ES2908705T3 - Análisis de moléculas de interferencia de la señal de lactobacillus acidophilus La-5 - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un péptido aislado de una bacteria probiótica, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección bacteriana entérica en mamíferos, donde el péptido consiste en YPPGGP (SEQ ID NO:2).

Description

DESCRIPCIÓN
Análisis de moléculas de interferencia de la señal de Lactobacillus acidophilus La-5
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al control de bacterias patógenas en mamíferos. Más particularmente, la invención se refiere al aislamiento y a la identificación de moléculas secretadas/derivadas de bacterias probióticas para su uso en composiciones y métodos para su uso en el tratamiento y/o la prevención de infecciones por bacterias patógenas dañinas. Las moléculas aisladas son útiles en productos alimenticios nutricionales y médicos que proporcionan probióticos al tracto gastrointestinal de un mamífero.
Antecedentes de la invención
La Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7 (EHEC 0157) es un miembro de la Escherichia coli de adhesión y borrado (AEEC, por sus siglas en inglés) (3) que forma estructuras específicas conocidas como lesiones por adhesión y borrado (AE, por sus siglas en inglés) en la pared epitelial intestinal del huésped, que permiten que EHEC 0157 se adhiera íntimamente a la membrana epitelial con el fin de lograr la colonización (18, 22, 24). En una formación de lesión por AE, la adhesión inicial de la bacteria va seguida de la inyección de proteínas bacterianas en la célula huésped (8, 17, 21) a través de un aparato de translocación especializado, denominado sistema de secreción de tipo III (TTSS, por sus siglas en inglés). Esto da lugar a la reordenación del citoesqueleto y al borrado de las microvellosidades. Finalmente, se requiere una proteína de membrana externa bacteriana de 94 kDa, denominada intimina (19), que da lugar a la formación de la estructura tipo pedestal entre una bacteria y una célula huésped (9, 10, 27, 37).
Una serie de bacterias entéricas, entre las que se incluyen EHEC, se sabe que producen y/o responden a señales químicas llamadas autoinductores. El uso de este mecanismo de señalización de célula a célula facilita que los microbios entéricos regulen rasgos importantes que les permiten colonizar y/o iniciar satisfactoriamente la infección en su huésped (20). Los genes específicos de virulencia de EHEC están regulados por la detección del quórum (QS, por sus siglas en inglés) (34, 35) mediada por el sistema de señalización autoinductor-3/epinefrina/norepinefrina (36). El autoinductor-3 (Al-3) es una molécula producida por la microbiota gastrointestinal comensal que parece asemejarse a las hormonas epinefrina y norepinefrina producidas por el huésped (36) y se cree que permite a los patógenos entéricos organizar una activación/represión concertada de los genes específicamente requeridos. Asimismo, una quinasa sensora de EHEC, QseC, que se une a AI-3 y a las hormonas epinefrina/norepinefrina y regula la virulencia en un modelo de infección de conejo, proporciona pruebas de que este sistema QS participa en la comunicación cruzada entre reinos (5). Por tanto, los patógenos entéricos poseen un sistema de regulación extremadamente complejo que se usa para competir sistemáticamente en un entorno tan desafiante y la inhibición de este sistema QS puede conducir a una atenuación de la virulencia.
Salmonella spp. está muy extendida en el medio ambiente. S. Typhimurium DT104 es normalmente resistente a los antibióticos ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfonamidas y tetraciclina (ACSSuT tipo R) (48). Salmonella enterica serovar Typhimurium requiere la expresión del TTSS para una serie de importantes factores de virulencia como la invasión bacteriana, la apoptosis de los macrófagos y la enteropatogénesis (41, 43, 44, 46 y 47). La transcripción del gen del TTSS se activa en respuesta a señales ambientales (39, 40 y 45). Se cree que el ganado es un reservorio primario a través del cual los patógenos multirresistentes de salmonella pueden entrar en el suministro de alimentos.
El tracto gastrointestinal humano alberga un complejo ecosistema microbiano que contiene un gran número y variedad de bacterias que tienen un gran impacto en la función gastrointestinal y, de esta manera, en la salud y el bienestar humanos. Entre estas, algunas bacterias oportunistas se consideran perjudiciales y causan afecciones adversas tales como diarrea, infecciones, gastroenteritis y endotoxemia, mientras que otras bacterias se consideran "probióticas", en el sentido de que realizan funciones beneficiosas para el organismo humano (49).
Las bacterias probióticas son conocidas por estimular el sistema inmunitario y ejercer una exclusión competitiva de las bacterias patógenas y putrefactas, reducir las cantidades de amoníaco y colesterol en la sangre y promover la absorción de minerales (50). Adicionalmente, las bacterias probióticas producen efectos antagonistas contra los microorganismos patógenos; estimulan el sistema inmunitario; mejoran la digestión de la lactosa; son lipolíticas, permitiendo de esta manera que las grasas sean más digeribles; reducen el colesterol en plasma; protegen la mucosa intestinal, asegurando de esta manera la asimilación eficaz de las sustancias nutritivas; producen polisacáridos que son activos en algunos tumores; y reducen la viabilidad de algunos microorganismos productores de enzimas que catalizan la conversión de sustancias procancerígenas en cancerígenas. Se cree que las bacterias probióticas ejercen sus efectos de forma sinérgica para limitar y retrasar el crecimiento de las bacterias patógenas y perjudiciales del intestino (51 y 52).
Se cree que la salud y el bienestar de las personas y los animales pueden verse influidos positiva o negativamente por los microorganismos que habitan en el tracto gastrointestinal, y en particular en el intestino grueso. Estos microorganismos a través de la producción de toxinas, subproductos metabólicos, ácidos grasos de cadena corta, y similares, afectan a la condición fisiológica del huésped y mejoran el bienestar fisiológico del huésped. Como resultado, la investigación se ha centrado en el uso de cultivos probióticos en una variedad de composiciones y métodos para mejorar la salud.
Por ejemplo, el documento US 20040161422 divulga un producto alimenticio nutricional que comprende al menos una bacteria probiótica para mejorar la función intestinal. El documento US 20040115177 divulga métodos de administración de bacterias probióticas a animales de ganado en una cantidad eficaz para reducir la cantidad de bacterias peligrosas. Los suplementos dietéticos como los que, por ejemplo, se venden como parte de la línea PARINATtm están formulados con Lactobacillus acidophilus cepa L.B. y se afirma que son beneficiosos para los problemas digestivos e intestinales en general.
Los estudios también han determinado que L. acidophilus La-5 puede afectar a la expresión de genes relacionados con la virulencia en Escherichia coli O157:H7 (29). Se usó un medio agotado de células de La-5 y se descubrió que afectaba a los reguladores transcripcionales bacterianos, sin embargo, todos los estudios se llevaron a cabo in vitro en cultivos de Escherichia coli y, por tanto, las conclusiones no pudieron respaldar o identificar el(los) factor(es) bacteriano(s) responsable(s) de la regulación del sistema QS de EHEC 0157. Se concluyó por tanto en el estudio que se necesitaban modelos animales para caracterizar la eficacia y el uso potencial de L. acidophilus La-5 en las realizaciones terapéuticas en mamíferos.
Kitazawa et al. "Enzymatic digestion of the milk protein p-casein releases potent chemotactic peptide(s) for monocytes and macrophages.", International Immunopharmacology vol. 7, n.° 9, 12 de julio de 2007, páginas 1150­ 1159, divulga que los péptidos biológicamente activos liberados por la p-caseína de la leche digerida por actinasa pueden promover las respuestas inmunitarias innatas del huésped induciendo la migración y la activación de los macrófagos.
Medellin-Pena, M., J. et al. "Probiotics affect virulence-related gene expression in Escherichia coli O157:H7". Appl. Environ. Microbiol, Vol. 73, 2007, páginas 4259-4267 divulga que L. acidophilus La-5 secreta una molécula(s) que actúa(n) como un inhibidor de la señal de QS o interactúa(n) directamente con los reguladores de la transcripción bacteriana, controlando la transcripción de los genes de EHEC 0157 que participan en la colonización.
En vista de lo anterior, sería deseable aislar y caracterizar el(los) factor(es) producido(s) por las bacterias probióticas que proporcionan efectos beneficiosos en los mamíferos para la profilaxis, prevención y tratamiento de infecciones bacterianas perjudiciales, así como el uso de dichas moléculas como suplementos nutricionales y alimenticios para la salud en general.
Sumario de la invención
La invención es como se define en el juego de reivindicaciones adjuntas. Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia. En el presente documento se describen moléculas novedosas secretadas/derivadas de bacterias probióticas. Las moléculas novedosas son secretadas/derivadas de bacterias probióticas, lo que significa que son secretadas por las bacterias probióticas directamente en el medio o derivadas de fracciones de cultivo.
En el presente documento se describen fracciones proteináceas probióticas aisladas de las bacterias probióticas y las moléculas novedosas aisladas de dichas fracciones. Se describe el aislamiento, caracterización y métodos de uso de dichas moléculas para prevenir o tratar infecciones por bacterias dañinas como alternativa o complemento a la terapia antibiótica tradicional. Las moléculas pueden usarse ingeridas para mejorar la salud e incorporarse a las bebidas y a las fuentes alimentarias para mejorar las cualidades nutricionales.
Las moléculas son de bajo peso molecular y en unos aspectos, proteináceas, así como estables al calor y parcialmente afectadas por un tratamiento enzimático. Las moléculas secretadas también pueden usarse como suplemento nutricional para ayudar a mantener y/o aumentar la salud general de un mamífero y pueden incorporarse a una variedad de productos alimenticios y de bebida para facilitar su ingestión, así como incorporarse a medicamentos. Como tal, las moléculas secretadas pueden considerarse en un aspecto como probióticas. Por "probiótico" se define generalmente un suplemento alimenticio microbiano vivo que afecta de forma beneficiosa al ser humano o al animal huésped mejorando su equilibrio microbiano intestinal. Sin embargo, en la presente invención "probiótico" pretende abarcar las moléculas secretadas de las bacterias probióticas.
En el presente documento se describen moléculas secretadas aisladas de bacterias probióticas, siendo dichas moléculas secretadas eficaces in vitro e in vivo para prevenir y/o tratar una infección bacteriana.
En el presente documento se describen moléculas secretadas aisladas de bacterias probióticas, siendo dichas moléculas secretadas eficaces para la salud nutricional de un mamífero.
En el presente documento se describen composiciones que comprenden fracciones proteináceas probióticas liofilizadas que son eficaces en la prevención y/o el tratamiento de la infección por bacterias dañinas. Dichas fracciones liofilizadas también pueden usarse como fuente de salud nutricional de un mamífero.
En el presente documento se describen moléculas aisladas secretadas de una bacteria probiótica seleccionada entre Lactobacillus, Bifidobacteria y Streptococcus. En unos aspectos, la Bifidobacteria es una especie seleccionada entre Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium crudilactis. En otros aspectos, la bacteria probiótica es un Lactobacillus seleccionado entre Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus. En otros aspectos, la bacteria es Lactococcus Lactis. Todavía en otros aspectos, la bacteria probiótica procede de un Streptococcus tal como Streptococcus thermophilus.
Las moléculas secretadas son eficaces para el tratamiento y la terapia profiláctica contra bacterias infecciosas tales como, aunque de forma no limitativa, EHEC O157:H7 y Salmonella enterica.
En el presente documento se describe una composición que comprende una o más moléculas secretadas de una bacteria probiótica, siendo dicha composición eficaz para reducir y/o prevenir la infección bacteriana perjudicial en mamíferos.
En el presente documento se describe una composición que comprende una o más moléculas secretadas de una bacteria probiótica y un antibiótico, siendo dicha composición eficaz para reducir y/o prevenir la infección bacteriana perjudicial en mamíferos.
En el presente documento se describe una composición que comprende una o más moléculas secretadas de una bacteria probiótica, una fuente de azúcar y opcionalmente un antibiótico, siendo dicha composición eficaz para reducir y/o prevenir la infección bacteriana perjudicial en mamíferos. En unos aspectos, la fuente de azúcar comprende glucosa.
En el presente documento se describe una composición que comprende una o más moléculas secretadas de una bacteria seleccionada entre Lactobacillus, Bifidobacterium y Streptococcus y mezclas de los mismos.
Las moléculas secretadas son proteináceas. En aspectos adicionales, las moléculas secretadas son pequeños péptidos de bajo peso molecular. En aspectos adicionales, las moléculas secretadas pueden soportar calentamiento hasta aproximadamente 90 °C, congelación, descongelación, liofilización y/o secado por pulverización.
En el presente documento se describe una molécula secretada de Lactobacillus acidophilus (La-5), donde dicha molécula comprende una de las siguientes secuencias: YPVEPF, YPPGGP, YPPG y NQPY.
En el presente documento se describe una composición que comprende una molécula secretada de Lactobacillus acidophilus (La-5), donde dicha molécula puede inhibir la colonización por EHEC O157:H7 in vivo en un mamífero. De acuerdo con otro aspecto de la divulgación es una composición que comprende una molécula secretada de Lactobacillus acidophilus (La-5), donde dicha molécula comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos: YPVEPF, YPPGGP, YPPG y NQPY y dicha molécula puede prevenir y/o tratar la infección de EHEC O157:H7. Las secuencias de aminoácidos pueden tener sustituciones que no afectan negativamente a la actividad de la molécula secretada.
En el presente documento se describe una composición que comprende una molécula secretada de un Bifidobacterium seleccionado entre Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium infantis y/o Bifidobacterium crudilactis, donde dicha composición puede prevenir y/o tratar la infección de EHEC O157:H7 in vivo en un mamífero.
En el presente documento se describe un producto alimenticio, producto de bebida, medicamento o suplemento nutricional que comprende una o más moléculas secretadas de una bacteria seleccionada entre Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus Lactis, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium crudilactis, Streptococcus thermophilus y combinaciones de los mismos.
En el presente documento se describe un producto para la salud ingerible para mamíferos, donde dicho producto para la salud ingerible tiene características probióticas y comprende una o más moléculas secretadas de Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus Lactis, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium infantis y/o Bifidobacterium crudilactis.
En el presente documento se describe un método para prevenir y/o tratar terapéuticamente infecciones por Escherichia coli O157:H7 y/o Salmonella, comprendiendo el método administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende una o más moléculas secretadas de Lactobacillus acidophilus (La-5). En unos aspectos, las moléculas secretadas pueden comprender además las de Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus Lactis, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium crudilactis, Streptococcus thermophilus y combinaciones de los mismos. En el presente documento se describe un método para prevenir el transporte por parte de un animal para producción de alimentos de cepas de Salmonella que causan salmonelosis humana. El método comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de moléculas secretadas de bacterias probióticas al animal para producción de alimentos antes de la exposición a las cepas de Salmonella que causan salmonelosis humana. La administración de las moléculas secretadas de las bacterias probióticas se lleva a cabo mediante la alimentación con un corrector o aditivo de piensos que comprende una cantidad eficaz de dichas moléculas secretadas, o mediante el suministro de un aditivo para el tratamiento del agua o un inóculo al agua para beber de los animales. Por lo tanto, puede proporcionarse una composición de corrector de piensos que comprenda moléculas secretadas de bacterias probióticas y un aditivo para el agua que comprenda moléculas secretadas de bacterias probióticas. Las bacterias probióticas pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus Lactis, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium crudilactis, Streptococcus thermophilus y combinaciones de los mismos.
En el presente documento se describe un método para prevenir la infección por bacterias dañinas en un mamífero, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de una molécula(s) secretada(s) de una bacteria probiótica seleccionada entre el grupo que consiste en Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus Lactis, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium crudilactis, Streptococcus thermophilus y combinaciones de los mismos.
En el presente documento se describe un método para prevenir la colonización por bacterias dañinas en un mamífero, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de una molécula(s) secretada(s) de una bacteria probiótica seleccionada entre el grupo que consiste en Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus Lactis, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium infantis y/o Bifidobacterium crudilactis.
En el presente documento se describe un método para mejorar la salud general de un mamífero, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de una molécula(s) secretada(s) de una bacteria probiótica seleccionada entre el grupo que consiste en Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus Lactis, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium infantis y/o Bifidobacterium crudilactis.
La(s) molécula(s) descrita(s) en el presente documento puede(n) proporcionarse aislada(s) y/o purificada(s) o dentro de una fracción de cultivo libre de células de la bacteria probiótica. Como alternativa, las moléculas secretadas pueden proporcionarse dentro de una composición, producto o suplemento alimenticio comestible o líquido ingerible. Pueden usarse junto con bacterias probióticas enteras y con productos farmacéuticos tales como antibióticos conocidos.
Descripción de las figuras
La presente invención se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción con referencia a las Figuras, en las que:
Figura 1. Micrografías fluorescentes de células HEp-2 incubadas durante 6 h con la cepa EHEC 43984. La fluorescencia brillante con la tinción con isotiocianato y faloidina de fluoresceína, que indica la agregación de focos de alfa-actinina debajo de la EHEC adherida (flechas) se visualizó bajo las microcolonias por microscopía de fluorescencia. (A) Células infectadas; (B) Células no infectadas; (C) Células infectadas por EHEC coincubadas con 40 pl de fracción peptídica de L. acidophilus La5; y (D) células infectadas por EHEC LuxS (-ve). Aumento original, 40X. Barra, 22 pm. Las imágenes son representativas de tres ensayos independientes.
Figura 2. Imágenes de bioluminiscencia de ratones infectados por 108 UFC de EHEC 0157. Las imágenes se obtuvieron el 3er, 5° y 7° día posterior a la infección. Las áreas en las que hay presencia de EHEC 0157 luminiscente se muestran como una superposición de colores.
Figura 3. Promedio diario de excreción fecal de EHEC 0157. (0) grupo 2 (probiótico-EHEC), (A) grupo 3 (EHEC-probiótico) y (□) grupo 4 (control positivo). Los datos son valores fecales promedio diarios de cada grupo (medias ± desviaciones típicas, n = 5).
Figura 4. Pesos corporales de los ratones durante la semana siguiente a la exposición indicados como porcentaje de los pesos iniciales. (x) grupo 1 (control negativo), (0) grupo 2 (probiótico-EHEC), (A) grupo 3 (EHEC-probiótico) y (□) grupo 4 (control positivo). Los datos son valores de peso promedio diarios de cada grupo (medias ± desviaciones típicas, n = 5).
Figura 5. Efecto de la fracción de medio agotado libre de células de LA-5 (F54) y de CFSM de Bifidobacteria en la inducción de hilA en Salmonella Typhimurium mediante el ensayo LuxS. Las desviaciones típicas de la media se calculan a partir de 2 ensayos independientes con 3 pocilios por ensayo. La expresión del gen hilA se controla mediante la luminiscencia (URL) producida por la construcción de Salmonella.
Figura 6. Efecto de CFSM y de las fracciones de CFSM de LA-5 (F54) y de Bifidobacteria en la inducción de LEE1 en E. coli enterohemorrágica O157:H7 mediante el ensayo LuxS. Las desviaciones típicas de la media se calculan a partir de 2 ensayos independientes con 3 pocillos por ensayo. La expresión de LEE1 se controla mediante la luminiscencia (URL) producida por la construcción de E. coli Ol57:H7.
Figura 7. Efecto de CFSM de LA-5 y de Bifidobacteria (fracción de CFSM 54 [F54] separado por cromatografía de intercambio catiónico [CEX]) en la inducción de LEE1 en E. coli enterohemorrágica O157:H7 mediante el ensayo LuxS. Las desviaciones típicas de la media se calculan a partir de 2 ensayos independientes con 3 pocillos por ensayo. La expresión de LEE1 se controla mediante la luminiscencia (URL) producida por la construcción de E. coli O157:H7.
Figura 8. Actividad de luminiscencia de las fusiones LEE1::luxCDABE y LEE2::IuxCDABE en E. coli O157:H7 (C3, C4) cultivada en caldo LB solo (EHEC/LB) o en caldo LB suplementado con un 10 % de fracciones de CFSM de L. acidophilus La-5 25 a 40 (EHEC/F). Los datos se recopilaron tras 16 h de crecimiento. Los resultados se expresaron como unidades relativas de luz (URL) definidas como recuentos min"1 y ajustadas a DO600 (URL/DO600). Los datos son valores media ±DT de tres replicados independientes.
Figura 9. Bioensayo del autoinductor-2 realizado tres veces con las mismas muestras. EHEC O157:H7 (ATCC 43894) se cultivó durante 16 h en caldo LB solo (EHEC/LB) o suplementado con un 10 % de fracciones de CFSM de L. acidophilus La-525 a 40 (EHEC/F). Los sobrenadantes libres de células de estos cultivos se recogieron como se describe en la sección de métodos. Los resultados se expresaron como unidades relativas de luz (URL) definidas como recuentos min"1 y ajustadas a DO600 (URL/DO600). Los datos son valores media ±DT de tres replicados independientes.
Figura 10. Fraccionamiento de los péptidos de CFSM de L. acidophilus por FPLC de exclusión de tamaños.
Figura 11. Análisis de LC-MS del pico del péptido 1 (Maira 1).
Figura 12. Análisis
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del pico del péptido 1 (Maira 3).
Figura 13. Análisis de LC-MS del pico del péptido 1 (Maira 4).
Figura 14 Construcción de E. coli O157:H7 C3 (LEE1::lux) y C4 (LEE2::lux) cultivada en caldo LB suplementado con medio acondicionado por el crecimiento de LAB probióticas. Las construcciones cultivadas en caldo LB:MRS se usaron como controles positivos (datos no mostrados). La inducción de la luz se notifica como unidades relativas de luz (URL) por célula.
Figura 15. Construcción de E. coli O157:H7 C1 (LEE1::lux), C2 (LEE2::lux), C3 (LEE1::lux) y C4 (LEE2::lux) cultivada en caldo LB suplementado con medio acondicionado por el crecimiento de LAB probióticas. Las construcciones cultivadas en caldo LB:MRS se usaron como controles positivos (datos no mostrados). La inducción de la luz se notifica como unidades relativas de luz (URL) por célula. Figura 16. Producción de una molécula de señalización de AI-2 según lo detectado por el bioensayo del autoinductor-2 de V. harveyi. La cepa de EHEC O157:H7 43894 se cultivó en caldo LB suplementado con CFSM de LAB probióticas. Los controles positivos y negativos fueron la cepa V. harveyi BB152 (+) y E. coli DH5a (-), respectivamente (control negativo no mostrado). Los resultados se expresaron como unidades relativas de luz (URL) definidas como recuentos min-1 y ajustadas a DO600 (URL/DO600). Los datos son valores media ± DT de tres replicados independientes de cada muestra.
Descripción detallada
En el presente documento se describen moléculas secretadas aisladas de bacterias probióticas y otras fracciones de cultivo de las bacterias que pueden minimizar, inhibir y tratar la infección por patógenos entéricos dañinos en mamíferos. Las moléculas han demostrado ser eficaces tanto in vitro como in vivo. En particular, la(s) molécula(s) ha(n) sido aislada(s) y caracterizada(s) a partir de Lactobacillus acidophilus (La-5), así como de cepas de Bifidobacterium tales como, aunque de forma no limitativa, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis y Bifidobacterium crudilactis (Delcenserie, V., F. Gavini, H. Beerens, O. Tresse, C. Franssen, y G. Daube. 2007. Description of a new species, Bifidobacterium crudilactis sp. nov., isolated from raw milk and raw milk cheeses. Syst Appl Microbiol. 30:381-9; Daube, G., V. Delcenserie, y F. Gavini. 31-03-2006, 2006. Probiotic Bifidobacterial Species. Solicitud de patente internacional: documento PCT/EP2006/061247, y también de Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus Lactis y Streptococcus thermophilus. Las moléculas secretadas se han mostrado ahora eficaces contra la colonización de Escherichia coli O157:H7 y Salmonella.
Por "secretadas/derivadas" se entiende que las bacterias probióticas secretan las moléculas novedosas directamente en el medio de cultivo. En unos aspectos, las moléculas también pueden formarse indirectamente dentro del medio de cultivo.
Las moléculas novedosas secretadas en unos aspectos son pequeños péptidos que son resistentes a la temperatura (pueden ser calentados, congelados y descongelados y seguir mostrando actividad), son estables durante largos periodos de tiempo congelados (más de dos años), pueden producirse fácilmente en grandes volúmenes (por ejemplo, aproximadamente 2mg/l), pueden liofilizarse y secarse por pulverización. Las moléculas pueden incorporarse a una variedad de sustancias para su administración a un mamífero tal como cualquier tipo de animal y a seres humanos. Por ejemplo, las moléculas secretadas pueden incorporarse a cualquier tipo de producto alimenticio, suplemento nutricional o bebida para consumo animal o humano. Como tratamiento terapéutico, las moléculas secretadas pueden administrarse de una manera a un animal o a un ser humano para el tratamiento eficaz de una infección bacteriana tal como por EHEC O157:H7 o Salmonella. Como tratamiento terapéutico o profilaxis, el tratamiento puede realizarse en conjunto con otros antibióticos u otras terapias según se desee. Las moléculas secretadas pueden usarse en composiciones y en métodos además del uso de bacterias probióticas enteras.
En unos aspectos, las moléculas secretadas se aíslan de Lactobacillus acidophilus (La-5), donde dicha molécula comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: YPVEPF, YPPGGP, YPPG y NQPY. Un experto en la materia entiende que estas secuencias pueden ser alteradas por deleción, sustitución o inserción, siempre que la actividad de las moléculas secretadas no se vea sustancialmente afectada para reducir y/o prevenir la infección bacteriana.
Las secuencias pueden tener además inserciones, sustituciones o deleciones de uno o más de los residuos de aminoácidos. Asimismo, las moléculas de la invención pueden alterarse aún más con glicosilación, desglicosilación, sales orgánicas e inorgánicas y modificarse covalentemente. También se abarcan las moléculas modificadas para aumentar la semivida in vivo, p. ej., PEGiladas. Las modificaciones posibles pero no limitantes de las moléculas de la invención incluyen modificaciones que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos junto con una deleción de uno o más aminoácidos o la adición de uno o más aminoácidos.
Las moléculas pueden proporcionarse en una cantidad terapéuticamente eficaz individualmente o dentro de una composición y pueden variar en función de factores tales como el estado de infección/salud, edad, sexo y peso del receptor. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima y pueden quedar a discreción del médico o veterinario tratante. Por ejemplo, pueden administrarse diariamente o a intervalos periódicos varias dosis divididas, y/o la dosis puede reducirse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. La cantidad de la molécula para administración dependerá de la vía de administración, del tiempo de administración y variará en función de las respuestas del sujeto individual. Las vías de administración adecuadas son las inyecciones intramusculares, inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas o inyecciones intraperitoneales, administración oral e intranasal. Las composiciones que comprenden las moléculas o las fracciones de cultivo pueden comprender entre aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 90 % en peso del activo y cualquier intervalo intermedio.
Las moléculas o fracciones de cultivo pueden administrarse durante un periodo de horas, días, semanas o meses, dependiendo de varios factores, incluyendo la gravedad de la infección que se está tratando, si se considera probable una recurrencia de la infección, o para prevenir la infección, etc. La administración puede ser constante, p. ej., infusión constante durante un periodo de horas, días, semanas, meses, etc. Como alternativa, la administración puede ser intermitente, p. ej., las moléculas pueden administrarse una vez al día durante un periodo de días, una vez por hora durante un periodo de horas, o cualquier otra pauta de este tipo que se considere adecuado.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden prepararse mediante métodos conocidos per se para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que puedan administrarse a los sujetos, de manera que una cantidad eficaz de la sustancia activa se combina en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se describen vehículos adecuados, por ejemplo, en "Handbook of Pharmaceutical Additives" (compilado por Michael e Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, Inglaterra, 1995)). Sobre esta base, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las sustancias en asociación con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y pueden estar contenidas en soluciones tamponadas con un pH adecuado y/o ser isoosmóticas con fluidos fisiológicos. A este respecto, se puede hacer referencia a la patente de Estados Unidos n.° 5.843.456.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato cálcico, gelatina, dextrina, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo y agua. Es más, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender uno o más estabilizadores tales como, por ejemplo, hidratos de carbono que incluyen sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrina y glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína, y tampones como los fosfatos alcalinos.
Por ejemplo, como ejemplo veterinario, una composición que contenga las moléculas secretadas en un vehículo aceptable puede administrarse a un animal al menos aproximadamente tres semanas antes del envío del animal en una cantidad eficaz para reducir la cantidad de Salmonella en el animal tanto antes como después de la cosecha. Las moléculas secretadas de las bacterias probióticas pueden administrarse en un vehículo aceptable a través de una vía de administración alimentaria (por ejemplo, producto lácteo, agua, pienso, o cualquier medio adecuado) o por una vía de administración medicinal (por ejemplo, inoculación oral o intranasal). Los vehículos aceptables para las moléculas secretadas de las bacterias probióticas incluyen productos de pienso para el ganado, incluyendo, por ejemplo, cultivos de leche o yogur. También puede producirse una forma seca de las moléculas secretadas del cultivo probiótico y añadirse al pienso mediante el proceso de liofilización. Las moléculas secretadas liofilizadas pueden administrarse a los animales por cualquier vía de administración adecuada, incluyendo pienso seco y agua.
Al administrar dicha terapia antes del transporte, los niveles significativos de bacterias peligrosas tales como Salmonella, se reducen en el ganado antes y después del sacrificio.
La administración de las moléculas secretadas aisladas de las bacterias probióticas puede realizarse por cualquier método que pueda introducir las moléculas en el tracto digestivo. Las bacterias pueden mezclarse con un vehículo y aplicarse a un pienso líquido o sólido o al agua para beber. El material vehiculante debe ser no tóxico para el animal. Las moléculas también pueden formularse en una composición proporcionada como pasta inoculante para ser inyectada directamente en la boca del animal. La formulación puede incluir ingredientes añadidos para mejorar la palatabilidad, mejorar la vida útil, impartir beneficios nutricionales, y similares. Si se desea una dosis reproducible y medida, las moléculas pueden administrarse mediante una cánula ruminal, como se describe en el presente documento. La cantidad de las moléculas secretadas aisladas de las bacterias probióticas que se van a administrar se rige por factores que afectan a la eficacia. Mediante el control del número de E. coli O157:H7 en las heces antes, durante y después de la administración de las moléculas secretadas de las bacterias probióticas, los expertos en la materia pueden determinar fácilmente el nivel de dosificación necesario para reducir la cantidad de E. coli O157:H7 que portan los animales. Las moléculas secretadas de una o más cepas de bacterias probióticas pueden administrarse conjuntamente. Una combinación de cepas puede ser ventajosa puesto que los animales individuales pueden diferir en cuanto a la cepa que es más persistente en un individuo determinado.
Las moléculas secretadas de las bacterias probióticas pueden administrarse como preventivo, para evitar que los animales que no son actualmente portadores de E. coli O157:H7 adquieran la cepa por exposición a otros animales o entornos donde está presente E. coli O157:H7. Los terneros jóvenes y los animales maduros que vayan a ser trasladados a un nuevo lugar, tal como un corral de alimentación, son candidatos atractivos para la administración preventiva. El tratamiento de los animales portadores de E. coli O157:H7 puede llevarse a cabo para reducir o eliminar la cantidad de E. coli O157:H7 que portan los animales, administrando las moléculas secretadas de las bacterias probióticas a los animales infectados por E. coli O157:H7. Los animales de los que se sabe que excretan E. coli O157:H7 en las heces, o los criados donde se sabe que existe E. coli O157:H7 son candidatos adecuados para el tratamiento con las moléculas de la invención.
Los métodos para administrar las moléculas secretadas de las bacterias probióticas son esencialmente los mismos, ya sea para la prevención o para el tratamiento. Por lo tanto, se elimina la necesidad de determinar primero si los animales son portadores de E. coli O157:H7. Al administrar rutinariamente una dosis eficaz a todos los animales de un rebaño, el riesgo de contaminación por E. coli O157:H7 puede reducirse o eliminarse sustancialmente mediante una combinación de prevención y tratamiento.
Un experto en la materia entiende que las moléculas aisladas y las fracciones de cultivo que las contienen, pueden usarse junto con terapias antibióticas conocidas para la prevención y/o el tratamiento de la infección bacteriana en mamíferos. También se entiende que las composiciones de las moléculas novedosas, ya sean aisladas o en fracciones de cultivo aisladas, también pueden usarse conjuntamente (formuladas con) con una fuente de azúcar, tal como por ejemplo glucosa en cantidades de hasta aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 0,1 % o más en peso de la composición.
También se entiende que, aunque las composiciones de la invención pueden ingerirse directamente o usarse como aditivo junto con los alimentos, se apreciará que pueden incorporarse a una variedad de alimentos y bebidas, incluyendo, aunque de forma no limitativa, yogures, helados, quesos, productos horneados tales como pan, galletas y pasteles, alimentos lácteos y sustitutos de los lácteos, productos de confitería, composiciones de aceite comestible, productos para untar, cereales para el desayuno, zumos y similares. Dentro del ámbito del término, "alimentos" se incluirán, en particular, los alimentos susceptibles de ser clasificados como alimentos funcionales, es decir, "alimentos de apariencia similar a los alimentos convencionales y destinados a ser consumidos como parte de una dieta normal, pero que han sido modificados para desempeñar funciones fisiológicas más allá del suministro de un simple nutriente". De manera similar, las composiciones de la invención pueden presentarse en formas de dosificación tales como en una cápsula. De nuevo, las cantidades de la molécula aislada activa variarán en función del alimento o la bebida particular y puede contener cualquier cantidad hasta aproximadamente el 100 % del producto, especialmente cuando se formula como una cápsula ingerible. Un experto en la materia entiende también que las moléculas, ya sean aisladas o proporcionadas como parte de una fracción de cultivo pueden combinarse con el uso de bacterias probióticas en métodos de tratamiento o para la suplementación nutricional.
El CFSM de Lactobacillus acidophilus La-5 disminuyó la adhesión de E. coli O157:H7 a las células de cultivo tisular.
Anteriormente se demostró que L. acidophilus La-5 SM influía en el T3SS de EHEC 0157 (29). Actualmente se detectó una regulación por disminución de la expresión de genes importantes relacionados con la virulencia después de que EHEC 0157 se cultivara en un medio suplementado con fracciones biológicamente activas de CFSM de L. acidophilus La-5 (fracciones de La-5) en comparación con EHEC 0157 cultivada en el mismo medio sin la adición de fracciones de La-5. Actualmente se ha demostrado que la adición de la fracción de La-5 influye en la adhesión de EHEC 0157 a las células eucariotas in vitro e in vivo. La adhesión y la formación de lesiones por AE en células eucariotas (líneas celulares HEp-2 y HeLa, respectivamente) se redujeron sustancialmente cuando se añadieron las fracciones de La-5 antes de la exposición a la cepa de E. coli O157:H7 ATCC 43894. La infección de las células HeLa con EHEC 0157 sola mostró el típico comportamiento de adherencia localizada (Fig. 1A). Sin embargo, cuando se coincubó con la fracción de La-5 se pudo visualizar la reducción de la acumulación de actina debajo de las bacterias adheridas (Fig. 1C). Las células HeLa infectadas con EHEC 0157 LuxS" en presencia de propanolol no mostraron evidencia de acumulación de actina (Fig. 1D); comparable a las células HeLa no infectadas incubadas solo con la fracción seleccionada de CFSM de La-5 (F34) (Fig. 1B). Para complementar el ensayo FAS se realizó el ensayo de adhesión con la misma cepa de EHEC 015743894 en la línea celular HEp-2. Los resultados del ensayo de adhesión se resumen en la Tabla 2. La infección de las células HEp-2 con EHEC 0157 se normalizó al 100 % con el fin de compararla con las células tratadas con La-5. El grado de adhesión se redujo en un 76 % en los pocillos que contenían la fracción biológicamente activa de La-5.
La adhesión de EHEC a las células epiteliales humanas implica la activación de la intimina adhesina, una proteína de la membrana externa codificada por el gen eae (9, 26, 27, 37). Trabajos anteriores (27) demostraron que la producción de antisueros específicos de intimina bloqueaba la adherencia de EHEC a las células HEp-2. La capacidad inmunogénica de intimina se ha estudiado ampliamente para desarrollar vacunas anti-EHEC y anti-EPEC (6, 7, 12, 28). Los resultados demuestran que las moléculas secretadas por las bacterias probióticas podrían usarse para evitar la adhesión de EHEC a las células epiteliales en modelos de cultivo tisular.
Relación entre la dosis infecciosa de EHEC y la formación de imágenes bioluminiscentes en ratones ICR.
Se determinó la dosis infecciosa óptima de EHEC para la formación de imágenes bioluminiscentes de la colonización bacteriana en ratones SPF ICR. Se usaron cinco concentraciones celulares diferentes, que variaban de 105 a 109 células por dosis, para una sola estimulación con la cepa bioluminiscente de EHEC 0157. La señal bioluminiscente para los ratones infectados con 105 células fue muy débil a lo largo del experimento y solo en una inoculación de 107 UFC o más la señal fue lo suficientemente fuerte como para ser visualizada y calculada (Tabla 3). Basándose en un trabajo anterior en el que EHEC 0157 proliferó en los intestinos de los ratones a las 24 h de la infección (2), se esperaba que una dosis de 105 UFC hubiera sido suficiente para emitir una fuerte potencia luminosa. El objetivo era controlar la colonización de EHEC 0157 in vivo en un corto periodo de tiempo, se seleccionó una dosis de inoculación de 108 UFC para los estudios de exposición.
La fracción biológicamente activa de L. acidophilus La-5 reduce la adhesión de EHEC al epitelio intestinal de ratones ICR.
Se comparó la capacidad de EHEC 0157 para colonizar ratones tratados con la fracción de La-5 probiótica y ratones ICR no tratados. Se recuperó EHEC 0157 de las heces de todos los grupos de ratones infectados con el organismo (es decir, los grupos 2, 3 y 4) a lo largo del estudio. La proporción de ratones que excretaban EHEC 0157 disminuyó significativamente a lo largo del estudio en los animales que recibieron la fracción de La-5 (grupos 2 y 3; P = 0,0004 y P = 0,002, respectivamente); sin embargo, la excreción fecal en los ratones que fueron infectados con EHEC 0157 en ausencia de la fracción (grupo 4) aumentó a 109 UFC g-1 después del quinto día posterior a la infección (Fig. 3). En este momento, los ratones del grupo 4 mostraban signos de deshidratación y deterioro físico y fueron reevaluados cada 8 h (Fig. 4). Tres ratones del grupo 4 murieron durante el periodo de evaluación y el resto mostró una reducción significativa de la temperatura corporal (< 34 °C). En el día 5, se alcanzó el criterio de valoración del grupo 4 y los ratones restantes fueron sacrificados (Tabla 4). Para los grupos 2 y 3, el estado de los ratones siguió siendo aceptable diez días posteriores a la infección. Se tomaron y analizaron las señales bioluminiscentes de los ratones de los grupos 2, 3 y 4 con el fin de comparar sus intensidades de luz en los momentos especificados. Al tercer día del experimento, todos los ratones fueron infectados por vía oral con 108 UFC de EHEC 0157. La bioluminiscencia se controló el tercer, quinto y séptimo día después de la infección. En el tercer día después de la infección, se observó una fuerte bioluminiscencia en el tracto gastrointestinal (GI) de todos los ratones de los grupos 4 (Fig. 2a) y 3 (Fig. 2c), y de dos ratones del grupo 2 (Fig. 2f). No hubo diferencias significativas en los valores de bioluminiscencia de todos los grupos de ratones al tercer día posterior a la infección. Sin embargo, se observaron diferencias significativas después del quinto día posterior a la infección, ya que un ratón del grupo 2 (Fig. 2g) y dos ratones del grupo 3 (Fig. 2d) no mostraron ninguna señal bioluminiscente. Sin embargo, el ratón que produjo la señal positiva del grupo 3 (Fig. 2d) mostró una fuerte bioluminiscencia en comparación con la débil señal bioluminiscente que emanaba de los dos ratones del grupo 2 (Fig. 2g). La bioluminiscencia observada al séptimo día posterior a la infección disminuyó considerablemente en ambos grupos tratados con probióticos, lo que indica que la fracción de La-5 probiótica es capaz de inhibir la adhesión de EHEC 0157 a las células epiteliales intestinales (Fig. 2e y Fig. 2h). Se ha propuesto que la presencia de bacterias probióticas en el tracto gastrointestinal del huésped mejora la inmunidad; protegiendo de esta manera al huésped contra las infecciones bacterianas (11, 13, 31, 32). Teniendo en cuenta la especificidad de las cepas de probióticos (2), se seleccionó y empleó un medio agotado libre de células de una bacteria probiótica que reguló por disminución los genes relacionados con la virulencia de EHEC in vitro (29). Debido a la capacidad de las células probióticas de proteger a los huéspedes animales y humanos una vez presentes en su tracto GI (14-16, 30, 33, 38), la presente invención se centró en el papel de las moléculas secretadas por los probióticos en el control de la infección.
Actividad contra otros patógenos entéricos
También se demostraron los efectos de las moléculas secretadas de L. acidophilus LA-5 y de varias cepas de Bifidobacteria contra la expresión de genes de virulencia de Salmonella entérica serovar Typhimurium. La selección del gen hilA (Hyper Invasive Locus, locus hiperinvasivo) para el ensayo de fusión génica se basó en su importancia en la transcripción del gen del sistema de secreción de tipo III (TTSS) codificado dentro de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI1).
Se estudió el medio agotado libre de células (CFSM, por sus siglas en inglés) de los probióticos y el CFSM fraccionado por cromatografía de exclusión de tamaños (SEC, por sus siglas en inglés) mediante el ensayo de fusión del gen LuxS. El ensayo LuxS se usó para determinar la expresión de hilA (luxCDABE::hilA). Ni la fracción de CFSM de Bifidobacteria ni de CFSM de LA-5 (F54) afectaron a las tasas de crecimiento de Salmonella (Fig. 5). Cuando se determinó mediante el ensayo LuxS, se descubrió que el CFSM tenían un efecto inhibidor en la expresión de hilA en comparación con el control (Fig. 5).
Actividad producida por otras bacterias probióticas
También se analizaron los efectos de las moléculas secretadas por varias cepas de bacterias probióticas probadas: Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium crudilactis y tres especies de Bifidobacteria aún no nombradas contra la Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7 y la expresión del gen de virulencia de Salmonella enterica serovar Typhimurium mediante el ensayo LuxS. Los resultados de estos experimentos mostraron que las cepas probióticas contienen moléculas que actúan de manera similar a L. acidophilus LA-5 inhibiendo la inducción de LEE1 en E. coli enterohemorrágica O157:H7 (Fig. 6) y hilA en S. Typhimurium (Fig. 5). Ni la fracción de CFSM de Bifidobacteria ni CFSM de LA-5 (F54) afectaron a las tasas de crecimiento de Salmonella (Fig. 5) y E. coli enterohemorrágica O157:H7 (Fig. 6). Estos resultados preliminares muestran diferencias en la actividad inhibitoria, pero se cree que se debe a la concentración de la(s) molécula(s). Todas las cepas probióticas crecen a tasas diferentes y el protocolo usado para recoger el medio agotado libre de células bacterianas fue tras un periodo de 24 h, ya que se estandarizó el periodo de crecimiento de acuerdo con las diferencias de tasa de crecimiento.
El efecto del medio acondicionado por el crecimiento de las cepas probióticas sobre la expresión de los genes asociados a la virulencia de E. coli O157:H7 se caracterizó además de la siguiente manera para identificar cepas adicionales de bacterias probióticas eficaces contra EHEC: (1) La activación o represión de los operones de LEE se controló usando una cepa de EHEC (ATCC 43894) transformada con construcciones indicadoras de genes que contienen el gen de la luciferasa luxCDABE (amablemente proporcionado por el Dr. Haifeng Wang). Estas construcciones operan bajo el control transcripcional de los promotores de LEE. La expresión de los operones de LEE se midió como la emisión de luz producida por las construcciones de E. coli O157:H7 tras su exposición al medio acondicionado por el crecimiento de las cepas probióticas. Cepas probióticas utilizadas y consideradas eficaces: Lactobacillus reuteri (RC14) (control), Lactobacillus fermentum (LFER), Lactobacillus rhamnosus (GR1), Lactococcus lactis (LL), Lactobacillus acidophilus La5 (LA5) y Streptoccocus thermophilus (STTH).
Identificación de las moléculas secretadas activas
Se estudiaron las fracciones extracelulares de los cultivos de B. infantis tras 24 h de crecimiento. Tras la centrifugación (6000 g, 10 min) de 1 litro de cultivo, el sobrenadante se filtró a través de filtros de membrana de acetato de celulosa (tamaño de poro: 0,22 pm). A continuación, el medio agotado libre de células (CFSM) se concentró mediante liofilización a 1/100 del volumen original. El CFSM liofilizado se volvió a suspender en agua de grado biológico molecular y se separó mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) y las fracciones activas se almacenaron a -2o °C para su posterior análisis. Después de la SEC se usó cromatografía de intercambio iónico (IEC, por sus siglas en inglés), ya que es adecuada para el fraccionamiento, purificación y cribado de la muestra. Las diferentes fracciones (proteínas básicas y ácidas concentradas por IEC y sus flujos continuos) se analizaron entonces con el ensayo LuxS para determinar cuál de estas fracciones posee la actividad deseada. Tras confirmar la presencia de moléculas activas, las fracciones se usarán en análisis multidimensionales, tales como electroforesis en gel 2-D y HPLC. Al mismo tiempo, se llevaron a cabo ensayos de cultivo tisular con Salmonella enterica serovar Typhimurium y posiblemente con otros patógenos transmitidos por los alimentos.
Los resultados preliminares muestran que la molécula activa del CFSM de B. infantis se unió a la columna de cromatografía de intercambio catiónico (Aurum CEX, BioRad), lo que sugiere que las moléculas pueden ser un pequeño péptido señal que posee residuos de aminoácidos básicos (Fig. 7). La primera etapa de separación de moléculas de las cantidades a granel se realizó mediante la cromatografía de exclusión por tamaños (SEC). Tras las fracciones separadas, se realizaron bioensayos con EHEC O157:H7 para confirmar la presencia de la(s) molécula(s) biológicamente activa(s). Por consiguiente, el análisis de las fracciones biológicamente activas se llevó a cabo mediante espectroscopia de masas por electrospray (ES-MS, por sus siglas en inglés) y resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés). Los resultados de la ES-MS y la NMR mostraron que las fracciones biológicamente activas seguían siendo excesivamente complejas, evitando un informe concluyente de la naturaleza de las fracciones estudiadas. Las fracciones biológicamente activas fueron sometidas a tratamientos de sensibilidad al pH, enzimáticos y de temperatura para tratar de arrojar algo de luz sobre su naturaleza. Los resultados de estas pruebas, indicaron que las fracciones biológicamente activas podrían ser muy pequeñas y de naturaleza proteica.
Persiguiendo la necesidad de purificación, las fracciones biológicamente activas se separaron aún más mediante SEC a baja presión y las fracciones recogidas se leyeron a longitudes de onda de 214 y 280 nm y se analizó de nuevo la actividad contra EHEC O157:H7. Se recogieron cuatro picos de los cuales dos seguían siendo activos in vitro. Las fracciones biológicamente activas consistieron en cuatro picos de péptidos que se enviaron para la secuenciación de péptidos y las secuencias proporcionadas en el presente documento en la sección de ejemplos. Se puede obtener una comprensión más completa de la presente invención haciendo referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Aunque se han empleado términos específicos en el presente documento, dichos términos tienen por objeto un sentido descriptivo y no con fines de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Fracciones libres de células
Las fracciones libres de células se prepararon como se ha descrito previamente (25). En resumen, la cepa de Lactobacillus acidophilus La-5 se cultivó durante una noche en un medio DeMann, Rogosa y Sharpe modificado. (mMRS, por sus siglas en inglés; 10 g de peptona de caseína, 8 g de extracto de carne, 4 g extracto de levadura, 8 g de D(+)-glucosa, 2 g hidrogenofosfato de dipotasio, 2 g de hidrogenocitrato de diamonio, 5 g de acetato de sodio, 0,2 g de sulfato de magnesio, 0,04 g de sulfato de manganeso en 1 l de agua destilada) (MRS; BD Diagnostic Systems, Sparks, MD). El cultivo de una noche se diluyó 1:100 en medio fresco. Cuando el cultivo creció hasta una densidad óptica a 600 nm (DO600) de 1,6 (1,2 x 108 células/ml), las células se cosecharon por centrifugación a 6.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se esterilizó filtrando a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 pm (Millipore, Bioscience Division, Mississauga, ON, Canadá) y se denominará medio agotado libre de células (CFSM). Se recogieron dos litros de CFSM de L. acidophilus La-5 y se liofilizaron (Unitop 600 SL, VirTis Co., Inc. Gardiner, NY., Estados Unidos). El CFSM liofilizado se reconstituyó con 200 ml de agua 18-0. El contenido total de proteínas del CFSM reconstituido se cuantificó usando el kit de ensayo de proteínas DC II de BioRad (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, ON, Canadá). El CFSM liofilizado se almacenó a -20 °C antes de los ensayos.
Ejemplo 2 - Fraccionamiento del CFSM de L. acidophilus La-5
Cinco mililitros de CFSM se depositaron directamente en una columna de Biogel P2 (Bio-Rad, Missasauga, ON., Canadá) (exclusión, 100 a 1.800 Da; 2,5 x100 cm; Bio-Rad Laboratories Ltd.) y se analizó a temperatura ambiente en agua 18-0 a un caudal de gravedad de 0,8 ml/min, y se recogieron ochenta fracciones de 5 ml. Las fracciones recogidas se liofilizaron y se volvieron a suspender en 1 ml de agua 18-0 para el cribado preliminar contra EHEC LEE1, LEE2 y la producción de AI-2 como se ha descrito previamente (29). El contenido total de proteínas de las fracciones se cuantificó usando el kit de ensayo de proteínas DC II de BioRad. Se seleccionaron las fracciones que mostraban una fuerte actividad inhibidora contra la expresión de LEE y la producción de AI-2.
Ejemplo 3 - Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas usadas en este estudio se describen en la Tabla 1. La cepa de L. acidophilus La-5 se cultivó en condiciones anaeróbicas a 37 °C en medio mMRS (29). La cepa de E. coli O157:H7 VS94 (36) se cultivó en caldo Luria-Bertani (LB) (BD Diagnostic Systems). La cepa bioluminiscente de E. coli O157:H7 (luxCDABE) se cultivó en agar LB suplementado con ampicilina (Amp) y kanamicina (Km) (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON, Canadá) a una concentración cada una de 50 pg/ml y se incubó durante una noche a 37 °C. Se tomó una sola colonia de la placa y se subcultivó en caldo LB y en medio esencial mínimo de Dulbecco con alto contenido en glucosa (DMEM/alto) (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) suplementado con los antibióticos y se incubó durante una noche a 37 °C en un agitador a 150 rpm. La correlación entre la luminiscencia y el recuento de células en el caldo LB se estableció mediante una técnica convencional de recuento en placa y mediante la medición de la bioluminiscencia para 1 ml de diluciones seriadas de cultivo con un luminómetro de tubo (MGM Instruments, Hamden, CT). Para la infección de los ratones, un cultivo de una noche se centrifugó a 13.000 x g durante 10 min, se lavó y se volvió a suspender en caldo LB fresco suplementado con antibióticos.
Ejemplo 4 - Tinción fluorescente de los filamentos de actina
Los ensayos FAS se realizaron como se ha descrito previamente (23) con algunas modificaciones. Las células epiteliales de adenocarcinoma de cuello uterino humano, HeLa, fueron proporcionadas por el Dr. Roger Johnson (Laboratorio de Zoonosis Transmitidas por Alimentos, Agencia de Salud Pública de Canadá). Las células HeLa se cultivaron en medio esencial mínimo completo de Eagle (EMEM) (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) suplementado con un 2 % (v/v) de suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) (Invitrogen Canada Inc, Burlington, ON, Canadá). A continuación, las células se sembraron en placas sobre portaobjetos de microcámaras de 4 pocillos a 2 x 105 células ml-1 y se incubaron durante 24 h en presencia de CO2 al 5 %. Las células se mantuvieron a continuación durante el ensayo en EMEM libre de suero ni antibióticos. Antes de la inoculación con bacterias, se añadieron fracciones seleccionadas de CFSM de L. acidophilus (F33 y F34) a los pocillos del grupo de tratamiento. Como control negativo para la formación de lesiones por AE se usó una cepa de E. coli O157:H7 luxS negativo. Los pocillos del grupo de control negativo se inocularon con 105 cepa de E. coli O157:H7 VS94 con o sin suplementación con 100 pM de propanolol, y solo con las fracciones seleccionadas de L. acidophilus. El propanolol se usó para suprimir la complementación del fenotipo AE por las hormonas epinefrina y norepinefrina producidas por las células eucariotas. Tras la inoculación de la cepa EHEC 015743894 en los pocillos de tratamiento y de control positivo, los portaobjetos se incubaron durante 6 h a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %. A continuación, se lavaron las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) y se añadió medio fresco. Las células se incubaron durante otras 3 h y luego se lavaron seis veces con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4 %. Las células fijadas y lavadas se permeabilizaron tratando los portaobjetos con Triton X-100 al 0,1 % en PBS durante 15 min. Las células se incubaron con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,2 % (Invitrogen Canada Inc.) en PBS durante 1 h. Después de tres lavados en PBS, los portaobjetos se trataron con una solución de 10 pg/ml de faloidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés) (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) en PBS durante 40 min para teñir específicamente los filamentos de actina. Los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS y luego se examinaron con un microscopio Zeiss Axioskope 2 con filtros de fluorescencia para FITC (Carl Zeiss Canada, Inc., North York, ON, Canadá). Las imágenes se grabaron usando el Axiocam y el software Zeiss Axiovision (Carl Zeiss Canada, Inc.).
Ejemplo 5 - Ensayo de adhesión de células HEp-2
Con el fin de comparar los niveles de adherencia a las células epiteliales HEp-2 en cultivo, se usó un modelo establecido para evaluar la adherencia de EHEC O157:H7 (27). Las células epiteliales de carcinoma laríngeo humano, HEp-2, fueron un amable regalo del Dr. Carlton Gyles (Departamento de Patobiología, Universidad de Guelph). En resumen, las células HEp-2 cultivadas en EMEM suplementado con un 10 % (v/v) de FBS se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos a 2 x 105 células ml-1 y se incubaron durante 24 h en presencia de CO2 al 5 %. Las células se mantuvieron a continuación durante el ensayo en EMEM libre de suero ni antibióticos. Antes de la inoculación con bacterias, se añadió por triplicado un 10 % (v/v) de fracciones seleccionadas de CFSM de L. acidophilus a los pocillos de los grupos de tratamiento. Los pocillos que contenían los grupos de control negativo se inocularon con 105 cepa de E. coli O157:H7 VS94 con o sin suplementación con 100 pM de propanolol (Sigma-Aldrich Canada Ltd.). Tras la inoculación de 105 EHEC 0157 en los pocillos de tratamiento y de control positivo, las placas se incubaron durante 3 h a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %. A continuación, las monocapas celulares se lavaron tres veces con PBS para eliminar las bacterias no adheridas y se añadió medio fresco. Las células se incubaron durante otras 3 h y luego se lavaron seis veces con PBS. Las células lavadas se lisaron con Triton X-100 al 0,1 %. Se recogieron las bacterias liberadas presentes en la suspensión y se sembraron en placas diluciones adecuadas en agar LB. Para evaluar si el porcentaje de adherencia en los grupos de tratamiento era significativamente diferente al del grupo de control, donde los recuentos recuperados del grupo de control (2,2 x 107 UFC ml-1) se consideraron para ser del 100 %, el porcentaje de adherencia en los grupos de control negativo y de tratamiento se calculó mediante la siguiente ecuación.
% de recuperación = Grupo UFC ml-1 x 100
2,2 x 107
Ejemplo 6 - Experimentos de colonización en ratones
Los ratones ICR hembra SPF se obtuvieron a las 3 semanas de edad en Taconic Farms (Hudson, NY), y se usaron para los experimentos tras una semana de aclimatación. Los ratones se alojaron en la Unidad de Aislamiento de la Instalación Central de Animales (Universidad de Guelph) en un entorno de temperatura controlada con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. El cuidado de los animales se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de utilización de animales n.° 04R030 (Universidad de Guelph) y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (1). Los ratones fueron alimentados con alimento balanceado comercial sólido esterilizado para roedores y agua. Cuando fuera necesario, el agua se suplementó con Amp y Km a una concentración de 400 mg l-1 y 200 mg l-1, respectivamente. Se evaluó diariamente el peso de cada ratón, la temperatura corporal, los signos de deshidratación, la postura y el estado de alerta.
Ejemplo 7 - Experimentos con ratones
Experimentos dosis-respuesta
Se dividieron diez ratones en 5 grupos iguales (n=2), y cada grupo se infectó por alimentación por sonda oral con 100 pl de suspensión celular bacteriana que contenía de 105 a 109 células. Los ratones recibieron los antibióticos necesarios para la selección del plásmido codificador de luxCDABE en su agua para beber a las concentraciones mencionadas previamente. Se añadió sacarosa (5 % p/v) (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) con el fin de hacer que el agua suplementada con los antibióticos fuera apetecible. La solución de sacarosa al 5 % suplementada con los antibióticos se cambió diariamente.
Experimentos de alimentación-infección
Los ratones se dividieron en cuatro grupos. El grupo 1 fue alimentado con 100 pl de fracción de La-5 (control negativo) (n=5); los grupos 2 y 3 fueron alimentados diariamente con 100 |jl de la fracción de La-5 2 días antes (probiótico-EHEC) y 2 días después (EHEC-probiótico) de la estimulación con 108 UFC ml"1 de EHEC, respectivamente (n=5); y el grupo 4 (control positivo) fue infectado con 108 UFC ml"1 de EHEC (n=5). Los experimentos de alimentación-infección se repitieron tres veces.
Formación de imágenes bioluminiscentes
La formación de imágenes bioluminiscentes se realizó como se ha descrito previamente (4) con pequeñas modificaciones. En resumen, la formación de imágenes bioluminiscentes se controló el 3er, 5° y 7° día después de la infección. Antes de la formación de imágenes, los ratones fueron anestesiados con un cóctel compuesto por ketamina (60 mg kg"1) y medetomidina (0,75 mg kg"1). Se usó atipamezol (2,25 mg kg"1) para revertir los efectos de los anestésicos. Todos los fármacos se administraron por vía intraperitoneal. Se tomaron imágenes bioluminiscentes y fotográficas de los ratones con una cámara CCD de barrido lento refrigerada (NightOWL Molecular Imager, EG&G Berthold Technologies, Wildbad, Alemania). El tiempo de integración de la bioluminiscencia fue de un minuto a baja resolución. Las imágenes se procesaron con el software WinLight (EG&G Berthold). Se obtuvieron imágenes en pseudocolor para representar la distribución de la intensidad bioluminiscente, que cambiaba de azul a amarillo y a rojo con el aumento de la potencia luminosa. Las imágenes bioluminiscentes se superpusieron a las imágenes fotográficas de los mismos ratones para localizar el origen de la bioluminiscencia. Las áreas de máxima bioluminiscencia se identificaron con el uso de la opción de búsqueda de picos 2D del software, y la potencia luminosa de estas áreas se calculó en términos de recuentos de unidades relativas de luz por cm2 por segundo (cts [cm2 s"1] "1) con el programa WinLight. El experimento dosis~respuesta se llevó a cabo durante 7 días. El experimento de alimentación"infección se llevó a cabo durante 12 días o hasta que se alcanzó el criterio de valoración del experimento (indicado por una temperatura corporal de < 34 °C y/o una pérdida del 20 % del peso corporal). En el criterio de valoración, los ratones fueron sacrificados con dióxido de carbono (CO2).
Enumeración de excreción de EHEC 0157 en las heces
Se pesaron las heces frescas de los ratones y se suspendieron en PBS (0,5 g de heces por 4,5 ml de agua de peptona estéril al 0,1 % [p/v]) para obtener una concentración de 100 mg ml"1. Las suspensiones fecales se diluyeron en serie 10 veces y las diluciones apropiadas se sembraron en placas por triplicado en agar LB solo y en agar LB suplementado con 50 jg ml"1 de Amp y Km. Se contaron las colonias que se desarrollaron tras la incubación durante 24 h a 37 °C. El límite de detección fue de 102 UFC g"1 de heces. Se asignó un valor de 102 g"1 de heces a cualquier cultivo que no mostrara colonias detectables a efectos del análisis estadístico.
Análisis estadístico
Todos los resultados en este estudio son medias de tres ensayos independientes ± desviaciones típicas. Se usó la prueba de la t de Student, cuando fue necesario, para evaluar la significación estadística de las diferencias entre los grupos de prueba y de control (P < 0,05).
Ejemplo 8 - Efecto de las enzimas, temperatura y pH en la actividad del CFSM.
El pH de todos los CFSM activos se ajustó a 6,0 con NaOH 1 N estéril. Se trataron alícuotas de las muestras con las siguientes enzimas (1 mg ml"1) y se incubaron durante 2 h a 30 °C: Proteinasa K (Sigma"Aldrich Ltd., Oakville, ON, Canadá), tripsina (Sigma"Aldrich) y pepsina (Sigma"Aldrich). El efecto del pH en el CFSM se analizó ajustando el CFSM a valores que varían de 2,0 a 10,0 (en incrementos de una unidad de pH) con NaOH 1 N o HCL 1 N estéril, y el CFSM tratado se incubó durante 30 min y 2 h, respectivamente, a 30 °C. El efecto de la temperatura sobre la actividad del CFSM se analizó por calentamiento de 30 °C a 100 °C, con incrementos de 10 °C durante un periodo de 20 min. Se comprobó la actividad inhibidora de todos los CFSM tratados usando las construcciones de EHEC O157:H7 y el bioensayo autoinductor descrito previamente en el presente documento.
CFSM de L. acidophilus, fracciones biológicamente activas y contenido total de proteínas.
Contenido total de proteínas
(mg/ml)
CFSM de Lactobacillus acidophilus 9,7
Fracciones agrupadas de CFSM 4,1
Picos peptídicos de las fracciones agrupadas 2,125
Pico 1 1,75
Pico 2 ND
Pico 3 0,125
Pico 4 0,25
ND Contenido de proteínas no detectado
Tratamiento enzimático, de temperatura y de pH del CFSM probiótico. Se observó una inactivación parcial de la actividad inhibidora contra la expresión de EHEC O157:H7 LEE y la producción de la molécula de señalización AI~2 tras el tratamiento del CFSM biológicamente activo con proteinasa K y pepsina (Tabla 5.2). No se descubrió ninguna reducción de la actividad tras el tratamiento con tripsina (Tabla 5.2). No se registró ninguna disminución de la actividad tras el tratamiento a las diferentes temperaturas (30 °C, 65 °C, 90 °C y 100 °C) durante 20 min (Tabla 5.2). La actividad se mantuvo tras 2 h de incubación a diferentes valores de pH (2,0, 4,0, 6,0, 7,08,0, 9,0 y 10,0) (Tabla 5.2). Ninguno de los CFSM tuvo actividad antimicrobiana contra EHEC O157:H7, ya que no se observó la inhibición del crecimiento a lo largo de este estudio. Aunque la mayoría de las bacteriocinas solo son activas contra las bacterias grampositivas, se necesitó asegurarse de que las bacteriocinas no estaban implicadas en los efectos observados. Se incubó L. acidophilus a una temperatura de 37 °C, que se sabe que afecta en gran medida a la producción de bacteriocinas (Matsusaki et al., 1996). Matzusaki et al. (Matsusaki et al., 1996) demostró que la temperatura de cultivo óptima para la producción de nisina Z era de 30 °C. En conjunto, estos resultados eliminan la posibilidad de que la presencia de bacteriocinas sea responsable de los efectos inhibidores sobre las cepas EHEC O157:H7 estudiadas
Nuestros resultados demostraron que las moléculas secretadas por L. acidophilus no se vieron afectadas por los cambios en el pH del cultivo y que la(s) molécula(s) son(es) resistente(s) al calor. La inactivación parcial de la actividad observada tras la adición de proteinasa K y pepsina sugiere que podría tratarse de pequeñas moléculas que podrían consistir en cadenas cortas de aminoácidos. No obstante, estos resultados no confirman que las moléculas activas sean proteináceas.
Factores que afectan a la actividad inhibidora de CFSM de L. acidophilus hacia la expresión de EHEC O157:H7 LEE y la producción/captación de AI-2.
T ratamiento Actividad del medio agotado libre de células Enzimas (0,1 mg ml'1):
Proteinasa K, pepsina ±
Tripsina
pH, 2,0-10,0
Temperatura, 30-100 °C (20 min)
(+) Actividad inhibidora de L. acidophilus
(-) Sin actividad inhibidora de L. acidophilus
(±) 30 % de actividad inhibidora de L. acidophilus
Ejemplo 9 - Purificación de los péptidos secretados por L. acidophilus La-5
Las fracciones de CFSM biológicamente activas se separaron mediante cromatografía líquida de presión rápida (FPLC, por sus siglas en inglés) en una columna Tricorn Superdex 10/300 GL (Amersham Bioscience, Quebec, Canadá) con el fin de recoger y separar los péptidos presentes. Se modificaron ligeramente las condiciones de funcionamiento establecidas por el fabricante. En resumen, se inyectaron cien microlitros de fracción de CFSM a una concentración de proteínas de aproximadamente 3,5 mg ml-1 disuelta en tampón de fosfato sódico 50 mM pH 7,0 en la columna de péptidos Superdex conectada a una bomba FPLC (ThermoFinnigan A53500, Thermo-lnstruments Inc., Canadá. Missisauga, ON) y se eluyó con el mismo tampón a un caudal de 0,7 ml min-1. La absorbancia se registró a 214 y 280 nm mediante un detector de UV (SpectraSYSTEM, ThermoFinnigan, Thermolnstruments Inc.). Los picos eluidos se agruparon, se liofilizaron y se concentraron 10 veces en agua 18 O. La columna se calibró con un patrón de a-lactalbúmina (2,0 mg ml-1). La curva de calibración se usó para determinar el peso molecular promedio de las muestras desconocidas. Los gráficos cromatográficos se obtuvieron usando la estación de trabajo de cromatografía ChromQuest™. El contenido total de proteínas de los picos recogidos se midió como se ha descrito previamente (Tabla 5.1). A continuación, las muestras de péptidos se desalaron y concentraron en una columna de centrifugado C18 Vivapure® Micro (Sartorius Biotech Inc, Edgewood, NY, Ee .UU.), y se enviaron a la instalación de Espectrometría de Masas Biológica de la Universidad de Guelph (Guelph, ON., Canadá) para cromatografía líquidaespectroscopia de masas (LC-MS) y al Centro de Tecnología Avanzada de Proteínas para la secuenciación Edman en el Hospital para Niños Enfermos (Toronto, Canadá).
Purificación de los péptidos secretados por L. acidophilus La-5. Los resultados del cromatograma de FPLC muestran que las fracciones seleccionadas del CFSM están compuestas por cuatro fracciones de péptidos (Fig. 10). Se determinó que la masa molar de las fracciones peptídicas era inferior a 14.000 Da. La a-lactalbúmina (MW de 14,2 kDa) se eluyó a los 9,3 min, mientras que la elución de los picos peptídicos comenzó a los 23 min. Estos resultados demuestran que las fracciones contienen péptidos pequeños que podrían consistir en aproximadamente 2 a 10 residuos de aminoácidos.
Los picos peptídicos recogidos se concentraron y desalaron antes de ser enviados para el análisis LC-MS y la secuenciación de péptidos. La espectrometría de masas se llevó a cabo usando HPLC Agilent, acoplado a un LC/MS de un solo cuadripolo de Agilent 6110 (Agilent Technologies). Las masas molares de tres picos peptídicos (FI, FIII y FIV) se detectaron a m/z 994, 997, 1019, 1078, 1139, 1289 y 2466. El pico peptídico (FII) no mostró ningún pico de señal (Figs. 11, 12 y 13). El análisis de secuenciación de péptidos de los picos FI, FII y FIV mostró que las fracciones peptídicas están compuestas de 4 a 6 residuos de aminoácidos (Tabla 10). Existe la posibilidad de que las secuencias de aminoácidos obtenidas sean secuencias peptídicas parciales de péptidos más grandes o de proteínas pequeñas debido a posibles extremos N-terminales bloqueados. Los extremos N-terminales bloqueados constituyen el mayor impedimento para el análisis de la secuencia de proteínas. Se estima que entre el 50 y el 80 % de todas las proteínas tienen naturalmente extremos N-terminales modificados químicamente. Las secuencias de análisis Edman secuencial, el extremo N-terminal y proteína interna. En este proceso, el aminoácido N-terminal se hace reaccionar con fenilisotiocianato (PITC) para formar una proteína feniltiocarbamilo (PTC). A continuación, la proteína PTC se escinde con ácido trifluoroacético (TFA), dando lugar a la formación de una anilinotiazolinona (ATZ) intermedia. El producto intermedio se convierte en el derivado aminoácido más estable de la feniltiohidantoína (PTH) y posteriormente se separa por HPLC, en comparación con un patrón y se identifica mediante el software del secuenciador.
Ejemplo 10 - Análisis de secuenciación de péptidos.
Muestra Residuos de
aminoácido
Pico peptídico (FI) P-Pro Y-Tyr V-Val E-Glu P-Pro F-Phe Pico peptídico (FIII) A-Ala, Y-Tira, V-P-Pro Val P-Pro G-Gly, Y-Tyr G-Gly, Y-Tyr P-Pro Pico peptídico (IV) N-Asn, A-Ala, F-Phe Q-Gln P-Pro Y-Tyr
a Aminoácido con mayor probabilidad de estar presente en el residuo 1
Análisis BLAST de las secuencias peptídicas. Las secuencias de aminoácidos de los picos peptídicos se introdujeron en la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) y se encontraron varias coincidencias. BLASTp se realizó usando las penalizaciones por apertura y hueco por defecto y una matriz de puntuación por defecto. Se menciona solo la homología del 100 % (Tabla 5.4).
Proteínas con un 100 % de homología con los picos peptídicos según lo determinado por BLASTp usando penalizaciones por apertura y por hueco y matriz de puntuación por defecto.
Secuencia pico/secuencia alineada Proteína de BLASTp
(100 % de homología con la secuencia peptídica) YPVEPF/YPVEPF YP 194702 neopulanasa
[NCFM de Lactobacillus acidophilusl
YPPGGP/YPPG YP 193877 cadena A de la ornitina descarboxilasa
[NCFM de Lactobacillus acidophilus]
NQPY/NQPY YP 193484 transportador ABC de glutamina
[NCFM de Lactobacillus acidophilus]
Tabla 1. Cepas bacterianas y construcciones usadas en este estudio
Cepa, plásmido o
construcción Serotipo Genotipo/propiedad relevante Referencia Cepas
E. coli
VS94 O157:H7 luxS negativo 21
ATCC 43894 O157:H7 Stx1 y Stx2+, aislado de heces humanas.
Michigan, EE.UU. Cepa madre de CRIFS3 L. acidophilus
La-5 Bacterias de ácido láctico probióticas Cepa madre de CRIFSa Construcciones
E. coli
ATCC 43894 (C4) O157:H7 Stx1+ y Stx2+, LEE2::/ux 15 a Las cepas madre del CRIFS están depositadas en la colección de cultivos del Instituto Canadiense de Investigación para la Seguridad Alimentaria (CRIFS, por sus siglas en inglés).
Tabla 2. Adherencia de las cepas EHEC 0157 a las células HEp-2.
Bacterias % de adherenciab
EHEC 43894 100a*
EHEC 43894 coincubada con un 10 % de fracción de L. acidophilus La5 33 26*
EHEC 43894 coincubada con un 10 % de fracción de L. acidophilus La5 34 24*
EHEC VS94 luxS (-)ve p-bloqueante 22
EHEC VS94 IuxS (-)ve sin p-bloqueante________________________________ 64"a--L-a--s--- U--F-C---- m--l1'--- d-e--l i~ g ~i-r-u-p--o--- d-e1-- c--o-n--tr 1-o--l- d--e--- E--H--E--C--- 4--3-8--9--4-- s--e--- n-o--r-m--a--l-iz--a-r-o--n--- a--- u-n--a-- c--a--p-a--c-i-d--a-d--- d--e-- a--d--h-e--r-e--n--c-i-a-- d--e-l-- 1--0--0-- %---. b Los resultados son valores promedio de tres replicados independientes.
* Valor estadísticamente significativo (P = 0,001 [prueba de la t de Studentl).____________________________ Tabla 3. Áreas de máxima bioluminiscencia en ratones infectados por EHEC 0157 calculadas en términos de ___________________ recuentos de unidades relativas de luz por cm2 por segundo........ .......................... Grupo experimental con ratones Media gris (cts [cm V']-1)a,b
EHEC 3er día (grupo de control) 4002±544ns
EHEC-probiótico 3er día 5171±637ns
Probiótico-EHEC 3er día 4065±884ns
EHEC 5° día (grupo de control) 21965±4871*
EHEC-probiótico 5° día 2176± 635
Probiótico-EHEC 5° día 792±82*
EHEC 7° día (grupo de control) NAc
EHEC-probiótico 7° día 875±172c
Probiótico-EHEC 7° día 422±1493c
Ensayo dosis-respuesta
EHEC 1053er día 1900±178
EHEC 1063er día 2683,8±65
EHEC 1073er día 3364,85±450
EHEC 1083er día
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5262,8±391
EHEC 1093er día 27998±3059
a Las áreas de máxima bioluminiscencia se calcularon en términos de recuentos de unidades relativas de luz por cm2 por segundo (cts [cm2s'* 1234]'1)
b Los resultados son medias ± desviaciones típica de tres replicados.
c El grupo de control no sobrevivió hasta este punto
* Valor estadísticamente significativo (P < 0,05 [prueba de la t de Student])
ns Valor estadísticamente no significativo (P > 0,05 [prueba de la t de Student])________________________
Tabla 4. Puntuación promedio del acondicionamiento corporal de los ratones y tasa de supervivencia 7 días después de la estimulación con EHEC O157:H7.
Grupo experimental con Temperatura Pelaje á Tasa de spero (+/- Letárgico
ratones corporal (°C)a )*b (+/-)*b supervivencia en el 5° día b Grupo 1 (control negativo) 38,2±0,17 - - 5/5 Grupo 2 (probiótico-EHEC) 33,3±1,7 - 5/5 Grupo 3 (EHEC-probiótico) 33,6±1,3 - 5/5 Grupo 4 (control positivo) 30,9±1,3 2/5 a Los datos son medias ± desviaciones típicas de tres replicados de grupo (n = 5)
b Los signos de deterioro y la tasa de supervivencia son los promedios de tres replicados de grupo (n = 5)
* (+) representa la presencia del signo de deterioro, (-) representa la ausencia del signo de deterioro
Tabla 5. Cepas bacterianas y construcciones usadas para estudiar los efectos sobre hilA (luxCDABE::hilA) Cepa, plásmido o Genotipo/propiedad relevante Referencia construcción Serotipo
Cepas
L. acidophilus LA-5 Bacterias de ácido láctico probióticas Cepa madre de CRIFS3
B. longum Bacterias de ácido láctico probióticas Cepa madre de CRIFS3
B. bifidum Bacterias de ácido láctico probióticas Cepa madre de CRIFS3
B. infantis Bacterias de ácido láctico probióticas Cepa madre de CRIFS3
B. crudilactis Bacterias de ácido láctico probióticas (Delcenserie et al., 2008) Construcciones
E. coli
ATCC 43888 (C1) O157:H7 Stx IFFT7ux (Medellin-Pena et Stx" LEE1::/ al., 2007) a Las cepas madre del CRIFS están depositadas en la colección de cultivos del Instituto Canadiense de Investigación para la Seguridad Alimentaria (CRIFS, por sus siglas en inglés).____________________
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un péptido aislado de una bacteria probiótica, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una infección bacteriana entérica en mamíferos, donde el péptido consiste en YPPGGP (SEQ ID NO:2).
2. La composición para el uso de la reivindicación 1, donde dicha bacteria probiótica es Lactobacillus.
3. La composición para el uso de la reivindicación 2, donde dicho Lactobacillus se selecciona entre Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, y Lactobacillus rhamnosus.
4. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de Salmonella y/o Escherichia coli, preferentemente donde dicha Salmonella es la cepa Salmonella enterica; o donde dicha Escherichia coli es EHEC 0157:H7.
5. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, combinada además en un producto alimenticio comestible, suplemento nutricional y/o líquido ingerible.
6. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una fuente de azúcar, preferentemente glucosa.
7. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además uno o más antibióticos.
8. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el péptido está liofilizado.
9. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicha bacteria probiótica se selecciona entre Lactobacillus acidophilus.
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