ES2907652T3

ES2907652T3 - Formulaciones inyectables de toxina botulínica y métodos de uso de las mismas que tienen un efecto terapéutico o cosmético de larga duración

Info

Publication number: ES2907652T3
Application number: ES16860952T
Authority: ES
Inventors: Curtis L Ruegg; Jacob M Waugh
Original assignee: Revance Therapeuticals Inc
Current assignee: Revance Therapeuticals Inc
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2022-04-25
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: DK3368071T3; JP2022008814A; SG10202004337WA; IL286472A; CO2018005361A2; SG11201803566TA; IL259016A; MX2018005256A; US20180311333A1; EP3368071A4; RU2018119765A3; CA3003447A1; JP6955491B2; JP2018531984A; EP3368071A1; CN109069608A; AU2016343748A1; KR20180077202A; EP3368071B1; US20220062400A1

Abstract

Un método de: a. administración de toxina botulínica para conseguir un efecto cosmético de duración ampliada en un individuo, comprendiendo el método: administrar mediante inyección una primera cantidad eficaz de una composición inyectable estéril en un área del individuo que necesita tratamiento para conseguir el efecto cosmético después de un primer tratamiento con la composición; en donde la primera cantidad eficaz de la composición administrada mediante inyección al individuo consigue el efecto cosmético de duración ampliada que tiene una duración del efecto de al menos aproximadamente 6 meses a aproximadamente 10 meses, opcionalmente, antes de que se administre una segunda o posterior cantidad eficaz; o b. reducción de arrugas, líneas o surcos en un individuo que lo necesite, comprendiendo el método: administrar al individuo una composición como inyección de una sola dosis; en donde la inyección de una sola dosis de la composición proporciona un solo tratamiento que tiene una duración del efecto en la reducción de las arrugas, líneas o surcos en el individuo de al menos aproximadamente seis meses a aproximadamente 10 meses, ampliando, de este modo, la duración del intervalo de tratamiento para el individuo; y en donde la composición de a. o b. comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para inyección; y un componente de toxina botulínica de serotipo A y que tiene un peso molecular de 150 kDa; y un componente transportador cargado positivamente que comprende la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR; en donde el componente de toxina botulínica se administra al individuo en una cantidad eficaz de 20 U a 60 U; en donde el transportador cargado positivamente está asociado de forma no covalente con el componente de toxina botulínica.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones inyectables de toxina botulínica y métodos de uso de las mismas que tienen un efecto terapéutico o cosmético de larga duración

Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevas composiciones inyectables que comprenden toxina botulínica que pueden administrarse a un sujeto para diversos fines terapéuticos, estéticos y/o cosméticos. Las composiciones inyectables y los métodos en los que se utilizan estas composiciones proporcionan tratamientos ventajosos que dan como resultado altas tasas de respuesta y una larga duración del efecto, por ejemplo, una duración del efecto de más de 20 a 24 semanas y más.

Antecedentes de la invención

La piel protege los órganos del organismo de las amenazas ambientales externas y actúa como un termostato para mantener la temperatura corporal. Consiste varias capas diferentes, cada una con funciones especializadas. Las capas principales incluyen la epidermis, la dermis y la hipodermis. La epidermis es una capa estratificada de células epiteliales que recubre la dermis, que consiste en tejido conectivo. Tanto la epidermis como la dermis se apoyan además en la hipodermis, una capa interna de tejido adiposo.

La epidermis, la capa más superior de la piel, tiene solamente 0,1 a 1,5 milímetros de espesor (Inlander, Skin, Nueva York, N.Y: People's Medical Society, 1-7 (1998)). Esta consiste en queratinocitos y se divide en varias capas en función de su estado de diferenciación. La epidermis se puede clasificar adicionalmente en el estrato córneo y la epidermis viable, que consiste en las células melfigianas granulares y basales. El estrato córneo es higroscópico y requiere al menos un 10 % de humedad por peso para mantener su flexibilidad y suavidad. La higroscopicidad es atribuible en parte a la capacidad de retención de agua de la queratina. Cuando la capa córnea pierde su suavidad y flexibilidad se vuelve áspera y quebradiza, dando como resultado piel seca.

La dermis, que se encuentra justo debajo de la epidermis, es de 1,5 a 4 milímetros de espesor. Es la más gruesa de las tres capas de la piel. La mayoría de las estructuras de la piel, incluidas las glándulas sudoríparas y sebáceas (que secretan sustancias a través de aberturas en la piel llamadas poros o comedones), los folículos pilosos, las terminaciones nerviosas y los vasos sanguíneos y linfáticos se encuentran en la dermis (Inlander, Skin, Nueva York, N.Y: People's Medical Society, 1-7 (1998)). Sin embargo, los componentes principales de la dermis son colágeno y elastina.

La hipodermis es la capa más profunda de la piel. Actúa tanto como aislante para la conservación del calor corporal como un amortiguador para la protección de los órganos (Inlander, Skin, Nueva York, N.Y: People's Medical Society, 1-7 (1998)). Además, la hipodermis también almacena grasa para reservas de energía. El pH de la piel está normalmente entre 5 y 6. Esta acidez se debe a la presencia de aminoácidos anfóteros, ácido láctico y ácidos grasos de las secreciones de las glándulas sebáceas. La expresión "manto ácido" se refiere a la presencia de las sustancias solubles en agua en la mayoría de las regiones de la piel. La capacidad amortiguadora de la piel se debe en parte a estas secreciones almacenadas en la capa córnea de la piel.

La arrugas, uno de los signos reveladores del envejecimiento, pueden estar causadas por cambios bioquímicos, histológicos y fisiológicos que se acumulan debido al daño ambiental en la piel. (Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999)). Además, hay otros factores secundarios que pueden causar pliegues, surcos y rayas característicos de arrugas faciales (Stegman etal., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2a ed., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990)). Estos factores secundarios incluyen la atracción constante de la gravedad, presión posicional frecuente y constante sobre la piel (por ejemplo, durante el sueño) y movimientos faciales repetidos causados por la contracción de los músculos faciales (Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2a ed., St. Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990)).

Se han utilizado diferentes técnicas para atenuar potencialmente algunos de los signos del envejecimiento. Estas técnicas varían desde humectantes faciales que contienen ácidos alfa hidroxi y retinol hasta procedimientos quirúrgicos e inyecciones de neurotoxinas. Por ejemplo, en 1986, Jean y Alastair Carruthers, un equipo de marido y mujer formado por un cirujano ocuplástico y un dermatólogo, creó un método para usar la forma de toxina botulínica de tipo A para el tratamiento de las arrugas asociadas con el movimiento en el área de la glabela (Schantz y Scott, en Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, Nueva York: Academic Press, 143-150 (1981)). El uso de Carruthers de la forma de toxina botulínica de tipo A para el tratamiento de las arrugas dio lugar a la publicación fundamental de este enfoque en 1992 (Schantz y Scott, en Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, Nueva York: Academic Press, 143-150 (1981)). Para el año 1994, el mismo equipo reportó experiencias con otras arrugas en la cara asociadas con el movimiento (Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)). Esto, a su vez, dio lugar al nacimiento de la era del tratamiento cosmético utilizando la forma de toxina botulínica de tipo A.

Se informa que la forma de toxina botulínica de tipo A es el agente biológico natural más letal conocido por el hombre.

Las esporas de C. botulinum se encuentran en el suelo y pueden crecer en recipientes de alimentos mal esterilizados y sellados. El botulismo, que puede ser letal, puede estar causado por la ingestión de la bacteria. La toxina botulínica actúa produciendo parálisis de los músculos al impedir la transmisión sináptica al inhibir la liberación de acetilcolina a través de la unión neuromuscular, y se cree que también actúa de otras formas. Su acción esencialmente bloquea las señales que normalmente causarían espasmos o contracciones musculares, dando lugar a parálisis. En la última década, la actividad paralizante muscular de la toxina botulínica se ha aprovechado para conseguir una variedad de efectos terapéuticos. La administración controlada de toxina botulínica se ha utilizado para proporcionar parálisis muscular para tratar una variedad de afecciones médicas, por ejemplo, trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. Las afecciones que se han tratado con toxina botulínica incluyen espasmo hemifacial, tortícolis espasmódica del adulto, fisura anal, blefaroespasmo, parálisis cerebral, distonía cervical, dolores de cabeza de tipo migraña, estrabismo, trastorno de la articulación temporomandibular y varios tipos de calambres y espasmos musculares. Más recientemente, los efectos paralizantes musculares de la toxina botulínica se han aplicado a aplicaciones faciales terapéuticas y cosméticas, tal como el tratamiento de arrugas, líneas de expresión y otros resultados de espasmos o contracciones de los músculos faciales.

Además de la forma de toxina botulínica de tipo A, hay otras siete formas serológicamente distintas de toxina botulínica que también se producen por bacterias grampositivas Clostridium botulinum. De estos ocho tipos serológicamente distintos de toxina botulínica, los siete que pueden causar parálisis se han denominado serotipos de toxina botulínica A, B, C, D, E, F y G. Cada uno de estos se distingue por la neutralización con anticuerpos específicos de tipo. El peso molecular de cada una de las proteínas de toxina botulínica es de aproximadamente 150 kD. Debido al tamaño molecular y la estructura molecular de la toxina botulínica, no puede atravesar el estrato córneo y las múltiples capas de la arquitectura cutánea subyacente. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en el efecto y en la gravedad y duración de la parálisis que provocan en diferentes especies animales. Por ejemplo, en ratas, se ha determinado que la toxina botulínica de tipo A es 500 veces más potente que la toxina botulínica de tipo B, medido por la tasa de parálisis. Adicionalmente, se ha determinado que la toxina botulínica de tipo B no es tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg, aproximadamente 12 veces la DL⁵⁰en primates para el tipo A.

Tal y como se libera por las bacterias Clostridium botulinum, la toxina botulínica es un componente de un complejo de toxinas que contiene la molécula de proteína de toxina botulínica de aproximadamente 150 kD junto con proteínas que no son toxinas asociadas. Se cree que estas proteínas que no son toxinas endógenas incluyen una familia de proteínas de hemaglutinina, así como proteína que no son hemaglutinina. Se ha informado que las proteínas que no son toxinas estabilizan la molécula de toxina botulínica en el complejo de toxinas y la protegen contra la desnaturalización por los ácidos digestivos cuando se ingiere el complejo de toxinas. Por lo tanto, las proteínas que no son toxinas del complejo de toxinas protegen la actividad de la toxina botulínica y, por lo tanto, potencian la penetración sistémica cuando el complejo de toxinas se administra a través del tracto gastrointestinal. Adicionalmente, se cree que algunas de las proteínas que no son toxinas estabilizan específicamente la molécula de toxina botulínica en la sangre.

La presencia de proteínas que no son toxinas en los complejos de toxinas generalmente hace que los complejos de toxinas tengan pesos moleculares mayores que los de la molécula de toxina botulínica esencial, que tiene aproximadamente 150 kD, como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, las bacterias Clostridium botulinum pueden producir complejos de toxina botulínica de tipo A que tienen pesos moleculares de alrededor de 900 kD, 500 kD o 300 kD. Los tipos de toxina botulínica B y C se producen como complejos que tienen un peso molecular de aproximadamente 700 kD o aproximadamente 500 kD. El tipo de toxina botulínica D se produce como complejos que tienen pesos moleculares de aproximadamente 300 kD o 500 kD. Los tipos de toxina botulínica E y F solamente se producen como complejos que tienen un peso molecular de aproximadamente 300 kD.

Para proporcionar estabilidad adicional a la toxina botulínica, los complejos de toxinas se estabilizan convencionalmente combinando los complejos con albúmina durante la fabricación. Por ejemplo, BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA) es una formulación que contiene toxina botulínica que contiene 100 U de toxina botulínica de tipo A con proteínas accesorias, 0,5 miligramos de albúmina humana y 0,9 miligramos de cloruro de sodio. La albúmina sirve para unir y estabilizar complejos de toxinas en ambientes dispares, incluidos los relacionados con la fabricación, transporte, almacenamiento y administración.

También se han divulgado formas alternativas de estabilizar la toxina botulínica con fines cosméticos y terapéuticos con la ayuda de componentes transportadores cargados positivamente (véase, por ejemplo, los documentos US 2010/0330123 A1, US 2013/0251770 A1 o US 2011/0268765 A1).

Normalmente, la toxina botulínica se administra a pacientes mediante inyecciones cuidadosamente controladas de composiciones que contienen complejo de toxina botulínica y albúmina. Sin embargo, hay varios problemas asociados con este enfoque. Las inyecciones no solamente son dolorosas, sino que normalmente se generan localmente grandes pozos subdérmicos de toxina alrededor de los lugares de inyección, para conseguir el efecto terapéutico o cosmético deseado. La toxina botulínica puede migrar desde estos pozos subdérmicos causando una parálisis no deseada en las áreas circundantes del cuerpo. Este problema se exacerba cuando el área a tratar es grande y se requieren muchas inyecciones de toxina para tratar el área. Por otra parte, debido a que los complejos de toxina inyectados contienen proteínas que no son toxinas y albúmina que estabilizan la toxina botulínica y aumentan el peso molecular del complejo de toxinas, los complejos de toxinas tienen una semivida larga en el cuerpo y pueden causar una respuesta antigénica no deseada en el paciente. Por ejemplo, algunos pacientes, con el tiempo, padecerán una alergia a la albúmina utilizada como estabilizante en las formulaciones comerciales actuales. También, los complejos de toxinas pueden inducir al sistema inmunitario del paciente a formar anticuerpos neutralizantes, por lo que se requieren mayores cantidades de toxina en administraciones posteriores para conseguir el mismo efecto. Cuando esto sucede, las inyecciones posteriores deben colocarse con cuidado para que no liberen una gran cantidad de toxina en el torrente sanguíneo del paciente, que podría dar lugar a una intoxicación sistémica letal, especialmente porque las proteínas que no son toxinas y la albúmina estabilizan la toxina botulínica en la sangre.

En vista de los inconvenientes asociados con las formulaciones actuales de toxina botulínica, sería muy deseable contar con una formulación de toxina botulínica inyectable que sea eficaz y estable, pero que presente una antigenicidad reducida y una menor tendencia a difundirse localmente después de la inyección. También sería deseable utilizar dicha una formulación de toxina botulínica de este tipo para diversos fines terapéuticos, estéticos y/o cosméticos.

Sumario de la invención

En uno de sus aspectos, la presente invención proporciona composiciones inyectables que comprenden toxina botulínica asociada de forma no covalente con una molécula transportadora cargada positivamente, como se define en las reivindicaciones. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención poseen una o más ventajas sobre las formulaciones comerciales convencionales de toxina botulínica, tal como BOTOX® o MYOBLOC®. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las composiciones pueden presentar una o más ventajas sobre las formulaciones botulínicas inyectables convencionales, incluyendo antigenicidad reducida, una tendencia reducida a experimentar difusión en el tejido circundante después de la inyección, mayor duración de la eficacia clínica o potencia potenciada en relación con las formulaciones de toxina botulínica convencionales, inicio más rápido de la eficacia clínica y/o estabilidad mejorada.

Otro aspecto de la presente invención es el reconocimiento de que se pueden añadir determinadas moléculas que no son naturales (es decir, moléculas que no se encuentran en los complejos de toxina botulínica obtenidos a partir de bacterias Clostridium botulinum) a la toxina botulínica, a los complejos de toxina botulínica, y en particular a los complejos de toxina botulínica reducidos (como se define en el presente documento), para mejorar la difusión de toxinas a través de los tejidos. Las moléculas que no son naturales se asocian de forma no covalente con la toxina y actúan como potenciadores de la penetración que mejoran la capacidad de la toxina para alcanzar las estructuras diana después de la inyección. Asimismo, las moléculas que no son naturales pueden aumentar la estabilidad de la toxina antes y después de la inyección. A modo de ejemplo, los potenciadores de penetración pueden ser transportadores cargados positivamente, tal como péptidos catiónicos, que no tienen una actividad similar a la toxina botulínica inherente y que también contienen uno o más dominios de transducción de proteínas como se describe en el presente documento.

Otro aspecto de la presente invención, como se define en las reivindicaciones, es proporcionar una composición que comprende toxina botulínica, un complejo de toxinas botulínicas (o un complejo de toxinas botulínicas de proteínas reducido que incluye solo la propia neurotoxina de 150 kD, o la neurotoxina con algunas, pero no la totalidad, de las proteínas complejas naturales) y un transportador cargado positivamente.

En otro de sus aspectos, la invención se refiere además a un método para producir un efecto biológico mediante la inyección de una cantidad eficaz, preferentemente una cantidad terapéuticamente eficaz, de las composiciones de la presente invención a un sujeto o paciente que necesite dicho tratamiento. El efecto biológico puede incluir, por ejemplo, parálisis muscular, reducción de la hipersecreción o sudoración, tratamiento del dolor neurológico o dolor de cabeza de tipo migraña, tratamiento de la rinitis o sinusitis, tratamiento de la vejiga hiperactiva, reducción de los espasmos musculares, prevención o reducción del acné, reducción o potenciación de una respuesta inmunitaria, reducción de arrugas, líneas finas, o líneas glabelares, también conocidas como líneas de expresión, particularmente en la cara, o prevención o tratamiento de diversos trastornos diferentes.

En otro aspecto, la invención proporciona dosis y cantidades eficaces de las composiciones de la presente invención, como se define en las reivindicaciones, que proporcionan una eficacia sostenida de larga duración, por ejemplo, una tasa de respuesta de larga duración, después de la administración por inyección a un sujeto o paciente que necesita tratamiento. Dichas dosis y cantidades son preferentemente dosis y cantidades terapéutica o cosméticamente eficaces que producen o dan como resultado un efecto terapéutico o cosmético deseado en un sujeto al que se administran las dosis y cantidades. En una realización, el efecto de reducir las arrugas y líneas de la cara, particularmente, las líneas glabelares, proporcionado por una dosis de una composición de la invención administrada mediante inyección como un solo tratamiento al sujeto o paciente que lo necesita, duró de varias semanas a varios meses en comparación con el tratamiento convencional, tal como la inyección de BOTOX® Cosmetic. En realizaciones particulares, y como se describe en los ejemplos en el presente documento, un solo tratamiento de un sujeto o paciente con una composición de la invención que comprende una toxina botulínica, tal como la toxina botulínica A, y un transportador cargado positivamente, como se describe en el presente documento, en cantidades terapéuticamente eficaces de 20 U a 60 U, proporcionó una tasa de respuesta de reducción de arrugas y líneas faciales durante al menos 20 semanas, al menos 24 semanas, o de aproximadamente 6 a 10 meses, o incluso más, en comparación con la inyección convencional de BOTOX®. Por otra parte, las composiciones de la invención proporcionan un atributo de difusión o propagación reducidas desde el lugar de inyección después de la inyección, localizando, de este modo, la toxina y su efecto donde se desee y disminuyendo los efectos inespecíficos o no deseados de la toxina en lugares o ubicaciones distantes del lugar de inyección para el tratamiento.

La duración del efecto proporcionado por las composiciones de la invención, por ejemplo, RT002 del ejemplo 5, así como por los métodos de tratamiento y usos descritos, proporciona ventajas significativas en comparación con la técnica. A modo de ejemplo, los sujetos que se someten a tratamiento, tal como tratamiento estético, con composiciones que contienen toxina botulínica consideran que la duración del efecto después del tratamiento es de gran importancia para ellos. Una duración de efecto tan larga y sostenida, que se consigue incluso con un solo tratamiento con una dosis eficaz de un producto de la invención, por ejemplo, RT002, permite menos inyecciones por curso de tratamiento para un sujeto, lo cual es extremadamente importante para el sujeto. Un efecto de duración prolongada de un solo tratamiento con un producto que tiene una clara eficacia y seguridad, como proporcionan las composiciones y métodos de la invención descritos en el presente documento, ofrece menos molestias, menos coste y más conveniencia para los sujetos que se someten a un curso de tratamiento. Asimismo, un producto que proporciona efectos significativos y sostenidos, que se mantienen durante al menos un período de 20 o 24 semanas, o durante al menos un período de 6 meses, o durante más de un período de 6 meses, después del tratamiento inyectable único del producto a un sujeto, proporciona una solución a una necesidad insatisfecha en la técnica tanto para los médicos como para los pacientes. Por lo tanto, las composiciones y métodos de la invención proporcionan una solución al problema de los tratamientos demasiado frecuentes y mejoran el bienestar general de los pacientes. Dicha duración de acción prolongada proporciona menos tratamientos durante un curso de tratamiento completo.

La invención proporciona un método de administración de toxina botulínica para conseguir un efecto cosmético o terapéutico de duración ampliada en un individuo, en el que el método comprende administrar mediante inyección una dosis de una composición inyectable estéril en un área del individuo que necesita tratamiento para conseguir el efecto terapéutico o cosmético después de un primer tratamiento con la composición; en donde la composición comprende un componente de toxina botulínica de serotipo A y que tiene un peso molecular de 150 kDa; y un componente transportador cargado positivamente que comprende la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR; en donde el componente de toxina botulínica se administra al individuo en una dosis de tratamiento de 20 U a 60 U; en donde el transportador cargado positivamente está asociado de forma no covalente con la toxina botulínica, complejo de toxinas botulínicas, o componente reducido del complejo de toxinas botulínicas; y un diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para inyección; y en donde la primera dosis de tratamiento de la composición administrada mediante inyección al individuo consigue el efecto terapéutico o cosmético de duración ampliada que tiene una duración del efecto de al menos aproximadamente 6 meses a aproximadamente 10 meses, opcionalmente, antes de administrar una segunda o posterior dosis de tratamiento.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para reducir las arrugas, líneas o surcos en un individuo que lo necesite, comprendiendo el método administrar al individuo como inyección de una sola dosis una composición como se ha descrito anteriormente; y en donde la inyección de una sola dosis de la composición proporciona un solo tratamiento que tiene una duración del efecto en la reducción de las arrugas, líneas o surcos en el individuo de al menos aproximadamente seis meses a aproximadamente 10 meses, ampliando, de este modo, la duración del intervalo de tratamiento para el individuo. En una realización, la composición reduce, o reduce la gravedad de, las líneas glabelares en la cara del individuo.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición inyectable estéril que comprende una toxina botulínica en una cantidad de dosificación seleccionada de 20 U, 40 U, o 60 U; y un transportador cargado positivamente que tiene la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR; y un diluyente farmacéuticamente aceptable para inyección; en donde el transportador cargado positivamente está asociado de forma no covalente con la toxina botulínica, complejo de toxinas botulínicas, o componente reducido del complejo de toxinas botulínicas; y en donde la composición proporciona un efecto cosmético o terapéutico que dura al menos de 20 a 24 semanas, o al menos 6 meses, o más de 6 meses, por ejemplo, de aproximadamente 6 meses a aproximadamente 10 meses, después de un tratamiento de un individuo con una dosis eficaz de la composición inyectable.

Según la invención, para estos métodos y composición anteriores y posteriores, la composición comprende toxina botulínica de serotipo A y que tiene un peso molecular de 150 kDa. El transportador cargado positivamente tiene la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR. En una realización, la toxina botulínica está presente en la composición en una dosis de 20 U.

El componente de toxina botulínica está presente y/o se administra al individuo en una cantidad eficaz de 20 U a 60 U.

En una realización, la toxina botulínica está presente en la composición en una cantidad de dosificación de 40 U. En una realización, la toxina botulínica está presente en la composición en una cantidad de dosificación de 60 U. En una realización, la composición reduce la gravedad de las líneas glabelares en un individuo que se ha sometido a un solo tratamiento por inyección de la composición. En determinadas realizaciones, la duración del efecto del tratamiento comprende más de 6 meses; más de 7 meses; más de 8 meses; más de 9 meses; o al menos de 6 meses a 10 meses.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un método para tratar a un individuo que necesita tratamiento con toxina botulínica inyectable, en el que el método de tratamiento comprende un curso de tratamiento que tiene múltiples intervalos de tratamiento con una duración prolongada del efecto y tiempo de duración entre cada intervalo de tratamiento, comprendiendo el curso de tratamiento: administrar mediante inyección una dosis de tratamiento inicial de una composición inyectable estéril en un área del individuo que necesita tratamiento para conseguir un efecto terapéutico o cosmético después del tratamiento inicial con la composición; en donde la composición comprende una toxina botulínica, serotipo A y que tiene un peso molecular de 150 kDa; y un transportador cargado positivamente que tiene la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR; y un diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para inyección; en donde la toxina botulínica, el complejo de toxinas botulínicas o componente de complejo de toxinas botulínicas reducido se administra al individuo en una dosis de tratamiento de 20 U a 60 U; en donde el transportador cargado positivamente está asociado de forma no covalente con la toxina botulínica, complejo de toxinas botulínicas, o componente reducido del complejo de toxinas botulínicas; en donde la dosis de tratamiento inicial de la composición administrada mediante inyección al individuo proporciona una duración del efecto terapéutico o cosmético que dura al menos aproximadamente 10 meses; y administrar dosis de tratamiento posteriores de la composición mediante inyección al individuo a intervalos de tratamiento que comprenden una duración mayor o igual a 3 meses hasta al menos aproximadamente 10 meses después de la dosis de tratamiento inicial y entre cada dosis de tratamiento posterior.

En realizaciones del método de tratamiento descrito anteriormente, el efecto terapéutico o cosmético es el tratamiento o reducción de arrugas, líneas o surcos. En una realización, el efecto terapéutico o cosmético es la reducción de las líneas glabelares en la cara del individuo.

La composición comprende toxina botulínica de serotipo A, que tiene un peso molecular de 150 kDa. El transportador cargado positivamente es un péptido cargado positivamente que tiene la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR. En una realización, la composición no se difunde localmente desde el lugar de inyección después de la inyección. Las cantidades eficaces son de 20 U a 60 U.

En realizaciones específicas, la toxina botulínica se administra al individuo en una cantidad de 20 U, o en una cantidad de 40 U, o en una cantidad de 60 U. En una realización, el efecto terapéutico es la reducción de un síntoma asociado con un trastorno seleccionado del grupo que consiste en espasmo hemifacial, tortícolis espasmódica del adulto, fisura anal, blefaroespasmo, parálisis cerebral, cefaleas, estrabismo, trastorno de la articulación temporomandibular, dolor neurológico, vejiga hiperactiva, rinitis, sinusitis, acné, distonía, contracciones distónicas, hiperhidrosis e hipersecreción de una glándula controlada por el sistema nervioso colinérgico. En determinadas realizaciones, la duración del intervalo de tratamiento comprende más de 3 meses; más de 4 meses; más de 5 meses; más de 6 meses; más de 7 meses; más de 8 meses; más de 9 meses; o al menos de 6 meses a 10 meses.

La presente invención también proporciona kits para preparar formulaciones o composiciones que contienen una toxina botulínica, un complejo de toxinas botulínicas o un complejo de toxinas botulínicas de proteínas reducido y un transportador cargado positivamente o una premezcla que a su vez puede usarse para producir dicha formulación o composición. También se proporcionan kits que contienen medios para administrar secuencialmente un complejo de toxinas botulínicas (o un complejo de toxinas botulínicas reducido que incluye solamente la propia neurotoxina de 150 KD o la neurotoxina con algunas proteínas complejas naturales) y un transportador cargado positivamente.

Descripción de las figuras

La figura 1 presenta un gráfico de barras que muestra el tiempo necesario para volver al valor inicial de la puntuación de abducción de dedos (DAS) (0,4) tras la administración repetida de RT003 o BOTOX®.

Figuras 2A y 2B: la figura 2A muestra la pata trasera de un ratón inyectado con un tinte oscuro para indicar la porción del músculo gastrocnemio de un ratón que se ve afectada por la inyección de la línea lateral a la media. La figura 2B muestra la pata trasera de un ratón inyectado con un tinte oscuro para indicar la porción del músculo gastrocnemio de un ratón que se ve afectada por la inyección en la línea media.

La figura 3 presenta puntuaciones de abducción digital (DAS) medidos como función del tiempo después de la inyección de RT003, RTT150 o BOTOX® en la porción de la línea lateral a la línea media o de la línea media del músculo gastrocnemio de un ratón.

Las figuras 4A y 4B presentan Curvas de Kaplan-Meier que muestran la duración de la respuesta en varios grupos de tratamiento del estudio clínico descrito en el ejemplo 5 en el presente documento. Las curvas de Kaplan-Meier representan los resultados de los análisis de eficacia primarios del estudio clínico y demuestran la duración de la respuesta para una mejora de al menos 1 punto desde el valor inicial para la evaluación global del investigadorevaluación de la gravedad de las arrugas faciales (IGA-FWS, por sus siglas en inglés) en los grupos de tratamiento indicados. La figura 4A presenta las curvas de Kaplan-Meier para el grupo de tratamiento con placebo, el grupo de tratamiento con 20 U de VISTABEL®/BOTOX® y el grupo de tratamiento con 40 U de RT002. La figura 4b presenta las curvas de Kaplan-Meier para el grupo de tratamiento con placebo, el grupo de tratamiento con 20 U de VISTABEL®/BOTOX®, el grupo de tratamiento con 20 U de RT002, el grupo de tratamiento con 40 U de RT002 y el grupo de tratamiento con 60 U de RT002.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a nuevas composiciones inyectables que comprenden toxina botulínica, un complejo de toxinas botulínicas o un complejo de toxinas botulínicas reducido. En realizaciones preferidas, las composiciones estabilizan la toxina o permiten el transporte o el suministro de la toxina a través de los tejidos después de la inyección de manera que la toxina tiene una antigenicidad reducida, un mejor perfil de seguridad, una potencia potenciada, un inicio más rápido de la eficacia clínica y/o una mayor duración de la eficacia clínica en comparación con los complejos de toxinas botulínicas comerciales convencionales que se unen a la albúmina exógena (por ejemplo, BOTOX® o MYOBLOC®). Las composiciones de la invención se pueden usar como aplicaciones inyectables para proporcionar una toxina botulínica a un sujeto, para diversos fines terapéuticos, estéticos y/o cosméticos, como se describe en el presente documento. Las composiciones de la invención también tienen un perfil de seguridad mejorado sobre otras composiciones y métodos de suministro de toxina botulínica. Además, estas composiciones pueden proporcionar reducciones beneficiosas en las respuestas inmunitarias a la toxina botulínica. En las realizaciones, las composiciones inyectables de la invención proporcionan una eficacia de larga duración, por ejemplo, un efecto que dura al menos 20 semanas, al menos 24 semanas, al menos 6 meses o más de 6 meses, por ejemplo, hasta aproximadamente 10 meses, en sujetos a quienes se administran dichas composiciones, particularmente aquellas que comprenden toxina botulínica en cantidades de 20 U o más, mediante inyección para el tratamiento de arrugas y líneas faciales, tal como las líneas glabelares.

La expresión "toxina botulínica" puede referirse a cualquiera de los tipos conocidos de toxina botulínica (por ejemplo, moléculas de proteína de toxina botulínica de 150 kD asociadas con los diferentes serotipos de C. botulinum), ya sea producida por la bacteria o mediante técnicas recombinantes, así como cualquiera de dichos tipos que pueda descubrirse posteriormente, incluidos los serotipos recién descubiertos y las variantes modificadas por ingeniería o las proteínas de fusión. Tal como se ha mencionado anteriormente, actualmente se han caracterizado siete neurotoxinas botulínicas inmunitariamente distintas, en concreto, los serotipos de neurotoxina botulínica A, B, C, D, E, F y G, cada uno de los cuales se distingue por la neutralización con anticuerpos específicos de tipo. Los serotipos de toxina botulínica están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y de Metabiologics, Inc. (Madison, WI), así como de otras fuentes. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en las especies animales que afectan y en la gravedad y duración de la parálisis que provocan. Al menos dos tipos de toxina botulínica, los tipos A y B, están disponibles comercialmente en formulaciones para el tratamiento de determinadas afecciones. El tipo A, por ejemplo, se encuentra en preparaciones de Allergan que tienen la marca comercial BOTOX® y de Ipsen que tienen la marca comercial DYSPORT®, y el tipo B se encuentra en preparaciones de Elan que tienen la marca comercial MYOBLOC®.

La expresión "toxina botulínica" puede referirse como alternativa a un derivado de toxina botulínica, es decir, un compuesto que tiene actividad de toxina botulínica pero que contiene una o más alteraciones químicas o funcionales en cualquier parte o en cualquier cadena de aminoácidos con respecto a las toxinas botulínicas de origen natural o naturales recombinantes. Por ejemplo, la toxina botulínica puede ser una neurotoxina modificada que es una neurotoxina que tiene al menos uno de sus aminoácidos eliminados, modificados o reemplazados, en comparación con una forma natural, o la neurotoxina modificada puede ser una neurotoxina producida de forma recombinante o un derivado o fragmento de la misma. Por ejemplo, la toxina botulínica puede ser una que se haya modificado de tal manera que, por ejemplo, mejora sus propiedades o disminuye los efectos secundarios no deseados, pero que todavía conserva la actividad deseada de toxina botulínica. Como alternativa, la toxina botulínica puede ser una toxina preparada usando técnicas recombinantes o químicas sintéticas, por ejemplo, un péptido recombinante, una proteína de fusión o una neurotoxina híbrida, por ejemplo, preparada a partir de subunidades o dominios de diferentes serotipos de toxina botulínica (véase, la patente de Estados Unidos n.° 6.444.209, por ejemplo). La toxina botulínica también puede ser una porción de la molécula global que se ha demostrado que posee la actividad de toxina botulínica necesaria y, en tal caso, puede usarse por sí misma o como parte de una combinación o molécula conjugada, por ejemplo, una proteína de fusión. Como alternativa, la toxina botulínica puede estar en forma de un precursor de toxina botulínica, que puede ser en sí mismo no tóxico, por ejemplo, una proteasa de zinc no tóxica que se vuelve tóxica en la escisión proteolítica.

La expresión "complejo de toxinas botulínicas" o "complejo de toxinas" puede referirse a la molécula de proteína de toxina botulínica de aproximadamente 150 kD (perteneciente a uno cualquiera de los serotipos A-G de toxina botulínica), junto con proteínas que no son toxinas endógenas asociadas (es decir, proteína hemaglutinina y proteína que no es hemaglutinina que no es tóxica producida por bacterias Clostridium botulinum). Obsérvese, sin embargo, que el complejo de toxinas botulínicas no necesita proceder de bacterias Clostridium botulinum como un complejo unitario de toxinas. Por ejemplo, la toxina botulínica o la toxina botulínica modificada pueden prepararse primero de forma recombinante y después combinarse posteriormente con las proteínas que no son toxinas. La toxina botulínica recombinante también se puede adquirir (por ejemplo, de List Biological Laboratories, Campbell, CA) y después combinarse con proteínas que no son toxinas.

A efectos de la presente invención, un componente de toxina botulínica comprende una toxina botulínica de serotipo A que tiene un peso molecular de 150 kDa.

La presente invención también contempla la modulación de la estabilidad de las moléculas de toxina botulínica mediante la adición de uno o más estabilizantes exógenos, la eliminación de estabilizantes endógenos o una combinación de los mismos. Por ejemplo, la presente invención contempla el uso de "complejos de toxinas botulínicas reducidos", en el que los complejos de toxinas botulínicas tienen cantidades reducidas de proteína que no es toxina en comparación con las cantidades que se encuentran de manera natural en los complejos de toxinas botulínicas producidos por bacterias Clostridium botulinum. En una realización, los complejos de toxinas botulínicas reducidos se preparan utilizando cualquier método convencional de separación de proteínas para extraer una fracción de la proteína hemaglutinina o de la proteína que no es hemaglutinina que no es toxina de los complejos de toxinas botulínicas procedentes de bacterias Clostridium botulinum. Por ejemplo, pueden producirse complejos de toxinas botulínicas reducidos mediante la disociación de complejos de toxinas botulínicas a través de la exposición a glóbulos rojos a un pH de 7,3 (por ejemplo, véase el documento EP 1514556 A1, incorporado al presente documento por referencia). Se puede utilizar HPLC, diálisis, columnas, centrifugación y otros métodos para extraer proteínas de proteínas. Como alternativa, cuando los complejos de toxinas botulínicas reducidos se produzcan combinando la toxina botulínica producida sintéticamente con proteínas que no son toxinas, uno puede simplemente agregar menos hemaglutinina o proteína que no es toxina, que no es hemaglutinina a la mezcla de lo que estaría presente para los complejos de toxinas botulínicas de origen natural. Cualquiera de las proteínas que no son toxinas (por ejemplo, proteína hemaglutinina o proteína que no es hemaglutinina que no es toxina o ambas) en los complejos de toxinas botulínicas reducidos según la invención puede reducirse independientemente en cualquier cantidad. En determinadas realizaciones ilustrativas, una o más proteínas que no son toxinas se reducen en al menos aproximadamente un 0,5 %, 1 %, 3 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % en comparación con las cantidades que normalmente se encuentran en los complejos de toxinas botulínicas. Como se ha indicado anteriormente, las bacterias Clostridium botulinum producen siete serotipos diferentes de toxinas y las preparaciones comerciales se fabrican con diferentes cantidades relativas de proteínas que no son toxinas (es decir, diferentes cantidades de complejos de toxinas). Por ejemplo, MYOBLOC™ tiene 5000 U de toxina botulínica de tipo B por ml con 0,05 % de albúmina sérica humana, succinato de sodio 0,01 M y cloruro de sodio 0,1 M. DYSPORT™ tiene 500 U de complejo de toxina botulínica de tipo A-hemaglutinina con 125 mcg de albúmina y 2,4 mg de lactosa. En determinadas realizaciones, sustancialmente toda la proteína que no es toxina (por ejemplo, más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la proteína hemaglutinina y la proteína que no es hemaglutinina que no es toxina) que normalmente se encontraría en los complejos de toxinas botulínicas procedentes de bacterias Clostridium botulinum se elimina del complejo de toxinas botulínicas. Asimismo, aunque la cantidad de proteínas que no son toxinas endógenas puede reducirse en la misma cantidad en algunos casos, la presente invención también contempla reducir cada una de las proteínas que no son toxinas endógenas en diferentes cantidades, así como reducir al menos una de las proteínas que no son toxinas endógenas, pero no las demás.

Como se ha indicado anteriormente, normalmente se añade un estabilizante exógeno (por ejemplo, albúmina) para estabilizar las formulaciones de toxinas botulínicas. Por ejemplo, en el caso de BOTOX®, 0,5 mg de albúmina humana por 100 U de complejo de toxina botulínica de tipo A para estabilizar el complejo. Generalmente, la cantidad de estabilizante exógeno que se puede añadir para estabilizar las composiciones según la invención no está particularmente limitada. En algunas realizaciones, la cantidad de estabilizante añadido puede ser menor que la cantidad añadida de manera convencional, debido a la capacidad de los transportadores cargados positivamente de la invención para actuar como un estabilizante por sí mismo. Por ejemplo, la cantidad de albúmina exógena añadida puede ser cualquier cantidad inferior al exceso convencional de mil veces de albúmina exógena y, en determinadas realizaciones ilustrativas de la presente invención, es solamente aproximadamente 0,25, 0,20, 0,15, 0,10, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,00001, 0,000005, 0,000001 o 0,0000001 mg por 100 U de toxina botulínica. En una realización, no se añade albúmina exógena como estabilizante a las composiciones de la invención, produciendo, de este modo, composiciones de toxina botulínica sin albúmina.

Una composición preferida de la invención es una composición líquida, que contiene toxina botulínica que se estabiliza sin un excipiente proteínico, especialmente sin excipientes derivados de proteínas animales. Dicha una composición líquida comprende una toxina botulínica, preferentemente toxina botulínica de serotipo A, un transportador cargado positivamente (por ejemplo, un péptido) un disacárido no reductor o un trisacárido no reductor, un tensioactivo no iónico y un tampón fisiológicamente compatible para mantener el pH entre 4,5. y 7,5. La concentración del azúcar no reductor en la composición líquida se encuentra en el intervalo del 10 % al 40 % (p/v) y la concentración del tensioactivo no iónico se encuentra en el intervalo del 0,005 % al 0,5 % (p/v). La composición preferida proporciona un efecto de larga duración después del tratamiento con una sola inyección. En una realización preferida, la toxina botulínica A tiene un peso molecular (PM) de 150 kDa. La composición preferida comprende toxina botulínica, preferentemente toxina botulínica A, más preferentemente, de un PM de 150 kDa, un transportador cargado positivamente (por ejemplo, un péptido) como se describe en el presente documento, un disacárido no reductor, tal como sacarosa, un tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80, o un éster de sorbitán, y un tampón fisiológicamente compatible, tal como ácido cítrico, ácido acético, ácido succínico, ácido tartárico, ácido maleico e histidina; y tiene un pH en el intervalo de pH 4,5. a pH 7,5.

Según la presente invención, una molécula transportadora cargada positivamente que tiene dominios de transducción de proteínas o grupos de eficacia, como se describe en el presente documento, se ha encontrado adecuada como un sistema de transporte para una toxina botulínica, permitiendo que la toxina se inyecte con una mejor penetración en estructuras diana tales como músculos y/u otras estructuras asociadas con la piel. El transporte se produce sin modificación covalente de la toxina botulínica. Además de potenciar la penetración de la toxina botulínica, los transportadores cargados positivamente de la invención pueden, en determinadas realizaciones preferidas, estabilizar la toxina botulínica contra la degradación. En dichas realizaciones, la proteína hemaglutinina y la proteína que no es toxina, que no es hemaglutinina que normalmente está presente para estabilizar la toxina botulínica puede reducirse u omitirse por completo. De manera similar, se puede omitir la albúmina exógena que normalmente se añade durante la fabricación.

Mediante el uso de las expresiones "cargado positivamente" o "catiónico" en relación con el término "transportador", se entiende que el transportador tiene una carga positiva en al menos algunas condiciones de fase de solución, más preferentemente, al menos en algunas condiciones fisiológicamente compatibles. Más específicamente, "cargado positivamente" y "catiónico" como se usa en el presente documento, significa que el grupo en cuestión contiene funcionalidades que se cargan en todas las condiciones de pH, por ejemplo, una amina cuaternaria, o contiene una funcionalidad que puede adquirir carga positiva en determinadas condiciones de fase de solución, tal como los cambios de pH en el caso de las aminas primarias. Más preferentemente, "cargado positivamente" o "catiónico" como se usa en el presente documento se refiere a aquellos grupos que tienen el comportamiento de asociarse con aniones en condiciones fisiológicamente compatibles. Los polímeros con una multiplicidad de restos cargados positivamente no necesitan ser homopolímeros, como será evidente para un experto en la materia. Otros ejemplos de restos cargados positivamente son bien conocidos en la técnica anterior y se pueden emplear fácilmente, como resultará evidente para aquellos expertos en la materia.

Generalmente, el transportador cargado positivamente (también conocido como "cadena principal cargada positivamente") es normalmente una cadena de átomos, ya sea con grupos en la cadena que llevan una carga positiva a pH fisiológico o con grupos que llevan una carga positiva unidos a cadenas laterales que se extienden desde la cadena principal. En determinadas realizaciones preferidas, la cadena principal cargada positivamente es un péptido catiónico. Como se usa en el presente documento, el término "péptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos, pero no tiene ninguna connotación con respecto al número de restos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos. En consecuencia, el término "péptido" también puede abarcar polipéptidos y proteínas. En determinadas realizaciones preferidas, la propia cadena principal con carga positiva no tendrá una actividad biológica enzimática o terapéutica definida. En determinadas realizaciones, la cadena principal es una cadena principal de hidrocarburo lineal que, en algunas realizaciones, está interrumpida por heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno, azufre, silicio y fósforo. La mayor parte de los átomos de la cadena principal son habitualmente carbono. Adicionalmente, la cadena principal con frecuencia será un polímero de unidades de repetición (por ejemplo, aminoácidos, poli(etilenoxi), poli(propilenamina), polialquilenimina y similares) pero puede ser un heteropolímero. En un grupo de realizaciones, la cadena principal cargada positivamente es una polipropilenamina en donde varios de los átomos de nitrógeno de amina están presentes como grupos amonio (tetrasustituidos) que llevan una carga positiva. En otra realización, la cadena principal cargada positivamente es un polímero no peptídico, que puede ser un hetero u homopolímero tal como una polialquilenimina, por ejemplo, una polietilenimina o polipropilenimina, que tiene un peso molecular de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 2.500.000, más preferentemente de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 1.800.000 y los más preferentemente de aproximadamente 500.000 a aproximadamente 1.400.000. En otro grupo de realizaciones, la cadena principal tiene unida una pluralidad de restos de cadena lateral que incluyen grupos cargados positivamente (por ejemplo, grupos amonio, grupos piridinio, grupos fosfonio, grupos sulfonio, grupos guanidinio o grupos amidinio). Los restos de la cadena lateral en este grupo de realizaciones se pueden colocar en espacios a lo largo de la cadena principal que son coherentes en las separaciones o variables. Adicionalmente, la longitud de las cadenas laterales puede ser similar o diferente. Por ejemplo, en un grupo de realizaciones, las cadenas laterales pueden ser cadenas hidrocarbonadas lineales o ramificadas que tengan de uno a veinte átomos de carbono y que terminen en el extremo distal (lejos de la cadena principal) en uno de los grupos cargados positivamente mencionados anteriormente. La asociación entre el transportador cargado positivamente y la toxina botulínica es por interacción no covalente, cuyos ejemplos no limitantes incluyen interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o combinaciones de los mismos.

En un grupo de realizaciones, la cadena principal cargada positivamente es un polipéptido que tiene múltiples grupos de cadena lateral cargados positivamente (por ejemplo, lisina, arginina, ornitina, homoarginina y similares). Preferentemente, el polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.500.000, más preferentemente de aproximadamente 500 a aproximadamente 1.200.000, lo más preferentemente de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1.000.000. Un experto en la materia apreciará que cuando se usan aminoácidos en esta porción de la invención, las cadenas laterales pueden tener la forma D o L (configuración R o S) en el centro de unión. En determinadas realizaciones preferidas, el polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000, más preferentemente de 1000 a aproximadamente 4000, más preferentemente de 2000 a aproximadamente 3000. En otras realizaciones preferidas, el polipéptido comprende de 10 a 20 aminoácidos, o 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos, preferentemente polilisina.

Como alternativa, la cadena principal puede comprender análogos de aminoácidos y/o aminoácidos sintéticos. La cadena principal puede ser un análogo de un polipéptido tal como un peptoide. Véanse, por ejemplo, Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem. 4:80 (1992); y Simon et al. Proc.

Nat'1. Acad. Sci. USA 89:9367 (1992)). Brevemente, un peptoide es una poliglicina en la que la cadena lateral está unida a los átomos de nitrógeno de la cadena principal en lugar de a los átomos de carbono a. Como anteriormente, una porción de las cadenas laterales terminará normalmente en un grupo cargado positivamente para proporcionar un componente de cadena principal cargado positivamente. La síntesis de peptoides se describe en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 5.877.278, que se incorpora por la presente como referencia en su totalidad. Como se usa la expresión en el presente documento, las cadenas principales cargadas positivamente que tienen una construcción de cadena principal peptoide se consideran "no peptídicas" ya que no están compuestas por aminoácidos que tengan cadenas laterales de origen natural en las ubicaciones de carbonos alfa.

Puede usarse una diversidad de otras cadenas principales empleando, por ejemplo, miméticos estéricos o electrónicos de polipéptidos en donde los enlaces amida del péptido se reemplazan con sustitutos tales como enlaces éster, tioamidas (--CSNH--), tioamida invertida (--NHCS--), aminometileno (--NHCH²--) o grupos metilenoamino invertido (--CH²NH--), grupos cetometileno (--COCH²--), fosfinato (--PO²RCH²--), fosfonamidato y éster de fosfonamidato (--PO²RNH--), péptido inverso (--NHCO--), trans-alqueno (--CR=CH--), fluoroalqueno (--CF=CH--), dimetileno (--CH²CH²--), tioéter (--CH²S--), hidroxietileno (-CH(OH)CH²--), metilenoxi (--CH²O--), tetrazol (CN⁴), sulfonamido (--SO²NH--), metilenosulfonamido (--CHRSO²NH--), sulfonamida invertida (--NHSO²--) y cadenas principales con subunidades de malonato y/o gem-diaminoalquilo, por ejemplo, según lo revisado por Fletcher et al. ((1998) Chem. Vol. 98:763) y lo detallado por referencias citadas en el mismo. Muchas de las sustituciones anteriores dan como resultado cadenas principales poliméricas aproximadamente isostéricas con respecto a cadenas principales formadas a partir de aaminoácidos.

En cada una de las cadenas principales proporcionadas anteriormente, pueden añadirse grupos de cadena lateral que lleven un grupo cargado positivamente. Por ejemplo, las cadenas principales unidas por sulfonamida ((--SO²NH-- y --NHSO²--) pueden tener grupos de cadena lateral unidos a los átomos de nitrógeno. De manera similar, el enlace hidroxietileno (--CH(OH)CH²--) puede llevar un grupo de cadena lateral unido al sustituyente hidroxi. Un experto en la materia puede adaptar fácilmente las otras químicas de enlace para proporcionar grupos de cadena lateral cargados positivamente usando métodos de síntesis convencionales.

En una realización, la cadena principal cargada positivamente es un polipéptido que tiene dominios de transducción de proteínas (también denominados grupos de eficiencia). Como se usa en el presente documento, un grupo de eficiencia o dominio de transducción de proteínas es cualquier agente que tenga el efecto de promover la translocación del transportador polimérico cargado positivamente a través de un tejido o membrana celular. Los ejemplos no limitantes de dominios de transducción de proteínas o grupos de eficiencia incluyen -(gly)^{n i}-(arg)ⁿ², HIV-TAT o fragmentos del mismo, o el dominio de transducción de proteínas (PTD, por sus siglas en inglés) de Antennapedia, o un fragmento del mismo, en los que el subíndice ni es un número entero de 0 a 20, más preferentemente de 0 a 8, aún más preferentemente de 2 a 5, y el subíndice n2 es independientemente un número entero impar de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, más preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 17, más preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 13. En algunas realizaciones, el fragmento HIV-TAT no contiene la región rica en cisteína de la molécula HIV-TAT, para minimizar los problemas asociados con la agregación de disulfuro. Preferentemente, los fragmentos de los dominios de transducción de proteínas de Antennapedia y HIV-TAT conservan la actividad de transducción de proteínas de la proteína completa. Aún más preferidas son aquellas realizaciones en las que el fragmento HIV-TAT tiene la secuencia de aminoácidos (gly)^p-RGRDDRRQRRR-(gly)^q, (gly)^p-YGRKKRRQRRR-(gly)^qo (gly)^p-RKKRRQRRR-(gly)^qen donde los subíndices p y q son cada uno independientemente un número entero de 0 a 20, o en donde p y q son cada uno independientemente el número entero 1. En otra realización, el fragmento o grupo de eficiencia se une a la cadena principal mediante el extremo C o el extremo N del fragmento o secuencia de aminoácidos del grupo de eficiencia. En determinadas realizaciones preferidas, p es uno y q es cero o p es cero y q es uno. Los fragmentos HIV-TAT preferidos son aquellos en los que los subíndices p y q son cada uno independientemente números enteros de 0 a 8, más preferentemente de 0 a 5. En otra realización preferida, la cadena lateral o el grupo de ramificación cargados positivamente es el dominio de transducción de proteínas (PTD) de Antennapedia (Antp), o un fragmento del mismo que conserva la actividad. Estos son conocidos en la técnica, por ejemplo, de Console et al., J. Biol. Chem. 278:35109 (2003) y un ejemplo no limitante de un PTD de Antennapedia contemplado por la presente invención es el PTD que tiene la secuencia de aminoácidos SGRQIKIWFQNRRMKWKKC. En otras realizaciones, el transportador cargado positivamente es un péptido cargado positivamente que tiene la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRR-G-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR; o un péptido cargado positivamente que tiene la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRRG-(K)¹⁵-G-YGRKKRRQRRR; o un péptido cargado positivamente que tiene las secuencias de aminoácidos RGRDDRRQRRRG-(K)¹⁵-G-RGRDDRRQRRR para su uso en las composiciones y métodos de la invención. A efectos de la presente invención, el componente transportador cargado positivamente comprende un componente que tiene la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR.

Preferentemente, el transportador cargado positivamente incluye dominios de transducción de proteínas cargados positivamente en la cadena lateral o grupos de eficiencia cargados positivamente en una cantidad de al menos aproximadamente un 0,01 %, como porcentaje del peso total del transportador, preferentemente de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 50 por ciento en peso, más preferentemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 45 por ciento en peso y los más preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 30 % en peso. Para dominios de transducción de proteínas cargados positivamente que tienen la fórmula -(gly)ⁿ¹-(arg)ⁿ², un intervalo preferido es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 %.

En otra realización, la porción de cadena principal es una polilisina y los dominios de transducción de proteínas cargados positivamente están unidos a los grupos amino de la cadena lateral de lisina o a los extremos C o N. En algunas realizaciones preferidas, la polilisina puede tener un peso molecular de al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, o 6000 D, y menos de aproximadamente 2.000.000, 1.000.000, 500.000, 250.000, 100.000, 75.000, 50.000 y 25.000 D. Dentro del intervalo de 100 a 2.000.000 D, se contempla que se pueda aumentar o disminuir el intervalo inferior y/o superior, respectivamente, en 100, siendo cada subintervalo resultante una realización de la invención contemplada de manera específica. En algunas realizaciones ilustrativas, la polilisina tiene un peso molecular de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 1.500.000 D, de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 800.000 D, o de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 200.000 D. En otras realizaciones ilustrativas, la polilisina tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 10.000 D, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5.000 D, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 4.000 D, de aproximadamente 1.500 a aproximadamente 3.500 D o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 3.000 D. Se prefiere un polipéptido de polilisina que tenga de 10 a 20 lisinas, más preferentemente, 15 lisinas. En algunas realizaciones, la polilisina contemplada por la presente invención puede ser cualquiera de las polilisinas disponibles comercialmente (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., Estados Unidos) tales como, por ejemplo, polilisina que tiene un PM > 70.000, polilisina que tiene un Pm de 70.000 a 150.000, polilisina que tiene un PM de 150.000 a 300.000 y polilisina que tiene un PM > 300.000. La selección de una polilisina adecuada dependerá de los componentes restantes de la composición y será suficiente para proporcionar una carga positiva neta global a la composición y proporcionar una longitud que sea preferentemente de una a cuatro veces la longitud combinada de los componentes cargados negativamente. Los dominios de transducción de proteínas o grupos de eficiencia cargados positivamente preferidos incluyen, por ejemplo, -gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (-GlyaArgy) o HIV-TAT.

En otra realización preferida, la cadena principal cargada positivamente es una polialquilenimina, cuyos ejemplos no limitantes incluyen polietilenimina, polipropilenimina y polibutilenimina. En determinadas realizaciones, la polialquilenimina tiene un peso molecular de al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, o 6000 D, y menos de aproximadamente 2.000.000, 1.000.000, 500.000, 250.000, 100.000, 75.000, 50.000 y 25.000 D. Dentro del intervalo de 100 a 2.000.000 D, se contempla que se pueda aumentar o disminuir el intervalo inferior y/o superior, respectivamente, en 100, siendo cada subintervalo resultante una realización de la invención contemplada de manera específica.

En otras realizaciones de la presente invención, el transportador es una cadena principal de polilisina o polietilenimina (PEI) relativamente corta (que puede ser lineal o ramificada) y que tiene grupos de ramificación cargados positivamente. Sin desear quedar restringidos por teoría alguna, se cree que dichos transportadores son útiles para minimizar la agregación descontrolada de las cadenas principales y la toxina botulínica en una composición terapéutica, lo que provoca que la eficacia del transporte disminuya drásticamente. Cuando el transportador es una cadena principal de polilisina o PEI lineal relativamente corta, la cadena principal tendrá un peso molecular inferior a 75.000 D, más preferentemente menos de 30.000 D, y lo más preferentemente, menos de 25.000 D. Cuando el transportador es una cadena principal de polilisina o PEI ramificada relativamente corta, sin embargo, la cadena principal tendrá un peso molecular inferior a 60.000 D, más preferentemente inferior a 55.000 D y lo más preferentemente inferior a 50.000 D.

En una realización particularmente interesante, las moléculas que no son naturales son péptidos catiónicos que no tienen actividad similar a la toxina botulínica inherente y que también contienen uno o más dominios de transducción de proteínas como se describe en el presente documento. Sin desear quedar ligados a teoría científica particular alguna, se cree que los péptidos potencian la penetración tisular de las moléculas asociadas en el complejo después de la inyección, al mismo tiempo que potencian la estabilización de la toxina botulínica en la piel e in vitro. Se cree que la penetración tisular potenciada proporcionada por estos péptidos en particular proporciona una antigenicidad reducida, un mejor perfil de seguridad, una potencia potenciada, un inicio más rápido de la eficacia clínica o una mayor duración de la eficacia clínica en comparación con los complejos de toxinas botulínicas comerciales convencionales que se unen a la albúmina exógena (por ejemplo, BOTOX® o MYOBLOC®).

En realizaciones preferidas, la concentración de transportadores cargados positivamente en las composiciones según la invención es suficiente para potenciar el suministro de la toxina botulínica a dianas moleculares tales como, por ejemplo, placas nerviosas motoras. Asimismo, sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que la tasa de penetración sigue una cinética mediada por receptores, de tal manera que la penetración en el tejido aumenta con cantidades crecientes de moléculas potenciadoras de la penetración hasta un punto de saturación, sobre el cual la tasa de transporte se vuelve constante. Por lo tanto, en una realización preferida, la cantidad de moléculas potenciadoras de la penetración añadidas es igual a la cantidad que maximiza la tasa de penetración justo antes de la saturación. Un intervalo de concentración útil para el transportador (o péptido transportador) cargado positivamente en las composiciones inyectables de la presente invención es de aproximadamente 0,1 pg de transportador por unidad (U) de toxina botulínica (0,1 pg/U) a aproximadamente 1,0 mg por unidad (mg/U)) de la toxina botulínica como se describe en el presente documento. Un intervalo de concentración útil para el transportador (o péptido transportador) cargado positivamente en las composiciones tópicas de la invención es de aproximadamente 1,0 pg/U a 0,5 mg/U de toxina botulínica (cantidad de transportador/U de toxina botulínica). En otras realizaciones, el transportador (o péptido transportador) cargado positivamente está presente en las composiciones inyectables de la invención en el intervalo de, por ejemplo, 10 ng/U a 200 ng/U de toxina botulínica, o en el intervalo de 1 ng/U a 1000 ng/U de toxina botulínica; o en el intervalo de 0,1 ng/U a 10.000 ng/U de toxina botulínica. En algunas realizaciones, la cantidad de transportador (o péptido transportador) cargado positivamente con respecto a unidades de toxina botulínica presente en las composiciones de la invención es, a modo de ejemplo no limitante, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, etc. ng de transportador por unidad de toxina botulínica (ng/U). Preferentemente, la toxina botulínica es del serotipo A, y en particular, la forma de 150 kD de toxina botulínica de serotipo A.

En general, los métodos y procedimientos para medir la actividad de la toxina botulínica, es decir, unidades (U) de actividad de toxina botulínica, se conocen y ponen en práctica por los expertos en la materia. Brevemente, se utilizan convencionalmente ensayos de mediana de letalidad (ensayos de DL⁵⁰) en ratones para estimar el número de unidades de toxina botulínica con un alto grado de precisión. Las dosis de todas las toxinas botulínicas disponibles comercialmente se expresan en términos de unidades de actividad biológica. A modo de ejemplo, una unidad de toxina botulínica corresponde a la mediana de la dosis letal (DL50) intraperitoneal calculada en ratones hembra Swiss-Webster. Véanse, Hoffman, R.O. et al., 1986, Int. Ophthalmol. Clin., 26:241-50, así como DePass, L.R., 1989, Toxicol. Letters, 49:159-170; y Pearce, L.B. et al., 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol., 128:69-77, que también describen ensayos de letalidad en la técnica. Más concretamente, un método adecuado para determinar unidades de toxina botulínica para un componente de toxina botulínica de las composiciones de la invención es el siguiente: cuarenta y ocho (48) ratones hembra CD-1 que pesan 17-23 gramos se asignan aleatoriamente a seis dosis del artículo de prueba (1,54, 1,31, 1,11, 0,95, 0,80 y 0,68 U/0,5 ml), ocho (8) animales por grupo de dosis. El artículo de prueba se refiere a la preparación o muestra de toxina botulínica que se analiza o prueba. Los animales se alojan ocho por jaula y se pesan en las 24 horas posteriores a la dosificación con el artículo de prueba. El día de la dosificación, el artículo de prueba se diluye a las concentraciones adecuadas en solución salina isotónica (0,9 % de NaCl). A cada animal se le administran 0,5 ml del artículo de prueba diluido mediante inyección intraperitoneal. Después de la inyección, los ratones se devuelven a la jaula y los fallecimientos se registran diariamente durante tres días. La letalidad se califica 72 horas después de la inyección y los resultados se analizan mediante análisis probit o logístico para obtener el valor de DL⁵⁰con respecto a un patrón de referencia que se evalúa utilizando la misma pauta posológica. A modo de ejemplo, el patrón de referencia es un lote específicamente calificado y calibrado de la misma composición de la invención que se usa para comparación para obtener la potencia relativa del artículo de prueba. El valor de LD⁵⁰determinado se corrige después por el valor para las diluciones acumulativas realizadas para asignar un valor de potencia relativa para el artículo de prueba puro (sin diluir).

Las composiciones de la presente invención están preferentemente en una forma que permite la inyección en la piel o el epitelio de sujetos o pacientes, (es decir, seres humanos u otros mamíferos que necesitan el tratamiento particular). La expresión "que necesita" pretende incluir necesidades tanto farmacéuticas como relacionadas con la salud (por ejemplo, el tratamiento de afecciones que implican espasmos musculares faciales no deseados), así como necesidades cosméticas y subjetivas (por ejemplo, alterar o mejorar la apariencia del tejido facial). En realizaciones preferidas, las composiciones se preparan mezclando la toxina botulínica (ya sea que contenga las proteínas que no son toxinas asociadas o las proteínas que no son toxinas asociadas reducidas) con el transportador cargado positivamente, y normalmente con uno o más transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales. En su forma más simple, pueden contener un diluyente acuoso farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Sin embargo, las composiciones pueden contener otros ingredientes que se encuentran normalmente en composiciones farmacéuticas o cosmecéuticas inyectables, incluyendo un transportador, vehículo o medio dermatológica o farmacéuticamente aceptable que sea compatible con los tejidos en los que se aplicarán. La expresión "dermatológica o farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa que las composiciones o componentes de las mismas que se describen de este modo son adecuados para su uso en contacto con estos tejidos o para su uso en pacientes en general sin excesiva toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica, y similares. Según sea adecuado, las composiciones de la invención pueden comprender cualquier ingrediente convencionalmente utilizado en los campos considerados, y particularmente en cosmética y dermatología.

En términos de su forma, las composiciones de la presente invención pueden incluir soluciones, emulsiones (incluyendo microemulsiones), suspensiones, geles, polvos u otras composiciones sólidas o líquidas habituales utilizadas para inyección en músculo y otros tejidos donde pueden usarse las composiciones. En realizaciones preferidas, las composiciones de la invención están presentes formulaciones estériles de baja viscosidad adecuadas para inyección con una jeringa. Como se usa en el presente documento, los términos composiciones y formulaciones son esencialmente intercambiables cuando se refieren a las composiciones y formulaciones según la presente invención. Las composiciones de la invención pueden estar en forma de polvo liofilizado que se reconstituye usando un diluyente líquido farmacéuticamente aceptable antes de la inyección. En determinadas realizaciones, el polvo liofilizado se reconstituye con un diluyente líquido para formar una formulación inyectable con una viscosidad de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 2 Pa s (0,1 a aproximadamente 2.000 cP), más preferentemente de aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,5 Pa s (0,2 a aproximadamente 500 cP), incluso más preferentemente de aproximadamente 0,0003 a aproximadamente 0,05 Pa s (0,3 a aproximadamente 50 cP), e incluso más preferentemente de aproximadamente 0,0004 a aproximadamente 0,002 Pa s (0,4 a aproximadamente 2,0 cP). Las composiciones de la invención pueden contener, además de la toxina botulínica y el transportador cargado positivamente, otros ingredientes normalmente utilizados en dichos productos, tales como agentes antimicrobianos, agentes hidratantes, agentes de carga de tejidos o rellenos de tejidos, conservantes, emulsionantes, aceites naturales o sintéticos, disolventes, tensioactivos, detergentes, agentes gelificantes, antioxidantes, cargas, espesantes, polvos, agentes de control de la viscosidad y agua, y que incluyen opcionalmente anestésicos, activos antipicaduras, extractos botánicos, agentes acondicionadores, minerales, polifenoles, siliconas o derivados de las mismas, vitaminas y productos fitomedicinales.

Las composiciones inyectables según la presente invención pueden estar en forma de composiciones de liberación controlada o de liberación sostenida que comprenden toxina botulínica y un transportador cargado positivamente encapsulado o que se encuentra de otro modo dentro de un material de manera que se liberan dentro del tejido de manera controlada a lo largo del tiempo. La composición que comprende la toxina botulínica y el transportador cargado positivamente puede encontrarse dentro de matrices, liposomas, vesículas, microcápsulas, microesferas y similares, o dentro de un material particulado sólido, todos los cuales se seleccionan y/o se construyen para proporcionar la liberación de la toxina botulínica a lo largo del tiempo. La toxina botulínica y el transportador cargado positivamente pueden encapsularse juntos (es decir, en la misma cápsula) o por separado (es decir, en cápsulas separadas).

En las realizaciones, las composiciones de la invención comprenden composiciones (o formulaciones) líquidas (acuosas) que comprenden una toxina botulínica como se describe en el presente documento, un transportador (o péptido) cargado positivamente como se describe en el presente documento, un disacárido no reductor o un trisacárido no reductor, un tensioactivo no iónico y un tampón fisiológicamente compatible, que es capaz de mantener un pH adecuado, tal como un pH en el intervalo de pH 4,5 a pH 7,5, o pH 4,5 a pH 6,8, o pH 4,5 a pH 6,5. Debe entenderse que un pH adecuado también incluye los valores de pH superior e inferior en el intervalo, por ejemplo, un pH de 6,5 o un pH de 7,5. La concentración del azúcar no reductor en la composición líquida se encuentra en el intervalo del 10 % al 40 % (p/v) y la concentración del tensioactivo no iónico se encuentra en el intervalo del 0,005 % al 0,5 % (p/v). Las composiciones líquidas se pueden secar, preferentemente por liofilización, para producir composiciones sólidas estabilizadas, que posteriormente puede reconstituirse para su uso, por ejemplo, usando solución salina estéril u otros diluyentes, excipientes o vehículos conocidos fisiológica y farmacéuticamente aceptables, especialmente aquellos conocidos por su uso en formulaciones inyectables. Preferentemente, las composiciones sólidas secas, por ejemplo, liofilizadas, son composiciones sólidas no cristalinas y amorfas, y pueden estar en forma de polvos, por ejemplo. También, preferentemente, las composiciones de la invención no incluyen productos derivados de proteínas animales, tal como albúmina. Las composiciones que son adecuadas para la invención también se describen en la publicación de solicitud de Estados Unidos n.° US 2010/0330123, cuyo contenido completo se incorpora como referencia en el presente documento. En realizaciones particulares las composiciones comprenden toxina botulínica de serotipo A. En otras realizaciones particulares, las composiciones comprenden toxina botulínica de serotipo A que tiene un peso molecular de 150 kDa.

En determinadas realizaciones, las composiciones de la invención contienen un azúcar no reductor, que es preferentemente un disacárido, cuyos ejemplos no limitantes incluyen trehalosa, incluidas sus formas anhidra e hidratada, o sacarosa, así como combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, se prefiere la forma hidratada de trehalosa, dihidrato de trehalosa. En otras realizaciones, las composiciones contienen un trisacárido, cuyo ejemplo no limitante es rafinosa. En general, la concentración del azúcar no reductor, preferentemente un disacárido, por ejemplo, sacarosa, en las composiciones de la invención se encuentran en el intervalo del 10 % al 40 % (p/v), preferentemente del 10 % al 25 % (p/v), más preferentemente del 15 % al 20 % (p/v). En algunas realizaciones preferidas, la concentración del azúcar no reductor, preferentemente un disacárido, por ejemplo, sacarosa, es un 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 % (p/v).

En general, las composiciones de la invención pueden incluir cualquier tensioactivo no iónico que tenga la capacidad de estabilizar la toxina botulínica y que sea adecuado para uso farmacéutico. En algunas realizaciones, el tensioactivo no iónico es un polisorbato, tal como, a modo de ejemplo no limitante, polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60 y polisorbato 80. En otras realizaciones, el tensioactivo no iónico es éster de sorbitano, cuyos ejemplos no limitantes incluyen SPAN® 20, SPAN® 60, SPAN® 65 y SPAN® 80. También se pueden utilizar los tensioactivos no iónicos Triton® X-100 o NP-40. Además, se puede utilizar una combinación de los diferentes tensioactivos no iónicos. En determinadas realizaciones preferidas, el tensioactivo no iónico es un polisorbato, un poloxámero y/o un sorbitán; se prefieren particularmente polisorbatos y sorbitanos. En las realizaciones, el tensioactivo no iónico está presente en las composiciones de la invención en el intervalo de 0,005 % a 0,5 %, o en el intervalo de 0,01 % a 0,2 %, o en el intervalo de 0,02 % a 0,1 % o en el intervalo de 0,05 al 0,08 %, incluyendo los valores superior e inferior. Además, las composiciones de la invención pueden contener un tensioactivo no iónico en una cantidad de 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 %, 0,10 %, 0,11 %, 0,12 %, 0,13 %, 0,14 % o 0,15 %.

En general, para las composiciones de la invención, cualquier tampón fisiológicamente compatible capaz de mantener el pH en los intervalos anteriores es adecuado para su uso. Los ejemplos no limitantes de dichos tampones incluyen sales de ácido cítrico, ácido acético, ácido succínico, ácido tartárico, ácido maleico e histidina. Los ejemplos no limitantes de concentraciones de tampón adecuadas incluyen concentraciones de tampón en el intervalo de 0,400 % a 0,600 %; 0,450 % a 0,575 %, o de 0,500 % a 0,565 %. Las composiciones de la invención también pueden comprender una mezcla de sales tampón, cuyos ejemplos no limitantes incluyen citrato/acetato, citrato/histidina, citrato/tartrato, maleato/histidina o succinato/histidina. En consecuencia, una composición de la invención que proporciona un efecto de larga duración después del tratamiento con una sola inyección incluye una toxina botulínica, tal como la toxina botulínica A o la toxina botulínica A de PM de 150 kDa, como se describe en el presente documento, un transportador (o péptido) cargado positivamente como se describe en el presente documento, un disacárido no reductor, tal como sacarosa, un tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80, o un éster de sorbitán, y un tampón fisiológicamente compatible, tal como ácido cítrico, ácido acético, ácido succínico, ácido tartárico, ácido maleico e histidina, que es capaz de mantener un pH adecuado, tal como un pH en el intervalo de pH 4,5 a pH 6,5 o en el intervalo de pH 4,5. a pH 7,5, en cantidades p/v como se describe en el presente documento.

Una composición particular de la invención es una composición líquida (acuosa) sin albúmina que comprende una toxina botulínica, preferentemente la toxina botulínica de serotipo A, o una toxina botulínica A que tiene un peso molecular de 150 kDa; un transportador cargado positivamente (por ejemplo, péptido); un disacárido no reductor o un trisacárido no reductor, preferentemente un disacárido, presente en un intervalo de 10 % a 40 % (p/v); un tensioactivo no iónico, preferentemente, un polisorbato o éster de sorbitán, presentes en el intervalo de 0,005 % a 0,5 % (p/v); y un tampón fisiológicamente compatible, tal como ácido cítrico, ácido acético, ácido succínico, ácido tartárico, ácido maleico o histidina, presente en el intervalo de 0,400 % a 0,600 %; de 0,450 % a 0,575 %, o de 0,500 % a 0,565 %, para mantener el pH entre 4,5. y 7,5.

Las formulaciones de toxina botulínica según la invención se pueden suministrar mediante inyección (normalmente usando una jeringa) a los músculos que se encuentran debajo de la piel o a las estructuras glandulares dentro de la piel, en una cantidad eficaz para producir parálisis, producir relajación, aliviar las contracciones, prevenir o aliviar los espasmos, reducir la producción glandular u otros efectos deseados. El suministro local de la toxina botulínica de esta manera podría permitir reducciones de dosis, reducir la toxicidad y permitir una optimización de la dosis más precisa para los efectos deseados en relación con los materiales inyectables o implantables.

Las composiciones de la invención se administran para suministrar una cantidad eficaz, preferentemente una cantidad terapéutica o cosméticamente eficaz de la toxina botulínica. La expresión "cantidad eficaz" o "cantidad terapéutica o cosméticamente eficaz", tal como se utiliza en el presente documento, significa una cantidad de una toxina botulínica como se define anteriormente que es suficiente para producir la parálisis muscular u otro efecto biológico o estético deseados, pero que sea implícitamente una cantidad segura, es decir, una que sea lo suficientemente baja como para evitar efectos secundarios graves. Los efectos deseados incluyen la relajación de determinados músculos con el objetivo de, por ejemplo, disminuir la aparición de líneas finas y/o arrugas, especialmente en la cara, o ajustar la apariencia facial de otras maneras, tal como agrandar los ojos, levantar las comisuras de los labios, o alisar las líneas que salen desde el labio superior, o aliviar en general la tensión muscular. El último efecto mencionado, alivio general de la tensión muscular, puede efectuarse en la cara o en cualquier otro lugar.

Las composiciones de la invención pueden contener una cantidad eficaz apropiada de la toxina botulínica para su aplicación como tratamiento de una sola dosis o pueden estar más concentradas, ya sea para dilución en el lugar de administración o para su uso en múltiples aplicaciones. Mediante el uso del transportador cargado positivamente de la presente invención, una toxina botulínica puede administrarse mediante inyección a un sujeto para tratar afecciones tales como arrugas, espasmos de músculos faciales u otros espasmos musculares no deseados, hiperhidrosis, acné, o afecciones en otras partes del cuerpo en las que se desea el alivio del dolor o espasmos musculares. Las composiciones de la invención son particularmente adecuadas para el tratamiento de líneas finas, tales como líneas finas faciales y líneas glabelares, también conocidas como "líneas de expresión" en la cara de un sujeto. La toxina botulínica se administra mediante inyección en los músculos o en otras estructuras tisulares asociadas a la piel u otras diana. La administración se puede hacer, por ejemplo, a las piernas, hombros, espalda (incluida la espalda baja), axilas, palmas, pies, cuello, cara, zona genital, dorso de las manos o de los pies, codos, parte superior de los brazos, rodillas, parte superior de las piernas, nalgas, torso, pelvis, o cualquier otra parte del cuerpo donde se desee la administración de la toxina botulínica.

La administración de las composiciones inyectables que contienen toxina botulínica de la presente invención también se puede llevar a cabo para tratar otras afecciones, incluyendo cualquier afección para la cual la prevención de la transmisión sináptica de o la liberación de acetilcolina conferiría un beneficio terapéutico. Por ejemplo, las afecciones que pueden tratarse por las composiciones según la invención incluyen, sin limitación, dolor neurológico, dolor de cabeza de tipo migraña u otro dolor de cabeza, vejiga hiperactiva, rinitis, sinusitis, acné, distonía, contracciones distónicas (ya sean subjetivas o clínicas), hiperhidrosis (ya sea subjetiva o clínica) e hipersecreción de una o más glándulas controladas por el sistema nervioso colinérgico. Las composiciones de la presente invención también se pueden usar para reducir o potenciar la respuesta inmunitaria, o el tratamiento de otras afecciones para las que se ha sugerido o realizado la administración de toxina botulínica mediante inyección.

De la manera más preferente, las composiciones se administran por o bajo la dirección de un médico u otro profesional de la salud. Pueden administrarse en un solo tratamiento o en una serie de tratamientos a lo largo del tiempo. En realizaciones preferidas, una composición según la invención se inyecta en un lugar o lugares donde se desea un efecto asociado con la toxina botulínica. Debido a su naturaleza, la toxina botulínica se administra preferentemente en una cantidad, velocidad y frecuencia de aplicación que produzca el resultado deseado sin producir ningún resultado adverso o no deseado. Las composiciones de la invención se aplican a una tasa de 20 U a 60 U, U, 30 U, 40 U, 50 U, 60 U de la toxina botulínica de serotipo A que tiene un peso molecular de 150 kDa, al sujeto que se somete a tratamiento. En las realizaciones, un solo tratamiento con una dosis eficaz de las composiciones de la invención proporciona un efecto de larga duración de manera que durante un curso de tratamiento para una indicación tratable con toxina botulínica, por ejemplo, el tratamiento de las arrugas, líneas y surcos, un sujeto requeriría menos inyecciones, y quizás solo una sola inyección, o una serie de inyecciones durante una sola sesión de tratamiento, con un efecto concomitante que perdura durante largos períodos de tiempo, por ejemplo, al menos 6 meses o más de 6 meses, concretamente, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses o más, incluyendo 10 meses. La mayor duración de la acción proporciona intervalos o períodos de tiempo más prolongados entre tratamientos en los que se utilizan múltiples tratamientos para mantener un objetivo o efecto de tratamiento. En una realización, la mayor duración del efecto de la composición después de la administración o dosificación de un individuo con una composición de la invención que proporciona 20 U a 100 U, o 20 U a 60 U, o 20 U, 40 U, o 60 U de toxina botulínica, por ejemplo, al menos 6 meses o más de 6 meses, tal como 7, 8, 9 o 10 meses, incluso en el medio, es con respecto a la duración del efecto de una composición o producto que contiene toxina botulínica que no contiene un transportador (o péptido) cargado positivamente según la presente invención. En algunos casos, una composición o producto que contiene toxina botulínica sin un transportador (o péptido) cargado positivamente de la invención es eficaz durante menos de 6 meses, tal como 3 o 4 meses.

En determinadas realizaciones, las composiciones de la invención, que comprenden una toxina botulínica y un transportador cargado positivamente que comprende una cadena principal polimérica cargada positivamente con uno o más grupos de eficiencia cargados positivamente unidos covalentemente como se describe en el presente documento, se administran como una sola inyección a un sujeto o paciente que lo necesita en una cantidad o a una dosis que proporciona de 20 U a 60 U, de toxina botulínica por inyección para el tratamiento de las arrugas, líneas o surcos, particularmente en la cara. Según la invención, después de una sola inyección en el tratamiento de un sujeto o paciente, un efecto de tratamiento, concretamente, la reducción de arrugas, líneas o surcos, tal como líneas glabelares, dura varias semanas o meses, por ejemplo, durante al menos 20 semanas, durante al menos 24 semanas, o durante al menos 6 meses, o más de 6 meses, tal como 6, 7, 8, 9 o 10 meses o más. La toxina botulínica es de serotipo A. La toxina botulínica de serotipo A tiene un peso molecular de 150 kDa. En una realización, la toxina botulínica del serotipo A está en forma de un complejo de mayor peso molecular como se describe supra. En realizaciones preferidas, la toxina botulínica de 150 kDa o las formas de mayor peso molecular de la toxina están en formulaciones sin albúmina. El transportador cargado positivamente tiene la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR.

La composición se administra mediante inyección en una cantidad o dosis que proporciona 20 U o al menos 20 U; 30 U o al menos 30 U; 40 U o al menos 40 U; 50 U o al menos 50 U; 60 U de toxina botulínica por inyección. También se contemplan cantidades o dosis entre las cantidades o dosis anteriores, por ejemplo, 25 U o al menos 25 U; 35 U o al menos 35 U; 45 U o al menos 45 U y similares. En realizaciones particulares, la composición se administra mediante inyección como una sola dosis de tratamiento en una cantidad que proporciona 20 U; 40 U; o 60 U de toxina botulínica y se consigue una respuesta o efecto, por ejemplo, disminución de las arrugas y líneas faciales, tal como líneas glabelares, y se mantiene durante mucho tiempo, por ejemplo, al menos 20 semanas, al menos 24 semanas, al menos 6 meses o más de 6 meses, tal como, por ejemplo, 6, 7, 8, 9 o 10 meses, o más. En una realización particular, una sola dosis de una composición de la invención que contiene un transportador cargado positivamente como se describe y toxina botulínica A de 150 kDa en una cantidad de dosificación de 40 U proporciona un efecto de larga duración en el tratamiento de las líneas glabelares, por ejemplo, durante al menos 6 meses y probablemente más. Véase, por ejemplo, la figura 4B.

Sin ánimo de ser limitante, en el curso del tratamiento, las composiciones de la invención pueden administrarse a intervalos menos frecuentes después de una dosis de tratamiento inicial basada en la duración ampliada del efecto proporcionado por las dosis terapéutica y cosméticamente eficaces de las composiciones y métodos de la invención como se describe en el presente documento. Por ejemplo, las composiciones de la invención se pueden administrar (o dosificar) a un individuo que lo necesite aproximadamente dos veces al año (aproximadamente cada 6 meses), o cada 7 meses, 8 meses, 9 meses, o 10 meses, o más, mediante la puesta en práctica de los métodos de la invención. En una realización particular, a un individuo se le administra una dosis de una composición de la invención dos veces al año. Una mediana de duración entre dosis puede ser de 6 meses, al menos 6 meses o más de 6 meses, dependiendo del tratamiento terapéutico o cosmético y/o el deseo de tratamiento determinado por el individuo que se está tratando. Por lo tanto, la dosificación de un individuo con las composiciones de la invención se puede producir dos veces al año o más de dos veces al año, y, por ejemplo, cada 6, 7, 8, 9 o 10 meses, después de una dosis inicial. Una composición de la invención se puede dosificar en el intervalo apropiado de 20 U a 60 U, y más preferentemente, 20 U, 40 U, o 60 U de toxina botulínica en la composición.

La presente invención también contempla el uso de una variedad de dispositivos de suministro para inyectar composiciones que contienen toxina botulínica descritas en el presente documento a través de la piel. Dichos dispositivos pueden incluir, sin limitación, una aguja y una jeringa, o puede implicar dispositivos más sofisticados capaces de dispensar y controlar la dispensación de la composición y, opcionalmente, controlar el estado del sujeto en uno o más aspectos (por ejemplo, controlar la reacción del sujeto a las sustancias que se dispensan).

En algunas realizaciones, las composiciones se pueden formular previamente y/o instalar previamente en un dispositivo de suministro como tal. La presente invención también contempla realizaciones en donde las composiciones se proporcionan en un kit que almacena uno o más componentes por separado de los componentes restantes. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la invención proporciona un kit que almacena por separado la toxina botulínica y el transportador cargado positivamente para combinarlos en el momento de la aplicación o antes. La cantidad de transportador cargado positivamente o la relación de concentración de estas moléculas con respecto a la toxina botulínica dependerá de qué transportador se elija para su uso en la composición en cuestión. La cantidad o relación apropiada de molécula de transportador en un caso dado se puede determinar fácilmente, por ejemplo, realizando uno o más experimentos como los descritos a continuación.

En general, la invención también contempla un método para administrar toxina botulínica (como alternativa como complejos de toxinas botulínicas o complejos de toxinas botulínicas reducidos) a un sujeto o paciente que lo necesite, en el que se administra una cantidad eficaz de toxina botulínica junto con un transportador cargado positivamente, como se describe en el presente documento. Por "junto con" se entiende que los dos componentes (toxina botulínica y transportador cargado positivamente) se administran en un procedimiento de combinación, que puede implicar combinarlos antes de la administración a un sujeto o administrarlos por separado, pero de manera que actúen juntos para proporcionar el suministro necesario de una cantidad eficaz de la proteína terapéutica. Por ejemplo, primero se puede administrar a la piel del sujeto una composición que contenga el transportador cargado positivamente, seguido de la aplicación de un parche para la piel, jeringa u otro dispositivo que contenga la toxina botulínica. La toxina botulínica se puede almacenar en forma seca en una jeringa u otro dispositivo dispensador y el transportador cargado positivamente se puede inyectar antes de la aplicación de la toxina de manera que ambos actúen juntos, dando como resultado la potenciación deseada de la penetración en el tejido. En ese sentido, por lo tanto, las dos sustancias (transportador cargado positivamente y toxina botulínica) actúan en combinación o quizá interactúan para formar una composición o combinación in situ. En consecuencia, la invención también incluye un kit con un dispositivo para dispensar toxina botulínica y un líquido, gel o similares que contiene el transportador cargado positivamente y que es adecuado para inyección en la piel o tejido diana de un sujeto. Los kits para administrar las composiciones de las invenciones, ya sea bajo la dirección de un profesional de la salud o por el paciente o sujeto, también puede incluir un aplicador personalizado adecuado para ese fin.

Las composiciones de la presente invención son adecuadas para su uso en entornos fisiológicos con un pH que varía de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,3 y, por lo tanto, pueden tener dicho pH. Sin embargo, las composiciones que tienen un pH que varía de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 también están abarcadas por la invención como se describe en el presente documento. Las composiciones según la presente invención se pueden almacenar bien a temperatura ambiente o en condiciones de refrigeración.

En algunas realizaciones, el paciente a tratar tiene 65 años de edad, al menos 65 años o más de 65 años. Por ejemplo, el paciente puede tener 65, 66, 68, 70, 75, 80 años o más.

Ejemplos

Ejemplo 1

Duración de la parálisis muscular local en un modelo murino

Este ejemplo compara la duración de la parálisis muscular local en ratones inyectados bien con RT003 o BOTOX®. RT003 es una formulación inyectable ilustrativa según la invención que contiene toxina botulínica de tipo A (purificada para eliminar todas las proteínas endógenas que no son toxinas) y transportador cargado positivamente. con la secuencia RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR BOTOX® también contiene toxina botulínica de tipo A, pero se añade albúmina exógena para estabilizar la molécula de toxina botulínica de tipo A.

La parálisis muscular se midió utilizando el ensayo de puntuación de abducción de dedos (DAS) según lo informado por Aoki, K.R. en "A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice", Toxicon 2001; 39(12): 1815-1820. En el ensayo de DAS, un ratón se suspende brevemente por la cola para provocar una respuesta de sobresalto característica en la que el ratón extiende sus patas traseras y abduce sus dedos traseros. La medida en que el ratón es capaz de mostrar esta respuesta de sobresalto se califica en una escala de cinco puntos (de 0-4), donde cero representa una respuesta de sobresalto normal y cuatro representa la reducción máxima en la abducción de dedos y la extensión de la pata. La puntuación la realiza un observador sin conocimiento de la medida en que se ha tratado al ratón sujeto con neurotoxina. Se determinó que la puntuación inicial utilizando el ensayo de DAS era de 0,4 para una población de animales sin tratar.

El estudio informado en este ejemplo implicó a diez animales (5 ratones en el grupo con RT003 y 5 ratones en el grupo con BOTOX®). A cada uno de los animales se le inyectó tres veces la formulación de toxina botulínica correspondiente (es decir, RT003 o BOTOX®), con un período de 40 días entre cada dosificación. Después de la inyección, se contó el número de días que todos los animales de cada grupo de ensayo estuvieron por encima del valor inicial de 0,4 del ensayo de DAS. Los resultados, mostrados en la figura 1, indican que la puntuación del ensayo de DAS para el grupo tratado con RT003 se mantuvo por encima del valor inicial de 0,4 durante 25, 22 y 21 días, siguiendo al primer, segundo y tercer tratamiento, respectivamente. En cambio, la puntuación del ensayo de DAS para el grupo tratado con BOTOX® se mantuvo por encima del valor inicial de 0,4 durante 11,8 y 11 días, siguiendo al primer, segundo y tercer tratamiento, respectivamente.

Estos datos del ensayo de DAS indican que la parálisis muscular local causada por la formulación de RT003 dura aproximadamente el doble que la parálisis muscular local causada por BOTOX®. Este resultado tiene implicaciones importantes para los usos terapéuticos de RT003 y otros compuestos inyectables que contienen toxina botulínica según la invención. En particular, mediante el uso de composiciones inyectables según la invención, se puede reducir significativamente la frecuencia de las inyecciones de seguimiento necesarias para mantener un efecto cosmético o terapéutico particular causado por la toxina botulínica. A su vez, la frecuencia de aplicación reducida puede dar como resultado una mejor eficacia a largo plazo, ya que el sujeto es menos propenso a desarrollar anticuerpos contra la toxina botulínica.

Ejemplo 2

Formulaciones inyectables de toxina botulínica con un perfil de seguridad mejorado

En las últimas décadas, la toxina botulínica ha encontrado uso como agente terapéutico para tratar una variedad de afecciones, incluidas las arrugas, hiperhidrosis y espasmos musculares. Sin embargo, debido a que la toxina botulínica es la toxina de origen natural más potente conocida por los seres humanos, la administración inadecuada de la toxina puede ser extremadamente peligrosa. Por ejemplo, el suministro sistémico accidental de toxina botulínica puede dar lugar a parálisis, dificultad para respirar e incluso la muerte. Por otra parte, incluso si la toxina botulínica se suministrara correctamente en una región localizada del cuerpo como parte de un tratamiento terapéutico, la toxina tiene una tendencia natural a difundirse a lo largo del tiempo, aumentando, de este modo, el riesgo de parálisis no deseada en otras partes del cuerpo. Por ejemplo, cuando se inyecta toxina botulínica alrededor de los ojos para tratar las arrugas, puede difundirse a los músculos que controlan el movimiento de los párpados. Si esto pasa, los músculos de los párpados pueden quedar parcialmente paralizados, dando lugar a una afección bien conocida que se la conoce como "caída del párpado", en la que el párpado está parcialmente cerrado e interfiere con la visión normal.

Un aspecto de presente invención es proporcionar formulaciones inyectables de toxina botulínica con un perfil de seguridad mejorado en comparación con las formulaciones de toxina botulínica comerciales actualmente disponibles. En realizaciones preferidas, las formulaciones inyectables de toxina botulínica tienen una tendencia reducida a difundirse después de la inyección. De este modo, determinadas formulaciones preferidas de la invención permiten un suministro más preciso de toxina botulínica, reduciendo drásticamente los efectos secundarios no deseados asociados con la difusión local descontrolada de la toxina botulínica.

Este ejemplo informa sobre un estudio comparativo de la tendencia de la toxina botulínica en diversas formulaciones a difundirse después de la inyección. El estudio implicó tres formulaciones de toxina botulínica: (1) BOTOX®; (2) RT003, una solución tamponada y estabilizada que contiene la molécula de toxina botulínica de tipo A de 150 kD asociada de forma no covalente con un transportador cargado positivamente que tiene la fórmula RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR; y (3) RTT150, que es idéntica a la formulación RT003, excepto que no contiene el transportador cargado positivamente presente en RT003.

El músculo gastrocnemio de cada uno de los ratones utilizados en el estudio se inyectó con una de las formulaciones de toxina botulínica mencionadas anteriormente, ya sea en la porción lateral a la línea media del músculo (figura 2A), o en la porción de la línea media del músculo (figura 2B). Se realizaron ensayos de DAS en cada uno de los ratones durante cuatro días después de la inyección de la toxina botulínica para determinar si la toxina botulínica de la correspondiente formulación mostraba alguna tendencia a difundirse desde el músculo gastrocnemio hacia las patas traseras del ratón. A partir de los ensayos de DAS, cualquier disminución de la capacidad de los animales de prueba para abducir sus dedos posteriores se interpretó como una indicación de difusión de toxina botulínica.

La figura 3 muestra los resultados de los ensayos de DAS realizados después de inyectar a los animales de prueba las diferentes formulaciones de toxina botulínica como se describe anteriormente. Téngase en cuenta que las puntuaciones de abducción de dedos se agrupan en dos grupos, correspondiente a si la inyección fue en la línea media o en la porción lateral a línea media del músculo gastrocnemio. Las puntuaciones de DAS generalmente más bajas para las inyecciones en la línea media, en comparación con las puntuaciones de DAS para las inyecciones de la línea lateral a la línea media, indica que el grado de parálisis en las patas traseras de los animales de prueba es generalmente menor después de la inyección en la línea media. Sin pretender limitarse a teoría alguna, se cree que este comportamiento se debe a la mayor distancia que tiene que recorrer la toxina botulínica para alcanzar los dedos posteriores de un animal de prueba después de la inyección en la línea media, en comparación con la inyección lateral a línea media. Se cree que esta mayor distancia de recorrido requerida por la toxina botulínica disminuye la probabilidad de parálisis de los dedos posteriores.

La figura 3 muestra una puntuación de abducción digital de cero durante los cuatro días posteriores a la inyección en la línea media de la formulación RT003. Este resultado indica que la toxina botulínica en la formulación RT003 permanece localizada en la porción de la línea media del músculo gastrocnemio tras la inyección y que no se produce ninguna difusión que cause parálisis en la escala de tiempo del experimento. Por el contrario, se observan puntuaciones de abducción digital por encima del valor inicial de DAS de 0,4 después de la inyección de las formulaciones RTT150 y BOTOX®, siendo la puntuación de DAS promedio más alta para la formulación BOTOX®. Los resultados de DAS para las formulaciones RTT150 y BOTOX® indican que se observó parálisis en los dedos posteriores de los animales de prueba después de la inyección en la línea media de estas formulaciones, observándose un mayor grado de parálisis después de la inyección de la formulación BOTOX®. Estos datos sugieren que las moléculas de toxina botulínica en las formulaciones RTT150 y BOTOX® son capaces de difundirse localmente después de la inyección, con un mayor grado de difusión local para las moléculas de toxina botulínica en la formulación BOTOX®.

La figura 3 también muestra que se observa parálisis de los dedos posteriores en todos los animales de prueba después de la inyección lateral a línea media, independientemente de la formulación específica de toxina botulínica. Tal como se ha analizado anteriormente, este mayor grado de parálisis después de la inyección lateral a línea media, en comparación con la inyección en la línea media, se cree que se relaciona con una distancia de recorrido más corta para la toxina botulínica a las patas traseras de los animales de prueba. Sin embargo, mientras que las tres formulaciones de toxina botulínica presentan una difusión que causa parálisis después de la inyección lateral a línea media, el grado de parálisis en animales de prueba inyectados con RT003 es menor, en promedio, que el grado de parálisis observado para las formulaciones RTT150 y BOTOX® durante la escala de tiempo del experimento. Por lo tanto, los datos del ensayo de DAS correspondientes a la inyección lateral a línea media son cualitativamente similares a los de la inyección en la línea media, ya que muestran una menor tendencia a la difusión local de toxina botulínica para la formulación RT003, en comparación con RTT150 y BOTOX®.

Se puede hacer una comparación de la tasa de difusión local después de la inyección en la línea media y la inyección lateral a línea media considerando un parámetro denominado "índice de difusión", que se define según la Ecuación (1):

„ , , . r p u ntuación de abducción digital de línea m edia

índice de difusión = — _punt-_u--_a-_c-_i-_ó—_{n d}—_{e a}—_bd-_u-_c-_c--_ió—_{n d}—_igital- _la-- _t-_e-_r-_a— _{l a l}-_ín--_e-_a-- _m--- _ed—_iax 100 (1)

Debido a que las puntuaciones de abducción digital pueden variar de 0 a 4, y se espera que las puntuaciones de abducción digital de línea lateral a media sean más altas que las puntuaciones de abducción digital de línea media (como se analiza anteriormente), los valores del índice de difusión variarán normalmente de 0 a 100. Un valor del índice de difusión que se aproxima a 100 indica que la relación de las puntuaciones de abducción digital de línea media y lateral a línea media se aproxima a la unidad. Esto puede producirse si las tasas de difusión después de la inyección son lo suficientemente altas como para que los tiempos de difusión para que la toxina botulínica alcance y paralice los dedos posteriores del animal de prueba después de la inyección en la línea media y lateral a línea media sean comparables o casi iguales. En el otro extremo, los valores del índice de difusión que se aproximan a cero indican que la relación de las puntuaciones de abducción digital de la línea media y de la línea lateral a línea media se aproxima a cero. Esto puede producirse si la difusión de la toxina botulínica después de la inyección en la línea media es tan baja que es insuficiente para causar parálisis en los dedos posteriores de los animales de prueba, aunque se observa parálisis después de la inyección lateral a línea media.

La tabla 1 a continuación muestra los valores del índice de difusión calculados utilizando puntuaciones de abducción digital después de la inyección de BOTOX®, RT003 y RTT150 en la línea media o lateral a línea media., como se indica en el experimento correspondiente a la figura 3. En la escala de tiempo del experimento, los valores del índice de difusión correspondientes a la inyección de la formulación BOTOX® son superiores a los valores observados para las formulaciones RTT150 y RT003. Esto indica que, para la inyección de la formulación de BOTOX®, la relación de las puntuaciones de abducción digital de línea media y lateral a línea media están más cerca de la unidad, en comparación con las relaciones observadas para las formulaciones RTT150 y RT003. Debido a que la toxina botulínica debe difundirse aún más para causar parálisis en los dedos posteriores de un animal de prueba después de la inyección en la línea media, la observación de que la relación de las puntuaciones de abducción digital en la línea media y de lateral a línea media después de la inyección de BOTOX® está más cerca de la unidad sugiere que la tasa de difusión de la toxina botulínica después de la inyección de BOTOX® en la línea media es bastante sustancial con respecto a la tasa después de la inyección en la línea media. En otras palabras, la mayor longitud de la vía de difusión asociada con la inyección en la línea media es una barrera menor para causar parálisis de los dedos posteriores.

En cambio, los valores del índice de difusión para RT003 son todos cero en la escala de tiempo de cuatro días del experimento. Este resultado indica que no se observa difusión inductora de parálisis después de la inyección en la línea media de RT003. En otras palabras, la formulación RT003, que contiene la molécula de toxina botulínica de tipo A asociada no covalentemente con un transportador cargado positivamente, permite una localización potenciada inyectada con toxina botulínica de tipo A. De este modo, la formulación RT003 proporciona un perfil de seguridad mejorado en comparación con la formulación BOTOX® y minimiza la parálisis no deseada.

Los valores del índice de difusión observados para RTT150, aunque no son cero como en el caso de RT003, son aún menores que los observados para la formulación BOTOX®. Véase, Tabla 1. Este resultado indica que se produce suficiente difusión de toxina botulínica para producir una parálisis de los dedos posteriores observable en la escala de tiempo de cuatro días del experimento, pero que el tiempo necesario para la difusión de la toxina botulínica que causa la parálisis es relativamente más largo después de la inyección en la línea media.

T l 1

Ejemplo 3

Formulaciones inyectables de toxina botulínica con tendencia reducida a generar anticuerpos

Cuando la toxina botulínica se inyecta periódicamente a un paciente para tratar una afección no deseada, tal como arrugas, con frecuencia se observa que la eficacia de la toxina botulínica disminuye con las sucesivas inyecciones, aunque la duración de los efectos de la toxina botulínica puede seguir siendo la misma. Se cree que este fenómeno es el resultado de la formación de anticuerpos contra la toxina botulínica por parte del sistema inmunitario del paciente. Desde la perspectiva del tratamiento, la formación de anticuerpos contra la toxina botulínica por parte del paciente no es deseable, porque después se necesitan dosis cada vez mayores de toxina botulínica para conseguir el mismo efecto, lo que presenta serios problemas relacionados tanto con la seguridad como con el coste.

En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona formulaciones inyectables de toxina botulínica que tienen una menor tendencia a inducir la formación de anticuerpos, en comparación con las formulaciones comerciales inyectables de toxina botulínica actualmente disponibles. Por lo tanto, en estas realizaciones, las formulaciones de toxina botulínica ayudan a minimizar el riesgo asociado con la inyección de toxina botulínica al permitir, a lo largo del tiempo, usar menos toxina para conseguir el mismo efecto.

En este ejemplo, los datos del ensayo de DAS obtenidos después de inyecciones repetidas de RT003 y BOTOX® como se describe en el ejemplo 2 se analizan en función del tiempo para determinar cómo cambia la eficacia de estas dos formulaciones tras la administración repetida a los mismos animales de prueba. Generalmente, después de la administración repetida de cualquiera de las formulaciones, la duración de los efectos asociados con la toxina botulínica fue la misma. Sin embargo, el grado de parálisis muscular tras la administración repetida varió dependiendo de la formulación. Para cuantificar el cambio en el grado de parálisis muscular, el cambio porcentual en las puntuaciones de abducción digital después de la inyección bien de RT003 o BOTOX® se determinó según la Ecuación (2):

^{.... , , . t-* * ~ DAS p ara el enésim o tratam iento-D A S p} % de cambio en DAS = ------------------------------ p--r-im--- e-r-- tr-a--t-a- ^{ara p rim er tratam iento .......}

DAS p ara m— ien -to-------------------- x 100 (2)

Debido a que el numerador de la Ecuación (2) es la diferencia entre las puntuaciones de abducción digital medidas para el tratamiento enésimo y el primero, el cambio porcentual en DAS será negativo si la puntuación de abducción digital medida para el enésimo tratamiento es menor que la puntuación de abducción digital medida para el primer tratamiento. En otras palabras, el cambio porcentual en DAS es negativo cuando se observa menos parálisis después del enésimo tratamiento, en comparación con el primer tratamiento. La Tabla 2 muestra el cambio porcentual en los valores de DAS medidos después de la administración repetida de las formulaciones RT003 y BOTOX® según el procedimiento descrito en el ejemplo 2.

T l 2

Como se indica en la tabla 2, después del primer retratamiento, el cambio porcentual en la puntuación de abducción digital fue de -44 % para la formulación BOTOX®, lo que sugiere una caída sustancial en la eficacia. En cambio, el cambio porcentual en la puntuación de abducción digital para la formulación RT003 fue cero, lo que indica que la puntuación de DAS después del segundo retratamiento fue la misma que después de la administración inicial y el primer retratamiento. Este resultado indica que el grado de parálisis observado después del primer retratamiento de RT003 es el mismo que el grado de parálisis posterior al primer tratamiento y que se produjo una formación insignificante de anticuerpos neutralizantes en los animales de prueba incluso después del primer retratamiento. Después del 2° retratamiento de RT003 y BOTOX®, los cambios porcentuales calculados en los valores de DAS fueron negativos para ambas formulaciones, aunque la magnitud del cambio porcentual en los valores de DAS para la formulación RT003 fue la mitad del valor determinado para BOTOX®. El cambio porcentual más grande y negativo en los valores de DAS observados para BOTOX® sugiere que los animales de prueba tenían una mayor tasa de generación de anticuerpos contra BOTOX®, en comparación con RT003. Por lo tanto, estos datos indican que las formulaciones contempladas por la presente invención, tales como RT003, puede tener una menor tendencia a inducir la formación de anticuerpos que neutralicen el efecto de la toxina botulínica. En consecuencia, este resultado sugiere que mediante el uso de formulaciones contempladas por la presente invención, uno puede, a lo largo del tiempo, usar menos toxina botulínica para conseguir el mismo efecto terapéutico.

Ejemplo 4

Formulaciones inyectables de toxina botulínica con estabilidad mejorada

Este ejemplo demuestra que las moléculas transportadoras cargadas positivamente utilizadas en las formulaciones inyectables de toxina botulínica de la invención no solamente potencian el perfil de seguridad de las formulaciones (ejemplo 2), sino que también mejoran su estabilidad. La tabla 3 muestra los resultados de los experimentos de envejecimiento en donde las formulaciones RT003 y RTT150 se envejecen a 4 °C (solamente RT003) y a 40 °C (tanto RT003 como RTT150) durante varios intervalos de tiempo. Después del envejecimiento a las temperaturas especificadas durante los tiempos especificados, la potencia de las formulaciones RT003 y RTT150 se midió a través de una serie de ensayos de DL⁵⁰en ratones IP. Los resultados, resumidos en la tabla 3, indican que la potencia de RT003 permanece esencialmente sin cambios después del envejecimiento a 4 °C, incluso después de seis meses. Asimismo, la potencia de la formulación RT003, según lo medido por la capacidad de la formulación para matar a los animales diana en un ensayo de DL⁵⁰en ratones IP, disminuye solo ligeramente incluso si la formulación RT003 se envejece a temperatura elevada (40 °C) durante seis meses. Por el contrario, la formulación RTT150 presentó una disminución significativa en la potencia después de solo un mes de envejecimiento a 40 °C. Debido a que las formulaciones RT003 y RTT150 son idénticas, con la excepción de que la formulación RT003 también contiene una molécula transportadora cargada positivamente que tiene la fórmula RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR, estos datos indican que la molécula transportadora cargada positivamente mejora la estabilidad de la toxina botulínica en la formulación RT003.

T l

Ejemplo 5

Formulación inyectable de toxina botulínica que muestra efectos de larga duración en el tratamiento de las líneas glabelares

Este ejemplo describe un estudio clínico y un análisis intermedio de los resultados en la semana 24 para evaluar la seguridad, eficacia y duración del efecto de una composición inyectable de la invención que contiene toxina botulínica A y un transportador cargado positivamente que comprende un polipéptido de polilisina cargado positivamente que tiene uno o más grupos de eficiencia cargados positivamente unidos covalentemente, denominada RT002. El producto RT002 es una formulación inyectable, que contiene la molécula de toxina botulínica de subtipo A de 150 kD, que no está asociada covalentemente con un péptido transportador cargado positivamente que tiene la fórmula RKKRRQRRRG-(K)¹⁵-GRKKRRQRRR y que no contiene proteínas accesorias ni componentes de origen animal, utilizada en el estudio para el tratamiento de líneas glabelares moderadas a graves.

El estudio clínico fue un estudio multicéntrico de fase 2, aleatorizado, con doble enmascaramiento con intervalos de dosis activo y controlado con placebo diseñado y realizado para evaluar la seguridad y eficacia y la duración del efecto de un solo tratamiento (una sola vez) por inyección de RT002 para la mejora temporal en la apariencia de las líneas glabelares en adultos. Se evaluaron tres dosis, 20 U, 40 U y 60 U, de RT002 en comparación con un control activo, es decir, VISTABEL®/BOTOX® (dosis de 20 U por inyección intramuscular) y uno con placebo (inyección intramuscular). El tratamiento de inyección fue una sola inyección intramuscular. También se evaluó la duración del efecto de un solo tratamiento de RT002 en los tres niveles de dosificación frente a VISTABEL®/BOTOX® Cosmetic.

El producto RT002 está compuesto por neurotoxina botulínica purificada de 150 kDa, denominada RTT150, formulada en polvo liofilizado. En estudios no clínicos, se ha demostrado que RT002 presenta menos difusión que otras formas de neurotoxina botulínica A (BoNTA) y puede ofrecer un mayor control del efecto en los lugares diana con menos efectos secundarios debido a la propagación distante de la toxina en los músculos vecinos. Además, la formulación de toxina botulínica de tipo A sin aditivos RT002 tiene la capacidad de proporcionar un potencial inmunogénico menor debido a la ausencia de proteínas no activas presentes en la formulación. Además, RT002 se toleró bien después de la administración intramuscular de dosis repetidas de hasta 50 U/kg en ratas.

Posología y técnica de inyección.: La posología de RT002 para este estudio fue un solo tratamiento de bien RT002 (20 U, 40 U o 60 U), placebo o VISTABEL®/BOTOX®, que se dosificó a 20 U por sujeto, como una inyección intramuscular de 0,1 ml en cada uno de los 5 lugares de inyección en la frente (0,5 ml en total), entre las cejas, del sujeto que se somete a tratamiento. Todos los tratamientos fueron inyecciones intramusculares administradas por un médico capacitado. Más específicamente, los sujetos del estudio recibieron un solo tratamiento de 0,1 ml por inyección en cinco puntos de inyección: dos inyecciones en cada músculo corrugador y una inyección en el músculo prócer. Los investigadores, el personal del centro, los sujetos y el patrocinador tenían enmascaramiento de las asignaciones de los grupos de tratamiento. Se inscribieron en el estudio aproximadamente 250 adultos, sujetos femeninos y masculinos, de 30 a 65 años de edad y en buen estado de salud general, con líneas glabelares moderadas a graves en el momento de la entrada.

Las líneas faciales glabelares surgen de los músculos corrugador lateral y prócer vertical en la cara. Estos pueden identificarse fácilmente mediante la palpación de la masa muscular mientras se hace que el paciente frunza el ceño al máximo. El corrugador deprime la piel creando una línea vertical, es decir, un surco, rodeado por crestas de músculo tenso (es decir, líneas de expresión). Debido a la ubicación, el tamaño y el uso de los músculos varían notablemente entre los individuos, los médicos que administran la toxina botulínica inyectable deben comprender la anatomía relevante del área involucrada y cualquier alteración en la anatomía debido a procedimientos quirúrgicos previos. Para reducir el riesgo de ptosis, se realizan de manera óptima las siguientes etapas: (i) debe evitarse la inyección de o cerca del elevador del párpado superior, particularmente en pacientes con depresores de cejas más grandes; (ii) las inyecciones del corrugador medial deben estar al menos 1 centímetro por encima del reborde supraorbitario óseo; (iii) se debe asegurar que el volumen/dosis inyectado sea exacto; y (iv) la toxina no debe inyectarse a menos de 1 centímetro por encima de la ceja central. La toxina botulínica se inyecta aplicando presión con el dedo en el borde orbital medial superior mientras se avanza la aguja a través de la piel hacia el músculo subyacente.

Para el estudio, se evaluó la gravedad de las líneas glabelares de un sujeto por el investigador y el sujeto. Para la evaluación del investigador, se usó un sistema de puntuación de calificación de la evaluación global del investigadorevaluación de la gravedad de las arrugas faciales (IGA-FWS) de la siguiente manera: una puntuación de calificación IGA-FWS de (0) indicaba ausencia de gravedad de las arrugas faciales; una puntuación de calificación IGA-FWS de (1) indicaba una gravedad leve de las arrugas faciales; una puntuación de calificación IGA-FWS de (2) indicaba una gravedad moderada de las arrugas faciales; y un puntuación de calificación IGA-FWS de (3) indicaba una gravedad fuerte de las arrugas faciales. Como aprecia el médico experto, una guía fotográfica muestra los grados de gravedad de las arrugas utilizados para el investigador y por referencia.

Evaluación de la gravedad de las arrugas faciales del paciente (PFWS, por sus siglas en inglés): Se utilizó una gravedad de las arrugas faciales del paciente (PFWS) para la evaluación de la gravedad de las arrugas faciales de un sujeto. Los sujetos completaron la evaluación de la gravedad de las arrugas faciales del paciente (PFWS) con el ceño fruncido al máximo para evaluar la gravedad de las líneas glabelares en la visita de selección, en la visita de tratamiento (día 0) antes del tratamiento, en las visitas de seguimiento (semanas 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32) y en la visita de fin de estudio (semana 24, 28, 32 o 36, según corresponda) o en la visita de interrupción temprana, si procedía. El formulario de evaluación se proporcionó directamente al sujeto para que lo completara mientras revisaba las líneas glabelares utilizando un espejo de mano suministrado. El sistema de puntuación de calificación de PFWS fue el siguiente: una puntuación de calificación de PFWS de (0) indicaba ausencia de gravedad de las arrugas, con la descripción asociada de "sin arrugas"; una puntuación de calificación de PFWS de (1) indicaba una gravedad leve de las arrugas, con la descripción asociada de "arrugas muy superficiales"; una puntuación de calificación PFWS de (2) indicaba una gravedad moderada de las arrugas, con la descripción asociada de "arrugas moderadas"; y un puntuación de calificación de PFWS de (3) indicaba una gravedad fuerte de las arrugas, con la descripción asociada de "arrugas profundas". Según el estudio, se necesitó una calificación IGA-FWS y PFWS de (2) moderada o (3) grave para las líneas glabelares de un sujeto para que un sujeto se inscribiera en el estudio.

Los sujetos se aleatorizaron 1:1:1:1:1 a uno de los tratamientos presentados en la tabla 4 a continuación.

T l 4

Los sujetos inscritos en el estudio tuvieron visitas de selección y tratamiento y evaluaciones de seguridad y eficacia de seguimiento a lo largo del estudio durante hasta 36 semanas. Se proporcionó un diario del sujeto durante el período inicial de 2 semanas para documentar el inicio de la respuesta al tratamiento. Los sujetos se evaluaron con una llamada telefónica en la semana 1 y durante las visitas en las semanas 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32 y 36 del estudio. Se realizó un seguimiento de los sujetos durante al menos 24 semanas después del tratamiento. Si la puntuación de la evaluación global del investigador-evaluación de la gravedad de las arrugas faciales (IGA-FWS) del sujeto con el ceño fruncido al máximo volvía al valor inicial entre las visitas de la semana 24 y la semana 36, la visita en la que se registró esa puntuación se consideró la visita de fin del estudio para el sujeto.

La duración del estudio fue de hasta 38 semanas en el estudio, incluido un período de selección de hasta dos semanas seguido de un solo tratamiento y un período de seguimiento de hasta 36 semanas después del tratamiento. Se realizó un seguimiento de los sujetos durante al menos 24 semanas después del tratamiento. Los lugares de inyección se evaluaron en la visita de selección, visita de tratamiento (día 0), antes y después del tratamiento (para determinar si hubo una reacción inmediata al producto en investigación), en las visitas de seguimiento (semanas 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32) y en la visita de fin de estudio (semana 24, 28, 32 o 36, según corresponda) o en la visita de interrupción temprana, si procedía. La evaluación se realizó como una evaluación global de los 5 lugares de inyección y se evaluó el eritema, edema, sensación de ardor o escozor y picazón, como lo describe el sujeto.

Además, los nervios craneales II-VII se evaluaron por el investigador en la visita de tratamiento (día 0) antes del tratamiento, en las visitas de seguimiento (semanas 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32) y en la visita de fin del estudio (semana 24, 28, 32 o 36, según corresponda) o visita de interrupción temprana, si procedía. Las puntuaciones de las evaluaciones de los nervios craneales se capturaron de la siguiente manera: una calificación de (1) correspondía a "normal"; una calificación de (2) correspondía a "anormal, no clínicamente significativo;" una calificación de (3) correspondía a "anormal, clínicamente significativo"; una calificación de (4) correspondía a "no evaluado". Para estas evaluaciones, el nervio craneal II es el nervio óptico; el nervio craneal III es el nervio oculomotor; el nervio craneal IV es el nervio troclear; el nervio craneal V es el nervio trigémino; el nervio craneal VI es el nervio motor ocular externo y el nervio craneal VII es el nervio facial. El sistema regional de clasificación de los nervios faciales House-Brackmann (Yen, T.L. et al., 2003, Otol. Neurotol., 24(1): 118-122) se diseñó para evaluar la sincinesia y las cuatro ramas principales del nervio facial (VII) que inerva la musculatura diana y adyacente. El investigador evaluó la funcionalidad del nervio facial (VII) en la visita de tratamiento (día 0) antes del tratamiento, en las visitas de seguimiento (semanas 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32) y en la visita de fin de estudio (semana 24, 28, 32 o 36, según corresponda) o en la visita de interrupción temprana, si procedía.

La fuerza de los músculos faciales se evaluó utilizando la escala del consejo de investigación médica para la evaluación de la fuerza muscular (MRC, por sus siglas en inglés). La MRC es una escala confiable y validada para evaluar la debilidad muscular y ayuda en la investigación de lesiones de los nervios periféricos (Paternostro-Sluga, 2008). Se evaluaron los músculos orbicular de los párpados (párpado), elevador de cejas laterales y orbicular cigomático lateral en cada lado de la cara. En la escala MRC para la evaluación de la fuerza muscular, una calificación de (0) corresponde a "sin movimiento"; una calificación de (1) corresponde a "parpadeo perceptible en el músculo"; una calificación de (2) corresponde a "solamente movimiento si se elimina la gravedad"; una calificación de (3) corresponde a "puede mover la extremidad contra la gravedad"; una calificación de (4) corresponde a "puede moverse contra la gravedad y cierta resistencia ejercida por el examinador; y una clasificación de (5) corresponde a "fuerza normal".

Se realizaron consultas sobre la propagación a distancia de la toxina con sujetos en la visita de tratamiento (día 0) posterior al tratamiento, en la llamada telefónica de seguimiento (semana 1), en las visitas de seguimiento (semanas 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32) y en la visita de fin de estudio (semana 24, 28, 32 o 36, según corresponda) o en la visita de interrupción temprana, si procedía. Además, los eventos adversos (EA) también se evaluaron en estos mismos puntos temporales. Sin ánimo de ser limitante, los ejemplos de EA incluyen visión doble, parálisis del párpado, debilidad muscular, cansancio extremo y dificultad para tragar, respirar y hablar.

Las evaluaciones de eficacia incluyeron la evaluación del investigador de la gravedad de la línea glabelar y las escalas de mejora de la línea glabelar, la evaluación del sujeto de la gravedad y mejora de la línea glabelar, incluidos los cuestionarios del sujeto, y el inicio del efecto evaluado por el diario del sujeto. Las evaluaciones de eficacia se realizaron con el sujeto en una posición sentada. Para tener una posición consistente de los ojos durante la evaluación, el investigador le pide al sujeto que se concentre en un punto fijo en la sala de examen. La evaluación debe llevarse a cabo en una habitación con buena iluminación cenital (no se debe usar una luz de examen) o luz natural de una ventana (pero no luz solar directa). En cada visita a la clínica, el investigador evaluó la apariencia visual (con el ceño fruncido al máximo y en reposo después del ceño fruncido al máximo) de las líneas glabelares utilizando una escala/puntuación de clasificación IGA-FWS de 4 puntos adecuada para la puntuación de la gravedad de las arrugas faciales, de la siguiente manera: una puntuación de calificación de (0) correspondía a la ausencia de arrugas faciales; una puntuación de calificación de (1) correspondía a arrugas faciales leves; una puntuación de calificación de (2) correspondía a arrugas faciales moderadas; y una puntuación de calificación de (3) correspondía a arrugas faciales graves. La evaluación representó la gravedad de las arrugas en cada punto temporal dado y no se basó en una comparación con el nivel antes del tratamiento. Las evaluaciones se completaron de manera óptima por el mismo investigador y lo más cerca posible a la misma hora del día en cada visita. En un esfuerzo por estandarizar la clasificación de la gravedad de las arrugas entre los investigadores, se utilizó un conjunto de fotografías de capacitación que mostraban los grados de gravedad de las arrugas para la capacitación de los investigadores.

También se proporcionó una guía fotográfica a cada centro de estudio para ayudar en la evaluación del investigador.

Escala de mejora estética global del paciente (GAIS, por sus siglas en inglés): El investigador y el sujeto evaluaron la apariencia visual (con el ceño fruncido al máximo y en reposo después del ceño fruncido al máximo) de la mejora de las líneas glabelares desde la condición inicial utilizando la escala de mejora estética global del paciente (GAIS) de 7 puntos de gravedad que se muestra en la tabla 5 a continuación. Los sujetos del estudio completaron la escala de mejora estética global del paciente (GAIS) con el ceño fruncido al máximo y en reposo después del ceño fruncido al máximo, para evaluar la apariencia visual de la mejora de las líneas glabelares desde la condición inicial en las visitas de seguimiento (semanas 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32) y en la visita de fin de estudio (semana 24, 28, 32 o 36, según corresponda) o en la visita de interrupción temprana, si procedía. El formulario de evaluación GAIS se entregó directamente al sujeto para que lo completara mientras revisaba el área tratada usando un espejo de mano suministrado. Los sujetos con lentes de contacto vieron de manera óptima sus líneas glabelares mientras usaban sus lentes de contacto. Se aconsejó a los sujetos que usaban gafas que, si era posible, vieran sus líneas glabelares sin las gafas. Si se necesitaran anteojos para que el sujeto viera sus líneas glabelares, después se usaron gafas para la evaluación. La evaluación del sujeto se completó antes de que el investigador completara la evaluación IGA-FWS.

T l

En cada visita a la clínica, el sujeto evaluó la apariencia visual (con el ceño fruncido al máximo) de las líneas glabelares utilizando la siguiente escala de 4 puntos adecuada para la evaluación del sujeto de la gravedad de las arrugas faciales del paciente (tabla 6 a continuación). El formulario de evaluación se proporcionó directamente al sujeto para que lo completara mientras revisaba el área de tratamiento glabelar utilizando el espejo de mano suministrado. En cuanto a la evaluación GAIS anterior, los sujetos con lentes de contacto vieron de manera óptima sus líneas glabelares mientras usaban sus lentes de contacto. Se aconsejó a los sujetos que usaban gafas que, si era posible, vieran sus líneas glabelares sin las gafas. Si se necesitaran anteojos para que el sujeto viera sus líneas glabelares, después se usaron gafas para la evaluación. La evaluación del sujeto se completó antes de que el investigador complete la evaluación IGA-FWS. La evaluación representó la gravedad de las arrugas en cada punto de tiempo dado y no se basó en una comparación con el nivel de defectos antes del tratamiento. Las evaluaciones se completaron por el sujeto lo más cerca posible a la misma hora en cada visita.

T l

Las evaluaciones adicionales de los sujetos durante el estudio incluyeron una calificación de la importancia de la duración del efecto al elegir un tratamiento estético (proporcionado en la visita de tratamiento (día 0); una calificación de la satisfacción de los sujetos con los resultados del tratamiento (en la visita de la semana 4), en forma de cuestionario para calificar su satisfacción con los resultados del tratamiento: se preguntó a los sujetos cuánto de satisfechos o insatisfechos estaban con la apariencia del área tratada de la cara; y una calificación de su satisfacción con la duración del efecto del tratamiento (en la visita de fin de estudio (semanas 24, 28, 32 o 36, según corresponda) o visita de interrupción temprana, si procedía.

Se tomaron fotografías digitales del área de tratamiento en la visita de tratamiento (día 0) antes del tratamiento, en las visitas de seguimiento (semanas 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32) y en la visita de fin de estudio (semana 24, 28, 32 o 36, según corresponda) o en la visita de interrupción temprana. Se tomaron fotografías digitales de manera controlada y estandarizada. Se proporcionaron fotografías de referencia y capacitación adecuada al personal del centro y a los investigadores. Los sujetos de forma óptima no usaron maquillaje de ojos o facial de ningún tipo. Para minimizar el reflejo de la luz de la piel, las áreas tratadas se secaron con una toallita con alcohol y se dejaron secar para eliminar la grasa de la piel antes de tomar las fotografías. Las fotografías incluían la vista frontal del sujeto con el ceño fruncido al máximo y en reposo después del ceño fruncido al máximo.

Análisis estadístico: Toda la programación estadística y los análisis se realizaron utilizando SAS versión 9.3 o superior. Como este estudio no tuvo el poder estadístico para detectar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de tratamiento al nivel de 0,05, se espera que el valor de p obtenido de varias pruebas descritas a continuación establezca una tendencia estadística. No se hicieron ajustes por multiplicidad de pruebas. Las características demográficas y de referencia se resumieron para las poblaciones por intención de tratar (ITT, por sus siglas en inglés), por protocolo (PP) y de seguridad. Se proporcionaron estadísticas descriptivas para todas las variables de eficacia en todos los puntos temporales por grupo de tratamiento, así como por grupo de tratamiento y geografía/país. Se realizaron análisis de eficacia para las poblaciones ITT y PP. Los análisis de seguridad se realizaron en la población de seguridad.

Poblaciones: Todos los sujetos que se aleatorizaron y recibieron tratamiento se incluyeron en la población por intención de tratar (ITT). Todos los sujetos que se aleatorizaron recibieron tratamiento y proporcionaron al menos una evaluación de seguridad posterior al tratamiento se incluyeron en la población de seguridad. La población por protocolo (PP) incluyó sujetos de la población ITT que completaron la evaluación de 24 semanas sin un incumplimiento importante del protocolo. Los sujetos se excluyeron de la población PP por cualquiera de las siguientes razones: (i) el sujeto incumplió los criterios de inclusión/exclusión; (ii) el sujeto faltó a la visita de la semana 24; (iii) el sujeto usó un medicamento prohibido; (iv) la visita de la semana 24 del sujeto fue ±5 días fuera del calendario (fuera de la variación permitida en los días de visita programados).

Para grupos de seguridad y comparaciones de eficacia, los sujetos se aleatorizaron en 5 grupos de tratamiento (20 U de RT002; 40 U de RT002; 60 U de RT002; placebo; comparador activo). Las comparaciones de eficacia primaria se realizaron entre cada dosis de RT002 y comparador activo; cada dosis de RT002 y placebo; así como comparador activo a placebo. Se evaluó una relación riesgo-beneficio para examinar las tendencias a favor de al menos una de las dosis de RT002 frente al comparador activo en las evaluaciones clave del estudio (relación de sujetos que responden en el mes 6 y duración de la respuesta medida hasta 36 semanas; frecuencia de EA).

Dentro de cada grupo de tratamiento, las puntuaciones que faltan para IGA-FWS, PFWS y GAIS para la población ITT se imputaron mediante imputación múltiple de Markov Chain Monte Carlo (MCMC) para análisis basados en la proporción de sujetos que responden. El análisis de sensibilidad para el criterio principal de valoración se realizó mediante imputaciones basadas en el método de la última observación realizada.

Se utilizaron estadísticas descriptivas para resumir las características demográficas (por ejemplo, edad, género, raza, etc.) y características de fondo (por ejemplo, IGA-FWS, PFWS, etc.). Se resumieron el historial médico pasado o en curso, el cumplimiento de la visita de estudio y el uso previo y concomitante de medicamentos para todos los sujetos y se presentaron en una lista por sujeto.

Eficacia: Para determinar la eficacia, se evaluó la eficacia clínica primaria mediante un evaluador con enmascaramiento que calificó la gravedad de las líneas glabelares del sujeto en el ceño fruncido al máximo usando la IGA-FWS. Un sujeto que responde se define como un sujeto que tiene una mejora de un punto o más en IGA-FWS en comparación con el valor inicial y que no ha regresado al valor inicial de IGA-FWS en el momento de la evaluación. A efectos del análisis primario, la proporción de sujetos que responden se comparó entre cada dosis de RT002 y el comparador activo en la semana 24. Cada grupo de tratamiento con RT002 se comparó por separado con el placebo y el comparador activo. El comparador activo se comparó con placebo en cada visita. Las comparaciones se realizaron con pruebas de Cochran-Mantel-Haenszel (CMH) estratificadas por valor inicial de IGA-FWS.

A efectos del análisis primario, se comparó la duración de la respuesta entre cada una de las dosis de RT002 y el comparador activo mediante el método de Kaplan-Meier. La duración de la respuesta se midió desde el momento de la inyección hasta el momento en que un sujeto volvió a su gravedad inicial según lo medido por el investigador con enmascaramiento basándose en IGA-FWS. Si el sujeto no consiguió una mejora de un punto desde el valor inicial por IGA-FWS en o antes de la semana 4, la duración de la respuesta se consideró cero. Si el sujeto consiguió al menos una mejora de 1 punto basándose en IGA-FWS en o antes de la semana 4, pero no volvió a su valor inicial en la semana 36 (último punto temporal), dicho sujeto fue objeto de censura estadística en la semana 36 (fecha de la última evaluación) para el análisis. Se utilizó la prueba del orden logarítmico para comparar la duración de la respuesta entre RT002 y el comparador activo. Una relación riesgo-beneficio calculada para cada grupo de tratamiento fue igual a la suma del número de eventos adversos relacionados con el tratamiento dividida por la suma de la duración de los días de respuesta para los sujetos en el grupo de tratamiento. Si un sujeto consiguió una mejora de al menos 1 punto basándose en IGA-FWS en o antes de la semana 4 pero volvió a su valor inician en la semana 36 (último punto de tiempo), entonces su contribución a la suma del beneficio era el número de días entre el valor inicial y el último día de visita.

Para análisis secundarios, los criterios de valoración secundarios utilizados se definen de la siguiente manera:

(1) proporción de sujetos que responden en la semana 2 y en las semanas 4-36 con énfasis en las evaluaciones de la semana 12 y la semana 24. Las comparaciones entre los grupos de tratamiento se basaron en la prueba de CMH estratificada por la gravedad inicial de la variable analizada cuando era posible. Cada grupo de tratamiento se comparó con el placebo y se comparó por separado con el comparador activo para aquellos sujetos que tenían una gravedad inicial que posiblemente podría permitir la mejora necesaria para el éxito. El comparador activo también se comparó con placebo en cada visita. Los sujetos que respondían se evaluaron basándose en varias definiciones: (i) aquellos que mejoran en al menos 2 puntos basándose en IGA-FWS frente al valor inicial; (ii) aquellos que mejoran en al menos 1 punto basándose en IGA-FWS frente al valor inicial; (iii) aquellos que tienen puntuaciones IGA-FWS de 0 o 1; (iv) aquellos que mejoran en al menos 1 punto basándose en PFWS; (v) aquellos que mejoran en al menos 2 puntos basándose en PFWS; (vi) aquellos que tienen una puntuación de al menos 1 en la escala GAIS;

(2) criterios de valoración secundarios basados en diversas definiciones de duración de la respuesta. A los sujetos que no consiguieron una mejora como se especifica en cada definición a continuación para la semana 4 se les asignó 0 duración; los sujetos que consiguieron una mejora como se define a continuación pero que no regresaron al valor inicial en la semana 36 fueron objeto de cesura estadística en la semana 36 (fecha de la última evaluación). Los grupos de tratamiento se compararon utilizando la prueba del orden logarítmico. Para cada definición y grupo de tratamiento, se calculó una relación riesgo beneficio como se describe anteriormente. Las definiciones para la duración de la respuesta incluyen (i) el tiempo desde la inyección hasta la puntuación GAIS inferior a 1 para una definición de sujeto que responde de al menos 1 en GAIS; (ii) tiempo desde la inyección hasta la reversión al valor inicial para una definición de sujeto que responde de una mejora de al menos 2 puntos en IGA-FWS; (iii) tiempo desde la inyección hasta la reversión al valor inicial para una definición de sujeto que responde de una mejora de al menos 1 punto en PFWS; (iv) tiempo desde la inyección hasta la reversión al valor inicial para una definición de sujeto que responde de una mejora de al menos 2 puntos en PFWS; (v) tiempo desde la inyección hasta la reversión al valor inicial para una definición de sujeto que responde de una mejora de al menos 1 punto en IGA-FWS utilizando un modelo de riesgos proporcionales con un término para el tratamiento, la gravedad inicial y la interacción entre el tratamiento y la gravedad inicial; y (vi) tiempo desde la inyección hasta la reversión al valor inicial para una definición de sujeto que responde de una mejora de al menos 1 punto en PFWS utilizando un modelo de riesgos proporcionales con un término para el tratamiento, la gravedad inicial y la interacción entre el tratamiento y la gravedad inicial. Se realizó un análisis exploratorio para correlacionar las puntuaciones de la evaluación GAIS del sujeto con las tasas de respuesta basándose en la PFWS para cambios tanto de 1 como de 2 puntos. Se utilizaron análisis de correlación y regresiones logísticas, según correspondiera.

Análisis intermedio y resultados del estudio para el tratamiento de las líneas glabelares

Se realizó un análisis intermedio de la variable principal cuando el 100 % de los sujetos había completado (o había interrumpido previamente) la visita de la semana 12. El análisis proporcionó estimaciones puntuales con intervalos de confianza del 95 por ciento para la proporción de sujetos que respondían según se define en el criterio principal de valoración. También se proporcionó una estimación puntual con un intervalo de confianza del 95 por ciento para la diferencia en la proporción de sujetos que respondían entre el comparador activo (grupo de tratamiento 5) y cada grupo de tratamiento activo 20 U de RT002, 40 U de RT002 y 60 U de RT002 (grupos de tratamiento 1, 2 y 3). Se realizaron análisis intermedios de los criterios de valoración secundarios de eficacia para la visita de la semana 12 y la semana 24 cuando el 75 % de los sujetos habían completado estas visitas, respectivamente. El análisis intermedio realizado en la semana 24 para determinar la seguridad y la eficacia incluyó al menos el 75 % (100 % real) de los sujetos que habían completado o interrumpido previamente, la visita de la semana 24. El análisis también incluyó criterios de valoración de eficacia primarios y secundarios (con el ceño fruncido al máximo) y datos de seguridad. En el momento del análisis intermedio, el personal y los sujetos permanecieron con enmascaramiento. Los resultados se resumen a continuación.

Eficacia: RT002 consiguió tasas de respuesta del 100 % en todos los grupos de dosis en el criterio principal de valoración de eficacia de 28 días de una mejora de 1 punto en la IGA-FWS. (Marcador de posición para el éxito del paciente). Las dosis de RT002 mantuvieron un beneficio de 1 punto durante más tiempo que BOTOx ® cosmético. RT002 se comportó de manera superior a BOTOX® Cosmetic según lo medido por el porcentaje de pacientes sin arrugas o con arrugas leves. Más del doble de sujetos tratados con 40 U y 60 U de RT002 mantuvieron ninguna arruga o arrugas leves (según el sistema de puntuación IGA-FWS) en comparación con el tratamiento con BOTOX® Cosmetic en la semana 16 (p< 0,5) El porcentaje de sujetos sin arrugas o con arrugas leves (según el sistema de puntuación IGA-FWS) fue estadísticamente superior en los tres grupos de dosis de RT002 en comparación con BOTOX® Cosmetic en la semana 16. El porcentaje de sujetos sin arrugas o con arrugas leves (según el sistema de puntuación IGA-FWS) fue estadísticamente superior en el grupo de dosis de 40U de RT002 en comparación con el grupo de tratamiento con BOTOX® Cosmetic en todos los puntos temporales posteriores a la semana 16.

Datos del paciente: Los resultados informados por los pacientes respaldaron los hallazgos de los investigadores sobre la duración y la eficacia del tratamiento con RT002. A las 24 semanas (6 meses), la dosis de 40U de RT002 continuó brindando tasas de respuesta más altas clínicamente significativas en la escala de mejora estética global del sujeto (GAIS) teniendo el 46,3 % de los sujetos tratados con 40 U RT002 frente al 31 % de los sujetos tratados con BOTOX® Cosmetic una puntuación de calificación de al menos un 1. En la semana 16, en comparación con la duración de "hasta 120 días" de BOTOX® Cosmetic, basándose en la información de su etiqueta, la dosis de 40 U de RT002 consiguió tasas de respuesta estadísticamente significativas más altas, medidas por una mejora de al menos 1 punto en la escala de gravedad de las arrugas del paciente (PWS) y al menos una calificación de 1 punto en la escala de mejora estética global del sujeto. El 76,9 % de los sujetos tratados con 40 U de RT002 mantuvieron al menos una mejora de 1 punto en PWS en comparación con el 58,5 % de los sujetos tratados con BOTOX® Cosmetic. Además, el 89,7 % de los sujetos tratados con 40 U de RT002 mantuvieron al menos una puntuación de 1 punto en GAIS en comparación con el 70,7 % de los sujetos tratados con BOTOX® Cosmetic.

Seguridad: El producto RT002 mostró un perfil de seguridad y eficacia altamente comparable con BOTOX® Cosmetic. Los eventos adversos fueron generalmente leves y se asociaron principalmente con los efectos de la propia inyección. Todos los grupos de dosis de RT002 mostraron un excelente perfil de seguridad general con EA predominantemente localizados, transitorios y leves en gravedad. No se produjeron eventos adversos graves en ningún grupo de dosis activo. Los grupos de dosis de 20U y 40U de RT002 se toleraron bien y fueron clínicamente superiores a BOTOX® con respecto a causar ptosis. Además, RT002 mostró una menor propagación descendente en las dosis de 20 U y 40 U. Tanto las dosis de 20 U como las de 40 U no causan ptosis en ningún sujeto tratado con esas dosis de RT002 en ningún punto temporal, en comparación con el 1,9 % en el grupo tratado con BOTOX® Cosmetic. Se observó una tasa de ptosis del 5,7 % en sujetos del grupo de tratamiento de 60 U de RT002. Estas fueron de naturaleza transitoria, como se ve normalmente con el tratamiento con BOTOX®. La difusión reducida de RT002 es coherente con estudios no clínicos y previos y respalda una propagación reducida de la toxina, como se observa en sujetos tratados con composiciones de la invención que contienen toxina botulínica, tal como la toxina botulínica A y un transportador cargado positivamente que comprende una cadena principal, tal como polilisina, con uno o más grupos de eficiencia cargados positivamente unidos de manera covalente como se describe en el presente documento, tal como RT002.

Dosis y duración del efecto: Sin ánimo de ser limitante, los resultados del análisis intermedio respaldan una selección de dosis de 40 U como dosis óptima para un solo tratamiento con las composiciones que contienen toxina botulínica de la invención, basándose en las altas tasas de respuesta, duración del efecto y perfil de seguridad positivo. Además, las composiciones de la invención tales como RT002, tienen un efecto sostenido y de larga duración, por ejemplo, durante al menos 6 meses, después de la administración por inyección a un sujeto. Como se determinó a partir del análisis intermedio de los resultados del estudio, el tratamiento de las líneas glabelares de los sujetos con el producto RT002 consiguió un efecto de duración superior en comparación con el tratamiento de las líneas glabelares en sujetos con BOTOX® Cosmetic. De hecho, se demostró una mediana de duración de 5,9 meses de mejora de 1 punto en IGA en el grupo de dosis de 40 U de RT002 (23,6 semanas) frente a una duración de 18,8 semanas en sujetos tratados con BOTOX® Cosmetic (p = 0,020) basándose en el método de análisis de Kaplan Meier. (Véase, por ejemplo, las figuras 4A y 4B). Cabe destacar que, en el mes 6, un número significativo de sujetos tratados con RT002 fueron objeto de cesura estadística del análisis intermedio de duración ya que todavía respondían. En el mes 6, casi un tercio (~33 %) de los sujetos en el grupo de tratamiento con 40 U de RT002 todavía no tenían, o casi no tenían, arrugas después de un solo tratamiento (p = 0,041) frente al 12 % de los sujetos en el grupo de tratamiento con BOTOX® Cosmetic. Aún más, se realizó el seguimiento del grupo de dosis alta durante 32 semanas después del tratamiento para evaluar la duración de la respuesta y alcanzó una mediana de duración de 29,4 semanas o 7,3 meses basándose en las evaluaciones del investigador y del sujeto.

La duración del efecto proporcionado por las composiciones de la invención, tales como RT002, así como los métodos de tratamiento y los usos de los mismos proporcionan ventajas en el sentido de que los sujetos que se someten a tratamiento consideran que la duración del efecto después del tratamiento es de gran importancia para ellos para un tratamiento estético. Una duración de efecto tan larga y sostenida, conseguida particularmente por una dosis de producto de una sola inyección o de una sola vez, concretamente, RT002, permite menos inyecciones por curso de tratamiento para un sujeto, lo cual es importante para la comodidad del sujeto, conveniencia y bienestar general. Un producto que proporciona efectos significativos y sostenidos, que se mantienen durante al menos un período de 6 meses después de una sola dosis de tratamiento por inyección del producto a un sujeto proporciona una solución a una necesidad no satisfecha en la técnica tanto para los médicos como para los pacientes.

Sumario de los resultados intermedios: Los resultados demuestran que una composición de la invención representada por el producto RT002 demostró ser superior a BOTOX® Cosmetic según lo medido por la mediana de la duración del efecto y las tasas de respuesta en 1 punto y 2 puntos de mejora en IGA-FWS, y el porcentaje de pacientes que consiguieron y se mantuvieron sin arrugas o con arrugas leves según el sistema de puntuación IGA-FWS descrito anteriormente. El estudio consiguió resultados estadísticamente significativos para el criterio principal de valoración de la eficacia de una mejora de 1 punto en IGA-FWS a los 28 días. El análisis intermedio de la semana 24 demostró una diferenciación clínicamente significativa en los resultados proporcionados por el tratamiento de una sola vez de sujetos con una dosis inyectada de RT002 frente a la inyección con BOTOX® Cosmetic.

Como también se determinó en el análisis intermedio, RT002 consiguió una duración del efecto de aproximadamente 6 meses con altas tasas de respuesta. RT002 consiguió una duración del efecto superior en comparación con BOTOX® Cosmetic, demostrando una duración media de 5,9 meses de mejora de 1 punto en las líneas glabelares según la escala de la evaluación global del investigador-gravedad de las arrugas faciales (IGA-FWS) en el grupo de dosis de 40 U (23,6 semanas) frente a 18,8 semanas para BOTOX® Cosmetic (p =0,020) basándose en el método de análisis de Kaplan Meier. A las 24 semanas (6 meses), RT002 en dosis de 40U y 60U continuó brindando tasas de respuesta más altas clínicamente significativas manteniendo el 35,9 % y el 29,3 % de los sujetos, respectivamente, una mejora de 1 punto frente al 19 % de los sujetos tratados con BOTOX® Cosmetic. RT002 consiguió su criterio principal de valoración de eficacia de al menos 1 punto de mejora en la escala del investigador (IGA-FWS) a los 28 días, así como el resultado informado por el paciente. RT002 consiguió tasas de respuesta del 100 % en todos los grupos de dosis en el criterio principal de valoración de eficacia de 28 días de una mejora de 1 punto en la escala de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de:

a. administración de toxina botulínica para conseguir un efecto cosmético de duración ampliada en un individuo, comprendiendo el método:

administrar mediante inyección una primera cantidad eficaz de una composición inyectable estéril en un área del individuo que necesita tratamiento para conseguir el efecto cosmético después de un primer tratamiento con la composición; en donde la primera cantidad eficaz de la composición administrada mediante inyección al individuo consigue el efecto cosmético de duración ampliada que tiene una duración del efecto de al menos aproximadamente 6 meses a aproximadamente 10 meses, opcionalmente, antes de que se administre una segunda o posterior cantidad eficaz;

o

b. reducción de arrugas, líneas o surcos en un individuo que lo necesite, comprendiendo el método:

administrar al individuo una composición como inyección de una sola dosis;

en donde la inyección de una sola dosis de la composición proporciona un solo tratamiento que tiene una duración del efecto en la reducción de las arrugas, líneas o surcos en el individuo de al menos aproximadamente seis meses a aproximadamente 10 meses, ampliando, de este modo, la duración del intervalo de tratamiento para el individuo;

y

en donde la composición de a. o b. comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para inyección; y

un componente de toxina botulínica de serotipo A y que tiene un peso molecular de 150 kDa; y

un componente transportador cargado positivamente que comprende la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR;

en donde el componente de toxina botulínica se administra al individuo en una cantidad eficaz de 20 U a 60 U; en donde el transportador cargado positivamente está asociado de forma no covalente con el componente de toxina botulínica.

2. Una composición farmacéutica en una formulación inyectable estéril para su uso en:

a. la administración de una cantidad eficaz de una toxina botulínica para conseguir un efecto terapéutico o cosmético de duración ampliada en un individuo;

en donde dicha cantidad eficaz de la composición consigue el efecto terapéutico o cosmético de duración ampliada que tiene una duración del efecto en el individuo al que se administra dicha formulación mediante inyección de al menos aproximadamente 6 meses a aproximadamente 10 meses;

o

b. la reducción de arrugas, líneas o surcos en un individuo que lo necesite;

en donde dicha dosis de la composición proporciona un solo tratamiento que tiene una duración del efecto en la reducción de las arrugas, líneas o surcos en el individuo de al menos aproximadamente seis meses a aproximadamente 10 meses, ampliando, de este modo, la duración del intervalo de tratamiento para el individuo; y

un componente de toxina botulínica en una cantidad eficaz de 20 U a 60 U, en donde dicho componente de toxina botulínica es del serotipo A y tiene un peso molecular de 150 kDa; y

en donde el transportador cargado positivamente está asociado de forma no covalente con el componente de toxina botulínica.

3. El método según la reivindicación 1 o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 2, en donde el efecto terapéutico o cosmético es el tratamiento o reducción de arrugas, líneas o surcos en el individuo.

4. El método o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3,

en donde la composición reduce las líneas glabelares en la cara del individuo.

5. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 2a, en donde el efecto terapéutico es la reducción de un síntoma asociado con un trastorno seleccionado del grupo que consiste en espasmo hemifacial, tortícolis espasmódica del adulto, fisura anal, blefaroespasmo, parálisis cerebral, cefaleas, estrabismo, trastorno de la articulación temporomandibular, dolor neurológico, vejiga hiperactiva, rinitis, sinusitis, acné, distoma, contracciones distónicas, hiperhidrosis e hipersecreción de una glándula controlada por el sistema nervioso colinérgico.

6. El método o la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición no se difunde localmente desde el lugar de la inyección después de la inyección.

7. El método o la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la duración del efecto del tratamiento comprende más de 8 meses o más de 9 meses.

8. Una composición inyectable estéril que comprende:

un componente de toxina botulínica de serotipo A y un peso molecular de 150 kDa en una cantidad de dosificación seleccionada de 20 U, 40 U, o 60 U; y

un componente transportador cargado positivamente que comprende la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR; y

un diluyente farmacéuticamente aceptable para inyección;

en donde el transportador cargado positivamente está asociado de forma no covalente con el componente de toxina botulínica; y

en donde la composición proporciona un efecto cosmético o terapéutico que dura al menos de 20 a 24 semanas después de un solo tratamiento de un individuo con la composición inyectable.

9. La composición según la reivindicación 8, en donde la toxina botulínica se administra al individuo en una cantidad de dosificación de 40 U.

10. Un método no terapéutico, en donde el método comprende un curso de tratamiento que tiene múltiples intervalos de tratamiento con una duración del efecto y un tiempo de duración entre cada intervalo de tratamiento prolongados, comprendiendo el curso de tratamiento:

administrar mediante inyección una cantidad eficaz inicial de una composición inyectable estéril en un área del individuo que necesita tratamiento para conseguir un efecto cosmético después del tratamiento inicial con la composición;

en donde la composición comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para inyección; una toxina botulínica de serotipo A y que tiene un peso molecular de 150 kDa; y

un componente transportador cargado positivamente la secuencia de aminoácidos RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR; y en donde el componente de toxina botulínica se administra al individuo en una cantidad eficaz de 20 U a 60 U;

en donde el transportador cargado positivamente está asociado de forma no covalente con el componente de toxina botulínica;

en donde la cantidad eficaz inicial de la composición administrada mediante inyección al individuo proporciona una duración del efecto cosmético que dura al menos aproximadamente 10 meses; y

administrar cantidades eficaces posteriores de la composición mediante inyección al individuo a intervalos de tratamiento que comprenden una duración mayor o igual a 6 meses hasta al menos aproximadamente 10 meses después de la cantidad eficaz inicial y entre cada cantidad eficaz posterior.

11. Una composición inyectable estéril para su uso en un método para tratar a un individuo que necesita tratamiento con toxina botulínica inyectable, en donde el método de tratamiento comprende un curso de tratamiento que tiene múltiples intervalos de tratamiento con una duración del efecto y un tiempo de duración entre cada intervalo de tratamiento prolongados, comprendiendo el curso de tratamiento:

administrar mediante inyección una cantidad eficaz inicial de una composición inyectable estéril en un área del individuo que necesita tratamiento para conseguir un efecto terapéutico o cosmético después del tratamiento inicial con la composición;

en donde la composición comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado para inyección; un componente de toxina botulínica de serotipo A y que tiene un peso molecular de 150 kDa; y

en donde el componente de toxina botulínica se administra al individuo en una cantidad eficaz de 20 U a 60 U; en donde el transportador cargado positivamente está asociado de forma no covalente con el componente de toxina botulínica;

12. El método según la reivindicación 10 o la composición para su uso según la reivindicación 11, en donde:

(i) el efecto terapéutico o cosmético es el tratamiento o reducción de arrugas, líneas o surcos; opcionalmente en donde el efecto terapéutico o cosmético es la reducción de las líneas glabelares en la cara del individuo; y/o (ii) la composición no se difunde localmente desde el lugar de inyección después de la inyección.

13. La composición para su uso según la reivindicación 11 o 12, en donde el efecto terapéutico es la reducción de un síntoma asociado con un trastorno seleccionado del grupo que consiste en espasmo hemifacial, tortícolis espasmódica del adulto, fisura anal, blefaroespasmo, parálisis cerebral, cefaleas, estrabismo, trastorno de la articulación temporomandibular, dolor neurológico, vejiga hiperactiva, rinitis, sinusitis, acné, distonía, contracciones distónicas, hiperhidrosis e hipersecreción de una glándula controlada por el sistema nervioso colinérgico.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12 o la composición para su uso según las reivindicaciones 11 a 13, en donde la duración del intervalo de tratamiento comprende más de 7 meses, más de 8 meses o más de 9 meses.

15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, 7, 10 o 12 a 14 o la composición según la reivindicación 8 o 9 o la composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 u 11 a 14, en donde el componente transportador cargado positivamente está presente en la composición en una relación de 1 200 ng/U del componente de toxina botulínica.

16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, 7, 10 o 12 a 14 o la composición según la reivindicación 8 o 9 o la composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 u 11 a 14, en donde el componente transportador cargado positivamente está presente en la composición en una relación de 10 100 ng/U del componente de toxina botulínica.

17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, 7, 10 o 12 a 16 o la composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 u 11 a 16, en donde el componente de toxina botulínica se administra al individuo en una cantidad eficaz de 40 U a 60 U.

18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6, 7, 10 o 12 a 16 o la composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 u 11 a 16, en donde el componente de toxina botulínica se administra al individuo en una cantidad eficaz de 20 U a 40 U.