ES2925002T3 - Método y kit para el tratamiento de tumor cerebral mediante el uso del sistema de ultrasonidos - Google Patents

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Abstract

Proporcionó un método para reducir una cantidad efectiva de Bevacizumab necesaria para tratar un tumor cerebral. También se proporciona un kit utilizado para el método mencionado. El presente método adopta una estrategia de combinación para combinar el tratamiento con Bevacizumab con la exposición a ultrasonidos, que comprende al menos los siguientes pasos: administrar Bevacizumab a un sujeto; administrar un medio de respuesta a ultrasonidos a dicho sujeto; y administrar dicho sujeto con una exposición a ultrasonidos. Se identificaron la cantidad efectiva específica del tratamiento con bevacizumab y la exposición a ultrasonidos. La eficacia del tratamiento convencional con Bevacizumab mejora significativamente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método y kit para el tratamiento de tumor cerebral mediante el uso del sistema de ultrasonidos
Los pacientes con glioblastoma multiforme (GBM) generalmente solo tienen una tasa de supervivencia a 5 años inferior al 5 % y una mediana de supervivencia general de solo 15 meses después de una cirugía agresiva y luego de quimioterapia y radiación adyuvantes. La terapia antiangiogénica es el foco de los recientes esfuerzos de desarrollo terapéutico porque los GBM son tumores altamente vascularizados con proliferación vascular extensa e irregular, mayor expresión de factores angiogénicos y niveles profundamente altos de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) secretado. La alta expresión de VEGF asociada a GBM da como resultado el crecimiento y la proliferación de células endoteliales, lo que se correlaciona con la hipoxia y la necrosis tumorales, y desencadena la angiogénesis y progresión tumoral.
Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une específicamente a la isoforma VEGF-A y neutraliza la proliferación de células endoteliales. Bevacizumab reduce la neovascularización tumoral, mejora la integridad de los vasos sanguíneos, disminuye el edema asociado al tumor y mejora la calidad de vida clínica. Teóricamente, la administración constante de fármacos antiangiogénicos debería conducir a la destrucción de la red vascular, al impedir el transporte de oxígeno y nutrientes y, en última instancia, provocar la inanición del tumor. Sin embargo, estos efectos antitumorales también se ven obstaculizados por la "normalización vascular" mediada por la capacidad de los agentes anti-VEGF para reducir eficazmente la permeabilidad vascular y revertir temporalmente la fuga capilar anormal. La "normalización vascular" transitoria restaura la integridad de la BBB y restringe aún más la penetración de bevacizumab en el parénquima cerebral, lo que reduce la supresión angiogénica de las células GBM y la inanición sostenida del tumor para mejorar la supervivencia del paciente.
RICHARD T FRANK Y OTROS, "Strategies for enhancing antibody delivery to the brain", BBA - REVIEWS ON CANCER, ELSEVIER SCIENCE BV, AMSTERDAM, NL, vol. 1816, no. 2, doi:10.1016/J.BBCAN.2011.07.002, ISSN 0304-419X, (20110703), pages 191 - 198, (20110708) es una revisión que muestra las múltiples rutas para investigar posibles opciones para mejorar la transición de anticuerpos sobre la barrera hematoencefálica (BBB). HENDRICKS BENJAMIN K Y OTROS, NEUROSURGICAL FOCUS, AMERICAN ASSOCIATION OF NEUROLOGICAL SURGEONS, UNITED STATES, (20150228), vol. 38, núm. 3, doi:10.3171/2015.1.FOCUS14767, revisa la entrega de medicamentos en todo el BBB.
RODRIGUEZ A Y OTROS, PHARMACEUTICS, (20150803), vol. 7, núm. 3, doi:10.3390/PHARMACEUTICS7030175, ISSN 1999-4923, páginas 175 - 187 menciona bevacizumab y su implicación en el transporte de BBB.
IU HAO-LI Y OTROS, RADIOLOGY MAY 2010, (201005), vol. 255, núm. 2, ISSN 1527-1315, páginas 415 - 425 es un documento que muestra la aplicación de ultrasonido para mejorar la transición BBB de BCNU.
Resumen
A la luz de lo anterior, uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar un compuesto para usar en un método para tratar el cáncer de cerebro mediante el uso de una terapia antiangiogénica. El compuesto para usar en un método es capaz de proporcionar una mejor eficacia mientras se usa una dosis menor de medicamento antiangiogénico.
Con el fin de lograr los objetivos antes mencionados, la presente invención proporciona Bevacizumab para su uso en el tratamiento de un tumor cerebral, el tratamiento que comprende los siguientes pasos:
administrar Bevacizumab a un sujeto; en el que dicho Bevacizumab está en una cantidad de 0,011 a 11 mg/kg de peso corporal para un ser humano;
administrar un medio de respuesta a ultrasonidos a dicho sujeto; y
administrar dicho sujeto con una exposición a ultrasonidos de 0,47 a 1,26 de índice mecánico (MI), en el que dicho medio de respuesta a ultrasonidos es una pluralidad de partículas; y en el que dicha exposición a ultrasonidos se administra en un sistema nervioso central de dicho sujeto.
Preferentemente, dicho Bevacizumab está en una cantidad de 0,11 a 11 mg/kg de peso corporal. Más Preferentemente, dicho Bevacizumab está en una cantidad de 1,1 a 11 mg/kg de peso corporal. Preferentemente, dicha administración de dicho Bevacizumab es mediante inyección intravenosa.
Preferentemente, dicha administración para dicho medio de respuesta a ultrasonidos es mediante inyección intravenosa. Preferentemente, dicho medio de respuesta a ultrasonidos es una pluralidad de partículas. Preferentemente, dichas partículas tienen un diámetro medio de 0,1 a 10 pm. Preferentemente, dicha pluralidad de partículas es de una cantidad de 1,9 * 106 a 1,17 * 108 partículas/kg de peso corporal para dicha administración. Preferentemente, dichas partículas son microburbujas.
Preferentemente, dicha exposición a ultrasonidos se administra en el sistema nervioso central de dicho sujeto. Preferentemente, dicho tumor cerebral es Glioblastoma multiforme.
La presente invención también proporciona una combinación de una formulación de Bevacizumab y un medio de respuesta de ultrasonido para usar en un tratamiento de un tumor cerebral, donde dicha combinación se comprende en un kit, y dicho kit comprende además un sistema de ultrasonido que comprende un transductor de ultrasonido; en el que una administración de Bevacizumab es en una cantidad de 0,011 a 11 mg/kg de peso corporal para un ser humano, y dicho sistema de ultrasonido se configura para generar una exposición de ultrasonido de 0,47 a 1,26 MI,
en el que dicho medio de respuesta a ultrasonidos es una pluralidad de partículas; y en el que dicha exposición a ultrasonidos se administra en un sistema nervioso central de dicho sujeto.
Preferentemente, dicha formulación de Bevacizumab comprende de 0,11 a 25 mg/ml de Bevacizumab y un vehículo para inyección; donde dicho mg/ml se basa en el volumen total de dicha formulación de Bevacizumab. Preferentemente, dicho vehículo para inyección es agua, solución salina, polímero, emulsionante, tensioactivo o una combinación de los mismos.
Preferentemente, dicho medio de respuesta a ultrasonidos comprende de 1 x 104 a 1 x 1012 partículas/ml de partículas; en el que dicha partícula/ml se basa en el volumen total de dicho medio de respuesta a ultrasonidos. Preferentemente, dichas partículas tienen un diámetro medio de 0,1 a 10 pm.
Preferentemente, dicho medio de respuesta a ultrasonidos se mezcla con un vehículo para inyección. Preferentemente, dicho vehículo para inyección es agua, solución salina, polímero, emulsionante, tensioactivo o una combinación de los mismos.
Preferentemente, dicho tumor cerebral es Glioblastoma multiforme.
Preferentemente, dicho sistema de ultrasonidos es un sistema de ultrasonidos de guía en base a imágenes médicas. Preferentemente, dicha formación de imágenes médicas comprende neuronavegación, ultrasonografía, formación de imágenes ópticas, tomografía computarizada, formación de imágenes nucleares (CT) o formación de imágenes por resonancia magnética (MRI).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el transcurso del tiempo para el diseño experimental en el uso de la apertura de la BBB inducida por ultrasonido para mejorar la administración de bevacizumab en ratones portadores de glioma. Bevacizumab se administró por vía intravenosa a 50 mg/kg de peso corporal semanalmente (días 1, 8, 15, 22 y 29 después de la primera prueba de detección mediante resonancia magnética), y la progresión tumoral y la supervivencia se siguieron longitudinalmente mediante T2-RM. La exposición a ultrasonido se realizó semanalmente (días 1, 8, 15, 22 y 29 después de la primera prueba de resonancia magnética, antes de la administración intravenosa de Bevacizumab).
La Figura 2 ilustra los conceptos y las observaciones de MRI representativas de la apertura de la barrera hematoencefálica (BBB) inducida por ultrasonido. (a) Diagrama conceptual para el enfoque experimental que utiliza la apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido para mejorar la administración de bevacizumab para el tratamiento del glioma. (B a I) Análisis CE-MRI representativo de la apertura de la BBB inducida por ultrasonido con un nivel de exposición al ultrasonido intermedio (0,4 MPa, es decir, 0,63 MI) y agresivo (0,8 MPa, es decir, 2 MI). (b, c) Mapas de aumento del nivel de intensidad de la señal de imágenes ponderadas en T1 mejoradas con contraste (en %); (d, e) acumulación de área bajo la curva (AUC) de mapas R1 (en s-1 min); (f, g) Mapas Ktrans (en min-1); (h, i) Ve mapas.
La Figura 3 muestra la cuantificación de la penetración de Bevacizumab administrada, la correlación con las imágenes de RM y la transferencia de Western. (a) Concentración de bevacizumab con diferentes exposiciones a ultrasonido (0, 0,4 y 0,8 MPa; es decir, 0, 0,63 y 2 MI respectivamente) nivel medido por HPLC; (b-e) Correlaciones de la concentración de bevacizumab con diferentes índices de resonancia magnética realzada con contraste, incluido el aumento de SI en T1-WI (penal (b)), cambio de nivel de R1-AUC (penal (c)), cambio de nivel de Ktrans (penal (d)), y cambio de nivel de Ve (penal (e)). (f) Western blot que muestra una mayor penetración de Bevacizumab en el SNC después de la apertura de la BBB inducida por ultrasonido. (g) Comparación del análisis cuantitativo de la intensidad de Western blot. El símbolo "***" representa p < 0,001. BEV = Bevacizumab.
La Figura 4 muestra las observaciones microscópicas fluorescentes de la administración de dextranos marcados con fluorescencia de 70 kDa asistida por ultrasonido en el SNC. (a, b) Hemisferios izquierdo y derecho del animal controlado sin exposición a ultrasonido y sin señal fluorescente detectada debido a la BBB intacta. (c, d) animal tratado con una exposición de ultrasonido de 0,3 MPa en el hemisferio derecho (intensidad fluorescente de 42 354 ± 3937 a.u.). (e, f) animal tratado con exposición a ultrasonidos de 0,4 MPa (es decir, 0,63 MI) en el hemisferio derecho (intensidad fluorescente de 81 329 ± 7926 a.u.). (g, h) animal tratado con una exposición a ultrasonidos de 0,53 MPa (es decir, 0,84 MI) en el hemisferio derecho (intensidad fluorescente de 85348 ± 1050 a.u.). Bar = 100 pm.
La Figura 5 muestra las observaciones microscópicas fluorescentes de la administración de dextranos marcados con fluorescencia de 150 kDa asistida por ultrasonido en el SNC. (a, b) Hemisferios izquierdo y derecho del animal controlado sin exposición a ultrasonido y sin señal fluorescente detectada debido a la BBB intacta. (c, d) animal tratado con una exposición de ultrasonido de 0,3 MPa/0,4 MHz en el hemisferio derecho (intensidad fluorescente de 22 716 ± 3706 a.u.). (e, f) animal tratado con exposición a ultrasonidos de 0,4 MPa (es decir, 0,63 MI) en el hemisferio derecho (intensidad fluorescente de 29 208 ± 7518 a.u.). (g, h) animal tratado con exposición a ultrasonidos de 0,53 MPa/0,4 MHz (es decir, 0,84 MI) en el hemisferio derecho (intensidad fluorescente de 52643 ± 11644 a.u.). Bar = 100 pm.
La Figura 6 muestra las observaciones microscópicas fluorescentes de la administración de dextranos marcados con fluorescencia de 250 kDa asistida por ultrasonido en el SNC. (a, b) Hemisferios izquierdo y derecho del animal controlado sin exposición a ultrasonido y sin señal fluorescente detectada debido a la BBB intacta. (c, d) animal tratado con una exposición de ultrasonido de 0,3 MPa (es decir, 0,47 MI) en el hemisferio derecho (intensidad fluorescente de 42012 ± 5764 a.u.). (e, f) animal tratado con una exposición a ultrasonidos de 0,4 MPa (es decir, 0,63 MI) en el hemisferio derecho (intensidad fluorescente de 60504,81 ± 1956,97 a.u.). (g, h) animal tratado con una exposición de ultrasonido de 0,53 MPa (es decir, 0,84 MI) en el hemisferio derecho (intensidad fluorescente de 71672 ± 7770 a.u.). Bar = 100 pm.
La Figura 7 muestra la comparación del cambio de intensidad de fluorescencia bajo varios tamaños moleculares y de presión activados mejorados por ultrasonido. Los animales de control sin recibir exposición a ultrasonidos no permiten la penetración de dextranos debido al bloqueo de BBB. Puede detectarse una intensidad de fluorescencia más alta cuando se aplica una presión acústica más alta o cuando se administra un tamaño más pequeño de dextranos marcados con fluorescencia.
La Figura 8 indica las correlaciones de la intensidad de fluorescencia con las concentraciones de tres dextranos marcados con fluorescencia. (a-c) Varios tamaños de dextranos marcados con fluorescencia muestran una alta correlación entre la intensidad de la fluorescencia y la concentración (r2 = 0,9517, 0,8447 y 0,9679 para 70 kDa (penal (a)), 150 kDa (penal (b)), y 250 k-Da (penal (c)), respectivamente).
La Figura 9 muestra la resonancia magnética ponderada en T2 representativa para seguir la progresión del tumor. (a-d) Se empleó resonancia magnética ponderada en T2 para monitorear la progresión del tumor cerebral semanalmente desde los días 7 a 35 en cada grupo experimental. La apertura de la BBB inducida por ultrasonido sola (penal (b)) presentó una progresión tumoral similar al control no tratado (penal (a)), mientras que la administración de bevacizumab solo proporcionó una mejor supresión de la progresión tumoral (penal (c)). Entre los grupos, la apertura de la BBB combinada inducida por ultrasonido con la administración de bevacizumab proporcionó el efecto supresor del tumor más significativo (penal (d)).
La Figura 10 muestra el análisis de progresión tumoral y supervivencia animal. (a, b) Progresión tumoral desde los días 7 a 35 en cada grupo experimental. Penal (a) muestra el volumen del tumor (en mm3) y penal (b) muestra la tasa de progresión semanal del tumor (en %). (c) Diagrama de Kaplan-Meier para demostrar la supervivencia animal entre cada grupo experimental. BEV = Bevacizumab.
La Figura 11 muestra la comparación de tinciones de HE y microscopía de fluorescencia inmunoquímica (IHC) teñida con CD-31. (a-c) La tinción HE y la microscopía IHC CD-31 muestran un tumor cerebral tratado con la administración de bevacizumab solo. (d-f) La tinción HE y la microscopía IHC CD-31 muestran un tumor cerebral tratado con apertura de BBB inducida por ultrasonido combinado con administración de bevacizumab. Bar = 500 pm. (g) Comparación cuantitativa de la densidad de vasos medida dentro de las regiones tumorales. (h, i) Las imágenes ampliadas muestran la vascularización marcada con CD-31 obtenida de (C) y (F), respectivamente. Bar = 100 pm.
La Figura 12 muestra las imágenes de PET/CT corregidas por descomposición representadas de ratones con apertura de BBB 15 min después de la inyección de 68Ga-bevacizumab. a. Grupo experimental (n=3), los ratones se trataron con ultrasonido y se les inyectó 68Ga-bevacizumab. Los círculos indican los sitios de orientación del ultrasonido. Grupo control (n=3) con la misma dosis de inyección de 68Ga-bevacizumab, pero sin el tratamiento con ultrasonido b. Cuantificación PET del efecto de apertura de la BBB y perfil de biodistribución de los órganos principales (corazón, hígado, riñón, pulmón, músculo) entre ambos grupos. La Figura 13 muestra la cuantificación de la penetración de Bevacizumab administrado. "Vacío" representa el grupo de control (grupo no tratado). "50 mg", "30 mg" y "10 mg" representan los grupos tratados con 50 mg/kg de peso corporal, 30 mg/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal de bevacizumab respectivamente sin exposición a ultrasonidos. "Ultrasonido 50 mg", "ultrasonido 30 mg" y "ultrasonido 10 mg" representan los grupos tratados con 50 mg/kg de peso corporal, 30 mg/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal de bevacizumab respectivamente con ultrasonido exposición.
La Figura 14 muestra el progreso del tumor por volumen. "Control" representa el grupo de control (grupo no tratado). "50 mg" representa el grupo tratado con 50 mg/kg de peso corporal de bevacizumab sin exposición a ultrasonidos. "ultrasonido 30 mg" y "ultrasonido 10 mg" representan respectivamente los grupos tratados con 30 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal de bevacizumab con exposición a ultrasonido. La Figura 15 demuestra la probabilidad de supervivencia del experimento modelo de ratones. "Control" representa el grupo de control (grupo no tratado). "50 mg" representa el grupo tratado con 50 mg/kg de peso corporal de bevacizumab sin exposición a ultrasonidos. "ultrasonido 30 mg" y "ultrasonido 10 mg" representan respectivamente los grupos tratados con 30 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal de bevacizumab con exposición a ultrasonido.
Descripción detallada
La exposición al ultrasonido transcraneal en modo ráfaga de baja presión puede abrir la BHE de forma local, temporal y reversible. La exposición al ultrasonido transcraneal es capaz de suministrar energía focal de manera no invasiva a ubicaciones cerebrales profundas. La interrupción de b Bb puede aumentar la concentración local de agentes terapéuticos en el cerebro sin dañar el tejido normal.
El término "cantidad eficaz" que se utiliza aquí se refiere a una cantidad de reactivo, fármaco o medicamento que es suficiente para obtener el efecto deseado para el sujeto que lo necesita. La descripción de "tratamiento de un tumor cerebral" o similar utilizada en el presente documento se refiere, entre otros, a reducir y/o prevenir el progreso del tumor, reducir el tamaño del tumor, reducir y/o prevenir el efecto del tumor en la fisiología normal de un sujeto, o una combinación de los mismos.
El término "medio de respuesta a ultrasonidos" utilizado aquí se refiere a un medio que es capaz de proporcionar cavitación en respuesta a la potencia acústica de los ultrasonidos. En una realización preferente, dicha cavitación puede abrir la BBB y, más preferentemente, aumentar la permeabilidad a través de la BBB. Sin estar ligado a ninguna teoría, dicho medio de respuesta a ultrasonidos se utiliza sinérgicamente con dicha exposición a ultrasonidos para abrir o romper la BHE y, por lo tanto, aumentar la permeabilidad del medicamento.
Un aspecto de la presente invención es proporcionar bevacizumab para su uso en el tratamiento de un tumor cerebral de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. Mediante el uso de Bevacizumab para el uso de la invención, puede reducirse la cantidad eficaz de Bevacizumab requerida para tratar el tumor cerebral. En una realización alternativa, dicho tumor cerebral podría ser meningioma o astrocitoma. En una realización específica, dichos astrocitomas son Glioblastoma multiforme.
El Bevacizumab para uso de la presente invención comprende administrar Bevacizumab a un sujeto; administrar un medio de respuesta a ultrasonidos a dicho sujeto; y administrar dicho sujeto con una exposición a ultrasonidos. En una realización alternativa, no existe un orden particular para realizar los tres pasos anteriores.
En una realización, dicho Bevacizumab está en una cantidad de 0,11 a 11 mg/kg de peso corporal; más preferentemente, es de 1,1 a 11 mg/kg de peso corporal.
En una realización preferente, se administra una cantidad de 1,9 * 106 a 1,17 * 108 partículas/kg de peso corporal de dichas partículas. En una realización alternativa, dichas partículas tienen un diámetro medio de 0,1 a 10 pm. Preferentemente, dichas partículas son microburbujas. En una realización alternativa, dicha microburbuja tiene una estructura de núcleo-envoltura; en el que dicha cubierta se hace de materiales biocompatibles (incluidos, entre otros, albúmina, lípidos o polímeros similares) y el núcleo es un medio gaseoso biocompatible. En una realización alternativa, dicha microburbuja comprende una microburbuja recubierta de albúmina, una microburbuja cubierta de lípido, una microburbuja llena de gas o una combinación de las mismas. En otra realización alternativa, dicha microburbuja puede ser un producto comercialmente disponible, tal como los productos de SonoVue®, Definity®, Optison®, Imagent®, Levovist® o Lumason®.
En una realización alternativa, dicha exposición a ultrasonidos es de 0,55 a 0,84 MI (índice mecánico; definido como donde P es la presión negativa máxima (en MPa) y f es la frecuencia (en MHz)). Preferentemente, dicha exposición a ultrasonidos se realiza en el sistema nervioso central del sujeto; más preferentemente, en el cerebro del sujeto.
Otro aspecto de la presente invención es una combinación de una formulación de Bevacizumab y un medio de respuesta de ultrasonido para usar en un tratamiento de un tumor cerebral en el que dicha combinación se comprende en un kit, y dicho kit comprende además un sistema de ultrasonido que comprende un transductor de ultrasonido de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. En una realización alternativa, dicho tumor cerebral podría ser meningioma o astrocitoma. En una realización específica, dichos astrocitomas son Glioblastoma multiforme. En una realización alternativa, dicha formulación de Bevacizumab comprende de 0,11 a 25 mg/ml de Bevacizumab y un vehículo para inyección. Dicho vehículo para inyección podría ser, entre otros, agua, solución salina, polímero, emulsionante, tensioactivo o una combinación de los mismos.
Dicho medio de respuesta a ultrasonidos del kit de la presente invención es el mismo expuesto en los párrafos anteriores respecto al método de la presente invención. En una realización preferente, dicho medio de respuesta a ultrasonidos se mezcla con un vehículo para inyección como una formulación y dicha formulación comprende de 1 * 104 a 1 * 1012 partículas/ml de partículas; donde dicha partícula/ml se basa en el volumen total de dicha formulación. Alternativamente, dicho vehículo para inyección es agua, solución salina, polímeros, emulsionante, tensioactivo o una combinación de los mismos. En una realización preferente, dichas partículas se formulan como una preparación que comprende dichas partículas, solución salina y heparina.
Un sistema de ultrasonido típico generalmente incluye un transductor de ultrasonido y un tanque de agua. En una realización específica, dicho sistema de ultrasonidos es un sistema de ultrasonidos de guía en base a imágenes médicas. En una realización preferente, dicho sistema de ultrasonido es un sistema de ultrasonido guiado por neuronavegación, que además incluye un sistema de neuronavegación (Tsai y otros, Ultrasonics Symposium (IUS), 2015 IEEE International). En una realización alternativa, dicho sistema de ultrasonido podría ser un sistema de ultrasonido guiado por ultrasonografía, un sistema de ultrasonido guiado por imágenes ópticas, un sistema de ultrasonido guiado por tomografía computarizada, un sistema de ultrasonido guiado por imágenes nucleares (TC) o un sistema de ultrasonido guiado por resonancia magnética.
Los siguientes experimentos y detalles se proporcionan para una mayor explicación del espíritu y la concepción de la presente invención. Cabe señalar que la siguiente información no pretende limitar el alcance de la reivindicación de la presente invención. Los expertos en la materia podrán modificar la siguiente descripción detallada de la presente invención sin apartarse del espíritu de la presente invención.
Experimentos 1 a 4.
Materiales y Métodos de los siguientes Experimentos 1 a 4
1. Modelo animal de glioma U87.
Se cultivaron células de glioma de ratón U87 a 37 °C con CO2 al 5 % en MEM con suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (Invitrogen). Ratones NU/NU macho libres de patógenos (5-7 semanas de edad, 20­ 25 gramos) de BioLASCO (Taiwán) se alojaron en un ambiente controlado y todos los experimentos fueron aprobados por nuestro Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Para implantar células U87, los animales fueron anestesiados con gas isoflurano al 2 % e inmovilizados en un marco estereotáctico. Se realizó una incisión sagital a través de la piel que recubre la bóveda craneal y se usó una aguja 27G para crear un orificio en el cráneo expuesto 1,5 mm anterior y 2 mm lateral al bregma. Se inyectaron cinco microlitros de suspensión de células U87 (1 x 1o5 células/pl) a una profundidad de 2 mm desde la superficie del cerebro durante un período de 5 minutos, y se retiró la aguja durante 2 minutos. El crecimiento del xenoinjerto se controló mediante MRI durante 10 días después de la implantación.
2. Diseño experimental.
Se utilizaron doce ratones normales y 42 con tumor. En el grupo 1, el objetivo era evaluar si la apertura de la BBB inducida por ultrasonido mejoraba la penetración de bevacizumab en ratones normales (n = 4) y determinar el rango de potencia de ultrasonido apropiado (n = 4) y para el análisis de transferencia Western (n = 8; 4 normales y 4 tumorales). En el grupo 2, el objetivo fue evaluar la eficacia terapéutica de bevacizumab combinado con exposición a ultrasonidos en ratones portadores de tumores. Hubo 4 subgrupos: (1) simulado (n = 7); (2) ultrasonido solo (n = 9); (3) bevacizumab solo (n = 6), bevacizumab se administró por vía intravenosa a 50 mg/kg de peso corporal semanalmente (días 1, 8, 15, 22 y 29 después de la primera prueba de detección con resonancia magnética); y (4) bevacizumab apertura de BBB por ultrasonido (n = 12), bevacizumab se administró por vía intravenosa a 50 mg/kg de peso corporal semanalmente (días 1, 8, 15, 22 y 29 después de la 1ra prueba de resonancia magnética). En el grupo 2, el criterio de valoración fue un volumen tumoral medido por IRM > 200 mm3 o superior al 20 % de caída del peso corporal durante una semana. El curso de tiempo para el diseño experimental se muestra en la Figura 1.
3. Exposición a ultrasonido.
La ecografía es una ecografía guiada por neuronavegación de acuerdo con Tsai y otros, Simposio de ultrasonidos (IUS), 2015 IEEE International. Se aplicó un transductor de ultrasonido (Sonic Concepts Inc., Washington, EE. UU.; diámetro = 60 mm, radio de curvatura = 52 mm, frecuencia = 400 kHz) para generar energía ultrasónica concentrada. Se usó un generador de funciones arbitrarias (33220A, Agilent, Palo Alto, CA) para producir la señal de conducción, que se alimentó a un amplificador de potencia de radiofrecuencia (No. 500-009, Advanced Surgical Systems, Tucson, AZ) que operaba en modo de ráfaga. Los animales anestesiados se inmovilizaron en un marco estereotáctico y se insertó un catéter PE-10 en las venas de la cola. El animal se colocó directamente debajo de un tanque de agua acrílico con la cabeza firmemente unida a una ventana de película delgada de 4 x 4 cm2 en la parte inferior para permitir la entrada de energía ultrasónica. Se administraron por vía intravenosa partículas de ultrasonido llenas de SonoVue® SF6 (2-5 pm, 10 pl/ratón, 2 x 108 microburbujas/ml; Bracco, Milán, Italia) antes del ultrasonido. El sitio del cerebro del hemisferio del tumor-implante se expuso luego a ultrasonido en modo de ráfaga (potencia eléctrica = 4-18 W; presión negativa máxima = 0,1 a 2 MI; duración de la ráfaga = 10 ms; frecuencia de repetición del pulso = 1 Hz; tiempo de exposición = 60 s).
4. Formación de imágenes por resonancia magnética (IRM).
Se utilizó una resonancia magnética con contraste para evaluar el aumento de la permeabilidad de la BBB mediante la administración de Gd-DTPA (Magnevist, Wayne, NJ, EE. UU.) y obtener los siguientes índices de imagen: (1) aumento de la intensidad de la señal en las imágenes ponderadas en T1 después de la inyección de Gd-DTPA 10; (2) Área bajo la curva de la relajación R1 durante un período (indicado como R1-AUC); (3) el parámetro cinético "Ktrans", tasa de transferencia constante desde el sistema intravascular al espacio extravascular extracelular, caracterizado a partir del modelo compartimental de Kety; (4) el parámetro cinético "Ve", fracción de volumen del agente de contraste en el EES, caracterizado a partir del modelo compartimental de Kety.
Se adquirieron secuencias de imágenes ponderadas por susceptibilidad para identificar extravasaciones de eritrocitos a gran escala (parámetros: TR/t E = 30 ms/18 ms; ángulo de giro = 40°; espesor de corte = 0,6 mm; tamaño de matriz = 256 * 384; y FOV = 80 * 130 mm2). Las imágenes de resonancia magnética se adquirieron en un escáner de resonancia magnética de 7 Tesla (Bruker ClinScan, Alemania) y se usó una bobina de superficie de 4 canales en la parte superior del cerebro del ratón. Los animales anestesiados se colocaron en un soporte acrílico y se colocaron en el centro del imán. El tamaño del tumor se cuantificó mediante el uso de imágenes ponderadas en T2 en base a turbo-spin-eco con los siguientes parámetros: tiempo de repetición de pulso (TR)/tiempo de eco (TE) = 2540/41 ms; FOV = 19 * 30 mm2 (156 * 320 píxeles); espesor de corte = 0,5 mm; ángulo de giro =180; tiempo total de adquisición = 155 segundos. El tamaño relativo del tumor se estimó al medir el portaobjetos de una sola imagen que contenía el área máxima del tumor, y se tomaron imágenes longitudinales de los animales cada 7 días hasta 35 días después de la primera pantalla de resonancia magnética.
5. Examinación histológica.
Se inyectó colorante azul de Evans por vía intravenosa y los animales se sacrificaron después de dos horas. La histopatología se realizó en secciones de 10 pm de cerebros incluidos en parafina y fijados con paraformaldehído. Los portaobjetos se colocaron en un frasco de tinción que contenía una solución de ácido clorhídrico y ferrocianuro de potasio durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se contrastaron con rojo nuclear rápido durante 5 min. Se utilizó tinción con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar el daño del tejido cerebral y la progresión del tumor.
Para evaluar la vascularidad, los portaobjetos se sometieron a inmunofluorescencia con anticuerpo antimouse-CD31 (1:500, 55 0274, BD Pharmingen, NJ, EE. UU.) y anticuerpo de cabra antirata Dylight 488 (1:200, 405 409, Biolegend, CA, EE. UU.). Los vasos sanguíneos del tumor se cuantificaron como el área total del vaso en relación con el área de la sección transversal del tumor.
6. Mancha occidental.
Se usaron 50 pg de proteína (IgG anti-humana de cabra, AP112P, Millipore, EE. UU.) de tejidos cerebrales homogeneizados para el análisis de transferencia Western. La densidad de la banda óptica en la película se analizó mediante el uso del sistema de imágenes BioSpectrum (UVP LLC, Upland, CA).
7. Análisis cuantitativo de bevacizumab.
Los animales se sacrificaron 2 horas después de la ecografía y los cerebros se dividieron en hemisferios derecho e izquierdo y se homogeneizaron con 10 pl/mg/ml de metanol. El bevacizumab extraído se analizó por HPLC con un detector UV Modelo L-2400 y una bomba Modelo L-2130 (Hitachi), y una columna SUPELCOSIL™ LC-18 (4,6 • 250 mm).
8. Análisis estadístico.
La significación estadística se calculó mediante el uso de la prueba t no pareada de dos colas o la prueba de Mantel-Cox. Se utilizó el método de Kaplan-Meier para el análisis de supervivencia. Se asumió significación estadística en p < 0,05.
Experimento 1: el ultrasonido abre efectivamente BBB y aumenta la concentración de bevacizumab en el cerebro. En este experimento, se realizó una exposición a ultrasonidos transcraneales de 0,63 MI o 2 MI (es decir, con una presión máxima negativa de 0,4 MPa o 0,8 MPa) de acuerdo con el método expuesto anteriormente para evaluar su efecto sobre la apertura de la BBB. Además, se administró bevacizumab antes de realizar la exposición al ultrasonido para ver si la exposición al ultrasonido contribuía con algún beneficio a la penetración de Bevaczumab a través de la BBB.
La apertura de BBB se confirmó mediante resonancia magnética con contraste. Para esta confirmación se utilizaron cuatro tipos de índices CE-MRI. El resultado que se muestra en la Figura 2 indicó que tanto la exposición al ultrasonido de 0,63 MI como la de 2 MI abrieron efectivamente la BBB en las regiones cerebrales objetivo. Además, una mayor presión contribuyó a un mayor efecto de apertura de BBB.
Se usó HPLC para cuantificar la concentración de bevacizumab en el cerebro. El resultado mostró que la ecografía aumentó la concentración de bevacizumab en el parénquima del SNC. La exposición intermedia a ultrasonidos de 0,63 MI resultó en 0,175 ± 0,15 pM de penetración de bevacizumab en el SNC (es decir, un aumento de 5,73 veces), mientras que la exposición agresiva a ultrasonidos de 2 MI aumentó significativamente el bevacizumab a 1,554 ± 0,37 |jM (es decir, un aumento de 58,77 veces) (Figura 3a). En los controles, bevacizumab normalmente se limita a la circulación y penetra en el SNC en cantidades muy limitadas (0,026 ± 0,02 j M). También se analizaron los cuatro índices CE-MRI con correlaciones a las concentraciones de bevacizumab (Figuras 3b-e). Se observó que R1-AUC tenía la correlación lineal más alta con el nivel de bevacizumab medido (Figura 3c; r2 = 0,738). El aumento de la intensidad de la señal en las imágenes ponderadas en T1 o Ktrans proporcionó una correlación moderada con el nivel de bevacizumab con un coeficiente de correlación superior a 0,6 (r2 = 0,678 y 0,606, respectivamente; Figura 3b y 3d), mientras que Ve se correlacionó menos con el nivel de bevacizumab (r2 = 0,56; Figura 3e). En general, los cuatro índices proporcionaron una correlación suficiente con la mejora de la apertura de la BBB inducida por ultrasonido in vivo de la administración de bevacizumab en el SNC.
Experimento 2: El efecto de la apertura de BBB inducida por ultrasonido en la penetración molecular de diferentes tamaños moleculares.
Para comprender la influencia de la penetración molecular con el tamaño molecular y el nivel de exposición al ultrasonido, se sirvieron dextranos marcados con fluorescencia (70 a 250 kDa) con un peso molecular similar al bevacizumab (150 kDa) como sustitutos para ajustar el nivel de exposición (0,55 a 0,84 Mi) alrededor del nivel de exposición intermedio (es decir, 0,4 MPa/0,63 MI). Se descubrió que un nivel de presión superior a 0,55 MI era capaz de inducir la apertura de la BBB y permitir la penetración de moléculas de todos los tamaños, incluidas las fluorescentes de 70 kDa (Figura 4), 150 kDa (Figura 5) y 250 kDa (Figura 6) dextranos marcados, lo que sugiere que un nivel de exposición de 0,63 MI debería proporcionar una penetración molecular estable y consistente con la molécula al menos hasta 250 kDa. Sin embargo, la intensidad de la fluorescencia aumentó en el cerebro, ya sea aumentando el nivel de exposición al ultrasonido o al disminuir el peso molecular, lo que sugiere que un nivel de exposición más pequeño o más alto contribuye a una mayor penetración molecular (Figura 7). La exposición al ultrasonido aumentada a 0,84 MI comenzó a inducir extravasaciones de eritrocitos notables pero mínimas (Figura 8c), pero no se observaron a un nivel de exposición más bajo (Figuras 8a-b). Estas extravasaciones causadas por la exposición de 0,84 MI no pudieron detectarse en T2* resonancia magnética; en contraste, la exposición de 2 MI indujo una caída aparente en la intensidad de la señal en T2* MRI, lo que sugiere que se induce una escala relativamente mayor de extravasaciones de eritrocitos que una exposición de 0,84 MI. Considerándolos juntos, se seleccionó el nivel de exposición al ultrasonido de 0,63 MI para la siguiente sonicación del tumor portador de glioma.
Se realizaron transferencias Western para medir los niveles de proteína bevacizumab en cerebros expuestos a ultrasonido (Figura 3f). No se detectó bevacizumab en los animales de control o solo con ultrasonido. Con la administración de bevacizumab solo, solo se detectó una banda de 150 kDa, lo que indica la presencia de bevacizumab en el SNC. Por el contrario, la combinación de exposición a ultrasonido (0,63 MI) con la administración de bevacizumab aumentó notablemente los niveles de proteína bevacizumab detectable. El ultrasonido con la administración de bevacizumab produjo un aumento de casi 3 veces en la intensidad de hibridación (Figura 3g), que fue similar a la penetración mejorada determinada por el análisis de HPLC (12,238 frente a 4,138 en los recuentos detectados).
Experimento 3: Estrategia de combinación de ultrasonido y bevacizumab para la terapia del glioma
Nuestro objetivo fue evaluar si la administración mejorada de bevacizumab con la apertura de la BBB inducida por ultrasonido mejoraba la terapia del glioma. El nivel de exposición a ultrasonidos de 0,63 MI se seleccionó para evitar la extravasación de eritrocitos asociada al régimen de tratamiento repetitivo planificado de cinco semanas. Consulte la sección "Diseño del experimento" y la Figura 1.
Las imágenes típicas de seguimiento del tumor se muestran en la Figura 9 (días 7 a 35), con la progresión del volumen del tumor medida por T2-MRI (Figuras 10a-b). En general, los controles no tratados (Figura 9a) y la exposición a ultrasonido sola (Figura 9b) mostraron un crecimiento tumoral progresivo (las proporciones de progresión tumoral con un intervalo de seguimiento de 10-35 días fueron 172 ± 33,2 % y 185 ± 22,6 %, respectivamente). El tratamiento con bevacizumab solo (Figura 9b) mostró un efecto supresor del tumor en las primeras cuatro semanas de tratamiento, pero la progresión del tumor aumentó en la semana 5. La progresión global del tumor (152 ± 27,7 %) no fue significativamente diferente de los grupos de control (p = 0,6477) o de tratamiento con ultrasonido solo (p = 0,3735). La administración de bevacizumab combinada con la apertura de la BBB por ultrasonido (Figura 9d) redujo consistentemente la progresión del tumor a lo largo del régimen de tratamiento de cinco semanas y mostró el control más profundo de la progresión del tumor cuando se evaluó a través de T2-MRI (45 ± 16,11 %, p=0,0016 vs. grupo control; Figuras 10a-b). Este resultado sugiere que la penetración mejorada de bevacizumab facilitada por la exposición al ultrasonido contribuye a un efecto antiangiogénico estable y sostenido para controlar la progresión del tumor.
El tratamiento combinado de ultrasonido y bevacizumab se realizó durante 5 semanas (días 7-35), luego se evaluó la supervivencia de los animales a los 100 días (Figura 10c y Tabla 1). los animales con ultrasonido solo no mostraron una extensión efectiva de la supervivencia, al igual que se observó en la progresión del tumor monitoreada por resonancia magnética (mediana de supervivencia = 34 días en comparación con 31 días en el control; mediana IST = 9,68 %; p = 0,5407). La administración de bevacizumab durante cinco semanas contribuyó a prolongar significativamente la supervivencia a 46 días en comparación con los controles (mediana IST = 48,39 %; p = 0,0369). La estrategia combinada de apertura de la BBB inducida por ultrasonido y administración de bevacizumab resultó en una mediana de supervivencia significativamente mejorada de 73 días, que es 2,35 veces mayor que la mediana de supervivencia del control y 1,58 veces mayor que bevacizumab solo. La observación equivalente también se mantiene cuando se calcularon la supervivencia media y la media de IST.
Tabla 1. Resumen del análisis de supervivencia animal. Se encontró que el aumento en la mediana del tiempo de supervivencia (ISTmedian; en %) fue del 135 % en el grupo combinado de ultrasonido/bevacizumab y superó al 48 % en el grupo de bevacizumab solo. De manera similar, se encontró que el aumento en el tiempo de supervivencia medio (ISTmedia; en %) fue del 143 % en el grupo combinado de ultrasonido/bevacizumab y superó al 76 % en el grupo de bevacizumab solo; los valores de p son todos relativos al grupo de control.
grupo (n) Supervivencia encia
ISTm e d ia n a Superviv
(%) ISTm e d ia
mediana (días) media (días) Valor-p (%)
Control (7) 31 -- 29,71 ± 5,35 -- --Ultrasonido solo (9) 34 9,68 33,67 ± 4,82 13,33 0,5407 Bevacizumab solo (6) 46 48,39 52,33 ± 14,8 76,14 0,0369 Ultrasonido Bevacizumab
(12) 73 135,48 72,33 ± 18,9 143,45 0,0001
Se utilizaron la tinción H&E y la inmunohisoquímica (IHC) de CD-31 para evaluar los cambios morfológicos y las distribuciones vasculares de los xenoinjertos tumorales de la semana 4 después de la administración de bevacizumab solo o combinado con la apertura de la BBB inducida por ultrasonido (Figura 11). Se detectó una morfología tumoral similar en la apertura de bevacizumab solo o bevacizumab ultrasonido-BBB: un núcleo tumoral necrótico acompañado de bordes tumorales altamente proliferativos. CD-31 IHC visualizó una estructura vascular enriquecida dentro de los bordes del tumor, pero no el núcleo necrótico, de los tumores tratados con bevacizumab solo (marcados con flechas blancas). Por el contrario, se observó una reducción significativa en la distribución vascular marcada con CD-31 en los xenoinjertos tratados con bevacizumab ultrasonido, y los bordes del tumor eran significativamente más pequeños que los tumores tratados con bevacizumab solo (contorneado por una línea discontinua; Figura 11c y Figura 11f). El análisis cuantitativo de los vasos sanguíneos del tumor demostró que el porcentaje medio (± DE) del área de los vasos en xenoinjertos tumorales de animales tratados con bevacizumab solo fue de 0,93 ± 0,19 %. El área del vaso disminuyó notablemente en los xenoinjertos tratados con ultrasonido combinado y bevacizumab, con un área del vaso de 0,2 ± 0,07 % (Figura 11c, Figura 11f, Figura 11g). También se observó necrosis tisular mediante tinción con H&E en el área que rodea al tumor (Figura 11b, Figura 11e). Estos datos sugieren que la adición de la apertura de BBB por ultrasonido mejoró la penetración de bevacizumab y suprimió de manera efectiva la angiogénesis, particularmente en la periferia del tumor, lo que resultó en un mejor control del tumor.
Experimento 4
Experimento 4: la apertura de BBB inducida por ultrasonido aumenta la penetración de bevacizumab
Habíamos demostrado que el ultrasonido aumentó la penetración molecular de diferentes tamaños moleculares en experimentos anteriores. Se propuso además que la exposición al ultrasonido puede disminuir la dosis requerida de bevacizumab en el tratamiento del giloblastoma multiforme. Para verificar nuestra hipótesis, ratones normales y ratones en gestación fueron tratados con bevacizumab de varias dosis con o sin ultrasonido. La concentración de bevacizumab en el parénquima del SNC se determinó por HPLC. La curva de penetración (dosis dada frente a la concentración de bevacizumab en el parénquima del SNC) se realizó en consecuencia. Las operaciones de ultrasonido y HPLC fueron las mismas que se exponen en los experimentos anteriores 1-4.
Específicamente en los experimentos, se utilizaron 42 ratones normales y 42 ratones portadores de tumores. En el grupo 1, los ratones recibieron bevacizumab de 50 mg/kg de peso corporal solo (n=3) o con ultrasonido (n=3); en el grupo 2, los ratones recibieron bevacizumab de 25 mg/kg de peso corporal solo (n=3) o con ultrasonido (n=3); en el grupo 3, los ratones recibieron bevacizumab de 10 mg/kg de peso corporal solo (n=3) o con ultrasonido (n=3); en el grupo 4, los ratones no fueron tratados (n=3) como controles negativos. La concentración de bevacizumab también puede determinarse mediante microPET/micro-CT. El siguiente es el resultado principal de evaluar el cambio dinámico de la distribución de bevacizumab a través de microPET/micro-CT.
El cambio dinámico de la distribución de bevacizumab se evaluó a través de imágenes fusionadas microPET/micro-CT con bevacizumab radiomarcado con radioisótopo 68Ga3+ (vida media: 68 min; procedimientos ver los métodos complementarios). Las imágenes PET se adquirieron 15 minutos después de la inyección intravenosa y las imágenes PET coronales representativas de ambos grupos, con este punto de tiempo el contraste de la región objetivo alcanzó el máximo como unión no específica.
La penetración de 68Ga-bevacizumab en ratones con apertura BBB muestra una mejora significativa en la región insonificada mediante el uso de la administración de partículas combinadas con tratamiento de ultrasonido. La penetración de 68Ga-bevacizumab aumentó de 0,16 ± 0,026 SUVmáx a 0,64 ± 0,09 SUVmáx (Figura 12a) correspondiente a una mejora de 4 veces, que fue comparable a los resultados cuantificados por HPLC (5,73 veces). La captación sistémica muestra que bevacizumab se absorbe y metaboliza principalmente desde el riñón. Los animales sometidos a ultrasonido-BBB la apertura no cambia la ruta metabolizada de bevacizumab, aunque hubo una ligera disminución del nivel de SUVmax en comparación con los grupos de control (7,53 ± 4,05 SUVmax vs. 8,19 ± 7,29 SUVmáx; p > 0,05; ver Figura 12b).
Experimento 5
Materiales y Métodos del siguiente Experimento 5:
1. Diseño experimental
Se utilizaron un total de 45 ratones portadores de tumores, incluidos ratones normales (n = 19) y portadores de tumores (n = 26). Los experimentos se dividieron en dos grupos. En el grupo experimental 1, el objetivo principal era evaluar si la apertura de la BBB inducida por ultrasonido promovía la penetración y el depósito de Bevacizumab en el tejido cerebral (n = 19). La mayoría de los animales normales se dividieron en dos grupos, sin apertura de la BHE inducida por ultrasonido (n = 10) y con apertura de la BHE inducida por ultrasonido (n = 9), y las muestras de cerebro con la concentración de bevacizumab se cuantificaron mediante inmunoabsorción ligado a enzimas, kit de ensayo (ELISA). Todos los animales se sacrificaron y las muestras de cerebro se conservaron 2 horas después de la administración de Bevacizumab.
En el grupo experimental 2, el objetivo fue evaluar la eficacia terapéutica de Bevacizumab combinado con ultrasonido en ratones portadores de tumores. La captación de bevacizumab se realizó 10 días después de la implantación de células de glioma U87. Bevacizumab se administró IV cinco veces (días 10, 17, 24, 31 y 38 después de la implantación de células de glioma U87) y se siguió longitudinalmente la progresión del tumor y la supervivencia. Los animales se dividieron en 4 subgrupos: (1) simulado (sin administración de Bevacizumab) (n = 10); (2) Bevacizumab 10 mg/kg por semana durante 5 semanas más apertura de la BBB inducida por ultrasonido (n = 8); (3) Bevacizumab 30 mg/kg por semana durante 5 semanas más apertura de BHE por ultrasonido (n = 12) y (4) Bevacizumab 50 mg/kg por semana durante 5 semanas (n = 6).
2. Parámetro de ultrasonido
La ecografía es una ecografía guiada por neuronavegación de acuerdo con Tsai y otros, Ultrasonics Symposium (IUS), 2015 IEEE International. Se aplicó un transductor de ultrasonidos (Imasonics, Besancon, Francia; diámetro = 60 mm, radio de curvatura = 80 mm, frecuencia = 400 kHz) para generar energía ultrasónica concentrada. Se usó un generador de funciones arbitrarias (33120A, Agilent, Palo Alto, CA) para producir la señal de conducción, que se alimentó a un amplificador de potencia de radiofrecuencia (No. 500-009, Advanced Surgical Systems, Tucson, AZ) que operaba en modo de ráfaga. Los animales fueron anestesiados con isoflurano al 2 % e inmovilizados en un marco estereotáctico. Se afeitó la parte superior del cráneo con tijeras y se insertó un catéter PE-10 en la vena de la cola. El animal se colocó directamente debajo de un tanque de agua acrílico (con una ventana de 4 * 4 cm2 en su parte inferior sellada con una película delgada para permitir la entrada de la energía ultrasónica) con la cabeza unida firmemente a la ventana de película delgada. Se administraron por vía intravenosa partículas de ultrasonido llenas de SonoVue SF6 (2-5 pm, 10 pl/ratón, 2 * 108 microburbujas/ml; Bracco, Milán, Italia) antes del tratamiento. El sitio del cerebro implantado en el tumor se expuso luego a ultrasonido en modo de tono de ráfaga para abrir localmente la BBB (0,63 MI; longitud de ráfaga = 10 ms; frecuencia de repetición de pulso = 1 Hz; tiempo de exposición = 60 s).
3. Modelo de glioma de ratón
Se cultivaron células de glioma de ratón U87 a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 en una mediana esencial mínima (MEM) suplementada con suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (Invitrogen). Las células se recogieron mediante tripsinización, se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron (1,6 x 105 células/pl) en MEM para su implantación en el cuerpo estriado de cerebros de ratón. Se compraron ratones NU/NU macho libres de patógenos (5 a 7 semanas de edad) de BioLASCO (Taiwán). Los ratones se alojaron y mantuvieron en un ambiente controlado y todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las pautas de cuidado de animales experimentales del Comité de Animales de la Universidad Chang Gung. Para implantar células tumorales U87, anestesiamos a los animales con gas isoflurano al 2 % y los inmovilizamos en un marco estereotáctico. Se hizo una incisión sagital a través de la piel que recubre la bóveda craneal y se usó una aguja 23G para crear un agujero en el cráneo expuesto 2 mm anterior y 2 mm lateral al bregma. Se inyectaron tres microlitros de suspensión de células de glioma U87 a una profundidad de 2 mm desde la superficie del cerebro. La inyección se realizó durante un período de 3 minutos y la aguja se retiró durante otros 2 minutos. El crecimiento de los cerebros de los ratones se controló mediante MRI durante 10 días después de la implantación de células tumorales.
4. Análisis cuantitativo de bevacizumab
Los tejidos cerebrales se recolectaron 2 horas después de la administración de Bevacizumab. Los tejidos cerebrales se homogeneizaron y centrifugaron a 5000 rpm durante 10 minutos hasta que se observó una clara separación entre el líquido sobrenadante y los componentes del tejido. La concentración de bevacizumab se midió con un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (My Biosource, Inc. San Diego, CA, EE. UU.), la densidad óptica se determinó a 450 nm con el espectrofotómetro de absorción con la sustracción de fondo a 620 nm.
Experimento 5: El ultrasonido aumenta la penetración de bevacizumab y promueve la eficacia de bevacizumab en el tratamiento del glioblastoma multiforme
De acuerdo con el resultado que se muestra en la Figura 13, se observó que, básicamente, la dosis más alta de Bevacizumab administrada resultó en una mayor penetración de Bevacizumab en el cerebro. Además, el tratamiento de 10 mg/kg de peso corporal de Bevacizumab con ultrasonido exhibió una concentración comparable de Bevacizumab en la muestra de cerebro con el tratamiento de 50 mg/kg de peso corporal de Bevacizumab sin exposición a ultrasonido. El tratamiento de 30 mg/kg de peso corporal de Bevacizumab con ultrasonido mostró mucha más penetración de Bevacizumab que el tratamiento de 50 mg de Bevacizumab sin exposición a ultrasonido. El resultado demostró que, con la ayuda de ultrasonido, se requería menos cantidad de Bevacizumab para lograr una concentración comparable en el cerebro. Además, la progresión tumoral fue moderada en los grupos con tratamiento en comparación con el grupo control. Además, los grupos con exposición a ultrasonido mostraron resultados aunque se administró menor cantidad de Bevacizumab (Figura 14).
Además en la prueba de supervivencia (Figura 15), entre otros, el tratamiento de 30 mg/kg de peso corporal de Bevacizumab con ultrasonido aportó la mejor probabilidad de supervivencia. La probabilidad de supervivencia del grupo tratado con 10 mg/kg de peso corporal de Bevacizumab con ultrasonido fue casi tan buena como la del grupo tratado con 50 mg/kg de peso corporal de Bevacizumab sin ultrasonido. El resultado fue consistente con el experimento de penetración establecido anteriormente que muestra que el ultrasonido ayudó a una mayor penetración de Bevacizumab y, por lo tanto, brindó una mejor oportunidad de supervivencia.
Conclusión
En conclusión, el uso de la apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido mejora la administración al SNC del mAb antiangiogénico bevacizumab. La concentración de bevacizumab en el SNC aumenta hasta 57 veces (Figura 2a), lo que da como resultado un efecto antiangiogénico significativo en la periferia del tumor y, lo que es más importante, supera el desafío actual de normalización vascular de bevacizumab en la terapia de GBM. Además, en este estudio se encontró una mejora más profunda de la eficacia terapéutica en la que la ecografía combinada para mejorar la administración de bevacizumab contribuye al 135 % de la mejora de la mediana de supervivencia, en comparación con la mejora del 48 % en la administración de bevacizumab solo (Tabla 1). Este estudio proporciona una prueba de principio para el desarrollo de estrategias terapéuticas que incorporan ultrasonido para mejorar la administración de anticuerpos monoclonales (u otras moléculas grandes) al SNC, y sugiere la combinación de ultrasonido/bevacizumab como una estrategia anti-GBM prometedora.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Bevacizumab para el uso en el tratamiento de un tumor cerebral, el tratamiento que comprende los siguientes pasos:
administrar Bevacizumab a un sujeto; en el que dicho Bevacizumab está en una cantidad de 0,011 a 11 mg/kg de peso corporal para un ser humano;
administrar un medio de respuesta a ultrasonidos a dicho sujeto; y
administrar a dicho sujeto una exposición a ultrasonidos de 0,47 a 1,26 de índice mecánico (MI), en el que dicho medio de respuesta a ultrasonidos es una pluralidad de partículas; y en el que dicha exposición a ultrasonidos se administra en un sistema nervioso central de dicho sujeto.
2. Bevacizumab para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha exposición a ultrasonidos es de 0,55 a 0,84 MI.
3. Bevacizumab para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho Bevacizumab está en una cantidad de 0,11 a 11 mg/kg de peso corporal para un ser humano.
4. El Bevacizumab para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha administración de dicho Bevacizumab se realiza mediante inyección intravenosa.
5. El Bevacizumab para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha administración para dicho medio de respuesta de ultrasonido es mediante inyección intravenosa.
6. El bevacizumab para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas partículas tienen un diámetro medio de 0,1 a 10 pm.
7. El bevacizumab para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha pluralidad de partículas es de una cantidad de 1,9 * 10 6 a 1,17 * 10 8 partículas/kg de peso corporal para dicha administración.
8. Bevacizumab para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas partículas son microburbujas.
9. Una combinación de una formulación de Bevacizumab y un medio de respuesta de ultrasonido para el uso en el tratamiento de un tumor cerebral, en el que dicha combinación está comprendida en un kit, y dicho kit comprende además un sistema de ultrasonido que comprende un transductor de ultrasonido;
en el que una administración de Bevacizumab es en una cantidad de 0,011 a 11 mg/kg de peso corporal para un ser humano, y dicho sistema de ultrasonido se configura para generar una exposición de ultrasonido de 0,47 a 1,26 Mi,
en el que dicho medio de respuesta a ultrasonidos es una pluralidad de partículas; y en el que dicha exposición a ultrasonidos se administra en un sistema nervioso central de dicho sujeto.
10. La combinación para el uso de la reivindicación 9, en la que dicha formulación de Bevacizumab comprende de 0,11 a 25 mg/ml de Bevacizumab y un vehículo para inyección; en el que dicho mg/ml se basa en el volumen total de dicha formulación de Bevacizumab, en el que dicho vehículo para inyección es preferentemente agua, solución salina, polímero, emulsionante, tensioactivo o una combinación de los mismos.
11. La combinación para el uso de la reivindicación 9 o 10, en la que dicho medio de respuesta a ultrasonidos comprende de 1 * 104 a 1 * 1012 partículas/ml de partículas; en el que dicha partícula/ml se basa en el volumen total de dicho medio de respuesta a ultrasonidos, en el que dichas partículas tienen preferentemente un diámetro medio de 0,1 a 10 pm.
12. La combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicho medio de respuesta de ultrasonido se mezcla con un vehículo para inyección, en el que dicho vehículo para inyección es preferentemente agua, solución salina, polímero, emulsionante, tensioactivo o una combinación de los mismos.
13. El Bevacizumab para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o la combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicho tumor cerebral es Glioblastoma multiforme.
14. La combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en la que dicho sistema de ultrasonidos es un sistema de ultrasonidos de guía basado en imágenes médicas.
15. La combinación para el uso de la reivindicación 14, en la que dicha formación de imágenes médicas comprende neuronavegación, ultrasonografía, formación de imágenes ópticas, tomografía computarizada (TC), formación de imágenes nucleares o formación de imágenes por resonancia magnética (IRM).
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