ES2927417T3 - Hidrogel antimicrobiano anfifílico - Google Patents

Abstract

Un hidrogel antimicrobiano sólido que comprende un primer componente anfifílico. El primer componente anfifílico, en su estado reticulado químicamente, es un cristal líquido liotrópico y tiene una nanoestructura ordenada de dominios hidrofóbicos e hidrofílicos, comprendiendo además la composición un agente antimicrobiano unido covalentemente a al menos uno de los dominios hidrofílicos o hidrofóbicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Hidrogel antimicrobiano anfifílico

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a hidrogeles antimicrobianos. Específicamente, se refiere a un hidrogel antimicrobiano que comprende un primer componente anfifílico y un agente antimicrobiano unido covalentemente al mismo.

Antecedentes de la invención

La infección de la herida, que afecta la piel o los tejidos cercanos a la herida, interfiere con el proceso de curación y puede provocar enfermedades sistémicas. Hoy en día, la terapia con antibióticos es el tratamiento más frecuente para tratar la infección de heridas. Durante muchos años, se ha demostrado que tales rutinas de terapia con antibióticos no solo provocan efectos secundarios sistémicos a los pacientes, sino que también han resultado en un rápido aumento de infecciones graves provocadas por bacterias resistentes a los antibióticos.

Hoy en día hay disponibles varios apósitos para heridas que están destinados a reducir o eliminar las infecciones. Sin embargo, el problema cada vez mayor de la resistencia a los antibióticos ha impulsado la necesidad de nuevos y avanzados apósitos para heridas. Muchos apósitos para heridas comercialmente disponibles tales como Mepilex o Mepilex-Ag (comercializados por Molnlycke Health Care) incorporan capas de apósito superabsorbentes suaves que comprenden plata como agente antimicrobiano. La plata se libera en la herida y mata los microbios al dañar la pared celular o inhibir la reproducción del microbio. Numerosos apósitos para heridas incorporan moléculas antimicrobianas como la clorhexidina o fármacos antibióticos convencionales como la penicilina, que se utilizan para prevenir la adhesión bacteriana o la infección en el lugar de la herida. Sin embargo, los compuestos anteriores tienen un uso limitado debido a su limitado espectro de actividad, citotoxicidad para las células humanas y la posibilidad de desarrollar resistencia antimicrobiana en un período corto.

Gran parte del trabajo reciente se ha centrado en la inmovilización covalente de compuestos antimicrobianos como la sulfadiazina de plata, los derivados fenólicos antibióticos, la clorhexidina y los polímeros de amonio cuaternario en sustratos para su uso en apósitos para heridas (F. Costa et. al., Acta Biomaterialia 7 (2011) 1431-1440). La inmovilización covalente de esos compuestos evita que las moléculas se filtren al entorno biológico y también evita que se desarrollen infecciones en el lugar de la lesión o herida. Los compuestos activos se unen al resto del apósito para heridas que puede estar en forma de fibras, hidrogeles o plásticos flexibles disponibles en el comercio. Aunque la unión covalente limita la cantidad de sustancias antimicrobianas en el apósito, aún presenta un riesgo de citotoxicidad de las células epiteliales humanas presentes en y alrededor del lugar de la herida.

Por lo tanto, los polímeros antimicrobianos catiónicos como los péptidos antimicrobianos (AMP) como fármacos alternativos reciben una mayor atención, en especial en el tratamiento de heridas cutáneas.

Sin embargo, surgen problemas cuando los AMP se utilizan como agentes terapéuticos en apósitos para heridas, que tradicionalmente se han centrado en la liberación o lixiviación de AMP adsorbidos físicamente para llevar a cabo la función deseada. Existen dos inconvenientes principales en el enfoque antes mencionado. Los AMP son generalmente moléculas peptídicas donde el enlace amida es el enlace predominante entre diferentes aminoácidos. Los enlaces amida son susceptibles a la degradación a partir de las enzimas en el entorno biológico, lo que exige la necesidad de aumentar la cantidad de AMP, a menudo en el nivel de micro a miligramos para funcionar, lo que a su vez aumenta el coste del dispositivo. Esto limita el uso de AMP como agentes terapéuticos funcionales en dispositivos médicos.

El documento US 2007/0254006 A1 divulga un sustrato que puede ser un hidrogel de dextrano al que se pueden unir los AMP. El hidrogel de dextrano del documento US 2007/0254006 A1 tiene una estructura hidrófila y reticulada al azar. Los AMP unidos a dicha estructura pueden ser propensos a la degradación. Además, los AMP solo se pueden proporcionar unidos a las ataduras y no absorbidos en el hidrogel de dextrano.

Por lo tanto, se desean materiales mejorados que tengan propiedades antimicrobianas.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención busca preferiblemente mitigar, aliviar o eliminar una o más de las deficiencias identificadas en la técnica anterior, individualmente o en cualquier combinación, y resuelve al menos los problemas mencionados anteriormente al proporcionar un hidrogel antimicrobiano que comprende un primer componente anfifílico reticulable, dicho primer componente anfifílico tiene, en su estado químicamente reticulado, una nanoestructura ordenada de dominios hidrofóbicos e hidrofílicos, la composición comprende además un agente antimicrobiano unido covalentemente a al menos uno de los dominios hidrofílicos o hidrofóbicos.

También se proporciona un dispositivo que comprende un hidrogel antimicrobiano.

Se proporciona además un método para producir un hidrogel antimicrobiano.

También se proporciona un hidrogel antimicrobiano o un dispositivo que comprende un hidrogel antimicrobiano para su uso en la prevención y/o el tratamiento de quemaduras, cicatrices o infecciones.

Otras realizaciones favorables se divulgan en las reivindicaciones de patente adjuntas y dependientes.

Breve descripción de los dibujos

Estos y otros aspectos, características y ventajas de los que es capaz la invención serán evidentes y se aclararán a partir de la siguiente descripción de realizaciones de la presente invención, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en donde

La Figura 1 es un esquema de síntesis del copolímero tribloque Pluronic modificado con diacrilato, donde X e Y se refieren al número de grupos PEO y PPO.

La Figura 2 muestra el esquema de reacción de la unión covalente de péptidos antimicrobianos al copolímero F-127 tribloque Pluronic modificado con diacrilato mediante activación de EDC/NHS.

La Figura 3 muestra imágenes de microscopía fluorescente de 5(6) carboxifluoresceína marcado con RRPRPRPRPWWWW-NH². La Figura 3a (fila superior) muestra el péptido marcado inmovilizado covalentemente en hidrogeles cúbicos micelares normales DA-F127 preparados según la sección experimental y la Figura 3b (fila inferior) muestra el péptido marcado absorbido físicamente en hidrogeles cúbicos micelares normales DA-F127, es decir, no inmovilizado covalentemente. Todas las muestras tratadas en etanol al 50 % durante un máximo de 3 semanas.

La Figura 4 muestra imágenes en estado vivo/muerto de biopelículas de S. epidermidis formadas sobre: a) hidrogeles anfifílicos preparados según la sección experimental, pero sin AMP; b) hidrogeles anfifílicos con AMP absorbidos físicamente, es decir, AMP no unidos covalentemente; y c) hidrogeles antimicrobianos anfifílicos según un aspecto donde los AMP se han inmovilizado covalentemente en el hidrogel anfifílico. Las bacterias se tiñen con SYTO 9 y yoduro de propidio. Las bacterias vivas aparecen verdes y las bacterias muertas aparecen rojas.

La Figura 5 muestra una prueba de inhibición de zona del hidrogel antimicrobiano frente a las muestras de control. La Figura 5a muestra un hidrogel anfifílico de control negativo sin AMP; la Figura 5b muestra un hidrogel anfifílico con solo AMP absorbidos físicamente; la Figura 5c muestra un hidrogel antimicrobiano anfifílico según un aspecto donde los AMP se unen covalentemente al hidrogel anfifílico.

La Figura 6 muestra un esquema de AMP unidos covalentemente a un hidrogel anfifílico reticulado químicamente con una nanoestructura ordenada hexagonal normal, repetitiva, impresa en 3D y alineada.

La Figura 7 muestra imágenes en estado vivo/muerto de varias biopelículas formadas en un hidrogel anfifílico de control (imagen más a la izquierda) y un hidrogel anfifílico antimicrobiano según un aspecto (imagen más a la derecha). La Figura 7a muestra S. epidermis. La Figura 7b muestra imágenes de P. aeruginosa. La Figura 7c muestra S. aureus.

La Figura 8 muestra un análisis cuantitativo de la proporción de células bacterianas muertas en la superficie de los hidrogeles de la Figura 7. La proporción de células muertas se calculó mediante el uso de una macro de análisis de imágenes según la fórmula: (células muertas (células muertas células vivas)) para representar las diferencias en el crecimiento de la biopelícula. La Figura 8c incluye una proporción de células muertas en un hidrogel donde los AMP se absorbieron físicamente y no se unieron covalentemente. El asterisco (*) indica una diferencia significativa en comparación con la muestra de control a un nivel de confianza del 95 %.

La Figura 9 muestra imágenes fluorescentes en estado vivo/muerto de colonias bacterianas/biopelículas formadas en la superficie de un hidrogel anfifílico antimicrobiano según un aspecto. Las células muertas muestran diferentes morfologías en cada una de las tres imágenes.

La Figura 10 muestra los espectros FTIR entre el número de onda 1500 y 1900 cm^-1 de las cinco muestras diferentes: a) no modificadas, b) modificadas, c) reticuladas, d) reticuladas y lavadas y e) EDC y NHS activado. Los números de onda (cm^-1) se encuentran a lo largo del eje x y la transmitancia (% de T) se encuentra en el eje y. Se encuentra una señal clara en todas las muestras, excepto en la muestra no modificada. «No modificado» indica una muestra que contiene el copolímero de bloque; sin embargo, que no puede reticularse debido a la falta de grupos funcionales de acrilato.

La Figura 11 muestra los resultados de una prueba de estabilidad al almacenamiento en solución salina tamponada con fosfato (PBS). En la Figura 11a se puede ver la proporción de células muertas (S. aureus) para un hidrogel anfifílico de control y un hidrogel anfifílico antimicrobiano.

La Figura 11b muestra la cobertura total de la superficie encontrada en los hidrogeles. El asterisco (*) indica una diferencia significativa en comparación con la muestra de control a un nivel de confianza del 95 %.

La Figura 12 muestra los resultados de una prueba de estabilidad del suero donde los hidrogeles se expusieron al 20 % de suero humano. Los hidrogeles se extrajeron del suero en los tiempos indicados en el eje x. La proporción de células muertas (S. aureus) en la superficie de los hidrogeles se determinó mediante tinción live/dead y se encuentra en el eje y. En cada punto temporal, excepto a los 5 días, hubo una diferencia significativa con un nivel de confianza del 95 % entre las superficies activadas en comparación con el control. Cada barra está compilada con imágenes tomadas de dos muestras.

La Figura 13 muestra la proporción de células muertas calculada a partir de la tinción live/dead de la superficie del hidrogel activada por las diferentes gotas que contienen AMP. Todas las muestras activadas con AMP mostraron una diferencia significativa con un 95 % de confianza en comparación con el control.

La Figura 14 muestra los resultados de la activación superficial de hidrogeles al rociar la solución de AMP sobre la superficie del hidrogel. Las superficies se estudiaron mediante tinción live/dead de biopelículas en la superficie de los hidrogeles. La proporción de células vivas/muertas se calculó según la macro de análisis de imágenes antes mencionada. Todas las muestras activadas con AMP mostraron una diferencia significativa en comparación con la muestra de control con un nivel de confianza del 95 %.

La Figura 15 muestra la viabilidad celular obtenida mediante dos ensayos de MTT realizados en fibroblastos con medios expuestos a muestras de control y de prueba. La línea discontinua indica una viabilidad celular del 75 %. Las muestras que son más altas que eso, se consideran no tóxicas. Los hidrogeles analizados fueron el control y los AMP unidos covalentemente. El control y el hidrogel anfifílico antimicrobiano mostraron una viabilidad celular significativamente mayor que el límite del 75 %.

Descripción detallada

La siguiente descripción de la presente invención describe un hidrogel antimicrobiano mejorado. El hidrogel antimicrobiano comprende un primer componente anfifílico reticulable. En su estado reticulado, el componente anfifílico resulta en un hidrogel que comprende una estructura ordenada de dominios hidrofílicos e hidrofóbicos. El hidrogel antimicrobiano comprende además un agente antimicrobiano unido covalentemente a los dominios hidrofílicos y/o hidrofóbicos repetidos del hidrogel reticulado.

La nanoestructura ordenada repetida comprende dominios hidrofóbicos/hidrofílicos repetidos y alternos. La morfología y la estructura específica de los dominios hidrofóbicos/hidrofílicos se analizan a continuación. El hidrogel comprende una nanoestructura ordenada y repetida en todo el hidrogel, es decir, no solo en la superficie del hidrogel. El hidrogel reticulado es sólido. La reticulación intermolecular bloquea irreversiblemente la estructura ordenada y resulta en un hidrogel que tiene una alta integridad y es mecánicamente resistente.

El hidrogel antimicrobiano es especialmente adecuado para aplicaciones de cuidado de heridas debido a la nanoestructura ordenada y repetida que conduce a una provisión ordenada y repetida de agentes antimicrobianos en la piel o la superficie de la herida. Además, los agentes antimicrobianos se inmovilizan mejor, lo que conduce a un mejor rendimiento a largo plazo.

Se puede considerar que el hidrogel forma un sustrato sobre el que se pueden inmovilizar los agentes antimicrobianos. El hidrogel es, en su estado reticulado, autoportante y tridimensional. Por lo general, el hidrogel es sustancialmente no degradable en condiciones fisiológicas. Es decir, el hidrogel es no biodegradable, no se degrada sustancialmente por las condiciones químicas o enzimáticas que se encuentran en las condiciones in vitro e in vivo pertinentes. Por ejemplo, el hidrogel no se degrada en presencia de sangre, sudor, orina u otros fluidos biológicos. Además, el hidrogel es sustancialmente no degradable, es decir, es estable y permanece sólido, en entornos de pH relativamente bajo o alto.

El hidrogel puede formar una primera capa sustancialmente uniforme a la que se unen covalentemente los agentes antimicrobianos. Los agentes antimicrobianos se pueden unir covalentemente a al menos los dominios hidrofílicos repetidos del hidrogel en toda la capa. Pueden proporcionarse dentro de la capa, y no solo en la superficie del hidrogel. Se trata de una mejora significativa en comparación con las técnicas de modificación de la superficie de un hidrogel u otro sustrato que solo conducen a la inmovilización superficial de los agentes antimicrobianos.

La estructura repetida y ordenada de los dominios hidrofílicos e hidrofóbicos se ordena al menos en la nanoescala y, como se explicará más adelante, se puede ordenar en una escala mayor, micro o macro, dependiendo de las técnicas de producción. Los términos ordenados y repetidos se refieren al hidrogel que tiene una periodicidad definida. A diferencia de los hidrogeles basados en hidratos de carbono, polisacáridos u otras moléculas no anfifílicas, la nanoestructura del hidrogel, tal como se describe en la presente, tiene una nanoestructura ordenada y repetida y no se reticula aleatoriamente. El hidrogel es anfifílico. Después de la reticulación, el hidrogel anfifílico es un hidrogel anfifílico reticulado químicamente.

La nanoestructura ordenada y repetida resulta en agentes antimicrobianos unidos covalentemente al hidrogel que tiene una orientación definida. Si los propios agentes antimicrobianos son anfifílicos, entonces el agente antimicrobiano se inmoviliza además de forma más eficaz sobre la superficie y dentro del hidrogel. La anfifilicidad del hidrogel también permite la absorción de soluciones tanto acuosas como no acuosas.

Como se indicó con anterioridad, a diferencia de un hidrogel que tiene un tratamiento de superficie para definir una química de superficie, el hidrogel de la presente divulgación tiene una nanoestructura repetida y ordenada tanto en la superficie como dentro del granel del hidrogel. Esto conduce a una mejor inmovilización de los agentes antimicrobianos tanto en la superficie como dentro del hidrogel.

El hidrogel antimicrobiano puede formarse mediante la reticulación química de materiales anfifílicos orgánicos tales como copolímeros reticulables, tensioactivos reticulables, proteínas reticulables, péptidos reticulables y lípidos reticulables. «Reticulable», como se usa en la presente, se refiere al enlace covalente de moléculas entre sí usando grupos químicos reactivos presentes en las moléculas. El proceso de reticulación química se puede catalizar utilizando luz, como la luz ultravioleta, el calor u otros catalizadores químicos, como las enzimas. La reticulación covalente del hidrogel es no reversible. La reticulación covalente no se degradará ni se desintegrará a temperaturas elevadas. La reticulación covalente también es estable frente a variaciones de pH.

El primer componente anfifílico del hidrogel puede ser un polímero anfifílico reticulable. Un material anfifílico típico y adecuado es un poloxámero modificado con diacrilato, como óxido de polietileno-óxido de polipropileno-óxido de polietileno (DA-PEO^x-PPO^y-PEO^x-DA, donde x e y se refieren al número de grupos ^p E^o y PPO presentes respectivamente) como se describe en la sección experimental a continuación. Específicamente, el material anfifílico puede ser los copolímeros de tres bloques anfifílicos, óxido de polietileno(100)- óxido de polipropileno(70)-óxido de polietileno( 100) (Pluronic F127 - BASF Corporation), óxido de polietileno(30)-óxido de polipropileno(70)-óxido de polietileno(30) (Pluronic® P123 - BASF Corporation).

Como se indicó con anterioridad, el componente anfifílico puede ser un derivado de diacrilato de un copolímero de tres bloques, lo que permite que el copolímero se reticule químicamente. En la siguiente sección experimental se proporciona un proceso para la modificación del diacrilato. La modificación se puede realizar mediante la reacción de un copolímero anfifílico de tres bloques con cloruro de acriloílo para formar un derivado de diacrilato. Pueden ser posibles otros métodos para formar polímeros anfifílicos reticulables, como la formación de derivados de metacrilato o mediante puentes carboxílicos-amínicos.

El polímero anfifílico reticulable puede, en presencia de agua, autoensamblarse para formar nanoestructuras ordenadas denominadas cristales líquidos liotrópicos (LLC). En su forma reticulada, es decir, después de la reticulación, el hidrogel puede considerarse un cristal líquido liotrópico (LLC) químicamente reticulado. Puede considerarse que la reticulación del polímero anfifílico forma un cristal líquido liotrópico polimerizado (PLLC) que tiene una estructura bien definida.

Un hidrogel reticulado no sólido puede tener una estructura de agregados micelares esféricos en un rango de tamaño de 2-100 nm dispuestos aleatoriamente en todo el hidrogel denominado sistema micelar normal, indicado en forma abreviada como L¹. Un hidrogel micelar normal de este tipo puede comprender de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 19 % (% en peso) de polímero anfifílico, y de aproximadamente el 99 % a aproximadamente el 81 % (% en peso) de agua. Por lo general, este sistema no forma un gel sólido reticulado; sin embargo, en ciertos casos, como entre el rango de 15-19 % (% en peso) de concentración de polímero anfifílico, el sistema puede existir como un sólido reticulado con características mecánicas muy blandas y flexibles.

El hidrogel puede tener una estructura de agregados micelares esféricos en el rango de tamaño de 2-100 nm dispuestos en un cristal líquido liotrópico, de forma cúbica, disposición ordenada conocida como sistema cúbico micelar normal, indicado en forma abreviada como I¹, con una disposición primordial (P...) o centrada en el cuerpo (B...) o una disposición centrada en la cara (F...) de las estructuras micelares en una red cúbica. Un ejemplo de una estructura cúbica micelar normal con una simetría de cristal Im3m puede comprender de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 65 % (% en peso) de polímero anfifílico y de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 35 % (% en peso) de agua. Otra composición de ejemplo para obtener un sistema cúbico micelar normal con disposición primordial de estructuras micelares en una red cúbica es del 65 % (% en peso) de agua, 10 % (% en peso) de butanol y 25 % (% en peso) de polímero anfifílico.

El hidrogel puede tener una estructura de agregados micelares esféricos en el rango de tamaño de 2-100 nm dispuestos en un cristal líquido lotrópico, con forma cúbica bicontinua, disposición ordenada conocida como sistema cúbico micelar con estructura cristalina Pn3m. Tal sistema cúbico micelar bicontinuo con estructura cristalina Pn3m puede comprender de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 65 % (% en peso) de polímero anfifílico y de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 35 % (% en peso) de agua. Otro ejemplo de composición para obtener una estructura de LLC de este tipo es 33-38 % (% en peso) de agua y el resto está compuesto por una especie anfifílica o un polímero anfifílico.

El hidrogel puede tener una estructura de agregados micelares esféricos en el rango de tamaño de 2-100 nm dispuestos en un cristal líquido lotrópico, con forma cúbica bicontinua, disposición ordenada conocida como sistema cúbico micelar con estructura cristalina Ia3d. Un ejemplo de composición para obtener una estructura de LLC de este tipo es 13-32 % (% en peso) de agua y el resto está compuesto por la especie anfifílica o polímero anfifílico.

El hidrogel puede tener una estructura de agregados micelares cilíndricos con un diámetro de cilindros en el rango de tamaño de 2-100 nm dispuestos en un cristal líquido liotrópico ordenado, geometría hexagonal denominada sistema hexagonal normal. En un sistema hexagonal normal de este tipo, el polímero anfifílico puede estar presente en aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 80 % (% en peso), y el agua puede estar presente en aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 20 % (% en peso), con o sin cantidades menores de solventes orgánicos. Tal sistema hexagonal micelar normal puede comprender de aproximadamente el 35 % a aproximadamente el 40 % (% en peso) de polímero anfifílico, aproximadamente el 50 % (% en peso) de agua y de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 15 % (% en peso) de solvente orgánico.

El hidrogel antimicrobiano también puede tener una nanoestructura ordenada químicamente reticulada de las siguientes estructuras con una geometría neutra y curvatura cero; agregados micelares en forma de lámina con una distancia entre láminas adyacentes en el rango de 2-100 nm, dispuestos como cristal líquido liotrópico, geometría laminar denominada sistema laminar. Tal sistema laminar podría comprender entre el 20-80 % (% en peso) de molécula anfifílica, 15-60 % (% en peso) de solución acuosa y 0-25 % (% en peso) de solventes orgánicos tales como butanol. Un ejemplo de composición para obtener un LLC laminar es 20 % de polímero anfifílico, 55 % (% en peso) de agua y 25 % (% en peso) de solvente orgánico como butanol.

Las nanoestructuras de cristal líquido micelar y liotrópico del hidrogel antimicrobiano pueden comprender líquidos acuosos como el agua como dominio continuo y partes hidrofóbicas confinadas dentro de los agregados micelares. La nanoestructura de cristal líquido micelar y liotrópico puede comprender un líquido acuoso como agua confinada dentro de los agregados micelares y un dominio continuo hidrofóbico. Los líquidos acuosos incluyen, entre otros, agua, soluciones salinas, sangre, sudor y otros posibles fluidos biológicos. En su estado completamente húmedo, también conocido como estado hinchado, el hidrogel antimicrobiano puede absorber hasta 3 o 4 veces su propio peso de líquidos acuosos. Un estado completamente húmedo/hinchado se refiere a la concentración original (en peso) del hidrogel del 20-90 % de solución acuosa y el 10-80 % de moléculas orgánicas anfifílicas, según el tipo de estructura reticulada de LLC que posean los hidrogeles. En su estado totalmente seco, el hidrogel contiene uniformemente menos del 10 % de solución acuosa en peso y, más normalmente, menos del 5 % de solución acuosa en peso, en cuyo caso puede absorber de hasta 8 a 10 veces la solución acuosa de su propio peso. Las Tablas 2 y 3 detallan el comportamiento de absorción de líquido del hidrogel antimicrobiano. Después de la absorción del líquido, el hidrogel antimicrobiano se hincha y cambia de tamaño. Sin embargo, la forma y geometría de los hidrogeles se mantienen sustancialmente.

Debido a la anfifilicidad del hidrogel antimicrobiano, también puede absorber líquidos hidrofóbicos. Como se muestra en la Tabla 2 en la sección experimental, en presencia del solvente hidrofóbico cloroformo, el hidrogel completamente seco puede absorber líquido hidrofóbico, como el cloroformo, hasta 20 a 30 veces su propio peso. Como se indicó con anterioridad, un estado completamente seco se refiere a la concentración del hidrogel inferior al 5 % de solución acuosa y superior al 95 % de moléculas orgánicas anfifílicas en peso.

Las propiedades de absorción de líquidos de los hidrogeles se pueden adaptar para absorber más o menos agua o líquidos hidrofóbicos. Esto se puede lograr mediante el uso de moléculas anfifílicas de diferentes proporciones de longitudes de cadena en grupos hidrofílicos a hidrofóbicos para formar el hidrogel. Por ejemplo, el copolímero de bloque anfifílico DA-PEO^x-PPO^y-PEO^x-DA, donde x e y se refieren al número de grupos PEO y PPO, pueden tener más o menos grupos PEO o PPO. Cantidades más altas de grupos PEO que de grupos PPO pueden resultar en un hidrogel con alta capacidad de absorción de agua, hasta 3 a 8 veces su propio peso inicial. Por el contrario, un hidrogel con más grupos PPO que PEO absorbe menos agua aproximadamente, 0,5-1,5 veces su peso inicial. Este efecto se ejemplifica en la Tabla 3 en la sección experimental de propiedades de absorción de líquidos de materiales de hidrogel formados a partir de DA-PEO¹⁰⁰-PPO⁷⁰-PEO¹⁰⁰-DA y materiales de hidrogel formados a partir de DA-PEO³⁰-PPO⁷⁰-PEO³⁰-DA.

El agente antimicrobiano está unido covalentemente a los dominios hidrofílicos y/o hidrofóbicos repetidos. En el hidrogel antimicrobiano, hay una pluralidad de moléculas antimicrobianas, cada una de las cuales está unida covalentemente a al menos una parte de los dominios hidrofílicos y/o hidrofóbicos repetidos y periódicos.

Más del 10 %, por ejemplo más del 50 % o más del 90 % del agente antimicrobiano presente en el hidrogel puede unirse covalentemente al hidrogel. Esto resulta en una mayor estabilidad y una menor lixiviación del agente antimicrobiano del hidrogel.

El agente antimicrobiano puede ser un agente antimicrobiano anfifílico. Es decir, la molécula antimicrobiana puede tener una región hidrófila y una región hidrófoba. El agente antimicrobiano puede seleccionarse de manera que rompa la pared celular bacteriana mediante fuerzas electrostáticas. El agente antimicrobiano puede ser una molécula polimérica antimicrobiana, como biocidas poliméricos o un péptido antimicrobiano (AMP). Los AMP generalmente interrumpen o inhiben el crecimiento y la proliferación microbianos al dañar las membranas celulares de los microbios. Los AMP son generalmente anfifílicos. Los AMP son generalmente péptidos de cadena corta, es decir, que constan de 1 a 25 aminoácidos y pesos moleculares entre 10 y 25 kDa. Los AMP pueden ser AMP de cadena lineal, AMP ramificados y/o AMP cíclicos. Generalmente tienen una carga neta positiva y tienen regiones hidrofílicas e hidrofóbicas. Se sabe que la estructura anfifílica cargada positivamente de los AMP permite que el péptido penetre en la membrana bacteriana cargada negativamente. La pared celular comprometida conduce a la muerte celular. La naturaleza anfifílica de los AMP en combinación con la nanoestructura ordenada y repetida del hidrogel conduce a la orientación y una mayor inmovilización de los AMP. Es decir, los AMP no se separan ni se liberan del hidrogel subyacente. Esto resulta en que el hidrogel antimicrobiano sea un sustrato no lixiviable para los agentes antimicrobianos. Un AMP puede unirse covalentemente tanto a un dominio hidrofílico como a un dominio hidrofóbico del hidrogel anfifílico. Un AMP puede unirse covalentemente a dominios hidrofílicos e hidrofóbicos adyacentes. El extremo N-terminal de un AMP puede unirse covalentemente a los dominios hidrofóbicos del hidrogel. El extremo C-terminal de un AMP puede unirse covalentemente a los dominios hidrofílicos del hidrogel.

Un AMP puede unirse covalentemente al hidrogel anfifílico y absorberse físicamente en el hidrogel. Como se muestra en la imagen más a la derecha en la Figura 3B, incluso después de 3 semanas de lavado en etanol al 50 %, el hidrogel anfifílico no libera todo el AMP marcado con fluorescencia absorbido físicamente. Esto se debe a la anfifilicidad del hidrogel y la interacción del AMP con los dominios hidrofílico e hidrofóbico del hidrogel. Esto resulta en un mayor rendimiento antimicrobiano y una estabilidad a largo plazo durante su uso.

El agente antimicrobiano puede ser plata (Ag). Por ejemplo, el agente antimicrobiano puede ser una nanopartícula de plata inmovilizada dentro o sobre los dominios hidrófilos y/o hidrófobos repetidos y ordenados del hidrogel. Como se explicó con anterioridad, la plata tiene la desventaja de una mayor toxicidad para las células de mamíferos; sin embargo, también es generalmente un agente antimicrobiano de menor coste en comparación con un AMP.

No sería evidente para el experto en la materia que los grupos carboxilo estarían presentes en el hidrogel anfifílico. Por lo tanto, no hay motivo para intentar unir covalentemente un AMP al hidrogel anfifílico, sin modificaciones adicionales al hidrogel. Sin embargo, como se muestra en las Figuras 10B-E, los grupos carboxilo están presentes en el hidrogel anfifílico y se logran durante el proceso de reticulación del hidrogel.

La inmovilización generalmente se logra a través de enlaces covalentes entre grupos carboxilo en los dominios hidrofílicos del hidrogel. En el caso de que el agente antimicrobiano sea un péptido antimicrobiano, se forman fuertes enlaces amida entre el AMP y los dominios hidrofílicos repetidos del hidrogel. Como se divulgó en la sección experimental, el AMP puede unirse covalentemente al hidrogel a través de la activación de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)-N-hidroxisuccinimida (NHS) de los grupos carboxilo presentes en los dominios hidrofílicos del hidrogel. El esquema de reacción para dicha unión covalente de AMP a través de la activación de EDC/NHS se puede ver en la Figura 2. Como se puede ver en la sección experimental, los AMP u otros agentes antimicrobianos pueden además absorberse físicamente en el hidrogel; sin embargo, en tal caso no hay unión covalente del agente antimicrobiano a las regiones hidrofílicas o hidrofóbicas del hidrogel. Sin embargo, los agentes antimicrobianos no unidos covalentemente son propensos a una degradación y lixiviación/liberación del hidrogel relativamente más rápidas.

El AMP, u otro agente antimicrobiano anfifílico, tiene una región hidrofóbica que interactúa con las regiones hidrofóbicas ordenadas y repetidas del hidrogel. Esto conduce a una orientación mejorada y a una inmovilización mejorada del agente antimicrobiano. La estabilidad y la resistencia a la degradación de los AMP aumentan, mientras que disminuyen o eliminan la liberación de AMP en el entorno circundante, debido a que el hidrogel tiene dominios hidrofílicos e hidrofóbicos ordenados y repetidos. Tal arquitectura puede mejorar la estabilidad y la actividad de los AMP desde unas pocas horas hasta 2 días o más, según los resultados de la sección experimental.

Como se muestra en la sección experimental a continuación, el hidrogel antimicrobiano puede matar hasta el 99,99 % de las bacterias grampositivas y gramnegativas. Sin limitarse a la teoría, un beneficio adicional es que los dominios hidrofílicos del hidrogel antimicrobiano pueden atraer a las bacterias cargadas negativamente y matarlas eficazmente. En aplicaciones para el cuidado de heridas, esto también puede conducir a la eliminación de bacterias muertas y/o adheridas mediante la eliminación de un apósito para heridas que comprende el hidrogel antimicrobiano. Los resultados experimentales para bacterias grampositivas y gramnegativas indican que el hidrogel antimicrobiano también puede matar cepas de bacterias resistentes a los fármacos, como MRSA y E-coli resistente a múltiples fármacos (MDR).

Como se muestra en la sección experimental, el péptido antimicrobiano puede ser uno o más de los siguientes; RRPRPRPRPWWWW-NH2 (RRP9W4N, Red Glead Discovery AB, Lund, Suecia), RRPRPRPRP-NH2 (RRP9N, Red Glead Discovery AB, Lund, Suecia), RRPRPRPWWWWRP-NH2 (RRP7W4RPN, Red Glead Discovery AB, Lund, Suecia), RRPRPWWRPWWRP-NH2 (RRP5W2RPW2RPN, Red Glead Discovery AB, Lund, Suecia). Las secuencias para RRP9W4N, RRP9N se proporcionan en el documento WO 2012/033450 A1. Secuencias para RRP7W4RPN (SEQ ID n.°: 1) y RRP5W2RPW2RPN (SEQ ID n.°: 2) se proporcionan junto con esta solicitud. El péptido antimicrobiano puede ser un péptido antimicrobiano que comprende menos de 20 aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, tal como un 95 %, de identidad con la secuencia de aminoácidos RRPRPRPRP (secuencia proporcionada en el documento WO 2012/033450 A1), y opcionalmente, un tramo de al menos tres residuos consecutivos de triptófano o fenilalalina añadidos al extremo Cor N-terminal, o entre ellos. El péptido antimicrobiano puede comprender una amidación N-terminal. El péptido antimicrobiano puede ser un péptido antimicrobiano que comprende un tramo de al menos uno, al menos tres aminoácidos hidrofóbicos, como residuos de fenilalina o triptófano, que forman una región hidrofóbica. La región hidrofóbica permite la interacción con las regiones hidrofóbicas del hidrogel. Sin embargo, otros péptidos antimicrobianos pueden ser adecuados para su uso como agente antimicrobiano.

El agente antimicrobiano puede ser un AMP derivado sintéticamente como los del párrafo anterior o derivado biológicamente. Los AMP de origen biológico pueden derivar de proteínas de cininógenos, proteína de repetición rica en leucina con extremo rico en prolina y arginina (PRELP), proteínas del factor de crecimiento, proteínas del sistema de coagulación, factor del complemento C3a, factor de von Willebrand, vitronectina, superóxido dismutasa, proteínas priónicas, inhibidor de proteína C, fibronectina, laminina, quimiocinas y glicoproteína rica en histidina. Algunos ejemplos de AMP derivados biológicamente son el péptido LL-37 derivado de catelicidina humana y el pentahidrocloruro de Omiganan. Todos estos péptidos pueden incorporarse potencialmente en el hidrogel como unidos covalentemente o absorbidos físicamente. Solos o junto con otros péptidos.

El agente antimicrobiano se puede unir al hidrogel a través de diversos procesos. Como se muestra en la sección experimental, el agente antimicrobiano se puede unir mediante la inmersión del hidrogel en una solución que comprende el agente antimicrobiano. Se puede aplicar un agente antimicrobiano sustancialmente a la superficie del hidrogel a través de un proceso de aplicación superficial en lugar de inmersión. Se puede dejar caer sobre la superficie del hidrogel una solución que comprende el agente antimicrobiano. Se puede rociar sobre el hidrogel una solución que comprende el agente antimicrobiano. Como se muestra en la sección experimental, la cantidad de agente antimicrobiano necesaria para la activación antimicrobiana de la superficie generalmente se reduce significativamente por goteo y rociado en comparación con la inmersión. Esto se debe a que la mayor parte del hidrogel no se activa con un agente antimicrobiano.

Además del agente antimicrobiano, el hidrogel puede comprender al menos un agente terapéutico. Debido a los dominios hidrofílicos e hidrofóbicos ordenados y repetidos del hidrogel, el agente terapéutico puede ser hidrofóbico, hidrofílico o anfifílico, polar o no polar. El hidrogel antimicrobiano puede albergar agente(s) terapéutico(s) hidrofóbico(s) en el dominio hidrofóbico mientras que los dominios hidrofílicos albergarán agente(s) terapéutico(s) hidrofílico(s). Un agente terapéutico puede ser, entre otros, moléculas de fármaco o biomoléculas pequeñas tales como péptidos o proteínas con propiedades antiinflamatorias, antibióticas o anticancerígenas. La propiedad de liberación selectiva de agentes terapéuticos de los hidrogeles antimicrobianos puede utilizarse, además de sus propiedades antimicrobianas, en dispositivos médicos tales como para el cuidado y la curación de heridas u otras aplicaciones de liberación de fármacos/antimicrobianos. Al menos un agente terapéutico puede unirse covalentemente o absorberse físicamente a los dominios hidrofóbicos y/o hidrofílicos del hidrogel antimicrobiano. Puede proporcionarse al hidrogel una pluralidad de agentes terapéuticos. En tales casos, un primer agente terapéutico puede unirse covalentemente al hidrogel y un segundo, tercer, etc. agente terapéutico puede absorberse físicamente. A diferencia del agente antimicrobiano, al menos un agente terapéutico no tiene por qué estar inmovilizado sobre o dentro del hidrogel, sino que puede estar libre para lixiviarse sustancialmente desde la superficie.

El hidrogel antimicrobiano no se adhiere ni se fija a superficies biológicas como la piel o base de una herida. Esto conduce a un mejor rendimiento en diversas aplicaciones. Un artículo para el cuidado de heridas, como un apósito para heridas, debe ser suave y poder absorber el exceso de exudado de la herida para contener la infección y evitar que el entorno de la herida albergue microbios. El hidrogel antimicrobiano puede usarse como apósito para heridas para absorber los exudados incontrolables liberados desde una piel comprometida. Los exudados de las heridas pueden contener pus, sangre, agua y sudor. Debido a las propiedades de absorción altas y versátiles del hidrogel antimicrobiano, en combinación con las propiedades antimicrobianas, resulta especialmente adecuado como artículo para el cuidado de heridas. La Tabla 2 en la sección experimental muestra que el hidrogel antimicrobiano absorbe sustancialmente la misma cantidad de agua en comparación con un hidrogel que comprende un componente anfifílico, pero sin un agente antimicrobiano unido covalentemente al mismo. Por lo tanto, el hidrogel antimicrobiano tiene suficiente rendimiento de absorción de exudado de heridas, incluso cuando comprende un agente antimicrobiano.

Se puede formar un dispositivo que comprende el hidrogel antimicrobiano mediante la aplicación del hidrogel antimicrobiano sobre un sustrato. El sustrato puede tener una mayor resistencia mecánica que el hidrogel, de modo que es menos susceptible de dañarse durante su uso.

El término «dispositivo», utilizado en la presente, se refiere a un dispositivo médico, de higiene o de cuidado de heridas donde las propiedades antimicrobianas son favorables. Por ejemplo, el dispositivo puede seleccionarse del grupo que comprende artículos de higiene personal, pañales, implantes, instrumentos quirúrgicos, endoprótesis, catéteres, injertos de piel, lentes de contacto, apósitos para heridas, apósitos para ostomía, placas base para ostomía, películas para incisiones, paños quirúrgicos, parches, vendajes, curitas, emplastos, adhesivos, cintas adhesivas, emplastos adhesivos, tiritas adhesivas y vendajes adhesivos y cualquier combinación de los mismos. El dispositivo comprende una primera capa que es el hidrogel antimicrobiano, como se describe en la presente. El dispositivo puede comprender una segunda capa, que es el sustrato mencionado anteriormente, la segunda capa puede comprender una capa de hidrogel, de manera que el dispositivo comprende al menos una primera y una segunda capa de hidrogel. La segunda capa puede comprender, por ejemplo, un metal, un plástico, un elastómero, una película, un tejido, una espuma, una película no tejida, una red de fibras, un tejido de punto. La segunda capa puede seleccionarse de modo que tenga propiedades de absorción de líquido reducidas en comparación con la primera capa.

En el caso de dispositivos para el cuidado de heridas o la higiene personal, donde el dispositivo se va a aplicar sobre la piel de un paciente, la primera capa de hidrogel antimicrobiano se dispone próxima a la piel. La segunda capa, por lo tanto, se dispone distal a la piel.

La segunda capa se puede disponer sobre la primera capa de hidrogel antimicrobiano. Se puede disponer una capa de revestimiento, adhesiva o protectora sobre el dispositivo.

Como se indicó con anterioridad, el hidrogel antimicrobiano puede aplicarse a un implante o dispositivo implantable, de modo que el implante se proporciona con un revestimiento antimicrobiano no lixiviable. Dichos implantes pueden ser tornillos, placas, derivaciones, articulaciones artificiales, corazones artificiales, endoprótesis, catéteres, tubos de vías respiratorias, conductos, válvulas, etc. De manera similar, el hidrogel antimicrobiano puede aplicarse a instrumentos quirúrgicos.

El hidrogel antimicrobiano puede formarse en estructuras tridimensionales mediante técnicas de moldeo convencionales o, por ejemplo, técnicas de fabricación aditiva (AM). La fabricación aditiva puede mejorar la estructura y la orientación de los dominios hidrofílicos e hidrofílicos. Por ejemplo, durante la AM de extrusión de los hidrogeles, las fuerzas de cizallamiento y extensión orientan la nanoestructura ordenada de los hidrogeles en una dirección preferida. Dado que los agentes antimicrobianos están unidos al hidrogel, esta orientación o alineación de la nanoestructura del hidrogel puede presentar uniformemente los agentes antimicrobianos en el hidrogel antimicrobiano en cualquier dirección preferida, como se muestra en la Figura 6. Esto puede conducir a que los agentes antimicrobianos se extiendan uniformemente al entorno externo, lo que conduce a una mejor atracción y eliminación de bacterias.

Aunque la presente invención se ha descrito anteriormente con referencia a realizaciones específicas, no se pretende que se limite a la forma específica expuesta en la presente. Más bien, la invención está limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones, el término «comprende/que comprende» no excluye la presencia de otros elementos o pasos. Además, aunque se enumeran individualmente, una pluralidad de medios, elementos o pasos de métodos pueden implementarse, por ejemplo, una sola unidad o procesador. Además, aunque las características individuales pueden incluirse en diferentes reivindicaciones, pueden combinarse de manera favorable, y la inclusión en diferentes reivindicaciones no implica que una combinación de características no sea factible y/o favorable. Además, las referencias singulares no excluyen una pluralidad. Los términos «un», «una», «primero/a», «segundo/a», etc. no excluyen una pluralidad. Los signos de referencia en las reivindicaciones se proporcionan simplemente como un ejemplo aclaratorio y de ninguna manera se interpretarán como limitantes del alcance de las reivindicaciones.

Sección experimental

Los siguientes ejemplos son meros ejemplos, y de ninguna manera deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Más bien, la invención está limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Experimento 1: Producción de hidrogeles antimicrobianos

Formación de moléculas anfifílicas reticulables

Resumen

Copolímeros de tres bloques anfifílicos, óxido de polietileno(100)-óxido de polipropileno(70)-óxido de ®

polietileno(100) (Pluronic F127), óxido de polietileno(30)-óxido de polipropileno(70)-óxido de polietileno(30) (Pluronic P123), cloroformo, cloruro de acriloílo, trietilamina, carbonato de sodio, sulfato de magnesio anhidro, todos se usaron tal como se recibieron. El derivado de diacrilato de los copolímeros de tres bloques anfifílicos, Pluronic® F127 (DA-F127) (o) Pluronic® P123 (DA-P123) se sintetizaron haciendo reaccionar la molécula de Pluronic con cloruro de acriloílo (Figura 1). Todo el material de vidrio se limpió con acetona, etanol y agua, seguido de secado a 100 °C en un horno de convección durante la noche.

Proceso detallado

La reacción se lleva a cabo en un matraz de fondo redondo de tres bocas (250 ml o 1 L) boca central para condensador, bocas laterales; una para la purga de N² y otra para la adición de cloruro de acriloilo por goteo.

Se pesaron 18,9 g (0,0015 mol) de Pluronic F127 en un vaso de precipitados de 500 ml y se añadieron 200 ml de cloroformo (CHCb) bajo agitación magnética (400 rpm). El Pluronic F127 se disolvió por completo en CHCb en 10 minutos. Esta solución se añadió al matraz de fondo redondo. El vaso de precipitados se lavó con otros 30 ml de CHCl3 para eliminar el tensioactivo residual. El tensioactivo residual y CHCb se añadieron al matraz de fondo redondo.

Se añadió el doble de la cantidad molar de trietilamina, TEA (0,303 g añadidos como una solución con 10 ml de CHCb) a la solución de tensioactivo en el matraz de fondo redondo. Se añadió TEA para neutralizar el ácido clorhídrico (HCl) que se producía durante la reacción.

Se preparó una solución de cloruro de acriloílo (0,006 mol, 0,5431 g) en cloroformo (20 ml). Esa solución se añadió por goteo al matraz de fondo redondo utilizando un cuentagotas con provisión de juntas (recipiente de reacción que se mantiene en un baño de agua fría) en atmósfera de N² (tubo de gas de N² unido a una pipeta de vidrio acoplada a un corcho de goma) con agitación magnética a 400 rpm.

Todas las uniones y aberturas se sellaron con Parafilm antes de dejarlo toda la noche. La mezcla de reacción se volvió muy turbia después de 3 horas (sugiere la neutralización del HCl producido por TEA). Según el aumento de la viscosidad, añadir 20-30 ml de CHCb a la mezcla de reacción de forma intermitente. La reacción se detuvo después de 24 horas y la mezcla de reacción se retiró por la abertura lateral del cuentagotas y se vació en el embudo de separación.

Los productos de reacción se lavaron 3 veces con 100 ml de Na2CO3 acuoso (5 % en peso) en un embudo de separación de 250 ml o 500 ml dependiendo de la cantidad de producto. La mezcla de dos fases se agitó vigorosamente antes de permitir que se separara. Se formó una emulsión espesa de separación lenta. En el segundo o tercer lavado, el embudo de separación con la mezcla se dejó reposar durante la noche para una separación clara y completa. Para cada lavado, la fase de CHCb se eliminó a través de la liberación inferior. La fase acuosa se retiró de la parte superior para evitar la contaminación.

La fase orgánica se transfirió a un vaso de precipitados de 500 ml. Se añadió sulfato de magnesio anhidro (5 espátulas ~ 20-30 g de Mg2SO4) en porciones a la mezcla y se dejó reposar con agitación magnética (200-300 rpm, temperatura ambiente) durante 2 horas hasta que se formó una capa transparente de fase CHCb.

Se usó un embudo Buchner para filtrar al vacío la mezcla de CHCb en un matraz cónico. Antes de la filtración, añadir otros 100 ml de CHCb al vaso de precipitados que contiene la mezcla, para la dilución, lo que reduce la viscosidad de la mezcla y ayuda a evitar la obstrucción de los canales del embudo. Se colocó un papel de filtro Whatman de 11 cm de diámetro en las aberturas del canal del embudo para la filtración. Durante la filtración, se raspó el papel de filtro para facilitar el proceso de filtrado. El papel se cambió cuando la producción de filtrado comenzó a disminuir mucho. Se utilizó un sistema de vacío a base de agua para la filtración. La solución transparente filtrada se transfirió a un matraz de fondo redondo de 1 boca de 1 L previamente pesado para la evaporación del solvente a presión reducida.

El solvente se eliminó a presión reducida a 40 °C durante 2,5 a 6 horas. La mayor parte del solvente se eliminó en los primeros 30 minutos y se recogió en recipientes de recolección tanto primarios como secundarios. Luego, se realizó la evaporación a la mínima presión posible hasta que se formó un residuo pulverulento seco. Este proceso tarda casi 6 horas en finalizar. Se obtuvo un residuo pulverulento blanco al final de la evaporación.

Se logró un rendimiento general del 75-85 % (DA-F127). El procedimiento anterior se repitió para sintetizar DA-P123. Formación de cristales líquidos liotrópicos reticulables químicamente mediante el uso de los copolímeros de bloques anfifílicos reticulables

Para el presente ejemplo, se formó una fase de LLC cúbica micelar usando Pluronic F127 modificado con diacrilato (DA-F127) y agua. Las composiciones en peso para este ejemplo particular son 30 % de DA-F127 y 70 % de agua.

A eso le sigue la adición del fotoiniciador 2-metil 2-hidroxi propiofenona. La concentración de fotoiniciador añadido fue del 1 % en peso de la composición total del copolímero de bloque DA-F127. Para formar un gel de LLC, el copolímero de bloque anfifílico modificado con diacrilato, el agua y el fotoiniciador se mezclan por completo en un recipiente de vidrio para formar un gel transparente, claro y viscoso. Luego, el recipiente con el gel se mantuvo cerrado herméticamente en un entorno oscuro durante 24 horas. El mismo procedimiento se aplica a todas las fases de LLC posibles que se pueden formar usando los copolímeros de bloques anfifílicos DA-F127 o DA-P123. Formación de matrices de cristal líquido liotrópico tridimensionales, sólidas y reticuladas químicamente según la invención

Luego, el gel de LLC reticulable se transfirió a un molde de forma preferida o se fabricó con aditivos (impresión en 3D) utilizando un sistema de fabricación aditiva por extrusión para obtener la forma final de interés. A ese paso le siguió la reticulación del gel con forma utilizando luz ultravioleta (lámpara de 90 W, 252 nm) durante 5-30 minutos para formar un hidrogel de cristal líquido liotrópico sólido y reticulado tridimensional con una nanoestructura hidrófila e hidrófoba alterna.

Formación de hidrogeles de cristal líquido liotrópico reticulados químicamente, con péptidos antimicrobianos cargados positivamente unidos covalentemente

Se preparó una solución de péptido antimicrobiano RRPRPRPRPWWWW-NH2 (RRP9W4N, Red Glead Discovery AB, Lund, Suecia) en agua esterilizada a una concentración de 200 pM. Para la unión covalente del AMP a los hidrogeles, los hidrogeles se sumergieron en una solución de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) en tampón MES (pH = 6) a una concentración final de 2 mg/ml y se dejaron reaccionar durante 30 minutos en agitación lenta a temperatura ambiente. Luego, los hidrogeles se lavaron 3 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y se suspendieron en la solución de AMP durante 2 horas a temperatura ambiente. Los hidrogeles se lavaron 3 veces durante 0,5 horas para eliminar los péptidos que no reaccionaron a partir del material y se usaron para ensayos bacterianos.

Tabla 1 Composiciones y detalles de hidrogeles antimicrobianos producidos a través del proceso anterior

Experimento 2: Prueba de actividad antimicrobiana y sin lixiviación de los hidrogeles antimicrobianos

Prueba de inmovilización y rendimiento sin lixiviación de hidrogeles

Se utilizó AMP marcado con fluorescencia (5(6) carboxifluoresceína-RRPRPRPRPWWWW-NH²) para estudiar la estabilidad de la unión de AMP y su distribución en superficies de hidrogel después de varios pasos de lavado en etanol durante un máximo de 3 semanas.

Para evaluar la eficacia de unión del AMP al hidrogel, el hidrogel antimicrobiano se lavó secuencialmente en etanol al 50 % durante 3 semanas. Después de cada lavado en puntos temporales específicos, los hidrogeles antimicrobianos se extrajeron, se golpearon con papel de seda para eliminar el exceso de solvente y se tomaron imágenes bajo un microscopio fluorescente para evaluar la fluorescencia emitida por el AMP. Los resultados se compararon con un hidrogel de control, donde el AMP marcado con fluorescencia se absorbió en el hidrogel mediante inmersión; sin embargo, no se produjo ningún enlace covalente del AMP marcado. La Figura 3a (fila superior) muestra que la fluorescencia emitida por el AMP unido covalentemente al hidrogel permanece intacta en diferentes puntos temporales después del lavado. La Figura 3b (fila inferior) muestra el control. Como puede observarse en la figura, la inmovilización fue significativamente mayor con el AMP unido covalentemente.

Evaluación de la actividad antimicrobiana del hidrogel antimicrobiano

Se utilizó S. epidermidis (ATCC 35984) para evaluar la formación de biopelículas en los hidrogeles antimicrobianos. Un día antes del experimento, se usó un circuito esterilizado de 10 pl para extraer una sola colonia de las placas de agar cultivadas de cada bacteria para inocular un tubo de 5 ml de caldo de soja tríptico (TSB). Las células inoculadas se cultivaron en una incubadora durante 6 horas, se diluyeron en TSB y se cultivaron en la incubadora durante la noche para alcanzar la fase estacionaria de crecimiento bacteriano.

La densidad óptica del cultivo bacteriano se ajustó a 0,7 a 620 nm (estimada para proporcionar 109 colonias) usando un espectrómetro. La suspensión bacteriana se centrifugó durante 10 minutos a 2500 rpm y el sedimento bacteriano formado se suspendió en medio de TSB fresco. Se sembraron 2 ml de la suspensión sobre sustratos de vidrio de control negativo, hidrogeles de control negativo, hidrogeles de control positivo e hidrogeles antimicrobianos anfifílicos según un aspecto de la invención, en una placa de 12 pocillos. Los hidrogeles de control negativo tenían la estructura ordenada y repetida descrita con anterioridad, pero no se les proporcionó ningún agente antimicrobiano (AMP). Los hidrogeles de control positivo tenían AMP absorbidos en el hidrogel, pero no se produjo unión covalente del AMP al hidrogel. Luego, las bacterias se cultivaron durante 24 horas en condiciones de cultivo estándar (aire ambiente a 37 °C) para promover la formación de biopelículas en las superficies. Después de 1 hora de cultivo, se aspiró el medio y se reemplazó con TSB fresco durante otras 23 horas de cultivo. Al final del punto temporal de 24 horas, las muestras de hidrogel antimicrobiano y de control se enjuagaron 3 veces con PBS fresco para lavar cualquier bacteria planctónica no adherida antes del análisis de la biopelícula. La biopelícula se tiñó con el kit de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD BacLight (Sondas moleculares, Invitrogen). Las imágenes de la Figura 4 se obtuvieron con SYTO 9 y la tinción de ácido nucleico con yoduro de propidio proporcionada en el kit. Las bacterias vivas con membranas celulares intactas aparecían verdes y las bacterias muertas con membranas comprometidas aparecían rojas. La Figura 4a muestra biopelículas de S. epidermidis formadas en los hidrogeles de control negativo sin AMP. La Figura 4b muestra biopelículas de S. epidermidis formadas en hidrogeles de control positivo con AMP absorbidos físicamente, es decir, no unidos covalentemente. La Figura 4c muestra biopelículas de S. epidermidis formadas sobre hidrogeles con AMP unidos covalentemente según un aspecto de la invención. La Figura 4b muestra que hay menos unión bacteriana en el control de hidrogel positivo. En tanto, la Figura 4c muestra un efecto antimicrobiano de casi el 100 %, es decir, la eliminación de bacterias en los hidrogeles antimicrobianos.

Prueba de inhibición de zona

Un día antes del experimento, se usó un circuito esterilizado de 10 pl para extraer una sola colonia de S.aureus de las placas de agar cultivadas para inocular un tubo de 5 ml de caldo de soja tríptico (TSB). Las células inoculadas se cultivaron en la incubadora durante 6 horas, se diluyeron en TSB y se incubaron hasta alcanzar la fase estacionaria para el crecimiento bacteriano. Se sembraron 50 pl de la suspensión en placas de agar de infusión de cerebro y corazón (BHI), seguido de la colocación de los hidrogeles en agar. Luego, las placas se incubaron en condiciones de cultivo estándar (aire ambiente a 37 °C) durante 24 horas. En la Figura 5b, la región clara que apareció alrededor de los hidrogeles con AMP absorbidos físicamente indica la inhibición efectiva del crecimiento microbiano debido a la difusión de AMP desde los geles. Por otro lado, como se muestra en la Figura 5c, cuando los AMP se unen covalentemente al hidrogel, no se observa una región clara alrededor de los hidrogeles y la inhibición solo se observa en la región directamente debajo del área cubierta por hidrogel, lo que significa que no se lixivió AMP del gel.

Experimento 3: Evaluación de la capacidad de absorción de líquidos del hidrogel y el hidrogel antimicrobiano

Los hidrogeles basados en DA-F127 y DA-P123 y los hidrogeles antimicrobianos con nanoestructura ordenada hexagonal normal y cúbica micelar normal se utilizaron para los estudios de absorción de líquidos. Se liofilizaron pequeños trozos de hidrogel durante 2 días para eliminar toda el agua presente en los hidrogeles. Para aquellos hidrogeles en estado completamente húmedo, la prueba se realizó sin ningún paso de secado adicional. Después del secado, los hidrogeles estaban en estado seco y se colocaron en exceso de agua o cloroformo (20 ml) durante la noche para permitir que los hidrogeles absorbieran la mayor cantidad de líquido posible. Después de la absorción durante 15 horas a temperatura ambiente, los hidrogeles se extrajeron de los respectivos líquidos utilizando pinzas, y el exceso de líquidos se eliminó golpeando sobre un papel de seda. Después de eso, las muestras se pesaron con una exactitud de 0,001 g. La Tabla 2 muestra la capacidad de absorción inicial, final y líquida (% de LQ) de cada hidrogel tanto en agua como en cloroformo. Los hidrogeles antimicrobianos solo se evaluaron en agua, dado que el agua era más relevante para el estudio. Se utilizó la siguiente ecuación para calcular la absorbancia líquida de los hidrogeles y los hidrogeles antimicrobianos

Peso final - Peso inicial

Absorbencia de líquidos CLQ> % ^* 100

Peso inicial

Tabla 2: Absorción de líquidos de hidrogeles completamente secos e hidrogeles antimicrobianos: nanoestructura de orden cúbico micelar

La Tabla 2 muestra que los hidrogeles en estado seco tienen una absorbencia de líquidos de hasta 1795 % en cloroformo mientras que puede absorber 750 % de agua. Es importante destacar que la función antimicrobiana de los hidrogeles no cambia drásticamente la absorbencia de líquido de los hidrogeles con una absorbencia de agua del 676 % para los hidrogeles antimicrobianos.

Tabla 3: Absorción de líquidos de varios hidrogeles según la invención en estado completamente húmedo

El estado completamente húmedo en la Tabla 3 se refiere a la concentración original del hidrogel de 20-80 % de agua y 20-80 % de moléculas orgánicas anfifílicas en peso. La alta absorbencia de líquidos hace que los hidrogeles sean particularmente adecuados para su uso en apósitos para heridas donde la absorbencia de líquidos del exudado de la herida es importante.

Conclusiones

Se ha preparado un hidrogel antimicrobiano anfifílico que muestra propiedades mejoradas en comparación con los hidrogeles existentes. La unión covalente de agentes antimicrobianos a los dominios hidrofílicos y/o dominios hidrofóbicos del hidrogel anfifílico resulta en la inmovilización de agentes antimicrobianos al hidrogel. Además, el hidrogel antimicrobiano anfifílico puede absorber soluciones hidrofóbicas tanto acuosas como no acuosas en un grado significativo.

Experimento 4: Formación de hidrogeles de LLC, unión covalente de AMP y posterior caracterización y análisis Síntesis de Pluronic F-127 modificado con diacrilato

El Pluronic F127 en su forma original no puede reticularse químicamente. En cambio, es una solución de LLC en constante cambio que responde a diferentes concentraciones y temperaturas. Aquí se deseaba un hidrogel sólido, lo que significaba que el Pluronic debía modificarse para que pudiera reticularse químicamente (o de manera covalente). Esto se hizo mediante la adición de grupos acrilato en los extremos del polímero anfifílico, lo que ha demostrado ser exitoso en estudios anteriores (He, W. et al Mesoscopically Ordered Bone-Mimetic Nanocomposites. Adv. Mater., Vol. 27: 2260-2264) y como se describió con anterioridad. Un esquema general de la reacción química se muestra en la Figura 1. Se puede encontrar una descripción detallada del proceso de síntesis en He, W. et al, 2015.

Formación de hidrogeles anfifílicos

El derivado de diacrilato de Pluronic F127 es esencialmente un polvo blanco de aspecto similar a su molécula original. El polvo se mezcló con agua para formar el LLC deseado. Este estudio solo utilizó la fase cúbica micelar (denominada en forma abreviada como h) ya que la fase h es más fácil de formar y manipular y solo requiere cantidades bajas del anfífilo en comparación con otras estructuras de LLC como la fase hexagonal o laminar, que es mucho más gruesa y requiere una mayor concentración del anfífilo. Los LLC en la fase cúbica micelar se obtuvieron mezclando manualmente Pluronic F-127 diacrilado (DA-F127) (40 % en peso) con agua (60 % en peso), para formar un gel espeso y homogéneo. Se añadió un fotoiniciador, 2-hidroxi-2-metilpropiofenona a la mezcla de gel correspondiente al 2 % en peso de DA-F127 para facilitar la reticulación. Otro fotoiniciador no citotóxico denominado 2-hidroxi-4-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona también se utilizó para partes de este estudio. Luego, la mezcla de gel se extendió entre dos portaobjetos de vidrio para obtener un espesor adecuado, que luego se envolvió en Parafilm y papel de aluminio. El gel se mantuvo en reposo durante la noche para que la fase de LLC alcanzara su estado de equilibrio. Al día siguiente, el gel, aún entre los portaobjetos de vidrio, se expuso a luz UV (X= 254 nm) durante 10 minutos para reticular el gel. Se obtuvo un hidrogel sólido y se cortó en la forma deseada con la ayuda de punzones circulares de biopsia que tenían diámetros de 4 mm (en lo sucesivo denominados hidrogeles pequeños) y 8 mm (en lo sucesivo denominados hidrogeles grandes). Para los hidrogeles de mayor diámetro se utilizó un molde de plástico con un grosor de 1,8 mm para conseguir también un grosor uniforme. El último paso fue lavar los hidrogeles en agua durante 48 horas para eliminar el iniciador y los polímeros no reticulados, así como para que los hidrogeles alcanzaran su estado completamente hinchado.

Unión covalente de AMP a los hidrogeles anfifílicos

Los diferentes tipos se denominan hidrogeles de control sin AMP, hidrogeles con AMP cargados físicamente e hidrogeles con AMP unidos covalentemente. El hidrogel de control se utilizó en todos los experimentos y consistió solo en el hidrogel reticulado. La segunda variante, los AMP cargados físicamente, son hidrogeles que se sumergieron en la solución de AMP 200 pM durante 2 horas. Básicamente, la segunda variante no induce ningún enlace covalente entre el AMP y el hidrogel. La última variante, denominada muestras de AMP unidos covalentemente, se obtuvo de la siguiente manera: al seguir el paso de lavado de la sección anterior, los hidrogeles se colocaron en pocillos separados de una placa de 24 pocillos. Se pesaron individualmente N-hidroxisuccinimida (NHS) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para preparar una solución de 2 mg/ml en tampón de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) (con un pH de 6,00). Se añadieron 500 pl de cada una de las soluciones de EDC y NHS a cada pocillo rápidamente después de preparar las soluciones, dado que tienen una semivida corta. Los hidrogeles se dejaron en la solución de EDC/NHS durante 30 minutos y luego se lavaron con agua. Después de la activación de EDC/NHS, los hidrogeles se sumergieron en la solución de AMP durante 2 horas. La concentración y el volumen de la solución variaron según el experimento. A menos que se indique lo contrario, la concentración y los volúmenes utilizados en todos los experimentos fueron 200 pM y 400 pl para los hidrogeles pequeños y 700 pl para los hidrogeles grandes descritos anteriormente en el Experimento 1 y mostrados en el esquema de reacción presentado en la Figura 2.

Análisis de espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FITR)

La reacción que se muestra en la Figura 2 solo puede producirse cuando hay un ácido carboxílico presente en la molécula de Pluronic. Sin embargo, el DA-F127 solo contiene un grupo éster y no un grupo ácido carboxílico. Por lo tanto, para que se produzca la reacción, en algún momento durante el proceso de formación del hidrogel, antes de la activación de ^e D^c /NHS, se deben haber formado grupos de ácido carboxílico. En un intento de investigar esta reacción, se realizaron mediciones de FTIR en muestras de todos los diferentes pasos antes del paso de unión de AMP. Eso incluyó el polvo Pluronic F127 no modificado, el polvo Pluronic F127 modificado con DA, los hidrogeles reticulados (lavados y sin lavar) y, finalmente, los hidrogeles activados por EDC/NHS. El análisis de FTIR se realizó en un espectrómetro Perkin Elmer Frontier utilizando el modo de reflectancia total atenuada (ATR, placa de diamante GladiATR de Pike Technologies). El rango de exploración estaba sobre un número de onda de 400-4000 cm-1. Las muestras tenían un grosor de 1-2 mm y cada muestra se escaneó 16 veces.

Los espectros en el rango de 1500-1900 cirr1 de las cinco muestras diferentes se muestran en la Figura 10. El Pluronic F127 no modificado en polvo no mostró un pico distinto en esa región. Por otro lado, el polvo Pluronic modificado mostró un pico distinto a 1725 cirr1. El hidrogel reticulado, el hidrogel reticulado y lavado y el hidrogel activado con EDC y NHS mostraron picos distintos a 1734, 1734 y 1735 cm-1, respectivamente.

En el Pluronic F127 no modificado, no hay una señal separada clara en la región de la cetona, lo que indica la ausencia de carbonilo en esta molécula. Por otro lado, se halla una señal clara en las mediciones de FTIR de Pluronic F127 modificado, lo que indica una incorporación exitosa de los grupos acrilato. La única diferencia entre los pasos, donde se observa una señal es entre el Pluronic F127 modificado y el hidrogel reticulado, que muestran un desplazamiento del pico de 1725 cirr1 a 1734 cirr1. Lo más probable es que ese pico indique que la reacción tiene un rendimiento inferior al 100 % y, por lo tanto, hay una mezcla de ésteres normales, ésteres conjugados y ácidos carboxílicos en todo el hidrogel.

Mediciones de concentración de péptidos con espectroscopia de UV-visible (UV-vis)

Se aplicó espectrofotometría UV-vis para calcular la cantidad de AMP presente en el hidrogel. Primero se activaron los hidrogeles de la forma estándar descrita con anterioridad y después de exponerlos a la solución de AMP, se recogió todo el líquido y se transfirió a viales a los que se añadió agua, hasta un volumen total de 3 ml. Esta solución diluida se transfirió a una cubeta de cuarzo, que se colocó dentro de un espectrofotómetro HP8453. Las medidas se realizaron con agua como referencia y se anotó la absorbancia a 280 nm. Esa longitud de onda se correlaciona con la región de absorción del aminoácido triptófano. Se preparó un estándar externo de los péptidos antes de las mediciones para correlacionar las longitudes de onda medidas con una concentración correspondiente. Los análisis se realizaron en hidrogeles grandes (8 mm de diámetro) y pequeños (4 mm), así como en hidrogeles de AMP unidos covalentemente y en hidrogeles de AMP cargados físicamente. Los hidrogeles se volvieron a lavar después de sumergirlos en la solución de AMP y se realizaron mediciones en el extracto lavado a fin de cuantificar la lixiviación de AMP de los hidrogeles.

Los resultados que muestran la cantidad de hidrogel adherido o absorbido en el caso de los hidrogeles de AMP cargados físicamente se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4: Cantidad de AMP unido o absorbido en el hidrogel, presentada en mg ± desviación estándar.

La Tabla 4 indica que los hidrogeles cargados físicamente con AMP y los hidrogeles a los que los AMP están unidos covalentemente absorben una cantidad similar de AMP. Esto indica que los hidrogeles de LLC anfifílicos, probablemente debido al mecanismo del efecto hidrofóbico, incorporan AMP de manera eficiente incluso si solo se absorben físicamente.

Evaluación cualitativa y cuantitativa de la formación de biopelículas y actividad antibacteriana de hidrogeles anfifílicos

En este experimento, el efecto antimicrobiano de los hidrogeles se evaluó según el protocolo del experimento 2; sin embargo, se repitió con tres cepas bacterianas separadas: Staphylococcus aureus CCUG 10778, Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 y Pseudomonas aeruginosa CCUG 6489. Se eligieron estas bacterias porque se encuentran con frecuencia en infecciones y porque el género Pseudomonas es gramnegativo mientras que el género Staphylococci es grampositivo. Todas las bacterias se almacenaron en un congelador a -80 °C y solo se sacaron brevemente para la formación de colonias para el cultivo. Se hizo en placas de agar con infusión de cerebro y corazón (placas de agar BHI) que se rayaron con una técnica estéril y luego se incubaron boca abajo en una incubadora a 37 °C durante la noche. En la Figura 7 se presenta una selección de imágenes de microscopía tomadas de las bacterias presentes en las muestras de hidrogel después de la tinción LIVE/DEAD. Por lo general, S. aureus y S. epidermidis eran completamente viables en los hidrogeles de control formando una estructura de biopelícula sobre la mayor parte de la muestra.

P. aeruginosa, no pareció crecer tan eficazmente como las especies de Staph grampositivas. En varias ocasiones hubo pocas bacterias o ninguna en los hidrogeles cultivados con P. aeruginosa. Los resultados se han analizado con respecto a la proporción de células muertas halladas en la superficie utilizando la fórmula (células muertas) (células muertas vivas). Los resultados cuantitativos se muestran en la Figura 8.

Como queda claro en ambas Figuras 7 y 8, la incorporación de los AMP al material produce un importante efecto antibacteriano sobre las bacterias que están en contacto directo con la superficie. La mayoría de las bacterias estaban muertas y las que estaban vivas eran relativamente pocas en comparación con el control y, la mayor parte del tiempo, estaban separadas en pequeños grupos. Por lo tanto, la formación de biopelículas se mantuvo al mínimo, lo que sugiere que las bacterias vivas en la superficie del hidrogel podrían ser eliminadas más fácilmente por la propia respuesta inmunitaria del cuerpo. Si la esterilidad es de suma importancia, se podrían usar antibióticos convencionales junto con el hidrogel de AMP, lo que debería resultar en menos bacterias que sobrevivan al tratamiento y, por lo tanto, una menor resistencia a los antibióticos en esos casos. La Figura 9 muestra las diferentes morfologías de las células muertas. Tanto las manchas irregulares que se muestran en la Figura 9a como la estructura en forma de polvo de la Figura 9b implican una integridad estructural comprometida de la membrana bacteriana. Esto significaría que aunque los péptidos son demasiado cortos para penetrar por completo la membrana, aún ejercen su actividad interfiriendo con la membrana muy probablemente a través de las fuerzas electrostáticas.

Estabilidad de almacenamiento en PBS

Para determinar la estabilidad de los hidrogeles anfifílicos se realizó un experimento de estabilidad en almacenamiento. Los hidrogeles grandes se dejaron durante 10 semanas en PBS y luego se incubaron con S. aureus y luego les siguió nuevamente la tinción LIVE/DEAD como se describió con anterioridad. Los hidrogeles que se habían dejado en PBS durante 10 semanas, con y sin AMP, se incubaron junto con S. aureus. Los resultados de la tinción LIVE/DEAD de las bacterias se presentan en la Figura 11. Se muestran tanto la proporción de células muertas, a), como la cobertura superficial de bacterias, b), y en ambas se halló una diferencia significativa.

Estabilidad del suero

A fin de evaluar la estabilidad de la unión covalente de los AMP al hidrogel anfifílico, se colocaron hidrogeles en suero humano. Se prepararon grandes hidrogeles según el procedimiento anterior y se colocaron en pocillos separados de una placa de 24 pocillos. A cada pocillo se añadieron 400 pl de suero humano al 20 % después de la filtración a través de un filtro de 0,2 pm para eliminar las bacterias y los precipitados. El suero se compró a Sigma Aldrich como suero puro y se diluyó al 20 % con agua Milli-Q. Las placas se mantuvieron a temperatura ambiente, envueltas en papel de aluminio. En los puntos temporales deseados, se extrajo del suero un conjunto de hidrogeles (2x control, 2x físicamente y 2x covalentemente) y se lavaron tres veces en PBS. Los hidrogeles se colocaron en una nueva placa de 24 pocillos, donde se dejó crecer un cultivo de S. aureus durante la noche en una incubadora a 37 °C. Después de la incubación, los hidrogeles se tiñeron con el kit de viabilidad LIVE/DEAD y se analizaron los resultados. Los resultados se presentan en la Figura 12. Los resultados muestran que durante las primeras 10 horas se logró una actividad normal. El efecto bactericida todavía se observó en las muestras de hidrogel de AMP unidos covalentemente, incluso después de 1 y 2 días en suero, que fue significativamente mayor que el control. Aplicación superficial de AMP a hidrogeles

Se realizaron ensayos a fin de minimizar la cantidad de AMP utilizada para activar el hidrogel sin comprometer el efecto bactericida. Se hizo de dos maneras diferentes, ya sea añadiendo gotas de la solución de AMP en los hidrogeles o utilizando un dispositivo de rociado. Para la prueba de caída, se utilizaron cuatro volúmenes diferentes y dos concentraciones diferentes, lo que resultó en ocho combinaciones diferentes. Las diferentes combinaciones se resumen en la Tabla 5. A modo comparativo, los 400 pl de solución 200 pM en la que normalmente se activaron los hidrogeles pequeños mediante inmersión contenían 154,5 pg de la molécula de AMP. El AMP se pesó cuidadosamente y luego se diluyó en agua para alcanzar la concentración deseada de 800 pM. Una parte de esa solución se diluyó hasta 200 pM para la concentración más baja. Los hidrogeles se prepararon de forma similar a la descrita en el experimento 2 y luego se activaron en EDC/NHS como antes. Después de eso, los hidrogeles se secaron rápidamente con un pañuelo de papel para secar la superficie. Luego, las gotas se distribuyeron sobre los hidrogeles con la ayuda de una pipeta según la Tabla 5. Las gotas se mantuvieron en los hidrogeles durante 3 horas y luego se lavaron 3 veces con agua. El efecto antibacteriano se evaluó en función de S. aureus cultivado de la misma manera que se describió previamente en el experimento 2 y se analizó con tinción LIVE/DEAD.

Tabla 5: Diferentes combinaciones utilizadas en la prueba de caída.

Los resultados se muestran en la Figura 13. Todas las muestras mostraron una diferencia significativa a partir del control. Los hidrogeles activados con gotas de solución de AMP 200 pM mostraron un efecto antibacteriano relativamente menor en comparación con la técnica de inmersión. Los hidrogeles activados con gotas de 800 pM mostraron el mismo efecto antibacteriano, todos en la misma región que los hidrogeles que se activaron en la forma de remojo mencionada con anterioridad. Se observó que los volúmenes más grandes, es decir, 40 pl y 90 pl, no siempre permanecieron como una gota sobre los hidrogeles, sino que fluyeron fuera del hidrogel. Eso puede, por ejemplo, explicar las barras de error más grandes para las muestras de 200 pM 90 pl y la aparente reducción de la actividad para las gotas de 200 pM 40 pl.

Para la prueba de rociado, los hidrogeles se activaron con EDC/NHS antes de cortarlos en discos circulares con el punzón de biopsia y solo se trató un lado. Por lo tanto, se activaron las láminas enteras en lugar de los discos pequeños. Eso se hizo para obtener una capa uniforme de sustancia rociada sobre los hidrogeles y también para simular cómo los hidrogeles probablemente se activarían en una forma industrial de producción. La pistola utilizada en estos estudios fue la serie A470 del sistema de aerografía AZTEK Se analizaron dos tipos de hidrogeles: hidrogeles que se habían lavado durante 48 horas en agua e hidrogeles recién reticulados sin ningún paso de lavado antes de la activación de AMP. Todos esos hidrogeles se fabricaron con el fotoiniciador no citotóxico en un nuevo intento de simular un enfoque industrial. Las concentraciones de AMP utilizadas en este experimento fueron 200 pM, 400 pM y 800 pM. El volumen exacto de líquido que se roció sobre la superficie es difícil de calcular debido a las pérdidas durante el proceso de rociado. Sin embargo, un cálculo aproximado es que se usaron alrededor de 500 pl de la solución de AMP por 10 cm2 de hidrogel.

En el primer ensayo, las láminas de hidrogel se activaron con soluciones de AMP de 200 pM, 400 pM y 800 pM. Se utilizaron láminas rectangulares del hidrogel que habían sido lavadas durante 2 días en agua, y las que estaban frescas de la reticulación. Eso significa que los hidrogeles estaban completamente hinchados (aproximadamente 90 % de agua) y aquellos que estaban entre el estado seco y completamente hinchado (aproximadamente 60 % de agua). Para ambos tipos de láminas, los hidrogeles no se lavaron en el medio para eliminar cualquier exceso de EDC/NHS y, por lo tanto, se dejaron en el hidrogel cuando se añadió el AMP, ya que se determinó que eso podría conducir a un mayor rendimiento en comparación con el lavado de la solución de EDC-NHS de los hidrogeles antes de la aplicación de la solución de AMP. Los resultados de las soluciones de AMP de 400 pM y 800 pM se muestran en la Figura 14. El rociado con una solución de AMP de 200 pM conduce a un rendimiento reducido. Como no se hallaron diferencias significativas si se permitió que los hidrogeles se hincharan o no, los resultados indican que debería ser totalmente posible activar los hidrogeles directamente después de la reticulación.

Toxicidad en células humanas del hidrogel antimicrobiano anfifílico: ensayo de MTT

Para estudiar la toxicidad de los hidrogeles para las células humanas, se realizó un ensayo de MTT en hidrogeles de control e hidrogeles con AMP unidos covalentemente. Un ensayo de MTT mide la actividad metabólica celular, que se correlaciona con la viabilidad de las células. Los hidrogeles se prepararon según el proceso anterior y se cortaron en discos con un punzón de biopsia más pequeño que medía 4 mm de diámetro. Luego se lavaron durante 48 horas en agua seguido de 30 minutos en etanol y luego nuevamente en agua Milli-Q. Se activó la mitad de los hidrogeles, seguido de la transferencia de todas las muestras a 0,7 ml de medio de cultivo durante al menos 24 horas. El medio de cultivo utilizado en el experimento fue una versión del medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que no tenía rojo de fenol, pero con adición del 1 % v/v de L-Glutamina 200 mM, 10 % v/v de suero bovino fetal, 1 pg/ml de hidrocortisona, 3 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano, 10 pg/ml de heparina, 10 pg/ml de gentamicina y 0,25 pg/ml de anfotericina B.

Mientras los hidrogeles estaban en los medios de cultivo, los tubos se mezclaron y agitaron ocasionalmente para que los compuestos potencialmente tóxicos se filtraran de los hidrogeles. Luego, se añadieron 0,2 ml de cada medio de cultivo a pocillos separados de una placa de 96 pocillos junto con una cantidad uniforme de fibroblastos humanos. La placa se colocó en una incubadora humidificada a 37 °C y 5 % de CO² y los fibroblastos se expandieron a 30,000-50,000 células por pocillo. Luego, se retiró el medio y se reemplazó por 100 pl del correspondiente medio de cultivo empapado en muestra junto con 10 pl de solución de MTT 12 mM. También se utilizó un control positivo y negativo para el cultivo. El control positivo consistió en células que se cultivaron en un medio que no había estado en contacto con ninguna muestra de hidrogel, y el control negativo consistió solo en medio de cultivo y la solución de MTT sin células. Luego, la placa se incubó durante 4 horas, seguido de la adición de 100 pl de solución de SDS-HCl a cada pocillo. Luego, la placa se incubó nuevamente durante 4 horas, seguido de mediciones de absorbancia a 570 nm, que se correlaciona con la densidad celular. Los resultados se presentan en la Figura 15. La línea punteada indica una viabilidad celular del 75 %, que generalmente se considera como el punto de corte, donde se dice que los valores inferiores a ese son tóxicos para las células. 0 % en la barra indicaría ningún crecimiento y 100 % indicaría un crecimiento igual al del control positivo, que era solo medio de cultivo. Los resultados mostraron datos significativos de que ninguno de los hidrogeles liberó sustancias tóxicas para los fibroblastos humanos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un hidrogel antimicrobiano sólido que comprende un primer componente anfifílico reticulable, siendo dicho primer componente anfifílico, en su estado químicamente reticulado, un cristal líquido liotrópico y que tiene una nanoestructura ordenada de dominios hidrófobos e hidrófilos, comprendiendo el hidrogel un agente antimicrobiano unido covalentemente a los dominios hidrofílicos y/o hidrofóbicos.

2. El hidrogel antimicrobiano según la reivindicación 1, en donde el agente antimicrobiano es un agente antimicrobiano sustancialmente anfifílico inmovilizado covalentemente en los dominios hidrofílicos y, opcionalmente, en los dominios hidrofóbicos del primer componente anfifílico.

3. El hidrogel antimicrobiano según la reivindicación 2, en donde el agente antimicrobiano es un péptido antimicrobiano, tal como un péptido antimicrobiano que comprende un tramo de al menos uno, al menos tres aminoácidos hidrofóbicos que forman una región hidrofóbica para la interacción con las regiones hidrofóbicas del hidrogel, tal como el péptido antimicrobiano RRP9W4N.

4. El hidrogel antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la molécula anfifílica es un copolímero.

5. El hidrogel antimicrobiano según la reivindicación 4, en donde el copolímero es un derivado de diacrilato de un copolímero de tres bloques tal como poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno) (PEO-PPO-PEO).

6. El hidrogel antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la nanoestructura ordenada es una nanoestructura ordenada y repetida de morfología micelar, hexagonal, cúbica o laminar.

7. El hidrogel antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente antimicrobiano también se absorbe físicamente en el hidrogel, de modo que una parte del agente antimicrobiano presente en el hidrogel se absorbe físicamente y una parte se une covalentemente.

8. El hidrogel antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde un agente terapéutico, además del agente antimicrobiano, se une covalentemente o se absorbe físicamente a los dominios hidrofílicos y/o hidrofóbicos del primer componente anfifílico.

9. El hidrogel antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el hidrogel es sustancialmente no degradable en condiciones fisiológicas.

10. Un dispositivo que comprende el hidrogel antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el hidrogel antimicrobiano se aplica sobre un sustrato y en donde el hidrogel antimicrobiano forma una primera capa de hidrogel antimicrobiano, en donde el sustrato tiene una mayor resistencia mecánica en relación con la primera capa de hidrogel antimicrobiano.

11. El dispositivo según la reivindicación 10, en donde el dispositivo se selecciona del grupo que comprende un implante, un instrumento quirúrgico, una endoprótesis, un catéter, un injerto de piel, una lente de contacto, artículos de higiene personal, pañales, un apósito para heridas, un apósito para ostomía, placa base de ostomía, película para incisión, paños quirúrgicos, un parche, un vendaje, curitas, emplastos, un adhesivo, una cinta adhesiva, un emplasto adhesivo, tiritas adhesivas y vendajes adhesivos y cualquier combinación de los mismos.

12. El hidrogel antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el dispositivo según las reivindicaciones 10 u 11 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de quemaduras, cicatrices, infecciones bacterianas, infecciones virales y/o infecciones fúngicas.

13. Un método para la producción un hidrogel antimicrobiano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende:

- proporcionar un primer componente anfifílico reticulable,

- reticular el primer componente anfifílico para formar un cristal líquido liotrópico sólido tridimensional y reticulado químicamente a partir del primer componente anfifílico, y

- unir, covalentemente, un agente antimicrobiano al hidrogel.

14. El método según la reivindicación 13, en donde el agente antimicrobiano se localiza sustancialmente en la superficie del hidrogel, y en donde la unión del agente antimicrobiano se realiza mediante la aplicación superficial de una solución que comprende un agente antimicrobiano.

15. El método según la reivindicación 14, en donde el agente antimicrobiano es un péptido antimicrobiano (AMP) y la aplicación superficial se logra rociando una solución que tiene una concentración de AMP superior a aproximadamente 5o pM, tal como superior a aproximadamente 200 pM, a la superficie del hidrogel.