ES2909722T3

ES2909722T3 - Terapia de combinación con un anticuerpo anti-CD19 y una mostaza nitrogenada

Info

Publication number: ES2909722T3
Application number: ES12747923T
Authority: ES
Inventors: Jutta Amersdorfer; Stefan Steidl; Mark Winderlich; Susanne Krohn; Lisa Rojkjaer
Original assignee: Morphosys AG
Current assignee: Morphosys AG
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2012-08-14
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2032-08-14
Also published as: DK2744515T3; EP2744515A1; NZ617770A; LT2744515T; US20200353077A1; KR102115203B1; SG10201606785UA; CA3137321A1; EP2744515B1; RU2014103492A; KR20190107749A; AU2012296907B2; BR112013033919B1; KR20200058583A; HRP20220228T1; JP6184952B2; CA2841875A1; RS63238B1; PT2744515T; CN103732252A

Abstract

Una combinación sinérgica de un anticuerpo específico para CD19 y bendamustina para su uso en el tratamiento de linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica o leucemia linfoblástica aguda, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada variable de la secuencia EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDG TKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 10) y una cadena ligera variable de la secuencia DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSN LNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 11) y un dominio constante de cadena pesada de la secuencia ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:12).

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia de combinación con un anticuerpo anti-CD19 y una mostaza nitrogenada

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a una combinación farmacéutica de un anticuerpo anti-CD19 y una mostaza nitrogenada para el tratamiento del linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica y/o leucemia linfoblástica aguda.

Antecedentes

Las células B son linfocitos que desempeñan un papel importante en la respuesta inmune humoral. Se producen en la médula ósea de la mayoría de los mamíferos y representan el 5-15% de la reserva linfoide circulante. La función principal de las células B es elaborar anticuerpos contra varios antígenos y son un componente esencial del sistema inmunitario adaptativo.

Debido a su papel crítico en la regulación del sistema inmunitario, la desregulación de las células B se asocia con una variedad de trastornos, como linfomas y leucemias. Estos incluyen el linfoma no Hodgkin (NHL), la leucemia linfocítica crónica (CLL) y la leucemia linfoblástica aguda (ALL).

El NHL es una enfermedad maligna heterogénea que se origina en los linfocitos. En los Estados Unidos (U.S.), la incidencia se estima en 65.000/año con una mortalidad de aproximadamente 20.000 (American Cancer Society, 2006; y SEER Cancer Statistics Review). La enfermedad puede producirse en todas las edades, el inicio habitual comienza en adultos mayores de 40 años, la incidencia aumentando con la edad. El NHL se caracteriza por una proliferación clonal de linfocitos que se acumulan en los ganglios linfáticos, la sangre, la médula ósea y el bazo, aunque puede verse afectado cualquier órgano importante. El sistema de clasificación actual usado por patólogos y médicos es la Clasificación de tumores de la Organización Mundial de la Salud (OMS), que organiza el NHL en neoplasias de células B o células T precursoras y maduras. El PDQ actualmente divide el NHL como indolente o agresivo para la entrada en ensayos clínicos. El grupo de NHL indolente está compuesto principalmente por subtipos foliculares, linfoma linfocítico pequeño, MALT (tejido linfoide asociado a mucosas) y zona marginal; el indolente abarca aproximadamente el 50% de los pacientes con NHL de células B recién diagnosticados. El NHL agresivo incluye pacientes con diagnósticos histológicos de células B grandes principalmente difusas (DLBL, DLBCL o DLCL) (el 40% de todos los pacientes recién diagnosticados tienen células grandes difusas), de Burkitt y células del manto. El curso clínico del NHL es muy variable. Un determinante principal del curso clínico es el subtipo histológico. La mayoría de los tipos indolentes de NHL se consideran enfermedades incurables. Los pacientes responden inicialmente a la quimioterapia o a la terapia con anticuerpos y la mayoría recaerá. Los estudios hasta la fecha no han demostrado una mejora en la supervivencia con una intervención temprana. En pacientes asintomáticos, es aceptable "observar y esperar" hasta que el paciente se vuelva sintomático o hasta que el ritmo de la enfermedad parezca acelerarse. Con el tiempo, la enfermedad puede transformarse en una histología más agresiva. La supervivencia mediana es de 8 a 10 años y los pacientes indolentes a menudo reciben 3 o más tratamientos durante la fase de tratamiento de su enfermedad. Históricamente, el tratamiento inicial del paciente con NHL indolente sintomático ha sido quimioterapia de combinación. Los agentes más comúnmente usados incluyen: ciclofosfamida, vincristina y prednisona (CVP); o ciclofosfamida, adriamicina, vincristina, prednisona (CHOP). Aproximadamente del 70% al 80% de los pacientes responderán a su quimioterapia inicial, la duración de las remisiones es del orden de 2 3 años. En última instancia, la mayoría de los pacientes recaen. El descubrimiento y uso clínico del anticuerpo anti-CD20, rituximab, ha proporcionado mejoras significativas en la respuesta y la tasa de supervivencia. El estándar de cuidados actual para la mayoría de los pacientes es rituximab CHOP (R-CHOP) o rituximab CVP (R-CVP). El interferón está aprobado para el tratamiento inicial del NHL en combinación con agentes alquilantes, pero tiene un uso limitado en los Estados Unidos. Se ha demostrado que la terapia con rituximab es eficaz en varios tipos de NHL y actualmente está aprobado como tratamiento de primera línea para el NHL tanto indolente (linfoma folicular) como agresivo (linfoma difuso de células B grandes). Sin embargo, hay limitaciones significativas del anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD20, incluyendo la resistencia primaria (50% de respuesta en pacientes indolentes en recaída), resistencia adquirida (50% de tasa de respuesta tras el retratamiento), respuesta completa rara (2% de respuesta completa en la población con recaídas) y un patrón continuado de recaídas. Finalmente, muchas células B no expresan CD20 y, por tanto, muchos trastornos de las células B no pueden tratarse con la terapia con anticuerpos anti-CD20. En la WO2010/083365 se informa de la combinación terapéutica de un anticuerpo anti-Cd20 y bendamustina.

Además del NHL, hay varios tipos de leucemias que resultan de la desregulación de las células B. La leucemia linfocítica crónica (también conocida como "leucemia linfoide crónica" o "CLL") es un tipo de leucemia en adultos provocada por una acumulación anormal de linfocitos B. En la CLL, los linfocitos malignos pueden parecer normales y maduros, pero no pueden hacer frente eficazmente a la infección. La CLL es la forma más común de leucemia en adultos. Los hombres tienen el doble de probabilidades de desarrollar CLL que las mujeres. Sin embargo, el factor de riesgo clave es la edad. Más del 75% de los casos nuevos se diagnostican en pacientes mayores de 50 años. Cada año se diagnostican más de 10.000 casos y la mortalidad es de casi 5.000 al año (American Cancer Society, 2006; y SEER Cancer Statistics Review). La CLL es una enfermedad incurable pero progresa lentamente en la mayoría de los casos. Muchas personas con CLL llevan vidas normales y activas durante muchos años. Debido a su aparición lenta, la CLL en etapa temprana generalmente no se trata, ya que se cree que la intervención temprana de la CLL no mejora el tiempo de supervivencia ni la calidad de vida. En cambio, la afección se monitoriza a lo largo del tiempo. Los tratamientos iniciales de CLL varían dependiendo del diagnóstico exacto y la progresión de la enfermedad. Hay docenas de agentes usados para la terapia de la CLL. Los regímenes de quimioterapia de combinación como FCR (fludarabina, ciclofosfamida y rituximab) y BR (bendamustina y rituximab) son eficaces tanto en la CLL recién diagnosticada como en la recidivante. El trasplante alogénico de médula ósea (células madre) rara vez se usa como tratamiento de primera línea para la CLL debido a su riesgo.

Otro tipo de leucemia es la leucemia linfoblástica aguda (ALL), también conocida como leucemia linfocítica aguda. La ALL se caracteriza por la sobreproducción y la multiplicación continua de glóbulos blancos malignos e inmaduros (también conocidos como linfoblastos) en la médula ósea. 'Aguda' se refiere al estado inmaduro e indiferenciado de los linfocitos circulantes ("blastos"), y a que la enfermedad progresa rápidamente con una esperanza de vida de semanas a meses si no se trata. La ALL es más común en la infancia con una incidencia máxima entre los 4 y 5 años de edad. Los niños de 12 a 16 años mueren más fácilmente que otros. Actualmente, por lo menos el 80% de la ALL infantil se considera curable. Cada año se diagnostican menos de 4.000 casos y la mortalidad es de casi 1.500 al año (American Cancer Society, 2006; y SEER Cancer Statistics Review).

La molécula CD 19 humana es un receptor de superficie celular estructuralmente distinto expresado en la superficie de las células B humanas incluyendo, pero no limitado a, células pre-B, células B en desarrollo temprano (es decir, células B inmaduras), células B maduras a través de diferenciación terminal en células plasmáticas y células B malignas. La CD 19 es expresada por la mayoría de las leucemias linfoblásticas agudas (ALL) pre-B, linfomas no Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas (CLL) de células B, leucemias prolinfocíticas, leucemias de células pilosas, leucemias linfocíticas agudas comunes y algunas leucemias linfoblásticas agudas nulas. (Nadler et al, J. Immunol., 131 :244-250 (1983), Loken et al, Blood, 70:1316-1324 (1987), Uckun et al, Blood, 71 :13-29 (1988), Anderson et al, 1984. Blood, 63:1424-1433 (1984), Scheuermann, Leuk. Lymphoma, 18:385-397(1995)). La expresión de CD 19 en células plasmáticas sugiere además que puede expresarse en tumores de células B diferenciadas como mieloma múltiple, plasmacitomas, tumores de Waldenstrom (Grosbard et al., Br. J. Haematol, 102:509-15 (1998); Treon et al, Semin. Oncol, 30:248-52 (2003)).

Por lo tanto, el antígeno de CD 19 es un objetivo para la inmunoterapia en el tratamiento del linfoma no Hodgkin (incluyendo cada uno de los subtipos descritos en la presente), la leucemia linfocítica crónica y/o la leucemia linfoblástica aguda.

Se han mostrado ciertas terapias de CD19. Se administraron células T que expresan un receptor de antígenos quiméricos (CAR) anti-CD19 que incluye tanto CD3-Z como el dominio coestimulador 4-BB a tres pacientes con CLL avanzada. Kalos et al., T cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia, Science Translational Medicine, vol. 3, N° 95 (10 de agosto de 2011), trataron a pacientes con CART que tenían una especificidad para CD19 una semana después de que los pacientes recibieran tratamiento con bendamustina. Por lo tanto, en el momento en que se administraron los CART, la bendamustina ya se ha depurado del cuerpo humano y puede excluirse un efecto sinérgico. Sadelain et al., The promise and potential pitfalls of chimeric antigen receptors, Current Opinion in Immunology, Elsevier, vol. 21, N° 2, 2 de abril de 2009 también describe receptores de antígenos quiméricos (CAR) anti-CD19. Sin embargo, ni Kalos et al. ni Sadelain et al. describen el anticuerpo específico para CD19 en combinación con bendamustina como se ejemplifica en la presente.

La bendamustina como terapia en el tratamiento del linfoma no Hodgkin se describió en Bremer et al., High rates of long lasting remission after 5-day bendamustine chemotherapy cycles in pre-treated low-grade non-Hodgkin's lymphomas, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, Springer International, Berlin, DE, vol.

128, N° 11, 1 de noviembre de 2002 y la WO2006065392 pero ninguno sugiere el anticuerpo específico para CD19 en combinación con bendamustina como se ejemplifica en la presente.

El uso de un anticuerpo CD19 en linfomas de células B no específicos se analiza en la WO2007076950 (US2007154473) junto con la mención superficial de la bendamustina dentro de una larga lista de posibles socios de combinación, pero ni enseña el anticuerpo ejemplificado en la presente ni sugiere los efectos sinérgicos de la combinación en el tratamiento del linfoma no Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica y/o la leucemia linfoblástica aguda como se ejemplifica en la presente.

El uso de un anticuerpo CD19 en CLL, NHL y ALL se describe en Scheuermann et al., CD19 Antigen in Leukemia and Lymphoma Diagnosis and Immunotherapy, Leukemia and Lymphoma, vol. 18, 385-397 (1995) pero no sugiere la combinación ejemplificada en la presente.

Los anticuerpos adicionales específicos para CD19 se describen en la WO2005012493 (US7109304), WO2010053716 (US12/266,999) (Immunomedics); WO2007002223 (US US8097703) (Medarex); WO2008022152 (12/377,251) y WO2008150494 (Xencor), WO2008031056 (US11/852,106) (Medimmune); WO 2007076950 (US 11/648,505 ) (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (US12/253,895) (Seattle Genetics); y WO2010095031 (12/710,442) (Glenmark Pharmaceuticals).

Las combinaciones de anticuerpos específicos para CD19 y otros agentes se describen en la WO2010151341 (US 13/377,514) (The Feinstein Institute); US5686072 (University of Texas), y WO2002022212 (PCT/US01/29026) (IDEC Pharmaceuticals)

Está claro que a pesar del progreso reciente en el descubrimiento y desarrollo de agentes anticancerígenos, muchas formas de cáncer que implican tumores que expresan CD19 aún tienen un mal pronóstico. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos mejorados para tratar tales formas de cáncer.

Sumario

Ni por sí sola ni en combinación, la técnica anterior sugiere los efectos sinérgicos de la combinación del anticuerpo ejemplificado y la bendamustina en el tratamiento del linfoma no Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica y/o la leucemia linfoblástica aguda.

La presente divulgación se refiere a una combinación sinérgica de un anticuerpo específico para CD19 y bendamustina para su uso en el tratamiento del linfoma no Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica o la leucemia linfoblástica aguda, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada variable de la secuencia

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 10) y una cadena ligera variable de la secuencia

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPD RFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 11) y un dominio constante de cadena pesada de la secuencia ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD

YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSK LTVDKSR-WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 12).

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una combinación sinérgica de un anticuerpo específico para CD19 y una mostaza nitrogenada. Tales combinaciones son útiles en el tratamiento de enfermedades malignas de células B como linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica o leucemia linfoblástica aguda.

Los modelos in vitro e in vivo se consideran indicativos de cómo se comportaría un determinado compuesto o combinación de compuestos en humanos. Además, cuando los compuestos se combinan in vitro o in vivo, se espera que la combinación tenga únicamente efectos aditivos. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que la combinación de un anticuerpo particular específico para CD19 y bendamustina mediaba un nivel sinérgico de muerte celular específica en una línea celular de leucemia de células B crónica (MEC-1) en comparación con el anticuerpo y la bendamustina solos. Este modelo in vitro es indicativo de cómo funcionará la combinación en el tratamiento de la leucemia linfoide crónica (CLL) en humanos. Además, y también inesperadamente, los inventores descubrieron que la combinación de un anticuerpo particular específico para CD19 y bendamustina inhibía el crecimiento tumoral y aumentaba sinérgicamente la mediana de días de supervivencia y el aumento mediano de la esperanza de vida, tanto en modelos de ratón SCID con linfoma de Burkitt, en comparación con el anticuerpo y la bendamustina solos. Estos modelos in vivo son indicativos de cómo funcionará la combinación en el tratamiento del linfoma no Hodgkin en humanos. En resumen, la combinación del anticuerpo anti-CD19 ejemplificado y la bendamustina se comportó sinérgicamente en modelos relevantes para NHL y CLL. Como tanto el NHL como la CLL son trastornos relacionados con las células B y CD19 se expresa en gran medida en las células B, la combinación ejemplificada tendría el mismo mecanismo de acción y también debería comportarse sinérgicamente en el tratamiento de otros trastornos relacionados con las células B, por ejemplo, la ALL.

Por lo tanto, la combinación del anticuerpo ejemplificado específico para CD19 y la bendamustina será eficaz en el tratamiento de humanos en linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica o leucemia linfoblástica aguda. Además, el anticuerpo específico para CD19 ejemplificado en la presente memoria descriptiva ya ha entrado en ensayos clínicos, donde tales combinaciones pueden confirmarse en humanos.

Como el mecanismo de acción de la bendamustina y otras mostazas nitrogenadas es similar, ya que son agentes alquilantes que forman enlaces cruzados entre cadenas (ICL) entre las bases del ADN, bloqueando por tanto los procesos fundamentales como la replicación y la transcripción, se cree que también debe observase sinergia cuando se trata a humanos que tienen linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica o leucemia linfoblástica aguda con una combinación del anticuerpo anti-CD19 ejemplificado y una mostaza nitrogenada distinta de bendamustina.

Como el anticuerpo anti-CD19 ejemplificado y otros anticuerpos anti-CD19 se unen a CD19, se cree que también debería observarse sinergia cuando se trata a humanos que tienen linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica o leucemia linfoblástica aguda con una combinación de cualquier anticuerpo anti-CD19 y una mostaza nitrogenada, por ejemplo, bendamustina.

Como el anticuerpo anti-CD19 ejemplificado se une a un epítopo específico de CD19, se cree que los anticuerpos que compiten de manera cruzada con el anticuerpo ejemplificado o se unen al mismo epítopo que el anticuerpo ejemplificado también deberían comportarse sinérgicamente cuando se trata a humanos que tienen linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica o leucemia linfoblástica aguda cuando se usa en combinación con una mostaza nitrogenada, por ejemplo, bendamustina.

Un aspecto de la presente divulgación comprende una combinación sinérgica en donde el anticuerpo específico para CD19 comprende una región HCDR1 de secuencia SYVMH (SEQ ID NO: 1), una región HCDR2 de secuencia NPYNDG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de secuencia GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de secuencia RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de secuencia RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), y una región LCDR3 de secuencia MQHLEYPIT (S^eQ ID NO: 6) y bendamustina. En aspectos preferidos, la combinación se usa para el tratamiento del linfoma no Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica o la leucemia linfoblástica aguda.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los efectos de citotoxicidad de MOR00208 y bendamustina solos y en combinación en células MEC-1.

La Figura 2 muestra las curvas de respuesta a la dosis de ADCC de la combinación de MOR00208 y bendamustina en células MEC-1.

La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de MOR00208.

La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones Fc de MOR00208.

La Figura 5 muestra los datos de destrucción específica normalizados de la Tabla 2.

La Figura 6 muestra los resultados del modelo de supervivencia del linfoma de células B de Burkitt Ramos humano en ratones SCID como se describe en el Ejemplo 3. La figura representa los datos mostrados en la Tabla 6, pero excluye las muertes relacionadas con el tratamiento.

La Figura 7 muestra el análisis estadístico de los resultados del modelo de crecimiento tumoral de linfoma de células B de Burkitt Ramos humano implantado subcutáneamente (SC) en ratones SCID, como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 8 muestra los resultados del modelo de crecimiento tumoral de linfoma de células B de Burkitt Ramos humano implantado por vía subcutánea (SC) en ratones SCID, como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 9 muestra los resultados del modelo de crecimiento tumoral de linfoma de células B de Burkitt Ramos humano implantado subcutáneamente (SC) en ratones SCID, como se describe en el Ejemplo 2. En esta figura, la dosificación de BEN es de 13 mg/kg.

La Figura 10 muestra los resultados del modelo de crecimiento tumoral de linfoma de células B de Burkitt Ramos humano implantado subcutáneamente (SC) en ratones SCID, como se describe en el Ejemplo 2. En esta figura, la dosificación de BEN es 16 mg/kg.

Descripción detallada de la invención

"Sinergia", "sinergismo" o "sinérgico" significan más que el efecto aditivo esperado de una combinación. El efecto de "sinergia", "sinergismo" o "sinérgico" de una combinación se determina en la presente mediante los métodos de Chou et al., Clarke et al., y/o Webb et al. Ver Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006). Ver también Clarke et al., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255-278 (1997). Ver también Webb, J. L. (1963) Enzyme and Metabolic Inhibitors, Academic Press, Nueva york.

El término "anticuerpo" significa anticuerpos monoclonales, incluyendo cualquier isotipo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Un anticuerpo de IgG se compone de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable. Cada región variable contiene tres segmentos denominados "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR") o "regiones hipervariables", que son principalmente responsables de unir un epítopo de un antígeno. Se denominan CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente desde el extremo N-terminal. Las porciones más altamente conservadas de las regiones variables fuera de las CDR se denominan "regiones marco". Un "fragmento de anticuerpo" significa un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' F(ab')2, u otro fragmento que contenga por lo menos una cadena pesada variable o ligera variable, cada una conteniendo las CDR y las regiones marco.

Una "mostaza nitrogenada" es un agente alquilante de ADN no específico que se usa como quimioterapia. Los agentes alquilantes añaden un grupo alquilo (CnH2n+1) a las bases de los ácidos nucleicos, por ejemplo, añadiendo un grupo alquilo a la base de guanina del ADN en el átomo de nitrógeno número 7 del anillo de imidazol. Los pasos de alquilación dan como resultado la formación de enlaces cruzados entre cadenas (ICL). Estos ICL son altamente citotóxicos, ya que bloquean procesos metabólicos fundamentales como la replicación y la transcripción. Las mostazas nitrogenadas incluyen ciclofosfamida, clorambucilo, uramustina, ifosfamida, melfalán y bendamustina.

La ciclofosfamida se comercializa como Endoxan, Cytoxan, Neosar, Procytox y Revimmune, y también se conoce como citofosfano. La ciclofosfamida, o combinaciones que incluyen ciclofosfamida, se usan en el tratamiento de linfomas, leucemia y algunos tumores sólidos. La ciclofosfamida tiene la siguiente estructura:

El clorambucilo se comercializa como Leukeran por GlaxoSmithKline. Se usa principalmente en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica. El clorambucilo tiene la siguiente estructura:

La uramustina se usa en el tratamiento del linfoma no Hodgkin. La uramustina tiene la siguiente estructura:

La ifosfamida se comercializa como Mitoxana e Ifex. La ifosfamida tiene la siguiente estructura:

El melfalán se comercializa como Alkeran. El melfalán tiene la siguiente estructura:

La bendamustina se comercializa con los nombres de Ribomustin® y Treanda®, y también se la conoce como SDX-105, por Mundipharma International Corporation Limited (licenciatario de Astellas Pharma GmbH) y Cephalon para el tratamiento de leucemias linfocíticas crónicas (CLL), linfoma no Hodgkin (NHL) de células B indolente y otros linfomas. La bendamustina tiene la siguiente estructura:

"BEN" cuando se usa en la presente significa bendamustina.

"VH" se refiere a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. "VL" se refiere a la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El término "CD19" se refiere a la proteína conocida como CD19, que tiene los siguientes sinónimos: B4, antígeno de linfocitos B CD19, antígeno de superficie de linfocitos B B4, CVID3, antígeno de diferenciación CD19, MGC12802 y antígeno de superficie de células T Leu-12.

La CD19 humana tiene la secuencia de aminoácidos de:

M PPPRLLFFLLFLTPM EVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTW SRESPLKPFLKLSL GLPGLGIHM RPLAIW LFIFNVSQQ M GGFYLCQPGPPSEKAW QPGW TVNVEGSGELFRW NVSDLG GLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLM SPKLYVW AKDRPEIW EGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTM APGS TLW LSCGVPPDSVSRGPLSW THVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDM W VM ETGLLLPRATAQDAGK YYCHRGNLTM SFHLEITARPVLW HW LLRTGGW KVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRK RM TDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAGRW AAGLGGTAPSYGNPSSDVQA DG ALG SRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGGDQLSQDGSGYENPEDEPLGPE DEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTM DFLSPHGSAW DPSREATSLGSQSYEDM RGILYAAPQLR SIRG QPGPNHEEDADSYENM DNPDGPDPAW GGGGRM GTW STR. (SEQ ID NO: 7) "MOR00208" es un anticuerpo anti-CD19. La secuencia de aminoácidos de los dominios variables se proporciona en la Figura 3. La secuencia de aminoácidos de las regiones Fc de cadena pesada y ligera de MOR00208 se proporciona en la Figura 4. "MOR00208" y "XmAb 5574" se usan como sinónimos para describir el anticuerpo mostrado en las Figuras 3 y 4. El anticuerpo MOR00208 se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° de serie 12/377,251.

Los anticuerpos adicionales específicos para CD19 se describen en la Patente de Estados Unidos N° 7,109,304 (Immunomedics); Solicitud de Estados Unidos N° de serie 11/917,750 (Medarex); Solicitud de Estados Unidos N° de serie 11/852,106 (Medimmune); Solicitud de Estados Unidos N° de serie 11/648.505 (Merck Patent GmbH); Patente de Estados Unidos N° 7,968,687 (Seattle Genetics); y Solicitud de Estados Unidos N° de serie 12/710,442 (Glenmark Pharmaceuticals).

"Región Fc" significa la región constante de un anticuerpo, que en humanos puede ser de la subclase IgG1, 2, 3, 4 u otras. Las secuencias de las regiones Fc humanas están disponibles en iMGT, Human IGH C-REGIONs, http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/ (consultado el 16 de mayo de 2011).

"RefmAb33" es un anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos es la siguiente:

Cadena pesada que incluye la región Fc:

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTAGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKKH YNPSLKDRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTATYYCARDMIFNFYFDVWGQGTTVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVGFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKE YKCKVSN KALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO: 8)

Cadena ligera que incluye la región Fc:

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASSRVGYMHWYGQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9)

RefmAb33 es específico para RSV y se usa como control de isotipo, ya que comparte la misma región Fc que MOR00208.

Una "combinación" significa más de un elemento, por ejemplo, un compuesto como un anticuerpo y bendamustina.

La presente divulgación también se refiere a combinaciones, productos farmacéuticos y composiciones farmacéuticas que contienen las combinaciones descritas. Los dos componentes de la combinación sinérgica de la presente invención, por ejemplo, el anticuerpo específico para CD19 y la bendamustina, pueden administrarse juntos, simultáneamente o por separado. Cuando se administran juntos, los dos componentes pueden formularse juntos en una composición farmacéutica, que puede incluir un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Alternativamente, los dos componentes también podrían formularse en diferentes composiciones farmacéuticas. En este caso, los dos componentes pueden administrarse simultáneamente o posteriormente. En una realización, la bendamustina se administra antes y/o por separado de la administración del anticuerpo específico para CD19, por ejemplo, MOR00208.

Una composición farmacéutica incluye un agente activo, por ejemplo, un anticuerpo para uso terapéutico en humanos. Una composición farmacéutica puede incluir portadores o excipientes aceptables.

"Administrado" o "administración" incluye, pero no se limita a la entrega por una forma inyectable como, por ejemplo, una vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea o vía mucosal, por ejemplo, como un espray o aerosol nasal para inhalación o como solución, cápsula o comprimido ingerible.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto o combinación se refiere a una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones clínicas de una enfermedad o trastorno dado y sus complicaciones. La cantidad que es eficaz para un propósito terapéutico particular dependerá de la gravedad de la enfermedad o lesión, así como del peso y estado general del sujeto. Se entenderá que la determinación de una dosificación apropiada puede lograrse usando experimentación rutinaria, construyendo una matriz de valores y probando diferentes puntos en la matriz, todo lo cual está dentro de las habilidades ordinarias de un médico o científico clínico capacitado.

Las "CDR" en la presente están definidas por Chothia et al o Kabat et al. Ver Chothia C, Lesk AM. (1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol., 196(4):901-17. Ver Kabat E.A, Wu T.T., Perry H.M., Gottesman K.S. y Foeller C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5a edición, Publicación NIH N° 91-3242, US Dept. of Health and Human Services, Washington, DC,.

"Competencia cruzada” significa la capacidad de un anticuerpo u otro agente de unión para interferir con la unión de otros anticuerpos o agentes de unión a CD19 en un ensayo estándar de unión competitiva. La capacidad o el grado en los que un anticuerpo u otro agente de unión puede interferir con la unión de otro anticuerpo o molécula de unión a CD19 y, por lo tanto, si puede decirse que compite de manera cruzada de acuerdo con la invención, pueden determinarse usando ensayos de unión de competición estándar. Un ensayo adecuado implica el uso de la tecnología Biacore (por ejemplo, usando el instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia)), que puede medir el grado de las interacciones usando la tecnología de resonancia de plasmones superficiales. Otro ensayo para medir la competencia cruzada usa un enfoque basado en ELISA. En la Solicitud de Patente Internacional N° WO 2003/48731 se describe un proceso de alto rendimiento para anticuerpos de "agrupamiento de epítopos" en base a su competencia cruzada.

El término "epítopo" incluye cualquier proteína determinante capaz de unirse específicamente a un anticuerpo o de interactuar de otro modo con una molécula. Los determinantes epitópicos consisten generalmente de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas como aminoácidos o cadenas laterales de carbohidratos o azúcares y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser "lineal" o "conformacional". El término "epítopo lineal" se refiere a un epítopo con todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula que interactúa (como un anticuerpo) que se producen linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína (continua). El término "epítopo conformacional" se refiere a un epítopo en el que los aminoácidos discontinuos se unen en una conformación tridimensional. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se producen a través de residuos de aminoácidos en la proteína que están separados entre sí.

"Se une al mismo epítopo que" significa la capacidad de un anticuerpo u otro agente de unión para unirse a CD19 y que tiene el mismo epítopo que el anticuerpo ejemplificado. Los epítopos del anticuerpo ejemplificado y otros anticuerpos para CD19 pueden determinarse usando técnicas estándar de mapeo de epítopos. Las técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. incluyen Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando concurrentemente un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos todavía están unidos a los soportes. Tales técnicas son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 4.708.871; Geysen et al, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al, (1986) Mol. Immunol. 23 :709-715. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos, por ejemplo, mediante intercambio de hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de las proteínas también pueden identificarse usando gráficos estándar de antigenicidad e hidropatía, como los calculados usando, por ejemplo, el programa de software Omiga versión 1.0 disponible de Oxford Molecular Group. Este programa informático emplea el método Hopp/Woods, Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828; para determinar perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al, (1982) J.Mol. Biol. 157: 105-132; para gráficos de hidropatía.

Realizaciones

Un aspecto de la presente divulgación comprende una combinación de un anticuerpo específico para CD19 y una mostaza nitrogenada para su uso en el tratamiento del linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica y/o leucemia linfoblástica aguda. En realizaciones, la combinación es sinérgica.

En la presente, la combinación del anticuerpo anti-CD19 ejemplificado y la bendamustina se comportó sinérgicamente en modelos in vitro e in vivo relevantes para NHL y CLL. Como tanto el NHL como la CLL son trastornos relacionados con las células B y CD19 se expresa en gran medida en las células B, la combinación ejemplificada debería tener el mismo mecanismo de acción y también debería comportarse sinérgicamente en el tratamiento de otros trastornos relacionados con las células B, por ejemplo, la ALL. Por lo tanto, la combinación del anticuerpo específico para CD19 ejemplificado y la bendamustina será eficaz en el tratamiento de humanos en linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica y/o leucemia linfoblástica aguda.

Como el mecanismo de acción de la bendamustina y otras mostazas nitrogenadas es similar, ya que son agentes alquilantes que forman enlaces cruzados entre cadenas (ICL) entre las bases del ADN, bloqueando por tanto procesos fundamentales como la replicación y la transcripción, se cree que la sinergia también debería observarse cuando se trata a humanos que tienen linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica y/o leucemia linfoblástica aguda con una combinación del anticuerpo anti-CD19 ejemplificado y una mostaza nitrogenada distinta de bendamustina, por ejemplo, ciclofosfamida, clorambucilo, uramustina, ifosfamida y melfalán.

Como el anticuerpo anti-CD19 ejemplificado y otros anticuerpos anti-CD19 se unen a CD19, se cree que también debería observarse sinergia cuando se trata a humanos con linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica y/o leucemia linfoblástica aguda con una combinación de cualquier anticuerpo anti-CD19 y una mostaza nitrogenada, donde el anticuerpo anti-CD19 se describe, por ejemplo, en la de solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 12/377,251 12/377,251 (Xencor), WO2005012493, WO2010053716 (Immunomedics); WO2007002223 (Medarex); WO2008022152 (Xencor); WO2008031056 (Medimmune); WO 2007/076950 (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (Seattle Genetics); y WO2010095031 (Glenmark Pharmaceuticals).

Como se divulga en la presente, el anticuerpo específico para CD19 comprende un anticuerpo que compite de manera cruzada con el anticuerpo que comprende una región HCDR1 de secuencia SYVMH (SEQ ID NO: 1), una región HCDR2 de secuencia NPYNDG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de secuencia GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de secuencia RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de secuencia RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), y una región LCDR3 de secuencia MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

Como se divulga en la presente, el anticuerpo específico para CD19 comprende un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende una región HCDR1 de secuencia SYVMH (SEQ ID NO: 1), una región HCDR2 de secuencia NPYNDG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de secuencia GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de secuencia RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de secuencia RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de secuencia M^qHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

Como se divulga en la presente, el anticuerpo específico para CD19 comprende una región HCDR1 de secuencia SYVMH (SEQ ID NO: 1), una región HCD^r2 de secuencia NPYNDG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de secuencia GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de secuencia RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de secuencia RMSⁿLⁿS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de secuencia MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

En realizaciones, el anticuerpo específico para CD19 comprende una cadena pesada variable de la secuencia EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO: 10) y una cadena ligera variable de la secuencia DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQK-PGQSPQLLIYR MSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 11) .

En realizaciones, el anticuerpo específico para CD19 comprende un dominio constante de cadena pesada de la secuencia

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK. (SEQ ID NO: 12)

En realizaciones, el anticuerpo específico para CD19 comprende un dominio constante de cadena ligera de la secuencia RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC. (SEQ ID NO: 13)

En realizaciones, la mostaza nitrogenada es bendamustina.

En realizaciones, los componentes de la combinación, el anticuerpo específico para CD19 y la bendamustina, se administran por separado. En una realización, la bendamustina se administra antes de la administración del anticuerpo específico para CD19.

Como se divulga en la presente, la combinación es una composición farmacéutica. Como se divulga en la presente, la composición comprende un portador aceptable. Como se divulga en la presente, la combinación se administra en una cantidad eficaz.

En otro aspecto, la combinación sinérgica de un anticuerpo específico para CD19 que comprende una región HCDR1 de secuencia SYVMH (SEQ ID NO: 1), una región HCDR2 de secuencia NPYn Dg (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de secuencia GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de secuencia RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de secuencia

RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), y una región LCDR3 de secuencia MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6) y bendamustina es capaz de mediar en la destrucción de células MEC-1 mediante ADCC en presencia de PBMC humanas aisladas con por lo menos dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor eficacia que la bendamustina sola.

Un aspecto de la presente divulgación comprende una combinación sinérgica de un anticuerpo específico para CD19 que comprende una región HCDR1 de secuencia SYVMH (SEQ ID NO: 1), una región HCDR2 de secuencia NPYNDG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de secuencia GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de secuencia RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de secuencia RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), y una región LCDR3 de secuencia m Qh LEYPIT (SeQ ID NO: 6) y bendamustina para el tratamiento de linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica y/o leucemia linfoblástica aguda. En realizaciones, el linfoma no Hodgkin se selecciona del grupo que consiste de linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeño, tejido linfoide asociado a mucosas, zona marginal, célula B grande difusa, Burkitt y célula del manto.

Otro aspecto comprende un método para tratar el linfoma no Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica y/o la leucemia linfoblástica aguda en un individuo con necesidad de ello, tal método comprende la administración de un anticuerpo específico para CD19 y una mostaza nitrogenada. En realizaciones del método, el anticuerpo específico para CD19 comprende una región HCDR1 de secuencia SYVMH (SEQ ID NO: 1), una región HCDR2 de secuencia NPYNDG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 de secuencia GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 de secuencia RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 de secuencia RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 de secuencia MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6). En las realizaciones del método, el anticuerpo comprende el anticuerpo ejemplificado específico para CD19. En realizaciones del método, la mostaza nitrogenada es bendamustina.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inhibición de la proliferación de células MEC-1 usando MOR00208 y bendamustina solos y en combinación

Materiales

Células MEC-1: línea celular de leucemia crónica de células B DSMZ# ACC497; Medio celular: medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) con GlutaMAX™, Invitrogen, N° de cat.: 31980-048, FCS al 20%; PBMC: RPM11640, con glutamina estable, PAN Biotech GmbH, N° de cat.: P04-13500 suplementado con FCS al 10%; Biocoll: Biochrome AG N° de CAT: L6115 N° de LOTE: 1050T; Bendamustina: Mundipharma N° de LOTE: 88018; FCS: PAN N° de CAT: 3302-P282403 N° de LOTE: P282403; y RefmAb33 (anti-RSV) con la misma región Fc que MOR00208.

Métodos

La citotoxicidad de MOR00208 y la bendamustina solos y en combinación se probó en células MEC-1. BEN es un agente alquilante, por lo tanto, funciona a través de la citotoxicidad directa en las células MEC-1. MOR00208 se dirige a CD19 y, además, funciona a través de ADCC en la destrucción de células MEC-1. Para los siguientes grupos se midió la destrucción de células MEC-1: BEN a 100 pg/ml; MOR00208 a 6,6pm y la combinación de MOR00208 a 6,6pm y BEN a 100 pg/ml. Estas concentraciones se eligieron porque están cerca o en la EC50 para MOR00208 y BEN. Como controles se usaron los siguientes: RefmAb33 o PBMC solos. Tanto en el grupo de BEN como en el grupo de combinación MOR00208+BEN, las células MEC-1 se preincubaron con BEN 48 horas antes de las mediciones del ensayo de ADCC. Las células MEC-1 se tiñeron usando 1 mg/ml de calceína AM, luego se contaron y se ajustaron a 2x105/ml. Las PBMC se contaron y ajustaron a 6x106/ml. Los ensayos de destrucción celular se realizaron de la siguiente manera: usando placas de 96 pocillos, se añadieron100 pl de suspensión celular de células MEC-1 por pocillo, luego se añadieron 100 pl de suspensión celular de PBMC a cada pocillo, lo que dio como resultado una relación E:T de 30:1. Los anticuerpos se diluyeron a 1 pg/ml en medio. Las células se centrifugaron y se volvieron a suspender. Al objetivo: sedimento de células efectoras, se añadieron 100 pl de solución de anticuerpo o la solución de control correspondiente. La mezcla se incubó durante 4 h en una incubadora de CO2 a 37° C. Las mediciones de destrucción celular se tomaron de la siguiente manera: la solución celular incubada (~100 pl) se transfirió a tubos FACS y se añadieron 200 pl de tampón FACS (DPBS FCS al 3%) y 0,5 pl de solución madre de PI a cada tubo. Se usó FACS-Calibur. Las células MEC-1 muertas se tiñeron con yoduro de propidio. La Tabla 1 y la Figura 1 muestran los datos en bruto.

T l 1

Los valores representan el % de células muertas. Cada experimento representa PBMC de diferentes donantes. Los controles usados para cada experimento fueron RefMab33.

La Tabla 2 muestra los datos en bruto de la Tabla 1 normalizados para muerte específica y los resultados de los cálculos de Chou realizados en la determinación del sinergismo.

T l 2

Los valores que se muestran en la Tabla 2 se calculan de la siguiente manera: 1) de los datos en bruto (% de células muertas) mostrados en la Tabla 1, se restaron los antecedentes (controles), dando como resultado la muerte específica para cada grupo de tratamiento; luego 2) los valores de muerte específicos se normalizaron estableciendo la combinación de MOR00208 BEN en 1. Las medias de la Tabla 2 se representan en la Figura 5. En la Figura 2 se muestran ejemplos de curvas de respuesta a la dosis de ADCC usadas en los cálculos del factor Chou de la combinación MOR00208 BEN.

Se completaron los cálculos del índice de Chou (IC) para determinar la sinergia de la combinación del anticuerpo anti-CD19 ejemplificado y la bendamustina en comparación con MOR00208 y BEN solos. Estos cálculos se describen en Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006) y Chou TC, Talalay P, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55 (1984). Los métodos de Chou-Talalay se llevan a cabo mediante el método Clisobol.

Ecuación de efecto mediano

La ecuación del efecto mediano realiza el modelo del efecto de un inhibidor (como un fármaco) como Fa/Fu =(D/D50)Am, donde D es la dosis, Fa y Fu es la fracción del sistema afectado y no afectado por la dosis D (Fa Fu = 1); D50 es la dosis que produce el efecto mediano (por ejemplo, IC50, ED50, LD50). La constante m determina la forma de la curva de efecto de la dosis.

Usamos el software Excel Fit para realizar un cálculo de regresión lineal para estimar los parámetros m y D50.

Los efectos de la combinación sobre las células MEC-1 se miden en % de muerte celular como se ha descrito anteriormente. Definimos la fracción Fu como la relación entre el % de muerte celular de la línea celular tratada con el % de muerte celular de la línea celular expuesta a un control. Es decir:

Fu = % de muerte celular (línea celular tratada)/ % muerte celular (línea celular no tratada) Entonces, el % de muerte celular de una línea celular es la constante D50 en la ecuación del efecto mediano, que puede estimarse mediante la regresión lineal descrita anteriormente.

Método Cl-isobol

El método Cl-isobol proporciona una evaluación cuantitativa del sinergismo entre fármacos. Se calcula un índice de combinación (Cl) a partir de los datos de efecto de la dosis de los tratamientos farmacológicos individuales y combinados. Un valor de Cl inferior a 1 indica sinergismo; Cl = 1 indica efecto aditivo; y Cl >1 indica antagonismo. La interacción farmacológica (sinergismo o antagonismo) es más pronunciada cuanto más lejos está el valor de Cl de 1.

Formalmente, el índice de combinación (Cl) de un tratamiento farmacológico combinado se define como CI = Di/Dxi D²/DX²

Aquí D1 y D2 son las dosis del fármaco 1 y el fármaco 2 de la combinación, respectivamente; y Dx1, y Dx2 es la dosis de un tratamiento con solo el fármaco 1 y el fármaco 2 que produciría el mismo efecto que el de la combinación. Las dosis Dx1 y Dx2 deben estimarse a partir de los datos de efecto de la dosis de los tratamientos con un solo fármaco. Esencialmente, se ajusta una ecuación de efecto mediano a los datos de cada fármaco. A partir de la ecuación del efecto mediano de un fármaco, podemos estimar la dosis (es decir, D) necesaria para producir un efecto (es decir, Fa, Fu). Cuanto más lejos se encuentra un punto de la línea aditiva, mayor será la diferencia entre 1 y su Cl, por tanto, más fuerte es el efecto (sinérgico o antagónico).

Resultados

Como se muestra en la Tabla 2, los valores del índice de Chou indican un claro sinergismo de la combinación de MOR00208 y bendamustina en la destrucción específica de células MEC-1 en comparación con MOR00208 y bendamustina solos. Esta conclusión se basa en los cálculos de Chou de 0,2, 0,7 y 0,75 de cada uno de los tres experimentos, respectivamente, con una media de 0,6, donde un CI <1 indica sinergismo. Por lo tanto, la combinación de MOR00208 y bendamustina también se comportará sinérgicamente en el tratamiento del linfoma no Hodgkin (NHL), la leucemia linfoide crónica (CLL) y la leucemia linfoblástica aguda (ALL) en humanos. Para confirmar los resultados de los cálculos de Chou anteriores, se evaluó la significancia estadística de los datos normalizados de la Tabla 2 usando la Prueba de Comparación Múltiple de Bonferroni. Ver James, et al, El agotamiento de células B mediado por anticuerpos antes de la inmunoterapia adoptiva con células T que expresan receptores de células T quiméricos específicos de CD20 facilita la erradicación de la leucemia en ratones inmunocompetentes, Blood, 114(27):5454-63 (Epub 30 de octubre de 2009). Los resultados se muestran en la Tabla 3.

T l

Resultados

Como se muestra en la Tabla 3, la Prueba de Comparación Múltiple de Bonferroni muestra que el tratamiento combinado de BEN MOR00208 es estadísticamente más eficaz en la destrucción específica de células MEC-1 que el tratamiento de BEN y MOR00208 solos.

Ejemplo 2: MOR00208 y BEN solos y en combinación en un modelo de crecimiento tumoral de linfoma de células B de Burkitt Ramos humano implantado por vía subcutánea (SC).

Materiales

Las células de linfoma de Burkitt humano RAMOS (número ATCC CRL-1596, lote N° 3953138); Control de vehículo: NaCl 150 mM, manitol 25 mg/ml, pH 5,5-6,0; (ajustado con NaOH 0,01 M). Ref_mAb_33_IgG_Xen (10 mg/ml en PBS, denominado Ref_mAb_33). Se adquirieron ratones CB-17 SCID hembra de seis semanas de edad (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrlcoCrl) de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) y se aclimataron en los laboratorios durante nueve días antes de la experimentación.

Métodos

A los ratones SCID se les implantaron por vía subcutánea células RAMOS (~5 x 106 células/ratón). Cuando los ratones tenían tumores de aproximadamente 150 mm3 de tamaño, o ~4 días después de la inoculación, se separaron en grupos, donde cada grupo tenía volúmenes de tumor relativamente del mismo tamaño. Los tratamientos comenzaron el día 15. Los regímenes de tratamiento se proporcionan en la Tabla 4. La duración del estudio fue de 60 días.

T l 4

Debido a un error técnico, MOR00208 el día 18 no se administró.

MOR00208 y bendamustina, se administraron en un volumen de 0,1 ml/10 g de peso corporal. MOR00208 y control de vehículo/Ref_mAb_33 a una concentración de 0,6/1,0 mg/ml, y bendamustina a una concentración de 1,3 y 1,6 mg/ml.

Las lecturas fueron 1) Mediana de días para alcanzar un tamaño de 4000 mg, donde el análisis estadístico se realizó usando la prueba de rango logarítmico y 2) Tamaño del tumor en el día 34 del estudio, donde el análisis estadístico se realizó usando ANOVA unidireccional y pruebas post-hoc de Bonferroni. (No se muestran los datos en bruto). Los pesos de los tumores se calcularon usando la ecuación (I x w2)/2, donde I y w se refieren a las dimensiones más grandes y más pequeñas recogidas en cada medición. Los resultados se muestran en las Figuras 7-10. La terapia de combinación no fue significativamente superior a las monoterapias respectivas en este modelo de subcorte, en comparación con la clara sinergia mostrada en el modelo de supervivencia ortotópica a continuación. Se considera que esto está relacionado con el régimen de dosificación de MOR00208 ineficaz en este modelo. Sin embargo, se cree que el modelo de supervivencia ortotópico descrito a continuación es más predictivo de como de bien funcionaría el tratamiento de combinación en el tratamiento de CLL, NHL y ALL en humanos, ya que el modelo ortotópico imita mejor la naturaleza de la enfermedad multifocal, incluyendo la participación del sistema vascular, en comparación con el modelo de tumor sólido subcortado anterior.

Ejemplo 3 MOR00208 y bendamustina solos y en combinación en tumor RAMOS no Hodgkin humano en modelo de supervivencia de ratones SCID

Materiales

Ciclofosfamida (Baxter, N° de Lote 1A548C); Control de vehículo: cloruro de sodio al 0,9%, 25 mg/ml de manitol, pH 6,5-6,8 (ajustado con NaOH 0,01 M); Ratones SCID (Universidad de Adelaida, Campus de Waite, Urrbaraie, SA, Australia, Cepa CB-17-Igh-1b- Prkdcscid); células de linfoma de Burkitt humano RAMOS (número ATCC CRL-1596); Ref_mAb_33_IgG_Xen (10 mg/ml en PBS, denominado Ref_mAb_33); Bendamustina (Mundipharma, N° de Lote 83889).

Métodos

Se pretrataron ratones SCID con ciclofosfamida (75 mg/kg, i.p., dos veces al día) durante dos días antes de la inoculación de células RAMOS (Días 2 y 1). El día de la inoculación (Día 0), los ratones se separaron en siete grupos de diez ratones cada uno y se les inocularon 1 x 106 células RAMOS a cada uno por vía intravenosa en la vena de la cola. El régimen de dosificación planificado para cada grupo se muestra en la Tabla 5 y comenzó el Día 3. La duración del estudio fue de 60 días.

T l R im n ifi i n

Los datos de supervivencia se muestran en la Tabla 6 y la Figura 6.

T l M r r n

A partir de los datos en bruto que se muestran en la Tabla 6, se calcularon tanto la supervivencia mediana en días como el aumento mediano de la vida útil. Se excluyeron de los cálculos todas las muertes relacionadas con el tratamiento. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

T l

La mediana del % de vida útil aumentada (ILS) se calcula de la siguiente manera:

Aumento % medio en Esperanza de vida = (Supervivencia-Tratamiento - Supervivencia mediacontroi)/ Supervivencia mediacontroi*100.

Los tiempos de supervivencia se miden en los días posteriores a la inoculación.

Clasificación de efectos combinatorios

La clasificación del efecto de la terapia de combinación MOR000208/Bendamustina (combo) se evaluó comparando el ILS de la combinación con el ILS agregado de las monoterapias respectivas:

Sinergia/Potenciación*: ILSCombo > ILSMOR00208 3 mg/kg ILSBendamustina. Los efectos sinérgicos se clasifican como potenciación si por lo menos una de las monoterapias no tiene efecto. Aditividad: ILSCombo = ILSMOR002083mg/kg ILSBendamustina. Antagonismo: ILSCombo < ILSMOR002083mg/kg ILSBendamustina.

Además de un análisis de los datos con el propósito de identificar la sinergia, también se completó el siguiente análisis estadístico. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando los valores medianos. Cualquier animal que murió inesperadamente o fue sacrificado antes del día 17 del estudio en los grupos de tratamiento del artículo de prueba se excluyó del cálculo del análisis de supervivencia. La muerte/sacrificio de estos animales se atribuyó a la toxicidad del compuesto en lugar de a la progresión de la enfermedad, ya que se produjeron mucho antes de las primeras muertes en los animales del control de vehículo. Se creó una curva de supervivencia usando el límite del producto de Kaplan y Meier, y las curvas de supervivencia se compararon usando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). Cuando se encontraron diferencias significativas, se realizó una comparación múltiple por pares (prueba de Holm-Sidak). La comparación se realaizó entre todos los grupos. Además, la comparación de los siguientes grupos se resumió en figuras separadas para cada artículo de prueba: Control de vehículo/Ref_mAb (grupo 10) frente a grupos de bendamustina (Grupos 2, 3 y 4) y Control de vehículo/Ref_mAb (grupo 10) frente a grupos de combinación (Grupos 5 y 6) o grupo de monoterapia de MOR0020 respectivo 8 (grupo 1). Se consideró significativo un valor de p inferior a 0,05. Los resultados se muestran en las Tablas 8-10.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una combinación sinérgica de un anticuerpo específico para CD19 y bendamustina para su uso en el tratamiento de linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica o leucemia linfoblástica aguda, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada variable de la secuencia EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDG TKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 10) y una cadena ligera variable de la secuencia DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSN LNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 11) y un dominio constante de cadena pesada de la secuencia

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ

SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE

LLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEGFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQV

YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 12).

2. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende un dominio constante de cadena ligera de la secuencia

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:

13).

3. La combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento del linfoma no Hodgkin, opcionalmente en donde el linfoma no Hodgkin se selecciona del grupo que consiste de linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas, linfoma de la zona marginal, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt y linfoma de células del manto.

4. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el linfoma no Hodgkin es linfoma folicular.

5. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el linfoma no Hodgkin es linfoma linfocítico pequeño.

6. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el linfoma no Hodgkin es linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas.

7. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el linfoma no Hodgkin es linfoma de la zona marginal.

8. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el linfoma no Hodgkin es linfoma difuso de células B grandes.

9. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el linfoma no Hodgkin es linfoma de Burkitt.

10. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el linfoma no Hodgkin es linfoma de células del manto.

11. La combinación de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica.

12. La combinación de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda.

13. La combinación para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los anticuerpos específicos para CD19 y bendamustina:

(a) se formulan juntos en una composición farmacéutica; o

(b) se formulan en diferentes composiciones farmacéuticas.

14. La combinación para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicho anticuerpo específico para CD19 y la bendamustina se administran simultáneamente.

15. La combinación para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la reivindicación 13(b), en donde dicho anticuerpo específico para CD19 y la bendamustina se administran por separado.

16. La combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la bendamustina se administra antes de la administración de dicho anticuerpo específico para CD19.