBS artificial. Preferentemente, el plásmido auxiliar y el vector plasmídico no comprenden un RBS artificial. Opcionalmente, no hay RBS en el vector plasmídico y/o en el plásmido auxiliar, excepto dentro de cualquier ITR, promotor p5 y promotor p19.
Gen cap de AAV
El vector plasmídico puede comprender un gen cap de AAV. El gen cap de AAV codifica una proteína Cap de AAV funcional. El gen cap de AAV puede codificar un conjunto funcional de proteínas Cap de AAV. El AAV generalmente comprende tres proteínas Cap de AAV, VP1, VP2 y VP3. Estas tres proteínas forman una cápside en la que se inserta el genoma de AAV y permiten la transferencia del genoma de AAV a una célula huésped. Todas las VP1, VP2 y VP3 son codificados en los AAV nativos por un solo gen, el gen cap de AAV. La secuencia de aminoácidos de VP1 comprende la secuencia de VP2. La parte de VP1 que no forma parte de VP2 se denomina VPlunique o VP1U. La secuencia de aminoácidos de VP2 comprende la secuencia de VP3. La parte de VP2 que no forma parte de VP3 se denomina VP2unique o VP2U.
A conjunto "funcional" de proteínas Cap de AAV es aquel que permite la encapsidación de AAV. Como se ha analizado anteriormente, está dentro de las capacidades de los expertos determinar si una proteína Cap de AAV dada o un conjunto de proteínas Cap de AAV son funcionales. Los expertos simplemente necesitan determinar si las proteínas Cap de AAV codificadas facilitan la producción de AAV usando un ensayo de producción de AAV como se describió anteriormente. En este caso, el sistema de dos plásmidos de ensayo comprenderá un vector plasmídico que comprende el gen cap de AAV que codifica las proteínas Cap de AAV cuya "funcionalidad" debe determinarse y, por lo demás, el sistema de dos plásmidos de ensayo utilizado será idéntico al sistema de dos plásmidos de referencia. Las proteínas Cap de AAV se considerarán "funcionales" si facilitan la producción de rAAV a un nivel de al menos el 25 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del nivel facilitado por el producto del gen cap de AAV de tipo salvaje, es decir, si el rendimiento de rAAV producido es de al menos un 25 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % del rendimiento de rAAV producido utilizando el sistema de dos plásmidos de referencia. Preferentemente, las proteínas Cap de AAV se considerarán "funcionales" si facilitan la producción de rAAV a un nivel de al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del nivel facilitado por el producto del gen cap de AAV de tipo salvaje.
Opcionalmente, las proteínas VP2 y/o VP3 son "funcionales" si un AAV que comprende las proteínas VP2 y/o VP3 es capaz de transducir células Huh7 a un nivel de al menos un 25 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de el de un AAV equivalente que comprende una proteína VP2 y/o VP3 de tipo salvaje. La capacidad de una partícula de AAV para transducir células Huh7 se puede analizar agregando una proteína indicadora, como la proteína fluorescente verde ("green fluorescent protein", GFP), a la partícula AAV, mezclando la partícula de AAV con células Huh7 y midiendo la fluorescencia producida.
Opcionalmente, el vector plasmídico comprende un gen cap de AAV que codifica una proteína VP1, VP2 y/o VP3. Opcionalmente, las proteínas VP1, VP2 y VP3 se expresan a partir de más de un gen cap de AAV. Opcionalmente, el vector plasmídico comprende un gen cap de AAV que codifica una proteína VP1, VP2 y VP3. Opcionalmente, el vector plasmídico comprende un gen cap de AAV que codifica una VP1 funcional, es decir, una proteína VP1 capaz de ensamblarse con otras proteínas Cap de AAV para encapsidar un genoma viral.
Diferentes serotipos de AAV tienen proteínas Cap de AAV que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. Un gen cap de AAV que codifica cualquier proteína (conjunto de proteínas) Cap de AAV es adecuado para su uso en relación con la presente invención. La proteína Cap de AAV puede ser una proteína Cap de AAV nativa expresada en AAV de un determinado serotipo. Como alternativa, la proteína Cap de AAV puede ser no natural, por ejemplo, una proteína Cap de AAV modificada que se diseña para comprender una secuencia diferente a la de una proteína Cap de AAV nativa. Los genes que codifican proteínas Cap no naturales son particularmente ventajosos, puesto que, en el contexto de las aplicaciones de terapia génica, es posible que menos pacientes potenciales tengan niveles de anticuerpos que impidan la transducción por AAV que comprenden proteínas Cap no naturales, en relación con las cápsides nativas.
Opcionalmente, el gen cap de AAV codifica una proteína Cap de AAV de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en los serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13. Opcionalmente, el gen cap de AAV codifica una proteína Cap de AAV seleccionada del grupo que consiste en LK03, rh74, rh10 y Mut C (documento WO 2016/181123; documento WO 2013/029030; documento WO 2017/096164).
Promotor del gen cap de AAV
Opcionalmente, el vector plasmídico comprende un promotor del gen cap de AAV. El promotor del gen cap de AAV puede estar unido operativamente a un gen cap de AAV. Como alternativa, el vector plasmídico puede no comprender un gen cap de AAV, pero puede comprender un sitio de clonación unido operativamente (es decir, en estrecha yuxtaposición: 5'-[promotor del gen cap]-[sitio de clonación]-3') al promotor del gen cap. El sitio de clonación puede ser un sitio de clonación múltiple ("multiple cloning site", MCS o policonector; véanse, por ejemplo, las figuras 4C-E). El usuario puede desear tener la opción de agregar un gen cap específico para una aplicación específica. Por ejemplo, si el vector plasmídico se va a utilizar para producir AAV para su uso en terapia génica, el usuario puede desear que el vector plasmídico carezca de un gen cap, pero que comprenda un sitio de clonación para permitir clonar un gen cap específico para una aplicación específica. El vector plasmídico podría usarse en relación con cualquier transgén (en un módulo de expresión), y el usuario puede descubrir que, para ciertos transgenes, la encapsidación de dichos módulos en cápsides que tienen propiedades, tales como tropismo hepático, es ventajosa, mientras que, para otros transgenes, son ventajosas las cápsides que tienen diferentes tropismos. Mediante el diseño de un vector plasmídico que comprende un promotor del gen cap relacionado con un sitio de clonación, el usuario puede fácilmente "enchufar" un gen cap apropiado para una aplicación específica (como el uso de un transgén específico).
El gen cap de AAV nativo (es decir, el gen cap de un AAV de tipo salvaje) está unido operativamente a un promotor p40, un promotor p5 y un promotor p19. Opcionalmente, dicho al menos un promotor del gen cap de AAV comprende un promotor p40 de AAV, un promotor p5 y/o un promotor p19. Opcionalmente, dicho al menos un promotor del gen cap de AAV comprende un promotor p40 de AAV, un promotor p5 y un promotor p19. Sin embargo, puede usarse cualquier promotor adecuado que sea capaz de dirigir la expresión del gen cap de a Av .
Puede determinarse si un promotor del gen cap de AAV dado es capaz o no de dirigir la expresión del gen cap de AAV usando un ensayo de producción de AAV como se describió anteriormente. Específicamente, si el promotor del gen cap de AAV puede dirigir la expresión del gen cap de AAV, facilitará la producción de AAV. En este caso, el sistema de dos plásmidos de ensayo comprenderá un vector plasmídico que comprende el gen cap de AAV y un promotor del gen cap de AAV cuya capacidad para facilitar la producción de AAV se va a analizar y, por lo demás, el sistema de dos plásmidos de ensayo utilizado será idéntico al sistema de dos plásmidos de referencia. En una realización, se considerará que el promotor del gen cap de AAV facilita la producción de AAV si facilita la producción de rAAV en un nivel de al menos el 25 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del nivel facilitado por un promotor p40 del gen cap de tipo salvaje, es decir, si el rendimiento de los vectores rAAV producidos es de al menos un 25 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % del rendimiento de rAAV producido utilizando el sistema de dos plásmidos de referencia. Preferentemente, se considerará que el promotor del gen cap de AAV facilita la producción de AAV si facilita la producción de rAAV en un nivel de al menos el 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % del rendimiento de rAAV producido utilizando el sistema de dos plásmidos de referencia.
Se entiende que el promotor p40 dirige la expresión del gen cap. El promotor p40 nativo está contenido dentro del gen rep nativo. El promotor p40 de AAV2 tiene una secuencia de nucleótidos 1710-1827 de SEQ ID NO:1. Sin embargo, los promotores p40 en otros serotipos de AAV pueden comprender secuencias ligeramente diferentes. En algunas realizaciones, el promotor p40 tiene una secuencia al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 99 % idéntica a los nucleótidos 1710-1827 de SEQ ID NO:1, o una secuencia correspondiente de otro serotipo de AAV. En algunas realizaciones, el promotor p40 tiene una secuencia idéntica en al menos un 98 % a los nucleótidos 1710-1827 de SEQ ID NO:1.
Los presentes inventores han descubierto que al menos un promotor del gen cap de AAV que comprende un promotor p40, un promotor p5 y un promotor p19 es ventajoso, puesto que el promotor p5 y el promotor p19 desempeñan un papel en la regulación del promotor p40, y la presencia del promotor p40, el promotor p5 y el promotor p19 conduce a la expresión oportunamente regulada del gen cap de AAV que da como resultado un rAAV de alto rendimiento/alta calidad. En consecuencia, en algunas realizaciones, dicho al menos un promotor del gen cap de AAV está comprendido en una "región promotora" que comprende un promotor p40, un promotor p5 y un promotor p19. Opcionalmente, la región promotora comprende una secuencia con al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 800, al menos 900, al menos 1000 o al menos 1100 nucleótidos de longitud de los siguientes tramos de la secuencia nativa de AAV2 (SEQ ID NO:1) colocados en yuxtaposición inmediata de 5' a 3': 200-354; 600-1049; 1701-2202, o con tramos yuxtapuestos de nucleótidos correspondientes de un serotipo diferente de AAV.
El promotor p5 nativo está secuencia arriba del gen rep de AAV nativo. El promotor p5 de AAV2 tiene una secuencia de nucleótidos 204-292 de SEQ ID NO:1. Sin embargo, los promotores p5 en otros serotipos de AAV pueden comprender secuencias ligeramente diferentes. En algunas realizaciones, el promotor p5 tiene una secuencia al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % idéntica a los nucleótidos 204-292 de SEQ ID NO:1, o una secuencia correspondiente de otro serotipo de AAV. En algunas realizaciones, el promotor p5 tiene una secuencia idéntica en al menos un 98 % a los nucleótidos 204-292 de SEQ ID NO:1.
El promotor p19 está contenido dentro del gen rep de AAV nativo. El promotor p19 de AAV2 tiene una secuencia de nucleótidos 730-890 de SEQ ID NO:1. Sin embargo, los promotores p19 en otros serotipos de AAV pueden comprender secuencias ligeramente diferentes. En algunas realizaciones, el promotor p19 tiene una secuencia al menos un 95 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % idéntica a los nucleótidos 730-890 de SEQ ID NO:1, o una secuencia correspondiente de otro serotipo de AAV. En algunas realizaciones, el promotor p19 tiene una secuencia idéntica en al menos un 98 % a los nucleótidos 730-890 de SEQ ID NO:1.
Módulo de expresión flanqueado en al menos un lado por una ITR
El sistema de dos plásmidos de la invención puede usarse para producir un vector AAV para su uso en terapia génica. La "terapia de genes" implica administrar AAV/partículas virales de la invención que son capaces de expresar un transgén (tal como una secuencia de nucleótidos que codifica el factor IX) en el huésped al que se administran. En estos casos, el vector plasmídico comprenderá un módulo de expresión.
Opcionalmente, el vector plasmídico comprende al menos una ITR. Por tanto, el vector plasmídico comprende al menos una ITR, pero, más normalmente, dos ITR (generalmente con uno de los extremos del módulo de expresión, es decir, una en el extremo 5' y la otra en el extremo 3'). Puede haber secuencias intermedias entre el módulo de expresión y una o más de las ITR. El módulo de expresión puede incorporarse en una partícula viral ubicado entre dos ITR normales o ubicado a ambos lados de una ITR diseñada con dos regiones D. Opcionalmente, el vector plasmídico comprende secuencias ITR que se derivan de AAV1, AAV2, AAV4 y/o AAV6. Preferentemente, las secuencias ITR son secuencias ITR de AAV2.
Opcionalmente, el vector plasmídico comprende un módulo de expresión. Como se describe en el presente documento, un módulo de expresión se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que comprende un transgén y un promotor unido operativamente al transgén. Opcionalmente, el módulo comprende además elementos reguladores de la transcripción adicionales, tales como potenciadores, intrones, regiones no traducidas, terminadores transcripcionales, etc.
Opcionalmente, el módulo de expresión comprende un elemento regulador de la transcripción que comprende el elemento promotor y/o el elemento potenciador de HLP2, HLP1, LP1, HCR-hAAT, ApoE-hAAT y/o lSp . Estos elementos reguladores de la transcripción se describen con más detalle en las siguientes referencias bibliográficas: HLP2: documento WO16/075473; HLP1: McIntosh J. et al., Blood, 25 de abril de 2013, 121(17):3335-3344; LP1: Nathwani et al., Blood. 1 de abril de 2006, 107(7): 2653-2661; HCR-hAAT: Miao et al., Mol. Ther., 2000, 1:522-532; ApoE-hAAT: Okuyama et al., Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996); y LSP: Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 30 de marzo, 96(7): 3906-3910. Cada uno de estos elementos reguladores de la transcripción comprende un promotor, un potenciador y, opcionalmente, otros nucleótidos. Si el polinucleótido está destinado a la expresión en el hígado, el promotor puede ser un promotor específico de hígado. Opcionalmente, el promotor es un promotor específico de hígado humano.
El transgén puede ser cualquier gen adecuado. Si el vector plasmídico es para su uso en terapia génica, el transgén puede ser cualquier gen que comprenda o codifique una proteína o una secuencia de nucleótidos que pueda usarse para tratar una enfermedad. Por ejemplo, el transgén puede codificar una enzima, una proteína metabólica, una proteína de señalización, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína similar a un anticuerpo, un antígeno, o un ARN no traducido, como un miARN, ARNip, ARNnp o ARN antisentido.
Codones de iniciación de la traducción prescindibles
Opcionalmente, el vector plasmídico no comprende codones de iniciación de la traducción prescindibles. Opcionalmente, el vector plasmídico puede comprender al menos dos genes que deben poder transcribirse y traducirse (el transgén (en un módulo de expresión) y el gen cap de AAV). Opcionalmente, el transgén codifica un ARN funcional que no codifica una proteína o polipéptido traduccional. El transgén, si codifica una proteína, y el gen cap de AAV comprenderán codones de iniciación (a Tg o GTG) para activar la iniciación de la traducción del gen. Sin embargo, el vector plasmídico puede comprender casos adicionales de ATG o GTG (ya sea dentro o fuera del marco con el marco de lectura de estos genes), y es posible que la traducción pueda iniciarse en una de estas posiciones. Dado que no es necesario iniciar la traducción en el sitio de estos casos adicionales de ATG o GTG, los codones ATG o GTG pueden considerarse "codones de iniciación de la traducción prescindibles". Se prefiere que los codones de iniciación de la traducción prescindibles se eliminen o se vuelvan no funcionales, en concreto cuando aparecen en la región promotora. La región promotora es una región del vector plasmídico que comprende uno o más promotores unidos operativamente al gen cap de AAV. En algunas realizaciones, el gen cap de AAV está unido operativamente a uno o más de los promotores p5, p19 y p40, y en tales realizaciones la región promotora comprende los promotores p5, p19 y p40.
Opcionalmente, el plásmido comprende una región promotora que comprende uno o más promotores, y la región promotora no comprende codones ATG ni GTG. Opcionalmente, la región promotora comprende los promotores p5, p19 y/o p40, y los codones ATG o GTG en una o más posiciones correspondientes a las posiciones (a) 321-323 (codón de iniciación ATG Rep78/68), (b) 766-768 (codón ATG), (c) 955-957 (codón ATG), (d) 993-995 (codón de iniciación ATG Rep52/40) y (e) 1014-1016 (codón GTG) de SEQ ID No :1 están ausentes o mutados.
Opcionalmente, en la región promotora:
(a) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 321-323 de SEQ ID NO:1 están ausentes;
(b) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 766-768 de SEQ ID NO:1 no son ATG y son opcionalmente ATT;
(c) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 955-957 de SEQ ID NO:1 están ausentes;
(d) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 993-995 de SEQ ID NO:1 están ausentes; y/o
(e) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1014-1016 de SEQ ID NO:1 están ausentes.
Opcionalmente, en la región promotora:
(a) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 321-323 de SEQ ID NO:1 están ausentes;
(b) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 766-768 de SEQ ID NO:1 no son ATG y son opcionalmente ATT;
(c) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 955-957 de SEQ ID NO:1 están ausentes;
(d) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 993-995 de SEQ ID NO:1 están ausentes; y
(e) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1014-1016 de SEQ ID NO:1 están ausentes.
Tamaño del vector plasmídico
Tal como se analizó anteriormente en relación con el plásmido auxiliar, es ventajoso que los plásmidos usados en la producción de rAAV sean lo más pequeños posible. Los plásmidos más pequeños son más baratos de producir y más fáciles de transfectar a células.
El tamaño del vector plasmídico estará definido, en parte, por el tamaño de los promotores, los elementos reguladores de la transcripción, los transgenes y los genes cap de AAV que estén incluidos y, tal como se analizó anteriormente, la naturaleza de estas características estará definida parcial o totalmente por la aplicación para la que se utilizará el rAAV.
Sin embargo, el tamaño del vector plasmídico se puede reducir asegurándose de que el tamaño del esqueleto que se utiliza sea pequeño y/o asegurándose de que el vector plasmídico no contenga un espaciador (regiones contiguas de secuencias de ácido nucleico no codificantes de más de 200 nucleótidos de longitud).
Opcionalmente, el vector plasmídico comprende un esqueleto de menos de 4000 nucleótidos, menos de 3500 nucleótidos, menos de 3000 nucleótidos, o menos de 2500 nucleótidos de longitud. Opcionalmente, el vector plasmídico no comprende ningún espaciador.
Célula huésped
Se describe una célula huésped que comprende el sistema de dos plásmidos de la invención, el plásmido auxiliar de la invención o el vector plasmídico.
La célula huésped es preferentemente una célula huésped que puede usarse para producir rAAV. Por lo tanto, la célula huésped puede ser una célula huésped adecuada para la producción de rAAV. Además, la célula huésped puede ser para la producción de rAAV.
En general, una célula huésped que es adecuada para la producción de rAAV es una célula huésped que procede de una línea celular eucariota, preferentemente una línea celular de vertebrados, preferentemente una línea celular de mamífero, preferentemente una línea celular humana. Opcionalmente, la célula huésped es una célula que se selecciona del grupo que consiste en una célula HEK293T, una célula HEK293, una célula HEK293EBNA, una célula CAP, una célula CAP-T, una célula AGE1.CR, una célula PerC6, una célula C139, una célula EB66, una célula BHK, una célula COS, una célula Vero, una célula Hela y una célula A549. Preferentemente, la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula HEK293T, una célula HEK293, una célula HEK293EBNA, una célula CAP, una célula CAP-T, una célula AGE1.CR, una célula PerC6, una célula C139 y una célula EB66. Incluso más preferentemente, la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula HEK293T, una célula HEK293 y una célula HEK293EBNA. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula HEK293T. Opcionalmente, la célula huésped es una célula que expresa una proteína E1A/B adenoviral funcional. Por ejemplo, la célula huésped puede comprender un cromosoma que comprende un gen que codifica una proteína E1A/B adenoviral funcional. Las proteínas E1A/B adenovirales funcionales se analizan en la sección titulada "Al menos un gen de virus auxiliar".
Está dentro de las capacidades de los expertos determinar si una célula huésped es adecuada para la producción de rAAV. Los expertos simplemente necesitan determinar si la célula huésped facilita la producción de aAv usando un ensayo de producción de AAV como se describió anteriormente. En este caso, el sistema de dos plásmidos de ensayo y el sistema de dos plásmidos de referencia que se utilizan serán idénticos. Sin embargo, el sistema de dos plásmidos de ensayo se transfectará a la célula huésped cuya idoneidad para la producción de AAV recombinante se va a analizar, y el sistema de dos plásmidos de referencia se transfectará en células HEK293T. La célula huésped se considerará adecuada para la producción de AAV recombinante si facilita la producción de AAV en un nivel de al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del nivel facilitado por las células HEK293T, es decir, si el rendimiento de AAV recombinante producido es de al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % del rendimiento de AAV recombinante producido en células HEK293T.
Nivel bajo de AAV competente para la replicación (rcAAV)
El sistema de dos plásmidos de la invención, el plásmido auxiliar de la invención o el vector plasmídico pueden usarse para producir una preparación de rAAV que tiene un nivel bajo de AAV competente para la replicación (rcAAV).
El plásmido auxiliar o el vector plasmídico también pueden usarse para reducir o minimizar el nivel de rcAAV producido durante la producción de rAAV.
La presente invención también proporciona un método para producir una preparación de rAAV que comprende: (a) obtener el sistema de dos plásmidos de la invención, el plásmido auxiliar de la invención o el vector plasmídico;
(b) transfectar una célula huésped con el sistema de dos plásmidos de la invención, el plásmido auxiliar de la invención o el vector plasmídico; y
(c) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de rAAV
en el que la preparación de rAAV comprende un nivel bajo de AAV competente para la replicación (rcAAV).
También se proporciona un método para reducir o minimizar el nivel de AAV competente para la replicación (rcAAV) producido durante la producción de AAV recombinante (rAAV) que comprende:
(a) obtener el sistema de dos plásmidos de la invención, el plásmido auxiliar de la invención o el vector plasmídico;
(b) transfectar una célula huésped con el sistema de dos plásmidos de la invención, el plásmido auxiliar de la invención o el vector plasmídico; y
(c) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de rAAV.
El método puede comprender además una etapa de recolección del rAAV para proporcionar una preparación de rAAV, que opcionalmente tiene un nivel bajo de rcAAV.
"rAAV" o "AAV recombinante" se refiere a partículas de AAV, es decir, partículas que comprenden un genoma de AAV (tal como un genoma de vector) y una cápside de AAV.
Para los fines de la presente invención, el término "rcAAV" o la expresión "AAV competente para la replicación" pretenden referirse a partículas de rAAV que comprenden un genoma que comprende un gen rep o un genoma que comprende un gen cap. Aunque, para los fines de la presente invención, el término "rcAAV" se refiere a partículas de rAAV que comprenden un genoma que comprende un gen rep o un gen cap, se entiende que las partículas de rAAV que comprenden un genoma que comprende un gen rep, pero no un gen cap (denominadas en el presente documento "rcAAV deficiente en cap") o un genoma que comprende un gen cap, pero no un gen rep (denominadas en el presente documento "rcAAV deficiente en rep") no son competentes para la replicación de forma aislada. Más bien, para replicarse (en presencia de las funciones de virus auxiliares necesarias, pero sin ningún requisito para las funciones de AAV proporcionadas in trans), una partícula de AAV debe comprender un gen rep y un gen cap (los llamados "rcAAV de tipo pseudosalvaje"). Sin embargo, una partícula de AAV que comprende un gen rep, pero no comprende un gen cap, puede replicarse cuando se coinfecta en una célula huésped con una partícula de AAV que comprende un gen cap, y una partícula de AAV que comprende un gen cap, pero no comprende un gen rep, puede replicarse cuando se coinfecta en una célula huésped con una partícula de AAV que comprende un gen rep. Por tanto, el término "rcAAV" engloba "rcAAV deficiente en cap", pero también "rcAAV de tipo pseudosalvaje" y "rcAAV deficiente en rep"). El rcAAV de tipo pseudosalvaje puede (en presencia de funciones de virus auxiliares) ser capaz de replicarse en una célula huésped sin coinfección con otra partícula de AAV y producir virus de progenie. El rcAAV de tipo pseudosalvaje puede comprender un gen rep y un gen cap flanqueado por secuencias ITR.
Todas las especies de rcAAV son indeseables en una preparación de rAAV. El rcAAV deficiente en cap puede replicarse cuando se coinfecta con partículas de AAV que contienen cap. El rcAAV deficiente en rep puede replicarse cuando se coinfecta con partículas de AAV que contienen rep, y el rcAAV de tipo pseudosalvaje puede replicarse sin coinfección con AAV. Si el rcAAV se replica, puede causar efectos secundarios significativos. En consecuencia, es ventajoso reducir o minimizar el nivel de rcAAV producido. Como se usa en el presente documento, la expresión "reducir el nivel de rcAAV" se refiere a disminuir el número de rcAAV que se producen. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "minimizar el nivel de rcAAV" se refiere a reducir el nivel de rcAAV al nivel más bajo posible dadas las limitaciones del método.
Cuando se usan los métodos de la invención, el genoma de rAAV que se encapsida no debe comprender un gen rep ni un gen cap, ya que, en general, ni el gen rep ni el gen cap están relacionados (en el mismo plásmido, muy cerca) con una ITR. Sin embargo, los acontecimientos de recombinación únicos podrían dar como resultado la generación de rcAAV deficientes en cap o rep. Para generar rcAAV de tipo pseudosalvaje, deben producirse dos acontecimientos de recombinación, y esto es muy poco probable.
Puede determinarse si una partícula de rAAV comprende o no un genoma que comprende un gen rep, o si una preparación de partículas de rAAV comprende una partícula que comprende un genoma que comprende un gen rep, usando qPCR. Opcionalmente, la cantidad de rcAAV se mide determinando el número de copias de rep producido. Opcionalmente, la cantidad de rcAAV se mide determinando el número de copias de rep por célula (es decir, célula huésped) usando qPCR.
Se debe utilizar un cebador (o dos cebadores) específico para el gen rep en la qPCR. Opcionalmente, los cebadores son específicos (inverso y complementario o idéntico dependiendo de si el cebador es un cebador directo o un cebador inverso) para una región de al menos 12, al menos 14, al menos 16, o al menos 18 de los nucleótidos 321­ 2252 de SEQ ID NO:1, que codifican las cuatro proteínas Rep. Opcionalmente, el cebador es específico para rep 40. Opcionalmente, el cebador es específico para rep 52. Opcionalmente, el cebador es específico para rep 68.
Para determinar el número de copias de rep por célula usando qPCR, se debe usar un segundo par de cebadores en la qPCR que sean específicos para un gen endógeno (como un gen constitutivo endógeno) en la célula huésped, como la albúmina humana en las células HEK293. Opcionalmente, cada cebador o par de cebadores es específico para una región (complementario con esta) de al menos 8, al menos 10, al menos 12 o al menos 15 nucleótidos de la secuencia genómica de la albúmina humana. El número de copias por célula puede entonces determinarse como la proporción entre el número de copias de rep y el número de copias del gen endógeno.
Como alternativa, el método anterior para detectar/medir rcAAV (de tipo pseudosalvaje y/o rcAAV deficiente en cap) puede realizarse mediante qPCR específica del gen cap que puede usarse para detectar rcAAV deficiente en rep. Los métodos o usos pueden proporcionar una preparación de rAAV. En tales realizaciones, la preparación de rAAV preferentemente comprende un nivel bajo de rcAAV. Un nivel bajo de rcAAV es generalmente un nivel de rcAAV menor que 1 rcAAV en 107 rAAV, o es más bajo que el de una preparación de rAAV que se produce utilizando un método equivalente al de un método de la invención, excepto que el vector plasmídico comprende al menos un gen rep y al menos un gen cap. El nivel de rAAV se puede determinar usando qPCR para determinar el número de genomas del vector, como se describe a continuación en la sección titulada "Rendimiento alto".
Opcionalmente, el nivel de rcAAV es menor que a 1 rcAAV en 107 AAV recombinantes, menor que 1 rcAAV en 109 AAV recombinantes, o menor que 1 rcAAV en 1010 AAV recombinantes. Opcionalmente, el nivel de rcAAV es menor que el nivel de rcAAV producido utilizando un método equivalente, excepto que el vector plasmídico comprende dicho al menos un gen rep y al menos un gen cap. Opcionalmente, el nivel de rcAAV se mide utilizando el ensayo qPCR anterior. Opcionalmente, el nivel de rcAAV se mide usando el ensayo qPCR después de dos o tres generaciones de cultivo. Opcionalmente, el rcAAV es un rcAAV de tipo pseudosalvaje. Opcionalmente, el rcAAV es un rcAAV deficiente en cap. Opcionalmente, el rcAAV es un rcAAV deficiente en rep. Opcionalmente, el rcAAV comprende rcAAV de tipo pseudosalvaje, rcAAV deficiente en cap y rcAAV deficiente en rep.
La expresión "método equivalente al de un método de la invención" pretende referirse a un método que es idéntico, excepto que el vector plasmídico comprende dicho al menos un gen rep y al menos un gen cap.
Proporción deseada de partículas llenas a totales
También se proporciona un uso del sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico para producir una preparación de rAAV que tenga una proporción deseada de partículas llenas a totales.
También se proporciona un uso del sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico para controlar o maximizar la proporción de partículas llenas a totales producidas durante la producción de rAAV.
También se proporciona un método para producir una preparación de rAAV que comprende:
(a) obtener el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico;
(b) transfectar una célula huésped con el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico; y (c) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de rAAV
en el que la preparación de rAAV comprende una proporción deseada de partículas llenas a totales.
También se proporciona un método para controlar o maximizar la proporción de partículas llenas a totales producidas durante la producción de rAAV que comprende:
(a) obtener el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico;
(b) transfectar una célula huésped con el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico; y (c) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de rAAV.
El método puede comprender además una etapa de recolección del rAAV para proporcionar una preparación de rAAV, que tiene opcionalmente una proporción deseada de partículas llenas a totales.
Los presentes inventores han determinado que se puede usar la alteración de la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico para alterar la proporción de partículas llenas a totales que se producen. Específicamente, los inventores han determinado que al aumentar el nivel del vector plasmídico en relación con el plásmido auxiliar se reduce la proporción de partículas llenas a totales.
Las partículas "llenas" son partículas de rAAV que comprenden tanto una cápside como el genoma del vector previsto, o al menos un genoma parcial, tal como se determina usando el método de qPCR descrito a continuación. Las partículas "vacías" (es decir, las partículas que no están llenas) comprenden cápsides, pero no comprenden un genoma, o comprenden solo un genoma parcial (por lo tanto, no forman una partícula de rAAV completa) que no se detecta usando el método qPCR. Sin embargo, las preparaciones de rAAV pueden comprender tanto partículas llenas como partículas vacías. Generalmente se desea una proporción baja o minimizada de partículas vacías. Por ejemplo, si el rAAV se va a utilizar en terapia génica, cualquier partícula vacía no comprenderá el módulo de expresión de interés completo y, por lo tanto, no será eficaz en la terapia. Por otra parte, hay circunstancias en las que la presencia de partículas vacías podría ser deseable. En algunos casos, y en algunos grupos de pacientes, puede darse el caso de que las partículas vacías se comporten como "señuelos" para reducir la respuesta inmunitaria en un paciente a las partículas de rAAV administradas (documento WO2013/078400). Además, tal como se analizará con más detalle a continuación, mientras que aumentar el nivel del vector plasmídico en relación con el plásmido auxiliar disminuye la proporción de partículas llenas a totales, también aumenta el rendimiento de rAAV producido (y, por lo tanto, en algunos casos, el número total de partículas llenas que se producen). Por tanto, incluso si el usuario del método cree que es deseable una proporción alta entre partículas llenas y partículas totales, el usuario puede usar una proporción menor de plásmido auxiliar si esto conduce a un mayor rendimiento. Como alternativa, si el usuario, por ejemplo, aplica un cambio de proceso durante el desarrollo de un producto dado, por ejemplo, cambia del biorreactor A al biorreactor B, lo que da como resultado diferentes proporciones de partículas llenas a totales cuando se mantiene constante la proporción de plásmidos, la proporción de plásmidos se puede modificar para compensar o contrarrestar el efecto del cambio de proceso para garantizar una proporción constante de partículas llenas a totales durante todo el desarrollo, ya que esta proporción es un parámetro de calidad crítico de un lote de rAAV que debe controlarse y mantenerse comparable de un lote a otro.
En consecuencia, una ventaja de los métodos y usos es que permiten al usuario la flexibilidad para determinar una proporción deseable de partículas llenas a totales y modificar la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico para lograr la proporción deseada de partículas llenas a totales.
La proporción de partículas llenas a totales puede expresarse en el presente documento como el porcentaje del número total de partículas (cápsides) que teóricamente comprenden un genoma de vector o al menos un genoma parcial (suponiendo un genoma (parcial) por cápside) según se determina utilizando el siguiente ensayo de qPCR. La qPCR se lleva a cabo utilizando un par de cebadores que son capaces de amplificar al menos una región del promotor del módulo de expresión. Opcionalmente, al menos uno de los cebadores es específico (inverso y complementario o idéntico dependiendo de si el cebador es un cebador directo o un cebador inverso) para una región de al menos 12, al menos 14, al menos 16, o al menos 18 nucleótidos del promotor del módulo de expresión. Opcionalmente, un cebador es específico para el inicio del promotor (los primeros al menos 12 nucleótidos del promotor) y el otro cebador es específico para una región del módulo de expresión que está a 150 pares de bases del sitio de unión del primer cebador.
La proporción entre partículas llenas y totales (medida como un porcentaje del número total de partículas que son partículas llenas) se puede determinar usando qPCR para determinar el número de genomas del vector (como se analizó en el párrafo anterior), y usando un ELISA específico de cápside para medir el número total de partículas.
Por ejemplo, el ELISA específico de cápside puede comprender exponer la preparación de rAAV a un anticuerpo que se une a la proteína de la cápside. Si, por ejemplo, el vector plasmídico comprende un gen cap que codifica una cápside de un serotipo AAV2, el anticuerpo puede ser un anticuerpo que se une a la cápside de Aa V2. Por ejemplo, el usuario puede recubrir una placa con un anticuerpo específico para la cápside.
Luego, el usuario puede hacer pasar la preparación de rAAV sobre la superficie de la placa. Las partículas se unirán al anticuerpo y quedarán inmovilizadas en la placa. A continuación, la placa se puede lavar para eliminar los contaminantes. La cantidad de partículas presentes se puede detectar luego mediante la adición de un anticuerpo de detección que se puede unir a la cápside y está conjugado con un agente de detección, como la estreptavidina peroxidasa. La cantidad de partícula presente será proporcional al cambio de color obtenido cuando la estreptavidina peroxidasa se expone al sustrato cromogénico TMB (tetrametilbencidina).
Opcionalmente, la proporción deseada entre partículas llenas y totales (expresada como porcentaje del número total de partículas que teóricamente comprenden un genoma de vector) es de al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 7 %, al menos un 10 % o al menos un 15 % (medido en el producto a granel antes de la recolección, la purificación y/o la concentración de la preparación de rAAV). En muchos casos, es ventajoso aumentar la proporción de partículas llenas a totales, y los presentes inventores han determinado que el objetivo de una proporción de partículas llenas a totales de al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 7 %, al menos un 10 % o al menos un 15 % logra un buen equilibrio entre el mantenimiento de una alta proporción de partículas totales, además de lograr un buen rendimiento. Opcionalmente, la proporción deseada de partículas llenas a totales es una proporción de partículas llenas a totales que es al menos un 20 % o al menos un 30 % de la proporción de partículas llenas a totales lograda utilizando un método equivalente con una proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico de 1,8:1.
Opcionalmente, la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico que se utiliza, se selecciona o se ajusta para que sea de entre 3:1 y 1:10, entre 1,5:1 y 1:9, entre 1,4:1 y 1:8, entre 1,3:1 y 1:7, entre 1,2:1 y 1:6, entre 1,1:1 y 1:5, entre 1:1 y 1:4, o entre 1:1,5 y 1:3. Opcionalmente, la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico comprende un exceso molar de vector plasmídico.
Rendimiento alto
También se proporciona un uso del sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico para producir una preparación de rAAV con un rendimiento alto o deseado.
También se proporciona un uso del sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico para aumentar, optimizar o maximizar el rendimiento de rAAV producido durante la producción de rAAV.
También se proporciona un método para producir una preparación de rAAV que comprende:
(a) obtener el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico;
(b) transfectar una célula huésped con el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico; y (c) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de rAAV
en el que la preparación de rAAV tiene un rendimiento alto o deseado.
También se proporciona un método para aumentar, optimizar o maximizar el rendimiento de rAAV producido durante la producción de rAAV que comprende:
(a) obtener el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico;
(b) transfectar una célula huésped con el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico; y (c) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de rAAV.
El método puede comprender además una etapa de recolección del vector rAAV para proporcionar una preparación de rAAV, opcionalmente con un rendimiento alto o deseado. El término "rendimiento" se refiere a la cantidad de partículas de AAV que se preparan en los métodos o usos de la invención. El "rendimiento" puede expresarse como el número de genomas de vector (vg) por ml de medio, medido antes (medido en el producto a granel antes de la recolección, la purificación y/o la concentración de la preparación de rAAV). El número de genomas de vector se puede medir como se analiza en el encabezado "Proporción deseada de partículas llenas a totales", es decir, el rendimiento de rAAV (como las partículas de rAAV) se puede determinar usando qPCR para cuantificar el número de secuencias de ácido nucleico que comprenden un módulo que comprende una secuencia de promotor (vg).
Los presentes inventores han demostrado que se puede usar la modificación de la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico para aumentar el rendimiento (es decir, la cantidad de vg o vg/ml producida) de un método que produce rAAV. Tener el mayor rendimiento posible es claramente ventajoso, ya que reduce la cantidad de recursos necesarios para producir el rAAV. Sin embargo, en algunas condiciones, aumentar el rendimiento al nivel más alto posible puede resultar en una disminución en la proporción de partículas llenas a totales. Por tanto, si el usuario está produciendo el rAAV para una aplicación donde es importante maximizar la proporción de partículas llenas a totales, entonces puede optar por usar un rendimiento deseado que no sea el rendimiento más alto posible mediante el uso de una proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico que se optimiza a favor de la proporción de partículas llenas a totales (es decir, "% de llenas").
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "maximizar" el rendimiento se refiere a aspirar al mayor rendimiento posible dentro de las limitaciones de los métodos de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "optimizar" se refiere a aumentar el rendimiento, pero apuntando a un rendimiento deseado que puede no ser el rendimiento máximo posible si, por ejemplo, el usuario desea garantizar una alta proporción de partículas llenas y totales (es decir, minimizar la proporción de partículas vacías).
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "rendimiento alto" generalmente se refiere a un rendimiento mayor que 2 * 1010 vg/ml, o al menos 2 veces mayor que el rendimiento logrado utilizando un método equivalente con una proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico de 1,8:1. Un "método equivalente" es un método que es idéntico, excepto que la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico es de 1,8:1.
Opcionalmente, el rendimiento alto o deseado es un rendimiento mayor que 2 * 1010 vg/ml, mayor que 4 * 1010 vg/ml, mayor que 6 * 1010 vg/ml, mayor que 8 * 1010 vg/ml, mayor que 1 * 1011 vg/ml, mayor que 2 * 1011 vg/ml o mayor que 4 * 1011 vg/ml.
Opcionalmente, el rendimiento alto o deseado es un rendimiento que es al menos el doble, al menos 4 veces, al menos 5 veces, o al menos 6 veces mayor que el rendimiento logrado utilizando un método equivalente con una proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico de 1,8:1.
Opcionalmente, la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico que se utiliza, se selecciona o se ajusta para que sea de entre 3:1 y 1:10, entre 1,5:1 y 1:9, entre 1,4:1 y 1:8, entre 1,3:1 y 1:7, entre 1,2:1 y 1:6, entre 1,1:1 y 1:5, entre 1:1 y 1:4, o entre 1:1,5 y 1:3. Opcionalmente, la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico comprende un exceso molar de vector plasmídico en comparación con el plásmido auxiliar.
Equilibrio entre alto rendimiento y alta proporción de partículas llenas a totales
Como se ha analizado anteriormente, la proporción de partículas llenas a totales y el rendimiento pueden verse afectados por la alteración de la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico utilizada en los métodos. Por tanto, el usuario puede ajustar la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico a una proporción adecuada para obtener la proporción de partículas llenas a totales deseada. Opcionalmente, los métodos o usos pueden comprender una etapa de seleccionar una proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico. Se puede alterar la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico, o seleccionar una proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico, simplemente mezclando el plásmido auxiliar y el vector plasmídico en diferentes proporciones relativas. El usuario puede necesitar llevar a cabo un método de prueba para determinar la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico que se requiere para obtener la proporción deseada de partículas llenas a totales, pero esto no es trabajoso. Por ejemplo, los expertos en la materia pueden realizar un experimento a pequeña escala para determinar la proporción requerida de plásmido auxiliar a vector plasmídico, y luego esta proporción puede usarse en un proceso de producción a mayor escala. Opcionalmente, la etapa de seleccionar una proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico puede comprender realizar pruebas a pequeña escala del método de la invención usando diferentes proporciones de plásmido auxiliar a vector plasmídico.
Opcionalmente, la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico se selecciona o se ajusta a una proporción que logre un rendimiento equilibrado frente a la proporción de partículas llenas a totales. Opcionalmente, la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico se selecciona o se ajusta a una proporción que logre un rendimiento máximo de rAAV (es decir, vg) con el rendimiento mínimo de partículas alcanzable con dicho rendimiento máximo de rAAV, es decir, el usuario maximiza el rendimiento y luego determina la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico que logra ese rendimiento mientras proporciona la proporción más alta de partículas llenas a totales.
Opcionalmente, la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico que se utiliza, se selecciona o se ajusta para que sea de entre 3:1 y 1:10, entre 1,5:1 y 1:9, entre 1,4:1 y 1:8, entre 1,3:1 y 1:7, entre 1,2:1 y 1:6, entre 1,1:1 y 1:5, entre 1:1 y 1:4, o entre 1:1,5 y 1:3. Opcionalmente, la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico comprende un exceso molar de vector plasmídico.
Transfección, cultivo y recolección
Los métodos de la invención pueden comprender etapas de obtención del sistema de dos plásmidos de la invención, el plásmido auxiliar de la invención o el vector plasmídico, mediante la transfección de una célula huésped con el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico, y el cultivo de la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de AAV recombinante.
La transfección de una célula huésped con el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico, puede comprender exponer la célula huésped al sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico en condiciones adecuadas para la transfección. Por ejemplo, el usuario del método puede añadir un agente de transfección (la adición de un agente de transfección se consideraría una condición adecuada para la transfección). Como alternativa, puede usarse la transfección con fosfato de calcio, la electroporación o liposomas catiónicos. Opcionalmente, la etapa de transfectar la célula huésped tiene lugar cuando la célula huésped ha crecido hasta la confluencia.
El cultivo de la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de rAAV se refiere al cultivo de la célula huésped en condiciones en las que puede crecer y el AAV puede replicarse. Por ejemplo, la célula huésped se puede cultivar a una temperatura entre 32 °C y 40 °C, entre 34 °C y 38 °C, entre 35 °C y 38 °C o aproximadamente de 37 °C. Opcionalmente, la célula huésped puede cultivarse en presencia de un medio de cultivo celular completo, tal como medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Un medio de cultivo celular completo es un medio que proporciona todos los nutrientes esenciales necesarios para el crecimiento de la célula huésped. Opcionalmente, el medio de cultivo celular completo se complementa con suero, tales como suero bovino fetal o seroalbúmina bovina.
Opcionalmente, la célula huésped es una célula huésped como las definidas anteriormente bajo el encabezado "Célula huésped". Opcionalmente, la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula HEK293T, una célula HEK293, una célula HEK293EBNA, una célula CAP, una célula CAP-T, una célula AGE1.CR, una célula PerC6, una célula C139 y una célula EB66. Opcionalmente, la célula huésped es una célula que expresa una proteína E1A/B funcional.
El método puede comprender además una etapa de purificar el rAAV. En general, una etapa de purificación del rAAV implicará aumentar la concentración del rAAV en comparación con otros componentes de la preparación. Opcionalmente, la etapa de purificación del rAAV da como resultado una preparación concentrada de rAAV. Opcionalmente, la etapa de purificación del rAAV da como resultado un rAAV aislado.
Puede usarse cualquier método de purificación adecuado. Opcionalmente, la etapa de purificación del rAAV se lleva a cabo utilizando una técnica seleccionada del grupo que consiste en centrifugación en gradiente de densidad (como la centrifugación en gradiente de densidad con CsCl o Iodixanol), filtración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño molecular, cromatografía de afinidad y cromatografía de interacción hidrofóbica.
Opcionalmente, el método comprende concentrar aún más el rAAV usando ultracentrifugación, filtración de flujo tangencial o filtración en gel.
Opcionalmente, el método comprende formular el rAAV con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden comprender vehículos, diluyentes y/u otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos o adyuvantes, etc. Opcionalmente, los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden solución salina. Opcionalmente, los excipientes farmacéuticamente aceptables comprenden seroalbúmina humana.
Preparaciones de AAV recombinante (rAAV)
Puede obtenerse una preparación de AAV recombinante (rAAV) mediante un método de la invención. La preparación de AAV recombinante se puede obtener mediante un método de la invención.
Las preparaciones de AAV recombinantes obtenibles u obtenidas por los métodos de la invención son ventajosas, ya que generalmente comprenden un nivel bajo de rcAAV y/o tienen una proporción deseada de partículas llenas a totales. Las secciones tituladas "Proporción deseada de partículas llenas a totales", "Equilibrio entre alto rendimiento y alta proporción de partículas llenas a totales" y "Nivel bajo de AAV competente para la replicación (rcAAV)" proporcionan más detalles de lo que significan las expresiones nivel bajo de rcAAV y una proporción deseada de partículas llenas a totales.
Tabla de listado de secuencias
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Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de plásmidos auxiliares y vectores de un sistema de dos plásmidos ("transdivididos') Plásmido auxiliar
Para preparar el plásmido auxiliar, los nucleótidos 200-4497 de AAV2 de tipo salvaje (número de acceso de Genbank AF043303; SEQ ID NO:1) que contenían los genes rep y cap se clonaron en el pUC19 (Yanisch-Perron et al. (1985), Gene, 33:103-119). A continuación, se delecionaron los nucleótidos 4461-4497 de AAV2 para minimizar la homología de secuencia con el vector plasmídico (cuya construcción se describe a continuación). Para evitar la expresión de Rep 78 mientras se mantiene la expresión de Rep 68, se eliminó el intrón dentro del gen rep clonado. Para proporcionar la expresión de Rep 52 después de la eliminación del intrón, los nucleótidos de AAV2 correspondientes a Rep 52, incluido el promotor p19, se clonaron inmediatamente 3' del gen Rep 68 sin intrones. A continuación, se delecionaron la mayoría de las secuencias del gen cap.
Los dos promotores p40 (uno en cada una de las duplicaciones del gen rep que codifica Rep 68 y Rep 52) se volvieron no funcionales mediante la ablación de las cajas TATA (mutación de la T correspondiente a la posición 1823 de AAV2, y AAG correspondiente a las posiciones de AAV21826-1828 a C y CTC, respectivamente).
El "módulo de rep" resultante se clonó luego en un plásmido que comprende un tramo de 8342 nucleótidos que comprende los genes VA ARN I y II, E2A y E4 funcionales de adenovirus (es decir, virus auxiliar) serotipo 5 (SEQ ID NO:4). El esqueleto del plásmido, que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación bacteriano, tenía aproximadamente 2,2 kb de longitud, dando como resultado un plásmido auxiliar de 14021 nucleótidos.
La figura 2 es un esquema del plásmido auxiliar que muestra las características principales. Para el "módulo de rep", se indican las partes de la secuencia AAV2, por referencia a las posiciones de nucleótidos de SEQ ID NO:1.
Vector plasmídico
Para preparar el vector plasmídico, los nucleótidos 200-4497 de AAV2 de tipo salvaje (número de acceso de Genbank AF043303; SEQ ID NO:1) que contenían los genes rep y cap se clonaron en el pUC19. Dos porciones de la secuencia del gen rep, entre los promotores p5 y p19 y entre los promotores p19 y p40, respectivamente, se eliminaron después para evitar la expresión de la proteína Rep mientras se mantenía el gen cap secuencia abajo bajo la regulación de los tres promotores nativos. En cuanto al plásmido auxiliar descrito anteriormente, Los nucleótidos 4461-4497 de AAV2 se delecionaron para minimizar la homología de secuencia con el plásmido auxiliar. Para minimizar o prevenir la traducción de productos no deseados de posibles codones de iniciación dentro de la región promotora restante, se eliminaron cuatro codones ATG y un codón GTG: los ATG en las posiciones correspondientes a los nucleótidos 321-323, 955-957 y 993-995 de AAV2, y un GTG correspondiente a los nucleótidos 1014-1016 de AAV2, fueron delecionados, mientras que ATG en los nucleótidos 766-768 de AAV2 se mutó a ATT.
El gen cap de AAV2 que codifica las VP 1, 2 y 3 inmediatamente 3' de la región promotora anterior se reemplazó por la secuencia correspondiente de un gen cap manipulado, y este gen cap es 3 nucleótidos (equivalente a un aminoácido codificado adicional) más largo que el gen cap de AAV2. El módulo de "promotor-cap" resultante se clonó en un esqueleto del plásmido que contenía un gen de resistencia a la kanamicina y un origen bacteriano de replicación. En este esqueleto se insertó un módulo de expresión, que contenía la secuencia transgénica unida al promotor y los elementos reguladores de la transcripción de poliA, flanqueada por la secuencia de AAV2 que comprende las ITR nativas de AAV2 (nucleótidos 1-145 y 4535-4679 de AAV2).
En el caso del vector plasmídico que comprende el módulo de expresión del factor IX de 2672 nucleótidos (ITR-a-ITR), como se usa en el ejemplo 2, el esqueleto del plásmido tenía una longitud aproximada de 2,3 kb, dando como resultado un vector plasmídico de 8525 nucleótidos. En todas las actividades posteriores, incluida la producción de los lotes de rAAV del ejemplo 3, el esqueleto del plásmido se redujo en longitud a aproximadamente 2 kb. El módulo de expresión de a-galactosidasa A (g La ) (ejemplo 3) tenía una longitud de 2297 nucleótidos.
La figura 3 es un esquema del vector plasmídico que muestra las características principales. Para el módulo de "promotor-cap", se indican las porciones de la secuencia AAV2, por referencia a las posiciones de nucleótidos de SEQ ID NO:1.
Ejemplo 2: Sistema de dos plásmidos: comparación de proporciones de plásmido auxiliar:vector
Cultivo de células
Las células HEK293T se mantuvieron en cultivo adherente en condiciones convencionales a 37 °C, 95 % de humedad relativa y 5 % v/v de CO2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % y GlutaMax™ (dipéptido de L-alanina-L-glutamina) al 1 %. La confluencia celular durante la transferencia varió entre el 40 y el 95 %.
Transfección de células HEK293T y preparación de lisados celulares
Las células HEK293T se transfectaron con un plásmido auxiliar y un vector plasmídico (este último comprende el gen cap manipulado y el módulo de expresión del factor IX; ejemplo 1) usando diferentes proporciones molares de plásmido (de auxiliar:vector 3:1 a 1:6) mientras se mantiene la cantidad total de ADN plasmídico. Se sembraron 1,5 x 105 células viables por cm2 área de cultivo en placas de 6 cm en un volumen de 3 ml de DMEM, FBS al 10 %, GlutaMax™ al 1 % el día anterior a la transfección, lo que da como resultado una confluencia del 60-70 % el día de la transfección. Los complejos de PEI-ADN se prepararon en DMEM sin complementos utilizando el reactivo de transfección de polietilenimina lineal PEIpro™ (Polyplus) según el manual del fabricante. Se mantuvo una cantidad de 6 |jg de ADN plasmídico total y una proporción de PEI a ADN de 2:1 independientemente de las proporciones de combinación de plásmidos aplicadas. Las células se cultivaron hasta el día 3 después de la transfección, se recolectaron del medio y se lisaron mediante tres ciclos de congelación-descongelación (-80 °C y 37 °C). Los residuos celulares se retiraron por centrifugación a 10000 x g durante 5 minutos.
Cuantificación de los genomas de vectores rAAV
El ensayo del genoma del vector AAV se basa en una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) específica para la secuencia de promotor del módulo de expresión de rAAV. En principio, los cebadores de qPCR se pueden diseñar para unirse a cualquier parte del genoma de AAV recombinante que no sea común a los genomas de AAV de tipo salvaje, pero se recomienda no usar secuencias de plantilla de cebadores muy cercanas a las ITR, ya que hacerlo puede conducir a una medición exagerada del título del genoma del vector.
Las muestras de ensayo de lisado celular se sometieron a un procedimiento de tratamiento con nucleasas para eliminar los genomas del vector no encapsidados antes de realizar la qPCR. Para ello, las muestras se prediluyeron 1:250 en agua sin nucleasas que contenía Pluronic F-68 al 0,125 %. Se utilizaron 25 j l de la predilución para la digestión con 2 unidades de Turbo DNase (ThermoFisher Scientific, Waltham, EE. UU.) y 1x tampón de reacción de Turbo DNasa, dando como resultado un volumen de reacción total de 29 jl. La incubación se realizó durante 1 h a 37 °C. Después, se añadió 1 volumen de NaOH 0,4 M y las muestras se incubaron durante 45 min a 65 °C. Se añadieron 1035 j l de agua sin nucleasas complementada con Pluronic F-68 al 0,1 % junto con 30 j l de HCl 0,4 M. Para controlar la calidad del digerido de Turbo DNase, se midieron en paralelo un control de tendencia que contenía lisado celular no purificado con un título conocido de genoma de vector AAV y controles añadidos que usaban ADN plasmídico que portaba la secuencia de promotor.
En cada muestra, se mezclaron 12,5 j l de QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Venlo, Países Bajos) con 0,75 j l de solución madre final de cebador de qPCR (que contenía 10 jM de cada cebador) y se llevaron hasta un volumen de 20 j l con agua sin nucleasas. Se añadieron a la mezcla 5 j l de lisado celular tratado con Turbo DNasa o muestra de ensayo de virus purificado (volumen total de reacción 25 jl, concentración de cebador final en la reacción 300 nM cada uno) y se realizó una qPCR en un ciclador de PCR en tiempo real CFX 96 Touch (Bio -Rad Laboratories Inc., Hércules, EE. UU.) con las siguientes etapas del programa: 95 °C 5 min; 39 ciclos (95 °C 10 s, 60 °C 30 s, lectura de placa); 95 °C 10 s; 60-95 °C (+0,5 °C/etapa), 10 s; lectura de placa. Para controlar la calidad de la qPCR, se midió en paralelo un control de tendencia con un título conocido del genoma del vector AAV. Para comprobar si hay contaminaciones, también se incluyó un control sin plantilla (NTC, 5 j l de H2O). La fila del patrón, las muestras de ensayo y los controles se midieron por triplicado para cada dilución. Las muestras de ensayo de virus purificadas y el control de tendencia se midieron generalmente a 3 diluciones diferentes en tampón EB (Tris-Cl 10 mM, pH 8,5). Las muestras de ensayo de lisado celular tratado con Turbo DNasa se usaron directamente en la qPCR sin ninguna dilución adicional. Los datos se analizaron utilizando el software CFX ManagerTM 3.1 (Bio-Rad Laboratories Inc.).
El análisis de la curva de fusión confirmó la presencia de un solo amplicón. La amplificación da como resultado amplicones de ADN bicatenario nacientes detectados con el intercalador fluorescente SYBR Green para controlar la reacción de PCR en tiempo real. Cantidades conocidas del material genético del promotor, en forma de plásmido linealizado, se diluyeron en serie para crear una curva patrón, y el título del genoma del vector de muestra se interpoló a partir de la curva patrón.
Cuantificación de partículas de rAAV (cápsides)
El método ELISA de titulación de AAV2 es una medida del total de partículas de AAV (cápsides) y se basa en un kit disponible en el mercado (Progen™, Heidelberg, Alemania; número de catálogo PRATv ). Esta técnica inmunométrica de tipo sándwich utiliza el anticuerpo monoclonal A20 (Wobus et al. (2000), J. Virol., 74:9281-9293) tanto para la captura como para la detección. El anticuerpo es específico para un epítopo conformacional presente en las cápsides ensambladas de los serotipos AAV2, AAV3 y la cápside manipulada utilizada en estos experimentos.
El kit ELISA de titulación de AAV2 se utilizó para cuantificar las partículas de AAV totales en lisados celulares y preparaciones de virus purificados según las instrucciones del fabricante. En resumen, se añadieron 100 j l de control de kit AAV2 diluido, muestras de ensayo o control de tendencias de la cápside manipulada con un título conocido de partículas totales por pocillo de una placa de microtitulación recubierta con anticuerpo monoclonal A20 y se incubaron durante 1 h a 37 °C. La fila del patrón, las muestras de ensayo y los controles se midieron por duplicado para cada dilución. En una segunda etapa, se añadieron 100 j l de anticuerpo monoclonal A20 conjugado con biotina prediluido (1:20 en tampón de ensayo [ASSB]) y se incubó durante 1 hora a 37 °C. Después, se añadieron 100 j l de un conjugado de estreptavidina peroxidasa prediluido (1:20 en ASSB) y se incubó durante 1 hora a 37 °C. Se añadieron 100 j l de solución de sustrato (TMB [tetrametilbencidina]) y, después de incubar durante 15 min, la reacción se detuvo usando 100 j l de solución de parada. La absorbancia se midió fotoquímicamente a 450 nm utilizando el lector de microplacas SpectraMax M3 (Molecular Devices, San José, EE.UU.). Los datos se analizaron con el software SoftMax Pro 7.0 (Molecular Devices).
Las muestras de ensayo se diluyeron en el Intervalo de ensayo y las concentraciones de partículas totales de AAV se determinaron por interpolación usando la curva patrón que se preparó usando el control del kit AAV2 provisto. Se usó ASSB como blanco.
Proporción de genoma de vector a partículas totales
La proporción entre los genomas de vector y el total de partículas de AAV se expresa como un porcentaje. Esto se basa en el título del genoma del vector (determinado por qPCR, como se describió anteriormente) y el número total de partículas de AAV (determinado por ELISA de cápside, como se describió anteriormente).
Resultados
Como se desprende de la figura 5A y B, el aumento de la proporción de vector plasmídico condujo a mayores rendimientos tanto de partículas como de genoma del vector. Sin embargo, el aumento relativo en los rendimientos de partículas (cápside) fue más pronunciado y la meseta en los rendimientos del genoma del vector se alcanzó antes. Estas observaciones fueron responsables de una disminución gradual en la proporción entre el genoma del vector y las partículas totales (figura 5C). Una proporción de plásmido auxiliar:vector 1:3 dio como resultado un aumento casi máximo en el título del genoma del vector de aproximadamente 3,5 veces en comparación con la proporción de 1,8:1 aplicada anteriormente, mientras que el título de partículas aumentó aproximadamente 8 veces. Con fines comparativos, dos plásmidos en una configuración convencional "no dividida" (es decir, en la que un plásmido contenía las mismas secuencias del genoma auxiliar y del vector de AdV (módulo de expresión del factor IX), y el otro plásmido contenía la misma secuencia del gen cap, además de un módulo rep de AAV2 que contenía los cuatro genes rep (de modo que las funciones Rep y Cap no se dividen entre los dos plásmidos) se transfectaron en una proporción de plásmido molar establecida de 1,6:1, revelando rendimientos del genoma del vector y de partículas considerablemente más bajos.
La secuenciación confirmatoria posterior del plásmido auxiliar reveló una mutación en el codón dentro de la secuencia que codifica Rep 68 correspondiente a las posiciones 429-431 de AAV2 (SEQ ID NO:1), lo que produjo una sustitución de leucina por fenilalanina en la posición del aminoácido 37 del proteína Rep 68. La corrección de la secuencia del plásmido auxiliar para restaurar el codón AAV2 de tipo salvaje que codifica leucina dio como resultado un mayor rendimiento de vg/ml y un aumento de aproximadamente el doble en la proporción entre los genomas del vector y las partículas totales (es decir, % de partículas llenas), cuando se compara directamente con el plásmido auxiliar "mutado". La secuencia corregida del plásmido auxiliar se usó en todos los trabajos posteriores, incluyendo la producción de los lotes de rAAV analizados en el ejemplo 3.
Ejemplo 3: Determinación de la frecuencia de AAV competente para la replicación (rcAAV) en rAAV producido por un sistema de dos plásmidos transdivididos
Pruebas de rcAAV
Se sometió la sustancia farmacológica a granel de rAAV purificada, fabricada a gran escala utilizando el biorreactor iCellis® con células transfectadas con el sistema de dos plásmidos y purificadas mediante una serie de procesos posteriores para eliminar las impurezas del producto, a una prueba del límite para la presencia de rcAAV. Los lotes de rAAV se produjeron usando un vector plasmídico que comprende el gen cap manipulado y (i) un módulo de expresión de a-galactosidasa A (como se menciona en el ejemplo 1) o (ii) un módulo de expresión del factor IX idéntico al mencionado en el ejemplo 1, excepto por una secuencia codificante del factor IX diferente con codones optimizados parcialmente. El sistema de dos plásmidos utilizado para producir estos lotes de rAAV utilizó el esqueleto de plásmido de vector acortado y la secuencia de plásmido auxiliar corregida como se menciona en los ejemplos 1 y 2, respectivamente. En la prueba del límite, las células HEK293 son transducidas por el rAAV en su forma más concentrada (después de la purificación y de la preformulación del fármaco) en presencia o ausencia de adenovirus de tipo salvaje. Se llevan a cabo tres rondas sucesivas de amplificación del virus como se describe a continuación.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un plásmido auxiliar que comprende al menos un gen rep de virus adenoasociado (AAV) que codifica al menos una proteína Rep de AAV funcional y al menos un gen de virus auxiliar, y que no comprende un gen cap que codifica un conjunto funcional de proteínas Cap.
2. Un sistema de dos plásmidos que comprende el plásmido auxiliar de la reivindicación 1 y un vector plasmídico.
3. El sistema de dos plásmidos de la reivindicación 2, en el que:
(i) el vector plasmídico comprende:
(a) un gen cap de AAV que codifica al menos una proteína Cap de AAV funcional; o
(b) al menos un promotor del gen cap de AAV, un sitio de clonación unido operativamente al promotor del gen cap de AAV y un módulo de expresión flanqueado en al menos un lado por una repetición terminal invertida ("inverted terminal repeat", ITR);
en el que el vector plasmídico no comprende un gen rep que codifica una proteína Rep funcional y el módulo de expresión comprende un transgén unido operativamente al menos a un elemento de control regulador; y/o (ii) la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico está entre 1:1 y 1:4.
4. El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 52 funcional, al menos un gen que codifica una proteína Rep 40 funcional y un gen que codifica una proteína Rep 68 funcional.
5. El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
(i) dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 52 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 52 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 1000 nucleótidos de longitud de los nucleótidos 993-2186 de SEQ ID NO:1, o con un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV; y/o
(ii)
(a) dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 40 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 40 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 800 nucleótidos de longitud de un tramo de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 993-2252 menos los nucleótidos 1907­ 2227 de SEQ ID NO:1, o con tramos de nucleótidos correspondientes en un serotipo diferente de AAV; y/o (b) dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 40 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 40 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 1100 nucleótidos de longitud de los nucleótidos 993-2252 de SEQ ID NO:1, o con un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV; y/o
(iii) dicho al menos un gen rep de AAV comprende un gen que codifica una proteína Rep 68 funcional, y el gen que codifica una proteína Rep 68 funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 1500 nucleótidos de longitud de un tramo de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 321-2252 menos los nucleótidos 1907-2227 de SEQ ID NO:1, o con tramos de nucleótidos correspondientes en un serotipo diferente de AAV.
6. El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
(i) el plásmido auxiliar no comprende un gen que codifica una proteína Rep 78 funcional; y/o
(ii) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 1800 nucleótidos correspondientes a un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendido dentro de los nucleótidos 321-2186 de SEQ ID NO:1 o dentro de un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV; y/o (iii) dicho al menos un gen rep de AAV no comprende un promotor p40 interno funcional; y/o
(iv) el plásmido auxiliar no comprende un tramo contiguo de la secuencia del gen cap exclusivamente de más de 60 nucleótidos.
7. El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
(i) el plásmido auxiliar comprende al menos un gen de virus auxiliar y dicho al menos un gen de virus auxiliar comprende un ácido nucleico asociado a virus ("viral associated", VA), un gen E2A y un gen E4; y/o
(ii) el plásmido auxiliar comprende al menos un gen de virus auxiliar y dicho al menos un gen de virus auxiliar comprende un ácido nucleico VA, un gen E2A y un gen E4, y el gen E4 no está ubicado entre el ácido nucleico VA y el gen E2A; y/o
(iii) el plásmido auxiliar comprende al menos un gen de virus auxiliar y el plásmido auxiliar tiene una longitud de entre 12000 pb y 15000 pb; y/o
(iv) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 3000 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 194-3620 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus; y/o
(v) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 60 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 4032-4100 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus; y/o
(vi) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 350 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 4051-4413 de SEQ ID NO:1, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV.
8. El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
(i) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 600 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 2301-2947 de SEQ ID NO:1, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de AAV; y/o
(ii) el plásmido auxiliar comprende al menos un gen de virus auxiliar y dicho al menos un gen de virus auxiliar comprende un ácido nucleico VA, un gen E2A y un gen E4, y el ácido nucleico VA, el gen E2A y el gen E4 están comprendidos dentro de una porción contigua de menos de 10000 nucleótidos; y/o
(iii) el plásmido auxiliar no comprende una secuencia contigua de al menos 22000 nucleótidos de un tramo de nucleótidos contiguo de longitud equivalente comprendida dentro de los nucleótidos 10619-32756 de SEQ ID NO:2, o un tramo de nucleótidos correspondiente en un serotipo diferente de adenovirus; y/o
(iv) el plásmido auxiliar y/o el vector plasmídico no comprende un sitio de unión a Rep artificial.
9. El sistema de dos plásmidos o plásmido auxiliar de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el plásmido auxiliar comprende al menos un gen del virus auxiliar y dicho al menos un gen del virus auxiliar está comprendido en un tramo contiguo del plásmido que tiene al menos un 98 % de identidad con la longitud completa o con un fragmento de al menos 8000 nucleótidos de longitud de SEQ ID NO:4.
10. El sistema de dos plásmidos de una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en el que:
(i) el vector plasmídico comprende al menos un promotor del gen cap de AAV, que comprende un promotor p40 de AAV, un promotor p5 y un promotor p19; y/o
(ii) el vector plasmídico no comprende codones de iniciación de la traducción prescindibles; y/o
(iii) el vector plasmídico comprende una región promotora que comprende uno o más promotores, y en la región promotora:
(a) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 321-323 de SEQ ID NO:1 están ausentes;
(b) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 766-768 de SEQ ID NO:1 no son ATG;
(c) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 955-957 de SEQ ID NO:1 están ausentes;
(d) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 993-995 de SEQ ID NO:1 están ausentes; y
(e) los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 1014-1016 de SEQ ID NO:1 están ausentes; y/o (iv) el vector plasmídico comprende un esqueleto de menos de 3000 nucleótidos de longitud.
11. El sistema de dos plásmidos de la reivindicación 10(iii)(b), en el que los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos 766-768 de SEQ ID NO:1 son ATT.
12. Un método para producir una preparación de AAV recombinante que comprende:
(a) obtener el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-11;
(b) transfectar una célula huésped con el sistema de dos plásmidos, el plásmido auxiliar o el vector plasmídico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-11; y
(c) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la producción de AAV recombinante.
13. El método de la reivindicación 12:
(i) que comprende además una etapa de recolección del AAV recombinante para proporcionar una preparación de AAV recombinante; y/o
(ii) en el que la preparación de AAV recombinante comprende un nivel bajo de AAV competente para la replicación (rcAAV); y/o
(iii) en el que el nivel de rcAAV medido es menor que 1 rcAAV en 107 AAV recombinantes, menor que 1 rcAAV en 109 AAV recombinantes, o menor que 1 rcAAV en 1010 AAV recombinantes; y/o
(iv) en el que la preparación de AAV recombinante comprende un nivel bajo de rcAAV y el nivel de rcAAV es menor que el nivel de rcAAV producido utilizando un método equivalente, excepto que el vector plasmídico comprende al menos un gen rep de AAV y al menos un gen cap de AAV; y/o
(v) comprende una etapa de seleccionar una proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico en el que la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico se selecciona o ajusta a una proporción que permite al usuario obtener la proporción deseada de partículas llenas a totales o el rendimiento alto o deseado del vector AAV recombinante; y/o
(vi) en el que la proporción de plásmido auxiliar a vector plasmídico se selecciona o ajusta a una proporción que logra un rendimiento máximo de AAV recombinante con el rendimiento mínimo de partículas vacías alcanzable con dicho rendimiento máximo de AAV recombinante; y/o
(vii) en el que la proporción deseada de partículas llenas a totales es una proporción de partículas llenas a totales que es al menos el 20 % o al menos el 30 % de la proporción de partículas llenas a totales lograda utilizando un método equivalente con una proporción de plásmido auxiliar al vector plasmídico de 1,8:1; y/o
(viii) que comprende además una etapa de purificación del AAV recombinante.
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