ES2909468T3 - Composición que comprende un conjugado que comprende un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento para fotoinmunoterapia - Google Patents

Composición que comprende un conjugado que comprende un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento para fotoinmunoterapia Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un conjugado que comprende un colorante de ftalocianina unido a cetuximab para su uso en un programa de dosificación para tratar un tumor en un sujeto humano, en donde el programa de dosificación comprende: (a) administrar por vía intravenosa al sujeto humano que tiene un tumor, el conjugado en una cantidad que es o es aproximadamente 320 mg/m2 o que es o es aproximadamente 640 mg/m2; y (b) después de administrar el conjugado, irradiar el tumor a una longitud de onda de 600 nm a 850 nm a una dosis de 5 J cm-2 a 200 J-cm-2 o de 20 J/cm de longitud de fibra hasta 500 J/cm de longitud de fibra.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición que comprende un conjugado que comprende un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento para fotoinmunoterapia
Listado de secuencias
La presente solicitud se presenta con un listado de secuencias en formato electrónico. El listado de secuencias se proporciona como un archivo titulado 751702000440seqlist.txt, creado el 18 de agosto de 2016, que tiene un tamaño de 9.934 bites.
Campo
La presente divulgación se refiere a conjugados, composiciones y métodos para su uso en fotoinmunoterapia, tal como fotoinmunoterapia inducida por la activación de un colorante de ftalocianina conjugado con una molécula de direccionamiento que se une a una proteína en la célula, por ejemplo, un conjugado de IR700 y anticuerpo. La presente divulgación también se refiere a terapias de combinación para su uso en combinación con fotoinmunoterapia, tal como fotoinmunoterapia inducida por la activación de un colorante de ftalocianina conjugado con una molécula de direccionamiento que se dirige a una célula tumoral, por ejemplo, un conjugado de IR700 y anticuerpo. En algunas realizaciones, el conjugado de ftalocianina-colorante puede activarse mediante irradiación con luz infrarroja cercana. Las características de los conjugados, composiciones, combinaciones y métodos, incluyendo la dosis del conjugado, proporcionan diversas ventajas, tales como menor toxicidad y/o eficacia mejorada. En algunas realizaciones, la divulgación también se refiere a un conjugado de ftalocianina-colorante con doble marcador en el que la molécula de direccionamiento se conjuga con un colorante fluorescente adicional, que se puede utilizar para fotoinmunoterapia mientras que también presenta, por ejemplo, un rendimiento mejorado para la obtención de imágenes o detección. La divulgación también proporciona métodos terapéuticos que usan los conjugados, composiciones y combinaciones para el tratamiento de enfermedades y afecciones, incluyendo tumores o cánceres.
Antecedentes
Hay varias terapias disponibles para tratar enfermedades, tales como un cáncer. Por ejemplo, la fotoinmunoterapia (PIT, del inglés "photoimmunotherapy") es un método que utiliza un fotosensibilizador conjugado con un anticuerpo u otra molécula de direccionamiento para dirigirse a una proteína de la superficie celular a fin de permitir la destrucción dirigida de células específicas. En algunos casos, la PIT puede dirigirse de manera selectiva a células enfermas, tales como células tumorales, y de ese modo destruyen de manera selectiva dichas células sin dañar las células sanas. Se necesitan mejores estrategias para mejorar los métodos de fotoinmunoterapia, por ejemplo, para aumentar la eficacia del tratamiento. Se proporcionan composiciones para su uso en métodos que satisfacen dichas necesidades.
Sato et al., Molecular Oncology (2014) 8(3):620-632 describe la eficacia comparativa de dos anticuerpos monoclonales dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico en fotoinmunoterapia.
El documento WO 2017/031363 describe métodos para fabricar conjugados de colorante de ftalocianina y conjugados estables, y composiciones que comprenden conjugados de colorante de ftalocianina.
La entrada de Clinicaltrials.gov para el estudio NTC02422979 describe un estudio clínico que implica la administración de RM-1929 y fotoinmunoterapia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello recurrente.
Sumario
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado que comprende un colorante de ftalocianina unido a cetuximab para su uso en un programa de dosificación para tratar un tumor en un sujeto humano, en donde el programa de dosificación comprende:
(a) administrar por vía intravenosa al sujeto humano que tiene un tumor, el conjugado en una cantidad que es o es aproximadamente 320 mg/m2 o que es o es aproximadamente 640 mg/m2; y
(b) después de administrar el conjugado, irradiar el tumor a una longitud de onda de 600 nm a 850 nm a una dosis de 5 J cm-2 a 200 J cm-2 o de 20 J/cm de longitud de fibra hasta 500 J/cm de longitud de fibra.
Obsérvese que el alcance de la invención se define por medio de las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que esté fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines de información. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del organismo humano (o animal) mediante terapia.
En algunas realizaciones se divulga un método para tratar una enfermedad o afección en un sujeto que contiene el uso de fotoinmunoterapia (PIT). En algunas realizaciones, el método incluye administrar al sujeto que tiene una enfermedad o afección un conjugado que contiene un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento, tal como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína en la superficie de una célula presente en el microambiente de una lesión asociada con la enfermedad o afección. En algunas realizaciones, el conjugado se administra para lograr una exposición sistémica que no supere el 75 % de la exposición sistémica terapéuticamente eficaz total del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que no está así conjugado para tratar la misma enfermedad o afección como se describe en la etiqueta aprobada para la comercialización por las agencias reguladoras (por ejemplo, FDA, EMA, PDMA). En algunas realizaciones, después de administrar el conjugado, la lesión se irradia a una longitud de onda de 500 a 900 nm a una dosis de al menos 1 J cm-2 o 1 J/cm de longitud de fibra tratando así el tumor en el sujeto. En algunas realizaciones, la longitud de onda para la irradiación es de 600 nm a 850 m, tal como de 660 nm a 740 nm.
En algunas realizaciones, el conjugado se administra en un programa de dosificación en el que: la administración del conjugado se realiza una sola vez como una sola inyección o infusión; o el programa de dosificación no incluye una dosis posterior del conjugado; o el programa de dosificación no incluye una dosis posterior de la molécula de direccionamiento, por ejemplo, una macromolécula, que no está así conjugada.
El conjugado se administra por vía intravenosa.
En algunas realizaciones, el conjugado se administra para lograr una exposición sistémica (AUC) que no sea más del 60 %, no más del 50 %, no más del 40 % o no más del 30 % de la exposición sistémica terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que no está así conjugado para tratar la misma enfermedad o afección.
En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un tumor, por lo que el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno se une a una molécula en la superficie de una célula presente en el microambiente tumoral y se irradia el tumor.
En algunas realizaciones se divulga un método para tratar una enfermedad o afección en un sujeto utilizando fotoinmunoterapia (PIT) en donde la exposición sistémica medida por el área bajo la curva de concentración del conjugado-tiempo en plasma promedio desde el tiempo 0 hasta el infinito (AUC(del inglés "area under the curve" )[0-inf ] o AUC0-~) para una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra después de la administración del conjugado está entre o entre aproximadamente 250 jg/ml*h y 100.000 |jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 50.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 18.000 jg/ml*h, o entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 10.000 jg/ml*h. En algunas realizaciones, la exposición sistémica medida por el área bajo la curva de concentración del conjugado-tiempo en plasma promedio desde el tiempo 0 hasta el infinito (AUC[0-inf] o AUC0-~) para una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra después de la administración del conjugado no es más de 100.000 jg/ml*h, no más de 75.000 jg/ml*h, no más de 50.000 jg/ml*h, no más de 40.000 jg/ml*h, no más de 30.000 jg/ml*h, no más de 20.000 jg/ml*h, no más de 10.000 jg/ml*h, no más de 5.000 jg/ml*h, o no más de 2.500 jg/ml*h.
En algunas realizaciones, la exposición sistémica medida por el área bajo la curva de concentración del conjugadotiempo en plasma promedio desde el tiempo 0 a 24 horas (AUC[0- 24] o AUC0-24) para una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra después de la administración del conjugado está entre o entre aproximadamente 100 jg/ml*h y 25.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 200 jg/ml*h y 10.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 5.000 jg/ml*h; o la exposición sistémica medida por el área bajo la curva de concentración del conjugado-tiempo en plasma promedio desde el tiempo 0 a 24 horas (AUC[0-24] o AUC0-24) para una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra después de la administración del conjugado no es más de 25.000 jg/ml*h, no más de 15.000 jg/ml*h, no más de 10.000 jg/ml*h, no más de 5.000 jg/ml*h, no más de 2.500 jg/ml*h, no más de 1.000 jg/ml*h, o no más de 500 jg/ml*h.
El conjugado se administra a una dosis que es o es de aproximadamente 320 mg/m2, o 640 mg/m2 (área de superficie corporal del sujeto).
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que es un Fab, un solo dominio Vh, un fragmento variable monocatenario (scFv), un scFv multivalente, un scFv biespecífico o un dímero de scFv y CH3.
En algunas realizaciones, la lesión se irradia a una longitud de onda de 690 ± 50 nm o a una longitud de onda de aproximadamente 690 ± 20 nm. En algunas realizaciones, la lesión se irradia a una dosis de al menos o al menos aproximadamente 5 J/cm-2, 10 J/cm-2, 25 J cm-2, 50 J cm-2, 75 J cm-2, 100 Jcm -2 o 150 J cm-2; o la lesión se irradia a una dosis de al menos o al menos aproximadamente 25 J/cm de longitud de fibra, 50 J/cm de longitud de fibra, 75 J/cm de longitud de fibra, 100 J/cm de longitud de fibra, 150 J/cm de longitud de fibra, 200 J/cm de longitud de fibra, 250 J/cm de longitud de fibra, 300 J/cm de longitud de fibra o 400 J/cm de longitud de fibra.
En algunas realizaciones, la irradiación se realiza o se efectúa entre o entre aproximadamente 30 minutos y 96 horas después de la administración del conjugado. En algunas realizaciones, el conjugado se administra en un programa de dosificación en el que la administración del conjugado se realiza solo una vez como una sola inyección o infusión. En algunas realizaciones, el conjugado se administra en un programa de dosificación en el que el programa de dosificación no contiene una dosis posterior del conjugado. En algunas realizaciones, el conjugado se administra en un programa de dosificación en el que el programa de dosificación no contiene una dosis posterior de la molécula de direccionamiento que no está así conjugada. En algunas realizaciones, se repite el programa de dosificación.
El conjugado se administra por vía intravenosa.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina tiene una longitud de onda de absorción máxima desde o desde aproximadamente 600 nm a aproximadamente 850 nm.
El colorante de ftalocianina está unido directa o indirectamente a la molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina incluye la fórmula:
Figure imgf000004_0001
en donde:
L es un enlazador;
Q es un grupo reactivo para la unión del colorante a la molécula de direccionamiento;
R2, R3, R7y R8 cada uno se selecciona de manera independiente entre alquilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido;
R4, R5, R6, R9, R10, y R11 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, alcanoilo opcionalmente sustituido, alcoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquil carbamoílo opcionalmente sustituido y un ligando quelante, en donde al menos uno de R4, R5, R6, R9, R10 y R11 incluye un grupo soluble en agua; R12,
R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22 y R23 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, halógeno, alquiltio opcionalmente sustituido, alquilamino opcionalmente sustituido y alcoxi opcionalmente sustituido; y
X2 y X3 son cada uno de manera independiente alquileno C1-C10, opcionalmente interrumpido por un heteroátomo.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina incluye la fórmula:
Figure imgf000005_0001
X1 y X4 son cada uno de manera independiente un alquileno C1-C10 opcionalmente interrumpido por un heteroátomo;
R2, R3, R7y R8 cada uno se selecciona de manera independiente entre alquilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido;
R4, R5, R6, R9, R10, y R11 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, alcanoilo opcionalmente sustituido, alcoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquilcarbamoílo opcionalmente sustituido y un ligando quelante, en donde al menos uno de R4, R5, R6, R9, R10 y R11 incluye un grupo soluble en agua; y
R16, R17, R18 y R19 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, halógeno, alquiltio opcionalmente sustituido, alquilamino opcionalmente sustituido y alcoxi opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina incluye IRDye 700DX (IR700).
En algunas realizaciones divulgadas, la proteína de la superficie celular se selecciona entre ACTHR, anxa-1 de células endoteliales, aminopetidasa N, anti-IL-6R, integrina a-4, integrina a-5-p-3, integrina a-5-p-5, a-fetoproteína (AFP), ANPA, ANPB, APA, APN, APP, 1AR, 2AR, AT1, B1, B2, BAGE1, BAGE2, receptor de linfocitos B BB1, BB2, BB4, receptor de calcitonina, antígeno de cáncer 125 (CA 125), CCK1, CCK2, CD5, CD10, CD11a, CD13, CD14, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD45, CD52, CD56, CD68, CD90, CD133, CD7, CD15, CD34, CD44, CD206, CD271, CEA (antígeno carcinoembrionario), CGRP, receptores de quimiocina, anexina-1 de la superficie celular, plectina-1 de la superficie celular, cripto-1, CRLR, CXCR2, CXCR4, dCc , DLL3, glucoproteína E2, eGf R, EGFRvIII, EMR1, endosialina, EP2, EP4, EpcAlVI, EphA2, receptores de ET, fibronectina, fibronectina ED-B, FGFR, receptores de Frizzled, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, receptor GLP-1, receptores acoplados a la proteína g de la familia A (similares a la rodopsina), receptores acoplados a la proteína g de la familia B (similares al receptor de secretina), receptores acoplados a la proteína g de la familia C (similar al receptor metabotrópico de glutamato), GD2, GP100, GP120, glipicano-3, hemaglutinina, sulfatos de heparina, HER1, HER2, HER3, HER4, HMFG, antígenos de HPV 16/18 y E6/E7, hTERT, IL11-R, IL-13R, ITGAM, calecreína-9, Lewis Y, receptor de LH, LHRH-R, LPA1, MAC-1, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MART1, MC1R, mesotelina, MUC1, MUC16, Neu (nucleolina de la superficie celular), neprilisina, neuropilina-1, neuropilina-2, NG2, NK1, NK2, NK3, NMB-R, Notch-1, NY-ESO-1, OT-R, mutante p53, antígeno de melanoma p97, NTR2, NTR3, p32 (p32/gC1q-R/HABP1), p75, PAC1, PARI, Patched (PTCH), PDGFR, receptores de PDFG, PDT, colágeno IV escindido por proteasa, proteinasa 3, prohibitina, proteína tirosina cinasa 7, PSA, PSMA, familia P2X purinérgica (por ejemplo, P2X1-5), mutante Ras, Ra MP1, RAMP2, RAMP3 parcheado, receptor de RET, plexinas, smoothened, sst1, sst2A, sst2B, sst3, sst4, sst5, sustancia P, TEMs, receptor CD3 de linfocitos T, TAG72, TGFBR1, TGFBR2, Tie-1, Tie-2, Trk-A, Trk-B, Trk-C, TR1, TRPA, TRPC, TRPV, TRPM, TRPML, TRPP (por ejemplo, TRPV1-6, TRPA1, TRPC1-7, TRPM1-8, TRPP1-5, TRPML1-3), receptor de TSH, receptores de VEGF (VEGFR1 o Flt-1, VEGFR2 o FLK-1/KDR, y VEGF-3 o FLT-4), canales iónicos dependientes de voltaje, VPAC1, VPAC2, tumor 1 de Wilms, Y1, Y2, Y4 e Y5. En algunas realizaciones, la proteína de la superficie celular se selecciona entre HER1/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (receptor de IL-2Ra), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6, antígeno de cáncer 125 (CA125), a-fetoproteína (AFP), Lewis Y, TAG72, caprina-1, mesotelina, receptor de PDGF, PD-1, PD-L1, CTLA-4, receptor IL-2, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, glipicano-3, gpA33, mucinas, CAIX, PSMA, proteína de unión a folato, gangliósidos (tales como GD2, GD3, GM1 y GM2), receptor de VEGF (VEGFR), integrina aVp3, integrina a5p1, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, AFP, complejo BCR, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 p, antígeno HLA-DR, IgE, MUC-1, nuC242, antígeno PEM, metaloproteinasas, receptor de efrina, ligandos de efrina, receptor de HGF, CXCR4, CXCR4, receptor de bombesina y antígeno SK-1.
En algunas realizaciones, la proteína de la superficie celular se selecciona entre CD25, PD-1 (CD279), PD-L1 (CD274, B7-H1), PD-L2 (CD273, B7-DC), CTLA-4, LAG3 (CD223), TIM3 (HAVCR2), 4-1BB (CD137, TNFRSF9), CXCR2, CXCR4 (CD 184), CD27, CEACAM1, Galectina 9, BTLA, CD160, VISTA (homólogo de PD1), B7-H4 (VCTN1), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD28, HHLA2 (B7-H7), CD28H, CD155, CD226, TIGIT, CD96, Galectina 3, CD40, CD40L, CD70, LIGHT (TNFSF14), HVEM (TNFRSF14), B7-H3 (CD276), Ox40L (TNFSF4), CD137L (TNFSF9, GITRL), B7RP1, ICOS (CD278), ICOSL, KIR, GAL9, NKG2A (CD94), GARP, TL1A, TNFRSF25, TMIGD2, BTNL2, familia de la butirofilina, CD48, c D244, familia Siglec, CD30, CSF1R, MiCA (secuencia A relacionada con el polipéptido MHC de clase I), MICB (secuencia B relacionada con el polipéptido MHC de clase I), NKG2D, familia KIR (receptor similar a la inmunoglobulina de células citolíticas, familia LILR (receptores similares a la inmunoglobulina leucocitaria, CD85, ILTs, LIRs), SIRPA (proteína reguladora de señales a), CD47 (IAP), neuropilina 1 (NRP-1) un VEGFR y VEGF.
El anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno es cetuximab o es un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el conjugado es cetuximab-IR700.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo que es cetuximab o es un fragmento de unión a antígeno del mismo o el conjugado es cetuximab-IR700.
En algunas realizaciones, el área bajo la curva de concentración del conjugado-tiempo en plasma promedio desde el tiempo 0 hasta el infinito (AUC[0-inf] o AUCo-~) para una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra después de la administración del conjugado está entre o entre aproximadamente 500 |jg/ml*h y 18.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 10.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 5.000 jg/ml*h, o entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 2.500 jg/ml*h. En algunas realizaciones, el área bajo la curva de concentración del conjugado-tiempo en plasma promedio desde el tiempo 0 a 24 horas (AUC[0-24] o AUC0-24) para una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra después de la administración del conjugado está entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 8.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 5.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 2.000 jg/ml*h o entre o entre aproximadamente 1000 jg/ml*h y 4.000 jg/ml*h.
En algunas realizaciones, el conjugado se administra en un intervalo de dosificación que es al menos aproximadamente o es aproximadamente 320 mg/m2, o 640 mg/m2 (área de superficie corporal del sujeto).
En algunas realizaciones se proporciona un conjugado de cetuximab IR700 para su uso en un método para tratar una lesión de enfermedad en un sujeto, el cual incluye: a) administrar por vía intravenosa a un sujeto que tiene una lesión asociada con una enfermedad o afección el conjugado cetuximab-IR700, en donde el conjugado se administra en una cantidad que es o es aproximadamente 640 mg/m2; y b) después de administrar el conjugado, irradiar la lesión a una longitud de onda de 690 ± 20 nm a una dosis de al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 50 J cirr2o 100 J/cm de longitud de fibra, tratando así la enfermedad o afección en el sujeto. En algunas realizaciones, el conjugado se administra en un programa de dosificación en el que: la administración del conjugado se realiza una sola vez como una sola inyección o infusión; o el programa de dosificación no incluye una dosis posterior del conjugado; o el programa de dosificación no incluye una dosis posterior de la molécula de direccionamiento que no está así conjugada.
En algunas realizaciones, la irradiación se realiza 24 horas ± 3 horas, tal como 24 horas ± 2 horas, después de administrar el conjugado.
La lesión es un tumor y la enfermedad o afección es un tumor o cáncer.
En algunas realizaciones, la lesión es un tumor que es un tumor superficial. En algunas realizaciones, el tumor tiene menos de 10 mm de espesor. En algunas realizaciones, la irradiación se realiza utilizando una fibra con punta de microlente para la iluminación de la superficie. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación de luz es de aproximadamente 5 J/cm2 a aproximadamente 200 J/cm2.
En algunas realizaciones se describe un método para tratar un tumor superficial con fotoinmunoterapia, que incluye iluminar un tumor superficial en un sujeto con una fibra con punta de microlente para la iluminación de la superficie con una dosis de luz de o de aproximadamente 5 J/cm2 a aproximadamente 200 J/cm2, en donde el tumor está asociado con un agente fototóxico que incluye una molécula de direccionamiento unida a una molécula de la superficie celular del tumor. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación de luz es o es aproximadamente 50 J/cm2.
En algunas realizaciones, la lesión es un tumor que es un tumor intersticial. En algunas realizaciones, el tumor mide más de 10 mm de profundidad o es un tumor subcutáneo. En algunas realizaciones, la irradiación se realiza utilizando fibras difusoras cilíndricas que incluyen una longitud de difusor de 0,5 cm a 10 cm y separadas 1,8 ± 0,2 cm. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación de luz es de o de aproximadamente 20 J/cm de longitud de fibra a aproximadamente 500 J/cm de longitud de fibra.
En algunas realizaciones se describe un método para tratar un tumor intersticial con fotoinmunoterapia, que incluye iluminar un tumor intersticial en un sujeto con fibras difusoras cilíndricas que incluyen una longitud de difusor de 0,5 cm a 10 cm y separadas 1,8 ± 0,2 cm con una dosis de luz de o aproximadamente 100 J/cm de longitud de fibra o con una tasa de fluencia de o de aproximadamente 400 mW/cm, en donde el tumor está asociado con un agente fototóxico que incluye una molécula de direccionamiento unida a una molécula de la superficie celular del tumor. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación de luz es de o de aproximadamente 50 J/cm de longitud de fibra a aproximadamente 300 J/cm de longitud de fibra. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación de luz es o es aproximadamente 100 J/cm de longitud de fibra.
En algunas realizaciones, el tumor mide más de 10 mm de profundidad o es un tumor subcutáneo. En algunas realizaciones, las fibras difusoras cilíndricas se colocan en un catéter ubicado en el tumor con una separación de 1,8 ± 0,2 cm. En algunas realizaciones, el catéter es ópticamente transparente.
En algunas realizaciones, más de 6 horas antes de iluminar el tumor, al sujeto se le ha administrado el agente fototóxico que incluye la molécula de direccionamiento, en donde el agente fototóxico se asocia con el tumor. En algunas realizaciones, el agente fototóxico se ha administrado previamente al sujeto más o más de aproximadamente 12 horas, 24 horas, 26 horas, 48 horas, 72 horas o 96 horas antes de iluminar el tumor. En algunas realizaciones, el agente fototóxico es un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es IR700.
En algunas realizaciones, en cualquiera de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, el programa de dosificación se repite, por lo que se repiten las etapas (a) y (b). En algunas realizaciones, el programa de dosificación se repite si queda lesión residual después de un tratamiento previo con el conjugado. En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente evaluar al sujeto para determinar la presencia de una lesión residual y si la lesión residual permanece, repetir el programa de dosificación. En algunas realizaciones, el programa de dosificación se repite si permanece una lesión residual en un tiempo que es superior a o aproximadamente o 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 6 meses o 1 año después del inicio de la administración previa del conjugado. En algunas realizaciones, el programa de dosificación se repite si permanece una lesión residual a o aproximadamente a las 4 semanas después del inicio de la administración previa del conjugado.
En algunas realizaciones, el conjugado contiene de 1 a 100, de 1 a 10 o de 2 a 5 moléculas de colorante de ftalocianina por molécula de direccionamiento.
En algunas realizaciones, el método no contiene la administración de un agente terapéutico adicional o tratamiento contra el cáncer. En algunas realizaciones, el método contiene la administración de un agente terapéutico adicional o un tratamiento contra el cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento contra el cáncer contiene radioterapia. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente anticanceroso o un agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente de modulación inmunitaria que es un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el inhibidor del puntos de control inmunitario se une específicamente a una molécula seleccionada entre CD25, PD-1, PD-L1, p D-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, 4-1BB, GITR, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CXCR2, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, CD28 y VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, una molécula pequeña o un polipéptido. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona entre nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A, ipilimumab, tremelimumab, IMP31, BMS-986016, urelumab, TRX518, dacetuzumab, lucatumumab, SEQ-CD40, CP-870, CP-893, MED16469, MEDI4736, MOXR0916, AMP-224 y MSB001078C o es un fragmento de unión a antígeno de los mismos.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se administra antes de irradiar la lesión o el tumor. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se administra más de o más de aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 96 horas, una semana, dos semanas, tres semanas o un mes antes de irradiar el tumor.
En algunas realizaciones, los métodos divulgados incluyen la administración continua del agente inmunomodulador posterior a la irradiación tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes.
En algunas realizaciones se divulga un método para tratar un tumor en un sujeto que incluye: a) administrar a un sujeto un agente inmunomodulador; b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado que incluye un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento capaz de unirse a una molécula en la superficie de una célula presente en el microambiente de un tumor; y c) más de 12 horas después de la administración del agente inmunomodulador, irradiar el tumor a una longitud de onda que hace que el conjugado sea citotóxico, tratando así el tumor. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se administra más de o más de aproximadamente 24 horas, 48 horas, 96 horas, una semana, dos semanas, tres semanas o un mes antes de irradiar el tumor.
En algunas realizaciones, el conjugado se une a una proteína en la superficie de una célula presente en el microambiente del tumor. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados, la etapa c) de irradiar el tumor se realiza i) después de la administración del agente inmunomodulador y después de la administración del conjugado o ii) solamente después de la administración del conjugado.
En algunas realizaciones, el conjugado se administra antes de, simultáneamente o posteriormente a la administración del agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el conjugado se administra después de administrar el agente inmunomodulador, pero antes de irradiar el tumor. En algunas realizaciones, el conjugado se administra desde o desde aproximadamente 12 horas hasta 48 horas antes de irradiar el tumor y el agente inmunomodulador se administra desde o desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 1 mes antes de irradiar el tumor.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el inhibidor del puntos de control inmunitario se une específicamente a una molécula seleccionada entre CD25, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, 4-1BB, GITR, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CXCR2, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, CD28 y VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, una molécula pequeña o un polipéptido. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario se selecciona entre nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A, ipilimumab, tremelimumab, IMP31, BMS-986016, urelumab, TRX518, dacetuzumab, lucatumumab, SEQ-CD40, CP-870, CP-893, MED16469, MEDI4736, MOXR0916, AMP-224 y MSB001078C o es un fragmento de unión a antígeno de los mismos de cualquiera de los anteriores.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador que es un agente desmetilante que aumenta la expresión de un antígeno asociado a tumores (TAA, del inglés "tumor associated antigen") o es una citocina.
En algunas realizaciones, los métodos divulgados incluyen la administración continua del agente inmunomodulador posterior a la irradiación tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes.
En algunas realizaciones se describe un método para tratar un tumor en un sujeto que incluye: a) administrar a un sujeto un agente inmunomodulador que potencia la expresión de una molécula en la superficie de una célula presente en el microambiente del tumor; b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado que incluye un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento que es capaz de unirse a la molécula de la superficie celular; y c) más de 5 minutos después de administrar el conjugado, irradiar el tumor a una longitud de onda que hace que el conjugado sea citotóxico, tratando así el tumor.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es una citocina o es un agente que induce una mayor expresión de una citocina en el microambiente tumoral. En algunas realizaciones, la citocina es interferón gamma. En algunas realizaciones, la molécula en la superficie de las células se selecciona de CD25, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, 4-1BB, GITR, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CXCR2, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, CD28 y VISTA. En algunas realizaciones, la molécula en la superficie de la célula es PD-L1.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un inhibidor de puntos de control inmunitario.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una molécula pequeña o un polipéptido. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se selecciona entre nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A, ipilimumab, tremelimumab, IMP31, BMS-986016, urelumab, TRX518, dacetuzumab, lucatumumab, SEQ-CD40, CP-870, CP-893, MED 16469, MED14736, MOXR0916, AMP-224 y MSB001078C o es un fragmento de unión a antígeno de los mismos de cualquiera de los anteriores.
En algunas realizaciones se describe un método para tratar un tumor en un sujeto que incluye: a) administrar a un sujeto un conjugado que incluye un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento capaz de unirse a una molécula de superficie celular en una célula en el microambiente del tumor; b) más de 5 minutos después de administrar el conjugado, irradiar el tumor a una longitud de onda que hace que el conjugado sea citotóxico, en donde el tratamiento del tumor con el conjugado seguido de irradiación con luz aumenta la presencia de células inmunosupresoras en el tumor o aumenta la expresión de marcadores inmunosupresores en el tumor; y c) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inmunomodulador capaz de reducir la cantidad o la actividad de las células inmunosupresoras en el tumor o capaz de bloquear la actividad del marcador inmunosupresor o reducir la actividad de una célula promotora de tumores en el tumor o capaz de bloquear la actividad del marcador promotor de tumores.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es un primer colorante y el agente inmunomodulador incluye un conjugado que incluye un segundo colorante de ftalocianina conjugado con un agente inmunomodulador capaz de unirse a la célula inmunosupresora o a una célula promotora de tumores. En algunas realizaciones, el primer y el segundo colorante de ftalocianina son iguales o diferentes.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se une específicamente a una molécula seleccionada entre CD25, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, 4-1BB, GITR, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CXCR2, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, CD28 y VISTA.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una molécula pequeña o un polipéptido.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador no es un anticuerpo anti-CTLA4.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se selecciona entre nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A, ipilimumab, tremelimumab, IMP31, BMS-986016, urelumab, TRX518, dacetuzumab, lucatumumab, SEQ-CD40, CP-870, CP-893, MED16469, MED14736, MOXR0916, AMP-224 y MSB001078C o es un fragmento de unión a antígeno de los mismos de cualquiera de los anteriores.
En algunas realizaciones se describe un método para tratar un tumor en un sujeto que incluye: a) administrar a un sujeto un conjugado que incluye un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento capaz de unirse a una molécula en la superficie de una célula presente en el microambiente del tumor; b) más de 5 minutos después de administrar el conjugado, irradiar el tumor a una longitud de onda que hace que el conjugado sea citotóxico, en donde el tratamiento del tumor con el conjugado seguido de irradiación de luz prepara la activación de las células inmunitarias; y c) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inmunomodulador capaz de aumentar la actividad de la célula inmunitaria.
En algunas realizaciones, la célula inmunitaria es una célula presentadora de antígenos. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria es una célula dendrítica. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se selecciona entre GM-CSF, CpG-ODN (oligodesoxinucleótidos CpG), lipopolisacárido (LPS), monofosforil lípido A (MPL, del inglés "monophosphoryl lipid A"), alumbre, poliproteína recombinante de Leishmania, imiquimod, MF59, poli I:C, poli A:U, IFN de tipo 1, Pam3Cys, Pam2Cys, adyuvante completo de Freund (CFA, del inglés "complete freund's adjuvant"), alfa-galactosilceramida, RC-529, MDF2p, loxoribina, agonista anti-CD40, antagonista de SIRPa, AS04, AS03, flagelina, resiquimod, DAP (ácido diaminopimélico), MDP (dipéptido de muramilo) y CAF01 (formulación adyuvante catiónica-01). En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un agonista de receptor de tipo Toll (TLR, del inglés "Toll-like receptor"), un adyuvante o una citocina. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un agonista de TLR y el agonista de TLR es un agonista de TLR es un agonista de TLR4, un agonista de TLR7, un agonista de TLR8 o un agonista de TLR9. En algunas realizaciones, el agonista de TLR se selecciona entre lipoproteínas triaciladas, lipopéptido diacilado, ácido lipoteicoico, peptidoglicano, zimosano, Pam3CSK4, ARNbc, poli I:C, poli G10, poli G3, CpG, 3M003, flagelina, lipopolisacárido (LPS) de Leishmania homólogo del factor 4a de elongación e iniciación ribosómico eucariota (LelF), MEDI9197, SD-101 y agonistas de TLR de imidazoquinolina.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es una citocina y la citocina es IL-4, TNF-a, GM-CSF o IL-2. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se administra antes de, simultáneamente con o después de la irradiación. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se administra no más de 5 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 6 horas, 12 horas o 24 horas después de la irradiación. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se administra no más de 5 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 2 horas, 6 horas, 12 horas o 24 horas antes de la irradiación.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se une a una molécula o proteína de manera directa o indirecta. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es una segunda molécula de unión que se une a una primera molécula de unión, siendo dicha primera molécula de unión capaz de unirse a la molécula o proteína. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo secundario.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina tiene una longitud de onda de absorción máxima desde o desde aproximadamente 600 nm a aproximadamente 850 nm.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina está unido de manera covalente o no covalente a la molécula
de direccionamiento. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina incluye un enlazador que incluye un grupo reactivo para la fijación del colorante a la molécula de direccionamiento.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina incluye la fórmula:
Figure imgf000010_0001
en donde:
L es un enlazador;
Q es un grupo reactivo para la unión del colorante a la molécula de direccionamiento;
R2, R3, R7y R8 cada uno se selecciona de manera independiente entre alquilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido;
R4, R5, R6, R9, R10, y R11 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, alcanoilo opcionalmente sustituido, alcoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquil carbamoílo opcionalmente sustituido y un ligando quelante, en donde al menos uno de R4, R5, R6, R9, R10 y R11 incluye un grupo soluble en agua;
R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22 y R23 se seleccionan cada uno de maner hidrógeno, halógeno, alquiltio opcionalmente sustituido, alquilamino opcionalmente sustituido y alcoxi opcionalmente sustituido; y
X2 y X3 son cada uno de manera independiente alquileno C1-C10, opcionalmente interrumpido por un heteroátomo.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina incluye la fórmula:
Figure imgf000011_0001
X1 y X4 son cada uno de manera independiente un alquileno C1-C10 opcionalmente interrumpido por un heteroátomo;
R2, R3, R7y R8 cada uno se selecciona de manera independiente entre alquilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido;
R4, R5, R6, R9, R10, y R11 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, alcanoilo opcionalmente sustituido, alcoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquilcarbamoílo opcionalmente sustituido y un ligando quelante, en donde al menos uno de R4, R5, R6, R9, R10 y R11 incluye un grupo soluble en agua; y
R16, R17, R18 y R19 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, halógeno, alquiltio opcionalmente sustituido, alquilamino opcionalmente sustituido y alcoxi opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina incluye IRDye 700DX (IR700).
En algunas realizaciones, el tumor es un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer ubicado en la cabeza y el cuello, de mama, hígado, colon, ovario, próstata, páncreas, cerebro, cuello del útero, hueso, piel, ojo, vejiga, estómago, esófago, peritoneo o pulmón. En algunas realizaciones, el tumor es un sarcoma o carcinoma. En algunas realizaciones, el tumor es un carcinoma que es un carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales o adenocarcinoma. En algunas realizaciones, el tumor es un carcinoma que es un carcinoma de la vejiga, páncreas, colon, ovario, pulmón, de mama, estómago, próstata, cuello del útero, esófago o cabeza y cuello.
En algunas realizaciones, el tumor se irradia a una longitud de onda de 600 nm a 850 nm a una dosis de al menos 1 J cm-2 o al menos 1 J/cm de longitud de fibra. En algunas realizaciones, el tumor se irradia a una longitud de onda de 690 nm ± 50 nm o a una longitud de onda de aproximadamente 690 ± 20 nm.
En algunas realizaciones, el método reduce el tamaño o el volumen del tumor en al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o más en el plazo de un mes desde la irradiación en comparación con el tamaño o volumen del tumor antes de la administración y la irradiación.
En algunas realizaciones, el método de tratamiento con PIT utilizando el conjugado de colorante de ftalocianina, tal como según cualquiera de los métodos anteriores o descritos en el presente documento, da como resultado una mejora de un parámetro relacionado con un trastorno o cáncer en una población de sujetos tratados en comparación con una población de sujetos en una situación similar tratada con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que no está conjugado. En algunas realizaciones, el parámetro se selecciona de uno o más de: a) tasa de respuesta objetiva (ORR, del inglés "objective response rate"); b) supervivencia sin progresión (SLP, del inglés "progression free survival"); c) supervivencia general (OS, del inglés "overall survival"); d) reducción de la toxicidad; e) respuesta tumoral; o f) calidad de vida.
En algunas realizaciones, el parámetro se mejora en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 % o más.
En algunas realizaciones, el método de tratamiento con PIT utilizando el conjugado de colorante de ftalocianina, tal como según cualquiera de los métodos anteriores o descritos en el presente documento, da como resultado una tasa de respuesta objetiva (ORR) de al menos un 15 %, al menos un 25 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o más en una población de sujetos tratados.
En algunas realizaciones, el conjugado contiene un colorante de ftalocianina como primer colorante y además contiene un segundo colorante fluorescente unido a la molécula de direccionamiento que es diferente del primer colorante. En algunas realizaciones, el segundo colorante fluorescente presenta una o más propiedades espectrales seleccionadas entre rendimiento cuántico fluorescente en agua, coeficiente de extinción, cambio de Stokes, absorción y emisión a longitud de onda larga y fotoestabilidad que es mayor en comparación con la propiedad espectral correspondiente del primer colorante. En algunas realizaciones, la lesión o tumor emite una señal de fluorescencia desde el segundo colorante fluorescente para efectuar la detección de la presencia del conjugado en la lesión o tumor en el sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye además la obtención de imágenes de la lesión o tumor en el sujeto irradiando o iluminando el tumor a una longitud de onda capaz de absorberse por el segundo colorante.
En algunas realizaciones, el primer colorante es IR700. En algunas realizaciones, el segundo colorante no es IR700. En algunas realizaciones, el segundo colorante se selecciona entre hidroxicumarina, Cascade Blue, Dylight 405, Pacific Orange, Alexa Fluor 430, Fluoresceína, Oregon Green, Alexa Fluor 488, BODIPY 493, 2.7-dioclorofluoresceína, ATTO 488, Chromeo 488, Dylight 488, HiLyte 488, Alexa Fluor 555, ATTO 550, BODIPY TMR-X, CF 555, Chromeo 546, Cy3, TMR, TRITC, Dy547, Dy548, Dy549, HiLyte 555, Dylight 550, BODIPY 564, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, rodamina, rojo Texas, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Dylight 633, Alexa Fluor 647, APC, ATTO 655, CF633, CF640R, Chromeo642, Cy5, Dylight 650, Alexa Fluor 680, IRDye 680, Alexa Fluor 700, Cy 5.5, ICG, Alexa Fluor 750, Dylight 755, IRDye 750, Cy7, Cy7.5, Alexa Fluor 790, Dylight 800, IRDye 800, Qdot® 525, Qdot® 565, Qdot® 605, Qdot® 655, Qdot® 705 y Qdot® 800.
En algunas realizaciones, el primer colorante es IR700 y el conjugado contiene de 1 a 10 o de 1 a 5 moléculas del segundo colorante por molécula de direccionamiento.
En algunas realizaciones, el segundo colorante presenta un cambio de Stokes que es superior a 15 nm, superior a 20 nm, superior a 30 nm, superior a 40 nm, superior a 50 nm, superior a 60 nm, superior a 70 nm, superior a 80 nm, superior a 90 nm o superior a 100 nm.
En algunas realizaciones, el segundo colorante tiene un rendimiento cuántico en agua superior al 10 %, superior al 15 %, superior al 20 % o superior al 25 %, superior al 30 %, superior al 40 %, superior al 50 % o superior.
En algunas realizaciones, el segundo colorante tiene una longitud de onda de absorción y emisión en el espectro entre o entre aproximadamente 650 nm y 950 nm, entre o entre aproximadamente 700 nm y 1000 nm, o entre o entre aproximadamente 1000 nm y 1700 nm.
En algunas realizaciones, el primer colorante y el segundo colorante no presentan espectros de emisión y absorción superpuestos. En algunas realizaciones, el segundo colorante se selecciona entre ICG, IRDye 680, Alexa Fluor 750, Dylight 755, IRDye 750, Cy7.5, Alexa Fluor 790, Dylight 800 e IRDye 800. En algunas realizaciones, el segundo colorante es Alexa Fluor 488, IRDye 680, IRDye 800 o Dylight 755.
En algunas realizaciones, el método incluye además irradiar o iluminar el tumor a una longitud de onda capaz de absorberse por el segundo colorante, obteniendo así imágenes del sujeto. En algunas realizaciones, la irradiación o iluminación del tumor se realiza con un dispositivo seleccionado entre una lámpara ultravioleta de mano, una lámpara de mercurio, una lámpara de xenón, un láser, un diodo láser o un dispositivo de obtención de imágenes. En algunas realizaciones, el dispositivo de obtención de imágenes LED contiene un diodo de infrarrojo cercano (NIR, del inglés "nearinfrared").
En algunas realizaciones se describe una composición que contiene un conjugado que contiene un colorante de ftalocianina unido a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que se une a una molécula en la superficie de una célula presente en el microambiente de una lesión, tal como el microambiente tumoral. En algunas realizaciones, la composición está formulada para la administración de una sola dosis del conjugado en una cantidad que está entre o entre aproximadamente 100 mg y 1200 mg. En algunas realizaciones, la composición está formulada para la administración de una sola dosis de una cantidad entre o entre aproximadamente 100 mg y 500 mg o entre o entre aproximadamente 200 mg y 400 mg. En algunas realizaciones, la composición está formulada para la administración de una sola dosis de una cantidad entre o entre aproximadamente 500 mg y 1500 mg, 800 mg y 1200 mg o 1000 mg y 1500 mg.
En algunas realizaciones, el volumen de la composición está entre o entre aproximadamente 10 ml y 500 ml o 50 ml y 250 ml. En algunas realizaciones, el volumen de la composición es al menos 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 400 ml o 500 ml. En algunas realizaciones, el volumen de la composición está entre o entre aproximadamente 10 ml y 1000 ml o 50 ml y 500 ml; o el volumen de la composición es al menos 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 400 ml 500 ml o 1000 ml.
En algunas realizaciones se describe un artículo de fabricación, incluyendo una pluralidad de recipientes sellables, que contiene cada uno de manera individual una fracción de una dosis de administración única de una composición que contiene un conjugado que contiene un colorante de ftalocianina unido a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que se une a una molécula en la superficie de una célula presente en el microambiente de una lesión, tal como el microambiente tumoral. En algunas realizaciones, la cantidad combinada del conjugado en la pluralidad de recipientes sellables está entre o entre aproximadamente 100 mg y 1500 mg, o 100 mg y 1200 mg. En algunas realizaciones, el artículo de fabricación contiene material de envasado y una etiqueta o prospecto que contiene instrucciones para combinar el contenido de la pluralidad de viales para preparar una formulación de una sola dosis de la composición.
En algunas realizaciones, la cantidad combinada del conjugado en la pluralidad de recipientes sellables está entre o entre aproximadamente 100 mg y 1200 mg. En algunas realizaciones, la cantidad combinada del conjugado en la pluralidad de recipientes sellables está entre o entre aproximadamente 100 mg y 500 mg, entre o entre aproximadamente 200 mg y 400 mg, entre o entre aproximadamente 500 mg y 1500 mg, entre o entre aproximadamente 800 mg y 1200 mg o entre o entre aproximadamente 1000 mg y 1500 mg.
En algunas realizaciones, la lesión es un tumor.
En algunas realizaciones se describe un conjugado, que incluye un colorante de ftalocianina unido a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que es un agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un inhibidor de puntos de control inmunitario.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a la superficie de un tumor, célula tumoral o célula cancerosa. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se une específicamente a una molécula seleccionada entre CD25, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, 4-1BB, GITR, CD40, CD40L, OX40, OX40L, CXCR2, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, CD28 y VISTA. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se selecciona entre nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A, ipilimumab, tremelimumab, IMP31, BMS-986016, urelumab, TRX518, dacetuzumab, lucatumumab, SEQ-CD40, CP-870, CP-893, MED16469, MED14736, MOXR0916, AMP-224 y MSB001078C o es un fragmento de unión a antígeno de los mismos de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a PD-L1.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un anticuerpo seleccionado de BMS-935559, MEDI4736, MPDL3280A y MSB0010718C o un fragmento de unión a antígeno de los mismos.
En algunas realizaciones se describe un conjugado que contiene una molécula de direccionamiento unida a al menos un primer y segundo colorante fluorescente. En algunas realizaciones, el primer colorante fluorescente es un colorante de ftalocianina capaz de presentar fototoxicidad.
En algunas realizaciones, el conjugado tiene la fórmula:
[Dl-(Ll)n]p - A -[(L2)m-D2]o,
en donde:
A es una molécula de direccionamiento que puede unirse a una molécula en la superficie de una célula;
L1 y L2 son cada uno un enlazador seleccionado de manera independiente, que pueden ser iguales o diferentes; n y m son de manera independiente 1 o 2;
D1 es un primer colorante que es el colorante de ftalocianina capaz de presentar fototoxicidad;
D2 es un segundo colorante que es un colorante fluorescente, en donde D2 es diferente de D1;
p es de 1 a 10; y
o es de 1 a 10.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno.
En algunas realizaciones, la molécula de la superficie celular contiene un antígeno, un polipéptido, un lípido, o un carbohidrato o una combinación de estas moléculas.
En algunas realizaciones, la molécula de la superficie celular se selecciona entre ACTHR, anxa-1 de células endoteliales, aminopetidasa N, anti-IL-6R, integrina a-4, integrina a-5-p-3, integrina a-5-p-5, a-fetoproteína (AFP), ANPA, ANPB, APA, APN, APP, 1AR, 2AR, AT1, B1, B2, BAGE1, BAGE2, receptor de linfocitos B BB1, BB2, BB4, receptor de calcitonina, antígeno de cáncer 125 (CA 125), CCK1, CCK2, CD5, CD10, CD11a, CD13, CD14, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD45, CD52, CD56, CD68, CD90, CD133, CD7, CD15, CD34, CD44, CD206, CD271, CEA (antígeno carcinoembrionario), CGRP, receptores de quimiocina, anexina-1 de la superficie celular, plectina-1 de la superficie celular, cripto-1, Cr LR, CXCR2, CXCR4, Dc C, DLL3, glucoproteína E2, EGFR, EGFRvIII, EMR1, endosialina, EP2, EP4, EpCAM, EphA2, receptores de ET, fibronectina, fibronectina ED-B, FGFR, receptores de Frizzled, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, receptor GLP-1, receptores acoplados a la proteína g de la familia A (similares a la rodopsina), receptores acoplados a la proteína g de la familia B (similares al receptor de secretina), receptores acoplados a la proteína g de la familia C (similar al receptor metabotrópico de glutamato), GD2, GP100, GP120, glipicano-3, hemaglutinina, sulfatos de heparina, HER1, HER2, HER3, HER4, HMFG, antígenos de HPV 16/18 y E6/E7, hTERT, IL11-R, IL-13R, ITGAM, calecreína-9, Lewis Y, receptor de LH, LHRH-R, LPA1, MAC-1, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MART1, MC1R, mesotelina, MUC1, MUC16, Neu (nucleolina de la superficie celular), neprilisina, neuropilina-1, neuropilina-2, NG2, NK1, NK2, NK3, NMB-R, Notch-1, NY-ESO-1, OT-R, mutante p53, antígeno de melanoma p97, NTR2, NTR3, p32 (p32/gC1q-R/HABP1), p75, PAC1, PARI, Patched (PTCH), PDGFR, receptores de PDFG, PDT, colágeno IV escindido por proteasa, proteinasa 3, prohibitina, proteína tirosina cinasa 7, PSA, PSMA, familia P2X purinérgica (por ejemplo, P2X1-5), mutante Ras, Ra MP1, RAMP2, RAMP3 parcheado, receptor de RET, plexinas, smoothened, sst1, sst2A, sst2B, sst3, sst4, sst5, sustancia P, TEMs, receptor CD3 de linfocitos T, TAG72, TGFBR1, TGFBR2, Tie-1, Tie-2, Trk-A, Trk-B, Trk-C, TR1, TRPA, TRPC, TRPV, TRPM, TRPML, TRPP (por ejemplo, TRPV1-6, TRPA1, TRPC1-7, TRPM1-8, TRPP1-5, TRPML1-3), receptor de TSH, receptores de VEGF (VEGFR1 o Flt-1, VEGFR2 o FLK-1/KDR, y VEGF-3 o FLT-4), canales iónicos dependientes de voltaje, VPAC1, VPAC2, tumor 1 de Wilms, Y1, Y2, Y4 e Y5.
En algunas realizaciones, la molécula de la superficie celular se selecciona entre HER1/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (receptor de IL-2Ra), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6, antígeno de cáncer 125 (CA125), a-fetoproteína (AFP), Lewis Y, TAG72, caprina-1, mesotelina, receptor de PDGF, PD-1, PD-L1, CTLA-4, receptor IL-2, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, glipicano-3, gpA33, mucinas, CAIX, PSMA, proteína de unión a folato, gangliósidos (tales como GD2, GD3, GM1 y GM2), receptor de VEGF (VEGFR), integrina aVp3, integrina a5p1, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, AFP, complejo BCR, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 p, antígeno HLA-DR, IgE, MUC-1, nuC242, antígeno PEM, metaloproteinasas, receptor de efrina, ligandos de efrina, receptor de HGF, CXCR4, CXCR4, receptor de bombesina y antígeno SK-1.
En algunas realizaciones, la molécula de la superficie celular se selecciona entre CD25, PD-1 (CD279), PD-L1 (CD274, B7-H1), PD-L2 (CD273, B7-DC), CTLA-4, LAG3 (CD223), TIM3 (HAVCR2), 4-1BB (CD137, TNFRSF9), CXCR2, CXCR4 (CD184), CD27, CEACAM1, Galectina 9, BTLA, CD160, VISTA (homólogo de PD1), B7-H4 (VCTN1), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD28, HHLA2 (B7-H7), CD28H, CD155, CD226, TIGIT, CD96, Galectina 3, CD40, CD40L, CD70, LIGHT (TNFSF14), HVEM (TNFRSF14), B7-H3 (CD276), Ox40L (TNFSF4), CD137L (TNFSF9, GITRL), B7RP1, ICOS (CD278), ICOSL, KIR, GAL9, NKG2A (CD94), GARP, TL1A, TNFRSF25, TMIGD2, BTNL2, familia de la butirofilina, CD48, c D244, familia Siglec, CD30, CSF1R, MiCA (secuencia A relacionada con el polipéptido MHC de clase I), MICB (secuencia B relacionada con el polipéptido MHC de clase I), NKG2D, familia KIR (receptor similar a la inmunoglobulina de células citolíticas, familia LILR (receptores similares a la inmunoglobulina leucocitaria, CD85, ILTs, LIRs), SIRPA (proteína reguladora de señales a), CD47 (IAP), neuropilina 1 (NRP-1) un VEGFR y VEGF.
La molécula de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno que es cetuximab o es un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento no es o no incluye un nanoportador. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento no es o no incluye una partícula similar a un virus, una nanopartícula, un liposoma, un punto cuántico o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el primer colorante que es un colorante de ftalocianina que tiene una longitud de onda de absorción máxima desde o desde aproximadamente 600 nm hasta aproximadamente 850 nm.
En algunas realizaciones, el primer colorante que es un colorante de ftalocianina contiene la fórmula:
Figure imgf000015_0001
en donde:
L es un enlazador;
Q es un grupo reactivo para la unión del colorante a la molécula de direccionamiento;
R2, R3, R7y R8 cada uno se selecciona de manera independiente entre alquilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido;
R4, R5, R6, R9, R10, y R11 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, alcanoilo opcionalmente sustituido, alcoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquil carbamoílo opcionalmente sustituido y un ligando quelante, en donde al menos uno de R4, R5, R6, R9, R10 y R11 contiene un grupo soluble en agua;
R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22 y R23 se seleccionan cada uno de hidrógeno, halógeno, alquiltio opcionalmente sustituido, alquilamino opcionalmente sustituido y alcoxi opcionalmente sustituido; y
X2 y X3 son cada uno de manera independiente alquileno C1-C10, opcionalmente interrumpido por un heteroátomo.
En algunas realizaciones, el primer colorante que es un colorante de ftalocianina contiene la fórmula:
Figure imgf000016_0001
X1 y X4 son cada uno de manera independiente un alquileno C1-C10 opcionalmente interrumpido por un heteroátomo;
R2, R3, R7y R8 cada uno se selecciona de manera independiente entre alquilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido;
R4, R5, R6, R9, R10, y R11 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, alcanoilo opcionalmente sustituido, alcoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquilcarbamoílo opcionalmente sustituido y un ligando quelante, en donde al menos uno de R4, R5, R6, R9, R10 y R11 contiene un grupo soluble en agua; y
R16, R17, R18 y R19 se seleccionan cada uno de manera independiente de hidrógeno, halógeno, alquiltio opcionalmente sustituido, alquilamino opcionalmente sustituido y alcoxi opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, el primer colorante que es un colorante de ftalocianina contiene IRDye 700DX (IR700). En algunas realizaciones, el segundo colorante fluorescente presenta una o más propiedades espectrales seleccionadas entre rendimiento cuántico fluorescente en agua, coeficiente de extinción, cambio de Stokes, absorción y emisión a longitud de onda larga y fotoestabilidad que es mayor en comparación con la propiedad espectral correspondiente del primer colorante.
En algunas realizaciones, el segundo colorante no es IR700. En algunas realizaciones, el segundo colorante se selecciona entre hidroxicumarina, Cascade Blue, Dylight 405, Pacific Orange, Alexa Fluor 430, Fluoresceína, Oregon Green, Alexa Fluor 488, BODIPY 493, 2.7-dioclorofluoresceína, ATTO 488, Chromeo 488, Dylight 488, HiLyte 488, Alexa Fluor 555, ATTO 550, BODIPY TMR-X, CF 555, Chromeo 546, Cy3, TMR, TRITC, Dy547, Dy548, Dy549, HiLyte 555, Dylight 550, BODIPY 564, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, rodamina, rojo Texas, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Dylight 633, Alexa Fluor 647, APC, ATTO 655, CF633, CF640R, Chromeo642, Cy5, Dylight 650, Alexa Fluor 680, IRDye 680, Alexa Fluor 700, Cy 5.5, ICG, Alexa Fluor 750, Dylight 755, IRDye 750, Cy7, Cy7.5, Alexa Fluor 790, Dylight 800, IRDye 800, Qdot® 525, Qdot® 565, Qdot® 605, Qdot® 655, Qdot® 705 y Qdot® 800. En algunas realizaciones, el primer colorante es IR700 y el conjugado contiene de 1 a 10 o de 1 a 5 moléculas del segundo colorante por molécula de direccionamiento.
En algunas realizaciones, el segundo colorante presenta un cambio de Stokes que es superior a 15 nm, superior a 20 nm, superior a 30 nm, superior a 40 nm, superior a 50 nm, superior a 60 nm, superior a 70 nm, superior a 80 nm, superior a 90 nm o superior a 100 nm.
En algunas realizaciones, el segundo colorante tiene un rendimiento cuántico en agua superior al 10 %, superior al 15 %, superior al 20 % o superior al 25 %, superior al 30 %, superior al 40 %, superior al 50 % o superior.
En algunas realizaciones, el segundo colorante tiene una longitud de onda de absorción y emisión en el espectro entre o entre aproximadamente 650 nm y 950 nm, entre o entre aproximadamente 700 nm y 1000 nm, entre o entre aproximadamente 1000 nm y 1700 nm.
En algunas realizaciones, el primer colorante y el segundo colorante no presentan espectros de emisión y absorción superpuestos.
En algunas realizaciones, el segundo colorante se selecciona entre ICG, IRDye 680, Alexa Fluor 750, Dylight 755, IRDye 750, Cy7.5, Alexa Fluor 790, Dylight 800 e IRDye 800. En algunas realizaciones, el segundo colorante es Alexa Fluor 488, IRDye 680, IRDye 800 o Dylight 755.
En algunas realizaciones se describe una composición, que contiene cualquiera de los conjugados descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición contiene además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones se describe un método para tratar una enfermedad o afección en un sujeto que incluye: a) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los conjugados o composiciones descritos en el presente documento, en donde el conjugado se une a una célula presente en el microambiente de una lesión asociada con una enfermedad o afección; y b) después de administrar el conjugado, irradiar la lesión a una o más longitudes de onda para inducir la actividad fototóxica del conjugado, tratando así la enfermedad o trastorno.
En algunas realizaciones se describe un método para tratar una enfermedad o una afección, tal como un tumor en un sujeto utilizando fotoinmunoterapia (PIT), que incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los conjugados o composiciones descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el método incluye irradiar el tumor a una longitud de onda de 660 nm a 740 nm a una dosis de al menos 1 J cm-2 o 1 J/cm de longitud de fibra, tratando así la enfermedad o afección en el sujeto.
En algunas realizaciones se describe un método para tratar una enfermedad o afección en un sujeto que incluye: a) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los conjugados o composiciones descritos en el presente documento, en donde el conjugado se une a una célula presente en el microambiente de una lesión asociada con una enfermedad o afección; y b) después de administrar el conjugado, irradiar la lesión a una o más longitudes de onda para inducir la actividad fototóxica del primer colorante del conjugado y una señal fluorescente del segundo colorante del conjugado.
En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen irradiar la lesión a una longitud de onda que es de o de aproximadamente 400 a aproximadamente 900 nm a una dosis de al menos 1 J cm-2o 1 J/cm de longitud de fibra. En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen irradiar la lesión con una sola longitud de onda. En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen irradiar la lesión a dos longitudes de onda diferentes, simultánea o secuencialmente, en donde una longitud de onda induce la actividad fototóxica y la otra longitud de onda induce la señal fluorescente.
En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es un tumor.
En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen irradiar el tumor a una longitud de onda de 660 nm a 740 nm y a una dosis de al menos 1 J cm-2, tratando así el tumor en el sujeto.
En algunas realizaciones, el tumor es un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer ubicado en la cabeza y el cuello, de mama, hígado, colon, ovario, próstata, páncreas, cerebro, cuello del útero, hueso, piel, ojo, vejiga, estómago, esófago, peritoneo o pulmón. En algunas realizaciones, el tumor es un sarcoma o carcinoma. En algunas realizaciones, el tumor es un carcinoma que es un carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales o adenocarcinoma. En algunas realizaciones, el tumor es un carcinoma que es un carcinoma de la vejiga, páncreas, colon, ovario, pulmón, de mama, estómago, próstata, cuello del útero, esófago o cabeza y cuello.
En algunas realizaciones, antes de la administración del conjugado, se administra la molécula de direccionamiento al sujeto. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se administra hasta 96 horas antes de la administración del conjugado. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se administra en una dosis dentro de un intervalo de o de aproximadamente 10 mg/m2 a 500 mg/m2. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, tal como cetuximab. En algunos ejemplos, cetuximab se administra al sujeto antes de la administración del conjugado.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra las curvas de respuesta a la dosis de cetuximab y del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX para la inhibición de la fosforilación de EGFR en células A431.
La figura 2 muestra la curva de respuesta a la dosis para fotoinmunoterapia (PIT) con el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX utilizando 8 J/cm2 de luz de 690 nm en células A431.
La figura 3 muestra la comparación de las curvas de respuesta a la dosis para la fotoinmunoterapia (PIT) con el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX utilizando 16 J/cm2 frente a 32 J/cm2 de luz de 690 nm en células BxPC3. La figura 4 muestra la estructura esquemática del conjugado de panitumumab-IR700DX-Alexa-488 doblemente marcado.
Las figuras 5A y 5B muestran la progresión de la muerte celular después de la fotoinmunoterapia (PIT) inducida por diferentes conjugados en varias dosis de luz (0-16 J/cm2) en células de cáncer de páncreas BxPC3. La figura 5A muestra la muerte celular después de PIT utilizando conjugado de panitumumab-IR700 monomarcado. La figura 5B muestra la muerte celular después de PIT utilizando un conjugado de panitumumab-IR700-Alexa-488 doblemente marcado.
La figura 6A muestra la duración de la exposición de cetuximab-IRDye 700DX a luz blanca fluorescente o luz LED verde de 500 lux y su efecto sobre la formación de agregados solubles.
La figura 6B muestra el efecto de la exposición previa de cetuximab-IRDye 700DX a luz fluorescente blanca o luz LED verde sobre la actividad PIT de BxPC3.
La figura 6C muestra el efecto del porcentaje de formación de agregados solubles de cetuximab-IRDye 700DX sobre la actividad de la PIT.
La figura 7 muestra la actividad destructora de la PIT con tinción secuencial utilizando cetuximab y anticuerpo secundario de burro antihumano-IRDye 700DX (DxHu IR700).
La figura 8A muestra la destrucción dependiente de la luz de células BxPC3 con cetuximab biotinilado que forma complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX (mSA IR700).
La figura 8B muestra la especificidad de la PIT con cetuximab biotinilado que forma complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX (mSA IR700).
La figura 8C muestra el efecto de la exposición previa de estreptavidina monomérica-IRDye 700DX a la luz blanca sobre la actividad de destrucción de la PIT con cetuximab biotinilado en células BxPC3.
La figura 9A muestra la destrucción dependiente de la dosis de anticuerpo de células 4T1 con anti-EpCAM-IRDye 700DX conjugado directamente.
La figura 9B muestra la especificidad de la actividad destructora de la PIT con anti-EpCAM-IRDye 700DX.
La figura 10 muestra la destrucción específica del receptor Fc de células THP1 mediante cetuximab-IRDye 700DX.
La figura 11A muestra la especificidad de la destrucción dependiente de luz con EGF-IRDye 700DX en células A431.
La figura 11B muestra el efecto de la exposición previa a EGF-IRDye 700DX a diferentes tipos de luz sobre la destrucción dependiente de luz en células A431.
La figura 12A muestra la destrucción dependiente de la luz de las células BxPC3 utilizando toxina del cólera B-IRDye 700DX.
La figura 12B muestra la especificidad de la destrucción activada por luz de toxina del cólera B-IRDye 700DX. La figura 12C muestra el efecto de la exposición previa de toxina del cólera B-IRDye 700DX a diferentes longitudes de onda de luz sobre la destrucción activada por la luz en células BxPC3.
La figura 13A muestra la destrucción dependiente de la luz de las células Vero con virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX.
La figura 13B muestra el efecto de la exposición previa de virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX a la luz blanca frente a la luz verde sobre la destrucción celular fotoactivada.
La figura 14A muestra el efecto de la dosis de luz sobre la actividad destructora de SNA-IRDye 700DX en células BxPC3.
La figura 14B muestra el efecto del tratamiento con sialidasa sobre la especificidad de la unión de SNA-IRDye 700DX a las células.
La figura 15 muestra la destrucción mediante PIT de S. aureus mediante cetuximab-IRDye 700DX en combinación con iluminación láser.
La figura 16 muestra la PIT de las partículas del virus de la gripe utilizando el anticuerpo de ratón antivirus de la gripe (H3N2) que forma complejo previamente con GtxMs Fab-IRDye 700DX.
La figura 17 muestra la destrucción dependiente de la luz de las células infectadas por el virus de la gripe con el anticuerpo de ratón antivirus de la gripe (H3N2) y el anticuerpo de cabra antirratón IRDye 700DX (GtxMs-IR700). La figura 18 muestra la destrucción mediante PIT de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG, del inglés "dorsal root ganglion") embrionarias de rata utilizando toxina del cólera B-IRDye 700DX.
La figura 19A muestra el efecto del tratamiento con IFNgamma sobre el porcentaje de muerte de células BxPC3. La figura 19B muestra el efecto del tratamiento con IFNgamma sobre la expresión de PD-L1 en células BxPC3. La figura 19C muestra el efecto del tratamiento con IFNgamma sobre la actividad destructora de la PIT con anti-PD-L1 IRDye 700DX en células BxPC3.
La figura 20A muestra el efecto del tratamiento con PIT en células A431 y FaDu utilizando cetuximab-IRDye 700DX sobre la cantidad de HMGB1 detectada en solución extracelular.
La figura 20B muestra el aumento de los marcadores de maduración de células dendríticas (DC, del inglés "dendritic cell") en células dendríticas inmaduras (iDC) cultivadas junto con tumores sometidos a PIT a través de cetuximab-IRDye 700DX.
La figura 20C muestra el efecto de la activación de células presentadoras de antígeno por células A431 o FaDu tratadas con PIT (tratadas con cetuximab-IRDye 700DX y en presencia de irradiación de luz) o células A431 o FaDu no tratadas con PIT (tratadas con cetuximab-IRDye 700Dx , pero sin irradiación de luz) según lo evaluado por la expresión del marcador de activación ilustrativo CD86.
La figura 21 muestra el efecto sobre la activación de las células dendríticas al cebar las células dendríticas con células tumorales tratadas con PIT (tratadas utilizando cetuximab-IRDye 700DX) o células tumorales no tratadas con PIT (tratadas utilizando cetuximab-IRDye 700DX, pero sin irradiación de luz) seguida de su estimulación con un inmunomodulador (poli I:C) evaluado por la expresión de marcadores de activación ilustrativos.
La figura 22A muestra el espectro UV-Vis de cetuximab-IRDye 700DX-Alexa Fluor 488 (CTX700-ALX488). La figura 22B muestra el espectro UV-Vis de CTX-700-IRDye 800CW.
La figura 22C muestra el espectro UV-Vis de CTX700-Dylight 755.
La figura 23A muestra la actividad destructora mediante PIT de cetuximab-IRDye 700DX con o sin DyLight 755 en células BxPC3 a varias concentraciones y dosis de luz.
La figura 23B muestra la actividad destructora mediante PIT de cetuximab-IRDye 800CW, cetuximab-Alexafluor488, o cetuximab-IRDye 700DX conjugado con o sin IRDye 800CW o Alexafluor488 en células BxPC3. Los resultados se muestran como un porcentaje de la actividad PIT en comparación con cetuximab-IRDye 700DX (control).
La figura 24A muestra el efecto de la exposición previa del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX, el conjugado de cetuximab-IRDye 680RD y el conjugado doble de cetuximab-IRDye 700+IRDye 680RD a luz blanca o luz verde sobre la formación de agregados solubles.
La figura 24B muestra el efecto de la exposición previa del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX, del conjugado cetuximab-IRDye 680RD y del conjugado doble cetuximab-IRDye 700+IRDye 680RD a luz blanca o luz verde sobre la fluorescencia normalizada al contenido de monómeros.
Descripción detallada
I. Métodos de fotoinmunoterapia
En el presente documento se describen conjugados, composiciones, combinaciones y métodos relacionados con la fotoinmunoterapia (PIT). La fotoinmunoterapia es una terapia molecular dirigida que utiliza un fotosensibilizador específico de diana basado en colorante de ftalocianina, tal como un colorante de ftalocianina del infrarrojo cercano (NIR) (por ejemplo, IR700), conjugado con una molécula de direccionamiento que se dirige a una proteína, tal como una proteína de superficie celular en una célula en una enfermedad o afección, tal como una célula en un tumor. Por ejemplo, en algunos casos, un conjugado de colorante de ftalocianina utilizado en fotoinmunoterapia puede incluir la conjugación con un anticuerpo monoclonal (mAb) que se dirige a un receptor de proteínas de superficie celular o un receptor expresado en una célula en el ambiente de una lesión de enfermedad, tal como un microambiente tumoral, que puede incluir células tumorales y otras células infiltrantes. En algunas realizaciones, la activación del conjugado de colorante mediante irradiación con luz absorbente, tal como la luz NIR, excita el fotosensibilizador y da como resultado la destrucción celular, reduciendo o eliminando así la lesión (por ejemplo, tumor) y tratando la enfermedad o afección. En algunos casos, el uso de luz en el intervalo de NIR conduce a una penetración más profunda en los tejidos, lo que da como resultado la eliminación exitosa de tumores después de una sola dosis de irradiación de luz NIR externa.
En general, la fototoxicidad dirigida parece depender principalmente de la unión del conjugado de colorante a la membrana celular a través de la molécula de direccionamiento específica (por ejemplo, una macromolécula, tal como un anticuerpo). Por ejemplo, los estudios que utilizan una molécula de anticuerpo-IR700 ilustrativa indican que el conjugado debe estar unido a la membrana celular para estar activo, y que la destrucción celular no requiere localización intracelular para ser eficaz (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 8.524.239 y la solicitud publicada de Estados Unidos n.° US20140120119). La fotoactivación de las células unidas al conjugado da como resultado una rápida muerte celular y necrosis.
Normalmente, PIT da como resultado la muerte celular principalmente de aquellas células a las que el conjugado de colorante de ftalocianina, tal como conjugado de IR700 y anticuerpo, se une después de que las células se irradien con NIR, mientras que las células que no expresan la proteína de la superficie celular reconocida por la molécula de direccionamiento (por ejemplo, el anticuerpo) no se destruyen en cantidades significativas. Por tanto, debido a que la terapia está dirigida de manera específica a células enfermas, tal como células en un tumor, sus efectos son muy selectivos para el tejido enfermo en comparación con el tejido o las células sanas. Por ejemplo, aunque un fotosensibilizador dirigido puede distribuirse por todo el cuerpo, solo está activo donde se aplica luz intensa, reduciendo la probabilidad de efectos colaterales. Esto contrasta con los métodos no basados en PIT en los que no se puede localizar la actividad de moléculas de direccionamiento terapéuticas similares (por ejemplo, anticuerpos terapéuticos) que no están conjugadas con un fotosensibilizador (por ejemplo, IR700), dando como resultado, por lo tanto, riesgos significativos de efectos secundarios colaterales. En algunas realizaciones, el agente fototóxico es un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es IR700.
En algunas realizaciones, los métodos descritos implican la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado IR700 y anticuerpo) en una cantidad de dosis para lograr una exposición que es mucho más baja que la exposición que de otro modo se necesitaría para lograr un efecto terapéutico de la molécula de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpo) que no está conjugado con un colorante de ftalocianina. Debido a que PIT requiere la unión de la molécula de direccionamiento conjugada (por ejemplo, anticuerpo) a una proteína de la superficie celular para mediar en la destrucción celular, se creía que la ocupación del receptor sería un factor que se correlacionaría con el grado de actividad de la PIT. Por tanto, se creía que sería necesaria una exposición sistémica similar, o incluso superior, del conjugado para asegurar la exposición en el sitio de la lesión (por ejemplo, tumor) para lograr la destrucción celular suficiente como sería necesario para lograr un efecto terapéutico clínicamente aceptable de la molécula de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpo) que no estaba así conjugado (es decir, no conjugado con el fotosensibilizador, por ejemplo, IR700). Por ejemplo, la dosis de Erbitux® (cetuximab) aprobada por la Food and Drug Administration (FDA) para tratar el cáncer de cabeza y cuello es una dosis inicial de 400 mg/m2 seguida de una administración semanal de 250 mg/m2. La exposición sistémica promedio (AUC, por ejemplo, AUC0-inf o AUC[0-inf]) en una población de pacientes de muestra resultante de la administración de una sola dosis de Erbitux a 400 mg/m2 es de aproximadamente 24.620 |jg*h/ml y la exposición sistémica total para un (1) mes de tratamiento (dosis inicial de 400 mg/m2 seguida de la administración semanal de 250 mg/m2) se estima que es aproximadamente 60.056 jg*h/ml (exposiciones sistémicas acumuladas de las cuatro dosis semanales en 1 mes, 1 x 24.620 3 x 11.812 jg*h/ml) (Fracasso et al. (2007) Clin. Cancer. Res., 13:986).
En el presente documento se encuentra, sin embargo, que se pudo observar la destrucción celular mediante PIT después de la administración de una sola dosis de una cantidad de conjugado de cetuximab-IR700 que logró una exposición sistémica media de solo aproximadamente 1810 jg/ml *h (AUCtwnf) o 770 /- 47,5 (AUC0-24) en una población de pacientes de muestra. Esta cantidad es hasta o aproximadamente 13,6 veces mayor que la exposición sistémica observada después de las dosis clínicas terapéuticas de Erbitrux® a 400 mg/m2 descrito anteriormente. Además, como se muestra en el ejemplo 2, los resultados mostraron que la exposición sistémica promedio (AUCo-24) en una población de pacientes de muestra incluso a una dosis más alta de 640 mg/m2 fue aproximadamente el 15 % del AuC para 400 mg/m2 de Erbitux® (3.690 frente a 24.740 jg/ml*h, respectivamente). Los resultados mostraron además que en pacientes con cáncer de cabeza y cuello (que incluían pacientes en los que habían fallado otros tratamientos), hubo una tasa de respuesta objetiva (ORR, del inglés "objective response rate") del 100 % para el tratamiento de una sola dosis (todos los pacientes presentaron una respuesta completa o parcial al tratamiento), demostrando una respuesta rápida y fuerte que fue sorprendente considerando la baja exposición sistémica. En comparación, la ORR de sujetos tratados con monoterapia con Erbitux® suele ser aproximadamente un 15 % o menos, incluso con las múltiples dosis necesarias para la exposición continua.
Además, la mayoría de los tratamientos con Erbitux® implican una terapia de combinación con uno o más tratamientos quimioterapéuticos u otros tratamientos contra el cáncer. A modo de ejemplo, en un estudio informado, el aumento de ORR por cetuximab en combinación con quimioterapia en comparación con la quimioterapia sola es solo aproximadamente un 16 %, que es similar a la ORR proporcionada por la monoterapia con cetuximab (véase, por ejemplo, Specenier and Vermorken (2013) Biologics, 7:77-90).
Por tanto, los métodos descritos se basan en observaciones de que la potencia de un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado IR700 y anticuerpo) para mediar en la PIT y la destrucción celular es suficientemente alta incluso cuando la exposición sistémica del conjugado es baja. Por tanto, los métodos descritos incluyen la administración del conjugado en dosis que logran una exposición sistémica que es una fracción de la exposición de una dosis clínica en seres humanos de la correspondiente molécula de direccionamiento terapéutica (por ejemplo, anticuerpo terapéutico) cuando no está así conjugado con un colorante de ftalocianina ( por ejemplo, IR700). En algunas realizaciones, la dosis clínica en seres humanos de una molécula terapéutica es una dosis tal como se describe en la etiqueta aprobada para su comercialización por las agencias reguladoras (por ejemplo, FDA, EMA, PDMA). En algunas realizaciones, la baja exposición sistémica lograda por dichas dosis del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento significa que la exposición sistémica a la molécula de direccionamiento no es lo suficientemente alta para presentar actividad farmacológica, a menos que la PIT se induzca por la exposición del conjugado a la luz. Debido a que la irradiación con una dosis de luz puede localizarse en la lesión de la enfermedad (por ejemplo, un tumor), los métodos proporcionados pueden lograr la destrucción celular selectiva solo de la lesión de la enfermedad (por ejemplo, un tumor) mientras evitan la actividad inespecífica no querida o no deseada.
Además de la potencia de la respuesta proporcionada por los métodos de la PIT descritos en el presente documento, los métodos también son particularmente ventajosos para tratar enfermedades o afecciones (por ejemplo, tumores) en las que las terapias existentes, tal como las terapias de anticuerpos existentes, son propensas a dar como resultado efectos secundarios adversos colaterales. Por ejemplo, en algunos casos, es difícil lograr una fuerte actividad anticancerosa en el intervalo de seguridad utilizando terapias que implican agentes inmunomoduladores. En algunos casos, esto se debe a que tales agentes inmunomoduladores inhiben (o potencian) mecanismos que son los mismos mecanismos que utiliza nuestro cuerpo para combatir la autoinmunidad. Como resultado, en muchos casos, la dosificación con agentes inmunomoduladores puede dar como resultado efectos secundarios terapéuticos significativos. Para la seguridad de muchos agentes inmunomoduladores (y otros anticuerpos terapéuticos), las dosis aceptables comprometen la eficacia terapéutica, deben administrarse en un ciclo de dosificación para lograr o mantener un umbral continuo de exposición sistémica y/o deben administrarse en combinación con otros agentes quimioterapéuticos o anticancerosos que presenten un riesgo de efectos secundarios adversos aún mayores. Los métodos descritos resuelven estos problemas porque los conjugados basados en PIT que contienen moléculas de direccionamiento terapéuticas, incluyendo agentes inmunomoduladores y otras moléculas de anticuerpos antitumorales, puede administrarse a dosis que eviten o minimicen una alta exposición sistémica, mientras que también permite la destrucción celular selectiva en el sitio de la enfermedad o lesión. Por tanto, la ventaja de la dosificación baja y/o la exposición sistémica baja es significativa para lograr la seguridad.
En algunas realizaciones, las propiedades fluorescentes del colorante de ftalocianina también permiten la monitorización de la terapia PIT utilizando cualquiera de una serie de imágenes u otros métodos capaces de detectar la señal fluorescente. En algunas realizaciones, la evaluación de la fluorescencia, como por obtención de imágenes, se puede utilizar para monitorizar la carga o la presencia del conjugado en la lesión (por ejemplo, tumor) antes de la PIT. En algunas realizaciones, la evaluación de la fluorescencia, como por obtención de imágenes, se puede utilizar para iluminar la lesión (por ejemplo, tumor) para garantizar que la PIT se dirija al sitio de la lesión (por ejemplo, tumor). En algunas realizaciones, la evaluación de la fluorescencia se puede utilizar en el entorno quirúrgico donde los márgenes de la lesión (por ejemplo, tumor) se pueden visualizar con fluorescencia y luego las células cancerosas residuales en los márgenes se pueden destruir con PIT.
En algunas realizaciones, el conjugado contiene además un colorante fluorescente adicional además del colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700). Por ejemplo, en algunos casos, IR700 no se encuentra entre los colorantes más ideales para la obtención de imágenes porque, por ejemplo, presenta una o más propiedades espectrales que pueden no ser tan adecuadas para asegurar un marcaje fluorescente específico y eficaz. En algunos aspectos, otros fluoróforos comúnmente utilizados para marcar proteínas pueden presentar un mayor rendimiento cuántico fluorescente, un mayor cambio de Stokes, un mayor coeficiente de extinción en la longitud de onda de excitación y/o una longitud de onda mayor para una penetración más profunda en un tejido. Por tanto, en algunas realizaciones, se proporciona un conjugado con doble marcador en el que una molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) se conjuga con un primer colorante que es un colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) y también se conjuga con otro segundo colorante fluorescente que presenta una o más propiedades entre un rendimiento cuántico más alto, mayor cambio de Stokes, mayor coeficiente de extinción y/o mayor longitud de onda que se aumenta o mejora en comparación con el primer colorante. En algunas realizaciones, el conjugado con doble marcador se puede usar tanto para monitorizar la terapia PIT como se describe anteriormente como para tratar con PIT activando el colorante de ftalocianina, tal como activando IR700. En algunas realizaciones, el primer y segundo colorante se seleccionan para minimizar la transferencia de energía entre ellos, por ejemplo, el primer y el segundo colorante se seleccionan para evitar o minimizar la superposición de espectros de emisión y absorción.
En algunas realizaciones, también se proporcionan en el presente documento terapias de combinación para su uso junto con fotoinmunoterapia para tratar una enfermedad o afección en un sujeto. En algunas realizaciones, la terapia de combinación puede usarse en métodos para tratar un tumor o cáncer. En algunas realizaciones, la combinación de fotoinmunoterapia y la administración de un agente terapéutico adicional, tal como un agente inmunomodulador, un agente anticanceroso u otro agente, puede aumentar la eficacia del tratamiento del tumor, que, en algunos casos, puede aumentar el resultado terapéutico o la supervivencia del sujeto tratado.
En algunos aspectos, los métodos de terapia de combinación descritos explotan los efectos de destrucción y/o lisis citotóxicos inducidos por PIT para potenciar los resultados terapéuticos en relación con la terapia tumoral. En aspectos particulares, se pueden administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales a un sujeto que tiene un tumor antes de completar la PIT, que se produce por irradiación de luz para activar el conjugado de colorante de ftalocianina. En algunas realizaciones, la administración previa del agente terapéutico adicional puede preparar el microambiente del tumor para que responda mejor a la PIT o al agente terapéutico adicional tras la posterior irradiación del tumor.
Por ejemplo, en una realización, un agente terapéutico adicional puede ser un agente inmunomodulador, que, en algunos aspectos, se administra antes de la irradiación para potenciar la respuesta inmunitaria a los agentes asociados a tumores inducidos por PIT liberados de las células lisadas. En otro ejemplo, un agente terapéutico adicional puede ser un agente anticanceroso, que, en algunos aspectos, se administra antes de la irradiación para aumentar la disponibilidad sistémica del agente anticanceroso para potenciar el suministro o absorción del agente anticanceroso en el área del tumor en respuesta a los cambios en la permeabilidad tumoral inducidos por PIT. En algunas realizaciones, el resultado terapéutico potenciado de la terapia de combinación puede dar como resultado una mayor reducción en el tamaño tumoral (por ejemplo, volumen o peso tumoral) o una supervivencia mayor o más prolongada del sujeto en comparación con los métodos que implican el tratamiento con cualquiera de las dos terapias solas. En algunas realizaciones, el efecto terapéutico de la terapia de combinación puede ser sinérgico en comparación con los métodos de tratamiento que implican el tratamiento con el conjugado de colorante de ftalocianina/PIT solo o los tratamientos que implican el agente terapéutico adicional solo, tales como tratamientos únicamente con el agente inmunomodulador o únicamente el agente anticanceroso.
A. Conjugados que contienen un colorante de ftalocianina y una molécula de direccionamiento
Las composiciones y combinaciones proporcionadas en el presente documento incluyen un conjugado que contiene un fotosensibilizador, tal como un colorante de ftalocianina, por ejemplo, IR700, y una molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo) que se une a una proteína de la superficie celular. En algunas realizaciones, la unión de la molécula de direccionamiento que se conjuga con el fotosensibilizador, tal como un colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700), a la proteína de la superficie celular permite que el conjugado se dirija a las células implicadas en una enfermedad o afección, tal como un tumor o cáncer, infección, enfermedad o afección inflamatoria, enfermedad o afección neuronal u otras enfermedades o afecciones. En algunas realizaciones, las células diana (por ejemplo, células que expresan la proteína de la superficie celular capaz de unirse a la molécula de direccionamiento) están presentes en el microambiente de una lesión asociada con la enfermedad o afección, por ejemplo, las células están presentes en un microambiente tumoral. En algunas realizaciones, el direccionamiento celular aumenta la eficacia de la PIT inducida por la irradiación local de la lesión (por ejemplo, tumor) del sujeto a una longitud de onda que se absorbe por el colorante de ftalocianina (por ejemplo, una longitud de onda del infrarrojo cercano (NIR)), ya que la destrucción de células es selectiva para aquellas células en las que se une el conjugado de colorante-molécula de direccionamiento.
En algunas realizaciones, los conjugados de colorante de ftalocianina para su uso en la terapia de combinación proporcionada en el presente documento incluyen una molécula de colorante conjugada con una molécula de direccionamiento a través de un grupo enlazador. En un aspecto, el conjugado es de fórmula I:
A-[(L)n-D]p (I)
en donde:
A es una molécula de direccionamiento que puede unirse a células o tejidos;
L es un enlazador seleccionado de manera independiente para cada p;
n es 1 o 2;
D es un colorante de ftalocianina hidrófilo seleccionado de manera independiente para cada p; y
p es de manera independiente 1, 2, 3, 4, 5 o mayor que 5, tal como hasta 1000. Por ejemplo, p puede ser de 1 a 1000, tal como generalmente 1 a 10 o 2 a 5.
En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina se produce mediante un método o proceso en el que el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, tal como un conjugado de IR700 y molécula de direccionamiento (por ejemplo, IR700-anticuerpo), se prepara en condiciones de protección contra la luz. En algunas realizaciones, el método incluye 1) preparar o proporcionar un colorante de ftalocianina y una molécula de direccionamiento; 2) poner en contacto la molécula de direccionamiento y el colorante de ftalocianina en condiciones para generar el conjugado con una exposición mínima del colorante; y 3) formular, purificar y/o aislar el conjugado para producir una composición que contenga la sustancia farmacéutica, donde una o más de las etapas, tal como, en algunos casos, todas las etapas, se realizan con una exposición mínima del colorante o el conjugado que contiene el colorante a la luz ambiental. En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, tal como un conjugado de IR700 y molécula de direccionamiento (por ejemplo, IR700-anticuerpo), es un conjugado, o se prepara utilizando métodos para producir un conjugado, como se describe en la solicitud de Estados Unidos N.° 62/206.774.
1. Colorante de ftalocianina
Las ftalocianinas son un grupo de compuestos fotosensibilizadores que tienen el sistema de anillo de ftalocianina. Las ftalocianinas son azaporfirinas que contienen cuatro grupos benzoindol conectados por puentes de nitrógeno en un anillo de 16 miembros de átomos de carbono y nitrógeno alternos (es decir, C32H16N8) que forman quelatos estables con cationes metálicos y metaloides. En estos compuestos, el centro del anillo está ocupado por un ion metálico (ya sea un ion diamagnético o paramagnético) que puede, dependiendo del ion, llevar uno o dos ligandos. Así mismo, la periferia del anillo puede estar sustituida o sin sustituir. La síntesis y el uso de una amplia variedad de ftalocianinas en la terapia fotodinámica se describen en la publicación internacional WO 2005/099689 y en la patente de Estados Unidos n.° 7.005.518.
En algunas realizaciones, las ftalocianinas absorben fuertemente la radiación roja o cercana al infrarrojo con máximos de absorción comprendidos entre aproximadamente 600 nm y 810 nm, que, en algunos casos, permite la penetración profunda de la luz en los tejidos. Las ftalocianinas generalmente son fotoestables. Normalmente, esta fotoestabilidad es ventajosa en pigmentos y colorantes y en muchas de las otras aplicaciones de las ftalocianinas. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es soluble en agua y contiene una fracción de fluoróforo luminiscente que tiene al menos una fracción solubilizante en agua. En algunas realizaciones, la fracción solubilizante acuosa contiene silicio. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina tiene un átomo central tal como Si, Ge, Sn o Al. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina existe como un isómero de un solo núcleo, esencialmente sin otros isómeros. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina contiene un enlazador que tiene un grupo reactivo o activable, que es capaz de formar un enlace entre el enlazador y la molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina se puede adaptar para que produzca fluorescencia a una longitud de onda particular.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina contiene un enlazador, es decir, es una fracción de colorante de ftalocianina y enlazador (L-D). En algunas realizaciones, el enlazador contiene un grupo reactivo. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es de fórmula Ia:
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en donde
L se selecciona de un enlace directo o un enlace covalente;
Q es un grupo reactivo o un grupo activable que puede ser parte del enlazador L, y es cualquier grupo que pueda reaccionar para formar un enlace entre L y la molécula de direccionamiento A;
R2, R3, R7y R8 cada uno se selecciona de manera independiente entre alquilo opcionalmente sustituido y arilo opcionalmente sustituido;
R4, R5, R6, R9, R10 y R11, si están presentes, cada uno se selecciona de manera independiente entre hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, alcanoilo opcionalmente sustituido, alcoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquilcarbamoílo opcionalmente sustituido o un ligando quelante, en donde al menos uno de R4, R5, R6, R9, R10 y
R11 comprende un grupo soluble en agua;
R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22 y R23 son cada uno de los grupos seleccionar de manera independiente de hidrógeno, halógeno, alquiltio opcionalmente sustituido, alquilamino opcionalmente sustituido o alcoxi opcionalmente sustituido;
o en una realización alternativa, al menos uno de i) R13 y R14, y los carbonos a los que están unidos, o ii) R17 y
R18, y los carbonos a los que están unidos, o iii) R21 y R22, y los carbonos a los que están unidos, se unen para formar un anillo fusionado; y
X2 y X3 son cada uno de manera independiente alquileno C1-C10, opcionalmente interrumpido por un heteroátomo.
En algunas realizaciones, L es un enlace covalente. En algunas realizaciones, el enlace covalente es lineal o ramificado, cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, que tiene de 1 a 60 átomos, tal como de 1 a 45 átomos o de 1 a 25 átomos. En algunos casos, dichos átomos se pueden seleccionar de C, N, P, O y S. En algunas realizaciones, L puede tener átomos de hidrógeno adicionales para llenar valencias (además de los 1 a 60 átomos).
En general, el enlace contiene cualquier combinación de enlaces éter, tioéter, amina, éster, carbamato, urea, tiourea, oxi o amida; o enlaces carbono-carbono simples, dobles, triples o aromáticos; o enlaces fósforo-oxígeno, fósforoazufre, nitrógeno-nitrógeno, nitrógeno-oxígeno o nitrógeno-platino; o enlaces aromáticos o heteroaromáticos.
En algunas realizaciones, L es de la fórmula -R1'Y'X1-Y1-, en donde R1 es un enlace directo o radical bivalente; Y e
Y1 se seleccionan cada uno de manera independiente de t un enlace directo, oxígeno, un nitrógeno opcionalmente sustituido o azufre; y X1 se selecciona de t un enlace directo y alquileno C1-C10 opcionalmente interrumpido por un átomo. Los radicales bivalentes incluyen, pero sin limitación, alquileno opcionalmente sustituido, alquilenoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquilencarbamoílo opcionalmente sustituido, alquilenosulfonilo opcionalmente sustituido y arileno opcionalmente sustituido.
Los sustituyentes R1 ilustrativos incluyen, pero sin limitación, alquileno opcionalmente sustituido, alquilenoxicarbonilo opcionalmente sustituido, alquilencarbamoílo opcionalmente sustituido, alquilenosulfonilo opcionalmente sustituido, alquilenosulfonilcarbamoílo opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, arilenosulfonilo opcionalmente sustituido, arilenoxicarbonilo opcionalmente sustituido, arilenocarbamoílo opcionalmente sustituido, arilenosulfonilcarbamoílo opcionalmente sustituido, carboxialquilo opcionalmente sustituido, carbamoílo opcionalmente sustituido, carbonilo opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, heteroarilenoxicarbonilo opcionalmente sustituido, heteroarilenocarbamoílo opcionalmente sustituido, heteroarilenosulfonilcarbamoílo opcionalmente sustituido, sulfonilcarbamoílo opcionalmente sustituido, tiocarbonilo opcionalmente sustituido, un sulfonilo opcionalmente sustituido y sulfinilo opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, Q contiene un grupo reactivo para la unión opcional a un material, tal como una molécula de direccionamiento. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "grupo reactivo" significa una fracción en el compuesto que es capaz de reaccionar de manera química con el grupo funcional en un material diferente (por ejemplo, molécula de direccionamiento) para formar un enlace, tal como un enlace covalente. Normalmente, el grupo reactivo es un electrófilo o nucleófilo que puede formar un enlace covalente mediante la exposición al grupo funcional correspondiente que es un nucleófilo o electrófilo, respectivamente. Como alternativa, el grupo reactivo es un grupo fotoactivable y se vuelve químicamente reactivo solo después de la iluminación con luz de una longitud de onda adecuada. Normalmente, la reacción de conjugación entre el colorante reactivo y la molécula de direccionamiento a conjugar da como resultado uno o más átomos del grupo reactivo Q incorporados en un nuevo enlace que une el colorante a la molécula de direccionamiento conjugada.
En algunas realizaciones, Q contiene un grupo reactivo que es reactivo con un grupo carboxilo, una amina o un grupo tiol en la molécula de direccionamiento. Los grupos reactivos adecuados incluyen, pero sin limitación, un éster activado, un haluro de acilo, un haluro de alquilo, un anhídrido, un ácido carboxílico, una carbodiimida, un carbonato, un carbamato, una haloacetamida (por ejemplo, yodoacetamida), un isocianato, un isotiocianato, una maleimida, un éster de NHS, una fosforamidita, un complejo de platino, un éster sulfonato y un tiocianato para la unión opcional a la molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, los grupos reactivos son reactivos con un grupo carboxilo, una amina o un grupo tiol en una molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el grupo reactivo es un grupo químico reactivo con sulfhidrilo tal como maleimida, haloacetilo y disulfuro de piridilo. En algunas realizaciones, el grupo reactivo es reactivo con amina. En algunas realizaciones, el grupo reactivo es un éster de NHS.
En algunas realizaciones, R2, R3, R7y R8 son cada uno alquilo opcionalmente sustituido, tal como grupos metilo, etilo o isopropilo opcionalmente sustituidos.
En algunas realizaciones, al menos uno de R4, R5, R6, R9, R10 y R11 contiene un grupo soluble en agua. Por ejemplo, la porción alquilo de R4, R5, R6, R9, R10y R11 está sustituida con un sustituyente soluble en agua. Como se utiliza en el presente documento, "grupo soluble en agua" se refiere a un grupo que comprende uno o más sustituyentes polares y/o iónicos que mejora la solubilidad de la molécula global en medios acuosos. En algunos casos, al menos dos de R4, R5, R6, R9, R10 y R11 comprenden grupos solubles en agua. En otras realizaciones, tres o más comprenden grupos solubles en agua. Los grupos solubles en agua incluyen, pero sin limitación, un grupo carboxilato (-CO2"), un grupo sulfonato (-SO3"), un grupo sulfonilo (-SO2"), un grupo sulfato (-SO4"2), un grupo hidroxilo (-OH), un grupo fosfato (-OPO3"2), un grupo fosfonato (-PO3"2), un grupo amina (-NH2) y un nitrógeno cuaternizado opcionalmente sustituido, cada uno de los cuales tiene un contraión opcional.
Los contraiones adecuados incluyen, pero sin limitación, sodio, potasio, calcio, amonio, sal amino orgánica o sal de magnesio o una sal similar. Preferentemente, el contraión es un contraión biológicamente aceptable.
En algunas realizaciones, el átomo o átomos de nitrógeno al que R4, R5, R6, R9, R10 y R11 se unen pueden ser trivalentes o tetravalentes.
En algunas realizaciones, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22 y R23 son cada uno hidrógeno.
En algunas realizaciones, X2 y X3 se seleccionan cada uno de manera independiente de alquileno C1-C10 opcionalmente interrumpido por un átomo. En algunas realizaciones, los nitrógenos añadidos a X2 y/o X3 se pueden opcionalmente cuaternizar.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es de fórmula Ib:
Figure imgf000025_0001
X1 y X4 son cada uno de manera independiente un alquileno C1-C10 opcionalmente interrumpido por un heteroátomo; y
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R16, R17, R18, R19, X2 y X3 son como se define en el presente documento.
En algunas realizaciones, el grupo reactivo es un éster de NHS. En algunas realizaciones, la reactividad del éster de NHS se puede ajustar mediante la variación de la longitud del grupo alquileno de X4, entre el éster de NHS y la funcionalidad carbamato. En algunas realizaciones, la longitud del grupo alquileno de X4 entre el éster de NHS y la funcionalidad carbamato es inversamente proporcional a la reactividad del éster de NHS. En algunas realizaciones, X4 es alquileno C5. En otras realizaciones, X4 es alquileno C3. En algunas realizaciones, X1 es alquileno C6. En otras realizaciones, X1 es alquileno C3.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina tiene una carga electrónica total de cero. Esta neutralidad de carga puede, en determinados casos, obtenerse con uno o más contraiones opcionales o nitrógenos cuaternizados.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina tiene suficiente solubilidad en soluciones acuosas que una vez que se une a una molécula de direccionamiento soluble, la molécula de direccionamiento conserva su solubilidad. En algunas realizaciones, el colorante también es soluble en medios orgánicos (por ejemplo, DMSO o DMF).
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina tiene una absorción de luz máxima en el infrarrojo cercano (intervalo NIR). En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina tiene una longitud de onda de absorción de luz máxima entre 400 nm y 900 nm, tal como entre 600 nm y 850 nm, tal como entre 680 nm y 850 nm, por ejemplo, a aproximadamente 690 nm ± 50 nm o 690 ± 20 nm. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina se puede excitar de manera eficaz mediante diodos láser disponibles comercialmente que emiten luz en estas longitudes de onda.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina que contiene el grupo reactivo es el éster IR700 NHS, tal como el éster de NHS IRDye 700DX NHS (Li-Ccor 929-70010, 929-70011). Por tanto, en algunas realizaciones, el colorante es un compuesto que tiene la siguiente fórmula:
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éster de NHS IRDye 700DX
A efectos del presente documento, el término "IR700", "IRDye 700DX", o variaciones del mismo se refieren a la fórmula anterior cuando el colorante se conjuga con una molécula de direccionamiento a través de su grupo reactivo. En general, IR700 tiene varias propiedades químicas favorables. El IR700 reactivo con amino es un colorante relativamente hidrófilo y se puede conjugar de manera covalente con un anticuerpo utilizando el éster de NHS del IR700. Normalmente, |R700 también tiene un coeficiente de extinción más de 5 veces superior (2,1 * 105 M-1cm-1 al máximo de absorción de 689 nm) al de los fotosensibilizadores convencionales tales como el derivado de la hematoporfirina Photofrin® (1,2 * l03 M-1cm-1 a 630 nm), la metatetrahidroxifenilclorina; Foscan® (2,2 * 104 M-1cm-1 a 652 nm), y mono-L-aspartilclorina e6; NPe6/Laserfirina® (4,0*104 M-1cm-1 a 654 nm).
Los colorantes de ftalocianina descritos en el presente documento se pueden preparar con material de partida disponible comercialmente. La estructura del núcleo se sintetiza mediante la condensación de dos o más diiminoisoindolinas diferentes. Las estrategias sintéticas que utilizan diferentes dinitrilos o diiminoisoindolinas pueden conducir a varios grados de sustitución de la ftalocianina y/o distribución de regioisómeros. Los esquemas sintéticos ilustrativos para generar los colorantes se describen en la patente de Estados Unidos n.° 7.005.518.
En algunas realizaciones, en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo) está unida de manera directa o indirecta al colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700). En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo) está unida, de manera directa o indirecta, al colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) a través de un enlace covalente o una interacción no covalente. En algunas realizaciones, las interacciones o enlaces covalentes o no covalentes son directos o indirectos. En algunas realizaciones, la unión incluye un enlace indirecto, tal como a través de un enlazador (por ejemplo, tal como cualquiera de los enlazadores ilustrativos descritos anteriormente), una fracción o dominio de unión o un grupo reactivo. En algunas realizaciones, el enlace incluye una interacción directa entre la molécula de direccionamiento y un colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700). En otras realizaciones, una o ambas de la molécula de direccionamiento y el colorante de ftalocianina están unidos a uno o más enlazadores, y la interacción es indirecta, por ejemplo, entre un enlazador unido a una de las moléculas y otra molécula, o entre dos enlazadores, cada uno unido a la molécula de direccionamiento o al colorante de ftalocianina.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina está unido o asociado de manera no covalente a la molécula de direccionamiento. Por ejemplo, el colorante de ftalocianina forma un complejo con la molécula de direccionamiento a través de una interacción no covalente. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) contiene una fracción o dominio capaz de interactuar de manera no covalente con un grupo de unión de la molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el método incluye incubar o unir el colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) con la molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo) para formar una interacción no covalente entre el colorante y la molécula de direccionamiento. En algunos ejemplos, la interacción no covalente entre la molécula de direccionamiento y el colorante de ftalocianina incluye, por ejemplo, interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals, interacciones hidrófobas, n-efectos, interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, enlaces halógenos y/o combinaciones de los mismos, o cualquier interacción que dependa de una o más de las fuerzas. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento y el colorante de ftalocianina se enlazan utilizando interacciones que imitan interacciones moleculares no covalentes tales como, por ejemplo, interacción ligando-receptor, interacción de anticuerpo y antígeno, interacción de avidina y biotina, interacción de estreptavidina y biotina, interacción de histidina e ion metálico divalente (por ejemplo, Ni, Co, Cu y Fe), interacciones entre dominios de multimerización (por ejemplo, dimerización), interacción de glutatión S-transferasa (GST) y glutatión y/o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, una fracción o dominio de interacción no covalente está unido a la molécula de direccionamiento o es parte de ella, y forma una interacción no covalente, por ejemplo, un complejo, con el colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700). En otras realizaciones, la molécula o dominio de interacción no covalente está unido a la molécula de colorante de ftalocianina o es parte de ella y forma una interacción no covalente, por ejemplo, un complejo, con la molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el método incluye incubar o poner en contacto una molécula de direccionamiento conjugada con biotina (por ejemplo, un anticuerpo-biotina, tal como cetuximab-biotina) y el colorante de ftalocianina conjugado con una avidina o un análogo de la misma o una estreptavidina o un análogo de la misma, que incluye sus formas monoméricas (por ejemplo, avidina monomérica-IR700 o estreptavidina monomérica-IR700). En virtud de la interacción no covalente entre avidina, estreptavidina o análogos de las mismas y biotina, en algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) forma un complejo no covalente con la molécula de direccionamiento.
2. Molécula de direccionamiento
En la composición farmacéutica para su uso según la invención, el conjugado comprende un colorante de ftalocianina unido a cetuximab. En algunas realizaciones descritas, el colorante de ftalocianina se conjuga con una molécula de direccionamiento a través de un grupo reactivo de la molécula de colorante. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es aquella que puede dirigir el conjugado a una célula o patógeno, por ejemplo, mediante la unión a una molécula de la superficie celular (por ejemplo, un receptor de la superficie celular) en la célula o patógeno. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento, por ejemplo, una macromolécula, se puede unir de manera selectiva a un tipo de célula deseada, células con un fenotipo particular o células que presentan uno o más marcadores de la superficie celular o antígenos. En algunos casos, la molécula de direccionamiento se une a una célula que es una célula cancerosa, una célula tumoral, una célula inflamatoria, una célula inmunitaria, una neurona, una célula madre, una célula proliferativa o una célula en una hiperplasia. En algunos casos, la molécula direccionamiento se une a un patógeno o una célula infectada por patógenos. En algunas realizaciones, la célula es una célula inflamatoria, tal como un leucocito, por ejemplo, un neutrófilo, un eosinófilo, un basófilo, un linfocito o un monocito. En algunas realizaciones, la célula es una célula inmunitaria, tal como un linfocito T, un linfocito B, un linfocito citolítico natural (NK), una célula dendrítica, un macrófago o un neutrófilo. En algunas realizaciones, la célula es una neurona que es una neurona del sistema nervioso periférico o una neurona del sistema nervioso central, tal como un nociceptor, por ejemplo, nociceptores térmicos, nociceptores mecánicos, nociceptores químicos o nociceptores polimodales. En algunos casos, la molécula direccionamiento se une a un patógeno o una célula patógena, tal como un virus, bacteria, hongo, biopelícula u otro sistema de células procariotas. En algunas realizaciones, la molécula direccionamiento se une a un patógeno que es una bacteria gramnegativa o grampositiva.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo) del conjugado de colorante de ftalocianina se une a una proteína en la superficie de una célula o células presentes en un microambiente de una lesión que está asociada o presente como resultado de una enfermedad o afección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el conjugado se une a una proteína en la superficie de una célula o células presentes en un microambiente tumoral asociado o presente en un tumor. En algunas realizaciones, el conjugado se une a una proteína presente en la matriz extracelular en el microambiente del tumor.
Como se utiliza en el presente documento, una "célula presente en el microambiente de una lesión" se refiere a cualquier célula presente en el entorno celular asociada con una lesión, una enfermedad o un trastorno, tal como cualquier célula presente en un tumor o inmediatamente adyacente a él, tal como las células presentes en un microambiente tumoral o la matriz extracelular en el microambiente tumoral.
Como se utiliza en el presente documento, una "célula presente en un microambiente tumoral" se refiere a cualquier célula presente en el entorno celular en el que existe el tumor, tal como cualquier célula presente en el tumor o inmediatamente adyacente a él, que incluye las células tumorales en proliferación (por ejemplo, células cancerosas), el estroma tumoral, vasos sanguíneos, células inflamatorias infiltrantes (por ejemplo, células inmunitarias) y una variedad de células tisulares asociadas (por ejemplo, fibroblastos). Por tanto, se entiende que la referencia al tumor se refiere no solo a las células tumorales, que pueden incluir células cancerosas o malignas, sino también a otras células presentes en el microambiente tumoral que regulan el crecimiento del tumor, que incluyen las células inmunitarias. En algunos casos, las células inmunitarias presentes en un microambiente tumoral pueden incluir linfocitos T, que incluyen linfocitos T reguladores (Treg), células dendríticas, linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos B, macrófagos y otras células inmunitarias (Whiteside (2008) Oncogene, 27:5904-5912). Se reconoce que, en algunos aspectos, muchas células no cancerosas presentes dentro y alrededor del tumor pueden regular la proliferación, angiogénesis, invasión y/o metástasis de células tumorales, promoviendo así el crecimiento del tumor. Por tanto, en algunos casos, dirigirse a dichas células no cancerosas, tales como las células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T, tales como los linfocitos T reguladores), presentes en un tumor puede ser una terapia eficaz para destruir un tumor mediante PIT.
En general, las células cancerosas contienen antígenos asociados con un tumor que debe reconocerse por el sistema inmunitario. Normalmente, en un sistema inmunitario activo, las células inmunitarias, tales como los linfocitos T citotóxicos, atacan y eliminan estas células cancerosas. En condiciones fisiológicas normales, la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T se inicia mediante el reconocimiento de antígenos por el receptor de linfocitos T (TCR, del inglés "T cell receptor") y se regula mediante un equilibrio de señales estimuladoras e inhibidoras juntas (por ejemplo, proteínas de punto de control inmunitario). En particular, los linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresan un TCR pueden activarse tras el reconocimiento de péptidos antigénicos presentados en células presentadoras de antígenos en moléculas de clase I o clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, del inglés "major histocompatibility complex"), respectivamente. En algunos aspectos, las células CD8+ activadas o linfocitos T citotóxicos, puede destruir las células tumorales que expresan el antígeno, que puede ser ayudado por la presencia de linfocitos T CD4+.
En el caso de los tumores, sin embargo, el microambiente tumoral tiene mecanismos para inhibir el sistema inmunitario, evadiendo así el reconocimiento inmunitario y evitando o reduciendo la destrucción de las células tumorales. Por ejemplo, en algunos casos, las proteínas de punto de control inmunitario se pueden desregular en los tumores, lo que da como resultado una supresión de la respuesta inmunitaria en el microambiente del tumor como un mecanismo para evadir el sistema inmunitario. En algunos casos, los linfocitos infiltrantes del tumor pueden incluir Treg (por ejemplo, linfocitos T CD4+CD25+), que son células capaces de suprimir la proliferación de otros linfocitos T en el microambiente (Whiteside, T. L. (2008) Oncogene, 27:5904-5912). En algunos casos, otros mecanismos pueden actuar para inhibir el acceso de las células inmunitarias a los antígenos tumorales, contribuyendo también así a la capacidad de los tumores para evadir el sistema inmunitario.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es una molécula de direccionamiento que se une a una proteína de la superficie celular en un tumor o célula cancerosa. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se une a una proteína de la superficie celular en una célula inmunitaria u otra célula no cancerosa presente en un microambiente tumoral. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se une a una proteína de la superficie celular en la superficie de un linfocito T, tal como un Treg, una célula dendrítica, un linfocito citolítico natural (NK), un linfocito B, un macrófago u otra célula inmunitaria que está presente en un microambiente tumoral. En algunos casos, el tumor o cáncer se encuentra en la cabeza y el cuello, de mama, hígado, colon, ovario, próstata, páncreas, cerebro, cuello del útero, hueso, piel, ojo, vejiga, estómago, esófago, peritoneo o pulmón.
Ejemplos de moléculas de direccionamiento, tales como moléculas de direccionamiento que se dirigen a un tumor o cáncer, incluyen, pero sin limitación, cualquiera como se describe en las solicitudes del pCt internacional publicadas n.° WO2014120974, WO2014176284, WO2015042325, la patente de Estados Unidos n.° 8.524.239 o la publicación de patente de Estados Unidos n.° US20140120119.
Las moléculas de direccionamiento ilustrativas incluyen, pero sin limitación, una proteína, una glucoproteína, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un antígeno, un fragmento de unión a antígeno, un péptido, un polipéptido, una molécula pequeña, una molécula sintética polimérica, una nanopartícula polimérica, un liposoma, un sustrato enzimático, una hormona, un neurotransmisor, un metabolito celular, una partícula vírica, una cápside vírica, una nanopartícula vírica, una partícula bacteriana, un marcador, una célula, un hapteno, una avidina, una estreptavidina, una estreptavidina monomérica, una biotina, un hidrato de carbono, un oligosacárido, un polisacárido, un ácido nucleico, un ácido desoxinucleico, un fragmento de ADN, un fragmento de ARN, trifosfatos de nucleótidos, trifosfatos de terminador de aciclo o PNA.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un aminoácido, péptido, proteína, tiramina, polisacárido, fracción que forma complejos de iones, nucleósido, nucleótido, oligonucleótido, psoraleno, fármaco, hormona, lípido, conjunto lipídico, polímero, micropartícula polimérica, una célula biológica o un virus. En algunas realizaciones, la molécula direccionamiento es un antígeno, esteroide, vitamina, fármaco, metabolito, toxina, contaminación ambiental, polímero de ácidos nucleicos, hidrato de carbono, lípido o vidrio, plástico u otro polímero no biológico. En algunas realizaciones, las moléculas de direccionamiento es una célula, sistema celular, fragmento celular o partícula subcelular, por ejemplo, una partícula de virus, partícula bacteriana, componente vírico, célula biológica (tal como célula animal, célula vegetal, bacterias, levadura o protista) o componente celular. En algunas realizaciones, los colorantes reactivos pueden marcar grupos funcionales en la superficie celular, en las membranas celulares, orgánulos o citoplasma.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se dirige o se une a un antígeno, tal como cualquier sustancia estructural que sirva como diana capaz de unirse a la molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el antígeno es o está compuesto como parte de una molécula de la superficie celular, tal como una proteína, por ejemplo, un receptor, que se expresa en una superficie celular. En algunas realizaciones, por ejemplo, el antígeno es o está compuesto como parte de una molécula expresada en la superficie celular presente en un tumor, que incluye cualquier célula presente en el microambiente tumoral. Los ejemplos de moléculas de la superficie celular incluyen, pero sin limitación, un antígeno, péptidos, lípidos, polisacáridos, hidratos de carbono o ácidos nucleicos que contienen determinantes antigénicos, tales como los reconocidos por una célula inmunitaria. En algunos ejemplos, un antígeno incluye un péptido específico de tumor (tal como uno que se encuentra en la superficie de una célula cancerosa) o un fragmento inmunogénico del mismo. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo.
En algunas realizaciones, la molécula de la superficie celular puede ser ACTHR, anxa-1 de células endoteliales, aminopetidasa N, anti-IL-6R, integrina a-4, integrina a-5-p-3, integrina a-5-p-5, a-fetoproteína (AFP), ANPA, ANPB, APA, APN, APP, 1AR, 2AR, ATI, B1, B2, BAGE1, BAGE2, receptor de linfocitos B BB1, BB2, BB4, receptor de calcitonina, antígeno de cáncer 125 (CA 125), CCK1, CCK2, CD5, CD10, CD11a, CD13, CD14, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD45, CD52, CD56, CD68, CD90, CD133, CD7, CD15, CD34, CD44, CD206, CD271, CEA (antígeno carcinoembrionario), CGRP, receptores de quimiocina, anexina-1 de la superficie celular, plectina-1 de la superficie celular, cripto-1, CRLR, CXCR2, CXCR4, DCC, DLL3, glucoproteína E2, EGFR, EGFRvIlI, EMR1, endosialina, EP2, EP4, EpCAM, EphA2, receptores de ET, fibronectina, fibronectina ED-B, FGFR, receptores de Frizzled, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, receptor GLP-1, receptores acoplados a la proteína g de la familia A (similares a la rodopsina), receptores acoplados a la proteína g de la familia B (similares al receptor de secretina), receptores acoplados a la proteína g de la familia C (similar al receptor metabotrópico de glutamato), GD2, GP100, GP120, glipicano-3, hemaglutinina, sulfatos de heparina, HERI, HER2, He R3, HER4, HMFG, antígenos de HPV 16/18 y E6/E7, hTERT, IL11-R, IL-13R, ITGAM, calecreína-9, Lewis Y, receptor de LH, LHRH-R, LPA1, MAC-1, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MART1, MC1R, mesotelina, MUC1, MUC16, Neu (nucleolina de la superficie celular), neprilisina, neuropilina-1, neuropilina-2, NG2, NK1, NK2, NK3, NMB-R, Notch-1, Ny -ESO-1, OT-R, mutante p53, antígeno de melanoma p97, NTR2, NTR3, p32 (p32/gC1q-R/HABP1), p75, PAC1, PARI, Patched (PTCH), PDGFR, receptores de PDFG, PDT, colágeno IV escindido por proteasa, proteinasa 3, prohibitina, proteína tirosina cinasa 7, PSA, PSMA, familia P2X purinérgica (por ejemplo, P2X1-5), mutante Ras, RAMP1, RAMP2, RAMP3 parcheado, receptor de RET, plexinas, smoothened, sst1, sst2A, sst2B, sst3, sst4, sst5, sustancia P, TEMs, receptor CD3 de linfocitos T, TAG72, TGFBR1, TGFBR2, Tie-1, Tie-2, Trk-A, Trk-B, Trk-C, TR1, TRPA, TRPC, TRPV, TRPM, TRPML, TRPP (por ejemplo, TRPV1-6, TRPA1, TRPC1-7, TRPM1-8, TRPP1-5, TRPML1-3), receptor de TSH, receptores de VEGF (VEGFR1 o Flt-1, VEGFR2 o FLK-1/KDR, y VEGF-3 o FLT-4), canales iónicos dependientes de voltaje, VPAC1, VPAC2, tumor 1 de Wilms, Y1, Y2, Y4 o Y5.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un miembro de unión, tal como un ligando, capaz de unirse a una molécula de la superficie celular, tal como una proteína de la superficie celular, por ejemplo, un receptor de la superficie celular. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se selecciona de hormona adrenocorticotrópica (ACTH), angiotensina II, factor natriurético auricular (ANF), bombesina, bradiquinina, factor neurotrófico procedente del cerebro (BDNF), proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), proteína morfogenética ósea 6 (BMP-6), proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7), calcitonina, cardiotrofina 1 (BMP-2), CD22, CD40, pancreocimina, factor neurotrófico ciliar (CNTF), CCL1-CCL28, CXCL1-CXCL17, XCL1, XCL2, CX3CL1, péptido de unión a cripto 1, factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), endotelina 1, endotelina 1/3, ligando FAS, factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1), factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2), factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF-4), factor de crecimiento de fibroblastos 5 (FGF-5), factor de crecimiento de fibroblastos 6 (FGF-6), factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-7), factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-10), Flt-3, gastrina, péptido liberador de gastrina (GRP), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), péptido similar al glucagón (GLP-1), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), interferón a (IFN-a), interferón p (IFN-p), interferón y (IFN-y), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF-2), interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), interleucina 6 (IL-6), interleucina 7 (IL-7), interleucina 8 (IL-8), interleucina 9 (IL-9), interleucina 10 (IL -10), interleucina 11 (IL-11), interleucina 12 (IL-12), interleucina 13 (IL-13), interleucina 15 (IL-15), interleucina 17 (IL-17), interleucina 19 (IL-19 ), hormona luteinizante (LH), hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), proteína inflamatoria de macrófagos 3a (MIP-3a), proteína inflamatoria de macrófagos 3b (MIP-3b), factor de crecimiento nervioso (NGF), neuromedina B, neurotrofina 3 (NT-3), neurotrofina 4 (NT-4), neurotensina, neuropéptido Y, oxitocina, péptido activador de adenilato ciclasa pituitaria (PACAP), factor de crecimiento procedente de plaquetas AA (PDGF-AA), factor de crecimiento procedente de plaquetas AB (PDGF-AB), factor de crecimiento procedente de plaquetas BB (PDGF-BB), factor de crecimiento procedente de plaquetas CC (PDGF-CC), factor de crecimiento procedente de plaquetas DD (PDGF-DD), netrina-1 (NTN1), netrina-2 (NTN2), netrina-4 (NTN4), netrina-G1 (NTNG1) y netrina-G2 (NTNG2), efrina A1 (EFNA1), efrina A2 (EFNA2), efrina A3 ( EFNA3), efrina A4 (EFNA4), efrina A5 (EFNA5), semaforina 3A (SEMA3A), semaforina 3B (SEMA3B), semaforina 3C (SEMA3C), semaforina 3D (SEMA3D), semaforina 3F (SEMA3F), semaforina 3G (SEMA3G), semaforina 4A (SEMA4A), semaforina 4B (SEMA4B), semaforina 4C (SEMA4C), semaforina 4D (SEMA4D), semaforina 4F (SEMA4F), semaforina 4G (SEMA4G), semaforina 5A (SEMA5A), semaforina 5B (SEMA5B), semaforina 6A (SEMA6A), semaforina 6B (SEMA6B), semaforina 6D (SEMA6D), semaforina 7A (SEMA7A), SLIT1, SLIT2, SLIT3, familia similar a SLIT y Nt Rk , miembro 1 (SLITRK1), familia similar a SLIT y NTRK, miembro 2 (SLITRK2), familia similar a SLIT y NTRK, miembro 3 (SLITRK3), familia similar a SLIT y NTRK, miembro 4 (SLITRK4), familia similar a SLIT y NTRK, miembro 5 (SLITRK5), familia similar a SLIT y NTRK, miembro 6 (SLITRK6), prostaglandina E2 (PGE2), RANTES, somatostatina-14, somatostatina-28, factor citoblástico (SCF), factor 1 procedente de células estromales (SDF-1), sustancia P, hormona estimulante tiroidea (TSH), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-b), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), trombina, péptido intestinal vasoactivo (VIP), Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, WntlOa, Wnt10b, Wnt11, Wnt14, Wnt15 o Wnt16, Sonic hedgehog, Desert hedgehog e Indian hedgehog, o es un fragmento de unión al mismo que es capaz de unirse a su molécula de la superficie celular afín, tal como una proteína de la superficie celular, por ejemplo, un receptor de la superficie celular.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento puede ser un agente inmunomodulador, que se puede unirse a una molécula de la superficie celular o a una proteína en una célula inmunitaria para inhibir o activar la respuesta inmunitaria del cuerpo. En algunas realizaciones, la unión del agente inmunomodulador a la molécula o proteína de la superficie celular puede estimular una respuesta inmunitaria a un tumor y/o un patógeno, tal como mediante la inhibición de la inmunosupresión o mediante la mejora de la inmunoestimulación. En algunas realizaciones, la molécula o proteína de la superficie celular puede ser CD25, PD-1 (CD279), PD-L1 (CD274, B7-H1), PD-L2 (CD273, B7-DC), CTLA-4, LAG3 (CD223), TIM3 (HAVCR2), 4-1BB (CD137, TNFRSF9), CXCR2, CXCR4 (CD184), CD27, CEACAM1, Galectina 9, BTLA, CD160, VISTA (homólogo de PD1), B7-H4 (VCTN1), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD28, HHLA2 (B7-H7), CD28H, CD155, CD226, TIGIT, CD96, Galectina 3, CD40, CD40L, CD70, LIGHT (TNFSF14), HVEM (TNFRSF14), B7-H3 (CD276), Ox40L (TNFSF4), CD137L (TNFSF9, GITRL), B7RP1, ICOS (CD278), ICOSL, KIR, GAL9, NKG2A (CD94), GARP, TL1A, TNFRSF25, TMIGD2, BTNL2, familia de la butirofilina, CD48, CD244, familia Siglec, CD30, CSF1R, MICA (secuencia A relacionada con el polipéptido MHC de clase I), MICB (secuencia B relacionada con el polipéptido MHC de clase I), NKG2D, familia KIR (receptor similar a la inmunoglobulina de células citolíticas, familia LILR (receptores similares a la inmunoglobulina leucocitaria, CD85, ILTs, LIRs), SIRPA (proteína reguladora de señales a), CD47 (IAP), neuropilina 1 (NRP-1), un VEGFR o VEGF. En algún ejemplo, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que es un agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un inhibidor de puntos de control inmunitario.
En algunas realizaciones, la molécula de la superficie celular puede ser HER1/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (receptor de IL-2Ra), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM5, CEACAM6, antígeno de cáncer 125 (CA125), a-fetoproteína (AFP), Lewis Y, TAG72, caprina-1, mesotelina, receptor de PDGF, PD-1, PD-L1, CTLA-4, receptor IL-2, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, glipicano-3, gpA33, mucinas, CAIX, PSMA, proteína de unión a folato, gangliósidos (tales como GD2, g D3, GM1 y GM2), receptor de VEGF (VEGFR), integrina aVp3, integrina a5p1, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, AFP, complejo BCR, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 p, antígeno HLA-DR, IgE, MUC-1, nuC242, antígeno PEM, metaloproteinasas, receptor de efrina, ligandos de efrina, receptor de HGF, CXCR4, CXCR4, receptor de bombesina o antígeno SK-1.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno que es o es parte de una molécula de la superficie celular expresado en la superficie de una célula. Entre dichos anticuerpos se incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno capaces de unirse a una molécula de la superficie celular, tal como una proteína de la superficie celular, por ejemplo, un receptor de la superficie celular, descritos en el presente documento. En algunos casos, el anticuerpo se puede unir a un antígeno de una proteína expresada en una célula en un tumor, que incluye una proteína específica del tumor.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se une a un antígeno o proteína de manera directa o indirecta. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es una segunda molécula de unión que se une a una primera molécula de unión que es capaz de unirse al antígeno o proteína. Por ejemplo, la molécula de direccionamiento es un anticuerpo secundario, que se une a una primera molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo primario, capaz de unirse a la proteína o al antígeno, por ejemplo, una proteína de la superficie celular o un receptor de la superficie celular. Por tanto, en algunas realizaciones, el colorante se conjuga con un anticuerpo secundario.
Un "anticuerpo" es un ligando polipeptídico que comprende al menos una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera y/o de cadena pesada que reconoce y se une de manera específica a un epítopo de un antígeno. En general, los anticuerpos se componen de una cadena pesada y una ligera, cada una de las cuales tiene una región variable, denominadas región variable pesada (Vh) y región variable ligera (Vl). En conjunto, la región Vh y la región Vl son responsables de la unión al antígeno reconocido por el anticuerpo. El término anticuerpo incluye anticuerpos inalterados y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno que presentan unión a antígeno, tales como fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, proteínas Fv monocatenarias ("scFv") y proteínas Fv estabilizadas con disulfuro ("dsFv"). Una proteína de scFv es una proteína de fusión en la que una región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina y una región variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina están unidas por un enlazador, mientras que en dsFv, las cadenas se han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociación de las cadenas. El término también incluye formas modificadas por ingeniería genética tal como formas modificadas de inmunoglobulinas, anticuerpos quiméricos, por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, tales como anticuerpos biespecíficos. Véanse también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.); Kuby, J., Immunology, 3.a ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.
Normalmente, una inmunoglobulina de origen natural tiene cadenas pesadas (H) y ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (A) y kappa (k). Hay cinco clases principales de cadenas pesadas, o isotipos, que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.
Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable, también conocidas como "dominios". En combinación, las regiones variables de la cadena pesada y ligera generalmente se unen de manera específica al antígeno. Las regiones variables de la cadena ligera y pesada pueden contener una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". La extensión de la región marco y las CDR se han definido (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Sociales de los EE.UU., 1991). La base de datos de Kabat actualmente se encuentra en línea. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie, tales como en seres humanos. La región marco de un anticuerpo, esto es, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.
Las CDR son responsables normalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente empezando desde el extremo N, y generalmente también se identifican por la cadena en la que está ubicada la CDR particular. Por tanto, una CDR3 Vh está ubicada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 Vl es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra. Anticuerpos con diferentes especificidades, tales como con diferentes sitios de combinación para diferentes antígenos, tienen diferentes CDR. Aunque son las CDR las que varían de un anticuerpo a otro, solamente un número limitado de posiciones de los aminoácidos de las CDR están directamente implicadas en la unión al antígeno. Estas posiciones dentro de las CDR se denominan restos determinantes de la especificidad (SDR, del inglés "specificity determining residues").
Las referencias a "Vh" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a "Vl" o una "Vl" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, que incluye la de un Fv, scFv, dsFv o Fab.
Entre los anticuerpos proporcionados se encuentran fragmentos de anticuerpos. Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo inalterado que comprende una porción de un anticuerpo inalterado que se une al antígeno al que se une el anticuerpo inalterado. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Otros fragmentos de anticuerpo o anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo incluyen un scFv multivalente, un scFv biespecífico o un dímero de scFv y CH3. Los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitación, la digestión proteolítica de un anticuerpo inalterado, así como la producción por células hospedadoras recombinantes.
Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado los genes de la cadena ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante la preparación de células híbridas formadoras de anticuerpos a partir de una fusión de células de mieloma con células inmunitarias del bazo. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.
Un "anticuerpo quimérico" tiene restos marco de una especie, tal como de seres humanos y CDR, que generalmente confieren unión a antígenos, de otra especie, tal como un anticuerpo murino que se une de manera específica a mesotelina.
Una inmunoglobulina "humanizada" es una inmunoglobulina que incluye una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de ratón, rata o sintética). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante", y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptor". En algunas realizaciones, las CDR son de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. No es necesario que estén presentes las regiones constantes, pero en caso de haberlas, pueden ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, tal como al menos aproximadamente 85-90 %, tal como aproximadamente un 95 % o más idénticas. Por lo tanto, partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulinas humanas naturales. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y cadena pesada humanizada. Un anticuerpo humanizado se une al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. El marco aceptor de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado puede tener un número limitado de sustituciones por aminoácidos tomados del marco donante. Los anticuerpos humanizados u otros monoclonales pueden tener sustituciones conservadoras de aminoácidos adicionales que no tengan sustancialmente ningún efecto sobre la unión a antígeno u otras funciones de las inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas humanizadas se pueden construir mediante ingeniería genética (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.585.089).
Un anticuerpo "humano" (también llamado anticuerpo "completamente humano") es un anticuerpo que incluye regiones marco humanas y CDR de una inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, el marco y las c Dr son de la misma secuencia de aminoácidos de cadena ligera y/o pesada humana originaria. Sin embargo, las marco de un anticuerpo humano se pueden genomanipular para incluir CDR de un anticuerpo humano diferente. Partes de una inmunoglobulina humana pueden ser sustancialmente idénticas a partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulina humana natural.
"Se une de manera específica" se refiere a la capacidad de una molécula, tal como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, para unirse de manera específica a un antígeno, tal como un antígeno específico de tumor, en relación con la unión a proteínas no relacionadas, tales como proteínas no tumorales, por ejemplo, p-actina. En algunas realizaciones, una molécula, tal como un anticuerpo o un fragmento, que incluye una molécula, tal como un anticuerpo o un fragmento, unido a una molécula de colorante de ftalocianina, se une específicamente a una diana, tal como una proteína de la superficie celular, con una constante de unión que es al menos 103 M-1 mayor, 104 M-1 mayor o 105 M-1 mayor que una constante de unión para otras moléculas en una muestra o sujeto. En algunas realizaciones, una molécula, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, tiene una constante de asociación en equilibrio (Ka ) mayor o igual a aproximadamente 106 M-1, mayor que o igual a aproximadamente 107 M-1, mayor o igual a aproximadamente 108 M-1 o mayor o igual a aproximadamente 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 o anticuerpos también se pueden caracterizar por una constante de disociación en equilibrio (Kd) de 10-6 M, 10-7 M, 10­ 8 M, 10-10 M, 10-11 M o 10-12 M o menor. En algunas realizaciones, una constante de disociación de equilibrio (Kd) puede ser de 1 nM o menos. Las constantes de afinidad, tales como Kd o Ka , se pueden estimar de manera empírica o las afinidades se pueden determinar de manera comparativa, por ejemplo, mediante la comparación de la afinidad de un anticuerpo y otro anticuerpo por un antígeno particular. Por ejemplo, dichas afinidades se pueden determinar fácilmente utilizando técnicas conocidas en la materia, tales como, por ejemplo, mediante ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) competitivo o utilizando un dispositivo de resonancia de plasmón de superficie, tal como el Biacore T100 (disponible en Biacore, Inc., Piscataway, N.J), un radioinmunoensayo que utiliza antígeno diana radiomarcado o mediante otro método conocido por el experto en la materia.
En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) se conjuga con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. Por ejemplo, en algunos aspectos, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento es un conjugado de IR700 y anticuerpo. Los anticuerpos ilustrativos a los que se puede conjugar el colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) incluyen, pero sin limitación, cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, trastuzumab, adotrastuzumab emtansina, tositumomab (Bexxar ®), rituximab (Rituxan, Mabthera), ibritumomab tiuxetan (Zevalin), daclizumab (Zenapax), gemtuzumab (Mylotarg), alemtuzumab, fragmento Fab de escaneo CEA, anticuerpo monoclonal OC125, ab75705, B72.3, bevacuzimab (Avastin®), afatinib, axitinib, bosutinib, cabozantinib, ceritinib, crizotinib, dabrafenib, dasatinib, erlotinib, everolimus, ibrutinib, imatinib, lapatinib, lenvatinib, nilotinib, olaparib, palbociclib, pazopanib, pertuzumab, ramucirumab, regorafenib, ruxolitinib, sorafenib, sunitinib, temsirolimus, trametinib, vandetanib, vemurafenib, vismodegib, basiliximab, ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab, MPDL3280A, pidilizumab (CT-011), MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A, tremelimumab, IMP321, BMS-986016, LAG525, urelumab, PF-05082566, TRX518, MK-4166, dacetuzumab, lucatumumab, SEQ-CD40, CP-870, CP-893, MEDI6469, MEDI6383, MOXR0916, AMP-224, MSB0010718C, MEDI4736, PDR001, rHIgM12B7, ulocuplumab, BKT140, varlilumab (CDX-1127), ARGX-110, MGA271, lirilumab (BMS-986015, IPH2101), IPH2201, AGX-115, emactuzumab, CC-90002 y MNRP1685A o un fragmento de unión a anticuerpo de los mismos.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un péptido de asentamiento específico de tejido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polipéptido de asentamiento puede contener la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ iD NOS: 1 a 52. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es un polipéptido RGD, tal como un polipéptido iRGD, un polipéptido Lyp-1, un polipéptido de unión a cripto-1, un polipéptido de unión al receptor de somatostatina o un polipéptido de unión a prohibitina, un polipéptido NGR o un polipéptido iNGR.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es una partícula vírica, tal como una partícula de tipo vírica, una nanopartícula de tipo vírica o una cápside vírica. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es una nanopartícula de tipo vírica. En algunas realizaciones, la nanopartícula de tipo vírica se ensambla a partir de proteínas de la cápside L1. En algunas realizaciones, la nanopartícula de tipo vírica se ensambla a partir de una combinación de proteínas de la cápside L1 y L2. En algunas realizaciones, la molécula direccionamiento se une e infecta a las células. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es una descrita en el documento WO2015042325.
En algunas realizaciones, una partícula de tipo vírica (VLP, del inglés "virus-like particle") se refiere a una estructura organizada similar a una cápside, tal como de forma aproximadamente esférica o cilindrica, que comprende matrices ordenadas de autoensamblaje de capsómeros L1 o L1 y L2 y no incluye un genoma vírico. En algunas realizaciones, las partículas de tipo víricas son morfológica y antigénicamente similares a los viriones auténticos, pero carecen de material genético vírico, tal como el ácido nucleico vírico, lo que hace que las partículas no sean infecciosas. Se puede utilizar una VLP para administrar a una célula receptora un agente, tal como agente profiláctico, agente terapéutico o agente de diagnóstico, o una molécula de ADN o ARN circular o lineal encerrada.
En algunas realizaciones, las VLP pueden tener inmunogenia y/o antigenicidad modificadas con respecto a las VLP de tipo silvestre. Las VLP pueden, por ejemplo, ensamblarse a partir de capsómeros que tienen una proteína de la cápside variante con inmunogenia y/o antigenicidad modificadas. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside variante con inmunogenia y/o antigenicidad modificada es aquella que se modifica de manera natural o sintética, tal como se muta, sustituye, elimina, pegila o inserta, en un aminoácido para reducir o evitar el reconocimiento de la proteína de la cápside mediante la existencia previa, tal como los anticuerpos endógenos específicos de serotipo vírico. Una proteína de la cápside variante puede ser una variante L1 del papilomavirus humano (VPH), una variante L1 del papilomavirus no humano o una variante L1 del papilomavirus basada en una combinación de aminoácidos de diferentes serotipos del VPH.
En algunas realizaciones, una VLP es una VLP del papilomavirus. La VLP puede ser una VLP del papilomavirus humano, tal como procedente de un virus que puede infectar a seres humanos, mientras que, en otras realizaciones, la VLP puede ser una VLP del papilomavirus no humano. Los ejemplos de VLP no humanas incluyen las procedentes de, sin limitación, papilomavirus bovino, papilomavirus murino, papilomavirus del conejo de cola de algodón y partículas de papilomavirus macaco o macaco de la India. En algunas realizaciones, las VLP son nanopartículas de tipo víricas del papilomavirus bovino, tal como nanopartículas de tipo víricas de tipo 1, tales como las ensambladas a partir de proteínas de la cápside L1 del BPV o una combinación de proteínas de la cápside L1 del BPV y L2 del BPV.
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside se refiere a un monómero de proteína, varios de los cuales forman un oligómero capsomérico. En algunas realizaciones, un capsómero se refiere a la unidad estructural oligomérica básica de una cápside vírica, que es una cubierta externa de proteína que protege el material genético de un virus. En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside pueden incluir, proteínas de la cápside principal L1 del papilomavirus y proteínas de la cápside menor L2 del papilomavirus. En algunas realizaciones, las VLP contienen solo proteínas de la cápside L1, mientras que, en otras realizaciones, las VLP contienen una mezcla o combinación, de proteínas de la cápside L1 y L2.
En algunas realizaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L1 en una partícula de tipo vírica es mayor que el porcentaje de proteínas de la cápside L2 en la partícula de tipo vírica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L1 en una partícula de tipo vírica es del 80 % al 100 % del número total de proteínas de la cápside en la partícula de tipo vírica. En algunas realizaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L1 en una partícula de tipo vírica es al menos o es aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L2 en una partícula de tipo vírica es del 1 % al 25 % del número total de proteínas de la cápside en la partícula de tipo vírica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el porcentaje de proteínas de la cápside L2 en una partícula de tipo vírica es al menos o aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 %.
En algunas realizaciones, una partícula de tipo vírica contiene de 12 a 72 proteínas L2. En algunas realizaciones, una partícula de tipo vírica contiene 360 proteínas L1 y de 12 a 72 proteínas L2. En algunas realizaciones, las proteínas de la cápside se ensamblan en nanopartículas de tipo vírico que tienen un diámetro de 20 a 60 nm. Por ejemplo, las proteínas de la cápside pueden ensamblarse en nanopartículas de tipo víricas que tienen un diámetro de al menos o aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 nm.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento no es o no incluye un nanoportador. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento no es o no incluye una partícula similar a un virus, una nanopartícula, un liposoma, un punto cuántico o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento es una DARPin (proteína de repetición de anquirina genomanipulada). Normalmente, las DARPin proceden de proteínas de repetición de anquirina naturales y se unen a proteínas que incluyen, por ejemplo, receptores humanos, citocinas, cinasas, proteasas humanas, virus y proteínas de membrana (Molecular Partners AG Zurich Suiza; véase el Capítulo 5. "Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins): From Research to Therapy", Methods in Enzymology, vol 503: 101~134 (2012); y "Efficient Selection of DARPins with Sub-nanomolar Affinities using SRP Phage Display", J. Mol. Biol. (2008) 382, 1211-1227). En algunas realizaciones, la DARPin es una proteína mimética de anticuerpos que tiene alta especificidad y alta afinidad de unión a una proteína diana, que se prepara mediante ingeniería genética. En algunas realizaciones, las DARPin tienen una estructura que comprende al menos 2 motivos de repetición de anquirina, por ejemplo, que comprenden al menos 3, 4 o 5 motivos de repetición de anquirina. Las DARPin pueden tener cualquier peso molecular adecuado dependiendo del número de motivos repetidos. Por ejemplo, las DARPin que incluyen 3, 4 o 5 motivos de repetición de anquirina pueden tener un peso molecular de aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 14 kDa o aproximadamente 18 kDa, respectivamente.
En algunas realizaciones, la DARPin incluye una parte central que proporciona estructura y una parte de unión a la diana que reside fuera del núcleo y se une a una diana. En algunas realizaciones, el núcleo estructural incluye una secuencia de aminoácidos conservada y la porción de unión a la diana incluye una secuencia de aminoácidos que difiere dependiendo de la diana.
En algunas realizaciones, el conjugado contiene una cantidad de restos de colorante por molécula de direccionamiento que es de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000, tal como de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5. En algunas realizaciones, la proporción de moléculas de colorante a la molécula de direccionamiento es o es aproximadamente 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 50:1, 75:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 400:1, 450:1, 500:1, 550:1, 600:1,650:1, 700:1, 750:1, 800:1, 850:1, 900:1, 950:1 o 1000:1, o se encuentra entre o entre aproximadamente dos de dichos valores. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento puede contener hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 moléculas de colorante. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento puede contener más de 1000 moléculas de colorante o menos de 10 moléculas de colorante.
En algunas realizaciones, como cuando la molécula de direccionamiento es un polipéptido, tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, el número de moléculas de colorante por molécula de direccionamiento puede ser de o de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, tal como de o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4, por ejemplo, aproximadamente 3 o 3. En algunas realizaciones, por ejemplo, cuando la molécula de direccionamiento es una nanopartícula, tal como una partícula de tipo vírica (VLP), el número de moléculas de colorante a la molécula de direccionamiento puede ser de o de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000, de 10 a aproximadamente 500, de 50 a aproximadamente 500 o de 50 a aproximadamente 1000. Por tanto, en algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento puede contener de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 moléculas de colorante.
En algunas realizaciones, como cuando la molécula de direccionamiento es una VLP, más de una molécula de colorante se puede conjugar con una sola proteína de la cápside. Por ejemplo, una sola proteína de la cápside, tal como la proteína de la cápside L1 o L2, puede conjugarse a de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, moléculas de colorante. Por tanto, más de un aminoácido de una proteína de la cápside puede conjugarse con una molécula de colorante. En algunas realizaciones, una sola proteína de la cápside puede conjugarse con 1 a 2, 1 a 3 o 2 a 3 moléculas de colorante. Por tanto, una molécula de colorante puede conjugarse con 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos diferentes, tales como lisina, arginina y/o histidina, u otro aminoácido, de una sola proteína de la cápside.
3. Colorante adicional para obtención de imágenes
En algunas realizaciones, el conjugado puede incluir opcionalmente un colorante adicional de modo que la molécula de direccionamiento pueda conjugarse con dos o más colorantes fluorescentes diferentes. Por ejemplo, se describe un conjugado que contiene una molécula de direccionamiento conjugada con un primer colorante que es un colorante de ftalocianina, tal como cualquiera de los descritos anteriormente, por ejemplo, IR700 y un segundo colorante fluorescente que es diferente al primer colorante. En un aspecto, el conjugado es de Fórmula (II):
[Dl-(Ll)n]p - A -[(L2)m-D2]o (II)
en donde:
A es una molécula de direccionamiento que puede unirse a células o tejidos;
L1 y L2 son cada uno un enlazador seleccionado de manera independiente para cada o u p, en donde cada L1 y L2 son como se definen anteriormente para L;
n y m son de manera independiente 1 o 2;
D1 es un colorante de ftalocianina hidrófilo seleccionado de manera independiente para cada p, en donde D1 es como se define anteriormente para D;
D2 es un colorante fluorescente seleccionado de manera independiente para cada o; y
p y o son de manera independiente 1, 2, 3, 4, 5 o mayores que 5, tal como hasta 1000. Por ejemplo, p y o pueden ser cada uno de manera independiente de 1 a 1000, tal como generalmente 1 a 10 o 2 a 5.
En algunas realizaciones, el primer colorante D1 es un colorante de ftalocianina, tal como un colorante de ftalocianina de infrarrojo cercano (NIR), tal como cualquiera de los colorantes descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina es o comprende un compuesto fotosensibilizador de manera que es capaz de presentar actividad fototóxica tras la irradiación con luz infrarroja cercana. En algunas realizaciones, D1 es IR700.
En algunas realizaciones, el segundo colorante D2 se selecciona para ofrecer una mejor fluorescencia para la visualización que el primer colorante Di (por ejemplo, IR700). Por tanto, en algunos aspectos, el compuesto de fórmula II se usa tanto para obtención de imágenes de fluorescencia como para fotoinmunoterapia. Por ejemplo, la irradiación de la lesión o tumor emite una señal de fluorescencia desde el segundo colorante fluorescente para efectuar la detección de la presencia del conjugado en la lesión o tumor en el sujeto. En algunas realizaciones, el conjugado se puede usar tanto para monitorizar la unión del colorante al sitio diana (por ejemplo, tumor) con obtención de imágenes de fluorescencia de D2 como para erradicar las células asociadas con una enfermedad o afección, por ejemplo, células de un tumor, utilizando fotoinmunoterapia por activación de Di (por ejemplo, IR700). En algunas realizaciones, el segundo colorante D2 presenta una o más propiedades espectrales seleccionadas entre rendimiento cuántico fluorescente (por ejemplo, en agua), coeficiente de extinción, cambio de Stokes, absorción y emisión a longitud de onda larga, y fotoestabilidad que es mayor en comparación con la propiedad espectral correspondiente de Di. En algunas realizaciones, D2 no es IR700.
En algunas realizaciones, el colorante adicional D2 es un colorante fluorescente. En algunas realizaciones, D2 puede ser, pero sin limitación, hidroxicumarina, Cascade Blue, Dylight 405 Pacific Orange, Alexa Fluor 430, Fluoresceína, Oregon Green, Alexa Fluor 488, BODIPY 493, 2.7-dioclorofluoresceína, ATTO 488, Chromeo 488, Dylight 488, HiLyte 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 555, ATTO 550, BODIPY TMR-X, CF 555, Chromeo 546, Cy3, TMR, TRITC, Dy547, Dy548, Dy549, HiLyte 555, Dylight 550, BODIPY 564, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, rodamina, rojo Texas, Alexa Fluor 6l0, Alexa Fluor 633, Dylight 633, Alexa Fluor 647, APC, ATTO 655, CF633, CF640R, chromeo642, Cy5, Dylight 650, Alexa Fluor 680, IRDye 680, Alexa Fluor 700, Cy5.5, ICG, Alexa Fluor 750, Dylight 755, IRDye 750, Cy7, Cy7.5, Alexa Fluor 790, Dylight 800, IRDye 800, Qdot® 525, Qdot® 565, Qdot® 605, Qdot® 655, Qdot® 705 o Qdot® 800.
En algunas realizaciones, D2 absorbe la luz y emite fluorescencia en longitudes de onda más largas donde la autofluorescencia del tejido es baja, está esencialmente ausente o eliminada o está ausente o eliminada. Por tanto, en algunos aspectos, D2 facilita una penetración profunda en el tejido de las imágenes. En algunas realizaciones, D2 es un colorante de infrarrojo cercano (NIR) que tiene una longitud de onda de absorción y emisión en el espectro NIR entre o entre aproximadamente 650 y 1450 nm, tal como entre o entre aproximadamente 650 y 900 nm, entre o entre aproximadamente 700 y 1000 nm, o entre o entre aproximadamente 750 y 950 nm. En algunas realizaciones, D2 es un segundo colorante de infrarrojo cercano (NIR-II) que tiene una longitud de onda de absorción y emisión en el espectro NIR-II entre o entre aproximadamente 1000 y 1700 nm, tal como entre o entre aproximadamente 1000 y 1400 nm. En algunas realizaciones, D2 es un colorante que tiene una longitud de onda de absorción y emisión en el espectro visible entre o entre aproximadamente 300 y 750 nm, tal como entre o entre aproximadamente 400 y 600 nm o entre o entre aproximadamente 400 y 700 nm. En algunas realizaciones, el conjugado de molécula de direccionamiento contiene dos colorantes con diferentes longitudes de onda de emisión y excitación. En algunas realizaciones, el colorante adicional tiene propiedades de excitación y emisión de longitud de onda larga. En algunas realizaciones, cualquiera de los métodos descritos puede comprender además la obtención de imágenes de la lesión 0 el tumor en el sujeto irradiando o iluminando el tumor a una longitud de onda capaz de absorberse por el segundo colorante.
En algunas realizaciones, el colorante adicional tiene un gran coeficiente de extinción en la longitud de onda de excitación. En algunas realizaciones, D2 tiene un coeficiente de extinción en agua superior a aproximadamente 10.000 moMcirr1, tal como superior a aproximadamente 25.000 moMcirr1, superior a aproximadamente 50.000 mol' 1cm-1, superior a aproximadamente 75.000 mol'1cm-1, superior a aproximadamente 100.000 mol'1cm-1, superior a aproximadamente 150.000 mol-1cm-1, superior a aproximadamente 200.000 mol-1cm-1, superior a aproximadamente 250.000 mol-1cm-1, o superior a aproximadamente 300.000 mol-1cm-1.
En algunas realizaciones, el segundo colorante D2 tiene un rendimiento cuántico fluorescente más alto cuando se conjuga con proteínas que el primer colorante D1. En algunas realizaciones, el colorante adicional tiene un alto rendimiento cuántico fluorescente en agua. En algunas realizaciones, el segundo colorante D2 tiene un rendimiento cuántico en agua superior al 5 %, tal como superior al 10 %, superior al 15 %, superior al 20 % o superior al 25 %, superior al 30 %, superior al 40 %, o superior al 50 % o superior.
En algunas realizaciones, el segundo colorante D2 tiene un gran cambio de Stokes (diferencia entre EXmáx y EMmáx). En algunas realizaciones, el colorante adicional D2 presente un cambio de Stokes que es mayor a 15 nm, 20 nm, 25 nm, tal como superior a 30 nm, superior a 40 nm, superior a 50 nm, superior a 60 nm, superior a 70 nm, superior a 80 nm, superior a 90 nm o superior a 100 nm.
En algunas realizaciones, el colorante adicional D2 puede ser ICG, IRDye 680, Alexa Fluor 750, Dylight 755, IRDye 750, Cy7.5, Alexa Fluor 790, Dylight 800 o IRDye 800. En algunas realizaciones, el colorante adicional D2 puede ser ICG, IRDye 680, Alexa Fluor 750, Dylight 755, IRDye 750, Cy7.5, Alexa Fluor 790, Dylight 800 o IRDye 800. En algunas realizaciones, el colorante adicional D2 puede ser Alexa Fluor 488, IRDye 680, IRDye 800 o Dylight 755. En algunas realizaciones, el conjugado contiene un número de restos del segundo colorante, D2, por molécula de direccionamiento que es de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000, tal como de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, o de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5. En algunas realizaciones, la proporción de moléculas de colorante a la molécula de direccionamiento es o es aproximadamente 2:1, 3:1,4:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 50:1, 75:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 400:1, 450:1, 500:1, 550:1, 600:1, 650:1, 700:1, 750:1, 800:1, 850:1, 900:1, 950:1 or 1000:1 o se encuentra entre o entre aproximadamente cualquiera dos de dichos valores. En algunas realizaciones, la proporción de moléculas de segundo colorante a molécula de direccionamiento es de 1 a 10 o de 1 a 5 moléculas de segundo colorante por molécula de direccionamiento.
II. Composiciones farmacéuticas y artículos de fabricación
En el presente documento se describen composiciones farmacéuticas que contienen un conjugado de colorante de ftalocianina-molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo). En algunas realizaciones, las composiciones se pueden utilizar en métodos de PIT como se describe en el presente documento. El conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento puede ser, por ejemplo, el conjugado IR700-anticuerpo. En algunas realizaciones, las composiciones se pueden proporcionar en combinación con otro agente terapéutico (por ejemplo, un agente inmunomodulador o un agente anticanceroso). En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento y otro agente terapéutico, tal como uno o ambos de un agente inmunomodulador o un agente anticanceroso, puede envasarse como un artículo de fabricación como composiciones separadas para la administración conjunta, secuencial o intermitentemente. Las combinaciones se pueden empaquetar como un kit.
1. Composiciones, formulaciones y formas farmacéuticas
En algunas realizaciones, los compuestos, tal como un conjugado, puede formularse en un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como el que contiene un transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable. En general, los transportadores o vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como los presentes en el tampón farmacéuticamente aceptable, pueden ser cualquiera de los conocido en la materia. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 19.a edición (1995) describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de uno o más compuestos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticamente aceptables generalmente se preparan en vista de las aprobaciones de una agencia reguladora u otra agencia preparada según la farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y seres humanos.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir transportadores tal como un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. En "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin se describen ejemplos de transportadores farmacéuticos adecuados. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, generalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de transportador para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. Dichos transportadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sésamo. El agua es un transportador típico cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como transportadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un principio activo: un diluyente, tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tales como goma arábiga, gelatina, glucosa, melaza, polivinilpirrolidona, celulosas y sus derivados, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes conocidos por los expertos en la materia. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes de pH, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitán, acetato sódico de trietanolamina, oleato de trietanolamina y otros agentes similares.
En algunas realizaciones, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). En algunos casos, las preparaciones farmacéuticas pueden presentarse en forma liofilizada para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso.
En algunas realizaciones, la naturaleza del tampón farmacéuticamente aceptable o del transportador, depende del modo particular de administración que se utilice. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las formulaciones parenterales pueden comprender líquidos inyectables que incluyen líquidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa o glicerol como vehículo. En algunas realizaciones, para composiciones sólidas, por ejemplo, polvo, píldora, comprimido o cápsula, los transportadores sólidos no tóxicos pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los transportadores biológicamente neutros, en algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o agentes tamponantes de pH, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.
Los compuestos se pueden formular en preparaciones farmacéuticas adecuadas tales como soluciones, suspensiones, comprimidos, comprimidos dispersables, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida o elixires, para administración oral, así como en forma de preparaciones de parches transdérmico e inhaladores de polvo seco. Normalmente, los compuestos se formulan en composiciones farmacéuticas utilizando técnicas y procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Cuarta Edición, 1985, 126). En general, el modo de formulación es función de la vía de administración.
En la composición para el uso de la presente invención, el conjugado que comprende un colorante de ftalocianina unido a cetuximab, cuyo conjugado se encuentra en la composición es para administración intravenosa. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden formular para la administración por cualquier vía conocida por los expertos en la materia, incluidas la administración intramuscular, intravenosa, intradérmica, intralesional, por inyección intraperitoneal, subcutánea, intratumoral, epidural, nasal, oral, vaginal, rectal, tópica, local, ótica, inhalatoria, bucal (por ejemplo, sublingual) y transdérmica o cualquier vía. También se contemplan otros modos de administración. La administración puede ser local, tópica o sistémica dependiendo del lugar de tratamiento. La administración local a un área que necesita tratamiento se puede lograr mediante, por ejemplo, pero sin limitación, infusión local durante una cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante.
En el presente documento se contempla la administración parenteral, generalmente caracterizada por inyección, ya sea por vía subcutánea, intramuscular, intratumoral, intravenosa o intradérmica. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en un líquido antes de la inyección o como emulsiones. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Así mismo, si se desea, las composiciones farmacéuticas a administrar también pueden contener un activador en forma de disolvente tal como agentes tamponantes de pH, sales de iones metálicos u otros tampones similares. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otras cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes de pH, estabilizantes, potenciadores de la solubilidad y otros agentes similares, tal como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas. También se contempla en el presente documento el implante de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida, de manera que se mantenga un nivel constante de dosificación (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 3.710.795). El porcentaje de compuesto activo que se encuentra en dichas composiciones parenterales depende en gran medida de la naturaleza específica del mismo, así como de la actividad del compuesto y las necesidades del sujeto.
Los inyectables se diseñan para administración local y sistémica. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para combinar con un disolvente justo antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, polvos insolubles secos estériles listos para combinar con un vehículo justo antes de su uso y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas. Si se administran por vía intravenosa, los transportadores adecuados incluyen suero salino fisiológico o suero salino tamponado con fosfato (PBS) y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tal como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
Los transportadores farmacéuticamente aceptables usados en las preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección isotónica de dextrosa, inyección de agua estéril, inyección de Ringer de dextrosa y lactada. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites no volátiles de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Se pueden añadir agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a las preparaciones parenterales envasadas en recipientes multidosis, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, metil y propil ésteres del ácido p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones incluyen fosfato y citrato.
Si se administran por vía intravenosa, los transportadores adecuados incluyen suero salino fisiológico o suero salino tamponado con fosfato (PBS) y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tal como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
La composición se puede formular para la administración de una sola dosis o para la administración de dosis múltiples. Los agentes pueden formularse para administración directa. La composición se puede proporcionar como una formulación líquida o liofilizada. Cuando la composición se proporciona en forma liofilizada, puede reconstituirse justo antes de su uso mediante un tampón apropiado, por ejemplo, una solución salina estéril.
Las composiciones también se pueden administrar con otros agentes biológicamente activos, ya sea de manera secuencial, de manera intermitente o en la misma composición. La administración también puede incluir sistemas de liberación controlada que incluyen formulaciones de liberación controlada y dispositivos de liberación controlada, tal como por medio de una bomba.
La vía más adecuada en cualquier caso dado depende de una variedad de factores, tal como la naturaleza de la enfermedad, el progreso de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la composición particular que se utiliza. Por ejemplo, las composiciones se administran sistémicamente, por ejemplo, a través de administración intravenosa. También se pueden emplear métodos subcutáneos, aunque puede ser necesario aumentar los tiempos de absorción para garantizar una biodisponibilidad equivalente en comparación con los métodos intravenosos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en formas farmacéuticas apropiadas para cada vía de administración. Los compuestos farmacéutica y terapéuticamente activos y los derivados de los mismos se formulan y administran normalmente en formas farmacéuticas unitarias o formas farmacéuticas múltiples. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el transportador, vehículo o diluyente farmacéutico necesario. Las formas farmacéuticas unitarias, incluyen, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles y soluciones o suspensiones orales y emulsiones de aceite agua que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o los derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las formas farmacéuticas unitarias pueden contener ampollas y jeringas o comprimidos o cápsulas envasadas individualmente. Las formas farmacéuticas unitarias pueden administrarse en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma farmacéutica múltiple es una pluralidad de formas farmacéuticas unitarias idénticas empaquetadas en un solo recipiente para su administración en una forma farmacéutica segregada. Los ejemplos de formas farmacéuticas múltiples incluyen viales, frascos de comprimidos o cápsulas o botellas de mililitros o litros. Por lo tanto, la forma farmacéutica múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no se segregan en su envase. En general, pueden prepararse formas farmacéuticas o composiciones que contienen el principio activo en el intervalo del 0,005 % al 100 % completándose con transportador no tóxico. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en formas farmacéuticas apropiadas para cada vía de administración.
La concentración del compuesto farmacéuticamente activo se ajusta de tal forma que una inyección proporciona una cantidad eficaz para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende de la edad, el peso y el estado del paciente o el animal, tal como se sabe en la técnica. Las preparaciones parenterales de dosis única se envasan en una ampolla, un frasco o una jeringuilla con una aguja. El volumen de solución líquida o preparación en polvo reconstituida, que contiene el compuesto farmacéuticamente activo, es una función de la enfermedad a tratar y del artículo de fabricación particular elegido para el envase. Todas las preparaciones para administración parenteral han de ser estériles, tal como se sabe y practica en la técnica. En algunas realizaciones, las composiciones se pueden proporcionar como un polvo liofilizado, que puede reconstituirse para su administración en forma de soluciones, emulsiones y otras mezclas. También pueden reconstituirse y formularse en forma de sólidos o geles. Los polvos liofilizados se pueden preparar a partir de cualquiera de las soluciones descritas anteriormente.
El polvo liofilizado estéril se puede preparar disolviendo un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento en una solución tampón. La solución tampón puede contener un excipiente que mejora la estabilidad u otros componentes farmacológicos de la solución en polvo o reconstituida, preparada a partir del polvo. En algunas realizaciones, la posterior esterilización por filtración de la solución, seguida de liofilización en condiciones normales conocidas por los expertos en la materia, proporciona la formulación deseada. Brevemente, el polvo liofilizado se prepara disolviendo un excipiente, tal como dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado, en un tampón adecuado, tal como citrato, fosfato de sodio o potasio u otro tampón similar conocido por los expertos en la materia. Después, se añade una enzima seleccionada a la mezcla resultante y se agita hasta que se disuelve. La mezcla resultante se esteriliza por filtración o se trata para eliminar las partículas y garantizar la esterilidad, y se reparte en viales para la liofilización. Cada frasco puede contener una dosis única (1 mg - 1 g, generalmente 1-100 mg, tal como 1-5 mg) o dosis múltiples del compuesto. El polvo liofilizado puede almacenarse en condiciones adecuadas, tales como a de aproximadamente 4 °C a temperatura ambiente. La reconstitución de este polvo liofilizado con una solución tampón proporciona una formulación para su uso en administración parenteral. La cantidad precisa depende de la indicación tratada y del compuesto seleccionado. Dicha cantidad puede determinarse empíricamente.
En algunas realizaciones, el pH de la composición está entre o entre aproximadamente 6 y 10, tal como entre o entre aproximadamente 6 y 8, entre o entre aproximadamente 6,9 y 7,3, tal como aproximadamente pH 7,1. En algunas realizaciones, el pH del tampón farmacéuticamente aceptable es al menos o aproximadamente 5, al menos o aproximadamente 6, al menos o aproximadamente 7, al menos o aproximadamente 8, al menos o aproximadamente 9 o al menos o aproximadamente 10, o es 7,1.
Las composiciones se pueden formular para la administración de una sola dosis o para la administración de múltiples dosis. Los agentes pueden formularse para administración directa.
En algunas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se formulan en una cantidad para la administración directa del compuesto activo, tal como el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, en un intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 3000 mg, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 50 mg, de alrededor de 0,01 mg a alrededor de 10 mg, de alrededor de 0,01 mg a alrededor de 1 mg, de alrededor de 0,01 mg a alrededor de 0,1 mg, de alrededor de 0,1 mg a alrededor de 2000 mg, de alrededor de 0,1 mg a alrededor de 1000 mg, de alrededor de 0,1 mg a 500 mg, de 0,1 mg a 100 mg, de 0,1 mg a 50 mg, de 0,1 mg a 10 mg, de 0,1 mg a 1 mg, de 1 mg a 2000 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1000 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 2000 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1000 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 2000 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1000 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 2000 mg, de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 1000 mg, y de aproximadamente 1000 mg a aproximadamente 3000 mg. En algunas realizaciones, el volumen de la composición puede ser de 0,5 ml a 1000 ml, tal como de 0,5 ml a 100 ml, de 0,5 ml a 10 ml, de 1 ml a 500 ml, de 1 ml a 10 ml, tal como al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente o 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml o más. Por ejemplo, la composición está formulada para la administración de una sola dosis de una cantidad entre o entre aproximadamente 100 mg y 500 mg o entre o entre aproximadamente 200 mg y 400 mg. En algunas realizaciones, la composición está formulada para la administración de una sola dosis de una cantidad entre o entre aproximadamente 500 mg y 1500 mg, 800 mg y 1200 mg o 1000 mg y 1500 mg. En algunas realizaciones, el volumen de la composición está entre o entre aproximadamente 10 ml y 1000 ml o 50 ml y 500 ml; o el volumen de la composición es al menos 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 400 ml 500 ml o 1000 ml.
En algunas realizaciones, todo el contenido del frasco de las formulaciones se puede extraer para la administración, o se puede dividir en una pluralidad de dosis para múltiples administraciones. Al extraer una cantidad de fármaco para su administración, la formulación se puede diluir adicionalmente si se desea, tal como diluida en agua, solución salina (por ejemplo, 0,9 %) u otra solución fisiológica.
En algunas realizaciones, también se describen composiciones que contienen un agente inmunomodulador o un agente anticanceroso, que se pueden preparar según pautas de formulación conocidas o convencionales, tal y como se ha descrito con anterioridad. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador, agente anticanceroso y/o conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, IR700 y molécula de direccionamiento, tal como el conjugado de IR700 y anticuerpo) se formulan como composiciones separadas. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se proporciona como una composición separada del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, y las dos composiciones se administran por separado. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso se proporciona como una composición separada del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, y las dos composiciones se administran por separado. Las composiciones se pueden formular para suministro parenteral (es decir, para suministro sistémico). Por ejemplo, las composiciones o combinación de composiciones se formulan para suministro subcutáneo o para suministro intravenoso. Los agentes, tal como un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, un agente inmunomodulador y/o un agente anticanceroso pueden administrarse por diferentes vías de administración.
3 Envasado y artículos de fabricación
También se describen los artículos de fabricación que contienen materiales de envasado, cualquier composición o combinación farmacéutica descrita en el presente documento, y una etiqueta que indique que las composiciones y combinaciones se van a usar para el tratamiento de cánceres. Artículos de fabricación ilustrativos son recipientes que incluyen recipientes de una sola cámara y de dos cámaras. Los recipientes incluyen, pero sin limitación, tubos, frascos y jeringas. Los recipientes pueden incluir además una aguja para administración subcutánea.
En algunas realizaciones, los agentes se pueden proporcionar por separado para el envasado como artículos de fabricación. En algunas realizaciones, el artículo de fabricación contiene composiciones farmacéuticas que contienen el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, tal como un conjugado de IR700 y anticuerpo y el agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el artículo de fabricación contiene composiciones farmacéuticas que contienen el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) y un agente anticanceroso. En algunas realizaciones, el artículo de fabricación contiene composiciones farmacéuticas que contienen el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo), el agente inmunomodulador y un agente anticanceroso adicional.
Los artículos de fabricación descritos en el presente documento contienen materiales de envasado. Los materiales de envasado para su uso en el envasado de productos farmacéuticos son bien conocidos por los expertos en la materia. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.° 5.323.907, 5.052.558 y 5.033.252. Los ejemplos de materiales de envasado farmacéutico incluyen, pero sin limitación, envases de tipo blíster, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, frascos y cualquier material de envasado adecuado para una formulación y un modo de administración y de tratamiento seleccionado. La elección del envase depende de los agentes. En general, el envase no reacciona con las composiciones contenidas en él.
Los componentes se pueden envasar en el mismo o en diferentes recipientes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los componentes se envasan por separado en el mismo recipiente. En general, los ejemplos de dichos recipientes incluyen aquellos que tienen un espacio cerrado, definido que contiene el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento y un espacio separado cerrado definido que contiene los otros componentes o componente de manera que las áreas posteriores estén separadas para permitir que los componentes se administren por separado. Se contempla cualquier recipiente u otro artículo de fabricación, siempre que los agentes estén separados de los otros componentes antes de la administración. Para realizaciones adecuadas, véase, por ejemplo, los recipientes descritos en las patentes de Estados Unidos números 3.539.794 y 5.171.081. En algunas realizaciones, se proporcionan una pluralidad de recipientes, que contiene cada uno por separado un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, un agente inmunomodulador o un agente anticanceroso. En dichos ejemplos, la pluralidad de recipientes puede envasarse como un kit.
En algunas realizaciones, un recipiente que contiene el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se encuentra en un recipiente protegido contra la luz. En algunas realizaciones, el recipiente es un frasco, tal como un frasco de vidrio despirogenado. En algunas realizaciones, el recipiente, tal como un frasco, bloquea la luz de una longitud de onda particular, tal como una longitud de onda de luz que es absorbida por el colorante o por el conjugado de colorante y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el conjugado se protege de la luz mediante recipientes que protegen el contenido de la luz, o de determinadas longitudes de onda o intensidades de luz. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el recipiente tiene una transmitancia de luz de no más del 50 %, no más del 40 %, no más del 30 %, no más del 20 %, no más del 10 %, no más del 5 % o no más del 1 %. En algunas realizaciones, el recipiente protege de la transmitancia de luz que tiene una longitud de onda entre o entre aproximadamente 500 nm y 725 nm, tal como entre o entre aproximadamente 650 nm y 725 nm, o no transmite una intensidad de luz superior a 700 lux, 600 lux, 500 lux, 400 lux, 300 lux, 200 lux o 100 lux. En algunas realizaciones, el recipiente es verde, ámbar, translúcido, opaco o está envuelto en un material opaco, tal como una lámina, tal como una lámina de aluminio. En algunas realizaciones, el recipiente es estéril o despirogenado.
En algunas realizaciones, los conjugados se proporcionan en una pluralidad de recipientes sellables. Por ejemplo, cada uno de los recipientes puede comprender individualmente una fracción de una dosis de administración única de una composición que contiene un conjugado que incluye un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, la cantidad combinada del conjugado en la pluralidad de recipientes sellables está entre o entre aproximadamente 100 mg y 1500 mg, o 100 mg y 1200 mg. En algunas realizaciones, la cantidad combinada del conjugado en la pluralidad de recipientes sellables está entre o entre aproximadamente 100 mg y 500 mg, entre o entre aproximadamente 200 mg y 400 mg, entre o entre aproximadamente 500 mg y 1500 mg, entre o entre aproximadamente 800 mg y 1200 mg o entre o entre aproximadamente 1000 mg y 1500 mg.
En algunas realizaciones, el artículo de fabricación contiene material de envasado y una etiqueta o prospecto que contiene instrucciones para combinar el contenido de la pluralidad de viales para preparar una formulación de una sola dosis de la composición.
En algunas realizaciones, los recipientes se envasan además para proteger el contenido de la luz. En algunas realizaciones, se proporciona un sistema de envasado que incluye un material de envasado interno que comprende un recipiente que comprende el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y molécula de direccionamiento, tal como el conjugado de IR700 y anticuerpo) y, opcionalmente, un recipiente que contiene un agente inmunomodulador o un agente anticanceroso. En algunas realizaciones, el material de envasado interno tiene una transmitancia de luz inferior al 20 %, tal como inferior al 15 %, inferior al 10 %, inferior al 5 % o inferior al 1 %. En algunas realizaciones, el sistema de envasado incluye un material de envasado externo que comprende el material de envasado interno. En algunas realizaciones, el material de envasado externo tiene una transmitancia de luz inferior al 20 %, tal como inferior al 15 %, inferior al 10 %, inferior al 5 % o inferior al 1 %. En algunas realizaciones, el material de envasado interno o externo incluye una lámina opaca, tal como una lámina de aluminio. En algunas realizaciones, el material de envasado secundario es un saco de aluminio. En algunas realizaciones, el material de envasado externo comprende cartón.
En algunas realizaciones, el material de envasado interno y/o externo es adecuado para el almacenamiento del conjugado. En algunas realizaciones, el material de envasado interno y/o externo es adecuado para el envío del conjugado.
Las composiciones seleccionadas que incluyen artículos de fabricación de las mismas también se pueden proporcionar como kits. Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un artículo para administración proporcionado como artículo de fabricación. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones para la aplicación, incluidas las dosis, pautas posológicas e instrucciones para los modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un artículo para diagnóstico.
En algunas realizaciones, las composiciones utilizadas para la administración de agentes, tales como el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento contienen una cantidad eficaz de cada agente junto con transportadores y excipientes farmacéuticos convencionales apropiados para el tipo de administración contemplada.
En algunas realizaciones, una dosis única del agente, tal como el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, se encuentra en un solo recipiente, tal como un recipiente en el que se almacena el agente. En algunas realizaciones, una sola cantidad de dosificación del conjugado se encuentra en una pluralidad de recipientes. Por tanto, en algunas realizaciones, una pluralidad de recipientes, tales como frascos, se combinan, en un recipiente que se utilizará para la administración del agente, tal como una bolsa para infusión intravenosa (i.v.). En algunas realizaciones, el recipiente utilizado para la administración, tal como una bolsa para infusión i.v., se prepara abriendo uno o varios recipientes que comprenden el agente y colocando el contenido en la bolsa, tal como hasta que se consiga una dosis deseada del agente para la administración, por ejemplo, infusión. Durante la preparación del recipiente de administración, tal como una bolsa para infusión i.v., se tomaron precauciones de luz para evitar la exposición del conjugado a la luz, tal como las diversas precauciones de luz descritas en el presente documento.
III. Métodos de tratamiento
En algunas realizaciones, se describen métodos para usar y usos de las composiciones que contienen un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y molécula de direccionamiento, tal como el conjugado de IR700 y anticuerpo) para PIT. En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se dirige a una célula o patógeno asociado con una enfermedad o afección, tal como mediante la unión a una proteína de la superficie celular o un a receptor de la superficie celular expresado en una célula. Dichos métodos y usos incluyen métodos y usos terapéuticos, por ejemplo, que implican la administración de las moléculas a un sujeto que padece una enfermedad, afección o trastorno seguida de irradiación para lograr la fotoinmunoterapia (PIT), dando como resultado la fotólisis de dichas células o patógenos para efectuar el tratamiento de la enfermedad o trastorno. En algunas realizaciones, los métodos se pueden utilizar para tratar un tumor o un cáncer, mediante el cual un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento administrado (conjugado de IR700 y molécula de direccionamiento, tal como el conjugado de IR700 y anticuerpo) se dirige a una célula asociada con un tumor, dando como resultado así en la fotólisis de dicha célula y, en algunos casos, dando como resultado el tratamiento del tumor. Los usos incluyen la utilización de las composiciones en dichos métodos y tratamientos, y la utilización de dichas composiciones en la preparación de un medicamento para llevar a cabo dichos métodos terapéuticos. En algunas realizaciones, los métodos y usos tratan así la enfermedad, afección o trastorno, tal como un tumor o cáncer, en el sujeto.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen la administración de un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR-700 y anticuerpo) al sujeto en condiciones en las que, en general, el conjugado entra en contacto con una célula a la que se quiere destruir. En algunas realizaciones, los métodos dan como resultado la unión de la parte de la molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo) del conjugado a una proteína de la superficie celular asociada con un tumor o cáncer. Después de poner en contacto o administrar el conjugado, una zona local del sujeto que contiene las células diana, por ejemplo, una célula o células asociadas con un tumor, se expone o irradia con la luz absorbida por el colorante, generalmente luz NIR, activando así el conjugado para llevar a cabo la destrucción celular específica. En algunas realizaciones, la irradiación se realiza a una longitud de onda de 600 nm a 850 nm a una dosis de al menos 1 J cm-2 o al menos 1 J/cm de longitud de fibra. En algunas realizaciones, los métodos para administrar un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR-700 y anticuerpo) incluyen métodos descritos en la patente de Estados Unidos n.° 8.524.239 o en la publicación de Estados Unidos n.° US2014/0120119.
A. Tumores y sujetos a tratar
En algunas realizaciones, la lesión es un tumor. En algunas realizaciones, el tumor es un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de cabeza y cuello, de mama, hígado, colon, ovario, próstata, páncreas, cerebro, cuello del útero, hueso, piel, pulmón o sangre. En algunas realizaciones, el cáncer puede incluir un tumor maligno caracterizado por un crecimiento celular anormal o descontrolado. Otras características que pueden estar asociadas con el cáncer incluyen metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anormales y supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunitaria, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como ganglios linfáticos, etc.
La enfermedad metastásica puede referirse a células cancerosas que han abandonado el sitio del tumor original y han migrado a otras partes del cuerpo, por ejemplo, a través del torrente sanguíneo o del sistema linfático. En algunas realizaciones, una célula a la que se dirigen los métodos divulgados es una célula cancerosa o una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, la célula cancerosa es una célula madre cancerosa. En algunas realizaciones, una célula a la que se dirigen los métodos divulgados es una célula que es una célula cancerosa, una célula tumoral, una célula inflamatoria, una célula inmunitaria, una neurona, una célula madre, una célula proliferativa o una célula en una hiperplasia.
La célula diana puede ser una célula que no se desea o cuyo crecimiento no se desea, tal como una célula tumoral o cancerosa. En algunas realizaciones, las células pueden estar creciendo en cultivo o presentes en un mamífero que se va a tratar, tal como un sujeto con cáncer. Cualquier célula diana se puede tratar con los métodos reivindicados. En algunas realizaciones, la célula diana expresa una proteína de la superficie celular que no se encuentra de manera sustancial en la superficie de otras células normales. En algunas realizaciones, se puede seleccionar un anticuerpo que se une de manera específica a dicha proteína y se puede generar un conjugado de colorante de ftalocianina y anticuerpo para esa proteína. En algunas realizaciones, la proteína de la superficie celular es una proteína específica de tumor. En algunas realizaciones, la proteína de la superficie celular es CD25, que se puede utilizar para atacar a células asociadas con el rechazo no deseado de trasplantes.
En algunas realizaciones, la célula tumoral es una célula cancerosa, tal como una célula en un sujeto con cáncer. Las células ilustrativas que se pueden dirigir en los métodos divulgados incluyen células de los siguientes tumores: un tumor líquido tal como una leucemia, que incluye leucemia aguda (tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de la cadena pesada). En algunas realizaciones, la célula es una célula tumoral sólida, tal como un sarcoma o carcinoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, carcinoma epidermoide, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, por ejemplo, adenocarcinoma de páncreas, colon, ovario, pulmón, de mama, estómago, próstata, cuello uterino o esófago, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncógeno, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello de útero, tumor testicular, carcinoma de vejiga, tumores del SNC, tales como un glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma. En algunas realizaciones, el cáncer es un carcinoma epidermoide de cabeza y cuello.
Los tumores ilustrativos, tales como cánceres, que se pueden tratar con los métodos reivindicados incluyen tumores sólidos, tales como carcinomas de mama, tales como carcinomas lobulillares y canaliculares, sarcomas, carcinomas de pulmón, tales como carcinoma microcítico, carcinoma macrocítico, carcinoma escamoso y adenocarcinoma, mesotelioma del pulmón, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma de estómago, adenocarcinoma de próstata, carcinoma de ovario, tal como cistadenocarcinoma seroso y cistadenocarcinoma mucinoso, tumores de células germinales ováricas, carcinomas testiculares y tumores de células germinales, adenocarcinoma pancreático, adenocarcinoma biliar, carcinoma hepatocelular, carcinoma de vejiga, que incluye, por ejemplo, carcinoma de células transicionales, adenocarcinoma y carcinoma escamoso, adenocarcinoma de células renales, carcinomas de endometrio, que incluyen, por ejemplo, adenocarcinomas y tumores de Müller mixtos (carcinosarcomas), carcinomas del endocérvix, ectocérvix y vagina, tales como adenocarcinoma y carcinoma escamoso de cada uno de los mismos, tumores de la piel, tales como carcinoma epidermoide, carcinoma basocelular, melanoma maligno, tumores del apéndice de la piel, sarcoma de Kaposi, linfoma cutáneo, tumores anexiales de piel y varios tipos de sarcomas y carcinoma de células de Merkel, carcinoma esofágico, carcinomas de nasofaringe y orofaringe, que incluyen carcinoma escamoso y adenocarcinomas de los mismos, carcinomas de las glándulas salivales, tumores de cerebro y del sistema nervioso central, que incluyen, por ejemplo, tumores de la glía, de origen neuronal y meníngeo, tumores del nervio periférico, sarcomas de tejidos blandos y sarcomas de hueso y cartílago, y tumores linfáticos, que incluyen linfoma maligno de linfocitos B y linfocitos T. En algunas realizaciones, el tumor es un adenocarcinoma.
Los métodos también se pueden utilizar para tratar tumores líquidos, tales como una leucemia linfática, de glóbulos blancos u otro tipo de leucemia. En algunas realizaciones, el tumor tratado es un tumor de la sangre, tal como una leucemia, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), tricoleucemia (HCL, del inglés "hairy cell leukemia"), leucemia prolinfocítica de linfocitos T (LPL-T), leucemia linfocítica granular grande y leucemia de linfocitos T adultos, linfomas, tales como el linfoma de Hodgkin y el linfoma no hodgkiniano y mielomas.
En algunas realizaciones, el conjugado se dirige a una proteína expresada en la superficie de una lesión o en la superficie de una célula presente en el microambiente de la lesión. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el conjugado se dirige a una proteína expresada en la superficie de una célula en el tumor o en la superficie de una célula en el microambiente del tumor. Ejemplos de dichas proteínas de la superficie celular son cualquiera de las descritas en el presente documento, incluyendo las descritas anteriormente.
En algunas realizaciones, la proteína de la superficie celular de la célula diana a la que se va a dirigir no está presente en cantidades significativas en otras células. Por ejemplo, la proteína de la superficie celular puede ser un receptor que solo se encuentra en el tipo de célula diana.
En algunas realizaciones, la proteína expresada en el tumor, por ejemplo, proteína específica de tumor, puede ser HER1/EGFR, HER2/ERBB2, CD20, CD25 (receptor de IL-2Ra), CD33, CD52, CD133, CD206, CEA, antígeno de cáncer 125 (CA125), a-fetoproteína (AFP), Lewis Y, TAG72, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), CD30, EpCAM, EphA2, glipicano-3, gpA33, mucinas, CAIX, PSMA, proteína de unión a folato, gangliósidos (tales como GD2, GD3, GM1 y GM2), receptor de VEGF (VEGFR), integrina aVp3, integrina a5p1, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, tenascina, AFP, complejo BCR, CD3, CD18, CD44, CTLA-4, gp72, HLA-DR 10 p, antígeno HLA-DR, IgE, MUC-1, nuC242, antígeno PEM, antígeno SK-1 o PD-L1. En algunas realizaciones, la proteína específica de tumor es PD-L1, HER1/EGFR, HER2, CD20, CD25, CD33, CD52, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA, del inglés "prostate specific membrane antigen"), EpCAM, EphA2, CD206, CD44, CD133, mesotelina, glipicano-3 o antígeno carcinoembrionario (CEA). Otras proteínas de la superficie celular incluyen cualquiera de las descritas anteriormente.
En algunas realizaciones, la proteína de la superficie celular está asociada con un tumor, tal como una proteína específica de tumor o un antígeno específico de tumor, tales como miembros de la familia de receptores EGF (por ejemplo, HERI, 2, 3 y 4) y receptores de citocinas (por ejemplo, CD20, CD25, IL-13R, CD5, CD52, etc.). En algunas realizaciones, las proteínas específicas de tumor son aquellas proteínas que son exclusivas de las células cancerosas o que son mucho más abundantes en ellas, en comparación con otras células, tales como las células normales. Por ejemplo, HER2 generalmente se encuentra en cánceres de mama, mientras que HERI se encuentra normalmente en adenocarcinomas, que se pueden encontrar en muchos órganos, tales como el páncreas, de mama, próstata y colon.
Las proteínas asociadas con un tumor ilustrativas que se pueden encontrar en una célula diana, y cuya molécula de direccionamiento, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, específica para esa proteína se puede utilizar para formular un conjugado de colorante de ftalocianina y anticuerpo, incluyen, pero sin limitación: cualquiera de los diversos MAGE (antígeno E asociado al melanoma), que incluye MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3 y Ma Ge 4, cualquiera de las diversas tirosinasas, mutante ras, mutante p53, antígeno de melanoma p97, glóbulo de grasa de la leche humana (HMFG, del inglés "human milk fat globule") que puede estar asociado con tumores de mama, cualquiera de los diversos BAGE (antígeno E asociado al melanoma humano B), que incluye BAGE1 y BAGE2, cualquiera de los diversos GAGE (antígeno G), que incluye GAGE1, GAGE2-6, varios gangliósidos y CD25.
Otras proteínas asociadas con un tumor incluyen los antígenos HPV 16/18 y E6/E7 asociados con cánceres de cuello uterino, antígeno de mucina (MUC 1)-KLH que puede estar asociado con el carcinoma de mama, CEA (antígeno carcinoembrionario) que puede estar asociado con cáncer colorrectal, gp100 que puede estar asociado con, por ejemplo, melanoma, antígenos MARTI que pueden estar asociados con el melanoma, antígeno de cáncer 125 (CA125, también conocido como mucina 16 o MUC16) que puede estar asociado con cánceres de ovario y otros cánceres, a-fetoproteína (AFP) que puede estar asociada con el cáncer de hígado, antígeno de Lewis Y que puede estar asociado con cáncer colorrectal, biliar, de mama, de pulmón microcítico y otros cánceres, glucoproteína 72 asociada a tumor (TAG72) que puede estar asociada con adenocarcinomas, y el antígeno PSA que puede estar asociado con cáncer de próstata.
Otras proteínas ilustrativas asociadas con un tumor incluyen además, pero sin limitación, PMSA (antígeno prostático específico de membrana), que puede estar asociada con neovasculatura tumoral sólida, así como cáncer de próstata, HER-2 (receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano) que puede estar asociado con el cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de estómago y cáncer de útero, HER-1 que puede estar asociado con cáncer de pulmón, cáncer anal y glioblastoma así como a adenocarcinomas, NY-ESO-1 que puede estar asociado con melanoma, sarcomas, carcinomas testiculares y otros cánceres, hTERT (también conocido como telomerasa), proteinasa 3 y tumor de Wilms 1 (WT-1).
En algunas realizaciones, la proteína asociada con un tumor es CD52 y puede estar asociada con leucemia linfocítica crónica, CD33 y puede estar asociada con leucemia mielógena aguda, o CD20 y puede estar asociada con linfoma no hodgkiniano.
Por tanto, los métodos divulgados se pueden utilizar para tratar cualquier cáncer que exprese una proteína específica de tumor. En algunas realizaciones, el agente terapéutico contra un tumor es un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno, una proteína, una glucoproteína, un péptido, un polipéptido, un virus, una cápside vírica o una partícula vírica. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno.
En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano o un mamífero no humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano o sujeto veterinario, tal como un ratón. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano, que tiene cáncer o está en tratamiento contra el cáncer. En algunas realizaciones, los métodos divulgados se utilizan para tratar a un sujeto que tiene un tumor, tal como un tumor descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el tumor ha sido tratado previamente, tal como extirpado de manera quirúrgica o química, y los métodos divulgados se utilizan posteriormente para destruir cualquier célula tumoral no deseada que pueda permanecer en el sujeto.
Los métodos divulgados se pueden utilizar para tratar cualquier sujeto mamífero, tal como un ser humano, quien tiene un tumor, tal como un cáncer, o se le ha extirpado o tratado previamente. Los sujetos que necesitan las terapias divulgadas pueden incluir sujetos humanos que tienen cáncer, en donde las células cancerosas expresan una proteína específica de tumor en su superficie que puede unirse de manera específica al conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. Por ejemplo, los métodos divulgados se pueden utilizar como tratamiento inicial para el cáncer, ya sea solos o en combinación con radiación u otra quimioterapia. Los métodos divulgados también se pueden utilizar en pacientes a los que les ha fallado la radiación o la quimioterapia anterior. Por tanto, en algunas realizaciones, el sujeto es alguien que ha recibido otras terapias, pero esas otras terapias no han proporcionado una respuesta terapéutica deseada. Los métodos divulgados también se pueden utilizar en pacientes con cáncer localizado y/o metastásico.
En algunas realizaciones, el método incluye seleccionar un sujeto que se beneficiará de las terapias divulgadas, tal como seleccionar un sujeto que tiene un tumor que expresa una proteína de la superficie celular, tal como una proteína específica de tumor, que se puede unir de manera específica a un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. Por ejemplo, si se determina que el sujeto tiene un cáncer de mama que expresa HER1, el sujeto puede seleccionarse para ser tratado con una molécula de anti-HER1-IR700, tal como cetuximab-IR700.
B. Dosis y Administración
Las composiciones proporcionadas en el presente documento que contienen un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) se administran en cantidades que son suficientes para ejercer un efecto terapéuticamente útil. Normalmente, los agentes activos se administran en una cantidad que no produce efectos secundarios indeseables para el paciente que se está tratando, o que minimiza o reduce los efectos secundarios observados en comparación con las dosis y cantidades necesarias para un tratamiento único con uno de los agentes anteriores.
Los métodos para determinar las dosis óptimas de un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) para un paciente que lo necesite, bien en solitario o en combinación con uno o más agentes diferentes, pueden determinarse mediante estudios convencionales de dosis-respuesta y toxicidad que son bien conocidos en la técnica.
La cantidad de un agente terapéutico, tal como el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) que se administra a un sujeto humano o veterinario variará dependiendo de una serie de factores asociados con ese sujeto, por ejemplo, la salud global del sujeto. En algunas realizaciones, se puede determinar una cantidad eficaz del agente mediante la variación de la dosis del producto y la medición de la respuesta terapéutica resultante, tal como la regresión de un tumor. En algunas realizaciones, se pueden determinar las cantidades eficaces a través de varios inmunoensayos in vitro, in vivo o in situ. En algunas realizaciones, los agentes divulgados se pueden administrar en una dosis única o en varias dosis, según sea necesario para obtener la respuesta deseada. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz depende de la fuente aplicada, del sujeto que se está tratando, de la gravedad y del tipo de la afección que ha de tratarse, y de la forma de administración.
En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de una composición que, sola o junto con un agente terapéutico adicional, tal como un agente quimioterapéutico, es suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto, o en una célula, que se trata con la composición. La cantidad eficaz del agente terapéutico, tal como el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) puede depender de varios factores, incluyendo, pero sin limitación, el sujeto o células que se están tratando, el agente terapéutico particular y la forma de administración de la composición terapéutica. En algunas realizaciones, una cantidad o concentración terapéuticamente eficaz es aquella que es suficiente para evitar el avance, tal como la metástasis, retrasar la progresión o provocar la regresión de una enfermedad o que sea capaz de reducir los síntomas causados por la enfermedad, tales como un cáncer. En algunas realizaciones, una cantidad o concentración terapéuticamente eficaz es aquella que es suficiente para aumentar el tiempo de supervivencia de un paciente con un tumor.
En la invención reivindicada, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado es o es aproximadamente 320 mg/m2 o 640 mg/m2.
En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado está entre o entre aproximadamente 0,25 mg/kg y 150 mg/kg, 0,25 mg/kg y 100 mg/kg, 0,25 mg/kg y 75 mg/kg, 0,25 mg/kg y 60 mg/kg, 0,25 mg/kg y 50 mg/kg, 0,25 mg/kg y 25 mg/kg, 0,25 mg/kg y 10 mg/kg, 0,25 mg/kg y 7,5 mg/kg, 0,25 mg/kg y 5,0 mg/kg, 0,25 mg/kg y 2,5 mg/kg, 0,25 mg/kg y 1,0 mg/kg, 0,25 mg/kg y 0,5 mg/kg, 0,50 mg/kg y 150 mg/kg, 0,50 mg/kg y 100 mg/kg, 0,50 mg/kg y 75 mg/kg, 0,50 mg/kg y 60 mg/kg, 0,50 mg/kg y 50 mg/kg, 0,50 mg/kg y 25 mg/kg, 0,50 mg/kg y 10 mg/kg, 0,50 mg/kg y 7,5 mg/kg, 0,50 mg/kg y 5,0 mg/kg, 0,50 mg/kg y 2,5 mg/kg, 0,50 mg/kg y 1.0 mg/kg, 1,0 mg/kg y 150 mg/kg, 1,0 mg/kg y 100 mg/kg, 1,0 mg/kg y 75 mg/kg, 1,0 mg/kg y 60 mg/kg, 1,0 mg/kg y 50 mg/kg, 1,0 mg/kg y 25 mg/kg, 1,0 mg/kg y 10 mg/kg, 1,0 mg/kg y 7,5 mg/kg, 1,0 mg/kg y 5,0 mg/kg, 1,0 mg/kg y 2,5 mg/kg, 2,5 mg/kg y 150 mg/kg, 2,5 mg/kg y 100 mg/kg, 2,5 mg/kg y 75 mg/kg, 2,5 mg/kg y 60 mg/kg, 2,5 mg/kg y 50 mg/kg, 2,5 mg/kg y 25 mg/kg, 2,5 mg/kg y 10 mg/kg, 2,5 mg/kg y 7,5 mg/kg, 2,5 mg/kg y 5,0 mg/kg, 5,0 mg/kg y 150 mg/kg, 5,0 mg/kg y 100 mg/kg, 5,0 mg/kg y 75 mg/kg, 5,0 mg/kg y 60 mg/kg, 5,0 mg/kg y 50 mg/kg, 5,0 mg/kg y 25 mg/kg, 5,0 mg/kg y 10 mg/kg, 5,0 mg/kg y 7,5 mg/kg, 7,5 mg/kg y 150 mg/kg, 7,5 mg/kg y 100 mg/kg, 7,5 mg/kg y 75 mg/kg, 7,5 mg/kg y 60 mg/kg, 7,5 mg/kg y 50 mg/kg, 7,5 mg/kg y 25 mg/kg, 7,5 mg/kg y 10 mg/kg, 10 mg/kg y 150 mg/kg, 10 mg/kg y 100 mg/kg, 10 mg/kg y 75 mg/kg, 10 mg/kg y 60 mg/kg, 10 mg/kg y 50 mg/kg, 10 mg/kg y 25 mg/kg, 25 mg/kg y 150 mg/kg, 25 mg/kg y 100 mg/kg, 25 mg/kg y 75 mg/kg, 25 mg/kg y 60 mg/kg, 25 mg/kg y 50 mg/kg, 50 mg/kg y 150 mg/kg, 50 mg/kg y 100 mg/kg, 50 mg/kg y 75 mg/kg, 50 mg/kg y 60 mg/kg, 60 mg/kg y 150 mg/kg, 60 mg/kg y 100 mg/kg, 60 mg/kg y 75 mg/kg, 75 mg/kg y 150 mg/kg, 75 mg/kg y 100 mg/kg, y 100 mg/kg y 150 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz del conjugado no es superior a 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 7,0 mg/kg, 8,0 mg/kg, 9,0 mg/kg, 10.0 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg o 150 mg/kg.
En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz es al menos o al menos aproximadamente 0,01 mg, 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1000 mg, 2000 mg, 3000 mg o más.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen administrar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, por ejemplo, el conjugado IR700-anticuerpo. En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se dirige a una célula presente en el microambiente de un tumor, lesión o hiperplasia. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado se administra por vía intratumoral.
En algunas realizaciones, la dosis del conjugado es de al menos 10 pg/kg, tal como al menos 100 pg/kg, al menos 500 pg/kg o al menos 500 pg/kg, por ejemplo, de 10 pg/kg a 1000 pg/kg, tal como una dosis de aproximadamente 100 pg/kg, aproximadamente 250 pg/kg, aproximadamente 500 pg/kg, aproximadamente 750 pg/kg, o aproximadamente 1000 pg/kg, por ejemplo, cuando se administra por vía intratumoral o intraperitoneal (IP). En algunas realizaciones, la dosis es de al menos 1 pg/ml, tal como al menos 500 pg/ml, tal como entre 20 pg/ml y 100 pg/ml, tal como aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 30 pg/ml, aproximadamente 40 pg/ml, aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 60 pg/ml, aproximadamente 70 pg/ml, aproximadamente 80 pg/ml, aproximadamente 90 pg/ml o aproximadamente 100 pg/ml, por ejemplo, administrada en solución tópica.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es una dosis administrada a un ser humano. En algunas realizaciones, el peso de un ser humano promedio es de 60 a 85 kg, tal como alrededor de o aproximadamente 75 kg.
En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz es aquella en la que un conjugado administrado que contiene un colorante de ftalocianina conjugado con una molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) logra una exposición sistémica que no supera la exposición sistémica terapéuticamente eficaz de la molécula de direccionamiento ( ej., anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) que no está así conjugada, tal como se produce tras la administración de una dosis clínicamente aceptable del fármaco de molécula de direccionamiento al fármaco solo.
La expresión "exposición sistémica" se refiere a la exposición del organismo real de una molécula de direccionamiento a fármaco en el plasma (sangre o suero) después de la administración de la molécula de direccionamiento a fármaco, y se puede establecer como el área bajo la curva de concentración de fármaco en plasma-tiempo (AUC) determinada por análisis farmacocinético después de la administración de una dosis de la molécula de direccionamiento a fármaco. En algunos casos, el a Uc se expresa en mg*h/l o en sus unidades correspondientes (por ejemplo, pg*h/l). En algunas realizaciones, el AUC se mide como un AUC promedio en una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra, por ejemplo, el AUC promedio de uno o más pacientes. En algunas realizaciones, la exposición sistémica se refiere al área bajo la curva (AUC) de 0 a infinito (inf o ~) (AUC0-~ o AUC[0-inf]), incluidos todos los datos medidos y los datos extrapolados de los parámetros farmacocinéticos (PK, del inglés "pharmacokinetic") medidos, tal como un AUC promedio de una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra. En algunas realizaciones, el AUC0-~ se predice basándose en la información PK para un mes. En algunas realizaciones, la exposición sistémica se refiere al AUC desde 0 hasta el último punto de tiempo medido experimentalmente (AUC0-último). En algunas realizaciones, la exposición sistémica es la exposición (AUC) que se produce en el momento de la irradiación de luz o iluminación, ya que la PIT depende de la dosis o cantidad del conjugado en el tumor en el momento en que se realiza la iluminación o irradiación. En algunas realizaciones, la irradiación de luz o iluminación se realiza dentro de o aproximadamente dentro de o aproximadamente 24 horas ± 3 horas, tal como 24 horas ± 2 horas después de la administración del conjugado. Por tanto, en algunas realizaciones, la exposición sistémica se refiere al área bajo la curva (AUC) de 0 a 24 horas (AUC0-24 o AUC [0-24]). En algunas realizaciones, la exposición sistémica se refiere al área bajo la curva (AUC) promedio de 0 a 24 horas (AUC0-24 o AUC[0-24]) de una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es aquella en la que un conjugado administrado que contiene un colorante de ftalocianina conjugado con una molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) logra una exposición sistémica medida en función del AUC0-24 que es sustancialmente inferior al AUC0-~ de una dosis clínicamente aceptable de la molécula de direccionamiento que no está así conjugada. En algunos casos, esto se debe a que una exposición sistémica terapéuticamente eficaz del conjugado lograda en el momento de la PIT (en el momento de la irradiación con luz o iluminación) es el período relevante para la actividad de la PIT como se describe anteriormente. En cambio, en algunos casos, para una exposición sistémica terapéuticamente eficaz, tal como para lograr actividad farmacológica, para una molécula de direccionamiento que no está así conjugada (por ejemplo, cetuximab sin conjugar), la molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo) debe estar presente a una exposición mucho mayor. Por ejemplo, bajo las pautas de la FDA para Erbitux (cetuximab), el anticuerpo se administra a 400 mg/m2 con dosis semanales de 250 mg/m2 En algunos casos, los pacientes pueden necesitar el tratamiento continuo de una molécula de direccionamiento sin conjugar (por ejemplo, un anticuerpo) durante más de un mes.
La expresión "exposición sistémica terapéuticamente eficaz" se refiere a la exposición sistémica lograda por una dosis de una molécula de direccionamiento a fármaco (por ejemplo, un anticuerpo) para la actividad farmacológica que se considera clínicamente aceptable y/o que logra un efecto terapéutico mientras tiene un perfil de seguridad aceptable. Se encuentra dentro del nivel de un experto en la materia determinar o identificar una dosis de una molécula de direccionamiento a fármaco (por ejemplo, un anticuerpo) que sea clínicamente aceptable y/o que logre un efecto terapéutico que tenga un perfil de seguridad aceptable. En algunas realizaciones, una dosis clínicamente aceptable de una molécula de direccionamiento a fármaco se determina como resultado de ensayos clínicos en animales, y particularmente en seres humanos, tal como los realizados por la Food and Drug Administration (FDA) u otras agencias reguladoras (por ejemplo, EMA, PDMA). En algunas realizaciones, una exposición sistémica terapéuticamente eficaz incluye la exposición sistémica que es el resultado de la administración de una sola dosis de una molécula de direccionamiento a fármaco (por ejemplo, un anticuerpo) o por la administración repetida de una molécula de direccionamiento a fármaco (por ejemplo, un agente) en un ciclo de administración, tal como dosificación diaria, semanal, quincenal o mensual.
Las pautas posológicas clínicamente aceptables aprobadas por la FDA ilustrativas para fármacos de anticuerpos ilustrativos se establecen en la tabla 1. En algunas realizaciones, una exposición sistémica terapéuticamente eficaz de una molécula de direccionamiento a fármaco, incluyendo una molécula de direccionamiento a fármaco que no está conjugada con un colorante de ftalocianina, puede determinarse o se conoce a partir de estudios farmacocinéticos de una población de sujetos a la dosis clínicamente aceptable o aprobada administrada como una sola administración de la dosis inicial o administrada mediante administraciones repetidas en un ciclo de dosificación (véase, por ejemplo, Fracasso et al. (2007) Clin. Cancer. Res., 13:986 para exposiciones sistémicas observadas (AUC) después de la administración de dosis únicas de cetuximab dentro del intervalo de dosificación aprobado por la FDA).
Figure imgf000046_0001
continuación
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En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz del conjugado es aquella en la que el conjugado administrado que contiene un colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) conjugado con una molécula de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) logra una exposición sistémica promedio (por ejemplo, AUC) para una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra, que no es más del 75 %, no más del 70 %, no más del 60 %, no más del 50 %, no más del 45 %, no más del 40 %, no más del 35 %, no más del 25 %, no más del 20 % de la exposición sistémica terapéuticamente eficaz promedio para una población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra de la molécula de direccionamiento correspondiente (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) que no está así conjugada. Normalmente, la exposición sistémica del conjugado es suficientemente alta para ser capaz de presentar fototoxicidad mediante PIT.
En algunas realizaciones, el conjugado se administra para lograr una exposición sistémica promedio medida por el área bajo la curva de concentración del conjugado en plasma-tiempo desde el tiempo 0 hasta el infinito (AUC[0-inf] o AUC0-~) para la población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra, después de la administración del conjugado que está entre o entre aproximadamente 250 |jg/ml*h (usado indistintamente con |jg*h/ml) y 100.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 50.000 jg/ml*h, entre o aproximadamente entre 500 jg/ml*h y 25.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 18.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 10.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 5.000 jg/ml*h o entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 2.500 jg/ml*h. En algunas realizaciones, el conjugado se administra para lograr una exposición sistémica medida por el área bajo la curva de concentración del conjugado en plasma-tiempo promedio desde el tiempo 0 hasta el infinito (AUC[0-inf] o AUC0-~) para la población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra, después de la administración del conjugado que no es más de 100.000 jg/ml*h, no más de 75.000 jg/ml*h, no más de 50.000 jg/ml*h, no más de 40.000 jg/ml*h, no más de 30.000 jg/ml*h, no más de 20.000 jg/ml*h, no más de 10.000 jg/ml*h, no más de 5.000 jg/ml*h, no más de 2.500 jg/ml*h.
En algunas realizaciones, el conjugado se administra para lograr una exposición sistémica promedio medida por el área bajo la curva de concentración del conjugado en plasma-tiempo desde el tiempo 0 hasta 24 horas (AUC[0-24] o AUC0-24) para la población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra, después de la administración del conjugado que está entre o entre aproximadamente 100 jg/ml*h y 25.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 200 jg/ml*h y 10.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 5.000 jg/ml*h; o la exposición sistémica promedio medida por el AUC0-24 para la población de pacientes, tal como una población de pacientes de muestra, después de la administración del conjugado no es más de 25.000 jg/ml*h, no más de 15.000 jg/ml*h, no más de 10.000 jg/ml*h, no más de 5.000 jg/ml*h, no más de 2.500 jg/ml*h, no más de 1.000 jg/ml*h, o no más de 500 jg/ml*h. En algunas realizaciones, el AUC0-24 del conjugado en plasma después de la administración del conjugado está entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 8.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 5.000 jg/ml*h, entre o entre aproximadamente 500 jg/ml*h y 2.000 jg/ml*h o entre o entre aproximadamente 1000 jg/ml*h y 4.000 jg/ml*h.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) es menor que la dosis terapéuticamente eficaz de administración única de la molécula de direccionamiento correspondiente (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) que no está así conjugada, como por ejemplo, no más del 75 %, no más del 70 %, no más del 60 %, no más del 50 %, no más del 45 %, no más del 40 %, no más del 35 %, no más del 25 %, no más del 20 % de la dosis terapéuticamente eficaz de administración única de la molécula de direccionamiento correspondiente que no está así conjugada.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) es menor que la dosis inicial en un programa de dosificación repetido de la dosis terapéuticamente eficaz de la molécula de direccionamiento correspondiente (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) que no está así conjugada, como por ejemplo, no más del 75 %, no más del 70 %, no más del 60 %, no más del 50 %, no más del 45 %, no más del 40 %, no más del 35 %, no más del 25 %, no más del 20 % de la dosis inicial en una administración de dosis repetida de la dosis terapéuticamente eficaz de la molécula de direccionamiento correspondiente que no está así conjugada.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) es menor que la dosis promedio en un programa de dosificación repetido de la dosis terapéuticamente eficaz de la molécula de direccionamiento correspondiente (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) que no está así conjugada, como por ejemplo, no más del 75 %, no más del 70 %, no más del 60 %, no más del 50 %, no más del 45 %, no más del 40 %, no más del 35 %, no más del 25 %, no más del 20 % de la dosis promedio en un programa de dosificación repetido de la dosis terapéuticamente eficaz de la molécula de direccionamiento correspondiente que no está así conjugada.
En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado es menor de 400 mg/m2, menor de 300 mg/m2, menor de 250 mg/m2, menor de 225 mg/m2, menor de 200 mg/m2, menor de 180 mg/m2, menor de 100 mg/m2 o menor de 50 mg/m2. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado está entre o aproximadamente entre 50 mg/m2 y 400 mg/m2, 100 mg/m2 y 300 mg/m2, 100 mg/m2 y 250 mg/m2 o 100 mg/m2 y 160 mg/m2. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado está entre o entre aproximadamente 80 mg/m2 y 240 mg/m2, 80 mg/m2 y 220 mg/m2, 80 mg/m2 y 200 mg/m2, 80 mg/m2 y
180 mg/m2, 80 mg/m2 y 160 mg/m2, 80 mg/m2 y 140 mg/m2, 80 mg/m2 y 120 mg/m2, 80 mg/m2 y 100 mg/m2, 100 mg/m2 y 240 mg/m2, 100 mg/m2 y 220 mg/m2, 100 mg/m2 y 200 mg/m2, 100 mg/m2 y 180 mg/m2, 100 mg/m2 y 160 mg/m2, 100 mg/m2 y 140 mg/m2, 100 mg/m2 y 120 mg/m2, 120 mg/m2 y 240 mg/m2, 120 mg/m2 y 220 mg/m2, 120 mg/m2 y 200 mg/m2, 120 mg/m2 y 180 mg/m2, 120 mg/m2 y 160 mg/m2,120 mg/m2 y 140 mg/m2, 140 mg/m2 y 240 mg/m2, 140 mg/m2 y 220 mg/m2, 140 mg/m2 y 200 mg/m2, 140 mg/m2 y 180 mg/m2, 140 mg/m2 y 160 mg/m2, 160 mg/m2 y 240 mg/m2, 160 mg/m2 y 220 mg/m2, 160 mg/m2 y 200 mg/m2, 160 mg/m2 y 180 mg/m2, 180 mg/m2 y 240 mg/m2, 180 mg/m2 y 220 mg/m2, 180 mg/m2 y 200 mg/m2, 200 mg/m2 y 220 mg/m2 o
En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado es menor de 12 mg/kg, menor de 10 mg/kg, menor de 8 mg/kg, menor de 6 mg/kg, menor de 4 mg/kg, menor de 2 mg/kg o menor de 1 mg/kg. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado está entre o entre aproximadamente 1 mg/kg y 12 mg/kg, 2 mg/kg y 10 mg/kg, 2 mg/kg y 6 mg/kg o 2 mg/kg y 4 mg/kg. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del conjugado está entre o entre aproximadamente 2,0 mg/kg y 6,5 mg/kg, 2,0 mg/kg y 6.0 mg/kg, 2,0 mg/kg y 5,0 mg/kg, 2,0 mg/kg y 4,0 mg/kg, 2,0 mg/kg y 3,0 mg/kg, 3,0 mg/kg y 6,5 mg/kg, 3,0 mg/kg y 6.0 mg/kg, 3,0 mg/kg y 5,0 mg/kg, 3,0 mg/kg y 4,0 mg/kg, 4,0 mg/kg y 6,5 mg/kg, 4,0 mg/kg y 6,0 mg/kg, 4,0 mg/kg y 5.0 mg/kg, 5,0 mg/kg y 6,5 mg/kg, 5,0 mg/kg y 6,0 mg/kg y 6,0 mg/kg y 6,5 mg/kg.
En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz está entre aproximadamente 75 mg y 500 mg, 75 mg y 400 mg, 75 mg y 400 mg, 75 mg y 300 mg, 75 mg y 200 mg, 75 mg y 150 mg, 150 mg y 500 mg, 150 mg y 400 mg, 150 mg y 300 mg, 150 mg y 200 mg, 200 mg y 500 mg, 200 mg y 400 mg, 200 mg y 300 mg, 300 mg y 500 mg, 300 mg y 400 mg o 400 mg y 500 mg.
En algunas realizaciones, el conjugado es IR700-cetuximab. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado IR700-cetuximab es al menos o aproximadamente al menos o es o es aproximadamente 160 mg/m2, 320 mg/m2 o 640 mg/m2. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado IR700-cetuximab es al menos o aproximadamente al menos o es o es aproximadamente 4,3 mg/kg, 8,6 mg/kg o 17 mg/kg.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz del conjugado es para administración de una sola dosis.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz se administra únicamente como una sola inyección o una sola infusión en un programa o ciclo de dosificación, por ejemplo, se administra solamente una vez en un programa o ciclo de dosificación. Por ejemplo, en un programa o ciclo de dosificación, no se administra una dosis posterior del conjugado. En algunas realizaciones, el programa de dosificación se puede repetir. En algunas realizaciones, la dosis repetida, como una sola dosis repetida, se administra en un momento en que la primera dosis se ha eliminado del sujeto, que, en algunos casos, es un momento en el que no hay exposición sistémica detectable del conjugado.
Por tanto, en algunas realizaciones, la dosificación del conjugado no se administra para lograr una exposición sistémica continua del conjugado, que es diferente a muchas terapias existentes, incluyendo terapias de anticuerpos, en las que se necesita repetir la dosificación en un programa o ciclo de dosificación para mantener una exposición sistémica continua. En algunas realizaciones, el programa o ciclo de dosificación se repiten una vez a la semana, cada dos semanas, una vez al mes, dos veces al año, una vez al año o con menor frecuencia según sea necesario. En algunas realizaciones, en cualquiera de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, el programa de dosificación se repite, si permanece una lesión residual después de un tratamiento previo con el conjugado. En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente evaluar al sujeto para determinar la presencia de una lesión residual y si la lesión residual permanece, repetir el programa de dosificación. En algunas realizaciones, el programa de dosificación se repite si permanece una lesión residual en un tiempo que es superior a o aproximadamente o 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 6 meses o 1 año después del inicio de la administración previa del conjugado. En algunas realizaciones, el programa de dosificación se repite si permanece una lesión residual a o aproximadamente a las 4 semanas después del inicio de la administración previa del conjugado.
En algunas realizaciones, en un programa o ciclo de dosificación, no se administra una dosis posterior de la molécula de direccionamiento, por ejemplo, moléculas de direccionamiento terapéuticas (por ejemplo,anticuerpos terapéuticos) que no están así conjugadas con un fotosensibilizador (por ejemplo, IR700). Por ejemplo, en algunas realizaciones, una dosis del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento no va seguida por una dosis de la molécula de direccionamiento sola.
Un experto en la materia reconocerá que también se pueden usar dosis más altas o más bajas del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, por ejemplo, dependiendo del agente particular. En algunas realizaciones, las dosificaciones, tales como dosificaciones diarias, se administran en una o más dosis divididas, tal como 2, 3 o 4 dosis, o en una sola formulación. El conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se puede administrar solo, en presencia de un transportador farmacéuticamente aceptable o en presencia de otros agentes terapéuticos, tal como un agente inmunomodulador, agente anticanceroso u otros agentes antineoplásicos.
En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento puede administrarse sistémica o localmente al órgano o tejido a tratar. Las vías de administración ilustrativas incluyen, pero sin limitación, las vías tópica, inyección (tal como subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral e intravenosa), oral, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal y de inhalación. En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se administra por vía parenteral. En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se administra por vía enteral. En algunas realizaciones, el conjugado se administra mediante inyección local. En algunas realizaciones, el conjugado se administra como aplicación tópica.
Las composiciones que comprenden el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento pueden administrarse local o sistémicamente utilizando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, a sujetos que tienen un tumor, tal como un cáncer, o que han tenido un tumor previamente extirpado, por ejemplo, mediante cirugía. Aunque se proporcionan ejemplos específicos, un experto en la materia apreciará que se pueden utilizar métodos alternativos de administración de los agentes divulgados. Dichos métodos pueden incluir, por ejemplo, el uso de catéteres o bombas implantables para proporcionar una infusión continua durante un período de varias horas a varios días en el sujeto que necesita tratamiento.
En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se administra por vía parenteral, incluyendo inyección directa o infusión en un tumor, tal como de manera intratumoral. En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se administra al tumor aplicando el agente al tumor, por ejemplo, bañando el tumor en una solución que contiene el agente, tal como el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento o vertiendo el agente sobre el tumor.
Además, o como alternativa, las composiciones divulgadas se pueden administrar por vía sistémica, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea u oral, a un sujeto que tiene un tumor, tales como un cáncer.
Las dosis del conjugado de molécula de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento para administrar a un sujeto no están sujetas a límites absolutos, pero dependerá de la naturaleza de la composición y sus principios activos y sus efectos secundarios no deseados, tales como la respuesta inmunitaria contra el agente, el sujeto que se está tratando y el tipo de afección que se está tratando y la forma de administración. En general, la dosis será una cantidad terapéuticamente eficaz, tal como una cantidad suficiente para lograr un efecto biológico deseado, por ejemplo, una cantidad que sea eficaz para disminuir el tamaño, tal como el volumen y/o el peso, del tumor, o atenuar el crecimiento adicional del tumor, o disminuir los síntomas no deseados del tumor.
En algunas realizaciones, las composiciones utilizadas para la administración del agente, tales como el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento contienen una cantidad eficaz del agente junto con transportadores y excipientes farmacéuticos convencionales apropiados para el tipo de administración contemplada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las formulaciones parenterales pueden contener una suspensión o solución acuosa estéril del conjugado. En algunas realizaciones, las composiciones para administración enteral pueden contener una cantidad eficaz del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento en suspensión o solución acuosa que opcionalmente pueden incluir tampones, tensioactivos, agentes tixotrópicos y aromatizantes.
C. Pauta posológica y fotoinmunoterapia
La PIT incluye la administración de una composición que contiene el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) seguida de irradiación. En algunas realizaciones, el método incluye irradiar el tumor.
En algunas realizaciones, después de que las células se pongan en contacto con el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, las células se irradian. Los métodos de irradiación se conocen en la materia. Como solo las células que expresan la proteína de la superficie celular serán normalmente reconocidas por la molécula de direccionamiento, generalmente, solo esas células tendrán cantidades suficientes del conjugado unido a ellas. Esto puede disminuir la probabilidad de efectos secundarios no deseados, tales como la destrucción de células normales, ya que la irradiación solo puede destruir las células a las que está unido el conjugado, y generalmente no otras células.
En algunas realizaciones, se irradia una célula in vivo, por ejemplo, irradiando a un sujeto al que se le ha administrado previamente el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el sujeto se irradia, por ejemplo, se puede irradiar un tumor en el sujeto.
En algunas realizaciones, la irradiación se efectúa después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, la irradiación o iluminación se realiza o se efectúa entre o entre aproximadamente 30 minutos y 96 horas después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo), tal como entre 30 minutos y 48 horas, 30 minutos y 24 horas o 12 horas y 48 horas, tal como generalmente al menos 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas o más después de la administración del conjugado. Por ejemplo, la irradiación se puede realizar en aproximadamente 24 horas después de la administración del conjugado. En algunas realizaciones, más de 6 horas antes de irradiar o iluminar el tumor, al sujeto se le ha administrado el conjugado que comprende la molécula de direccionamiento, en donde el conjugado se asocia con el tumor. En algunas realizaciones, el conjugado se ha administrado previamente al sujeto durante más de o más de aproximadamente 12 horas, 24 horas, 26 horas, 48 horas, 72 horas o 96 horas antes de irradiar o iluminar el tumor.
En algunas realizaciones, en el momento de o después de la irradiación, el sujeto puede recibir una o más terapias diferentes (por ejemplo, agente inmunomodulador o agente anticanceroso) como se describe en el presente documento. En algunos casos, por tanto, la una o más terapias diferentes también se administran después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo). En algunas realizaciones, la terapia adicional se administra dentro o dentro de aproximadamente 0 a 24 horas de la irradiación, tal como dentro de o dentro de aproximadamente 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas o 24 horas de la irradiación.
En algunas realizaciones, antes de la irradiación, el sujeto puede recibir una o más de terapias diferentes como se describe en el presente documento. En algunos casos, la una o más de las terapias diferentes se pueden administrar antes de, durante o después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo), y generalmente antes de la irradiación del sujeto. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional (por ejemplo, agente inmunomodulador o agente anticanceroso) puede administrarse durante o simultáneamente con la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional (por ejemplo, agente inmunomodulador o agente anticanceroso) puede administrarse después de o posteriormente a la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el conjugado se administra antes de la una o más terapias diferentes y el conjugado y una o más terapias diferentes se administran antes de irradiar el tumor. En algunas realizaciones, el conjugado se administra después de la una o más terapias diferentes y el conjugado y una o más terapias diferentes se administran cada uno antes de irradiar el tumor. En algunas realizaciones, la irradiación se realiza después de la administración del agente terapéutico adicional (por ejemplo, agente inmunomodulador o agente anticanceroso) y el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento.
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador y el agente inmunomodulador se administra de 6 horas a 4 semanas antes de la irradiación, tal como generalmente más de o más de aproximadamente 12 horas, 24 horas, 36 horas, 72 horas, 96 horas, una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas antes de la irradiación. En algunas realizaciones, el colorante de ftalocianina-molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) se administra de 6 a 96 horas antes de la irradiación, tal como generalmente dentro o dentro de aproximadamente o aproximadamente 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 72 horas o 96 horas antes de la irradiación.
En algunas realizaciones, antes de la irradiación, el sujeto puede recibir un agente inmunomodulador, tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador generalmente se administra antes de la irradiación del sujeto. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se administra entre o entre aproximadamente 12 horas y 2 meses antes de efectuar la irradiación, tal como entre 12 horas y 1 mes, 12 horas y 3 semanas, 12 horas y 2 semanas, 12 horas y 1 semana, y 1 semana y 1 mes, tal como generalmente al menos 12 horas, 24 horas, 48 horas, 96 horas, una semana, dos semanas, tres semanas o un mes antes de irradiar el tumor. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se puede administrar antes de, posterior a o simultáneamente con el conjugado, siempre que tanto el agente inmunomodulador como el conjugado se administren antes de la irradiación. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador puede administrarse antes de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo). En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador puede administrarse durante o simultáneamente con la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador puede administrarse posteriormente a o después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. Por ejemplo, el agente inmunomodulador posterior a la irradiación tres veces por semana, dos veces a la semana, una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes.
Por ejemplo, en algunos casos, el conjugado se administra al menos 12 horas, tal como desde o desde aproximadamente 12 horas a 48 horas, antes de la irradiación y el agente inmunomodulador se administra al menos 12 horas, tal como desde o desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 1 mes, antes de la irradiación. En algunas realizaciones, el conjugado se administra no más de o no más de aproximadamente 36 horas, 24 horas, 18 horas o 12 horas antes de la irradiación y el agente inmunomodulador se administra más de 12 horas antes de la irradiación, tal como generalmente más de 24 horas, 48 horas, 96 horas, una semana, dos semanas, tres semanas o un mes antes de la irradiación.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es en sí mismo un conjugado que contiene un colorante de ftalocianina, tal como un colorante de ftalocianina unido a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que es un agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un conjugado de IR700 y anticuerpo que incluye un anticuerpo inmunomodulador (por ejemplo, inhibidor de puntos de control) que se une a una proteína de puntos de control en una célula tumoral (por ejemplo, PD-L1). En algunas realizaciones, el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) se administra antes de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, tal como entre 12 horas y 2 meses, tal como generalmente al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 96 horas, al menos una semana, al menos de dos semanas, al menos tres semanas o al menos un mes antes de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, el conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) se administra durante o simultáneamente con la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) se administra después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, tal como entre 12 horas y 2 meses, tal como generalmente al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 96 horas, al menos una semana, al menos de dos semanas, al menos tres semanas o al menos un mes después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento.
En algunas realizaciones, la irradiación se realiza o se efectúa después de la administración del conjugado inmunomodulador (por ejemplo, conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) y del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, la irradiación se efectúa después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento.
En algunas realizaciones, el método de terapia de combinación incluye dos irradiaciones o iluminaciones. En algunas realizaciones, el método de terapia de combinación implica una primera irradiación del tumor después de administrar el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) y una segunda irradiación del tumor después de administrar el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, cada irradiación se realiza dentro de las 6 a 48 horas posteriores a la administración del conjugado correspondiente, tal como generalmente al menos aproximadamente 6 horas, 12 horas, 24 horas o 36 horas después de la administración de cada conjugado.
En algunas realizaciones, el método de terapia de combinación que comprende el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) y el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento solo incluye una única irradiación. En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se administra al menos 12 horas después de administrar el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) y dentro de las 6 a 48 horas antes de irradiar el tumor.
En algunas realizaciones, el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, el conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) y el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se administran por la misma vía de administración. En algunas realizaciones, tanto el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, el conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) como el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se administran sistémicamente. En otras realizaciones, ambos conjugados se administran por vía intravenosa.
En algunas realizaciones, antes de la irradiación, el sujeto puede recibir un agente anticanceroso. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso generalmente se administra antes de la irradiación del sujeto. En algunas realizaciones, la irradiación se realiza o se efectúa entre o entre aproximadamente 5 minutos y 2 semanas después de administrar el agente anticanceroso, tal como entre 5 minutos y 1 semana, 5 minutos y 3 días, 5 minutos y 48 horas, 5 minutos y 24 horas, 5 minutos y 12 horas, 5 minutos y 6 horas o 5 minutos y 1 hora, tal como generalmente al menos aproximadamente 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas o 24 horas antes de irradiar el tumor. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso se puede administrar antes de, posterior a o simultáneamente con el conjugado, siempre que tanto el agente anticanceroso como el conjugado se administren antes de la irradiación. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso puede administrarse antes de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso puede administrarse durante o simultáneamente con la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso puede ser después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento.
Por ejemplo, en algunos casos, el conjugado se administra al menos 12 horas, tal como desde o desde aproximadamente 12 horas a 48 horas, antes de la irradiación y el agente anticanceroso se administra al menos 5 minutos, tal como desde o desde aproximadamente 5 minutos a 24 horas, antes de la irradiación. En algunas realizaciones, el conjugado se administra no más de o no más de aproximadamente 36 horas, 24 horas, 18 horas o 12 horas antes de la irradiación y el agente anticanceroso se administra más de 5 minutos antes de la irradiación y generalmente no más de 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas o 24 horas antes de la irradiación.
En la invención reivindicada, el programa de dosificación comprende después de administrar el conjugado, irradiar el lesión a una longitud de onda de 600 nm a 850 nm a una dosis de 5 J cm-2 a 200 Jcm -2 o de 20 J/cm de longitud de fibra hasta 500 J/cm de longitud de fibra. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las células, tal como un tumor, se irradian con una dosis terapéutica de radiación en una longitud de onda dentro de un intervalo de aproximadamente 400 nm a aproximadamente 900 nm, tal como de o de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 900 nm, tal como de o de aproximadamente 600 nm a aproximadamente 850 nm, tal como de o de aproximadamente 600 nm a aproximadamente 740 nm, tal como de aproximadamente 660 nm a aproximadamente 740 nm, de aproximadamente 660 nm a aproximadamente 710 nm, de aproximadamente 660 nm a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 670 nm a aproximadamente 690 nm, de aproximadamente 680 nm a aproximadamente 740 nm o de aproximadamente 690 nm a aproximadamente 710 nm. En algunas realizaciones, las células, tal como un tumor, se irradian con una dosis terapéutica de radiación a una longitud de onda de 600 nm a 850 nm, tal como de 660 nm a 740 nm. En algunas realizaciones, las células, tal como un tumor, se irradia a una longitud de onda de al menos o aproximadamente al menos 600 nm, 620 nm, 640 nm, 660 nm, 680 nm, 700 nm, 720 nm o 740 nm, tal como 690 ± 50 nm, por ejemplo, aproximadamente 680 nm.
En algunas realizaciones, las células, tal como un tumor, se irradian a una dosis de al menos 1 J cm-2, tal como al menos 10 J cm-2, al menos 30 J cm-2, al menos 50 J cm-2, al menos 100 J cm-2 o al menos 500 J cm-2. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación es de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 J cm-2, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 J cm-2, de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 J cm-2, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 J cm-2 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 J cm-2. En algunas realizaciones, las células, tal como un tumor, se irradian a una dosis de al menos o al menos aproximadamente 2 J cm-2, 5 J cm-2, 10 J cm-2, 25 J cm-2, 50 J cm-2, 75 J cm-2, 100 J cm-2, 150 J cm-2, 200 J cm-2, 300 J cm-2, 400 J cm-2 o 500 J cm-2.
En algunas realizaciones, las células, tal como un tumor, se irradian o iluminan a una dosis de al menos 1 J/cm de longitud de fibra, tal como al menos 10 J/cm de longitud de fibra, al menos 50 J/cm de longitud de fibra, al menos 100 J/cm de longitud de fibra, al menos 250 J/cm de longitud de fibra o al menos 500 J/cm de longitud de fibra. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación es de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 J/cm de longitud de fibra, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 J/cm de longitud de fibra, de aproximadamente 2 a aproximadamente 500 J/cm de longitud de fibra, de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 J/cm de longitud de fibra, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 J/cm de longitud de fibra, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 J/cm de longitud de fibra. En algunas realizaciones, las células, tal como un tumor, se irradian a una dosis de al menos o al menos aproximadamente 2 J/cm de longitud de fibra, 5 J/cm de longitud de fibra, 10 J/cm de longitud de fibra, 25 J/cm de longitud de fibra, 50 J/cm de longitud de fibra, 75 J/cm de longitud de fibra, 100 J/cm de longitud de fibra, 150 J/cm de longitud de fibra, 200 J/cm de longitud de fibra, 250 J/cm de longitud de fibra, 300 J/cm de longitud de fibra, 400 J/cm de longitud de fibra o 500 J/cm de longitud de fibra.
En algunas realizaciones, la dosis de irradiación o iluminación en un sujeto humano es de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 400 J cm-2, de aproximadamente 2 a aproximadamente 400 J cm-2, de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 J cm-2, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 J cm-2 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 J cm-2, de aproximadamente tal como es al menos o al menos aproximadamente o es o dentro o dentro de aproximadamente o es o es aproximadamente 10 J cm-2, al menos 30 J cm-2, al menos 50 J cm-2, al menos 100 J cm-2. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación en un sujeto humano es de o de aproximadamente 1 a 300 J/cm de longitud de fibra, 10 a 100 J/cm de longitud de fibra o de 10 a 50 J/cm de longitud de fibra, tal como es al menos o al menos aproximadamente o está o dentro de o dentro de aproximadamente o es o es aproximadamente 10 J/cm de longitud de fibra, al menos 30 J/cm de longitud de fibra, al menos 50 J/cm de longitud de fibra, al menos 100 J/cm de longitud de fibra. En algunos casos, se observa que una dosis de irradiación en un sujeto humano para lograr PIT puede ser menor que la necesaria para PIT en un ratón. Por ejemplo, en algunos casos, 50 J/cm2 (50 J cm-2) de dosimetría de luz en un modelo de tumor en ratones in vivo no es eficaz para PIT, lo cual contrasta con lo que se puede observar en la clínica con pacientes humanos.
En algunas realizaciones, la dosis de irradiación después de la administración de la composición que comprende el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento es al menos 1 J cm-2 o 1 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 660-740 nm, por ejemplo, al menos 10 J cm-2 o 10 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 660-740 nm, al menos 50 J cm-2 o 50 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 660­ 740 nm, o al menos 100 J cm-2 o 100 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 660-740 nm, por ejemplo, de 1,0 a 500 J cm-2 o de 1,0 a 500 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 660-740 nm. En algunas realizaciones, la longitud de onda es de 660 a 710 nm. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación después de la administración de la composición que comprende el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento es al menos 1,0 J cm-2 o 1 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 680 nm, por ejemplo, al menos 10 J cm-2 o 10 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 680 nm, al menos 50 J cm-2 o 50 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 680 nm, o al menos 100 J cm-2 o 100 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 680 nm, por ejemplo, de 1,0 a 500 J cm-2 o de 1,0 a 500 J/cm de longitud de fibra a una longitud de onda de 680 nm. En algunas realizaciones, se realizan múltiples irradiaciones, tal como al menos 2, al menos 3 o al menos 4 irradiaciones, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 administraciones separadas. La irradiación ilustrativa después de la administración de los conjugados o composiciones descritos en el presente documento incluye irradiar el tumor a una longitud de onda de 660 nm a 740 nm a una dosis de al menos 1 J cm-2 o 1 J/cm de longitud de fibra.
En algunas realizaciones, se puede aplicar una luz o láser a las moléculas de colorante, tales como las células que contienen el conjugado, durante aproximadamente de 5 segundos a aproximadamente 5 minutos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la luz o el láser se aplica durante aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 55 segundos, o dentro de un intervalo entre cualquiera de dos de dichos valores, para activar las moléculas de colorante. En algunas realizaciones, la luz o el láser se aplica durante o durante aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 o 5 minutos, o más, o dentro de un intervalo entre dos cualesquiera de dichos valores. En algunas realizaciones, el tiempo que se aplica una luz o un láser puede variar dependiendo de, por ejemplo, la energía, tal como el vataje, de la luz o láser. Por ejemplo, se pueden aplicar luces o láseres con un vataje inferior durante un período de tiempo más largo para activar la molécula de colorante.
En algunas realizaciones, se puede aplicar una luz o un láser aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas después de la administración del conjugado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la luz o el láser se aplica a los o aproximadamente a los 30, 35, 40, 45, 50 o 55 minutos después de la administración del conjugado, o dentro de un intervalo entre dos cualesquiera de dichos valores. En algunas realizaciones, la luz o el láser se aplica a las o aproximadamente a las 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas después de la administración del conjugado, o se administra dentro de un intervalo entre o entre aproximadamente dos cualesquiera de dichos valores. En algunas realizaciones, la luz o el láser se aplica durante entre o entre aproximadamente 1 y 24 horas, tal como entre o entre aproximadamente 1 y 12 horas, 12 y 24 horas, 6 y 12 horas o puede administrarse más de 24 después de la administración del conjugado. En algunas realizaciones, la luz o el láser se aplica 36 o 48 horas después de la administración del conjugado.
En algunas realizaciones, las células o sujetos, se pueden irradiar una o más veces. Por tanto, la irradiación se puede completar en un solo día, o se puede hacer de manera repetida en varios días con la misma dosis o con una diferente, tal como irradiar al menos 2 veces diferentes, 3 veces diferentes, 4 veces diferentes, 5 veces diferentes o 10 veces diferentes. En algunas realizaciones, las irradiaciones repetidas pueden realizarse el mismo día, en días sucesivos o cada 1 a 3 días, cada 3 a 7 días, cada 1 a 2 semanas, cada 2 a 4 semanas, cada 1 a 2 meses o incluso a intervalos más prolongados.
En algunas realizaciones, la dosis o el método de irradiación difiere según el tipo o la morfología del tumor.
En algunas realizaciones, la lesión es un tumor que es un tumor superficial. En algunas realizaciones, el tumor tiene menos de 10 mm de espesor. En algunas realizaciones, la irradiación se realiza utilizando una fibra con punta de microlente para la iluminación de la superficie. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación de luz es de aproximadamente 5 J/cm2 a aproximadamente 200 J/cm2
En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen iluminar un tumor superficial en un sujeto con una fibra con punta de microlente para la iluminación de la superficie con una dosis de luz de o de aproximadamente 5 J/cm2 a aproximadamente 200 J/cm2, en donde el tumor está asociado con un agente fototóxico que incluye una molécula de direccionamiento unida a una molécula de la superficie celular del tumor. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación de luz es o es aproximadamente 50 J/cm2.
En algunas realizaciones, la lesión es un tumor que es un tumor intersticial. En algunas realizaciones, el tumor mide más de 10 mm de profundidad o es un tumor subcutáneo. En algunas realizaciones, la irradiación se realiza utilizando fibras difusoras cilíndricas que incluyen una longitud de difusor de 0,5 cm a 10 cm y separadas 1,8 ± 0,2 cm. En algunas realizaciones, la dosis de irradiación de luz es de o de aproximadamente 20 J/cm de longitud de fibra a aproximadamente 500 J/cm de longitud de fibra.
En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen iluminar un tumor intersticial en un sujeto con fibras difusoras cilíndricas que incluyen una longitud de difusor de 0,5 cm a 10 cm y separadas 1,8 ± 0,2 cm con una dosis de luz de o aproximadamente 100 J/cm de longitud de fibra o con una tasa de fluencia de o aproximadamente 400 mW/cm, en donde el tumor está asociado con un agente fototóxico que incluye una molécula de direccionamiento unida a una molécula de la superficie celular del tumor. En algunas realizaciones, el tumor mide más de 10 mm de profundidad o es un tumor subcutáneo. En algunas realizaciones, las fibras difusoras cilíndricas se colocan en un catéter ubicado en el tumor con una separación de 1,8 ± 0,2 cm. En algunas realizaciones, el catéter es ópticamente transparente.
En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen la irradiación a una o más longitudes de onda. En algunos ejemplos, después de administrar el conjugado, la lesión o tumor se irradia a una o más longitudes de onda para inducir la actividad fototóxica del primer colorante del conjugado y una señal fluorescente del segundo colorante del conjugado. Por ejemplo, en métodos que emplean un primer y un segundo colorante conjugados con una molécula de direccionamiento que tienen diferentes longitudes de onda de excitación, se pueden utilizar dos longitudes de onda diferentes para la irradiación. En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen irradiar la lesión con una sola longitud de onda. En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen irradiar la lesión a dos longitudes de onda diferentes, simultánea o secuencialmente, en donde una longitud de onda induce la actividad fototóxica y la otra longitud de onda induce la señal fluorescente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen irradiar la lesión a una o más longitudes de onda que son de o de aproximadamente 400 a aproximadamente 900 nm a una dosis de al menos 1 J cm- 2o 1 J/cm de longitud de fibra.
D. Agentes terapéuticos adicionales y terapia de combinación
En algunas realizaciones, otro agente terapéutico, tal como un agente inmunomodulador o un agente anticanceroso se administra junto con un agente de fotoinmunoterapia, tal como un conjugado de colorante de ftalocianina, por ejemplo, un conjugado de IR700 y anticuerpo. En algunas realizaciones, la terapia de combinación puede incluir la administración de un conjugado de colorante de ftalocianina, por ejemplo, un conjugado de IR700 y anticuerpo, en combinación con un agente anticanceroso o un agente inmunomodulador como se describe en la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 62/206.776.
En algunas realizaciones, el otro agente o agentes adicionales pueden administrarse en un tiempo suficiente antes de realizar la irradiación de manera que aumente el efecto terapéutico en el tratamiento del tumor. En algunas realizaciones, antes de la irradiación en el método de fotoinmunoterapia, se administran al sujeto uno o más agentes terapéuticos diferentes, tal como un agente inmunomodulador (por ejemplo, un inhibidor de puntos de control inmunitario) o un agente anticanceroso (por ejemplo, un antimetabolito). En una realización, un agente inmunomodulador se puede administrar un tiempo suficiente antes de la irradiación, tal como generalmente al menos 12 horas antes de la irradiación, para hacer que el sistema inmunitario responda a los agentes asociados a tumores liberados tras la lisis de las células tumorales después de la fotoinmunoterapia. En otra realización, se puede administrar un agente anticanceroso un tiempo suficiente antes de la irradiación, tal como generalmente al menos 5 minutos antes de la irradiación, para lograr la disponibilidad sistémica del agente anticanceroso de manera que pueda suministrarse inmediatamente en el tumor tras los cambios en la permeabilidad vascular después de la fotoinmunoterapia.
El uno o más agentes diferentes, tal como un agente inmunomodulador o un agente anticanceroso, se pueden administrar antes de, de manera simultánea con, posteriormente a o de forma intermitente con el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, la activación del fotosensibilizador de colorante de ftalocianina del conjugado por irradiación con luz no se efectúa hasta un tiempo después de la administración del otro agente terapéutico, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la activación del fotosensibilizador de colorante de ftalocianina del conjugado por irradiación con luz se realiza antes de la administración del otro agente terapéutico, tal como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el efecto combinado de la fotoinmunoterapia en combinación con el uno o más agentes diferentes puede ser sinérgico en comparación con los tratamientos que implican solamente fotoinmunoterapia con el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento o monoterapia con el otro agente terapéutico. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento dan como resultado un aumento o una mejora en un efecto terapéutico antitumoral deseado, tal como un aumento o una mejora en la reducción o inhibición de uno o más síntomas asociados con cáncer, que la fotoinmunoterapia o la monoterapia solas.
Los tratamientos con un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, y, opcionalmente, un agente anticancerosos o un agente inmunomodulador terapéutico adicional, se pueden completar en un solo día, 0 se pueden realizar de manera repetida en varios días con la misma dosis o con una diferente. Los tratamientos repetidos se pueden realizar el mismo día, en días sucesivos o cada 1 a 3 días, cada 3 a 7 días, cada 1 a 2 semanas, cada 2 a 4 semanas, cada 1 a 2 meses o incluso a intervalos más prolongados.
En algunas realizaciones, la terapia de combinación incluye administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente inmunomodulador, tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario. El agente inmunomodulador se administra en una cantidad que es de o de aproximadamente 0,01 mg a 1000 mg, tal como una dosis de al menos 0,01 mg, 0,1 mg, 1 mg, 10 mg, 1000 mg, 2000 mg, 3000 mg o más. En una realización ilustrativa, un agente inmunomodulador, tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario, puede administrarse a aproximadamente de 0,3 mg/kg a 10 mg/kg, o la dosis máxima tolerada, tales como al menos 0,5 mg/kg, o al menos 1 mg/kg, o al menos 2 mg/kg, o al menos 3 mg/kg, o al menos 5 mg/kg, o al menos 8 mg/kg. En algunos casos, la dosis puede administrarse como una sola dosis o en una pluralidad de dosis. Como alternativa, el agente inmunomodulador tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario puede administrarse mediante una pauta posológica creciente que incluye la administración de una primera dosis de aproximadamente 3 mg/kg, una segunda dosis de aproximadamente 5 mg/kg y una tercera dosis de aproximadamente 9 mg/kg. Como alternativa, la pauta posológica creciente incluye la administración de una primera dosis de agente inmunomodulador de aproximadamente 5 mg/kg y una segunda dosis de aproximadamente 9 mg/kg. Otro régimen de dosificación creciente gradual puede incluir la administración de una primera dosis de agente inmunomodulador de aproximadamente 3 mg/kg, una segunda dosis de aproximadamente 3 mg/kg, una tercera dosis de aproximadamente 5 mg/kg, una cuarta dosis de aproximadamente 5 mg/kg y una quinta dosis de aproximadamente 9 mg/kg. En otro aspecto, una pauta posológica creciente gradual puede incluir la administración de una primera dosis de 5 mg/kg, una segunda dosis de 5 mg/kg y una tercera dosis de 9 mg/kg. En algunas realizaciones, se pueden administrar dosis particulares dos veces por semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes o más. En algunos casos, las dosis se pueden administrar en el curso de un ciclo que puede repetirse, tal como repetirse durante un mes, dos meses, tres meses, seis meses, 1 año o más.
En algunas realizaciones, la terapia de combinación incluye administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente anticanceroso, tal como cualquiera descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz puede ser de aproximadamente 0,01 mg a 1000 mg, tal como una dosis de al menos 0,01 mg, 0,1 mg, 1 mg, 10 mg, 1000 mg, 2000 mg, 3000 mg o más. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz del agente anticanceroso es de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, tales como de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg o de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg.
En algunas realizaciones, la dosis del agente inmunomodulador (por ejemplo, inhibidor de puntos de control inmunitario) o agente anticanceroso se continúa o se repite según su programa de dosificación clínica después del tratamiento con PIT. Por tanto, en algunas realizaciones, en un programa de dosis o ciclo de administración según los métodos descritos, el conjugado de colorante de ftalocianina (por ejemplo, conjugado de IR700 y anticuerpo) solamente se puede administrar una vez, tal como en una sola dosis o infusión, para la PIT, mientras que la administración del agente inmunomodulador se continúa o se repite más de una vez, tal como tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes durante un programa de dosificación o ciclo de administración. En algunas realizaciones, el programa de dosificación o ciclo de administración es o es de aproximadamente 28 días o 4 semanas.
En algunas realizaciones, el otro agente o agentes adicionales administrados, o el agente adicional en una terapia de combinación, es una molécula de direccionamiento no conjugada. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento no conjugada es la misma o sustancialmente la misma molécula de direccionamiento que la molécula de direccionamiento del conjugado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, antes de la administración del conjugado, la molécula de direccionamiento, por ejemplo, un anticuerpo no conjugado que se dirige a una proteína o antígeno, se administra al sujeto. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se administra hasta 96 horas antes de la administración del conjugado. En algunas realizaciones, la molécula de direccionamiento se administra en una dosis dentro de un intervalo de o de aproximadamente 10 mg/m2 a 500 mg/m2. Por ejemplo, la molécula direccionamiento es cetuximab, y el cetuximab se administra al sujeto hasta 96 horas antes de la administración del conjugado.
1. Agentes inmunomoduladores
La presente divulgación proporciona agentes inmunomoduladores que pueden administrarse en combinación con métodos de PIT que emplean conjugados de colorantes de ftalocianina. Por lo tanto, la terapia de combinación descrita en el presente documento, incluyendo combinaciones y métodos de uso de la misma, incluye un agente inmunomodulador. En algunos aspectos, unos agentes moduladores inmunitarios o inmunomoduladores, son sustancias que, o bien, de manera directa o indirecta, suprimen o activan la respuesta inmune del organismo. Por ejemplo, los agentes inmunomoduladores que estimulan la respuesta inmunitaria frente a tumores y/o patógenos pueden utilizarse en combinación con fotoinmunoterapia. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador puede incluir agentes inmunomoduladores basados en células (por ejemplo, tratamiento de combinación con células inmunitarias tales como células dendríticas o linfocitos T) o agentes inmunomoduladores no basados en células.
En general, las células cancerosas contienen antígenos específicos de tumores que son reconocidos por el sistema inmunitario. Normalmente, en un sistema inmunitario activo, las células inmunitarias, tales como los linfocitos T citotóxicos, atacan y eliminan estas células cancerosas. En condiciones fisiológicas normales, la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T se inicia mediante el reconocimiento de antígenos por el receptor de linfocitos T (TCR, del inglés "T cell receptor") y se regula mediante un equilibrio de señales estimuladoras e inhibidoras juntas (por ejemplo, proteínas de puntos de control inmunitario). En particular, los linfocitos T CD4+ y CD8+ que expresan un TCR pueden activarse tras el reconocimiento de péptidos antigénicos presentados en células presentadoras de antígenos en moléculas de clase I o clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, del inglés "major histocompatibility complex"), respectivamente. En algunos aspectos, las células CD8+ activadas o linfocitos T citotóxicos, puede destruir las células tumorales que expresan el antígeno, que puede ser ayudado por la presencia de linfocitos T CD4+. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria es una célula presentadora de antígenos. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria es una célula dendrítica.
En el caso de los tumores, sin embargo, el microambiente tumoral tiene mecanismos para inhibir el sistema inmunitario, evadiendo así el reconocimiento inmunitario y evitando o reduciendo la destrucción de las células tumorales. Por ejemplo, en algunos casos, las proteínas de punto de control inmunitario se pueden desregular en los tumores, lo que da como resultado una supresión de la respuesta inmunitaria en el microambiente del tumor como un mecanismo para evadir el sistema inmunitario. En algunos casos, otros mecanismos pueden actuar para inhibir el acceso de las células inmunitarias a los antígenos tumorales, contribuyendo también así a la capacidad de los tumores para evadir el sistema inmunitario. Las terapias de combinación descritas en el presente documento abordan estos dos mecanismos de evasión, para proporcionar una respuesta inmunitaria más fuerte contra el tumor y, al mismo tiempo, destruir las células tumorales mediante mecanismos fotolíticos.
En algunas realizaciones de los métodos de terapia de combinación descritos en el presente documento, se administra un agente inmunomodulador a un sujeto para inhibir la señalización inmunosupresora o potenciar la señalización inmunoestimulante. Por ejemplo, los antagonistas y/o agonistas de proteínas de puntos de control inhibidores de los receptores coestimuladores pueden estimular la respuesta inmunitaria antitumoral endógena de un hospedador amplificando las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno. En aspectos de los métodos descritos, también se puede realizar fotoinmunoterapia, que puede dar como resultado la destrucción de células tumorales, liberando así antígenos tumorales. Al realizar fotoinmunoterapia en combinación con la administración de un agente inmunomodulador, la posterior liberación de antígenos inducidos por PIT puede proporcionar una fuente de estímulos antigénicos para los linfocitos T cuya respuesta se ha amplificado o estimulado por el agente inmunomodulador. Por tanto, en algunos aspectos, la respuesta inmunitaria potenciada que se genera tras la terapia con un agente inmunomodulador está preparada y lista para responder a los antígenos tumorales que quedan expuestos tras la lisis de las células después de la PIT. Por tanto, en algunos aspectos, las terapias de combinación descritas en el presente documento abordan los mecanismos de evasión naturales que pueden estar presentes en un microambiente tumoral, para proporcionar una respuesta inmunitaria más fuerte contra el tumor y, al mismo tiempo, destruir las células tumorales mediante mecanismos fotolíticos.
En general, en los métodos descritos, la destrucción de células mediada por PIT mediante irradiación y activación de un conjugado de colorante de ftalocianina administrado se realiza en un momento después de que la respuesta inmunitaria se haya estimulado o potenciado tras la administración de un agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se administra un tiempo suficiente antes de la irradiación de un conjugado de colorante de ftalocianina administrado de manera que la amplificación de la respuesta de los linfocitos T se haya producido antes de la lisis celular inducida por PIT. Por lo tanto, en general, el agente inmunomodulador se administra un tiempo suficiente antes de la irradiación para que sea terapéuticamente eficaz para amplificar una respuesta de linfocitos T, tal como administrado al menos 12 horas, tal como generalmente al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 96 horas, al menos una semana, al menos de dos semanas, al menos tres semanas o al menos un mes antes de realizar la irradiación para inducir la destrucción celular mediada por PIT a través de la activación de un conjugado de colorante de ftalocianina administrado (por ejemplo, conjugado de IR700 y molécula de direccionamiento, tal como un conjugado de colorante IR700 y anticuerpo).
En algunas realizaciones, el conjugado se administra antes de, simultáneamente o posteriormente a la administración del agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el conjugado se administra después de administrar el agente inmunomodulador, pero antes de irradiar el tumor. En algunas realizaciones, el conjugado se administra desde o desde aproximadamente 12 horas hasta 48 horas antes de irradiar el tumor y el agente inmunomodulador se administra desde o desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 1 mes antes de irradiar el tumor. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se administra más de o más de aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 96 horas, una semana, dos semanas, tres semanas o un mes antes de irradiar el tumor.
En algunas realizaciones, la irradiación del tumor se realiza i) después de la administración del agente inmunomodulador y después de la administración del conjugado o ii) solamente después de la administración del conjugado.
Se describen en otra parte del presente documento pautas posológicas y programas de dosificación ilustrativos para administrar un agente inmunomodulador, conjugado de colorante de ftalocianina (por ejemplo, conjugado de IR700 y molécula de direccionamiento, tal como un conjugado de colorante IR700 y anticuerpo) y para realizar la irradiación. En algunas realizaciones, los métodos de terapia combinación se pueden realizar con cualquier agente inmunomodulador que pueda estimular, amplificar y/o potenciar de otro modo una respuesta inmunitaria antitumoral, tal como inhibiendo la señalización inmunosupresora o potenciando la señalización inmunoestimulante. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un péptido, proteína o es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, la proteína puede ser una proteína de fusión o una proteína recombinante. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se une a una diana inmunitaria, tal como un receptor de superficie celular expresado en células inmunitarias, tales como linfocitos T, linfocitos B o células presentadoras de antígeno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, una proteína de fusión, una molécula pequeña o un polipéptido.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador inhibe una vía de puntos de control inmunitario. El sistema inmunitario tiene múltiples vías inhibidoras que están implicadas en el mantenimiento de la autotolerancia y en la modulación de las respuestas inmunitarias. Se sabe que los tumores pueden utilizar determinadas vías de puntos de control inmunitario como mecanismo principal de resistencia inmunitaria, particularmente contra los linfocitos T que son específicos para antígenos tumorales (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). Debido a que muchos de estos puntos de control inmunitario se inician por interacciones ligando-receptor, pueden bloquearse fácilmente mediante anticuerpos contra los ligandos y/o sus receptores.
Por lo tanto, la terapia con moléculas antagonistas que bloquean una vía de puntos de control inmunitario, tal como moléculas pequeñas, inhibidores de ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNi) o moléculas de anticuerpos, se están convirtiendo en vías prometedoras de inmunoterapia para el cáncer y otras enfermedades. A diferencia de la mayoría de los agentes anticancerosos, los inhibidores de puntos de control no necesariamente se dirigen directamente a las células tumorales, sino que se dirigen a los receptores de linfocitos o sus ligandos para potenciar la actividad antitumoral endógena del sistema inmunitario. (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). Como se utiliza en el presente documento, la expresión "inhibidor de puntos de control inmunitario" se refiere a moléculas que reducen, inhiben, interfieren o modulan total o parcialmente una o más proteínas de puntos de control. Las proteínas de puntos de control regulan la activación o función de los linfocitos T. Estas proteínas son responsables de las interacciones inhibidoras o coestimuladoras de las respuestas de los linfocitos T. Las proteínas de puntos de control inmunitario regulan y mantienen la autotolerancia y la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas.
Los inhibidores de puntos de control inmunitario incluyen cualquier agente que bloquee o inhiba de manera estadísticamente significativa, las vías inhibidoras del sistema inmunitario. Dichos inhibidores pueden incluir inhibidores de molécula pequeña o pueden incluir anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a y bloquean o inhiben los ligandos de receptores de puntos de control inmunitario. Las moléculas de puntos de control inmunitario ilustrativas que se pueden dirigir para el bloqueo o la inhibición incluyen, pero sin limitación, PD1 (CD279), PDL1 (CD274, B7-H1), PDL2 (CD273, B7-DC), CTLA-4, LAG3 (CD223), TIM3, 4-1BB (CD137), 4-1BBL (CD137L), GITR (TNFRSF18, AITR), CD40, Ox40 (CD134, TNFRSF4), CXCR2, antígenos asociados a tumores (TAA), B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4 (pertenece a la familia de moléculas de CD2 y se expresa en todas las células NK, y§, y linfocitos T CD8+ (ap) de memoria), CD160 (también denominado BY55) y CGEN-15049. Los inhibidores de puntos de control inmunitario incluyen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, u otras proteínas de unión, que se unen a y bloquean o inhiben la actividad de uno o más de PD1, PDL1, PDL2, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, 4-1BBL, GITR, CD40, Ox40, CXCR2, TAA, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4, CD160 y CGEN-15049. Los inhibidores de puntos de control inmunitario ilustrativos incluyen tremelimumab (anticuerpo bloqueante de CTLA-4), anti-OX40, anticuerpo monoclonal de PD-L1 (anti-B7-H1; MEDI4736), MK-3475 (bloqueador de PD-1), nivolumab (anticuerpo anti-PD1), CT-011 (anticuerpo anti-PD1), anticuerpo monoclonal bY55, AMP224 (anticuerpo anti-PDL1), BMS-936559 (anticuerpo anti-PDL1), MPLDL3280A (anticuerpo anti-PDL1), MSB0010718C (anticuerpo anti-PDL1) y yervoy/ipilimumab (inhibidor de punto de control anti-CTLA-4).
La muerte celular programada 1 (PD1) es una proteína de punto de control inmunitario que se expresa en los linfocitos B, células NK y linfocitos T (Shinohara et al., 1995, Genomics 23:704-6; Blank et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56:739-45; Finger et al., 1997, Gene 197:177-87; Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). El papel principal de PD1 es limitar la actividad de los linfocitos T en los tejidos periféricos durante la inflamación en respuesta a la infección, así como para limitar la autoinmunidad (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). La expresión de PD1 se induce en los linfocitos T activados y la unión de PD1 a uno de sus ligandos endógenos actúa para inhibir la activación de los linfocitos T al inhibir las cinasas estimulantes (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). PD1 también actúa para inhibir la "señal de parada" de TCR (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). PD1 se expresa en gran medida en los linfocitos Treg y puede aumentar su proliferación en presencia de ligando (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). Los anticuerpos anti-PD 1 se han utilizado para el tratamiento de melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama triple negativo, leucemia, linfoma y cáncer de células renales (Topalian et al., 2012, N Engl J Med 366:2443-54; Lipson et al., 2013, Clin Cancer Res 19:462-8; Berger et al., 2008, Clin Cancer Res 14:3044-51; Gildener-Leapman et al., 2013, Oral Oncol 49:1089-96; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5:278-85). Los anticuerpos anti-PD1 ilustrativos incluyen nivolumab (Opdivo de BMS), pembrolizumab (Keytruda de Merck), pidilizumab (CT-011 de Cure Tech), lambrolizumab (MK-3475 de Merck) y AMP-224 (Merck).
PD-L1 (también conocido como CD274 y B7-H1) y PD-L2 (también conocido como CD273 y B7-DC) son ligandos para PD1, que se encuentran en linfocitos T activados, linfocitos B, células mieloides, macrófagos y algunos tipos de células tumorales. Las terapias antitumorales se han centrado en los anticuerpos anti-PD-L1. El complejo de PD1 y PD-L1 inhibe la proliferación de linfocitos T CD8+ y reduce la respuesta inmunitaria (Topalian et al., 2012, N Engl J Med 366:2443-54; Brahmer et al., 2012, N Eng J Med 366:2455-65). Los anticuerpos anti-PD-L1 se han utilizado para el tratamiento del cáncer de pulmón no microcítico, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de células renales, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer de mama y neoplasias hematológicas (Brahmer et al., N Eng J Med 366:2455-65; Ott et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5300-9; Radvanyi et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5541; Menzies & Long, 2013, Ther Adv Med Oncol 5:278-85; Berger et al., 2008, Clin Cancer Res 14:13044-51). Los anticuerpos anti-PD-L1 ilustrativos incluyen MDX-1105 (Medarex), MEDI4736 (Medimmune) MPDL3280A (Genentech), BMS-935559 (Bristol-Myers Squibb) y MSB0010718C.
El antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), también conocido como CD152, es una molécula coinhibidora que funciona para regular la activación de los linfocitos T. CTLA-4 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas que se expresa exclusivamente en los linfocitos T. CTLA-4 actúa para inhibir la activación de los linfocitos T y se informa que inhibe la actividad de los linfocitos T auxiliares y potencia la actividad inmunosupresora de los linfocitos T reguladores (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). Aunque el mecanismo de acción preciso de CTLA-4 continúa en investigación, se ha sugerido que inhibe la activación de los linfocitos T al superar a CD28 en la unión a CD80 y CD86, así como el suministro activa de señales inhibidoras al linfocito T (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). Los anticuerpos anti-CTLA-4 se han utilizado en ensayos clínicos para el tratamiento de melanoma, cáncer de próstata, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico (Robert & Ghiringhelli, 2009, Oncologist 14:848-61; Ott et al., 2013, Clin Cancer Res 19:5300; Weber, 2007, Oncologist 12:864-72; Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89). Una característica importante de anti-CTLA-4 es la cinética del efecto antitumoral, con un período de retraso de hasta 6 meses después del tratamiento inicial requerido para la respuesta fisiológica (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). En algunos casos, los tumores en realidad pueden aumentar de tamaño después del inicio del tratamiento, antes de que se vea una reducción (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12:252-264). Los anticuerpos anti-CTLA-4 ilustrativos incluyen ipilimumab (Bristol-Myers Squibb) y tremelimumab (Pfizer). Ipilimumab recibió recientemente la aprobación de la FDA para el tratamiento de melanoma metastásico (Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89). En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador no es un anticuerpo anti-CTLA-4.
Gen-3 de activación de linfocitos (LAG-3), también conocido como CD223, es otra proteína de punto de control inmunitario. LAG-3 se ha asociado con la inhibición de la actividad de los linfocitos y, en algunos casos, con la inducción de la anergia de los linfocitos. LAG-3 se expresa en varias células del sistema inmunitario, incluidos los linfocitos B, células NK y células dendríticas. LAG-3 es un ligando natural para el receptor MHC de clase II, que se expresa sustancialmente en linfocitos T infiltrantes de melanoma, incluidos aquellos dotados de una potente actividad inmunosupresora. Un anticuerpo anti-LAG-3 ilustrativo es BMS-986016. IMP321 es una versión soluble de la molécula de punto de control inmunitario LAG-3, que activa las células dendríticas, aumentando la presentación de antígenos.
El dominio de inmunoglobulina de linfocitos T y dominio de mucina-3 (TIM-3), identificados inicialmente en linfocitos Th1 activados, ha demostrado ser un regulador negativo de la respuesta inmunitaria. El bloqueo de TIM-3 promueve la inmunidad antitumoral mediada por linfocitos T y tiene actividad antitumoral en una variedad de modelos de tumores en ratones. Las combinaciones de bloqueo de TIM-3 con otros agentes inmunoterapéuticos tales como TSR-042, anticuerpos anti-CD137 y otros, pueden ser aditivas o sinérgicas en el aumento de los efectos antitumorales. La expresión de TIM-3 se ha asociado con varios tipos de tumores diferentes, incluido melanoma, NSCLC y cáncer renal, y además, se ha demostrado que la expresión de TIM-3 intratumoral se correlaciona con un mal pronóstico en una variedad de tipos de tumores, incluido NSCLC, cánceres de cuello uterino y gástricos. El bloqueo de TIM-3 también es de interés para promover una mayor inmunidad frente a una serie de enfermedades víricas crónicas. También se ha demostrado que TIM-3 interactúa con varios ligandos, incluidos galectina-9, fosfatidilserina y HMGB1, aunque noi está claro en la actualidad, cuáles de estos, en caso de haberlos, son relevantes en la regulación de las respuestas antitumorales.
4-1BB, también conocido como CD137, es una glicoproteína transmembrana perteneciente a la superfamilia de TNFR. Los receptores de 4-1BB están presentes en los linfocitos T activados, linfocitos B y monocitos. Un anticuerpo anti-4-1BB ilustrativo es urelumab (BMS-663513), que tiene actividades inmunoestimuladoras y antineoplásicas potenciales.
El gen relacionado con la familia de TNFR inducido por glucocorticoides (GITR, del inglés "Glucocorticoid-induced TNFR family related") también es miembro de la superfamilia TNFR. GITR aumenta en los linfocitos T activados, que potencia el sistema inmunitario. Un anticuerpo anti-GITR ilustrativo es TRX518.
El grupo de diferenciación 40 (CD40) también es miembro de la superfamilia de TNFR. CD40 es una proteína coestimuladora que se encuentra en las células presentadoras de antígenos y media una amplia variedad de respuestas inmunitarias e inflamatorias. CD40 también se expresa en algunas neoplasias malignas, donde promueve la proliferación. Anticuerpos anti-CD40 ilustrativos son dacetuzumab (SGN-40), lucatumumab (Novartis, antagonista), SEA-CD40 (Seattle Genetics), y CP-870.893.
El miembro 4 de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFRSF4, del inglés "Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4"), también conocido como OX40 y CD134, es otro miembro de la superfamilia de TNFR. OX40 no se expresa de forma constitutiva en los linfocitos T vírgenes en reposo y actúa como una molécula de puntos de control inmunitario coestimuladora secundaria. Anticuerpos anti-OX40 ilustrativos son MEDI6469 y MOXR0916 (RG7888, Genentech).
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, daclizumab (Zenapax), bevacuzimab (Avastin®), basiliximab, ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab, MPDL3280A, pidilizumab (CT-011), MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A (Atezolizumab), tremelimumab, IMP321, BMS-986016, LAG525, urelumab, PF-05082566, TRX518, MK-4166, dacetuzumab (SGN-40), lucatumumab (HCD122), SEA-CD40, CP-870, CP-893, MEDI6469, MEDI6383, MOXR0916, AMP-224, MSB0010718C (Avelumab), MEDI4736, PDR001, rHIgM12B7, ulocuplumab, BKT140, varlilumab (CDX-1127), ARGX-110, MGA271, lirilumab (BMS-986015, IPH2101), IPH2201, ARGX-115, emactuzumab, CC-90002 y MNRP1685A o un fragmento de unión a anticuerpo de los mismos.
CXCR2 es un receptor de quimiocinas que se expresa en las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC, del inglés "myeloid-derived supressor cells"). Los CXCR2 contribuyen al escape inmunitario del tumor. Se ha demostrado que la terapia con anticuerpos monoclonales anti-CXCR2, potenció una respuesta inmune antitumoral inducida por anticuerpos anti-PD1 y la eficacia antitumoral.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es una citocina. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es una citocina o es un agente que induce una mayor expresión de una citocina en el microambiente tumoral. Por "citocina" se entiende un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas del crecimiento, tal como la hormona de crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana con N-metionilo y la hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glucoproteicas, tales como la hormona folículo estimulante (FSH, del inglés "follicle stimulating hormone"), hormona estimulante de la tiroides (TSH, del inglés "thyroid stimulating hormone") y hormona luteinizante (LH, del inglés "luteinizing hormone"); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-beta; factor de crecimiento procedente de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF, del inglés "transforming growth factors") tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como el interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF, del inglés "colony stimulating factors"), tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL, del inglés "kit ligand"). Como se utiliza en el presente documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural. Por ejemplo, el agente inmunomodulador es una citocina y la citocina es IL-4, TNF-a, GM-CSF o IL-2.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador se selecciona entre GM-CSF, CpG-ODN (oligodesoxinudeótidos CpG), lipopolisacárido (LPS), monofosforil lípido A (MPL, del inglés "monophosphoryl lipid A"), alumbre, poliproteína recombinante de Leishmania, imiquimod, MF59, poli I:C, poli A:U, IFN de tipo 1, Pam3Cys, Pam2Cys, adyuvante completo de Freund (CFA, del inglés "complete freund's adjuvant"), alfa-galactosilceramida, RC-529, MDF2p, loxoribina, agonista anti-CD40, antagonista de SIRPa, AS04, AS03, flagelina, resiquimod, DAP (ácido diaminopimélico), MDP (dipéptido de muramilo) y CAF01 (formulación adyuvante catiónica-01). En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un agonista de receptor de tipo Toll (TLR, del inglés "Toll-like receptor"), un adyuvante o una citocina. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un agonista de TLR y el agonista de TLR es un agonista de TLR es un agonista de TLR4, un agonista de TLR7, un agonista de TLR8 o un agonista de TLR9. En algunas realizaciones, el agonista de TLR se selecciona entre lipoproteínas triaciladas, lipopéptido diacilado, ácido lipoteicoico, peptidoglicano, zimosano, Pam3CSK4, ARNbc, poli I:C, poli G10, poli G3, CpG, 3M003, flagelina, lipopolisacárido (LpS) de Leishmania homólogo del factor 4a de elongación e iniciación ribosómico eucariota (LelF), MEDI9197, SD-101 y agonistas de TLR de imidazoquinolina.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador puede contener una o más interleucinas u otras citocinas. Por ejemplo, la interleucina puede incluir inyección de interleucina leucocitaria (Multikine), que es una combinación de citocinas naturales.
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un agonista de receptor de tipo Toll (TLR). En algunas realizaciones, dichos agonistas pueden incluir un agonista de TLR4, un agonista de TLR8 o un agonista de TLR9. Dicho un agonista puede seleccionarse de peptidoglucano, poli I:C, CpG, 3M003, flagelina y homólogo de factor de elongación e iniciación ribosómico eucariota 4a de Leismania(LelF).
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador puede ser uno que potencie la inmunogenicidad de las células tumorales tal como patupilona (epotilona B), anticuerpo monoclonal dirigido a receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) 7A7.27, inhibidores de histona desacetilasa (por ejemplo, vorinostat, romidepsina, panobinostat, belinostat y entinostat), el ácido graso n3-poliinsaturado, ácido docosahexaenoico, inhibidores del proteasoma (por ejemplo, bortezomib), shikonina (el componente principal de la raíz de Lithospermum erythrorhizon) y virus oncolíticos, tales como TVec (talimogene laherparepvec). En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador activa la muerte celular inmunogénica del cáncer o tumor, tal como las antraciclinas (doxorrubicina, mitoxantrona), agonistas del canal BK, bortezomib, bortezomib más mitomicina C más hTert-Ad, glucósidos cardíacos más inductores que no son ICD, ciclofosfamida, inhibidores de GADD34/PP1 más mitomicina, LV-tSMAC y oxaliplatino. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador puede ser una terapia epigenética, inhibidores de la ADN metiltransferasa (por ejemplo, decitabina, 5-aza-2'-desoxicitidina).
Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente inmunomodulador puede ser un inhibidor de la ADN metiltransferasa, que puede regular la expresión de antígenos asociados a tumores (TAA). Los TAA son sustancias antigénicas producidas en las células tumorales que desencadenan una respuesta inmunitaria. Los TAA con frecuencia están regulados negativamente por la metilación del ADN en los tumores para escapar del sistema inmunitario. La reversión de la metilación del ADN restaura la expresión de TAA, aumentando la inmunogenicidad de las células tumorales. Por ejemplo, los agentes desmetilantes tales como la decitabina (5-aza-2'-desoxicitidina) pueden aumentar la expresión de los TAA en las células tumorales y aumentar el reconocimiento inmunitario de las células cancerosas. La fotoinmunoterapia expondría aún más los TAA al sistema inmunitario al alterar las células.
En algunas realizaciones, el propio agente inmunomodulador puede ser un conjugado de anticuerpo que contiene un colorante de ftalocianina unido a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que es un agente inmunomodulador, tal como un inhibidor de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es uno que se dirige o se une a una molécula inmunosupresora, tal como una molécula de puntos de control inmunitario, sobre la superficie de células tumorales. Por ejemplo, PD-L1 es una molécula inmunosupresora que se expresa o induce de manera constitutiva en muchas células tumorales y puede prevenir la activación de los linfocitos T a través de interacciones con su receptor PD-1 expresado en las células inmunitarias. En algunos aspectos, un conjugado de colorante de ftalocianina que contiene un agente inmunomodulador que se une a una molécula inmunosupresora en las células tumorales (por ejemplo, PD-L1) se puede administrar tanto para potenciar una respuesta inmunitaria como para destruir específicamente las células cancerosas que expresan la molécula inmunosupresora, revirtiendo así la supresión inmunitaria en el microambiente tumoral. En particular, la irradiación de células tumorales a las que se une el conjugado puede dar como resultado su activación para mediar la destrucción celular inducida por PlT de las células cancerosas con PD-L1, que también actuaría para eliminar específicamente las células cancerosas en el tumor que controlan la supresión de linfocitos T en el microambiente tumoral.
Por lo tanto, en el presente documento se describe un conjugado que contiene un colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) unido a un agente inmunomodulador que se une a una molécula inmunosupresora expresada en las células tumorales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molécula inmunosupresora expresada en células tumorales puede ser una molécula de puntos de control inmunitario. En algunas realizaciones, la molécula de puntos de control inmunitario expresada en las células tumorales es PD-L1. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador que forma parte del conjugado es un inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que se une a PD-L1. Por ejemplo, en el presente documento se describe un conjugado que contiene un colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) unido a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que se une a PD-L1. Se describen anteriormente inhibidores de puntos de control inmunitario ilustrativos, incluyendo anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, contra PD-L1 y cualquiera puede incluirse en los conjugados descritos. Los anticuerpos anti-PD-L1 ilustrativos incluyen, pero sin limitación, BMS-935559, MEDI4736, Mp Dl3280A o MSB0010718C, o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos. Las moléculas conjugadas ilustrativas descritas en el presente documento incluyen, por ejemplo, IR700-BMS-935559, IR700-MEDI4736, IR700-MPDL3280A e IR700-MSB0010718C. En algunas realizaciones, dichos conjugados se pueden usar en métodos de fotoinmunoterapia, por ejemplo, mediante irradiación con luz a una longitud de onda suficiente para activar el colorante. Dichos conjugados pueden usarse en fotoinmunoterapia basada en monoterapia o pueden usarse en métodos de terapia de combinación con otros conjugados de colorantes de ftalocianina.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, se describen métodos de terapia de combinación en los que un primer conjugado que contiene un colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) unido a un agente inmunomodulador que se une a una molécula inmunosupresora expresada en las células de un tumor (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L1, tal como un conjugado IR700-anti-PD-L1) se administra a un sujeto, y después se administra al sujeto un segundo conjugado que contiene un colorante de ftalocianina unido a una molécula de direccionamiento. En general, el segundo conjugado puede incluir cualquier molécula de direccionamiento que sea capaz de unirse a una proteína de la superficie celular en una célula de un tumor, tal como una célula presente en un microambiente tumoral, tal como cualquiera de las descritas anteriormente. En algunas realizaciones, el primer conjugado y el segundo conjugado se unen a diferentes proteínas expresadas en una célula de un tumor. En algunas realizaciones, el segundo conjugado puede incluir un colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) unido a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que se une a una proteína de la superficie celular expresada en una célula de un tumor. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno ilustrativos del segundo conjugado pueden incluir, pero sin limitación, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, tositumomab (Bexxar ®), rituximab (Rituxan, Mabthera), ibritumomab tiuxetan (Zevalin), daclizumab (Zenapax), gemtuzumab (Mylotarg), alemtuzumab, fragmento Fab de escaneo CEA, anticuerpo monoclonal OC125, ab75705, B72.3, bevacizumab (Avastin ®) y basiliximab, nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, MK-3475, BMS-936559, MPDL3280A, ipilimumab, tremelimumab, IMP321, BMS-986016, LAG525, urelumab, PF-05082566, TRX518, MK-4166, dacetuzumab, lucatumumab, SEA-CD40, CP-870, CP-893, MED16469, MEDI6383, MEDI4736, MOXR0916, AMP-224, PDR001, MSB0010718C, rHIgM12B7, ulocuplumab, BKT140, varlilumab (CDX-1127), ARGX-110, MGA271, lirilumab (BMS-986015, IPH2101), IPH2201, AGX-115, emactuzumab, CC-90002 y MNRP1685A o es un fragmento de unión de anticuerpo de los mismos.
En algunas realizaciones, por ejemplo, si el tratamiento del tumor con el conjugado seguido de irradiación con luz aumenta la presencia de células inmunosupresoras en el tumor o aumenta la expresión de marcadores inmunosupresores en el tumor, se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inmunomodulador capaz de reducir la cantidad o la actividad de las células inmunosupresoras en el tumor o capaz de bloquear la actividad del marcador inmunosupresor o reducir la actividad de una célula promotora de tumores en el tumor o capaz de bloquear la actividad del marcador promotor de administrar al tumores. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se administra un conjugado con un primer colorante que es un colorante de ftalocianina, en combinación con un agente inmunomodulador incluye un conjugado que incluye un segundo colorante de ftalocianina conjugado con un agente inmunomodulador capaz de unirse a la célula inmunosupresora o a una célula promotora de tumores y modular la actividad de dicha célula. En algunas realizaciones, el primer y el segundo colorante de ftalocianina son iguales o diferentes.
Por tanto, en algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es en sí mismo un conjugado que contiene un colorante de ftalocianina, tal como un colorante de ftalocianina unido a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno que es un agente inmunomodulador. En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un conjugado de IR700 y anticuerpo que incluye un anticuerpo inmunomodulador (por ejemplo, inhibidor de puntos de control) que se une a una proteína de puntos de control en una célula tumoral (por ejemplo, PD-L1). En algunas realizaciones, el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) se administra antes de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, tal como entre 12 horas y 2 meses, tal como generalmente al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 96 horas, al menos una semana, al menos de dos semanas, al menos tres semanas o al menos un mes antes de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, el conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) se administra durante o simultáneamente con la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, el conjugado inmunomodulador (por ejemplo, conjugado IR700 y anticuerpo que es un agente inmunomodulador) se administra después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, tal como entre 12 horas y 2 meses, tal como generalmente al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 96 horas, al menos una semana, al menos de dos semanas, al menos tres semanas o al menos un mes después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento, o la irradiación después de la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento.
En dichos aspectos, los métodos de terapia de combinación generalmente incluyen una o más irradiaciones con luz a una longitud de onda suficiente para activar el colorante del primer y/o segundo conjugado.
En algunas realizaciones, se realizan al menos dos irradiaciones, donde se proporciona al menos una primera irradiación para activar el primer conjugado y se proporciona una segunda irradiación para activar el segundo conjugado. En algunas realizaciones, se proporciona una primera irradiación con luz al tumor después de la administración del primer conjugado. Por ejemplo, desde o desde aproximadamente 12 horas hasta 48 horas, tal como alrededor de o aproximadamente dentro de las 24 horas, después de administrar el primer conjugado, el tumor se puede tratar con luz para destruir las células cancerosas que expresan la molécula inmunosupresora, tal como para destruir células tumorales que expresan PD-L1. En algunas realizaciones, la destrucción de dichas células puede permitir la reactivación o amplificación de las respuestas de los linfocitos T en el tumor. En algunas realizaciones, posteriormente a la fotoinmunoterapia del primer conjugado por administración e irradiación, se puede administrar el segundo conjugado de colorante de ftalocianina al sujeto, seguido de una segunda irradiación con luz desde o desde aproximadamente 12 horas hasta 48 horas, tal como alrededor de o aproximadamente dentro de las 24 horas, después de administrar el segundo conjugado. En algunas realizaciones, la segunda irradiación logra la activación del segundo conjugado, lo que puede dar como resultado la muerte celular selectiva de células tumorales que expresan la molécula dirigida al tumor reconocida por el segundo conjugado, liberando así antígenos tumorales para inducir una fuerte respuesta inmunogénica ya que los linfocitos T en el tumor ya no se suprimen por la molécula inmunosupresora (por ejemplo, PD-L1). En algunas realizaciones, la primera irradiación se realiza antes de la administración del segundo conjugado, tal como al menos o aproximadamente al menos 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas o 24 horas antes de la administración del segundo conjugado.
En algunas realizaciones, se puede realizar una sola irradiación para efectuar la activación tanto del primer conjugado como del segundo conjugado para provocar la destrucción celular inducida por PIT de las células tumorales que expresan la molécula inmunosupresora (por ejemplo, PD-L1) reconocida por el primer conjugado y las células tumorales que expresan la molécula dirigida al tumor reconocida por el segundo conjugado. Por lo tanto, en dichos aspectos, la única irradiación de luz del tumor puede inducir ambos efectos para destruir selectivamente células tumorales específicas, liberando así antígenos tumorales, además de inducir una fuerte respuesta inmunogénica debido a la destrucción de las células tumorales inmunosupresoras, tales como las células tumorales que expresan PD-L1. En algunas realizaciones, antes de la irradiación, el primer conjugado se puede administrar antes, de manera simultánea, posterior o intermitente desde la administración del segundo conjugado. En algunas realizaciones, el primer conjugado se administra antes que el segundo conjugado, tal como al menos 5 minutos antes, y generalmente al menos 12 horas o al menos 24 horas antes. En algunas realizaciones, los conjugados primero y segundo se administran simultáneamente. En algunas realizaciones, los conjugados primero y segundo se formulan por separado. En algunas realizaciones, los conjugados primero y segundo se formulan juntos en la misma composición.
2. Agentes anticancerosos
También se describen en el presente documento agentes anticancerosos que pueden administrarse en combinación con fotoinmunoterapia empleando conjugados de colorante ftalocianina y moléculas de direccionamiento. Por lo tanto, la terapia de combinación descrita en el presente documento, incluyendo combinaciones y métodos de uso de la misma, incluye un agente anticanceroso, que puede incluir cualquier agente cuyo uso pueda reducir, detener o prevenir el cáncer en un sujeto. Opcionalmente, se puede usar un agente anticanceroso adicional en terapia de combinación con fotoinmunoterapia utilizando conjugados de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento junto con un agente inmunomodulador, por ejemplo, para tratar varios tipos de cáncer.
Como se describe en el presente documento, la destrucción de células tumorales inducida por PIT mediante la administración de uno o más conjugados de colorantes de ftalocianina a un sujeto que tiene un tumor en combinación con la irradiación puede dar lugar a aumentos en la permeabilidad tumoral, tal como aumentos en la permeabilidad vascular alrededor del espacio tumoral. En el presente documento se cree que el aumento de la permeabilidad puede dar como resultado una fuga rápida de moléculas sistémicamente disponibles en el espacio del tumor, maximizando así la exposición del tumor a dichas moléculas. Por tanto, en algunas realizaciones, en los métodos de terapia de combinación descritos en el presente documento, se administra un agente anticanceroso a un sujeto un tiempo suficiente antes de la irradiación de un conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento administrado para hacer que el agente anticanceroso esté disponible sistémicamente, tal como generalmente al menos 5 minutos antes de la irradiación, por ejemplo, al menos 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas o 24 horas antes de la irradiación. En dichas realizaciones, después de la irradiación y la destrucción de células tumorales inducida por PIT, el agente anticanceroso disponible sistémicamente puede incorporarse inmediatamente al espacio tumoral donde el agente puede proporcionar un efecto terapéutico. Por tanto, a diferencia de los métodos en los que el agente anticanceroso se administra después de la irradiación y, por lo tanto, después de la destrucción celular inducida por PIT, en los métodos de la presente invención no hay retraso en la consecución de un efecto terapéutico porque el agente anticanceroso está disponible para la captación directa e inmediata en el espacio tumoral. Esto puede maximizar las respuestas terapéuticas al agente anticanceroso.
Está dentro del nivel de un experto en la materia determinar el momento adecuado de administración de un agente anticanceroso particular antes de realizar la irradiación para garantizar una disponibilidad sistémica suficiente del agente anticanceroso. En muchos casos, la farmacocinética de agentes anticancerosos particulares es bien conocida en la técnica. En algunos casos, la farmacocinética se puede evaluar midiendo parámetros tales como la concentración plasmática máxima (pico) (Cmáx), la hora del pico (es decir, cuando se produce la concentración plasmática máxima); Tmáx), la concentración plasmática mínima (es decir, la concentración plasmática mínima entre dosis del agente; Cmín), la semivida de eliminación (T1/2) y área bajo la curva (es decir, el área bajo la curva generada al representar gráficamente el tiempo frente a la concentración plasmática del agente; a Uc ), después de la administración. La concentración de un agente particular en el plasma después de la administración subcutánea se puede medir utilizando cualquier método conocido en la técnica adecuado para evaluar las concentraciones de agentes en muestras de sangre. Por ejemplo, se puede utilizar un inmunoensayo, tal como un ELISA, o ensayos basados en cromatografía/espectrometría de masas.
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso que se usa en la terapia de combinación descrita en el presente documento puede referirse a cualquier agente o compuesto, utilizado en el tratamiento contra el cáncer. Estos incluyen cualquier agente, cuando se usa solo o en combinación con otros compuestos, que pueda aliviar, reducir, mejorar, prevenir, o colocar o mantener en un estado de remisión de síntomas clínicos o marcadores de diagnóstico asociados con tumores y cáncer, y puede usarse en combinaciones y composiciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es aquel cuyo efecto terapéutico generalmente está asociado con la penetración o suministro del agente anticanceroso en el microambiente tumoral o espacio tumoral. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso adicional es un agente alquilante, un fármaco de platino, un antimetabolito, un antibiótico antitumoral, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor mitótico, un corticoesteroide, un inhibidor del proteasoma, un inhibidor de cinasa, un inhibidor de histona desacetilasa o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es un péptido, proteína o fármaco de molécula pequeña.
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es 5-fluorouracilo/leucovorina, oxaliplatino, irinotecán, regorafenib, ziv-afibercept, capecitabina, cisplatino, paclitaxel, toptecán, carboplatino, gemcitabina, docetaxel, 5-FU, ifosfamida, mitomicina, pemetrexed, vinorelbina, oblea de carmustina, temozolomida, metotrexato, capacitabina, lapatinib, etopósido, dabrafenib, vemurafenib, citarabina liposómica, citarabina, interferón alfa, erlotinib, vincristina, ciclofosfamida, lomusina, procarbazina, sunitinib, somastostatina, doxorrubicina, doxorrubicina encapsulada en liposomas pegilados, epirrubicina, eribulina, paclitaxel unido a albúmina, ixabepilona, cotrimoxazol, taxano, vinblastina, temsirolimus, temozolomida, bendamustina, etopósido oral, everolimus, octreotida, lanredtida, dacarbazina, mesna, pazopanib, eribulina, imatinib, regorafenib, sorafenib, nilotinib, dasantinib, celecoxib, tamoxifeno, toremifeno, dactinomicina, sirolimus, crizotinib, certinib, enzalutamida, acetato de abiraterona, mitoxantrona, cabazitaxel, fluoropirimidina, oxaliplatino, leucovorina, afatinib, ceritinib, gefitinib, cabozantinib, oxoliplatino o auroropirimidina.
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso puede ser uno cualquiera o más de bevacizumab, cetuximab, panitumumab, ramucirumab, ipilimumab, rituximab, trastuzumab, adotrastuzumab emtansina, pertuzumab, nivolumab, lapatinib, dabrafenib, vemurafenib, erlotinib, sunitinib, pazopanib, imatinib, regorafenib, sorafenib, nilotinib, dasantinib, celecoxib, crizotinib, certinib, afatinib, axitinib, bevacizumab, bosutinib, cabozantinib, afatinib, gefitinib, temsirolimus, everolimus, sirolimus, ibrutinib, imatinib, lenvatinib, olaparib, palbociclib, ruxolitinib, trametinib, vandetanib o vismodegib o un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno de los mismos.
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso adicional es un agente alquilante. Los agentes alquilantes son compuestos que dañan directamente el ADN al formar enlaces covalentes con los ácidos nucleicos e inhibir la síntesis de a Dn . Los agentes alquilantes ilustrativos incluyen, pero sin limitación, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosamida, melfalán, clorambucilo, busulfán y tiotepa, así como agentes alquilantes de nitrosurea tales como carmustina y lomustina.
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es un fármaco de platino. Los fármacos de platino se unen y provocan la reticulación del ADN, que finalmente desencadena la apoptosis. Los fármacos de platino ilustrativos incluyen, pero sin limitación, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino, picoplatino, nedaplatino, triplatino y lipoplatino.
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es un antimetabolito. Los antimetabolitos interfieren con el crecimiento del ADN y el ARN al sustituir los componentes básicos normales del ARN y el ADN. Estos agentes dañan las células durante la fase S, cuando se están copiando los cromosomas de la célula. En algunos casos, los antimetabolitos se pueden usar para tratar leucemias, cánceres de mama, ovario y del tracto intestinal, así como otros tipos de cáncer. Los antimetabolitos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, 5-fluorouracilo (5-FU), 6-mercaptopurina (6-MP), capecitabina (Xeloda®), citarabina (Ara-C®), floxuridina, fludarabina, gemcitabina (Gemzar®), hidroxiurea, metotrexato y pemetrexed (Alimta®).
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es un antibiótico antitumoral. Los antibióticos antitumorales funcionan alterando el ADN dentro de las células cancerosas para evitar que crezcan y se multipliquen. Las antraciclinas son antibióticos antitumorales que interfieren con las enzimas implicadas en la replicación del ADN. Estos fármacos generalmente funcionan en todas las fases del ciclo celular. Se pueden utilizar ampliamente para una variedad de cánceres. Las antraciclinas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina e idarrubicina. Otros antibióticos antitumorales incluyen actinomicina-D, bleomicina, mitomicina-C y mitoxantrona.
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es un inhibidor de topoisomerasas. Estos fármacos interfieren con enzimas llamadas topoisomerasas, que ayudan a separar las cadenas de ADN para que puedan copiarse durante la fase S. Los inhibidores de topoisomerasas se pueden usar para tratar determinadas leucemias, así como cánceres de pulmón, de ovario, gastrointestinales y otros cánceres. Los inhibidores de topoisomerasas ilustrativos incluyen, pero sin limitación, doxorrubicina, topotecán, irinotecán (CPT-11), etopósido (VP-16), tenipósido y mitoxantrona. En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es un inhibidor mitótico. Los inhibidores mitóticos suelen ser alcaloides vegetales y otros compuestos derivados de productos vegetales naturales. Actúan deteniendo la mitosis en la fase M del ciclo celular, pero, en algunos casos, puede dañar las células en todas las fases al impedir que las enzimas produzcan las proteínas necesarias para la reproducción celular. Los inhibidores mitóticos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), ixabepilona (Ixempra®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), vinorelbina (Navelbina®) y estramustina (Emcyt®).
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es un corticosteroide. Los corticosteroides, con frecuencia llamados simplemente esteroides, son hormonas naturales y fármacos similares a las hormonas que son útiles en el tratamiento de muchos tipos de cáncer. Los corticosteroides también se pueden usar antes de la quimioterapia para ayudar a prevenir las reacciones alérgicas, así como durante y después de la quimioterapia para ayudar a prevenir las náuseas y los vómitos. Los corticosteroides ilustrativos incluyen, pero sin limitación, prednisona, metilprednisolona (Solumedrol®) y dexametasona (Decadron®).
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso es otro tipo de fármaco para quimioterapia, tal como un inhibidor del proteosoma, un inhibidor de cinasas o un inhibidor de histona-desacetilasas. En otras realizaciones, el agente anticanceroso es un producto biológico tal como un anticuerpo usado en la terapia contra el cáncer.
En algunas realizaciones, el agente anticanceroso se dirige a tumores asociados con varios tipos de cáncer. El cáncer puede ser cualquier cáncer localizado en el organismo de un sujeto, tales como, pero sin limitación, cánceres localizados en la cabeza y el cuello, de mama, hígado, colon, ovario, próstata, páncreas, cerebro, cuello del útero, hueso, piel, ojo, vejiga, estómago, esófago, peritoneo o pulmón. Por ejemplo, el agente anticanceroso se puede utilizar para el tratamiento del cáncer de colon, cáncer de cuello de útero, cáncer del sistema nervioso central, cáncer de mama, cáncer de vejiga, carcinoma anal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de pulmón microcítico, carcinoma pulmonar no microcítico, cáncer neuroendocrino, carcinoma de tejidos blandos, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de vesícula biliar o cáncer de esófago. En algunos casos, el cáncer puede ser un cáncer de la sangre.
E. Características ilustrativas
En algunas realizaciones, una respuesta deseada de tratamiento según los métodos descritos es reducir o inhibir uno o más síntomas asociados con un tumor o un cáncer. En algunas realizaciones, no es necesario eliminar por completo uno o más síntomas para que la composición sea eficaz.
Por ejemplo, la administración de una composición que contiene el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento seguida de irradiación puede disminuir el tamaño de un tumor, tal como el volumen o el peso de un tumor, o la metástasis de un tumor, por ejemplo, en al menos un 20 %, al menos 305, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos el 100 %, en comparación con el tamaño, volumen, peso o metástasis del tumor en ausencia del conjugado. En algunas realizaciones, la diferencia en el tamaño, volumen, peso o metástasis tumoral es evidente después de al menos 7 días, al menos 10 días, al menos 14 días, al menos 30 días, al menos 60 días, al menos 90 días, o al menos 120 días después de uno o más tratamientos. En algunas realizaciones, el tamaño y el volumen tumoral pueden monitorizarse por radiografía, obtención de imágenes por ultrasonido, necropsia, mediante el uso de calibres, por microCT o por 18F-FDG-PET. El tamaño tumoral también se puede evaluar visualmente. En ejemplos particulares, el tamaño tumoral (diámetro) se puede medir directamente utilizando calibres.
En algunas realizaciones, combinar los conjugados de colorante de ftalocianina y moléculas de direccionamiento y PIT (por ejemplo, moléculas de anticuerpo-IR700/PIT) con la terapia adicional, tal como un agente inmunomodulador o agente anticanceroso, según los métodos descritos en el presente documento puede dar como resultado un tamaño, volumen, peso o metástasis tumoral que es menor de lo que el tamaño, volumen, peso o metástasis tumoral serían si se tratara con el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento/PIT solo o la terapia adicional sola, es decir, existe un efecto sinérgico. Por ejemplo, la terapia de combinación descrita en el presente documento puede disminuir el tamaño de un tumor, tal como el volumen o el peso de un tumor, o la metástasis de un tumor, por ejemplo, en al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces o más en comparación con el tamaño, volumen, peso, o metástasis tumoral logrados en métodos de terapia que implican solamente fotoinmunoterapia con una composición que contiene el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento seguida de irradiación o en métodos de terapia que implican monoterapia con el agente inmunomodulador o el agente anticanceroso solo.
En algunas realizaciones, una respuesta deseada del tratamiento de acuerdo con los métodos descritos es destruir una población de células en una cantidad deseada, por ejemplo, mediante la destrucción de al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos el 100 % de las células, en comparación con la destrucción celular en ausencia del conjugado y de la irradiación. En algunas realizaciones, la diferencia en la destrucción de células tumorales es evidente después de al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 10 días, al menos 14 días o al menos 30 días, después del uno o más tratamientos. En algunas realizaciones, la actividad de destrucción celular se puede evaluar mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, pero sin limitación, ensayos de citotoxicidad/viabilidad celular que se pueden emplear para medir la necrosis y/o la apoptosis celular, tal como a partir de una muestra de biopsia, después del uno o más tratamientos), tal como MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) y otros ensayos relacionados basados en sales de tetrazolio (por ejemplo, XTT, MTS o WST), ensayos de ATP, ensayos de apoptosis (por ejemplo, utilizando anexina V marcada), tal como la tinción TUNEL de células infectadas, ensayos de fragmentación de ADN, ensayos de escaleras de ADN y ensayos de liberación de citocromo C. En algunos casos, se pueden utilizar métodos de obtención de imágenes, tal como tomografía por emisión de positrones (PET, del inglés "positron emission tomography"), incluyendo FDG-PET, CT por emisión de fotón único (SPECT, del inglés "single photon emission CT"), obtención de imágenes ponderadas en difusión (DWI, del inglés "diffusion weighted imaging"), obtención de imágenes de MR dinámicas con realce de contraste ponderado por susceptibilidad (DSC, del inglés "dynamic susceptibility-weighted contrast") u obtención de imágenes de MR con realce de contraste dinámico (DCE, del inglés "dynamic contrast-enhanced"), métodos de perfusión por CT, espectroscopía de resonancia magnética (MRS, del inglés "magnetic resonance spectroscopy") Dichos ensayos y métodos son bien conocidos por los expertos en la materia.
En algunas realizaciones, la terapia de combinación descrita en el presente documento puede aumentar la destrucción de células tumorales, por ejemplo, en al menos en al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces o más en comparación con destrucción celular en métodos de terapia que implican solamente fotoinmunoterapia con una composición que contiene el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento seguida de irradiación o en métodos de terapia que implican monoterapia con el agente inmunomodulador o el agente anticanceroso solos.
En algunas realizaciones, una respuesta deseada es aumentar el tiempo de supervivencia de un paciente con un tumor o al que se le ha extirpado un tumor recientemente, mediante una cantidad deseada, por ejemplo, para aumentar la supervivencia en al menos un 20 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos el 100 %, en comparación con el tiempo de supervivencia en ausencia del conjugado y de la irradiación. En algunas realizaciones, el aumento de la supervivencia es evidente por un aumento en uno o más indicadores de supervivencia entre la duración de la mediana de supervivencia sin progresión, la duración de la respuesta, la mediana de supervivencia global u otro criterio de valoración clínico relacionado con la supervivencia. En algunas realizaciones, la diferencia en la supervivencia es evidente después de al menos 7 días, al menos 10 días, al menos 14 días, al menos 30 días, al menos 60 días, al menos 90 días, al menos 120 días, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 24 meses, o al menos 5 años o más después del uno o más tratamientos. En algunas realizaciones, el anticuerpo-moléculas IR700/PIT solo según los métodos del presente documento, aumenta la duración de la mediana de supervivencia sin progresión, la duración de la respuesta, la mediana de supervivencia global u otro criterio de valoración clínico relacionado con la supervivencia en al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses, o al menos 5 años o más en comparación con si un sujeto se tratase con la molécula de direccionamiento correspondiente que no estuviera así conjugada. En algunas realizaciones, el anticuerpo-moléculas de IR700/PIT en combinación con la terapia adicional, tal como un agente inmunomodulador o agente anticanceroso, según los métodos descritos en el presente documento, aumenta la duración de la mediana de supervivencia sin progresión, la duración de la respuesta, la mediana de supervivencia global u otro criterio de valoración clínico relacionado con la supervivencia en al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses, o al menos 5 años o más en comparación con si el sujeto se hubiera tratado con el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento/PIT solo o con la terapia adicional sola.
En algunas realizaciones, la terapia de combinación descrita en el presente documento puede aumentar el tiempo de supervivencia de un sujeto tratado, por ejemplo, en al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces o más en comparación con el tiempo de supervivencia de un sujeto que recibe terapia que implica solamente fotoinmunoterapia con una composición que contiene el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento seguida de irradiación o en métodos de terapia que implican monoterapia con el agente inmunomodulador o el agente anticanceroso solos. En algunas realizaciones, combinando el anticuerpo-moléculas IR700/PIT con la terapia adicional, tal como un agente inmunomodulador o agente anticanceroso, según los métodos descritos en el presente documento, aumenta la duración de la mediana de supervivencia sin progresión, la duración de la respuesta, la mediana de supervivencia global u otro criterio de valoración clínico relacionado con la supervivencia en al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses o al menos 5 años o más en comparación con si se hubieran tratado con el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento/PIT solo o con la terapia adicional sola.
En un aspecto, la respuesta al tratamiento se caracteriza utilizando los criterios Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST), que es la pauta recomendada para la evaluación de la respuesta tumoral por el National Cancer Institute (véase Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000). En algunas realizaciones, los pacientes pueden evaluarse para determinar la respuesta a la terapia utilizando los criterios RECIST como se describe en las pautas revisadas de la versión 1.1 (RECIST 1.1, véase Eisenhauer et al. (2009) European Journal of Cancer, 45:228-247). Los criterios para el estado objetivo son necesarios para los protocolos para evaluar la respuesta de tumores sólidos. Los criterios representativos incluyen los siguientes: (1) Respuesta completa (CR, del inglés "Complete Response"), definida como la desaparición completa de toda enfermedad medible; sin nuevas lesiones; sin síntomas relacionados con la enfermedad; sin evidencia de enfermedad no medible; (2) Respuesta parcial (PR, del inglés "Partial Response") definida como una disminución del 30 % en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana (por ejemplo, tumor); (3) Enfermedad progresiva (PD, del inglés "Progressive Disease"), definida como un aumento del 20 % en la suma del diámetro más largo de las lesiones diana o la aparición de cualquier lesión nueva; (4) Respuesta estable o sin respuesta, definida como no aptos para CR, PR o PD. (Véase Therasse et al., supra.) En algunas realizaciones, se puede determinar la tasa de respuesta objetiva (ORR, del inglés "objective response rate"), que es el porcentaje de sujetos en los que se observa una respuesta CR o PR. La ORR se usa comúnmente para medir la respuesta tumoral al tratamiento en ensayos clínicos de oncología.
En algunas realizaciones, la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento según los métodos descritos, ya sea como monoterapia o en terapia de combinación, consigue una reducción del tamaño o volumen del tumor de al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o más en el plazo de dos semanas o un mes desde la irradiación en comparación con el tamaño o volumen del tumor antes de la administración y la irradiación.
En algunas realizaciones, en una población de sujetos tratados, la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento según los métodos descritos, ya sea como monoterapia o como terapia de combinación, produce una mejora de un parámetro relacionado con el trastorno o el cáncer en comparación con una población de sujetos en una situación similar tratada con la molécula de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) que no está conjugada, en donde el parámetro se selecciona de uno o más de: a) tasa de respuesta objetiva (ORR, del inglés "objective response rate"); b) supervivencia sin progresión (SLP, del inglés "progression free survival"); c) supervivencia general (OS, del inglés "overall survival"); d) reducción de la toxicidad; e) respuesta tumoral; de f) calidad de vida. En algunas realizaciones, el parámetro se mejora en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 % o más.
En algunas realizaciones, en una población de sujetos tratados, la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento según los métodos descritos, ya sea como monoterapia o en terapia de combinación, da como resultado una PR en al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de los sujetos tratados. En algunas realizaciones, en una población de sujetos tratados, la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento según los métodos descritos da como resultado una CR en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de los sujetos tratados.
En algunas realizaciones, en una población de sujetos tratados, la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento según los métodos descritos, ya sea como monoterapia o en terapia de combinación, da como resultado una ORR que es mayor que aproximadamente un 13 %, por ejemplo, mayor que aproximadamente un 15 %, mayor que aproximadamente un 20 %, mayor que aproximadamente un 30 %, mayor que aproximadamente un 40 %, mayor que aproximadamente un 50 %, mayor que aproximadamente un 60 %, mayor que aproximadamente un 70 %, mayor que aproximadamente un 80 %, mayor que aproximadamente un 95 % o mayor que aproximadamente un 99 %.
En algunas realizaciones, la terapia de combinación descrita en el presente documento, tales como terapias que emplean un agente inmunomodulador, se puede utilizar para estimular una respuesta inmunitaria en un paciente con cáncer. Normalmente, las respuestas inmunitarias pueden detectarse mediante cualquiera de una variedad de parámetros bien conocidos, incluyendo, pero sin limitación, la determinación in vivo o in vitro de: inmunoglobulinas o anticuerpos solubles; mediadores solubles tales como citocinas, linfocinas, quimiocinas, hormonas, factores de crecimiento y similares, así como otros péptidos pequeños solubles, hidrato de carbono, mediadores de nucleótidos y/o lípidos; cambios en el estado de activación celular determinados por propiedades funcionales o estructurales alteradas de las células del sistema inmunitario, por ejemplo, proliferación celular, motilidad alterada, inducción de actividades especializadas tales como expresión génica específica o comportamiento citolítico; diferenciación celular por células del sistema inmunitario, incluyendo perfiles de expresión de antígenos de superficie alterados o el inicio de la apoptosis (muerte celular programada); un aumento en los linfocitos T citotóxicos, macrófagos activados o linfocitos citolíticos naturales; o cualquier otro criterio por el cual se pueda detectar la presencia de una respuesta inmunitaria.
Los procedimientos para realizar estos y otros ensayos similares son ampliamente conocidos y se pueden encontrar, por ejemplo, en Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998; véase también Current Protocols in Immunology; véase también, por ejemplo, Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, Mass.; Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, San Francisco, Calif.; Green and Reed, 1998 Science 281:1309 y referencias citadas en los mismos).
La detección de la proliferación de linfocitos T reactivos a tumores se puede lograr mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de linfocitos T se puede detectar midiendo la tasa de síntesis de ADN, y la especificidad tumoral se puede determinar controlando los estímulos (tal como, por ejemplo, un tumor deseado específico o células presentadoras de antígeno pulsadas con antígeno de control) a los que se exponen los linfocitos T candidatos reactivos al tumor. Los linfocitos T que se han estimulado para proliferar presentan una mayor tasa de síntesis de ADN. Una forma típica de medir la tasa de síntesis de ADN es, por ejemplo, marcando a pulsos cultivos de linfocitos T con timidina tritiada, un precursor de nucleósido que se incorpora al ADN recién sintetizado. La cantidad de timidina tritiada incorporada se puede determinar utilizando un espectrofotómetro de centelleo líquido. Otras formas de detectar la proliferación de linfocitos T incluyen medir los aumentos en la producción de interleucina-2 (IL-2), el flujo de Ca2+ o la absorción de colorante, tal como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio Como alternativa, se puede medir la síntesis de linfocinas (tal como el interferón-gamma) o se puede cuantificar el número relativo de linfocitos T que pueden responder a un antígeno particular.
Se puede lograr la detección de la producción de anticuerpos (por ejemplo, producción de anticuerpos específicos de tumores), por ejemplo, analizando una muestra (por ejemplo, una muestra que contiene inmunoglobulina, tal como suero, plasma o sangre) de un hospedador tratado con una composición según la presente invención utilizando metodologías in vitro tal como radioinmunoensayo (RIA, por su siglas en inglés), ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), diálisis de equilibrio o inmunotransferencia en fase sólida, incluida la transferencia Western. En realizaciones preferidas, los ensayos ELISA pueden incluir además la inmovilización de captura de antígeno tumoral de un antígeno tumoral diana con un anticuerpo monoclonal en fase sólida específico para el antígeno, por ejemplo, para potenciar la sensibilidad del ensayo. La elaboración de mediadores solubles (por ejemplo, citocinas, quimiocinas, linfocinas, prostaglandinas, etc.) también puede determinarse fácilmente mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), por ejemplo, utilizando métodos, aparatos y reactivos que están fácilmente disponibles de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma, St. Louis, Mo.; véase también R & D Systems 2006 Catalog, R & D Systems, Mineápolis, Minnesota).
Cualquier cantidad de parámetros inmunitarios diferentes puede monitorizarse utilizando ensayos habituales que son bien conocidos en la técnica. Estos pueden incluir, por ejemplo, ensayos de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC, del inglés "antibody dependent cell-mediated cytotoxicity"), respuestas de anticuerpos secundarios in vitro, análisis inmunocitofluorimétrico de flujo de varias subpoblaciones de células mononucleares linfoides o de sangre periférica utilizando sistemas de antígenos marcadores bien establecidos, inmunohistoquímica u otros ensayos relevantes. Estos y otros ensayos se pueden encontrar, por ejemplo, en Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5.a Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, D.C.
IV. Obtención de imágenes
En algunas realizaciones, la administración del conjugado al sujeto también puede facilitar la obtención de imágenes del sujeto para determinar la señal de fluorescencia. En algunas realizaciones, los conjugados se pueden usar como agentes de obtención de imágenes ópticas in vitro o in vivo de células, tejidos u órganos en diversas aplicaciones biomédicas. En algunas realizaciones, los conjugados de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se pueden usar como agentes de obtención de imágenes ópticas in vivo de tumores, tejidos y órganos en un sujeto. En algunas realizaciones, los conjugados de colorante de ftalocianina molécula de direccionamiento se utilizan para la detección de tumores y otras anomalías. Por ejemplo, la existencia de células cancerosas o tejidos cancerosos puede verificarse mediante la administración del conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento al sujeto para la detección y obtención de imágenes del tumor.
En algunas realizaciones, la detección o evaluación de una señal de fluorescencia se puede utilizar para monitorizar la carga del conjugado en la lesión (por ejemplo, tumor) antes de la PIT. En algunas realizaciones, la detección o evaluación de una señal de fluorescencia se puede utilizar para monitorizar la ubicación de la lesión (por ejemplo, un tumor) iluminando el área alrededor o cerca de la lesión en la que se localiza selectivamente el conjugado tras la administración. En algunas realizaciones, la detección o evaluación de una señal de fluorescencia se puede utilizar para visualizar cualquier célula cancerosa residual que pueda estar presente en un entorno quirúrgico, por ejemplo, después de la resección del tumor, que, en algunos casos, se puede utilizar para facilitar el direccionamiento de dichas células por PIT.
En algunas realizaciones, la señal de fluorescencia del colorante de ftalocianina utilizado para PIT (por ejemplo, IR700) se puede monitorizar directamente.
En algunas realizaciones, el conjugado de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento puede contener un colorante adicional como se describe anteriormente, que, en algunos casos, tiene una longitud de onda de emisión y excitación que es diferente a la del colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700). En algunas realizaciones, los conjugados de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento de fórmula I o fórmula II se utilizan para obtener imágenes de un sujeto. En algunas realizaciones, los conjugados de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se administran a un sujeto, y se realiza irradiación o iluminación para identificar, detectar, localizar y/o seguir el movimiento del conjugado en el sujeto. En algunas realizaciones, la obtención de imágenes del sujeto se realiza iluminando a una longitud de onda capaz de absorberse por el segundo colorante o colorante de adición del conjugado, pero no por el colorante de ftalocianina.
En algunas realizaciones, la luz a una longitud de onda correspondiente a la que se absorbe por el colorante se expone al conjugado. En algunas realizaciones, el área diana a la que se unen los conjugados de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se expone a la luz de la longitud de onda de la radiación electromagnética absorbida por el colorante, tal como el colorante de ftalocianina (por ejemplo, IR700) o el colorante adicional o segundo. En algunas realizaciones, los conjugados, cuando se exponen a la luz de una longitud de onda apropiada, absorben la luz, haciendo que se produzcan sustancias que iluminen las células o tejidos diana en el sujeto al que se une el conjugado. En algunas realizaciones, la iluminación se realiza para identificar, detectar, localizar y/o caracterizar una célula cancerosa o un tumor en el sujeto.
En algunas realizaciones, el conjugado se expone a la luz utilizando un dispositivo seleccionado entre una lámpara ultravioleta de mano, una lámpara de mercurio, una lámpara de xenón, un láser, un diodo láser o un dispositivo de obtención de imágenes LED. En algunas realizaciones, el dispositivo de obtención de imágenes LED contiene un LED de infrarrojo cercano (NIR).
En algunas realizaciones, la irradiación se realiza utilizando una fibra con punta de microlente para la iluminación de la superficie. En algunas realizaciones, la irradiación se realiza utilizando fibras difusoras cilíndricas. En algunas realizaciones, las fibras difusoras cilíndricas tienen una longitud de difusor de 0,5 cm a 10 cm y están separadas 1,8 ± 0,2 cm. En algunas realizaciones, las fibras difusoras cilíndricas se colocan en un catéter ubicado en el tumor con una separación de 1,8 ± 0,2 cm. En algunas realizaciones, el catéter es ópticamente transparente.
En algunas realizaciones, los conjugados de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento de fórmula I o fórmula II se utilizan para obtener imágenes de fluorescencia en una cirugía. En algunas realizaciones, los conjugados de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se utilizan para obtener imágenes del área diana (por ejemplo, tumor) antes de la cirugía para proporcionar información sobre la ubicación del tumor. En algunas realizaciones, los conjugados de colorante de ftalocianina y molécula de direccionamiento se utilizan para obtener imágenes del área diana en y alrededor del tumor, de manera que los márgenes del tumor se puedan visualizar con fluorescencia y las células cancerosas residuales en los márgenes se puedan erradicar con PIT. En algunas realizaciones, los métodos de obtención de imágenes antes de la cirugía incluyen, pero sin limitación, obtención de imágenes por resonancia magnética (IMRI, del inglés "magnetic resonance imaging") y tomografía computarizada (CT, del inglés "computerized tomography").
En algunas realizaciones, los conjugados se pueden usar para teñir o marcar directamente una muestra para que la muestra se pueda identificar o cuantificar. Por ejemplo, el conjugado se puede añadir como parte de un ensayo para determinar un analito biológico diana o como un elemento trazador detectable en un fluido biológico o no biológico. Normalmente, la muestra se obtiene directamente de una fuente líquida o como un lavado de un material sólido o un medio de cultivo en el que se han introducido células para el cultivo, o una solución tampón en la que se han colocado las células para su evaluación. Cuando la muestra comprende células, las celdas son opcionalmente células sueltas, incluyendo microorganismos, o células múltiples asociadas con otras células en capas bi o tridimensionales, incluidos los organismos pluricelulares, embriones, tejidos, biopsias, filamentos, biopelículas, y similares. En algunas realizaciones, la obtención de imágenes de las células o tejidos se realiza irradiando o iluminando a una longitud de onda capaz de absorberse por uno o más de los colorantes del conjugado. En algunas realizaciones, los métodos de obtención de imágenes in vitro incluyen, pero sin limitación, microscopía de contraste de fase, microscopia de fluorescencia, microscopía multifotónica, microscopía de barrido láser confocal, microscopía Raman confocal, microscopía de resonancia magnética, tomografía de coherencia óptica y microscopía electrónica.
V. Definiciones
A menos que se definan de otra manera, se pretende que todos los términos de la técnica, las notaciones y otros términos o terminología técnicos y científicos utilizados en el presente documento tengan el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la materia objeto reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente comprendidos se definen en el presente documento con fines de claridad y/o para tener una referencia inmediata, y la inclusión de dichas definiciones en el presente documento no se ha de considerar necesariamente como representativa de una diferencia sustancial frente a lo que se comprende en la materia.
Como se utiliza en el presente documento, las formas en singular "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "una" significa "al menos uno" o "uno o más". Se entiende que aspectos y variaciones descritos en el presente documento incluyen "que consiste" y/o "que consiste esencialmente en" aspectos y variaciones.
A lo largo de la presente divulgación, diversos aspectos del tema reivindicado se presentan en un formato de intervalo. Ha de comprenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad, y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la materia objeto reivindicada. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor afirmado o que interviene en el intervalo comentado queda englobado dentro de la materia objeto reivindicada. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse de manera independiente en los intervalos más pequeños, y también están englobados dentro de la materia objeto reivindicada, sujetos a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen alguno o ambos de los límites incluidos también quedan englobados en la materia objeto reivindicada. Esto es aplicable de manera independiente de la amplitud del intervalo.
El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, se refiere al intervalo de error habitual para el valor correspondiente, fácilmente conocido por un experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí. Por ejemplo, una descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
Como se utiliza en el presente documento, un "conjugado" se refiere a un polipéptido unido de manera directa o indirecta a uno o más polipéptidos o fracciones químicas diferentes. Dichos conjugados incluyen proteínas de fusión, los producidos mediante conjugados químicos y los producidos mediante cualquier otro método. Por ejemplo, un conjugado se puede referir a un colorante de ftalocianina, tal como una molécula IR700, unido directa o indirectamente a uno o más polipéptidos o fracciones químicas diferentes, tales como a una molécula de direccionamiento que se une o se dirige a una proteína de la superficie celular.
Como se utiliza en el presente documento, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo células. Puede ser una solución, una suspensión, líquido, polvo, una pasta, acuoso, no acuoso o cualquier combinación de los mismos.
Como se utiliza en el presente documento, una "composición farmacéutica" o "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma sea eficaz y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que puede administrarse la composición.
Como se utiliza en el presente documento, un "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente incluido en una formulación farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un transportador farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitación, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se utiliza en el presente documento, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o más elementos. La combinación puede ser de dos o más elementos separados, tal como dos composiciones o dos colecciones, puede ser una mezcla de los mismos, tal como una sola mezcla de los dos o más elementos, o cualquier variación de los mismos. Los elementos de una combinación están generalmente asociados o relacionados funcionalmente.
Como se utiliza en el presente documento, un derivado se refiere a una forma de un fármaco que ha sufrido un cambio o modificación a partir de un fármaco o agente de referencia, pero aún conserva la actividad (por ejemplo, presenta una actividad aumentada o disminuida) en comparación con el fármaco o agente de referencia.
Normalmente, una forma derivada de un compuesto significa que una cadena lateral del compuesto se ha modificado o cambiado.
Como se utiliza en el presente documento, un análogo o análogo de un fármaco o agente es un fármaco o agente relacionado con un fármaco de referencia, pero cuyas actividades químicas y biológicas pueden ser diferentes. Normalmente, los análogos presentan actividades similares a un fármaco o agente de referencia, pero la actividad se puede aumentar o disminuir o mejorar de otro modo. Normalmente, una forma análoga de un compuesto o fármaco significa que el núcleo de la cadena principal de la estructura se modifica o cambia en comparación con un fármaco de referencia.
Como se utiliza en el presente documento, un kit es una combinación envasada que opcionalmente incluye otros elementos, tales como reactivos adicionales e instrucciones de uso de la combinación o elementos de la misma. El término "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos. Como se utiliza en el presente documento, un "artículo de fabricación" es un producto que se fabrica y, en algunos casos, que se puede vender. En algunas realizaciones, la expresión se puede referir a composiciones contenidas en artículos de envasado, tal como en un recipiente.
Como se utiliza en el presente documento, "terapia de combinación" se refiere a un tratamiento en el que un sujeto recibe dos o más agentes terapéuticos, tal como al menos dos o al menos tres agentes terapéuticos, para el tratamiento de una sola enfermedad. En algunas realizaciones, cada terapia puede dar como resultado un efecto farmacéutico independiente y juntas pueden dar como resultado un efecto farmacéutico aditivo o sinérgico.
Como se utiliza en el presente documento, "enfermedad o trastorno" se refiere a una afección patológica en un organismo que resulta de una causa o afección que incluye, pero sin limitación, infecciones, condiciones adquiridas, condiciones genéticas y caracterizadas por síntomas identificables.
Como se utiliza en el presente documento, "tratar" a un sujeto con una enfermedad o afección significa que los síntomas del sujeto se alivian de manera parcial o total, o permanecen estáticos después del tratamiento. Por tanto, el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. La profilaxis se refiere a la prevención de una posible enfermedad y/o la prevención del empeoramiento de los síntomas o la progresión de una enfermedad.
Como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" significa cualquier forma en que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad u otra indicación, mejoran o se alteran de otra manera beneficiosa.
Como se utiliza en el presente documento, "efecto terapéutico" significa un efecto resultante del tratamiento de un sujeto que altera, normalmente corrige o mejora los síntomas de una enfermedad o afección o que cura una enfermedad o afección.
Como se utiliza en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por lo tanto, es la cantidad necesaria para evitar, curar, mejorar, detener o detener de manera parcial un síntoma de una enfermedad o trastorno.
Como se utiliza en el presente documento, la mejora de los síntomas de una enfermedad o trastorno en particular mediante un tratamiento, tal como mediante la administración de una composición farmacéutica u otro tratamiento, se refiere a cualquier disminución, ya sea permanente o temporal, duradera o transitoria, de los síntomas que pueden atribuirse o asociarse con la administración de la composición o tratamiento.
Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, tal como un ser humano.
Como se utiliza en el presente documento, "opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre y casos en los que no. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo no está sustituido o está sustituido.
Los encabezados de sección utilizados en el presente documento son solamente para fines de organización y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.
VI. Ejemplos
Los ejemplos siguientes se incluyen con fines ilustrativos únicamente y no están destinados a limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1: Generación de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX
Este ejemplo describe un método para preparar un conjugado que contiene IRDye 700DX (I R700) unido a cetuximab para producir cetuximab-IRDye 700DX (cetuximab-IR700). Los métodos descritos son ilustrativos y se pueden emplear métodos similares para conjugar otra molécula de direccionamiento a IRDye 700Dx. Los métodos se realizaron para limitar la exposición del colorante y el conjugado a la luz debido a la fotosensibilidad del colorante, que incluyeron el uso de niveles bajos de luz verde con una longitud de onda de 425 a 575 nm y una intensidad inferior a 200 lux en la instalación de fabricación.
A. Preparación de tampones
Los tampones se prepararon utilizando agua altamente purificada (HPW, del inglés "Highly Purified Water") o agua para inyección (WFI, de inglés "Water for Injection") y se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm antes de almacenarlos a temperatura ambiente. Las tablas 2-4 muestran los controles y las pruebas en proceso para los tampones preparados: tampón de conjugación (fosfato de sodio 100 mM, pH 8,65), tampón de extinción (glicina 1,0 M, pH 9) y tampón de formulación de solución salina tamponada con fosfato (PBS) final: (Na2HPO4 5,60 mM, KH2PO41,058, NaCl 154 mM, pH 7,1), respectivamente.
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B. Preparación de colorante y cetuximab
1. Preparación de cetuximab
Antes de la conjugación, se pulverizaron frascos de cetuximab (Myoderm USA, Norristown, PA) con alcohol isopropílico estéril y se colocaron en una campana de flujo laminar. Se utilizaron un total de 423 frascos para preparar las sustancia farmacéutica. Los frascos se desengarzaron con un desengarzador electrónico, los tapones se retiraron con pinzas esterilizadas en autoclave y el contenido se vertió en botellas de PETG estériles de 2 l. Las botellas se taparon cuando se llenaron. A continuación, se filtró el cetuximab a través de un filtro de 0,22 pm y se agruparon en un HyQtainer de 50 l. El cetuximab filtrado y agrupado se almacenó a 2-8 °C.
A continuación, se realizó una etapa de concentración e intercambio de tampón mediante ultrafiltración/diafiltración (UF/DF). La limpieza del dispositivo de UF/DF se realizó antes de su uso. La solución de almacenamiento se drenó y la membrana se lavó abundantemente con al menos 20 L de HPW. La unidad se lavó abundantemente con NaOH 0,1 M durante 30 a 40 min y después se lavó abundantemente con HPW. Se confirmó el pH del enjuague. El sistema se equilibró con tampón fosfato sódico 100 mM, pH 8,65. El pH y la conductividad del efluente del permeado y del retenido se confirmaron antes de su uso. También se realizaron pruebas de endotoxinas; el sistema se utilizó dentro de las 48 horas posteriores a la prueba de endotoxinas.
Antes de las operaciones de UF/DF, el cetuximab filtrado y agrupado se calentó mediante la colocación en una incubadora a 25 °C durante 120 a 150 min. El material se concentró primero hasta un objetivo de 5 mg/ml y después se diafiltró en tampón fosfato sódico 100 mM, pH 8,65. Se realizó diafiltración hasta que se alcanzaron los objetivos de conductividad y pH del permeado. El sistema se lavó abundantemente con tampón y la descarga se añadió al retenido diafiltrado. Las presiones del sistema de UF/DF se monitorizaron y registraron durante la operación como se describe en la tabla 5.
Se determinó la concentración de producto de cetuximab diafiltrado y después se diluyó a una concentración objetivo de 2 mg/ml (1,8 a 2,4 mg/ml) utilizando tampón fosfato sódico 100 mM, pH 8,65. El producto se filtró de manera aséptica a través de un filtro de 0,22 pm y se dividió en dos garrafas de 40 l dedicadas al producto esterilizadas en autoclave que contenían barras de agitación y se procesó directamente en la operación de conjugación. Se determinó el peso de cetuximab en cada garrafa.
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2. Preparación de colorante
Antes de la conjugación, se preparó éster de NHS IRDye 700DX (colorante; número de Cat. 929-70011, Li-COR, Lincoln, NE) disolviéndolo a una concentración de 10 mg/ml en DMSO anhidro. Las etapas se realizaron bajo luz verde (por ejemplo, longitud de onda de 425 a 575 nm y una intensidad inferior a 200 lux) para proteger el colorante de las longitudes de onda de la luz que son fuertemente absorbidas por el colorante.
C. Conjugación
Las etapas de conjugación y desactivación se realizaron en garrafas de 2 *40 l (envueltas en papel de aluminio para protegerlas de la luz) que contenían cetuximab diafiltrado. Las etapas se realizaron a temperatura ambiente bajo luz verde (por ejemplo, longitud de onda de 425 a 575 nm y una intensidad inferior a 200 lux) para proteger el conjugado de la fotodegradación.
Para la reacción de conjugación, se calculó la cantidad adecuada de éster de NHS IRDye 700DX en DMSO (basado en el peso de cetuximab en cada garrafa, normalmente de 80 a 120 g) para lograr una proporción molar final de 4:1 (éster de NHS IRDye 700DX:cetuximab). Los estudios de desarrollo de procesos han determinado que esta proporción, junto con el tiempo de incubación de conjugación dirigida, debe incorporar de 2 a 3 restos de colorante por molécula de cetuximab. La cantidad calculada del éster de NHS IRDye 700DX se añadió a las garrafas que contenían cetuximab y se mezcló en una placa de agitación durante 10-15 min. La reacción de conjugación prosiguió después durante 120 min mediante la colocación de las garrafas en una incubadora a 25 °C.
La reacción de conjugación se desactivó mediante la adición de glicina 1 M hasta una concentración final de 4,2 mM y se mezcló durante 10-12 min. Las garrafas se incubaron durante 20-25 min más en la incubadora a 25 °C. La tabla 6 muestra los controles y las pruebas en proceso para las etapas de conjugación y desactivación.
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Se realizó una etapa final de UF/DF para intercambiar el producto conjugado en el tampón de formulación de PBS final. La limpieza del sistema de UF/DF se realizó antes de su uso. La unidad se limpió y las piezas se remojaron en NaOH 1,0 M y después se aclararon con HPW. El sistema se equilibró con PBS, pH 7,1 hasta que el permeado estuvo dentro de las especificaciones. Se analizaron el permeado y el retenido para detectar endotoxinas.
El conjugado desactivado se transfirió al sistema de UF/DF y primero se concentró de 8 a 10 l seguido de diafiltración con 8 a 12 diavolúmenes de PBS para intercambiar el producto en el tampón de formulación final. Se confirmaron el pH y la conductividad. El sistema se lavó abundantemente con tampón y la descarga se añadió al producto final. Se determinó la concentración de proteína y, si era necesario, se realizó una dilución adicional con PBS para alcanzar una concentración final de producto objetivo de 2,0 mg/ml (1,8 a 2,1 mg/ml).
Se realizó una filtración final a través de un filtro de 0,22 pm y el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX se almacenó en la oscuridad a 2-8 °C en un HyQtainer de 50 l cubierto con papel de aluminio para proteger el contenido de la luz. Las etapas se realizaron a temperatura ambiente bajo luz verde para proteger el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX. La tabla 7 muestra los controles y pruebas en proceso para la Uf/DF final, filtración y almacenamiento. En algunos casos, se requirió dilución.
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Después de preparar el material conjugado, la muestra se presentó para SEC-HPLC para determinar la concentración, proporción de colorante a anticuerpo (DAR, del inglés "dye to antibody ratio"), identidad y pureza. También se realizaron otras pruebas de apariencia, pH, biocarga y nivel de endotoxinas. La tabla 8 muestra los resultados de estas pruebas para un producto en lote ilustrativo con referencia al criterio de aceptación general para la sustancia farmacéutica.
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Ejemplo 2: Farmacocinética y eficacia terapéutica del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX
Este ejemplo describe los resultados intermedios de un estudio clínico (fases 1 y 2) que evalúa la seguridad y la eficacia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello tratados con una administración única o múltiple de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX seguida, por irradiación para inducir fotoinmunoterapia (PIT). Se determinaron los parámetros farmacocinéticos y la respuesta tumoral en pacientes humanos después de la administración de una sola dosis del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX para evaluar la seguridad y eficacia de la terapia.
1. Métodos
Nueve (9) pacientes con carcinoma escamoso de cabeza y cuello ingresaron en un ensayo clínico de aumento de dosis. Los pacientes se dividieron en tres (3) cohortes de dosis, como se enumeran en la tabla 8A a continuación. Cada cohorte incluía tres (3) pacientes. Todos los pacientes inscritos en el ensayo tenían cánceres progresivos recurrentes que habían fracasado en múltiples rondas de tratamientos disponibles comercialmente, algunos de los cuales habían fracasado en tratamientos previos con el anticuerpo cetuximab. El estudio incluyó a pacientes con tumores tanto HPV positivos como negativos, y pacientes con tumores P16 positivos y negativos.
Para garantizar una dosis inicial segura basada en la guía ICH para la primera administración humana de terapias experimentales, se utilizó una dosis inicial de 4,3 mg/kg (160 mg/m2) en el estudio de aumento de dosis. La dosis inicial estaba por debajo del umbral de 6 veces por debajo de la dosis máxima no tóxica grave (HNSTD, del inglés "Highest Non-Severely Toxic Dose").
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Se prepararon bolsas intravenosas (i.v.) que contenían el conjugado a partir de viales que contenían 50 ml de una solución de 2 mg/ml de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX producido como se describe en el ejemplo 1. Como se describe en el ejemplo 1, los viales se empaquetaron en una sola caja y después en una bolsa opaca antes de su uso. El manejo del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX y su administración por infusión se realizaron en una habitación oscura con menos de 400 lux de luz fluorescente. Nunca se utilizó iluminación de tungsteno durante la preparación de las bolsas de infusión. Todas las ventanas de la habitación se cubrieron con persianas para que el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX nunca se expusiera directa o indirectamente a la luz solar.
En una cabina o campana de bioseguridad con la luz apagada de modo que el conjugado hubiera estado expuesto a una intensidad de luz de no más de 200 lux (equivalente a una bombilla de 60 W o una luz fluorescente de 15 W), cada frasco se extrajo del lecho opaco y después de la caja. Se abrió el envase de cada frasco que contenía el conjugado y se colocó el contenido de ese frasco en una bolsa i.v. estéril hasta alcanzar la dosis deseada de conjugado para infusión. Cada frasco se abrió por separado y se colocó en la bolsa i.v. para reducir la exposición del medicamento a la luz ambiental. El proceso se realizó en menos de 15 min. La bolsa i.v. estaba cubierta en todo momento por una funda opaca para proteger el conjugado de la exposición a la luz. Después de la preparación, la bolsa i.v. se almacenó a 2-8 °C durante un máximo de 1 hora.
Antes de la administración del conjugado, los sujetos se trataron previamente con 100 mg de Erbitux® (cetuximab no conjugado) administrado por infusión i.v. durante 30 minutos como etapa de detección para evaluar posibles reacciones a la infusión. Durante la infusión, el sujeto se evaluó para determinar posibles reacciones a la infusión de Erbitux® de grado 3 o superior, lo cual no se produjo en ninguno de los pacientes tratados. Después de la infusión de Erbitux® de 100 mg, pero justo antes de la infusión del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX, se trató previamente a los sujetos con 50 mg de antihistamínico Benadryl (difenhidramina) y 10 mg del esteroide Decadron (Dexametasona) mediante administración i.v. para limitar el riesgo de hipersensibilidad a la infusión del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX.
A los pacientes se les administró por vía intravenosa una dosis única del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX a las dosis clínicas establecidas anteriormente en la tabla 8A. El conjugado se administró mediante infusión i.v. durante 2 horas el día 1. La bolsa de infusión intravenosa (i.v.) se cubrió durante la administración con una funda opaca para proteger el conjugado de la exposición a la luz. Cualquier exposición a la luz se limitó a menos de 5 minutos. Si el flujo del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX durante la infusión de la bolsa de infusión i.v. se detenía durante más de 5 minutos, el tubo y el filtro se protegían de la exposición a la luz mediante una cubierta opaca, tal como una lámina de aluminio.
Para inducir la fotoinmunoterapia (PIT), se realizó una aplicación de luz con una luz que tenía una longitud de onda de 690 nm a las 24 horas ± 3 horas (día 2) después de la administración del conjugado. Se administró luz de 690 nm al tumor a través de fibras de excitación hacia adelante con microlente de fibra de vidrio de 400 micras para la iluminación de la superficie de tumores que tenían menos de 10 mm de grosor, o a través de fibras difusoras cilíndricas colocadas en el tumor para tumores que tenían más de 10 mm de grosor o para tumores subcutáneos. El tratamiento con luz se fijó a una baja fluencia de 50 J/cm2 para iluminación superficial o 100 J/cm de longitud de fibra para iluminación intersticial (a una tasa de fluencia de 150 mW/cm2 para iluminación superficial y 400 mW/cm de longitud de fibra para iluminación intersticial).
Para el tratamiento de luz superficial con microlentes, el tejido normal ubicado 0,5-1,0 cm alrededor de la periferia del tumor también se incluyó en el campo de tratamiento con luz para alcanzar la enfermedad infiltrante microscópica en el margen del tumor. Todos los demás tejidos normales se cubrieron con toallas quirúrgicas, esponjas quirúrgicas húmedas o algodonoides para evitar que la luz reflejada de 690 nm activara potencialmente el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX en tejidos cutáneos normales, para reducir el riesgo de edema, ulceración o necrosis del tejido normal. En la cavidad bucal, faringe y laringe, todos los tejidos que no debían tratarse se cubrieron con esponjas quirúrgicas húmedas o algodonoides para evitar que la luz reflejada activara el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX que pudiera estar presente en la mucosa. Si se trató la laringe, toda la vía aérea laríngea se protegió de la exposición a la luz utilizando esponjas quirúrgicas húmedas. La fibra de microlente se conectó a la consola láser según las instrucciones del fabricante. La iluminación de la sala de tratamiento o del quirófano era la iluminación convencional de la sala superior, sin lámparas quirúrgicas de alta intensidad encendidas en la sala. En todo momento, se cumplieron las precauciones de láser médico de clase IV.
Para la implantación de difusores cilíndricos directamente en tumores, los catéteres de braquiterapia de 17 Fr transparentes Best se colocaron en el tumor con una separación de 1,8 /- 0,2 cm para iluminar uniformemente todo el volumen del tumor más un margen de al menos 0,5 cm de tejido normal alrededor del tumor. Se utilizaron técnicas convencionales para colocar catéteres de braquiterapia, incluida la guía por ultrasonido (US, del inglés "ultrasound") o tomografía computarizada (CT) basada en métodos radiológicos intervencionistas. En algunos casos, se empleó una rejilla de braquiterapia para colocar las fibras separadas 1,8 cm y paralelas entre sí en el campo de tratamiento. La colocación de los catéteres se confirmó mediante radiografía lateral, US o CT. Después, las fibras difusoras cilíndricas se conectaron a la consola láser de 690 nm, según las instrucciones del fabricante. Después de asegurar la salida de luz adecuada de cada difusor cilíndrico, las fibras difusoras cilíndricas de longitud previamente determinada (1,0, 2,0, 3,0 o 4,0 cm de longitud) dependiendo del diámetro del tumor, se colocaron por el catéter hasta su punta y se aseguraron en su lugar al catéter externamente con cinta quirúrgica. La iluminación de la sala de tratamiento o del quirófano era la iluminación convencional de la sala superior, sin lámparas quirúrgicas de alta intensidad encendidas en la sala. En todo momento, se cumplieron las precauciones de láser médico de clase IV. Ninguno de los pacientes mostró efectos adversos a la infusión y no refirió ningún dolor. No se detectó fotosensibilidad de la piel a la luz ambiental.
2. Respuesta y Farmacocinética
Se evaluó la respuesta tumoral en pacientes con cáncer de cabeza y cuello tratados con una sola administración de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX seguida de irradiación para inducir fotoinmunoterapia (PIT). La respuesta del tumor se evaluó según los criterios RECIST (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors) como se describe en las pautas revisadas de la versión 1.1 (RECIST 1.1, véase Eisenhauer et al. (2009) European Journal of Cancer, 45:228-247). Se determinó que una respuesta era una "respuesta completa" (CR) si había una desaparición de todas las lesiones diana y cualquier ganglio linfático patológico (ya sea diana o no diana) se reducía en el eje corto a < 10 mm. Se determinó que una respuesta era una "respuesta parcial" (PR) si había una disminución de al menos un 30 % en la suma del diámetro de las lesiones diana (por ejemplo, una reducción de al menos un 30 % en el crecimiento del tumor), tomando como referencia la suma inicial de los diámetros de las lesiones diana antes del tratamiento. La "tasa de respuesta objetiva" (ORR) es el porcentaje de sujetos en los que se observó una respuesta CR o PR.
La respuesta tumoral se observó a los cuatro días con evidencia de necrosis tumoral. Todos los pacientes de las tres cohortes mostraron una respuesta parcial o completa al tratamiento con PIT.
Para examinar la exposición de cetuximab en la sangre de la dosis única administrada más baja del conjugado de cetuximab-IRDye 700Dx, se recogieron muestras de sangre de cada paciente y se sometieron a análisis farmacocinéticos. La exposición de cetuximab-IRDye 700DX en sujetos humanos se determinó mediante estudios bioanalíticos utilizando métodos validados por Good Laboratory Practic que detectan específicamente cetuximab-IRDye 700DX en suero humano. La concentración sérica frente al tiempo se analizó mediante un modelo no compartimental con eliminación lineal. El área bajo la curva (AUC) a las 24 horas (AUC0-24) describió la cantidad total de exposición al fármaco en la sangre humana desde la infusión hasta el momento de la actividad farmacológica a las 24 h posteriores a la infusión del fármaco, que es cuando el fármaco se activa en el tumor para inducir la destrucción del cáncer de forma localizada.
Un sumario de las variables farmacocinéticas del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX en la cohorte 1 (4 mg/kg; 160 mg/m2 de dosis), la cohorte 2 (8 mg/kg; 320 mg/m2 de dosis) y la cohorte 3 (16 mg/kg; 640 mg/m2 de dosis) se presenta en la tabla 9. El AUC0-24 medio es la exposición relevante para cetuximab-IR700, ya que la actividad farmacológica se activa solamente a través de la irradiación de luz, que se produce 24 horas después de la dosificación de cetuximab-IR700.
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La tabla 9A resume la exposición de Erbitux® en función de dosis únicas como se informó en Fracasso et al. (2007) Clin Cancer Res, 13(3), 986-993 (véase la tabla 3 en el mismo). La pauta posológica aprobada por la FDA para Erbitux® en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello es una infusión inicial de 400 mg/m2 seguida de 250 mg/m2 de infusiones semanales. Basándose en las exposiciones reportadas en Fracasso et al., la exposición para un tratamiento de 1 mes basado en la pauta posológica aprobada por la FDA para el cáncer de cabeza y cuello se extrapoló y también se enumera en la tabla 9A.
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Tal como se muestra en la tabla 9A, el valor de AUC0-~ para Erbitux® a las dosis de 400 mg/m2 y los 250 mg/m2 se informa que es de aproximadamente 24.620 |jg/ml*h y 11.812 |jg/ml*h, respectivamente, y se prevé que sea de aproximadamente 60.056 jg/ml*h después de la infusión según la pauta posológica aprobada por la FDA. En cambio, la exposición de cetuximab-IRDye 700DX tras la administración según la pauta posológica anterior descrita en este ejemplo es mucho menor. Los resultados muestran que el AUC0-24 medio, incluso a la dosis más alta utilizada en el estudio actual (640 mg/m2), fue aproximadamente el 15 % del AUC para 400 mg/m2 de Erbitux® (3.690 frente a 24.740 |jg/ml*h, respectivamente). Por tanto, estos resultados demuestran que la dosis única del conjugado cetuximab-IRDye 700Dx dio como resultado una exposición de cetuximab que fue mucho más baja que la exposición notificada observada con una dosis única a las dosis terapéuticas más altas de Erbitux®.
Además, la dosis única de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX administrada en este estudio fue mucho más baja que la dosis de cetuximab que se ha aprobado por la FDA para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. Por ejemplo, la dosis aprobada de Erbitux® para tratar el cáncer de cabeza y cuello es una dosis inicial de 400 mg/m2 seguida de la administración semanal de 250 mg/m2, y el AUC0-24 medio, incluso a la dosis más alta utilizada en el estudio actual (640 mg/m2), fue aproximadamente el 6 % del AUC extrapolada del tratamiento de 1 mes con Erbitux® según la pauta posológica aprobada por la FDA (3.690 frente a 60.056 jg/ml*h, respectivamente).
Los resultados mostraron que incluso con esta exposición reducida, el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX provocó una respuesta tumoral rápida y eficaz tras la activación con luz 24 h después de la infusión, en todos los pacientes del estudio. Por tanto, a pesar de la menor exposición, los resultados demostraron que un tratamiento de dosis única con el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX seguido de irradiación daba como resultado una respuesta tumoral rápida y fuerte.
3. Ensayo de fotoinmunoterapia (PIT) con administración repetida de cetuximab-IRDye 700DX
Se prueba un régimen de tratamiento para determinar la seguridad y la eficacia del tratamiento repetido con la administración del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX seguida de fotoinmunoterapia (PIT). Se incluyen en el estudio hasta veinte (20) pacientes adultos, hombres y mujeres, que tengan carcinoma escamoso recurrente confirmado de cabeza y cuello que no se puedan tratar de manera satisfactoria con cirugía, radiación o quimioterapia con platino. Los pacientes incluidos han recibido quimioterapia sistémica previa basada en platino a menos que esté contraindicado, tienen una esperanza de vida de más de 6 meses y tienen una puntuación de resultados de Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0 a 2.
A pacientes seleccionados se les administra una dosis única de 640 mg/m2 de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX mediante infusión i.v. durante 2 horas el día 1 del comienzo del tratamiento. Para inducir la fotoinmunoterapia (PIT), se realizó una aplicación de luz con una luz que tenía una longitud de onda de 690 nm a las 24 horas ± 3 horas (día 2) después de la administración del conjugado, a una fluencia de 50 J/cm2 para iluminación superficial o 100 J/cm de longitud de fibra para iluminación intersticial. Las observaciones de seguimiento se realizan 1 semana, 2 semanas y 1 mes después del tratamiento inicial (tratamiento 1). Para el seguimiento a largo plazo, las observaciones se realizan cada 3 meses durante 2 años después del tratamiento 1. Los pacientes con tumor residual restante cuatro (4) semanas después del tratamiento 1 reciben el tratamiento 2, con la misma dosis y pauta de PIT. Los pacientes con tumor residual restante cuatro (4) semanas después del tratamiento 2 reciben un tratamiento 3 adicional, manteniendo la misma dosis y pauta de PIT. Los pacientes con tumor residual restante cuatro (4) semanas después del tratamiento 3 reciben un tratamiento 4 adicional, manteniendo la misma dosis y pauta de PIT, hasta un total de cuatro (4) tratamientos.
El criterio de valoración principal del estudio es la seguridad asociada con hasta cuatro (4) tratamientos repetidos. Los criterios de valoración secundarios incluyen la evaluación de los parámetros farmacocinéticos del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX, la evaluación de la respuesta tumoral utilizando los criterios RECIST 1.1 1 mes después del último tratamiento mediante barrido por tomografía computarizada (CT) y/o tomografía por emisión de positrones (PET), la evaluación de los resultados a largo plazo para la supervivencia general (OS) y la supervivencia sin progresión (PFS), y la evaluación del desarrollo de anticuerpos antifármacos y anticuerpos neutralizantes.
Ejemplo 3: Ensayos de comparación de la concentración de conjugado para alterar la actividad de la proteína de la superficie celular frente a mediar la muerte destrucción por fotoinmunoterapia in vitro
Se emplearon ensayos in vitro para comparar el efecto de un conjugado de IRDye 700DX-anticuerpo tras la unión a su antígeno proteico de la superficie celular en ensayos funcionales de actividad proteica y en ensayos de fotoinmunoterapia (PIT). Los ensayos se realizaron utilizando el conjugado de cetuximab-IRDye 700Dx ilustrativo, que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de la proteína de la superficie celular a través del anticuerpo anti-EGFR cetuximab. Hay ensayos in vitro similares en el nivel de un experto en la materia para evaluar otros conjugados de IRDye 700DX y molécula de direccionamiento, por ejemplo, conjugados de IRDye 700DX-anticuerpo, utilizando líneas celulares que expresan la proteína a la que se une la molécula de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpo) y/o ensayos que evalúan una actividad funcional inducida tras dicha unión.
A. Ensayo de fosforilación in vitro para evaluar la actividad funcional al unirse a EGFR
Para evaluar los efectos del conjugado de cetuximab-IRDye 700Dx en la regulación de la actividad funcional de EGFR, se realizó un ensayo de fosforilación. EGF es un ligando natural para EGFR que induce la fosforilación de EGFR al unirse. Se sembraron células A431 (ATCC CRL 1555) en pocillos de una placa de 96 pocillos y después se incubaron previamente durante 5 minutos con cantidades crecientes de cetuximab o conjugado de cetuximab-IRDye 700DX. A continuación, las células se estimularon con 100 ng/ml de ligando EGF durante 10 min para inducir la fosforilación de EGFR. Las células se fijaron en la placa de ensayo con formaldehído y se incubaron con un anticuerpo específico anti-fosfo-EGFR. Después del lavado, la fosforilación de EGFR se midió mediante cuantificación colorimétrica tras la adición de un anticuerpo anti-fosfo-EFGR conjugado con HRP en un ensayo ELISA. Se añadió solución de parada y se midió la densidad óptica (DO) de los pocillos en un lector de microplacas ajustado a 450 nm. Como control positivo, las células se estimularon con EGF en ausencia cualquiera de cetuximab o conjugado de cetuximab-IRDye 700DX (denominadas "NT"), y la fosforilación (como indica la DO) inducida en el control positivo se fijó en 100 %. El porcentaje relativo (%) de fosforilación de EGFR se determinó como porcentaje de la fosforilación del control positivo.
Como se muestra en la figura 1, cetuximab y el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX previnieron la fosforilación inducida por EGF con la misma potencia. El efecto inhibidor de cetuximab y cetuximab-IRDye 700DX fue dependiente de la dosis, con una CI50 de 694 y 570 ng/ml, respectivamente. Por tanto, los resultados del ensayo ELISA in-Cell mostraron que, como cetuximab, el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX también puede unirse a EGFR en el sitio de unión de EGF o cerca de él para evitar la estimulación y fosforilación de EGFR por parte de EGF. Debido a que la unión de anticuerpos es rápida y casi irreversible, es probable que la curva de potencia para la prevención de la fosforilación refleje fielmente la ocupación del receptor por parte del anticuerpo.
B. Ensayos de fotoinmunoterapia (PIT) in vitro
En comparación con la fosforilación inducida por EGFR, se realizaron experimentos de PIT in vitro para el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX. Las células A431 se incubaron con concentraciones crecientes de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX durante 2 horas a 37 °C. Después, se aplicaron 8 J/cm2 de luz de 690 nm para inducir PIT. Para monitorizar la progresión de la muerte celular después del tratamiento con luz, el medio que contenía el conjugado se reemplazó por medio nuevo que contenía CellTox Green (Promega), un colorante que informa de la muerte celular en función de la integridad comprometida de la membrana celular. Se observó un aumento dependiente del tiempo en la muerte celular durante 24 horas. Como control, la muerte celular también se evaluó en células en las que no se añadió el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX (denominadas "NT").
Como se muestra en la figura 2, el grado de muerte celular era dependiente de la dosis. La mitad de la muerte celular máxima (CE50) resultante de PIT con el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX fue de 37,6 ng/ml. Por tanto, este resultado mostró que la concentración de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX necesaria para inducir la mitad de la muerte celular máxima mediante PIT era más de 15 veces menor que la concentración necesaria para bloquear la mitad de la fosforilación en el experimento ELISA descrito anteriormente (570 ng/ml). Además, la concentración del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX que dio lugar al 90 % de muerte celular (257 ng/ml) dio como resultado solamente una reducción de aproximadamente el 25 % de la fosforilación.
Se realizaron experimentos similares con células BxPC3, en los que se comparó la PIT inducida por dosis de titulación crecientes del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX a dos dosis de luz más altas (16 J/cm2 y 32 J/cm2). Como se muestra en la figura 3, los resultados también mostraron la potencia del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX para inducir PIT incluso a concentraciones muy bajas. En particular, los resultados mostraron que la CE50 resultante de PIT con el conjugado de cetuximab-IRDye 700DX fue incluso menor, lo que probablemente se deba a que se aplicaron dosis de luz más altas. Por ejemplo, el aumento de la dosis de luz de 16 J/cm2 a 32 J/cm2 dio como resultado una disminución de la mitad de la muerte celular máxima (CE50) de 22,6 a 13,7 ng/ml. Por tanto, los resultados mostraron que las dosis de luz más altas pueden necesitar concentraciones incluso más bajas de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX (eso significa una menor ocupación de receptor) para el mismo grado de destrucción celular.
Ejemplo 4 (referencia): Síntesis y evaluación de un conjugado con doble marcador de panitumunab-IRDye 700DX-Alexa-488
Se preparó un conjugado con doble marcador en el que el anticuerpo ilustrativo panitumunab se conjugó tanto con IRDye 700DX como con Alexa Fluor 488.
A. Materiales
El derivado de silicio-ftalocianina, soluble en agua, éster de NHS IRDye 700DX (IR-700; C74H96N12Na4O27S6Si3, peso molecular de 1954,22), se obtuvo de LI-COR Bioscience (Lincoln, Ne ). El ácido carboxílico Alexa Fluor 488, el éster de succinimidilo Alexa Fluor 488-NHS se obtuvieron de Life Technologies (Carlsbad, CA). Panitumumab, un mAb IgG2 totalmente humanizado dirigido contra el receptor 1 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER1) se adquirió de Amgen (Thousand Oaks, CA). Todos los demás productos químicos utilizados fueron de grado reactivo.
B. Síntesis de panitumunab-IRDye 700DX-Alexa-488 (Pan-IRDye 700DX-Alexa-488)
Se incubó panitumumab (2 mg, 13,6 nmol) en 0,1 mol/l de Na2HPO4 (pH 8,5) con 7 |jl de una solución de Alexa Fluor 488-NHS (35 nmol) con DMSO 5 mM durante 45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, después de lo cual se añadió IR-700DX (66,8 jg, 35,0 nmol, 5 mmol/l en DMSO). Después de un tiempo adicional de incubación de 45 min a temperatura ambiente, se añadieron 15 j l de base Tris 100 mM para detener las reacciones de conjugación. El colorante extraño y otras impurezas de molécula pequeña se eliminaron mediante filtración e intercambio de tampón excesivo (30 volúmenes de reacción de HyCLone PBS pH=7,1 utilizando unidades de filtro centrífugo Amicon® ultra 15 (Merck Millipore Ltd, Billerica, MA)).
C. Caracterización del conjugado
El conjugado se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, del inglés "size exclusion chromatography") en una columna para SEC TSKgel G2000 SWxl, de 7,6 x 300 mm (TOSOH Biosciences, King of Prussia, PA) utilizando un sistema de HPLC Agilent 1100 equipado con un detector de matriz de diodos (DAD, del inglés "diode array detector") Agilent G1315A que monitoriza las longitudes de onda de 280, 488 y 690 nm, junto con un detector de fluorescencia (FLS) Agilent G1321A que monitoriza la longitud de onda de excitación a 488 nm y la longitud de onda de emisión a 505 nm.
La concentración de anticuerpos y la relación promedio de colorante a anticuerpo (DAR, del inglés "dye to antibody ratio") para ambos colorantes se determinaron utilizando el área de integración de unidades de absorbencia de 280, 488 y 690 nm para el pico de monómero de anticuerpo después de que se aplicaran los factores de corrección del valor del coeficiente de extinción apropiados según fuera necesario para cada colorante correspondiente. Se calculó que la DAR para los colorantes Alexa-488 e IRDye 700DX era 1,0 y 2,1, respectivamente. La estructura esquemática del conjugado de panitumumab-IRDye 700DXDX-Alexa-488 se muestra en la figura 4.
Los resultados de fluorescencia mostraron una fuerte señal de HPLC de Agilent, que se observó a 505 nm utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nm para el anticuerpo conjugado con Alexa Flour-488 en el tiempo de retención apropiado para una proteína IgG1 de 150.000 dalton. Así mismo, se observó a simple vista una fluorescencia verde visible característica del conjugado marcado Pan-IRDye 700DX-Alexa-488 utilizando luz de excitación tanto ambiental como de 365 nm (lámpara de mano).
D. Fotoinmunoterapia (PIT) utilizando anticuerpos conjugados con IRDye 700DX
Para evaluar si la fotoinmunoterapia con el anticuerpo conjugado con IRDye 700DX se vio afectada por la presencia de un colorante adicional conjugado con el mismo anticuerpo, se comparó la actividad de PIT del conjugado con doble marcador panitumunab-IRDye 700DX-Alexa-488 (Pan-IRDye 700DX-Alexa-488) con un fármaco de anticuerpo anti-EGFR humano panitumumab conjugado únicamente con IRDye 700DX (Pan-IRDye 700DX).
Se probó la eficacia de los dos conjugados para destruir células en un ensayo de PIT in vitro utilizando la línea de cáncer de páncreas BxPC3. Se sembraron BxPC3 en placas de pared blanca de 96 pocillos (4.000 células/pocillo) el día anterior al experimento. Se añadieron conjugados de anticuerpos a las células a una concentración de 10 jg/ml y se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Se aplicó luz de 690 nm mediante un diodo a una salida de potencia constante de 50 mW/cm2. El tiempo de iluminación se moduló para lograr las fluencias 4 J/cm2, 8 J/cm2 o 16 J/cm2. Como control, un grupo de células no se irradió con luz (0 J/cm2). Para monitorizar la progresión de la muerte celular después del tratamiento con luz, el medio que contenía el conjugado se reemplazó por medio nuevo que contenía CellTox Green (Promega), un colorante que informa de la muerte celular en función de la integridad comprometida de la membrana celular. Se observó un aumento dependiente del tiempo en la muerte celular durante 24 horas. Como se muestra en la figura 5A (Pan-IRDye 700DX) o en la figura 5B (Pan-IRDye 700DX-Alexa-488), ambos conjugados dieron lugar a una destrucción celular casi completa con 16 J/cm2 de luz a 690 nm. Por otro lado, la sensibilidad de los dos conjugados a la luz para inducir la destrucción fue casi idéntica. Una dosis de luz de 8 J/cm2 a 690 nm dio como resultado un 74 % y 73 % de destrucción mediante panitumumab monomarcado (Pan-IRDye 700DX) y doblemente marcado (Pan-IRDye 700DX-Alexa-488), respectivamente, y una dosis de luz de 4 J/cm2 a 690 nm fue solamente marginalmente eficaz para ambos conjugados. Por tanto, los resultados mostraron que la presencia del colorante Alexa488 no interfirió con la capacidad de un conjugado de panitumumab-IRDye 700DX para inducir la destrucción celular dependiente de la luz de 690 nm.
Ejemplo 5: Evaluación de la actividad de destrucción celular y composición de varios conjugados de anticuerpo e IRDye 700DX
Se realizaron estudios para evaluar si los conjugados de anticuerpo-IRDye 700DX expuestos previamente a diferentes longitudes de onda de luz afectan de manera diferente a la formación de agregados solubles. Dos anticuerpos diferentes de ratón anti-PD-L1 humana (n.° de catálogo: 329728, Biolegend, San Diego, CA) y anti-EGFR (cetuximab; Myoderm Estados Unidos, Norristown, PA) - se marcaron con IRDye 700DX y se evaluaron para analizar si la exposición previa a diferentes longitudes de onda de luz afectaba la formación de agregados solubles. A. Conjugación de anticuerpos
Ambos anticuerpos se conjugaron con IRDye 700DX utilizando el mismo enfoque. Para todos los conjugados descritos a continuación, el protocolo general utilizado para conjugar los anticuerpos fue similar al de la conjugación a mayor escala con cetuximab-IRDye 700DX descrito en el ejemplo 1. Se realizaron modificaciones al protocolo para volúmenes de reacción a menor escala que utilizaron 3 mg o menos de proteína.
La solución de anticuerpo (ya sea anticuerpo anti-PD-L1 o anticuerpo anti-EGFR) se intercambió primero con solución salina tamponada con fosfato pH 7 utilizando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 30.000 dalton, a continuación, el pH de la solución de anticuerpo se ajustó a un pH de 8,5 con la adición de tampón fosfato a pH = 9. Alícuotas sólidas congeladas de éster de NHS IRDye 700DX (N.° de catálogo 929-70011; Li-COR, Lincoln, Ne ) se descongelaron a temperatura ambiente, a continuación se disolvieron con DMSO para lograr una concentración de 10 mg/ml. En un entorno oscuro, a continuación, se añadió el éster de NHS IR700 solubilizado a la solución de anticuerpo en una relación molar de 4 (éster de NHS IR700) a 1 (anticuerpo). La reacción de conjugación se desarrolló a 25 °C durante 2 horas protegida de la luz. Se añadió glicina (pH 8,2) hasta una concentración final de 10 mM durante 15 minutos para desactivar la reacción. La solución de conjugado de anticuerpo se intercambió después con un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 30.000 dalton con 24 ml de PBS pH 7 para eliminar el colorante libre, la glicina y la glicina-IR700, y ajustar el pH de la solución de nuevo a pH 7. Los conjugados de anticuerpos se analizaron con cromatografía de exclusión por tamaño para evaluar la concentración de anticuerpo-IR700, la pureza del monómero, el % de agregado soluble y la proporción de colorante a anticuerpo (DAR).
B. Efectos de la exposición previa a la luz en la composición del conjugado de IRDye 700DX
Se analizó la formación de agregados solubles en el conjugado de anticuerpo-IRDye 700DX en cuatro condiciones diferentes con al menos 30 pl de conjugado a una concentración de conjugado de anticuerpo de 850 pg/ml. Las cuatro condiciones de tratamiento fueron las siguientes: (1) conjugado de anticuerpo-IRDye 700DX almacenado a 4 °C protegido de la luz (control "4 °C"); (2) conjugado de anticuerpo-IRDye 700DX colocado en un tubo de vidrio transparente de HPLC bajo una lámpara halógena (N.° de catálogo: PL-800, Dolan-Jenner, Boxborough, MA) a 2500 lux durante 24 horas ("luz blanca"); (3) conjugado de anticuerpo-IRDye 700DX colocado en un tubo de vidrio transparente de HPLC envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la exposición a la luz bajo una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 horas ("sin luz", utilizado para controlar los efectos del calentamiento térmico en la formación de agregados); y (4) conjugado de anticuerpo-IRDye 700DX colocado en un tubo de vidrio transparente de HPLC y expuesto a una lámpara LED verde (N.° de catálogo: Green-ECS GP19 EcoSmart) a 2500 lux durante 24 horas ("luz verde"). Después de 24 horas bajo cada condición de tratamiento, se evaluaron la pureza del monómero y la formación de agregados solubles mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
Los resultados para el conjugado de anti-PD-L1-IRDye 700DX se muestran en la tabla 10. Como se muestra, el conjugado de anti-PD-L1-IRDye 700DX (DAR ~ 3) que se almacenó a 4 °C presentó una baja formación de agregados solubles (<1,5 %) y una alta pureza de monómeros (>96 %) medida por la absorbencia a 280 nm y la absorbencia a 690 nm. La exposición del conjugado de anti-PD-L1-IRDye 700DX a 2500 lux de luz blanca de una lámpara halógena dio como resultado un aumento significativo en la formación de agregados solubles (~30 %) y una disminución simultánea en la pureza del monómero (~65 %) según lo medido mediante la absorbencia a 280 nm y la absorbencia a 690 nm. El anti-PD-Ll-IRDye 700DX expuesto a los efectos de calentamiento térmico de la luz blanca de 2500 lux de una lámpara halógena, pero protegido de la iluminación con papel de aluminio, no indujo ningún aumento en la formación de agregados solubles en comparación con el de la muestra de control a 4 °C. El conjugado de anti-PD-Ll-IRDye 700DX expuesto a la luz de una lámpara LED verde dio como resultado un aumento muy pequeño en la formación de agregados solubles (~5 %), que fue una cantidad significativamente menor de formación de agregados solubles que la del anti-PD-L1-IRDye 700DX expuesto a la luz blanca.
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Los resultados del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX se muestran en la tabla 11. Los conjugados de cetuximab-IRDye 700DX (DAR ~ 3) que se almacenaron a 4 °C no tuvieron ninguna formación de agregados solubles detectable (~0 %) ni una alta pureza de monómeros (~100 %) medida a una absorbencia a 280 nm y absorbencia a 690 nm. La exposición del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX a luz blanca de 2500 lux de una lámpara halógena dio como resultado un aumento significativo en la formación de agregados solubles (~40 %) y una disminución simultánea en la pureza del monómero (~55 %) según lo medido mediante la absorbencia a 280 nm y la absorbencia a 690 nm. El cetuximab-IRDye 700DX expuesto a los efectos de calentamiento térmico de una luz blanca de 2500 lux de una lámpara halógena, pero protegido de la iluminación con papel de aluminio, no indujo ningún aumento en la formación de agregados solubles en comparación con el de la muestra de control a 4 °C. La exposición del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX a la luz de una lámpara LED verde dio como resultado un aumento menor en la formación de agregados solubles (~4 %), que fue una cantidad significativamente menor de formación de agregados solubles que la del cetuximab-IRDye 700Dx expuesto a luz blanca.
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Ejemplo 6: Duración de la exposición previa de la iluminación fluorescente blanca frente a la iluminación LED verde y su efecto sobre la formación de agregados solubles de cetuximab-IRDye 700DX y la potencia de la PIT
Los siguientes estudios se realizaron para evaluar si los conjugados de cetuximab-IRDye 700DX expuestos previamente a diferentes longitudes de onda de luz y para diferentes duraciones de exposición afectaban de manera diferente la formación de agregados solubles y la actividad farmacológica.
Se conjugó cetuximab-IRDye 700DX como se describe en el ejemplo 1. Se evaluaron las siguientes 14 condiciones diferentes: la muestra se expuso a una luz blanca fluorescente de 500 lux a 25 °C para diferentes duraciones de exposición a la luz a las 24 horas, 12 horas, 6 horas, 3 horas, 1,5 horas y 45 minutos; la muestra se expuso a 500 lux de iluminación LED verde (N.° de catálogo: Green-ECS GP19 EcoSmart) a 25 °C para diferentes duraciones de exposición a la luz a las 24 horas, 12 horas, 6 horas, 3 horas, 1,5 horas y 45 minutos; la muestra no se expuso a luz a 25 °C; y la muestra no se expuso a luz a 4 °C. La duración de la exposición a la luz durante 24 horas, 12 horas, 6 horas, 3 horas, 1,5 horas y 45 minutos corresponden a 12.000 lux-horas, 6.000 lux-horas, 3.000 lux-horas, 1.500 lux-horas, 750 lux-horas o 375 lux-horas, respectivamente. Para cada condición, se colocaron 30 pl de conjugado en un frasco transparente de HPLC por muestra a una concentración de conjugado de anticuerpo de 2 mg/ml y la muestra se expuso a cada condición de luz.
La composición del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX después de la exposición a luz blanca o luz verde durante diferentes períodos de tiempo se evaluó mediante la monitorización de la formación de agregados solubles y la actividad destructora de la PIT.
1. Formación de agregados
El cetuximab-IRDye 700DX se analizó con cromatografía de exclusión por tamaño, HPLC, para evaluar la pureza del monómero y la formación de agregados solubles. El porcentaje de formación de agregados solubles se midió en función de lux-horas de exposición de cetuximab-IRDye 700DX a la luz blanca, luz verde o sin luz.
Como se muestra en la figura 6A, la duración de la exposición de cetuximab-IRDye 700DX a luz blanca fluorescente de 500 lux tuvo un efecto directo en la formación de agregados solubles. La exposición de cetuximab-IRDye 700DX a luz blanca fluorescente dio como resultado un rápido aumento en la formación de agregados solubles con la presencia de una formación de agregados solubles superior al 5,0 % observada incluso después de solo 375 luxhoras (45 minutos a 500 lux) de exposición a luz blanca, que aumentó aún más con el aumento de la duración de la exposición a la luz blanca fluorescente. La exposición a la luz verde de cetuximab-IRDye 700DX también aumentó ligeramente la formación de agregados solubles, aunque a un ritmo mucho más lento que el de la luz blanca; el porcentaje de agregados formados incluso después de la exposición a 12.000 lux-horas (24 horas a 500 lux) de luz verde no fue más del 5,0 %. Los resultados mostraron que hubo una mayor formación de agregados solubles con cetuximab-IRDye 700DX con un aumento en el tiempo de exposición a la luz blanca que a la luz verde. Se observó menos del 1 % de formación de agregados solubles en muestras incubadas a 4 °C o 25 °C cuando se protegieron de cualquier exposición a la luz.
2. Destrucción con PIT
Para evaluar la actividad destructora de la PIT mediante el cetuximab-IRDye 700DX expuesto previamente a las diversas condiciones de luz, se incubaron células BxPC3 (n.° CRL-1687, ATCC, Manassas VA) durante una hora a 4 °C con o sin cetuximab-IRDye 700DX 1 pg/ml en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo) y después se lavaron una vez con medio de cultivo completo para eliminar el cetuximab-IRDye 700DX no unido. A continuación, las células se iluminaron con un láser de 690 nm a una dosis de luz de 32 J/cm2 o se protegieron de la luz (0 J/cm2).
El efecto de diferentes regímenes de tratamiento sobre la muerte celular se midió utilizando la tinción fluorescente, CellTox green (N.° de Cat: G8731, Promega, Madison, WI). CellTox green es un colorante fluorescente no permeable que presenta una mayor fluorescencia al unirse al ADN. Por lo tanto, solo las células que tienen membranas plasmáticas comprometidas presenten una fuerte tinción con CellTox green. Después del tratamiento con luz, todas las células se incubaron con reactivo CellTox green 1x diluido en RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo). Los pocillos que no incluían ninguna célula también se incubaron con reactivo CellTox green 1x diluido en medio de cultivo completo para servir como pocillos de efecto de fondo durante la detección de la señal fluorescente. La señal de fluorescencia de CellTox green se midió a las 24 horas después del tratamiento con luz utilizando un lector de placas de fluorescencia. A continuación, las células se lisaron con detergente, se incubaron a 37 °C durante 30 minutos, y la señal de fluorescencia de CellTox green se midió de nuevo después de la lisis. El porcentaje de células muertas se calculó tomando la relación entre la señal de CellTox green sustraída del fondo (CellTox green 1x en medio de cultivo completo sin células) por pocillo antes y después de la lisis y multiplicando la proporción por 100.
Como se muestra en la figura 6B, no se observó ningún efecto sobre la muerte celular para todas las muestras expuestas a 0 J/cm2 durante el tratamiento de PIT, lo que indica que, a pesar del aumento de agregados solubles después de la exposición previa a luz blanca, los agregados solubles no eran citotóxicos en ausencia de irradiación de luz. En cambio, se observó destrucción celular para las muestras que posteriormente se irradiaron con un láser de 690 nm a una dosis de luz de 32 J/cm.2, aunque la extensión de la destrucción celular se redujo de manera sustancial por el cetuximab-IRDye 700DX expuesto a una mayor duración de la luz blanca. Como se muestra, el cetuximab-IRDye 700DX expuesto previamente a 3000 lux-horas (500 lux durante 6 horas) o más de luz blanca fluorescente mostró un efecto inferior al 90 % o inferior en la actividad de la PIT. Sin embargo, el cetuximab-IRDye 700DX expuesto a todas las dosis de lux-hora de luz verde evaluadas no produjo un efecto en la potencia de la PIT, lo que indica que la exposición previa a luz verde no tuvo un impacto sustancial en la actividad destructora activada por la luz.
El efecto de la formación de agregados en la actividad de la PIT se muestra en la figura 6C. Como se muestra, la potencia de la PIT (porcentaje de células muertas) para todos los regímenes de tratamiento con cetuximab-IR700 para evaluar la exposición a la luz blanca y la luz verde se representó como una función del porcentaje de agregado soluble medido para cada muestra correspondiente. Los resultados mostraron que una formación de agregados solubles superior al 15 % con cetuximab-IRDye 700DX da como resultado una disminución significativa en la potencia de la PIT.
Ejemplo 7: Efecto de la conjugación indirecta con colorante de ftalocianina sobre la destrucción de la PIT y la especificidad de la PIT
Se realizaron los siguientes estudios para evaluar si los anticuerpos que se unen directamente a las moléculas de la superficie celular requieren conjugación directa con un fotosensibilizador de ftalocianina, tal como IRDye 700DX, para mediar en la actividad destructora de la PIT.
A. Conjugación con IR700 de anticuerpo secundario contra anticuerpo dirigido a células
En lugar de conjugar directamente un anticuerpo de direccionamiento contra una molécula de la superficie celular (por ejemplo, en una célula cancerosa) con IR700, se conjugó un anticuerpo secundario anti-IgG humana que se unía al anticuerpo de direccionamiento con IR700. De manera específica, el anticuerpo específico de burro del fragmento Fcy anti-IgG humana (DxHu) AffiniPure, (Número de catálogo: 709-005-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) se marcó con IRDye 700DX para evaluar si el marcaje no covalente de anticuerpos primarios con anticuerpo secundario-IRDye 700DX podría utilizarse en la destrucción mediada por la PIT. El protocolo utilizado para conjugar el anticuerpo DxHu con IRDye 700DX fue de manera sustancial el mismo que el protocolo para la conjugación de anticuerpos utilizado en el ejemplo 5.
La destrucción por PIT de células BxPC3 se evaluó de forma similar al método descrito en el ejemplo 6, excepto que las células se incubaron primero durante una hora a 4 °C con o sin anticuerpo anti-EGFR, cetuximab (Myoderm USA, Norristown, PA) en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo). A continuación, las células se lavaron una vez con medio de cultivo completo, se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con o sin anticuerpo secundario conjugado con IRDye 700DX (DxHu IRDye 700DX) diluido con medio de cultivo completo y después se lavaron una vez con medio de cultivo completo. Como control, las células BxPC3 se incubaron con cetuximab-IRDye 700DX en el que el cetuximab se conjugó directamente con IRDye 700DX. Para inducir la destrucción celular, a continuación, las células se iluminaron con un láser de 690 nm a una dosis de luz de 16 J/cm.2 o se protegieron de la luz ("sin luz"). La muerte celular se evaluó como se describe en el ejemplo 6 utilizando CellTox green.
Como se muestra en la figura 7, las células BxPC3 que se marcaron de manera secuencial con cetuximab y el anticuerpo secundario de burro antihumano-IRDye 700DX y se trataron con luz presentaron ~90 % de muerte celular. El mismo tratamiento con el anticuerpo primario y secundario no dio como resultado la muerte celular cuando las células no se expusieron al tratamiento con luz de 690 nm. La iluminación con luz de las células tratadas solo con el anticuerpo secundario no condujo a la muerte celular porque el anticuerpo secundario DxHu-IRDye 700DX no se une directamente a las células en ausencia de incubación previa con un anticuerpo primario de origen humano dirigido a un antígeno de la superficie celular. El grado de destrucción celular inducida por la exposición secuencial a los anticuerpos fue incluso ligeramente mayor que en las células BxPC3 incubadas con cetuximab que se habían marcado directamente con IRDye 700DX. El tratamiento con luz de células BxPC3 tratadas solo con medio sin incubación con cetuximab o DxHu IRDye 700DX dio como resultado un nivel de muerte celular basal de ~10 %, que fue similar a la muerte celular de fondo en células que no fueron irradiadas con luz (tratamiento sin luz). Por tanto, los resultados mostraron que los anticuerpos que se unen directamente a las células cancerosas no requieren la conjugación directa de un fotosensibilizador de ftalocianina, tal como IRDye 700DX, para mediar la actividad de destrucción de la PIT. El marcaje indirecto de anticuerpos anticancerosos mediado por un IRDye 700DX conjugado con un anticuerpo secundario también puede inducir una actividad destructora de la PIT eficaz.
B. Conjugación con IR700 de estreptavidina monomérica contra un anticuerpo biotinilado dirigido a células En otro estudio, se examinó la actividad destructora de la PIT de células incubadas de manera secuencial con un anticuerpo anti-EGFR biotinilado (cetuximab biotinilado)-IRDye 700DX conjugado con estreptavidina monomérica. Asimismo, también se examinó el efecto de la exposición previa de estreptavidina monomérica-IR700 a la luz blanca sobre la actividad destructora de la PIT.
1. Conjugaciones
a. Conjugación de biotina con cetuximab
Para conjugar el anticuerpo anti-EGFR cetuximab con biotina, un volumen de 5 ml de anticuerpo anti-EGFR (cetuximab; Myoderm Estados Unidos, Norristown, PA) suministrado a una concentración de 2 mg/ml en PBS pH 7,2 se concentró a un volumen de 2 ml (5 mg/ml) utilizando un filtro centrífugo de corte de peso molecular de 30.000 Dalton (n.° de cat.: UFC903024, Merck-Millipore, Cork, IRL.) La solución se diluyó a 5 ml con Na2HPO4 100 mM (pH 8,9) hasta un volumen final de 5 ml y un pH de ~ 8,5.
Se utilizó EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina (sulfocussinimidil-6-[biotina-amido]hexanoato) para marcar el anticuerpo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (n.° de cat. 21327, ThermoScientific, Rockford, IL). De manera específica, una muestra de 2 mg de Sulfo-NHS-Biotina (SO3-ester de NHS-biotina, n.° de cat: 1854200, Thermo Scientific) se descongeló a temperatura ambiente, a continuación, se disolvió con agua desionizada (DI) para lograr una concentración de 10 mg/ml. Un volumen de 130 pl de SO3-biotina-éster de NHS solubilizado se añadió a la solución de anticuerpo de cetuximab en una relación molar de 20 (SO3-biotina-éster de NHS) a 1 (anticuerpo de cetuximab). La reacción de conjugación se desarrolló a 25 °C durante 2 horas protegida de la luz tras lo cual se añadió glicina en exceso para desactivar la reacción durante 15 minutos. La solución de conjugado de cetuximab y biotina se intercambió después con diez veces el volumen de conjugación equivalente con p Bs pH 7,2 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 30.000 dalton para eliminar el colorante libre, la glicina y el glicina-IRDye 700DX, y ajustar el pH de nuevo a pH 7,2.
El conjugado de cetuximab y biotina se analizó con cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC) para evaluar la pureza del cetuximab y biotina monomérica, el % de agregados solubles y los niveles de impurezas residuales del producto de reacción. La relación molar media de biotina a anticuerpo (bAr , del inglés "Biotin to Antibody Ratio") para el conjugado se determinó mediante el ensayo de cuantificación de biotina colorimétrica Pierce (N.° de cat.: 128005, Thermo Scientific, Rockford, IL) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los resultados se muestran en la tabla 12.
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b. Conjugación de estreptavidina monomérica a IR700
El protocolo general utilizado para conjugar la estreptavidina 2 monomérica genomanipulada (mSA2) (N.° de cat.: EBU001/2, Kerafast, Boston, MA) con IR700 fue de manera sustancial el mismo que el protocolo para la conjugación de anticuerpos descrito en el ejemplo 5, excepto que antes de la conjugación, la solución de mSA2 se intercambió primero con solución salina tamponada con fosfato pH 7 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 3.000 dalton. Para la conjugación, a continuación, se añadió el éster de NHS IR700 solubilizado a la solución de mSA2 en una relación molar de 2 (éster de NHS IR700) a 1 (estreptavidina monomérica). Después de la reacción de conjugación realizada de manera sustancial como se describe en el ejemplo 5, la solución de conjugado de estreptavidina monomérica se intercambió después con 24 ml de PBS pH 7 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 10.000 dalton para eliminar el colorante libre, la glicina y el glicina-IR700, y ajustar el pH de nuevo a pH 7.
2. Destrucción con PIT
Se incubó previamente cetuximab biotinilado con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX en una relación molar de 20 (estreptavidina monomérica-IRDye 700DX) a 1 (1 pg/ml de cetuximab biotinilado) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se incubaron células BxPC3 con medio RPMI complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo) que contenía 1 pg/ml de cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX o medio de cultivo completo solo durante una hora a 37 °C. A continuación, las células se lavaron una vez con medio de cultivo completo. Las células estaban protegidas de la luz (dosis de luz 0 J/cm2) o se iluminaron con un láser de 690 nm con diferentes dosimetrías de luz (2 J/cm2, 8 J/cm2, 32 J/cm2 o 64 J/cm2). La muerte celular se evaluó como se describe en el ejemplo 6 utilizando CellTox green.
Como se muestra en la figura 8 A, la actividad de destrucción de la PIT dependiente de la luz de las células BxPC3 con cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX (mSA IRDye 700DX) dependía de la dosis de luz. No se observó actividad destructora dependiente de la luz con células incubadas con medio de cultivo completo solo.
Para confirmar la especificidad del efecto, el efecto de cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX se evaluó en presencia de cetuximab no conjugado o estreptavidina monomérica no conjugada para evaluar si el efecto podía competir. En una condición, se incubaron previamente primero células BxPC3 con 100 pg/ml de cetuximab no conjugado o medio de cultivo completo solo durante una hora a 37 °C. A continuación, las células se lavaron una vez. A continuación, las células incubadas previamente con cetuximab no conjugado se incubaron con medio de cultivo completo que contenía 1 pg/ml de cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con 2 pg/ml de estreptavidina monomérica-IRDye 700DX. En otra condición, las células que se habían incubado previamente con medio de cultivo completo solo (pero no incubado previamente con cetuximab no conjugado) se incubaron con 1 pg/ml de cetuximab biotinilado que había formado complejo previamente en presencia de un exceso de 10 veces de estreptavidina monomérica no conjugada (formación de complejo realizada con 20 pg/ml de estreptavidina monomérica no conjugada y 2 pg/ml de estreptavidina monomérica-IRDye 700DX). Así mismo, las células que se habían incubado previamente con medio de cultivo celular (pero no incubado previamente con cetuximab no conjugado) se incubaron con 2 pg/ml de estreptavidina monomérica-IRDye 700DX solo o con medio de cultivo completo solo durante una hora a 37 °C. A continuación, las células se lavaron una vez con medio de cultivo completo.
Los resultados mostrados en la figura 8B demuestran que la destrucción mediada por la PIT con cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX (mSA IRDye 700DX) era específica de las células que tenían unido cetuximab asociado con IR700. No se observó destrucción mediante PIT dependiente de la luz cuando las células BxPC3 se expusieron previamente a 100 pg/ml de cetuximab no conjugado antes de la incubación con cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX. Los resultados también mostraron que la destrucción mediante PIT dependía de la asociación de la estreptavidina monomérica conjugada con IR700 y el anticuerpo biotinilado, ya que no se observó destrucción mediante PIT dependiente de la luz de las células BxPC3 incubadas con cetuximab biotinilado que formaba complejo con un exceso molar 10x de estreptavidina monomérica no conjugada sobre la estreptavidina monomérica-IRDye 700DX. Además, los resultados demostraron que no se observó destrucción mediante PIT dependiente de la luz de células BxPC3 en células incubadas con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX solo en ausencia de cetuximab biotinilado o en células BxPC3 incubadas en medio de cultivo solo.
3. Efectos de la exposición previa a la luz sobre la composición y la actividad
También se evaluó el efecto de la destrucción indirecta de células con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX que habían sido expuestas a diferentes tipos de luz. Se añadieron treinta microlitros de conjugado de estreptavidina monomérica-IRDye 700DX (DAR 1.35) por frasco transparente de HPLC a una concentración de conjugado de estreptavidina monomérica de 865 pg/ml. Se probaron las siguientes condiciones: (1) el conjugado de estreptavidina monomérica-IRDye 700DX se colocó en un tubo de vidrio transparente de HPLC envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la exposición a la luz bajo una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 horas ("sin luz"; para controlar los efectos del calentamiento térmico); (2) el conjugado de estreptavidina monomérica-IRDye 700DX se colocó en un tubo de vidrio transparente de HPLC bajo una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 horas ("luz blanca"); (3) el conjugado de estreptavidina monomérica-IRDye 700DX se colocó en un tubo de vidrio transparente de HPLC y se expuso a una lámpara LED verde a 2500 lux durante 24 horas ("luz verde").
Se evaluó la destrucción celular inducida por estreptavidina monomérica-IRDye 700DX expuesto previamente en las diversas condiciones y que se había formado complejo con cetuximab biotinilado en células BxPC3 como se describió anteriormente. Por tanto, todos los tratamientos con células BxPC3 se incubaron con medio de cultivo completo o medio de cultivo completo que contenía cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX que se había sometido a una exposición previa a la luz de diferentes longitudes de onda de luz como se describió anteriormente.
Como se muestra en la figura 8C, los resultados revelaron que la exposición previa de estreptavidina monomérica-IRDye 700DX a la luz blanca inhibe el potencial de actividad destructora de la PIT. La destrucción dependiente de la luz esperada de las células BxPC3 se observó cuando las células se incubaron con cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX que se había protegido de la exposición a la luz con papel de aluminio. En cambio, no se observó destrucción mediante PIT dependiente de la luz de las células BxPC3 cuando las células se incubaron con cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con estreptavidina monomérica que se había expuesto a la luz blanca de una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 horas.
Los resultados mostraron que la pérdida de destrucción mediante PIT tras la exposición a la luz se redujo cuando las células BxPC3 se incubaron con cetuximab biotinilado que formaba complejo previamente con estreptavidina monomérica-IRDye 700DX que se había expuesto a luz verde de una lámpara LED verde a 2500 lux durante 24 horas, aunque en este experimento hubo alguna disminución en la destrucción mediante PIT incluso cuando el conjugado de IR700 se expuso previamente a la luz verde. Sin destrucción mediante PIT dependiente de la luz de las células BxPC3 incubadas con medio de cultivo completo solo.
Ejemplo 8 (referencia): Efecto del conjugado de anticuerpo anti-EpCAM-IR700 en la destrucción mediante PIT Se realizó un estudio adicional más para evaluar el efecto sobre la destrucción celular de un anti-CD326 de ratón (EpCAM) (N.° de cat.: 118202, BioLegend, San Diego, CA) conjugado con un fotosensibilizador de ftalocianina tal como IRDye 700DX. El anticuerpo se dirige a otra molécula alternativa de la superficie celular, EpCAM. Para preparar el anti-EpCAM-IRDye 700DX, se realizó una conjugación como se describe en el ejemplo 5.
Para evaluar la actividad destructora de la PIT mediante el conjugado de anti-EpCAM-IRDye 700DX, se incubaron células 4T1 con medio RPMI complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo) que contenía concentraciones crecientes de anti-EpCAM-IRDye 700DX como se indica o medio de cultivo completo solo durante una hora a 37 °C. A continuación, las células se lavaron una vez con medio de cultivo completo. A continuación, las células se iluminaron con un láser de 690 nm a una dosimetría de luz de 0 o 32 J/cm2. La muerte celular se evaluó como se describe en el ejemplo 6 utilizando CellTox green.
Como se muestra en la figura 9 A, los resultados mostraron que las células 4T1 incubadas con anti-EpCAM-IRDye 700DX e iluminadas a 32 J/cm2 se destruyeron de una manera dependiente de la dosis del anticuerpo. No se observó muerte celular significativa a ninguna concentración de anticuerpo sin iluminación con luz.
Para confirmar la especificidad de la destrucción celular, las células 4T1 se incubaron con un exceso molar de anticuerpo anti-EpCAM no conjugado para bloquear la unión del conjugado de anti-EpCAM-IRDye 700DX a la superficie celular. De manera específica, 10, 1 o 0,1 pg/ml de anticuerpo anti-EpCAM no conjugado o medio de cultivo completo solo durante una hora a 37 °C. Sin lavar las células, se añadió anti-EpCAM-IRDye 700DX a las células 4T1 para lograr una concentración final de 0,1 pg/ml y se incubaron durante una hora a 37 °C. La destrucción celular se indujo mediante iluminación con un láser de 690 nm a una dosis de luz de 32 J/cm2 y la destrucción celular se determinó utilizando el CellTox green como se describe anteriormente.
Los resultados se muestran en la figura 9B, que muestra la especificidad de la actividad destructora de PIT con anti-EpCAM-IRDye 700DX. Los resultados mostraron que las células 4T1 que se incubaron previamente con anticuerpo anti-EpCAM no conjugado antes de la incubación con anti-EpCAM-IRDye 700DX mostraron una muerte celular significativamente menor después de la exposición a una iluminación láser de 32 J/cm2 en comparación con las células 4T1 que no se sometieron a la etapa de bloqueo, lo que demuestra que la unión celular de anti-EpCAM y la conjugación con IRDye 700DX es necesaria para la destrucción basada en fotoinmunoterapia.
Ejemplo 9: Destrucción mediante PIT de células diana que expresan el receptor Fc con cetuximab-IRDye 700DX
Se realizaron los siguientes estudios para evaluar si el conjugado de fármaco de anticuerpo-IRDye 700DX puede unirse al receptor Fc (FcR) y si la activación con luz infrarroja cercana (~ 690 nm) da como resultado la destrucción de células FcR+. Los FcR se encuentran comúnmente en una amplia variedad de células inmunitarias tales como, monocitos, macrófagos y células supresoras procedentes de mieloides (MDSC, del inglés "myeloid derived suppressor cells"). Se ha descubierto que el papel de estas células en los tumores sólidos es perjudicial y favorece la formación de tumores. La línea celular monocítica humana THP1 expresa receptores Fc de superficie y se utilizó como sistema celular modelo para este ensayo.
Las células THP1 (ATCC, TIB-202) cultivadas en medio RPMI 1640 completo se sembraron en placas a 5000 células en un volumen total de 100 pl por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos para la adherencia durante la noche. Se comprobó la viabilidad de las células antes de la siembra mediante el método de exclusión con azul tripán y >95 % de las células eran viables. Las células se dividieron en tres grupos (todos por triplicado) de la siguiente manera: (1) células THP1 solamente (sin tratar); (2) células THP1 tratadas con el fármaco cetuximab-IRDye 700DX a 500 ng/ml; y (3) células THP1 primero incubadas con solución de bloqueo del receptor de Fc (N.° de cat.: 564220, BD, Franklin Lakes, NJ) a 1 pg/pocillo durante 20 min a temperatura ambiente seguido de tratamiento con el fármaco cetuximab-IRDye 700DX (500 ng/ml, 1 h a 37 °C en incubadora protegida de la luz).
Para inducir la destrucción, las células de cada grupo se sometieron a luz láser de 690 nm a una dosis de 32 J/cm2. Los controles representaron pocillos correspondientes a los grupos descritos anteriormente pero no tratados con luz. La destrucción celular se evaluó utilizando CellTox green como se describe de manera sustancial en el ejemplo 6. Se añadió colorante CellTox green (IX) a los pocillos y las células se incubaron durante 24 horas a 37 °C en una incubadora. El colorante también se añadió a un par de pocillos que contenían solo 100 pl del medio para la sustracción de fondo más tarde. Después de la incubación, la placa de cultivo de tejidos se leyó inmediatamente en un lector de placas. A continuación, las células se sometieron a lisis mediante la adición de 5 pl de solución de lisis diluida (Promega, n,° de cat. G1821), incluidos también los pocillos de control que contenían solo el medio. La dilución se realizó mediante la adición de medio de cultivo a la solución de lisis en la proporción 40 % (solución de lisis):60 % (medio de cultivo). A continuación, se volvió a leer la placa para obtener valores del 100 % de muerte celular. Para cada lectura, los dos pozos de fondo se promediaron y sus valores se restaron de todos los demás pozos. Para calcular el % de muerte celular para cada pocillo, el valor de fondo sustraído de la primera lectura se dividió por el valor de la segunda lectura (después de la lisis) y se multiplicó por 100.
Como se muestra en la figura 10, los resultados mostraron la destrucción de las células THP1 específica del receptor Fc por cetuximab-IRDye 700DX. Se observó una destrucción máxima en el grupo representado por células t HP1 tratadas con fármaco sometidas a luz de 32 J/cm2. Los valores porcentuales de destrucción son relativos a las células THP1 tratadas con luz y con fármaco. Por tanto, los resultados mostraron que la destrucción mediada por anticuerpos puede estar mediada por la unión específica a moléculas diana en la superficie celular, así como, en algunos casos, por la unión del anticuerpo al FcR.
Ejemplo 10 (referencia): Evaluación de la actividad de destrucción celular y del efecto de la exposición a la luz blanca sobre la actividad de destrucción celular de conjugados de molécula que no es anticuerpo-IRDye 700DX
Se realizaron los siguientes estudios para evaluar si las proteínas que no son anticuerpos, pequeñas proteínas y virus se pueden conjugar con un colorante de ftalocianina, tales como IR700, para destruir células diana. Como se muestra a continuación, los resultados mostraron que varias moléculas que no son anticuerpos diferentes median la destrucción celular que depende de la activación con luz infrarroja cercana (por ejemplo, aproximadamente 690 nm de luz), la unión a las células y/o afectan la exposición previa del conjugado de molécula de direccionamiento a la luz blanca.
A. Conjugado de proteína que no es anticuerpo-IR700
El factor de crecimiento epidérmico (EGF, del inglés "epidermal growth factor") recombinante humano (N.° de cat.: 01-401, EMD Millipore, Billerica, MA) se conjugó con IRDye 700DX y se evaluó para evaluar su actividad destructora y si la exposición previa a diferentes longitudes de onda de luz afectaba la formación de agregados solubles.
1. Conjugación del EGF
El protocolo utilizado para marcar el EGF recombinante humano con IRDye 700DX fue de manera sustancial el mismo que el protocolo para la conjugación de anticuerpos descrito en el ejemplo 5, excepto que antes de la conjugación, la solución de EGF se intercambió primero con solución salina tamponada con fosfato pH 7 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 3.000 dalton. Para la conjugación, a continuación, se añadió el éster de NHS IR700 solubilizado a la solución de EGF en una relación molar de 4 (éster de NHS IR700) a 1 (EGF) o en una relación molar de 1,2 (éster de NHS IR700) a 1 (EGF). Después de la reacción de conjugación realizada como se describe en la parte A, la solución de conjugado de EGF se intercambió después con seis veces el volumen de conjugación equivalente con PBS pH 7 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 3.000 dalton para eliminar el colorante libre, la glicina y el glicina-IR700, y ajustar el pH de nuevo a pH 7.
2. Actividad destructora dependiente de la luz de EGF-IR700
Se evaluó la destrucción celular de EGF-IR700 fotoactivado en células A431. Se sembraron células A431 a 5000 células por pocillo en placas de fondo blanco transparente de 96 pocillos un día antes del experimento. El día siguiente, las células A431 se lavaron tres veces con EMEM complementado con penicilina/estreptomicina al 1 % (medio sin suero). A continuación, las células A431 se lavaron una vez con medio sin suero, después se incubaron con medio sin suero que contenía 1 pg/ml de EGF-IRDye 700DX durante una hora a 4 °C o solo con medio sin suero. Como control para evaluar la especificidad de la actividad, en una condición, las células A431 se incubaron previamente con 100 pg/ml de cetuximab no conjugado diluido en medio sin suero durante una hora a 4 °C antes de la incubación con 1 pg/ml de EGF-IRDye 700DX. Cetuximab es un inhibidor competitivo de la unión de EGF a EGFR. A continuación, las células se lavaron una vez con medio sin suero.
Para inducir la destrucción dependiente de IR700, a continuación, las células se iluminaron con un láser de 690 nm con 32 J/cm2 de luz o protegidas de la luz ("sin luz"). La muerte celular se evaluó como se describe en el ejemplo 6 utilizando CellTox green. El porcentaje normalizado de células muertas se calculó restando a todos los pocillos el porcentaje de células muertas del control de solo medio sin suero y sin luz, dividido por EGF-IRDye 700DX a 32 J/cm2 menos el control solamente de medio sin suero y sin luz y multiplicado por 100.
Como se muestra en la figura 11A, los resultados mostraron que la destrucción celular mediada por EGF-IRDye 700DX es una destrucción dependiente de la luz, observándose la destrucción solo cuando las células se trataron con luz para activar la actividad de destrucción celular. La exposición previa de células A431 con 100 pg/ml de cetuximab no conjugado antes de la incubación con 1 pg/ml de EGF-IRDye 700DX bloqueó la destrucción celular dependiente de la luz. Las células A431 incubadas con medio solo no presentaron ninguna destrucción inducida por la luz.
3. Efectos de la exposición previa a la luz sobre la actividad fotoactivada
También se evaluó en células A431 el efecto de la exposición previa de EGF-IRDye 700DX a la luz blanca frente a la luz verde sobre la destrucción de células fotoactivadas. Se expuso previamente EGF-IRDye 700DX a diferentes tipos de luz y se evaluó el efecto del tratamiento con luz sobre la actividad destructora fotoactivada. Se añadieron cinco microlitros de conjugado de EGF-IRDye 700DX (DAR 2) por frasco transparente de HPLC a una concentración de EGF-IRDye 700DX de 1,14 mg/ml. Se probaron las siguientes condiciones: (1) el conjugado de anticuerpo-IRDye 700DX almacenado a 4 °C protegido de la luz ("4 °C", utilizado como control); (2) conjugado de anticuerpo-IRDye 700DX colocado en un tubo de vidrio transparente de HPLC bajo una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 h ("luz blanca"); (3) conjugado de anticuerpo-IRDye 700DX colocado en un tubo de vidrio transparente de HPLC envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la exposición a la luz bajo una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 h ("sin luz"), utilizado como control de los efectos del calentamiento térmico en la formación de agregados); y (4) conjugado de anticuerpo-IRDye 700DX colocado en un tubo de vidrio transparente de HPLC y expuesto a una lámpara LED verde a 2500 lux durante 24 h ("luz verde").
Para evaluar la actividad de destrucción celular, las células A431 se lavaron dos veces con medio sin suero y se incubaron en medio sin suero solo durante una hora a 4 °C. A continuación, las células se lavaron una vez con medio sin suero y se incubaron con medio sin suero solo o medio sin suero que contenía 1 pg/ml de EGF-IRDye 700DX ("sin luz"), medio sin suero que contenía 1 pg/ml de EGF-IRDye 700DX expuesto previamente a luz blanca ("luz blanca de 2500 lux") o medio sin suero que contenía 1 pg/ml de EGF-IRDye 700DX expuesto previamente a luz verde durante una hora a 4 °C ("luz verde de 2500 lux"). A continuación, las células se lavaron una vez con medio sin suero.
Para inducir la destrucción celular, las células se protegieron de la luz (dosis de luz 0 J/cm2) o se iluminaron con un láser de 690 nm con diferentes dosimetrías de luz (8 J/cm2, 32 J/cm2 o 64 J/cm2).
Como se muestra en la figura 11B, la actividad destructora dependiente de la luz de EGF-IRDye 700DX fue sensible a la exposición previa a la luz blanca. Las células A431 incubadas con EGF-IRDye 700DX que se habían protegido de la exposición a la luz pero sin calentamiento térmico bajo luz blanca de una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 horas presentaron muerte dependiente de la luz. Las células A431 incubadas con EGF-IRDye 700DX que se habían expuesto a la luz blanca de una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 horas ya no presentaban actividad destructora dependiente de la luz. Las células A431 incubadas con EGF-IRDye 700DX que se habían expuesto a la luz verde de una lámpara LED verde a 2500 lux durante 24 horas presentaron una actividad destructora dependiente de la luz comparable a la del EGF-IRDye 700DX "sin luz". Las células A431 incubadas con medio sin suero solo no presentaron actividad destructora dependiente de la luz.
B. Conjugado de toxina B del cólera-IR700
Para evaluar si la destrucción celular puede estar mediada por una molécula que se une a moléculas no proteicas, la toxina B del cólera (N.° de cat.: C9903-2MG, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) se conjugó con IRDye 700DX y se evaluó para evaluar su actividad destructora tras la exposición previa a diferentes longitudes de onda de luz. La toxina B del cólera se une específicamente al glucolípido, GM1, que es una fracción de molécula de direccionamiento a la superficie no proteica.
1. Conjugación de la toxina B del cólera
El protocolo utilizado para emarcar la toxina B del cólera con IRDye 700DX fue de manera sustancial el mismo que el protocolo para la conjugación de anticuerpos descrito en el ejemplo 5, excepto que antes de la conjugación, la solución de toxina B del cólera se intercambió primero con solución salina tamponada con fosfato pH 7 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 3.000 dalton. Para la conjugación, a continuación, se añadió el éster de NHS IR700 solubilizado a la solución de toxina del cólera en una relación molar de 2 (éster de NHS IR700) a 1 (toxina B del cólera). Después de la reacción de conjugación, que se realizó de manera sustancial como se describe en el ejemplo 8, la solución del conjugado de toxina B del cólera se intercambió después con 24 ml de PBS pH 7 utilizando un filtro con límite de peso molecular de 10.000 dalton para eliminar el colorante libre, la glicina y el glicina-IR700, y ajustar el pH de nuevo a pH 7.
2. Actividad destructora de la toxina B del cólera-IR700
Se evaluó la destrucción de células fotoactivadas utilizando toxina B del cólera-IR700 en células BxPC3. Las células BxPC3 se lavaron tres veces con medio RPMI complementado con penicilina/estreptomicina al 1 % (medio sin suero), después se incubaron solo con medio sin suero o medio sin suero que contenía 2 pg/ml de toxina B del cólera-IRDye 700DX (DAR ~2,9 por pentámero) durante una hora a 4 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces con medio sin suero.
Para inducir la destrucción dependiente de IR700, las células se protegieron de la luz (dosis de luz 0 J/cm2) o se iluminaron con un láser de 690 nm con diferentes dosimetrías de luz (2 J/cm2, 8 J/cm2 o 32 J/cm2 o 96 J/cm2). La muerte celular se evaluó como se describe en el ejemplo 6 utilizando el reactivo CellTox. El porcentaje normalizado de células muertas se calculó restando todos los pocillos el porcentaje de células muertas del control de solo medio de cultivo completo sin luz, dividido por la toxina B del cólera-IRDye 700DX a 96 J/cm2 menos el control solamente de medio de cultivo completo sin luz y multiplicado por 100.
Como se muestra en la figura 12A, el efecto de la dosis de luz sobre la destrucción dependiente de la luz de las células BxPC3 fue dependiente de la dosis, como lo demuestra un aumento en el porcentaje normalizado de células BxPC3 muertas que se habían incubado con 2 pg/ml de toxina B del cólera-IRDye 700DX durante 1 hora a 4 °C seguido de irradiación en presencia de una dosis creciente de luz. No se observó destrucción dependiente de la dosis de luz de células BxPC3 tratadas solo con medio de cultivo completo.
Para evaluar la especificidad de la actividad destructora de células fotoactivadas, las células BxPC3 se lavaron tres veces con medio sin suero, después se incubaron con medio de cultivo completo solo o con medio de cultivo completo que contenía 100 pg/ml de toxina B del cólera no conjugada durante una hora a 4 °C. A continuación, las células se lavaron una vez con medio sin suero y se incubaron durante una hora a 4 °C con medio sin suero solo, medio sin suero que contenía 2 pg/ml de toxina B del cólera-IRDye 700DX o 100 pg/ml de toxina B del cólera no conjugada con 2 pg/ml de toxina B del cólera-IRDye 700DX. A continuación, las células se lavaron dos veces con medio sin suero. Para inducir la destrucción dependiente de IR700, las células se protegieron de la luz (dosis de luz 0 J/cm2) o se iluminaron con un láser de 690 nm con 96 J/cm2 y la muerte celular se evaluó como se describió anteriormente.
Como se muestra en la figura 12B, los resultados mostraron que la incubación previa de células BxPC3 con un exceso de 100 veces la toxina B del cólera no conjugada bloqueó la destrucción dependiente de la luz de la toxina B del cólera-IRDye 700DX en las células BxPC3, lo que indica que la actividad destructora depende de la unión de la toxina B del cólera a las células.
3. Efectos de la exposición previa a la luz sobre la actividad de destrucción celular
Se evaluó el efecto de la exposición previa de toxina B del cólera-IRDye 700DX a la luz blanca frente a la luz verde sobre la actividad destructora fotoactivada. Se añadieron diez microlitros de conjugado de toxina B del cólera-IRDye 700DX (DAR 2.9) por frasco transparente de HPLC a una concentración de toxina B del cólera-IRDye 700DX de 1 mg/ml. Se probaron las siguientes condiciones: (1) el conjugado de toxina B del cólera-IRDye 700DX colocado en un tubo de vidrio transparente de HPLC envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la exposición a la luz bajo una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 horas ("sin luz", utilizado como control de los efectos del calentamiento térmico en la formación de agregados); (2) el conjugado de toxina B del cólera-IRDye 700DX se colocó en un tubo de vidrio transparente de HPLC bajo una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 h ("luz blanca"); o (3) el conjugado de toxina B del cólera-IRDye 700DX se colocó en un tubo de vidrio transparente de HPLC y se expuso a una lámpara LED verde a 2500 lux durante 24 h ("luz verde").
La destrucción celular inducida por la toxina B del cólera-IRDye 700DX expuesta previamente en las diversas condiciones se evaluó en células BxPC3 como se describió anteriormente. Por tanto, todos los tratamientos con células BxPC3 se incubaron con medio sin suero solo o con medio sin suero que contenía toxina B del cólera-IRDye 700DX que se había sometido a una exposición previa a la luz de diferentes longitudes de onda de luz como se describió anteriormente.
Como se muestra en la figura 12C, la actividad destructora dependiente de la luz mediada por toxina B del cólera-IRDye 700DX fue sensible a la exposición previa a la luz blanca. Las células BxPC3 incubadas con toxina B del cólera-IRDye 700DX que se habían protegido de la exposición a la luz, pero sin calentamiento térmico bajo luz blanca de una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 horas presentaron una destrucción dependiente de la luz. Las células BxPC3 incubadas con toxina B del cólera-IRDye 700DX que se habían expuesto a la luz blanca de una lámpara halógena a 2500 lux durante 24 horas ya no presentaban actividad letal dependiente de la luz. Las células BxPC3 incubadas con toxina B del cólera-IRDye 700DX que se habían expuesto a la luz verde de una lámpara LED verde a 2500 lux durante 24 horas presentaron una ligera disminución en la actividad destructora dependiente de la luz, pero, de manera sustancial, menor que la de las células tratadas con toxina B del cólera-IRDye 700DX expuestas a la luz blanca. Las células BxPC3 incubadas con medio sin suero solo no presentaron actividad destructora dependiente de la luz.
C. Virus de la gripe-IR700
Se realizaron los siguientes estudios para evaluar si las partículas víricas se pueden conjugar con colorantes de ftalocianina tal como IRDye 700DX para la destrucción de células fotoactivadas. También se evaluó el efecto de la exposición previa a la luz blanca sobre la destrucción del conjugado de virus-IR700 fotoactivado.
1. Conjugación del virus de la gripe (X-31)
Alícuotas sólidas congeladas de éster de NHS IRDye 700DX (N.° de Cat. 929-70011; Li-COR, Lincoln, NE) se descongelaron a temperatura ambiente, a continuación se disolvieron con DMSO para lograr una concentración de 10 mg/ml. En un entorno oscuro, se añadieron 10 |jg de éster de NHS IRDye 700DX a 65.536 unidades de HA de la reserva de gripe AX-31 A/Aichi/68 (H3N2) (N.° de cat.: 10100375, Charles River Laboratories, Wilmington, MA), y se colocó en la posición más baja posible en un vórtex de mesa durante 2 horas a 25 °C. Se utilizó una columna de flujo por gravedad para separar el conjugado de virus del colorante libre cargando 100 j l de solución de virus en una columna de flujo por gravedad Nap 5 equilibrada previamente con solución salina tamponada con fosfato (N.° de cat.: 17-0853-02, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA). Después de añadir 650 j l de solución salina tamponada con fosfato, se descartó el flujo continuo. Se cargaron 400 j l adicionales de solución salina tamponada con fosfato en la columna y se recogió el flujo continuo, que contenía el virus conjugado. Antes de utilizar el virus para experimentos, la solución de conjugado de virus se filtró con un filtro de PVDF de tamaño de poro de 0,2 jm para eliminar cualquier agregado insoluble.
2. Actividad destructora con virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX
Se incubaron células Vero con el virus de la gripe (X-31)-IR700 para evaluar si las células asociadas con el virus de la gripe (X-31)-IR700 eran susceptibles de ser destruidas después de la irradiación de luz. Las células Vero se lavaron cuatro veces con medio EMEM complementado con penicilina/estreptomicina al 1 % (medio sin suero). El medio de inoculación del virus se preparó mediante la mezcla de 1200 j l de flujo continuo de medio sin suero con 400 j l de virus de la gripe purificado (X-31)-IRDye 700DX (preparado como se describió anteriormente), que luego se filtró con un filtro de PVDF de tamaño de poro de 0,2 jm para eliminar cualquier agregado. Se añadieron a las células 100 j l de medio de inoculación de virus o 100 j l de medio de cultivo sin suero y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. A continuación, las células se lavaron una vez con 100 j l de medio sin suero.
A continuación, las células asociadas al virus o las células Vero de control se protegieron de la luz (dosis de luz 0 J/cm2) o se iluminaron con un láser de 690 nm con diferentes dosimetrías de luz (2 J/cm2, 8 J/cm2, 32 J/cm2 o 96 J/cm2). La muerte celular se evaluó como se describe en el ejemplo 6 utilizando CellTox green.
Como se muestra en la figura 13A, Las células Vero que se inocularon con virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX se destruyeron de una manera dependiente de la dosis de luz. Las células Vero incubadas en medio de cultivo completo sin virus no presentaron destrucción dependiente de la luz.
3. Efectos de la exposición previa a la luz sobre la actividad del conjugado
El virus de la gripe (X-3 1)-IRDye 700DX se probó para determinar el efecto de la exposición previa a la luz sobre la actividad destructora fotoactivada dependiente de la luz en tres condiciones diferentes de exposición a la luz, que incluye las diferentes longitudes de onda de la luz blanca frente a la luz verde. Se añadieron aproximadamente 130 |jl de flujo continuo de virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX por frasco transparente de HPLC y se analizaron después de la exposición a las siguientes condiciones: ( i) el conjugado de virus de la gripe (X-31)-lRDye 700DX se colocó en un tubo de vidrio transparente de HPLC envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la exposición a la luz bajo una lámpara halógena (N.° de cat.: PL-800, Dolan-Jenner, Boxborough, MA) a 2500 lux durante 18 h ("sin luz", para controlar los efectos del calentamiento térmico); (2) el conjugado de virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX se colocó en un tubo de vidrio transparente de HPLC bajo una lámpara halógena a 2500 lux durante 18 h ("luz blanca"); (3) el conjugado de virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX se colocó en un tubo de vidrio transparente de HPLC y se expuso a una lámpara LED verde (N.° de cat.: Green-ECS GP19 EcoSmart) a 2500 lux durante 18 h (("luz verde").
La destrucción celular inducida por la inoculación de células Vero con virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX expuesto previamente en las diversas condiciones se evaluó como se describe anteriormente después de la iluminación con un láser de 690 nm con una dosis de luz de 96 J/cm2. Por tanto, todos los tratamientos con células Vero se incubaron con medio sin suero solo o medio sin suero que contenía virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX que se había sometido a una exposición previa a luz de diferentes longitudes de onda de luz.
Como se muestra en la figura 13B, la actividad destructora dependiente de la luz mediada por el virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX es sensible a la exposición previa a la luz blanca. Las células Vero incubadas con el virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX que se habían protegido de la exposición a la luz con papel de aluminio ("sin luz") presentaron una destrucción dependiente de la luz. Sin embargo, el grado de destrucción celular disminuyó en las células Vero incubadas con el virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX que se habían expuesto a la luz blanca de una lámpara halógena a 2500 lux durante 18 horas en comparación con las células tratadas con el virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX "sin luz" que se había protegido de la luz. En cambio, la incubación de células Vero con el virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX que se habían expuesto a la luz verde de una lámpara LED verde a 2500 lux durante 18 horas presentó la misma actividad destructora fotoactivada que la de virus de la gripe (X-31)-IRDye 700DX "sin luz" que se había protegido de la luz. Las células Vero incubadas con medio sin suero solo no presentaron actividad destructora dependiente de la luz.
Ejemplo 11 (referencia): Evaluación de la actividad de destrucción celular de conjugados de molécula adicional-IR700DX
Se realizaron estudios para evaluar la actividad de destrucción celular de conjugados adicionales de IR700 sin anticuerpos que pueden unirse a moléculas de superficie que no son proteínas. En un estudio adicional ilustrativo, el efecto de la lectina de saúco (SNA, del inglés "Sambucus Nigra Lectin"; también llamada lectina de baya del saúco, EBL) (N.° de cat.: L-1300, Vector Labs, Burlingame, CA) conjugada con IRDye 700DX se evaluó para evaluar su actividad destructora. La SNA se une de manera específica a los ácidos siálicos unidos a a(2,6) en las glucoproteínas de las células. También se evaluó la agregación inducida por luz del SNA-IR700 mediante cromatografía de exclusión por tamaño, pero en este experimento ilustrativo no hubo efecto sobre la cromatografía de exclusión por tamaño del conjugado de SNA-IR700 expuesto a luz blanca frente a luz verde.
1. Conjugación de la lectina de baya de saúco (SNA)
El protocolo utilizado para marcar la SNA con IRDye 700DX es de manera sustancial el mismo que el protocolo para la conjugación de anticuerpos descrito en el ejemplo 5.
2. Actividad de destrucción dependiente de la luz de SNA-IR700
Para evaluar si el SNA-IR700 pudo provocar la destrucción celular después de la irradiación de luz, se evaluó la destrucción celular en células BxPC3. Se disociaron células BxPC3 de la placa de cultivo celular y el medio de cultivo celular que contenía medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo) se intercambió por medio RPMI complementado con BSA al 1 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de unión). Las células BxPC3 se transfirieron a tubos separados que contenían solo medio de unión o medio de unión que contenía 10 pg/ml de SNA-IRDye 700DX en una relación de colorante a anticuerpo (DAR) de ~ 2,5) y se incubaron durante una hora a 4 °C. A continuación, las células se transfirieron a placas recubiertas previamente con 200 pg/ml de SNA sin conjugar (tratamiento de recubrimiento de 1 hora a 37 °C y se lavaron 3 veces con medio sin suero) para bloquear la unión no específica de SNA-IRDye 700DX a las placas.
Para inducir la destrucción dependiente de IR700, las células se protegieron de la luz (dosis de luz 0 J/cm2) o se iluminaron con un láser de 690 nm con diferentes dosimetrías de luz (8 J/cm2, 32 J/cm2 o 96 J/cm2). La muerte celular se evaluó como se describe en el ejemplo 6 utilizando CellTox green.
Como se muestra en la figura 14A, Las células BxPC3 incubadas con SNA-IRDye 700DX presentaron una destrucción dependiente de la luz. Las células BxPC3 tratadas con medio de cultivo completo en ausencia de un conjugado de IR700 no presentaron una destrucción dependiente de la luz.
Para evaluar la especificidad de la destrucción celular, las células BxPC3 se trataron con sialidasa A, que escinde los ácidos siálicos con enlaces a(2,6), el receptor de SNA. Las células BxPC3 se disociaron del matraz de cultivo de tejidos y se fijaron con formalina al 10 % durante 20 minutos. A continuación, las células se lavaron 3 veces con PBS y se trataron con un tampón de reacción 1x solo (diluido de un tampón de reacción glucosialidasa A-51 5x, número de catálogo GK80045, Prozyme), tampón de reacción 1x que contiene 0,025 U de sialidasa A o tampón de reacción 1x que contiene 0,075 U de sialidasa A durante 2 horas a 37 °C. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS y después se incubaron con PBS solo o PBS que contenía 10 pg/ml de SNA-IRDye 700DX durante 1 hora a 4 °C.
Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS, se tiñeron con tinción nuclear DAPI y después sembraron en placas de 96 pocillos y se tomaron imágenes en un microscopio fluorescente de epi-iluminación. Se eligieron al menos 10 regiones y se tomaron imágenes para detectar la tinción nuclear DAPI y la señal fluorescente de SNA-IRDye 700DX. Para comparar la intensidad fluorescente de los grupos probados, la resta de fondo se realizó mediante la resta de la intensidad mínima de píxeles de una imagen dada de todos los demás píxeles de la misma imagen. La señal nuclear DAPI se definió como umbral y se utilizó como área representativa para cada célula. La imagen DAPI segmentada se utilizó después para determinar el área de cada célula individual a cuantificar para la intensidad de fluorescencia promedio en el canal utilizado para obtener la imagen de SNA-IRDye 700DX. Debido a que la tinción de SNA-IRDye 700DX es una tinción de membrana que es difusa y debido a que se utilizó un microscopio de epi-iluminación, la señal fluorescente media medida de la región enmascarada definida por la tinción nuclear DAPI podría utilizarse como una intensidad fluorescente media representativa para la tinción de SNA-IRDye 700DX por célula. La intensidad de fluorescencia media se recogió para cientos de células por condición de tratamiento y se representó en un diagrama de caja y bigotes.
Los resultados de la intensidad fluorescente de los grupos probados después del tratamiento de las células con sialidasa A se muestran en la figura 14B. Los resultados mostraron que un aumento dependiente de la dosis en el tratamiento con sialidasa A dio como resultado una disminución simultánea en la tinción de SNA-IRDye 700DX en la muestra. El aumento dependiente de la dosis del tratamiento con sialidasa A no produjo ningún cambio en la fluorescencia del canal utilizado para detectar el SNA-IRDye 700DX cuando las células BxPC3 no se tiñeron con SNA-IRDye 700DX.
Ejemplo 12 de referencia: Destrucción de patógenos bacterianos mediante PIT mediada por conjugado de IR700
Se realizaron los siguientes estudios para evaluar si los anticuerpos conjugados directamente con un fotosensibilizador de ftalocianina, tal como IRDye 700DX, pueden destruir células bacterianas mediante la unión a proteínas que se muestran en su superficie celular. La proteína A es una proteína que se muestra en la superficie celular de Staphylococcus aureus (S. aureus) que se une a la región Fc de los anticuerpos.
En estos estudios se utilizó cetuximab-IR700, sustancialmente conjugado como se describe en el ejemplo 1 en estos estudios. S. aureus se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC) ID 6538.
Se cultivó S. aureus en placas de agar Brain Heart Infusion (BHI) para la selección y recuento de colonias, o en caldo BHI (medio de cultivo completo) para la expansión de la población.
Para evaluar la destrucción mediante PIT inducida por células bacterianas, se incubó S. aureus con 100 pg/ml de cetuximab-IRDye 700DX durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, las células se iluminaron con un láser de 690 nm a 0 o 300 J/cm2. El número de células bacterianas viables restantes se determinó mediante el recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) en placas de agar BHI en las siguientes condiciones. Como control, el número de células bacterianas viables también se evaluó en células tratadas con incubación con cetuximab-IRDye 700DX solo pero sin iluminación láser, iluminación láser sola o sin tratar. El porcentaje de UFC viable se normalizó a células bacterianas sin tratamiento.
Los resultados se muestran en la figura 15, que muestra que la destrucción celular de S. aureus mediada por PIT puede producirse en presencia de un conjugado de anticuerpo-IR700 que se une a la proteína A. Solo las células bacterianas que se incubaron con cetuximab-IRDye 700DX con iluminación láser posterior tuvieron una reducción estadísticamente significativa de las UFC en comparación con los otros tres grupos.
Ejemplo 13 (referencia): Destrucción de patógenos víricos mediante PIT mediada por el conjugado de IR700 Se realizaron los siguientes estudios para evaluar si la infectividad del virus se puede inhibir mediante PIT en partículas víricas con anticuerpos anti-virus marcados con ftalocianina. Se realizó un estudio ilustrativo utilizando el virus de la gripe como un ejemplo específico en el que se realizó un tratamiento indirecto con PIT contra partículas del virus de la gripe recubiertas con anticuerpos de ratón antivirus de la gripe A (H3N2) y anticuerpos de cabra anti-Fab de ratón-IRDye 700DX. Debido a que el marcaje indirecto de anticuerpos primarios no conjugados con conjugados de anticuerpo secundario-IRDye 700DX puede inducir la destrucción mediante PIT de manera similar a la de los anticuerpos primarios conjugados directos, los hallazgos pueden generalizarse a anticuerpos anti-virus-IRDye 700DX directamente conjugados. Por tanto, estos resultados demuestran que el tratamiento con PIT puede conducir a la inhibición de la infección vírica.
Se conjugó el anticuerpo de cabra de fragmento Fab anti-IgG1 de ratón específico (GtxMs Fab) AffiniPure (Número de catálogo: 115-007-185, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) a IR700 sustancialmente como se describe en el ejemplo 5, excepto que la solución de anticuerpo GtxMs Fab se intercambió primero con solución salina tamponada con fosfato pH 7 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 10.000 dalton, a continuación, el pH de la solución de anticuerpo se ajustó a un pH de 8,5 con la adición de tampón fosfato a pH = 9. Alícuotas sólidas congeladas de éster de NHS IRDye 700DX (N.° de Cat. 929-70011; Li-COR, Lincoln, NE) se descongelaron a temperatura ambiente, a continuación se disolvieron con DMSO para lograr una concentración de 10 mg/ml. En un ambiente oscuro, a continuación, se añadió el éster de NHS IR700 solubilizado a la solución de anticuerpo en una relación molar de 2 (éster de NHS IR700) a 1 (anticuerpo). La reacción de conjugación se desarrolló a 25 °C durante 2 horas protegida de la luz. Se añadió glicina (pH 8,2) hasta una concentración final de 10 mM durante 15 minutos para desactivar la reacción. La solución de conjugado de anticuerpo se intercambió después con 24 ml de PBS pH 7 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 10.000 dalton para eliminar el colorante libre, la glicina y el glicina-IR700, y ajustar el pH de nuevo a pH 7.
Para la PIT, el virus de la gripe A se asoció de manera indirecta con el IR700 mediante la mezcla de 1 |jg de anticuerpo de ratón antivirus de la gripe A humano (H3N2) (F49) (N.° de catálogo: M146, TaKaRa, Katsushika Tokio, Japón) y 1 jg de GtxMs Fab-IRDye 700DX durante 5 minutos a 25 °C en oscuridad, seguido de una incubación de 30 minutos con 16.384 unidades de HA de la reserva de gripe AX-31 A/Aichi/68 (H3N2) (N.° de cat.: 10100375, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) durante 30 minutos a 25 °C en oscuridad. Se añadieron aproximadamente 875 j l de EMEM complementado con penicilina/estreptomicina al 1 % (medio sin suero) y el virus incubado se filtró con un filtro de PVDF de tamaño de poro de 0,2 jm para eliminar cualquier agregado insoluble (medio de inoculación de virus). La incubación se realizó por duplicado. Para una de las muestras duplicadas, la solución de anticuerpo-virus se expuso a 144 J/cm2 de luz de 690 nm, mientras que la otra muestra se protegió de la luz.
Se evaluó la infectividad de los virus tratados con PIT con células Vero. Veinticuatro horas antes de marcar el virus de la gripe (X-31) con el anticuerpo de ratón antivirus de la gripe A (H3N2) y el GtxMs Fab-IRDye 700DX, se colocaron en placas 125.000 células Vero en una placa de 6 pocillos. Al día siguiente, después de sembrar las células y después de marcar el virus de la gripe (X31) con el anticuerpo de ratón antivirus de la gripe (H3N2) y con GtxMs Fab-IRDye 700DX, las células se lavaron cuatro veces con medio sin suero. A continuación, las células se incubaron con 100 j l de medio de inoculación de virus tratado con luz, medio de inoculación de virus tratado sin luz o medio sin suero durante 1 hora a 37 °C. A continuación, el medio se reemplazó con EMEM complementado con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,3 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Después de 14 horas después de la inoculación del virus, las células se tripsinizaron y se resuspendieron en EMEM complementado con suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % y se colocaron en tubos Eppendorf. A continuación, las células se fijaron con formalina al 10 % durante 20 minutos y posteriormente se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7). Para cada etapa de lavado, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos, se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió con 1 ml de PBS.
A continuación, las células se incubaron durante 30 minutos a 25 °C con "tampón de bloqueo" que contenía PBS complementado con albúmina de suero bovino al 3 % (sin IgG, sin proteasa) (N.° de catálogo: 001-000-162, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Wilmington, MA) y saponina al 0,08 %. A continuación, las células se incubaron durante 1 hora y 10 minutos a 25 °C con 1:2000 de anticuerpo de ratón antinucleoproteínas del virus de la gripe A (IgG2a) [AA5H] (N° de catálogo: ab20343, Abcam, Cambridge, Reino Unido) diluido en tampón de bloqueo. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con tampón de bloqueo haciendo girar las células a 1500 rpm durante 3 minutos, se eliminó el sobrenadante, se resuspendió el sedimento celular con 100 j l de tampón de bloqueo y se incubaron las células durante al menos 5 minutos a 25 °C antes del siguiente lavado. Después de lavar el anticuerpo primario, las células se incubaron durante 30 minutos a 25 °C con 1:250 de anticuerpo de cabra antisubclase 2a de Fcgamma de IgG específico (n.° de catálogo: 115-545-206, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Wilmington, MA) AffiniPure conjugado con AlexaFluor 488 diluido en tampón de bloqueo. A continuación, las células se lavaron 3 veces con 100 j l por lavado de tampón de bloqueo con al menos 5 minutos por etapa de lavado, seguido de 3 lavados adicionales con PBS. A continuación, las células se colocaron en una placa de 96 pocillos y se obtuvieron imágenes con un microscopio fluorescente (Evos, Life Technologies). Se eligieron de manera aleatoria al menos 12 regiones aleatorias de interés para obtener la imagen de campo claro y la imagen fluorescente correspondiente tomada con el cubo de excitación y emisión de GFP. La imagen de campo claro se utilizó para obtener el número total de células y la imagen fluorescente se utilizó para detectar la presencia de expresión de nucleoproteínas, una lectura de que la célula estaba infectada con el virus de la gripe.
Se evaluó el efecto de la exposición de partículas del virus de la gripe recubiertas con anticuerpo anti-HA y anticuerpo de cabra antirratón IRDye 700DX (GtxMs Fab-IRDye 700DX) a luz de 690 nm sobre la infectividad del virus. Los resultados de la figura 16 muestran que la PIT en partículas del virus de la gripe que utilizan el anticuerpo de ratón antivirus de la gripe (H3N2) que forma complejo previamente con GtxMs Fab-IRDye 700DX anula la infección por el virus de la gripe. Las células Vero incubadas con virus recubiertas con anticuerpo de ratón antivirus de la gripe (H3N2) que forma complejo previamente y GtxMs Fab-IRDye 700DX que no se expusieron a luz de 690 nm dieron como resultado una fuerte infección vírica, con aproximadamente un 97,4 % de las células Vero que se tiñen para la expresión de nucleoproteínas del virus de la gripe. En marcado contraste, las células Vero incubadas con virus tratado con PIT recubierto con anticuerpo de ratón antivirus de la gripe (H3N2) y GtxMs Fab-IRDye 700DX mostraron una disminución significativa en la infección vírica, con solo el 1,8 % de las células teñidas para la expresión de nucleoproteínas del virus de la gripe.
Ejemplo 14 (referencia): Destrucción mediante PIT mediada por el conjugado de IR700 de células infectadas por patógenos
Se realizaron los siguientes estudios para evaluar si las células infectadas por virus se pueden tratar de manera selectiva con PIT con anticuerpos antivirus marcados con colorantes de ftalocianina (tal como IRDye 700DX), ya sea mediante conjugación directa o marcaje indirecto con conjugados de anticuerpos secundarios. Los datos ilustrativos incluyen realizar la PIT en células infectadas con el virus de la gripe utilizando una PIT indirecta con anticuerpos de ratón antivirus de la gripe (H3N2) y anticuerpos secundarios de cabra antirratón-IRDye 700DX.
En este estudio, la conjugación del fragmento Fab del anticuerpo de cabra anti-IgG1 de ratón específico (GtxMs Fab) AffiniPure con IR700D se realizó de manera sustancial como se describe en el ejemplo 5.
Se infectaron células Vero con el virus de la gripe antes de tratar el virus o las células con la PIT. Se colocaron aproximadamente 5000 células Vero en placas negras de fondo transparente de 96 pocillos. Al día siguiente, después de colocar las células, las células se lavaron cuatro veces con 100 pl de e Me M complementado con penicilina/estreptomicina al 1 % (medio sin suero), después se incubaron con medio sin suero que contenía 327,68 unidades de Ha de gripe AX-3l, A/Aichi/68 (H3N2) (N.° de catálogo: 10100375, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) por pocillo. A continuación, las células se incubaron con el medio de inoculación del virus o el medio sin suero durante 90 minutos a 37 °C, después de lo cual el medio de inoculación del virus se reemplazó con EMEM complementado con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,3 % y penicilina/estreptomicina al 1 %.
A continuación, las células infectadas con virus se marcaron con IR700 14 horas después de la inoculación del virus. Brevemente, las células se incubaron durante una hora a 4 °C con 1 pg/ml de anticuerpo de ratón antivirus de la gripe A humana (H3N2) (F49) (N.° de catálogo: M146, TaKaRa, Katsushika Tokio, Japón) diluido con EMEM complementado con suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo). A continuación, las células se lavaron una vez con medio de cultivo completo y después se incubaron durante una hora a 4 °C con 5 pg/ml de GtxMs-IRDye 700DX diluido en medio de cultivo completo. A continuación, las células se lavaron una vez con 100 pl de medio de cultivo completo. Para inducir la PIT, las células se iluminaron con un láser de 690 nm a 64 J/cm2 o se protegieron de la luz ("sin luz").
La muerte celular se evaluó utilizando el reactivo CellTox green. Después del tratamiento con luz, todas las células se incubaron con reactivo CellTox green 1x diluido en medio de cultivo completo durante 15 minutos a 37 °C, después se tomaron imágenes con un microscopio fluorescente (Evos, Life Technologies). Se eligieron aleatoriamente al menos 5 regiones de interés aleatorias por pocillo para al menos tres pocillos diferentes para obtener la imagen de campo claro, la imagen fluorescente del anticuerpo antivirus de la gripe utilizando un cubo de excitación y emisión Cy5 y la imagen fluorescente de CellTox green utilizando un cubo de excitación y emisión GFP. Después las células se puntuaron para la tinción con anticuerpo antivirus de la gripe como una indicación de que la célula estaba infectada por el virus. De las células infectadas por virus, a continuación, se puntuaron las células para determinar si había tinción con CellTox green.
Como se muestra en la figura 17, los resultados mostraron que se observó muerte celular inducida por PIT en células Vero infectadas con el virus de la gripe que se habían marcado de manera secuencial con el anticuerpo de ratón antivirus de la gripe (H3N2) y el anticuerpo de cabra antirratón-IRDye 700DX (GtxMs-IRDye 700DX) seguido de irradiación de luz. El grado de muerte celular que se observó fue dependiente de la luz, ya que solo se observó una muerte celular insignificante en ausencia de tratamiento con luz.
Ejemplo 15 (referencia): Destrucción de neuronas mediante PIT mediada por el conjugado de IR700
El siguiente estudio se realizó para evaluar si las neuronas se pueden destruir mediante PIT utilizando conjugados de IRDye 700DX. Las neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) se sometieron a PIT con la subunidad B de la toxina del cólera conjugada con IRDye 700DX. La irradiación con luz láser de 690 nm dio como resultado la muerte celular completa medida en un ensayo de toxicidad celular basado en luminiscencia. Sin la administración de luz no se observó muerte celular significativa. Los hallazgos demuestran que la PIT puede ser un tratamiento eficaz para destruir neuronas y, en términos más generales, para destruir células no cancerosas, incluidas células primarias. Los DRG embrionarios de rata se obtuvieron de Lonza (número de catálogo R-eDRG-515, Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD) en formato crioconservado y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso. Se recubrieron placas de 96 pocilios de pared negra con 50 |jl de PBS por pocilio que contenía 30 |jg/ml de poli-D-lisina (Sigma-Aldrich, n.° de catálogo P0899, St. Louis, MO) y 2 jg/ml de laminina (sigma-Aldrich, L2020, St. Louis, MO) durante 1 hora a temperatura ambiente, siguiendo la preparación de la solución madre y los procedimientos de Lonza. La solución de recubrimiento se aspiró y las placas se dejaron secar durante una hora (tapa abierta en la cabina de bioseguridad) y se utilizaron inmediatamente para la siembra de células. Las instrucciones proporcionadas por Lonza se siguieron estrictamente para descongelar y sembrar las células. El medio de cultivo fue PNBM complementado en todo momento con L-glutamina 2 mM, gentamicina 50 jg/ml, anfotericina 37 ng/ml y NSF-1 al 2 %, pero este último se añadió fresco cada vez antes de su uso. Estos componentes formaban parte de un kit (número de catálogo CC-4461, Lonza, Basilea, Suiza). Además, también se añadió factor de crecimiento nervioso (NGF, número de catálogo N2513, Sigma, St. Louis, MO) nuevo en el momento del uso a 100 ng/ml. Para colocar las células, se descongeló un frasco de 0,25 ml y se diluyó gota a gota con 3,75 ml de medio de cultivo y se sembraron 200 j l de suspensión en los pocillos. Las células se incubaron durante 4 horas a 37 °C y CO2 al 5 %, y el medio se reemplazó con medio que también contenía los inhibidores mitóticos 5-fluoro-2'-desoxiuridina (concentración final de 7,5 jg/ml, número de catálogo F-0503, Sigma, St. Louis, MO) y uridina (concentración final de 17,5 jg/ml, número de catálogo U-3003, Sigma, St. Louis, MO) que se añadieron justo antes de su uso. El medio se cambió de nuevo cada 3 a 4 días.
La conjugación de la toxina B del cólera con IR700 se realizó como se describe en el ejemplo 10.B.
Después de cultivar DRG embrionarios de rata durante 11 días, se diluyó 1 jg/ml de solución madre de toxina B del cólera-IR700 a 40 jg/ml con medio de cultivo y se añadieron 5 j l del conjugado diluido directamente a los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenía neuronas de DRG en 200 j l de medio, para lograr una concentración final de 5 jg/ml de conjugado. Las células se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Se retiró el medio de cultivo, las células se lavaron una vez con medio de cultivo y se añadieron 100 j l de medio de cultivo fresco. Las neuronas teñidas se iluminaron después con un láser de 690 nm a una dosis de luz de 64 J/cm2 (150 mW/cm2) o se dejaron protegidas de la luz como control ("sin luz").
El efecto de la PIT en las neuronas de DRG se midió con el ensayo de toxicidad basado en luminiscencia CytoTox Glo (número de catálogo G9291, Promega, Madison, WI). Este ensayo se basa en la integridad de la membrana y emplea un prosustrato para la luciferasa que no puede penetrar en las células inalteradas. Cuando las células mueren, el daño en la membrana plasmática permite que las enzimas se difundan fuera de las células y activen el prosustrato, convirtiéndose ahora en un verdadero sustrato para la luciferasa, lo que da como resultado una señal de luminiscencia. Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 minutos y se añadieron 50 j l de reactivo de ensayo. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, la luminiscencia se leyó en un lector multimodo. Para determinar la muerte celular completa, se añadieron 50 j l de solución de digitonina para destruir las células viables restantes y, después de 20 minutos, se leyó de nuevo la luminiscencia. Los valores de fondo de los pocillos sin células se restaron de cada lectura y el porcentaje de muerte celular se calculó como la relación entre la luminiscencia antes y después de la lisis con digitonina, multiplicada por 100.
Como se muestra en la figura 18, la PIT Indujo la muerte celular en neuronas del DRG embrionarias de rata. La irradiación con luz láser de 690 nm de 64 J/cm2) conducen a una muerte celular del 100 por cien después de 3 horas (barra izquierda), mientras que las células protegidas de la luz ("Sin luz") permanecieron ilesas (6 % de células muertas, barra derecha).
Ejemplo 16 (referencia): Tratamiento de combinación con interferón gamma y PIT con anti-PD-L1-IR700 Los siguientes estudios se realizaron para evaluar si PIT se puede combinar con agentes inmunomoduladores, que también pueden afectar a las células cancerosas, para potenciar la actividad destructora de PIT.
A. Efecto del interferón gamma sobre la muerte celular
Se sembraron células BxPC3 (n.° CRL-1687, ATCC, Manassas VA) se sembraron en platos de fondo plano transparente de 96 pocillos negros, a 5.000 células por pocillo, y se colocaron en una incubadora a 37 °C, CO2 al 5 %. El día siguiente, las células se lavaron una vez con RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomiocina al 1 % (medio de cultivo completo). A continuación, las células se incubaron durante 18 horas con medio de cultivo completo que contenía diferentes concentraciones de interferón gamma humano recombinante (IFNgamma) (sin portador) (N.° de cat.: 570202, BioLegend, San Diego, CA) que oscilan entre 0 ng/ml y 3,75 jg/ml.
Después de 18 horas, el medio que contenía diferentes concentraciones de interferón gamma se reemplazó con medio de cultivo completo que contenía 1x CellTox Green (N.° de cat.: G8731, Promega, Madison, WI). Los pocillos que no incluían ninguna célula también se incubaron con reactivo CellTox green 1x diluido en medio de cultivo completo para servir como pocillos de efecto de fondo durante la detección de la señal fluorescente. La señal de fluorescencia de CellTox green se midió a las 24,5 horas después del tratamiento con luz utilizando un lector de placas de fluorescencia. A continuación, las células se lisaron con detergente, se incubaron a 37 °C durante 30 minutos, y la señal de fluorescencia de CellTox green se midió de nuevo después de la lisis. El porcentaje de células muertas se calculó tomando la relación entre la señal de CellTox green sustraída del fondo (CellTox green 1x en medio de cultivo completo sin células) por pocilio antes y después de la lisis y multiplicando la proporción por 100. Los resultados en la figura 19A muestran que la concentración creciente de IFNgamma da como resultado un aumento dependiente de la dosis en la muerte celular de las células BxPC3.
B. Efecto del interferón gamma en la expresión de PD-L1
Las células BxPC3 se sembraron en placas de 12 pocillos a 145.000 células por pocillo y se colocaron a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %. El día siguiente, las células se lavaron una vez con RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomiocina al 1 % (medio de cultivo completo). A continuación, las células se incubaron durante 18 horas con medio de cultivo completo solo, medio de cultivo completo que contenía 375 pg/ml de interferón gamma humano recombinante (sin portador) (n.° de cat.: 570202, BioLegend, San Diego, CA), o medio de cultivo completo que contenía 37,5 ng/ml de interferón gamma humano recombinante (sin portador). Después de la incubación de 18 horas con o sin interferón gamma recombinante, las células BxPC3 se lavaron una vez con medio de cultivo completo.
A continuación, las células se incubaron durante una hora a 37 °C con medio de cultivo completo solo o medio de cultivo completo que contenía 10 pg/ml de anti-PD-L1-IRDye 700DX, que se preparó como se describe en el ejemplo 5.
Después de una hora de incubación, las células se lavaron tres veces con tampón de fosfato salino (pH 7) y se incubaron con tampón de disociación celular sin enzimas (N.° de cat.: S-014-C, EMD Millipore, Billerica, MA) hasta que se desprendieron las células. Después de que las células se desprendieran, se añadió solución salina tamponada con fosfato que contiene fracción V de albúmina sérica bovina al 0,5 % (n.° de cat.: 15260-037, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) a las células y las muestras se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo para determinar la expresión de PD-L1 en función de la señal fluorescente del colorante IR700 del anti-PD-L1-IRDye 700DX. El factor de aumento en la expresión se calculó restando primero la intensidad fluorescente de la tinción con anti-PD-L1-IRDye 700DX para cada tratamiento de las muestras de células no teñidas, normalizando, después, cada tratamiento restando la intensidad fluorescente de fondo determinada a partir de la media de las muestras teñidas con anti-PD-L1-IRDye 700DX sin tratar con interferón gamma.
Como se muestra en la figura 19B, los resultados mostraron que el aumento de la concentración de IFNgamma dio como resultado un aumento dependiente de la dosis en la expresión de PD-L1 en células BxPC3.
C. Combinación de interferón gamma y conjugado anti-PD-L1-IR700 en la destrucción celular mediante PIT Se realizaron estudios para evaluar si el tratamiento de células con interferón gamma para aumentar la expresión de PD-L1 puede potenciar la destrucción mediante PIT mediada por anti-PD-L1, se sembraron células BxPC3 se sembraron en platos de fondo plano transparente de 96 pocillos blancos, a 5.000 células por pocillo, y se colocaron en una incubadora a 37 °C, CO2 al 5 %. El día siguiente, las células se lavaron una vez con RPMI 1640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomiocina al 1 % (medio de cultivo completo). A continuación, las células se incubaron durante 18 horas con medio de cultivo completo solo, medio de cultivo completo que contenía 375 pg/ml de interferón gamma humano recombinante (sin portador) (n.° de cat.: 570202, BioLegend, San Diego, CA), o medio de cultivo completo que contenía 37,5 ng/ml de interferón gamma humano recombinante (sin portador). Después de la incubación de 18 horas con o sin interferón gamma recombinante, las células BxPC3 se lavaron una vez con medio de cultivo completo. A continuación, las células se incubaron durante una hora a 37 °C con medio de cultivo completo solo o medio de cultivo completo que contenía 10 pg/ml de anti-PD-L1-IRDye 700DX o 10 pg/ml de anti-PD-L1-IRDye 700DX con 100 ug/ml de anti-PD-L1 sin conjugar. Después de una hora de incubación, las células se lavaron una vez con medio de cultivo completo.
A continuación, las células se iluminaron con un láser de 690 nm con 96 J/cm2 de luz con un láser de 690 nm o se protegieron de la luz ("sin luz"). La muerte celular se evaluó utilizando el reactivo CellTox green como se describe en el ejemplo 6.
Como se muestra en la figura 19C, el tratamiento de combinación con IFNgamma antes del tratamiento con el conjugado anti-PD-L1-IR700 potenció la destrucción fotoactivada de anti-PD-L1 en comparación con la del tratamiento con PIT con anti-PD-L1-IR700 sola. Las células BxPC3 que no se trataron con interferón gamma antes de la incubación con anti-PD-L1-IR700 presentaron un aumento modesto en la muerte celular con una iluminación de luz de 690 nm en comparación con el control sin luz. Las células BxPC3 incubadas con interferón gamma, seguido de incubación con conjugado anti-PD-L1-IR700 mostró un aumento dependiente de la dosis de IFNgamma en la muerte celular basal en las células sin tratar con luz, lo cual es coherente con el efecto de IFNgamma para mediar en la muerte celular. Las células BxPC3 incubadas con IFNgamma, incubadas con conjugado anti-PD-L1-IR700 e iluminadas con luz de 690 nm presentaron un aumento dependiente de la dosis de IFNgamma en la muerte celular en relación con el control sin luz para cada grupo de tratamiento correspondiente. Los resultados mostraron que la actividad destructora de PIT con anti-PD-L1-IR700 era específica porque la unión de anti-PD-L1-IR700 no competitiva con un exceso molar 10x de anti-PD-LI no conjugado anuló la destrucción fotoactivada del conjugado anti-PD-L1-IR700 como se demuestra por el mismo porcentaje de muerte celular en los tratamientos con luz y sin luz.
Los resultados demostraron que el tratamiento de combinación con interferón gamma, un agente anticanceroso y modulador inmunitario, y PIT con anti-PD-L1-IR700 presenta una actividad anticancerosa potenciada que la del tratamiento con PIT con anti-PD-L1-IR700 solo o del tratamiento con interferón gamma solo.
Ejemplo 17: Muerte celular inmunogénica y activación inmunitaria mediante PIT mediada por conjugado de anticuerpo-IR700
Se realizaron los siguientes estudios para evaluar si se producen cambios inmunoestimulantes en las células tratadas con PIT y si las células tratadas con PIT tienen el potencial de activar las células inmunitarias. Para evaluar qué cambios inmunoestimuladores se producen en las células tratadas con PIT, las células cancerosas tratadas con y sin PIT se evaluaron para determinar la expresión de marcadores de muerte celular inmunogénica (ICD, del inglés "immunogenic cell death"). La muerte celular inmunogénica es un tipo específico de muerte celular presentada por células necróticas y se caracteriza por una mayor presentación y liberación de marcadores inmunoestimuladores. Las células que presentan ICD muestran cambios en la membrana, tal como una expresión superficial elevada de la proteína de choque térmico 90 y la secreción de marcadores intracelulares solubles, conocidos como patrones moleculares asociados al peligro (DAMP, del inglés "danger associated molecular patterns"), tal como ATP y proteína de caja uno del grupo de alta movilidad (HMGB1) (Kromer et al. (2013) Annual Review of Immunology, 31:51-72). Como se muestra a continuación, las células cancerosas tratadas con PIT muestran una mayor secreción de HMGB1 en comparación con las células no tratadas con PIT.
Debido a que las células tratadas con PIT mostraban una liberación elevada de HMGB1, se realizaron estudios de seguimiento para evaluar si las células tratadas con PIT podían activar las células inmunitarias. Para determinar si las células tumorales tratadas con PIT podrían activar las células inmunitarias, las células cancerosas tratadas con PIT y no tratadas con PIT se cultivaron junto con células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (iDC, del inglés "immature dendritic cells"). La expresión superficial de los marcadores de maduración/activación de las DC, CD80, CD86, CD40 y MHCII, que se ven aumentados ante estímulos inflamatorios tal como la muerte celular inmunogénica a través de PIT, se observaron para determinar cualquier cambio. La potenciación de las moléculas coestimuladoras CD80, CD86 y CD40 indican un aumento en la capacidad de las DC para activar los linfocitos T y el aumento de MHCII representa una mayor capacidad de presentación de antígenos a medida que maduran las Dc . Se observó un aumento de la expresión tanto de moléculas coestimuladoras como de MHCII en iDC expuestas a tumor destruido a través de PIT en comparación con el control (células tumorales no tratadas con PIT).
Se realizó un cultivo conjunto similar de tumor y APC utilizando otro sistema modelo que utiliza células THP1, una línea celular monocítica humana que se usa ampliamente para la activación basada en APC y ensayos funcionales in vitro. Se observó un aumento de los marcadores de activación CD86 en células THP1 que se exponen a células tumorales destruidas por PIT en lugar de células THP1 que se cultivaron junto con células tumorales no tratadas con PIT, lo que confirma adicionalmente el potencial inmunoestimulador de PIT.
En conjunto, los datos indicaron que las células tratadas con PIT presentan marcadores característicos de ICD y que las células tratadas con PIT tienen el potencial de activar células inmunitarias. Por lo tanto, el tratamiento de combinación con PIT con un agente inmunomodulador puede potenciar adicionalmente el potencial de activación inmunitaria de PIT.
A. Estimación de los niveles de HMGB1 a partir de células tumorales sometidas a PIT a través de cetuximab-IR700
Las líneas celulares tumorales A431 y FaDu se cultivaron en medios RPMI 1640 completo y EMEM completo, respectivamente. Las células se sembraron en placa a razón de 15.000 células en un volumen total de 100 pl por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos para la adherencia durante la noche. Se comprobó la viabilidad de las células antes de la siembra mediante el método de exclusión con azul tripán y >95 % de las células eran viables.
Al día siguiente, las células se trataron con cetuximab-IR700 (preparado como se describe en el ejemplo 1) a 500 ng/ml durante 1 hora a 37 °C en la incubadora con CO2 y después se irradiaron con láser de 690 nm a una fluencia de luz de 32 J/cm2. Los controles representaron pocillos correspondientes a los grupos no tratados con luz. Después de someterse a PIT, el medio se eliminó de las células tratadas seguido de un lavado de las células una vez con PBS. A esto le siguió la adición de una versión del medio sin suero y la incubación durante 1 hora a 37 °C en la incubadora con CO2. El sobrenadante se recogió después de la incubación y se almacenó a -20 °C hasta su uso.
Los sobrenadantes de cultivo de varios pocillos tratados se sometieron a ELISA para HMGB1 (IBL International, n.° de cat. ST51011) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, el control y el patrón de HMGB1 liofilizado se solvataron con tampón diluyente según las instrucciones del kit. Se preparó una curva patrón de calibración diluyendo la solución madre patrón de HMGB1 1:4 en tampón diluyente, a continuación, se diluyó en serie 1:2 para un total de 6 puntos (80 ng/ml - 2,5 ng/ml). Se añadieron 100 pl/pocillo de tampón diluyente a cada pocillo usado de la placa ELISA proporcionada en el kit. se añadieron 10 pl/pocillo de patrón, control o muestra a cada pocillo, la placa se selló y se incubó durante la noche a 37 °C. Después de 20-24 horas, la muestra no unida se lavó con el tampón de lavado proporcionado (diluido a 1x con agua destilada). El conjugado enzimático liofilizado se solvató con diluyente de conjugado enzimático según las instrucciones del kit y se añadió a la placa lavada a 100 pl/pocillo. La placa se golpeó suavemente para mezclar y después se selló e incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, se lavó el exceso de conjugado enzimático con tampón de lavado 1x y se añadió a la placa una mezcla 1:1 de soluciones de colrea A y colrea B a 100 pl/pocillo y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se detuvo la reacción añadiendo 100 pl/pocillo de solución de parada y golpeando suavemente la placa para mezclar. La cantidad de producto de color amarillo se cuantificó por su absorción a 450 nm. La curva patrón de HMGB1 se representó gráficamente con una función logística de 4 parámetros y los datos de la muestra de prueba se interpolaron en la curva patrón para determinar la concentración de HMGB1 en cada muestra. Los datos se representaron como el factor de aumento sobre los correspondientes controles sin luz.
Como se muestra en la figura 20A, PIT a través de cetuximab-IR700 dio como resultado una fuerte secreción de HMGB1 de las células tumorales. Tanto A431 como FaDu mostraron una liberación masiva de HMGB1 en comparación con los controles sin luz.
B. Determinación del aumento de los marcadores de maduración de DC CD80, CD86, CD40 y MHCII en DC cultivadas junto con células tumorales tratadas con PIT
Las células FaDu se cultivaron en medio EMEM completo. Las células se colocaron en placas en un volumen total de 100 pl por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos para la adherencia durante la noche. Se comprobó la viabilidad de las células antes de la siembra mediante el método de exclusión con azul tripán y >95 % de las células eran viables.
El día siguiente, las células se trataron con cetuximab-IRDye 700DX a 500 ng/ml durante 1 hora a 37 °C en la incubadora con CO2 y después se trataron con luz sometiendo las células a una fluencia de luz láser de 690 nm de 12 J/cm2. Los controles representaban pocillos correspondientes a los grupos no tratados con luz (células tumorales no tratadas con PIT).
Para el cultivo conjunto, se añadieron directamente iDC humanas (Astarte Biologics) de un donante sano a los pocillos con células tumorales tratadas con PIT y a los pocillos de control (células tumorales no tratadas con PIT) en una relación 1:1. A continuación, los cultivos conjuntos se incubaron durante 48 horas a 37 °C en la incubadora con CO2. A continuación, las células se desprendieron utilizando una solución de desprendimiento no enzimática. Las células recogidas de diversas condiciones de tratamiento se incubaron después con colorante de discriminación viva/muerta Zombie Green (BioLegend, 1:500) durante 20 min a temperatura ambiente seguido de lavado con tampón de tinción.
Las células se resuspendieron en tampón de tinción y después se añadió reactivo de bloqueo de Fc humano (BD Biosciences) y las células se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron anti-CD80 antihumano (BioLegend, clon 2D10), anti-CD86 humano (BioLegend, clon IT2.2), anti-CD40 humano (BioLegend, clon 5c 3), anti-CD11c humano (Bd , clon B-ly6) y anti-MHCII humano (BioLegend, clon L243) (1:20), las células se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. También se realizó la tinción de control de isotipo correspondiente para evaluar la señal de fondo. A esto le siguió un lavado y las células se resuspendieron en tampón de tinción. A continuación, los datos se adquirieron mediante citometría de flujo (citómetro de enfoque acústico Attune®) en modo de alta sensibilidad. La citometría de flujo se realizó utilizando anticuerpos anti-CD14 humano (clon 63D3, BioLegend, San Diego, CA) y anti-CD86 humano (clon IT2.2, BioLegend, San Diego, CA), en donde se añadieron a las células a una dilución de 1:40, y después las células se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. A esto le siguió un lavado y después las células se resuspendieron en tampón de tinción. A continuación, los datos se adquirieron mediante citometría de flujo (citómetro de enfoque acústico Attune®, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en modo de alta sensibilidad. Se realizó una selección adecuada mientras se analizaban los datos para excluir los desechos celulares y los datos se analizaron con selección realizada en eventos en vivo. Los resultados que se describen a continuación se basan en los datos de la intensidad de fluorescencia media (MFI, del inglés "mean fluorescence intensity") de cada grupo, que se representa gráficamente como un factor de aumento sobre los controles sin luz.
La figura 20B muestra el aumento de los marcadores de maduración de células dendríticas (DC) en iDC cultivadas junto con células tumorales FaDu sometidas a PIT a través de cetuximab-IRDye 700DX. El cultivo junto con FaDu provocó un aumento de la expresión en la superficie de CD80, CD86, CD40 y MHCII en iDC en comparación con los controles sin luz. El eje Y representa el factor de aumento sobre los correspondientes controles sin luz
C. Expresión de CD86 en células THP1 tras el cultivo junto con células tumorales tratadas con PIT y no tratadas con PIT
La línea celular A431 se cultivó en RPMI completo y las líneas de células tumorales T98G, FaDu y U87 se cultivaron en medio EMEM completo. Las células se sembraron en placa a razón de 15.000 células en un volumen total de 100 |jl por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos para la adherencia durante la noche. Se comprobó la viabilidad de las células antes de la siembra mediante el método de exclusión con azul tripán y >95 % de las células eran viables.
Al día siguiente las células se trataron con cetuximab- IR700 a 500 ng/ml durante 1 hora a 37 °C en la incubadora con CO2 y después se trataron con luz sometiendo las células a una fluencia de luz láser de 690 nm de 12 J/cm2 Los controles representaban pocillos correspondientes a los grupos no tratados con luz (células tumorales no tratadas con PIT).
Se cultivaron células THP1 (ATCC® TIB202™) en RPMI completo. Para el cultivo conjunto, se añadieron directamente 15.000 células THP1 a los pocillos con células tumorales tratadas con PIT y pocillos con células tumorales sin tratar con PIT de control. A continuación, los cultivos conjuntos se incubaron durante 24 horas a 37 °C en la incubadora con CO2. A continuación, al día siguiente, las células se desprendieron utilizando una solución de desprendimiento no enzimática. Las células recogidas de varias condiciones de tratamiento se resuspendieron después en PBS solamente y se añadió el colorante de discriminación viva/muerta Zombie Green (BioLegend) (1:500). Las células se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente y después se lavaron con tampón de tinción.
Las células se resuspendieron en tampón de tinción y después se añadió reactivo de bloqueo de Fc humano (BD Biosciences) y las células se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. La citometría de flujo se realizó utilizando anticuerpos anti-CD14 humano (clon 63D3, BioLegend, San Diego, CA) y anti-CD86 humano (clon IT2.2, BioLegend, San Diego, CA), en donde se añadieron a las células a una dilución de 1:40, y después las células se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. A esto le siguió un lavado y después las células se resuspendieron en tampón de tinción. A continuación, los datos se adquirieron mediante citometría de flujo (citómetro de enfoque acústico Attune®, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en modo de alta sensibilidad. Se realizó una selección adecuada mientras se analizaban los datos para excluir los desechos celulares y los datos se analizaron con selección realizada en eventos en vivo. Se usó el marcador CD14 para identificar las células THP1. Los resultados se basaron en los datos de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de cada grupo, que se representaron gráficamente como factor de aumento con respecto a los controles sin luz. Los datos se representaron como factor de aumento en la expresión superficial de CD86 sobre los correspondientes controles sin luz.
Como se muestra en la figura 20C, CD86 aumentó en células THP1 cultivadas junto con tumores sometidos a PIT a través de cetuximab-IR700. El cultivo conjunto con células A431 y FaDu sometidas a PIT provocó un aumento de la expresión de CD86 en la superficie de las células THP1 en comparación con los controles sin luz.
Ejemplo 18: La PIT en combinación con el tratamiento con un inmunomodulador potencia la activación inmunitaria
Se realizaron estudios para evaluar si existe una mayor activación inmunitaria cuando las células inmunitarias se preparan con tumores destruidos por PIT y también se tratan con un inmunomodulador. Como se muestra en el ejemplo 17, PIT crea un entorno inflamatorio que da lugar a la activación de células inmunitarias tal como las células dendríticas (DC) y los monocitos. Estas células preparadas con PIT también pueden mostrar un mayor potencial de activación adicional cuando se combinan con un tratamiento con un inmunomodulador tal como poli I:C (un análogo sintético de ARN bicatenario). Para analizar esto, las células tumorales tratadas con PIT se cultivaron junto con células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (iDC), seguido de tratamiento con poli I:C, y después se evaluaron los cambios en los niveles de expresión de los marcadores de activación de DC CD80 y CD86. Se utilizó como control el cultivo conjunto de iDC con células tumorales no tratadas con PIT. Se observó un aumento de la expresión de CD80 y CD86 en DC que se habían expuesto previamente a un entorno en el que el tumor se destruía mediante PIT frente a la condición en la que el tumor no se trató con PIT.
Las células FaDu cultivadas en medio EMEM completo se sembraron en placas en un volumen total de 100 j l por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos para la adherencia durante la noche. Se comprobó la viabilidad de las células antes de la siembra mediante el método de exclusión con azul tripán y se descubrió que >95 % de las células eran viables. Al día siguiente, las células se trataron con cetuximab IRDye 700DX (500 ng/ml durante 1 hora a 37 °C en una incubadora con CO2). La destrucción celular mediante PIT se indujo mediante iluminación con una luz láser de 690 nm a una fluencia de 12 J/cm.2. Los controles representaron pocillos correspondientes a los grupos no tratados con luz.
Para el cultivo conjunto, se añadieron directamente iDC humanas (Astarte Biologics) de un donante sano a los pocillos con células tumorales destruidas por PIT y a los pocillos de control (células tumorales no tratadas con PIT). A continuación, los cultivos conjuntos se incubaron durante 48 horas a 37 °C en la incubadora con CO2. A continuación, las DC recogidas se sometieron a un tratamiento con poli I:C (1 jg/ml) durante la noche. A continuación, las células se desprendieron utilizando una solución de desprendimiento no enzimática.
Las células recogidas de diversas condiciones de tratamiento se incubaron con colorante de discriminación viva/muerta Zombie Green (BioLegend, 1:500) durante 20 min a temperatura ambiente seguido de lavado con tampón de tinción. Las células se resuspendieron en tampón de tinción y después se añadió reactivo de bloqueo de Fc humano (BD) y las células se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron anti-CD80 humano (BioLegend, clon 2D10), anti-CD86 humano (BioLegend, clon IT2.2), anti-CD40 humano (BioLegend, clon 5c 3), anti-CD11c humano (BD, clon B-ly6) y anti-MHCII humano (BioLegend, clon L243) (1:20) y las células se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. También se realizó la tinción de control de isotipo correspondiente para evaluar la señal de fondo. Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de tinción. A continuación, los datos se adquirieron mediante citometría de flujo (citómetro de enfoque acústico Attune®) en modo de alta sensibilidad.
Se llevó a cabo una selección adecuada mientras se analizaban los datos para excluir los desechos celulares y los datos se analizaron con selección realizada en eventos en vivo. Los resultados que se describen a continuación se basan en los datos de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de cada grupo, que se representa gráficamente como un factor de aumento sobre los controles sin luz.
Los resultados en la figura 21 mostraron que las células dendríticas (DC) tratadas con PIT en combinación con un inmunomodulador (poli I:C) mostraron una activación inmunitaria potenciada en comparación con las DC que no se sometieron a tratamiento con PIT en combinación con un inmunomodulador. El tratamiento previo de las DC con PIT en combinación con un inmunomodulador da lugar a un aumento de los niveles de expresión de CD80 y CD86 en comparación con los controles sin luz (sin PIT).
Por tanto, los datos indicaron que las DC expuestas a un entorno creado mediante PIT están inherentemente más predispuestas a la activación a través de un inmunomodulador. Por lo tanto, el tratamiento de combinación con PIT con un agente inmunomodulador puede potenciar adicionalmente el potencial de activación inmunitaria de PIT. Ejemplo 19: Cetuximab doblemente marcado con IRDye 700DX y AlexaFluor488, IRDye 700DX y, DvL¡ght755. IRDye 700DX y IRDye800 CW
De manera similar a los estudios descritos en el ejemplo 4, se realizaron estudios adicionales para evaluar si los anticuerpos conjugados con el fotosensibilizador de ftalocianina IRDye 700DX también pueden conjugarse con una segunda molécula de colorante fluorescente. En algunos aspectos, el enfoque de doble marcaje se puede utilizar para permitir capacidades de obtención de imágenes de tumores mientras se mantiene la unión a las células cancerosas y la posterior actividad destructora de PIT.
A. Métodos de conjugación
El derivado de silicio-ftalocianina, soluble en agua, el éster de NHS IRDye 700DX y el IRDye 800CW-NHS (también denominado IRDye 800 en el presente documento) se obtuvieron de LI-COR Bioscience (Lincoln, NE). Alexa Fluor 488-SDP se obtuvo de Life Technologies (Carlsbad, CA). Dylight 755-NHS se obtuvo de Thermo Scientific (Waltham, MA). Erbitux (cetuximab) se adquirió de (Myoderm USA, Norristown, PA). Unidades de filtro centrífugo Amicon® ultra (Merck Millipore Ltd, Billerica, MA). Todos los demás productos químicos utilizados fueron de grado reactivo.
1. Cetuximab-IR700 (CTX700)
El conjugado de cetuximab-IRDye 700DX (CTX700) utilizado para producir todos los conjugados dobles descritos a continuación, se preparó sustancialmente como se describe en el ejemplo 1. Brevemente, cetuximab se hizo reaccionar con 4 equivalentes molares de éster de NHS IRDye 700DX durante 2 horas a pH = 8,5, en la oscuridad, a temperatura ambiente en un uso a través de unidades de filtro centrífugo Amicon® ultra (n.° de cat.: UFC903024, Merck-Millipore, Billerica, MA) para todas las etapas de purificación de UF/DF y el intercambio de tampones, teniendo cuidado de proteger el conjugado en todo momento de cualquier exposición innecesaria a la luz.
El conjugado se evaluó por cromatografía de exclusión por tamaño, concentración de anticuerpo (conc.) y relación de colorante a anticuerpo (DAR) sustancialmente como se describe en el ejemplo 4. Los resultados mostraron las siguientes características del conjugado: A690 = 96,7 % de monómero; Conc = 1,8 mg/ml; DAR = 2,4 IRDye 700DX /Ab
2. CTX700-ALX488
Se incubaron 10 mg de CTX-700 a una concentración de 2 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM (pH = 8,5) en un recipiente protegido de la luz con 2 equivalentes molares de Alexa Fluor 488-SDP (5 mg/ml de DMSO) a temperatura ambiente. temperatura durante 2 horas. La reacción se desactivó mediante la adición de 100 pl de solución de glicina 1 M (pH = 8). El producto conjugado se intercambió y se purificó utilizando 10 volúmenes de reacción de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10 mM pH = 7,1 filtrada a través de unidades de filtro centrífugo Amicon® ultra. El conjugado se caracterizó mediante UV-VIS, SE-HPLC, PIT y citometría de flujo de doble emisión. El espectro UV-Vis de CTX700-ALX488 se representa en la figura 22A.
3. CTX700-IRDye 800
Se incubaron 10 mg de CTX-700 a una concentración de 2 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM (pH = 8,5) en un recipiente protegido de la luz con 2 equivalentes molares de IRDye 800CW-NHS (5 mg/ml de DMSO) a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se desactivó mediante la adición de 100 pl de solución de glicina 1 M (pH = 8). El producto conjugado se intercambió y purificó utilizando 10 volúmenes de reacción de PBS (pH = 7,1) filtrados a través de unidades de filtro centrífugo Amicon® ultra 15. El conjugado se caracterizó mediante UV-VIS, SE-HPLC, PIT y citometría de flujo de doble emisión. El espectro UV-Vis de CTX700-ALX488 se representa en la figura 22B. 4. CTX700-Dylight 755
Se incubaron 10 mg de CTX-700 a una concentración de 2 mg/ml en tampón de fosfato 100 mM (pH = 8,5) en un recipiente protegido de la luz con 4 equivalentes molares de DyLight-NHS (10 mg/ml de DMSO) a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se desactivó mediante la adición de 100 pl de solución de glicina 1 M (pH = 8). El producto conjugado se intercambió y purificó utilizando 10 volúmenes de reacción de PBS (pH = 7,1) filtrados a través de unidades de filtro centrífugo Amicon® ultra 15. El conjugado se caracterizó mediante UV-VIS, SE-HPLC, PIT y citometría de flujo de doble emisión. El espectro UV-Vis de CTX700-ALX488 se representa en la figura 22C. B. Caracterización de conjugados mediante HPLC-SEC
Los conjugados se evaluaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en una columna de SEC Shodex KW-803, 8,0 x 300 mm utilizando un sistema de HPLC Agilent 1100 equipado con un detector de matriz de diodos (DAD) Agilent G1315A que monitoriza las longitudes de onda de 280, 488, 690, 755 y 778 nm. El tampón de ejecución era PBS que fluía a una velocidad de 1 ml/min. La relación promedio de colorante a anticuerpo (DAR) para los colorantes para obtención de imágenes se determinaron utilizando áreas de integración de absorbencia de 280, 488, 690, 755 y 778 nm para el pico de monómero de anticuerpo después de que se aplicaran los factores de corrección del valor del coeficiente de extinción apropiados según fuera necesario para cada colorante correspondiente. El CTX-700 utilizado en todas las reacciones de conjugación doble se analizó mediante este método antes de la conjugación con el colorante para obtención de imágenes para tener un DAR = 2,4 antes de la conjugación y se supuso que la relación IRDye 700DX/Ab no cambió después de la conjugación con el colorante para obtención de imágenes. Los resultados se muestran en la tabla 13.
Todos los conjugados demostraron tanto los tiempos de retención de la columna de exclusión de tamaño apropiados (8,1-8,2 min para este método) como las absorbencias apropiadas de la longitud de onda del colorante para obtención de imágenes en esos tiempos de retención, lo que confirma que el colorante para obtención de imágenes se incorporó al conjugado de anticuerpo CTX-700 en la relación de colorante a anticuerpo (DAR) medida para el colorante 2 dado en la tabla.
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C. Tinción celular con conjugados CTX-IRDye 700DX dobles mediante citometría de flujo
Las células BxPC3 (cultivadas en RPMI que contenía FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %) se desprendieron utilizando el reactivo de desprendimiento de células HyQTase. A continuación, se comprobó la viabilidad de las células mediante el método de tinción por exclusión con azul de tripán y se encontró que > 99 % estaban vivas. Las células se contaron utilizando un hemocitómetro y se resuspendieron en tampón de tinción (PBS que contenía BSA al 1 % y azida de sodio al 0,01 %). Aproximadamente, se tiñeron 45.000 células por condición de tinción con conjugados de colorantes individuales junto con el control de solo células para evaluar la fluorescencia de fondo en los correspondientes canales. Aproximadamente, se usaron 0,25 pg de los conjugados de colorante/100 pl de volumen de tinción que contenía 45.000 células por condición de tinción. A continuación, las células se incubaron con el colorante durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células se lavaron una vez con tampón de tinción (1800 rpm, 6 min). Las células teñidas se resuspendieron finalmente en 300 pl de tampón de tinción.
Las células se leyeron utilizando un citómetro con enfoque acústico Attune de Applied Biosystems (láseres rojo y azul, 6 canales) en un modo de alta sensibilidad (modo de recogida más lento). Se cumplieron todos los parámetros de control de calidad necesarios para la máquina antes de ejecutar el ensayo. El citómetro tenía 4 canales fluorescentes de láser azul de 488 nm, en concreto, BL1 (1er canal de láser azul), BL2, BL3 y BL4. Sus filtros de paso de banda correspondientes se describen entre paréntesis en la tabla anterior. Hay 2 canales fluorescentes fuera del láser rojo de 638 nm designado RL1 (1er canal de láser rojo) y RL2.
Para el análisis, la ventana de adquisición primaria de dispersión frontal/dispersión lateral (FSC/SSC, del inglés "Forward Scatter/Side Scatter") se realizó para evitar que se introdujeran desechos/células muertas en el análisis. Se determinaron las intensidades de fluorescencia medias de los canales correspondientes para el conjugado de colorante correspondiente analizado. Los resultados se muestran en la tabla 14. Los resultados mostraron intensidades de emisión de fluorescencia potenciadas de las células marcadas con los conjugados dobles en relación con el monoconjugado CTX700. Por tanto, estos resultados demuestran que los conjugados dobles pueden ser adecuados para aplicaciones de obtención de imágenes además de la fotoinmunoterapia (PIT).
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D. Evaluación de la actividad destructora de la PIT
Se sembraron células BxPC3 (n.° CRL-1687, ATCC, Manassas VA, EE. UU.) en una placa de poliestireno tratada con cultivo tisular (TC, del inglés "tissue culture"), de fondo transparente, paredes blancas y de 96 pocillos a una concentración de 5.000 células/pocillo en medio RPMI-l640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, el medio de cultivo completo se reemplazó con medio de cultivo completo nuevo solo o medio que contenía 500 ng/ml o 100 ng/ml del agente de prueba, según se indica, y la placa se incubó durante una hora a 37 °C.
A continuación, las células se iluminaron con un láser de 690 nm a una dosis de luz de 16 J/cm2 o 32 J/cm2 o se protegieron de la luz ("sin luz").
El efecto de los diferentes regímenes de tratamiento sobre la muerte celular se midió utilizando el tinte fluorescente, CellTox Green (n.° de catálogo: G8731, Promega, Madison, WI, EE. UU.) sustancialmente como se describe en el ejemplo 6. Después se normalizaron los resultados, estableciendo la muerte celular tras incubación con 500 ng/ml de cetuximab-IRDye 700DX y tratamiento PIT con 32 J/cm2 como 100 % de actividad PIT y la muerte celular después de la incubación con medio de cultivo completo solo y tratamiento PIT con 32 J/cm2 como 0 % de actividad PIT.
Como se muestra en la figura 23A, Las células BxPC3 incubadas con 100 o 500 ng/ml de cetuximab conjugado con IRDye 700DX solo o doblemente conjugado con IRDye 700DX-DyLight-755 mostraron destrucción dependiente de la luz y dependiente de la concentración. El conjugado doble dosificado a 500 ng/ml indujo al menos el 90 % de la destrucción celular del control de conjugado solo de cetuximab-IRDye 700DX después de PIT con 32 J/cm2. Cuando la concentración de conjugado se redujo a 100 ng/ml, el conjugado doble de cetuximab-IRDye 700DX y el DyLight-755 lograron niveles similares de destrucción celular mediante PIT. El conjugado doble de cetuximab-IRDye 700DX y el DyLight-755 mantuvo un nivel significativo de destrucción celular mediante PIT a 16 J/cm2, con al menos un 75 % de destrucción celular a 100 ng/ml o 500 mg/ml. No se observó actividad de destrucción celular mediante PIT con células incubadas con 500 ng/ml de conjugado pero no expuestas a la luz. La muerte celular de fondo (0 % de actividad), determinada con células incubadas con medio solo y expuestas a 32 J/cm2, fue menos del 15 % de la población celular.
Como se muestra en la figura 23B, las células BxPC3 incubadas con 100 o 500 ng/ml de cetuximab-IRDYE 700DX, solo o doblemente conjugado con IRDye 700DX y Alexafluor488 o IRDye 800CW, mostró destrucción dependiente de la luz y dependiente de la concentración. Ambos conjugados dobles, dosificados a 500 ng/ml o 100 ng/ml, indujeron al menos el 90 % de la muerte celular del control conjugado solo de cetuximab-IRDye 700DX después de PIT con 32 J/cm2. Cuando la exposición a la luz se redujo a 16 J/cm2, a ambas concentraciones de 100 ng/ml y 500 ng/ml de cetuximab-IRDye 700DX-Alexafluor488, la destrucción celular mediante PIT se redujo ligeramente al 6070 % del control. Para cetuximab-IRDye 700DX-IRDye 800, la destrucción celular mediante PIT se redujo a menos del 50 % del control para ambas concentraciones. Cetuximab-IRDye 700DX mantuvo un nivel significativo de destrucción celular mediante PIT a 16 J/cm2, con al menos un 75 % de destrucción celular a 100 ng/ml o 500 mg/ml. Los resultados mostraron que los conjugados solos de cetuximab-Alexafluor488 y cetuximab-IRDye 800 no fueron capaces de inducir la destrucción celular mediante PIT sin la presencia de IRDye 700DX. No se observó actividad de destrucción celular con células incubadas con 500 ng/ml de conjugado pero no expuestas a la luz. La muerte celular de fondo (0 % de actividad), determinada con células incubadas con medio solo y expuestas a 32 J/cm2, fue menos del 10 % de la población celular.
Ejemplo 20: Sensibilidad del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX, del conjugado de cetuximab-IRDye 680RD y el conjugado doble de cetuximab-IRDye 700+IRDye 680RD a la luz blanca fluorescente frente a luz LED verde
Se realizaron estudios para evaluar si la protección contra la luz para los conjugados de IRDye 700DX es una propiedad específica debido a la sensibilidad única de los conjugados de IRDye 700DX para formar agregados solubles cuando se exponen a la luz. Se evaluaron tres conjugados diferentes: (1) un conjugado de cetuximab-IRDye 700DX, (2) un conjugado de cetuximab-IRDye 680RD y (3) un conjugado doble de cetuximab-IRDye 700+IRDye 680RD.
Aunque muchos fluoróforos requieren protección de la luz porque no son muy fotoestables, de modo que la exposición a la luz da como resultado la degradación del fluoróforo y una disminución simultánea de las propiedades de fluorescencia, IRDye700DX es un colorante fotoestable único (véase, por ejemplo, Peng et al. Proceedings of SPIE 6097, 2006; www.licor.com/bio/products/reagents/irdye/700dx/photostability.html). Debido a la extrema fotoestabilidad del colorante, esto sugeriría que el IRDye 700Dx no necesita estar protegido de la luz. Sin embargo, se observó que solamente cuando el IR700 se conjuga con una molécula de direccionamiento, el IR700 requiere protección frente a la luz debido a una mayor sensibilidad de la molécula conjugada para inducir la formación de agregados solubles.
A. Conjugación de anticuerpos
Todos los anticuerpos se conjugaron con los colorantes (es decir, IRDye 700DX, IRDye 600RD o ambos) utilizando el mismo enfoque.
El conjugado de cetuximab-IRDye 700DX se preparó como se describe en el ejemplo 1.
El conjugado de cetuximab-IRDye 680RD se preparó utilizando el mismo protocolo general que se describe en el ejemplo 1, con las siguientes modificaciones. Se incubó una muestra de cetuximab con 4 equivalentes molares de IRDye 680RD (N.° de cat. 929-70050; Li-COR, Lincoln, NE) disuelto a 5 mg/ml en DMSO. Todas las demás etapas en los procesos de conjugación, purificación y caracterización del conjugado fueron idénticas a las descritas anteriormente para la preparación del conjugado de cetuximab-IR700.
El conjugado doble de cetuximab-IRDye 700DX+IRDye 680RD se preparó utilizando el mismo protocolo general que se describe en el ejemplo 1, con las siguientes modificaciones. A una muestra de cetuximab-IRDye 700DX preparada previamente mediante el protocolo descrito anteriormente se le añadieron 4 equivalentes molares de IRDye 680Rd disuelto en DMSO a 5 mg/ml. Todas las demás etapas de la conjugación, incluyendo el proceso de purificación y caracterización del conjugado, fueron idénticas a las descritas anteriormente para la preparación de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX.
B. Efectos de la exposición previa a la luz sobre la composición del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX, el conjugado de cetuximab-IRDye 680RD y el conjugado doble de cetuximab-IRDye 700+IRDye 680RD
Se analizó la formación de agregados solubles en los conjugados en cuatro condiciones diferentes con al menos 30 |jl de conjugado colocados en un frasco transparente de HPLC por muestra a una concentración de conjugado de anticuerpo de ~1,8 mg/ml. Las muestras se expusieron a iluminación blanca fluorescente de 500 lux a 25 °C, iluminación LED verde de 500 lux (N-° de catálogo: Green-ECS GP19 EcoSmart) a 25 °C, sin luz a 25 °C o sin luz a 4 °C durante 24 horas. Después de 24 horas bajo cada condición de tratamiento, la pureza del monómero, la formación de agregados solubles y la fluorescencia se evaluaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño. El porcentaje de formación de agregados solubles se midió utilizando cromatografía de exclusión por tamaño a una absorbencia de 280 nm. Para evaluar el efecto del tratamiento sobre la fluorescencia, se determinó la fluorescencia a 680 nm (áreas para el máximo de monómero) dividida por el área para la absorbencia de 280 nm para el monómero.
Los resultados de la figura 24A muestran que cetuximab conjugado con IRDye 700DX dio como resultado una mayor sensibilidad a la formación de agregados solubles en comparación con cetuximab conjugado con IRDye 680RD cuando se expuso a luz blanca. La exposición de cetuximab-IRDye 700DX a luz blanca fluorescente dio como resultado un aumento rápido en la formación de agregados solubles. La exposición a la luz verde de cetuximabIRDye 700DX también aumentó la formación de agregados solubles, aunque a un ritmo mucho más lento que el de la luz blanca. Se observó menos del 1 % de formación de agregados solubles en muestras incubadas a 4 °C o 25 °C, pero protegidas de la luz. En cambio, la exposición de cetuximab-IRDye 680RD a luz blanca fluorescente dio como resultado un aumento muy leve e la formación de agregados solubles, que fue mucho menor que la de cetuximab-IRDye 700DX. Las muestras de cetuximab-IRDye 680RD incubadas a 4 °C o 25 °C, pero protegidas de la luz o expuestas a luz verde, no mostraron ningún aumento en la formación de agregados solubles. Como se muestra, el conjugado doble en el que IRDye 700DX se conjugó con cetuximab-IRDye 680RD, dio como resultado una sensibilidad a la exposición a la luz blanca y verde en la formación de agregados solubles.
Los resultados de la figura 24B muestran que el conjugado de cetuximab-IRDye 680RD era más sensible a la exposición a la luz blanca que la de los conjugados de cetuximab-IRDye 700DX. Para todos los tratamientos de cetuximab-IRDye 700DX, la fluorescencia del conjugado de cetuximab-IRDye 700DX se mantuvo estable a pesar del aumento significativo en la formación de agregados solubles con exposición a luz blanca fluorescente de 500 lux durante 24 horas. El cetuximab-IRDye 680RD expuesto a luz blanca fluorescente durante 24 horas presentó la mayor disminución en la fluorescencia de todas las condiciones de tratamiento probadas, lo que indica que parte del IRDye 680RD probablemente se blanqueó con la exposición a la luz blanca. También se observó una disminución de la fluorescencia cuando el IRDye 700DX se conjugó de forma doble con el IRDye 680RD. Basado en cetuximab-IRDye 700DX monomarcado, esta disminución en la fluorescencia probablemente se debió al blanqueo de IRDye 680RD para el conjugado doblemente marcado de cetuximab-IRDye 700DX+IRDye 680RD.
Por tanto, los resultados mostraron que los conjugados de IRDye 700DX tienen una sensibilidad única para formar agregados solubles cuando se exponen a la luz. A pesar del aumento en la formación de agregados solubles en los conjugados de IRDye 700DX cuando se exponen a la luz, las propiedades de fluorescencia del conjugado IRDye 700DX no cambiaron, coherente con los hallazgos publicados informados de que IRDye 700DX es un colorante fotoestable. En marcado contraste, la exposición a luz blanca de otro conjugado marcado con IRDye 680RD dio como resultado solo un modesto aumento en la formación de agregados solubles en comparación con el del conjugado de IRDye 700DX. Solo cuando el conjugado de IRDye 680RD se marcó tanto con IRDye 700DX como con IRDye 680RD se produjo un aumento en la formación de agregados solubles con el conjugado de IRDye 680RD. El conjugado de IRDye 680 fue sensible al fotoblanqueo con la exposición a la luz.
Los datos muestran que los conjugados de cetuximab-IRDye 700DX, cetuximab-IRDye 680RD y cetuximab-IRDye 700DX+IRDye 680RD expuestos previamente a diferentes longitudes de onda de luz presentan una sensibilidad diferencial a la formación de agregados solubles y al blanqueo por fluorescencia. Los datos proporcionados respaldan la necesidad de protección contra la luz de los conjugados para garantizar la coherencia en la fabricación del producto. De manera específica, para conjugados de molécula de direccionamiento e IRDye 700DX tales como conjugados de anticuerpo-IRDye 700DX, la fracción de pureza del monómero y la actividad farmacológica son esenciales y los cambios pueden tener un impacto significativo en la actividad destructora activada por la luz.
Ejemplo 21: PIT mediante marcado no covalente de anticuerpo primario sin conjugar, monomarcado o doblemente marcado con un anticuerpo secundario-IRDye 700DX
Se realizaron estudios para evaluar si los anticuerpos que se unen directamente a las células cancerosas requieren la conjugación directa de un fotosensibilizador de ftalocianina tal como IRDye 700DX para mediar en la actividad destructora de PIT. El marcaje indirecto de anticuerpos anticancerosos mediado por un IRDye 700DX conjugado con un anticuerpo secundario también puede inducir una actividad destructora de la PIT eficaz.
Asimismo, en determinadas situaciones como en el caso de las moléculas de direccionamiento doblemente conjugadas, las interacciones colorante a colorante pueden dar como resultado una disminución de la fluorescencia y para los conjugados de IRDye 700DX, una disminución de la actividad destructora fotoactivada. El marcaje indirecto de cetuximab sin conjugar, monomarcado o doblemente marcado con un conjugado secundario de IRDye700DX potenció significativamente la señal de fluorescencia de las células tratadas y la actividad destructora fotoactivada. Tomados en conjunto, estos estudios muestran que una mayor separación entre conjugados doble, tal como a través de un anticuerpo secundario o mediante la adición de enlazadores, puede potenciar la fluorescencia y la actividad destructora fotoactivada de los conjugados de IRDye 700DX.
A. Conjugación de anticuerpos
Todos los anticuerpos se conjugaron con los colorantes (es decir, IRDye 700DX, IRDye 680RD o sulfo Cy7) utilizando el mismo enfoque.
Los conjugados de cetuximab-IRDye 700DX, cetuximab-IRDye 680RD y cetuximab-IRDye 700DX IRDye 680RD se prepararon utilizando los mismos protocolos generales que se describen en los ejemplos 1 y 19.
El conjugado de cetuximab-sulfo Cy7 se preparó utilizando el mismo protocolo de conjugación general que se describe para cetuximab-IRDye 700DX, con las siguientes modificaciones. A una muestra de Cetuximab se le añadieron 2 equivalentes molares de éster de NHS sulfo-cianina7(n.° de catálogo 15320; Lumiprobe, Hallandale Beach, FL) disuelto en DMSO a 10 mg/ml. Todas las demás etapas de la conjugación, incluyendo el proceso de purificación y caracterización del conjugado, fueron idénticas a las descritas anteriormente para la preparación de conjugado de cetuximab-IRDye 700DX.
Para el conjugado cetuximab-anticuerpo de burro antihumano-IRDye 700DX, se utilizó el protocolo general utilizado para conjugar el anticuerpo de burro anti-IgG humana específico de fragmento Fcy (DxHu) AffiniPure(Número de catálogo: 709-005-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Este protocolo fue similar a las etapas utilizadas para la conjugación a mayor escala con cetuximab-IRDye 700DX descritas en el ejemplo 1. Se realizaron modificaciones al protocolo para volúmenes de reacción a menor escala que utilizaban 3 mg o menos de proteína. El anticuerpo DxHu se marcó con IRDye 700DX (IR700) para evaluar si el marcado no covalente de anticuerpos primarios con anticuerpo secundario-IRDye 700DX podría usarse como para PIT. La solución de anticuerpo DxHu se intercambió primero con solución salina tamponada con fosfato pH 7 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 30.000 dalton, a continuación, el pH de la solución de anticuerpo se ajustó a un pH de 8,5 con la adición de tampón fosfato a pH = 9. Alícuotas sólidas congeladas de éster de NHS iRDye 700DX (N.° de Cat. 929-70011; Li-COR, Lincoln, NE) se descongelaron a temperatura ambiente, a continuación se disolvieron con DMSO para lograr una concentración de 10 mg/ml. En un ambiente oscuro, a continuación, se añadió el éster de NHS iRDye 700DX solubilizado a la solución de anticuerpo en una relación molar de 4 (éster de NHS IRDye 700DX) a 1 (anticuerpo). La reacción de conjugación se desarrolló a 25 °C durante 2 horas protegida de la luz. Se añadió glicina (pH 8,2) hasta una concentración final de 10 mM durante 15 minutos para desactivar la reacción. La solución de conjugado de anticuerpo se intercambió después con 24 ml de PBS pH 7 utilizando un filtro centrífugo con límite de peso molecular de 30.000 dalton para eliminar el colorante libre, la glicina y el glicina-IRDye 700DX y para ajustar el pH de nuevo a pH 7. Los conjugados de anticuerpos se analizaron con cromatografía de exclusión por tamaño para evaluar la concentración de anticuerpo-IRDye 700DX, la pureza del monómero, el % de agregado soluble y la relación de colorante a anticuerpo.
B. Cuantificación de la fluorescencia emitida por células BxPC3 con anticuerpo sin conjugar, monoconjugado o doblemente conjugado con o sin un anticuerpo secundario
Se incubaron células BxPC3 (n.° CRL-1687, ATCC, Manassas VA) durante una hora a 4 °C con o sin 250 ng/ml de anticuerpo anti-EGFR, cetuximab (Myoderm USA, Norristown, PA), cetuximab-IRDye 700DX (cetuximab directamente conjugado con IRDye 700DX), cetuximab-IRDye 680RD (cetuximab directamente conjugado con IRDye 680RD), cetuximab-Cy7-SO3 (cetuximab directamente conjugado con Cy7 sulfonado), cetuximab-IRDye 700DX IRDye 680RD (cetuximab directamente conjugado con IRDye 700DX e IRDye 680RD), y cetuximab-IR700 sulfo Cy7 (cetuximab directamente conjugado con IRDye 700DX y Cy7 sulfonado) en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo). A continuación, las células se lavaron una vez con medio de cultivo completo, se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con o sin 2 pg/ml de anticuerpo secundario de burro antihumano conjugado con IRDye 700DX (DxHu IRDye 700DX) diluido con medio de cultivo completo y después se lavaron una vez con medio de cultivo completo. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con tampón de disociación celular sin enzimas (n.° de catálogo: S-014-C, Millipore, Billerica, MA). La suspensión de células se transfirió a un tubo nuevo y se diluyó con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1 %.
La señal de fluorescencia de las células teñidas con anticuerpos fluorescentes se midió con un citómetro de flujo Attune (Thermo Scientific, Waltham, MA). Un láser de 633 nm, y la fluorescencia pasó a través de un filtro de paso largo dicroico de 645 nm, filtro de paso largo dicroico de 740 nm y filtro de paso de banda de 690/50 nm. La fluorescencia medida se normalizó al medio de control solo sin teñir, para evaluar el factor de aumento en la señal de fluorescencia.
C. Evaluación de la actividad destructora de la PIT: especificidad de la actividad destructora de la PIT
Se incubaron células BxPC3 (n.° CRL-1687, ATCC, Manassas VA) durante una hora a 4 °C con o sin 250 ng/ml de anticuerpo anti-EGFR, cetuximab (Myoderm USA, Norristown, PA), cetuximab-IR700 (cetuximab directamente conjugado con IRDye 700DX), cetuximab-IRDye 680RD (cetuximab directamente conjugado con IRDye 680RD), cetuximab-Cy7-SO3 (cetuximab directamente conjugado con Cy7 sulfonado), cetuximab-IRDye 700DX IRDye 680RD (cetuximab directamente conjugado con IRDye 700DX e IRDye 680r D), y cetuximab-IRDye 700DX sulfo Cy7 (cetuximab directamente conjugado con IR700 y Cy7 sulfonado) en medio RPMI-1640 complementado con FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (medio de cultivo completo). A continuación, las células se lavaron una vez con medio de cultivo completo, se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con o sin 2 pg/ml de anticuerpo secundario de burro antihumano conjugado con IRDye 700DX (DxHu IRDye 700DX) diluido con medio de cultivo completo y después se lavaron una vez con medio de cultivo completo. A continuación, las células se iluminaron con un láser de 690 nm a una dosis de luz de 16 J/cm.2 o se protegieron de la luz ("sin luz").
El efecto de diferentes regímenes de tratamiento sobre la muerte celular se midió utilizando la tinción fluorescente, CellTox green (N.° de Cat: G8731, Promega, Madison, WI). CellTox green es un colorante fluorescente no permeable que presenta una mayor fluorescencia al unirse al ADN. Por lo tanto, solo las células que tienen membranas plasmáticas comprometidas presenten una fuerte tinción con CellTox green. Después del tratamiento con luz, todas las células se incubaron con reactivo CelITox Green 1x diluido en medio de cultivo completo. Los pocilios que no incluían ninguna célula también se incubaron con reactivo CellTox green 1x diluido en medio de cultivo completo para servir como pocillos de efecto de fondo durante la detección de la señal fluorescente. La señal de fluorescencia de CellTox green se midió a las 24 horas después del tratamiento con luz utilizando un lector de placas de fluorescencia. A continuación, las células se lisaron con detergente, se incubaron a 37 °C durante 30 minutos, y la señal de fluorescencia de CellTox green se midió de nuevo después de la lisis. El porcentaje de células muertas se calculó tomando la relación entre la señal de CellTox green sustraída del fondo (CellTox green 1x en medio de cultivo completo sin células) por pocillo antes y después de la lisis y multiplicando la proporción por 100.
La tabla 15 muestra la fluorescencia de las células BxPC3 después del tratamiento con cetuximab sin conjugar, monomarcado o doblemente marcado con un conjugado de anticuerpo secundario-IRDye 700DX. Los resultados muestran que el marcaje no covalente de cetuximab sin conjugar, monomarcado o doblemente marcado con un conjugado de anticuerpo secundario-IRDye 700DX aumenta la fluorescencia de las células BxPC3 marcadas. Las células BxPC3 se incubaron con 250 ng/ml de cetuximab solo o sin anticuerpo primario, pero con 2 pg/ml de anticuerpo de burro antihumano-IRDye 700DX y cetuximab-sulfo Cy7. Todos los tratamientos en los que las células se trataron con anticuerpo primario y secundario de burro antihumano-IRDye 700DX dieron como resultado una potenciación en la señal fluorescente relativa en comparación con la del mismo anticuerpo primario tratado, pero sin el anticuerpo secundario de burro antihumano-IRDye 700DX. El tratamiento que produjo el mayor aumento de fluorescencia fue el tratamiento 8, en el que las células BxPC3 se marcaron con cetuximab-IRDye 680RD, seguido por anticuerpo de burro antihumano-IRDye 700DX.
Figure imgf000105_0001
Como se muestra en la tabla 16, los resultados con conjugados dobles ilustrativos mostraron que, en algunos casos, cetuximab doblemente conjugado, tal como cetuximab-IRDye 700DX IRDye 680 RD y cetuximab-IRDye 700 DX sulfo Cy7, mostró una disminución de la destrucción fotoactivada en comparación con la de cetuximab-IRDye 700DX monomarcado, lo que indica que los conjugados dobles podrían interferir con la potencia de destrucción fotoactivada. Para Cetuximab-IRDye 700DX IRDye 680 RD, la actividad de destrucción reducida puede deberse a la superposición espectral entre IRDye 700DX e IRDye 680, reduciendo así los fotones que se absorben por el IRDye 700DX para mediar en la destrucción fotoactivada. Para cetuximab-IRDye 700DX sulfo Cy7, la reducción significativa en la destrucción fotoactivada en relación con cetuximab-IRDye 700DX solo probablemente se deba a las interacciones de colorante a colorante que dan como resultado la desactivación de IRDye 700DX, lo cual es coherente con la disminución de la fluorescencia de las células BxPC3 incubadas con cetuximab-IRDye 700DX sulfo Cy7 en comparación con la de las células teñidas con cetuximab-IRDye 700DX monomarcado.
Sin embargo, el grado de destrucción celular aumentó en presencia de un anticuerpo secundario conjugado con IRDye 700Dx, lo que indica que el conjugado doble no interfirió con la potencia de la PIT cuando se combinó con el anticuerpo secundario. Los datos de la tabla 16 mostraron que los conjugados de cetuximab marcados con anticuerpo secundario de burro antihumano-IRDye 700DX (DxHu IR700) potenciaron la destrucción de células BxPC3 fotoactivada. Solamente se observó un aumento de la muerte celular con células tratadas con cetuximab que estaba directamente conjugado con IRDye 700DX o con un anticuerpo secundario antihumano-IRDye 700DX, y cuando las células se iluminaron con un láser de 690 nm. La muerte celular de fondo en todos los tratamientos no expuestos al láser de 690 nm fue similar. Todos los tratamientos en los que las células se trataron con anticuerpo primario y secundario de burro antihumano-IRDye 700DX dieron como resultado una potenciación en la destrucción celular fotoactivada relativa en comparación con la del mismo anticuerpo primario tratado, pero sin el secundario de burro antihumano-IRDye 700DX.
Figure imgf000106_0001
SECUENCIAS
Figure imgf000106_0002
continuación
Figure imgf000107_0001

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado que comprende un colorante de ftalocianina unido a cetuximab para su uso en un programa de dosificación para tratar un tumor en un sujeto humano, en donde el programa de dosificación comprende:
(a) administrar por vía intravenosa al sujeto humano que tiene un tumor, el conjugado en una cantidad que es o es aproximadamente 320 mg/m2 o que es o es aproximadamente 640 mg/m2; y
(b) después de administrar el conjugado, irradiar el tumor a una longitud de onda de 600 nm a 850 nm a una dosis de 5 J cm-2 a 200 J cm-2 o de 20 J/cm de longitud de fibra hasta 500 J/cm de longitud de fibra.
2. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde la irradiación se realiza entre 30 minutos y 96 horas después de la administración del conjugado.
3. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde la irradiación se realiza 24 horas ± 3 horas después de la administración del conjugado.
4. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el colorante de ftalocianina es IR700.
5. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el tumor se irradia a una longitud de onda de 690 nm ± 50 nm o a una longitud de onda de 690 ± 20 nm.
6. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el tumor se irradia a una dosis de aproximadamente 50 J cm-2 o aproximadamente 100 J/cm de longitud de fibra.
7. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde, en el programa de dosificación, la administración es una sola inyección o una sola infusión.
8. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde se repite el programa de dosificación, por lo que se repiten las etapas (a) y (b).
9. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8, en donde el programa de dosificación se repite si permanece un tumor residual en un tiempo que es superior a o aproximadamente o es 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 2 meses, 6 meses o 1 año después del inicio de la administración previa del conjugado.
10. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8 o 9, en donde el programa de dosificación se repite si un tumor residual permanece a o aproximadamente a las 4 semanas después del inicio de la administración previa del conjugado.
11. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el tumor es un tumor superficial.
12. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 11, en donde la etapa de irradiación comprende iluminar el tumor superficial con una fibra con punta de microlente para la iluminación superficial.
13. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el tumor es un tumor subcutáneo.
14. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 13, en donde la etapa de irradiación se realiza utilizando fibras difusoras cilíndricas.
15. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 14, en donde las fibras difusoras cilindricas comprenden una longitud de difusor de 0,5 cm a 10 cm y están separadas 1,8 ± 0,2 cm.
16. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde el tumor es un cáncer que es un cáncer de cabeza o cuello.
17. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde el conjugado se administra en una cantidad que es o es aproximadamente 640 mg/m2.
18. La composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde el conjugado se administra en una cantidad que es o es aproximadamente 320 mg/m2.
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