ES2922478T3

ES2922478T3 - Método para detectar y cuantificar una molécula deseada en un tejido

Info

Publication number: ES2922478T3
Application number: ES12731087T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Stauber; David Bonnel
Original assignee: Imabiotech
Current assignee: Imabiotech
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2022-09-15
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: KR20140051187A; EP2715310A1; AU2012264458B2; JP6170911B2; KR102004350B1; US20140106391A1; CN103688151A; IN2013MN02451A; CA2837153A1; WO2012164221A1; EP2715310B1; AU2012264458A1; DK2715310T3; FR2976076A1; FR2976076B1; CN103688151B; US10132796B2; JP2014520259A; CA2837153C

Abstract

La invención se refiere a un método para preparar una gama de diluciones de al menos una molécula patrón para un tejido, según el cual se utiliza un tejido molido al que se le añade la molécula patrón, acondicionándose y fraccionándose el conjunto antes del análisis de una fracción de dicho tejido. La invención también se refiere a un método para detectar y cuantificar al menos una molécula diana en al menos un tejido utilizando un rango estándar según la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para detectar y cuantificar una molécula deseada en un tejido

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de un abanico de diluciones de una molécula para un tejido para la cuantificación de dicha molécula en dicho tejido, por ejemplo, por espectrometría de masas. El abanico de diluciones según la invención tiene en cuenta el comportamiento específico de la molécula a cuantificar en el tejido de interés. Más en concreto, la invención da a conocer un método que permite la detección y/o la cuantificación de una molécula deseada directamente en la superficie de un tejido, mediante el uso de imágenes por espectrometría de masas y, en concreto, imágenes de MALDI. La invención también se refiere a un método para validar un método de detección y/o cuantificación, así como a un método para controlar la calidad y/o la reproducibilidad de un método de detección y/o cuantificación.

En general, la invención encuentra aplicaciones en cualquier campo donde sea útil/necesaria la detección y/o la cuantificación de una molécula en un tejido. La invención encuentra aplicaciones, por ejemplo, en el campo farmacéutico para estudiar la distribución y farmacocinética de un fármaco en diversos tejidos biológicos. Asimismo, la invención encuentra aplicaciones en el campo biomédico, por ejemplo, para detectar, identificar y rastrear un determinado biomarcador en un tejido patológico en un instante determinado. La invención también encuentra aplicaciones en el campo de la agroquímica, por ejemplo, para evaluar la toxicidad y la degradación de una molécula, tal como un producto fitosanitario en las plantas.

Estado de la técnica

Actualmente se utilizan diversas técnicas para detectar e identificar una molécula en una muestra, en particular un tejido. Por ejemplo, la espectrometría de masas es una técnica ampliamente conocida y utilizada en los análisis químicos y bioquímicos, para detectar e identificar moléculas de interés en una muestra. En los últimos años se ha desarrollado toma de imágenes moleculares por espectrometría de masas, tal como la imagen por MALDI, que permite visualizar la distribución de las moléculas de interés directamente en cortes de tejidos biológicos. Las imágenes por MALDI, debido a su altísima sensibilidad, permiten visualizar simultáneamente la distribución de un gran número de moléculas diferentes directamente sobre la superficie de los tejidos. En el campo farmacéutico, esta tecnología permite, por ejemplo, comparar la distribución de una molécula en diferentes órganos en diferentes tiempos de tratamiento.

Sin embargo, en el caso de que se desee una cuantificación de la molécula así detectada en el momento t, es necesario acoplar esta técnica de imagen a un análisis químico cuantitativo, por un método convencional o instrumental. Esta segunda etapa de cuantificación es fuente de errores de manejo y de interpretación. Además, no permite la correlación directa entre la presencia de la molécula de interés y su distribución cuantitativa en el tejido.

Además, una determinada molécula a una determinada concentración no emite una señal de la misma intensidad si cambia el tejido en el que se detecta. De manera similar, dos moléculas diferentes en una concentración idéntica en un tejido dado muestran una intensidad de señal diferente.

Este fenómeno puede explicarse por la existencia de un coeficiente de extinción tisular (TEC), o efecto tisular, o incluso efecto de sobrepresión iónica, específico de cada molécula y de cada tejido. El TEC es representativo de la pérdida o ganancia de intensidad de la señal de una determinada molécula en función del tejido y/o de su ubicación en el tejido, con respecto a la señal de dicha molécula sobre un soporte de análisis inerte. El TEC depende de varios factores, y en particular de la naturaleza del tejido (animal o vegetal), del ambiente químico, del tratamiento químico o no del tejido, etc. La existencia de este TEC dificulta la interpretación de la intensidad de la señal emitida por una molécula en un tejido durante un análisis, en particular en la espectrometría de masas.

Los siguientes artículos se consideran estado de la técnica: Becker et al. "Elemental imaging mass spectrometry of thin section of tissues and analysis of brain proteins in gels by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry”, PHYSICA STATUS SOLIDI (C), 4(6), 2007;

Hare et al. "Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models” METALLOMICS, 1(1), 2009.

Descripción de la invención

Se describe un método que hace posible preparar un abanico de diluciones, o escala de referencia, de una molécula dada para un tejido dado. La escala de referencia se prepara utilizando un corte de una reconstrucción del tejido de interés a partir de un tejido fragmentado. Los inventores han descubierto que una molécula dada se comporta de manera equivalente en dicho tejido reconstituido y en el correspondiente tejido intacto. En el caso de un análisis por espectrometría de masas, el espectro de masas de la molécula en el tejido reconstituido es sustancialmente idéntico al espectro de masas de la misma molécula, a la misma concentración, en el correspondiente tejido intacto. De manera similar, en el caso de un análisis de fluorescencia, la intensidad de la señal fluorescente emitida por la molécula marcada en el tejido reconstituido es sustancialmente idéntica a la intensidad de la señal fluorescente emitida por la misma molécula marcada, a la misma concentración, en el correspondiente tejido intacto. Además, al utilizar una escala de referencia según la invención para un análisis cuantitativo de una molécula dada en un tejido dado, no es necesario tener en cuenta el TEC. La señal obtenida durante el análisis de dicha molécula en dicho tejido se puede correlacionar directamente con las señales de la escala de referencia correspondiente.

La invención también propone un método para detectar y/o cuantificar una molécula deseada en un tejido, cualquiera que sea el modo de detección y en particular por ionización, radiactividad o fluorescencia. Por ejemplo, el método según la invención utiliza la espectrometría de masas, o la formación de imágenes por espectrometría de masas, lo que permite la adquisición automatizada de una señal vinculada al espectro de masas de la molécula, directamente en un corte del tejido, para reconstruir imágenes de la distribución y de la cantidad de dicha molécula deseada en el tejido. Para ello, según la invención, se utiliza un abanico de diluciones de la molécula deseada, o de una molécula de características físico-químicas similares, producida a partir de un corte de un tejido reconstituido a partir de un tejido idéntico al tejido a analizar. Así pues, se puede cuantificar con precisión la molécula en el tejido por comparación directa con los resultados del abanico de diluciones.

La invención también propone un método para validar un método para detectar y/o cuantificar una molécula deseada en un tejido con el uso de un corte de tejido. El método de validación según la invención permite verificar, para un tejido dado y una molécula dada, que los resultados de los análisis obtenidos para dicha molécula directamente sobre un corte de dicho tejido serán representativos de dicho tejido, independientemente del efecto que tenga el tejido.

La invención también da a conocer un método para controlar la calidad y/o la reproducibilidad de un método para detectar y/o cuantificar una molécula deseada en un tejido utilizando un corte de tejido. Tal método permite controlar las variabilidades experimentales y/o tenerlas en cuenta, en particular cuando se normalizan los valores obtenidos para cada análisis con respecto a este control de calidad para, por ejemplo, hacer la cuantificación relativa del compuesto o compuestos de interés entre diferentes análisis.

La invención da a conocer un método para preparar un intervalo de diluciones de al menos una molécula de calibración para un tejido, que comprende las etapas que consisten en:

(i) triturar un tejido para obtener un tejido homogeneizado;

(ii) mezclar la molécula de calibración con una primera muestra del tejido homogeneizado de la etapa (i), en donde dicha molécula de calibración está a una primera concentración conocida;

(iii) acondicionar la primera muestra del tejido homogeneizado de la etapa (ii) para poder cortar dicha muestra de tejido acondicionado homogeneizado;

(iv) repetir las etapas (ii) y (iii) con al menos una segunda muestra del tejido homogeneizado de la etapa (i) y una segunda concentración conocida de la molécula de calibración, diferente de la primera concentración;

(v) analizar al menos un corte de cada una de las muestras de tejido homogeneizado acondicionado surgido de la etapa (iii), para obtener una señal representativa de la cantidad de molécula de calibración en el tejido para cada una de las concentraciones de dicha molécula de calibración.

El método se puede aplicar a cualquier tejido biológico, ya sea de origen animal o vegetal. Por tejido se entiende en líneas generales un conjunto de células del mismo origen que se agrupan en un conjunto funcional para contribuir a la misma función. En algunos casos, un tejido puede significar un órgano o parte de un órgano.

La molécula de calibración puede ser un péptido, un polipéptido, una proteína, un aminoácido, un ácido nucleico, un lípido, un metabolito, una molécula pequeña, tal como un fármaco, etc. De manera más general, la molécula de calibración puede ser cualquier molécula activa desde el punto de vista farmacéutico, biológico o de otro tipo. Según el análisis a realizar en la etapa (v), la molécula de calibración puede estar sin marcar o marcada, y en particular radiomarcada o marcada con una molécula fluorescente, como la GFP (proteína fluorescente verde).

Durante la etapa (i) de trituración, el tejido puede fragmentarse para formar un material homogeneizado más o menos fino, en particular líquido, semilíquido, pastoso, etc. El tejido triturado puede no ser homogéneo e incluir, por ejemplo, fragmentos de tejido de diferentes tamaños. Es posible, si es necesario, añadir una solución de homogeneización al material triturado obtenido, y en particular una solución acuosa, para diluir dicho material triturado y hacerlo menos compacto. La solución de homogeneización se puede agregar antes, después o durante la etapa de trituración.

La trituración puede realizarse por cualquier medio, en particular manual o mecánico. Por ejemplo, el tejido homogeneizado se obtiene por cizalladura con la ayuda de una batidora o por machacado con la ayuda de un mortero.

El tejido utilizado en la etapa (i) es ventajosamente un órgano, tal como un riñón, un hígado, etc. A continuación, se utiliza indistintamente un órgano completo o solo una parte de dicho órgano para producir la escala de referencia. El tejido se puede triturar antes de subdividirlo en al menos tantas muestras de tejido homogeneizado como puntos de dilución haya en la escala de referencia que se va a producir. Como alternativa, es posible realizar la división de dicho tejido antes de la trituración, en donde cada muestra se tritura por separado. También es posible utilizar uno o más órganos diferentes, enteros o no, para cada uno de los puntos de dilución de la escala de referencia, en donde los órganos utilizados para la realización de la misma escala son cada vez de idéntica naturaleza y origen. Por ejemplo, para la producción de una escala de referencia de una molécula en un hígado de rata, que comprende cuatro puntos de dilución o concentraciones, se usa un hígado de rata nuevo para cada concentración.

Se realizan preparaciones de la molécula de calibración a al menos dos concentraciones diferentes. Por ejemplo, la molécula de calibración se suspende en una solución de solubilización (acuosa o que contiene un solvente), a diferentes concentraciones conocidas. A continuación, se añade la misma cantidad de solución a cada una de las muestras de tejido homogeneizado, cada una de las cuales tiene una concentración diferente y conocida de dicha molécula de calibración. En otro ejemplo, la molécula de calibración se suspende en una solución de solubilización, en donde se añaden diferentes cantidades de dicha solución a cada una de las muestras de tejido homogeneizado, de manera que cada muestra de tejido homogeneizado de la etapa (ii) tenga una concentración diferente y conocida de dicha molécula de calibración. Preferiblemente, el abanico de diluciones incluye entre 2 y 10 puntos de dilución.

Ventajosamente, se prevé una etapa de homogeneización antes de la etapa (iii) de acondicionamiento, para obtener una distribución homogénea de la molécula de calibración en la muestra de tejido homogeneizado. Esta etapa de homogeneización se puede realizar, por ejemplo, con un mezclador vorticial, como un Vortex.

En un ejemplo de realización, las etapas (i), (ii) y, en su caso, la etapa de homogeneización, se realizan de forma sucesiva; por supuesto, es posible llevar a cabo simultáneamente todas o parte de estas etapas. Por ejemplo, el tejido se tritura con la solución que contiene la molécula de calibración.

La etapa de acondicionamiento (iii) consiste en un tratamiento y/o conformado de la muestra de tejido homogeneizado, para permitir su corte con el fin de obtener al menos un corte de dicho material homogeneizado.

Por ejemplo, el acondicionamiento incluye una etapa de congelación de la muestra del tejido homogeneizado. Para ello, la muestra del tejido homogeneizado se coloca, por ejemplo, en un molde, cuya forma puede ser arbitraria, y a continuación se congela el conjunto mediante cualquier técnica apropiada. Por ejemplo, dicho molde se sumerge en nitrógeno líquido, para provocar la congelación instantánea de toda la masa, luego se mantiene a -18 °C hasta la etapa de corte.

En otro ejemplo, la etapa de acondicionamiento consiste en recubrir dicha muestra de tejido homogeneizado, en particular en parafina, resina o gelatina. Por recubrimiento se entiende un revestimiento que rodea completamente la muestra de tejido homogeneizado. La etapa de recubrimiento se puede realizar en particular con un molde.

Por supuesto, la etapa de congelación puede ir seguida de una etapa de recubrimiento.

La elección del acondicionamiento puede depender en particular del estado de la muestra de tejido homogeneizado. Por ejemplo, si el tejido homogeneizado de la etapa (ii) es líquido, se optará ventajosamente por congelar la muestra de tejido homogeneizado para permitir su posterior corte. En el caso de que el material homogeneizado consista en un trozo grueso de tejido, o en una pasta compacta, puede ser suficiente el recubrimiento en parafina o similar para que se pueda cortar.

En una realización, es posible utilizar el mismo molde para acondicionar todas o parte de las muestras de tejido homogeneizado de la misma escala de referencia. En este caso, el molde tiene diferentes compartimentos para permitir la separación física entre las distintas muestras. Ventajosamente, los tabiques que delimitan los compartimentos son desmontables y/o de un material que se puede cortar en las mismas condiciones que las muestras de tejido homogeneizado. Así, es posible realizar cortes a partir del contenido del molde, cada uno de los cuales comprende la sucesión de muestras de tejido homogeneizado del abanico de diluciones que se está realizando. Preferiblemente, las muestras de tejido homogeneizado se colocan en concentraciones crecientes (o decrecientes) sucesivas en los compartimentos sucesivos.

Una vez acondicionadas, las muestras de tejido homogeneizado pueden mantenerse en las condiciones de acondicionamiento, por ejemplo, congeladas, o almacenarse en unas condiciones que garanticen el mantenimiento de su integridad (por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 5 °C), en sus moldes o desmoldados, hasta su corte y/o su utilización en la etapa (v) de análisis.

Ventajosamente, la muestra de tejido homogeneizado de la etapa (iii) tiene una densidad idéntica a la de un tejido intacto correspondiente. Asimismo, ventajosamente, la muestra de tejido homogeneizado de la etapa (iii) tiene un coeficiente de extinción tisular (TEC) idéntico al de un tejido intacto correspondiente.

Por densidad se entiende la masa del tejido o de la muestra de tejido homogeneizado por unidad de volumen.

Por tejido intacto se entiende un tejido idéntico al tejido utilizado para producir las muestras de tejido homogeneizado, que conserva las cualidades/propiedades inherentes a dicho tejido.

La etapa de análisis (v) se lleva a cabo sobre cortes de las muestras de tejido homogeneizado, realizadas previamente a partir de las muestras de material homogeneizado acondicionadas. Cualquier tecnología que permita el análisis molecular en un corte de tejido puede usarse para la etapa (v), como espectrometría de masas, análisis de fluorescencia, autorradiografía, etc.

En general, un corte significa una sección de un tejido (reconstituido o intacto). Además, se pueden utilizar todas las dimensiones de cortes compatibles con el análisis molecular y en particular cuantitativo, por ejemplo, en un espectrómetro o un microscopio. Ventajosamente, los cortes tienen un espesor comprendido entre 2 gm y 50 gm, y en particular aproximadamente 20 gm. El espesor se refiere a la dimensión que se extiende perpendicular al plano del corte.

De acuerdo con los ejemplos de implantación del método, los cortes pueden procesarse antes de la etapa de análisis. Por ejemplo, se puede proceder a la desecación del corte obtenido a partir de una muestra de tejido homogeneizado previamente congelado o recubierto. En el caso de un corte de una muestra de tejido homogeneizado previamente congelado, es posible criosecar dicho corte. Por ejemplo, el corte se coloca a -18 °C durante una noche antes de la etapa de análisis.

Los cortes de tejido se pueden realizar a partir de muestras de tejido homogeneizado aún congeladas, o a partir de dichas muestras una vez descongeladas. Ventajosamente, para la producción de un abanico de diluciones dado, se aplica a todas las muestras de tejido homogeneizado los mismos acondicionamientos y posible(s) tratamiento(s) posterior(es). Preferiblemente, todos los cortes utilizados para la producción de una escala de referencia dada tienen un grosor sustancialmente idéntico.

Ventajosamente, los cortes de muestras de tejido homogeneizado se depositan sobre un soporte, tal como un portaobjetos, que permite su introducción en un espectrómetro, microscopio o similar. Preferiblemente, todos los cortes utilizados para la producción de una escala de referencia dada están dispuestos sobre soportes idénticos para la realización del análisis.

En general, se aplican ventajosamente las mismas condiciones de análisis a todas las muestras de tejido homogeneizado del mismo abanico de diluciones. Por condiciones de análisis entendemos en particular los ajustes y configuraciones del aparato utilizado para el análisis, y las condiciones para preparar las muestras, tales como las etapas de lavado finales, el depósito de una matriz en el caso de un análisis espectrofotométrico, etc.

Una vez que se ha obtenido la señal representativa de la cantidad de la molécula obtenida para cada uno de los cortes de muestra de tejido homogeneizado de la gama, es posible producir una curva de calibración representativa del abanico de diluciones.

Por ejemplo, en el caso de un análisis por espectrometría de masas, se elige la misma señal asociada al espectro de masas de la molécula deseada para todos los puntos de dilución, para trazar la curva de calibración. La señal puede ser en particular la intensidad del pico, el área del pico o la relación señal/ruido de dicho espectro de masas.

En el caso de un análisis por autorradiografía, se utiliza la intensidad de la radiactividad emitida por la molécula de calibración radiomarcada, por ejemplo, con carbono 14. En el caso de un análisis por fluorescencia, se utiliza la intensidad de la emisión de luz de la molécula de calibración marcada con una molécula fluorescente.

En una realización del método, se producen al mismo tiempo al menos dos escalas de referencia diferentes.

Por ejemplo, en la etapa (ii) se añaden al menos dos moléculas de calibración diferentes a cada una de las muestras de tejido homogeneizado, en donde el análisis de la etapa (v) se realiza para cada una de las moléculas de calibración con el fin de obtener la señal representativa de la cantidad de molécula de calibración de cada una de las moléculas de calibración en el tejido, para cada una de las concentraciones.

Cada molécula de calibración se añade a una muestra dada de tejido homogeneizado a una concentración dada, que puede ser diferente de la concentración de la otra molécula en dicha muestra de tejido homogeneizado.

El abanico de diluciones se puede utilizar para calcular la cantidad más pequeña de la molécula de calibración detectable en el tejido con un determinado nivel de confianza, o LOD ("límite de detección", del inglés limit of detection). Para ello, se identifica en el abanico de diluciones la señal más pequeña detectable dentro del límite de detección, es decir, que tenga un valor de señal/ruido mayor o igual a 3.

De manera similar, la escala de referencia se puede usar para calcular la cantidad cuantificable más pequeña de molécula de calibración en el tejido con un nivel de confianza dado, o LOQ ("Límite de cuantificación'', de linglés limit of quantification). Este valor (señal/ruido) está fijado internacionalmente que debe ser igual a tres veces el valor de Lo D (LOQ = 3LOD) y ser al menos igual a 10.

El abanico de diluciones también puede utilizarse para evaluar la influencia del espesor de los cortes y/o de la naturaleza de la matriz y/o de la manera de depositar dicha matriz sobre la detección y/o cuantificación de la molécula. Así es posible determinar el espesor de corte óptimo y/o la matriz más adecuada en función del tejido y/o de la molécula.

Los abanicos de dilución obtenidos según el método también pueden utilizarse para cuantificar una molécula deseada en un tejido durante un análisis de dicho tejido.

Por lo tanto, el objeto de la invención es un uso de un abanico de diluciones de una molécula de calibración en un tejido reconstituido para cuantificar una molécula deseada en un tejido de interés idéntico al tejido reconstituido del abanico de diluciones.

Asimismo, la invención tiene por objeto un método de detección y cuantificación de al menos una molécula deseada en al menos un tejido de interés que comprende las siguientes etapas:

a) analizar un corte del tejido de interés, para obtener una señal representativa de la cantidad de molécula deseada en dicho corte;

b) determinar la cantidad de la molécula deseada en dicho tejido usando un abanico de diluciones de una molécula de calibración en un tejido reconstituido idéntico al tejido de interés.

El abanico de diluciones utilizado se obtiene según las etapas (i) a (v) descritas anteriormente con un tejido idéntico al tejido de interés para producir el tejido homogeneizado.

El tejido significa al menos una parte de al menos un tejido biológico (de origen vegetal o animal).

En una realización, es posible cuantificar al menos una molécula deseada en una muestra de tejido que comprende varios tejidos, y en particular varios tejidos adyacentes en un organismo. Por ejemplo, el corte de la muestra de tejido puede consistir en un corte de un animal completo o de una porción de un animal, que comprende al menos un órgano o al menos una porción de órgano. En particular, el análisis sobre un corte de un animal completo puede permitir comparar, sobre una misma muestra, la distribución de una o más moléculas deseadas en diferentes tejidos de dicho animal. En este caso, para determinar la cantidad de una determinada molécula deseada en cada uno de los tejidos de la muestra de tejido, se utiliza cada vez un abanico de diluciones de dicha molécula deseada específica del tejido en cuestión.

La etapa a) de análisis de la molécula deseada se puede realizar mediante cualquier método de análisis, como la espectrometría de masas, y en particular con la espectrometría de masas directa (MS) o en tándem (MSn, MRM, SRM), el análisis de fluorescencia, la autorradiografía, etc.

El método según la invención se puede utilizar ventajosamente con la espectrometría de masas. En este caso, es posible utilizar diferentes fuentes de ionización, MALDI (desorción-ionización láser asistida por matriz), LDI (desorciónionización láser), LESA (análisis de superficie de extracción líquida), LAESI (ionización por electropulverización de ablación láser), DESI (desorción-ionización por electropulverización), NanoDESI, etc., combinado con diferentes tipos de analizadores, TOF (tiempo de vuelo), Orbitrap, FTICR (resonancia ciclotrónica de iones con transformada de Fourier), etc. Esta técnica de imagen permite cuantificar la molécula deseada directamente sobre el mapa de densidad iónica obtenido para la muestra de tejido, correspondiente a la distribución espacial de la molécula deseada en dicha muestra de tejido. De hecho, la señal obtenida en dicho mapa de densidad de iones puede compararse con el abanico de diluciones correspondiente.

Ciertas técnicas de espectrometría de masas, tales como MALDI o ME-SIMS, requieren que una parte de la muestra de tejido a analizar se recubra previamente con una matriz compuesta por pequeñas moléculas orgánicas que absorben en el UV. Esta matriz permite la desorción e ionización de las moléculas presentes en la muestra.

El método según la invención se puede utilizar independientemente de la matriz elegida. Estas matrices vienen en forma sólida (cristalización en la muestra) o líquida y se dice que son iónicas o no. La elección de la matriz se realiza en función del abanico de masas analizado. La mayoría de las veces se preparan extemporáneamente en una mezcla de solvente y solución acuosa.

La matriz se puede depositar de varias maneras, y en particular el depósito manual mediante una pipeta, lo que permite depositar un volumen preciso de matriz directamente sobre el tejido. También es posible depositar la matriz por pulverización o nebulización, en donde la matriz es pulverizada o nebulizada directamente sobre la muestra de tejido mediante un robot o manualmente. Del mismo modo, se puede considerar un depósito por microgotas mediante el cual la matriz se salpica sobre la muestra de tejido mediante sistemas piezoeléctricos, acústicos o de bomba de jeringa. También se puede depositar la matriz por tamizado, para depositar la matriz en forma sólida.

Los parámetros experimentales, tales como el intervalo de masas y/o la intensidad del láser, se establecen ventajosamente para optimizar la detección de la molécula deseada en términos de intensidad, sensibilidad y resolución.

A continuación, se adquiere la señal representativa de la cantidad de molécula deseada en dicho corte.

Si el análisis consiste en adquirir el espectro de masas, se pueden utilizar diferentes características espectrales como señal en la etapa b), y en particular la intensidad de los picos del espectro de masas, la relación entre señal y ruido (S/N), área del pico, etc. Por supuesto, la característica espectral utilizada para cuantificar la molécula deseada es la misma que la característica espectral utilizada para la preparación de la escala de referencia. Y más en general, la característica de la señal tenida en cuenta para cuantificar la molécula deseada es la misma que la característica de la señal utilizada para la preparación de la escala de referencia.

En ciertas condiciones, es posible además normalizar la una o varias características espectrales a partir de un factor de normalización determinado por la tecnología.

Por ejemplo, en el caso de que el método según la invención utilice la toma de imágenes por espectrometría de masas del tipo MALDI, se prevé una etapa para evaluar la homogeneidad del depósito de la matriz sobre la muestra. En efecto, la señal correspondiente a la matriz utilizada puede proporcionar información sobre la calidad/uniformidad del depósito de dicha matriz. Los defectos de la matriz en la superficie de la muestra pueden entonces correlacionarse con la falta de detección o la pérdida de intensidad de la señal de la molécula deseada en la muestra en consideración.

La evaluación de la homogeneidad de la matriz puede realizarse según criterios cualitativos, observando al microscopio óptico la homogeneidad del depósito sobre la superficie de la muestra, y/o según criterios cuantitativos, siguiendo las variaciones de la señal relativa a la propia matriz en la muestra.

En cuanto a los criterios cualitativos, se debe asegurar que la matriz se ha depositado lo más uniformemente posible sobre la superficie considerada, que no existen zonas vacías de la matriz y que su cristalización es óptima.

Para la evaluación cuantitativa de la homogeneidad del depósito de matriz, la matriz se considera como una molécula específica cuya señal se detecta de la misma forma que la señal de la molécula deseada, en el momento del análisis de una muestra. A continuación, la señal de la molécula de la matriz se compara con su señal de referencia. La señal de referencia de la matriz corresponde en este caso a la señal emitida por la matriz sobre un depósito de matriz de referencia, es decir, sobre una muestra y sobre un soporte de análisis utilizado específicamente para medir la señal de referencia de la matriz.

Mediante estas etapas adicionales, la señal de la molécula deseada se valida y normaliza para tener en cuenta la variación en la calidad del depósito de la matriz que puede influir en las características espectrales de esta última.

Esta consideración del efecto matriz puede ser particularmente ventajosa en el caso de que se desee seguir la evolución de la presencia de una molécula deseada en el tiempo, al poder variar la calidad del depósito de la matriz de una muestra a otra.

La escala de referencia utilizada se puede producir con una molécula de calibración idéntica a la molécula deseada. También es posible utilizar una molécula de calibración diferente de la molécula deseada y que tenga propiedades fisicoquímicas similares. También es posible utilizar la molécula deseada marcada con un isótopo como molécula de calibración para la preparación del abanico de diluciones.

Dependiendo de los métodos de análisis utilizados, la molécula deseada puede estar marcada. Por ejemplo, en el caso de un análisis de fluorescencia, la molécula deseada está marcada con una molécula fluorescente. De manera similar, en el caso de un análisis por autorradiografía, la molécula deseada está radiomarcada.

El método según la invención se puede utilizar para el análisis de todo tipo de moléculas, como por ejemplo péptidos, polipéptidos, proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos, lípidos, metabolitos, etc., y en general para cualquier molécula activa desde el punto de vista farmacéutico u otro, y en particular, en el caso de un análisis por espectrometría de masas, para cualquier molécula que se pueda ionizar.

En el caso de que la molécula deseada sea una proteína de alto peso molecular, es posible realizar un pretratamiento enzimático de la molécula deseada, con el fin de escindirla en varios péptidos. A continuación, se realiza la detección y cuantificación de al menos uno de los péptidos resultantes de dicha digestión enzimática, representativo de dicha proteína. Por ejemplo, se puede utilizar la tripsina para escindir la proteína deseada en varios péptidos previamente identificados.

Asimismo, se puede tratar el tejido a analizar con al menos un disolvente y/o al menos un detergente antes de la etapa de detección, para eliminar las moléculas responsables del ruido de fondo. Por ejemplo, el lavado con cloroformo elimina ciertas clases de lípidos. El lavado con etanol permite una mejor detección de las moléculas con masas bajas. Estos dos lavados permiten ventajosamente eliminar ciertas moléculas, en particular los lípidos, favoreciendo así la detección de nuevos iones directamente sobre la muestra del tejido.

El método según la invención también se puede utilizar para cuantificar al menos dos moléculas deseadas diferentes en el mismo tejido y/o en la misma muestra de tejido que comprende varios tejidos, simultáneamente o no. Luego se usan diferentes abanicos de diluciones, cada uno específico para la molécula deseada en consideración y para el tejido en consideración.

De manera similar, la misma molécula deseada puede detectarse y cuantificarse simultáneamente en diferentes tejidos, mediante el análisis por espectrometría de masas, o similar, de una muestra de tejido que comprende varios tejidos. En este caso, para cada uno de los tejidos de la muestra, por ejemplo, órganos en un corte de un animal completo, se utiliza el abanico de diluciones alcanzado para dicha molécula deseada en el tejido/órgano correspondiente.

La invención también propone un método para validar un método para detectar y/o cuantificar al menos una molécula deseada en un tejido a partir de un corte de dicho tejido, que comprende las etapas que consisten en:

(x) triturar un tejido idéntico al tejido al que se va a aplicar el método de detección y/o cuantificación, para obtener un tejido homogeneizado;

(xi) mezclar una molécula de calibración con al menos dos muestras del tejido homogeneizado de la etapa (x), en donde dicha molécula de calibración está a la misma concentración conocida para las al menos dos muestras de tejido homogeneizado;

(xii) acondicionar las muestras de tejido homogeneizado de la etapa (xi) para poder cortar dichas muestras de tejido homogeneizado acondicionado;

(xiii) analizar al menos un corte de cada una de las muestras de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xii), para obtener una señal representativa de la molécula de calibración para cada uno de los cortes;

(xiv) comparar entre sí las señales obtenidas para cada uno de los cortes.

Tal método permite verificar, en particular antes de un método de detección y/o cuantificación, que un determinado tejido reconstituido, es decir, un tejido homogeneizado acondicionado, es representativo del correspondiente tejido intacto. Este método permite evaluar la sensibilidad del método de detección y/o cuantificación según la invención para una molécula dada y una muestra dada, en particular por medio del LOD.

Ventajosamente, la etapa (xi) se realiza sobre al menos tres muestras de tejido homogeneizado.

La comparación de las señales realizada en la etapa (xiv) permite ventajosamente evaluar la reproducibilidad de la detección y/o de la cuantificación de una determinada molécula en un determinado tejido, mediante el cálculo del coeficiente de variación RSD (“desviación estándar relativa”), dado en decimal o en porcentaje.

Por supuesto, todas las realizaciones particulares de trituración del tejido, acondicionamiento, preparación de la molécula de calibración, análisis, etc., así como la naturaleza del tejido y/o de la molécula de calibración, tal como se expone más adelante para la preparación del abanico de diluciones, se puede aplicar para llevar a cabo el método de validación. La invención también da a conocer un método para controlar la calidad y/o la reproducibilidad de un método para detectar y/o cuantificar al menos una molécula deseada en un tejido de interés a partir de un corte de dicho tejido, que comprende las etapas de:

(xx) triturar un tejido idéntico al tejido de interés, para obtener un tejido homogeneizado;

(xxi) mezclar una concentración conocida de una molécula de calibración con una muestra del tejido homogeneizado de la etapa (xx);

(xxii) acondicionar la muestra de tejido homogeneizado de la etapa (xxi) para poder cortar dicha muestra de tejido homogeneizado acondicionado;

(xxiii) para cada corte del tejido de interés a analizar, se analiza simultáneamente un corte de la muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxii), para obtener cada vez una señal representativa de la molécula de calibración para el corte de la muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxii) y una señal representativa de la molécula deseada para el tejido de interés;

(xxiv) se comparan las señales obtenidas para cada uno de los cortes de la muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxii).

Así, según la invención, un corte de tejido enriquecido, y en particular de órgano, sangre, plasma, suero, orina, tejido vegetal, etc., que contenga uno o más compuestos puede utilizarse como control de calidad para cada análisis realizado en el ámbito de un estudio de detección y/o cuantificación, y/o para vigilar el funcionamiento de un instrumento analítico.

El tejido de interés se refiere al tejido en el que debe tener lugar la detección y/o cuantificación.

La etapa (xxiii) se realiza ventajosamente depositando sobre el mismo soporte, y en particular sobre el mismo portaobjetos, el corte del tejido de interés a analizar y el corte de la muestra del material homogeneizado del tejido enriquecido/acondicionado. Las mismas condiciones de preparación del soporte (por ejemplo, la matriz utilizada, la calidad de su depósito) y de análisis se aplican así a los dos cortes.

La variación de la señal obtenida en la etapa (xxiv) puede normalizarse, por ejemplo, utilizando la media ponderada correspondiente, para tener en cuenta las variaciones de los parámetros, tal como el efecto de la matriz.

Tal método puede usarse, por ejemplo, para la cuantificación relativa de una molécula por simple comparación de la señal de un corte a otro, para vigilar la evolución de la biodisponibilidad de una molécula a lo largo del tiempo, etc. Por tanto, también es objeto de la invención dar a conocer un método para la cuantificación relativa de al menos una molécula deseada en un tejido de interés, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en:

(xxx) triturar un tejido idéntico al tejido de interés, para obtener un tejido homogeneizado;

(xxxi) mezclar una concentración conocida de una molécula de calibración con una muestra del tejido homogeneizado de la etapa (xxx);

(xxxii) acondicionar la muestra de tejido homogeneizado resultante de la etapa (xxxi) para poder cortar dicha muestra de tejido acondicionado homogeneizado;

(xxxiii) para cada corte del tejido de interés a analizar, se analiza simultáneamente un corte de la muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxxii), para obtener cada vez una señal representativa de la molécula de calibración para el corte de la muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxxii) y una señal representativa de la molécula deseada para el tejido de interés;

(xxxiv) calcular, para cada corte del tejido de interés a analizar, la relación de la señal de la molécula deseada en el tejido de interés entre la señal de la molécula de calibración en el tejido reconstituido;

(xxxv) comparar las proporciones obtenidas para cada corte del tejido de interés entre sí para obtener una cuantificación relativa de la molécula deseada.

Por supuesto, todas las realizaciones concretas de trituración del tejido, acondicionamiento, preparación de la molécula de calibración, análisis, etc., así como la naturaleza del tejido y/o de la molécula de calibración, tal como se expone más adelante para la preparación del abanico de diluciones se puede aplicar para llevar a cabo el método para controlar la calidad y/o la reproducibilidad según la invención, del método para la cuantificación relativa o absoluta y del método para evaluar la cantidad más pequeña de una molécula deseada detectable y/o cuantificable en un tejido según la invención.

De acuerdo con la invención, la normalización de los datos originales, es decir, las correlaciones entre una señal de una molécula deseada en un tejido y la concentración correspondiente a partir de un abanico de diluciones de una molécula de calibración en un tejido reconstituido idéntico, con vistas a la cuantificación, puede realizarse mediante un programa informático que integre todos o algunos de estos factores.

Este programa informático, o programa de reprocesamiento de datos, puede ponderar ventajosamente estos valores por el efecto de la matriz o del patrón (isotópico o no) durante el procesamiento de la imagen en el caso de la toma de imágenes por espectrometría de masas.

Ventajosamente, un programa informático según la invención puede comparar la intensidad de la molécula deseada sobre el tejido de interés con la intensidad de la molécula de calibración sobre el tejido reconstituido, para llegar a una relación que permita realizar una cuantificación relativa del compuesto de interés entre diferentes tejidos por comparación de las prorporciones obtenidas para cada uno de ellos.

La invención describe un soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones ejecutables por el ordenador, como por ejemplo la lectura de los datos en crudo resultantes del análisis por espectrometría de masas, y/o la determinación de la curva de calibración, y/o la normalización de los datos crudos por este último para obtener un valor cuantitativo de la molécula deseada. Ventajosamente, estas instrucciones ejecutables por el ordenador están adaptadas para permitir que un sistema informático ejecute al menos la etapa b) del método de cuantificación según la invención y/o la etapa (xxiv) del método de control de calidad/reproducibilidad de un método de detección/cuantificación, y en su caso la etapa de ponderación utilizando los resultados según la etapa (xxiv), así como la etapa (xxxiv) y/o la etapa (xxxv) del método de cuantificación relativa según la invención.

Ventajosamente, el soporte de los datos comprende al menos una escala de referencia de al menos una molécula deseada en al menos dos tejidos diferentes. Preferiblemente, en el caso de las muestras biológicas, como por ejemplo un corte de un animal completo, la base de datos incluye el abanico de diluciones de al menos una molécula deseada en los diferentes tejidos de dicha muestra.

El medio de soporte de los datos también puede comprender una base de datos de la señal de referencia de al menos una matriz utilizada en la formación de imágenes por espectrometría de masas. Por lo tanto, es posible tener en cuenta el efecto de la matriz durante el análisis de la muestra mediante la toma de imágenes al poner en marcha el soporte de datos.

Breve descripción de las figuras

Figuras 1A y 1B. Una representación esquemática de un ejemplo de un molde (FIG. 1A) con varios compartimentos, que puede ser utilizado durante la implantación del método para preparar un abanico de diluciones de acuerdo con la descripción, en donde cada compartimento puede recibir una muestra de tejido homogeneizado enriquecido con una concentración específica de la molécula de calibración; y una representación esquemática de las muestras de tejido homogeneizado acondicionado y desmoldado después de la congelación en el molde (FIG. 1B), en donde cada muestra de tejido homogeneizado está separada de una muestra adyacente por un tabique.

Figura 2: Curva de calibración de una molécula de calibración (propranolol) en un tejido (riñón) obtenida según el método de preparación de la descripción, que representa la concentración (pg/g en el eje de abscisas) de propranolol en función de la intensidad emitida por el propranolol (eje de ordenadas) en la espectrometría de masas.

Figura 3: Una recta de ponderación que muestra la variabilidad analítica en la MSI medida con los controles de calidad del tipo de tejido de riñón reconstituido y enriquecido con la misma concentración de propranolol.

Ejemplos

Material y método

Material

Se usó propranolol de Sigma-Aldrich para hacer una solución de propranolol a 1 ■ 10-10 mol/pl.

De esta solución se toman seis subvolúmenes precisos diferentes, que se añadirán cada uno a una muestra de tejido homogeneizado, para obtener una concentración en las muestras de 0, 2,8, 5,6, 11,2, 22,4 y 44,8 pg/g (tabla 1). Muestras de tejido homogeneizado

Se utilizaron ratones macho de tipo suizo de 25-40 g de peso de Charles River (Francia).

Para la preparación del abanico de diluciones, se extraen dos riñones de un ratón de control (es decir, que no ha sido sometido a ningún tratamiento concreto). Los dos riñones se trituran mecánicamente con un bisturí, en un recipiente previamente esterilizado y colocado en hielo. Una vez obtenido el material homogeneizado de riñón, dicho material homogeneizado se divide aproximadamente en seis tubos de 1,5 ml, y se pesa cada una de las seis muestras de tejido homogeneizado (tabla 1).

Se añade uno de los subvolúmenes concretos de la solución de propranolol a cada una de las muestras de tejido homogeneizado.

En la tabla 1 que viene a continuación se muestran todos los datos específicos para las seis muestras de riñón homogeneizado.

Tabla 1: Preparación de muestras de riñón homogeneizado utilizadas para la producción de un abanico de diluciones representativo del propranolol en el riñón.

Preparación de los tejidos reconstituidos

Cada tubo que contiene una muestra de riñón homogeneizado se agita vorticialmente durante 1 h a temperatura ambiente para distribuir el propranolol homogéneamente en dichas muestras.

Se utiliza un molde de aluminio 100, como el que se muestra en la figura 1A, provisto de 7 tabiques transversales 101 para proporcionar seis compartimentos 102 que se extienden sucesivamente por la dimensión mayor de dicho molde (solo se proporcionan 3 compartimentos en el molde de la figura 1A). El molde se coloca en nitrógeno líquido para congelar rápidamente los riñones homogeneizados. Luego se coloca el molde a -80 °C durante 1 h.

A continuación, se desmolda el bloque 200 de tejidos reconstituidos o acondicionados (es decir, las muestras congeladas de riñón homogeneizado) (figura 1B). Los tejidos reconstituidos 201 se cortan con ayuda de un criostato enfriado a -22 °C hasta un espesor de 20 pm. Según las necesidades, todos los tejidos 201 del abanico se mantienen en el mismo corte, separados entre sí por los tabiques 101, o se separa del resto del corte la parte correspondiente al tejido o tejidos reconstituidos deseados.

Ejemplo 1: Validación del modelo “tejido reconstituido”

En este ejemplo, se busca demostrar que los tejidos reconstituidos, formados por tejidos homogeneizados que han sido congelados, forman un modelo representativo del correspondiente tejido intacto.

Para ello, se midieron y compararon la densidad y el coeficiente de extinción tisular (TEC) de un riñón reconstituido según la invención y de un riñón intacto.

Se individualizan diez cortes de tejido reconstituido n.° 6 (control, tabla 1) y cada una se coloca en un soporte (portaobjetos ITO2).

También se hacen diez cortes de tejido de 20 gm de un riñón intacto tomado de otro ratón de control, mantenido a temperatura ambiente. Cada corte se coloca sobre un soporte (portaobjetos ITO3).

Los soportes se escanean simultáneamente en un escáner de HP Scanjet G4010 a 2400 ppp y la imagen se guarda en formato jpeg.

A continuación, se calcula la densidad media de los cortes de riñón reconstituido y de los cortes de riñón intacto, como se explica en la tabla 2 que viene a continuación. Más en concreto, el valor medio de la superficie, de la altura, del volumen y del peso del riñón reconstituido se calcula a partir de los valores obtenidos para cada uno de los diez cortes del tejido reconstituido de control. Asimismo, a partir de los valores obtenidos para cada uno de los diez cortes correspondientes, se calcula el valor medio de la superficie, de la altura, del volumen y del peso del riñón intacto. Se puede observar que las densidades de los dos tejidos son sustancialmente idénticas, ya que sólo difieren en 0,04 mg/mm3 (tabla 2).

Para calcular el TEC para el tejido reconstituido y para el tejido intacto, se pulveriza la matriz de MALDI DHB (40 mg/ml de metanol/TFA al 0,1% 1/1) que contiene 10 pmol de propranolol mediante un sistema robótico (SunCollect) en los dos lotes de diez portaobjetos ITO2 e ITO3 utilizados para el cálculo de la densidad.

A continuación, cada corte de tejido se analiza mediante imágenes de MALDI con la ayuda de un Autoflex Speed LRF (Bruker, Daltonics).

Las intensidades de propranolol (m/z 260,2) de cada lote de cortes se promedian en función del corte de tejido y en función del soporte.

A continuación, se puede calcular el TEC con los valores de la intensidad de la señal emitida por el propranolol en el portaobjetos y en los tejidos respectivamente, según la fórmula matemática:

Int (portaobjetos) x

^{TEC =} ^--------- I ^;- n ^--- t ^--(^-- t-e ^--- j ^T i ^T a -o ^{T ^} )-x ^----------Tal como se muestra en la tabla 2, se puede observar que los valores promedio de TEC obtenidos para el riñón reconstituido y para el riñón intacto son idénticos.

Por lo tanto, el riñón reconstituido tiene la misma densidad y el mismo coeficiente de extinción tisular que un riñón intacto.

Tabla 2: Comparación de las densidades y los TEC en un riñón reconstituido y un riñón intacto.

Por lo tanto, el propranolol se comporta de manera idéntica en un riñón reconstituido y en un riñón intacto. El uso de un tejido reconstituido para la preparación de un abanico de diluciones de una molécula según la invención puede, por lo tanto, permitir cuantificar posteriormente de forma fiable dicha molécula en un tejido intacto correspondiente.

Ejemplo 2: Preparación de un abanico de diluciones de propranolol para el riñón

Sobre un soporte (portaobjetos ITO1) se deposita un corte que contiene la sucesión de muestras de riñón homogeneizado y, por tanto, presenta las 6 concentraciones sucesivas de propanolol (en el orden presentado en la tabla 1).

La matriz de MALDI DHB (40 mg/ml de metanol/TFA al 0,1 % 1/1) se rocía sobre el corte de tejido con la ayuda de un sistema robótico (SunCollect).

A continuación, cada parte del corte que representa una muestra de riñón homogeneizado se analiza mediante formación de imágenes de espectrometría de masas con un Autoflex Speed LRF (Bruker, Daltonics).

A continuación, se delimitan varias regiones de interés (ROI), de iguales dimensiones, sobre la imagen obtenida por espectrometría de masas para cada una de las muestras de tejido homogeneizado.

Se opta por utilizar como señal de referencia la intensidad de los picos del espectro de masas. Se recuperan las intensidades de los picos del espectro de masas del propranolol para cada ROI, para cada una de las muestras de tejido homogeneizado. Y para cada muestra de tejido homogeneizado se calcula una intensidad media (ROI media) a partir de la intensidad obtenida para todas las ROI correspondientes.

Las intensidades promedio de los picos del espectro de masas de propranolol para cada punto del abanico de diluciones, es decir, para cada muestra de tejido homogeneizado, se enumeran en la tabla 3.

Tabla 3: Intensidades promedio obtenidas por imágenes de MALDI para cada punto del abanico de diluciones de propranolol (m/z 260.2) en un riñón reconstituido

A continuación, se puede dibujar una recta de calibración. Esta recta de calibración se puede utilizar más tarde, durante un método de cuantificación de propranolol en un riñón. Basta con correlacionar la intensidad del pico del espectro de masas obtenido para el propranolol en el riñón analizado con una concentración en dicha recta de calibración.

Por ejemplo, se dibuja una recta de calibración que representa la concentración de propranolol en el tejido (gg/g) en función de la intensidad del pico del espectro de masas (figura 2). La ecuación de la recta de regresión de todos los puntos del abanico de diluciones, o nube de puntos, se calcula en el formato y = ax b con la ayuda de un programa de reprocesamiento gráfico, como por ejemplo Excel.

En el ejemplo descrito, la ecuación de la recta de regresión es y = 3244,7x 534,92. Esta ecuación permite entonces la cuantificación de la molécula.

Del mismo modo, calculamos el coeficiente de determinación (aquí R2 = 0,9999) que es un indicador que permite juzgar la calidad de una regresión lineal, simple o múltiple. Cuanto más cerca esté este coeficiente de 1, más lineal será la tendencia.

Ejemplo 3: Cuantificación del propranolol en un riñón de ratón tratado

Se extrae un riñón de un ratón tratado con 7,5 mg/kg de propranolol y sacrificado 20 min después de la administración. A partir del riñón se hacen tres cortes de tejido de 20 gm de espesor y se colocan cada uno sobre un soporte (portaobjetos ITO).

La matriz de MALDI DHB (40 mg/ml de metanol/TFA al 0,1 % 1/1) se rocía con un sistema robótico (SunCollect) sobre los cortes.

Cada corte se analiza mediante imágenes de espectrometría de masas con un Autoflex Speed LRF (Bruker, Daltonics). Se calcula la intensidad media de los picos del espectro de masas del propranolol (m/z 260,2), utilizando de nuevo varias ROI en cada corte, todas con las mismas dimensiones.

El valor de la intensidad media obtenida es 19633,3.

La concentración de propranolol en el riñón se cuantifica mediante la ecuación de la recta de calibración (figura 2), al representar el valor medio de intensidad obtenido en dicha recta. El propranolol se encuentra aquí a una concentración de 5,9 pg/g de tejido.

Ejemplo 4: Evaluación del límite de detección de propranolol en el riñón

En el contexto de este uso, se utiliza un abanico de diluciones o un punto de dilución de una o más moléculas de interés en los tejidos reconstituidos para evaluar la detección de la una o varias moléculas mediante un método analítico elegido.

En este ejemplo, se produce un abanico de diluciones a partir de nueve subvolúmenes precisos diferentes de la solución de propranolol, cada uno de los cuales se agrega a una muestra de riñón homogeneizado, para obtener una concentración en las muestras de 0, 0,3, 0,7, 1,4, 2,8, 5,6, 11,2, 22,4 y 44,8 pg/g.

Sobre un soporte (portaobjetos ITO) se deposita un corte que contiene la sucesión de muestras de material renal homogeneizado, y que contiene, pues, las 9 concentraciones sucesivas de propanolol (en el orden presentado en la tabla 4).

En el marco de un análisis de los cortes por imágenes de MALDI-TOF, es posible, gracias a la invención, desarrollar el protocolo para la preparación de los tejidos que serán analizados en una fase preliminar. De hecho, se puede utilizar la gama preparada y realizar varias pruebas de preparación para evaluar, por ejemplo, la influencia del espesor de los cortes o incluso la elección de la matriz y/o el modo de depositarla sobre la señal obtenida.

En este ejemplo, el espesor óptimo se fija en 20 pm y la matriz de MALDI más eficiente es DHB a 40 mg/ml metanol/TFA al 0,1% 1/1.

A continuación, cada parte del corte que representa una muestra de riñón homogeneizado se analiza mediante la toma de imágenes por espectrometría de masas o mediante el análisis directo con la ayuda de un Autoflex Speed LRF (Bruker, Daltonics).

En el marco de una adquisición en modo imagen, se delimitan varias regiones de interés (ROI), de iguales dimensiones, sobre la imagen obtenida por espectrometría de masas para cada una de las muestras de tejido homogeneizado.

En el marco de una adquisición en modo de análisis directo, se obtiene un espectro medio representativo de cada punto del intervalo.

Se opta por utilizar como señal de referencia la intensidad de los picos del espectro de masas. Se recuperan las intensidades de los picos del espectro de masas del propranolol para cada una de las muestras de tejido homogeneizado. Y para cada muestra de tejido homogeneizado, obtenemos una intensidad media.

Las intensidades promedio de los picos del espectro de masas del propranolol para cada punto del abanico de diluciones, es decir, para cada muestra de tejido homogeneizado, se enumeran en la tabla 4.

Tabla 4: Intensidades medias obtenidas por imágenes de MALDI para cada punto del abanico de diluciones de propranolol (m/z 260,2) en un riñón reconstruido

Por lo tanto, se puede evaluar el límite de detección del compuesto en el medio elegido, que aquí es de 0,7 pg/g. Este límite de detección se fija en este ejemplo como la concentración más baja para la que se detecta el compuesto con una relación señal/ruido superior a 3. Hay que tener en cuenta que también es posible determinar el límite de cuantificación.

Además, si se tuviera que realizar una cuantificación del compuesto en un tejido tratado, se puede evaluar en este ejemplo que el método analítico es lineal a lo largo de 3 log.

Más generalmente, la invención permite evaluar varios parámetros antes de la preparación de los sistemas de ensayo in vivo, como por ejemplo:

• El grosor de los cortes de tejido.

• La matriz de MALDI más adecuada para la desorción e ionización de los compuestos

• El modo de depositar la matriz

• El límite de detección y cuantificación del compuesto o compuestos en un medio de referencia

• El intervalo de linealidad del método analítico para realizar la cuantificación de los compuestos, etc.

Ejemplo 5: Control de la calidad y reproducibilidad de los análisis de imágenes mediante espectrometría de masas MALDI

En este ejemplo, queremos evaluar la calidad y la reproducibilidad de un análisis de imágenes de MALDI.

Un corte de riñón homogeneizado que comprende una concentración conocida de propranolol (5,6 pg/g) se deposita en el mismo soporte (portaobjetos ITO) que la muestra de interés. Cabe señalar que este homogeneizado de riñón reconstituido se utiliza en el contexto de todos los análisis cuya reproducibilidad debe evaluarse.

Durante cada análisis de las muestras de interés, para las que se utiliza el mismo método de preparación y el mismo método analítico, se analiza al mismo tiempo un corte del control de calidad con imágenes de MALDI.

Así pues, se obtiene el valor de la intensidad media del propranolol para cada análisis y, por lo tanto, es posible controlar la reproducibilidad de los análisis. Así, en el contexto de 10 análisis de tejidos de interés, se añadió un corte de riñón reconstituido enriquecido con propranolol a 5,6 pg/g. En la figura 3 se muestra la variabilidad obtenida en el contexto de 10 análisis constitutivos dentro de un mismo estudio.

Es así posible seguir las variabilidades experimentales o incluso normalizar los valores obtenidos para cada análisis con respecto a este control de calidad para realizar la cuantificación relativa del compuesto o compuestos de interés entre diferentes análisis.

También es posible juzgar la calidad de la preparación del tejido (más particularmente de cómo se depositó la matriz de MALDI) y la calidad del rendimiento analítico del instrumento utilizado. Hay que tener en cuenta que el mantenimiento se puede determinar en función de los resultados de estos controles de calidad con propranolol a 5,6 pg/g. En la figura 3 se muestra la variabilidad obtenida en el contexto de 10 análisis constitutivos dentro de un mismo estudio.

Es así posible seguir las variabilidades experimentales o incluso normalizar los valores obtenidos para cada análisis con respecto a este control de calidad para realizar la cuantificación relativa del compuesto o compuestos de interés entre los diferentes análisis.

También es posible juzgar la calidad de la preparación de los tejidos (más particularmente cómo se depositó la matriz de MALDI) y la calidad del rendimiento analítico del instrumento utilizado. Hay que tener en cuenta que el mantenimiento se puede determinar en función de los resultados de estos controles de calidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de cuantificación de al menos una molécula deseada en al menos un tejido biológico de interés de origen animal o vegetal que comprende las siguientes etapas:

a) analizar un corte de un tejido de interés para obtener una señal representativa de la cantidad de molécula deseada en dicho corte;

b) determinar la cantidad de molécula deseada en el tejido usando un abanico de diluciones de una molécula de calibración para dicho tejido hecho a partir de cortes de un tejido reconstituido idéntico al tejido de interés,

en donde el abanico de diluciones de la molécula de calibración se obtiene de acuerdo con las etapas que consisten en:

(i) triturar un tejido idéntico al tejido de interés para obtener un tejido homogeneizado:

(ii) mezclar la molécula de calibración con una primera muestra de tejido homogeneizado de la etapa (i), en donde dicha molécula de calibración está a una primera concentración conocida;

(iii) acondicionar la primera muestra de tejido homogeneizado derivada de la etapa (ii) para poder cortar dicha muestra de tejido homogeneizado;

(iv) repetir las etapas (ii) y (iii) con al menos una segunda muestra de tejido homogeneizado de la etapa (i) y una segunda concentración conocida de la molécula de calibración, diferente de la primera concentración;

(v) analizar al menos un corte de cada una de las muestras de tejido homogeneizado acondicionado derivadas de la etapa (iii), para obtener una señal representativa de la cantidad de molécula de calibración en el tejido para cada una de las concentraciones de dicha molécula de calibración.

2. Procedimiento de cuantificación según la reivindicación 1, en el que la etapa (iii) de acondicionamiento de la muestra de tejido homogeneizado consiste en congelar y/o embeber dicha muestra de tejido homogeneizado.

3. Procedimiento de cuantificación según la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de análisis (v) consiste en un análisis de espectrometría de masas, o un análisis de fluorescencia, o un análisis de autorradiografía.

4. Procedimiento de cuantificación según una de las reivindicaciones 2 a 3, que comprende la etapa adicional consistente en:

(vi) homogeneizar la muestra de tejido homogeneizado y la molécula de calibración de la etapa (ii) antes de la etapa de acondicionamiento (iii).

5. Procedimiento de cuantificación según una de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la muestra de tejido homogeneizado acondicionado o reconstituido presenta una densidad y/o un coeficiente de extinción tisular idénticos a los del correspondiente tejido intacto.

6. Procedimiento de cuantificación según una de las reivindicaciones 2 a 5, en el que se detectan al menos dos moléculas deseadas diferentes simultáneamente en dicho tejido y se cuantifican, en donde la escala de referencia para cada una de las moléculas deseadas se lleva a cabo, para la etapa (ii) de preparación de la escala de referencia, con el uso de al menos dos moléculas de calibración diferentes que se agregan a cada una de las muestras de tejido homogeneizado, en donde el análisis de la etapa (v) se lleva a cabo para cada una de las moléculas de calibración para obtener la señal representativa de la cantidad de cada una de las moléculas de calibración en el tejido para cada concentración, y en donde la etapa b) de determinación de la cantidad de molécula deseada se realiza para cada una de las moléculas deseadas utilizando el abanico de diluciones correspondiente y/o en el que se analizan al menos dos tejidos diferentes, en donde las etapas (i) a (v) de preparación de una escala de referencia se lleva a cabo para cada uno de los tejidos para obtener la señal representativa de la molécula de calibración para cada uno de los tejidos, en donde la etapa b) de determinación de la cantidad y de molécula deseada se lleva a cabo para cada uno de los tejidos usando el abanico de diluciones correspondiente.

7. Procedimiento de cuantificación según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula deseada es una proteína, un péptido, un polipéptido, un aminoácido, un ácido nucleico, un lípido, un fármaco, una molécula farmacéutica o biológicamente activa, o un metabolito.

8. Procedimiento de cuantificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa a) consiste en un análisis de espectrometría de masas, en donde la señal asociada al espectro de masas de la molécula deseada corresponde a la intensidad del pico, el área del pico o la relación señal/ruido de dicho espectro de masas.

9. Procedimiento de cuantificación según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula de calibración utilizada para la preparación del abanico de diluciones corresponde a la molécula deseada.

10. Procedimiento de cuantificación según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula de calibración utilizada para la preparación del abanico de diluciones es la molécula deseada marcada con un isótopo.

11. Procedimiento de cuantificación según una de las reivindicaciones anteriores, en el que se utiliza la imagen por espectrometría de masas, en donde la intensidad de la señal de la molécula deseada permite visualizar simultáneamente la distribución y concentración de la molécula deseada en el corte de dicho tejido y/o caracterizado por que la molécula deseada es detectada y cuantificada directamente en un corte de un animal completo, para comparar simultáneamente la distribución de dicha molécula deseada en diferentes tejidos del animal, mediante un abanico de diluciones específico para cada uno de los tejidos.

12. Procedimiento de cuantificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa b) de determinación de la cantidad de molécula deseada en el tejido se ejecuta mediante un sistema informático, por medio de un soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones ejecutables por ordenador adaptadas para permitir a dicho sistema informático ejecutar la etapa b).

13. Procedimiento de validación de un procedimiento de detección y/o cuantificación de al menos una molécula deseada en un tejido biológico de interés de origen vegetal o animal a partir de un corte de dicho tejido, que comprende las etapas consistentes en:

(x) triturar un tejido idéntico al tejido al que se le va a aplicar el procedimiento de detección y/o cuantificación, para obtener un tejido homogeneizado;

(xi) mezclar una molécula de calibración con al menos dos muestras de tejido homogeneizado de la etapa (x), en donde dicha molécula de calibración está a la misma concentración conocida para las al menos dos muestras de tejido homogeneizado;

(xii) acondicionar las muestras de tejido homogeneizado derivadas de la etapa (xi) para poder cortar dichas muestras de tejido homogeneizado;

(xiii) analizar al menos un corte de cada una de las muestras de tejido homogeneizado derivadas de la etapa (xii), para obtener una señal representativa de la cantidad de molécula de calibración en el tejido para cada uno de los cortes;

(xiv) comparar las señales obtenidas para cada uno de los cortes entre sí.

14. Procedimiento para evaluar la menor cantidad de una molécula deseada detectable en un tejido biológico de interés de origen vegetal o animal, según el cual se identifica la menor señal detectable que tiene una relación de señal/ruido mayor o igual a 3 a partir de un abanico de diluciones específico para la molécula deseada y el tejido de interés obtenido a partir de cortes de un tejido reconstituido idéntico al tejido de interés, según el cual el abanico de diluciones se obtiene según las etapas que consisten en:

(i) triturar un tejido idéntico al tejido para el que se desea evaluar la cantidad más pequeña de la molécula deseada detectable o cuantificable, para obtener un tejido homogeneizado;

(ii) mezclar una molécula de calibración con una primera muestra de tejido homogeneizado de la etapa (i), en donde dicha molécula de calibración está a una primera concentración conocida;

15. Procedimiento para evaluar la menor cantidad cuantificable de una molécula deseada en un tejido biológico de interés de origen vegetal o animal, según el cual se identifica la menor señal que tiene un valor de señal/ruido mayor o igual a 3 veces el valor de señal/ruido de la señal más pequeña detectable, a partir de un abanico de diluciones específico para la molécula deseada y el tejido de interés obtenido a partir de cortes de un tejido reconstituido idéntico al tejido de interés, según el cual el abanico de diluciones se obtiene según las etapas que consisten en:

16. Procedimiento para el control de la calidad y/o reproducibilidad de un procedimiento de detección y/o cuantificación de al menos una molécula deseada en un tejido biológico de interés de origen vegetal o animal a partir de un corte de dicho tejido, que comprende las etapas consistentes en:

(xx) triturar un tejido idéntico al tejido de interés para obtener un tejido homogeneizado;

(xxi) mezclar una concentración conocida de una molécula de calibración con una muestra de tejido homogeneizado de la etapa (xx);

(xxii) acondicionar la muestra de tejido homogeneizado derivada de la etapa (xxi) para poder cortar dicha muestra de tejido homogeneizado acondicionado;

(xxiii) para cada corte del tejido de interés a analizar, analizar simultáneamente un corte de muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxii), para obtener cada vez una señal representativa de la molécula de calibración para el corte de la muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxii) y una señal representativa de la molécula deseada para el tejido de interés;

(xxiv) comparar las señales obtenidas para cada uno de los cortes de la muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxii), en donde dicha etapa (xxiv) se realiza ventajosamente por medio de un sistema informático, gracias a un soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones ejecutables por el ordenador adaptadas para permitir que dicho sistema informático ejecute dicha etapa (xxiv) y opcionalmente la etapa de ponderación con el uso de los resultados según la etapa (xxiv).

17. Procedimiento de cuantificación relativa a al menos una molécula deseada en un tejido biológico de interés de origen vegetal o animal, que comprende las etapas consistentes en:

(xxx) triturar un tejido idéntico al tejido de interés para obtener un tejido homogeneizado;

(xxxi) mezclar una concentración conocida de una molécula de calibración con una muestra de tejido homogeneizado de la etapa (xxx);

(xxxii) acondicionar la muestra de tejido homogeneizado derivada de la etapa (xxxi) para poder cortar dicha muestra de tejido homogeneizado acondicionado;

(xxxiii) para cada corte de tejido de interés a analizar, analizar simultáneamente un corte de la muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxxii), para obtener cada vez una señal representativa de la molécula de calibración para el corte de muestra de tejido homogeneizado acondicionado de la etapa (xxxii) y una señal representativa de la molécula deseada para el tejido de interés;

(xxxiv) calcular para cada corte de tejido de interés a analizar la relación de señal de la molécula deseada en el tejido de interés en función de la señal de la molécula de calibración en el tejido reconstituido;

(xxxv) comparar las proporciones obtenidas para cada corte del tejido de interés entre sí para obtener una cuantificación relativa de la molécula deseada,

en donde dicha etapa (xxxiv) y/o dicha etapa (xxxv) las ejecuta ventajosamente un sistema informático, por medio de un soporte de datos legible por ordenador que comprende las instrucciones ejecutables por ordenador adaptadas para permitir que dicho sistema informático ejecute dicha etapa (xxiv) y/o dicha etapa (xxxv).

18. Procedimiento de cuantificación según la reivindicación 12 o procedimiento para el control de la calidad y/o reproducibilidad según la reivindicación 16, o procedimiento de cuantificación relativa según la reivindicación 17, en el que el soporte de datos legible por ordenador comprende una base de datos del abanico de diluciones de al menos una molécula de calibración para al menos dos tejidos diferentes y/o una base de datos de la señal de referencia para al menos una matriz utilizada en la formación de imágenes de espectrometría de masas.