ES2921015T3

ES2921015T3 - Anticuerpos contra GARP-TGF-BETA

Info

Publication number: ES2921015T3
Application number: ES18728524T
Authority: ES
Inventors: Der Woning Sebastian Van; Filip Borgions; Torsten Dreier; Lore Mariën; Boeck Gitte De; Stéphanie Lienart; Sophie Lucas; Pierre Coulie
Original assignee: Universite Catholique de Louvain UCL; ArgenX BVBA
Current assignee: Universite Catholique de Louvain UCL; ArgenX BVBA
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2018-05-11
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2038-05-11
Also published as: NZ758647A; EP3606961B1; US20200095311A1; PT3606961T; JP2022169549A; PL3606961T3; KR20200027469A; US10793627B2; PH12019502526A1; MX2019013490A; RU2767784C2; US20190375832A1; RU2019140602A; AU2018265241B2; JP7118135B2; EP4282430A3; IL270236B2; CN110945027B; US10875914B2; ECSP19087742A

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un complejo de GARP y TGF-β1, particularmente un complejo de GARP humano y TGF-β1 humano. Estos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno exhiben una combinación de propiedades ventajosas que incluyen unión a antígeno de alta afinidad y la capacidad de inhibir la liberación de TGF-β activo; de las células T reguladoras. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son relativamente resistentes a la desamidación, isomerización y oxidación, de modo que muestran una estabilidad mejorada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra GARP-TGF-BETA

Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII. Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a un complejo de GARP humano y TGF-p1 humano. Estos anticuerpos muestran una combinación de propiedades ventajosas que incluyen la unión al antígeno con alta afinidad y la capacidad de inhibir la liberación de TGF-p activo a partir de los linfocitos T reguladores. Los anticuerpos de la presente invención están mejorados en comparación con los anticuerpos de la técnica anterior que se unen al complejo de GARP y TGF-p1. En particular, los anticuerpos de la presente invención son relativamente resistentes a la desamidación, la isomerización y la oxidación, de modo que muestran una estabilidad mejorada en comparación con los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 descritos en la técnica anterior.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos T reguladores (también conocidos como "Treg" o linfocitos T reguladores Foxp3 ) son un componente importante del sistema inmunitario. En particular, los Treg desempeñan un papel fundamental en la homeostasis inmunitaria al suprimir varios aspectos de la respuesta inmunitaria. Como consecuencia de su papel en la coordinación de la respuesta inmunitaria, la actividad desregulada de Treg puede conducir al desarrollo de diversas enfermedades y afecciones. En particular, la función insuficiente de Treg puede dar lugar a una patología autoinmunitaria, mientras que la actividad excesiva de Treg se ha relacionado con la inhibición de las respuestas antitumorales en pacientes con cáncer.

La proteína GARP (glicoproteína A predominante en repeticiones) se ha identificado como un marcador altamente expresado en la superficie de Treg, particularmente Treg activados. La GARP es una proteína transmembrana de 80 kDa con una región extracelular que comprende 20 repeticiones ricas en leucina. También se conoce como LRRC32. La GARP sirve como el receptor para TGF-p, particularmente la forma latente de TGF-p, y es necesario para la expresión de TGF-p latente en los linfocitos Treg (EM Shevach. Expert Opin Ther Targets (2016) 21(2), 191 200).

El TGF-p es una citocina conocida por desempeñar un papel en múltiples procesos que incluyen la proliferación y la diferenciación celular, la morfogénesis de los tejidos, la inflamación y la apoptosis. También se ha identificado como un importante factor de crecimiento implicado en el desarrollo del cáncer y, de manera bastante inusual, se ha identificado como una citocina con propiedades promotoras y supresoras de tumores.

La producción y la activación de TGF-p es un proceso de varias etapas, que se regula en diferentes niveles. El TGF-p se sintetiza como un precursor dimérico pro-TGF-p, cada cadena polipeptídica consiste en un péptido asociado a latencia (LAP) y una región de TGF-p maduro. El pro-TGF-p se escinde por la enzima furina para formar "TGF-p latente", una forma inactiva en la que el LAP permanece asociado de forma no covalente con la región de TGF-p maduro de cada cadena polipeptídica (consulte la Figura 1). La GARP localizada en la membrana sirve para transportar y anclar el TGF-p latente a la superficie celular de Treg, y es a partir de este complejo de TGF-p latente con GARP unido a la membrana que se libera la forma activa de TGF-p. Se han propuesto una variedad de mecanismos para explicar cómo se libera el TGF-p activo del complejo de TGF-p latente con GARP en la superficie de Treg. Sin embargo, ahora se cree que las integrinas, particularmente avp6 y avp8, desempeñan un papel importante en la conducción de las fuerzas de cizallamiento necesarias para la liberación del dímero de TGF-p maduro.

Una vez liberado, el dímero de TGF-p activo puede actuar como un mediador autocrino o paracrino de las vías de señalización posteriores. En el contexto del sistema inmunitario, se cree que la liberación de TGF-p a partir de Treg influye en la actividad de varios linfocitos T efectores y también en los propios Treg (consulte la Figura 1). Dado que los Treg juegan un papel importante en la supresión de la inmunidad, se cree que el TGF-p liberado a partir de Treg y que actúa de manera autocrina puede estar involucrado en la mediación de la supresión de Treg. En particular, se cree que el TGF-p1 derivado de Treg desempeña un papel importante en la supresión de la inmunidad tumoral mediada por Treg.

Dado el papel del TGF-p derivado de Treg en la supresión de la respuesta inmunitaria en el microambiente tumoral, ha habido interés en enfocarse en esta vía como un enfoque alternativo para la inmunoterapia contra el cáncer. Por ejemplo, los agentes terapéuticos capaces de amortiguar esta vía pueden servir como herramientas útiles para mejorar la eficacia de las vacunas contra el cáncer u otras estrategias de inmunoterapia contra el cáncer diseñadas para aprovechar el poder del sistema inmunitario del cuerpo para tratar el cáncer.

El documento núm. CA2999819 describe anticuerpos anti-GARP. Cuende y otros (Sci Transí Med. 22 de abril de 2015; 7(284):284ra56) describen la producción y la caracterización de dos anticuerpos monoclonales (MHG-8 y LHG10), que se unen al complejo GARP-TGF-p en Treg e inhiben la producción de TGF-p. Estos dos anticuerpos también se describen y se caracterizan en las solicitudes de patentes internacionales núms. WO2015/015003 y WO2016/125017. Se demostró que estos anticuerpos son capaces de inhibir la actividad inmunosupresora de Treg humano en un modelo de ratón xenogénico con enfermedad de injerto contra huésped. Este trabajo sirve para validar el complejo GARP-TGF-p como una diana terapéutica de interés para los propósitos de modular la función de Treg y consecuentemente tratar enfermedades tales como el cáncer y las enfermedades autoinmunitarias donde el nivel de actividad de Treg juega un papel importante. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de anticuerpos contra GARP-TGF-p mejorados capaces de inhibir la liberación de TGF-p y, por lo tanto, modificar la actividad de Treg. La presente invención aborda este problema como se describe en la presente descripción.

Resumen de la invención

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención mejora el estado de la técnica al proporcionar nuevos anticuerpos que se unen al complejo GARP-TGF-p1 humano. Los anticuerpos de la presente invención se derivan del anticuerpo contra GARP-TGF-p1 "LHG-10", descrito en las solicitudes de patentes internacionales núms. WO2015/015003 y WO2016/125017. Las secuencias de dominio variable de la cadena pesada y la cadena ligera de LHG-10 se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, y el dominio variable de la cadena ligera de una variante de cadenas mezcladas, LHG-10.6 (también descrito en los documentos núms. WO2015/015003 y WO2016/125017), se muestra en la SEQ ID NO: 3. Los anticuerpos de la presente invención difieren particularmente con respecto a determinadas secuencias de CDR en comparación con l HG-10 y LHG-10.6, específicamente con respecto a las secuencias de CDR2 y CDR3 del dominio variable de la cadena pesada. Los anticuerpos contra GARP-TGF-p LHG-10 y LHG-10.6 poseen la secuencia de CDR2 de la cadena pesada: RIDPEDGGTKYAQKFQG (SeQ ID NO: 5); y la secuencia de CDR3 de la cadena pesada: NEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 6), mientras que los anticuerpos de la presente invención comprenden la secuencia de CDR2 de la cadena pesada: RIDPEDAGTKYAQKFQG (SEQ ID ⁿO: 12); y la secuencia de CDR3 de la cadena pesada: YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13).

Las diferencias en las secuencias de CDR2 y CDR3 de la cadena pesada descritas en la presente descripción dan como resultado anticuerpos mejorados en comparación con los anticuerpos de la técnica anterior en virtud de su estabilidad mejorada. Más específicamente, los anticuerpos de la presente invención son relativamente resistentes a la desamidación, la isomerización y la oxidación, de modo que muestran una estabilidad mejorada. Sorprendentemente, estas sustituciones específicas en las regiones CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que conducen a una estabilidad mejorada no disminuyen significativamente la afinidad de unión de los anticuerpos por el complejo GARP-TGF-p1. La estabilidad mejorada combinada con la unión a la diana con alta afinidad hace que los anticuerpos de la presente invención sean particularmente adecuados para el desarrollo clínico como agentes terapéuticos, por ejemplo, como agentes terapéuticos contra el cáncer.

La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a un complejo de GARP y TGF-p1 humano, en donde el anticuerpo comprende

un dominio variable de la cadena pesada (VH), en donde:

la CDR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13), la CDR2 de VH comprende la secuencia de aminoácidos RIDPEDAGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 12), y

la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4); y

un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde:

la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos QQYASVPVT (SEQ ID NO: 11),

la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos GASRLKT (SEQ ID NO: 10), y

la CDR1 de VL comprende la secuencia de aminoácidos QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 9).

En determinadas modalidades, el anticuerpo comprende

un dominio variable de la cadena pesada (VH), en donde:

la CDR3 de VH consiste en la secuencia de aminoácidos YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13), la CDR2 de VH consiste en la secuencia de aminoácidos RIDPEDAGTKYAQKFQG (SeQ ID NO: 12), y

la CDR1 de VH consiste en la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4); y

un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde:

la CDR3 de VL consiste en la secuencia de aminoácidos QQYASVPVT (SEQ ID NO: 11),

la CDR2 de VL consiste en la secuencia de aminoácidos GASRLKT (SEQ ID NO: 10), y

la CDR1 de VL consiste en la secuencia de aminoácidos QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 9).

Los anticuerpos pueden incluir al menos un dominio variable de la cadena pesada (VH) y/o al menos un dominio variable de la cadena ligera (VL) que es una variante humanizada, de línea germinal o de afinidad de un dominio VH o VL derivado de camélido.

En la presente descripción se describen anticuerpos que se unen al complejo de GARP humano y TGF-p1 humano, en donde los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada que se selecciona de los siguientes:

(i) una VH que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; o

(ii) una VH que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 14.

Alternativamente o además, los anticuerpos pueden comprender un dominio variable de la cadena ligera (VL) que se selecciona de los siguientes:

(i) una VL que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; o

(ii) una VL que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 15.

Cuando los dominios de los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno se definen por un porcentaje particular de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, los dominios VH y/o VL conservan secuencias de CDR idénticas a las presentes en la secuencia de referencia, de modo que la variación está presente solo dentro de las regiones marco.

En una modalidad particular, en la presente descripción se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, en donde el dominio variable de la cadena pesada (VH) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y el dominio variable de la cadena ligera (VL) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

En determinadas modalidades, los anticuerpos de la invención incluyen el dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 de un anticuerpo humano, en particular IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En determinadas modalidades, el anticuerpo incluye la región CH3 de una IgG4 humana e incluye la sustitución S228P en el dominio CH3.

Los anticuerpos que se unen al complejo GARP-TGF-p1 pueden comprender al menos una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa y/o al menos una cadena ligera lambda o kappa de longitud completa. En determinadas modalidades, los anticuerpos comprenden una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En la presente descripción se describen anticuerpos monoclonales que comprenden una cadena pesada con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 16. En la presente descripción se describen anticuerpos monoclonales que comprenden una cadena ligera con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 17. En la presente descripción se describen anticuerpos monoclonales que comprenden una cadena pesada con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 16, y una cadena ligera con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 17.

Para las modalidades en donde las cadenas pesadas y/o ligeras de los anticuerpos están definidas por un porcentaje particular de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, la cadena pesada y/o la cadena ligera conservan secuencias de CDR idénticas a las presentes en la secuencia de referencia de modo que la variación está presente sólo fuera de las regiones CDR.

A menos que se indique de cualquier otra manera en la presente solicitud, el % de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse al comparar estas dos secuencias alineadas de manera óptima y en la que la secuencia de aminoácidos a comparar puede comprender adiciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia para un alineamiento óptimo entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula al determinar el número de posiciones idénticas para las que el residuo de aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, al dividir este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y al multiplicar el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias. Por ejemplo, es posible usar el programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova y otros, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbio! Lett. 174:247-250), siendo los parámetros usados los dados por defecto (en particular para los parámetros "penalización de espacio abierto": 5, y "penalización de espacio de extensión": 2; siendo la matriz elegida, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar se calcula directamente por el programa.

Cada uno de los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 proporcionados en la presente descripción puede exhibir una o más de las siguientes propiedades/características:

- el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno puede reaccionar de forma cruzada con el complejo GARP-TGF-p de origen Cynomolgus;

- el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno puede unirse al GARP-TGF-p1 humano con alta afinidad; - el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno puede incluir un dominio VH y un dominio VL que, cuando se evalúan como un fragmento Fab, muestran una tasa de disociación (Koff) para el complejo de gAr P y TGF-p1 humano de menos de 5 x 10'4 s-1;

- el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno puede incluir un dominio VH y un dominio VL que, cuando se evalúan como un fragmento Fab, muestran una tasa de disociación (Koff) para el complejo de ^gA^rP y TGF-p1 humano en el intervalo de 1 x 10'6 s_1 a 5 x 10'4 s-1;

- el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno puede incluir un dominio VH y un dominio VL que, cuando se evalúan como un mAb, muestran una Kd de menos de 1,7 x 10'9 M;

- el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno pueden bloquear o inhibir la liberación de TGF-p1 activo a partir de linfocitos T reguladores.

En otros aspectos, la invención también proporciona uno o más polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos enumerados anteriormente, además de los vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos, las células huésped que contienen los vectores y los métodos de producción/expresión recombinante de los anticuerpos descritos en la presente descripción.

En la presente descripción se describe una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos descritos en la presente descripción, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

También en la presente descripción se describen los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 enumerados anteriormente o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, para su uso en métodos de tratamiento médico, particularmente en la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos relacionados con TGF-p. En la presente descripción se describen los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, para su uso en métodos de tratamiento, en donde la enfermedad o la afección a tratar se selecciona del grupo que consiste en enfermedades inflamatorias, infección crónica, cáncer, fibrosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad cerebrovascular y enfermedad neurodegenerativa. Los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden administrarse en combinación con otro tratamiento como parte de una terapia de combinación. Por ejemplo, los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden administrarse en combinación con un agente inmunoterapéutico, opcionalmente un anticuerpo inmunoestimulador o una vacuna tumoral.

Estas y otras modalidades de la invención se apreciarán y entenderán mejor cuando se consideren junto con la siguiente descripción y los dibujos adjuntos. Debe entenderse, sin embargo, que la siguiente descripción, aunque indica varias modalidades de la invención y numerosos detalles específicos de la misma, se proporciona a modo de ilustración y no de limitación.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema que muestra la unión de TGF-p latente a GARP en la superficie de los linfocitos T reguladores. El TGF-p se produce como un precursor, "pro-TGF-p" y se escinde para producir "TGF-p latente", una forma en la que el dímero de TGF-p maduro permanece asociado de forma no covalente con la región del péptido asociado a latencia (LAP) de cada polipéptido. Es esta forma latente la que se une a GARP en la superficie de los linfocitos Treg. Se cree que las integrinas avp6 y avp8 son responsables de mediar en la liberación de "TGF-p activo" o maduro de la superficie celular. Esta forma activa puede actuar de forma paracrina para producir efectos en una variedad de células diana, o puede actuar como un mediador autocrino al unirse al receptor de TGF-p en los linfocitos Treg.

La Figura 2 muestra la actividad de unión a la diana medida por Biacore™ o resonancia de plasmón superficial (SPR) de los anticuerpos 39B6 IgG1N297Q y 39B6 IgG4S228P durante un período de 56 días de las muestras almacenadas a -20 °C, 5 °C y 37 °C en PBS o PBS-Tween (PBSTw). La muestra de referencia (-20 °C) se estableció como una actividad de unión del 100 % en cada punto de tiempo.

La Figura 3 muestra los resultados de la prueba de las variantes del anticuerpo 39B6-A en un ensayo diseñado para controlar la fosforilación de SMAD2 posterior de la activación del receptor de TGF-p. La fosforilación de SMAD2 sirve como un marcador de activación de la vía de señalización de TGF-p, luego de la unión de TGF-p a su receptor. Si se reduce la fosforilación de SMAD2, se inhibe la actividad de TGF-p.

Figura 3A: Inmunoelectrotransferencias que muestran disminuciones en la fosforilación de SMAD2 en presencia de diferentes concentraciones de los anticuerpos contra GARP-TGF-p 39B6-A, 39B6-AVE, 39B6-AEE, 39B6-AYE, 39B6-ANR y 39B6-ANK. Figura 3B: Representación gráfica de los datos en (A) que muestra el porcentaje de inhibición de la fosforilación de SMAD2 a diferentes concentraciones de anticuerpo.

La Figura 4 muestra los resultados de probar las variantes del anticuerpo 39B6-A en un ensayo diseñado para medir la actividad de TGF-p a través de un gen informador de luciferasa conjugado con un promotor SMAD. Los gráficos muestran el porcentaje de inhibición de la señal de luminiscencia en presencia de diferentes concentraciones de los anticuerpos contra GARP-TGF-p LHG-10, 39B6-A, 39B6-AVE, 39B6-AEE, 39B6-AYE, 39B6-ANR y 39B6-ANK.

La Figura 5 muestra el porcentaje de formación de agregados durante un período de 56 días con los anticuerpos 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-a Nk y 39B6-ANR almacenados a 5 °C y 37 °C. La formación de agregados se controló mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC).

La Figura 6 muestra el porcentaje de formación de fragmentos durante un período de 56 días con los anticuerpos 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR almacenados a 37 °C. La formación de fragmentos se controló mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC).

La Figura 7 muestra el porcentaje de área de monómero durante un período de 56 días con los anticuerpos 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR almacenados a 5 °C y 37 °C. El área de monómero se controló mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC).

La Figura 8 muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de las muestras de anticuerpos almacenadas durante 56 días a una temperatura de referencia (-20 °C), a 5 °C y a 37 °C. Figura 8A: 39B6-^aV^e. Figura 8B: 39B6-AYE. Figura 8C: 39B6-ANK. Figura 8D: 39B6-ANR. Los marcadores aparecen en el centro de cada gel.

A la izquierda de los marcadores, las 3 muestras son (i) Ref; (ii) 5 °C; y (iii) muestras a 37°C evaluadas en condiciones no reductoras y a la derecha de los marcadores, las 3 muestras son (i) Ref; (ii) 5 °C; y (iii) muestras a 37 °C evaluadas en condiciones reductoras.

La Figura 9 muestra la actividad de unión a la diana medida por Biacore™ o SPR de los anticuerpos 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR durante un período de 56 días de las muestras almacenadas a -20 °C, 5 °C y 37 °C. La muestra de referencia (-20 °C) se estableció como una actividad de unión del 100 % en cada punto de tiempo.

La Figura 10 muestra la concentración de proteínas (mg/ml) de las muestras de anticuerpos 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR durante un período de 56 días de las muestras almacenadas a -20 °C (ref), 5 ° C y 37 °C.

La Figura 11 muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de muestras de anticuerpos después de 10 ciclos de congelación y descongelación. Los marcadores aparecen en el centro del gel. A la izquierda de los marcadores, las 4 muestras son las muestras analizadas en condiciones no reductoras: (i) Ref para 39B6-AVE; (ii) Muestra congelada y descongelada para 39B6-AVE; (iii) Ref para 39B6-AYE; y (iv) Muestra congelada y descongelada para 39B6-AYE. A la derecha de los marcadores, las 4 muestras son las muestras analizadas en condiciones reductoras: (i) Ref para 39B6-AVE; (ii) Muestra congelada y descongelada para 39B6-AVE; (iii) Ref para 39B6-AYE; y (iv) Muestra congelada y descongelada para 39B6-AYE.

La Figura 12 muestra la actividad de unión a la diana medida por Biacore™ o SPR después de 10 ciclos de congelación y descongelación de los anticuerpos 39B6-AVE y 39B6-AYE. La muestra de referencia (-20 °C) se estableció como una actividad de unión del 100 % en cada punto de tiempo.

La Figura 13 muestra la concentración de proteínas (mg/ml) de las muestras de anticuerpos 39B6-AVE y 39B6-AYE después de 10 ciclos de congelación y descongelación.

La Figura 14 muestra la actividad de unión a la diana medida por Biacore™ o SPR después de la prueba de estabilidad térmica a temperaturas que varían de 54,6 °C a 71,4 °C de los anticuerpos 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR. La muestra de referencia se fijó como una actividad de unión del 100 %.

La Figura 15 muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de muestras de anticuerpos después de 96 horas de rotación. Los marcadores aparecen en el centro del gel. A la izquierda de los marcadores, las 4 muestras son las muestras analizadas en condiciones no reductoras: (i) Ref para 39B6-AVE; (ii) Muestra rotada para 39B6-AVE; (iii) Ref para 39B6-AYE; y (iv) Muestra rotada para 39B6-AYE. A la derecha de los marcadores, las 4 muestras son las muestras analizadas en condiciones reductoras: (i) Ref para 39B6-AVE; (ii) Muestra rotada para 39B6-AVE; (iii) Ref para 39B6-AYE; y (iv) Muestra rotada para 39B6-AYE.

La Figura 16 muestra la actividad de unión a la diana medida por Biacore™ o SPR después de la prueba de estabilidad rotacional de mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE. La muestra de referencia se fijó como una actividad de unión del 100 %.

La Figura 17 muestra la concentración de proteínas (mg/ml) de las muestras de mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE después de la prueba de estabilidad rotacional.

La Figura 18 muestra la cantidad relativa de desamidación e isomerización de la posición N95 en los anticuerpos 39B6-ANE, 39B6-ANR y 39B6-ANK durante un período de 56 días. Los anticuerpos 39B6-AVE y 39B6-AYE no están incluidos porque a estos anticuerpos se les ha eliminado el residuo "N95" de CDR3. También se muestra la actividad de unión relativa de los mAb 39B6-ANE, 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR durante el transcurso de 56 días, de las muestras almacenadas a 37 °C.

La Figura 19 muestra el requisito de TGF-p maduro en la unión de 39B6-AYE (ARGX-115) al complejo GARP-TGF-p. Las placas ELISA se recubrieron con GARP o anti-GARP Ab ARGX-115. Para las placas ELISA recubiertas con GARP, se permitió que se formara un complejo con TGF-p latente de longitud completa (que incluyen las regiones LAP y TGF-p maduro) o un complejo con LAP recombinante mediante la adición de la proteína recombinante relevante. Para las placas ELISA recubiertas con ARGX-115, se añadió GARP y luego se añadió TGF-p latente de longitud completa o LAP. ARGX-115 solo pudo unirse a GARP en presencia de TGF-p de longitud completa. No se produjo la unión de ARGX-115 al complejo GARP-LAP. Por el contrario, un anticuerpo anti-LAP pudo unirse al complejo GARP-LAP. Esto demuestra el requisito de TGF-p maduro para la unión de ARGX-115 al complejo GARP-TGF-p.

La Figura 20 muestra la capacidad de los anticuerpos para neutralizar la activación de TGF-p por el complejo GARP-TGF-p con varias formas mutantes de TGF-p. La actividad neutralizante de ARGX-115 se anuló por mutación de R58 en LAP y K338 en TGF-p maduro.

Descripción detallada

A. Definiciones

"GARP" - GARP (glicoproteína A predominante en repeticiones) es un miembro de la familia de proteínas con repeticiones ricas en leucina. También se denomina repetición rica en leucina que contiene 32 (LRRC32). GARP es una proteína transmembrana de 80 kDa con una región extracelular compuesta principalmente por 20 repeticiones ricas en leucina. La secuencia completa de aminoácidos de la variante 2 del transcrito de la proteína GARP humana (núm. de acceso de GenBank NP_001122394.1) es:

MRPQILLLLALLTLGLAAQHQDKVPCKMVDKKVSCQVLGLLQVPSVLPPDTETLDLSGNQLRSIL

ASPLGFYTALRHLDLSTNEISFLQPGAFQALTHLEHLSLAHNRLAMATALSAGGLGPLPRVTSLD

LSGNSLYSGLLERLLGEAPSLHTLSLAENSLTRLTRHTFRDMPALEQLDLHSNVLMDIEDGAFE

GLPRLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLRVLDLSCNSIEAFQTASQPQAEFQLTW LDLRENKLLHFP

DLAALPRLIYLNLSNNLIRLPTGPPQDSKGIHAPSEGW SALPLSAPSGNASGRPLSQLLNLDLSY

NEIELIPDSFLEHLTSLCFLNLSRNCLRTFEARRLGSLPCLMLLDLSHNALETLELGARALGSLRT

LLLQGNALRDLPPYTFANLASLQRLNLQGNRVSPCGGPDEPGPSGCVAFSGITSLRSLSLVDN

EIELLRAGAFLHTPLTELDLSSNPGLEVATGALGGLEASLEVLALQGNGLMVLQVDLPCFICLKR

LNLAENRLSHLPAW TQAVSLEVLDLRNNSFSLLPGSAMGGLETSLRRLYLQGNPLSCCGNGW

LAAQ LHQG RVDVDATQDLICRFSSQEEVSLSHVRPEDCEKGGLKNIN Ll IILTFILVSAILLTTLAA CCCVRRQKFNQQYKA (SEQ ID NO: 33).

"TGF-p" - TGF-p es una citocina que pertenece a una superfamilia de factores de crecimiento. Hay tres isoformas distintas de TGF-p (TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3) codificadas por tres genes distintos, pero las estructuras generales de las isoformas de TGF-p son muy similares, con homologías del orden de 70-80 %. El término TGF-p, como se usa en la presente descripción, se usa normalmente para abarcar las tres isoformas diferentes de la citocina TGF-p, a menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera.

Las tres isoformas de TGF-P se codifican como precursores de proteínas grandes; TGF-P1 (núm. de acceso de GenBank: NM_000660) contiene 390 aminoácidos, y TGF-P2 (núms. de acceso de GenBank: NM_001135599 y NM_003238) y TGF-P3 (núm. de acceso de GenBank: XM_005268028) contienen 412 aminoácidos cada uno. Cada uno tiene un péptido señal en el extremo N de 20-30 aminoácidos que se requiere para la secreción de una célula, una pro-región (llamada péptido asociado a latencia o LAP) y una región en el extremo C de 112-114 aminoácidos que se convierte en la molécula de TGF-P maduro después de su liberación de la pro-región por escisión proteolítica. Después de la escisión proteolítica, LAP y el TGF-P maduro permanecen asociados de forma no covalente y forman la molécula de "TGF-P latente". En esta forma latente, LAP impide que el TGF-P maduro se una al receptor de TGF-p. Para ejercer una señal, el LAP debe liberar TGF-P maduro. El TGF-P maduro que no está asociado a LAP se denomina T^gF-P activo, ya que puede unirse al receptor de TGF-P y transducir una señal.

El TGF-P1 de longitud completa tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

M PPSGLRLLPLLLPLLW LLVLTPGRPAAGLSTCKTIDM ELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQG

EVPPG PLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLM VETHNEIYDKFKQSTH

SIYM FFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSW RYLSNRLLAPSDSP

EW LSFDVTG W RQ W LSRG G EIEG FRLSAHCSCDSRDNTLQ VDING FTTG RRG DLATIHG M NR

PFLLLM ATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGW KW IHEPKGYH

ANFCLGPCPYIW SLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSN M IVRSCKCS (SEQ ID NO: 34).

El LAP tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAE PEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLR LKLKVEQHVELYQKYSNNSW RYLSNRLLAPSDSPEW LSFDVTGVVRQW LSRGGEIEGFRLSA HCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRR (SEQ ID NO: 35).

El TGF-P1 maduro tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGW KW IHEPKGYHANFCLGPCPYIW SLDTQYSKVLA

LYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (SEQ ID NO: 36).

"Complejo GARP-TGF-P" - Como se usa en la presente descripción, el complejo GARP-TGF-P significa el complejo nativo que se forma cuando el TGF-P latente se une a GARP, particularmente Ga RP ubicado en la superficie de los linfocitos Treg. Aunque no se especifica en todo el documento, el "complejo GARP-TGF-P", o simplemente "GARP-TGF-P", como se usa en la presente descripción, pretende significar el complejo entre gAr P y el TGF-P latente. La unión de GARP a TGF-P, más específicamente TGF-P latente, se ha caracterizado a nivel molecular, por ejemplo, como se informa en Wang y otros, Mol Biol Cell. Marzo 2012; 23(6):1129-39. GARP forma un enlace disulfuro con la Cys4 del TGF-P latente y también se asocia con el TGF-P latente a través de interacciones no covalentes. Hay 15 residuos de Cys en el dominio extracelular de GARP, y gAr P usa Cys-192 y Cys-331 para formar enlaces disulfuro con los dos residuos de Cys4 del TGF-P latente. De ello se deduce que una proteína gAr P se asocia con un dímero de TGF-P latente.

"Anticuerpo" o "Inmunoglobulina" - Como se usa en la presente descripción, el término "inmunoglobulina" incluye un polipéptido que tiene una combinación de dos cadenas pesadas y dos ligeras, posea o no alguna inmunorreactividad específica relevante. "Anticuerpos" se refiere a tales ensamblajes que tienen una actividad inmunorreactiva específica significativa conocida para un antígeno de interés (por ejemplo, el complejo de GARP y TGF-P). El término "anticuerpos contra GARP-TGF-P" se usa en la presente descripción para referirse a anticuerpos que exhiben especificidad inmunológica por el complejo de GARP y TGF-P1, particularmente el complejo GARP-TGF-P1 humano y en algunos casos especies homólogas del mismo. Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden las cadenas ligeras y pesadas, con o sin un enlace covalente intercatenario entre ellas. Las estructuras básicas de las inmunoglobulinas en los sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien.

El término genérico "inmunoglobulina" comprende cinco clases distintas de anticuerpos (IgG, IgM, IgA, IgD o IgE) que pueden distinguirse bioquímicamente. Las cinco clases de anticuerpos están dentro del alcance de la presente invención. La siguiente discusión generalmente se dirigirá a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a la IgG, las inmunoglobulinas normalmente comprenden dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de un peso molecular de aproximadamente 23 000 Dalton y dos cadenas pesadas idénticas de un peso molecular de 53 000-70 000. Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración en "Y" en donde las cadenas ligeras entrecruzan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras de un anticuerpo se clasifican como kappa (k) o lambda (A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida a una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada están unidas entre sí de forma covalente, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan por hibridomas, linfocitos B o células huésped modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo N en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el extremo C en la parte inferior de cada cadena. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (Y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1-Y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la técnica en vista de la presente descripción y, en consecuencia, están dentro del alcance de la presente invención.

Como se indicó anteriormente, la región variable de un anticuerpo permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a los epítopos de los antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión al antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternaria forma el sitio de unión al antígeno presente al final de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión al antígeno está definido por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en cada una de las cadenas VH y VL.

"Sitio de unión" - Como se usa en la presente descripción, el término "sitio de unión" comprende una región de un polipéptido que es responsable de la unión selectiva a un antígeno diana de interés. Los dominios de unión comprenden al menos un sitio de unión. Los dominios de unión ilustrativos incluyen un dominio variable de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo pueden comprender un solo sitio de unión o múltiples (por ejemplo, dos, tres o cuatro) sitios de unión.

"Región variable" o "dominio variable" - Los términos "región variable" y "dominio variable" se usan en la presente descripción de manera intercambiable y se pretende que tengan un significado equivalente. El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables VH y VL difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno diana. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados "bucles hipervariables" en cada uno de los dominios VL y VH que forman parte del sitio de unión al antígeno. El primer, segundo y tercer bucles hipervariables del dominio de la cadena ligera VLambda se denominan en la presente descripción L1(A), L2(A) y L3(A) y pueden definirse como que comprenden los residuos 24-33 (L1(A), que consisten en 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos), 49-53 (L2(A), que consiste en 3 residuos) y 90-96 (L3(A), que consiste en 5 residuos) en el dominio VL (Morea y otros, Methods 20:267-279 (2000)). El primer, segundo y tercer bucles hipervariables del dominio de la cadena ligera VKappa se denominan en la presente descripción L1(^k), L2(^k) y L3(^k) y pueden definirse como que comprenden los residuos 25 33 (L1(k), que consisten en 6, 7, 8, 11, 12 o 13 residuos), 49-53 (L2(k), que consiste en 3 residuos) y 90-97 (L3(k), que consiste en 6 residuos) en el dominio VL (Morea y otros, Methods 20:267-279 (2000)). El primer, segundo y tercer bucles hipervariables del dominio VH se denominan en la presente descripción H1, H2 y H3 y pueden definirse como que comprenden los residuos 25-33 (H1, que consiste en 7, 8 o 9 residuos), 52-56 (H2, que consiste en 3 o 4 residuos) y 91-105 (H3, de longitud altamente variable) en el dominio VH (Morea y otros, Methods 20:267-279 (2000)).

A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos L1, L2 y L3 se refieren respectivamente al primer, segundo y tercer bucles hipervariables de un dominio VL y abarcan bucles hipervariables obtenidos de los isotipos Vkappa y Vlambda. Los términos H1, H2 y H3 se refieren respectivamente al primer, segundo y tercer bucles hipervariables del dominio VH y abarcan bucles hipervariables obtenidos de cualquiera de los isotipos de la cadena pesada conocidos, que incluyen y, £, 8, a o m.

Cada uno de los bucles hipervariables L1, L2, L3, H1, H2 y H3 puede comprender parte de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR", como se define más abajo. Los términos "bucle hipervariable" y "región determinante de la complementariedad" no son estrictamente sinónimos, ya que los bucles hipervariables (HV) se definen en función de la estructura, mientras que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se definen en función de la variabilidad de la secuencia (Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983) y los límites de los HV y las CDR pueden ser diferentes en algunos dominios VH y VL.

Las CDR de los dominios VL y VH normalmente pueden definirse como que comprenden los siguientes aminoácidos: residuos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3) en el dominio variable de la cadena ligera, y residuos 31-35 o 31-35b (^hC^dR1), 50-65 (^hC^dR2) y 95-102 (H^cDR3) en el dominio variable de la cadena pesada; (Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, M^d. (1991)). Por lo tanto, los HV pueden estar comprendidos dentro de las CDR correspondientes y las referencias en la presente descripción a los "bucles hipervariables" de los dominios VH y VL deben interpretarse como que también abarcan las CDR correspondientes y viceversa, a menos que se indique de cualquier otra manera.

Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan región marco (FR), como se define más abajo. Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), que adoptan en gran medida una configuración de hoja p, conectadas por los tres bucles hipervariables. Los bucles hipervariables en cada cadena se mantienen juntos en estrecha proximidad por las FR y, con los bucles hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos. El análisis estructural de los anticuerpos reveló la relación entre la secuencia y la forma del sitio de unión formado por las regiones determinantes de la complementariedad (Chothia y otros, J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992)); Tramontano y otros, J. Mol. Biol, 215:175-182 (1990)). A pesar de su alta variabilidad de secuencia, cinco de los seis bucles adoptan solo un pequeño repertorio de conformaciones de la cadena principal, llamadas "estructuras canónicas". Estas conformaciones están determinadas, en primer lugar, por la longitud de los bucles y, en segundo lugar, por la presencia de residuos clave en determinadas posiciones en los bucles y en las regiones estructurales que determinan la conformación a través de su empaquetamiento, enlaces de hidrógeno o la capacidad de asumir conformaciones de la cadena principal inusual.

"CDR" - Como se usa en la presente descripción, el término "CDR" o "región determinante de la complementariedad" significa los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de la cadena pesada y ligera. Estas regiones particulares se han descrito por Kabat y otros, J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) y Kabat y otros, Sequences of protein of immunological interest. (1991), y por Chothia y otros, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y por MacCallum y otros, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) donde las definiciones incluyen superposición o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Los residuos de aminoácidos que abarcan las CDR definidas por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen para comparación. Preferentemente, el término "CDR" es una CDR como la define Kabat en función de comparaciones de secuencias.

Tabla 1 Definiciones de CDR

"Región marco" - El término "región marco" o "región FR" como se usa en la presente descripción, incluye los residuos de aminoácidos que son parte de la región variable, pero no son parte de las CDR (por ejemplo, mediante el uso de la definición de Kabat de las CDR). Por lo tanto, una región marco variable tiene entre aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud, pero incluye solo aquellos aminoácidos fuera de las CDR. Para el ejemplo específico de un dominio variable de la cadena pesada y para las CDR definidas por Kabat y otros, la región marco 1 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; la región marco 2 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 36-49; la región marco 3 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94, y la región marco 4 corresponde al dominio de la región variable desde los aminoácidos 103 hasta el final de la región variable. Las regiones marco para la cadena ligera están separadas de manera similar por cada una de las CDR de la región variable de la cadena ligera. De manera similar, mediante el uso de la definición de CDR de Chothia y otros o McCallum y otros, los límites de la región marco están separados por los respectivos términos de CDR como se describe anteriormente. Preferentemente, las CDR son las definidas por Kabat.

En los anticuerpos naturales, las seis CDR presentes en cada anticuerpo monomérico son secuencias cortas no contiguas de aminoácidos que se posicionan específicamente para formar el sitio de unión al antígeno cuando el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los dominios variables pesados y ligeros muestran menos variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se denominan regiones marco. Las regiones estructurales adoptan en gran medida una conformación de hoja p y las CDR forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja p. Por lo tanto, estas regiones marco actúan para formar un andamio que proporciona la posición de las seis CDR en la orientación correcta mediante interacciones no covalentes entre cadenas. El sitio de unión al antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo al epítopo del antígeno inmunorreactivo. La posición de las ^cD^rpuede identificarse fácilmente por un experto en la técnica.

"Región constante" - Como se usa en la presente descripción, el término "región constante" se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo fuera de los dominios variables o regiones variables. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina tienen una "región constante" de un solo dominio, normalmente denominada "dominio CL o CL1". Este dominio se encuentra en el extremo C del dominio VL. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina difieren en su región constante según la clase de inmunoglobulina (y, m, a, 8, £). Las cadenas pesadas y, a y 8 tienen una región constante que consiste en tres dominios de inmunoglobulina (denominados CH1, CH2 y CH3) con una región bisagra flexible que separa los dominios CH1 y CH2. Las cadenas pesadas ^my £ tienen una región constante que consiste en cuatro dominios (CH1-CH4). Los dominios constantes de la cadena pesada se ubican en el extremo C del dominio VH.

La numeración de los aminoácidos en las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera va desde el extremo N en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el extremo C en la parte inferior de cada cadena. Se usan diferentes esquemas de numeración para definir los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina. De acuerdo con el esquema de numeración de EU, los dominios constantes de la cadena pesada de una molécula de IgG se identifican como sigue: CH1 - residuos de aminoácidos 118-215; CH2 - residuos de aminoácidos 231-340; CH3 - residuos de aminoácidos 341-446. De acuerdo con el esquema de numeración de Kabat, los dominios constantes de la cadena pesada de una molécula de IgG se identifican como sigue: CH1 - residuos de aminoácidos 114-223; CH2 - residuos de aminoácidos 244-360; CH3 - residuos de aminoácidos 361-477. La "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, lo que permite que las dos regiones de unión al antígeno en el extremo N se muevan de forma independiente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, central e inferior (Roux K.H. y otros, J. Immunol. 161:4083-90 1998). Los anticuerpos de la invención que comprenden una región bisagra "totalmente humana" pueden contener una de las secuencias de la región bisagra que se muestran en la Tabla 2 más abajo.

Tabla 2 Secuencias de bisagra humana

"Fragmento" - El término "fragmento", como se usa en la presente descripción, se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo intacto o completo o cadena de anticuerpo. El término "fragmento de unión al antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que se derivaron) por la unión al antígeno (es decir, la unión específica al complejo GARP-TGF-p). Como se usa en la presente descripción, el término "fragmento" de una molécula de anticuerpo incluye fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos, por ejemplo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo, un dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo, un anticuerpo de cadena única (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un anticuerpo de un solo brazo (monovalente), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos o cualquier molécula de unión al antígeno formada por combinación, ensamblaje o conjugación de tales fragmentos de unión al antígeno. El término "fragmento de unión al antígeno", como se usa en la presente descripción, pretende además abarcar fragmentos de anticuerpos que se seleccionan del grupo que consiste en monocuerpos, dominios de anticuerpos y nanocuerpos. Los fragmentos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo intacto o completo o cadena de anticuerpo o por medios recombinantes.

"Sustitución de aminoácidos conservativa" - Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales de ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial en un polipéptido de inmunoglobulina puede reemplazarse con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Una cadena de aminoácidos puede reemplazarse con una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o la composición de los miembros de la familia de cadenas laterales.

"Quimérica" - Una proteína "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos unida a una segunda secuencia de aminoácidos con la que no está unida de forma natural en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se juntan en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero se colocan en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Puede generarse una proteína quimérica, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la generación y la traducción de un polinucleótido en el que las regiones peptídicas se codifican en la relación deseada. Los anticuerpos quiméricos ilustrativos incluyen proteínas de fusión que comprenden dominios VH y VL derivados de camélidos, o variantes humanizadas de los mismos, fusionados con los dominios constantes de un anticuerpo humano, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana.

"Valencia" - Como se usa en la presente descripción, el término "valencia" se refiere al número de sitios potenciales de unión a la diana en un polipéptido. Cada sitio de unión a la diana se une específicamente a una molécula diana o sitio específico en una molécula diana. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio de unión a la diana, cada sitio de unión a la diana puede unirse específicamente a la misma o a diferentes moléculas (por ejemplo, puede unirse a diferentes ligandos o diferentes antígenos, o diferentes epítopos en el mismo antígeno).

"Especificidad" - El término "especificidad" se refiere a la capacidad de unirse (por ejemplo, inmunorreaccionar con) una diana dada, por ejemplo, un complejo de GARP-TGF-p1. Un polipéptido puede ser monoespecífico y contener uno o más sitios de unión que se unen específicamente a una diana o un polipéptido puede ser multiespecífico y contener dos o más sitios de unión que se unen específicamente a la misma o diferentes dianas.

"Sintético" - Como se usa en la presente descripción, el término "sintético" con respecto a los polipéptidos incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que no es natural. Por ejemplo, polipéptidos no naturales que son formas modificadas de polipéptidos naturales (por ejemplo, que comprenden una mutación tales como una adición, sustitución o eliminación) o que comprenden una primera secuencia de aminoácidos (que puede o no ser natural) que está unida en una secuencia lineal de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos (que puede o no ser natural) a la que no está unida de forma natural en la naturaleza.

"Modificado genéticamente" - Como se usa en la presente descripción, el término "modificado genéticamente" incluye la manipulación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios sintéticos (por ejemplo, mediante técnicas recombinantes, síntesis de péptidos in vitro, mediante acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas). Preferentemente, los anticuerpos de la invención están modificados genéticamente, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanizados y/o quiméricos, y anticuerpos que se han modificado genéticamente para mejorar una o más propiedades, tales como la unión al antígeno, la estabilidad/vida media o la función efectora.

"Sustituciones de humanización" - Como se usa en la presente descripción, el término "sustituciones de humanización" se refiere a sustituciones de aminoácidos en las que el residuo de aminoácido presente en una posición particular en el dominio VH o VL de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo contra GARP-TGF-p1 derivado de camélido) se reemplaza con un residuo de aminoácido que se encuentra en una posición equivalente en un dominio VH o VL humano de referencia. El dominio VH o VL humano de referencia puede ser un dominio VH o VL codificado por la línea germinal humana. Pueden realizarse sustituciones de humanización en las regiones marco y/o las CDR de los anticuerpos, definidos en la presente descripción.

"Variantes humanizadas" - Como se usa en la presente descripción, el término "variante humanizada" se refiere a una variante de anticuerpo que contiene una o más "sustituciones de humanización" en comparación con un anticuerpo de referencia, en donde una parte del anticuerpo de referencia (por ejemplo, el dominio Vh y/o el dominio VL o partes de los mismos que contienen al menos una CDR) tiene un aminoácido derivado de una especie no humana, y las "sustituciones de humanización" ocurren dentro de la secuencia de aminoácidos derivada de una especie no humana.

"Variantes de línea germinal" - El término "variante de línea germinal" se usa en la presente descripción para referirse específicamente a "variantes humanizadas" en las que las "sustituciones de humanización" dan como resultado el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos presentes en una posición particular en el VH o dominio VL de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo contra GARP-TGF-p1 derivado de camélido) con un residuo de aminoácido que se encuentra en una posición equivalente en un dominio VH o VL humano de referencia codificado por la línea germinal humana. Es típico que para cualquier "variante de línea germinal" dada, los residuos de aminoácidos de reemplazo sustituidos en la variante de línea germinal se tomen exclusivamente, o predominantemente, de un solo dominio VH o VL codificado en la línea germinal humana. Los términos "variante humanizada" y "variante de línea germinal" se usan a menudo de forma intercambiable en la presente descripción. La introducción de una o más "sustituciones de humanización" en un dominio VH o VL derivado de camélido (por ejemplo, derivado de llama) da como resultado la producción de una "variante humanizada" del dominio VH o VL derivado de camélido (llama). Si los residuos de aminoácidos sustituidos se derivan predominante o exclusivamente de una sola secuencia de dominio VH o VL codificada en línea germinal humana, entonces el resultado puede ser una "variante de línea germinal humana" del dominio VH o VL derivado de camélido (llama).

"Variantes de afinidad" - Como se usa en la presente descripción, el término "variante de afinidad" se refiere a una variante de anticuerpo que muestra uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en comparación con un anticuerpo de referencia, en donde la variante de afinidad muestra una afinidad alterada por el antígeno diana en comparación con el anticuerpo de referencia. Por ejemplo, las variantes de afinidad mostrarán una afinidad modificada por GARP-TGF-p, en comparación con el anticuerpo contra GARP-TGF-p de referencia. Preferentemente, la variante de afinidad exhibirá una afinidad mejorada por el antígeno diana, en comparación con el anticuerpo de referencia. Las variantes de afinidad muestran normalmente uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos en las CDR, en comparación con el anticuerpo de referencia. Tales sustituciones pueden dar como resultado el reemplazo del aminoácido original presente en una posición dada en las CDR con un residuo de aminoácido diferente, que puede ser un residuo de aminoácido natural o un residuo de aminoácido no natural. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas.

B. Anticuerpos contra GARP-TGF-p1

En la presente descripción se describen anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se unen específicamente al complejo de GARP y TGF-p1, particularmente al complejo de GARP humano y TGF-p1 humano. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden definirse con respecto a las características estructurales y funcionales como se describe en la presente descripción.

Es importante destacar que los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 de la invención son mejores en comparación con los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 descritos anteriormente, debido a que muestran una estabilidad mejorada. En particular, la estabilidad de los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 descritos en la presente descripción mejora en comparación con los anticuerpos que tienen las secuencias de CDR de la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 de referencia LHG-10 y LHG-10.6, descritos en los documentos núms. WO2015/015003 y WO2016/125017. Esta mejora en la estabilidad se logra sin una disminución significativa en la afinidad de unión de los anticuerpos por el complejo GARP-TGF-p1, en comparación con los anticuerpos de referencia LHG10 y LHG10.6.

Los anticuerpos de la presente invención difieren de los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 de referencia LHG-10 y LHG-10.6 descritos previamente, particularmente con respecto a las secuencias de ^cDR2 y CDR3 de la cadena pesada. Más específicamente, los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 LHG-10 y LHG-10.6 poseen la secuencia de CDR2 de la cadena pesada: RIDPEDGgTkYAQKFQG (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de CDR3 de la cadena pesada: NEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 6), mientras que los anticuerpos de la presente invención comprenden la secuencia de CDR2 de la cadena pesada: RIDPEDAGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 12) y la secuencia de CDR3 de la cadena pesada: YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13). Como se describe y ejemplifica en la presente descripción, se encontró que las sustituciones de aminoácidos G55A y N95Y en las secuencias de CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, respectivamente, mejoran la estabilidad del anticuerpo al reducir la desamidación, la isomerización y la oxidación, al tiempo que logran una afinidad de unión por el complejo GARP-TGF-p1 aproximadamente equivalente al de los anticuerpos de referencia.

En la presente descripción se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se unen a un complejo de GAR^py TGF-p1, y comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) en donde:

la CDR3 de VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13),

la CDR2 de VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos RIDPEDAGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 12), y

la CDR1 de VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4).

Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden comprender adicionalmente un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde:

la CDR3 de VL comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos QQYASVPVT (SEQ ID NO: 11), la CDR2 de VL comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GASRLKT (SEQ ID NO: 10), y la CDR1 de VL comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 9).

En la presente descripción se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1, en donde los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos comprenden al menos un dominio variable de la cadena pesada (VH) y al menos un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde:

la CDR2 de VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos RIDPEDAGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 12),

la CDR1 de VH comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4),

la CDR3 de VH consiste en la secuencia de aminoácidos YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13), la CDR2 de VH consiste en la secuencia de aminoácidos RIDPEDAGTKYAQKFQG (S^eQ ID NO: 12), la CDR1 de VH consiste en la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4),

Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden ser recombinantes. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden ser monoclonales.

El término "anticuerpo" en la presente descripción se usa en el sentido más amplio y abarca, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales (que incluyen los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), siempre que exhiban la especificidad inmunológica apropiada por el complejo GARP-TGF-p1. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente descripción se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que puede estar presente en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un solo sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) del antígeno, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante o epítopo del antígeno.

También se describen "fragmentos de unión al antígeno" de anticuerpos, y tales fragmentos se definen en otra parte en la presente descripción. Los fragmentos de anticuerpos normalmente comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el dominio de unión al antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fab' biespecíficos y fragmentos Fv, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena única, un fragmento variable de cadena única (scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos (consulte Holliger y Hudson, Nature Biotechnol.

23:1126-36 (2005)).

Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden exhibir una alta homología humana. El nivel de homología con la secuencia humana puede evaluarse a lo largo del dominio variable de la cadena pesada (VH) y/o a lo largo del dominio variable de la cadena ligera (VL). Puede considerarse que un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL) tiene una alta homología humana si los dominios VH y los dominios VL, tomados en conjunto, exhiben al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, o al menos un 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de VH y VL de línea germinal humana más parecidas. El dominio VH del anticuerpo con alta homología humana puede exhibir una identidad de secuencia de aminoácidos u homología de secuencia de al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 % o al menos un 96 % con uno o más dominios VH humanos a lo largo del regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4. El dominio VH del anticuerpo con alta homología humana puede contener uno o más (por ejemplo, de 1 a 10) desajustes de secuencias de aminoácidos en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, en comparación con la secuencia VH humana más parecida.

El dominio VL del anticuerpo con alta homología humana puede exhibir una identidad de secuencia u homología de secuencia de al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 % o al menos un 96 % con uno o más dominios VL humanos en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4. El dominio VL del anticuerpo con alta homología humana puede contener uno o más (por ejemplo, de 1 a 10) desajustes de secuencias de aminoácidos en las regiones marco FR1, FR2, FR3 y FR4, en comparación con la secuencia VL humana más parecida.

Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de la presente que tienen una alta homología humana pueden incluir anticuerpos que comprenden dominios VH y VL de anticuerpos no humanos nativos que exhiben un porcentaje suficientemente alto de identidad de secuencia con las secuencias de línea germinal humana. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden ser variantes humanizadas o de línea germinal de anticuerpos no humanos, por ejemplo, anticuerpos que comprenden dominios VH y VL de anticuerpos convencionales de camélidos modificados genéticamente para ser humanizados, o variantes de línea germinal de los anticuerpos originales.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden comprender un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y, opcionalmente, un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden comprender un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden comprender un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden comprender un dominio variable de la cadena pesada (VH) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden comprender un dominio variable de la cadena ligera (VL) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden comprender un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden comprender un dominio variable de la cadena pesada (VH) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

En la presente descripción se describen anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que comprenden un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera, el dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia V^hcon al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 14 y/o el dominio variable de la cadena ligera que comprende una VL con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 15.

Cuando los dominios de los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno se definen por un porcentaje particular de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, los dominios VH y/o VL pueden conservar secuencias de CDR idénticas a las presentes en la secuencia de referencia, de modo que la variación está presente solo dentro de las regiones marco. Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno que comprenden dominios variables de la cadena pesada y/o dominios variables de la cadena ligera definidos como que tienen un porcentaje de identidad particular con las SEQ ID NO: 14 y 15, respectivamente, tendrán las siguientes secuencias de CDR: una CDR3 de VH que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13),

una CDR2 de VH que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos RIDPEDAGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 12),

una CDR1 de VH que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4), una CDR3 de VL que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos QQYASVPVT (SEQ ID NO: 11), una CDR2 de VL que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GASRLKT (SEQ ID NO: 10), y una CDR1 de VL que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 9). Los anticuerpos pueden comprender dominios CH1 y/o dominios CL (de la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente), cuya secuencia de aminoácidos es total o sustancialmente humana. Cuando el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo destinado al uso terapéutico humano, es típico que toda la región constante del anticuerpo, o al menos una parte del mismo, tenga una secuencia de aminoácidos total o sustancialmente humana. Por lo tanto, una o más o cualquier combinación del dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 y el dominio CL (y el dominio CH4 si está presente) puede ser total o sustancialmente humana con respecto a su secuencia de aminoácidos.

Ventajosamente, el dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 y el dominio CL (y el dominio CH4, si está presente) pueden tener una secuencia de aminoácidos completa o sustancialmente humana. En el contexto de la región constante de un anticuerpo humanizado o quimérico, o un fragmento de anticuerpo, el término "sustancialmente humano" se refiere a una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos un 90 %, o al menos un 92 %, o al menos un 95 % o al menos un 97 %, o al menos un 99 % con una región constante humana. El término "secuencia de aminoácidos humana" en este contexto se refiere a una secuencia de aminoácidos que está codificada por un gen de inmunoglobulina humana, que incluye genes de línea germinal, reordenados y mutados somáticamente. También se describen polipéptidos que comprenden dominios constantes de secuencia "humana" que se han alterado por una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a la secuencia humana, excepto aquellas modalidades en las que la presencia de una región bisagra "completamente humana" es expresamente requerida.

La presencia de una región bisagra "totalmente humana" en los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 puede ser beneficiosa tanto para minimizar la inmunogenicidad como para optimizar la estabilidad del anticuerpo.

Como se analiza en otra parte en la presente descripción, se contempla que pueden realizarse una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos dentro de la región constante de la cadena pesada y/o ligera, particularmente dentro de la región Fc. Las sustituciones de aminoácidos pueden dar como resultado el reemplazo del aminoácido sustituido con un aminoácido natural diferente, o con un aminoácido no natural o modificado. También se permiten otras modificaciones estructurales, tales como por ejemplo cambios en el patrón de glucosilación (por ejemplo, mediante la adición o eliminación de sitios de glucosilación unidos por N o por O). Los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 pueden modificarse dentro de la región Fc para aumentar la afinidad de unión por el receptor neonatal FcRn. La afinidad de unión aumentada puede medirse a pH ácido (por ejemplo, de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,0). La afinidad de unión aumentada también puede medirse a pH neutro (por ejemplo, de aproximadamente pH 6,9 a aproximadamente pH 7,4). Por "afinidad de unión aumentada" se entiende una afinidad de unión aumentada a FcRn en relación con la región Fc no modificada. Normalmente, la región Fc no modificada poseerá la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En tales modalidades, la afinidad de unión a FcRn aumentada de la molécula de anticuerpo que tiene la región Fc modificada se medirá en relación con la afinidad de unión de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo salvaje por FcRn. Uno o más residuos de aminoácidos dentro de la región Fc pueden sustituirse con un aminoácido diferente para aumentar la unión a FcRn. Se han informado varias sustituciones de Fc que aumentan la unión de FcRn y, por lo tanto, mejoran la farmacocinética del anticuerpo. Tales sustituciones se informan, por ejemplo, en Zalevsky y otros (2010) Nat. Biotechnol. 28(2):157-9; Hinton y otros (2006) J Immunol. 176:346-356; Yeung y otros (2009) J Immunol.

182:7663-7671; Presta ^lG. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460-470; y Vaccaro y otros (2005) Nat. Biotechnol.

23(10):1283-88.

Los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 pueden comprender un dominio Fc de IgG humana modificada que comprende o consiste en las sustituciones de aminoácidos H433K y N434F, en donde la numeración del dominio Fc está de acuerdo con la numeración EU. Los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 descritos en la presente descripción pueden comprender un dominio Fc de IgG humana modificada que comprende o consiste en las sustituciones de aminoácidos M252Y, S254T, T256E, H433K y N434F, en donde la numeración del dominio Fc está de acuerdo con la numeración EU.

Los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 pueden comprender un dominio Fc de IgG humana modificada que consiste en hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, hasta 10, hasta 12, hasta 15, hasta 20 sustituciones con respecto a la correspondiente secuencia de IgG de tipo salvaje.

En dependencia del uso previsto del anticuerpo, puede ser conveniente modificar el anticuerpo con respecto a sus propiedades de unión a los receptores Fc, por ejemplo, para modular la función efectora. Por ejemplo, pueden introducirse residuo(s) de cisteína en la región Fc, lo que permite de este modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor destrucción celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Consulte Caron y otros, J. Exp. Med. 176:1191 -1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)). También se describen inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo como se describe en la presente descripción conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Las regiones Fc también pueden modificarse genéticamente para la extensión de la vida media, como se describe en Chan y Carter, Nature Reviews: Immunology, Vol. 10, páginas 301-316, 2010.

La región Fc puede modificarse para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor F^cymediante la modificación de uno o más aminoácidos.

La región Fc puede modificarse genéticamente de manera que no haya una función efectora. Un anticuerpo contra GARP-TGF-p1 que no tenga función efectora de Fc puede ser particularmente útil como agente bloqueante del receptor. Los anticuerpos pueden tener una región Fc derivada de isotipos de IgG naturales que tienen una función efectora reducida, por ejemplo, IgG4. Las regiones Fc derivadas de IgG4 pueden modificarse adicionalmente para aumentar la utilidad terapéutica, por ejemplo mediante la introducción de modificaciones que minimicen el intercambio de brazos entre moléculas de IgG4 in vivo. Las regiones Fc derivadas de IgG4 pueden modificarse para incluir la sustitución S228P.

La glucosilación de un anticuerpo puede modificarse. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno diana. Tales modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, mediante la orientación de uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden realizarse una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región marco variable para eliminar de ese modo la glucosilación en ese sitio. Tal no glucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

También se contemplan variantes de anticuerpos contra GARP-TGF-p1 que tienen un tipo alterado de glucosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo total o parcialmente desfucosilado (como se describe en Natsume y otros, Drug Design Development and Therapy, Vol. 3, páginas 7-16, 2009) o un anticuerpo que tiene estructuras GlcNac de bisección aumentadas. Se ha demostrado que tales patrones de glucosilación alterados aumentan la actividad de ADCC de los anticuerpos, lo que produce normalmente un aumento de 10 veces de ADCC en relación con un anticuerpo equivalente que comprende un dominio Fc humano "nativo". Tales modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, al expresar el anticuerpo en una célula huésped con una maquinaria enzimática de glucosilación alterada (como se describe en Yamane-Ohnuki y Satoh, mAbs 1:3, 230-236, 2009). Los ejemplos de anticuerpos no fucosilados con función ADCC mejorada son los producidos mediante el uso de la tecnología Potelligent® de BioWa Inc.

Los anticuerpos destinados al uso terapéutico en humanos serán normalmente del tipo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, a menudo del tipo IgG, en cuyo caso pueden pertenecer a cualquiera de las cuatro subclases IgG1, IgG2a y b, IgG3 o IgG4. Dentro de cada una de estas subclases, se permite realizar una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos dentro de la porción Fc, o realizar otras modificaciones estructurales, por ejemplo, para mejorar o reducir las funcionalidades dependientes de Fc.

En determinadas modalidades, los anticuerpos que se unen específicamente a GARP-TGF-p1 comprenden al menos una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa y/o al menos una cadena ligera lambda o kappa de longitud completa, en donde la cadena pesada comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y la cadena ligera comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En determinadas modalidades, los anticuerpos que se unen específicamente a GARP-TGF-p1 comprenden al menos una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa y/o al menos una cadena ligera lambda o kappa de longitud completa, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En determinadas modalidades, los anticuerpos que se unen específicamente a GARP-TGF-p1 comprenden al menos una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa y/o al menos una cadena ligera lambda o kappa de longitud completa, en donde la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y la cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En la presente descripción se describen anticuerpos monoclonales que comprenden una cadena pesada con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 16 y/o una cadena ligera con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 17.

En la presente descripción se describen anticuerpos monoclonales que comprenden una cadena pesada con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 16. En la presente descripción se describen anticuerpos monoclonales que comprenden una cadena ligera con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 17. En la presente descripción se describen anticuerpos monoclonales que comprenden una cadena pesada con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera con al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra como la SEQ ID NO: 17.

Cuando las cadenas de los anticuerpos se definen por un porcentaje particular de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, la cadena pesada y/o la cadena ligera pueden conservar secuencias de CDR idénticas a las presentes en la secuencia de referencia, de modo que la variación está presente solo fuera de las regiones CDR.

En particular, los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno que comprenden las cadenas pesadas y/o las cadenas ligeras definidas como que tienen un porcentaje particular de identidad con las SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente, pueden tener las siguientes secuencias de CDR:

una CDR3 de VH que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13),

una CDR1 de VH que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4), una CDR3 de VL que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos QQYASVPVT (SEQ ID NO: 11), y una secuencia de CDR2 de VL que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 10 [GASRLKT] y

una CDR1 de VL que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos QASQSISSYLa (SEQ ID NO: 9). Unión a GARP-TGF-p1

Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno se unen a un complejo de GARP y TGF-p1, particularmente a un complejo de GARP humano y TGF-p1 humano. Como se explica en otra parte en la presente descripción, GARP es una proteína transmembrana que se expresa en la superficie de los linfocitos T reguladores y actúa como el receptor de la forma latente de TGF-p. La Figura 1 incluye una representación esquemática del complejo que se forma entre GARP y el TGF-p latente en la superficie celular de los linfocitos T reguladores.

El complejo GARP-TGF-p1 al que se unen los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno es el complejo GARP-TGF-p1 nativo que se forma en la superficie celular entre GARP y TGF-p1.

Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno se caracterizan porque se unen al complejo GARP-TGF-p1 pero no se unen a GARP en ausencia de TGF-p1 o TGF-p latente. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno se unen a GARP solo en la presencia de TGF-p1. En particular, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno se unen a GARP solo en la presencia de TGF-p1 latente. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden bloquear o inhibir la liberación de TGF-p activo de los linfocitos Treg.

Dado que el antígeno diana para los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos es un complejo que comprende dos proteínas separadas, el epítopo al que se unen los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno es un epítopo conformacional, en oposición a uno lineal. El epítopo conformacional comprende al menos un residuo de GARP y al menos un residuo de TGF-p1 latente. El epítopo conformacional puede comprender preferentemente al menos un residuo de GARP, al menos un residuo del péptido asociado a latencia (LAP) del TGF-p1 latente y al menos un residuo del TGF-p1 maduro.

Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden unirse a un epítopo de un complejo formado por GARP humano y TGF-p1 humano en donde el epítopo comprende al menos un residuo de GARP que se selecciona de Y137, S138, G139, T162 y R163 (con referencia a la SeQ ID NO: 33), y al menos un residuo de TGF-p1. El epítopo puede comprender preferentemente al menos los residuos Y137, S138, G139, T162 y R163 de GARP (con referencia a la SEQ ID NO: 33).

El epítopo puede comprender al menos un residuo del polipéptido TGF-p1 (SEQ ID NO: 34), opcionalmente en donde al menos un residuo es K338. El epítopo puede comprender al menos un residuo del péptido asociado a latencia (LAP) de TGF-p1 y al menos un residuo del TGF-p1 maduro. El epítopo puede comprender R58 de LAP y K338 de TGF-p1 maduro (con referencia a la SEQ ID NO: 34).

Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno se unen a un complejo de GARP y TGF-p1. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden unirse adicionalmente a un complejo de GARP humano y TGF-p2 humano y/o un complejo de GARP humano y TGF-p3 humano.

Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden unirse al complejo de GARP y TGF-p1 con alta afinidad. Tal como se usa en la presente descripción, el término "afinidad" o "afinidad de unión" debe entenderse según el significado habitual en la técnica en el contexto de la unión de anticuerpos, y refleja la fuerza y/o la estabilidad de la unión entre un antígeno y un sitio de unión en un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.

La afinidad de unión de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo por su respectivo antígeno puede determinarse experimentalmente mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los instrumentos SPR tal como Biacore™ miden la afinidad en función de la inmovilización de una proteína o antígeno diana en un chip biosensor mientras el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo pasa sobre la diana inmovilizada en condiciones de flujo específicas. Estos experimentos producen mediciones de kon y koff, que pueden traducirse en valores de K^d, en donde K^des la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con un anticuerpo o fragmento del mismo. Cuanto menor sea el valor de K^d, más fuerte será la interacción de unión entre un anticuerpo y su antígeno diana.

Como se indicó anteriormente, la afinidad de un anticuerpo puede determinarse mediante Biacore™ o SPR, por ejemplo, mediante el uso del protocolo descrito en otra parte en la presente descripción. La afinidad del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno por el complejo GARP-TGF-p1, medida por Biacore™ o SPR, puede determinarse mediante el uso del complejo GARP-TGF-p1 expresado de forma recombinante, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 2.

Los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden mostrar una tasa de disociación (koff) por el complejo GARP-TGF-p1 de menos de 7 x 10-4 s-1, menos de 5 x 10-4 s-1, menos de 3 x 10-4 s-1, menos de 1,5 x 10-4 s-1 cuando se evalúa como un Fab. Los anticuerpos contra GARP-TGF-p o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden exhibir una tasa de disociación (koff) por el complejo de GARP-TGF-p1 en el intervalo de 1 x 10-6 s-1 a 5 x 1o-4 s-1, preferentemente en el intervalo de 1 x 10-6 s-1 a 3 x 10-4 s-1, con mayor preferencia en el intervalo de 1 x 10'5 s_1 a 1,5 x 10'4 s-1.

Los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 pueden exhibir un valor de Kd inferior a 5 x 10'9 M, menos de 2 x 10'9 M. Preferentemente, los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 exhiben un valor de Kd inferior a 1,7 x 10'9 M.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno descritos en la presente descripción que se unen al complejo de GARP y TGF-p1 pueden reaccionar de forma cruzada con una o más especies homólogas de GARP y TGF-p, por ejemplo, homólogas de GARP y TGF-p de origen primate no humano.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno pueden no reaccionar de forma cruzada con el complejo de GARP y TGF-p de origen murino. Como alternativa o además, los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno pueden unirse al complejo GARP-TGF-p de origen primate no humano, particularmente el complejo GARP-TGF-p de origen cynomolgus. La reactividad cruzada con homólogos de otras especies puede ser particularmente ventajosa en el desarrollo y ensayo de anticuerpos terapéuticos. Por ejemplo, las pruebas toxicológicas preclínicas de anticuerpos terapéuticos se llevan a cabo con frecuencia en especies de primates que incluyen, pero no se limitan, a monos cangrejeros. Por lo tanto, la reactividad cruzada con estos homólogos de especies puede ser particularmente ventajosa para el desarrollo de anticuerpos como candidatos clínicos.

Estabilidad mejorada

Los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 están mejorados en comparación con los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 descritos anteriormente, debido a que muestran una estabilidad mejorada. En particular, la estabilidad de los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 se mejora en comparación con los anticuerpos que tienen las secuencias de CDR de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo contra GARP-TGF-p1 de referencia LHG10.6, descrito en los documentos núms. WO2015/015003 y WO2016/125017.

El anticuerpo contra GARP-TGF-p LHG10.6 posee la siguiente combinación de dominio variable de la cadena pesada y secuencias de CDR de dominio variable de la cadena ligera:

CDR3 de la cadena pesada que consiste en NEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 6),

CDR2 de la cadena pesada que consiste en RIDPEDGGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 5),

CDR1 de la cadena pesada que consiste en SYYID (SEQ ID NO: 4),

CDR3 de la cadena ligera que consiste en QQYASVPVT (SEQ ID N^o: 11),

CDR2 de la cadena ligera que consiste en GASRLKT (SEQ ID NO: 10), y

CDR1 de la cadena ligera que consiste en QASQSISSYLA (SEQ ID nO: 9).

Como se informa en otra parte en la presente descripción, se ha encontrado que los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 que tienen las secuencias de CDR de la cadena pesada y la cadena ligera de LHG10.6 carecen de estabilidad. En particular, se encontró que las variantes de anticuerpos monoclonales de línea germinal de LHG10.6 (denominados en otra parte en la presente descripción como mAb 39B6 IgG4 y 39B6 IgG1) muestran una tendencia hacia una menor actividad de unión a la diana cuando se almacenan a 37 °C tanto en PBS como en PBS/Tween (consulte por ejemplo, la Figura 2). Esta inestabilidad se atribuyó, al menos en parte, a la isomerización y la desamidación en la posición N95 de HCDR3, es decir, el primer residuo de CDR3 de la cadena pesada.

Los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 de la presente invención difieren con respecto a sus secuencias de CDR, particularmente sus secuencias de CDR de la cadena pesada, de modo que se mejora su estabilidad. En particular, la secuencia de CDR2 de la cadena pesada (HCDR2 o CDR2 de VH) se modifica para incluir una sustitución G55A, de modo que la secuencia de HCDR2 de los anticuerpos de la invención comprende el HCDR2 representado por RIDPEDAGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 12). Además, la secuencia de CDR3 de la cadena pesada (HCDR3 o CDR3 de VH) se modifica para incluir una sustitución N95Y, de modo que la secuencia de HCDR3 de los anticuerpos de la invención comprende el HCDR3 representado por YEWETVV^vG^dLMYEYEY (SEQ ID NO: 13). Los anticuerpos de la presente invención no sufren desamidación ni isomerización. Además, sorprendentemente se ha encontrado que los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 de la presente invención son relativamente resistentes a la oxidación. Esta resistencia a la desamidación, la isomerización y la oxidación se correlaciona con una estabilidad mejorada de los anticuerpos de la invención, particularmente una estabilidad mejorada medida a una temperatura de 37 °C.

Además, los anticuerpos de la invención son sorprendentemente ventajosos porque las modificaciones de las secuencias de CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, en comparación con el anticuerpo de referencia LHG10.6, no disminuyen significativamente la actividad de unión a la diana. Como se ejemplifica en la presente descripción, los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 de la presente invención son relativamente estables a 37 °C y no muestran una reducción significativa en la afinidad de unión por el complejo GARP-TGF-p1 en comparación con el anticuerpo de referencia LHG10.6 o una variante de línea germinal del mismo (39B6). Como se describe en otra parte, en modalidades preferidas, los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 de la invención muestran un valor de Kd inferior a 1,7 x 10-9 M.

Como se informa en la presente descripción, no todas las sustituciones en la posición N95 de HCDR3 que eliminan el residuo de Asn (N) son capaces de mejorar la estabilidad del anticuerpo al mismo tiempo que conservan la afinidad de unión por el complejo GARP-TGF-p1. Se encontró que una variante de anticuerpo monoclonal de línea germinal que tenía una sustitución N95V (denominada en la presente descripción 39B6-AVE) era resistente a la desamidación y la isomerización, pero sufrió una oxidación significativa tras el almacenamiento durante 28 días a 37 °C. También se encontró que la actividad de unión de esta variante de anticuerpo N95V disminuyó significativamente durante un período de almacenamiento de 56 días a 37 °C. Los inventores también encontraron que las sustituciones voluminosas en la posición adyacente 96 en la cadena pesada (es decir, el segundo residuo de HCDR3) eran incapaces de mejorar la estabilidad y conservar la actividad de unión al antígeno con alta afinidad. Como se ejemplifica en la presente descripción, los inventores evaluaron dos variantes de anticuerpos monoclonales de línea germinal que incluían las sustituciones E96K y E96R en el dominio HCDR3. La variante E96K (denominada en la presente descripción 39B6-ANK) no sufrió oxidación, pero estuvo sujeta a desamidación e isomerización durante un período de 28 días a 37 °C y experimentó una disminución significativa en la actividad de unión durante un período de 56 días. La variante E96R (denominada en la presente descripción como 39B6-ANR) experimentó una oxidación y desaminación significativas durante un período de 28 días a 37 °C y experimentó una disminución en la actividad de unión durante un período de 56 días.

En modalidades preferidas de la invención, los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1 y exhiben una estabilidad mejorada comprenden al menos un dominio variable de la cadena pesada (VH) y al menos un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde

Los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1 y presentan una estabilidad mejorada comprenden al menos un dominio variable de la cadena pesada (VH) y al menos un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde

la CDR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13), la CDR2 de VH comprende la secuencia de aminoácidos RIDPEDAGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 12), la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4),

la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos QQYASVPVT (SEQ ID NO: 11),

la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos GASRLKT (SEQ ID NO: 10), y

En determinadas modalidades preferidas de la invención, los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1 y exhiben una estabilidad mejorada comprenden al menos un dominio variable de la cadena pesada (VH) y al menos un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde la CDR3 de VH consiste en la secuencia de aminoácidos YEWETVVVGDLMYEYEY (SEQ ID NO: 13),

la CDR2 de VH consiste en la secuencia de aminoácidos RIDPEDAGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 12), la CDR1 de VH consiste en la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4),

Estos anticuerpos presentan preferentemente un valor de Kd inferior a 1,7 x 10-9 M.

En modalidades particularmente preferidas de la invención, los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1 y exhiben una estabilidad mejorada comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y opcionalmente un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15. En modalidades particularmente preferidas de la invención, los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1 y exhiben una estabilidad mejorada comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

En modalidades particularmente preferidas de la invención, los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1 y exhiben una estabilidad mejorada comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y un dominio variable de la cadena ligera (VL) que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

En modalidades preferidas adicionales de la invención, los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1 y exhiben una estabilidad mejorada comprenden una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y opcionalmente una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En modalidades preferidas adicionales de la invención, los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1 y exhiben una estabilidad mejorada comprenden una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En modalidades preferidas adicionales de la invención, los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGF-p1 y exhiben una estabilidad mejorada comprenden una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

Polinucleótidos que codifican anticuerpos contra GARP-TGF-p

También en la presente descripción se describen moléculas de polinucleótidos que comprenden una o más secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 o los fragmentos de unión al antígeno de la invención, los vectores de expresión que contienen dichas secuencias de nucleótidos de la invención unidas operativamente a secuencias reguladoras que permiten la expresión de los anticuerpos o los fragmentos de los mismos en una célula huésped o sistema de expresión sin células, y las células huésped o los sistemas de expresión sin células que contienen dichos vectores de expresión.

En determinadas modalidades, el dominio variable de la cadena pesada y/o el dominio variable de la cadena ligera de los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 o los fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con la presente invención están codificados por secuencias de polinucleótidos primera y segunda, en donde las secuencias de polinucleótidos primera y segunda comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 18 y 19, respectivamente. Los polinucleótidos que codifican los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 pueden comprender secuencias variantes que codifican dominios VH o VL funcionales de un anticuerpo contra GARP-TGF-p1. Las secuencias variantes que codifican los dominios VH pueden exhibir al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99% de identidad de secuencia cuando se alinean de forma óptima con la SEQ ID NO: 18, y las secuencias variantes que codifican los dominios VL pueden exhibir al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia cuando se alinea de forma óptima con la SEQ ID NO: 19.

La cadena pesada y/o la cadena ligera de los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 o los fragmentos de unión al antígeno pueden estar codificados por secuencias de polinucleótidos primera y segunda, en donde las secuencias de polinucleótidos primera y segunda comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20 y 21, respectivamente. Los polinucleótidos que codifican los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 pueden comprender secuencias variantes que codifican las cadenas pesadas o las cadenas ligeras de un anticuerpo contra GARP-TGF-p1. Las secuencias variantes que codifican las cadenas pesadas pueden exhibir al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia cuando se alinean de forma óptima con la SEQ ID NO: 20, y las secuencias variantes que codifican las cadenas ligeras pueden exhibir al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia cuando se alinea de forma óptima con la SEQ ID NO: 21.

En este contexto, el % de identidad de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos puede determinarse al comparar estas dos secuencias alineadas de manera óptima y en el que la secuencia de polinucleótidos a comparar puede comprender adiciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula al determinar el número de posiciones idénticas para las que el residuo de nucleótido es idéntico entre las dos secuencias, al dividir este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y al multiplicar el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias. Por ejemplo, es posible usar el programa BLAS^t, "BLAST 2 sequences" (Tatusova y otros, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible en ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2, siendo los parámetros usados los dados por defecto (en particular para los parámetros "penalización de espacio abierto": 5, y "penalización de espacio de extensión": 2; siendo la matriz elegida, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), siendo calculado directamente por el programa el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar.

Las moléculas de polinucleótidos que codifican los anticuerpos incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN recombinante. Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" o "molécula de polinucleótido" tal como se usan en la presente descripción indistintamente y se refieren a cualquier molécula de ADN o ARN, monocatenaria o bicatenaria y, si es monocatenaria, la molécula de su secuencia complementaria. Al discutir las moléculas de ácido nucleico, una secuencia o estructura de una molécula de ácido nucleico particular puede describirse en la presente descripción de acuerdo con la convención normal de proporcionar la secuencia en la dirección 5' a 3'. Los ácidos nucleicos o los polinucleótidos pueden "aislarse". Este término, cuando se aplica a una molécula de ácido nucleico, se refiere a una molécula de ácido nucleico que se separa de las secuencias con las que está inmediatamente contigua en el genoma natural del organismo en el que se originó. Por ejemplo, un "ácido nucleico aislado" puede comprender una molécula de ADN insertada en un vector, tales como un plásmido o vector de virus, o integrada en el ADN genómico de una célula procariota o eucariota o un organismo huésped no humano. Cuando se aplica a ARN, el término "polinucleótido aislado" se refiere principalmente a una molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada como se define anteriormente. Alternativamente, el término puede referirse a una molécula de ARN que se ha purificado/separado de otros ácidos nucleicos con los que estaría asociada en su estado natural (es decir, en células o tejidos). Un polinucleótido aislado (ya sea ADN o ARN) puede representar además una molécula producida directamente por medios biológicos o sintéticos, y separada de otros componentes presentes durante su producción.

Para la producción recombinante de un anticuerpo de acuerdo con la invención, puede prepararse un polinucleótido recombinante que lo codifica (mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular) e insertarlo en un vector replicable para la expresión en una célula huésped elegida o en un sistema de expresión sin células. Las células huésped adecuadas pueden ser células procariotas, de levadura o eucariotas superiores, específicamente células de mamíferos. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por ^sV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y otros, J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de mieloma de ratón SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; a Tc C CRL 8287) o NS0 (colecciones de cultivos HPA núm. 85110503); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (M^dCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y otros, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2), así como también la línea celular PERC-6 de DSM. Los vectores de expresión adecuados para su uso en cada una de estas células huésped también generalmente se conocen en la técnica.

Cabe señalar que el término "célula huésped" generalmente se refiere a una línea celular cultivada. Los seres humanos completos en los que se ha introducido un vector de expresión que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno están explícitamente excluidos de la definición de una "célula huésped".

Producción de anticuerpos

En otro aspecto, la invención también proporciona un método para producir anticuerpos de la invención que comprende cultivar una célula huésped (o un sistema de expresión sin células) que contiene uno o más polinucleótidos (por ejemplo, un vector de expresión) que codifican el anticuerpo en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo y la recuperación del anticuerpo expresado. Este proceso de expresión recombinante puede usarse para la producción a gran escala de anticuerpos, que incluyen los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 de acuerdo con la invención, que incluyen los anticuerpos monoclonales destinados al uso terapéutico humano. Los vectores, las líneas celulares y los procesos de producción adecuados para la fabricación a gran escala de anticuerpos recombinantes adecuados para el uso terapéutico in vivo están generalmente disponibles en la técnica y se conocerán bien por los expertos.

Composiciones farmacéuticas

En la presente descripción se describen composiciones farmacéuticas que contienen uno o una combinación de anticuerpos contra GARP-TGF-p1 de la invención, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, formuladas con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más) anticuerpos contra GARP-TGF-p1. Las técnicas para formular anticuerpos monoclonales para uso terapéutico humano se conocen bien en la técnica y se revisan, por ejemplo, en Wang y otros, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 96, páginas 1-26, 2007.

Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para su administración a un sujeto a través de cualquier vía de administración adecuada que incluye, pero no se limita a, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, epidural, nasal, oral, rectal, tópica, por inhalación, bucal (por ejemplo, sublingual) y administración transdérmica.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en estas composiciones incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias amortiguadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato ácido de disodio, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa (por ejemplo, ejemplo, carboximetilcelulosa sódica), polietilenglicol, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Utilidad terapéutica de los anticuerpos contra GARP-TGF-p1

Cualquier referencia en la descripción a los métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno descritos en la presente descripción pueden usarse en métodos de tratamiento, en donde a un sujeto que lo necesita se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contra GARP-TGF-p1 o fragmento de unión al antígeno del mismo. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden usarse en métodos de tratamiento, en donde a un sujeto humano que lo necesita se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contra GARP-TGF-p1 o fragmento de unión al antígeno del mismo. En la presente descripción se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se unen al complejo de GAR^py TGF-p1 humano, para su uso como medicamentos. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno se unen al complejo GARP-TGF-p en los linfocitos T reguladores y pueden bloquear o inhibir la producción o liberación de TGF-p activo. Por lo tanto, en la presente descripción se describen métodos para tratar sujetos que tienen o se sospecha que tienen trastornos relacionados con TGF-p. Tales métodos implican administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contra GARP-TGF-p1.

Los trastornos relacionados con TGF-p ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, enfermedades inflamatorias, infección crónica, cáncer, fibrosis, enfermedades cardiovasculares, enfermedad cerebrovascular (por ejemplo, accidente cerebrovascular isquémico) y enfermedades neurodegenerativas. Un trastorno relacionado con TGF-p puede ser una infección crónica. Un trastorno relacionado con TGF-p puede ser cáncer.

Para su uso en la administración a un sujeto, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno pueden formularse como composiciones farmacéuticas. Las composiciones pueden administrarse por vía oral, parenteral, mediante pulverización de inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El término "administración" como se usa en la presente descripción incluye, sin limitación, técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intratumoral e intracraneal.

Las formas inyectables estériles de las composiciones pueden ser acuosas o una suspensión oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica mediante el uso de agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente aceptable parenteralmente no tóxico. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, puede emplearse cualquier aceite fijo suave, que incluyen monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, al igual que los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones de aceite también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables que incluyen emulsiones y suspensiones. Otros tensoactivos usados comúnmente, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comúnmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables también pueden usarse para fines de formulación.

Los programas y las dosificaciones para la administración del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno del mismo en las composiciones farmacéuticas pueden determinarse de acuerdo con métodos conocidos para este tipo de productos, por ejemplo, mediante el uso de las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, un anticuerpo presente en una composición farmacéutica puede suministrarse a una concentración de 10 mg/ml en viales de un solo uso de 100 mg (10 ml) o 500 mg (50 ml). El producto está formulado para la administración intravenosa (IV) en 9,0 mg/ml de cloruro de sodio, 7,35 mg/ml de citrato de sodio dihidrato, 0,7 g/ml de polisorbato 80 y agua estéril para inyección. El pH se ajusta a 6,5.

Para uso clínico, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno puede administrarse a un sujeto en una o más dosis. Para las vías de administración parenteral, una sola dosis del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Una sola dosis del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Una sola dosis del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal. Para la dosificación repetida, las dosis individuales pueden administrarse por la misma vía de administración o por vías diferentes. También para dosis repetidas, las dosis individuales pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, una dosis inicial o de carga puede ser más que una dosis posterior. También para la dosificación repetida, las dosis individuales pueden administrarse en un programa fijo o en un programa ajustable o variable basado, por ejemplo, en la condición clínica o la respuesta clínica de un sujeto. También para dosis repetidas, las dosis individuales normalmente pueden administrarse una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada 3, 4, 5, 6 o 7 días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres o cuatro semanas o una vez cada dos mes. También se contemplan otros programas.

Se apreciará que estas dosis y programas son ilustrativos y que puede determinar un programa y régimen óptimos al tener en cuenta factores tales como el anticuerpo particular o el fragmento de unión al antígeno que se administrará, la enfermedad o el trastorno que se tratará, el tamaño, la edad y el estado del sujeto a tratar, la vía de administración, otras terapias que se administran al sujeto y la afinidad y la tolerabilidad del anticuerpo particular. Tales factores y consideraciones de dosificación pueden determinarse en uno o más ensayos clínicos.

También se describen métodos para estimular el sistema inmunitario en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en la presente descripción. También se describen métodos para inhibir la función inmunosupresora de los Treg humanos en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en la presente descripción.

También se describen métodos para el tratamiento del cáncer mediante el uso de anticuerpos contra GARP-TGF-p1 y fragmentos de unión al antígeno. Tales métodos pueden implicar la reducción de la inmunosupresión en el entorno del tumor en un sujeto que lo necesita.

Cuando los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos se usan en métodos para tratar el cáncer, los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos pueden administrarse en combinación con uno o más tratamientos adicionales para el cáncer, por ejemplo, uno o más agentes inmunoterapéuticos.

Cuando los anticuerpos contra GARP-TGF-p1 se administran en combinación con un agente inmunoterapéutico, dicho agente inmunoterapéutico puede ser una vacuna tumoral. Alternativamente, el agente inmunoterapéutico puede ser un anticuerpo inmunoestimulador.

Sin desear limitarse a la teoría, los anticuerpos descritos en la presente descripción probablemente mejorarán la eficacia del agente inmunoterapéutico al prevenir o aliviar cualquier inmunosupresión. La combinación con un agente inmunoterapéutico puede exhibir un efecto sinérgico.

Pueden tratarse varios tipos de cáncer de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de vejiga, tumor cerebral, glioma, carcinoma de mama, tumor carcinoide, cáncer de cuello uterino, carcinoma de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer extrahepático, cáncer de las vías biliares, tumor de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hipofaringe, carcinoma de células de los islotes, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, mesotelioma, carcinoma de células de Merkel, cáncer escamoso metastásico de cabeza y cuello, mieloma, neoplasia, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de senos paranasales y nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, feocromocitoma, cáncer de hipófisis, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer de recto, carcinoma de células renales, cáncer de glándulas salivales, cáncer de piel, sarcoma de Kaposi, linfoma de linfocitos T, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de vagina, cáncer de vulva o tumor de Wilms.

Los antígenos tumorales adecuados para su uso como vacunas tumorales conocidas en la técnica incluyen, por ejemplo: (a) antígenos de cáncer de testículo tales como NY-ESO-1, SSX2, SCP1, así como también polipéptidos de la familia RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (que pueden usarse, por ejemplo, para tratar el melanoma, tumores de pulmón, cabeza y cuello, NSCLC, de mama, gastrointestinales y de vejiga), (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con varios tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, de pulmón, de cabeza y cuello), p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma, cáncer de páncreas y cáncer colorrectal), CD 4 (asociado con, por ejemplo, melanoma), MUM 1 (asociado con, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociado con, por ejemplo, con cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, con cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociado con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de linfocitos T), BCR-abl (asociado con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), triosefosfato isomerasa, IA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT, (c) antígenos sobreexpresados, por ejemplo, galectina 4 (asociada con, por ejemplo, cáncer colorrectal), galectina 9 (asociada con, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada con, por ejemplo, con leucemia mielógena crónica), WT 1 (asociada con, por ejemplo, diversas leucemias), anhidrasa carbónica (asociada con, por ejemplo, cáncer renal), aldolasa A (asociada con, por ejemplo, cáncer de pulmón), PRAME (asociada con, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu (asociada con, por ejemplo, cáncer de mama, colon, pulmón y ovario), alfafetoproteína (asociada con, por ejemplo, hepatoma), SA (asociada con, por ejemplo, cáncer colorrectal), gastrina (asociada con, por ejemplo, cáncer de páncreas y gástrico), proteína catalítica de telomerasa, MUC-1 (asociada con, por ejemplo, cáncer de mama y ovario), G-250 (asociada con, por ejemplo, carcinoma de células renales) y antígeno carcinoembrionario (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cánceres del tracto gastrointestinal tales como cáncer colorrectal), (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocitos tales como MART-I/Melan A, gp100, MC1R, receptor de hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, proteína relacionada con tirosinasa-1/TRP1 y proteína relacionada con tirosinasa-2/TRP2 (asociada con, por ejemplo, melanoma), (e) antígenos asociados a la próstata, tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con, por ejemplo, cáncer de próstata, (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados con mieloma y linfomas de linfocitos B, por ejemplo), y (g) otros antígenos tumorales, tales como antígenos que contienen polipéptidos y sacáridos, que incluyen (i) glicoproteínas tales como sialil Tn y sialil Le<x> (asociadas con, por ejemplo, cáncer de mama y colorrectal) así como también varias mucinas; las glicoproteínas pueden acoplarse a una proteína portadora (por ejemplo, MUC-1 puede acoplarse a LH); (ii) lipopolipéptidos (por ejemplo, MUC-1 unida a un resto lipídico); (iii) polisacáridos (por ejemplo, hexasacárido sintético Globo H), que pueden acoplarse a proteínas portadoras (por ejemplo, a KLH), (iv) gangliósidos tales como GM2, GM12, ^gD2, GD3 (asociados, por ejemplo, con cáncer de cerebro, pulmón, melanoma), que también pueden acoplarse a proteínas portadoras (por ejemplo, KLH). Otros antígenos tumorales incluyen pi 5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, ^mY^l-RAR, antígenos del virus Epstein Barr, EBNA, antígenos del virus del papiloma humano (HPV), que incluye E6 y E7, antígenos del virus de la hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópico de linfocitos T humanos, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23H I, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p 16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO- 1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares. Los anticuerpos inmunoestimuladores adecuados incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos anti-CTLA-4, anti-PD1, anti-PDL1 y anti-KIR.

Los métodos para tratar el cáncer descritos en la presente descripción pueden comprender administrar al sujeto el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno antes, simultáneamente y/o después de la administración de otro agente anticanceroso o tratamiento contra el cáncer, tal como un tratamiento de quimioterapia.

También se describen métodos para prevenir enfermedades infecciosas mediante la administración de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno para mejorar la eficacia de las estrategias de vacunación. Por ejemplo, los métodos pueden incluir la prevención de enfermedades infecciosas tales como VIH, malaria o Ébola mediante la administración combinada de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno como se describe en la presente descripción junto con vacunas específicas para estas enfermedades.

Kits

También se describe un kit que comprende al menos un anticuerpo contra GARP-TGF-p1 o fragmento de unión al antígeno descrito en la presente descripción.

El término "kit" pretende significar cualquier fabricación (por ejemplo, un paquete o un envase) que comprende al menos un reactivo, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, para unirse específicamente al complejo GARP-TGF-p1. El kit puede promocionarse, distribuirse o venderse como una unidad para realizar los métodos descritos en la presente descripción. Además, cualquiera o todos los reactivos del kit pueden proporcionarse dentro de envases que los protejan del entorno externo, como en envases sellados. Los kits también pueden contener un prospecto que describa el kit y los métodos para su uso.

Ejemplos

La invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Anticuerpo de línea germinal LHG-10.6

La producción y la caracterización del anticuerpo "LHG-10" se describe en las solicitudes de patentes internacionales núms. WO2015/015003 y WO2016/125017. El anticuerpo LHG-10 se generó mediante la inmunización de llamas con células HEK293E que sobreexpresan el complejo ^gA^rP-TGF-01 humano, y se identificó mediante la selección y la detección de Fab ^gA^rP-TGF-01. Se usó un enfoque de mezcla de las cadenas ligeras (como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional núm. WO2014/033252) para mejorar la afinidad del anticuerpo monoclonal LHG-10, y se identificó una variante "LHG-10.6" (también denominada en la presente descripción como 17H5) que tenía características de unión mejoradas. Las secuencias VH y VL de LHG-10 y la variante mezclada V^kLHG-10.6 se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3

Se encontró que el anticuerpo 17H5 tenía una identidad del 88,5 % con la secuencia de línea germinal humana más cercana (X92343|IGHV1-46*01) en el dominio VH y una identidad del 86,2 % con la secuencia de línea germinal humana más cercana (X59315|IGKV1-39*01) en el dominio VL. Este anticuerpo se sometió a germinación de acuerdo con un método de 3 etapas: 123

1- Ensamblaje de una biblioteca de genes mediante el uso de oligonucleótidos superpuestos para generar sintéticamente los genes que codifican la cadena ligera variable (VL) y pesada variable (VH) mediante PCR. 2- Clonación de esta biblioteca de genes en un vector (pCB13) que contiene los genes que codifican la cadena pesada constante humana (CH1) y kappa ligera constante (C^k) (construcción de biblioteca).

3- Selección de los Fab funcionales mediante el uso de presentación en fagos y selección por afinidad.

1. Construcción de bibliotecas

El VH de 17H5 se comparó con la secuencia de línea germinal humana más cercana y se identificaron los residuos del marco que se desvían de la línea germinal humana. Se permitió que estos residuos del marco mutaran al residuo presente en la región V humana y se mantiene también en la biblioteca el residuo original. Los 12 residuos de VH que se les permitió mutar a sus homólogos humanos se muestran en la siguiente tabla. Además de estas mutaciones de línea germinal, se permitió que mutaran un sitio de isomerización dentro de CDR2 (D54;D55) y un sitio de oxidación en CDR3 (M100f). Estos sitios también se muestran en la tabla más abajo.

Tabla 4 Residuos dirigidos en el dominio VH de 17H5

Para la Vk de 17H5, una comparación entre la secuencia de línea germinal humana más cercana y las secuencias del marco condujo a la identificación de 11 residuos a los que apuntar. Estos sitios se muestran en la tabla más abajo.

Tabla 5 Residuos dirigidos en el dominio VL de 17H5

Los tamaños teóricos de la biblioteca de línea germinal 17H5 se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6

2. Construcción de la biblioteca de genes.

Las bibliotecas de líneas germinales se generaron mediante ensamblaje de genes. Los genes sintéticos para VH y VL (dos conjuntos) basados en este diseño se generaron mediante ensamblaje basado en PCR (Stemmer y otros, Gene (1995) 164: 49 - 530). Los oligonucleótidos superpuestos con mutaciones específicas en determinadas posiciones se ensamblaron mediante PCR. Los nucleótidos se degeneraron para codificar el aminoácido humano y de llama. Esto se hizo para evitar la pérdida completa de la unión en caso de que los residuos de llama fueran críticos para la estabilidad, el plegamiento o la unión con alta afinidad.

Los genes sintéticos de las bibliotecas Vk y VH de 17H5 se clonaron primero en pCB13-CK1, un vector fagémido con los dominios CH1 y Ck humanos, respectivamente. Después de la construcción de estas sub-bibliotecas de VkCk y VHCH1, las bibliotecas finales se prepararon mediante ligación del inserto de la cadena pesada en la biblioteca de cadena ligera. Se llevó a cabo una PCR de colonias para determinar el porcentaje de inserción y se enviaron clones para secuenciación para garantizar que todas las mutaciones deseadas estuvieran presentes en la biblioteca. Las características de las diferentes bibliotecas se describen en la tabla más abajo.

Tabla 7 Características de las bibliotecas de línea germinal de 17H5

Se encontró que las bibliotecas de línea germinal eran de buena calidad y podían usarse para selecciones.

3. Selección de Fab con alta identidad humana

La presentación de fagos se usó para seleccionar Fab con alta afinidad por el complejo GARP-TGF-p1 humano, como se describió anteriormente en el documento núm. WO2015/015003. En resumen, una placa de microtitulación se recubrió durante la noche a 4 °C con el complejo GARP-TGF-p1 y, al día siguiente, los fagos que expresaban Fab se incubaron durante 2 horas en pocillos recubiertos con diferentes concentraciones de complejo. Las placas se lavaron y los fagos específicos se eluyeron con tripsina y se usaron para la infección de células TG1. Los detalles de las condiciones de selección se enumeran en la Tabla 8.

Tabla 8 Detalles de las rondas de selección para la biblioteca de línea germinal de 17H5

Después de la primera ronda de selección, solo se observó enriquecimiento sobre un recubrimiento de una proteína irrelevante a l0 pg/ml. En la ronda 2, el enriquecimiento fue 10 veces mayor, mientras que la cantidad de fago de entrada fue 10 veces menor. A partir de la ronda 3, se aumentó la rigurosidad al aumentar la duración del lavado y al añadir un exceso de diana en solución. Se añadió un gran exceso de diana soluble en solución para evitar que se volviera a unir el fago disociado. Incluso después de la 6ta ronda, con un lavado de tasa de disociación de 1 semana y un exceso de 100 veces de diana soluble, todavía se observó enriquecimiento.

4. Detección de Fab con alta identidad humana

Las placas maestras se seleccionaron de las rondas de selección 2, 3, 4, 5 y 6 (48 clones para cada ronda). Se prepararon extractos periplásmicos y se determinaron las tasas de disociación mediante SPR (mediante el uso de Biacore). Todos los clones se secuenciaron con ADN y se dedujeron las secuencias de aminoácidos de los mismos. Los clones con una identidad con la región V de Ig de línea germinal humana superior al 92 % se resumen en la Tabla 9. Las tasas de disociación de estos clones se midieron como extractos periplásmicos en SPR (mediante el uso de Biacore), y se compararon con la tasa de disociación de Fab 17H5.

Tabla 9 Afinidad de unión de clones con más del 92 % de identidad humana total

Los 5 clones que mostraban una identidad humana total de >93 % y una tasa de disociación comparable a la del Fab 17H5 original se volvieron a clonar como anticuerpos IgG1 humana completos. Las secuencias de CDR, VH y VL de estos anticuerpos se muestran en las Tablas 10, 11 y 12.

Tabla 10 Secuencias de CDR de VH para Ab contra GARP-TGF-p1

Tabla 11 Secuencias de CDR de VL para Ab contra GARP-TGF-p1

5. Caracterización in vitro de mAb con alta identidad de residuos del marco humano

Los cinco clones de línea germinal reformateados a IgG1 humana se produjeron mediante transfección transitoria en células HEK 293E. Se evaluó la unión de todos los anticuerpos al complejo GARP-TGF-p1 humano mediante SPR y mostraron una afinidad de unión similar a la del clon original de línea no germinal (KD 2-5 veces menor que 17H5). El cambio del residuo M100f en la CDR3 a una treonina disminuyó la K^d= 5 veces. Las propiedades de unión y las características de los Ab 17H5 de línea germinal se enumeran en la Tabla 13.

Tabla 13 Propiedades de unión y características de los Ab 17H5 de línea germinal

6. Estabilidad del mAb 39B6 de línea germinal

El clon 39B6 se seleccionó como el clon de línea de germinal líder en base a sus características de unión. Este anticuerpo se produjo en dos formatos deficientes en la función efectora, hlgG1N297Q y hlgG4S228P, y se realizaron pruebas de estabilidad. Antes de la prueba de estabilidad, se evaluó la afinidad de los anticuerpos 39B6 deficientes en la función efectora por GARP-TGF-p1 mediante BiacoreT200 mediante el uso de un chip CM5 recubierto con el complejo GARP-TGF-p1 a 750RU (Tabla 14) o recubierto con los anticuerpos a 1000RU (Tabla 15).

Tabla 14

Tabla 15

La termotolerancia de los anticuerpos 39B6 se evaluó mediante el uso de la siguiente configuración.

• Preparación de la muestra de mAb: 1 ml de los mAb (39B6-IgG1 y 39B6-IgG4), solución concentrada recién preparada (5 mg/ml), se puso en viales de vidrio con tapón de rosca de 2 ml y se almacenó a 5 °C y 37 °C. Los viales se comprobaron inmediatamente en busca de ausencia de partículas.

• Control negativo de PBS: se prepararon alícuotas de 1 ml de PBS de Dulbecco filtrado en viales de vidrio de 2 ml como control negativo de PBSt . Los viales se comprobaron inmediatamente en busca de ausencia de partículas.

• Control negativo de PBSTw: se prepararon alícuotas de 1 ml de PBS de Dulbecco filtrado que contenía Tween80 al 0,02 % (Sigma) en viales de vidrio de 2 ml como control negativo de PBSTw. Los viales se comprobaron inmediatamente en busca de ausencia de partículas.

• Control de alta agregación: se prepararon alícuotas de 1 ml de un anticuerpo interno con abundante agregación visible en viales de vidrio de 2 ml.

• Muestra de referencia: para cada anticuerpo, se prepararon alícuotas de 60 pl de mAb en tubos de PCR estériles de 500 pl, se etiquetaron y se almacenaron a -20 °C.

La estabilidad de los anticuerpos almacenados a diferentes temperaturas y en diferentes condiciones (PBS frente a PBSTw) se controló durante un transcurso de tiempo de 56 días. En la Figura 2 se muestra el efecto del almacenamiento sobre la actividad de unión a la diana medida por SPR (Biacore™). Como puede verse a partir de los resultados presentados, el anticuerpo 39B6 (en ambos formatos deficientes en la función efectora) mostró una tendencia hacia una menor actividad de unión a la diana tanto en PBS como en PBS/Tween cuando se almacenó a 37 °C. Por el contrario, las muestras almacenadas a 5 °C no mostraron una pérdida significativa en la actividad de unión a la diana a lo largo del tiempo.

Ejemplo 2 Desarrollo de anticuerpos contra GARP-TGF-p1 con estabilidad mejorada

2.1 Producción de variantes 39B6

Se descubrió que la disminución de la actividad de unión a la diana indicada anteriormente para el anticuerpo 39B6 estaba relacionada con la desamidación que se producía en las posiciones 95-96 de CDR3 de VH. Como tal, se llevó a cabo más trabajo para mejorar la estabilidad de 39B6.

En primer lugar, este clon se sometió a modificación de la cadena VH en la región CDR2 para introducir una sustitución G55A (39B6-A). Las regiones VH y VL de 39B6-A se volvieron a clonar en la cadena principal de IgG4S228P humana, es decir, el formato de anticuerpo humano deficiente en la función efectora.

En un intento por mejorar la estabilidad del anticuerpo 39B6-A IgG4S228P, se generaron cinco variantes que tenían mutaciones en las posiciones 95 o 96 de CDR3 del dominio VH. Estas variantes se muestran más abajo. Todas las variantes se produjeron en el formato deficiente en la función efectora IgG4S228P.

Tabla 16 Variantes de 39B6-A

Los anticuerpos se filtraron y se concentraron a 5 mg/ml y se almacenaron en PBS de Dulbecco con Tween80 al 0,02 % (Sigma). Se necesitaba el Tween80 para estabilizar las formulaciones de anticuerpos.

Se evaluó la afinidad de todos los anticuerpos (que incluye 39B6-A) por GARP-TGF-p1 mediante BiacoreT200usando un chip CM5 recubierto con complejo GARP-TGF-p1 a 150 RU (Tabla 17) o recubierto con los anticuerpos a 200 RU (Tabla 18)

Tabla 17

Tabla 18

La potencia para bloquear la liberación de TGF-p activo por Treg humanos se analizó con todas las variantes al determinar el nivel de fosforilación SMAD2 de Treg humanos estimulados con CD3/CD28 en presencia de los mAb. Como se muestra en la Figura 3, los anticuerpos 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR tenían una potencia similar en el ensayo de fosforilación de SMAD2 en comparación con el 39B6-A original. Las variantes 39B6-AEE y 39B6-AVE mostraron una clara pérdida de potencia.

Se obtuvieron resultados similares mediante el uso del ensayo GAGA-luc en el que las células 293T-hGARP se transfectaron transitoriamente con un plásmido informador en el que la luciferasa de luciérnaga está bajo el control de un promotor de respuesta SMAD (GAGA-luc). Los anticuerpos 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR tenían una potencia similar en el ensayo de luciferasa en comparación con el 39B6-A original. Las variantes 39B6-AEE y 39B6-AVE mostraron una clara pérdida de potencia (consulte Figura 4).

2.2 Estudios de estabilidad

Con la excepción de 39B6-AEE, se evaluó la estabilidad de las variantes mediante el uso de diferentes enfoques como se describe más abajo.

Para cada uno de los diferentes estudios de estabilidad, los anticuerpos se evaluaron mediante el uso de una o más de las siguientes técnicas:

- Inspección visual

- HPLC-Exclusión por tamaño

- SDS-PAGE (reductora y no reductora)

- Afinidad de unión a la diana en SPR

- Concentración de proteínas

Los protocolos para estas técnicas se describen más abajo.

Protocolo para inspección visual

Las muestras se seleccionaron a ciega y se calificaron en cuanto a la presencia de partículas visibles mediante inspección visual de los viales por parte de tres analistas. Se permitió que las muestras alcanzaran la temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la inspección. Para la evaluación se usó el siguiente sistema de puntuación: A: la muestra es transparente, no hay partículas visibles

B: muy pocas partículas

C: presencia moderada de partículas

D: abundantes partículas observadas

F: fibras

Protocolo para cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC)

Preparación de sistemas, columnas y muestras

La columna usada durante todo el estudio fue una Xbridge Protein BEH SEC 200A (3,5 pm, 7,8*30 mm, Waters) que se almacena de forma rutinaria en EtOH al 20 %. Se acopló una columna de protección previa Xbridge Protein BEH 200A a la columna analítica (3,5 pm, 7,8*3 mm; Waters). Antes de cada uso, la columna se equilibró con PBS de Dulbecco para 5CV por lo menos, y antes de retirarse del sistema, se limpió con 5CV de agua grado LC. Todos los disolventes se filtraron y desgasificaron antes de su utilización.

El sistema cromatográfico usado fue un Agilent 1260 Infinity, equipado con bomba cuaternaria, inyector automático, desgasificador en línea y detector DAD. La columna no se mantuvo en un compartimento termostatado y las muestras se analizaron a temperatura ambiente. El detector se ajustó a longitudes de onda de 280 y 214 nm simultáneamente (longitud de onda de referencia a 360 nm con un límite de 100 nm). Se siguió el seguimiento de la agregación en el canal de 214 nm. La adquisición de datos se realizó con el programa Chemstation (Agilent).

El análisis de las muestras se realizó mediante transferencia de 25 pl de todas las muestras originales directamente desde la concentración de 5 mg/ml en condiciones asépticas. Se centrifugaron a 2000 rcf durante 1 min y se transfirieron cuidadosamente 20 pl a viales de vidrio ámbar con tapón de rosca. El volumen de inyección para cada condición fue de 5 pl (25 pg), a una velocidad de flujo de 0,7 ml de PBS/min durante 25 min. Cada inyección se acompañó de un lavado de la aguja con agua de grado LC y se realizó un lavado del sello al final de cada muestra. Cada secuencia de puntos de tiempo se inició con 2 inyecciones de PBS (en blanco; volumen de inyección de 5 pl), seguidas de 2 pl de inyección de mezcla de proteína estándar BEH 200 (Waters) y una muestra de mAb de agregación conocida. Cada doce muestras analizadas se realizó una inyección de blanco. Cada secuencia analítica se terminó como se inició pero en el orden inverso (mAb de control de agregación conocida, mezcla de proteína estándar BEH y blanco 2x).

Método usado para la determinación del % de agregación y el % de área de monómero

Se usó el siguiente protocolo:

- Integrar todos los cromatogramas con el método ARGX-115 (parámetros técnicos básicos: modo estándar de acercamiento de tangente, sensibilidad de pendiente 2,0, rechazo de altura 1,7, rechazo de área 1,0, ancho de pico: 0,02)

- Verificar que todos los picos estén integrados de forma que coincidan con los análisis anteriores obtenidos - Exportar los resultados de la integración en un archivo PDF y Excel

- Calcular el % de agregación total como el resumen de las áreas de todos los picos que eluyen antes del pico del monómero dividido por el área total de la inyección y multiplicarlo por 100

- También calcular el % de área de monómero mediante la división del área de monómero por el área total y multiplicar por 100. Este % de área de monómero refleja si hay agregados insolubles presentes en la muestra - Mantener registros detallados para controlar el rendimiento, la eficiencia y la resolución de la columna analítica (es decir, simetría de pico, área de monómero, área total, reproducibilidad de los tiempos de retención, etc.) Protocolo para SDS-PAGE

Preparación de la muestra

El análisis de la muestra se realizó mediante transferencia de 25 pl de todas las muestras originales a 5 mg/ml en 100 pl de PBS/Tween80 al 0,02 % (abreviado como PBSTw a lo largo de este estudio) en condiciones asépticas para generar una concentración intermedia de 1 mg/ml, para SDS-PAGE (reductora y no reductora), afinidad de unión en SPR y evaluación de concentración de proteínas. Se usaron geles prefabricados, miniproteicos, sin manchas, tris-glicina al 4-20 % para el análisis SDS-PAGE de las muestras (Biorad). Se preparó un lote de colorante de carga concentrado 4x, con o sin agente reductor DTT, y se dividió en alícuotas a -20 °C. Rutinariamente, se tomaron 5 pl de la dilución intermedia a 1 mg/ml y luego se añadieron 5 pl de colorante de carga concentrado 4x (+/-DDT) junto con 10 pl de mQ. La cantidad final para cada condición fue de 5 pg. Las muestras se hirvieron durante 10 min a 95 °C y luego se cargaron (20 pl) en los geles prefabricados. La electroforesis tuvo lugar durante 35 min en un sistema amortiguador tris-glicina bajo un voltaje constante de 200 V. Se siguió la tinción azul (Gentaur) durante 1 h. Todos los geles se destiñeron con agua mQ durante al menos 1 hora.

Determinación del % Ab de longitud completa

La intensidad de las diferentes bandas se determinó en el sistema Odyssey v3.0 Li-Cor mediante el escaneo de los geles de proteínas hasta la detección de un canal (700 nm) con los ajustes: compensación de enfoque de 0,5 mm y calidad "alta". El brillo y el contraste para cada análisis se establecieron al 50 % con un parámetro manual lineal de 5.

El método fue el siguiente:

- Escanear el gel y verificar que todas las bandas del gel estén rodeadas por rectángulos estrechos

- Elegir "exportar" en la configuración para obtener la intensidad cruda de todas las bandas en un formato de Excel - Calcular el % de intensidad cruda de cada banda presente en un carril como la intensidad cruda de la banda dividida por la intensidad cruda total del carril y multiplicar por 100

- Para las condiciones no reductoras, el % Ab de longitud completa se define como el % de intensidad cruda de la banda que corresponde a la banda de ~100 kD

- Para las condiciones reductoras, el % Ab de longitud completa se define como el resumen del % de intensidad cruda de las bandas que corresponden a las bandas ~25-35 kD y ~55 kD

Protocolo para medir la actividad de unión a la diana en Biacore 3000

Preparación de la muestra

A partir de la concentración intermedia de todas las muestras a 1 mg/ml descrita anteriormente, se realizó una dilución adicional de 1/250 para el análisis SPR para obtener una concentración final de 4 pg/ml. Esta dilución 1/250 se realizó para todas las condiciones en dos etapas: a) 5 pl (1 mg/ml) 120 pl HBS-EP (amortiguador SPR) y b) una dilución 10x extra (15 pl 135 pl HBS-EP). Para cada anticuerpo y cada punto de tiempo, se preparó una curva estándar separada, a partir de una muestra congelada a -80 °C. Esto se analizó junto con las muestras de estabilidad para determinar la pendiente de cada curva después del ajuste general de los estándares. Estas pendientes se usaron para calcular el porcentaje de actividad de las muestras de estabilidad al establecer la muestra de referencia en 100 %.

Determinación del % de actividad en Biacore

Para determinar la actividad de unión a la diana en Biacore, se recubrió un chip CM5 con ~4000 RU de complejo GARP-TGF-p humano. El flujo se ajustó a 30 pl/min con un modo de inyección "kinject" y dos inyecciones de regeneración (NaCl 1 mM, glicina 2,5 mM pH 1,5) con un intervalo de 5 min.

El método se llevó a cabo de la siguiente manera:

- Abrir las curvas en el programa BIAEVAL y seleccionar el valor '2-1' (1: blanco, 2 hGARP-TGF-p1)

- Seleccionar una curva a la vez para la superposición de gráficos

- Eliminar la parte de regeneración de la curva.

- Seleccionar la línea de base justo antes de la inyección y transformar el eje Y para 'cero en la mediana de la selección'

- Seleccionar 'General Fit' y comenzar desde 120 segundos después de la inyección y terminar en 155 segundos - Trazar los estándares en Excel y determinar la pendiente de la curva para cada anticuerpo

- Estos valores se convierten en un porcentaje de actividad al configurar la referencia (muestra almacenada a -20 °C) al 100 %

Protocolo para la concentración de proteínas

Para la determinación del contenido de proteínas de cada condición se usó el sistema NanoDrop al medir la absorbancia a 280 nm de cada muestra (2 jl). El sistema se blanqueó con PBS y la determinación de proteínas se realizó al medir por triplicado la absorbancia a 280 nm de cada muestra (dilución intermedia a 1 mg/ml). Todos los valores obtenidos a ²⁸⁰nm se dividieron por el factor 1,51. Se realizó una medición del blanco de PBS después de cada condición diferente. Todos los datos se informaron como valor promedio de las tres mediciones para cada condición.

2.2.1 Estudio de estabilidad de la temperatura

Para controlar la estabilidad de los anticuerpos bajo diferentes condiciones de temperatura de almacenamiento, se siguió la siguiente configuración:

• Preparación de muestra de mAb: 1 ml de mAb (39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR), solución concentrada recién preparada (5 mg/ml), se colocó en viales de vidrio con tapa de rosca de 2 ml y se almacenó a 5 °C y 37 °C. Los viales se comprobaron inmediatamente en busca de ausencia de partículas.

• Control de alta agregación: se prepararon alícuotas de 1 ml de un anticuerpo interno con abundante agregación visible en viales de vidrio de ²ml.

• Muestra de referencia: para cada anticuerpo, se prepararon alícuotas de 60 j l de mAb en tubos de PCR estériles de 500 jl, se etiquetaron y se almacenaron a -20 °C.

En diferentes puntos de tiempo, se tomaron muestras de mAb de las condiciones de almacenamiento y se evaluaron para:

- Inspección visual

- SE-HPLC

- SDS-PAGE (reductora y no reductora)

- afinidad de unión a la diana en SPR

- concentración de proteínas

Inspección visual

Los resultados de la inspección visual se muestran en la Tabla 19 más abajo. Todos los mAb estaban en PBSTw, lo que debería dar un efecto estabilizador.

Tabla 19 Resultados de la inspección visual de muestras mAb de 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR durante un período de 56 días en condiciones de almacenamiento de 5 °C y 37 °C

Para la condición de 5 °C, las puntuaciones promedio de los mAb después de 56 días fueron las siguientes:

39B6-AYE: 'la muestra es transparente, no hay partículas visibles'

39B6-AVE y 39B6-ANK: 'muy pocas partículas'

39B6-ANR: 'presencia moderada de partículas'.

El amortiguador PBSTw se califica como 'la muestra es transparente, no hay partículas visibles' a 5 °C, lo que indica que las partículas observadas están relacionadas con las proteínas.

Para la condición de almacenamiento a 37 °C, las puntuaciones promedio de los mAb después de 56 días fueron las siguientes:

39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR: 'muy pocas partículas'

39B6-AVE: 'la muestra es transparente, no hay partículas visibles'.

El amortiguador PBSTw se califica como 'la muestra es transparente, no hay partículas visibles' a 37 °C, lo que indica que las partículas observadas están relacionadas con las proteínas.

Análisis por SE-HPLC

La agregación y la fragmentación de proteínas se midieron por SE-HPLC.

Los resultados de agregación de proteínas para los mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR, medidos por SE-HPLC, se resumen en la Tabla 20 a continuación y se muestran en la Figura 5.

Tabla 20 % de formación de agregados controlada por SE-HPLC para mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y

39B6-ANR

Cuando se almacenó a 5 °C, no se observaron cambios en los % de niveles de agregados para los mAb 39B6-AYE, 39B6-AVE y 39B6-ANK durante el período de 56 días. Los % de niveles de agregados observados fueron bajos, entre 0,9 % y 1,1 %. Se observó un aumento menor en los niveles de agregados de mAb 39B6-ANR de 1,1 % a 1,4 %.

A 37 °C, no se observaron cambios en los % de niveles de agregados para los mAb 39B6-AYE y 39B6-ANK. Para 39B6-ANR se observó un aumento menor de 1,1 % a los 0 días a 1,5 % a los 56 días. Para 39B6-AVE se observó un aumento en el % de agregado de 1,0 % a los 0 días a 4,4 % a los 56 días.

La presencia de picos de fragmentos para los mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR, medidos por SE-HPLC, se muestra en la Tabla 21 y la Figura 6. Como solo se observaron picos de fragmentación a 37 °C después de 56 días, solo se presentan estos resultados.

Tabla 21 % de formación de fragmentos controlada por cromatografía de exclusión por tamaño para mAb 39B6-AVE,

39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR a los 56 días

Para los mAb 39B6-AVE, 39B6-ANK y 39B6-ANR, el porcentaje de picos de fragmentos está entre el 0,2 % y el 0,3 % después de 56 días, mientras que para mAb 39B6-AYE el porcentaje de picos de fragmentos es del 5,7 %. Los resultados del % de pico de monómero para todos los mAb se resumen en la Tabla 22.

Tabla 22 Área de monómero (%) controlada por cromatografía de exclusión por tamaño para mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR

SDS-PAGE

Los resultados de SDS-PAGE para el análisis de todos los anticuerpos se muestran en la Tabla 23 y la Figura 8.

Tabla 23 Porcentaje total de Ab de longitud completa/cadena pesada estimada por análisis SDS-PAGE y exploración Odyssey para mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR

No se observó ninguna tendencia hacia la degradación para ninguno de los mAb para la condición de temperatura de 5 °C para las condiciones reductoras y no reductoras.

A 37 °C, todos los mAb mostraron una tasa de degradación similar para la condición no reductora excepto el mAb 39B6-AYE. Este mAb muestra una tasa de degradación similar hasta los 28 días, pero muestra una tasa de degradación más rápida entre el día 28 y el día 56 en comparación con los otros mAb. Para la condición reductora, todos los mAb muestran una tasa de degradación similar.

Afinidad de unión a la diana en Biacore

Las muestras se evaluaron para determinar su actividad de unión a la diana en Biacore al medir la pendiente en cada punto de tiempo. La muestra de referencia se fijó como el 100 % de la actividad. Los resultados para todos los mAb se resumen en la Tabla 24 y la Figura 9.

Tabla 24 Porcentaje de actividad en Biacore para mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR

Para las muestras de mAb almacenadas a 37 °C, solo el anticuerpo 39B6-AYE conservó la actividad de unión a la diana durante el período completo de 56 días. Todos los demás anticuerpos mostraron una disminución significativa en la actividad de unión a la diana durante el período de 56 días cuando se almacenaron a 37 °C.

Concentración de proteínas

La concentración de proteínas de todas las muestras se midió para cada condición en NanoDrop. En la Tabla 25 y la Figura 10, se muestra la concentración de proteínas medida para todos los mAb.

Tabla 25 Concentración de proteínas (mg/ml) para mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-ANR

Resumen y conclusión del estudio de estabilidad de la temperatura

El estudio de estabilidad de la temperatura reveló algunas diferencias significativas entre los cuatro mAb evaluados: se observó una agregación del 4,4 % en SE-HPLC para el mAb 39B6-AVE después de 56 días a 37 °C y una fragmentación del 5,7 % para el mAb 39B6-AYE. Sin embargo, esta fragmentación del mAb 39B6-AYE no afectó la actividad de unión a la diana a 37 °C en Biacore; después de 56 días, seguía siendo tan buena como la muestra de referencia. Mientras tanto, se observó claramente una menor actividad de unión a la diana para los mAb 39B6-AVE, 39B6-ANK y 39B6-ANR a 37 °C después de 56 días.

2.2.2 Estudio de estabilidad de congelación y descongelación

Para controlar la estabilidad de los anticuerpos en condiciones de congelación y descongelación, la configuración fue la siguiente. Se congeló una alícuota de 1 ml de mAb (a 5 mg/ml) durante al menos 6 horas a -20 °C y se descongeló durante 1 hora a temperatura ambiente. Este ciclo se repitió 9x (10 ciclos de congelación y descongelación en total). Las muestras se analizaron mediante inspección visual, SE-HPLC, SDS-PAGE, actividad de unión a la diana en Biacore y concentración de proteínas. Se usaron muestras de referencia almacenadas a -20 °C para todos los análisis en paralelo. Como los mAb 39B6-ANR y 39B6-ANK tienen un posible sitio de desamidación, solo se sometieron a análisis por inspección visual.

Inspección visual

Los resultados de la inspección visual en el estudio de estabilidad de congelación y descongelación se muestran en la Tabla 26. Todos los mAb estaban en PBSTw, lo que debería dar un efecto estabilizador.

Tabla 26 Inspección visual de la estabilidad de congelación y descongelación para mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE,

39B6-ANK y 39B6-ANR

Las puntuaciones promedio para los mAb fueron las siguientes:

39B6-AVE, 39B6-AYE y 39B-ANK: 'muy pocas partículas'; y

39B6-ANR: 'la muestra es transparente, no hay partículas visibles'.

Dos personas calificaron el amortiguador PBSTw como 'muy pocas partículas' y, por lo tanto, es posible que las partículas observadas en las muestras 39B6-AVE, 39B6-AYE y 39B-ANK no estén relacionadas con proteínas. Puede concluirse que todos los mAb permanecen sin cambios después de 10 ciclos de congelación y descongelación.

Análisis por SE-HPLC

La agregación y la fragmentación de proteínas se midieron por SE-HPLC.

Los resultados de agregación de proteínas para el estudio de estabilidad de congelación y descongelación para los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE se resumen en la Tabla 27.

Tabla 27 % de formación de agregados controlada por cromatografía de exclusión por tamaño en la estabilidad de congelación y descongelación para mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE

No se observó ningún cambio en los porcentajes de niveles de agregados para ninguno de los mAb después de 10 ciclos de congelación y descongelación en comparación con las muestras de referencia.

También se examinaron las áreas del pico monomérico para todas las inyecciones diferentes. Los resultados del % de área de monómero para los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE se resumen en la Tabla 28.

Tabla 28 % de área de monómero controlada por cromatografía de exclusión por tamaño en estabilidad de congelación y descongelación para mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE.

No se observó ningún cambio en el % de área de monómero para ambos mAb después de 10 ciclos de congelación y descongelación en comparación con las muestras de referencia.

Análisis por SDS-PAGE

Las muestras congeladas y descongeladas se analizaron en cuanto a su integridad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras y reductoras. Los resultados se muestran en la Tabla 29 y la Figura 11 para mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE.

Tabla 29 Porcentaje total de Ab de longitud completa/cadena pesada estimada por análisis SDS-PAGE y exploración Odyssey en estudio de estabilidad de congelación y descongelación para mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE

No se observaron cambios para ambos mAb después de 10 ciclos de congelación y descongelación.

Análisis de unión a la diana por Biacore

Se evaluó la actividad de unión a la diana de las muestras en Biacore al medir la pendiente después de 10 ciclos de congelación y descongelación. La muestra de referencia se fijó como el 100 % de la actividad. Los resultados para ambos mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE se muestran en la Figura 12.

Los resultados demuestran que después de 10 ciclos de congelación y descongelación no se observa ningún cambio en la actividad de unión a la diana.

Análisis de la concentración de proteínas

La concentración de proteínas de las muestras congeladas y descongeladas se midió en NanoDrop.

En la Tabla 30, se muestra la concentración de proteínas medida para los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE después de 10 ciclos de congelación y descongelación. Además, la Figura 13 muestra estos resultados para ambos mAb.

Tabla 30 Concentración de proteínas (mg/ml) en la estabilidad de congelación y descongelación para mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE

Conclusión

El estudio de estabilidad de congelación y descongelación no reveló ninguna diferencia significativa para los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE evaluados.

2.2.3 Estudio de estabilidad térmica

Para analizar las curvas de fusión, los mAb se calentaron de acuerdo con el siguiente esquema. Después de completar el ciclo térmico en el dispositivo de PCR, se evaluó la afinidad de las muestras en Biacore.

El protocolo usado fue el siguiente:

1) Se almacenaron alícuotas de 1 ml para cada mAb en viales de vidrio a -20 °C al comienzo del estudio.

2) Después de una semana de almacenamiento, se descongelaron una vez

3) Los mAb se diluyeron a 1 mg/ml como de costumbre y luego se diluyeron más a 100 pg/ml (dilución 10x: 200 pl 1800 pl de PBSTw)

4) Los mAb diluidos se dividieron en alícuotas en una placa de PCR (50 pl/pocillo)

5) Mantener suficiente muestra y también muestra a 5 °C como referencia para ser analizada en paralelo 6) 1 h en dispositivo de PCR expuesto a las temperaturas indicadas más abajo

⁷) 2 h en dispositivo de PCR a 25 °C

8) A 4 °C en dispositivo de PCR

9) Preparar las muestras y las referencias para el análisis a 4 pg/ml (dilución 25x: 168 pl de amortiguador Biacore 7 pl de muestra)

Ejecutar el siguiente programa en un dispositivo de PCR de gradiente:

Protocolo para análisis Biacore:

- Se usó el mismo chip CM5, recubierto con ~4000 RU de complejo GARP-TGF-p humano

- Abrir las curvas en el programa de evaluación BIAE y seleccionar el valor '2-1' (1: blanco, 2 hGARP-TGF-p) - Seleccionar una curva a la vez para la superposición de gráficos

- Eliminar la parte de regeneración de la curva.

- Seleccionar 'General Fit' y comenzar desde 120 segundos después de la inyección y terminar en 155 segundos - Para el cálculo de la IC50: La pendiente para las referencias de 5 °C se nivela al 100 %. El porcentaje (eje Y) de las otras temperaturas (eje X) puede calcularse

Se midió la tolerancia térmica de los cuatro mAb y los resultados se resumen en la Figura 14. La temperatura de fusión se calculó como la temperatura a la que el 50 % del anticuerpo sigue siendo funcional. Las muestras de referencia que se mantuvieron a 5 °C se establecieron como el 100 % de la actividad. Las temperaturas de fusión se muestran en la Tabla 31.

Tabla 31 Temperaturas de fusión en el estudio de estabilidad térmica

Los mAb 39B6-ANK y 39B6-ANR mostraron las temperaturas de fusión más altas: 69,13 °C y 68,55 °C, respectivamente. Los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE también dieron buenas temperaturas de fusión, 66,99 °C y 66,53 °C, respectivamente. Todas las temperaturas de fusión para todos los mAb pueden considerarse altas.

Conclusión del estudio de estabilidad térmica

Los cuatro mAb demostraron una buena tolerancia térmica. Las temperaturas de fusión fueron comparables al mAb 39B6-A original en el estudio de estabilidad anterior, 66,8 °C.

2.2.4 Estudio de estabilidad rotacional

Para el estudio de estabilidad rotacional, la configuración fue la siguiente. Se almacenaron alícuotas de 1 ml para cada mAb en viales de vidrio a -20 °C al comienzo del estudio. Después de una semana de almacenamiento, las alícuotas se descongelaron una vez y se rotaron cabeza sobre cabeza a 15 rpm a temperatura ambiente.

Las muestras se calificaron en cuanto a la presencia de partículas en los puntos de tiempo indicados:

- Horario: 0, 3, 6, 24, 30, 48, 54, 72 y 96

Las muestras también se analizaron después de 96 horas mediante SE-HPLC, SDS-PAGE, actividad de unión a la diana en Biacore y concentración de proteínas. Se usaron muestras de referencia almacenadas a -20 °C para todos los análisis en paralelo. Como los mAb 39B6-ANR y 39B6-ANK todavía tienen un posible sitio de desamidación, solo se evaluaron mediante inspección visual.

Inspección visual

Los resultados de la inspección visual en el estudio de estabilidad rotacional se muestran en la Tabla 32. Todos los mAb están en PBSTw, lo que debería dar un efecto estabilizador.

Tabla 32 Inspección visual de estudio de estabilidad rotacional para mAb 39B6-AVE, 39B6-AYE, 39B6-ANK y 39B6-

ANR

Se encontró que todos los mAb tenían una puntuación promedio de 'muy pocas partículas', por lo que permanecen relativamente inalterados después de 96 horas de rotación. El amortiguador PBSTw no contenía ninguna partícula en ninguna de las condiciones experimentales evaluadas. Esto indica que las 'muy pocas partículas' observadas están relacionadas con proteínas en las muestras de anticuerpos.

Análisis por SE-HPLC

La agregación y la fragmentación de proteínas se midieron por SE-HPLC. Los resultados de agregación de proteínas para el estudio de estabilidad rotacional para los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE se muestran en la Tabla 33.

Tabla 33 % de formación de agregados controlada por cromatografía de exclusión por tamaño en estudio de estabilidad rotacional para mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE.

No se observaron cambios en los % de niveles de agregados para los mAb después del estrés rotacional en comparación con las muestras de referencia.

También se examinaron las áreas del pico monomérico para todas las inyecciones diferentes. Los resultados del % de área de monómero para los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE se muestran en la Tabla 34.

Tabla 34 % de área de monómero controlada por cromatografía de exclusión por tamaño en estudio de estabilidad rotacional para mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE

No se observó ningún cambio en el % de área de monómero para ninguno de los mAb después de 96 horas de rotación en comparación con las muestras de referencia.

Para ambos anticuerpos, no se observó ningún cambio en el perfil de SE-HPLC después de 96 horas de rotación en comparación con las muestras de referencia.

Análisis por SDS-PAGE

Se analizó la integridad de las muestras de rotación mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras y reductoras. Los resultados para los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE se resumen en la Tabla 35.

Tabla 35 Porcentaje total de Ab de longitud completa/cadena pesada estimada por análisis SDS-PAGE y exploración Odyssey en estudio de estabilidad rotacional para mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE

El gel SDS-PAGE para ambos mAb después de 96 horas de rotación puede verse en la Figura 15.

No se observaron cambios para ninguno de los anticuerpos después de 96 horas de rotación.

Análisis para la unión a la diana en Biacore

Las muestras se evaluaron para determinar su actividad de unión a la diana en Biacore al medir la pendiente después de 96 horas de rotación. La muestra de referencia se fijó como el 100 % de la actividad. Los resultados para los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE se muestran en la Figura 16.

Análisis de concentración de proteínas

La concentración de proteínas de las muestras rotacionales se midió en NanoDrop.

En la Tabla 36, se muestra la concentración de proteínas medida para los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE después de 96 horas de rotación. Además, la Figura 17 muestra estos resultados para ambos mAb.

Tabla 36 Concentración de proteínas (mg/ml) en estabilidad rotacional para mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE

No se observó pérdida de proteínas para ninguno de los mAb después de 96 horas de rotación.

Conclusión del estudio de estabilidad rotacional

El estudio de estabilidad rotacional no reveló ninguna diferencia entre los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE evaluados.

2.2.5 Análisis de secuencias primarias mediante mapeo de péptidos

Las muestras del estudio de temperatura, congelación y descongelación y estabilidad rotacional se analizaron mediante el uso de la metodología RP-HPLC-UV-MS de mapeo de péptidos trípticos para identificar modificaciones (desamidación, isomerización y oxidación) a nivel de proteína (péptido).

La desamidación en la CDR3 de la cadena pesada en las posiciones 95-96 (aminoácidos NE) se eliminó por ingeniería genética en los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE por mutación de la posición N95. Este sitio de desamidación todavía está presente en los mAb 39B6-ANK y 39B6-ANR y se detectó una desamidación/isomerización significativa después de 28 días a 5 °C y 37 °C en el estudio de estabilidad de temperatura y también en el estudio de estabilidad rotacional y de congelación y descongelación. Se llegó a la conclusión de que la desamidación no podía evitarse mediante la introducción de residuos voluminosos cargados positivamente secuencia abajo de N95.

En la posición 100f de la CDR3 de la cadena pesada hay una metionina que es esencial para una alta afinidad de unión. Los estudios de temperatura, congelación y descongelación y estabilidad rotacional han demostrado que la oxidación de M100f no ocurre en los mAb 39B6-AYE y 39B6-ANK, mientras que la oxidación todavía se observa en los mAb 39B6-AVE y 39B6-ANR. Esto demuestra que los aminoácidos en las posiciones 95 y 96 influyen en la sensibilidad hacia la oxidación de la metionina secuencia abajo. La Tabla 37 muestra una descripción general de los niveles de oxidación y desamidación de péptidos que cubren la CDR3 de la cadena pesada, que se generaron mediante digestión con tripsina.

Tabla 37 Grado de oxidación y desamidación de péptidos dentro de la CDR3 de la cadena pesada

La cantidad relativa de desamidación e isomerización de N95 y la actividad de unión relativa de las variantes almacenadas a 37 °C se muestran en la Figura 18. También se muestra el 39B6-A original en la figura (etiquetado como 39B6-ANE). Debido a que N95 se ha mutado en los mAb 39B6-AVE y 39B6-AYE, los niveles de desamidación e isomerización son cero y, por lo tanto, no se incluyen. La correlación entre la desamidación de N95 y la menor actividad de unión a la diana observada para los mAb 39B6-ANK y 39B6-ANR sugiere que la desamidación de N95 afecta negativamente la unión del mAb a su diana.

Conclusión

La variante de anticuerpo contra GARP-TGF-p1 39B6-AYE es un anticuerpo contra GARP-TGF-p1 particularmente bueno para el desarrollo clínico porque:

- Conserva la unión con alta afinidad a su diana, el complejo GARP-TGF-p1;

- Muestra buena potencia en el ensayo de fosforilación SMAD2;

- No sufre desamidación o isomerización en CDR3

- No sufre oxidación en CDR3

- Muestra alta homología humana (95 %)

- Muestra una estabilidad mejorada en comparación con 39B6-A, según lo medido por diferentes ensayos de estabilidad.

Las secuencias de dominio variable y CDR para 39B6-AYE se muestran en las Tablas 38 y 39 más abajo. Las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera de longitud completa se muestran en la Tabla 40. Las secuencias de polinucleótidos que codifican los dominios VH y VL y las cadenas pesada y ligera de longitud completa se muestran en la Tabla 41.

Tabla 38 Secuencias de CDR de VH y VL para 39B6-AYE

Tabla 39 Secuencias de dominios VH y VL para 39B6-AYE

Tabla 40 Secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera para 39B6-AYE

Tabla 41 Secuencias de polinucleótidos que codifican 39B6-AYE

Ejemplo 3 Prueba por lotes de 39B6-AYE (ARGX-115)

Se evaluó la estabilidad del lote de sustancia farmacológica piloto de ARGX-115 durante un período de tres meses. Las muestras de prueba del lote de sustancia farmacológica piloto se almacenaron en la condición de almacenamiento prevista de -70 °C, en la condición de almacenamiento acelerado de 5 °C y en la condición de almacenamiento estresado de 25 °C. La sustancia farmacológica piloto se presentó en la formulación: histidina/clorhidrato de histidina 10 mM, sacarosa 200 mM, arginina 40 mM, polisorbato 80 al 0,03 % (p/v) a pH 6,0 y una concentración de proteínas de 20,0 2,0 mg/ml.

Se confirmó que el lote de sustancia farmacológica piloto de ARGX-115 es estable durante tres meses cuando se almacena en las condiciones de almacenamiento previstas de -70 °C. La actividad de unión a SPR también se determinó como una medida de la estabilidad. La actividad de unión se expresó como un porcentaje de la actividad de unión de la muestra de referencia que se mantuvo a -70 °C.

Los resultados se muestran en la Tabla 42 más abajo.

Estos resultados confirman que ARGX-115 es estable durante un período de almacenamiento prolongado.

Ejemplo 4 Caracterización de la unión de ARGX-115 al complejo GARP-TGF-p

4.1 El TGF-p maduro es esencial para la unión de ARGX-115

En la naturaleza, el complejo GARP-TGF-p (GARP en complejo con TGF-p latente) se forma en el retículo endoplásmico con interacciones covalentes de cisteína (puentes disulfuro) entre GARP y TGFp latente. Este complejo luego se muestra en la superficie celular. In vitro, el complejo GARP-TGF-p puede formarse a partir de GARP humano recombinante y TGF-p latente humano recombinante (C33S)-3xstrep-tag. La forma mutante C33S de TGF-p latente no forma las interacciones covalentes con GARP (o cualquiera de las proteínas de unión a TGF-p latente (LTBP)) como las que están presentes en el complejo nativo.

Para demostrar la unión de ARGX-115 al complejo formado in vitro de GARP recombinante y TGFp latente recombinante (C33S), se recubrió GARP recombinante en una placa ELISA (1 ^g/ml de GARP humano O/N a 4 °C),

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a un complejo de GARP y TGF-p1 humano, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH), en donde:

la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos SYYID (SEQ ID NO: 4); y

un dominio variable de la cadena ligera (VL), en donde:

la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos QQYASVPVT (SEQ ID NO: 11), la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos GASRLKT (SEQ ID NO: 10), y la CDR1 de VL comprende la secuencia de aminoácidos QASQSISSYLA (SEQ ID NO: 9).

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dominio variable de la cadena pesada (VH) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y el dominio variable de la cadena ligera (VL) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende el dominio CH1, la región bisagra, el dominio c H2 y/o el dominio CH3 de una IgG humana.

4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la IgG humana es IgG1.

5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la IgG humana es IgG4.

6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la IgG4 humana tiene la sustitución S228P en el dominio CH3.

7. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, 5 o 6, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

8. Uno o más polinucleótidos aislados que codifican:

(i) el dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7 y

(ii) el dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7

9. Uno o más polinucleótidos aislados:

(i) que codifican la cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, y que comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 18; y

(ii) que codifican la cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, y que comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 19.

10. Uno o más vectores de expresión que comprenden el(los) polinucleótido(s) de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 unidos operativamente a secuencias reguladoras que permiten la expresión del anticuerpo en una célula huésped o en un sistema de expresión sin células.

11. Una célula huésped o un sistema de expresión sin células que contiene el o los vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Un método para producir un anticuerpo recombinante que comprende cultivar la célula huésped o el sistema de expresión sin células de acuerdo con la reivindicación 11 en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo y recuperar el anticuerpo expresado.