ES2908883T3 - Métodos para el análisis de muestras - Google Patents

Métodos para el análisis de muestras Download PDF

Info

Publication number
ES2908883T3
ES2908883T3 ES18741602T ES18741602T ES2908883T3 ES 2908883 T3 ES2908883 T3 ES 2908883T3 ES 18741602 T ES18741602 T ES 18741602T ES 18741602 T ES18741602 T ES 18741602T ES 2908883 T3 ES2908883 T3 ES 2908883T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
wells
series
droplet
substrate
biphasic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18741602T
Other languages
English (en)
Inventor
Karen Leirs
Elena Perez-Ruiz
Jeroen Lammertyn
Mark A Hayden
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Katholieke Universiteit Leuven
Abbott Laboratories
Original Assignee
Katholieke Universiteit Leuven
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Katholieke Universiteit Leuven, Abbott Laboratories filed Critical Katholieke Universiteit Leuven
Application granted granted Critical
Publication of ES2908883T3 publication Critical patent/ES2908883T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B01L3/502792—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics for moving individual droplets on a plate, e.g. by locally altering surface tension
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0689—Sealing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/12—Specific details about manufacturing devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B01L2200/142—Preventing evaporation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0427—Electrowetting

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
  • Micromachines (AREA)

Abstract

Un método para sellar una serie de pocillos que tienen un fluido acuoso colocado en ellos al disponer una capa de fluido inmiscible sobre la serie de pocillos, el método comprende: accionar el movimiento de una gota de fluido acuoso hacia una gota de fluido inmiscible mediante el uso de electrodos microfluídicos digitales (DMF) de manera que las dos gotas entren en contacto entre sí de esta manera forman una gota bifásica que comprende una fase acuosa formada por la gota de fluido acuoso y una fase no acuosa formada por la gota de fluido inmiscible; accionar el movimiento de la fase acuosa de la gota bifásica mediante el uso de electrodos DMF de esta manera se arrastra la fase no acuosa presente en la gota bifásica hacia una serie de pocillos; poner en contacto la serie de pocillos con la fase acuosa de la gota bifásica mediante el movimiento de accionamiento de la fase acuosa de la gota bifásica sobre la serie de pocillos mediante el uso de electrodos DMF; y poner en contacto la serie de pocillos con la fase no acuosa de la gota bifásica mediante el movimiento de accionamiento de la fase acuosa de la gota bifásica a una posición adyacente a la serie de pocillos mediante el uso de electrodos DMF de manera que la fase no acuosa se arrastre sobre la serie de pocillos, en donde el contacto de la serie de pocillos con la fase no acuosa de la gota bifásica recubre la serie de pocillos con el fluido inmiscible para sellar de esta manera la serie de pocillos.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para el análisis de muestras
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de patente de los EE. UU. núm. 62/447,672 presentada el 18 de enero del 2017.
Introducción
La detección digital mediante el uso de las series de micropocillos usualmente requiere un método de sellado para cerrar las cámaras de la serie del entorno exterior. Tradicionalmente, un fluido inmiscible (por ejemplo, aceite) se esparce sobre la serie ya sea manualmente o mediante el uso de un brazo robótico acoplado con un sistema de vacío para garantizar un recubrimiento uniforme en toda la serie. Sin embargo, la adición manual de aceite no es conveniente ya que puede introducir errores en el ensayo, debido a las diferencias en la técnica del operador. La robótica puede reducir los errores relacionados con la imprecisión, sin embargo, requiere una ingeniería compleja y costosa.
Los métodos en los que se manipulan fluidos inmiscibles mediante electrodos microfluídicos digitales para llenar y sellar una serie de pocillos se conocen de los documentos WO 2016/161400 A1 y WO 2013/110146 A2.
Como tal, existe la necesidad de métodos mejorados y rentables para sellar series de pocillos, tales como, los que se usan para la detección de concentraciones bajas de analitos.
Resumen
Se proporcionan los métodos para usar microfluídicos digitales (DMF) para arrastrar una gota bifásica que comprende un fluido acuoso y un fluido inmiscible sobre las aberturas de una serie de pocillos localizados en un chip DMF. Los métodos descritos en la presente descripción ubican el fluido inmiscible sobre la serie de pocillos, lo que sella eficientemente las aberturas de los pocillos. En determinadas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden utilizarse adicionalmente para introducir un reactivo de ensayo (por ejemplo, un sustrato químico) en los pocillos antes de sellar los pocillos con el fluido inmiscible. En determinadas modalidades, el reactivo de ensayo puede estar presente en la porción acuosa de la gota bifásica.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 ilustra un dispositivo microfluídico digital que contiene una gota de fluido inmiscible (por ejemplo, aceite de sellado) y una gota de fluido acuoso (por ejemplo, sustrato enzimático) entre una placa superior y una parte inferior de la placa. El dispositivo incluye una serie de pocillos (marcados con un contorno cuadrado) en la superficie inferior de la placa superior.
La Figura 2 ilustra el movimiento de la gota acuosa a la gota de fluido inmiscible y la generación de una gota bifásica en el dispositivo microfluídico digital.
La Figura 3 ilustra el movimiento de la gota bifásica hacia la serie de pocillos en el dispositivo microfluídico digital.
La Figura 4 ilustra la ubicación de parte de la porción de la fase acuosa de la gota bifásica sobre la serie de pocillos con la porción inmiscible de la gota bifásica que se ubica inmediatamente adyacente a la serie de pocillos.
La Figura 5 ilustra la ubicación de parte de la porción inmiscible de la gota bifásica sobre la serie de pocillos con la porción de la fase acuosa de la gota bifásica que se ubica inmediatamente adyacente a la serie de pocillos. La Figura 6 ilustra el movimiento de la gota bifásica que se aleja de la serie de pocillos y hacia una región desechable.
Descripción detallada
Se proporcionan los métodos para usar microfluídicos digitales (DMF) para arrastrar una gota bifásica, formada a partir de un fluido acuoso y un fluido inmiscible, para recubrir una serie de pocillos localizados sobre un chip de DMF. Los métodos descritos en la presente descripción ubican el fluido inmiscible sobre la serie de pocillos, que sella eficientemente las cámaras. En determinadas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden utilizarse adicionalmente para introducir un reactivo en los pocillos antes de sellarlos con el fluido inmiscible. En tales modalidades, el reactivo puede incluirse en la porción de fluido acuoso de la gota bifásica.
Antes de describirse la presente invención con mayor detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a una modalidad particular descrita, ya que pueden, por supuesto, variar. Debe entenderse, además, que la terminología usada en la presente descripción es solo para el propósito de describir las modalidades particulares y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará solo mediante las reivindicaciones adjuntas.
Debe observarse que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un electrodo" incluye una pluralidad de tales electrodos y la referencia a "una gota" incluye la referencia a una o más gotas y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, etcétera.
Métodos para sellar una serie de pocillos
La presente descripción proporciona métodos para sellar una serie de pocillos con un fluido inmiscible mediante el accionamiento eléctrico de una fase acuosa asociada con el fluido inmiscible. El accionamiento eléctrico puede realizarse mediante el uso de uno o más electrodos, tales como, una serie de electrodos, por ejemplo, electrodos en un dispositivo microfluídico digital.
En determinadas modalidades, el método incluye el movimiento de accionamiento eléctrico de una gota de fluido acuoso hacia una gota de fluido inmiscible mediante el uso de electrodos microfluídicos digitales (DMF) en un dispositivo DMF de manera que las dos gotas contacten entre sí y de esta manera formar una gota bifásica que comprende una fase acuosa formada por la gota del fluido acuoso y una fase no acuosa formada por la gota del fluido inmiscible; el movimiento de accionamiento eléctrico de la fase acuosa de la gota bifásica mediante el uso de electrodos DMF de esta manera arrastra la fase no acuosa presente en la gota bifásica hacia una serie de pocillos; el contacto de la serie de pocillos con la fase acuosa de la gota bifásica mediante el movimiento de accionamiento de la fase acuosa de la gota bifásica sobre la serie de pocillos mediante el uso de electrodos DMF; y contactar la serie de pocillos con la fase no acuosa de la gota bifásica mediante el movimiento de accionamiento de la fase acuosa de la gota bifásica a una ubicación adyacente a la serie de pocillos mediante el uso de electrodos DMF de manera que la fase no acuosa se tire sobre la serie de pocillos, en donde el contacto de la serie de pocillos con la fase no acuosa de la gota bifásica recubre la serie de pocillos con el fluido inmiscible, de esta manera se sellan la serie de pocillos.
Un fluido inmiscible útil en los presentes métodos puede ser cualquier fluido que no se disuelva sustancialmente en una solución acuosa o basada en agua y que además no sea significativamente accionable por la fuerza eléctrica. En determinados casos, el fluido inmiscible puede ser un líquido hidrófobo, tal como, un hidrocarburo saturado, un hidrocarburo insaturado, un hidrocarburo aromático, un aceite de silicona, un perfluorocarburo, solventes de halógeno o mezclas de estos. En general, los fluidos inmiscibles son líquidos no acuosos o no basados en agua. Los fluidos inmiscibles incluyen pero no se limitan a aceite de silicona, aceite mineral, aceite vegetal, cloroformo, tetrahidrofurano (THF), alcoholes de cadena larga tales como hexanol o decanol, hidrocarburos, tales como decano, o cualquier fluido/solvente que no se disuelva sustancialmente en soluciones basadas en agua y no es significativamente accionable por la fuerza eléctrica, por ejemplo, no es móvil por electrohumectación (por ejemplo, no es móvil directamente por la fuerza eléctrica generada por electrodos DMF). En determinadas modalidades, el fluido inmiscible puede ser un aceite tal como, aceite de silicona o aceite mineral (por ejemplo, GE Healthcare™ INMOBILIANO™ Fluido de recubrimiento DryStrip).
En determinados casos, la gota de fluido acuoso puede generarse mediante la dispensa de la gota desde un depósito que contiene el fluido acuoso, donde el depósito está presente en un dispositivo DMF y la dispensa se realiza mediante accionamiento eléctrico por electrodos DMF del dispositivo DMF. La gota de fluido acuoso puede ser una gota de un tampón compatible con la detección de un analito o una señal relacionada con el analito en los pocillos. En determinados casos, el tampón puede ser un tampón de lavado o puede incluir uno o más reactivos para generar una señal relacionada con el analito. En determinados ejemplos, la gota de fluido acuoso puede ser un tampón, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS) con o sin reactivos de ensayo adicionales. La gota de fluido acuoso puede incluir un surfactante. El surfactante puede ser un surfactante iónico o no iónico. En determinados casos, la gota de fluido acuoso puede incluir un surfactante no iónico, tal como, Pluronic F-68. La cantidad de surfactante en el fluido acuoso puede variar desde 0,01 % a 5 %, por ejemplo, 0,05 %-3 %, 0,05 %-2 %, 0,05 %-1 %, 0,05 %-0,5 % o 0,1 %-0,5 %. En algunos casos, el reactivo puede ser un anticuerpo que se une directa o indirectamente al analito diana, un sustrato para una enzima presente en los pocillos y similares.
La gota de fluido inmiscible puede introducirse en un dispositivo DMF, usado para realizar los presentes métodos, mediante cualquier medio adecuado. En determinados casos, puede colocarse una gota de fluido inmiscible en un espacio entre los sustratos que forman una cámara del dispositivo DMF a través de una entrada en la cámara, mediante el uso de fuerza capilar o aplicando presión (por ejemplo, aplicando vacío) para liberar el fluido inmiscible en la cámara del dispositivo DMF.
El volumen de la gota de fluido inmiscible y la gota de fluido acuoso puede determinarse en función de factores tales como el tamaño de la serie de pocillos. En determinados casos, los volúmenes pueden ser suficientes para recubrir por completo o recubrir sustancialmente por completo las aberturas de los pocillos de la serie. En determinados casos, la gota puede deformarse, por ejemplo, aplanarse para aumentar la longitud y el ancho de la gota mientras disminuye la altura de la gota para aumentar el recubrimiento de la serie de pocillos sin aumentar sustancialmente el volumen total de la gota. En determinados casos, la forma de las gotas puede controlarse mediante el uso de sustratos que tienen regiones que difieren en hidrofobicidad/hidrofilicidad. Por ejemplo, una región de un chip DMF puede ser sustancialmente hidrófila, lo que facilita la formación de gotas más esféricas de fluido inmiscible y gotas menos esféricas de fluido acuoso y una región del chip DMF que contiene la serie de pocillos puede incluir una superficie hidrófoba que puede conducir a extender el fluido inmiscible sobre la serie de pocillos.
Puede formarse una gota bifásica mediante la combinación de una gota acuosa y una gota de fluido inmiscible, donde los volúmenes de las dos gotas son iguales o sustancialmente iguales. En algunos casos, una o más gotas acuosas pueden combinarse con una única gota de fluido inmiscible. En algunos casos, una o más gotas de fluido inmiscible pueden combinarse con una sola gota acuosa. Por ejemplo, puede formarse una primera gota bifásica mediante la combinación de una única gota de fluido inmiscible y una única gota de fluido acuoso, seguido de la combinación de la gota bifásica con gotas adicionales, tales como, una o más gotas de fluido inmiscible y/o una o más gotas de fluido acuoso. En determinados casos, tal método puede emplearse para controlar los volúmenes de los fluidos acuosos y/o inmiscibles en la gota bifásica. En determinadas modalidades, la gota bifásica incluye una fase acuosa en contacto con una fase no acuosa (formada por el fluido inmiscible no acuoso), donde las dos fases están asociadas entre sí en una interfaz. Una gota bifásica de la presente descripción puede incluir, además, una segunda interfaz entre la fase no acuosa y el entorno circundante (por ejemplo, aire) en la cámara del dispositivo DMF y una tercera interfaz entre la fase acuosa y el entorno circundante (por ejemplo, aire) en la cámara del dispositivo DMF. En otras palabras, la fase acuosa no es absorbida por el fluido inmiscible y viceversa. En determinados casos, la gota bifásica puede tomar la forma de una gota de Janus, que es una gota esférica compuesta por dos subvolúmenes ocupados por dos fases diferentes y separados por una interfaz curva. En otros casos, la gota bifásica puede no tomar la forma de una gota de Janus y, en cambio, tener una forma esférica alargada/aplanada.
El movimiento de accionamiento eléctrico de la fase acuosa de la gota bifásica mediante el uso de electrodos DMF que de esta manera arrastra la fase no acuosa presente en la gota bifásica hacia una serie de pocillos, puede realizarse energizando los electrodos DMF y ejerciendo una fuerza eléctrica sobre la fase acuosa de la gota bifásica y de esta manera provoca indirectamente el movimiento de la fase inmiscible (no acuosa) presente en la gota bifásica.
El accionamiento eléctrico puede usarse después para conducir la gota bifásica a la serie de pocillos. Dado que la porción acuosa de la gota bifásica forma la porción frontal de la gota, la porción acuosa primero contacta la serie antes de que la porción inmiscible de la gota bifásica contacte la serie. El tiempo de contacto de la serie con la porción acuosa y la porción no acuosa de la gota bifásica puede controlarse mediante el movimiento de la gota bifásica mediado por la activación de los electrodos de DMF. En una primera modalidad, el método puede incluir el movimiento de la porción acuosa de la gota bifásica sobre la serie a una velocidad relativamente alta para disminuir el período de tiempo que los pocillos están expuestos al fluido acuoso. En una segunda modalidad, el método puede incluir el movimiento de la porción acuosa de la gota bifásica sobre la serie de pocillos a una velocidad relativamente lenta o incluso mantener la porción acuosa sobre la serie y puede incluir la desactivación de los electrodos DMF para aumentar el período de tiempo que los pocillos están expuestos al fluido acuoso. La segunda modalidad de los presentes métodos puede ser útil para permitir la difusión de reactivos presentes en la porción de fluido acuoso de la gota bifásica en los pocillos.
La etapa de poner en contacto la serie de pocillos con la fase no acuosa de la gota bifásica mediante el movimiento de accionamiento de la fase acuosa de la gota bifásica a una ubicación adyacente a la serie de pocillos mediante el uso de electrodos DMF de manera que la fase no acuosa se arrastra sobre la serie de pocillos, puede realizarse mediante la activación de los electrodos DMF de manera que la fase acuosa de la gota se mueve fuera de la serie de pocillos y a su vez arrastra la porción de fluido inmiscible de la gota bifásica sobre la serie de pocillos. En este punto los electrodos DMF pueden desenergizarse de manera que la gota permanezca estacionaria. La serie de pocillos se sella efectivamente por el fluido inmiscible y puede analizarse para detectar/medir una señal relacionada con el analito de la serie de pocillos. Se considera que una gota está adyacente a una serie de pocillos como se describió en la presente descripción cuando un borde exterior de la gota está en contacto con una periferia de la serie de pocillos y/o cuando la gota o al menos una porción de esta se ubica sobre un electrodo inmediatamente adyacente al electrodo sobre el que se ubica la serie de pocillos, de manera que el próximo ciclo de activación/desactivación de electrodos pueda mover la gota a la serie de pocillos. En el caso de una gota bifásica, la fase no acuosa de la gota está adyacente a la serie de pocillos cuando la fase acuosa se ubica sobre los pocillos y la fase acuosa de la gota está adyacente a la serie de pocillos cuando la fase no acuosa se ubica sobre los pocillos.
La Figura 1 muestra un dispositivo DMF con una placa superior e inferior separadas por una brecha que define una cámara DMF. Una serie de electrodos que accionan individualmente se conectan de manera operativa al dispositivo para conducir el movimiento de las gotas del fluido acuoso. El dispositivo se conecta de manera operativa a un depósito que contiene un sustrato enzimático. Una gota de fluido inmiscible (por ejemplo, aceite) se coloca en el dispositivo. El área diana que contiene la serie de pocillos a los que la gota de aceite debe moverse está marcada con un cuadrado. La serie de pocillos se localizan sobre la superficie inferior de la placa superior con las aberturas de los pocillos en configuración enfrentada con el espacio en la cámara (definido por la configuración separada de las partes superiores e inferiores de las placas) y con la superficie superior de la placa inferior. Los electrodos DMF se ubican en la placa inferior. Los métodos para fabricar un dispositivo DMF con una serie de pocillos en una configuración enfrentada a un sustrato que contiene electrodos DMF se describen en el documento WO2016/161400. Por ejemplo, las Figuras 22-26 del documento WO2016/161400 representa un método para fabricar un dispositivo DMF que incluye electrodos DMF en un primer sustrato y una serie de pocillos en un segundo sustrato, donde el primer y el segundo sustrato se colocan separados entre sí y definen un espacio entre ellos y las aberturas de las cámaras de la serie de pocillos encaran al espacio. El dispositivo DMF puede usarse en cualquier orientación, es decir, donde el primer sustrato está en la parte inferior o en la parte superior.
En determinados casos, la serie de pocillos puede haber sido precargada con micropartículas (por ejemplo, perlas en las que se inmoviliza un analito diana) u otras moléculas. Los métodos para cargar micropartículas en una serie de pocillos, por ejemplo, una serie de pocillos que se localizan en una placa superior de un dispositivo DMF y donde las aberturas de los pocillos miran hacia abajo (por ejemplo, los pocillos están en una orientación invertida) se describen en el documento WO2016/161400 (ver, por ejemplo, Figuras 29-30). En algunos casos, los pocillos pueden cargarse con perlas magnéticas utilizando un imán.
La Figura 2 ilustra el accionamiento de la gota acuosa, que contiene un reactivo de ensayo (por ejemplo, un sustrato enzimático), en el área del dispositivo donde se coloca la gota de aceite. La gota de aceite se combina con la gota acuosa creando una gota bifásica en la que la gota de aceite se asocia con la gota acuosa de manera que el movimiento de la porción acuosa provoca el movimiento de la porción de aceite de la gota.
La Figura 3 ilustra el movimiento de la gota bifásica hacia el área del dispositivo que contiene la serie de pocillos. La gota bifásica se mueve mediante el uso de tensiones de accionamiento DMF estándares en la fase acuosa de la gota bifásica con la fase oleosa que se arrastra detrás de la fase acuosa.
La Figura 4 representa la ubicación de la porción de la fase acuosa de la gota bifásica en el área diana. Esta etapa puede usarse opcionalmente para depositar el sustrato enzimático en una serie de pocillos presentes en el área diana. Si se utiliza, la gota bifásica puede mantenerse en el área diana durante un período de tiempo suficiente para la difusión del sustrato enzimático en la serie de pocillos.
La Figura 5 ilustra el movimiento de la gota bifásica por accionamiento para permitir que la fase oleosa de la gota se mueva sobre el área diana. Una serie de pocillos incluidos en el área diana se recubre con el aceite. Tras la ubicación de la fase oleosa de la gota bifásica sobre el área diana, la tensión de conducción se apaga. En la Figura 5, la gota bifásica se mueve por una distancia suficiente para mover la porción acuosa de la gota de la serie y arrastrar la porción inmiscible de la gota bifásica hacia la serie.
La Figura 6 ilustra el accionamiento de la gota bifásica lejos del área diana y hacia un depósito de desechos. Tal etapa puede realizarse opcionalmente después de que la serie de pocillos sellados con el aceite se haya analizado para detectar una señal relacionada con el analito desde los pocillos.
En determinadas modalidades, una o más gotas bifásicas pueden generarse y accionarse simultánea o secuencialmente para recubrir una sola serie de pocillos o múltiples series de pocillos. En determinadas modalidades, el método puede incluir la generación de múltiples gotas bifásicas que pueden ubicarse en una sola serie para recubrir completamente la serie cuando una única gota tiene un volumen insuficiente para recubrir la serie. En determinadas modalidades, el dispositivo DMF puede incluir múltiples series de pocillos y las gotas bifásicas individuales pueden moverse simultánea o secuencialmente para recubrir las series.
En determinados casos, el sellado de la serie de pocillos con un líquido inmiscible puede realizarse como parte de un método para detectar la presencia o ausencia de un analito en una muestra. La muestra puede analizarse generando primero una gota de líquido a partir de la muestra. Tal primera gota que contiene o se sospecha que contiene un analito de interés puede manipularse por los electrodos de DMF en el dispositivo de DMF. En determinadas modalidades, el método de la presente descripción puede incluir a) proporcionar una primera gota de líquido que contiene un analito de interés; (b) proporcionar una segunda gota de líquido que contiene al menos un soporte sólido que contiene un miembro de unión específico que se une al analito de interés; (c) usar energía para ejercer una fuerza para manipular la primera gota de líquido con la segunda gota de líquido para crear una mezcla; (d) mover la totalidad o al menos una porción de la mezcla a la serie de pocillos, en donde uno o más pocillos de la serie tienen un tamaño suficiente para acomodar al menos un soporte sólido; (e) agregar una etiqueta detectable a la mezcla antes o después de mover una porción de la mezcla a la serie de pocillos; (f) realizar las etapas de accionamiento como se describió en la presente descripción; (g) realizar las etapas de contacto como se describió en la presente descripción; y (h) detectar el analito de interés en los pocillos.
En determinados casos, el al menos un soporte sólido puede incluir al menos un miembro de unión que se une específicamente al analito de interés. En determinadas modalidades, el método puede incluir la adición de una etiqueta detectable a la mezcla después de mover al menos una porción de la mezcla a la serie de pocillos. En determinados casos, la gota acuosa puede incluir la etiqueta detectable. En determinadas modalidades, la etiqueta detectable puede incluir al menos un miembro de unión que se une específicamente al analito de interés. En determinados casos, la etiqueta detectable puede ser un cromógeno, un compuesto fluorescente, una enzima, un compuesto quimioluminiscente o un compuesto radiactivo. En determinados casos, el miembro de unión puede ser un receptor o un anticuerpo. En determinados casos, la energía puede ser una fuerza de accionamiento eléctrico. En determinados casos, la primera gota de líquido puede ser un líquido polarizable, la segunda gota de líquido puede ser un líquido polarizable, la mezcla puede ser un líquido polarizable o ambas, la primera gota de líquido y la segunda gota de líquido pueden ser, cada una, líquidos polarizables y directamente accionables por la fuerza eléctrica generada por electrodos DMF.
En determinados casos, el soporte sólido puede ser de partículas magnéticas. El uno o más pocillos de la serie pueden cargarse con al menos un soporte sólido mediante la aplicación de un campo magnético para facilitar el movimiento de al menos un soporte sólido dentro de uno o más pocillos de la serie. En determinadas modalidades, el movimiento de accionamiento de las gotas puede incluir usar una fuerza de accionamiento eléctrico que comprende corriente alterna. La corriente alterna puede tener una tensión media cuadrática (rms) de 10 V o más. En algunas modalidades, la corriente alterna puede tener una frecuencia de 5 KHz o más, por ejemplo, 5 KHz-50 KHz, 5 KHz-40 KHz, 5 KHz-30 KHz, 5 KHz-20 KHz, 5 KHz-15 KHz, por ejemplo, 5 KHz, 10 KHz, 15 KHz o 20 KHz. En otras modalidades, la corriente alterna puede tener una frecuencia que es un intervalo de radiofrecuencia.
En determinadas modalidades, la fuerza de accionamiento eléctrico generada por los electrodos DMF para mover las gotas puede ser una corriente alterna. Por ejemplo, la corriente alterna puede tener una tensión media cuadrática (rms) de 10V-100V, tal como 30V-70V, 30V-50V, 20V-70V, 20V-50V, 20V-100V, 30V-100V, 40V- 100 V, 50 V-100 V, 60 V-100 V, 70 V-100 V, 80 V-100 V, por ejemplo, 10 V, 15 V, 20 V, 25 V, 30 V, 35 V, 50 V, 70 V, 80 V, 90 V o más. Dispositivos y sistemas microfluídicos digitales
Los métodos descritos en la presente descripción pueden realizarse en una variedad de dispositivos y sistemas asociados que pueden realizar los métodos en cuestión de forma automática o semiautomática. En determinadas modalidades, un dispositivo microfluídico digital puede incluir un primer sustrato y un segundo sustrato, en donde el segundo sustrato se ubica sobre el primer sustrato y se separa del primer sustrato por un espacio; el primer sustrato comprende: una serie de electrodos ubicados sobre una superficie superior del primer sustrato; una primera capa colocada sobre la superficie superior del primer sustrato y que recubre la serie de electrodos; y una serie de pocillos ubicados en un área del dispositivo DMF, donde la serie de pocillos se ubica en el primer sustrato o en el segundo sustrato. En determinados casos, puede colocarse una segunda capa sobre una superficie superior de la primera capa. La primera capa puede estar hecha de un material que es dieléctrico e hidrófobo. La serie de pocillos puede ubicarse en la primera capa. En otros casos, la primera capa puede estar hecha de una capa dieléctrica y la segunda capa puede ser una capa hidrófoba. La serie de pocillos puede ubicarse en la segunda capa. En determinados casos, la serie de pocillos puede tener una superficie hidrófila.
La primera capa puede hacerse de un material que sea un material dieléctrico e hidrófobo. Los ejemplos de un material que es dieléctrico e hidrófobo incluyen plástico (por ejemplo, PET o PMMA), material de politetrafluoroetileno (por ejemplo, Teflón®) o un fluorosurfactante (por ejemplo, FluoroPel™). La primera capa puede depositarse de manera que proporcione una superficie sustancialmente plana. Una serie de pocillos puede ubicarse en una porción del primer sustrato por encima de una porción de la serie de electrodos. La serie de pocillos puede ubicarse en la primera capa y puede ser hidrófoba. En determinadas modalidades, antes o después de la fabricación de la serie de pocillos en la primera capa, puede colocarse una capa hidrófila sobre la primera capa para proporcionar una serie de pocillos que tengan una superficie hidrófila. El espacio/brecha entre el primer y segundo sustratos puede rellenarse con aire.
En determinados casos, la primera capa puede ser una capa dieléctrica y una segunda capa de un material hidrófobo puede colocarse sobre la capa dieléctrica. La serie de pocillos puede ubicarse en la capa hidrófoba. Antes o después de la fabricación de la serie de pocillos en la capa hidrófoba, una capa hidrófila puede colocarse sobre la capa hidrófoba.
En determinados casos, el segundo sustrato puede incluir una capa conductora que forma un electrodo. La capa conductora puede colocarse sobre una superficie inferior del segundo sustrato. La capa conductora puede recubrirse por una primera capa hecha de un material dieléctrico/hidrófobo tal como plástico (por ejemplo, PET o PMMA), como se describió anteriormente. En determinados casos, la capa conductora puede recubrirse por una capa dieléctrica. La capa dieléctrica puede recubrirse por una capa hidrófoba. La capa conductora y cualquiera de las capas que la recubra pueden colocarse a través de la superficie inferior del segundo sustrato. En determinadas modalidades, el segundo sustrato y cualquier capa colocada sobre él (por ejemplo, capa conductora, capa dieléctrica, etcétera) pueden ser sustancialmente transparentes, al menos en la región que se superpone a la serie de pocillos. En otros casos, la serie de electrodos en el primer sustrato puede configurarse como electrodos coplanares y el segundo sustrato puede no incluir un electrodo.
En determinados casos, los electrodos presentes en la primera capa y/o la segunda capa pueden fabricarse de un material sustancialmente transparente, tales como, óxido de indio y estaño, óxido de estaño dopado con flúor (FTO), óxido de zinc dopado y similares. En determinados casos, al menos una porción del primer sustrato y/o del segundo sustrato puede ser sustancialmente transparente para facilitar la interrogación óptica de la serie de pocillos. El electrodo DMF puede controlarse individualmente de manera que uno o más electrodos en un dispositivo DMF pueden encenderse mientras que otros electrodos en el dispositivo DMF pueden apagarse. Los electrodos DMF pueden ser coplanares o en configuración enfrentada. Por ejemplo, una serie de electrodos pueden estar presente en un sustrato del dispositivo y un electrodo de tierra colocado en el mismo sustrato o en un segundo sustrato colocado de manera separada del primer sustrato y definiendo una cámara entre ellos.
Los dispositivos descritos en la presente descripción pueden ser planos (sustancialmente planos) y pueden tener cualquier forma, tal como rectangular o cuadrada, rectangular o cuadrada con esquinas redondas y similares.
Los microfluidos basados en gotas se refieren a la generación y accionamiento (tal como mover, fusionar, dividir, etcétera) gotas de líquido a través de fuerzas activas o pasivas. Los ejemplos de fuerzas activas incluyen, pero no se limitan a, campo eléctrico. Las técnicas de fuerza activa ilustrativas incluyen electrohumectación, dielectroforesis, optoelectrohumectación, mediada por electrodos, mediada por campo eléctrico, accionamiento electrostático y similares o una de sus combinaciones. En algunos ejemplos, el dispositivo puede accionar gotas de líquido a través de la superficie superior de la primera capa (por ejemplo, entre la superficie inferior de la segunda capa y la superficie superior del primer sustrato) en el espacio a través de microfluidos basados en gotas, tales como, electrohumectación o a través de una combinación de electrohumectación y flujo de fluido continuo de las gotas de líquido. La electrohumectación puede implicar el cambio de las propiedades humectantes de una superficie mediante la aplicación de un campo eléctrico a la superficie y afectando la tensión superficial entre una gota de líquido presente en la superficie y la superficie. El flujo de fluido continuo puede usarse para mover gotas de líquido a través de una fuente de presión externa, tal como una bomba mecánica externa o microbombas mecánicas integradas o una combinación de fuerzas capilares y mecanismos electrocinéticos. Los ejemplos de fuerzas pasivas incluyen, pero no se limitan a, métodos de enfoque de flujo y unión en T. Otros ejemplos de fuerzas pasivas incluyen usar líquidos inmiscibles más densos, tales como, fluidos de aceite pesado, que pueden acoplarse a gotas de líquido sobre la superficie del primer sustrato y desplazar las gotas de líquido a través de la superficie. El líquido inmiscible más denso puede ser cualquier líquido que sea más denso que el agua y que no se mezcle con agua en un grado apreciable. Por ejemplo, el líquido inmiscible puede ser hidrocarburos, hidrocarburos halogenados, aceite polar, aceite no polar, aceite fluorado, cloroformo, diclorometano, tetrahidrofurano, 1-hexanol, etcétera. En otras modalidades, el accionamiento eléctrico se usa para mover una gota bifásica que contiene fases acuosas e inmiscibles en ausencia de fuerzas no eléctricas o pasivas. El accionamiento eléctrico provoca indirectamente el movimiento de la fase inmiscible al causar el movimiento de la fase acuosa de la gota bifásica que, a su vez, arrastra la fase inmiscible, en ausencia de la aplicación de una fuerza no eléctrica. Por lo tanto, en algunas modalidades, las gotas de aceite pueden usarse para empujar una gota acuosa, donde la gota de aceite se mueve mediante la aplicación de presión en ausencia de la aplicación de una fuerza eléctrica, tal como, durante un método para fusionar una gota de muestra con una gota de reactivo y similares.
El espacio entre el primer y el segundo sustrato puede ser de hasta 1 mm de altura, por ejemplo, 0,1 pm, 0,5 pm, 1 pm, 5 pm, 10 pm, 20 pm, 50 pm, 100 pm, 140 pm, 200 pm, 300 pm, 400 pm, 500 pm, 1 pm -500 pm, 100 pm -200 pm, etcétera. El volumen de la gota generada y que se mueve en los dispositivos descritos en la presente descripción puede variar de aproximadamente 10 pl a aproximadamente 5 picol, tal como, 10 pl - 1 picol, 7,5 pl -10 picol, 5 pl -1 nL, 2,5 pl -10 nL, o 1 pl -100 nL, 800- 200 nL, 10 nL - 0,5 pl, por ejemplo, 10 pl, 1 pl 800 nL, 100 nL, 10 nL, 1 nL, 0,5 nL, 10 picol o menos. Como se comprenderá, el volumen de la gota bifásica será la suma de los volúmenes de la gota acuosa y la gota inmiscible. El volumen de la gota bifásica puede estar en el intervalo de 10 pl a aproximadamente 5 picol.
La Figura 1A del documento WO2016/161400 ilustra un dispositivo 10 que puede usarse para realizar los métodos en cuestión. Como se describió en el documento WO2016/161400, el dispositivo 10 incluye un primer sustrato 11 y un segundo sustrato 12, donde el segundo sustrato 12 se ubica sobre el primer sustrato 11 y se separa del primer sustrato por un espacio 13. Como se ilustra en la Figura 1A, el segundo sustrato 12 tiene la misma longitud que el primer sustrato 11. Sin embargo, en otros dispositivos ilustrativos, el primer sustrato y el segundo sustrato pueden tener diferentes longitudes. El segundo sustrato puede incluir o no un electrodo. El primer sustrato 11 incluye una serie de electrodos 17 ubicados en la superficie superior del primer sustrato. Una capa 18 de material dieléctrico/hidrófobo (por ejemplo, teflón que es tanto dieléctrico como hidrófobo) se coloca sobre la superficie superior del primer sustrato y recubre la serie de electrodos 17. Una serie de pocillos 19 se ubican en la capa dieléctrica 18 en el primer sustrato 16. En determinados casos, la gota de fluido inmiscible usada en los métodos de la presente descripción puede introducirse en una región cercana del dispositivo, por ejemplo, cerca de la periferia del dispositivo.
La Figura 2A del documento WO2016/161400 ilustra otro dispositivo microfluídico digital ilustrativo 30 que puede usarse para realizar los métodos descritos en la presente descripción. El dispositivo 30 incluye un primer sustrato 31 y un segundo sustrato 32, donde el segundo sustrato 32 se ubica sobre el primer sustrato 31 y se separa de una superficie superior del primer sustrato por un espacio 33. El primer sustrato 31 incluye una porción 35, donde una gota de líquido, tal como, una gota de muestra, una gota de reactivo, etcétera, se introduce sobre el primer sustrato 31. El primer sustrato 31 incluye una porción distal 36, hacia la cual se mueve una gota de líquido. El primer sustrato 31 incluye una serie de electrodos 37 ubicados en la superficie superior del primer sustrato. Una capa 38 de material dieléctrico se coloca sobre la superficie superior del primer sustrato y recubre la serie de electrodos 37. Una capa 34 de material hidrófobo se superpone a la capa dieléctrica 38. Una serie de pocillos 39 se ubica en la capa hidrófoba 34 en la porción distal del primer sustrato 31. La serie de pocillos puede tener una superficie hidrófila o hidrófoba.
En algunos ejemplos, una gota acuosa puede introducirse en el espacio a través de un actuador de gotas (no ilustrado). En otros ejemplos, una gota acuosa o una gota de fluido inmiscible puede entrar en el espacio a través de una entrada, poro o canal de fluido. Los componentes asociados adicionales del dispositivo no se ilustran en las figuras. Tales componentes pueden incluir cámaras para contener muestras, tampones de lavado, miembros de unión, sustratos enzimáticos, fluidos de desecho, etcétera. Los reactivos de ensayo pueden estar contenidos en depósitos externos como parte del dispositivo, donde volúmenes predeterminados pueden moverse desde el depósito a la superficie del dispositivo cuando sea necesario para las etapas específicas del ensayo. Adicionalmente, los reactivos de ensayo pueden depositarse en el dispositivo en forma de reactivos secos, impresos o liofilizados, donde pueden almacenarse durante largos períodos de tiempo sin pérdida de actividad. Tales reactivos secos, impresos o liofilizados pueden rehidratarse antes o durante el análisis del analito.
En algunos ejemplos, el primer sustrato puede hacerse de un material flexible, tal como papel (con electrodos impresos por chorro de tinta), polímeros. En otros ejemplos, el primer sustrato puede hacerse de un material no flexible, tal como, por ejemplo, placa de circuito impreso, plástico o vidrio o silicona. En algunos ejemplos, el primer sustrato se hace de una sola lámina, que después puede sufrir un procesamiento posterior para crear la serie de electrodos. En algunos ejemplos, múltiples series de electrodos pueden fabricarse sobre un primer sustrato que puede cortarse para formar una pluralidad de primeros sustratos superpuestos con una serie de electrodos. En algunos ejemplos, los electrodos pueden unirse a la superficie de la capa conductora a través de un agente adhesivo general o soldadura. El segundo sustrato puede hacerse de cualquier material adecuado que incluye, pero no se limita a un material flexible, tal como papel (con o sin electrodos impresos por chorro de tinta), polímeros, placa de circuito impreso y similares. En otros ejemplos, el segundo sustrato puede hacerse de un material no flexible, tal como, por ejemplo, placa de circuito impreso, plástico o vidrio o silicona. En algunos ejemplos, el primer sustrato y el segundo sustrato se hacen de un material seleccionado independientemente del grupo que consiste en vidrio, silicio o plástico (por ejemplo, Tereftalato de Polietileno (PET) o Metacrilato de Polimetilo (PMMA). En algunos ejemplos, ambos sustratos pueden hacerse de PMMA.
En algunos ejemplos, los electrodos están compuestos por un metal, una mezcla o aleación de metales, una mezcla o aleación de metal semiconductor o un polímero conductor. Algunos ejemplos de electrodos de metal incluyen cobre, oro, indio, estaño, óxido de indio y estaño y aluminio. En algunos ejemplos, la capa dieléctrica comprende un material aislante que tiene una baja conductividad eléctrica o es capaz de soportar un campo eléctrico estático. En algunos ejemplos, la capa dieléctrica puede hacerse de porcelana (por ejemplo, cerámica), polímero o plástico (por ejemplo, PET o PMMA). En algunos ejemplos, la capa hidrófila puede hacerse de un material con propiedades hidrófobas, tales como, por ejemplo, plástico (por ejemplo, PET o PMMA), teflón, polímero de poli(p-xilileno) y fluorocarbonos genéricos. En otro ejemplo, el material hidrófobo puede ser un tensioactivo fluorado (por ejemplo, FluoroPel). En modalidades que incluyen una capa hidrófila depositada sobre la capa dieléctrica, puede ser una capa de vidrio, cuarzo, sílice, hidróxido metálico o mica.
Un experto en la técnica apreciaría que la serie de electrodos puede incluir un determinado número de electrodos por unidad de área del primer sustrato, cuyo número puede aumentar o disminuir según el tamaño de los electrodos y la presencia o ausencia de electrodos interdigitados. Los electrodos pueden fabricarse mediante el uso de una variedad de procesos que incluyen, fotolitografía, deposición de capas atómicas, trazado o grabado con láser, ablación con láser e impresión de electrodos con chorro de tinta.
En algunos ejemplos, un patrón de máscara especial puede aplicarse a una capa conductora colocada en una superficie superior del primer sustrato seguido de ablación con láser de la capa conductora expuesta para producir una serie de electrodos sobre el primer sustrato.
En algunos ejemplos, el potencial eléctrico generado por la serie de electrodos transfiere gotas acuosas formadas en una superficie superior de la primera capa (o la segunda capa cuando está presente) que recubre la serie de electrodos, a través de la superficie del dispositivo microfluídico digital para ser recibido por la serie de pocillos. Cada electrodo puede ser capaz de mover independientemente las gotas a través de la superficie del dispositivo microfluídico digital.
La Figura 3A del documento WO2016/161400 ilustra una vista lateral de un dispositivo microfluídico digital integrado ilustrativo 100 con una gota que se mueve en el espacio 170. En la Figura 3A del documento WO2016/161400, se ilustra una gota de líquido que se acciona desde la porción proximal 115 a la porción distal 130 que contiene la serie de pocillos 160. Una gota de líquido 180 que contiene una pluralidad de nanoperlas o nanopartículas 190 se mueve a través de la porción proximal 115 y hacia la porción distal 130 a través de un movimiento direccional activo mediante el uso de la serie de electrodos 145. La flecha indica la dirección del movimiento de la gota de líquido. Aunque en la presente se ilustran nanoperlas/nanopartículas, la gota puede incluir moléculas de analito en lugar de, o además de, las nanoperlas/nanopartículas.
En determinadas modalidades, el líquido inmiscible usado para sellar los pocillos y movido mediante el accionamiento eléctrico de la fase acuosa de la gota bifásica puede tener un momento dipolar molecular inferior a aproximadamente 0,9 D, una constante dieléctrica inferior a aproximadamente 3 y/o conductividades inferiores a aproximadamente 10-9 S m-1. En determinadas modalidades, el líquido inmiscible usado para sellar los pocillos y movido mediante el accionamiento eléctrico de la fase acuosa de la gota bifásica no es significativamente móvil mediante la aplicación de fuerza eléctrica por los electrodos DMF sin asociación es una fase acuosa que es móvil por la aplicación de fuerza eléctrica mediante los electrodos DMF. En determinadas modalidades, el líquido inmiscible usado para sellar los pocillos y movido mediante el accionamiento eléctrico de la fase acuosa de la gota bifásica no es significativamente polarizable.
La Figura 4A del documento WO2016/161400 ilustra una gota de líquido 180 que contiene nanoperlas o nanopartículas 190 que se han movido a la porción distal del dispositivo y se ubica sobre la serie de pocillos 160. La gota puede moverse continuamente sobre la serie de pocillos o el movimiento puede pausarse sobre la serie de pocillos. El movimiento de la gota y/o la pausa de la gota sobre la serie de pocillos facilita el depósito de las nanopartículas o nanoperlas 190 en la serie de pocillos 160. Los pocillos se dimensionan para incluir una nanoperla/nanopartícula. En el dispositivo ilustrado en la Figura 4A del documento WO2016/161400, la gota se mueve sobre la serie de pocillos mediante el uso de la serie de electrodos 145. Aunque en la presente se representan nanoperlas/nanopartículas, las gotas que contienen moléculas de analito también pueden moverse de manera similar, y mediante la pausa de la gota que contiene las moléculas de analito encima de los pocillos durante un período de tiempo suficiente para permitir que las moléculas de analito difundan en los pocillos antes de que el fluido inmiscible selle los pocillos. Los pocillos se dimensionan para incluir una nanoperla/nanopartícula. Los pocillos pueden dimensionarse, además, para incluir una molécula de analito por pocillo.
Como se usa en la presente descripción, los microfluidos digitales se refieren al uso de una serie de electrodos para manipular gotas en un dispositivo microfluídico, por ejemplo, mover gotas, dividir gotas, fusionar gotas, etcétera, en un espacio pequeño, tal como el espacio definido entre el primero y el segundo sustrato. Como se usa en la presente descripción, los términos "gotas" y "gotas de fluido" se usan indistintamente para referirse a un volumen discreto de líquido que tiene una forma aproximadamente esférica y se delimita en al menos un lado por una pared o sustrato de un dispositivo microfluídico. Aproximadamente esférico en el contexto de la gota se refiere a formas tales como esférica, esfera parcialmente aplanada, por ejemplo, en forma de disco, en forma de babosa, esfera truncada, elipsoide, hemisférica u ovoide. El volumen de la gota en los dispositivos descritos en la presente descripción puede variar de aproximadamente 10 pl a aproximadamente 5 pl, tal como 10 pl -1 pl, 7,5 pl -10 pl, 5 pl -1 nl, 2,5 pl - 10 nl o 1 pl -100 nL, por ejemplo, 10 pl, 5 pl, 1 pl, 800 nL, 500 nL o menos.
En algunos ejemplos, la serie de pocillos incluye una pluralidad de pocillos individuales. La serie de pocillos puede incluir una pluralidad de pocillos que pueden variar desde 109 a 10 en número por 1 mm2. En determinados casos, puede fabricarse una serie de aproximadamente 100 000 a 500 000 pocillos (por ejemplo, pocillos de femtolitros) que cubren un área de aproximadamente 12 mm2. Cada pocillo puede medir aproximadamente 4,2 pm de ancho X 3,2 pm de profundidad (volumen de aproximadamente 50 femtolitros) y puede ser capaz de contener una sola perla/partícula (de aproximadamente 3 pm de diámetro). A esta densidad, los pocillos de femtolitros están separados a una distancia de aproximadamente 7,4 micras entre sí. En algunos ejemplos, la serie de nanopocillos puede fabricarse para tener pocillos individuales con un diámetro de 10 nm a 10000 nm.
En determinados casos, la serie de pocillos que se interrogan ópticamente para medir una señal relacionada con la cantidad de analito presente en la muestra puede tener un volumen de subfemtolitros, volumen de femtolitros, volumen de subnanolitros, volumen de nanolitros, volumen de submicrolitros o volumen de microlitros. Por ejemplo, la serie de pocillos puede ser una serie de pocillos de femolitros, una serie de pocillos de nanolitros o una serie de pocillos de microlitros. En determinadas modalidades, los pocillos en una serie pueden tener todos sustancialmente el mismo volumen. La serie de pocillos puede tener un volumen de hasta 100 pl, por ejemplo, aproximadamente de 0,1 femtolitros, 1 femtolitros, 10 femtolitros, 25 femtolitros, 50 femtolitros, 100 femtolitros, 0,1 pL, 1 pL, 10 pL, 25 pL, 50 pL, 100 pL, 0,1 nL, 1 nL, 10 nL, 25 nL, 50 nL, 100 nL, 0,1 microlitro, 1 microlitro, 10 microlitros, 25 microlitros, 50 microlitros o 100 microlitros.
La colocación de nanoperlas/nanopartículas/moléculas de analitos individuales en los pocillos permite una lectura digital o una lectura analógica. Por ejemplo, para un número reducido de pocillos positivos (<~70 % positivos), pueden usarse las estadísticas de Poisson para cuantificar la concentración del analito en un formato digital; para un gran número de pocillos positivos (>-70 %), las intensidades relativas de los pocillos portadores de señales se comparan con la intensidad de la señal generada a partir de una única nanoperla/nanopartícula/molécula de analito, respectivamente, y se usan para generar una señal analógica. Puede usarse una señal digital para concentraciones de analito más bajas, mientras que puede usarse una señal analógica para concentraciones de analito más altas. Puede usarse una combinación de cuantificación digital y analógica, lo que puede expandir el intervalo dinámico lineal. Como se usa en la presente descripción, un "pocillo positivo" se refiere a un pocillo que tiene una señal relacionada con la presencia de una nanoperlas/nanopartículas/molécula de analito, cuya señal está por encima de un valor umbral. Como se usa en la presente descripción, un "pocillo negativo" se refiere a un pocillo que puede no tener una señal relacionada con la presencia de una nanoperla/nanopartícula/molécula de analito. En determinadas modalidades, la señal de un pocillo negativo puede estar en un nivel de fondo, es decir, más abajo de un valor de umbral.
Los pocillos pueden ser cualquiera de una variedad de formas, tales como, cilíndricos con una superficie inferior plana, cilíndricos con una superficie inferior redonda, cúbicos, cuboidales, troncocónicos, troncocónicos invertidos o cónicos. En determinados casos, los pocilios pueden incluir una pared lateral que puede orientarse para facilitar la recepción y la retención de una nanoperla o nanopartícula presente en las gotas de líquido que se han movido sobre la serie de pocillos. En algunos ejemplos, los pocillos pueden incluir una primera pared lateral y una segunda pared lateral, donde la primera pared lateral puede estar opuesta a la segunda pared lateral. En algunos ejemplos, la primera pared lateral se orienta en un ángulo obtuso con respecto a la parte inferior de los pocillos y la segunda pared lateral se orienta en un ángulo agudo con respecto a la parte inferior de los pocillos. El movimiento de las gotas puede ser en una dirección paralela a la parte inferior de los pocillos y desde la primera pared lateral a la segunda pared lateral.
En algunos ejemplos, la serie de pocillos puede fabricarse mediante uno o más de moldeo, presión, calor, láser, o una de sus combinaciones. En algunos ejemplos, la serie de pocillos puede fabricarse mediante el uso de litografía de nanoimpresión/nanoesfera.
Los dispositivos descritos en la presente descripción pueden fabricarse mediante numerosos métodos. En determinados casos, los métodos pueden implicar una combinación de ablación por láser, recubrimiento por pulverización, rollo a rollo y litografía de nanoimpresión (NIL) para construir el primer sustrato, series de electrodos, capa dieléctrica y capa hidrófoba. Los métodos ilustrativos se describen en el documento WO 2016/161400.
En determinadas modalidades, el chip DMF puede formarse mediante el uso de un primer sustrato y un segundo sustrato, donde la serie de pocillos se localiza en el primer sustrato y se usa en una configuración invertida. Por ejemplo, el primer sustrato forma una placa superior del chip DMF e incluye una primera superficie y una segunda superficie opuesta a la primera superficie y el segundo sustrato forma una placa inferior del chip DMF e incluye una primera superficie y una segunda superficie opuesta a la primera superficie, donde la primera superficie de la placa inferior está en configuración enfrentada con la segunda superficie de la placa superior y la serie de pocillos se ubica en la segunda superficie de la placa superior. En determinadas modalidades, la serie de pocillos puede ubicarse en una capa hidrófoba de manera que al menos las regiones entre los pocillos sean hidrófobas. El interior de los pocillos puede o no ser hidrófobo. En algunos casos, la región fuera de los pocillos es hidrófoba y la región dentro de los pocillos es hidrófila. En determinados casos, el sustrato superior puede incluir múltiples capas. Por ejemplo, el sustrato superior puede incluir, desde la parte superior a la inferior, una capa de vidrio o un polímero tal como un plástico (por ejemplo, PET, polímero de cicloolefina (COP) o PMMA), una capa de material conductor que forma un solo electrodo o una serie de electrodos accionables individualmente (por ejemplo, óxido de indio y estaño (ITO)), una capa de material aislante, una serie de pocillos ubicados en la capa de material aislante. En determinados casos, la capa de material aislante puede recubrirse con un material hidrófobo que puede o no estar dispuesto en el interior de los pocillos. El sustrato superior puede separarse del sustrato inferior con un separador que incluye un corte que define los lados de la cámara, con la segunda superficie de la placa superior y la primera superficie de la placa inferior definiendo la parte superior e inferior de la cámara. El sustrato inferior puede incluir múltiples capas. Por ejemplo, el sustrato inferior puede incluir, desde la parte superior a la inferior, una capa hidrófoba, una capa dieléctrica, una capa conductora que forma una serie de electrodos accionables individualmente o un solo electrodo, una capa de vidrio o un polímero tal como un plástico (por ejemplo, PET, polímero de cicloolefina (COP) o PMMA).
Puede utilizarse cualquier método estándar para fabricar el sustrato superior, el separador y el sustrato inferior de tal chip DMF. Por ejemplo, un rollo de PMMA, PET o COP puede recubrirse con una capa de material conductor que forma un solo electrodo (por ejemplo, un electrodo de tierra). El material conductor puede recubrirse con un material aislante y puede formarse una serie de pocillos en el material aislante mediante grabado con un rodillo de tambor que tiene columnas de tamaño micrométrico seguido del curado del material aislante con UV. El material aislante puede recubrirse con un material hidrófobo. El separador puede crearse mediante el uso de cualquier material inerte que pueda cortarse con láser para crear la forma deseada de la cámara DMF. El sustrato inferior puede ser un rollo de plástico con una capa de material conductor ubicado de esta manera. El material conductor sobre el sustrato inferior puede someterse a ablación con láser para formar una serie de electrodos DMF que incluyen una pluralidad de electrodos accionables individualmente. Puede disponerse un material dieléctrico sobre los electrodos, seguido por el recubrimiento del material dieléctrico con un recubrimiento hidrófobo. El sustrato superior, el separador y el sustrato inferior pueden alinearse manual, semiautomática o automáticamente y ensamblarse en un chip DMF donde la cámara definida por el sustrato superior, el separador y el sustrato inferior incluye un interior sustancialmente hidrófobo definido mediante una segunda superficie hidrófoba del sustrato superior y una primera superficie hidrófoba de la placa inferior. Por lo tanto, en algunas modalidades, las gotas se mueven entre dos superficies hidrófobas de la cámara de DMF. Para el ensamblaje del chip DMF, la segunda superficie del sustrato superior se coloca en una configuración enfrentada con la primera superficie del sustrato inferior, lo que resulta en la colocación de la serie de pocillos en el interior del chip DMF en una configuración invertida y enfrentando a la capa hidrófoba del sustrato inferior.
Los materiales usados para formar los chips DMF se describen en la presente descripción y pueden ser cualquier material estándar. En determinados casos, el sustrato superior puede incluir, desde la parte superior a la inferior, una capa de PET recubierta con una capa de material conductor (por ejemplo, ITO), recubierta con una capa de material aislante tal como Nalex en el que se forma mediante NIL una serie de pocillos, donde la capa de material aislante se recubre con un material hidrófobo tal como FluoroPel. En determinados casos, el sustrato inferior puede incluir, desde la parte superior a la inferior, una capa de recubrimiento hidrófobo (por ejemplo, FluoroPel) sobre un recubrimiento dieléctrico (por ejemplo, Cianoetil Pululano (CEP)), sobre una capa de aluminio (eliminado con láser para formar una serie de electrodos controlables individualmente), colocados sobre una capa de plástico (por ejemplo, PET o PMMA) o vidrio.
Los dispositivos de la presente descripción pueden operarse manual, automática o semiautomáticamente. En determinados casos, los dispositivos pueden operarse mediante un procesador que ejecuta un programa para realizar las etapas necesarias para generar una señal relacionada con el analito, sellar los pocillos como se describió en la presente descripción y/o detectar la señal. Como se usa en la presente, la frase "señal relacionada con el analito" o "señal asociada con el analito" se refiere a una señal que es indicativa de la presencia de un analito y es proporcional a la cantidad del analito en una muestra. La señal puede ser de fluorescencia, quimioluminiscencia, colorimétrica, turbidimétrica, etcétera. En determinados casos, la lectura puede ser digital, por ejemplo, el número de recuentos positivos (por ejemplo, pocillos) se compara con el número de recuentos negativos (por ejemplo, pocillos) para obtener un recuento digital.
La serie de nanopocillos puede fabricarse sobre la capa dieléctrica/hidrófoba, la capa hidrófoba (si está presente) o la capa hidrófila (si está presente). Un método ilustrativo para fabricar una serie de nanopocillos sobre la capa hidrófoba del primer sustrato usa litografía de nanoimpresión térmica o ultravioleta. Como se describió en la presente descripción, "rollo a rollo" puede incluir el término equivalente "carrete a carrete" (R2R) y funciona mediante el movimiento de un sustrato a través de varios componentes a altas velocidades, que incluye, por ejemplo, velocidades de metros por segundo. Los conjuntos de rollo a rollo facilitan el desenrollado de un sustrato enrollado, el avance del sustrato a través de los componentes y el rebobinado del sustrato procesado en un rollo.
En algunos ejemplos, la detección del analito o muestra biológica de interés puede ocurrir a través de la detección de señales ópticas. Por ejemplo, hacer brillar una luz de excitación (por ejemplo, un láser) para medir el resultado de la intensidad de la señal. En otros ejemplos, el analito deseado puede detectarse midiendo una señal óptica que emana de cada cámara de pocillo y cuantificarse mediante la cuantificación del resultado. Por ejemplo, el número de recuentos positivos (por ejemplo, pocillos) se compara con el número de recuentos negativos (por ejemplo, pocillos) mediante análisis digital. Pueden detectarse una variedad de señales de los pocillos del dispositivo. Las señales ilustrativas incluyen fluorescencia, quimioluminiscencia, colorimétrica, turbidimétrica, etcétera.
Pueden utilizarse varias fuerzas para facilitar el movimiento de partículas/perlas desde una gota ubicada sobre la serie de pocillos hacia los pocillos. Tales fuerzas incluyen la gravedad, la fuerza eléctrica, la fuerza magnética, etcétera. Pueden usarse imanes permanentes o electroimanes como fuente de fuerza magnética. Las moléculas de analito pueden depositarse en los pocillos mediante difusión.
Muestras de analitos y ensayos de detección de analitos
Puede usarse cualquier formato de ensayo para generar una señal detectable cuya señal es indicativa de la presencia de un analito de interés en una muestra y es proporcional a la cantidad del analito en la muestra. Ensayos tales como inmunoensayos, ensayos químicos clínicos, ensayos basados en células, reacciones fluorogénicas, ensayos enzimáticos y similares pueden generar una señal relacionada con el analito.
Los dispositivos proporcionados en la presente descripción pueden usarse para medir la cantidad de un analito de interés en una muestra. Como se usa en la presente descripción, los términos "analito", "analito diana", "analito de interés" se refieren al analito que se mide en los métodos y dispositivos descritos en la presente descripción. Un analito puede ser una molécula pequeña, un péptido, una proteína, un ARN, un ADN, un lípido, un carbohidrato, una toxina o una célula. Las muestras que pueden analizarse para determinar la cantidad de analito presente en la muestra pueden incluir muestras de fluidos biológicos tales como, por ejemplo, sangre, plasma, suero, saliva, sudor, orina, etcétera.
Como se usa en la presente descripción, los términos "muestra", "muestra de prueba", "muestra biológica" se refieren a una muestra de fluido que contiene o se sospecha que contiene un analito de interés. La muestra puede proceder de cualquier fuente adecuada. En algunos casos, la muestra puede comprender un líquido, partículas sólidas fluidas o una suspensión fluida de partículas sólidas. En algunos casos, la muestra puede procesarse antes del análisis descrito en la presente descripción. Por ejemplo, la muestra puede separarse o purificarse de su origen antes del análisis; sin embargo, en determinadas modalidades, una muestra sin procesar que contiene el analito puede analizarse directamente. La fuente de la molécula de analito puede ser sintética (por ejemplo, producida en un laboratorio), el medio ambiente (por ejemplo, aire, suelo, etcétera), un animal, por ejemplo, un mamífero, una planta o cualquiera de sus combinaciones. En un ejemplo particular, la fuente de un analito es una sustancia corporal humana (por ejemplo, sangre, suero, plasma, orina, saliva, sudor, esputo, semen, moco, fluido lagrimal, fluido linfático, fluido amniótico, lavado pulmonar, fluido cefalorraquídeo, heces fecales, tejidos, órganos o similares). Los tejidos pueden incluir, pero no se limitan a tejido muscular esquelético, tejido hepático, tejido pulmonar, tejido renal, tejido miocárdico, tejido cerebral, etcétera. La muestra puede ser una muestra líquida o un extracto líquido de una muestra sólida. En determinados casos, la fuente de la muestra puede ser un órgano o tejido, tal como una muestra de biopsia, que puede solubilizarse mediante desintegración del tejido/lisis celular. Una muestra puede procesarse antes de realizar un inmunoensayo en la muestra. Por ejemplo, la muestra puede concentrarse, diluirse, purificarse, amplificarse, etcétera.
Pueden usarse varios formatos de inmunoensayo que generan una señal relacionada con el analito. En algunas modalidades, una gota de muestra que contiene el analito diana puede fusionarse con una gota que contiene perlas magnéticas sobre las que se une un primer miembro de unión que se une específicamente al analito diana presente en la muestra. La fusión crea una única gota que puede incubarse durante un tiempo suficiente para permitir la unión del primer miembro de unión a un analito presente en la gota muestra. Opcionalmente, la única gota puede agitarse para facilitar la mezcla de la muestra con el primer miembro de unión. La mezcla puede lograrse moviendo la única gota hacia adelante y hacia atrás, moviendo la única gota alrededor de una pluralidad de electrodos, dividiendo una gota y después fusionando las gotas. A continuación, la única gota puede someterse a una fuerza magnética para retener las perlas en una localización del dispositivo mientras que la gota puede alejarse a una cámara de desechos o almohadilla y reemplazarse con una gota que contiene un segundo miembro de unión. El segundo miembro de unión puede etiquetarse de manera detectable. La etiqueta puede ser cualquier etiqueta que pueda detectarse ópticamente. La etiqueta puede ser una etiqueta fluorescente. Puede realizarse una etapa de lavado opcional, antes de agregar el segundo miembro de unión, mediante el movimiento de una gota de tampón de lavado a la localización en la que se retienen las perlas mediante el uso de la fuerza magnética. Las perlas pueden o no resuspenderse en el tampón de lavado; se aplica una fuerza magnética a las perlas magnéticas y el tampón de lavado se transporta a una localización de desecho. Después de un período de tiempo suficiente para que el segundo miembro de unión se una al analito unido al primer miembro de unión, la gota que contiene el segundo miembro de unión puede alejarse mientras las perlas se retienen en el lugar. Las perlas pueden lavarse mediante el uso de una gota de tampón de lavado. Después de la etapa de lavado, puede eliminarse la fuerza magnética y una gota que contiene las perlas etiquetadas que tiene un complejo del primer miembro de unión, el analito y el segundo miembro de unión pueden moverse a una serie de pocillos. Las perlas etiquetadas pueden introducirse en la serie de pocillos del módulo de detección. Las perlas pueden introducirse mediante el uso de la fuerza gravitacional o mediante la aplicación de la fuerza eléctrica o magnética. Después de una etapa de lavado opcional para eliminar cualquier perla que no se localice dentro de los pocillos, los pocillos pueden sellarse mediante el uso de un líquido hidrófobo, como se describió en la presente descripción.
En otra modalidad, el segundo miembro de unión puede unirse a una partícula o perla a través de un enlazador escindible. Después de la etapa de lavado para eliminar cualquier segundo miembro de unión no unido, la partícula o perla unida al segundo miembro de unión puede escindirse químicamente o por fotoescisión. Las partículas/perlas escindidas pueden moverse a la serie de pocillos y las partículas/perlas presentes en los pocillos pueden cuantificarse después de sellar los pocillos como se describió en la presente descripción. En algunos casos, las partículas/perlas unidas al segundo miembro de unión pueden etiquetarse. Por ejemplo, las partículas/perlas pueden codificarse por colores o ser fluorescentes.
En otra modalidad, el segundo miembro de unión puede unirse a una etiqueta escindible. Después de la etapa de lavado para eliminar cualquier segundo miembro de unión no unido, la etiqueta unida al segundo miembro de unión puede escindirse químicamente o mediante fotoescisión. La etiqueta escindida puede moverse al módulo de detección, donde se permite que la etiqueta difunda en los pocillos. Después de la eliminación de cualquier etiqueta no depositada en los pocillos, los pocillos pueden sellarse con un fluido hidrófobo como se describió en la presente descripción y la etiqueta puede cuantificarse.
También puede usarse un segundo formato de inmunoensayo que puede generar una señal relacionada con el analito. En algunas modalidades, una gota de muestra que contiene el analito diana puede fusionarse con una gota que contiene el analito etiquetado o una molécula competidora etiquetada para producir una única gota. El analito etiquetado o la molécula competidora etiquetada compite con el analito diana para unirse a un primer miembro de unión. La etiqueta puede ser cualquier etiqueta que pueda detectarse ópticamente. La etiqueta puede ser una etiqueta fluorescente. La única gota puede agitarse para facilitar la mezcla, lo que puede lograrse moviendo la única gota hacia adelante y hacia atrás, moviendo la única gota alrededor de una pluralidad de electrodos, dividiendo una gota y después fusionando las gotas, o mediante el uso de SAW y similares. La única gota puede fusionarse después con una gota que contiene perlas magnéticas sobre las que se une un primer miembro de unión que se une específicamente al analito diana y al analito etiquetado (o la molécula competidora etiquetada). La fusión crea una segunda única gota que puede incubarse durante un tiempo suficiente para permitir que el analito diana o el analito etiquetado (o la molécula competidora etiquetada) presente en la gota se una competitivamente con el primer miembro de unión. Opcionalmente, la segunda única gota puede agitarse para facilitar la mezcla de la mixtura del analito etiquetado con el analito diana con el primer miembro de unión. A continuación, la segunda única gota puede someterse a una fuerza magnética para retener las perlas en una localización del dispositivo, mientras que la gota puede alejarse a un depósito/almohadilla de desechos y las perlas pueden ponerse en contacto con una gota que contiene un tampón de lavado. Si se usa una etiqueta fluorescente, las perlas pueden volver a resuspenderse en el tampón de lavado y después las perlas pueden moverse al módulo de detección. Si la etiqueta usada es una enzima, se aplica una fuerza magnética para capturar las perlas magnéticas y el tampón de lavado se transporta a un lugar de desecho. Una gota que contiene sustrato enzimático puede ponerse en contacto con las perlas magnéticas que tienen un complejo del primer miembro de unión, el analito y el analito etiquetado. Puede realizarse una mezcla opcional, después de lo cual las perlas pueden moverse al módulo de detección. Las perlas etiquetadas pueden introducirse en la serie de pocilios. Las perlas pueden introducirse mediante el uso de fuerza gravitacional o mediante la aplicación de fuerza eléctrica o magnética. Después de una etapa de lavado opcional para eliminar cualquier perla que no se localice dentro de los pocillos, los pocillos pueden sellarse mediante el uso de un líquido inmiscible, como se describió en la presente descripción.
Como apreciarán los expertos en la técnica, los miembros de unión estarán determinados por el analito que va a analizarse. Se conocen miembros de unión para una amplia variedad de moléculas diana o pueden encontrarse o desarrollarse fácilmente mediante el uso de técnicas conocidas. Por ejemplo, cuando el analito diana es una proteína, los miembros de unión pueden incluir proteínas, particularmente anticuerpos o fragmentos de estos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, anticuerpos policlonales o monoclonales de longitud completa, fragmentos similares a anticuerpos, etcétera), otras proteínas, tales como proteínas receptoras, Proteína A, Proteína C, o similares. En caso de que el analito sea una molécula pequeña, tal como, esteroides, bilinas, retinoides y lípidos, el primer y/o el segundo miembro de unión puede ser una proteína estructural (por ejemplo, lipocalinas). En algunos casos, el miembro de unión para analitos proteicos puede ser un péptido. Por ejemplo, cuando el analito diana es una enzima, los miembros de unión adecuados pueden incluir sustratos de enzimas y/o inhibidores de enzimas que pueden ser un péptido, una molécula pequeña y similares. En algunos casos, cuando el analito diana es una especie fosforilada, los miembros de unión pueden comprender un agente de unión a fosfato. Por ejemplo, el agente quelante de fosfato puede comprender medios de afinidad de iones metálicos tales como los descritos en la Patente de EE. UU. núm. 7,070,921 y en la Solicitud de Patente de EE. UU. núm. 20060121544. En determinados casos, al menos uno de los miembros de unión puede ser un aptámero, un ácido nucleico, tal como, ADN, ARN, oligonucleótidos y similares.
En determinadas modalidades, el miembro de unión se une específicamente al analito. Por "se une específicamente" o "especificidad de unión" se entiende que el miembro de unión se une a la molécula de analito con suficiente especificidad para diferenciar entre la molécula de analito y otros componentes o contaminantes de la muestra de prueba. Por ejemplo, el miembro de unión, de acuerdo con una modalidad, puede ser un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo sobre un analito.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un método para sellar una serie de pocilios que tienen un fluido acuoso colocado en ellos al disponer una capa de fluido inmiscible sobre la serie de pocillos, el método comprende:
accionar el movimiento de una gota de fluido acuoso hacia una gota de fluido inmiscible mediante el uso de electrodos microfluídicos digitales (DMF) de manera que las dos gotas entren en contacto entre sí de esta manera forman una gota bifásica que comprende una fase acuosa formada por la gota de fluido acuoso y una fase no acuosa formada por la gota de fluido inmiscible;
accionar el movimiento de la fase acuosa de la gota bifásica mediante el uso de electrodos DMF de esta manera se arrastra la fase no acuosa presente en la gota bifásica hacia una serie de pocillos;
poner en contacto la serie de pocillos con la fase acuosa de la gota bifásica mediante el movimiento de accionamiento de la fase acuosa de la gota bifásica sobre la serie de pocillos mediante el uso de electrodos DMF; y
poner en contacto la serie de pocillos con la fase no acuosa de la gota bifásica mediante el movimiento de accionamiento de la fase acuosa de la gota bifásica a una posición adyacente a la serie de pocillos mediante el uso de electrodos DMF de manera que la fase no acuosa se arrastre sobre la serie de pocillos, en donde el contacto de la serie de pocillos con la fase no acuosa de la gota bifásica recubre la serie de pocillos con el fluido inmiscible para sellar de esta manera la serie de pocillos.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido inmiscible es un fluido hidrófobo que no puede accionarse directamente mediante electrodos DMF y en donde el fluido inmiscible se selecciona del grupo que consiste en hidrocarburo saturado, hidrocarburo insaturado, hidrocarburo aromático, aceite de silicona, perfluorocarbono, solventes de halógeno y una mezcla de estos.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido inmiscible es un aceite seleccionado del grupo que consiste en aceite de silicona y aceite mineral.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además disponer una gota del fluido inmiscible en un dispositivo microfluídico antes de las etapas de accionamiento, el dispositivo microfluídico comprende:
un primer sustrato y un segundo sustrato, en donde el segundo sustrato se separa del primer sustrato por un espacio, el primer sustrato comprende una pluralidad de electrodos DMF para generar fuerzas de accionamiento eléctrico sobre la gota de fluido acuoso; y
una serie de pocillos dimensionada de manera que la serie de pocillos se recubra por la gota del fluido inmiscible, en donde la serie de pocillos se ubica sobre el segundo sustrato.
5. El método de la reivindicación 4, en donde el dispositivo microfluídico incluye un depósito rellenado con el fluido acuoso y el método comprende generar la gota del fluido acuoso mediante el movimiento de accionamiento de una gota desde el depósito.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el fluido acuoso comprende un sustrato y en donde el método comprende poner en contacto la serie de pocillos con la fase acuosa de la gota bifásica durante un período de tiempo suficiente para la difusión del sustrato a la serie de pocillos.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el método comprende analizar la serie de pocillos para detectar la presencia de una señal relacionada con el analito.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde al menos el primer o segundo sustrato es sustancialmente transparente para facilitar la detección de la presencia de la señal relacionada con el analito.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el método comprende:
(a) proporcionar una primera gota de líquido que contiene un analito de interés;
(b) proporcionar una segunda gota de líquido que contiene al menos un soporte sólido que contiene un miembro de unión específico que se une al analito de interés;
(c) usar energía para ejercer una fuerza para manipular la primera gota de líquido con la segunda gota de líquido para crear una mezcla;
(d) mover la totalidad o al menos una porción de la mezcla a la serie de pocillos, en donde uno o más pocillos de la serie es de tamaño suficiente para acomodar al menos un soporte sólido;
(e) añadir una etiqueta detectable a la mezcla antes o después de mover una porción de la mezcla a la serie de pocillos;
(f) realizar las etapas de accionamiento de acuerdo con la reivindicación 1;
(g) realizar las etapas de contacto de acuerdo con la reivindicación 1; y
(h) detectar el analito de interés en los pocillos.
10. El método de la reivindicación 9, en donde el al menos un soporte sólido comprende al menos un miembro de unión que se une específicamente al analito de interés.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, que comprende además añadir una etiqueta detectable a la mezcla después de mover al menos una porción de la mezcla a la serie de pocillos.
12. El método de la reivindicación 11, en donde la etiqueta detectable está presente en la gota acuosa.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde la etiqueta detectable comprende al menos un miembro de unión que se une específicamente al analito de interés.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en donde la etiqueta detectable comprende un cromógeno, un compuesto fluorescente, una enzima, un compuesto quimioluminiscente o un compuesto radiactivo.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en donde el miembro de unión es un receptor o un anticuerpo.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-15, en donde la energía es una fuerza de accionamiento eléctrico.
17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-16, en donde la primera gota de líquido es un líquido polarizable, la segunda gota de líquido es un líquido polarizable, la mezcla es un líquido polarizable o la primera gota de líquido y la segunda gota de líquido son líquidos polarizables y directamente accionables mediante fuerza eléctrica generada por electrodos DMF.
18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-17, en donde el soporte sólido comprende partículas magnéticas.
19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-18, en donde uno o más pocillos de la serie se cargan con al menos un soporte sólido mediante la aplicación de un campo magnético para facilitar el movimiento de al menos un soporte sólido en uno o más pocillos de la serie.
20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en donde el movimiento de accionamiento de las gotas comprende usar una fuerza de accionamiento eléctrico que comprende corriente alterna.
21. El método de la reivindicación 20, en donde la corriente alterna tiene una tensión cuadrática media (rms) de 10 V o más.
ES18741602T 2017-01-18 2018-01-17 Métodos para el análisis de muestras Active ES2908883T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762447672P 2017-01-18 2017-01-18
PCT/US2018/014047 WO2018136509A1 (en) 2017-01-18 2018-01-17 Methods and devices for sample analysis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2908883T3 true ES2908883T3 (es) 2022-05-04

Family

ID=62905953

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18741602T Active ES2908883T3 (es) 2017-01-18 2018-01-17 Métodos para el análisis de muestras

Country Status (6)

Country Link
US (2) US10335791B2 (es)
EP (1) EP3570980B1 (es)
JP (1) JP7097895B2 (es)
CN (1) CN110621405B (es)
ES (1) ES2908883T3 (es)
WO (1) WO2018136509A1 (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7097895B2 (ja) * 2017-01-18 2022-07-08 アボット・ラボラトリーズ 試料分析のための方法およびデバイス
WO2019023646A2 (en) * 2017-07-27 2019-01-31 Maxim Integrated Products, Inc. ANALYTE SENSOR HOUSING AND METHOD FOR ANALYZING FLUID SAMPLES
CN112689751A (zh) 2019-05-31 2021-04-20 伊鲁米那股份有限公司 具有一个或更多个屏障特征的流通池
WO2020247533A1 (en) * 2019-06-03 2020-12-10 Abbott Laboratories Devices and methods for sample analysis
FR3106206A1 (fr) * 2020-01-14 2021-07-16 bioMérieux Procédé de détermination de l’intégrité d’un dépôt d’un complexe à base d’un échantillon biologique et système permettant la mise en œuvre dudit procédé.
US20230096625A1 (en) * 2020-03-10 2023-03-30 Abbott Laboratories Method for droplet loading into nanowells
CN112718028B (zh) * 2020-12-24 2022-11-01 深圳先进技术研究院 一种光操控液滴运动材料及其制备方法和应用
US11919003B2 (en) * 2021-01-22 2024-03-05 The University Of Hong Kong Loss-free liquids manipulation platform
JP2023034431A (ja) * 2021-08-31 2023-03-13 国立大学法人 東京大学 デジタルアッセイ方法及びデジタルアッセイキット

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7632651B2 (en) 1997-09-15 2009-12-15 Mds Analytical Technologies (Us) Inc. Molecular modification assays
US7070921B2 (en) 2000-04-28 2006-07-04 Molecular Devices Corporation Molecular modification assays
JP4547301B2 (ja) 2005-05-13 2010-09-22 株式会社日立ハイテクノロジーズ 液体搬送デバイス及び分析システム
CN2862037Y (zh) * 2005-12-12 2007-01-24 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 用于全自动生化分析仪的一次性反应杯链
WO2007123908A2 (en) 2006-04-18 2007-11-01 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based multiwell operations
US7439014B2 (en) * 2006-04-18 2008-10-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based surface modification and washing
WO2011084703A2 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Advanced Liquid Logic, Inc. Enzyme assays on a droplet actuator
US9180453B2 (en) * 2008-08-15 2015-11-10 University Of Washington Method and apparatus for the discretization and manipulation of sample volumes
US9156010B2 (en) * 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
TWI385029B (zh) 2009-12-18 2013-02-11 Univ Nat Chiao Tung 產生可移除外殼之包覆式液滴的微流體系統及方法
WO2011075667A2 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 Abbott Point Of Care, Inc. Biologic fluid analysis cartridge
EP2436444A1 (en) * 2010-10-01 2012-04-04 Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S.) Microfluidic device for production and collection of droplets of a fluid
US9095852B2 (en) * 2011-08-22 2015-08-04 The Regents Of The University Of California Multilayer high density microwells
CN103930210B (zh) * 2011-09-19 2018-06-12 国家科学研究中心 微流体***
WO2013110146A2 (en) * 2012-01-24 2013-08-01 Katholieke Universiteit Leuven Patterning device
WO2014108185A1 (en) * 2013-01-09 2014-07-17 Tecan Trading Ag Disposable cartridge for microfluidics systems
EP2943279B1 (en) * 2013-01-09 2023-07-12 Tecan Trading AG System for manipulating samples in liquid droplets
EP3248018B1 (en) * 2015-01-22 2020-01-08 Becton, Dickinson and Company Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells
EP3271713B1 (en) * 2015-03-18 2021-05-05 The Broad Institute, Inc. Massively parallel on-chip coalescence of microemulsions
BR112017021256A2 (pt) * 2015-04-03 2018-06-26 Abbott Laboratories dispositivos e métodos para a análise de amostras
CN105567548B (zh) * 2015-12-17 2018-08-10 青岛意诚融智生物仪器有限公司 一种用于快速多重pcr扩增的微流控芯片及检测方法
JP7097895B2 (ja) * 2017-01-18 2022-07-08 アボット・ラボラトリーズ 試料分析のための方法およびデバイス

Also Published As

Publication number Publication date
US10335791B2 (en) 2019-07-02
EP3570980A1 (en) 2019-11-27
US20200001300A1 (en) 2020-01-02
CN110621405B (zh) 2021-10-01
US11697117B2 (en) 2023-07-11
CN110621405A (zh) 2019-12-27
JP7097895B2 (ja) 2022-07-08
JP2020509345A (ja) 2020-03-26
WO2018136509A9 (en) 2019-08-01
WO2018136509A1 (en) 2018-07-26
EP3570980B1 (en) 2022-02-23
US20180207640A1 (en) 2018-07-26
EP3570980A4 (en) 2020-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2908883T3 (es) Métodos para el análisis de muestras
AU2021209235B2 (en) Devices and methods for sample analysis
CA2712863C (en) Droplet actuator devices and methods employing magnetic beads
US20150021189A1 (en) Multiplexed Detection Schemes for a Droplet Actuator
US20110091989A1 (en) Method of Reducing Liquid Volume Surrounding Beads
US20160108432A1 (en) Droplet actuator for electroporation and transforming cells
JP2005274573A (ja) ナノ構造表面を有する動的に制御可能な生物学的／化学的検出器
Kaler et al. Liquid dielectrophoresis and surface microfluidics
EP2208531A1 (en) Distribution of particles in capillary channel by application of magnetic field
US20110259742A1 (en) Droplet Based Miniaturized Device With On-Demand Droplet-Trapping, -Fusion, And -Releasing
JP5072847B2 (ja) 化学的／生物学的検出アレイ
JP2022547239A (ja) 磁性ビーズのマイクロ流体への作用
US11919003B2 (en) Loss-free liquids manipulation platform
WO2011098089A1 (en) Sample processing device and method
US20220088599A1 (en) Devices and methods for sample analysis
Yoon Open-surface digital microfluidics
JP2007120983A (ja) マイクロ流体チップ
Chuo et al. Signal enhancement by particle concentration using dielectrophoresis in an electrowetting-driven droplet