ES2913497T3 - Variantes de GM-CSF y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Una variante de GM-CSF aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 7, 8 o 9.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de GM-CSF y métodos de uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a variantes de GM-CSF, polinucleótidos sintéticos que las codifican y métodos para elaborar y usar lo anterior.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un trastorno de etiología desconocida caracterizado típicamente por diarrea, calambres, dolores abdominales, pérdida de peso y sangrado rectal, cansancio, anemia, fístulas, perforaciones, obstrucción del intestino y necesidad frecuente de intervención quirúrgica. De acuerdo con el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos aproximadamente 1,4 millones de personas en los Estados Unidos padecen EII, lo que la convierte en una de las enfermedades gastrointestinales más prevalentes en los Estados Unidos. Se estima que el coste total de atención médica de la EII en los Estados Unidos es de más de 1,7 mil millones de US$ al año.

Una serie de trastornos se encuentran dentro de la clase de EII, incluyendo la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la colitis indeterminada, la colitis microscópica y la colitis colágena. Las formas más comunes de EII son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La colitis ulcerosa afecta al intestino grueso (colon) y el recto e implica el revestimiento interno (por ejemplo, la capa mucosa y submucosa) de la pared intestinal. La enfermedad de Crohn puede afectar a cualquier sección del tracto gastrointestinal (por ejemplo, boca, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, recto, ano, etc.) y puede implicar a todas las capas de la pared intestinal. Los síntomas clínicos de la EII incluyen sangrado rectal y/o intestinal, dolor y calambres abdominales, diarrea y pérdida de peso. Además, la EII es un factor de riesgo para el cáncer de colon, y este riesgo de cáncer de colon aumenta significativamente después de ocho a diez años de EII.

La EII no tiene cura. Las terapias actuales están dirigidas a reducir el proceso inflamatorio y los efectos perjudiciales del proceso inflamatorio asociados con la enfermedad, e incluyen la administración de fármacos antiinflamatorios (por ejemplo, APRISO® (mesalamina), AZULFIDINE® (sulfasalazina), REMICADE® (infliximab), HUMIRA® (adalimumab), prednisona, budesonida) y de fármacos inmunosupresores (por ejemplo, 6-mercaptopurina, azatioprina, ciclosporina). Tales terapias pueden estar asociadas con efectos secundarios adversos como náuseas, vómitos, anorexia, dispepsia, malestar general, dolores de cabeza, dolor abdominal, fiebre, sarpullidos, pancreatitis, supresión de la médula ósea, formación de anticuerpos, reacciones a la infusión y aumento de infecciones oportunistas.

Por lo tanto, hay una necesidad de terapias adicionales para la EII.

Heinzelman et al. (Biotechnol Prog, 2015; 31(3): 668-677) analizan la construcción de variantes de GM-CSF SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una variante de GM-CSF aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 7, 8 o 9.

La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la variante de GM-CSF de la invención.

La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la invención.

La invención también proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la invención. La invención también proporciona una célula huésped que comprende el vector de la invención.

La invención también proporciona una célula huésped que comprende el vector de expresión de la invención.

La invención también proporciona un método para producir la variante de GM-CSF de la invención, que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones en las que se expresa la variante de GM-CSF y purificar la variante de GM-CSF.

La invención también proporciona un kit que comprende la variante de GM-CSF de la invención.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la variante de GM-CSF de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona una variante de GM-CSF de la invención para su uso en un método para tratar una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) en un sujeto con necesidad de ello.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra la estructura del GM-CSF humano (PDB: 2GMF (Rozwarski et al., 1996)) que muestra los residuos considerados para ingeniería para mejorar la estabilidad del GM-CSF.

La Figura 2A muestra los alineamientos de secuencias de aminoácidos entre varias variantes de GM-CSF de los residuos 1-60. El número al comienzo de la fila indica la SEQ ID NO: de la secuencia de aminoácidos.

La Figura 2B muestra los alineamientos de secuencias de aminoácidos entre varias variantes de GM-CSF de los residuos 61-127. El número al comienzo de la fila indica la SEQ ID NO: de la secuencia de aminoácidos.

La Figura 3 muestra la estabilidad de las variantes de GM-CSF S29C/S69C, L49P, S29C/S69C/K107I y S29C/S69C/R23L/L49P/K107I a lo largo del tiempo (1, 10 y 30 minutos como se indica en la Figura) en fluido intestinal simulado en ayunas (FaSSIF) con 3 mg/ml de pancreatina. C: control.

La Figura 4A muestra que la actividad biológica de las variantes de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I y S29C/L49P/S69C/K107I se conservó después de 30 minutos de incubación con FaSSIF suplementado con 3 mg/ml de pancreatina, mientras que la actividad biológica del GM-CSF de tipo salvaje se anuló por completo. PP1A7: GM-CSF de tipo salvaje, GSFD96: variante R23L/S29C/L49P/S69C/K1071; GSFD97: variante S29C/L49P/S69C/K107I. La actividad biológica se midió en células TF-1 evaluando el porcentaje (%) de fosforilación de Tyr694 de STAT5 y se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF usada en los ensayos.

La Figura 4B muestra que la actividad biológica de las variantes de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I y S29C/L49P/S69C/K107I se conservaron después de 1 hora de incubación con FaSSIF suplementado con 3 mg/ml de pancreatina a niveles comparables a los del GM-CSF de tipo salvaje sin FaSSIF+pancreatina. PP1A7: GM-CSF de tipo salvaje, GSFD96: variante R23L/S29C/L49P/S69C/K1071; GSFD97: variante S29C/L49P/S69C/K107I. La actividad biológica se midió en células TF-1 evaluando el porcentaje (%) de fosforilación de Tyr694 de STAT5 y se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF usada en los ensayos.

La Figura 4C muestra que la actividad biológica de la variante de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I se conservó después de 4 horas de incubación con FaSSIF suplementado con 3 mg/ml de pancreatina a niveles comparables a los del GM-CSF de tipo salvaje sin FaSSIF+pancreatina y que la variante S29C/L49P/ S69C/K107I demuestra cierta actividad en este momento. PP1A7: GM-CSF de tipo salvaje, GSFD96: variante R23L/S29C/L49P/S69C/K107I; GSFD97: variante S29C/L49P/S69C/K107I. La actividad biológica se midió en células TF-1 evaluando el porcentaje (%) de fosforilación de Tyr694 de STAT5 y se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF usada en los ensayos.

La Figura 4D muestra que la actividad biológica de la variante de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I se conservó después de 6 horas de incubación con FaSSIF suplementado con 3 mg/ml de pancreatina. PP1A7: GM-CSF de tipo salvaje, GSFD96: variante R23L/S29C/L49P/S69C/K107I; GSFD97: variante S29C/L49P/S69C/K107I. La actividad biológica se midió en células TF-1 evaluando el porcentaje (%) de fosforilación de Tyr694 de STAT5 y se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF usada en los ensayos.

La Figura 5A muestra que la actividad biológica de las variantes de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I y S29C/L49P/S69C/K107I se conservó después de la incubación durante 30 minutos con contenido de colon de monos cynomolgus no tratados (CC), mientras que la actividad biológica del GM-CSF de tipo salvaje se anuló casi completamente. PP1A7: G^m -CSF de tipo salvaje, GSFD96: variante R23L/S29^c /^l49P/^s69C/K1071; GSFD97: variante S29C/L49P/S69C/K107I. La actividad biológica se midió en células TF-1 evaluando el porcentaje (%) de fosforilación de Tyr694 de STAT5 y se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF usada en los ensayos.

La Figura 5B muestra que la actividad biológica de las variantes de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I y S29C/L49P/S69C/K107I se conservó después de la incubación durante 2 horas con contenido de colon de monos cynomolgus no tratados (CC). PP1A7: GM-CSF de tipo salvaje, GSFD96: variante R23L/S29C/L49P/S69C/107I; GSFD97: variante S29C/L49P/S69C/K107I. La actividad biológica se midió en células TF-1 evaluando el porcentaje (%) de fosforilación de Tyr694 de STAT5 y se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF usada en los ensayos.

La Figura 5C muestra que la actividad biológica de la variante de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I se conservó después de la incubación durante 6 horas con contenido de colon de monos cynomolgus no tratados (CC). La variante R23L/S29C/L49P/S69C/K107I de GM-CSF mostró una pérdida de actividad de 5 veces en comparación con la variante de citoquina no tratada, mientras que la actividad de GM-CSF de tipo salvaje se eliminó por completo. PP1A7: GM-CSF de tipo salvaje, Gs Fd96: variante R23L/S29C/L49P/S69C/K1071; GSFD97: variante S29C/L49P/S69C/K107I. La actividad biológica se midió en células TF-1 evaluando el porcentaje (%) de fosforilación de Tyr694 de STAT5 y se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF usada en los ensayos.

La Figura 5D muestra que la actividad biológica de GM-CSF y sus variantes S29C/L49P/S69C/K107I y R23L/S29C/L49P/S69C/107I se eliminó después de la incubación durante 24 horas con contenido de colon de monos cynomolgus no tratados (CC). PP1A7: GM-CSF de tipo salvaje, GSFD96: variante R23L/S29C/L49P/S69C/107I; GSFD97: variante S29C/L49P/S69C/K107I. La actividad biológica se midió en células TF-1 evaluando el porcentaje (%) de fosforilación de Tyr694 de STAT5 y se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF usada en los ensayos.

La Figura 6 muestra la secuencia consenso de variantes de GM-CSF que tienen mutaciones S29C y S69C. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se usa en la presente y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier composición y método similar o equivalente a los descritos en la presente puede usarse en la puesta en práctica o prueba de la invención, en la presente se describen composiciones y métodos ejemplares.

“Polinucleótido” se refiere a una molécula que comprende una cadena de nucleótidos enlazados covalentemente por una estructura principal de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. El ADN y el ARN de cadena doble y sencilla son ejemplos típicos de polinucleótidos.

"Polipéptido" o "proteína" se refiere a una molécula que comprende por lo menos dos residuos de aminoácidos enlazados por un enlace peptídico para formar un polipéptido.

"Péptido" se refiere a un polipéptido corto de hasta 30 aminoácidos de longitud.

"Vector" se refiere a un polinucleótido capaz de ser duplicado dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos de vector típicamente contienen elementos como orígenes de replicación, señales de poliadenilación o marcadores de selección que funcionan para facilitar la duplicación o el mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico como una célula, un virus, un animal, una planta y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido de vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de éstas, de cadena sencilla o de cadena doble.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que puede utilizarse en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.

"Secuencia complementaria" se refiere a una segunda secuencia de polinucleótidos aislada que es antiparalela a una primera secuencia de polinucleótidos aislada y que comprende nucleótidos complementarios a los nucleótidos de la primera secuencia de polinucleótidos.

“Aproximadamente” significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor según se determina por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. A menos que se indique explícitamente lo contrario en los Ejemplos o en otra parte de la Memoria descriptiva en el contexto de un ensayo, resultado o realización particular, "aproximadamente" significa dentro de una desviación estándar según la práctica en la técnica, o un intervalo de hasta el 5% lo que sea más grande

"Muestra" se refiere a una colección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, así como fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Las muestras ejemplares son fluidos biológicos como sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, saliva, fluido quístico, lágrimas, heces, esputo, secreciones mucosales de los tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, fluidos de ascitis, fluidos de la cavidades pleurales, pericárdicas, peritoneales, abdominales y otras cavidades corporales, fluidos recogidos mediante lavado bronquial, líquido sinovial, soluciones líquidas en contacto con un sujeto o fuente biológica, por ejemplo, medios de cultivo de células y órganos, incluyendo medios acondicionados de células u órganos, fluidos de lavado y similares, biopsias de tejido, aspiraciones con aguja fina o tejido resecado quirúrgicamente.

"En combinación con" significa que se administran dos o más agentes terapéuticos a un sujeto juntos en una mezcla, concurrentemente como agentes individuales o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.

"Sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. "Animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, gallinas, anfibios, reptiles, etc. Excepto cuando se indique lo contrario, los términos "paciente" y " sujeto" se usan indistintamente.

"Variante" se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido de referencia o un polinucleótido de referencia en una o más modificaciones, por ejemplo, una o más sustituciones, inserciones o deleciones. Por ejemplo, la variante difiere de un polipéptido de GM-CSF maduro de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1 o del polinucleótido que codifica el GM-CSF maduro de tipo salvaje que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 18 en uno o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos.

"Aislado" se refiere a una población homogénea de moléculas (como polinucleótidos sintéticos o polipéptidos sintéticos) que se han separado y/o purificado sustancialmente de otros componentes del sistema en el que se producen las moléculas, como una célula recombinante, así como una proteína que ha sido sometida por lo menos a un paso de purificación o aislamiento. "Variante de GM-CSF aislada" se refiere a una variante de GM-CSF que está sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos y abarca variantes que se aíslan con mayor pureza, como un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% puro.

"Enfermedad inflamatoria intestinal (EII)" se refiere a un trastorno o enfermedad caracterizado por actividad inflamatoria en el tracto GI. La EII incluye, pero no se limita a, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la enfermedad de Johne, el síndrome de Behpet, la colitis colágena, la colitis por derivación, la colitis indeterminada, la colitis microscópica, la colitis infecciosa, la colitis isquémica, la colitis linfocítica, la inflamación idiopática del intestino delgado y/o proximal, diarrea relacionada con la EII y enfermedades y trastornos estrechamente relacionados del tracto gastrointestinal.

A lo largo de la especificación, los residuos que están sustituidos en las variantes de GM-CSF se numeran de acuerdo con su posición en el GM-CSF de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, "S29C" en la memoria descriptiva se refiere a la sustitución de serina en la posición del residuo que corresponde a la posición 29 en el GM-CSF de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1 con cisteína.

En la Tabla 1 se muestran las abreviaturas de los aminoácidos naturales como se usan en la presente.

Tabla 1.

Composiciones de materia

Las variantes del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) de la presente invención tienen una estabilidad y/o actividad biológica mejoradas en comparación con el GM-CSF de tipo salvaje. Las variantes de GM-CSF de la presente invención tienen una estabilidad mejorada en el entorno que imita el del tracto gastrointestinal. Por lo tanto, las variantes de GM-CSF de la presente invención pueden ser adecuadas para administración oral.

Las variantes de GM-CSF de la invención pueden usarse en el tratamiento terapéutico de sujetos que tienen enfermedad inflamatoria intestinal (EII) u otras enfermedades o afecciones en las que se desea potenciar la actividad de GM-CSF. Los polinucleótidos, vectores y líneas celulares de la invención son útiles para generar las variantes de GM-CSF de la invención.

El GM-CSF es un regulador clave de la inmunidad innata intestinal (Dabritz, 2014) y desempeña un papel en el mantenimiento de la integridad de la barrera intestinal. Evidencias recientes demuestran que el GM-CSF entérico también está implicado en el mantenimiento de la tolerancia en la mucosa (Mortha et al., 2014). En algunos pacientes con enfermedad de Crohn (CD), se ha planteado la hipótesis de que la etiología es una desregulación del sistema inmunitario innato, específicamente insuficiencia de la función de los neutrófilos y de otras células inmunitarias sensibles a GM-CSF (Korzenik & Dieckgraefe, 2000).

Se ha probado en la clínica la administración sistémica de GM-CSF para determinar la capacidad de inducir la remisión en pacientes con CD (Dieckgraefe & Korzenik, 2002; Kelsen et al., 2010; Korzenik, 2005; Vaughan & Drumm, 1999). A pesar de algunos resultados clínicos iniciales prometedores, se encontraron algunos eventos adversos en el grupo de tratamiento con GM-CSF en un ensayo de fase II de CD (Valentine et al., 2009). Además, el aumento documentado del riesgo de trombosis y trastornos pulmonares en pacientes con EII (Bernstein, Blanchard, Houston & Wajda, 2001; Bernstein, Wajda & Blanchard, 2008) también puede verse exacerbado por la terapia sistémica con GM-CSF.

El GM-CSF administrado por vía oral para la administración GI local podría resultar más deseable desde el punto de vista del cumplimiento del paciente, así como desde una perspectiva de seguridad al minimizar la exposición sistémica. Sin embargo, la administración oral de proteínas al tracto gastrointestinal inferior presenta desafíos debido a los entornos microbianos, proteolíticos y de pH severo a los que estaría expuesto el fármaco biológico (Amidon, Brown y Dave, 2015). De hecho, se ha demostrado que los factores de crecimiento del haz de cuatro hélices similares a los de GM-CSF son degradados rápidamente por las proteasas digestivas in vitro (Jensen-Pippo, Whitcomb, DePrince, Ralph y Habberfield, 1996).

Se espera que las variantes de GM-CSF que tienen una T^m más alta (por ejemplo, estabilidad térmica aumentada) tengan una resistencia mejorada a la proteólisis, como está bien establecido que una estabilidad térmica mejorada se traduce generalmente en una resistencia a la proteólisis mejorada (Akasako, Haruki, Oobatake y Kanaya, 1995; Daniel, Cowan, Morgan y Curran, 1982; McLendon y Radany, 1978; Parsell y Sauer, 1989).

Las variantes de GM-CSF que tienen un valor de EC⁵⁰ más bajo por su efecto en la inducción de la proliferación celular de TF-1 en comparación con el GM-CSF de tipo salvaje son activadores más potentes de las vías de señalización de GM-CSF.

La sustitución en la posición del residuo de aminoácidos correspondiente al residuo R23 de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución R23L.

La sustitución en la posición del residuo de aminoácidos correspondiente al residuo L49 de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución L49P.

La sustitución en la posición del residuo de aminoácidos correspondiente al residuo K107 de la SEQ ID NO: 1 es una sustitución K107I.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF comprende la sustitución S29C, la sustitución S69C y la sustitución K107I. Estas sustituciones mejoran la estabilidad térmica y la potencia de la variante de GM-CSF.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF comprende la sustitución S29C, la sustitución S69C, la sustitución L49P y la sustitución K107I. Estas sustituciones mejoran la estabilidad térmica y la potencia de la variante de GM-CSF. Además, la sustitución L49P elimina un epítopo de clase II de MHC potencial y por lo tanto las variantes de GM-CSF con la sustitución L49P pueden ser menos inmunogénicas.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF comprende la sustitución S29C, la sustitución S69C, la sustitución R23L, la sustitución L49P y la sustitución K107I. Estas sustituciones mejoran la estabilidad térmica y la potencia de la variante de GM-CSF. Además, la sustitución L49P elimina un epítopo de clase II de MHC potencial y, por lo tanto, las variantes de GM-CSF con la sustitución L49P pueden ser menos inmunogénicas.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 12.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 15.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 16.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 17.

Las variantes de GM-CSF de la invención pueden obtenerse de polinucleótidos que codifican las variantes de GM-CSF mediante el uso de sistemas de expresión libres de células como sistemas de expresión basados en lisados de reticulocitos o mediante sistemas de expresión recombinantes estándar. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las variantes de GM-CSF pueden sintetizarse usando la síntesis química de genes de acuerdo con los métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos N° US6521427 y US6670127, utilizando oligonucleótidos degenerados para generar las variantes deseadas, o mediante mutagénesis y clonación por PCR estándar. Los polinucleótidos que codifican las variantes de GM-CSF pueden clonarse en vectores de expresión y expresarse usando procedimientos estándar. El GM-CSF expresado puede purificarse usando, por ejemplo, intercambio aniónico CaptoQ, resina Capto Phenyl HIC e intercambio aniónico DEAE. Las variantes de GM-CSF generadas pueden probarse para determinar su estabilidad térmica y potencia usando los ensayos descritos, por ejemplo, en el Ejemplo 1.

Fracciones que prolongan la vida media

La invención también proporciona una variante de GM-CSF conjugada con una fracción que prolonga la vida media.

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media es una albúmina de suero humano (HAS), una variante de la albúmina de suero humano, como una variante C34S, una transtiretina (TTR), una globulina de unión a tiroxina (TGB), un dominio de unión a albúmina, o una Fc o fragmentos de la misma. La fracción que prolonga la vida media puede conjugarse con el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de la variante de GM-CSF.

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media se conjuga con el extremo N-terminal de GM-CSF.

En algunas realizaciones, la Fc es un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media es una variante C34S de HSA conjugada con el extremo N-terminal de GM-CSF.

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media es una variante C34S de HSA conjugada con el extremo N-terminal de GM-CSF a través de un conector de la SEQ ID NO: 23.

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media es una variante C34S de HSA conjugada con el extremo N-terminal de GM-CSF a través de un conector de la SEQ ID NO: 27.

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media es una Fc conjugada con el extremo N-terminal de GM-CSF.

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media es una Fc conjugada con el extremo N-terminal de GM-CSF a través de un conector de la SEQ ID NO: 23.

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media es una Fc conjugada con el extremo N-terminal de GM-CSF a través de un conector de la SEQ ID NO: 27.

En algunas realizaciones, el conector comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30.

En algunas realizaciones, la Fc comprende por lo menos una sustitución. Pueden hacerse sustituciones de Fc a la Fc para modular las funciones efectoras y las propiedades farmacocinéticas de la variante de GM-CSF conjugada con la Fc.

Las posiciones de Fc que pueden sustituirse para modular la vida media de una molécula que contiene Fc son las descritas, por ejemplo, en Dall'Acqua et al., (2006) J Biol Chem 281:23514-240, Zalevsky et al., (2010) Nat Biotechnol 28:157-159, Hinton et al., (2004) J Biol Chem 279(8):6213-6216, Hinton et al., (2006) J Immunol 176:346-356, Shields et al.(2001) J Biol Chem 276:6591-6607, Petkova et al., (2006). Int Immunol 18:1759-1769, Datta-Mannan et al., (2007) Drug Metab Dispos, 35:86-94, 2007, Vaccaro et al., (2005) Nat Biotechnol 23:1283-1288, Yeung et al., (2010) Cancer Res, 70:3269-3277 y Kim et al., (1999) Eur J Immunol 29: 2819, e incluyen las posiciones 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 y 435. Las sustituciones ejemplares que pueden realizarse individualmente o en combinación son las sustituciones T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A y H435R. Las sustituciones singulares o en combinación ejemplares que pueden realizarse para aumentar la vida media de la molécula que contiene Fc son las sustituciones M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A y T307A/E380A/N434A. Las sustituciones singulares o en combinación ejemplares que pueden realizarse para reducir la vida media de la molécula que contiene Fc son las sustituciones H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A y H435R.

En algunas realizaciones, la Fc comprende por lo menos una sustitución que reduce la unión de la molécula que contiene Fc a un receptor de F^cy activador (FcyR) y/o reduce las funciones efectoras mediadas por Fc.

Las posiciones de Fc que pueden sustituirse para reducir la unión de la molécula que contiene Fc al FcyR activador y posteriormente para reducir la función efectora son las descritas, por ejemplo, en Shields et al, (2001) J Biol Chem 276:6591-6604, Publicación de Patente Internacional N° WO2011/066501, Patentes de Estados Unidos N° 6.737.056 y 5.624.821, Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26, Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-1543, Bolt et al., (1993) Eur J Immunol 23:403-411, Cole et al., (1999) Transplantation, 68:563-571, Rother et al., (2007) Nat Biotechnol 25:1256-1264, Ghevaert et al., (2008) J Clin Invest 118:2929-2938, An et al., (2009) mAbs, 1:572-579) e incluyen las posiciones 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 y 365. Las sustituciones ejemplares que pueden realizarse individualmente o en combinación son las sustituciones K214T, E233P, L234V, L234A, deleción de G236, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S y P331S en IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Las sustituciones de combinación ejemplares que dan como resultado moléculas que contienen Fc con funciones efectoras reducidas son las sustituciones L234A/L235A en IgG1, V234A,/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S en IgG2, F234A/L235A en IgG4, S228P/F234A/ L235A en IgG4, N297A en todos los isotipos de Ig, V234A/G237A en IgG2, K214T/E233P/L234V/L235A/G236-eliminada/A327G/P331A/D365E/L358M en IgG1, H268Q/V309L/A330S/P331S en IgG2, S267E/L328F en IgG1, L234F/L235E/D265A en IgG1, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S en IgG1, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S en IgG4, y S228P/F234A/L235A/G236-deleted/G237A/P238S en IgG4. También pueden usarse dominios de Fc de IgG2/4 híbridos, como Fc con los residuos 117-260 de IgG2 y los residuos 261­ 447 de IgG4.

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media se conjuga con la variante de GM-CSF a través de un conector polipeptídico. Los conectores adecuados son, por ejemplo, los conectores que se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4.

(continuación)

En algunas realizaciones, la fracción que prolonga la vida media es un etilenglicol, una molécula de polietilenglicol (PEG) como PEG5000 o PEG20000, un dextrano, una polilisina, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares, polilisina, octano o carbohidratos (dextrano, celulosa, oligosacáridos o polisacáridos. Estar faccriones pueden dirigir fusiones con la variante de GM-CSF y pueden generarse mediante técnicas estándar de clonación y expresión. Alternativamente, para unir las fracciones a la variante de GM-CSF de la invención pueden usarse métodos de acoplamiento químico bien conocidos.

Polinucleótidos, vectores y células huésped

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican las variantes de GM-CSF de la invención. El polinucleótido puede ser un ácido desoxinucleico complementario (ADNc) y puede tener codones optimizados para la expresión en un huésped adecuado. La optimización de codones es una tecnología bien conocida.

En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica la variante de GM-CSF comprende la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 12, 15, 16 o 17.

Las secuencias de polinucleótidos que codifican las variantes de GM-CSF de la invención pueden enlazarse operativamente con uno o más elementos reguladores, como un promotor o potenciador, que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped deseada. El polinucleótido puede ser ADNc.

La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido que codifica la variante de GM-CSF de la invención.

La invención también proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido que codifica la variante de GM-CSF de la invención.

La invención también proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 12.

La invención también proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 15.

La invención también proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 16.

La invención también proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 17.

Tales vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores víricos, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción del polinucleótido sintético de la invención en un organismo o trasfondo genético dado por cualquier medio. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las variantes de GM-CSF de la invención, opcionalmente conjugados con una fracción que prolonga la vida media, se insertan en vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican las cadenas de inmunoglobulina pueden enlazarse operativamente a secuencias de control en el vector o vectores de expresión que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Tales secuencias de control incluyen secuencias señal, promotores (por ejemplo, promotores heterólogos o asociados de manera natural), elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción, y se eligen para que sean compatibles con la célula huésped elegida para expresar el anticuerpo. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las proteínas codificadas por los polinucleótidos incorporados.

Los vectores de expresión adecuados son típicamente replicables en los organismos huésped como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección como resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

Los elementos promotores y potenciadores adecuados son conocidos en la técnica. Para la expresión en una célula eucariota, los promotores ejemplares incluyen elementos promotores y potenciadores de genes de inmunoglobulina de cadena ligera y/o pesada, promotor temprano inmediato del citomegalovirus, promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple, promotores tempranos y tardíos del SV40, promotor presente en repeticiones terminales largas de un retrovirus, promotor de metalotioneína-I de ratón, promotor inducible por tetraciclina y varios promotores específicos de tejidos conocidos en la técnica. La selección del vector y promotor apropiados es bien conocida.

Un promotor ejemplar que puede usarse comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31 y puede estar codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 32.

SEQ ID NO: 31

MAWVWTLLFLMAAAQSIQA SEQ ID NO: 32

ATGGCCTGGGTGTGGACCCTGCTGTTCCTGATGGCCGCCGCCCAGAGCAT

CCAGGCC

Se conocen grandes cantidades de vectores y promotores adecuados. Muchos están disponibles comercialmente para generar constructos recombinantes. Ejemplos de vectores son vectores bacterianos pBs, phagescript, PsiXl74, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), y vectores eucariotas pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL (Pharmacia), pEE6.4 (Lonza) y pEE12.4 (Lonza). Los promotores ejemplares incluyen elementos promotores y potenciadores de genes de inmunoglobulina de cadena ligera y/o pesada, promotor temprano inmediato de citomegalovirus, promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple, promotores temprano y tardío de SV40, promotor presente en repeticiones terminales largas de un retrovirus, promotor de metalotioneína-I de ratón, promotor inducible por tetraciclina y varios promotores específicos de tejidos conocidos en la técnica. La selección del vector y promotor apropiados es bien conocida.

La invención también proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. "Célula huésped" se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector. Se entiende que el término célula huésped se refiere no sólo a la célula objeto particular sino también a la progenie de tal célula, y también a una línea celular estable generada a partir de la célula objeto particular. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser idéntica a la célula original, pero todavía está incluida dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente. Tales células huésped pueden ser células eucariotas, células procariotas, células vegetales o células arqueales. Escherichia coli, bacilos, como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, como Salmonella, Serratia, y varias especies de Pseudomonas son ejemplos de células huésped procariotas. Otros microbios, como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae) y Pichia son ejemplos de células huésped de levadura adecuadas. Las células eucarióticas ejemplares pueden ser de mamíferos, insectos, aves u otros orígenes animales. Las células eucariotas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas como hibridomas o líneas celulares de mieloma como las líneas celulares murinas SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC N° 85110503), FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular de mieloma humano ejemplar es la U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (c Ho ) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.

La invención también proporciona un método para producir la variante de GM-CSF de la invención, que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones en las que se expresa la variante de GM-CSF y recuperar la variante de GM-CSF producida por la célula huésped. Una vez sintetizadas (ya sea químicamente o recombinantemente), las variantes de GM-CS^f pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar, que incluyen precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, purificación por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), electroforesis en gel y similares (ver de manera general Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). La variante de GM-CSF de la invención puede ser sustancialmente pura, por ejemplo, por lo menos aproximadamente un de un 80% a un 85% pura, por lo menos de aproximadamente un 85% a un 90% pura, por lo menos de aproximadamente un 90% a un 95% pura, o por lo menos de aproximadamente un 98% a un 99%, o más, pura, por ejemplo, libre de contaminantes como desechos celulares, macromoléculas, etc. distintos de la variante de GM-CSF de la invención.

Los polinucleótidos que codifican las variantes de GM-CSF de la invención pueden incorporarse en vectores usando métodos estándar de biología molecular. La transformación, el cultivo, la expresión de anticuerpos y la purificación de la célula huésped se realizan usando métodos bien conocidos.

Métodos de uso

Las variantes de GM-CSF de la invención tienen utilidades terapéuticas y profilácticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, las variantes de GM-CSF de la invención pueden administrarse a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a un sujeto para tratar, prevenir y/o diagnosticar una variedad de trastornos, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EN).).

La invención proporciona una variante de GM-CSF de la invención para su uso en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII).

En algunas realizaciones, la EII es la enfermedad de Crohn.

En algunas realizaciones, la EII es una colitis ulcerosa.

En algunas realizaciones, la EII es la enfermedad de Johne, el síndrome de Behget, la colitis colágena, la colitis por desviación, la colitis indeterminada, la colitis microscópica, la colitis infecciosa, la colitis isquémica, la colitis linfocítica, la inflamación idiopática del intestino delgado y/o proximal, la diarrea relacionada con la EII y enfermedades y trastornos estrechamente relacionados del tracto gastrointestinal.

En algunas realizaciones, el sujeto está en remisión.

En algunas realizaciones, el sujeto es resistente al tratamiento con por lo menos uno de los agentes terapéuticos, un aminosalicilato, un corticosteroide, un inmunomodulador, un antibiótico o un agente biológico.

Los métodos de la invención pueden usarse para tratar a un sujeto perteneciente a cualquier clasificación animal. Los ejemplos de sujetos que pueden tratarse incluyen mamíferos como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF se administra como terapia de inducción.

En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF se administra como terapia de mantenimiento.

La "cantidad terapéuticamente eficaz" de la variante de GM-CSF de la invención eficaz en el tratamiento de la EII puede determinarse mediante técnicas de investigación estándar. La selección de una dosis eficaz particular puede ser determinada (por ejemplo, mediante ensayos clínicos) por los expertos en la técnica en base a la consideración de varios factores. Tales factores incluyen la enfermedad a tratar o prevenir, los síntomas implicados, la masa corporal del paciente, el estado inmunitario del paciente y otros factores conocidos por el experto en la técnica. La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse según el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a la dosis derivas de sistemas de prueba de modelos animales o in vitro.

"Tratar" o "tratamiento" se refiere a un tratamiento terapéutico en el que el objeto es ralentizar (disminuir) un cambio fisiológico o enfermedad no deseados, o proporcionar un resultado clínico beneficioso o deseado durante el tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen el alivio de los síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, el estado de la enfermedad estabilizado (es decir, sin empeoramiento), el retraso o la ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si un sujeto no estuviera recibiendo tratamiento. Los que necesitan tratamiento incluyen aquellos sujetos que ya tienen el cambio fisiológico o la enfermedad no deseados, así como aquellos sujetos propensos a tener el cambio fisiológico o la enfermedad. Un resultado clínico beneficioso ejemplar es lograr la remisión de la EII, que puede evaluarse mediante un examen clínico y visual del tracto G1 (por ejemplo, mediante endoscopia).

Las variantes de GM-CSF de la invención también pueden administrarse a un sujeto para tratar, prevenir y/o diagnosticar proteinosis alveolar pulmonar autoinmune (aPAP). La aPAPA es una enfermedad pulmonar rara que resulta de la acumulación de proteína surfactante. La homeostasis del surfactante normalmente la mantienen los macrófagos alveolares de una manera dependiente de GM-CSF (Tazawa, et al, (2014). Chest, 145(4), 729-737). La causa de aPAP se ha atribuido a los altos niveles de autoanticuerpos de GM-CSF en el pulmón que limitan la función de los macrófagos alveolares. Aunque el lavado pulmonar completo es el estándar de atención para la aPAP, la administración sistémica o inhalada de GM-CSF ha demostrado un beneficio clínico para los pacientes con PAP (Seymour et al., (2001) American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 163, 524-531).

Composiciones farmacéuticas y administración

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las variantes de GM-CSF de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Para uso terapéutico, las variantes de GM-CSF de la invención pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo como ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. "Portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el anticuerpo de la invención. Tales vehículos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, pueden usarse solución salina al 0,4% y glicina al 0,3%. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materia particulada. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización bien conocidas convencionales (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes tampón y reguladores del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de las variantes de GM-CSF de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar., desde menos de aproximadamente el 0,5%, habitualmente hasta por lo menos aproximadamente el 1% y hasta tanto como el 15 o el 20% en peso y puede seleccionarse principalmente en base a la dosis, los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc. requeridos, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Los vehículos y formulaciones adecuados, incluyendo otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina sérica humana, se describen, por ejemplo, en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Filadelfia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, Ver especialmente las páginas 958-989.

El modo de administración para uso terapéutico de las variantes de GM-CSF de la invención puede ser cualquier vía adecuada que administre la variante al huésped, como la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar, transmucosal (oral, intranasal, intravaginal, rectal), usando una formulación en comprimido, cápsula, solución, polvo, gel, partícula; y contenido en una jeringuilla, un dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; u otros medios apreciados por el experto en la técnica, como son bien conocidos en la técnica. La administración en un sitio específico puede lograrse, por ejemplo, por administración intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intracardíaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.

Las variantes de GM-CSF de la invención pueden administrarse a un sujeto por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía parenteral mediante infusión intravenosa (i.v.) o inyección en bolo, por vía intramuscular o subcutánea o intraperitoneal. La infusión i.v. puede administrarse durante, por ejemplo, 15, 30, 60, 90, 120, 180 o 240 minutos, o durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 horas.

La dosis administrada a un sujeto es suficiente para aliviar o por lo menos detener parcialmente la enfermedad que se está tratando ("cantidad terapéuticamente eficaz") y puede ser algunas veces de 0,005 mg a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 30 mg/kg o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg/kg, o de aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 16 mg/kg o aproximadamente 24 mg/kg, o por ejemplo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg, pero puede ser incluso más alta, por ejemplo aproximadamente de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg.

También puede administrarse una dosis unitaria fija, por ejemplo, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg, o la dosis puede basarse en el área superficial del paciente, por ejemplo, 500, 400, 300, 250, 200 o 100 mg/m2. Habitualmente, pueden administrarse entre 1 y 8 dosis (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) para tratar al paciente, pero pueden administrarse 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más dosis.

La administración de las variantes de GM-CSF de la invención puede repetirse después de un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. También son posibles cursos de tratamiento repetidos, así como la administración crónica. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente. Por ejemplo, las variantes de GM-CSF de la invención pueden administrarse a 8 mg/kg o a 16 mg/kg a intervalos semanales durante 8 semanas, seguido de la administración a 8 mg/kg o a 16 mg/kg cada dos semanas durante 16 semanas adicionales, seguido de la administración a 8 mg/kg o a 16 mg/kg cada cuatro semanas por infusión intravenosa.

Por ejemplo, las variantes de GM-CSF de la invención pueden proporcionarse como una dosificación diaria en una cantidad de aproximadamente 0,1-100 mg/kg, como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, al día, en por lo menos uno de los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40, o alternativamente, por lo menos uno de la semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 después del inicio del tratamiento, o cualquier combinación de los mismos, usando dosis individuales o divididas cada 24, 12, 8, 6, 4 o 2 horas, o cualquier combinación de los mismos.

Las variantes de GM-CSF de la invención también pueden administrarse profilácticamente para reducir el riesgo de desarrollar EII, retrasar la aparición de un evento en la progresión de la EII y/o reducir el riesgo de recurrencia cuando la EII está en remisión.

Las variantes de GM-CSF pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con preparaciones de proteínas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución bien conocidas.

Administración oral

Las variantes de GM-CSF de la invención pueden formularse para administración oral. Las variantes de GM-CSF pueden formularse con o sin los portadores usados habitualmente en la composición de formas de dosificación sólidas, como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, puede diseñarse una cápsula para liberar la parte activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de la variante de GM-CSF. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos y aglutinantes. Las composiciones farmacéuticas para administración oral también pueden formularse usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para administración oral. Tales portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para su ingestión por el paciente.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse mediante la combinación de principios activos con excipientes sólidos y procesando la mezcla de gránulos resultante (opcionalmente, después de molienda) para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Si se desea, pueden añadirse agentes auxiliares adecuados. Los excipientes adecuados incluyen rellenos de carbohidratos o proteínas, como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa, como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sódica; gomas, incluyendo arábiga y tragacanto; y proteínas, como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes o solubilizantes, como polivinilpirrolidona reticulada, agar y ácido algínico o una sal de los mismos, como alginato sódico.

Los núcleos de grageas pueden usarse junto con recubrimientos adecuados, como soluciones concentradas de azúcar, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos o mezclas de solventes adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosificación.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral también incluyen cápsulas hechas de gelatina de ajuste a presión, así como cápsulas hechas de gelatina selladas blandas y un recubrimiento, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener ingredientes activos mezclados con rellenos o aglutinantes, como lactosa o almidones, lubricantes, como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, como aceites grasos, líquido, o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.

La composición farmacéutica variante de GM-CSF también puede proporcionarse en un recubrimiento entérico, el recubrimiento entérico estando diseñado para proteger y liberar la composición farmacéutica de manera controlada dentro del sistema gastrointestinal inferior del sujeto y para evitar efectos secundarios sistémicos. Además de los recubrimientos entéricos, las variantes de GM-CSF de la invención pueden encapsularse, recubrirse, acoplarse o asociarse de otro modo dentro de cualquier sistema o componente de administración oral de fármacos compatible. Por ejemplo, la variante de GM-CSF de la invención puede proporcionarse en un sistema portador lipídico que comprende por lo menos uno de hidrogeles poliméricos, nanopartículas, microesferas, micelas y otros sistemas de lípidos.

Para superar la degradación en el intestino delgado, la variante de GM-CSF de la invención puede estar contenida dentro de un portador de polímero de hidrogel. La variante de GM-CSF de la invención puede formularse además para su uso compatible con un sistema portador que está diseñado para aumentar la cinética de disolución y mejorar la absorción intestinal de la variante de GM-CSF. Por ejemplo, la variante de GM-CSF puede formularse en liposomas, micelas y nanopartículas para aumentar la permeación del tracto gastrointestinal de las variantes de GM-CSF.

También pueden combinarse varios sistemas biosensibles con la variante de GM-CSF de la invención para proporcionar un agente farmacéutico para administración oral. En algunas realizaciones, la variante de GM-CSF se usa en combinación con un sistema biosensible, como hidrogeles y polímeros mucoadhesivos con grupos de enlace de hidrógeno (por ejemplo, PEG, ácido poli(metacrílico) [PMAA], celulosa, Eudragit®, quitosano y alginato) para proporcionar un agente terapéutico para administración oral.

Las variantes de GM-CSF de la invención pueden administrarse en combinación con potenciadores de la permeación que promueven el transporte de las variantes de GM-CSF a través de la mucosa intestinal aumentando la permeación paracelular o transcelular. Los potenciadores de la permeación ejemplares comprenden un ácido graso de cadena larga, una sal biliar, un surfactante anfifílico y un agente quelante.

Terapias de combinación

La invención también proporciona una variante de GM-CSF de la invención en combinación con un segundo agente terapéutico para su uso en un método para tratar la EII.

"En combinación con" se refiere a la administración de las variantes de GM-CSF de la invención descritas en la presente y un segundo agente terapéutico concurrentemente como agentes individuales o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o en un programa temporal determinado para ese agente.

El segundo agente terapéutico puede ser cualquier terapia conocida para la EII, incluyendo cualquier agente o combinación de agentes que se sabe que son útiles, o que se han usado o están actualmente en uso, para el tratamiento de la EII. Tales terapias y agentes terapéuticos incluyen aminosalicilatos, un corticosteroide, un inmunomodulador, un antibiótico o un agente biológico.

Los aminosalicilatos son eficaces en el tratamiento de casos leves a moderados de EII, así como en la prevención de recaídas y el mantenimiento de la remisión. Habitualmente se administran por vía oral o rectal. La sulfasalazina (Azulfidine®), el primer aminosalicilato que se usó ampliamente para la EII, es eficaz para lograr y mantener la remisión en personas con enfermedad de leve a moderada. Administra ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) al intestino, pero tiene efectos secundarios desagradables en algunos pacientes como dolor de cabeza, náuseas, pérdida de apetito, vómitos, sarpullidos, fiebre y disminución del recuento de glóbulos blancos. La sulfasalazina puede disminuir la producción y el funcionamiento de los espermatozoides en los hombres mientras están tomando el medicamento. Se ha asociado con pancreatitis en casos raros. Se piensa que los dolores de cabeza, náuseas, sarpullidos se deben a la liberación de la fracción de sulfapiridina que es necesaria para administrar la 5-ASA al intestino.

También se han sintetizado otros derivados del 5-ASA. Esos derivados incluyen Asacol® o Pentasa® (mesalamina), Dipentum® (olsalazina) y Colazal™ (balsalazida). Las preparaciones locales de mesalamina evitan el estómago para evitar una digestión temprana y luego se liberan cerca de la sección inflamada del intestino. Las preparaciones orales de liberación retardada como Pentasa® y Asacol® (mesalamina) pueden liberar la 5-ASA directamente en el intestino delgado y el colon, o en el íleon y/o el colon, respectivamente. Rowasa®, una formulación de enema de mesalamina, permite aplicar el fármaco directamente en el colon izquierdo. Rowasa® es eficaz en el 80% de los pacientes con colitis de leve a moderada que afecta solo el lado izquierdo del colon. Los supositorios de mesalamina (Canasa®) que liberan el fármaco directamente desde el recto hasta el colon sigmoide son eficaces en una alta proporción de pacientes con UC limitada al recto y al extremo inferior del colon. Dipentum®, una preparación oral de olsalazina de liberación retardada, administra 5-AS^a directamente al colon únicamente.

Como agentes antiinflamatorios e inmunosupresores de acción rápida, los corticosteroides se han usado para tratar los brotes agudos de EII durante más de 50 años. Desde entonces, estos potentes agentes han sido el pilar de tratamiento de las enfermedades. La mayoría de los pacientes notan una mejoría en los síntomas a los pocos días de comenzar con los corticosteroides. Este grupo de medicamentos está disponible en forma oral, rectal e intravenosa (IV). Los corticosteroides no son eficaces para prevenir los brotes y, por lo tanto, rara vez se usan como terapia de mantenimiento en la EII. Como el uso a largo plazo produce efectos secundarios, estos agentes se recomiendan solo para uso a corto plazo para lograr la remisión, pero no se usan con frecuencia en el último caso. Para personas con enfermedad activa de moderada a grave, los corticosteroides orales incluyen Deltasone® (prednisona), Medrol® (metilprednisolona) e hidrocortisona. A menudo se toman aminosalicilatos junto con corticosteroides.

El entocort® (budesonida), un corticosteroide oral, se usa para tratar la enfermedad de Crohn de leve a moderada que implica el final del intestino delgado y/o la primera parte del intestino grueso. Este esteroide no sistémico se dirige al intestino en lugar de a todo el cuerpo. Los corticosteroides también pueden administrarse por vía rectal en forma de enemas (hidrocortisona, metilprednisona, Cortenema®), espumas (acetato de hidrocortisona, ProctoFoam-HC®) y supositorios. Tales preparaciones se usan para la colitis ulcerosa de leve a moderada que se limita al recto o la parte inferior del colon. Cuando se usan en combinación con otras terapias, estos agentes también son eficaces contra enfermedades más extendidas que comienzan en el recto. La metilprednisona y la hidrocortisona se administran a menudo por infusión intravenosa a pacientes con enfermedad grave y extensa. La EII aguda no responde a la terapia con corticosteroides en el 20-30% de los casos y en el 30-40% de los casos con enfermedad de moderada a grave, los corticosteroides no pueden interrumpirse abruptamente sin que se produzca un brote de la enfermedad.

Como la EII parece estar provocada por un sistema inmunitario hiperactivo, Los inmunomoduladores desempeñan un papel importante en el tratamiento de esta enfermedad. Estos fármacos se usan para aquellos que tienen una de las siguientes características: (a) efectos secundarios con el tratamiento con corticosteroides, (b) enfermedad dependiente de esteroides, (c) no responden a los aminosalicilatos, antibióticos o corticosteroides, (d) enfermedad perineal que no responde a los antibióticos, y (e) necesidad de mantener la remisión. Estos fármacos pueden combinarse con un corticosteroide para acelerar la respuesta durante los brotes activos de la enfermedad.

El Imuran®, el Azasan® (azatioprina) y el Purinethol® (6-mercaptopurina, 6-MP) son inmunomoduladores orales que se usan para mantener la remisión en la enfermedad de Crohn y la UC. Como estos agentes tienen un inicio de acción lento, generalmente se administran junto con otros fármacos de acción más rápida, por ejemplo, corticosteroides. Otros inmunomoduladores usados para la EII son Sandimmune®, Neoral® (ciclosporina A) y Prograf® (tacrolimus). De estos agentes, la ciclosporina A tiene el inicio de acción más rápido. Cuando se administra IV a dosis altas, la ciclosporina A es útil contra la enfermedad de Crohn activa. Este fármaco es eficaz contra la UC grave al igual que el tacrolimus. Este último agente puede usarse contra la enfermedad de Crohn cuando los corticosteroides no son eficaces o cuando se desarrollan fístulas. El tacrolimus puede aplicarse tópicamente para tratar la enfermedad de Crohn en la boca o el área perineal. Una opción para las personas con enfermedad de Crohn que no responden a otros tratamientos y no pueden tolerar otros inmunosupresores es el Rheumatrex® o el Mexate® (metotrexato (MTX)) administrados IV.

Aunque no se ha identificado ningún agente infeccioso específico como causa de la EII, los antibióticos se usan con frecuencia como tratamiento primario. Los antibióticos son eficaces como terapia a largo plazo en pacientes con enfermedad de Crohn que tienen fístulas (entre asas de intestino o entre el intestino y órganos adyacentes, por ejemplo, piel) o abscesos recurrentes cerca del ano. Los pacientes cuya enfermedad activa se trata con éxito con antibióticos pueden continuar con estos como terapia de mantenimiento. En general, los antibióticos no se consideran útiles para las personas con UC; la excepción es el megacolon tóxico.

Los antibióticos de amplio espectro recetados con mayor frecuencia para la EII son Flagyl® (metronidazol) y Cipro® (ciprofloxacina). El metronidazol es una terapia primaria para la enfermedad de Crohn activa y se ha demostrado que reduce la recurrencia de la enfermedad de Crohn durante los primeros tres meses después de la cirugía de resección del íleon. Este fármaco es eficaz para gestionar la enfermedad de Crohn perineal en más del 50% de los casos. La ciprofloxacina, mucho más segura que el metronidazol, se usa comúnmente para tratar la enfermedad de Crohn activa. Para el tratamiento de la EII se usan el metronidazol y la ciprofloxacina tanto oral como IV.

Los posibles objetivos mediante los cuales los productos biológicos pueden interferir con la respuesta inflamatoria del cuerpo en la EII incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), las interleucinas, las moléculas de adhesión, los factores estimulantes de colonias y otros. Como su mecanismo es dirigido, las terapias biológicas ofrecen una clara ventaja en el tratamiento de la EII. A diferencia de los corticosteroides, que tienden a suprimir todo el sistema inmunitario y, por lo tanto, producen efectos secundarios importantes, los agentes biológicos actúan de manera selectiva. Los agentes biológicos están dirigidos a enzimas y proteínas particulares que ya han demostrado ser defectuosas, deficientes o excesivas en personas con EII o en modelos animales de colitis. Tanto en la enfermedad de Crohn como en la UC se han usado agentes anti-TNF, como REMICADE® (infliximab), SIMPONI® (golimumab) y HUMIRA® (adalimumab).

A pesar de las opciones de medicamentos anteriores para la EII, el 66%-75% de los pacientes con enfermedad de Crohn y el 25%-40% con UC finalmente se someterán a cirugía. La cirugía para la enfermedad de Crohn depende de la localización de la enfermedad. Si está en el intestino delgado, las áreas de intestino enfermo pueden alternar con áreas de intestino normal. Las áreas de enfermedad activa pueden estrecharse, formando estenosis, que pueden bloquear el paso de los alimentos digeridos. Si las lesiones están separadas, a menudo se usa la estricturoplastia. Aquí, las áreas estenosadas se ensanchan y se respeta el intestino delgado. Puede ser necesaria la resección y la anastomosis si la estenosis es larga o si hay múltiples estenosis unas cerca de otras. Aunque la resección puede ofrecer años de alivio, la enfermedad puede reaparecer en el sitio de la anastomosis o cerca de él. En pacientes con enfermedad de Crohn grave en el colon, puede realizarse una colectomía. Si el recto no está afectado, el extremo del íleon puede volver a unirse al recto; por tanto, las heces pueden pasar normalmente. Si están implicados tanto el colon como el recto, puede realizarse una proctocolectomía con una ileostomía posterior. Eventualmente se desarrollan fístulas y/o abscesos en alrededor del 25% de los pacientes con enfermedad de Crohn. Si las fístulas no responden a la medicación, se extirpan mediante resección del intestino afectado seguido de anastomosis. Los abscesos deben drenarse; en algunos casos, esto requiere resección. Durante años, la cirugía estándar para la UC ha sido la proctocolectomía con ileostomía. Ahora, el procedimiento más común es la proctocolectomía restaurativa; esto permite que el paciente continúe evacuando las heces por el ano. A diferencia de la enfermedad de Crohn, que puede reaparecer después de la cirugía, la UC se "cura" una vez que se extirpa el colon.

Kits

Una realización de la invención es un kit que comprende la variante de GM-CSF de la invención.

El kit puede usarse para usos terapéuticos.

En algunas realizaciones, el kit comprende la variante de GM-CSF de la invención y reactivos para detectar la variante de GM-CSF. El kit puede incluir uno o más de otros elementos que incluyen: instrucciones de uso; otros reactivos, por ejemplo, dispositivos u otros materiales para preparar la variante de GM-CSF para su administración; portadores farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para la administración a un sujeto.

En algunas realizaciones, el kit comprende la variante de GM-CSF de la invención en un recipiente.

En algunas realizaciones, el kit comprende la variante de GM-CSF de la SEQ ID NO: 7.

En algunas realizaciones, el kit comprende la variante de GM-CSF de la SEQ ID NO: 8.

En algunas realizaciones, el kit comprende la variante de GM-CSF de la SEQ ID NO: 9.

La invención se describirá ahora con ejemplos específicos no limitativos.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

Producción de variantes de GM-CSF humano:

El ADN y los vectores de expresión que codifican varias variantes de GM-CSF marcadas con His⁶ se produjeron sintéticamente y se usaron para transfectar transitoriamente Expi293 (células HEK, ThermoScientific). La proteína secretada se purificó a partir de sobrenadantes celulares mediante cromatografía de afinidad con metales inmovilizados y luego se intercambió con tampón en PBS IX usando métodos estándar y se usó para una caracterización adicional. La secuencia de señal usada fue MAWVWTLLFLMAAAQSIQA (SEQ ID NO: 19).

Ensayo de proliferación de TF-1

Se sembraron 5 x 10³ células TF-1 (ATCC® CRL 2003™)/pocillo en placas de 96 pocillos (Costar 3603) en medio de ensayo (RPMI1640 - Gibco, 11875 que contenía 10% de FBS - Gibco, 16140, 1% de PenStrep - Gibco, 10378). Se prepararon diluciones en serie de variantes de GM-CSF humano, así como de proteína recombinante comercialmente disponible (R&D Systems: N° de Cat. 215-GM/CF como control positivo) en medio de ensayo y se añadieron 50 pl/pocillo de titulaciones de GM-CSF a las células. Las células se incubaron durante 72 h a 37° C en una incubadora humidificada con una atmósfera de CO² al 5%. La proliferación celular se midió mediante la adición de Promega CellTiter 96® Aqueous One Solution (20 pl/pocillo) de acuerdo con el protocolo del fabricante e incubando las células durante 4 h adicionales a 37° C. Las placas se agitaron durante 10 min a temperatura ambiente y se leyó la absorbancia a 490 nm en un lector de placas. Los valores brutos de OD^490nm se representaron frente a la concentración de GM-CSF humano recombinante (rhGM-CSF) usando GraphPad Prism 6.02 para determinar los valores de EC⁵⁰.

Análisis de estabilidad térmica por calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Se usó calorimetría diferencial de barrido para evaluar la estabilidad térmica de las variantes purificadas de GM-CSF. Brevemente, la proteína purificada se diluyó a 1 mg/ml en IX PBS y se calentó de 25 a 120° C a una velocidad de barrido de 1° C/min usando un instrumento MicroCal VP-DSC. Los datos calorimétricos se analizaron usando Origin7 (Origin Lab Corporation). Los datos calorimétricos brutos se normalizaron a la concentración de la muestra, se restó el valor de referencia y finalmente se ajustaron a un modelo de desdoblamiento que no es de 2 estados usando el software Origin7 para obtener el valor de Tm (temperatura en el punto medio del desdoblamiento) y otros parámetros termodinámicos.

Ejemplo 2: Diseño de variantes de GM-CSF

Se diseñaron variantes de GM-CSF y posteriormente se caracterizaron por su estabilidad mejorada (estabilidad conformacional tras el calentamiento) mientras retenían y/o mejoraban su capacidad para inducir la proliferación de células objetivo.

Las mutaciones se diseñaron mediante el análisis de la estructura cristalina del GM-CSF humano, código de PDB 2GMF (Rozwarski, Diederichs, Hecht, Boone y Karplus, 1996). Las posiciones para las mutaciones se seleccionaron para que no interfirieran con la unión del receptor de acuerdo con la estructura cristalina del complejo GM-CSF:receptor, código de PDB 3CXE (Hansen et al., 2008). Además, la elección de las sustituciones L49P y R23L estuvo respaldada por una secuencia de GM-CSF de consenso generada a partir de la alineación de secuencias de aminoácidos primarias del polipéptido de GM-CSF maduro de cincuenta especies diferentes. El diseño de consenso para la ingeniería de termoestabilidad en proteínas se ha descrito con anterioridad (M. Lehmann, Pasamontes, Lassen y Wyss, 2000; M. Lehmann, Kostrewa et al., 2000; Martin Lehmann y Wyss, 2001). La Figura 1 muestra la estructura cristalina del GM-CSF de tipo salvaje y las posiciones de los residuos considerados para sustituciones.

La Tabla 5 muestra las sustituciones generadas y la justificación de cada sustitución. La numeración de los residuos se hace de acuerdo con el GM-CSF humano maduro de la SEQ ID NO: 1. Se prepararon variantes de GM-CSF con sustituciones individuales y combinaciones de las mismas y se caracterizaron por su potencia celular y estabilidad usando los métodos descritos en el Ejemplo 1.

SEQ ID NO: 1 APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQ

EPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKE

NLKDFLLVIPFDCWEPV QE

SEQ ID NO: 18 ADNc que codifica GM-CSF WT maduro

GCCCCCGCCCGCTCCCCCTCCCCATCGACCCAACCCTGGGAACACGTGAACGCC

ATTCAGGAGGCTAGGAGACTGCTGAACCTGTCCCGGGATACCGCAGCCGAGAT

GAACGAAACCGTGGAGGTCATCTCCGAAATGTTTGACTTGCAAGAACCTACTTG

TCTGCAAACTCGCCTCGAGCTGTACAAACAGGGACTCCGGGGAAGCCTCACTAA

GCTGAAGGGGCCTCTGACCATGATGGCCTCCCACTACAAGCAGCACTGCCCGCC

GACGCCGGAAACCAGCTGCGCGACCCAGATCATTACCTTCGAATCGTTCAAGGA

AAACCTGAAGGACTTCCTGCTTGTGATCCCGTTCGACTGCTGGGAGCCTGTGCA

GGAGTAA

Tabla 5

Hercus et al. (Hercus et al., 1994) informó que la variante R23L tiene un aumento de dos veces en la actividad en la proliferación dependiente de GM-CSF de células CML primarias. Sin embargo, la sustitución no se ha relacionado con la estabilidad conformacional mejorada resultante.

La sustitución K107I se incluyó para estabilizar el giro AB mediante interacciones hidrófobas con los residuos adyacentes L70 y F103. Existe un precedente en la naturaleza para esta combinación de aminoácidos hidrófobos, L70/F 103/1107, que se encuentran en GM-CSF de rata.

La Tabla 6 muestra las secuencias de aminoácidos de las variantes generadas y la Tabla 7 muestra las secuencias de ADNc que codifican las variantes de GM-CSF generadas. La Figura 2 muestra las alineaciones de secuencias de aminoácidos de las variantes generadas.

Tabla 6

(continuación)

Tabla 7

(continuación)

continuación

(continuación)

La Tabla 8 muestra el resumen de la estabilidad térmica de las variantes de GM-CSF humano, medida usando los métodos descritos en el Ejemplo 1 y expresado como la temperatura de fusión Tm y el cambio en la Tm en comparación con la proteína de GM-CSF de tipo salvaje. Todas las variantes mostraron una estabilidad térmica significativamente mejorada en comparación con la proteína de tipo salvaje. De las sustituciones individuales, la introducción del puente disulfuro en S29C/S69C en el GM-CSF de tipo salvaje dio como resultado la estabilización más mejorada en comparación con las sustituciones L49P, K107I y R23L solas. La introducción de variantes combinatoriamente mejoró adicionalmente la estabilidad térmica de la variante resultante de una manera aproximadamente aditiva. La variante que contiene las cinco sustituciones de aminoácidos descritas anteriormente, S29C/S69C/R23L/L49P/K107I, tenía un valor de Tm que era más de 28° C mayor que el de la proteína de tipo salvaje.

Tabla 8

continuación

Se analizó la potencia de las variantes resultantes en un ensayo de proliferación de células TF-1. La Tabla 9 muestra los valores de EC50 para cada variante expresados como la media de dos mediciones individuales y las veces de cambio en comparación con el GM-CSF de tipo salvaje. La S29C/S69C demostró una mejora de aproximadamente 2,6 veces en comparación con el GM-CSF de tipo salvaje. Las sustituciones individuales L49P y R23L tuvieron una modesta mejora en la potencia, mientras que la sustitución K107I dio como resultado una variante con una potencia ligeramente reducida. En general, los aumentos en la potencia celular de las variantes de GM-CSF se correlacionaron con la estabilidad conformacional de las variantes con la variante más estable (S29C/S69C/R23L/L49P/K107I) mostrando la mayor mejora (de 4 veces) en la estimulación de la proliferación de células TF-1.

Tabla 9

Ejemplo 3. Las variantes de GM-CSF son estables en fluido intestinal simulado en ayunas

El GM-CSF administrado por vía oral para la administración local podría resultar más deseable desde el punto de vista del cumplimiento por el paciente, así como desde una perspectiva de seguridad al minimizar la exposición sistémica. Sin embargo, la administración oral de proteínas al tracto gastrointestinal inferior presenta numerosos desafíos debido a los entornos microbianos, proteolíticos y de pH duros a los que estaría expuesto el fármaco biológico (Amidon, Brown y Dave, 2015).

La estabilidad de las variantes de GM-CSF generadas se probó en fluidos intestinales simulados en estado de ayuno (FaSSIF) suplementados con pancreatina (3 mg/ml; tripsina, amilasa, lipasa, ribonucleasa y otras proteasas) para evaluar su estabilidad en un entorno comparable a partes del tracto GI.

Se preparó FaSSIF-V2 (Biorelevant; Londres, Reino Unido) fresco de acuerdo con las especificaciones del fabricante y se suplementó con pancreatina de páncreas porcino (Sigma; St. Louis, MO, USA) a una concentración final de 3 mg/ml. Las variantes de GM-CSF formuladas en 1XPBS se diluyeron hasta una concentración final de 1 mg/ml con FaSSIF (que contenía pancreatina) y se incubaron a 37° C durante 0-30 min. La digestión se detuvo calentando las muestras a 95° C durante 5 min seguido de congelación. El análisis por SDS-PAGE de las muestras se realizó cargando 10 pg de GM-CSF (en base a la concentración de pretratamiento) por pista. El gel resultante se analizó mediante densitometría para cuantificar la cantidad restante de GM-CSF variante intacta, que se expresó como porcentaje del control no tratado.

Todas las variantes probadas, excepto la variante R23L (datos no mostrados), demostraron una estabilidad mejorada frente a la degradación proteolítica a lo largo del tiempo en comparación con el GM-CSF de tipo salvaje. La Figura 3 muestra la estabilidad de las variantes de G^m -CSF S29C/S69C, L49L, S29C/S69C/K107I y S29C/S69C/R23L/L49P/K107I a lo largo del tiempo en FaSSIF que contiene 3 mg/ml de pancreatina. En comparación con el GM-CSF de tipo salvaje, que se degrada por completo en menos de un minuto en FaSSIF que contiene pancreatina, más de la mitad de la proteína de la variante S29C/S69C/R23L/L49P/K107I permanece intacta después de 30 minutos de exposición enzimática.

Ejemplo 4. Evaluación in silico del riesgo de inmunogenicidad de variantes seleccionadas de GM-CSF Dos variantes de GM-CSF se sometieron a análisis in silico para determinar si se preveía que alguna de las sustituciones de aminoácidos (con respecto al GM-CSF de tipo salvaje) aumentaría la afinidad de unión de cualquier péptido de 9 mer con las moléculas de MHC de clase II y por lo tanto, predecir epítopos de células T usando la tecnología ImmunoFilter™. No se identificaron responsabilidades de inmunogenicidad potenciales importantes en las variantes probadas (variantes S29C/S69C/R23L/L49P/K107I y S29C/S69C/L49P/K107I).

La sustitución del aminoácido L49P pareció reducir el riesgo de inmunogenicidad. Las puntuaciones de unión previstas de un 9-mer con la sustitución L49P a HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4 y HLA-DR5 se redujeron del 24-32% al 4-8%.

Ejemplo 5. Las variantes de GM-CSF conservan su actividad funcional en fluido intestinal simulado en ayunas (FaSSIF)

Se evaluó la actividad biológica de las variantes R23L/S29C/L49P/S69C/K107I y S29C/L49P/S69C/K107I de GM-CSF después de la exposición a FaSSIF suplementado con tripsina, amilasa y lipasa, ribonucleasa y otras proteasas, producidas por células exocrinas de proteasas y ribonucleasas de páncreas porcino en varios períodos temporales como se indica a continuación y en la Figura 4A, Figura 4B, Figura 4C y Figura 4D.

Ambas variantes R23L/S29C/L49P/S69C/K107I y S29C/L49P/S69C/K107I conservaron total o parcialmente su actividad a los 30 minutos (Figura 4A), 1 hora (Figura 4B) y 4 horas (Figura 4C) de exposición al entorno proteolítico que imita el tracto GI, mientras que el GM-CSF de tipo salvaje estaba completamente inactivo después de 30 minutos de exposición (Figura 4A). La variante R23L/S29C/L49P/S69C/K107I conservó una parte sustancial de su actividad biológica incluso después de 6 horas de exposición al entorno proteolítico (Figura 4D). Ambas variantes fueron más potentes en la inducción de la fosforilación de STAT5 en comparación con el GM-CSF de tipo salvaje incluso en un entorno no proteolítico (incubación en ausencia de FaSSIF).

Métodos

Se diluyeron variantes de GM-CSF humano hasta una concentración final de 1 mg/ml en fluido intestinal simulado (preparado a partir de polvo FaSSIF-v2; Biorelevant; London, UK), que se suplementó con pancreatina porcina (Sigma; St. Louis, MO) a una concentración final de 3 mg/ml. Se incubaron variantes de GM-CSF humano en esta solución a 37° C durante 0,5-6 horas. La digestión proteolítica se detuvo mediante la adición de inhibidor de proteasa completo (Roche) a 10X. Las muestras de GM-CSF tratadas con fluido intestinal simulado se diluyeron dos veces en serie en medio libre de suero RPMI1640 (Gibco) y se aplicaron a células TF-1 (ATCC; 1e5 células/pocillo), que habían estado privadas de suero durante 2 horas a 37° C con 5% de CO2. Las células TF-1 tratadas se incubaron durante 15 min a 37° C. Las células TF-1 se recogieron mediante centrifugación y se lisaron con tampón de lisis Tris que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa (Meso Scale Discovery). La fosforilación de STAT5 (Tyr694) con respecto a STAT5a,b total se determinó mediante inmunoensayo (Meso Scale Discovery). La fosforilación de la proteína STAT5 (% con respecto al total de STAT5a,b) se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF.

Ejemplo 6. Las variantes de GM-CSF conservan su actividad funcional tras la exposición al contenido de colon

Se evaluó la actividad biológica de las variantes de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I y S29C/L49P/S69C/K107I después de la exposición al contenido de colon de monos cynomolgus no tratados en varios períodos temporales.

La Figura 5A muestra que la actividad biológica de las variantes de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I y S29C/L49P/S69C/K107I se conservaron completamente después de la incubación durante 30 minutos con contenido de colon de monos cynomolgus no tratados, mientras que la actividad biológica del GM-CSF de tipo salvaje se eliminó casi por completo.

La Figura 5B muestra que la actividad biológica de las variantes de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I y S29C/L49P/S69C/K107I se conservaron después de la incubación durante 2 horas con contenido de colon de monos cynomolgus no tratados. La variante R23L/S29C/L49P/S69C/K107I de GM-CSF mostró solo una pérdida de dos veces de la actividad después de la exposición al contenido de colon durante dos horas y todavía poseía una potencia que era dos veces mayor que la del GM-CSF de tipo salvaje que no se expuso al contenido del colon. La variante S29C/L49P/S69C/K107I de GM-CSF mostró una pérdida de actividad de 6 veces en comparación con la citoquina no tratada.

La Figura 5C muestra que la actividad biológica de la variante de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I se conservó después de la incubación durante 6 horas con contenido de colon de monos cynomolgus no tratados. La variante R23L/S29C/L49P/S69C/K107I de GM-CSF mostró una pérdida de actividad de 5 veces en comparación con la variante de citoquina no tratada, mientras que la actividad de GM-CSF de tipo salvaje se eliminó por completo.

La Figura 5D muestra que la actividad biológica de GM-CSF y sus variantes S29C/L49P/S69C/K107I y R23L/S29C/L49P/S69C/ 107I se eliminó después de la incubación durante 24 horas con contenido de colon de monos cynomolgus no tratados.

La Tabla 10 muestra los valores de EC⁵⁰ en el ensayo funcional para las variantes.

Tabla 10

Materiales y métodos

Las variantes de GM-CSF humano se diluyeron a una concentración final de 1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato IX o en contenido de colon de monos cynomolgus no tratados (BioreclamationlVT; Long Island, NY), que se normalizó a una concentración de proteína final de 3 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato IX. Se incubaron variantes de GM-CSF humano en esta solución a 37° C durante 0,5-24 horas. Después del período de incubación indicado, las muestras que contenían GM-CSF se diluyeron dos veces en serie en medio libre de suero RPMI1640 (Gibco) y se aplicaron a células TF-1 (ATCC; 1e5 células/pocillo), que se habían privado de suero durante 2 horas a 37° C con un 5% de CO2. Las células TF-1 tratadas se incubaron durante 15 min a 37° C. Las células TF-1 se recogieron por centrifugación y se lisaron con tampón de lisis Tri (Meso Scale Discovery; Rockville, Maryland) que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche Life Science). La fosforilación de STAT5 (Tyr694) con respecto al STAT5a,b total se determinó mediante inmunoensayo (Meso Scale Discovery). La fosforilación de STAT5 (% con respecto al total de STAT5a,b) se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF. En los experimentos, el GM-CSF de tipo salvaje y la variante S29C/L49P/S69C/K107I tenía una etiqueta 6x-His en el extremo C-terminal acoplada a GM-CSF a través de un conector GS.

Ejemplo 7 Las variantes de GM-CSF conservan su actividad funcional en diferentes fluidos del intestino delgado simulado canino (SSIF)

Se evaluó la capacidad del GM-CSF humano de tipo salvaje y la variante de GM-CSF R23L/S29C/L49P/S69C/K107I para estimular la fosforilación de STAT5 en células TF-1 después de una exposición de dos horas a SSIF suplementado con tripsina, amilasa y lipasa, ribonucleasa y otras proteasas, producidas por células exocrinas de proteasas y ribonucleasas de páncreas porcino como se indica en la Tabla 11.

La actividad funcional del GM-CSF humano de tipo salvaje marcado con His se eliminó por completo después de una exposición de dos horas a cualquiera de las cuatro preparaciones de SSIF canino. La variante R23L/S29C/L49P/S69C/K107I conservó la actividad estimuladora completa después de una exposición de dos horas cuando se preparó SSIF a pH 7 y se suplementó con 1 mg/ml de pancreatina, lo que es equivalente a 200 unidades USP de actividad de proteasa por mililitro. Cuando se expuso a diez veces más pancreatina (10 mg/ml; 2000 unidades USP/ml) a pH 7,0 durante el mismo marco temporal, R23L/S29C/L49P/S69C/K107I GM-CSF mostró una pérdida de potencia de 24 veces con respecto a la variante de GM-CSF no expuesta a SSIF. La variante R23L/S29C/L49P/S69C/K107I mostró una pérdida de 5 veces en la actividad funcional después de una exposición de dos horas a SSIF canino cuando el fluido simulado se preparó a pH 5,5 y se suplementó con 1 mg/ml de pancreatina, lo que equivale a 200 unidades USP de actividad de proteasa por mililitro. Cuando se expuso a diez veces más pancreatina (10 mg/ml; 2.000 unidades USP/ml) a pH 5.5, R23L/S29C/L49P/S69C/K107I GM-CSF mostró una pérdida de potencia de 47 veces con respecto a la muestra no pretratada. Incluso en ausencia de pretratamiento con SSIF canino, R23L/S29C/L49P/S69C/K107I GM-CSF fue dos veces y media más potente que el GM-CSF de tipo salvaje para inducir la fosforilación de STAT5 en células TF-1.

Tabla 11

Métodos

Las variantes de GM-CSF humano se diluyeron a una concentración final de 1 mg/ml en fluido intestinal simulado (preparado a partir de Dog FaSSIF/Dog FaSSGF en polvo a un pH final de 5,5 o 7; Biorelevant; Londres, Reino Unido), que se suplementó con pancreatina porcina (Sigma Catálogo P7545; St. Louis, MO) a una concentración final de 1 o 10 mg/ml. Se incubaron variantes de GM-CSF humano en esta solución a 37° C durante 2 horas. La digestión proteolítica se detuvo mediante la adición de inhibidor de proteasa completo (Roche) a 10X. Las muestras de GM-CS^f tratadas con fluido intestinal simulado se diluyeron dos veces en serie en medio libre de suero RPMI1640 (Gibco) y se aplicaron a células TF-1 (ATCC; 1e5 células/pocillo), que habían estado privadas de suero durante 2 horas a 37° C. con 5% de CO². Las células TF-1 tratadas se incubaron durante 15 min a 37° C. Las células TF-1 se recogieron por centrifugación y se lisaron con tampón de lisis Tris que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa (Meso Scale Discovery). La fosforilación de STAT5 (Tyr694) con respecto al STAT5a,b total se determinó mediante inmunoensayo (Meso Scale Discovery). La fosforilación de la proteína de STAT5 (% con respecto al total de STAT5a,b) se representó gráficamente en función de la concentración de GM-CSF. El ajuste de curvas se realizó en Prism 7 (GraphPad) para obtener los valores de EC⁵⁰.

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de GM-CSF aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 7, 8 o 9.

2. La variante de GM-CSF de la reivindicación 1, en donde:

(i) la variante está codificada por un polinucleótido sintético de las SEQ ID NO: 15, 16 o 17; y/o

(ii) la variante está conjugada con una fracción que prolonga la vida media, opcionalmente en donde:

(a) la fracción que prolonga la vida media es una albúmina se suero humano (HSA) o variantes de la misma, una región Fc de anticuerpo o fragmento de la misma, un dominio de unión a albúmina o un polietilenglicol; y/o

(b) la fracción que prolonga la vida media se conjuga con la variante de GM-CSF mediante un conector, opcionalmente en donde el conector comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30.

3. Un polinucleótido aislado:

a. que codifica la variante de GM-CSF de la reivindicación 1 o 2; y/o

b. que comprende la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 12, 15, 16 o 17.

4. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 3, opcionalmente en donde el vector es un vector de expresión.

5. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 4.

6. Un método para producir una variante de GM-CSF, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 5 en condiciones en las que se expresa la variante de GM-CSF, y purificar la variante de GM-CSF expresada.

7. Un kit que comprende la variante de GM-CSF de la reivindicación 1 o 2.

8. Una composición farmacéutica que comprende la variante de GM-CSF de la reivindicación 1 o 2 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. La variante de GM-CSF de la reivindicación 1 o 2 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria intestinal (EII).

10. La variante de GM-CSF de la reivindicación 9, en donde:

(i) la EII es:

(a) la enfermedad de Johne, el síndrome de Behget, la colitis colágena, la colitis por derivación, la colitis indeterminada, la colitis microscópica, la colitis infecciosa, la colitis isquémica, la colitis linfocítica, la inflamación idiopática del intestino delgado y/o proximal, o diarrea relacionada con la EII; o

(b) enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa;

(ii) el tratamiento comprende además administrar al sujeto un segundo agente terapéutico, opcionalmente en donde el segundo agente terapéutico es un aminosalicilato, un inmunomodulador, un antibiótico, o un agente biológico;

(iii) el sujeto está en remisión; y/o

(iv) la variante de GM-CSF se administra por vía oral.

11. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una EII, que comprende la variante de GM-CSF de la reivindicación 1 o 2.

12. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 11, en donde la EII es enfermedad de Johne, síndrome de Behget, colitis colágena, colitis por derivación, colitis indeterminada, colitis microscópica, colitis infecciosa, colitis isquémica, colitis linfocítica, inflamación idiopática del intestino delgado y/o proximal o diarrea relacionada con la EII.