ES2927220T3

ES2927220T3 - Composiciones y procedimientos de módulos suicidas

Info

Publication number: ES2927220T3
Application number: ES19790109T
Authority: ES
Inventors: Katharina Friederike Sonja Stengel
Original assignee: Caribou Biosciences Inc
Current assignee: Caribou Biosciences Inc
Priority date: 2018-10-01
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2022-11-03
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: US20210214416A1; WO2020072390A1; DK3833682T3; EP3833682B1; EP3833682A1

Abstract

Se describen proteínas transmembrana quiméricas que comprenden uno o más módulos suicidas y métodos para preparar y usar estas construcciones. Las proteínas transmembrana quiméricas comprenden uno o más módulos suicidas y un dominio transmembrana. También se describen células manipuladas que comprenden tales proteínas transmembrana quiméricas y métodos para usar tales células manipuladas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos de módulos suicidas

Campo técnico

La presente invención se refiere a proteínas transmembrana quiméricas que comprenden uno o más módulos suicidas, en los que el módulo suicida comprende un dominio de unión a ligando seleccionado del grupo que consiste en un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, una porción de un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, un mimótopo de un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, y combinaciones de los mismos; y, un dominio transmembrana, células manipuladas que comprenden dichas proteínas transmembrana quiméricas, ligandos de anticuerpos para su uso en el tratamiento de los efectos de la EICH, el rechazo del huésped contra el injerto, el síndrome de liberación de citoquinas (CRS), la tormenta de citoquinas, y la reducción de las transformaciones oncogénicas de las células genéticamente modificadas administradas, así como un procedimiento de fabricación de una célula modificada para mejorar las toxicidades asociadas a las células que pueden ocurrir con las terapias celulares autólogas y alogénicas. Más concretamente, la presente invención se refiere a proteínas transmembrana quiméricas que comprenden módulos suicidas para tratar y/o prevenir la Enfermedad de Injerto contra Huésped y otros efectos secundarios indeseables de las terapias celulares, tales como el síndrome de liberación de citoquinas (CRS) y la neurotoxicidad.

Antecedentes

Las terapias de terapia celular adoptiva (ACT) y de trasplante de células madre (SCT) utilizan potentes células inmunitarias nativas o modificadas para tratar enfermedades tales como el cáncer. Estos tratamientos utilizan células de un paciente específico devueltas a ese paciente (terapia celular autóloga) o células de un tercer donante (terapia celular alogénica) para tratar al paciente.

Las terapias celulares alogénicas, tales como los trasplantes de médula ósea, los trasplantes de células madre, las terapias de células T alogénicas y las terapias de células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) alogénicos, se están convirtiendo rápidamente en tratamientos de vanguardia. Las terapias alogénicas tienen varias ventajas sobre las autólogas, tales como la posibilidad de administrar un mayor número de células, así como la administración de células más sanas y no agotadas. Sin embargo, las células de los donantes tienen serios inconvenientes. Por ejemplo, los pacientes que reciben trasplantes celulares alogénicos pueden sufrir la Enfermedad de Injerto contra Huésped (GvHD), que puede ser mortal. La GvHD está causada por genes únicos y polimorfos del antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I presentes en cada individuo. Estos genes son reconocidos por los receptores de células T (TCR). Normalmente, cuando los genes HLA y los receptores de células T están perfectamente emparejados, existe autotolerancia inmunológica y no se produce la mortandad de las células. Por el contrario, la GvHD puede producirse cuando el donante y el receptor no son compatibles por sus genes HLA de clase I. En este caso, las células inmunitarias del donante atacan a las del receptor.

Para prevenir la GvHD en los trasplantes celulares alogénicos, el locus del receptor de células T a constante (TRAC) que codifica la porción del receptor de células T que reconoce los genes HLA de clase I extraños puede interrumpirse utilizando varios procedimientos de edición de genes.

Del mismo modo, las células inmunitarias del paciente pueden atacar a las células alogénicas injertadas con MHC no coincidente y causarles mortandad. Esto se denomina "rechazo del Huésped contra el Injerto" Por lo tanto, la terapia puede fracasar porque el número de células injertadas puede reducirse gravemente por debajo de los niveles eficaces. Para prevenir el rechazo del huésped contra el injerto, el locus de la microglobulina p2 (B2M, beta-2 microglobulina) que codifica una proteína esencial en las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I en las células del donante puede ser interrumpido utilizando procedimientos de edición de genes con el fin de evitar la presentación de estas moléculas en la superficie de las células del trasplante y así prevenir el rechazo del injerto. Véase, por ejemplo, Gornalusse et al., Nat. Biotechnol. (2017) 35:765-772. Sin embargo, la alteración de la B2M hace que el trasplante de células adoptivas sea vulnerable a la mortandad por parte de las células asesinas naturales (NK) del huésped. Por lo general, las células están protegidas de la mortandad mediada por las células NK mediante la presentación de HLA-E (una molécula MHC de clase I) complejada con un péptido en la superficie celular. Sin embargo, HLA-E también forma un complejo con B2M para presentarse en la superficie celular. Para evitar la mortandad del injerto alogénico mediada por las células NK del huésped, pueden introducirse fusiones B2M/HLA-E de cadena única en las células alogénicas mediante un vector, o integrarse en el locus B2M endógeno, lo que da lugar a células deficientes en MHC de clase I que sólo presentan HLA-E en la superficie celular. Sin embargo, dado que estas células son ahora inmunes a la mortandad por parte del sistema inmunitario del receptor, pueden producirse otros efectos secundarios problemáticos de la terapia, tal como la GvHD residual, el síndrome de liberación de citoquinas (SRC), la tormenta de citoquinas, la neurotoxicidad o las transformaciones oncogénicas del injerto.

Para causar mortandad a las células injertadas a voluntad, se pueden diseñar interruptores suicidas, o módulos de agotamiento celular, en las células. Estos interruptores pueden ser activados por anticuerpos o pequeñas moléculas. Se han desarrollado varios de estos interruptores, incluyendo módulos de interruptores de mortandad independientes y módulos de interruptores de mortandad acoplados a un casete de expresión CAR o al propio CAR. Véase, por ejemplo, Li et al., Protein Cell (2017) 8:573-589 Valton et al., Scientific Reports (2018) 8:8972. Uno de estos interruptores suicidas se basa en un mimótopo de CD20, una proteína de las células B que puede ser objeto del fármaco rituximab (Rituxan®, Genentech, South San Francisco, CA), un anticuerpo que se dirige a CD20. Este módulo suicida puede incorporarse a una proteína, tal como RQR8 (Philip et al., Blood (2014) 124:1277-1287 Quasim et al., Science Translational Medicine (2017) 9:374o en una constructo Ca r (Valton et al., Scientific Reports (2018) 8:8972). Sin embargo, este módulo hace que las células portadoras de CAR sean vulnerables a la mortandad por rituximab, que se utiliza ampliamente en la terapia y, por lo tanto, es inadecuado en los pacientes sometidos a tratamiento con rituximab. El documento wO2016090320 describe un CAR que comprende un interruptor suicida con base en caspasa-9. Dichos CAR pueden ser proteínas transmembrana. El documentoWO2017181119 divulga un CAR transmembrana dirigido contra BCMA, cuyo CAR comprende también un interruptor suicida con base en la caspasa-9.

Además, un número significativo de células puede perder la expresión del interruptor suicida y seguir conservando el CAR en sistemas desacoplados. Además, en los sistemas acoplados, algunas constructos CAR pueden no ser modificables para la adición de módulos de interruptor suicida y pueden no conservar la actividad CAR.

Por lo tanto, se necesitan nuevos diseños de módulos suicidas para mejorar los efectos secundarios asociados con las terapias celulares adoptivas.

Sumario

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se refiere a las proteínas transmembrana quiméricas que comprenden módulos suicidas y al uso de dichas proteínas para tratar y/o prevenir la Enfermedad de Injerto contra Huésped, el rechazo de Huésped contra Injerto y otras toxicidades celulares indeseables y efectos secundarios de las terapias celulares alogénicas. Las proteínas transmembrana quiméricas, las células modificadas, los ligandos y los procedimientos descritos en el presente documento pueden utilizarse para proporcionar tratamientos más eficaces, tales como en las aplicaciones de terapia celular, con menos efectos secundarios perjudiciales.

En un aspecto, se proporciona una proteína transmembrana quimérica. La proteína transmembrana quimérica comprende uno o más módulos suicidas, en los que el módulo suicida comprende un dominio de unión a ligando, y en los que el dominio de unión a ligando se selecciona del grupo un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, una porción del dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, un mimótopo de un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, y combinaciones de los mismos; y un dominio transmembrana. En ciertas realizaciones, el dominio de unión al ligando comprende los aminoácidos 6 a 41 de la SEQ ID NO:3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3, y en la que el dominio de unión al ligando retiene la actividad de unión al ligando.

En otras realizaciones, la proteína transmembrana quimérica comprende además un dominio de membrana intracelular del antígeno de maduración de células B o un fragmento del mismo. En ciertas realizaciones, el dominio de membrana intracelular del antígeno de maduración de células B o un fragmento del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 por ciento de identidad de secuencia con SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:4.

En otra realización, la proteína transmembrana quimérica comprende un dominio transmembrana CD8.

En otras realizaciones, la proteína transmembrana quimérica comprende una secuencia enlazadora que une el dominio de unión al ligando con el dominio transmembrana.

En otras realizaciones, la secuencia enlazadora se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27.

En otras realizaciones, la proteína transmembrana quimérica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 y SEQ ID NO:51.

En otras realizaciones, la proteína transmembrana quimérica comprende además un receptor de antígeno quimérico, en el que el receptor de antígeno quimérico comprende un fragmento variable de inmunoglobulina de cadena única y un dominio de señalización del receptor de antígeno quimérico.

En otras realizaciones, el módulo suicida está situado entre el fragmento variable de inmunoglobulina de cadena única y el dominio de señalización del receptor de antígeno quimérico.

En otras realizaciones, el módulo suicida está situado en el terminal N del fragmento variable de inmunoglobulina de cadena única y del dominio de señalización del receptor de antígeno quimérico.

En otras realizaciones, el fragmento variable de inmunoglobulina de cadena única comprende un fragmento variable de inmunoglobulina de cadena única anti-CD 19.

En otras realizaciones, un péptido de autodestrucción se sitúa entre el módulo suicida y el receptor de antígeno quimérico.

En otro aspecto, se proporciona una célula modificada que comprende la proteína transmembrana quimérica. En ciertas realizaciones, la célula manipulada es una célula T CAR.

En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para causar mortandad selectivamente de la célula manipulada. El procedimiento comprende la entrega a la célula manipulada de un ligando capaz de unirse al dominio de unión del ligando, lo que provoca la muerte de la célula. En una realización adicional, el ligando es un anticuerpo capaz de unirse al dominio de unión al ligando.

En otras realizaciones, el anticuerpo se conjuga con una molécula citotóxica, y la molécula conjugada anticuerpocitotóxica se selecciona del grupo que consiste en GSK2857916, MEDI2228, AMG 224 y HDP-101.

Estos aspectos y otras realizaciones de la presente invención se les ocurrirán fácilmente a aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica a la vista de la divulgación del presente documento.

Breve Descripción de las Figuras

Las figuras que no corresponden a las reivindicaciones adjuntas se presentan únicamente a título ilustrativo. La FIG. 1A ilustra un CAR ejemplar. Las FIGS. 1B-1F ilustran constructos CAR ejemplares que comprenden módulos suicidas (SM) de la presente invención.

La FIG. 2A ilustra una proteína de fusión de beta-2 microglobulina (B2M) y antígeno de histocompatibilidad de clase I de cadena alfa E (HLA-E). Las FIGS. 2B-2F ilustran constructos ejemplares con base en B2M/HLA-E que comprenden módulos suicidas (SM) de la presente invención.

Las FIGS. 3A-3F ilustran módulos suicidas ejemplares con base en BCMA de la presente invención.

Descripción Detallada de la Invención

La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente determinadas realizaciones. Tal y como se utiliza en la presente Memoria Descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula T" incluye una población de una o más células T, y similares.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque en la práctica de la presente invención pueden utilizarse otros procedimientos y materiales similares, o equivalentes, a los descritos en el presente documento, los materiales y procedimientos preferidos se describen en el presente documento.

En vista de las enseñanzas de la presente Memoria Descriptiva, una persona con conocimientos ordinarios en la técnica puede aplicar técnicas convencionales de inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, genómica y polinucleótidos recombinantes, como se enseña, por ejemplo, en los siguientes textos estándar: Antibodies: A Laboratory Manual, Second edition, E. A. Greenfield, 2014, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-1-936113-81-1 Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6a edición, R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell, ISBN 978-0-470-52812-9 Transgenic Animal Technology, tercera edición: A Laboratory Handbook, 2014, C. A. Pinkert, Elsevier, ISBN 978-0124104907; The Laboratory Mouse, segunda edición, 2012, H. Hedrich, Academic Press, ISBN 978-0123820082; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2013, R. Behringer, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ⁱS^bN 978-1936113019 P^cR 2: A Practical Approach, 1995, M. J. McPherson, et al., |Rl Press, ISBN 978-0199634248; Methods in Molecular Biology (Series), J.M. Walker, ISSN 1064-3745, Humana Press ARN: A Laboratory Manual, 2010, D. C. Rio , et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-0879698911; Methods in Enzymology (Series), Academic Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (cuarta edición), 2012, M. R. Green, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-1605500560 Bioconjugate Techniques, Third Edition, 2013, G. T. Hermanson, Academic Press, ISBN 978 0123822390 Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, 1997, W. V. Dashek, CRC Press, ISBN 978 0849394805.

Definiciones

Los términos "módulo suicida", "interruptor suicida" e "interruptor de seguridad" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una molécula, tal como un polipéptido que comprende un dominio de unión al ligando que permite la destrucción selectiva de las células transferidas adoptivamente. Por ejemplo, una célula adoptiva puede ser modificada genéticamente para incluir uno o más módulos suicidas que provoquen la muerte de la célula cuando se exponga a condiciones seleccionadas. Se conocen varios tipos de módulos suicidas e incluyen módulos suicidas que se activan por condiciones metabólicas; módulos que se inducen por dimerización; y módulos que se activan por anticuerpos monoclonales seleccionados. En algunas realizaciones, un módulo suicida comprende al menos un dominio de unión al ligando, así como un dominio transmembrana que ancla el dominio de unión al ligando a la membrana celular. Dichos módulos suicidas se describen en detalle en el presente documento. Un "gen suicida" codifica una proteína que posee una capacidad inducible para provocar la muerte celular y puede incorporarse a una constructo polinucleotídica para producir un módulo suicida.

Por "dominio de unión al ligando", en el contexto de un módulo suicida, se entiende un péptido presentado en la superficie de una célula adoptiva que es capaz de unir selectivamente un ligando afín, tal como un anticuerpo o un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC), en el que cuando el anticuerpo o el ADC se unen al dominio de unión al ligando, se produce la muerte de la célula adoptiva. Por lo tanto, un epítopo es un tipo de dominio de unión al ligando y se describe más adelante en el presente documento.

Por "ligando" se entiende una molécula capaz de unirse a un dominio de unión de ligando. Los ligandos son un ligando que puede unirse a un determinado dominio de unión del ligando que tiene actividad de unión para ese dominio. Un ligando suele tener una afinidad con el dominio de unión del ligando. Las afinidades de los ligandos por los dominios de unión de ligandos pueden ser de baja, media o alta afinidad. Las afinidades de los ligandos por los dominios de unión de los ligandos pueden medirse, por ejemplo, con la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), la clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS), la resonancia de plasmón superficial (SPR), la resonancia magnética nuclear (RMN) y otras técnicas conocidas.

Por "célula adoptiva" se entiende una célula que puede ser modificada genéticamente para su uso en un tratamiento de terapia celular, tal como para tratar el cáncer y/o prevenir la GvHD y otros efectos secundarios indeseables de las terapias celulares, tales como, pero no limitados a, la tormenta de citoquinas, las transformaciones oncogénicas del material genéticamente modificado administrado, los trastornos neurológicos, y similares. Las células adoptivas incluyen, entre otras, las células madre, las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), las células madre de la sangre del cordón umbilical, los linfocitos, los macrófagos, los glóbulos rojos, los fibroblastos, las células endoteliales, las células epiteliales y las células precursoras del páncreas.

Por "terapia celular" se entiende el tratamiento de una enfermedad o trastorno que utiliza células modificadas genéticamente. Las modificaciones genéticas pueden introducirse utilizando los procedimientos descritos en el presente documento, tales como los procedimientos que comprenden vectores virales, nucleofección, entrega de pistolas de genes, sonoporación, exprimido de células, lipofección, o el uso de otros productos químicos, péptidos que penetran en las células, y similares.

Por "terapia celular adoptiva" o "ACT" se entiende una terapia que utiliza células adoptivas modificadas genéticamente derivadas de un paciente específico devueltas a ese paciente (terapia celular autóloga) o de un tercero donante (terapia celular alogénica), para tratar al paciente. Los ACT incluyen, entre otros, los trasplantes de médula ósea, los trasplantes de células madre, las terapias con células T, las terapias con células T CAR y las terapias con células asesinas naturales (NK).

Por "linfocito" se entiende un leucocito (glóbulo blanco) que forma parte del sistema inmunitario de los vertebrados. El término "linfocito" también engloba a las células madre hematopoyéticas que dan lugar a las células linfoides. Los linfocitos incluyen células T para la inmunidad adaptativa citotóxica mediada por células, tal como las células T citotóxicas CD4+ y/o CD8+; células T alfa/beta y células T gamma/delta; células T reguladoras, tales como las células Treg; células NK que funcionan en la inmunidad innata citotóxica mediada por células; células B, para la inmunidad adaptativa humoral impulsada por anticuerpos; células NK/T; células asesinas inducidas por citocinas (células CIK); y células presentadoras de antígenos (APC), tales como las células dendríticas. Un linfocito puede ser una célula de mamífero, tal como una célula humana.

El término "linfocito" también abarca las células T y las células NK modificadas genéticamente para producir receptores antigénicos quiméricos (CAR) en la superficie de las células T o NK (células T CAR y células CAR-NK). Estas células T CAR reconocen antígenos solubles específicos o antígenos en la superficie de una célula objetivo, tal como la superficie de una célula tumoral, o en células del microambiente tumoral. Un CAR puede comprender uno o más dominios de unión al ligando extracelular, una región bisagra, una región transmembrana y una región de señalización intracelular. El dominio de unión del ligando extracelular comprende típicamente un fragmento variable de inmunoglobulina de cadena única, (scFv) u otro dominio de unión del ligando, tal como un ligando proteico natural. La región bisagra generalmente comprende una bisagra polipeptídica de longitud variable tal como uno o más aminoácidos, una región CD8 alfa o una región IgG4 (u otras), y combinaciones de las mismas. El dominio transmembrana suele contener una región transmembrana derivada de CD8 alfa, CD28 u otras proteínas transmembrana tales como DAP10, DAP12 o NKG2D, y combinaciones de las mismas. El dominio de señalización intracelular consiste en uno o más dominios de señalización intracelular tal como CD28, 4-1BB, CD3 zeta, OX40, 2B4, u otros dominios de señalización intracelular, y combinaciones de los mismos. Cuando el dominio de unión del ligando extracelular se une a un ligando afín, el dominio de señalización intracelular del CAR activa el linfocito. Véase, por ejemplo, Brudno et al., Nature Rev. Clin. Oncol. (2018) 15:31-46 Maude et al., N. Engl. J. Med. (2014) 371:1507-1517 Sadelain et al., Cancer Disc. (2013) 3:388-398 (2018) Patente de EE.UU. Nos. 7.446.190 y EE.UU.

8.399.645 para las descripciones de las células T CAR, los procedimientos de fabricación de las mismas y usos de los mismos. Para ver objetivos celulares ejemplares y las proteínas de unión a scFvs CAR que se dirigen a los objetivos celulares ejemplares, véase la Tabla 1.

Tabla 1: Lista de objetivos celulares ejemplares y proteínas de unión a scFv CAR que se dirigen a los objetivos celulares eem lares

También se incluyen en el término "linfocito", tal como se utiliza en el presente documento, las células T diseñadas con receptores de células T (TCR), modificadas genéticamente para expresar uno o más receptores de células T específicos, naturales o diseñados, que pueden reconocer antígenos proteicos o (glico)lipídicos de las células objetivo presentados por el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). Pequeños fragmentos de estos antígenos, tales como péptidos o ácidos grasos, se trasladan a la superficie de la célula objetivo y se presentan a los receptores de las células T como parte del MHC. La unión del receptor de la célula T a los MHC cargados de antígeno activa el linfocito.

Los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) también se engloban en el término "linfocito", tal y como se utiliza en el presente documento. Las TIL son células inmunitarias que han penetrado en el entorno de un tumor y sus alrededores ("el microentorno tumoral"). Los TIL se aíslan típicamente de las células tumorales y del microambiente del tumor y se seleccionan in vitro por su alta reactividad contra los antígenos tumorales. Las TIL se cultivan in vitro bajo condiciones que superan las influencias tolerantes que existen in vivo y luego se introducen en un sujeto para su tratamiento.

Los CAR también pueden incorporarse a los TIL, células NK o TCR, dando lugar a los CAR-TIL, células CAR-NK o células T CAR modificadas con TCR.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "célula madre" se refiere a una célula que tiene la capacidad de autorrenovación, es decir, la capacidad de pasar por numerosos ciclos de división celular manteniendo el estado indiferenciado. Las células madre pueden ser totipotentes, pluripotentes, multipotentes, oligopotentes o unipotentes. Las células madre son embrionarias, fetales, amnióticas, adultas o pluripotentes inducidas.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "células madre pluripotentes inducidas" o las iPSC, se refiere a un tipo de célula madre pluripotente que se deriva artificialmente de una célula no pluripotente, típicamente una célula somática adulta, induciendo la expresión de genes específicos.

Tal como se utiliza aquí, "célula madre hematopoyética" se refiere a una célula indiferenciada que tiene la capacidad de diferenciarse en una célula hematopoyética, tal como un linfocito.

Los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier miembro del filo Chordata, incluyendo, sin limitación, a los seres humanos y otros primates, incluyendo los primates no humanos tal como los macacos rhesus, los chimpancés y otras especies de monos y simios; los animales de granja, tal como el ganado vacuno, las ovejas, los cerdos, las cabras y los caballos; los mamíferos domésticos, tales como los perros y los gatos; los animales de laboratorio, tal como los conejos, los ratones, las ratas y los conejillos de Indias; las aves, incluyendo las domésticas, las silvestres y las de caza, tales como las gallinas, los pavos y otras gallináceas, los patos y los gansos; y similares. El término no denota una edad o un género en particular. Así, el término incluye a individuos adultos, jóvenes y recién nacidos, así como a machos y hembras. En algunas realizaciones, una célula huésped se deriva de un sujeto (por ejemplo, linfocitos, células madre, células progenitoras o células específicas de un tejido). En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto no humano.

Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición o agente, tal como una célula adoptiva modificada genéticamente como se proporciona en el presente documento, se refieren a una cantidad suficiente de la composición o agente para proporcionar la respuesta deseada, tal como para prevenir o eliminar uno o más efectos secundarios perjudiciales asociados con las terapias celulares adoptivas alogénicas. Dichas respuestas dependerán de la enfermedad concreta de que se trate. Por ejemplo, en un paciente que está siendo tratado por cáncer utilizando una terapia celular adoptiva, una respuesta deseada incluye, pero no se limita a, el tratamiento o la prevención de los efectos de la GvHD, el rechazo del Huésped contra el Injerto, el síndrome de liberación de citoquinas (CRS), la tormenta de citoquinas, y la reducción de las transformaciones oncogénicas de las células genéticamente modificadas administradas. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la afección que se esté tratando y el linfocito modificado concreto que se utilice, el modo de administración, etc. Una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto en la técnica utilizando la experimentación rutinaria.

El "tratamiento" o "tratar" una enfermedad particular, tal como condición cancerosa, o enfermedad de Injerto contra Huésped, incluye: prevenir la enfermedad, por ejemplo, prevenir el desarrollo de la enfermedad o hacer que la enfermedad ocurra con menos intensidad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no experimenta o muestra síntomas de la enfermedad; inhibir la enfermedad, por ejemplo, reducir la tasa de desarrollo, detener el desarrollo o revertir el estado de la enfermedad; y/o aliviar los síntomas de la enfermedad, por ejemplo, disminuir el número de síntomas experimentados por el sujeto.

Los términos "modificado", "ingeniería genética", "modificado genéticamente", "recombinante", "modificado" y "de origen no natural" indican la manipulación humana intencionada del genoma de un organismo o célula. Los términos abarcan los procedimientos de modificación genómica que incluyen la edición genómica, tal como se define en el presente documento, así como las técnicas que alteran la expresión o inactivación de los genes, la ingeniería enzimática, la evolución dirigida, el diseño basado en el conocimiento, los procedimientos de mutagénesis aleatoria, el barajado de genes, la optimización de codones y similares. Los procedimientos de ingeniería genética son conocidos en la técnica.

Por "edición de genes" o "edición del genoma", tal y como se utiliza en el presente documento, se entiende un tipo de ingeniería genética que da lugar a una modificación genética, tal como la inserción, la supresión o la sustitución de una secuencia de nucleótidos, o incluso de una sola base, en un sitio específico del genoma de una célula. Los términos incluyen, sin limitación, la expresión génica heteróloga, la inserción o deleción de genes o promotores, la mutación de ácidos nucleicos y una modificación genética disruptiva, como se define en el presente documento.

Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" son intercambiables y se refieren a polímeros de aminoácidos. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos naturales y sintéticos (no naturales), incluyendo las variantes de aminoácidos, los aminoácidos modificados, los peptidomiméticos, la glicina y los isómeros ópticos D o L. Un polipéptido puede tener cualquier longitud. Puede ser ramificado o lineal, puede estar interrumpido por no aminoácidos y puede comprender aminoácidos modificados. Los términos pueden utilizarse para referirse a un polímero de aminoácidos que ha sido modificado mediante, por ejemplo, acetilación, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, fosforilación, entrecruzamiento y/o conjugación (por ejemplo, con un componente de etiquetado o ligando). Las secuencias polipeptídicas se muestran en el presente documento en la orientación convencional de terminal N a terminal C.

No es necesario que el polipéptido incluya la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la molécula de referencia, sino que puede incluir sólo la parte de la molécula que sea necesaria para que el polipéptido funcione según lo previsto, por ejemplo, para unirse a un anticuerpo afín. Así, sólo es necesario que haya uno o pocos epítopos de la molécula de referencia. Además, el polipéptido puede comprender una proteína de fusión entre la molécula de referencia de longitud completa o un fragmento de la molécula de referencia y otra proteína que no altere la reactividad prevista, por ejemplo, del módulo suicida. Por lo tanto, es evidente que el polipéptido puede comprender la secuencia completa, fragmentos, secuencias truncadas y parciales, así como variantes y formas precursoras de la molécula de referencia. El término también se refiere a las supresiones, adiciones y sustituciones de la secuencia de referencia, siempre que el polipéptido conserve la inmunorreactividad.

Por lo tanto, las proteínas de longitud completa y fragmentos de los mismos, así como las proteínas con modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (ya sea de naturaleza conservadora o no conservadora), a la secuencia nativa, están destinadas a ser utilizadas en el presente documento, siempre y cuando la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de la mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de los anfitriones, que producen las proteínas o errores debido a la amplificación de la PCR. En consecuencia, se contempla en el presente documento el uso de proteínas activas sustancialmente homólogas a la secuencia madre, por ejemplo, proteínas con una identidad del 70...80...85...90...95...98...99 %, etc., que conservan la actividad deseada.

La identidad de secuencia entre dos secuencias polinucleotídicas o dos secuencias polipeptídicas se calcula generalmente utilizando los parámetros estándar por defecto de los diversos procedimientos o programas informáticos. Un alto grado de identidad de secuencia, tal y como se utiliza en el presente documento, entre dos polinucleótidos o dos polipéptidos está típicamente entre 90 % de identidad y 100 % de identidad, por ejemplo, 90 % de identidad o más, preferiblemente 95 % de identidad o más, más preferiblemente 98 % de identidad o más. Un grado moderado de identidad de secuencia, tal y como se utiliza en el presente documento, entre dos polinucleótidos o dos polipéptidos suele estar comprendido entre aproximadamente 80 % de identidad a aproximadamente 89 % de identidad, por ejemplo, aproximadamente 80 % de identidad o más, preferiblemente aproximadamente 85 % de identidad. Un grado bajo de identidad de secuencia, tal como se utiliza en el presente documento, entre dos polinucleótidos o dos polipéptidos se sitúa típicamente entre aproximadamente 50 % de identidad a aproximadamente 79 % de identidad, por ejemplo, aproximadamente 50 % de identidad, preferiblemente aproximadamente 60 % de identidad, más preferiblemente aproximadamente 75 % de identidad. Por ejemplo, un dominio de unión al ligando (por ejemplo, un dominio BCMA que comprende sustituciones de aminoácidos) puede tener un bajo grado de identidad de secuencia, un grado moderado de identidad de secuencia o un alto grado de identidad de secuencia, a lo largo de su longitud, con una proteína BCMA de referencia (por ejemplo, una BCMA de tipo silvestre).

El término "variante" se refiere a los derivados de la molécula de referencia que conservan la actividad deseada, o a los fragmentos de dichos derivados que conservan la actividad, como se ha descrito anteriormente. En general, el término "variante" se refiere a compuestos que tienen una secuencia y estructura polipeptídica nativa con una o más adiciones, sustituciones y/o supresiones de aminoácidos, en relación con la molécula nativa. Los análogos particularmente preferidos incluyen sustituciones que son de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. En concreto, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (a) ácidos -- aspartato y glutamato; (b) básicos -- lisina, arginina, histidina; (c) no polares -- alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (d) polares sin carga -- glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, de un aspartato por un glutamato, de una treonina por una serina, o una sustitución conservadora similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto importante en la actividad biológica. El polipéptido de interés puede incluir hasta aproximadamente 5-10 sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o incluso hasta aproximadamente 15-25 o 50 sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o cualquier número entre 5-50, siempre que la función deseada de la molécula permanezca intacta.

Los polipéptidos y polinucleótidos descritos en el presente documento pueden fabricarse utilizando técnicas rutinarias en el campo de la biología molecular (véanse, por ejemplo, los textos estándar comentados anteriormente). Además, se puede pedir a medida cualquier polipéptido o polinucleótido de fuentes comerciales.

Por "epítopo" se entiende un sitio en una molécula al que responden células B y células T específicas. Un epítopo puede comprender 3 o más aminoácidos en una conformación espacial única para el epítopo. Por lo general, un epítopo consiste en al menos 5 aminoácidos de este tipo y, más habitualmente, de al menos 8-10 aminoácidos. Los procedimientos para determinar la conformación espacial de los aminoácidos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Además, la identificación de epítopos en una proteína determinada se realiza fácilmente mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tal como el uso de estudios de hidrofobicidad y la serología dirigida al sitio.

Un "mimótopo" es una macromolécula, tal como un péptido, que imita la estructura de un epítopo. Debido a esta propiedad, puede provocar una respuesta de anticuerpos similar a la provocada por el epítopo. Un anticuerpo para un determinado antígeno epitópico reconocerá un mimotopo que imita ese epítopo. Los mimotopos se obtienen comúnmente a partir de bibliotecas de visualización de fagos mediante biopaneo.

Un "anticuerpo" es una molécula que "reconoce", es decir, se une específicamente a un epítopo de interés presente en un polipéptido, tal como un dominio de unión a un ligando. Por "se une específicamente" se entiende que el anticuerpo interactúa con el epítopo en una interacción del tipo "cerradura y llave" para formar un complejo entre el antígeno y el anticuerpo. El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, incluye los anticuerpos obtenidos a partir de preparaciones monoclonales, así como, los siguientes moléculas de anticuerpos híbridos (quiméricos); fragmentos F(ab')2 y F(ab); moléculas Fv (heterodímeros no covalentes; moléculas Fv de cadena única (scFv); constructos de fragmentos de anticuerpos diméricos y triméricos; minicuerpos; moléculas de anticuerpos humanizados; anticuerpos de cadena única; nanocuerpos cameloides; y cualquier fragmento funcional obtenido a partir de dichas moléculas, en los que dichos fragmentos conservan las propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo madre. Los anticuerpos pueden proceder de diferentes especies, tal como el ser humano, el ratón, la rata, el conejo, el camello, el pollo, etc. Los anticuerpos y las partes de anticuerpos pueden obtenerse posteriormente mediante técnicas in vitro, como la visualización de fagos y la visualización de levaduras. Los anticuerpos totalmente humanizados pueden obtenerse a partir de plasma humano, clonación de células B humanas, ratón, rata, conejo, pollo, etc., que tienen un repertorio de células B humanizado diseñado. A continuación, los anticuerpos pueden modificarse aún más mediante la maduración por afinidad y otros procedimientos, tal como la afucosilación o la ingeniería Fc de las IgG.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población de anticuerpos homogénea. El término no está limitado en cuanto a la especie o la fuente del anticuerpo, ni pretende estarlo por la forma en que se fabrica. El término abarca inmunoglobulinas enteras, así como fragmentos como Fab, F(ab')², Fv y otros fragmentos, así como poblaciones de anticuerpos quiméricos y humanizados homogéneos, que presentan propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo monoclonal madre.

La "citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC)", también denominada "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos", se refiere a un mecanismo por el que una célula efectora del sistema inmunitario genera lisis activamente de una célula objetivo, como una célula adoptiva, cuando un dominio de unión al ligando de la superficie de la membrana ha sido unido por un anticuerpo específico. Las células efectoras suelen ser células asesinas naturales (NK). Sin embargo, los macrófagos, neutrófilos y eosinófilos también pueden mediar la ADCC. La ADCC es independiente de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), que también genera lisis de los objeticos dañando las membranas sin la participación de anticuerpos o células del sistema inmunitario.

Por un "conjugado anticuerpo-fármaco (ADC)" se entiende un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal, conjugado con una molécula o un fármaco biológicamente activo, típicamente por un enlazador químico con enlaces lábiles. Combinando la orientación única de un anticuerpo monoclonal con un fármaco citotóxico, los ADC pueden dirigirse selectivamente a las células adoptivas que incluyen un dominio de unión al ligando que interactúa con la porción del anticuerpo del ADC. Tras la unión del ligando por el dominio de unión al ligando, la célula adoptiva absorbe o internaliza el anticuerpo junto con la citotoxina. Tras la internalización del ADC, el fármaco citotóxico se libera y causa mortandad a la célula.

Los términos "proteína de fusión" y "proteína quimérica", tal y como se utilizan en el presente documento, se refieren a una única proteína creada mediante la unión de dos o más proteínas, dominios de proteínas o fragmentos de proteínas que no se encuentran juntos de forma natural en una única proteína. Las proteínas quiméricas pueden comprender las secuencias de longitud completa de las proteínas de origen, una o más secuencias parciales de las proteínas de origen, una o más duplicaciones de secuencias de proteínas de origen, y cualquier combinación de las mismas. Algunas proteínas quiméricas pueden ser híbridos de proteínas o fragmentos de proteínas de tipo silvestre con secuencias polipeptídicas artificiales. Algunas proteínas quiméricas pueden comprender secuencias enlazadoras artificiales. Algunas proteínas quiméricas pueden comprender un dominio extracelular (ECD) de una proteína, un dominio transmembrana (TM) de una segunda proteína y un dominio intracelular (ICD) de una tercera proteína. Ejemplos conocidos de proteínas quiméricas artificiales son los receptores antigénicos quiméricos (CAR), las fusiones B2M/HLA-E de cadena única. Las proteínas quiméricas pueden tener uno o más dominios transmembrana de una o más proteínas de origen.

El término "dominio transmembrana", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un dominio proteico que es típicamente hidrófobo y está incrustado en una membrana celular. Los dominios transmembrana pueden predecirse mediante programas bioinformáticos (por ejemplo, Expasy, World Wide Web: Expasy.org). Los dominios transmembrana pueden estar formados por hélices alfa o por barriles beta. Las proteínas que contienen un único dominio transmembrana se denominan de Tipo I, II, III y IV en función de la topología de los extremos N y C en los dos lados de la bicapa lipídica. Las "proteínas transmembrana quiméricas", tal como se utilizan en el presente documento, son proteínas de fusión que comprenden uno o más dominios transmembrana y uno o más módulos suicidas.

Algunas proteínas quiméricas pueden comprender un péptido de autodestrucción, tal como un péptido 2A. Después de que el péptido autocierre se somete a la escisión, partes de la proteína quimérica pueden ser liberadas de la proteína quimérica.

Tal y como se utiliza en el presente documento, los "péptidos de autodestrucción" son secuencias polipeptídicas cortas que se escinden después de la traducción por un ribosoma. Los péptidos autolimpiantes comprenden péptidos tales como P2A del teschovirus-1 porcino, E2A del virus A de la rinitis equina, F2A del virus 18 de la fiebre aftosa y T2A del virus Thosea asigna . Uno o más péptidos autodestructivos pueden fusionarse en terminal N, terminal C o internamente a otras proteínas o polipéptidos.

Tal y como se utiliza en el presente documento, los "dominios extracelulares" son dominios en proteínas de membrana que sobresalen del lado extracelular de una membrana celular. Los dominios extracelulares están conectados con uno o más dominios transmembrana. La conexión puede ser terminal N, terminal C o ambas. Los dominios extracelulares conectados terminalmente en N y Ca dos dominios transmembrana se denominan bucles extracelulares.

Tal y como se utiliza en el presente documento, los "dominios intracelulares" son dominios en proteínas de membrana que sobresalen del lado intracelular de una membrana celular. Los dominios intracelulares están conectados con uno o más dominios transmembrana. La conexión puede ser terminal N, terminal C o ambas. Los dominios intracelulares conectados terminalmente en N y C a dos dominios transmembrana se denominan bucles intracelulares.

Las proteínas de membrana pueden no tener ninguno, uno o más dominios intracelulares. Los dominios intracelulares pueden comprender dominios de unión a ligandos y de señalización.

Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos "ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos", "oligonucleótido" y "polinucleótido" son intercambiables. Todos se refieren a una forma polimérica de nucleótidos. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos (ADN) o ribonucleótidos (ARN), o análogos, y pueden tener cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden realizar cualquier función y pueden tener cualquier estructura secundaria y tridimensional. Los términos abarcan los análogos conocidos de los nucleótidos naturales y los nucleótidos que están modificados en la base, el azúcar y/o las fracciones de fosfato. Los análogos de un determinado nucleótido tienen la misma especificidad de emparejamiento de bases (por ejemplo, un análogo de A se empareja con T). Un polinucleótido puede comprender un nucleótido modificado o múltiples nucleótidos modificados. Los ejemplos de nucleótidos modificados incluyen nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. La estructura de los nucleótidos puede modificarse antes o después del ensamblaje del polímero. Tras la polimerización, los polinucleótidos pueden ser modificados adicionalmente mediante, por ejemplo, la conjugación con un componente de etiquetado o de unión al objetivo. Una secuencia de nucleótidos puede incorporar componentes no nucleótidos. Los términos también abarcan los ácidos nucleicos que comprenden residuos de la columna vertebral o enlaces modificados que son sintéticos, naturales y no naturales, y que tienen propiedades de unión similares a las de un polinucleótido de referencia (por ejemplo, ADN o ARN). Los ejemplos de tales análogos incluyen, pero no se limitan a, fosforotiatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, ribonucleótidos de 2-O-metilo, ácidos péptido-nucleicos (PNAs), y estructuras morfolinas.

Las secuencias de polinucleótidos se muestran en el presente documento en la orientación convencional de 5' a 3'.

Por el término "variante degenerada" se entiende un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia de ácido nucleico del mismo que codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el polinucleótido del que deriva la variante degenerada. Un ejemplo de variante degenerada es una secuencia de polinucleótidos que ha sido optimizada para su expresión en una célula huésped concreta.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "identidad de secuencia" se refiere generalmente al porcentaje de identidad de bases o aminoácidos determinado al comparar un primer polinucleótido o polipéptido con un segundo polinucleótido o polipéptido utilizando algoritmos que tienen diversos parámetros de ponderación. La identidad de secuencias entre dos polipéptidos o dos polinucleótidos puede determinarse mediante la alineación de secuencias por diversos procedimientos y programas informáticos (por ejemplo, BLAST, CS-BLAST, FASTA, HMMER, L-ALIGN, etc.), disponibles en la web mundial en sitios que incluyen GENBANK (ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) y EMBL-EBI (ebi.ac.uk.). La identidad de secuencia entre dos polinucleótidos o dos secuencias polipeptídicas se calcula generalmente utilizando los parámetros estándar por defecto de los distintos procedimientos o programas informáticos.

Por "vector" se entiende cualquier elemento genético, tal como un plásmido, un fago, un transposón, un cósmido, un cromosoma, un virus, un virión, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias genéticas a las células. Así, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales. Los vectores pueden ser lineales o circulares. Los vectores pueden integrarse en un genoma objetivo de una célula huésped o replicarse independientemente en una célula huésped. Los vectores pueden comprender, por ejemplo, un origen de replicación, un sitio de multiclonación y/o un marcador seleccionable. Un "vector de expresión" suele comprender un casete de expresión.

Por "vector recombinante" se entiende un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico heterólogo capaz de expresarse in vitro o in vivo. El término "heterólogo", en relación con las secuencias de ácidos nucleicos, tal como las secuencias codificadoras y las secuencias de control, denota secuencias que no están normalmente unidas entre sí, y/o que no están normalmente asociadas a una célula concreta. Así, una región "heteróloga" de una constructo de ácido nucleico o de un vector es un segmento de ácido nucleico dentro de otra molécula de ácido nucleico o unido a ella que no se encuentra asociado a la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una constructo de ácido nucleico puede incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias que no se encuentran asociadas a la secuencia codificante en la naturaleza. Otro ejemplo de secuencia codificante heteróloga es una constructo en la que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). Del mismo modo, una célula transformada con una constructo que no está normalmente presente en la célula se consideraría heteróloga a efectos del presente documento. La variación alélica o los eventos mutacionales que se producen de forma natural no dan lugar a un ADN heterólogo, tal y como se utiliza en el presente documento.

Por "virus recombinante" se entiende un virus que ha sido alterado genéticamente, por ejemplo, mediante la adición o inserción de un constructo de ácido nucleico heterólogo en la partícula.

La "transformación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento utilizado para la inserción. Por ejemplo, la transformación puede ser por captación directa, transfección, infección y similares. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un episoma, o, alternativamente, puede integrarse en el genoma del huésped.

Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada, o es capaz de transformarse, por una secuencia de ADN exógena. Una célula huésped puede proceder de cualquier organismo que tenga una o más células. Los ejemplos de células huésped incluyen, pero no se limitan a: una célula procariota, una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula arquea, una célula de un organismo eucariota unicelular, una célula de protozoo, una célula de una planta, una célula de alga, una célula de hongo (por ejemplo, una célula de levadura, una célula de un hongo), una célula animal, una célula de un animal invertebrado, una célula de un animal vertebrado tal como una célula de un mamífero (por ejemplo, un cerdo, una vaca, una cabra, una oveja, un roedor, una rata, un ratón, un primate no humano, un humano, etc.). Además, una célula huésped puede ser una célula madre o progenitora, y una célula inmunológica, tal como cualquiera de las células inmunológicas descritas en el presente documento.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "casete de expresión" o "constructo de expresión" es una constructo polinucleotídica, generada de forma recombinante o sintética, que comprende secuencias reguladoras unidas de forma operativa a un polinucleótido seleccionado para facilitar la expresión del polinucleótido seleccionado en una célula huésped. Por ejemplo, las secuencias reguladoras pueden facilitar la transcripción del polinucleótido seleccionado en una célula huésped, o la transcripción y traducción del polinucleótido seleccionado en una célula huésped. Un casete de expresión puede, por ejemplo, integrarse en el genoma de una célula huésped o estar presente en un vector de expresión.

Una "secuencia codificadora" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificadora están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' y un codón de parada de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar situada a 3' de la secuencia codificante.

Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos "secuencias reguladoras", "elementos reguladores" y "elementos de control" son intercambiables y se refieren a las secuencias de polinucleótidos que se encuentran corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro o corriente abajo (secuencias no traducidas 3') de un polinucleótido que debe expresarse. Las secuencias reguladoras influyen, por ejemplo, en el momento de la transcripción, la cantidad o el nivel de transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, y/o la traducción de la secuencia estructural de nucleótidos relacionada. Las secuencias reguladoras pueden incluir secuencias de unión a activadores, potenciadores, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, promotores, elementos IRES, secuencias de unión a represores, estructuras de bucle de tallo, secuencias de iniciación de la traducción, secuencias líderes de la traducción, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias de terminación de la traducción, sitios de unión a cebadores y similares.

El término "promotor" se utiliza en el presente documento en su sentido ordinario para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora corriente abajo (dirección 3'). Los promotores de transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (en los que la expresión de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), "promotores reprimibles" (en los que la expresión de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) y "promotores constitutivos"

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "operablemente enlazado" se refiere a secuencias de polinucleótidos o secuencias de aminoácidos colocadas en una relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor o potenciador está vinculado de forma operativa a una secuencia codificante si regula o contribuye a la modulación de la transcripción de la secuencia codificante. Las secuencias de ADN enlazadas operativamente que codifican secuencias reguladoras suelen ser contiguas a la secuencia codificante. Sin embargo, los potenciadores pueden funcionar cuando están separados de un promotor por hasta varias kilobases o más. En consecuencia, algunos elementos polinucleótidos pueden estar unidos de forma operativa pero no contiguos.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "expresión" se refiere a la transcripción de un polinucleótido a partir de una plantilla de ADN, dando lugar, por ejemplo, a un ARNm u otro transcrito de ARN (por ejemplo, no codificante, tal como los ARN estructurales o de andamiaje). El término se refiere además al procedimiento mediante el cual el ARNm transcrito se traduce en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan a veces colectivamente "producto génico" La expresión puede incluir el empalme del ARNm en una célula eucariota, si el polinucleótido se deriva del ADN genómico.

Por "aislado" se entiende, cuando se refiere a un polipéptido, que la molécula indicada está separada y discreta de todo el organismo con el que la molécula se encuentra en la naturaleza o está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico desprovista, en todo o en parte, de secuencias normalmente asociadas a ella en la naturaleza; o una secuencia, tal como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con ella; o una molécula disociada del cromosoma.

El término "purificado", tal y como se utiliza en el presente documento, significa preferentemente que está presente al menos 75 % en peso, más preferentemente al menos 85 % en peso, más preferentemente aún al menos 95 % en peso, y más preferentemente al menos 98 % en peso, de la misma molécula.

La presente divulgación está dirigida a las proteínas transmembrana quiméricas que comprenden módulos suicidas, así como a las células modificadas que comprenden estas proteínas transmembrana quiméricas y al uso de estos constructos y células modificadas para prevenir los efectos secundarios indeseables de las terapias celulares autólogas y alogénicas, tales como el síndrome de liberación de citoquinas (CRS), la neurotoxicidad y la enfermedad de Injerto contra Huésped (GvHD). Dado que las células manipuladas, tal como las células T, pueden expandirse y persistir durante años después de su administración, es deseable incluir un mecanismo de seguridad que permita el agotamiento selectivo de las células infundidas de forma adoptiva frente a la toxicidad. El uso de módulos suicidas permite la destrucción selectiva de las células transferidas adoptivamente y puede utilizarse para prevenir o detener las toxicidades inaceptables causadas por la terapia en cuestión. En presencia de una molécula que se une o reacciona de otro modo con un módulo suicida expresado en la superficie de una célula, puede producirse la mortandad de la célula, lo que puede evitar otros efectos secundarios no deseados y perjudiciales del tratamiento. Así, los módulos suicidas permiten la eliminación selectiva de las células diseñadas in vivo.

Los genes suicidas que codifican proteínas suicidas para su uso en constructos de módulos suicidas pueden clasificarse ampliamente en función de su mecanismo de acción. Algunos genes suicidas se clasifican como genes que codifican módulos metabólicos con base en pequeñas moléculas, tal como los que convierten un profármaco en un agente tóxico activo, lo que se conoce como terapia enzimática de profármacos dirigida por genes (GDEPT). Algunos ejemplos de estos módulos son los sistemas derivados de la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-tk). El gen tk es un gen suicida dependiente del ciclo celular que cataliza la generación del trifosfato ganciclovir (GCV), que es tóxico para las células en proliferación al inhibir la elongación de la cadena de ADN. Otros sistemas de este tipo se basan en la citosina deaminasa/5-fluorocitosina (CD/5-FC). La citosina desaminasa convierte el profármaco 5-fluorocitosina en el activo 5-fluorouracilo, que a su vez provoca la muerte celular.

Otros tipos de genes suicidas incluyen genes que codifican sustancias que se dimerizan y causan la muerte celular en presencia de ciertos agentes químicos. Algunos ejemplos son FAS inducible (iFAS) y la Caspasa 9 inducible (iCasp9) que se dimerizan en presencia de la sustancia química rimiducid o análogos de rimiducid.

Otra clase de genes suicidas incluye genes que codifican receptores de ligandos que comprenden dominios de unión a ligandos, por ejemplo, epítopos, que pueden ser unidos por anticuerpos, tales como, pero no limitados a, anticuerpos clínicamente aprobados que causan muerte celular por citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) después de unirse con el epítopo. Esta clase de genes incluye, sin limitación, genes que codifican dominios de unión a ligandos de marcadores expresados en la superficie celular, tales como, pero no limitados a, CD20 o mimotopos de CD20 (véase, por ejemplo, Valton et al., Scientific Reports (2018) 8:8972). CD20 es un marcador de la membrana de las células B al que se dirige el rituximab (Rituxan®, Genentech, South San Francisco, CA), un anticuerpo monoclonal que se utiliza para tratar varios trastornos, tales como la leucemia linfocítica crónica (LLC), el linfoma no Hodgkins (LNH), la artritis reumatoide (AR), la granulomatosis con poliangitis (GPA), las angitits microscópicas (MPA) y el pénfigo vulgar (PV). También son útiles los epítopos de CD19, un marcador de la membrana de las células B al que se dirige el blinatumomab (Blincyto®, Amgen, Thousand Oaks, CA), utilizado para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA); los epítopos de CD34 que pueden unirse a anticuerpos anti-CD34, tal como QBEND10 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA); así como combinaciones de los anteriores, tales como RQR8 que contiene epítopos objetivo tanto de CD34 como de CD20 (Philip et al., Blood (2014) 124:1277-1287). En el constructo R2R8, CD34 sirve como marcador para la selección y los epítopos CD20 se unen al rituximab para inducir ADCC y la CDC. También es útil un polipéptido humano derivado del EGFR, tal como un EGFR truncado (huEGFRt) (Wang et al., Blood (2011) 118:1255-1263). Los polipéptidos derivados del EGFR pueden ser reconocidos por el cetuximab (Erbitux®, Eli Lilly and Company, Indianápolis, IN).

Los genes que codifican dominios de unión a ligandos derivados del antígeno de maduración de células B (BCMA, también conocido como miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) 17 (TNFRSF17), se utilizan en los presentes constructos. BCMA es un receptor de superficie celular que se expresa en la superficie de los linfocitos B maduros, pero no en los linfocitos T ni en los monocitos. La proteína BCMA incluye un dominio extracelular (ECD), una región transmembrana (TM) y un dominio de membrana intracelular (ICD). El BCMA se une a dos ligandos diferentes, denominados BAFF y APRIL, que pueden conjugarse con una citotoxina (un conjugado anticuerpo-fármaco, ADC) que se une a las células que expresan un dominio de unión al ligando del BCMA. Por ejemplo, BCMA puede ser objeto de GSK2857916 (GlaxoSmithKline, Brentford, Reino Unido), una molécula que incluye un anticuerpo monoclonal humanizado anti-BCMA conjugado con el agente citotóxico monometil auristatina-F. Otros ADCs anti-BCMA comprenden MEDI2228 (MedImmune LLC, Gaithersburg, MD), AMG224 (Amgen, Thousand Oaks, CA), y HDP-101 (Heidelberg-Pharma, Múnich, Alemania).

Por lo tanto, es evidente que los genes suicidas pueden codificar las moléculas de longitud completa, fragmentos de las mismas que comprenden epítopos (por ejemplo, dominios de unión a ligandos) y mimotopos de las mismas. Los productos genéticos suicidas pueden utilizarse en los módulos suicidas descritos en el presente documento.

Los módulos de proteínas suicidas para su uso con proteínas transmembrana quiméricas comprenden típicamente al menos un dominio de unión a ligando, por ejemplo, codificado por uno o más de los genes suicidas descritos anteriormente, incluyendo, un dominio de unión a ligando de BCMA, mimotopos de los mismos, y combinaciones de los mismos. Los módulos de la proteína suicida también incluyen un dominio transmembrana que ancla el dominio de unión al ligando a la membrana celular. El dominio de unión al ligando puede unirse a la fracción que conferirá la mortandad de ADCC, CDC y/o ADC, tal como un anticuerpo u otro ligando afín. El módulo suicida puede diseñarse como una proteína de membrana de tipo I con un ECD terminal N, una proteína de membrana de tipo II con un ICD terminal C-, o una proteína transmembrana de múltiples dimensiones. La TM es una TM quimérica. El dominio de unión al ligando elegido puede fusionarse a un constructo CAR o se divulga una proteína de fusión B2M/HLA-E, descrita más adelante, con o sin enlazadores. Además, en algunas realizaciones, los constructos incluyen secuencias enlazadoras, tales como enlazadores flexibles, para enlazar diversos componentes. Los enlazadores suelen ser secuencias de aminoácidos cortas y repetitivas, generalmente ricas en aminoácidos pequeños o polares, tales como Gly y Ser, y pueden aportar flexibilidad y solubilidad a los constructos. La longitud de los enlazadores flexibles puede ajustarse para permitir un plegado adecuado o para lograr una actividad biológica óptima de las proteínas de fusión. Los enlazadores típicos incluyen de 3 a 25 aminoácidos aproximadamente. Véase, por ejemplo, Chen et al., Adv. Drug. Deliv. Rev. (2013) 65:1357-1369, para una revisión de enlazadores para su uso en proteínas de fusión y la Tabla 2 para enlazadores ejemplares para su uso en los presentes constructos.

T l 2: Enl z r m l r

En una realización, los módulos de proteínas suicidas se basan en moléculas derivadas de BCMA. Como se explica en el presente documento, la proteína BCMA de longitud completa incluye un ECD, un TM y un ICD. Estos dominios pueden utilizarse en módulos suicidas en su totalidad, o en porciones de los mismos que comprendan deleciones o truncamientos, o variantes de los mismos, que conserven la actividad biológica deseada, tal como el dominio de unión al ligando (en el caso del ECD) y la capacidad de anclar el dominio de unión al ligando a la membrana celular (en el caso del TM). El módulo también puede incluir, aunque no necesariamente, una secuencia de señales. El BCMA puede incluir la secuencia de aminoácidos de longitud completa, tal como la secuencia de SEQ ID NO: 1. Alternativamente, el componente BCMA puede ser más corto o más largo. Por ejemplo, el módulo suicida puede incluir el ECD, tal como los residuos 1-54 de b CmA (SEQ ID NO:3). El módulo suicida BCMA puede incluir los residuos 1-77 de SEQ ID NO: 1, incluyendo así el ECD y la TM, para anclar la proteína en la membrana y permitir el agotamiento. El módulo suicida BCMA puede incluir ECD, TM, y una porción truncada de ICD, tal como ⁱC^dde SEQ ID NO: 5 que tiene una eliminación de los aminoácidos 2-15 del ICD BCMA. El módulo suicida BCMA puede incluir una proteína que retiene los aminoácidos 1-16 del ICD, con una eliminación terminal C del resto del ICD, tal como la secuencia IDC que muestra SEQ ID NO:6. Divulga que el módulo suicida BCMA puede incluir un ECD que carece de los aminoácidos 1 5 del ECD, como se muestra en la SEQ ID NO:7. También se divulga que el módulo suicida BCMA puede incluir un ECD que carece de los aminoácidos 41-54 del ECD, como se muestra en la SEQ ID NO:8. Además, se divulga que el módulo suicida BCMA puede incluir un ECD que carece de los aminoácidos 1-5 y 41-54, como se muestra en la SEQ ID NO:9. Se pueden prever fácilmente otras configuraciones del módulo suicida BCMA. La tabla 3 proporciona componentes representativos para su uso en los módulos de suicidio basados en BCMA.

Tabla : n i m l r m n n B MA r n m l i i n BCMA

Así, los módulos suicidas BCMA pueden comprender al menos un dominio de unión a ligando y un dominio transmembrana que ancla el dominio de unión a ligando a la membrana celular. El dominio de unión al ligando se encuentra en la porción rica en cisteína del ECD, aproximadamente en los aminoácidos 6-41 de la SEQ IN NO:3, y puede unir la fracción que conferirá la mortandad por ADCC o ADC, tal como un anticuerpo o un ligando afín, o un anticuerpo conjugado con una toxina. La TM presente en los módulos suicidas con base en BCMA puede ser la TM nativa de BCm A o una TM heteróloga, por ejemplo, una TM CD8, tal como la TM CD8a (SEQ ID NO: 10) o la TM CD28 (SEQ ID NO:64), así como, la TM HLA-E, la TM IL-15R, la TM IL-15/IL-15R, la TM TACI o la TM CD19. En algunas realizaciones, las constructos BCMA incluyen secuencias enlazadoras, por ejemplo, entre el ECD y la TM, o entre otros componentes de los constructos BCMa . En la Tabla 2D se muestran ejemplos de secuencias enlazadoras. Los constructos BCMA pueden incluir glicoproteínas de la superficie celular, tales como CD34 y/o CD8. CD34 puede utilizarse para la clasificación de las células utilizando un anticuerpo anti-CD34, tal como QBEND10 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) y la CD8 puede utilizarse como enlace adicional. La Tabla 4 proporciona las secuencias de fusión de constructos representativos que comprenden módulos suicidas BCMA.

T l 4: M l i i m l r n n B MA

Se divulga que uno o más módulos suicidas, tales como los módulos suicidas con base en BCMA, pueden incluirse en un constructo CAR, para producir una proteína de fusión que incluye componentes CAR y el módulo suicida. Divulga que el módulo suicida puede colocarse internamente o puede situarse en el extremo N o C del casete CAR. Se divulga que un péptido de autodestrucción entre el módulo suicida y el resto del constructo puede ser utilizado para permitir la coexpresión del módulo suicida y el resto del constructo dentro de la célula objetivo, seguido de la escisión, de tal manera que estos dos componentes se expresan como proteínas separadas en la superficie celular. Se divulga que, por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un péptido 2A de autodestrucción, tal como el péptido 2A de la fiebre aftosa.

La FIG. 1A es una representación de un constructo CAR representativo sin módulo suicida. Los constructor CAR suelen incluir al menos un fragmento variable de cadena simple (scFv) extracelular de un anticuerpo. El scFv se deriva de la porción del anticuerpo que reconoce específicamente una proteína objetivo y se expresa en la superficie de una célula T CAR para conferirle especificidad al antígeno. El componente scFv o el componente de unión a ligando puede ser cualquiera de los scFv o componentes de unión a ligando mostrados en la Tabla 1, así como otros scFv y componentes de unión a ligando conocidos en la técnica. El scFv puede unirse a un péptido bisagra/espaciador que conecta el elemento de orientación extracelular con un dominio transmembrana y afecta a la función del CAR y a la flexibilidad del scFv. El dominio transmembrana atraviesa la membrana celular, ancla el CAR a la superficie de la célula y conecta el dominio extracelular con el dominio de señalización intracelular, incidiendo así en la expresión del CAR en la superficie de la célula. El dominio de señalización intracelular media en la señalización descendente durante la activación de las células T. Cuando el dominio de unión del ligando extracelular se une a un ligando afín, el dominio de señalización intracelular del CAR activa el linfocito. Las células T CAR combinan la especificidad de un anticuerpo con las funciones citotóxicas y de memoria de las células T. En las FIGS. 1A a 1F, el "dominio de señalización CAR" se refiere a la combinación del péptido bisagra/espaciador, el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular de células T.

Proteínas de fusión CAR ejemplares que comprenden módulos suicidas de la presente invención (designados "SM" en las FIGS. 1 y 2) y los componentes CAR se muestran en las FIGS. 1B-1F y descrito en la Tabla 5. Como se muestra en la FIG. 1D, los constructos CAR pueden incluir un dominio scFv que se divide en dos partes (designadas scFvD 1 y scFvD2) que pueden estar conectadas por un módulo suicida. Además, los constructo de CAR pueden incluir los CAR con más de un dominio scFv o dominio de unión a ligando (orientación dual ), para dirigirse a más de una proteína. Debe entenderse que los módulos suicidas presentes en las fusiones CAR pueden ser cualquiera de los descritos en el presente documento. También debe entenderse que las secuencias para las fusiones CAR descritas en el presente documento son meramente ejemplares y que pueden diseñarse y utilizarse otras fusiones CAR que incluyan módulos suicidas.

T l : E m l n r AR in l n m l i i io

Usando los constructos descritos en el presente documento, los dominios de unión al ligando pueden presentarse en las membranas de las células adoptivas, y los anticuerpos que se dirigen a estos dominios pueden ser diseñados para causar la mortandad de ADCC, CDC o ADC. En el caso de ADC, se puede utilizar un conjugado de anticuerpos que incluya un fármaco citotóxico biológicamente activo. La porción de anticuerpo del conjugado interactúa con el dominio de unión al ligando. La reacción bioquímica entre el anticuerpo y el dominio de unión al ligando desencadena una señal en la célula adoptiva, que entonces internaliza el anticuerpo junto con la citotoxina. Tras la internalización del ADC, el fármaco citotóxico se libera y causa mortandad a la célula.

Ejemplos de citotoxinas para uso con anticuerpos, incluyen, monometil auristatina-F, auristatina-E, medicamentos con base en calicheamicina, y emtansina (DM-1).

Los polinucleótidos que codifican los constructos de proteínas que contienen módulos suicidas descritos en el presente documento pueden diseñarse y los vectores que comprenden casetes de expresión pueden utilizarse para transformar las células adoptivas como se describe en el presente documento.

Los polinucleótidos pueden ser ARN, tales como ARNm, o ADN de una o dos cadenas. Los polinucleótidos codifican las proteínas de fusión descritas en el presente documento y, por lo tanto, comprenden secuencias de codificación para los diversos componentes de los constructos que contienen módulos suicidas. Como se explica en el presente documento, los polinucleótidos también pueden comprender otras secuencias, como secuencias que codifican enlazadores y secuencias de señal. Los polinucleótidos que codifican los componentes de las fusiones pueden ligarse para formar una secuencia codificante para las proteínas de fusión utilizando técnicas estándar de biología molecular. Las secuencias polinucleotídicas pueden estar optimizadas en cuanto a codones para su expresión en células de mamífero. Las secuencias de ADN optimizadas pueden determinarse utilizando programas informáticos disponibles en el mercado y los polinucleótidos que comprenden las secuencias optimizadas pueden sintetizarse utilizando técnicas bien conocidas. Las secuencias optimizadas pueden obtenerse de fabricantes comerciales.

Las secuencias de polinucleótidos pueden entonces clonarse en un vector de expresión y utilizarse para transformar células huésped de mamíferos. Existe un gran número de vectores de expresión adecuados para la transformación de células de mamíferos. Además, los procedimientos generales para el constructo de vectores de expresión son conocidos en la técnica. Existen varios programas informáticos comerciales que facilitan la selección de los vectores adecuados y su constructo, tales como los vectores para la transformación de células de mamíferos y la expresión de genes en células de mamíferos.

Los vectores derivados de virus de mamíferos pueden utilizarse para expresar los polinucleótidos descritos en el presente documento en células de mamíferos. Entre ellos se encuentran los vectores derivados de virus tales como el adenovirus, el virus adeno-asociado (AAV), el papovirus, el herpesvirus, el poliomavirus, el citomegalovirus, el lentivirus, el retrovirus, la vaccinia y el virus Simian 40 (SV40) (véase, por ejemplo ,Kaufman, R. J., Molecular Biotechnology (2000) 16:151-160y Cooray et al., Methods Enzymol. (2012) 507:29-57). Las secuencias reguladoras unidas de forma operativa a los componentes pueden incluir secuencias de unión a activadores, potenciadores, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, promotores, secuencias de unión a represores, estructuras de bucle de tallo, secuencias de iniciación de la traducción, secuencias líderes de la traducción, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias de terminación de la traducción, sitios de unión de cebadores y similares. Los vectores virales suelen incluir promotores constitutivos o inducibles, tales como, por ejemplo, CMV, EF1a, SV40, PGK1 (ratón o humano), MND, Ubc, CAG, CaMKIIa y beta-Act. Véase, por ejemplo, Khan, K. H., Advanced Pharmaceutical Bulletin (2013) 3:257-263. Además, pueden utilizarse promotores de la ARN polimerasa III de mamíferos, incluyendo H1 y U6. Adicionalmente, puede estar presente un terminador, tal como, pero no limitado a, WPRN, o una secuencia PolyA, talcomo, pero no limitado a, una secuencia SV40, o una secuencia BGH. Además, los constructos multicistrónicos, tal como las descritos en el presente documento, que incluyen múltiples secuencias codificantes pueden diseñarse para utilizar sólo un promotor incluyendo un elemento de sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), o secuencias que codifican un péptido de autodestrucción 2A, y similares

Alternativamente, el ARNm puede ser producido por un fabricante comercial a partir de un vector de ADN que contiene un promotor y un módulo terminador. En otra realización, las secuencias de polinucleótidos descritas en el presente documento pueden clonarse en un transposón, tal como, por ejemplo, el sistema de transposones Sleeping Beauty (Kebriaei et al., Trends in Genetics (2017) 33:852-870), o el sistema de transposones PiggyBac (Woodard et al., Trends in Biotechnology (2015) 33:525-533).

El virus, el ARNm o el constructo de transposón/transposasa pueden entonces introducirse en células de mamífero utilizando procedimientos de transducción, tales como, pero no limitados a, espinoculación para el virus, o lipofección y nucleofección para el ADN. Las células madre o los linfocitos, tales como las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC), pueden adquirirse de proveedores comerciales. Alternativamente, los linfocitos, tales como las PBMC, pueden aislarse como se describe más adelante en el presente documento. Las células pueden ser transducidas con el virus a diferentes títulos (MOI, multiplicidad de infección), dependiendo del tipo de célula. Los títulos típicos pueden ser de hasta 1 x105 y 1 x106, 1 *107, y superiores.

Por ejemplo, los CAR, tales como los CAR que codifican módulos suicidas y componentes de CAR, pueden insertarse en linfocitos, tales como células T, utilizando la tecnología estándar de ADN recombinante, técnicas de terapia génica, transfección de ARNm, el sistema de transposones Sleeping Beauty (Kebriaei et al., Trends in Genetics (2017) 33:852-870), el sistema de transposones PiggyBac (Woodard et al., Trends in Biotechnology (2015) 33:525-533), así como los procedimientos de edición de genes que utilizan nucleasas programables que permiten realizar modificaciones genéticas selectivas en el genoma de una célula huésped mediante la creación de roturas específicas en los lugares deseados. Dichas nucleasas incluyen, pero sin limitarse a, nucleasas asociadas a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas (CRISPR), nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) y meganucleasas. Para revisiones de estas nucleasas programables véase, por ejemplo, Kim et al., Nature Reviews Genetics (2014) 15:321-334 (para revisiones de todas las nucleasas anteriores) Koonin et al., Curr Opin Microbiol. (2017) 37:67-78 Makarova et al., Cell (2017) 168:146 Makarova et al., Cell (2017) 168:328 Hsu et al., Cell (2014) 157:1262-1278 Jore, et al., Nature Struc. and Molec. Biol. (2011) 18:529-536 (para revisiones de nucleasas asociadas a CRISPR) Urnov et al., Nature Reviews Genetics (2010) 11:636-646 (para una revisión de las ZFN) Stoddard, B., Mobile DnA (2014) 5:7 (para una revisión de las meganucleasas) Joung et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology (2013) 14:49-55 (para una revisión de las TALEN).

Típicamente, los linfocitos, tales como las células T, se incuban con un vector viral, tal como un vector de virus adenoasociado (AAV) recombinante, un vector adenoviral, un vector lentiviral, un vector retroviral, o similares, que codifica el casete de expresión deseado, tal como un casete B2M/HLA-E, o un casete de expresión CAR (véase, por ejemplo ,Levine et al., Mol. Therapy-Meth. Clin. Develop. (2017) 4:92-101 Wang et al., Mol. Therapy -Oncolytics (2016) 3:16015; Smith et al., J. Cell Immunother. (2016) 02:59-68 Maude et al., N. Engl. J. Med. (2014) 371:1507-1517 Patente de EE. UU. No. 7,446,190 y 8,399,645. El material genético insertado puede integrarse en el genoma de las células del paciente o de las células del donante y luego expresarse en la célula o en la superficie celular.

Las células transducidas y transfectadas pueden analizarse para determinar la expresión del transgén utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como las técnicas de cribado de alto rendimiento que incluyen las plataformas de cribado basadas en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), las plataformas de cribado con base en la microfluídica, los ELISA y similares. Estas técnicas son bien conocidas y revisadas en, por ejemplo, Wojcik et al., Int. J. Molec. Sci. (2015) 16:24918-24945. También se pueden utilizar técnicas de Transferencia Western. Por ejemplo, las células T CAR transducidas por el gen suicida BCMA pueden analizarse para la expresión de CAR19 y BCMA utilizando anticuerpos anti-CAR19 y anti-BCMA marcados con fluorescencia (tales como los de Biolegend, San Diego, CA; o Abcam, Cambridge, MA). La mortandad con base en ADCC puede comprobarse con un ensayo de mortandad con base en células NK. Brevemente, las células NK pueden aislarse de las p Bm C y cultivarse en medios para células NK. Las células T CAR transducidas con un módulo suicida BCMA pueden cultivarse en medios de células T. Para el ensayo de mortandad, las células NK efectoras y las células T CAR objetivo pueden teñirse con fluorescencia y luego mezclarse en diferentes relaciones (1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1,4:1, 5:1 y 10:1) y puede añadirse un anticuerpo inductor de ADCC, tal como GSK2857916 (GlaxoSmithKline, Brentford, Reino Unido). Las células se pueden incubar durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o más horas, tal como hasta 24 horas, y luego se obtienen imágenes o se cuentan las células vivas/muertas y se contabilizan las relaciones. La mortandad con base en ADC puede evaluarse en un ensayo de mortandad similar que comprenda las células objetivo y el conjugado anticuerpo-fármaco inductor de ADC como se describe en el presente documento.

Las células adoptivas que pueden ser modificadas genéticamente para producir módulos que contengan suicidas incluyen, pero no se limitan a, linfocitos, tales como, pero no se limitan a, células T CAR, células T, TILS, células NK, células CAR-NK y células dendríticas; células madre, tales como, pero no limitadas a, células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), células madre de la sangre del cordón umbilical y células madre hematopoyéticas; macrófagos; glóbulos rojos; fibroblastos; células endoteliales; células epiteliales; y células precursoras pancreáticas. Las células para su uso en el presente documento pueden aislarse de un sujeto, tal como un sujeto humano, utilizando técnicas estándar.

Por ejemplo, los linfocitos para su uso en el presente documento pueden aislarse de un sujeto, por ejemplo, de la sangre, o de tumores sólidos en el caso de los TIL, o de órganos linfoides tales como el timo, la médula ósea, los ganglios linfáticos y los tejidos linfoides asociados a las mucosas. Las técnicas para aislar linfocitos son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) pueden aislarse de un paciente o de un donante mediante leucaféresis, un procedimiento donde se extrae sangre del sujeto, se separan los leucocitos y el resto de la sangre se devuelve a la circulación, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo ,Smith, J.W. Ther. Apher. (1997) 1:203-206).

Las PBMC también pueden separarse de la sangre total utilizando, por ejemplo, ficoll, un polisacárido hidrofílico que separa las capas de sangre, y centrifugación en gradiente de densidad. Generalmente, las muestras de sangre anticoagulada o desfibrada se colocan en capas sobre una solución de ficoll y se centrifugan para formar diferentes capas de células. La capa inferior incluye los glóbulos rojos (eritrocitos), que son recogidos o agregados por el medio ficoll y se hunden completamente hasta el fondo. La siguiente capa contiene principalmente granulocitos, que también migran hacia abajo a través de la solución opaca de ficol. La siguiente capa incluye linfocitos, que suelen estar en la interfaz entre el plasma y la solución de ficoll, junto con monocitos y plaquetas. Para aislar los linfocitos, se recupera esta capa, se lava con una solución salina para eliminar las plaquetas, el ficoll y el plasma, y se vuelve a centrifugar.

Otras técnicas para aislar linfocitos incluyen el biopaneo, que aísla poblaciones celulares de la solución mediante la unión de células de interés a superficies de plástico recubiertas de anticuerpos. A continuación, se eliminan las células no deseadas mediante un tratamiento con anticuerpos específicos y complemento. Además, se puede utilizar el análisis del clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) para detectar y contar los linfocitos. El análisis FACS utiliza un citómetro de flujo que separa las células marcadas en función de las diferencias de dispersión de la luz y la fluorescencia.

Para los TIL, los linfocitos se aíslan de un tumor y se cultivan, por ejemplo, en altas dosis de IL-2 y se seleccionan utilizando ensayos de cocultivo de liberación de citoquinas contra un tumor autólogo o líneas celulares tumorales compatibles con HLA. Los cultivos con evidencia de una mayor reactividad específica en comparación con los controles alogénicos no compatibles con el CMH pueden seleccionarse para una rápida expansión y luego introducirse en un sujeto con el fin de tratar el cáncer. Véase, por ejemplo, Rosenberg et al., Clin. Cancer Res. (2011) 17:4550-4557 Dudly et al., Science (2002) 298:850-854 Dudly et al., J. Clin. Oncol. (2008) 26:5233-5239 Dudley et al., J. Immnother. (2003) 26:332-342.

Una vez aislados, los linfocitos pueden ser caracterizados en términos de especificidad, frecuencia y función. Entre los ensayos más utilizados se encuentra el ensayo ELISPOT, que mide la frecuencia de la respuesta de las células T. El producto puede enriquecerse con subconjuntos específicos de células T, como las células T CD4+, CD8+, CD25+ o CD62L+, utilizando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Wang et al., Mol. Terapia - Oncolytics (2016) 3:16015.

Después del aislamiento, los linfocitos pueden ser activados usando técnicas bien conocidas en la técnica para promover la proliferación y diferenciación en linfocitos especializados. Por ejemplo, las células T pueden ser activadas utilizando diversos procedimientos, incluyendo el uso de activadores solubles CD3/28 disponibles en el mercado, o perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos monoclonales anti-CD3/anti-CD28. Las microesferas pueden extraerse fácilmente del cultivo mediante la separación magnética utilizando técnicas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Levine, B.L., BioProcessing J. (2007) 6:14-19). Se divulgan marcadores de superficie para células T activadas que incluyen, por ejemplo, CD3, CD4, CD8, PD1, IL2R y otros. Los linfocitos citotóxicos activados pueden causar mortandad a las células objetivo después de unirse a los receptores cognados en la superficie de las células objetivo. Los marcadores de superficie de las células NK incluyen, por ejemplo, CD16, CD56 y otros.

Antes, después o durante la activación, los linfocitos pueden ser modificados genéticamente para producir uno o más constructos que contengan módulos suicidas en la superficie celular, tales como los constructos derivados de BCMA y/o los constructos B2M/HLA-E que contienen módulos suicidas. Además, las células pueden transformarse con constructos que codifican uno o más receptores de antígenos quiméricos (CAR) en la superficie celular, reprogramando así los linfocitos para que se dirijan a las células tumorales. Divulga que los módulos de suicidio se incorporan a los constructos CAR. Se divulga que las constructos del módulo suicida se utilizan para transformar linfocitos independientemente de los constructos CAR. Los linfocitos modificados con CAR, tales como las células T CAR, reconocen antígenos solubles específicos o antígenos en la superficie de una célula objetivo, tal como la superficie de una célula tumoral, o en células del microambiente tumoral. Los objetivos celulares representativos, así como sus CAR afines, se muestran en la Tabla 1. Los CAR pueden incorporarse a células T, TIL, células NK o TCR, dando lugar a células T CAR, los CAR-TIL, células CAR-NK o células T CAR diseñadas con TCR, respectivamente, para su uso en inmunoterapias de células T adoptivas.

Los CAR, o los CAR y las constructos separadas que incluyen los módulos suicidas, pueden introducirse en los linfocitos, tal como las células T, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.

Una vez realizados los procedimientos de edición, las células se examinan para seleccionar las células con las modificaciones genómicas deseadas, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como las técnicas de cribado de alto rendimiento, incluyendo las plataformas de cribado con base en la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), las plataformas de cribado con base en la microfluídica, y similares. Estas técnicas son bien conocidas y revisadas en, por ejemplo, Wojcik et al., Int. J. Molec. Sci. (2015) 16:24918-24945.

Tras el aislamiento, la activación y, opcionalmente, la edición, los linfocitos pueden expandirse en un medio de cultivo seleccionado, tal como, por ejemplo, el medio Immunocult™ (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá); Medio RPMI 1640™ completo (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA); medio TexMACS™ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania); medio X-Vivo-15™ (Lonza, Basilea, Suiza); medio CTS Optimizer™ (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). El medio de cultivo puede complementarse con albúmina de suero humano, o con un sustituto de suero humano, tal como el sustituto de suero CTS™ Immune Cell SR (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), o el sustituto de suero KnockOut™ SR (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). El suero o el sustituto del suero estará típicamente presente en 0,5 % a 15 %, tal como 2 % a 15 %, 3 % al 12 %, por ejemplo 5 % a 10 %, o cualquier porcentaje entre 2 % a 15 %.

El medio también puede contener opcionalmente citoquinas, tales como IL-2, IL-7 y/o IL-15. También pueden estar presentes otras citoquinas, tales como IL-22 y/o la IL-18. El medio de cultivo celular puede complementarse además con inhibidores de la glucólisis tales como la 2-deoxiglucosa y antibióticos.

Las poblaciones de linfocitos producidas mediante las técnicas de cultivo descritas en el presente documento pueden utilizarse para prevenir la G^vH^d, el rechazo del Huésped contra el Injerto y otras toxicidades celulares causadas por el tratamiento de diversos tipos de cánceres mediante terapias celulares adoptivas, tales como el síndrome de liberación de citoquinas (CRS), la tormenta de citoquinas, la neurotoxicidad y las transformaciones oncogénicas del injerto. Dichos cánceres incluyen, cánceres de próstata; cánceres de ovario; cánceres cervicales; cánceres colorrectales; cánceres intestinales; cánceres testiculares; cánceres de piel; cánceres de pulmón; cánceres de tiroides; cánceres óseos; cánceres de mama; cánceres de vejiga; cánceres uterinos; cánceres vaginales; cánceres de páncreas; cánceres de hígado; cánceres de riñón; cánceres de cerebro; cánceres de médula espinal; cánceres de boca; tumores de parótida; cánceres de sangre; linfomas, tal como los linfomas de células B; leucemias; tumores sólidos; tumores líquidos; y similares.

Los constructos que contienen módulos suicidas pueden administrarse a pacientes que reciben tratamiento para otros trastornos proliferativos de las células, incluyendo las afecciones precancerosas, los trastornos hematológicos y los trastornos inmunitarios, tales como los trastornos autoinmunitarios que incluyen, sin limitación, la enfermedad de Addison, la enfermedad celíaca, la diabetes mellitus de tipo 1, la enfermedad de Grave, la enfermedad de Hashimoto, la enfermedad inflamatoria intestinal, la esclerosis múltiple, la psoriasis, la artritis reumatoide, la esclerodermia y el lupus eritematoso sistémico.

Experimental

Aspectos de la presente invención se ilustran además en el siguiente Ejemplo. Los aspectos que no están comprendidos en las reivindicaciones adjuntas se presentan únicamente con fines ilustrativos. Se ha procurado garantizar la exactitud de las cifras utilizadas(por ejemplo, cantidades, concentraciones, cambios porcentuales y similares), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella. Debe entenderse que este Ejemplo, aunque indica algunas realizaciones de la presente invención, se da a modo de ilustración solamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

Diseño, clonación, producción de vectores virales y transducción en células T de un casete de inserción B2M/HLA-E

Este Ejemplo ilustra el diseño in silico y la clonación de un casete B2M/HLA-E y su introducción en el locus B2M de las células T. No son necesarios todos los pasos siguientes ni debe seguirse el orden de los mismos.

Diseño in silico y clonación

La proteína de fusión B2M/HLA-E se construyó como se describe en Gornalusse et al., Nat. Biotechnol. (2017) 35:765-772. Brevemente, la secuencia de aminoácidos del constructo de la proteína de fusión B2M/HLA-E comprendía una secuencia de señal B2M unida a la secuencia de señal HLA-G, unida a una región enlazadora, unida a la proteína madura B2M, unida a una segunda región enlazadora, y unida a la cadena pesada HLA-E. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión B2M/HLA-E se muestra en la SEQ ID NO:57.

La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión se tradujo en ADN y la secuencia de nucleótidos se optimizó en codones para su expresión en células de mamífero utilizando la herramienta IDT codon optimizer (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA). La secuencia de oligonucleótidos que codifica la proteína de fusión B2M/HLA-E (SEQ ID NO:65) se proporcionó a un fabricante comercial para su síntesis.

Se divulga que la secuencia de nucleótidos se clonó en un vector de virus adeno-asociado tipo 6 (AAV6). El AAV6 y otros virus AAV (como el AAV2 y el AAV9) pueden ser diseñados para suministrar elementos donantes de ADN a las células de mamíferos. Se divulga que, si la entrega de AAV se combina con un evento de escisión genómico y el elemento donante de ADN en el AAV está flanqueado por brazos de homología, el elemento donante de ADN puede insertarse sin problemas en el sitio de corte genómico mediante la reparación dirigida por homología (HDR), como se describe en Eyquem et al., Nature (2017) 543:113-117.

Con el fin de insertar específicamente la secuencia de nucleótidos B2M/HLA-E en el genoma de la célula huésped después de la escisión específica del sitio con una nucleasa programable tal como Cas9, se eligió un sitio objetivo en el gen B2M (ubicación del motivo: chr15:44711542-44711564 en hg38). Los sitios de destino y las guías para entregar nucleasas programables como Cas9 se determinan fácilmente utilizando técnicas tales como las descritas en Patente de EE.UU. Nos 9,580,701 9,650,6179,688,972 9,771,601y 9,868,962. Se identificaron 500 pares de bases (pb), 5' y 3' del sitio de escisión, (SEQ ID NOS:66 y 67). Se divulga que para construir el casete de inserción AAV6, la secuencia promotora de mamíferos EF1 alfa se insertó corriente arriba de la secuencia de nucleótidos B2M/HLA-E (denominada "elemento donante"). Se divulga que las secuencias de nucleótidos del brazo de homología se añadieron a continuación a 5' y 3' del elemento donante invertido y se clonaron en el esqueleto del vector AAV6.

Producción de AAV recombinante

La producción de AAV recombinante (rAAV) se ha descrito en detalle en otros lugares (véase, por ejemplo, Halbert et. al., Methods. Mol. Biol. (2018) 1687:257-266 Naso et. al., BioDrugs (2017) 31:317-334). Brevemente, las células HEK 293T para la producción de rAAV se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, CRL-11268™; Manassas, VA). El primer día, las células T HEK 293 se sembraron a 4 x 105 células/ml en placas de 15 cm recubiertas de cultivo de tejidos en 20 ml de medio de crecimiento completo (DMEM complementado con 10 % de suero bovino fetal y 1 x de penicilina-estreptomicina) y se cultivaron a 37 °C al 5 % de CO², en una incubadora. Se utilizaron células de placas de 6 x 15 cm por experimento. El segundo día, las células se transfectaron con el vector B2M/HLA-E-rAAV para la producción de rAAV mediante transfección con fosfato de calcio.

Por placa de 15 cm, se mezclaron mediante vórtex agua 856 pl , CaCl22M 124 pl y ADN vectorial total 20 |jg (para la producción de AAV se combinaron los 3 plásmidos en relación1:1:1, pHelper, pAAV-RC6 y pAAV-B2M/HLA-E, 6,7 pg cada uno). A continuación, se añadió lentamente 1 ml de HBS. Se añadieron 2 ml de mezcla de transfección gota a gota a la placa de 15 cm de células HEK 293T y la mezcla se distribuyó suavemente por la placa y se cultivó a 37 °C, 5 % de CO²en una incubadora. Al tercer día, se retiró el sobrenadante de las células y se añadieron 20 ml de medio completo fresco.

Después de la transfección, 60-72 horas , las células se lavaron con tampón de gradiente (Tris 100 mM . pH 7,6; NaCl 500 mM ; MgCh 100 mM ). Se añadieron, continuación, 0,5 ml de tampón de gradiente a cada placa y las células se recogieron suavemente y se agruparon en un tubo de plástico de 50 ml. A continuación, se generó lisis de las células mediante 4 ciclos de congelación/descongelación. Brevemente, las células se congelaron utilizando nitrógeno líquido durante 10 minutos. Las células se descongelaron a 55 °C en un baño de agua y luego se trituraron con una aguja de jeringa para ayudar a la lisis celular utilizando una jeringa de 20 ml y una aguja de calibre 23. A continuación, la suspensión celular lisada se devolvió a 37 °C. Se añadió benzonasa (Sigma Aldrich, St Louis, MO) a razón de 1 pl por 5 ml y se incubó la suspensión celular a 37 °C durante 45 minutos. A continuación, la suspensión celular se centrifugó a 3700 rpm durante 15 minutos a 4 °C utilizando un rotor Beckman HS4.7™ (Beckman Coulter, Brea, CA). El sobrenadante que contenía las partículas virales se recogió en un tubo de plástico de 50 ml. A continuación, el sobrenadante se colocó en capas sobre un gradiente de 15 %/25 %/40 %/58 % (de arriba a abajo) de iodixanol (Optiprep™, NaCl, tampón de gradiente y rojo de fenol) (Optiprep, Axis-Shield, Dundee, Reino Unido). El sobrenadante del virus se centrifugó en el tubo sellado a través del gradiente de iodixanol utilizando un Beckman 70Ti fixed angle rotor™ (Beckman Coulter, Brea, CA) a 48.000 rpm durante 2 horas y 10 minutos. El virus purificado se extrajo del tubo con una jeringa y una aguja.

El virus se purificó aún más a partir del iodixanol mediante cromatografía de exclusión por tamaño de flujo gravitacional. La solución viral se hizo pasar por una columna de Sepharose G100 (Sephadex G-100 Superfine; GE Healthcare, Pittsburgh, PA), preequilibrada con tampón de gradiente, y el virus se recogió en fracciones de 1 ml. Se analizaron las fracciones que contenían virus midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nm con un espectrómetro UV (Nanodrop, Thermofisher, Waltham, MA). Las fracciones que contenían virus con una baja absorción a 260 nm se agruparon. Las fracciones se concentraron utilizando un concentrador Vivaspin 15R™ de 30 kDa de corte (Vivaspin, Sartorius, 37079. Gottingen, Alemania).

Titulación del B2M/HLA-E-rAAV

El título viral se evaluó utilizando el kit qPCR de Takara (Takara, Mountain View, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Preparación de Cas9

La sobreexpresión y purificación de la proteína CRISPR Cas9 (SpyCas9) de Streptococcus pyogenes a partir de vectores de expresión bacteriana, la expresión en Escherichia coli (BL21 (DE3)) y la purificación mediante cromatografía de afinidad, intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño, se ha descrito en detalle en otro lugar. Véase, por ejemplo, Jinek, et al., Science (2012) 337:816-821. SpyCas9 se produjo como se describe en Patente de EE.UU. Nos. 9,580,701 9,650,617 9,688,9729,771,601y 9,868,962. Los oligonucleótidos se compraron a un fabricante comercial. Los complejos Cas9-ribonucleoproteína (Cas9-RNPs) se formaron como se describe en las referencias anteriores.

Transducción de células T con B2M/HLA-E-rAAV

Las células T Pan se prepararon a partir de las PBMC del donante como se indica a continuación. Brevemente, se obtuvieron aproximadamente 350 millones de PBMC de donantes de AllCells (Alameda, CA). Las PBMC eran pequeñas alícuotas de un AllCells Apheresis Leuko Pak™, recogidas mediante el sistema de aféresis Spectra Optia™ (TERUMO BCT, INC., Lakewood, CO 80215). Aproximadamente 90 % de estas células eran células mononucleares (MNC).

Los productos frescos de MNC fueron procesados para agotar los glóbulos rojos (RBC) usando una solución de cloruro de amonio y fueron procesados para agotar las plaquetas por centrifugación. Las PBMC se enumeraron utilizando ácido acético con azul de metileno y un hemocitómetro (Countess II FL Automated Cell Counter™; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). A continuación, se purificaron las células T Pan utilizando el robot de separación celular Robosep™ (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá) y el kit EasySep™ de aislamiento de células T humanas Pan (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá), siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, las células T se cultivaron en medio Immunocult™ (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá), complementado con 5 % de suero bovino fetal (FBS) y 200 U/ml de interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2).

Las células se activaron utilizando anti-CD3/anti-CD28 Gibco Dynabeads™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) a 37 °C, 5 % de CO²en una incubadora. Después de 48 horas, se retiraron las perlas con un imán y las células se expandieron durante 24 horas en un medio Immunocult™ completo (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá), complementado con FBS 5 % y rhIL-2200 U/ml.

Nucleofección y transducción de AAV6

Tras la expansión, las células T pan fueron nucleofectadas con Cas9-RNPs y transducidas con B2M/HLA-E-rAAV. Brevemente, las Cas9-RNPs se transfectaron en células T activadas (CD4+ y CD8+) utilizando el Nucleofector™ Shuttle System de 96 pocillos (Lonza, Allendale, NJ). Las Cas9-RNPs se dispensaron en un volumen final de 5 pl en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. El medio Immunocult™ (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá), complementado con FBS 5 % y rhIL-2200 U/ml , se añadió a 100 pl/pocillo a una placa de cultivo de tejidos de 96 pocilios para células en suspensión. Las células T suspendidas se dispersaron por centrifugación durante 7 minutos a 200 x g, y las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de calcio y magnesio. Las células se dispersaron por centrifugación durante 7 minutos a 200 x g, y las células se resuspendieron a 1 x107 células/ml en tampón de electroporación (Lonza, Allendale, NJ). Las células se contaron utilizando el Countess II Automated Cell Counter™ (Life Technologies; Grand Island, NY).

A continuación, se añadieron 20 ^l de la suspensión celular a cada pozo individual que contenía 5 ^l de complejos de ribonucleoproteínas, y todo el volumen de cada pocillo se transfirió a un pocillos de una placa Nucleocuvette™ de 96 pocillos (Lonza, Allendale, NJ). La placa se cargó en el Nucleofector™ Shuttle™ de 96 pocillos (Lonza, Allendale, NJ) y las células se nucleofectaron. Tras la nucleofección, se añadieron 80 ^l de medio Immunocult™ completo (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá), complementado con FBS 5 % , rhIL-2200 U/ml y 5,5 ml de antibiótico-antimicótico 100X, a cada pocillo, y se transfirieron 50 ^l de la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 96 pocillos que contenía 100 ^l de medio Immunocult™ completo precalentado (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá). La placa se transfirió a una incubadora de cultivo de tejidos y se mantuvo a 37 °C en CO²5 % de durante un día.

Después de 24 horas, 2 x 105 células T nucleofectadas fueron transducidas con 1 lote de rAAV. A continuación, las células T se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2 en un medio Immunocult™ completo (Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá) hasta su posterior análisis.

Tinción celular

Las células T se evaluaron para la expresión de la superficie celular de la proteína objetivo utilizando análisis FACS y anticuerpos específicos de la proteína objetivo. Se centrifugaron 1 x105 células por muestra de células T activadas a 300 x g durante 5 minutos para pelar las células. El sobrenadante se decantó. Las células se resuspendieron en 100 ^l de tampón FACS (1 x ^pB^scon FBS 2,5 %).

Se utilizaron anticuerpos contra la proteína objetivo, tal como el anticuerpo anti-HLA-E marcado con BV421™ (Biolegend, San Diego, CA); el anticuerpo anti-B2M marcado con ficoeritrina (PE) (Biolegend, San Diego, CA); y/o el anti-HLA-A/B/C marcado con Alexa467TM (Biolegend, San Diego, CA). Los anticuerpos se añadieron a una dilución de 1:100 y las muestras se incubaron en hielo durante 60 minutos. Las muestras se lavaron tres veces añadiendo 100 ^l de tampón FACS, y se centrifugaron a aproximadamente 300 x g durante 5 minutos.

A continuación, las células teñidas se clasificaron en un cribador Intellicyt iQue™ (Intellicyt, Sartorius, Albuquerque, NM), y se contaron las respectivas poblaciones de BV421™, o PE, o células fluorescentes positivas a los tintes equivalentes.

Después de la transducción, 5-8 días , las células T nucleofectadas y transducidas, las células T de tipo silvestre (WT), y las células nucleofectadas solamente, fueron contadas para las células HLA-A/B/C-negativas y B2M/HLA-E-positivas. Las células T WT tenían 0,023 % de fracciones HLA-A/B/negativas para C/positivas para HlA-E; las células sólo nucleofectadas tenían 2,58 % de fracciones HLA-A/B/negativas para C/positivas para HLA-E; y las células T nucleofectadas y transducidas con B2M/HLA-E AAV6 tenían 15 % de fracciones HLA-A/B/negativas para C/positivas para HLA-E.

Los constructos B2M/HLA-E pueden utilizarse como base para diseñar proteínas transmembrana quiméricas que contengan módulos suicidas.

Siguiendo la orientación de la presente memoria descriptiva , un experto en la técnica puede aislar otros tipos de linfocitos a partir de PBMC, nucleofectarlos y transducirlos con virus.

Tabla 7: Tabla de secuencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína transmembrana quimérica que comprende:

uno o más módulos suicidas, en los que el módulo suicida comprende un dominio de unión a ligando seleccionado del grupo que consiste en un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, una porción de un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, un mimótopo de un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, y combinaciones de los mismos; y

un dominio transmembrana.

2. La proteína transmembrana quimérica de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión al ligando comprende los aminoácidos 6 a 41 de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 80 por ciento de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, y el dominio de unión al ligando conserva la actividad de unión al ligando.

3. La proteína transmembrana quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína transmembrana quimérica comprende además un dominio de membrana intracelular del antígeno de maduración de células B o un fragmento del mismo, opcionalmente en la que el dominio de membrana intracelular del antígeno de maduración de células B o el fragmento del mismo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 80 por ciento de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 4.

4. La proteína transmembrana quimérica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana CD8.

5. La proteína transmembrana quimérica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína transmembrana quimérica comprende además una secuencia enlazadora que une el dominio de unión al ligando con el dominio transmembrana, opcionalmente en la que la secuencia enlazadora se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, y SEQ ID NO: 27.

6. La proteína transmembrana quimérica de la reivindicación 1, en la que la proteína transmembrana quimérica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, y SEQ ID NO: 51.

7. La proteína transmembrana quimérica de la reivindicación 1 que comprende además un receptor de antígeno quimérico que comprende un fragmento variable de inmunoglobulina de cadena única y un dominio de señalización del receptor de antígeno quimérico.

8. La proteína transmembrana quimérica de la reivindicación 7,

en la que el módulo suicida está situado entre el fragmento variable de inmunoglobulina de cadena única y el dominio de señalización del receptor de antígeno quimérico, o

en la que la proteína transmembrana quimérica comprende además un péptido de autoescisión situado entre el módulo suicida y el receptor antigénico quimérico.

9. La proteína transmembrana quimérica de la reivindicación 8, en la que el módulo suicida ha situado el terminal N-en el fragmento variable de inmunoglobulina de cadena única y en el dominio de señalización del receptor de antígeno quimérico.

10. Una célula modificada que comprende la proteína transmembrana quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, opcionalmente en la que la célula modificada es una célula T CAR.

11. Un anticuerpo capaz de unirse al dominio de unión al ligando de la proteína transmembrana quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en el tratamiento de los efectos de la GvHD, el rechazo del Huésped contra el Injerto, el síndrome de liberación de citoquinas (CRS), la tormenta de citoquinas, y la reducción de las transformaciones oncogénicas de las células modificadas genéticamente administradas, opcionalmente en el que el anticuerpo se conjuga con una molécula citotóxica, y la molécula conjugada anticuerpo-citotóxica se selecciona del grupo que consiste en GSK2857916, MEDI2228, AMG 224 y HDP-101.

12. Un procedimiento para fabricar una célula modificada, comprendiendo el procedimiento introducir en una célula un ácido nucleico que codifica una proteína transmembrana quimérica que comprende:

uno o más módulos suicidas, en el que el módulo suicida comprende un dominio de unión a ligando seleccionado del grupo que consiste en un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, una porción de un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, un mimótopo de un dominio extracelular de antígeno de maduración de células B, y combinaciones de los mismos; y un dominio transmembrana;

en el que el ácido nucleico se introduce en la célula in vitro.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el ácido nucleico es introducido en la célula por un virus.