ES2922210T3 - Sustitución osteotrópica de hueso - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para producir un material de sustituto óseo osteotrópico a partir de un material de salida, que esencialmente Portlandit, Caßkalk, Aragonite; Tiene calcita y/o apatit. El material de partida es con un estroncio; La fuente de flúor y/o galio llevó a un autoclave, por lo que cuando se usa un material de salida, que esencialmente portlandita, grabado de cal, aragonita; Kalzit tiene una fuente de fosfato inserta. Además, H2O se agrega al autoclave como parte de un solvente y el valor de pH en los autoclaves se establece en un área por encima de 7. Luego, el autoclave cerrado y lleno se calienta durante al menos 1 hora y luego se enfría. El material de reemplazo óseo osteotrópico resultante se limpia mediante restos de la fuente de fósforo, estroncio, flúor y/o galio. Además, la invención afecta un material sustituto óseo osteotrópico, que esencialmente consiste en apatit y se instala en la rejilla de cristal en el estroncio y/o iones fluorinos y/o galio. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Sustitución osteotrópica de hueso
La invención se refiere a un procedimiento para fabricar un material osteotrópico de sustitución de hueso a partir de un material de partida que comprende esencialmente portlandita, cal cáustica, aragonito, calcita, por ejemplo esqueletos de algas calcáreas, y/o apatita, por ejemplo como hidroxiapatita, por ejemplo de huesos de vertebrados o producida sintéticamente. Además, la invención se refiere a un material óseo osteotrópico que ha sido fabricado según el procedimiento de la invención.
En el contexto de la invención, los materiales de partida mencionados también pueden entenderse como materiales que tienen una estructura análoga a los materiales de partida, pero que se producen sintéticamente.
Muchos de los materiales de sustitución de hueso usados actualmente a partir de hueso natural, tanto autólogo como alógeno y xenógeno, coral, algas o también materiales de sustitución de hueso de hidroxiapatita producidos totalmente de forma sintética, que se usan como implantes óseos o como materiales de sustitución de hueso en el contexto del aumento del material óseo, solo tienen propiedades osteoconductoras. Esto significa que, aunque los anteriores materiales de sustitución de hueso de fosfato de calcio o de hidroxiapatita proporcionan una superficie biocompatible adecuada para el crecimiento directo de tejido óseo en la superficie del implante, no estimulan directamente la formación de hueso nuevo en el entorno óseo inmediato del implante. Los materiales de hidroxiapatita o de fosfato de calcio son básicamente solo osteoconductores. Por lo tanto, permiten el crecimiento del hueso, pero no estimulan por sí mismos la proliferación o la diferenciación de las células de crecimiento óseo, tales como los osteoblastos o sus precursores. El crecimiento directo en el sentido de la invención puede entenderse en particular como el crecimiento sin una "capa de tejido intermedia" entre la superficie del implante y el tejido óseo.
Con el fin de desarrollar un efecto osteoinductor, los materiales de sustitución de hueso o las sustancias orgánicas, tales como los colágenos o las moléculas orgánicas, se han complementado con proteínas adicionales, péptidos u otras moléculas. Ejemplos de ello son los factores de crecimiento tales como diversos BMP, IGF1/2, FGF o similares, o productos de suero. El problema es que estas sustancias a menudo permanecen en el implante o en el lugar del implante durante períodos de tiempo poco claros, ya que normalmente se eliminan de manera rápida del lugar del implante o se degradan. Así, por un lado, las propiedades osteoinductoras solo están presentes durante un corto periodo de tiempo y realmente no se pueden dosificar, y por otro lado, también son posibles los efectos sistémicos en todo el organismo, que normalmente no se pretenden.
Ejemplos de procedimientos de fabricación de este tipo de material de sustitución de hueso pueden encontrarse en las patentes europeas EP 230570 B1 y EP 028074 B1. En este procedimiento, se obtiene un material de sustitución de hueso a partir de la hidroxiapatita, que procede de algas marinas que aportan calcio, en el que se transforma el esqueleto de carbonato cálcico que se encuentra en la naturaleza.
Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, un material de sustitución de hueso solo es osteoconductor y no osteoinductor.
Además, de P. Melnikov et al, Materials Chemistry and Physics 117(1), 86-90, (2009) se deriva hidroxiapatita con galio para uso en ortopedia, del documento CN 101928136 A hidroxiapatita fluorada y su uso en la fabricación de huesos artificiales, y del documento EP 2228 080 A un compuesto fosfocálcico dopado con galio con estructura de apatita para rellenar defectos dentales u óseos.
También el documento XP 55793154 (A. Sakai et al., Dental Materials Journal 31(2), 197-205 (2012)) y el documento XP 0222 45491 (E. Landi et al., Acta Biomaterialia 3, 961-969 (2007)) describen un cemento óseo de apatita en el que está presente el estroncio.
La invención tiene como objetivo, por tanto, proporcionar un procedimiento para fabricar un material de sustitución de hueso y un material de sustitución de hueso propiamente dicho que tenga propiedades osteotrópicas localizadas y de acción prolongada.
Según la invención, este objetivo se consigue mediante un procedimiento para fabricar un material osteotrópico de sustitución de hueso que tiene las características de la reivindicación 1, así como un material osteotrópico de sustitución de hueso que tiene las características de la reivindicación 13. En las reivindicaciones dependientes se muestran formas de realización ventajosas de la invención. Según la invención, está previsto que se use un material de partida que comprenda esencialmente portlandita, cal cáustica, aragonito, calcita y/o apatita, por ejemplo como hidroxiapatita, en donde la portlandita, la cal cáustica, el aragonito y/o la calcita se usan en forma de esqueletos biogénicos calcinados, no calcinados y/o procesados químicamente, o en donde se usan como apatita huesos de vertebrados tras su maceración pirolítica o química.
Se introduce el material de partida en un autoclave con una fuente de estroncio, flúor y/o galio, en donde cuando se usa un material de partida que comprende esencialmente portlandita, cal cáustica, aragonito, calcita se introduce una fuente de fosfato. En el caso de un material de partida compuesto esencialmente por apatita, también se puede introducir una fuente de fosfato, pero no es obligatorio. Además, se añade agua al autoclave como componente de un disolvente. A continuación, se ajusta el pH a un intervalo superior a 7 a temperatura ambiente y presión normal en el autoclave. A continuación, se calienta durante al menos una hora el autoclave cerrado y lleno y luego se enfría. Finalmente, se limpia el contenido del autoclave de los residuos de la fuente de estroncio, fluoruro y/o galio. Lo mismo se aplica a la fuente de fósforo, si se usa.
De acuerdo con la invención, se constató que los iones de estroncio, flúor y/o galio, entre otros, que se incorporan a una estructura de apatita, presentan propiedades osteoductivas u osteotrópicas o antirresortivas, respectivamente. Un aspecto esencial de la invención es el procedimiento según la invención para incorporar los iones de fluoruro de estroncio y/o galio en la apatita, en particular en la estructura de hidroxiapatita, y no simplemente acumularlos. En el caso de una adhesión puramente superficial, podría producirse un desprendimiento de las sustancias adheridas. Sin embargo, el procedimiento según la invención permite combinar los iones mencionados, que tienen propiedades osteotrópicas, es decir, osteoinductoras, antirresortivas y/o propiedades que favorecen la formación de tejido óseo, con la estructura de apatita que se está formando de tal manera que no se pueden disolver fácilmente.
Para una conversión con éxito de los materiales de partida a partir de materiales de carbonato de calcio, es decir, en particular la portlandita, la cal cáustica, la aragonita, la calcita, en una estructura de apatita o hidroxiapatita, es esencial la presencia de una fuente de fosfato, para lo cual se pueden usar diversas sales de fosfato. Cuando se usa un material de apatita como material de partida, la presencia de una fuente de fosfato no es obligatoria pero sí ventajosa. En particular, esto evita que la estructura existente se debilite durante el procedimiento.
Según las investigaciones en las que se basa la invención, se pueden conseguir resultados especialmente buenos cuando el autoclave cerrado y lleno se calienta a un mínimo de 30 °C, preferentemente a más de 190 °C. Esto se puede hacer en un horno o en un módulo de calentamiento. También es posible proporcionar un módulo de calefacción integrado en el autoclave. A estas temperaturas, se consigue una conversión suficientemente buena del material de partida en apatita dopada, por lo que además, como ya se ha descrito, los iones mencionados se incorporan y se unen a la red cristalina de la apatita. Cuanto más baja sea la temperatura del horno, más lenta será la reacción que se produzca en el autoclave.
Un horno en el sentido del procedimiento según la invención también puede denominarse armario de calentamiento o similar. En este caso, es esencial que el aparato pueda mantener una temperatura deseada de entre 30 y varios cientos de grados de forma constante durante un periodo de tiempo prolongado.
Son posibles varios procedimientos para limpiar el contenido del autoclave de los residuos de la fuente de estroncio, flúor y/o galio, así como de la fuente de fósforo. Dependiendo de la selección de fuentes, el contenido del autoclave se puede limpiar preferentemente de forma mecánica con un dispositivo de filtrado. Este es el caso si las fuentes usadas son lo más grandes posible o difíciles de disolver.
Para una buena compatibilidad tisular del material de sustitución de hueso según la invención, es ventajoso que el contenido del autoclave se limpie después de una limpieza, en particular mecánica, hasta alcanzar un valor de pH inferior a 8.
Para ajustar el pH a un intervalo superior a 7 antes de sellar el autoclave, se puede usar una solución básica, en particular una solución de amoníaco. Por ejemplo, se puede usar una solución de dihidrógeno fosfato de amonio o de otro compuesto de fosfato para este fin.
Preferentemente, se introduce una fuente de estroncio, flúor y/o galio en exceso con respecto al material de partida. Ventajosamente, esto también se aplica a la fuente de fosfato. En otras palabras, se dispone de una gran reserva de los materiales correspondientes, de modo que se puede lograr una buena incorporación de la apatita a la red cristalina con un alto grado de certeza. En la etapa final de purificación descrita anteriormente, se eliminan del material producido los correspondientes materiales fuente no consumidos de la fuente de estroncio, flúor y/o galio, así como la fuente de fósforo. Esto significa que se limpia el material.
Cuando se usa, por ejemplo, dihidrogenofosfato de amonio o fosfato de diamonio como fuente de fósforo, estos agentes se pueden usar al mismo tiempo para ajustar el pH deseado. También se ha comprobado que el uso de dihidrogenofosfato de amonio disuelto en agua es especialmente fácil de dosificar y se puede conseguir en el autoclave un entorno de reacción óptimo.
Preferentemente, los átomos de calcio y de fósforo están presentes en la mezcla total en el autoclave en una proporción de 10:5 como máximo. Dicha proporción ha demostrado ser ventajosa para las propiedades osteotrópicas del material de sustitución de hueso resultante, ya que las correspondientes sustancias osteotrópicas, es decir,
osteoinductoras y/o antirresortivas, están presentes en una proporción que permite obtener resultados especialmente buenos.
Como apatita se usan huesos de animales vertebrados.
Los huesos de los mamíferos, por ejemplo del ganado bovino o porcino, ya proporcionan apatito con una proporción significativa de apatito hidroxilo y carbonato. Cuando se usan huesos de vertebrados o mamíferos, éstos se someten primero a una maceración pirolítica o química, es decir, a la eliminación del material inmunógeno.
En principio, se prefiere un calentamiento prolongado del autoclave cerrado y lleno. De acuerdo con la invención, se ha comprobado que los resultados del material osteotrópico de sustitución de hueso resultante son muy buenos después de 1 a 4 días, por lo que un calentamiento aún más prolongado no conduce necesariamente a unos resultados significativamente mejores.
Tal como se ha descrito anteriormente, tras el calentamiento en el autoclave y el posterior enfriamiento, la fuente de estroncio, flúor y/o galio se separa del material osteotrópico de sustitución de hueso resultante mediante su purificación. En este caso, es preferible que como fuente de estroncio, flúor y/o galio se use un material fácilmente lixiviable o poco soluble en agua. El uso de un material fácilmente lavable tiene la ventaja de que se puede eliminar fácilmente al lavar el material osteotrópico de sustitución de hueso fabricado y, por lo tanto, el material osteotrópico de sustitución de hueso se puede limpiar más fácilmente. Alternativamente, un material poco soluble, en particular, toscamente cristalino, ofrece la ventaja de que durante el procedimiento de conversión en el autoclave están disponibles suficientes iones de estroncio, flúor y/o galio, pero la limpieza posterior puede realizarse con especial facilidad, por ejemplo, también mecánicamente.
Se puede conseguir una limpieza especialmente fácil del material osteotrópico de sustitución de hueso resultante si la fuente de estroncio, flúor y/o galio se añade al autoclave como sólido en un recipiente. En este caso, el recipiente está diseñado de tal manera que permite el intercambio de iones de la fuente de estroncio, flúor y/o galio con el disolvente presente en el autoclave, pero los sólidos quedan retenidos. Esto facilita la limpieza final del material de sustitución de hueso osteotrópica.
Preferentemente, el material de partida se somete a un tratamiento pirolítico y/o a una limpieza química antes o después de ser introducido en el autoclave y/o el contenido del autoclave se somete a un tratamiento pirolítico y/o a una limpieza química después de finalizar el procedimiento. El tratamiento pirolítico o el procedimiento de purificación química tienen la ventaja de que las proteínas u otras impurezas orgánicas presentes se eliminan del material osteotrópico de sustitución de hueso producido, de tal modo que se minimizan o excluyen las interacciones cuando el material sustitutivo óseo se implanta en un cuerpo humano.
Además, la invención se refiere a un material osteotrópico de sustitución de hueso que ha sido producido según el procedimiento de la invención descrito anteriormente. El material osteotrópico de sustitución de hueso, que comprende esencialmente apatita, tiene iones de estroncio, flúor y/o galio en su red cristalina. Estos desarrollan propiedades osteotrópicas tras su implantación en un cuerpo animal o humano. Además de la apatita, especialmente la hidroxiapatita, también pueden estar presentes pequeños componentes de fosfato de calcio, calcita, aragonito y fosfato tricálcico.
El material osteotrópico de sustitución de hueso según la invención, fabricado según el procedimiento de la invención, se puede usar, por ejemplo, para fabricar bloques dimensionalmente estables, integrando también implantes cilíndricos dentales u otros objetos metálicos. Estos bloques se pueden implantar en un maxilar como futuros portadores de implantes dentales y se pueden usar inmediatamente y sin otra segunda intervención tras una fase de cicatrización de 3 a 6 meses. Dado que el material osteotrópico de sustitución de hueso resultante tiene forma de polvo, los bloques dimensionalmente estables que se fabrican con él pueden personalizarse y, por tanto, adaptarse a los defectos óseos, tales como el hueco de un diente.
Al incrustar los iones de estroncio, flúor y/o galio de acuerdo con la invención, el material de sustitución de hueso desarrolla un efecto osteotrópico local sin más adición, que tiene lugar principalmente y de manera esencial solo en el lugar del implante. Así, el material de sustitución de hueso según la invención no tiene ningún efecto sistémico. Otra ventaja es que el material de sustitución de hueso según la invención desarrolla sus efectos osteoinductivos u osteotrópicos durante todo el tiempo que permanece en el lugar del implante y solo termina en cuanto es sustituido por tejido óseo autóctono. De este modo, se consigue una curación más rápida y sostenible de un defecto óseo.
Otro ejemplo de la aplicación del material osteotrópico de sustitución de hueso según la invención puede ser la estabilización en fracturas vertebrales osteoporóticas, traumáticas y/o malignas o en fracturas por sinterización. Otra posibilidad es usar el material producido según la invención como material de partida para procedimientos de impresión
La invención se explica con más detalle a continuación por medio de realizaciones a modo de ejemplo esquemáticas y con referencia a las figuras. Aquí se muestra
Fig. 1 a 6 Resultados de las pruebas comparativas
Procedimiento de fabricación
Se describe a continuación un ejemplo de preparación del material osteotrópico de sustitución de hueso según el procedimiento de la invención.
Para ello se usa un recipiente de teflón de 150 ml. Esto está lleno de las siguientes sustancias:
Como un ejemplo para el aragonito, se usa como material de partida un esqueleto de algas calcáreas incrustantes. En el caso de los materiales de partida que contienen CO2, suele ser ventajoso que éstos sean calcinados, en cuyo caso es deseable conservar la estructura exterior del material. Como se ha descrito, el procedimiento según la invención también se puede aplicar a un material de apatita, por ejemplo de huesos de vertebrados como material de partida, en el que la presencia de una fuente de fosfato ha demostrado ser ventajosa, por un lado, para la introducción de los iones osteotrópicos y, por otro, para mantener la estructura del material de partida.
El esqueleto de las algas se calcina, antes de añadirlo al recipiente de teflón, para eliminar cualquier proteína extraña, proteínas o similares. También se añade dihidrógeno fosfato de amonio, fluoruro de estroncio, fluoruro de potasio y una solución de amoníaco al 25 %. También se añade agua desionizada.
Los pesos o los volúmenes correspondientes de las sustancias añadidas pueden tomarse de la tabla.
En este caso, el dihidrógeno fosfato de amonio sirve como fuente de fosfato, aunque también son posibles otras fuentes de fosfato como se ha descrito. El fluoruro de estroncio se usa como fuente de estroncio y de flúor. El fluoruro de potasio también se usa como fuente de fluoruro.
Después de colocar las sustancias en el recipiente de teflón y esperar a la formación de gas, se sella el recipiente. A continuación, se coloca el recipiente de teflón en un autoclave, por ejemplo en un recipiente de digestión a presión. Este recipiente es preferentemente de acero inoxidable. A continuación, se enrosca firmemente la tapa para formar un autoclave.
El recipiente de digestión a presión debidamente cerrado se coloca entonces en un armario de calentamiento precalentado o en un bloque de calentamiento, que tiene una temperatura de 190 °C.
El recipiente de digestión a presión permanece en el horno de calentamiento durante 5 días, manteniendo la temperatura de 190 °C. Una vez transcurrido este tiempo, se desconecta el armario calefactor. A continuación, se enfría lentamente el recipiente de digestión a presión en la cabina o en el bloque de calefacción. Esto tarda aproximadamente un día.
Tras el enfriamiento completo, se abren el recipiente de digestión a presión y el recipiente de teflón y se limpia el material de sustitución de hueso osteotrópica resultante. Para ello, se dispone el material osteotrópico de sustitución de hueso con agua en un papel de filtro y se lava. Se llevan a cabo varios procedimientos de limpieza, por ejemplo, procedimientos de enjuague, hasta alcanzar un valor de pH inferior a 8.
Posteriormente, se dispone el material material de sustitución de hueso osteotrópico de nuevo en la cabina de calentamiento y se seca, pero solo a 40 °C.
Después, el material de sustitución de hueso osteotrópica está listo para su uso. A continuación, se le puede dar la forma deseada y esterilizar, por ejemplo.
Ensayos y resultados
A continuación, se explica con más detalle el efecto del nuevo material osteotrópico de sustitución de hueso, que se fabrica según el procedimiento de acuerdo con la invención, y se demuestra la eficacia osteoinductora sobre la base de los resultados de las pruebas. Los resultados muestran que el material de sustitución de hueso según la invención debería estimular adicionalmente la formación local de hueso nuevo en el defecto óseo, ya que en las células óseas humanas se estimula el marcador de acreción ósea más importante, la fosfatasa alcalina.
Se realizaron experimentos in vitro con células óseas osteoblásticas humanas primarias para estudiar la influencia directa del material osteotrópico de sustitución de hueso según la invención en contacto con células humanas primarias. Esto también se llevó a cabo para no pasar por alto las influencias nocivas del material osteotrópico de sustitución de hueso de la invención sobre las células óseas humanas, que irían acompañadas de la muerte celular.
Las células óseas primarias de osteoblastos humanos son, por tanto, adecuadas como sistema de prueba sensible para investigar el efecto de un nuevo material de sustitución de hueso en el metabolismo de las células óseas humanas antes del uso clínico de los nuevos materiales de sustitución de hueso in vivo.
Una célula in vitro -incluyendo una célula ósea humana primaria- tiene cuatro posibles modos de reacción:
• no hay respuesta
• apoptosis (muerte celular)
• aumento/disminución de la división celular
• aumento/disminución de la fabricación de productos celulares diferenciados (por ejemplo, en las células óseas la fosfatasa alcalina), que es necesaria para la formación de nuevo tejido óseo y para la mineralización y la formación de hidroxiapatita in vivo.
Se usaron cocultivos de células óseas humanas primarias para realizar los experimentos. Para comparar el efecto, se usaron materiales de sustitución de hueso disponibles en el mercado, así como material de sustitución de hueso osteotrópica, que se fabricó según el procedimiento de la invención. En los experimentos in vitro, se probaron de manera comparativa los siguientes materiales de sustitución de hueso con respecto a su efecto sobre las células óseas humanas primarias: 1. BioOss® (gránulos de hueso bovino, distribuidos comercialmente por Geistlich Biomaterials)
2. Algipore® (basado en el documento EP 230570 B1 distribuido comercialmente por Dentsply)
3. Nuevo material de sustitución de hueso osteotrópica Algipore 1 (= NA1) según la invención
4. Nuevo material de sustitución de hueso osteotrópica Algipore 2 (= NA2) según la invención
5. Nuevo BioOss1 (BioOss® que ha sido sometido al procedimiento según la invención)
Se seleccionaron los siguientes procedimientos de determinación para investigar la influencia de los materiales mencionados en las funciones celulares de las células óseas humanas primarias:
a. Fosfatasa alcalina
b. Proteínas celulares
1er ensayo
Fosfatasa alcalina
Los resultados comparativos se expresan como % del control /- desviación estándar. En primer lugar, se investigó la actividad de la fosfatasa alcalina en el sobrenadante del medio tras el cultivo de células óseas humanas en presencia
de los diferentes materiales. Una alícuota del medio de cultivo celular usado solo sin células sirvió de control, ya que los residuos del suero contenido en el medio de cultivo siempre permanecen en los orificios de las placas de cultivo a pesar del enjuague sin suero antes de exponer las células a los materiales. El suero siempre contiene también pequeñas cantidades de fosfatasa alcalina. En este rimer ensa o el nuevo BioOss1 aún no estaba dis onible.
Estos resultados se ilustran gráficamente en la Fig. 1.
Interpretación
BioOss® tiende a disminuir la actividad de la enzima fosfatasa alcalina, que es indispensable para la formación mineral y ósea de las células óseas humanas, mientras que el material de sustitución de hueso según la invención provoca un aumento muy significativo de la actividad de la fosfatasa alcalina secretada por las células óseas humanas.
La fosfatasa alcalina específica del hueso, como la proteína marcadora más importante de los osteoblastos, se estimula así de forma muy significativa en el modelo de células óseas humanas por medio del material de sustitución de hueso según la invención que en presencia de los materiales convencionales. La diferente potencia de NA1 y NA2 sobre la actividad de la fosfatasa alcalina se debe a un mayor contenido de flúor y estroncio en NA2 en comparación con NA1.
Al medir la actividad de la fosfatasa alcalina en el sobrenadante del cultivo celular, debe tenerse en cuenta que la formación de minerales o de hueso también se produce extracelularmente in vivo a través de la secreción de fosfatasa alcalina en el microambiente de los osteoblastos.
División celular / proteína celular
Como indicación de un efecto de los materiales de sustitución de hueso sobre la división celular, se analizó el contenido de proteínas en los "agujeros" individuales, es decir, en las cámaras de reacción, de las placas con múltiples agujeros usadas. Para ello, se usó un extracto de tritón de los respectivos agujeros para la determinación del contenido de proteínas según el procedimiento BCA. Cuanto mayor sea el contenido de proteínas en los agujeros individuales, más material celular correspondiente a las proteínas debe estar presente en los agujeros. Esto significa que el número de células ha aumentado porque una célula ósea siempre tiene un tamaño similar y las proteínas no se almacenan intracelularmente en mayor medida en las células óseas. Por lo tanto, una disminución del contenido de proteínas en un orificio de cultivo celular, es decir, en una cámara de reacción, equivaldría a una disminución del número de células adheridas a la placa de cultivo celular o a los materiales de sustitución de hueso (las células apoptóticas, es decir, muertas, no permanecen adheridas y son lavadas antes de la adición de tritón). Los resultados se indican de nuevo en % del control /- desviación estándar.
Estos resultados se ilustran gráficamente en la Fig. 2.
Interpretación
No hay diferencia entre los materiales probados en el contenido de proteínas celulares en los agujeros de cultivo celular. Por lo tanto, los materiales no afectan a la división celular, sino también a la muerte de las células, ya que las células que degeneran apoptóticamente no permanecen adheridas, sino que se desprenden y serían eliminadas antes del procedimiento de ensayo.
Visión general
Estas observaciones indican que los materiales obtenidos según los procedimientos de la invención tienen un efecto muy positivo sobre la actividad de la fosfatasa alcalina de las células óseas humanas.
Esta observación es coherente con un efecto muy favorable y sostenido del material de sustitución de hueso de la invención que estimula la formación mineral ósea in vivo, sin afectar a la división celular, es decir, estimulándola o inhibiéndola.
2° Ensayo, activación del material BioOss® convencional mediante el procedimiento según la invención
El material BioOss® usado anteriormente como material de sustitución de hueso en odontología o en cirugía oral consiste en el material natural de hidroxiapatita del tejido óseo inorgánico del ganado. Con el procedimiento según la invención, también se puede llevar a cabo de forma controlada un intercambio parcial de iones de calcio, en el cristal de hidroxiapatita, con iones de estroncio y fluoruro en una red cristalina de fosfato de calcio natural. Aquí, los átomos de calcio y fósforo deben estar presentes en la mezcla total del pesaje en autoclave en una proporción de 10:5 como máximo.
En el siguiente experimento con células primarias de osteoblastos humanos, se investiga el efecto del material BioOss® convencional en paralelo con los efectos del material BioOss1, activado por el procedimiento de la invención, sobre la actividad de la fosfatasa alcalina.
Al mismo tiempo, los materiales ya probados anteriormente se usan también en el mismo experimento para permitir una clasificación de las eficacias de todos los materiales producidos con el procedimiento según la invención en un montaje experimental paralelo. También se midió aquí la actividad de la fosfatasa alcalina en el sobrenadante del cultivo celular tras un tiempo de incubación de las células con el nuevo material de 24 horas.
Este experimento sellevó a cabo de nuevo con células óseas humanas primarias de un individuo diferente al de los primeros experimentos (1. Experimento).
Fosfatasa alcalina
Estos resultados se ilustran gráficamente en la Fig. 3.
División celular / proteína celular
Estos resultados se ilustran gráficamente en la Fig. 4.
Interpretación
Mientras que el material BioOss® convencional no tiene un efecto estimulante significativo sobre la actividad de la fosfatasa alcalina en los sobrenadantes de cultivo celular en comparación con las células óseas humanas sin contacto con un sustituto de injerto óseo, el material BioOss® (BioOss1) tratado previamente por medio del procedimiento según la invención provoca casi una duplicación de la actividad de la fosfatasa alcalina. Por lo tanto, el procedimiento según la invención también es adecuado para activar el material de hidroxiapatita bovina disponible en el mercado e imparte propiedades osteoinductoras al material BioOss®, que anteriormente solo era osteoconductor.
Por lo demás, este experimento reproduce los resultados del primer experimento ya analizado anteriormente: El BioOss® comercial no muestra una estimulación significativa de la fosfatasa alcalina, mientras que el BioOss1 producido por medio del procedimiento de la invención muestra casi el doble de activación de la actividad de la fosfatasa alcalina. Además, los "materiales de hidroxiapatita de algas" NA1 y especialmente NA2 producidos por el procedimiento de la invención muestran una estimulación aún más potente de la actividad de la fosfatasa alcalina.
En este experimento comparativo, tampoco hay pruebas definitivas de un efecto significativamente diferente de los materiales de sustitución de hueso probados frente a la producción total de proteínas celulares en los sobrenadantes celulares en las cámaras de reacción. (véase la figura 4).
3er Ensayo, reproducción de los resultados
En un enfoque adicional, todos los experimentos se repiten de nuevo con otras células osteoblásticas humanas primarias de un tercer donante sano y los resultados se reproducen de manera consistente. Así, los efectos de todos los materiales producidos hasta ahora según el procedimiento de la invención se reproducen en paralelo en un montaje experimental adicional y se comparan con los efectos de los materiales de sustitución de hueso disponibles en el mercado.
Las actividades de la fosfatasa alcalina se midieron de nuevo en los sobrenadantes del cultivo celular en las cámaras de reacción.
Fosfatasa alcalina
Estos resultados se ilustran gráficamente en la Fig. 5.
División celular / proteína celular
Estos resultados se ilustran gráficamente en la Fig. 6.
Interpretación
En este experimento, también, los materiales de sustitución de hueso NA2 y BioOss1 "activados" por el procedimiento según la invención demuestran ser significativamente más efectivos en términos de estimular la actividad de la fosfatasa alcalina que los materiales de sustitución de hueso comercialmente disponibles BioOss® y Algipore®. El material NA1 tratado en un procedimiento inicial muestra un efecto comparable al del material de sustitución de hueso Algipore® disponible en el mercado.
Así, cualquier material de sustitución de hueso "activado" por el procedimiento de fabricación de la invención resulta ser superior a los productos anteriores con respecto a la estimulación del marcador de formación de hueso estándar osteoblástico, la fosfatasa alcalina
El procedimiento de fabricación según la invención es, por tanto, adecuado para fabricar un material de sustitución de hueso activado tanto durante un procedimiento de conversión a partir de un carbonato de calcio o una mezcla de portlandita, cal cáustica y calcita en un material de apatita, como también directamente a partir de un material de hidroxiapatita existente mediante la inserción de iones activadores, tales como los iones de estroncio, en la red cristalina. En particular, un material que tiene propiedades osteoinductivas u osteotrópicas o también antirresortivas puede considerarse activado dentro del ámbito de la invención.
Así, el procedimiento según la invención o el material osteotrópico de sustitución de hueso producido por el procedimiento según la invención crea un material que tiene propiedades osteoinductoras u osteotrópicas localizadas y de acción prolongada y es muy adecuado como material de implante en el tejido óseo.
Claims (13)
1. Procedimiento de fabricación de un material osteotrópico de sustitución de hueso a partir de un
material de partida que presenta esencialmente portlandita, cal cáustica, aragonito; calcita y/o apatita, en particular hidroxiapatita,
en donde se usa portlandita, cal cáustica, aragonito y/o calcita en forma de esqueletos biogénicos calcinados, no calcinados y/o preparados químicamente o
en donde como apatita se usan huesos de vertebrados, tras su maceración pirolítica o química, en donde el material de partida se introduce en un autoclave con una fuente de estroncio, flúor y/o galio, en donde cuando se usa un material de partida que presenta esencialmente portlandita, cal cáustica, aragonito, calcita, se introduce una fuente de fosfato,
en donde al autoclave se le añade H2O como componente de un disolvente,
en donde el pH en el autoclave se ajusta en un intervalo superior a 7,
en donde el autoclave cerrado y lleno se calienta durante al menos 1 hora y luego se enfría, y
en donde a continuación se limpia el contenido del autoclave de los residuos de la fuente de fósforo, estroncio, flúor y/o galio.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado
porque se calienta el autoclave cerrado y lleno a por lo menos 30 grados Celsius, preferentemente por encima de 190 grados Celsius.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2,
caracterizado
porque se limpia mecánicamente el contenido del autoclave con un dispositivo de filtrado.
4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado
porque se lava el contenido del autoclave con H2O hasta alcanzar un valor de pH preferentemente inferior a 8.
5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado
porque para ajustar el pH en el autoclave en un intervalo superior a 7 se usa una solución básica, en particular una solución de amoníaco.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado
porque se introduce la fuente de estroncio, flúor y/o galio en exceso con respecto al material de partida.
7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado
porque como fuente de fósforo se añade dihidrógeno fosfato de amonio o fosfato de diamonio.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado
porque los átomos de calcio y fósforo están presentes en la mezcla total en una proporción de como máximo 10:5 (relación atómica).
9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
caracterizado
porque se calienta durante al menos 12 horas el autoclave cerrado y lleno .
10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
caracterizado
porque como fuente de estroncio, flúor y/o galio se usa un material fácilmente lixiviable o difícilmente soluble en agua.
11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,
caracterizado
porque se añade al autoclave en un recipiente la fuente de estroncio, flúor y/o galio como sólido, y porque el recipiente permite el intercambio de iones de la fuente de estroncio, flúor y/o galio con el disolvente, reteniéndose los sólidos.
12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,
caracterizado
porque se somete el material de partida a un tratamiento pirolítico y/o a un procedimiento de limpieza química antes o después de ser introducido en el autoclave y/o en el contenido del autoclave.
13. Material osteotrópico de sustitución de hueso, en particular según un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que presenta sustancialmente apatita,
- que se fabrica a partir de portlandita, cal cáustica, aragonito y/o calcita en forma de esqueletos biogénicos calcinados, no calcinados y/o preparados químicamente o
- que se fabrica a partir de huesos de vertebrados tras una maceración pirolítica o química
en donde los iones de estroncio, flúor y/o galio están incorporados en la red cristalina de la apatita.
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