ES2912743T3 - Receptores de linfocitos T - Google Patents
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Abstract
Un receptor de linfocitos T (RLC) de origen no natural y/o purificado y/o modificado por ingeniería genética, que tiene la propiedad de unirse al complejo FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 1) HLA-A2 con una afinidad mayor y/o una constante de disociación más lenta para el complejo que un RLC que tenga una secuencia extracelular de la cadena alfa de SEQ ID NO: 2 y una secuencia extracelular de la cadena beta de SEQ ID NO: 3 y que comprende al menos un dominio variable de la cadena alfa de RLC y/o al menos un dominio variable de la cadena beta de RLC, comprendiendo el dominio variable de la cadena alfa una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad respecto a la secuencia de residuos aminoacídicos 1-112 de la SEQ ID NO: 2, y/o comprendiendo el dominio variable de la cadena beta una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad respecto a la secuencia de residuos aminoacídicos 1-112 de la SEQ ID NO: 3, en donde el dominio variable de la cadena alfa incluye al menos una de las siguientes mutaciones: Residuo nº 31Q F Y 32S A 94D Q 95S N 96G S 97Y V 98A S
Description
DESCRIPCIÓN
Receptores de linfocitos T
La presente invención se refiere a receptores de linfocitos T (RLC) que se unen al epítopo peptídico FMNKFIYEI (158 166) restringido por HLA-A2 derivado de a Fetoproteína (AFP). Determinados RLC preferidos de la invención demuestran excelentes características de unión y perfiles de especificidad para este epítopo de AFP.
La AFP se expresa durante el desarrollo fetal y es el componente principal del suero fetal. Durante el desarrollo, la proteína se produce a niveles muy altos en el saco vitelino y en el hígado y después se reprime. La expresión de AFP se reactiva frecuentemente en el carcinoma hepatocelular (Butterfield et al. J Immunol., 2001, 15 de abril; 166 (8): 5300-8) y altos niveles de la proteína se utilizan como un marcador de diagnóstico para la enfermedad.
El carcinoma hepatocelular tiene uno de los índices de supervivencia a los 5 años más bajos de todos los tumores malignos en los Estados Unidos, la incidencia anual global es de 1,2 millones y es probable que aumente debido a la pandemia de hepatitis B y C. Normalmente el tratamiento implica cirugía, sin embargo, solo es beneficiosa si se lleva a cabo en las primeras etapas de la enfermedad. Por lo tanto se desean nuevos tratamientos.
Hay cuatro epítopos conocidos derivados de AFP: AFP158, AFP137, AFP325 y AFP542 (Butterfield et al. J Immunol., 2001, 15 de abril; 166 (8): 5300-8 y Butterfield et al. Cancer Res. 1999, 59: 3134-3142). El péptido FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 1) de AFP158 restringido por HLA-A2, proporciona una diana adecuada para nuevas intervenciones inmunoterapéuticas; este péptido se procesa de modo natural y se ha eluido de líneas de carcinoma hepático HepG2 (HLA-A2 positivo) y detectado mediante espectrometría de masas (Butterfield et al. J Immunol., 2001, 15 de abril; 166 (8): 5300-8). Se han suscitado clones de linfocitos T contra AFP158 (y AFP137) (Pichard et al. J Immunother. abril del 2008; 31(3): 246-53). Sin embargo, no se han comunicado receptores de linfocitos T que reconozcan a este péptido.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un receptor de linfocitos T (RLC) de origen no natural y/o purificado y/o modificado por ingeniería genética que tiene la propiedad de unirse al complejo FMNKFIYEI (SEC ID n O: 1) HLA-A2 con una afinidad mayor y/o una constante de disociación más lenta para el complejo que un RLC que tenga una secuencia extracelular de la cadena alfa de SEQ ID NO: 2 y una secuencia extracelular de la cadena beta de SEQ ID NO: 3 y que comprende al menos un dominio variable de la cadena alfa de RLC y/o al menos un dominio variable de la cadena beta de RLC,
comprendiendo el dominio variable de la cadena alfa una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad respecto a la secuencia de residuos aminoacídicos 1-112 de la SEQ ID NO: 2, y/o
comprendiendo el dominio variable de la cadena beta una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad respecto a la secuencia de residuos aminoacídicos 1-112 de la SEQ ID NO: 3,
en donde el dominio variable de la cadena alfa incluye al menos una de las siguientes mutaciones:
En algunas realizaciones de la invención, el dominio variable de la cadena alfa presenta al menos un 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad secuencial respecto a los residuos aminoacídicos 1 a 112 de la SEQ ID NO: 2.
El dominio variable de la cadena beta puede tener al menos un 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad secuencial respecto a los residuos aminoacídicos 1 a 112 de la SEQ ID NO: 3.
Los RLC se describen utilizando la nomenclatura International Immunogenetics (IMGT) de RLC y está relacionada con la base de datos pública de secuencias de RLC de IMGT. Los RLC alfa-beta heterodiméricos nativos tienen una cadena alfa y una cadena beta. En términos generales, cada cadena comprende regiones variables, de unión y constantes, y la cadena beta también suele contener una región de diversidad corta entre las regiones variables y de unión, pero esta región de diversidad a menudo se considera como parte de la región de unión. Cada región variable comprende tres CDR (regiones determinantes de complementariedad) integradas en una secuencia estructural, siendo una de ellas la región hipervariable denominada CDR3. Existen varios tipos de regiones de variables de cadena alfa
(Va) y varios tipos de regiones variables de cadena beta (Vp) que se distinguen por su estructura, por las secuencias de CDR1 y c DR2, y por una secuencia de CDR3 parcialmente definida. En la nomenclatura IMGT, los tipos Va se denominan mediante un solo número TRAV. Por lo tanto, "TRAV21" define una región Va de RLT que tiene una estructura y secuencias CDR1 y CDR2 únicas, y una secuencia CDR3 definida parcialmente por una secuencia de aminoácidos que se conserva de RLC a RLC pero que también incluye una secuencia de aminoácidos que varía de RLC a RLC. De la misma manera, "TRBV5-1" define una región Vp de RLC que tiene una estructura y secuencias CDR1 y CDR2 únicas, pero solo con una secuencia CDR3 parcialmente definida.
Las regiones de unión de los RLC se definen de manera similar mediante la nomenclatura única TRAJ y TRBJ de IMGT, y las regiones constantes mediante la nomenclatura TRAC y TRBC de IMGT.
En la nomenclatura IMGT, a la región de diversidad de cadena beta se la denomina con la abreviatura TRBD, y, como se ha mencionado, las regiones TRBD/TRBJ concatenadas a menudo se consideran en conjunto como la región de unión.
Generalmente se considera que cada una de las cadenas a y p de los RLC ap tiene dos "dominios" o "regiones", en concreto, dominios/regiones variables y constantes. En este documento, los términos "dominio(s)" y "región(es)" se usan indistintamente. El dominio variable consta de una concatenación de región variable y región de unión. En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, por lo tanto, la expresión "dominio variable alfa RLC" por lo tanto, se refiere a la concatenación de las regiones TRAV y TRAJ, y la expresión dominio constante alfa RLC se refiere a la región TRAC extracelular, o a una secuencia TRAC truncada en C-terminal. Del mismo modo, la expresión "dominio variable beta RLC" se refiere a la concatenación de regiones TRBV y TRBD/TRBJ, y el término dominio constante beta RLC se refiere a la región TRBC extracelular, o a una secuencia TRBC truncada C-terminal.
Las secuencias únicas definidas por la nomenclatura IMGT son muy conocidas y accesibles para quienes trabajan en el campo de los RLC. Por ejemplo, pueden encontrarse en la base de datos pública de IMGt . The "T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc y LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8, también desvela secuencias definidas por la nomenclatura IMGT, pero debido a su fecha de publicación y a la consiguiente demora, la información que contiene a veces ha de confirmarse por referencia a la base de datos IMGT.
Las SEQ ID NO: 2 y 3 son, respectivamente, las secuencias extracelulares de cadenas alfa y beta de lo que en este documento se denomina RLC de AFP "parental". El RLC de AFP parental tiene el siguiente uso de cadenas alfa y beta:
Cadena alfa: TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC (en la Figura 1 se muestra la secuencia extracelular de la cadena alfa del RLC de AFP parental (SEC ID NO: 2). Las CDR están definidas por los aminoácidos 27-32 (CDR1), 50-55 (CDR2) y 90-101 (CDR3) de la SEC ID NO: 2.
Cadena beta: TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2 (en la Figura 2 se muestra la secuencia extracelular de la cadena beta del RLC de AFP parental (SEC ID NO: 3). Las CDR están definidas por los aminoácidos 27-31 (CDR1), 49-54 (CDR2) y 92-102 (CDR3) de la SEC ID NO: 3.
(Tenga en cuenta que los términos '*01' y '*02' indican que, para esta secuencia, hay más de una variante alélica, según lo designado por la nomenclatura IMGT, y que es la variante *01/*02 que está presente en el clon RLC mencionado anteriormente. Tenga en cuenta también que la ausencia de un modificador "*" significa que solo se conoce un alelo para la secuencia relevante.)
Con el fin de proporcionar un RLC de referencia con el que se pueda comparar el perfil de unión de los RLC mutados de la invención, es conveniente usar el RLC soluble que tiene la secuencia extracelular de la cadena alfa RLC de AFP mostrada en la Figura 3 (SEC ID NO: 4) y la secuencia extracelular de la cadena beta RLC de AFP mostrada en la Figura 4 (SEC ID NO: 5). En este documento, a este RLC se le denomina "el RLC de referencia" o "el RLC de AFP de referencia". Tenga en cuenta que la SEQ ID NO: 4 es idéntica a la secuencia extracelular de cadena alfa parental SEQ ID NO: 2, excepto que C159 se ha sustituido por T159 (es decir, T48 de TRAC). Del mismo modo la Se Q ID NO: 5 es idéntica a la secuencia extracelular de cadena beta parental SEQ ID NO: 3, excepto que C169 se ha sustituido por S169 (es decir, S57 de TRBC2), A187 se ha sustituido por C187 y D201 se ha sustituido por N201. Estas sustituciones de cisteína. en relación con las secuencias extracelulares de las cadenas alfa y beta de AFP parental, permiten la formación de un enlace disulfuro entre cadenas que estabiliza al RLC soluble replegado, es decir, el RLC formado por replegamiento de cadenas alfa y beta extracelulares. El uso de RLC soluble, estable, ligado por enlace disulfuro, como el RLC de referencia, permite una evaluación más conveniente de la afinidad de unión y de semivida de unión.
Los RLC de la invención pueden transformarse en linfocitos T, hacerlos capaces de destruir células que presentan el complejo AFP HLA-A2, para su administración a un paciente en el procedimiento de tratamiento conocido como terapia adoptiva. Para este fin, sería deseable que los RLC tuvieran una afinidad más alta y/o una constante de disociación más lenta para el complejo péptido-HLA que los RLC nativos específicos para ese complejo. Los aumentos drásticos en la afinidad se han asociado con una pérdida de especificidad antigénica en los linfocitos T CD8 modificados con el gen de RLC, lo que podría dar como resultado la activación inespecífica de estos linfocitos CD8 transfectados con
RLC. Por lo tanto, los RLC que tienen una afinidad algo más alta y/o una constante de disociación más lenta para el complejo péptido-HLA que los RLC nativos específicos para ese complejo, pero no una afinidad drásticamente más alta y/o una disociación drásticamente más lenta para el complejo péptido-HLA que los RLC nativos, serían preferibles para la terapia adoptiva (véase Zhao et al., (2007) J Immunol. 179: 5845-54; Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-31; y el documento WO2008/038002).
El dominio variable de la cadena alfa puede comprender una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad respecto a los residuos 1-112 de una cualquiera de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20. Los aminoácidos subrayados en la Figura 5 pueden ser invariantes.
En una realización, el RLC comprende un dominio variable de la cadena alfa que comprende de Q1 a H112 de la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o s Eq ID NO: 13, y/o un dominio variable de la cadena beta que comprende de D1 a T112 de la SEQ ID NO: 3.
Las mutaciones pueden llevarse a cabo utilizando cualquier método apropiado, incluyendo, pero sin limitación, los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction), procedimientos de clonación basados en enzimas de restricción o de clonación independiente de ligamiento (CIL). Estos métodos se detallan en muchos de los textos de biología molecular habituales. Para más detalles sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sobre la clonación basada en enzimas de restricción, véase Sambrook y Russell, (2001) Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3a Ed.) CSHL Press. En Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6, puede encontrarse más información sobre procedimientos de clonación independiente de ligamiento (CIL).
También están dentro del alcance de la invención variantes fenotípicamente silenciosas de cualquier RLC desvelado en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "variantes fenotípicamente silenciosas" se entiende que se refiere a aquellos r Lc que tienen una Kd y/o semivida de unión para el complejo FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 1) HLA-A2 dentro de los intervalos de los valores de Kd y de semivida de unión descritos más adelante. Por ejemplo, como saben los expertos en la materia, puede ser posible producir RLC que incorporen cambios en los dominios constante y/o variable de los mismos en comparación con los detallados anteriormente sin alterar la afinidad por la interacción con el complejo FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 1) HLA-A2. Dichas variantes triviales están incluidas en el alcance de esta invención. Aquellos RLC en los que se han realizado una o más sustituciones conservativas también forman parte de esta invención.
Como será obvio para los expertos en la materia, puede ser posible truncar las secuencias proporcionadas en el extremo C y/o en el extremo N de las mismas, en 1, 2, 3, 4, 5 o más restos, sin que afecte sustancialmente a las características de unión del RLC. La presente invención abarca todas estas variantes triviales.
Los RLC nativos existen en formas ap o y§ heterodiméricas. Sin embargo, se ha demostrado anteriormente que los RLC recombinantes que constan de homodímeros aa o pp se unen a moléculas peptídicas del MHC (major histocompatibility complex, complejo principal de histocompatibilidad). Por lo tanto, el RLC de la invención puede ser un RLC ap heterodimérico o puede ser un RLC aa o pp homodimérico.
Para su uso en terapia adoptiva, un RLC ap heterodimérico puede, por ejemplo, transfectarse como cadenas de longitud completa que tienen dominios tanto citoplasmáticos como transmembrana. En determinadas realizaciones, los RLC de la invención pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los restos de los dominios constantes respectivos, tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2006/000830.
Los RLC de la invención, particularmente los RLC alfa-beta heterodiméricos, pueden comprender una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y/o una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta. Las secuencias de dominio constante de las cadenas alfa y beta pueden modificarse mediante truncamiento o sustitución para eliminar el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2. La(s) secuencia(s) del dominio constante de la cadena alfa y/o beta también puede(n) modificarse mediante la sustitución de restos de cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del RLC.
Los RLC de la invención pueden estar en formato de una sola cadena, por ejemplo, véase el documento WO 2004/033685. Los formatos de una sola cadena incluyen polipéptidos de RLC ap de los tipos Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp, Va-Ca-L-Vp-Cp, en donde Va y Vp son regiones variables a y p, respectivamente, del RLT, Ca y Cp son regiones constantes a y p, respectivamente, del RLC y L es una secuencia enlazadora. En determinadas realizaciones, los RLC de cadena única de la invención pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los restos de los dominios constantes respectivos, como se describe en el documento WO 2004/033685.
Los RLC de la invención tienen la propiedad de unirse al complejo FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 1) HLA-A2 con una afinidad mayor y/o una constante de disociación más lenta para el complejo que un RLC que tenga una secuencia extracelular de la cadena alfa de SEQ ID NO: 2 y una secuencia extracelular de la cadena beta de SEQ ID NO: 3. Se
ha descubierto que determinados RLC de la invención son muy adecuados para su uso en terapia adoptiva. Dichos RLC pueden tener una Kd para el complejo menor que la del RLC de AFP parental, por ejemplo, de aproximadamente 1 |jM a aproximadamente 21 j M y/o tener una semivida (T ^ ) de unión para el complejo en el intervalo de menos de 0,5 segundos a aproximadamente 2 segundos. El aumento de la afinidad de unión de un RLC nativo a menudo reduce la selectividad del RLC por su ligando peptídico con el MHC, y esto se demuestra en Zhao Yangbing et al., (J. Immunol, 2007 179: 9, p5845-5854). Sin embargo, determinados RLC de la invención siguen siendo selectivos para el complejo FMNKFIYEI HLA-A2, a pesar de que, en algunas realizaciones, tengan mayor afinidad de unión que el RLC de AFP parental (véase el Ejemplo 6).
La afinidad de unión (inversamente proporcional a la constante de equilibrio Kd) y la semivida de unión (expresada como T1^ ) pueden determinarse mediante cualquier método apropiado. Se apreciará que, al duplicar la afinidad de un RLC, la Kd se reduce a la mitad. T ^ se calcula como ln2 dividido entre la constante de disociación (koff). Por lo tanto, duplicando los resultados de T ^ los valores de koff se reducen a la mitad. Los valores de Kd y koff de los RLT generalmente se miden para formas solubles del TCR, es decir, aquellas formas que se truncan para eliminar restos del dominio citoplasmático y transmembrana. Por lo tanto, debe entenderse que un RLC dado tiene una afinidad de unión y/o una semivida de unión mejoradas para el RLC parental, si una forma soluble de ese RLC tiene dichas características. Preferentemente, la afinidad de unión o la semivida de unión de un RLC dado se mide varias veces, por ejemplo 3 veces o más, utilizando el mismo protocolo de ensayo, y se toma un promedio de los resultados. En una realización preferida, estas mediciones se realizan utilizando el método de Resonancia de Plasmón Superficial (BIAcore) del Ejemplo 3 del presente documento.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ácido nucleico de origen no natural y/o purificado y/o modificado por ingeniería genética que codifica un RLC de la invención. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADNc. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena a de un RLC de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena p de un RLC de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica tanto un dominio variable de cadena a de un RLC de la invención como un dominio variable de cadena p de un RLC de la invención.
Un vector puede comprender ácido nucleico de la invención. El vector puede ser un vector de expresión de RLC.
La invención también proporciona una célula que contiene (a) un vector de expresión de RLC que comprende ácido nucleico de la invención que codifica en un solo marco abierto de lectura, o en dos marcos abiertos de lectura distintos, la cadena alfa y la cadena beta respectivamente; o (b) un primer vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un RLC de la invención, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un RLC de la invención. Dichas células son particularmente útiles en terapia adoptiva. Las células pueden ser células aisladas y/o recombinantes y/o de origen no natural y/o estar modificadas por ingeniería genética.
Dado que los RLC de la invención tienen utilidad en terapia adoptiva, la invención incluye una célula de origen no natural y/o purificada y/o modificada por ingeniería genética, especialmente un linfocito T, que presenta un RLC de la invención. Existen diversos métodos adecuados para la transfección de linfocitos T con ácido nucleico (tal como ADN, ADNc o ARN) que codifica los RLC de la invención (véase, por ejemplo, Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116 6131). Los linfocitos T que expresan los RLC de la invención serán adecuadas para su uso en el tratamiento basado en terapia adoptiva de cánceres tales como los del páncreas y el hígado. Como sabrán los expertos en la materia, hay diversos métodos adecuados mediante los cuales se puede llevar a cabo una terapia adoptiva (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8 (4): 299-308).
Como se sabe bien en la técnica, los RLC de la invención pueden someterse a modificaciones postraduccionales cuando se expresan por células transfectadas. La glucosilación es una de dichas modificaciones, que comprende la unión covalente de grupos oligosacarídicos con aminoácidos definidos en la cadena del RLC. Por ejemplo, los restos de asparagina o los restos de serina/treonina son lugares bien conocidos para la unión de oligosacáridos. El estado de glucosilación de una proteína en particular depende de diversos factores, incluyendo la secuencia de proteínas, la conformación de proteínas y la disponibilidad de determinadas enzimas. Adicionalmente, el estado de glucosilación (es decir, el tipo de oligosacárido, el enlace covalente y el número total de uniones) puede influir en la función de la proteína. Por lo tanto, cuando se producen proteínas recombinantes, controlar la glucosilación es a menudo deseable. La glucosilación de los RLC transfectados puede controlarse mediante mutaciones del gen transfectado (Kuball J et al. (2009), J Exp Med 206 (2): 463-475). Dichas mutaciones también se incluyen en esta invención.
El RLC de la invención puede estar asociado con un marcador detectable, un agente terapéutico o un grupo modificador de PK.
Determinados RLC de la invención pueden estar en forma soluble (es decir, no tienen dominios transmembrana o citoplasmáticos). Para la estabilidad, los RLC de la invención, y preferentemente los RLC heterodiméricos ap solubles, pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los restos de los dominios constantes respectivos, tal como se
describe, por ejemplo, en el documento WO 03/020763. Algunos RLC solubles de la invención son útiles para preparar proteínas de fusión que pueden usarse para suministrar marcadores detectables o agentes terapéuticos a células presentadoras de antígeno y a tejidos que contienen células presentadoras de antígeno. Por lo tanto, pueden asociarse (de manera covalente o de otra manera) con un marcador detectable (con fines de diagnóstico en donde el RLC se utiliza para detectar la presencia de células que presentan el complejo FMNKFIYEI (SEQ ID NO 1) HLA-A2; un agente terapéutico; o un grupo modificador de PK (por ejemplo, por PEGilación).
Como marcadores detectables con fines de diagnóstico se incluyen, por ejemplo, marcadores fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácido nucleico y reactivos de contraste.
Los agentes terapéuticos que pueden estar asociados con los RLC de la invención incluyen inmunomoduladores, compuestos radiactivos, enzimas (por ejemplo, perforina) o agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, cisplatino). Para garantizar que los efectos tóxicos se ejercen en el lugar deseado, la toxina podría estar dentro de un liposoma unida a un RLC, de manera que el compuesto se libere lentamente. Esto evitará los efectos dañinos durante el transporte en el cuerpo y garantizará que la toxina tenga un efecto máximo después de la unión del RLC con las células presentadoras de antígeno pertinentes.
Otros agentes terapéuticos adecuados incluyen:
• agentes citotóxicos de molécula pequeña, es decir, compuestos con la capacidad de destruir células de mamífero que tienen un peso molecular inferior a 700 Daltons. Dichos compuestos también podrían contener metales tóxicos que pueden tener un efecto citotóxico. Adicionalmente, debe entenderse que estos agentes citotóxicos de molécula pequeña también incluyen profármacos, es decir, compuestos que, en condiciones fisiológicas, se degradan o se transforman para liberar agentes citotóxicos. Como ejemplos de dichos agentes se incluyen cisplatino, derivados de maitansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecán, melfalán, mitoxantrona, porfímero de sodio, fotofrina II, temozolomida, topotecán, glucuronato de trimetrexato, auristatina E, vincristina y doxorrubicina;
• citotoxinas peptídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con la capacidad de destruir células de mamífero. Por ejemplo, ricina, toxina diftérica, exotoxina A bacteriana de Pseudomonas, ADNasa y ARNasa; • radionúclidos, es decir, isótopos inestables de elementos que se degradan con la emisión simultánea de una o más de las partículas a o p, o rayos y. Por ejemplo, yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astatina 213; pueden utilizarse agentes quelantes para facilitar la asociación de estos radionúclidos con los RLC de alta afinidad, o con multímeros de los mismos;
• inmunoestimulantes, es decir, moléculas inmunoefectoras que estimulan la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, citocinas tales como IL-2 e IFN-y,
• Superantígenos y mutantes de los mismos;
• Fusiones RLC-HLA;
• quimiocinas, tales como IL-8, factor plaquetario 4, proteína estimuladora del crecimiento de melanomas, etc; • anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluidos los anticuerpos determinantes anti-linfocitos T o linfocitos citolílicos naturales (células NK, del inglés Natural Killer) (por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28 o anti-CD16));
• armazones proteicos alternativos con características de unión similares a las de los anticuerpos
• activadores del complemento;
• dominios proteicos xenogénicos, dominios proteicos alogénicos, dominios de proteínas víricas/bacterianas, péptidos víricos/bacterianos.
Para la administración a pacientes, los RLC o las células de la invención, pueden proporcionarse en una composición farmacéutica junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las células de acuerdo con la invención se suministrarán generalmente como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada, (dependiendo del método de administración que se desee realizar a un paciente). Esta puede proporcionarse en una forma farmacéutica unitaria, generalmente se proporcionará en un recipiente sellado y se puede proporcionar como parte de un kit. Dicho kit normalmente incluiría (aunque no necesariamente) las instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas farmacéuticas unitarias.
La composición farmacéutica puede adaptarse para su administración por cualquier vía apropiada, preferentemente por una vía parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular o preferentemente intravenosa). Dichas composiciones se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo, mezclando el principio activo con el vehículo (o vehículos) o excipiente (o excipientes) en condiciones estériles.
Los RLC, las composiciones farmacéuticas, los vectores, los ácidos nucleicos y las células de la invención pueden proporcionarse en forma sustancialmente pura, por ejemplo al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de pureza.
La invención también proporciona un RLC de la invención, o una célula de la invención, para su uso en medicina, preferentemente en un método de tratamiento del cáncer. El método puede comprender terapia adoptiva.
Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada uno de los otros aspectos con los cambios debidos. Cualquier referencia o identificación de cualquier documento en esta solicitud, no debería interpretarse como una admisión de que dicho documento esté disponible como técnica anterior a la presente invención.
Descripción de las figuras
La figura 1 (SEQ ID NO: 2) proporciona la secuencia de aminoácidos de la parte extracelular de la cadena alfa del RLC específico de AFP parental con el uso génico TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC.
La figura 2 (SEQ ID NO: 3) proporciona la secuencia de aminoácidos de la parte extracelular de la cadena beta del RLC específico de AFP parental con el uso génico TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2.
La figura 3 (SEQ ID NO: 4) proporciona la secuencia de aminoácidos de la cadena alfa de un RLC soluble (denominado en este documento "RLC de referencia"). La secuencia es la misma que la de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) excepto que una cisteína (en negrita y subrayada) se sustituye porT159 de la SEC ID NO: 2 (es decir, T48 de la región constante de TRAC).
La figura 4 (SEQ ID NO: 5) proporciona la secuencia de aminoácidos de la cadena beta de un RLC soluble (denominado en este documento "RLC de referencia"). La secuencia es la misma que la de la Figura 2 (SEQ ID NO: 3) excepto que una cisteína (en negrita y subrayada) se sustituye por S169 de la SEC ID NO: 3 (es decir, S57 de la región constante de TRBC2) y A187 se sustituye por 87 y D201 se sustituye por N201.
La figura 5 (SEQ ID NO: 6-20) proporciona la secuencia de aminoácidos de las cadenas alfa mutadas que pueden estar presentes en los RLC de la invención. Las regiones CDR están subrayadas y los cambios de aminoácidos en relación con el RLC de AFP parental están sombreados.
La figura 6 (SEQ ID NO: 21) y (SEQ ID NO: 22) proporciona las secuencias de ADN que codifican las cadenas alfa y beta del RLC mostradas en las Figuras 3 y 4 respectivamente
La figura 7 (SEQ ID NO: 23) proporciona la secuencia de ADN del gen del RLC de AFP parental (construcción de cadena alfa-2A-cadena beta con la secuencia 2A de teschovirus-1 porcino en negrita y subrayada) para la transducción de linfocitos T.
La figura 8 (SEQ ID NO: 24) proporciona la secuencia de aminoácidos del RLC de AFP parental para la transducción de linfocitos T producida a partir de la secuencia de ADN de la Figura 7. La secuencia 2A de teschovirus-1 porcino se indica en negrita y subrayada.
La Figura 9 muestra los resultados de un ensayo ELISPOT en el que se evaluó la liberación de IFN-y de linfocitos T transducidos con el RLC de AFP en respuesta a una serie de células diana
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1
Clonación de las secuencias de la región variable de la cadena alfa y beta del RLC de AFP parental en plásmidos de expresión basados en pGMT7
Los dominios alfa variable del RLC y beta variable del RLC de AFP de referencia, se amplificaron por PCR a partir de ADNc total aislado de un clon de linfocitos T de AFP. En el caso de la cadena alfa, para amplificar el dominio variable de la cadena alfa, se utilizó una secuencia de la región variable de la cadena alfa específica del oligonucleótido A1 gaattccatatgcaaaaagaagttgaacaaaattctggacccctc (SEQ ID NO: 25) que codifica el sitio de restricción NdeI y una secuencia de la región constante de la cadena alfa específica del oligonucleótido A2 ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg (SEQ ID NO: 26) que codifica el sitio de restricción Sall. En el caso de la cadena beta, para amplificar el dominio variable de la cadena beta se utilizó una secuencia de la región variable de la cadena beta específica del oligonucleótido B1 gaattccatatggattctggagttacacaaaccccaaagcacctg (SEQ ID NO: 27) que codifica el sitio de restricción NdeI y secuencia de la región constante de la cadena beta específica del oligonucleótido B2 tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc (SEQ ID NO: 28) que codifica el sitio de restricción Age1.
Mediante métodos habituales descritos en (Molecular Cloning a Laboratory Manual, tercera edición, de Sambrook y Russell), los dominios variables alfa y beta se clonaron en plásmidos de expresión basados en pGMT7 que contenían Ca o Cp. Los plásmidos se secuenciaron utilizando un analizador de ADN de Applied Biosystems 3730xl.
Las secuencias de ADN que codificaban la cadena alfa del RLC cortadas con Ndel y Sall se ligaron en el vector pGMT7 Ca, que se cortó con Ndel y Xhol. Las secuencias de ADN que codificaban la cadena beta del RLC cortadas con Ndel y Agel se ligaron en un vector pGMT7 Cp distinto, que también se cortó con Ndel y Agel.
Ligamiento
Los plásmidos ligados se transformaron en células competentes de E. coli de la cepa XL1-blue y se sembraron en placas de LB/agar que contenían ampicilina 100|jg/ml. Después de la incubación durante una noche a 37 °C, se tomaron colonias individuales y se cultivaron durante una noche en LB 10 ml que contenía ampicilina 100 jg/m l a una temperatura de 37 °C con agitación. Los plásmidos clonados se purificaron utilizando un kit Miniprep (Qiagen) y los plásmidos se secuenciaron utilizando un analizador de ADN de Applied Biosystems 3730xl.
Las Figuras 3 y 4 muestran respectivamente las secuencias de aminoácidos extracelulares de las cadenas a y p del RLC de AFP de referencia (SEQ ID NO: 4 y 5 respectivamente) producidas a partir de las secuencias de ADN de la figura 7 (SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22) respectivamente. Cabe destacar que, en relación con el RLC parental, para formar el RLC heterodimérico, las cisteínas se sustituyeron en las regiones constantes de las cadenas alfa y beta para proporcionar un enlace disulfuro artificial entre cadenas en el replegamiento. Las cisteínas introducidas se muestran en negrita y subrayadas.
Ejemplo 2
Expresión, replegamiento y purificación del RLC de AFP parental soluble
Los plásmidos de expresión que contenían la cadena a y la cadena p, respectivamente, del RLC, como los preparados en el Ejemplo 1, se transformaron por separado en la cepa BL21pLysS de E. coli y antes de inducir la expresión de las proteínas con IPTG 0,5 mM, se cultivaron colonias únicas resistentes a ampicilina a una temperatura de 37 °C en medio TYP (ampicilina 100 jg/m l) a una DO600 de ~ 0,6-0,8. Tres horas después de la inducción, las células se recogieron mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en una centrífuga Beckman J-6B. Los sedimentos celulares se lisaron con Bug Buster® 25 ml (Novagen) en presencia de MgCh y DNasal. Los sedimentos de cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. Después, se llevaron a cabo tres lavados con detergente para eliminar los residuos celulares y los componentes de la membrana. El sedimento de los cuerpos de inclusión se homogeneizaba cada vez en un tampón de Tritón (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, Tritón-X100 al 0,5%, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM) antes de sedimentarlo por centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. Después se eliminó el detergente y la sal mediante un lavado similar en el siguiente tampón: Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaEDTA 1 mM. Finalmente, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70 °C. El rendimiento proteico de los cuerpos de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y en un espectrofotómetro Hitachi U-2001 se realizó una medición de la DO. Después, la concentración proteica se calculó utilizando el coeficiente de extinción.
Aproximadamente 15 mg de cadena p de RLC y 15 mg de cuerpos de inclusión solubilizados en cadena a de RLC se descongelaron de reservas congeladas y se diluyeron en 10 ml de una solución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCl 50 mM, pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 10 mM), para garantizar la desnaturalización completa de la cadena. Después, la solución de guanidina que contenía las cadenas de RLC completamente reducidas y desnaturalizadas, se inyectó en 0,5 litros del siguiente tampón de replegamiento: Tris 100 mM, pH 8,1, L-arginina 400 mM, EDTA 2 mM, Urea 5 M. El par redox (clorhidrato de cisteamina y diclorhidrato de cistamina) a concentraciones finales de 6,6 mM y 3,7 mM respectivamente, se añadió aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas de RLC desnaturalizadas. La solución se dejó durante ~30 minutos. El RLC replegado se dializó en una membrana Spectra/Por® 1 (Spectrum; N.° de Producto 132670) frente a 10 l de H2O durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió a Tris 10 mM recién preparado, pH 8,1 (10 l) y la diálisis continuó a una temperatura de 5 °C ± 3 °C durante 8 horas aproximadamente.
El RLC soluble se separó de los productos de degradación e impurezas cargando el replegado dializado en una columna de intercambio aniónico POROS® 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en Tris 10 mM, pH 8,1 en 50 volúmenes de columna utilizando un purificador Akta® (GE Healthcare). Las fracciones pico se agruparon y se añadió un cóctel de inhibidores de proteasa (Calbiochem). Después, las fracciones pico agrupadas se conservaron a 4 °C y se analizaron mediante s DS-PAGE teñido con Coomassie antes de agruparlas y concentrarlas. Finalmente, el RLC soluble se purificó y se caracterizó utilizando una columna de filtración en gel Superdex® 75HR de GE Healthcare previamente equilibrada en tampón PBS (Sigma). El pico de elución a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se agrupó y se concentró antes de la caracterización por análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore®.
Ejemplo 3
Caracterización de unión
Análisis BIAcore
Para analizar la unión de un RLC soluble con su ligando péptido-MHC, puede utilizarse un biodetector de resonancia de plasmón superficial (BIAcore® 3000). Esto es posible produciendo complejos de péptido biotinilado soluble-HLA ("pHLA") que pueden inmovilizarse en una superficie de unión revestida con estreptavidina (micoplaca detectora). Las microplacas detectoras comprenden cuatro células de flujo individuales que permiten la medición simultánea de la unión del receptor de linfocitos T a cuatro complejos de pHLA diferentes. La inyección manual del complejo pHLA permite manipular fácilmente el nivel exacto de moléculas de clase I inmovilizadas.
Las moléculas de HLA-A*02 de clase I biotiniladas se replegaron in vitro a partir de cuerpos de inclusión expresados en bacterias que contenían las proteínas de la subunidad constituyente y el péptido sintético, seguido de purificación y biotinilación enzimática in vitro (O'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). La cadena pesada-HLA-A*02 se expresó con una etiqueta de biotinilación C-terminal que reemplazaba los dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína en una construcción apropiada. Se obtuvieron niveles de expresión de cuerpos de inclusión de ~ 75 mg/litro de cultivo bacteriano. La cadena ligera de MHC, o microglobulina p2, también se expresó como cuerpos de inclusión en E. coli a partir de una construcción apropiada, a un nivel de ~500 mg/litro de cultivo bacteriano.
Las células de E. coli se lisaron y los cuerpos de inclusión se purificaron hasta obtener una pureza de aproximadamente 80%. La proteína de los cuerpos de inclusión se desnaturalizó en guanidina-HCl 6 M, Tris 50 mM pH 8,1, NaCl 100 mM, DTT 10 mM, EDTA 10 mM, y se replegó a una concentración de 30 mg/litro de cadena pesada, p2m 30 mg/litro en L-Arginina 0,4 M, Tris 100 mM pH 8,1, diclorhidrato de cistamina 3,7 mM, clorhidrato de cisteamina 6,6 mM, 4 mg/l del péptido AFP necesario para ser cargado por la molécula HLA-A*02, por adición de un solo pulso de proteína desnaturalizada en un tampón de replegado a <5 °C. Se dejó acabar el replegamiento a 4 °C durante al menos 1 hora.
El tampón se cambió por diálisis en 10 volúmenes de Tris 10 mM, pH 8,1. La solución de proteína se filtró después a través de un filtro de acetato de celulosa de 1,5 pm y se cargó en una columna de intercambio aniónico POROS® 50HQ (8 ml de volumen de lecho). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-500 mM en Tris 10 mM, pH 8,1, utilizando un purificador Akta® (GE Healthcare). El complejo HLA-A*02-péptido se eluyó a aproximadamente NaCl 250 mM y se recogieron las fracciones pico, se añadió un cóctel de inhibidores de proteasa (Calbiochem) y las fracciones se enfriaron en hielo.
Se les cambió el tampón a las moléculas de pHLA etiquetadas con biotinilación a tampón Tris 10 mM, pH 8,1, NaCl 5 mM utilizando una columna de desalinización rápida de Pharmacia equilibrada en el mismo tampón. Inmediatamente después de la elución, las fracciones que contenían proteína se enfriaron en hielo y se añadió cóctel inhibidor de proteasa (Calbiochem). Después se añadieron los reactivos de biotinilación: biotina 1 mM, ATP 5 mM (tamponado a pH 8), MgCl27,5 mM y enzima BirA 5 pg/ml (purificada según O'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Después, la mezcla de reacción se dejó incubar a temperatura ambiente durante una noche.
Las moléculas de pHLA-A*01 biotiniladas se purificaron utilizando cromatografía por filtración en gel. Una columna GE Healthcare Superdex® 75 HR 10/30 se equilibró previamente con PBS filtrado y se cargó 1 ml de la mezcla de reacción de biotinilación y la columna se desarrolló con PBS a 0,5 ml/min utilizando un purificador Akta® (GE Healthcare). Las moléculas de pHLA-A*02 biotiniladas eluyeron como un solo pico a aproximadamente 15 ml. Las fracciones que contenían proteína se agruparon, se enfriaron en hielo y se añadió cóctel inhibidor de proteasa. La concentración proteica se determinó utilizando un ensayo de unión de Coomassie (PerBio) y las alícuotas de las moléculas de pHLA-A*02 biotiniladas se conservaron congeladas a -20 °C.
El biodetector de resonancia de plasmón superficial (RPS) BIAcore® 3000 mide cambios en el índice de refracción expresados en unidades de respuesta (UR) cerca de una superficie detectora dentro de una célula de flujo pequeño, un principio que puede utilizarse para detectar las interacciones de los ligandos con receptores y para analizar su afinidad y parámetros cinéticos. Los experimentos BIAcore® se realizaron a una temperatura de 25 °C, utilizando tampón PBs (Sigma, pH 7,1-7,5) como tampón de ejecución y en la preparación de diluciones de muestras de proteínas. La estreptavidina se inmovilizó en las células de flujo mediante métodos habituales de acoplamiento de aminas. Los complejos de pHLA se inmovilizaron a través de la etiqueta de biotina. Después, el ensayo se realizó pasando el RLC soluble sobre las superficies de las distintas células de flujo a un caudal constante, midiendo la respuesta de RPS al hacerlo.
Constante de unión en equilibrio
Los métodos de análisis BIAcore® anteriores se utilizaron para determinar las constantes de unión en equilibrio. Se prepararon diluciones en serie de la forma heterodimérica soluble unida por disulfuro del RLC de AFP de referencia y se inyectaron a un caudal constante de 5 pl min'1 sobre dos células de flujo diferentes; una revestida con ~1000 UR de complejo HLA-A*02 específico, la segunda revestida con ~1000 UR de complejo HLA-A2-péptido inespecífico. La respuesta se normalizó para cada concentración utilizando la medición de la célula de control. Los datos de respuesta normalizados se representaron gráficamente frente a la concentración de muestras de RLC y se ajustaron a un modelo de ajuste de curva no lineal para calcular la constante de unión en equilibrio, Kd (Price y Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2a edición) 1979, Clarendon Press, Oxford). La forma soluble unida por disulfuro
del RLC de la AFP de referencia (Ejemplo 2) demostró una Kd de aproximadamente 754 pM. A partir de los mismos datos de BIAcore®, la T1^ fue aproximadamente <0,5 s.
Parámetros cinéticos
Los métodos de análisis BIAcore® anteriores también se utilizaron para determinar las constantes de unión en equilibrio y las constantes de disociación.
Para los RLC de alta afinidad (véase el Ejemplo 4 a continuación) la Kd se determinó midiendo experimentalmente la constante de velocidad de disociación, koff y la constante de velocidad de asociación, kon. La constante de equilibrio Kd se calculó como kf/kon.
El RLC se inyectó en dos células diferentes, una revestida con ~1000 RU del complejo FMNKFIYE1HLA-A*02, y la segunda revestida con ~1000 UR del complejo HLA-A2-péptido inespecífico. El caudal se fijó a 50 pl/min. Normalmente, se inyectaron 250 pl de RLC a una concentración de ~ 1 pM. Después, el tampón se desbordó hasta que la respuesta volvió a la línea de referencia o transcurrieron más de 2 horas. Los parámetros cinéticos se calcularon utilizando el programa informático BIAevaluation®. La fase de disociación se ajustó a una sola ecuación de degradación exponencial, lo que permitió realizar el cálculo de la semivida.
Ejemplo 4
Preparación de los RLC mutados de la invención
La presentación en fagos es un medio mediante el cual pueden generarse bibliotecas de variantes de RLC para identificar mutantes de mayor afinidad. La presentación en fagos del RLC y los métodos de exploración descritos en (Li et al, (2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354) se aplicaron al RLC de AFP parental del Ejemplo 1. Se identificaron RLC con unión mejorada en comparación con el RLC de AFP parental, que tenían una o más mutaciones en los restos de aminoácidos del dominio variable de la cadena alfa 31Q, 32S, 94D, 95S, 96G, 97Y y 98A (utilizando la numeración mostrada en la SEC ID NO: 2). En la Figura 5 se muestran ejemplos específicos de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas alfa (SEQ ID NO: 6 a 20) de los RLC de mayor afinidad. Estas cadenas alfa están mutadas en la CDR1 y/o la CDR3.
Los plásmidos de expresión que contenían la cadena a y la cadena p, respectivamente, del RLC, para los siguientes RLC de la invención, se prepararon como en el Ejemplo 1:
Los plásmidos se transformaron por separado en la cepa BL21pLysS de E. coli y antes de inducir la expresión de las proteínas con IPTG 0,5 mM, se cultivaron colonias únicas resistentes a ampicilina a una temperatura de 37 °C en medio TYP (ampicilina 100 pg/ml) a una DO600 de ~ 0,6-0,8. Tres horas después de la inducción, las células se recogieron mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en una centrífuga Beckman J-6B. Los sedimentos celulares se lisaron con Bug Buster® 25 ml (Novagen) en presencia de MgCh y DNasal. Los sedimentos de cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. Después, se llevaron a cabo tres lavados con detergente para eliminar los residuos celulares y los componentes de la membrana. El sedimento de los cuerpos de inclusión se homogeneizaba cada vez en un tampón de Tritón (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, Tritón-X100 al 0,5%, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM) antes de sedimentarlo por centrifugación durante 15 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. Después se eliminó el detergente y la sal mediante
un lavado similar en el siguiente tampón: Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaEDTA 1 mM. Finalmente, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70 °C. El rendimiento proteico de los cuerpos de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y en un espectrofotómetro Hitachi U-2001 se realizó una medición de la DO. Después, la concentración proteica se calculó utilizando el coeficiente de extinción.
Aproximadamente 10 mg de cadena p de RLC y 10 mg de cuerpos de inclusión solubilizados de cadena a de RLC para cada RLC de la invención, se diluyeron en 10 ml de una solución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCl 50 mM, pH 8,1, NaCl 100 mM, e DtA 10 mM, DTT 10 mM), para garantizar la desnaturalización completa de la cadena. Después, la solución de guanidina que contenía las cadenas de RLC completamente reducidas y desnaturalizadas, se inyectó en 0,5 litros del siguiente tampón de replegamiento: Tris 100 mM, pH 8,1, L-arginina 400 mM, EDTA 2 mM, Urea 5 M. El par redox (clorhidrato de cisteamina y diclorhidrato de cistamina) a concentraciones finales de 6,6 mM y 3,7 mM respectivamente, se añadió aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas de RLC desnaturalizadas. La solución se dejó durante ~30 minutos. El RLC replegado se dializó en 1 membrana Spectra/Por® (Spectrum; N.° de Producto 132670) frente a 10 l de H2O durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió a Tris 10 mM recién preparado, pH 8,1 (10 l) y la diálisis continuó a una temperatura de 5 °C ± 3 °C durante 8 horas aproximadamente.
El RLC soluble se separó de los productos de degradación e impurezas cargando el replegado dializado en una columna de intercambio aniónico POROS® 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en Tris 10 mM, pH 8,1 en 15 volúmenes de columna utilizando un purificador Akta® (GE Healthcare). Después, las fracciones pico agrupadas se conservaron a 4 °C y se analizaron mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie antes de agruparlas y concentrarlas. Finalmente, los RLC solubles se purificaron y caracterizaron utilizando una columna de filtración en gel Superdex® 75HR de GE Healthcare pre-equilibrada en tampón PBS (Sigma). El pico de elución a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se agrupó y se concentró antes de la caracterización por análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore®.
Los perfiles de afinidad de los RLC preparados de este modo para el epítopo de AFP se evaluaron usando el método del Ejemplo 3 y se compararon con el RLC de referencia. Los resultados se exponen en la siguiente tabla:
Ejemplo 5
Transfección de linfocitos T con RLC de AFP parentales y variantes
(a) Preparación de vector lentivírico mediante transfección transitoria mediada por Express-In de células 293T
Para empaquetar vectores lentivíricos que contienen el gen que codifica el RLC deseado, se utilizó un sistema de empaquetamiento lentivírico de 3a generación. Células 293T se transfectaron con 4 plásmidos (un vector lentivírico que contenía el gen de un solo ORF (marco abierto de lectura) de cadena alfa de RLC-P2A-cadena beta de RLC descrito en el Ejemplo 5c (más adelante), y 3 plásmidos que contenían los otros componentes necesarios para construir partículas lentivirícas infecciosas pero no replicativas) utilizando transfección mediada por Express-In (Open Biosystems).
Para la transfección se coge un matraz T150 de células 293T en fase de crecimiento exponencial, con las células distribuidas uniformemente en la placa, y a una confluencia ligeramente mayor del 50 %. Las alícuotas Express-In se llevan a temperatura ambiente. En un tubo cónico estéril de 15 ml se colocan 3 ml de medio sin suero (RPMI 1640
HEPES 10 mM). Se añaden 174 |jl de reactivo Express-In directamente en el medio sin suero (esto da una proporción en peso de reactivo con respecto a ADN de 3,6: 1). Se mezcla exhaustivamente invirtiendo los tubos 3-4 veces y se incuba a temperatura ambiente durante 5-20 minutos.
En un microtubo distinto de 1,5 ml, a las alícuotas de la mezcla de empaquetamiento premezcladas (que contienen 18 jg de pRSV.REV (plásmido de expresión Rev) se añaden 15 jg de ADN plasmídico, 18 jg de pMDLg/p.RRE (plásmido de expresión Gag/Pol), 7 jg de pVSV-G (plásmido de expresión de glicoproteína VSV), habitualmente ~ 22 jl, y se pipetea hacia arriba y hacia abajo para garantizar la homogeneidad de la mezcla de ADN. A la mezcla de ADN se la añade por goteo ~ 1 ml de Express-In/Medio sin suero y después se pipetea hacia arriba y hacia abajo suavemente antes de volver a transferir al resto del Express-In/ Medio sin suero. El tubo se invierte 3-4 veces y se incuba a temperatura ambiente durante 15-30 minutos.
El medio de cultivo antiguo se retira del matraz de células. El complejo Express-In/medio/ADN (3 ml) se añade al matraz directamente en el fondo de un matraz vertical de células 293T. Lentamente, se coloca el matraz plano para cubrir las células y el matraz se balancea suavemente para garantizar una distribución uniforme. Después de 1 minuto, se añade 22 ml de medio de cultivo reciente (R10+h Ep ES: RPMI 1640, FBS termoinactivado al 10 %, Pen/Estrep/lglutamina al 1 %, HEPES 10 mM) y cuidadosamente se lleva de nuevo a la incubadora. Se incuba durante la noche a 37 °C/CO2 al 5 %. Después de 24 horas, se procede a recoger el medio que contiene los vectores lentivíricos empaquetados.
Para recoger los vectores lentivíricos empaquetados, el sobrenadante del cultivo celular se filtra a través de un filtro de jeringa de nailon de 0,45 micrómetros, se centrifuga el medio de cultivo a 10000 g durante 18 horas (o a 112000 g durante 2 horas), se elimina la mayor parte del sobrenadante (teniendo cuidado de no alterar el sedimento) y se resuspende el sedimento en los pocos ml restantes de sobrenadante (generalmente aproximadamente 2 ml de un volumen inicial de 31 ml por tubo). Alícuotas de 1 ml se congelan al instante y se conservan a -80 °C.
(b) Transducción de linfocitos T con vectores lentivíricos empaquetados que contienen un gen de interés
Antes de la transducción con los vectores lentivíricos empaquetados, se aíslan linfocitos T humanos (CD8 o CD4 o ambos según las necesidades) de la sangre de voluntarios sanos. Estas células se cuentan y se incuban durante la noche en R10 que contiene 50 U/ml de IL-2 a 1x106 células por ml (0,5 ml/pocillo) en placas de 48 pocillos con microperlas revestidas con anticuerpo anti-CD3/CD28 prelavado (Dynabeads® expansoras de linfocitos T de Invitrogen) a una proporción de 3 perlas por célula.
Después de la estimulación durante la noche, a las células deseadas se añaden 0,5 ml de vector lentivírico empaquetado sin diluir. Se incuba durante 3 días a 37 °C/CO2 al 5 %. Tres días después de la transducción se cuentan las células y se diluyen a 0,5x106 células/ml. Se añade medio reciente que contenga IL-2 según sea necesario. Las perlas se retiran 5-7 días después de la transducción. Las células se cuentan y se reemplaza o se añade medio reciente que contenga IL-2 a intervalos de 2 días. La células se mantienen entre 0,5x106y 1x106 células/ml. Las células pueden analizarse mediante citometría de flujo desde el día 3 y se pueden utilizarse para realizar ensayos funcionales (por ejemplo, ELISpot para determinar la liberación de IFNy, véase el Ejemplo 6) desde el día 5. Desde el día 10, o cuando las células están disminuyendo la división y reduciendo su tamaño, las células se congelan en alícuotas de al menos 4x106 células/vial (a 1x107 células/ml en FBS al 90 %/DMSO al 10 %) para su conservación.
(c) Gen de RLC parental para la transfección de linfocitos T mediante los métodos (a) y (b) anteriores
La Figura 7 es una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 23) que codifica el RLC de AFP parental (con codones optimizados para obtener una máxima expresión en células humanas). Es una construcción de un solo marco abierto de lectura de cadena alfa de longitud completa - 2A de teschovirus-1 porcino - cadena beta de longitud completa. La secuencia 2A está subrayada y está precedida por nucleótidos que codifican un sitio de escisión de furina para ayudar a la eliminación proteolítica de la secuencia 2A (que se analiza más adelante en relación con la Fig. 8 (SEQ ID NO: 24). La omisión del enlace peptídico durante la traducción de la proteína del ARNm en el extremo 3' de la secuencia 2A produce dos proteínas: 1) fusión de cadena alfa de RLC-2A, 2) cadena beta de RLC. La SEQ ID NO: 23 incluye los sitios de restricción Nhel y Sall (subrayados).
La Figura 8 es la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 24) correspondiente a la figura 7
En la figura 8:
M1-Q22 es una secuencia líder que se elimina al madurar la cadena alfa de RLC parental;
Q23-S274 corresponde a la secuencia de la cadena alfa parental;
Q23-N246 corresponde al dominio extracelular de la cadena alfa parental;
L247-T268 es la región transmembrana de la cadena alfa del RLC maduro;
L269-S274 es la región intracelular de la cadena alfa del RLC maduro;
R277-R280 es el sitio de escisión de furina para ayudar a la eliminación proteolítica, en el aparato de Golgi, de la secuencia A285-P303 de P2A;
G275, S276, S281 a G284, son enlazadores flexibles que permiten la plena función de la escisión de furina y de las secuencias P2A;
R304-V323 es una secuencia líder que se elimina al madurar la cadena beta de RLC parental;
D324-G614 corresponde a la secuencia de la cadena beta parental;
D324-E585 corresponde al dominio extracelular de la cadena beta parental;
I586-V607 es la región transmembrana de la cadena beta del RLC maduro;
K608-G614 es la región intracelular de la cadena beta del RLC maduro.
(d) linfocitos T transfectadas con RLC de AFP parental y de alta afinidad
Siguiendo los procedimientos descritos en los apartados (a) y (b) anteriores, el gen de RLT alfa-2A-beta de AFP parental (SEQ Id NO: 23 (Figura 7)) se insertó en el vector lenti pELNSxv utilizando los sitios de restricción Nhel y Sall únicos para ambas construcciones de ADN, y se crearon linfocitos T transfectados.
De manera similar, los linfocitos T pueden crearse por transfección con genes idénticos a la SEC ID NO: 23 (Fig. 7), excepto que codifican un dominio variable de cadena alfa que tiene una de las SEQ ID NO: 6 a 20 asociadas con la secuencia de dominio variable (D1 a T112) de la cadena beta parental SEQ ID NO: 3;
Ejemplo 6
Activación de linfocitos T modificados por ingeniería genética con RLC de AFP
El siguiente ensayo se llevó a cabo para demostrar la activación de linfocitos T citotóxicos (LTC) transducidos con RLC en respuesta a líneas de células tumorales. La producción de IFN-y, medida utilizando el ensayo ELISPOT, se utilizó como una lectura de la activación de linfocitos T citotóxicos (LTC).
Ensayos ELISPOT
Reactivos
Medios de ensayo: FCS al 10 % (Gibco, n° de cat 2011-09), RPMI 1640 al 88 % (Gibco, n° de cat. 42401), glutamina al 1 % (Gibco, n.° de cat. 25030) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco, n.° de cat. 15070-063).
Tampón de lavado: PBS 0,01 M/Tween 20
PBS al 0,05 % (Gibco, n.° de cat. 10010)
El kit ELISPOT de IFNy humano (BD Bioscience; n.° de cat. 551849) contiene anticuerpos de captura y de detección y placas ELISPOT de PVDF (fluoruro de polivinilideno) de 96 pocillos para IFN-y humano, con el conjunto de sustrato AEC asociado (BD Bioscience, n.° de cat. 551951)
Métodos
Preparación de células diana
Las células diana utilizadas en este método eran células presentadoras de epítopos naturales: células de carcinoma hepatocelular HepG2 que eran HLA-A2+AFP+. Como control negativo se utilizaron hepatocitos humanos normales HEP2 que eran HLA-A2+AFP- En una centrifugadora Megafuge® 1.0 (Heraeus), una cantidad suficiente de células diana (50000 células/pocillo) se lavó mediante centrifugación, tres veces a 1200 rpm durante 10 min. Después, las células se volvieron a suspender en medios de ensayo a 106 células/ml.
Preparación de células efectoras
Las células efectoras (linfocitos T) utilizadas en este método fueron linfocitos de sangre periférica (LSP), obtenidos por selección negativa utilizando kits de microperlas para CD14 y CD25 (Miltenyi Biotech n.° de cat. 130-050-201 y 130 092-983 respectivamente) a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) recién aisladas de la sangre venosa de voluntarios sanos. Las células se estimularon con perlas revestidas con antiCD3/CD28 (Dynabeads® expansoras de linfocitos T de Invitrogen), se transdujeron con lentivirus que llevaban el gen que codificaba el RLC ap completo de interés (basándose en la construcción descrita en el Ejemplo 5 y mostrada en la Figura 7) y se expandieron en medios de ensayo que contenían IL-2 50 U/ml, hasta entre 10 y 13 días después de la transducción. Después, estas células se colocaron en medios de ensayo antes de lavar por centrifugación a 1200 rpm, durante 10 min en una Megafuge® 1.0 (Heraeus). Las células se volvieron a suspender en medios de ensayo a 4X la concentración final requerida.
Las placas se prepararon de la siguiente manera: En 10 ml de PBS estéril, se diluyeron 100 pl de anticuerpo de captura anti-IFN-Y por placa. Después, en cada pocillo, se dispensaron 100 □ pl del anticuerpo de captura diluido. Después, las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Tras la incubación las placas se lavaron (programa 1, placas de tipo
Claims (16)
1. Un receptor de linfocitos T (RLC) de origen no natural y/o purificado y/o modificado por ingeniería genética, que tiene la propiedad de unirse al complejo FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 1) HLA-A2 con una afinidad mayor y/o una constante de disociación más lenta para el complejo que un RLC que tenga una secuencia extracelular de la cadena alfa de SEQ ID NO: 2 y una secuencia extracelular de la cadena beta de SEQ ID NO: 3 y que comprende al menos un dominio variable de la cadena alfa de RLC y/o al menos un dominio variable de la cadena beta de RLC, comprendiendo el dominio variable de la cadena alfa una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad respecto a la secuencia de residuos aminoacídicos 1-112 de la SEQ ID NO: 2, y/o
comprendiendo el dominio variable de la cadena beta una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad respecto a la secuencia de residuos aminoacídicos 1-112 de la SEQ ID NO: 3,
en donde el dominio variable de la cadena alfa incluye al menos una de las siguientes mutaciones:
2. El RLC de la reivindicación 1, en donde el dominio variable de la cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 90% de identidad respecto a los residuos 1-112 de una cualquiera de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20.
3. El RLC de cualquier reivindicación anterior, en donde el dominio variable de la cadena alfa comprende de Q1 a H112 de la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13 y/o el dominio variable de la cadena beta comprende de D1 a T112 de la SEQ ID NO: 3.
4. El RLC de cualquier reivindicación anterior que tiene una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y/o una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta.
5. El RLC de la reivindicación 4, en donde, la(s) secuencia(s) de dominio constante de la cadena alfa y/o beta se modifica(n) mediante truncamiento o sustitución para eliminar el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2.
6. El RLC de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5, en donde la(s) secuencia(s) del dominio constante de la cadena alfa y/o beta se modifica(n) mediante la sustitución de restos de cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando las cisteínas un enlace disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del RLC.
7. El RLC de cualquier reivindicación anterior, que está en formato de una sola cadena del tipo Va-L-Vp, Yp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp o Va-Ca-L-Vp-Cp, en donde Va y Vp son regiones variables a y p, respectivamente, del RLC, Ca y Cp son regiones constantes a y p, respectivamente, del RLC y L es una secuencia enlazadora.
8. El RLC de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que es un heterodímero alfa-beta.
9. El RLC de cualquier reivindicación anterior asociado con un marcador detectable, un agente terapéutico o un grupo modificador de PK.
10. Ácido nucleico de origen no natural y/o purificado y/o modificado por ingeniería genética que codifica el RLC de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
11. Una célula de origen no natural y/o purificada y/o modificada por ingeniería genética, especialmente un linfocito T, que presenta un RLC según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
12. Una célula que contiene
(a) un vector de expresión de RLC que comprende ácido nucleico según la reivindicación 10 que codifica en un solo marco abierto de lectura, o en dos marcos abiertos de lectura distintos, la cadena alfa y la cadena beta
respectivamente; o
(b) un primer vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un RLC según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un RLC según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. Una composición farmacéutica que comprende un RLC según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una célula según la reivindicación 11o la reivindicación 12, junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
14. Un RLC de origen no natural y/o purificado y/o modificado por ingeniería genética que se une al péptido FMNKFIYEI (SEQ ID NO: 1) presentado como un complejo de péptido-HLA-A2, o una célula que expresa y/o presenta un RLC de este tipo, para su uso en medicina, en donde el RlC es según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o en donde la célula es según la reivindicación 11 o la reivindicación 12.
15. El RLC o la célula para el uso de la reivindicación 14, para su uso en un método de tratamiento de cáncer.
16. El RLC o la célula para el uso de la reivindicación 15, en donde el método comprende terapia adoptiva.
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