ES2902477T3

ES2902477T3 - Péptidos SLC45A2 para inmunoterapia

Info

Publication number: ES2902477T3
Application number: ES16871668T
Authority: ES
Inventors: Gregory Lizee; Cassian Yee; Patrick Hwu; Janos Roszik
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2015-12-04
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2022-03-28
Anticipated expiration: 2036-12-02
Also published as: CA3007301A1; US20210170002A1; US20190169262A1; IL259793A; EP3383418A4; AU2016363006B2; WO2017096304A1; SG11201804648RA; AU2016363006A1; EP3383418A1; CN108601811A; EP3383418B1; KR20180118105A; JP2019507582A

Abstract

Un péptido aislado de 35 aminoácidos de longitud o menos para su uso en el tratamiento de melanoma excluyendo melanoma uveal, en el que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos SLC45A2 para inmunoterapia

Antecedentes

La presente divulgación se refiere generalmente al campo de la inmunología y la medicina. Más particularmente, se dan a conocer fragmentos de péptidos que son reconocidos por células T y pueden usarse para tratar un cáncer.

2. Descripción de la técnica relacionada

La terapia de células T adoptiva (ACT; también denomina “transferencia celular adoptiva”) ha demostrado ser muy prometedora como método para tratar el melanoma; desafortunadamente, este enfoque también se ha visto obstaculizado por limitaciones que incluyen la toxicidad hacia tejidos no cancerosos. La ACT implica generalmente lo que implica la infusión de un gran número de células T específicas de tumor activadas autólogas en un paciente, por ejemplo, para tratar un cáncer. La ACT ha dado lugar a respuestas clínicas terapéuticas en pacientes con melanoma (Yee 2002; Dudley 2002; Yee 2014; Chapuis 2016). Generalmente, para desarrollar respuestas eficaces de células T antitumorales, se requieren normalmente las siguientes tres etapas: sensibilizar y activar células T específicas de antígeno, hacer migrar las células T activadas al sitio del tumor y reconocer y destruir el tumor por parte de células T específicas de antígeno. La elección del antígeno diana es importante para la inducción de células T específicas de antígeno eficaces.

Varios antígenos seleccionados para tratar el melanoma con ACT han mostrado efectos secundarios autoinmunitarios adversos significativos. La elección del antígeno diana también es importante para la inducción de células T específicas de antígeno eficaces. En las últimas décadas, MART-1, gp100 y tirosinasa se han identificado como antígenos de diferenciación del melanoma humano (MDA) reconocidos por células T derivadas de PBL o TIL humanos (Yee 2002, Chapuis 2012; Coulie 1994; Kawakami 1995; Harada 2001)). Los MDA también se expresan en tejidos normales tales como los melanocitos en la piel y los ojos y las células del oído interno. Desafortunadamente, según los resultados de un ensayo clínico reciente, la ACT con células T específicas para estos MDA indujo respuestas autoinmunitarias no deseadas mediante la destrucción de tejidos normales, lo que condujo a vitíligo, pérdida de visión y toxicidad del oído interno (Yee C 2000; Brichard V 1993; Seaman 2012). Sería deseable la identificación de nuevos antígenos diana para el melanoma con menos toxicidad y eficacia óptima. Claramente, existe la necesidad de nuevos péptidos y dianas de antígenos que puedan usarse en terapias de células T adoptivas.

Sumario

La invención se refiere a las realizaciones tal como se definen en las reivindicaciones. En particular, la invención se refiere a un péptido aislado de 35 aminoácidos de longitud o menos para su uso en el tratamiento de melanoma excluyendo melanoma uveal, en el que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2^382-390(SEQ ID NO:1) o SLC45A2^{393 -402}(SEQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2^382-390(SEQ ID NO:1) o SLC45A2^393-402(SEQ ID NO:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402.

Además, la invención se refiere a un medio de cultivo celular que comprende un péptido de 35 aminoácidos de longitud o menos, en el que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2^382-390(SEQ ID NO:1) o SLC45A2^393-402(SEQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2^382-390(SEQ ID NO:1) o SLC45A2^393-402(SEQ ID NO:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un péptido de 35 aminoácidos de longitud o menos para su uso en el tratamiento de melanoma excluyendo melanoma uveal, en la que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2^382-390(SEQ ID NO:1) o SLC^{4 5}A^2393-402(SEQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2^382-390(SEQ ID NO:1) o SLC45A2^393-402(SEQ ID NO:2), en la que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402 y un excipiente.

La invención también se refiere a un método in vitro para inducir la proliferación de una población de células T, que comprende poner en contacto células T in vitro con un péptido en una cantidad suficiente para unirse a un ^{h L A -}A*0201 o un HLA-A2 en las células T y fomentar la proliferación de una o más de las células T, preferiblemente en el que las células T son linfocitos T citotóxicos (CTL) y/o células T CD8+, en el que el péptido tiene 35 aminoácidos de longitud o menos y en el que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2^{382-390 ( s E q}ID NO:1) o SLC45A2^393-402(SEQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2^382-390(SEQ ID NO:1) o SLC45A2^393-402(SEQ ID NO:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402.

La invención se refiere además a un anticuerpo que se une de manera selectiva a un péptido o que se une de manera selectiva a un complejo péptido - HLA-A2 para su uso en el tratamiento de melanoma excluyendo melanoma uveal, preferiblemente en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, está comprendido en antisueros policlonales, es un fragmento de anticuerpo, es un anticuerpo humano o humanizado, o está comprendido en un constructo de fusión, un constructo de fusión soluble, un ImmTAC o una inmunotoxina, en el que el péptido tiene 35 aminoácidos de longitud o menos y en el que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID nO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402.

Se dan a conocer epítopos de CMH de clase I de SLC45A2. Los péptidos antigénicos SLC45A2 pueden usarse en una terapia contra el cáncer, por ejemplo, como una vacuna contra el cáncer o en una terapia de células T adoptiva. También pueden generarse anticuerpos, tales como anticuerpos terapéuticos humanizados, que se unen de manera selectiva a uno o más de los péptidos SLC45A2 o al complejo formado por la unión de un péptido SLC45A2 y (HLA-A2 o HLA-A24). Los péptidos SLC45A2 pueden usarse para tratar un melanoma tal como, por ejemplo, un melanoma cutáneo, un melanoma uveal, un melanoma mucoso o un melanoma metastásico. La presente divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de que los péptidos de la proteína intracelular SLC45A2 son proporcionados por CMH I (HLA-A2 o HLA-A24) en la superficie de las células tumorales que reconocen los receptores de células T en las células T. En el presente documento se proporcionan péptidos SLC45A2 que pueden unirse a CMH I (HLA-A2 o HLA-A24) y pueden ser reconocidos por los receptores de células T en las células T. Los péptidos SLC45A2 pueden usarse terapéuticamente para tratar un cáncer, tal como un melanoma. También se proporcionan métodos para expandir una población de células T que seleccionan como diana SLC45A2. También se proporcionan péptidos SLC45A2 que pueden usarse para generar células T CD8 que destruyen de manera eficaz células de melanoma sin la destrucción de melanocitos normales. Esta reducción de la toxicidad hacia células no cancerosas puede ser particularmente útil para el tratamiento de melanomas.

Tal como se muestra en los ejemplos siguientes, se caracterizó la expresión de SLC45A2 en melanomas y tejidos normales, y se identificaron los péptidos SLC45A2 SLC45A2382-390 (^sE^qID NO:1) y SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2) como epítopos inmunogénicos que pueden unirse de manera selectiva a HLA-A*0201 (HLA-A2) y HLA-A*2402 (HLA-A24), respectivamente, y se observó que los linfocitos T citotóxicos (CTL) proliferados usando estos péptidos destruyeron de manera eficaz una variedad de células de melanoma, incluyendo múltiples melanomas cutáneos, melanomas uveales, melanomas mucosos y melanomas metastásicos. En la tabla 4 se proporcionan péptidos SLC45A2 adicionales que pueden usarse. Tal como se muestra en los ejemplos siguientes, se demostró que estos péptidos SLC45A2 muestran respuestas específicas de antígeno y restringidas a HLA-A*0201 o HLA A*2402 de células T CD8 específicas de SLC45A2. SLC45A2382-390 (SEQ ID No :1) y/o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2) puede usarse en diversos enfoques de inmunoterapia (por ejemplo, como una vacuna terapéutica, en una terapia de células T adoptiva) para tratar un melanoma.

Se da a conocer un péptido aislado de 35 aminoácidos de longitud o menos y que comprende la secuencia de SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402. El péptido puede tener 30 o menos, 25 o menos, 20 o menos, o 15 o menos aminoácidos de longitud. El péptido comprende o consiste en SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2 o HLA-A*0201 El péptido puede comprender o consistir en SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A24 o HLA-A*2402. El péptido puede estar comprendido en una preparación farmacéutica. La preparación farmacéutica puede formularse para administración parenteral, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inhalación o inyección subcutánea. El péptido puede estar comprendido en un liposoma, en una nanopartícula que contiene lípidos o en un portador a base de lípidos. La preparación farmacéutica puede formularse para inyección o inhalación como pulverizador nasal. El péptido puede estar comprendido en un medio de cultivo celular.

También se proporciona un medio de cultivo celular que comprende el péptido tal como se describió anteriormente.

Se da a conocer además una composición farmacéutica que comprende el péptido tal como se describió anteriormente y un excipiente. La preparación farmacéutica puede formularse para administración parenteral, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inhalación o inyección subcutánea. El péptido puede estar comprendido en un liposoma, en una nanopartícula que contiene lípidos o en un portador a base de lípidos.

También se da a conocer una composición que comprende un péptido tal como se describió anteriormente, para su uso en un tratamiento terapéutico. La composición puede ser para su uso en el tratamiento de un melanoma. El péptido puede tener 25 o menos, 20 o menos, o 15 o menos aminoácidos de longitud. El péptido puede comprender o consistir en SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1). El péptido puede comprender o consistir en SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2). El péptido puede estar comprendido en una preparación farmacéutica. La preparación farmacéutica puede formularse para administración parenteral, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inhalación o inyección subcutánea. El péptido puede estar comprendido en un liposoma, en una nanopartícula que contiene lípidos o en un portador a base de lípidos. La preparación farmacéutica puede formularse para inyección o inhalación como pulverizador nasal. El péptido puede producirse a través de síntesis peptídica. El péptido puede producirse de manera recombinante. El melanoma puede ser un melanoma cutáneo, un melanoma uveal, un melanoma mucoso o un melanoma metastásico.

También se da a conocer un método de tratamiento de un melanoma en un sujeto mamífero, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del péptido tal como se describe en el presente documento. El péptido puede estar comprendido en una preparación farmacéutica. La preparación farmacéutica puede formularse para administración parenteral, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inhalación o inyección subcutánea. El sujeto puede ser un ser humano. El melanoma puede ser un melanoma cutáneo, un melanoma uveal, un melanoma mucoso o un melanoma metastásico. Al sujeto se le puede administrar una segunda terapia contra el cáncer. La segunda terapia contra el cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en una quimioterapia, una radioterapia, una inmunoterapia o una cirugía. Al sujeto se le puede administrar el péptido en una cantidad eficaz para fomentar que los linfocitos T citotóxicos (CTL) en el sujeto lisen o destruyan las células cancerosas en el sujeto. Se proporciona además un método in vitro para inducir la proliferación de una población de células T, que comprende poner en contacto células T in vitro con un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en una cantidad suficiente para unirse a un HLA-A*0201 o un HLA-A2 en las células T y fomentar la proliferación de una o más de las células T. Las células T pueden ser linfocitos T citotóxicos (CTL). Las células T pueden ser células T CD8+. El método puede comprender además administrar las células T a un sujeto después de dicha proliferación. El sujeto puede ser un sujeto mamífero tal como, por ejemplo, un ser humano.

Se da a conocer además un método para fomentar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra SLC45A2, que comprende administrar al sujeto un péptido tal como se describe en el presente documento en una cantidad eficaz para provocar la proliferación de células T que seleccionan como diana de manera selectiva SLC45A2. Las células T pueden ser linfocitos T citotóxicos. El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede tener un melanoma. El melanoma puede ser un melanoma cutáneo, un melanoma uveal, un melanoma mucoso o un melanoma metastásico. El sujeto puede no tener cáncer.

También se da a conocer un ácido nucleico aislado que codifica para un péptido tal como se describió anteriormente. El ácido nucleico puede ser un ADN o un ARN. También se da a conocer un vector que comprende una secuencia contigua que consiste en el segmento de ácido nucleico. El vector puede comprender además un promotor heterólogo. El ácido nucleico o vector puede estar comprendido en un minigén, un plásmido o un ARN; por ejemplo, puede usarse el ácido nucleico o vector, por ejemplo, para modificar por ingeniería la expresión del epítopo en una células presentadoras de antígeno (por ejemplo, una célula dendrítica, una APC artificial o una célula T). También se da a conocer un anticuerpo aislado que se une de manera selectiva a un péptido tal como se describe en el presente documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, está comprendido en antisueros policlonales o es un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o humanizado. El anticuerpo puede estar comprendido en un constructo de fusión, un constructo de fusión soluble, un ImmTAC o una inmunotoxina; por ejemplo, pueden unirse una variedad de restos al anticuerpo para lograr un efecto terapéutico adicional, por ejemplo, tal como se describe en Oates et al. (2015) y Liddy et al. (2012). Por ejemplo, el anticuerpo puede fusionarse con un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) específico del grupo de diferenciación 3 (CD3) humanizado.

Se da a conocer además un anticuerpo aislado que se une de manera selectiva a un complejo péptido - HLA-A2, en el que el complejo péptido - HLA-A2 comprende el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 unido a un HLA-A2. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, puede estar comprendido en antisueros policlonales o puede ser un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o humanizado.

También se da a conocer un kit que comprende un péptido tal como se describió anteriormente en un recipiente. El péptido puede estar comprendido en una preparación farmacéutica. La preparación farmacéutica puede formularse para administración parenteral o inhalación. El péptido puede estar comprendido en un medio de cultivo celular. Tal como se usa en el presente documento, “esencialmente libre”, en cuanto a un componente especificado, se usa en el presente documento en el sentido de que ninguno de los componentes especificados se ha formulado de manera intencionada en una composición y/o está presente sólo como un contaminante o en cantidades traza. Por tanto, la cantidad total del componente especificado que resulta de cualquier contaminación no intencionada de una composición está muy por debajo del 0,05%, preferiblemente por debajo del 0,01%. La más preferida es una composición en la que no pueda detectarse ninguna cantidad del componente especificado con métodos analíticos convencionales.

HLA-A2 se refiere al antígeno leucocitario humano, serotipo A2, y también se denomina HLA-A*02. Se conocen bien varios serotipos de los productos génicos de muchos alelos HLA-A*02, incluyendo los productos génicos HLA-A*0201, *0202, *0203, *0206, *0207 y *0211.

HLA-A24 se refiere al antígeno leucocitario humano, serotipo A24, y también se denomina HLA-A*24. Se conocen bien varios serotipos de los productos génicos de muchos alelos HLA-A*24, incluyendo los productos génicos HLA-A*2402 y *2403.

Los términos “inhibir”, “reducir” o “prevención”, o cualquier variación de estos términos, cuando se usan en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva, incluyen cualquier disminución o inhibición completa medible para lograr un resultado deseado.

El término “eficaz”, tal como se usa ese término en la memoria descriptiva y/o en las reivindicaciones, significa adecuado para lograr un resultado deseado, esperado o pretendido.

El uso de la palabra “un” o “uno/a”, cuando se usa junto con el término “que comprende” en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva, puede significar “uno”, pero también es compatible con el significado de “uno o más”, “al menos uno” y “uno o más de uno”.

Se contempla que cualquier divulgación comentada en esta memoria descriptiva pueda implementarse con respecto a cualquier método o composición dados a conocer en el presente documento, y viceversa. Además, las composiciones dadas a conocer pueden usarse para lograr los métodos dados a conocer.

En toda esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente del error del dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos del estudio.

El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa en el sentido de “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refiere únicamente a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere únicamente a alternativas e “y/o”.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y en la(s) reivindicación/reivindicaciones, las palabras “comprender” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), tener” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “incluir” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluye” e “incluyen”) o “contener” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas de método adicionales no citados.

Otros objetos, características y ventajas dados a conocer en el presente documento resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos se proporcionan únicamente a modo de ilustración.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva. La divulgación puede entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada.

Figuras 1A-C: expresión de SLC45A2 en líneas celulares de melanoma cutáneo y tejido altamente restringido. Figura 1A, resumen de los resultados que muestran la expresión de MDA en 24 líneas celulares de melanoma cutáneo, tal como se determina mediante RT-PCR. Figura 1B, expresión de ARNm de SLC45A2 en células de melanoma cutáneo. Se detectó ARNm de SLC45A2 en la mayoría de las células de melanoma, incluyendo las células de melanoma metastásico originadas en diferentes sitios mediante análisis de RT-PCR como otros antígenos de diferenciación de melanocitos tales como MART-1, gp100 y tirosinasa. Figura 1C, sin expresión de ARNm de SLC45A2 en diversos tipos de células tumorales mediante análisis de RT-PCR. Las células tumorales de diferentes tipos, excepto los melanomas, no expresaron SLC45A2.

Figuras 2A-B: espectros de masas de péptidos derivados de tumores y derivados sintéticos de SLC45A2. Figura 2A, péptido SLC45A2 restringido a HLA-A*0201. Figura 2B, péptido restringido a HLA-A*2402. Figura 2C, estrategia experimental para identificar péptidos específicos de tumores de melanoma a partir de líneas celulares de melanoma.

Figuras 3A-C: generación de células T CD8 específicas de SLC45A2 en PBMC de donantes sanos restringidos a HLA A*0201 o A*2402. Figura 3A, programa para la generación de células T CD8 específicas de SLC45A2. Figura 3B, inducción de células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2. Se estimularon PBMC de donantes sanos restringidos a HLA A*0201 o A*2402 con DC pulsadas con péptido SLC45A2382-390 o péptido SLC45A2393-402 autólogas, respectivamente. Las células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2 se clasificaron mediante el clasificador ARIA después de una doble estimulación (panel superior) y las células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2 clasificadas se expandieron según el protocolo de expansión rápida (REP). Luego se usaron las células expandidas como células T CD8 específicas de SLC45A2 (panel central). El análisis del repertorio de TCR de las células T CD8 específicas de SLC45A2 se realizó usando el kit de repertorio IOTest Beta Mark TCR-Vp con anticuerpos Vp correspondientes a 24 especificidades diferentes (panel inferior). Figura 3C, fenotipo de las células T CD8 específicas de SLC45A2. 14 días después de REP, se sometió a prueba el fenotipo usando anticuerpos para CD45RA, CCR7, CD62L y CD28 mediante citometría de flujo.

Figuras 4A-F: función efectora de las células T CD8 específicas de SLC45A2. Figura 4A, el efecto destructor de las células T CD8 específicas de SLC45A2 se restringió a A*0201 en las células de melanoma cutáneo. Las células T CD8 específicas de SLC45A reconocieron y destruyeron las células de melanoma restringidas a HLA A*0201 que expresaban de manera endógena SLC45A2 (HlA-A*0201+/SLC45A2+: Mel888 transducidas con A2, Mel526, Mel624 y MeWo). Las células T CD8 específicas de SLC45A2 no destruyeron Mel888 que expresaban SLC45A2 pero no expresaban HLA A*0201 (HLA-A*0201-/SLC45A2+) y A375 que expresaban HLA A*0201 pero no SLC45A2 (HLA-A*0201+/SLC45A2-). Las células T CD8 específicas de SLC45A2 mostraron un efecto destructor contra melanomas metastásicos que expresaban HLA-A*0201 y SLC45A2+. Se usaron células T CD8 específicas de SLC45A2 del donante n.° 1. El ensayo de liberación de 51Cr convencional para determinar la actividad citotóxica se realizó en una razón E:T diferente. Se mostraron los resultados de 1 experimento representativo de al menos 3 realizados. Figura 4B, el efecto destructor de las células T CD8 específicas de SLC45A se restringió a A*2402 en las células de melanoma cutáneo. Las células T CD8 específicas de SLC45A restringidas a A*2402 destruyeron células de melanoma cutáneo que expresaban SLC45A2 y HLA A*2402. El ensayo de liberación de 51Cr convencional para determinar la actividad citotóxica se realizó en una razón E:T diferente. Se mostraron los resultados de 1 experimento representativo de al menos 2 realizados. Figura 4C, avidez funcional de las células T CD8 específicas de SLC45A. Se cultivaron células T CD8 específicas de SLC45A2 con células T2 preincubadas con péptido SLC45A2^382-390y péptido no coincidente, MART^{-127 -35}, a diversas concentraciones (100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0 nM) (panel superior). Se cultivaron células T CD8 específicas de MART-1 o gp100 con células T2 preincubadas con péptido M^27-35o G^154-162a la concentración indicada (panel inferior). 48 horas después de la incubación, se midió la producción de IFN-y mediante un ensayo ELISA. Se midió el umbral de dosis de péptido de las células T CD8 específicas de SLC45A2, MART-1 y gp100 para comparar la sensibilidad al péptido de las células T CD8 específicas de antígeno. Figura 4D, esquema que muestra la línea temporal experimental de la transferencia de células T adoptiva usando un modelo de xenoinjerto de melanoma. Figuras 4E-F, curvas de crecimiento tumoral que muestran el efecto terapéutico de los CTL específicos de SLC45A2 (figura 4E) o específicos de MART-1 (figura 4F) transferidos de manera adoptiva contra xenoinjertos de melanoma humano Mel526. Se les inoculó por vía subcutánea a ratones desnudos 1x107 células Mel526. Siete días después de la prueba de provocación del tumor, se inyectaron por vía intravenosa CTL específicos de SLC45A2 o específicos de MART-1 (1x107) una vez por semana durante 4 semanas y se monitorizó el crecimiento tumoral.

Figuras 5A-D: expresión de SLC45A2 y actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 contra melanocitos. Figura 5A, expresión del antígeno de diferenciación de melanoma en melanocitos. Se sometió a prueba la expresión de ARNm de SLC45A2, MART-1, gp100 y tirosinasa en dos melanocitos diferentes, 4C0197 (4C) y 3C0661 (3C), mediante RT-PCR. El ARNm de SLC45A2 se expresó en ambos melanocitos, pero su nivel fue muy bajo en comparación con las células de melanoma, mientras que otros antígenos de diferenciación de melanoma tales como MART-1, gp100 y tirosinasa se expresaron en melanocitos con un nivel similar al melanoma. Se muestran los resultados de 1 experimento representativo de al menos 3 realizados. Figura 5B, actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a HLA-A*0201 contra melanocitos. Las células T CD8 específicas de SLC45A2 no destruyeron bien dos clases de melanocitos (HLA-A*0201+), pero destruyeron células de melanoma con alto efecto citotóxico. Por el contrario, las células T CD8 específicas de MART-1 y gp100 destruyeron melanocitos y células de melanoma. El ensayo de liberación de 51Cr convencional se realizó usando células T CD8 específicas de SLC45A2, MART-1 y gp100 restringidas a HLA-A*0201 en diversas razón E:T. Mel526 (HLA-A*0201+/s Lc45A2+) y A375 (HLA-A*0201+/SLC45A2-) se usaron como control positivo y negativo, respectivamente. Figura 5C, actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a HLA-A*2402 contra melanocitos. Las células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a HLA-A*2402 no destruyeron melanocitos, 4C0197 que expresaba bien HLA-A*2402, pero destruyeron bien las células de melanoma que expresaban HLA-A*2402+/SlC45A2+. Mel526 (HLA-A*2402-/SLC45A2+) se usa como control negativo. Las líneas primarias de melanocitos 3C y 4C se pulsaron con 1 ug/ml de péptido SLYSYFQKV (SEQ ID NO:1) y se usaron como dianas para CTL específicos de SLC45A2 restringidos a HLA-A*0201 en el ensayo de liberación de 51Cr convencional. Figura 5D, comparación de la expresión de HLA-A*0201 en superficie en Mel526, A375 y melanocitos primarios 3C y 4C después de la tinción con AcM BB7.2 y análisis de citometría de flujo.

Figuras 6A-E: expresión de SLC45A2 y actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 contra células de melanoma uveal y mucoso. Figura 6A, expresión de SLC45A2 en células de melanoma uveal. La expresión de SLC45A2 se analizó mediante RT-PCR y todas las células de melanoma uveal usadas en este estudio expresaron SLC45A2. Figura 6B, efecto citotóxico de las células T CD8 específicas de SLC45A contra células de melanoma uveal. Las células T CD8 específicas de SLC45A restringidas a HLA A*0201 lisaron OMM1, células de melanoma uveal que expresaban SLC45A2 y HLA A*0201, pero no lisaron 202, células de melanoma uveal que expresaban SLC45A2 pero no HLA A*0201. Las células T C^d8 específicas de SLC45A restringidas a HLA A*2402 mostraron un efecto destructor contra UPMD2 que expresaban SLC45A2 y HLA A*2402. Cuando se pulsaron UPMD2 con péptido S^933-402, las células T CD8 específicas de SLC45A restringidas a HLA A*2402 mostraron una mayor citotoxicidad. Las células T CD8 específicas de SLC45A restringidas a HLA A*2402 no destruyeron UPMD1 que expresaban SLC45A2+ y HLA A*2402- restringidas a. El ensayo de liberación de 51Cr convencional para determinar la actividad citotóxica se realizan en una razón E:T diferente. Se muestran los resultados de 1 experimento representativo de al menos 2 realizados. Figura 6C, los CTL específicos de SLC45A2 restringidos a HLA A*2402 demuestran actividad lítica contra una línea celular de melanoma uveal. Figura 6D, expresión de SLC45A2 en células de melanoma mucoso. Dos clases de células de melanoma mucoso expresaron SLC45A2. La expresión de SLC45A2 se analizó mediante RT-PCR. Figura 6E, efecto citotóxico de las células T CD8 específicas de SLC45A contra células de melanoma mucoso. Las células T CD8 específicas de SLC45A destruyeron 2170, células de melanoma mucoso que expresaban SLC45A2 y HLA A*0201, pero no destruyeron 2042, que expresan SLC45A2 pero no HLA A*0201. El ensayo de liberación de 51Cr convencional para determinar la actividad citotóxica se realizan en una razón E:T diferente. Se muestran los resultados de 1 experimento representativo de al menos 2 realizados.

Figuras 7A-C: control de la expresión de SLC45A2 por la ruta de MAPK y destrucción potenciada de CTL de células de melanoma después del tratamiento con inhibidor de MAPK. Figura 7A, expresión del antígeno de diferenciación de melanocitos en melanocitos primarios transducidos para expresar GFP, BRAF silvestre o BRAF(V600E) mutante, tal como se evaluó mediante análisis de microalineamientos de expresión génica. Se muestra la expresión relativa de SLC45A2, MART-1, gp100, proteína relacionada con tirosinasa y tirosinasa en comparación con células no transducidas. Figura 7B, las líneas celulares de melanoma Mel526 o A375 positivas para BRAF(V600E) se trataron con el inhibidor específico de BRAF(V600E) dabrafenib (50 nM), el inhibidor de MEK trametinib (50 nM) o ambos inhibidores. Cuarenta y ocho horas después, se analizó la expresión de ARNm de SLC45A2 y MART-1 mediante RT-PCR cuantitativa. Se usaron como controles células de melanoma no tratadas. Figura 7C, destrucción citotóxica mediada por células T específicas de SLC45A2 de las líneas celulares de melanoma Mel526 o A375 después de un tratamiento de 48 h con BRAFi, MEKi o ambos inhibidores. Se muestra la actividad citotóxica de CTL específicos de SLC45A2 en un ensayo de liberación de 51Cr convencional (razón E:T = 20:1) contra dianas tratadas con fármaco en comparación con dianas no tratadas.

Figura 8: expresión de SLC45A2 en tejidos normales y tejidos cancerosos. Expresión genética relativa del antígeno de diferenciación de melanocitos en tejidos normales y tejidos cancerosos. La expresión génica del antígeno de diferenciación de melanocitos en tejidos normales y en muestras de pacientes con cáncer se analizó usando los datos del portal Genotype-Tissue Expression (GTEx) y los datos del portal Cancer Genome Atlas (TCGA), respectivamente. SLC45A2 apenas se expresó en muchos tejidos normales, mientras que la expresión de los genes MART-1 y gp100 se observó en la mayoría de los tejidos normales incluso en un nivel bajo. La expresión de los genes SLC45A2, MART-1, tirosinasa y gp100 mostró una alta expresión en el tejido del melanoma cutáneo y del melanoma uveal en comparación con otros tejidos cancerosos.

Figura 9: expresión ectópica de HLA en línea celular de melanoma SLC45A2+ Mel888.

Figura 10: generación de células T CD8 específicas de SLC45A2 en PBMC de donantes sanos restringidos a HLA A*0201. Inducción de células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2. Se estimularon PBMC de dos donantes sanos restringidos a HLA A*0201 adicionales con DC pulsadas con péptido SLC45A2382-390 autólogas. Las células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2 se clasificaron después de una doble estimulación y las células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2 clasificadas se expandieron según REP. Las células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2 expandidas se usaron para otro experimento. El análisis del repertorio de TCR de las células T CD8 específicas de SLC45A2 se realizó usando el kit de repertorio IOTest Beta Mark TCR-Vp con anticuerpos Vp correspondientes a 24 especificidades diferentes.

Figura 11: expresión de HLA en los melanocitos. La expresión de HLA se evaluó en melanocitos, 3C0661 y 4C0197, con diferente origen mediante tinción con anticuerpo anti-HLA A2 y anticuerpo anti HLA A24. 3C0661 expresó tanto HLA A2 como HLA A24. 4C0197 expresó HLA A2 pero no HLA A24.

Figuras 12A-B: actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 de otros donantes restringidos a HLA-A*0201 contra melanocitos. Figura 12A, actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a HLA-A*0201 de otros donantes contra melanocitos. Las células T CD8 específicas de SLC45A2 no destruyeron bien dos clases de melanocitos (HLA-A*0201+), pero destruyeron bien las células de melanoma con alto efecto citotóxico. Por el contrario, las células T CD8 específicas de MART-1 y gp100 destruyeron melanocitos y células de melanoma. El ensayo de liberación de 51Cr convencional se realizó usando células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a HLA-A*0201 en una razón E:T = 20:1. Mel526 (HLA-A*0201+/SLC45A2+) y A375 (HLA-A*0201+/SLC45A2-) se usaron como control positivo y negativo, respectivamente. Figura 12B, actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a HLA-A*2402 de otro donante contra melanocitos.

Figuras 13A-B: comparación de la expresión del gen MDA en melanomas y melanocitos primarios. Figura 13A, expresión del transcrito RNAseq de MART-1, gp100, tirosinasa y SLC45A2 en tejidos normales (base de datos del portal GTex), tumores de melanoma cutáneo y uveal (base de datos de TCGA), líneas celulares de melanoma (base de datos del laboratorio de TIL del MD Anderson) o melanocitos primarios. TPM, transcritos por millón. Figura 13B, índices de sobreexpresión tumoral para MART-1, gp100, tirosinasa y SLC45A2, tal como se calculan mediante la fórmula {expresión media del transcrito tumoral/expresión media del transcrito de melanocitos primarios}.

Descripción

I. INMUNOTERAPIAS USANDO PÉPTIDOS SLC45A2

Un péptido SLC45A2 tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, que comprende SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2) puede usarse para inmunoterapia de un cáncer. Por ejemplo, un péptido SLC45A2 puede ponerse en contacto con o usarse para estimular una población de células T para inducir la proliferación de las células T que reconocen o se unen al péptido SLC45A2. Un péptido SLC45A2 tal como se describe en el presente documento puede administrarse a un sujeto, tal como un paciente humano, para potenciar la respuesta inmunitaria del sujeto contra un cáncer. Para tumores tales como el melanoma, se ha demostrado que la transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) da como resultado un beneficio significativo para el paciente (Hawkins et al., 2010).

Puede incluirse un péptido SLC45A2 en una inmunoterapia activa (por ejemplo, una vacuna contra el cáncer) o una inmunoterapia pasiva (por ejemplo, una inmunoterapia adoptiva). Las inmunoterapias activas incluyen inmunizar a un sujeto con un antígeno de péptido SLC45A2 purificado o un péptido SLC45A2 inmunodominante (nativo o modificado); alternativamente, pueden administrarse a un sujeto células presentadoras de antígeno pulsadas con un péptido SLC45A2 (o transfectadas con genes que codifican para el antígeno de SLC45A2). El péptido SLC45A2 puede modificarse o contener una o más mutaciones tales como, por ejemplo, una mutación de sustitución. Las inmunoterapias pasivas incluyen inmunoterapias adoptivas. Las inmunoterapias adoptivas implican generalmente administrar células a un sujeto, donde las células (por ejemplo, células T citotóxicas) se han sensibilizado in vitro para SLC45A2 (véase, por ejemplo, el documento ^uS 7910109).

Puede usarse citometría de flujo en la inmunoterapia adoptiva para el aislamiento rápido de clones de células T específicos de antígenos tumorales humanos usando, por ejemplo, anticuerpos Vp del receptor de células T (TCR) en combinación con un ensayo de proliferación basado en el éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE). Véase, por ejemplo, Lee et al. (2008). La clasificación celular guiada por tetrámeros puede usarse tal como, por ejemplo, en los métodos descritos en Pollack et al. También se conocen diversos protocolos de cultivo para inmunoterapia adoptiva, y pueden usarse según la presente divulgación. Las células pueden cultivarse en condiciones que no requieran el uso de células presentadoras de antígeno (por ejemplo, Hida et al., 2002). Además, las células T pueden expandirse en condiciones de cultivo que utilizan células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas (Nestle et al., 1998), y también pueden usarse células presentadoras de antígeno artificiales para este fin (Maus et al., 2002). Los métodos adicionales para la inmunoterapia adoptiva se dan a conocer en Dudley et al. (2003), que pueden usarse según la presente divulgación. Se conocen diversos métodos y pueden usarse para clonar y expandir células T específicas de antígeno humano (véase, por ejemplo, Riddell et al., 1990).

El siguiente protocolo puede usarse para generar células T que reconocen de manera selectiva péptidos SLC45A2. Pueden generarse líneas de células T específicas de péptido a partir de donantes y pacientes normales HLA-A2+ usando métodos previamente notificados (Hida et al., 2002). En resumen, pueden estimularse PBMC (1 * 105 células/pocillo) con aproximadamente 10 |ig/ml de cada péptido por cuadruplicado en una placa de microcultivo con fondo en U de 96 pocillos (Corning Incorporated, Lowell, MA) en aproximadamente 200 |il de medio de cultivo. El medio de cultivo puede consistir en medio AIM-V al 50% (Invitrogen), medio RPMI1640 al 50% (Invitrogen), suero AB humano al 10% (Valley Biomedical, Winchester, VA) y 100 UI/ml de interleucina-2 (IL-2). Las células pueden reestimularse con el péptido correspondiente aproximadamente cada 3 días. Después de 5 estimulaciones, las células T de cada pocillo pueden lavarse e incubarse con células T2 en presencia o ausencia del péptido correspondiente. Después de aproximadamente 18 horas, puede determinarse la producción de interferón (IFN)-y en los sobrenadantes mediante ELISA. Las células T que secretan grandes cantidades de IFN-y pueden expandirse adicionalmente mediante un protocolo de expansión rápida (Riddell et al., 1990; Yee et al., 2002b).

Una inmunoterapia puede utilizar un péptido SLC45A2 tal como se describe en el presente documento que está asociado con un penetrador celular, tal como un liposoma o un péptido de penetración celular (CPP). Pueden usarse células presentadoras de antígeno (tales como células dendríticas) pulsadas con péptidos para potenciar la inmunidad antitumoral (Celluzzi et al., 1996; Young et al., 1996). Los liposomas y los CPP se describen con más detalle a continuación. Una inmunoterapia puede utilizar un ácido nucleico que codifica para un péptido SLC45A2 tal como se describe en el presente documento, en el que se suministra el ácido nucleico, por ejemplo, en un vector viral o no viral.

SLC45A2 se expresa en cánceres tales como melanomas. SLC45A2 (familia de portadores de solutos 45, miembro 2; también conocida como proteína asociada a la membrana, MATP o AIM-1) es una proteína de diferenciación de melanocitos tal como MART-1, gp100, tirosinasa y TRP-1 y una proteína transportadora localizada en la membrana del melanosoma (Newton jm 2001). Aunque se desconoce la función exacta, es probable que esté relacionada con la producción de melanina en cualquiera de dos papeles diferentes. Uno es el procesamiento y tráfico apropiados de la tirosinasa al melanosoma (Costin 2003) y el otro es el mantenimiento de un pH específico dentro de los melanosomas (Graf et al., 2005; Lucotte et al., 2010). SLC45A2 se ha relacionado con la piel, el cabello y la pigmentación de los ojos oscuros, y en humanos, la mutación patógena de SLC45A2 conduce al albinismo oculocutáneo de tipo IV (OCA4) al interrumpir la biosíntesis de melanina (Fukamachi 2001, Newton 2001, du2002). Curiosamente, las variantes de SLC45A2 por mutación están asociadas con el riesgo de melanoma, y su gen se ha propuesto como un gen de susceptibilidad al melanoma en la población de piel clara (Guedj m2008, Fernandes lp 2008, ibarrola 2012).

Un péptido SLC45A2 tal como se da a conocer en el presente documento puede usarse en una inmunoterapia para tratar un melanoma en un sujeto mamífero, tal como un paciente humano. El melanoma puede ser, por ejemplo, un melanoma cutáneo, un melanoma uveal, un melanoma mucoso o un melanoma metastásico. Se prevé que cualquier cáncer que exprese SLC45A2 puede tratarse a través de una inmunoterapia usando un péptido SLC45A2 tal como se describe en el presente documento.

Las células T específicas de antígeno tumoral circulantes reconocidas por el antígeno de melanocitos (MART-1, gp100, tirosinasa) pueden detectarse en pacientes con melanoma, aislarse de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando tecnología basada en tetrámeros y expandirse más de 20 veces usando anticuerpos anti-CD3 e IL-2 con las células alimentadoras irradiadas (Yee 2012). Pueden inducirse células T CD8 específicas de antígeno tumoral in vitro estimulando PBMC usando células dendríticas (DC) autólogas pulsadas con epítopo de CTL reconocido por péptidos. Durante la sensibilización, la exposición de IL-21 aumenta la frecuencia y el número de CTL específicos de antígeno y conduce a CTL con fenotipo similar a la memoria, que experimentaron persistencia in vivo a largo plazo y regresión tumoral mediada (Li 2005; Chapuis 2013). La estrategia usando IL-21 en la generación ex vivo de CTL específicos de antígeno tumoral potentes para transferencia adoptiva es muy útil y se empleó tal como se describe en los ejemplos siguientes.

II. PÉPTIDOS SLC45A2

Tal como se usa en el presente documento, el término “péptido” abarca cadenas de aminoácidos que comprenden 7-35 aminoácidos, preferiblemente 8-35 residuos de aminoácidos, e incluso más preferiblemente 8-25 aminoácidos, o 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 aminoácidos de longitud, o cualquier intervalo que se derive de los mismos. Por ejemplo, un péptido SLC45A2 tal como se da a conocer en el presente documento puede comprender o consistir en el péptido SLC45A2 de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. En la tabla 4 se proporcionan péptidos SLC45A2 adicionales que pueden usarse según la presente divulgación. Tal como se usa en el presente documento, un “péptido antigénico” es un péptido que, cuando se introduce en un vertebrado, puede estimular la producción de anticuerpos en el vertebrado, es decir, es antigénico, y en el que el anticuerpo puede reconocer y/o unirse de manera selectiva al péptido antigénico. Un péptido antigénico puede comprender un péptido SLC45A2 inmunorreactivo y puede comprender secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivarse de un antígeno nativo y pueden ser heterólogas, y tales secuencias pueden ser inmunogénicas, pero no es necesario. Un péptido SLC45A2 puede unirse de manera selectiva a un HLA-A2 o un HLA-A24. El péptido SLC45A2 puede tener 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 aminoácidos de longitud, o cualquier intervalo que se derive de los mismos. Preferiblemente, el péptido SLC45A2 tiene una longitud de desde 8 hasta 35 aminoácidos. El péptido SLC45A2 también puede tener una longitud de desde 8 hasta 10 aminoácidos.

Tal como apreciaría un experto en la técnica, las moléculas de CMH pueden unirse a péptidos de tamaños variables, pero normalmente no a proteínas de longitud completa. Si bien se ha descrito tradicionalmente que las moléculas de CMH de clase I se unen a péptidos de 8-11 aminoácidos de longitud, se ha demostrado que los péptidos de 15 aminoácidos de longitud pueden unirse a moléculas de CMH de clase I formando una protuberancia en la parte central del sitio de unión o extendiéndose hacia fuera del surco de unión a CMH clase I (Guo et al., 1992; Burrows et al., 2006; Samino et al., 2006; Stryhn et al., 2000; Collins et al., 1994; Blanchard y Shastri, 2008). Además, estudios recientes también demostraron que los péptidos más largos pueden endocitosarse, procesarse y presentarse de manera más eficaz por las células presentadoras de antígeno (Zwaveling et al., 2002; Bijker et al., 2007; Melief y van der Burg, 2008; Quintarelli et al., 2011). Tal como se demostró en Zwaveling et al. (2002), pueden usarse péptidos de hasta 35 aminoácidos de longitud para unirse de manera selectiva a un CMH de clase II y son eficaces. Tal como apreciará inmediatamente un experto en la técnica, un SLC45A2 de longitud completa que se produce de manera natural no sería útil para unirse de manera selectiva a un CMH de clase II de modo que se endocitose y genere la proliferación de células T. Generalmente, las proteínas SLC45A2 de longitud completa que se producen de manera natural no muestran estas propiedades y, por tanto, no serían útiles para estos fines de inmunoterapia.

Un péptido SLC45A2 es inmunogénico o antigénico. Tal como se muestra en los ejemplos siguientes, diversos péptidos SLC45A2 dados a conocer pueden fomentar la proliferación de células T. Se prevé que tales péptidos pueden usarse para inducir cierto grado de inmunidad protectora.

Un péptido SLC45A2 puede ser un péptido recombinante, péptido sintético, péptido purificado, péptido inmovilizado, péptido detectablemente marcado, péptido encapsulado o un péptido expresado por vector (por ejemplo, un péptido codificado por un ácido nucleico en un vector que comprende un promotor heterólogo unido operativamente al ácido nucleico). Puede administrarse un péptido SLC45A2 sintético a un sujeto, tal como un paciente humano, para inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto. Los péptidos sintéticos pueden presentar determinadas ventajas, tales como un riesgo disminuido de contaminación bacteriana, en comparación con los péptidos expresados de manera recombinante. Un péptido SLC45A2 también puede estar comprendido en una composición farmacéutica tal como, por ejemplo, una composición de vacuna, que se formula para su administración a un sujeto mamífero o humano. A. Péptidos de penetración celular

Un péptido SLC45A2 también puede asociarse con o unirse covalentemente a un péptido de penetración celular (CPP). Los péptidos de penetración celular que pueden unirse covalentemente a un péptido SLC45A2 incluyen, por ejemplo, Tat del VIH, VP22 del virus del herpes, el producto del gen homeobox de Drosophila Antennapedia, secuencias señal, secuencias de fusión o protegrina I. La unión covalente de un péptido a un CPP puede prolongar la presentación de un péptido por las células dendríticas, potenciando así la inmunidad antitumoral (Wang y Wang, 2002). Un péptido SLC45A2 tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, comprendido dentro de una cadena de péptidos o poliepítopos) pueden unirse covalentemente (por ejemplo, a través de un enlace peptídico) a un CPP para generar una proteína de fusión. Además, un péptido SLC45A2 o ácido nucleico que codifica para un péptido SLC45A2 puede encapsularse dentro o asociarse con un liposoma, tal como un liposoma mutilamelar, vesicular o multivesicular.

Tal como se usa en el presente documento, “asociación” significa una asociación física, una asociación química o ambas. Por ejemplo, una asociación puede implicar un enlace covalente, una interacción hidrófoba, encapsulación, adsorción superficial o similares.

Tal como se usa en el presente documento, “penetrador celular” se refiere a una composición o a un compuesto que potencia el suministro intracelular de la cadena de péptidos/poliepítopos a la célula presentadora de antígeno. Por ejemplo, el penetrador celular puede ser un lípido que, cuando se asocia con el péptido, potencia su capacidad para atravesar la membrana plasmática. Alternativamente, el penetrador celular puede ser un péptido. Los péptidos de penetración celular (CPP) son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la proteína Tat del VIH (Frankel y Pabo, 1988), la proteína V^p22 del VHS (Elliott y O'Hare, 1997) y el factor de crecimiento de fibroblastos (Lin et al., 1995).

Los péptidos de penetración celular (o “dominios de transducción de proteínas”) se han identificado a partir de la tercera hélice del gen homeobox de Drosophila Antennapedia (Antp), la Tat del VIH y la VP22 del virus del herpes, todos los cuales contienen dominios cargados positivamente enriquecidos con residuos de arginina y lisina (Schwarze et al., 2000; Schwarze et al., 1999). Además, los péptidos hidrófobos derivados de secuencias señal se han identificado como péptidos de penetración celular (Rojas et al., 1996; Rojas et al., 1998; Du et al., 1998). Se ha demostrado que el acoplamiento de estos péptidos a proteínas marcadoras tales como la p-galactosidasa confiere una internalización eficaz de la proteína marcadora en las células, y se han usado proteínas de fusión en marco quiméricas que contienen estos péptidos para suministrar proteínas a un amplio espectro de tipos de células tanto in vitro como in vivo (Drin et al., 2002). La fusión de estos péptidos de penetración celular a un péptido SLC45A2 tal como se da a conocer en el presente documento puede potenciar la captación celular de los polipéptidos.

La captación celular puede facilitarse mediante la unión de un lípido, tal como estearato o miristilato, al polipéptido. Se ha demostrado que la lipidación potencia el paso de péptidos al interior de las células. La unión de un resto lipídico es otro modo para aumentar la captación de polipéptidos por parte de la célula. La captación celular se comenta adicionalmente a continuación.

Un péptido SLC45A2 tal como se da a conocer en el presente documento puede incluirse en una composición de vacuna liposómica. Por ejemplo, la composición liposómica puede ser o comprender una composición proteoliposómica. Se describen métodos para producir composiciones proteoliposómicas que pueden usarse según la presente divulgación, por ejemplo, en Neelapu et al. (2007) y Popescu et al. (2007). Las composiciones proteoliposómicas pueden usarse para tratar un melanoma.

Al potenciar la captación de un polipéptido SLC45A2, puede ser posible reducir la cantidad de proteína o péptido requerida para el tratamiento. Esto, a su vez, puede reducir significativamente el coste del tratamiento y aumentar el suministro de agente terapéutico. Las dosis más bajas también pueden minimizar la posible inmunogenicidad de los péptidos y limitar los efectos secundarios tóxicos.

Un péptido SLC45A2 puede asociarse con una nanopartícula para formar un complejo nanopartícula-polipéptido. La nanopartícula es un liposomas u otra nanopartícula a base de lípidos, tal como una vesícula a base de lípidos (por ejemplo, una vesícula de DOTAP:colesterol). La nanopartícula es una nanopartícula superparamagnética a base de óxido de hierro. Las nanopartículas superparamagnéticas que oscilan en diámetro entre aproximadamente 10 y 100 nm son lo suficientemente pequeñas como para evitar que el bazo las secuestre, pero lo suficientemente grandes como para evitar que el hígado las aclare. Las partículas de este tamaño pueden penetrar en capilares muy pequeños y distribuirse de manera eficaz en los tejidos corporales. Los complejos nanopartículas superparamagnéticas-polipéptido pueden usarse como agentes de contraste de IRM para identificar y seguir aquellas células que captan el péptido SLC45A2. La nanopartícula puede ser un nanocristal semiconductor o un punto cuántico semiconductor, los cuales pueden usarse en obtención de imágenes óptica. La nanopartícula también puede ser una nanocapa (nanoshell), que comprende una capa de oro sobre un núcleo de sílice. Una ventaja de las nanocapas es que los polipéptidos pueden conjugarse con la capa de oro usando química convencional. La nanopartícula también puede ser un fullereno o un nanotubo (Gupta et al., 2005).

Los péptidos se eliminan rápidamente de la circulación por parte del riñón y son sensibles a la degradación por parte de las proteasas en suero. Al asociar un péptido SLC^{4 5}A²con una nanopartícula, los complejos nanopartículapolipéptido tal como se dan a conocer en el presente documento pueden proteger contra la degradación y/o reducir el aclaramiento por parte del riñón. Esto puede aumentar la semivida en suero de los polipéptidos, reduciendo así la dosis de polipéptido necesaria para una terapia eficaz. Además, esto puede reducir los costes del tratamiento y minimizar los problemas inmunitarios y las reacciones tóxicas de la terapia.

B. Cadenas de poliepítopos

Un péptido SLC45A2 puede estar incluido o comprendido en una cadena de poliepítopos. Una cadena de poliepítopos es un péptido o polipéptido que contiene una pluralidad de epítopos antigénicos de uno o más antígenos unidos entre sí. Puede usarse una cadena de poliepítopos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, tal como un sujeto humano. Las cadenas de poliepítopos se han usado previamente para seleccionar como diana la malaria y otros patógenos (Baraldo et al., 2005; Moorthy et al., 2004; Baird et al., 2004). Una cadena de poliepítopos puede hacer referencia a un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para una pluralidad de antígenos incluyendo un péptido SLC45A2) o a un péptido o a un polipéptido (por ejemplo, que contiene una pluralidad de antígenos incluyendo un péptido SLC45A2). Puede incluirse una cadena de poliepítopos en una composición de vacuna contra el cáncer.

C. Equivalentes funcionales biológicos

Un péptido SLC45A2 según la presente divulgación puede modificarse para contener sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos que no alteren sus interacciones respectivas con las regiones de unión de HLA-A2 o HLA-A24. Un equivalente biológicamente funcional de este tipo de un péptido SLC45A2 podría ser una molécula que tenga características similares o de otro modo deseables, por ejemplo, unión de HLA-A2 o HLA-A24. Como ejemplo no limitativo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en un péptido SLC45A2 dado a conocer en el presente documento sin una pérdida apreciable de capacidad interactiva, tal como se demuestra por la unión del péptido a HLA-A2 o HLA-A24 sin cambios detectables. SLC45A2 puede tener una mutación de sustitución en un lugar de anclaje, tal como una mutación de sustitución en una, dos o todas las posiciones: 1 (P1), 2 (P2) y/o 9 (P9). Por tanto, se contempla que un péptido SLC45A2 dado a conocer en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica para un péptido de este tipo) que está modificado en cuanto a secuencia y/o estructura, pero que no cambia en cuanto a su utilidad o actividad biológica, permanece dentro del alcance de la divulgación.

El experto en la técnica también entiende bien que, inherente a la definición de un péptido equivalente biológicamente funcional, está el concepto de que existe un límite en el número de cambios que pueden realizarse dentro de una porción definida de la molécula mientras se mantiene un nivel aceptable de actividad biológica equivalente. Por tanto, los péptidos equivalentes biológicamente funcionales se definen en el presente documento como aquellos péptidos en los que algunos, no la mayoría ni todos, de los aminoácidos pueden estar sustituidos. Por supuesto, pueden prepararse y usarse fácilmente una pluralidad de péptidos distintos con diferentes sustituciones según la divulgación.

El experto en la técnica también es consciente de que cuando se demuestra que determinados residuos son particularmente importantes para las propiedades biológicas o estructurales de un péptido, por ejemplo, residuos en epítopos específicos, generalmente tales residuos no pueden intercambiarse. Este puede ser el caso, ya que una mutación en un péptido SLC45A2 dado a conocer en el presente documento podría dar como resultado una pérdida de especificidad de especie y, a su vez, reducir la utilidad del péptido resultante para su uso en los métodos dados a conocer. Por tanto, se entiende que los péptidos que son antigénicos (por ejemplo, que se unen a HLA-A2 o HLA-A24 específicamente) y comprenden sustituciones de aminoácidos conservadoras están incluidos en la presente divulgación. Es menos probable que las sustituciones conservadoras alteren drásticamente la actividad de una proteína. Una “sustitución de aminoácidos conservadora” se refiere al reemplazo de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar, es decir, reemplazar los aminoácidos no polares por otros aminoácidos no polares; sustitución de aminoácidos polares por otros aminoácidos polares, residuos ácidos por otros aminoácidos ácidos, etc.

Las sustituciones de aminoácidos, tales como las que podrían emplearse para modificar un péptido SLC45A2 dado a conocer en el presente documento, se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Un análisis del tamaño, la forma y el tipo de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos revela que la arginina, la lisina y la histidina son todas residuos cargados positivamente; que la alanina, la glicina y la serina tienen todas un tamaño similar; y que la fenilalanina, el triptófano y la tirosina tienen todos una forma generalmente similar. Por tanto, basándose en estas consideraciones, arginina, lisina e histidina; alanina, glicina y serina; y fenilalanina, triptófano y tirosina; se definen en el presente documento como equivalentes biológicamente funcionales. La mutación puede potenciar la interacción TCR-pCMH y/o la unión péptido-CMH.

También se contemplan isoformas de los péptidos SLC45A2 dados a conocer en el presente documento. Una isoforma contiene el mismo número y la misma clase de aminoácidos que un péptido dado a conocer en el presente documento, pero la isoforma tiene una estructura molecular diferente. Las isoformas contempladas en el presente documento son las que tienen las mismas propiedades que un péptido tal como se describe en el presente documento.

Pueden incorporarse aminoácidos no convencionales en proteínas mediante la modificación química de los aminoácidos existentes o mediante síntesis de novo de un péptido dado a conocer en el presente documento. Un aminoácido no convencional se refiere a un aminoácido que difiere en cuanto a estructura química de los veinte aminoácidos convencionales codificados por el código genético.

También se contempla un derivado químico de un péptido SLC45A2 dado a conocer en el presente documento. “Derivado químico” se refiere a un péptido que tiene uno o más residuos derivatizados químicamente por reacción de un grupo lateral funcional, y que retiene la actividad y utilidad biológicas. Tales péptidos derivatizados incluyen, por ejemplo, aquellos en los que los grupos amino libres se han derivatizado para formar sales específicas o se han derivatizado mediante alquilación y/o acilación, grupos p-toluenosulfonilo, grupos carbobenzoxilo, grupos tbutilocilcarbonilo, grupos cloroacetilo, grupos formilo o acetilo, entre otros. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales orgánicas o inorgánicas, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas y preferiblemente amidas (primarias o secundarias). Los derivados químicos pueden incluir aquellos péptidos que comprenden uno o más derivados de aminoácidos que se producen de manera natural de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo, 4-hidroxiprolina puede sustituirse por serina; y ornitina puede sustituirse por lisina.

Debe tenerse en cuenta que todas las secuencias de residuos de aminoácidos están representadas en el presente documento por fórmulas cuya orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional del extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal. Además, debe tenerse en cuenta que una línea al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptídico unido a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos. Se prefiere que los aminoácidos descritos en el presente documento estén en la forma isomérica “L”. Sin embargo, los residuos en la forma isomérica “D” pueden sustituirse por cualquier residuo de L-aminoácido, siempre que la proteína retenga las propiedades funcionales deseadas expuestas en el presente documento.

Los péptidos SLC45A2 preferidos o análogos de los mismos se unen preferiblemente de manera específica o preferente a un HLA-A2 o un HLA-A24. Determinar si, o en qué grado, un péptido SLC45A2 particular o un péptido marcado, o un análogo del mismo, puede unirse a un HLA-A2 o un HLA-A24 puede evaluarse usando un ensayo in vitro tal como, por ejemplo, un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunotransferencia, inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA), inmunotinción, aglutinación en látex, ensayo de hemaglutinación indirecta (IHA), fijación del complemento, ensayo de inmunofluorescencia indirecta (FA), nefelometría, ensayo de citometría de flujo, ensayo de quimioluminiscencia, inmunoensayo de flujo lateral, ensayo de captura en U, ensayo de espectrometría de masas, ensayo basado en partículas, ensayo de inhibición y/o ensayo de avidez.

D. Ácidos nucleicos que codifican para un péptido SLC45A2

También se proporciona un ácido nucleico que codifica para un péptido SLC45A2 aislado que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% con cualquiera de las SEQ ID NO. 1-2, o el péptido puede tener 1, 2, 3 o 4 mutaciones puntuales (por ejemplo, mutaciones de sustitución) en comparación con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. Tal como se indicó anteriormente, un péptido SLC45A2 de este tipo puede tener, por ejemplo, desde 8 hasta 35 aminoácidos de longitud, o cualquier intervalo que se derive del mismo. El péptido SLC45A2 puede corresponder a una porción de la proteína SLC45A2 (NM_016180 o NM_00101250; o bien puede usarse cualquiera de estas variantes de corte y empalme). Se pretende que el término “ácido nucleico” incluya ADN y ARN, y pueden ser o bien bicatenarios o bien monocatenarios.

También se proporcionan péptidos SLC45A2 producidos de manera recombinante que pueden unirse específicamente a un HLA-A2 o un HLA-A24. Por consiguiente, un ácido nucleico que codifica para un péptido SLC45A2 puede unirse operativamente a un vector de expresión y al péptido producido en el sistema de expresión apropiado usando métodos bien conocidos en las técnicas de biología molecular. Un ácido nucleico que codifica para un péptido SLC45A2 dado a conocer en el presente documento puede incorporarse en cualquier vector de expresión que garantice una buena expresión del péptido. Los posibles vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos o virus modificados (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos en la replicación), siempre que el vector sea adecuado para la transformación de una célula huésped. Un vector de expresión recombinante que es “adecuado para la transformación de una célula huésped” significa que el vector de expresión contiene una molécula de ácido nucleico tal como se describe en el presente documento y secuencias reguladoras seleccionadas en base a las células huésped que van a usarse para la expresión, que está operativamente unidas a la molécula de ácido nucleico. Los términos “unido de manera operativa” o “unido operativamente” se usan de manera intercambiable y pretenden significar que el ácido nucleico está unido a secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión del ácido nucleico.

Por consiguiente, en el presente documento se proporciona un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un péptido SLC45A2 y las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción de la secuencia de proteína insertada. Las secuencias reguladoras adecuadas pueden derivarse de una variedad de fuentes, incluyendo genes bacterianos, fúngicos o virales (por ejemplo, véanse las secuencias reguladoras descritas en Goeddel (1990)).

La selección de secuencias reguladoras apropiadas depende generalmente de la célula huésped elegida, y puede realizarse fácilmente por un experto habitual en la técnica. Los ejemplos de tales secuencias reguladoras incluyen: un promotor y potenciador de la transcripción o una secuencia de unión de ARN polimerasa, una secuencia de unión al ribosoma, incluyendo una señal de inicio de la traducción. Además, dependiendo de la célula huésped elegida y del vector empleado, pueden incorporarse en el vector de expresión otras secuencias, tales como un origen de replicación, sitios de restricción de ADN adicionales, potenciadores y secuencias que confieren inducibilidad de transcripción. También se apreciará que las secuencias reguladoras necesarias pueden suministrarse por la proteína nativa y/o por sus regiones flanqueantes.

Un vector de expresión recombinante también puede contener un gen marcador seleccionable que facilita la selección de células huésped transformadas o transfectadas con un péptido SLC45A2 recombinante dado a conocer en el presente documento. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables son genes que codifican para una proteína tal como G418 e higromicina que confieren resistencia a determinados fármacos, p-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa o luciferasa de luciérnaga. La transcripción del gen marcador seleccionable se controla mediante cambios en la concentración de la proteína marcadora seleccionable tal como p-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa o luciferasa de luciérnaga. Si el gen marcador seleccionable codifica para una proteína que confiere resistencia a los antibióticos, tal como resistencia a la neomicina, las células transformantes pueden seleccionarse con G418. Las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células mueren. Esto hace posible visualizar y analizar la expresión de un vector de expresión recombinante y, en particular, determinar el efecto de una mutación sobre la expresión y el fenotipo. Se apreciará que pueden introducirse marcadores seleccionables en un vector independiente del ácido nucleico de interés.

Los vectores de expresión recombinantes pueden introducirse en células huésped para producir una célula huésped transformante. El término “célula huésped transformante” pretende incluir células procariotas y eucariotas que se han transformado o transfectado con un vector de expresión recombinante descrito en el presente documento. Los términos “transformado con”, “transfectado con”, “transformación” y “transfección” pretenden abarcar la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, un vector) en una célula mediante una de las muchas técnicas posibles conocidas en la técnica. Las células huésped adecuadas incluyen una amplia variedad de células huésped procariotas y eucariotas. Por ejemplo, las proteínas tal como se describen en el presente documento pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando baculovirus), células de levadura o células de mamífero.

Una molécula de ácido nucleico tal como se describe en el presente documento también puede sintetizarse químicamente usando técnicas convencionales. Se conocen diversos métodos de síntesis química de polidesoxinucleótidos, incluyendo la síntesis en fase sólida que, al igual que la síntesis de péptidos, se ha automatizado completamente en sintetizadores de ADN disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.598.049 concedida a Itakura et al.; la patente estadounidense n.° 4.458.066 concedida a Caruthers et al.; e las patentes estadounidenses n.os 4.401.796 y 4.373.071 concedidas a Itakura).

III. ANTICUERPOS

Pueden producirse uno o más anticuerpos contra un péptido SLC45A2 tal como se describe en el presente documento, un complejo péptido SLC45A2-HLA-A2 o un complejo péptido SLC45A2-HLA-A24. Estos anticuerpos pueden usarse, por ejemplo, para tratar un cáncer o pueden incluirse en una vacuna contra el cáncer. Un anticuerpo que reconoce de manera selectiva un péptido SLC45A2, un complejo péptido SLC45A2-HLA-A2 o un complejo péptido SLC45A2-HLA-A24 puede administrarse a un sujeto, tal como un paciente humano, para tratar un melanoma.

Existen métodos para inducir la destrucción celular mediada por células dendríticas (DC) contra una célula diana que expresa un polipéptido de superficie celular diana, que comprenden: a) poner en contacto la célula diana con un polipéptido que comprende un anticuerpo que se une de manera selectiva a un complejo péptido SLC45A2-HLA-A2 o un complejo péptido SLC45A2-HLA-A24; y b) exponer la célula diana a células dendríticas en condiciones que fomenten la destrucción de la célula diana.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” pretende hacer referencia ampliamente a cualquier agente de unión inmunitario tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Generalmente, se prefieren IgG y/o IgM porque son normalmente los anticuerpos más habituales en la situación fisiológica y porque se fabrican fácilmente en un entorno de laboratorio.

El término “anticuerpo” se usa para hacer referencia a cualquier molécula similar a un anticuerpo que tiene una región de unión a antígeno e incluye fragmentos de anticuerpos tales como Fab', Fab, F(ab')², anticuerpos con un solo dominio (DAB), Fv, scFv (Fv de cadena sencilla) y similares. Las técnicas para preparar y usar diversos constructos y fragmentos basados en anticuerpos se conocen bien en la técnica. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos también se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

También se contemplan “mini-anticuerpos” o “minicuerpos” para su uso según la presente divulgación. Los minicuerpos son cadenas polipeptídicas sFv que incluyen dominios de oligomerización en sus extremos C-terminales, separados del sFv por una región bisagra. Pack et al. (1992). El dominio de oligomerización comprende hélices alfa autoasociantes, por ejemplo, cremalleras de leucina, que pueden estabilizarse adicionalmente mediante enlaces disulfuro adicionales. El dominio de oligomerización está diseñado para ser compatible con el plegamiento vectorial a través de una membrana, un procedimiento que se cree que facilita el plegamiento in vivo del polipéptido en una proteína de unión funcional. Generalmente, los minicuerpos se producen usando métodos recombinantes bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pack et al. (1992); Cumber et al. (1992).

Los peptidomiméticos de unión similares a un anticuerpo también se contemplan en el presente documento. Liu et al. (2003) describen “peptidomiméticos de unión similares a un anticuerpo” (ABiP), que son péptidos que actúan como anticuerpos reducidos gradualmente y tienen determinadas ventajas tales como una semivida en suero más prolongada, así como métodos de síntesis menos engorrosos.

Se reconoce que los anticuerpos monoclonales (AcM) tienen determinadas ventajas, por ejemplo, reproducibilidad y producción a gran escala, y generalmente se prefiere su uso. Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan anticuerpos monoclonales de origen humano, murino, de mono, de rata, de hámster, de conejo e incluso de pollo. Debido a la facilidad de preparación y la fácil disponibilidad de los reactivos, a menudo se preferirán los anticuerpos monoclonales murinos.

También se contemplan los anticuerpos “humanizados”, al igual que los anticuerpos quiméricos de ratón, rata u otras especies, que portan dominios de región constante y/o variable humanos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos recombinantes y modificados por ingeniería y fragmentos de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, el término inmunoglobulina “humanizada” se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región de marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (normalmente de ratón o rata). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina “donante” y la inmunoglobulina humana que proporciona la región de marco se denomina “aceptor”. Un “anticuerpo humanizado” es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y una de cadena pesada humanizada.

A. Métodos para generar anticuerpos monoclonales

Los métodos para generar anticuerpos monoclonales (AcM) generalmente comienzan en la misma línea que los de preparación de anticuerpos policlonales. En resumen, se prepara un anticuerpo policlonal inmunizando a un animal con una composición de LEE o CEE según la presente divulgación y recogiendo antisueros de ese animal inmunizado.

Puede usarse una amplia gama de especies animales para la producción de antisueros. Normalmente, el animal usado para la producción de antisueros es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, una cobaya o una cabra. La elección del animal puede decidirse en función de la facilidad de manipulación, los costes o la cantidad deseada de sueros, tal como conocerá un experto en la técnica. Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden producirse de manera transgénica mediante la generación de un mamífero o una planta que sea transgénico para las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable a partir de los mismos. En relación con la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos pueden producirse y recuperarse de la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 y 5.741.957.

Tal como también se conoce bien en la técnica, la inmunogenicidad de una composición inmunogénica particular puede potenciarse mediante el uso de estimuladores inespecíficos de la respuesta inmunitaria, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes adecuados incluyen todos los compuestos inmunoestimuladores aceptables, tales como citocinas, quimiocinas, cofactores, toxinas, plasmodios, composiciones sintéticas o LEE o CEE que codifican para tales adyuvantes.

Los adyuvantes que pueden usarse incluyen IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, y-interferón, GMCSP, BCG, hidróxido de aluminio, compuestos de MDP, tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP (MTP-PE), lípido A y monofosforil lípido A (MPL). También se contempla RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, MPL, dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween 80. Incluso pueden usarse antígenos de CMH. Los adyuvantes a modo de ejemplo, a menudo preferidos, incluyen el adyuvante completo de Freund (un estimulador inespecífico de la respuesta inmunitaria que contiene Mycobacterium tuberculosis destruidas), adyuvantes incompletos de Freund y adyuvante de hidróxido de aluminio.

Además de los adyuvantes, puede ser deseable coadministrar modificadores de la respuesta biológica (BRM), que se ha demostrado que regulan por incremento la inmunidad de las células T o regulan por disminución la actividad de las células supresoras. Tales BRM incluyen, pero no se limitan a, cimetidina (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); ciclofosfamida en dosis bajas (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/Mead, NJ), citocinas tales como y-interferón, IL-2 o IL-12, o genes que codifican para proteínas implicadas en funciones inmunitarias auxiliares, tales como B-7.

La cantidad de composición inmunogénica usada en la producción de anticuerpos policlonales varía según la naturaleza del inmunógeno así como del animal utilizado para la inmunización. Pueden usarse una variedad de vías para administrar el inmunógeno incluyendo, pero sin limitarse a, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraepidérmica, intravenosa e intraperitoneal. La producción de anticuerpos policlonales puede monitorizarse tomando muestras de sangre del animal inmunizado en diversos puntos después de la inmunización.

También puede administrarse una segunda dosis de refuerzo (por ejemplo, proporcionada en una inyección). El procedimiento de refuerzo y titulación se repite hasta que se alcanza un título adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, pueden tomarse muestras de sangre del animal inmunizado y puede aislarse y almacenarse el suero, y/o puede usarse el animal para generar AcM.

Para la producción de anticuerpos policlonales de conejo, pueden tomarse muestras de sangre del animal a través de una vena de la oreja o alternativamente mediante punción cardíaca. La sangre extraída se deja coagular y luego se centrifuga para separar los componentes del suero de las células completas y los coágulos de sangre. El suero puede usarse tal cual para diversas aplicaciones o de lo contrario puede purificarse la fracción de anticuerpo deseada mediante métodos bien conocidos, tales como cromatografía de afinidad usando otro anticuerpo, un péptido unido a una matriz sólida, o usando, por ejemplo, cromatografía de proteína A o proteína G.

Los AcM pueden prepararse fácilmente mediante el uso de técnicas bien conocidas, tales como las ejemplificadas en la patente estadounidense 4.196.265. Normalmente, esta técnica implica inmunizar a un animal adecuado con una composición inmunogénica seleccionada, por ejemplo, una proteína, un polipéptido, péptido o dominio purificado 0 parcialmente purificado, ya sea una composición silvestre o mutante. La composición inmunizante se administra de una manera eficaz para estimular las células productoras de anticuerpos.

Los métodos para generar anticuerpos monoclonales (AcM) comienzan generalmente en la misma línea que los de preparación de anticuerpos policlonales. Los roedores tales como ratones y ratas son animales preferidos, sin embargo, también es posible el uso de células de conejo, oveja o rana. El uso de ratas puede proporcionar determinadas ventajas (Goding, 1986, págs. 60-61), pero se prefieren los ratones, siendo el ratón BALB/c el más preferido ya que se usa de manera más rutinaria y proporciona generalmente un mayor porcentaje de fusiones estables.

A los animales se les inyecta el antígeno, generalmente tal como se describió anteriormente. El antígeno puede mezclarse con un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund. Las administraciones de refuerzo con el mismo antígeno o ADN que codifica para el antígeno se producirían aproximadamente a intervalos de dos semanas.

Después de la inmunización, las células somáticas con el potencial de producir anticuerpos, específicamente linfocitos B (células B), se seleccionan para su uso en el protocolo de generación de AcM. Estas células pueden obtenerse de bazos, amígdalas o ganglios linfáticos sometidos a biopsia, o de una muestra de sangre periférica. Se prefieren las células del bazo y las células de sangre periférica, las primeras porque son una fuente rica de células productoras de anticuerpos que se encuentran en la etapa de división de plasmoblastos, y las segundas porque la sangre periférica es fácilmente accesible.

A menudo, se habrá inmunizado un panel de animales y se extraerá el bazo de un animal con el título de anticuerpo más alto y se obtendrán los linfocitos del bazo homogeneizando el bazo con una jeringa. Normalmente, el bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente de 5 * 107 a 2 * 108 linfocitos.

Los linfocitos B productores de anticuerpos del animal inmunizado se fusionan luego con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal inmunizado. Las líneas celulares de mieloma adecuadas para su uso en procedimientos de fusión que producen hibridomas preferiblemente no producen anticuerpos, tienen una alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en determinados medios selectivos que respaldan el crecimiento de sólo las células fusionadas deseadas (hibridomas). Puede usarse una cualquiera de varias células de mieloma, tal como conocen los expertos en la técnica (Goding, págs. 65-66, 1986; Campbell, págs. 75-83, 1984). referencias). Por ejemplo, cuando el animal inmunizado es un ratón, pueden usarse P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, pueden usarse R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 son todos útiles junto con fusiones de células humanas. Véase Yoo et al. (2002) para un análisis de los sistemas de expresión de mieloma.

Una célula de mieloma murino preferida es la línea celular de mieloma NS-1 (también denominada P3-NS-1-Ag4-1), que está fácilmente disponible en el Depósito de Células Mutantes Genéticas Humanas del NIGMS solicitando el número de depósito de línea celular GM3573. Otra línea celular de mieloma de ratón que puede usarse es la línea celular no productora SP2/0 de mieloma murino de ratón resistente a 8-azaguanina.

Los métodos para generar híbridos de células del bazo o de los ganglios linfáticos productoras de anticuerpos y células de mieloma comprenden habitualmente mezclar células somáticas con células de mieloma en una proporción 2:1, aunque la proporción puede variar desde aproximadamente 20:1 hasta aproximadamente 1:1, respectivamente, en presencia de un agente o agentes (químicos o eléctricos) que fomentan la fusión de las membranas celulares. Kohler y Milstein (1975; 1976) han descrito métodos de fusión usando el virus Sendai, y Gefter et al., (1977) aquellos que usan polietilenglicol (PEG), tal como PEG al 37% (v/v). El uso de métodos de fusión eléctricamente inducida también es apropiado (Goding págs. 71-74, 1986).

Los procedimientos de fusión producen habitualmente híbridos viables a bajas frecuencias, de aproximadamente 1 * 10'6 a 1 * 10'8. Sin embargo, esto no plantea ningún problema, ya que los híbridos fusionados viables se diferencian de las células no fusionadas parentales (particularmente las células de mieloma no fusionadas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente) mediante cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es generalmente uno que contiene un agente que bloquea la síntesis de novo de nucleótidos en medios de cultivo tisular. Los agentes a modo de ejemplo y preferidos son aminopterina, metotrexato y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo tanto de purinas como de pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea sólo la síntesis de purinas. Cuando se usa aminopterina o metotrexato, el medio se complementa con hipoxantina y timidina como fuente de nucleótidos (medio HAT). Cuando se usa azaserina, el medio se complementa con hipoxantina.

Además, puede usarse el medio de selección HAT. Generalmente, sólo las células que son capaces de hacer funcionar vías de rescate de nucleótidos pueden sobrevivir en el medio HAT. Las células de mieloma son defectuosas en enzimas clave de la vía de rescate, por ejemplo, hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), y no pueden sobrevivir. Las células B pueden hacer funcionar esta vía, pero tienen una vida útil limitada en cultivo y generalmente mueren en aproximadamente dos semanas. Por tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en los medios selectivos son los híbridos formados a partir de células B y de mieloma.

Este cultivo puede proporcionar una población de hibridomas de la que pueden seleccionarse hibridomas específicos. Normalmente, la selección de hibridomas se realiza cultivando las células mediante dilución de un solo clon en placas de microtitulación, seguido de pruebas a los sobrenadantes clonales individuales (después de aproximadamente dos a tres semanas) para determinar la reactividad deseada. El ensayo debe ser sensible, sencillo y rápido, tal como radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, ensayos de citotoxicidad, ensayos de placas, ensayos de inmunounión puntual y similares.

Luego, los hibridomas seleccionados pueden diluirse en serie y clonarse en líneas celulares productoras de anticuerpos individuales, clones que luego pueden propagarse indefinidamente para proporcionar AcM. Las líneas celulares pueden aprovecharse para la producción de AcM de dos maneras básicas. En primer lugar, puede inyectarse una muestra del hibridoma (a menudo en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se usó para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original (por ejemplo, un ratón singénico). Opcionalmente, los animales se sensibilizan con un hidrocarburo, especialmente aceites tales como pristano (tetrametilpentadecano), antes de la inyección. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido de células fusionadas. Luego pueden extraerse los líquidos corporales del animal, tales como el suero o el líquido ascítico, para proporcionar AcM en alta concentración. En segundo lugar, las líneas celulares individuales podrían cultivarse in vitro, donde los AcM se secretan naturalmente en el medio de cultivo del que pueden obtenerse fácilmente en altas concentraciones.

Además, la expresión de anticuerpos tal como se describen en el presente documento (u otros restos de los mismos) a partir de líneas celulares de producción puede potenciarse usando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, los sistemas de expresión génica de glutamina sintetasa y DHFR son enfoques habituales para potenciar la expresión en determinadas condiciones. Los clones de células de alta expresión pueden identificarse usando técnicas convencionales, tales como la clonación por dilución limitada y la tecnología Microdrop. El sistema GS se comenta en su totalidad o en parte en relación con las patentes europeas n.os 0216846, 0256055 y 0323997 y la solicitud de patente europea n.° 89303964.4.

Los AcM producidos mediante cualquiera de los medios pueden purificarse adicionalmente, si se desea, usando filtración, centrifugación y diversos métodos cromatográficos tales como HPLC o cromatografía de afinidad. Pueden obtenerse fragmentos de los anticuerpos monoclonales tal como se describen en el presente documento a partir de los anticuerpos monoclonales así producidos mediante métodos que incluyen digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o escisión de enlaces disulfuro mediante reducción química. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos monoclonales abarcados por la presente divulgación pueden sintetizarse usando un sintetizador de péptidos automatizado.

También se contempla que puede usarse un enfoque de clonación molecular para generar anticuerpos monoclonales. En una realización, las bibliotecas combinatorias de fagémidos de inmunoglobulina se preparan a partir de ARN aislado del bazo del animal inmunizado, y los fagémidos que expresan los anticuerpos apropiados se seleccionan mediante cribado usando células que expresan el antígeno y células de control. Las ventajas de este enfoque sobre las técnicas de hibridoma convencionales son que pueden producirse y seleccionarse aproximadamente 104 veces más anticuerpos en una sola tanda, y que se generan nuevas especificidades mediante la combinación de cadenas H y L, lo que aumenta adicionalmente la posibilidad de encontrar anticuerpos apropiados. En otro ejemplo, los LEE o CEE pueden usarse para producir antígenos in vitro con un sistema libre de células. Estos pueden usarse como dianas para la exploración de bibliotecas de anticuerpos monocatenarios. Esto permitiría identificar muy rápidamente muchos anticuerpos diferentes sin el uso de animales.

Otro método para producir anticuerpos que puede usarse se encuentra en la patente estadounidense n.° 6.091.001, que describe métodos para producir una célula que expresa un anticuerpo a partir de una secuencia genómica de la célula que comprende un locus de inmunoglobulina modificado usando recombinación específica del sitio mediada por Cre. El método implica transfectar en primer lugar una célula productora de anticuerpos con un vector de direccionamiento por homología que comprende un sitio lox y una secuencia de direccionamiento homóloga a una primera secuencia de ADN adyacente a la región de los loci de inmunoglobulina de la secuencia genómica que va a convertirse en una región modificada, por lo que el primer sitio lox se inserta en la secuencia genómica mediante recombinación homóloga específica del sitio. Luego, la célula se transfecta con un vector de direccionamiento a lox que comprende un segundo sitio lox adecuado para la recombinación mediada por Cre con el sitio lox integrado y una secuencia de modificación para convertir la región de los loci de inmunoglobulina en la región modificada. Esta conversión se realiza mediante la interacción de los sitios lox con Cre in vivo, de modo que la secuencia de modificación se inserta en la secuencia genómica mediante la recombinación específica del sitio mediada por Cre de los sitios lox.

Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos monoclonales abarcados por la presente divulgación pueden sintetizarse usando un sintetizador de péptidos automatizado, o mediante la expresión de un gen de longitud completa o de fragmentos de genes en E. coli.

B. Conjugados de anticuerpo

Además, en el presente documento se proporcionan anticuerpos contra un péptido SLC45A2 tal como se describe en el presente documento o un complejo péptido SLC45A2-HLA-A2, generalmente de tipo monoclonal, que están unidos a al menos un agente para formar un conjugado de anticuerpo. Con el fin de aumentar la eficacia de las moléculas de anticuerpo como agentes de diagnóstico o terapéuticos, es convencional ligar o unir covalentemente o complejar al menos una molécula o un resto deseado. Una molécula o un resto de este tipo puede ser, pero no se limita a, al menos una molécula efectora o indicadora. Las moléculas efectoras comprenden moléculas que tienen una actividad deseada, por ejemplo, actividad citotóxica. Los ejemplos no limitativos de moléculas efectoras que se han unido a anticuerpos incluyen toxinas, agentes antitumorales, enzimas terapéuticas, nucleótidos radiomarcados, agentes antivirales, agentes quelantes, citocinas, factores de crecimiento y oligonucleótidos o polinucleótidos. Por el contrario, una molécula indicadora se define como cualquier resto que pueda detectarse usando un ensayo. Los ejemplos no limitativos de moléculas indicadoras que se han conjugado con anticuerpos incluyen enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas de fotoafinidad, partículas coloreadas o ligandos tales como biotina. Puede emplearse cualquier anticuerpo de suficiente selectividad, especificidad o afinidad como base para un conjugado de anticuerpo. Tales propiedades pueden evaluarse usando la metodología de cribado inmunitario convencional conocida por los expertos en la técnica. Los sitios de unión a moléculas biológicas activas en la molécula de anticuerpo, además de los sitios de unión de antígeno canónicos, incluyen sitios que residen en el dominio variable que pueden unirse a patógenos, superantígenos de células B, el correceptor de células T CD4 y la envoltura del VIH-1 (Sasso et al., 1989; Shorki et al., 1991; Silvermann et al., 1995; Cleary et al., 1994; Lenert et al., 1990; Berberian et al., 1993; Kreier et al., 1991). Además, el dominio variable está implicado en la autounión de anticuerpos (Kang et al., 1988), y contiene epítopos (idiotopos) reconocidos por antianticuerpos (Kohler et al., 1989). Determinados ejemplos de conjugados de anticuerpo son aquellos conjugados en los que el anticuerpo está unido a un marcador detectable. Los “marcadores detectables” son compuestos y/o elementos que pueden detectarse debido a sus propiedades funcionales específicas y/o características químicas, cuyo uso permite detectar el anticuerpo al que están unidos y/o cuantificarlo de manera adicional si se desea. Otro ejemplo de este tipo es la formación de un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un agente citotóxico o anticelular, y pueden denominarse “inmunotoxinas”.

Generalmente, se prefieren los conjugados de anticuerpo para su uso como agentes de diagnóstico. Los diagnósticos con anticuerpos se dividen generalmente en dos clases, aquellos para su uso en diagnósticos in vitro, tales como en una variedad de inmunoensayos, y/o aquellos para su uso protocolos de diagnóstico in vivo, conocidos generalmente como “obtención de imágenes dirigida por anticuerpos”.

Se conocen en la técnica muchos agentes de obtención de imágenes apropiados, al igual que los métodos para su unión a anticuerpos (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.021.236; 4.938.948; y 4.472.509). Los restos de obtención de imágenes usados pueden ser iones paramagnéticos; isótopos radiactivos; fluorocromos; sustancias detectables por RMN; obtención de imágenes por rayos X.

En el caso de los iones paramagnéticos, pueden mencionarse a modo de ejemplo iones tales como cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y/o erbio (III), siendo particularmente preferido el gadolinio. Los iones útiles en otros contextos, tales como la obtención de imágenes por rayos X, incluyen, pero no se limitan a, lantano (III), oro (III), plomo (II) y especialmente bismuto (III).

En el caso de los isótopos radiactivos para aplicaciones terapéuticas y/o de diagnóstico, podrían mencionarse el astato211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, galio67, 3hidrógeno, yodo123, yodo125, yodo131, indio111, 59hierro, 32fósforo, renio186, renio188, 75selenio, 35azufre, tecnecio99m y/o itrio90. A menudo se prefiere el uso de 125I en determinadas aplicaciones, y a menudo también se prefieren el tecnecio99m y/o el indio111 debido a su baja energía e idoneidad para la detección de largo alcance. Los anticuerpos monoclonales marcados radiactivamente tal como se describen en el presente documento pueden producirse según métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden yodarse por contacto con yoduro de sodio y/o potasio y un agente oxidante químico tal como hipoclorito de sodio, o un agente oxidante enzimático tal como lactoperoxidasa. Los anticuerpos monoclonales tal como se describen en el presente documento pueden marcarse con tecnecio99m mediante un procedimiento de intercambio de ligandos, por ejemplo, reduciendo el pertecnato con disolución estannosa, quelando el tecnecio reducido en una columna de Sephadex y aplicando el anticuerpo a esta columna. Alternativamente, pueden usarse técnicas de mareaje directo, por ejemplo, incubando pertecnato, un agente reductor tal como el SNCh, una disolución tampón tal como una disolución de ftalato de sodio-potasio y el anticuerpo. Los grupos funcionales intermedios que se usan a menudo para unir radioisótopos que existen como iones metálicos al anticuerpo son el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Entre los marcadores fluorescentes contemplados para su uso como conjugados se incluyen Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, azul cascada, Cy3, Cy5,6-FAM, isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6-JOE, verde Oregón 488, verde Oregón 500, verde Oregón 514, azul Pacífico, REG, verde rodamina, rojo rodamina, renografina, ROX, TAMRA, TET, tetrametilrodamina y/o rojo Texas.

Otro tipo de conjugados de anticuerpo contemplados en el presente documento son los destinados principalmente a su uso in vitro, donde el anticuerpo se une a un ligando de unión secundario y/o a una enzima (una etiqueta de enzima) que generará un producto coloreado al entrar en contacto con un sustrato cromogénico. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de hidrógeno (rábano picante) o glucosa oxidasa. Los ligandos de unión secundarios preferidos son compuestos de biotina y/o avidina y estreptavidina. Los expertos en la técnica conocen bien el uso de tales marcadores, y se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241.

Otro método conocido de unión específica de sitio de moléculas a anticuerpos comprende la reacción de anticuerpos con marcadores de afinidad basados en hapteno. Esencialmente, los marcadores de afinidad basados en hapteno reaccionan con los aminoácidos en el sitio de unión al antígeno, destruyendo así este sitio y bloqueando la reacción del antígeno específico. Sin embargo, esto puede no ser ventajoso ya que da como resultado una pérdida de unión al antígeno por el conjugado de anticuerpo.

Las moléculas que contienen grupos azido también pueden usarse para formar enlaces covalentes con proteínas a través de productos intermedios de nitreno reactivos que se generan mediante luz ultravioleta de baja intensidad (Potter y Haley, 1983). En particular, los análogos 2 y 8-azido de nucleótidos de purina se han usado como fotosondas dirigidas al sitio para identificar proteínas de unión a nucleótidos en extractos celulares en bruto (Owens y Haley, 1987; Atherton et al., 1985). Los 2 y 8-azido nucleótidos también se han usado para mapear dominios de unión a nucleótidos de proteínas purificadas (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; y Dholakia et al., 1989) y pueden usarse como agentes de unión de anticuerpos.

Se conocen varios métodos en la técnica para la unión o conjugación de un anticuerpo a su resto conjugado. Algunos métodos de unión implican el uso de un complejo de quelato metálico que emplea, por ejemplo, un agente quelante orgánico tal como anhídrido del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA); ácido etilentriaminotetraacético; N-cloro-p-toluenosulfonamida; y/o tetracloro-3a-6a-difenilglicouril-3 unido al anticuerpo (patentes estadounidenses n.os 4.472.509 y 4.938.948). Los anticuerpos monoclonales también pueden reaccionar con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento tal como glutaraldehído o peryodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de acoplamiento o por reacción con un isotiocianato. En la patente estadounidense n.° 4.938.948, la obtención de imágenes de tumores de mama se consigue usando anticuerpos monoclonales y los restos de obtención de imágenes detectables se unen al anticuerpo usando ligadores tales como p-hidroxibencimidato de metilo o 3-(4-hidroxifenil)propionato de N-succinimidilo.

También se contempla la derivatización de inmunoglobulinas mediante la introducción selectiva de grupos sulfhidrilo en la región Fc de una inmunoglobulina, usando condiciones de reacción que no alteran el sitio de combinación del anticuerpo. Se describe que los conjugados de anticuerpo producidos según esta metodología presentan una longevidad, especificidad y sensibilidad mejoradas (patente estadounidense n.° 5.196.066). También se ha dado a conocer en la bibliografía la unión específica del sitio de moléculas efectoras o indicadoras, donde la molécula indicadora o efectora se conjuga con un residuo de hidrato de carbono en la región Fc (O'Shannessy et al., 1987). Se ha notificado que este enfoque produce anticuerpos diagnóstica y terapéuticamente prometedores que se encuentran actualmente en evaluación clínica.

Los anticuerpos anti-(péptido SLC45A2) o los anticuerpos anti-(péptido SLC45A2-HLA-A2) pueden unirse a nanocristales semiconductores tales como los descritos en las patentes estadounidenses n.os 6.048.616; 5.990.479; 5.690.807; 5.505.928; 5.262.357; así como la publicación PCT n.° 99/26299 (publicada el 27 de mayo de 1999). En particular, los materiales a modo de ejemplo para su uso como nanocristales semiconductores en los ensayos biológicos y químicos dados a conocer en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, los descritos anteriormente, incluyendo los semiconductores del grupo II-VI, III-V y del grupo IV, tales como ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb, AlS, AlP, AlSb, PbS, PbSe, Ge y Si, y mezclas ternarias y cuaternarias de los mismos. Los métodos para unir nanocristales semiconductores a anticuerpos se describen en las patentes estadounidenses n.os 6.630.307 y 6.274.323.

También se dan a conocer métodos de inmunodetección para unir, purificar, eliminar, cuantificar y/o detectar generalmente de otro modo componentes biológicos tales como células T que se unen a o reconocen de manera selectiva un péptido SLC45A2 o un complejo péptido SLC45A2-HLA-A2. Puede usarse un ensayo de tetrámeros según la presente divulgación. Los ensayos de tetrámeros implican generalmente la generación de tetrámeros de péptido-CMH solubles que pueden unirse a linfocitos T específicos de antígeno, y se describen métodos para los ensayos con tetrámeros, por ejemplo, en Altman et al. (1996). Algunos métodos de inmunodetección que pueden usarse incluyen, por ejemplo, ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunorradiométrico, fluoroinmunoensayo, ensayo quimioluminiscente, ensayo bioluminiscente, ensayo con tetrámeros e inmnotransferencia de tipo Western. Las etapas de diversos métodos de inmunodetección útiles se han descrito en la bibliografía científica, tales como, por ejemplo, Doolittle y Ben-Zeev, 1999; Gulbis y Galand, 1993; De Jager et al., 1993; y Nakamura et al., 1987.

IV. PREPARACIONES FARMACÉUTICAS

Se contempla que un péptido SLC45A2 tal como se describe en el presente documento puede estar comprendido en una composición de vacuna y administrarse a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica en el sujeto hacia un cáncer, tal como un melanoma, que expresa SLC45A2. Una composición de vacuna para uso farmacéutico en un sujeto puede comprender una composición de péptido SLC45A2 dada a conocer en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. Alternativamente, puede incluirse un anticuerpo que se une de manera selectiva a un complejo péptido SLC45A2-HLA-A2 en un portador farmacéuticamente aceptable.

Las expresiones “farmacéutica”, “farmacéuticamente aceptable” o “farmacológicamente aceptable” se refieren a composiciones y entidades moleculares que no producen una reacción adversa, alérgica u otra desfavorable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. Tal como se usa en el presente documento, “portador farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizadores de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de disgregración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, tal como conocería un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Pharmaceutical Press, 2011). Excepto en la medida en que cualquier portador convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones de vacuna tal como se describen en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, una “respuesta inmunitaria protectora” se refiere a una respuesta por parte del sistema inmunitario de un huésped mamífero a un cáncer. Una respuesta inmunitaria protectora puede proporcionar un efecto terapéutico para el tratamiento de un cáncer, por ejemplo, disminución del tamaño del tumor, aumento de la supervivencia, etc.

Una composición de vacuna tal como se describe en el presente documento puede comprender un péptido SLC45A2, un anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A2) o un anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A24) tal como se describen en el presente documento. Los péptidos SLC45A2 que se incluirán en una preparación farmacéutica pueden unirse de manera selectiva a HLA-A2 o HLA-A24. Puede usarse una composición de vacuna que comprende un péptido SLC45A2 o un anticuerpo que se une de manera selectiva a un complejo péptido SLC45A2-HLA-A2 o un complejo péptido SLC45A2-HLA-A24 para inducir una respuesta inmunitaria protectora contra un cáncer que expresa SLC45A2.

Un experto habitual en las técnicas médicas apreciará que la cantidad de dosificación real de una composición de vacuna administrada a un paciente animal o humano puede determinarse por factores físicos y fisiológicos tales como el peso corporal, la gravedad del estado, el tipo de enfermedad que está tratándose, intervenciones terapéuticas previas o concurrentes, la idiopatía del paciente y la vía de administración. El médico responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los principio(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual.

Las composiciones de vacuna pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente el 0,1% de un péptido SLC45A2, anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A2) o anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A24). El compuesto activo también puede comprender entre aproximadamente el 2% y aproximadamente el 75% del peso de la unidad, o entre aproximadamente el 25% y aproximadamente el 60%, por ejemplo, y cualquier intervalo que se derive de los mismos. Como ocurre con muchas composiciones de vacuna, un experto en la técnica de la inmunología variará la frecuencia de administración, así como la dosificación, entre los miembros de una población de animales o seres humanos de maneras predecibles. A modo de ejemplo no limitativo, las composiciones farmacéuticas y las vacunas pueden administrarse mediante inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía intranasal (por ejemplo, por aspiración) o por vía oral. Pueden administrarse entre 1 y 3 dosis durante un periodo de 1-36 semanas. Preferiblemente, se administran 3 dosis, a intervalos de 3-4 meses, y posteriormente pueden administrarse vacunas de refuerzo periódicamente.

Una “dosis adecuada” es una cantidad de un péptido SLC45A2, anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A2) o anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A24) que, cuando se administra tal como se describió anteriormente, puede provocar una respuesta inmunitaria en un paciente inmunizado contra un cáncer. En general, la cantidad de péptido presente en una dosis adecuada (o producida in situ por el ácido nucleico en una dosis) puede oscilar entre aproximadamente 0,01 y 100 mg por kg de huésped, entre aproximadamente 0,01-100 mg, preferiblemente entre aproximadamente 0,05-50 mg y de manera más preferible entre aproximadamente 0,1-10 mg. Puede administrarse un péptido SLC45A2 en una dosis de desde aproximadamente 0,25 mg hasta aproximadamente 1 mg por cada dosis de vacuna.

Una composición de vacuna tal como se describe en el presente documento puede comprender diferentes tipos de portadores dependiendo de si va a administrarse en forma sólida, líquida o de aerosol, y si es necesario que sea estéril para vías de administración tales como inyección. Una composición de vacuna dada a conocer en el presente documento puede administrarse por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, vía través de la mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, local y por inhalación, inyección, infusión, infusión continua, lavado y perfusión localizada. También puede administrarse una composición de vacuna a un sujeto a través de un catéter, en cremas, en composiciones lipídicas, por suministro de material particulado balístico, o por otro método o cualquier combinación de los anteriores tal como conocería por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición. Lippincott Williams and Wilkins, 2005).

Si bien puede emplearse cualquier portador adecuado conocido por los expertos habituales en la técnica en las composiciones farmacéuticas tal como se describen en el presente documento, el tipo de portador variará dependiendo del modo de administración. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el portador comprende preferiblemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, puede emplearse cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También pueden emplearse microesferas biodegradables (por ejemplo, galactida poliláctica) como potadores para las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Se dan a conocer microesferas biodegradables adecuadas, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 4.897.268 y 5.075.109.

La composición de vacuna puede administrarse mediante suministro de material particulado balístico o transdérmico microestructurado. Las microestructuras como portadores para la formulación de vacuna son una configuración deseable para aplicaciones de vacuna y son ampliamente conocidas en la técnica (Gerstel y Place 1976 (patente estadounidense 3.964.482); Ganderton y McAinsh 1974 (patente estadounidense 3.814.097); patentes estadounidenses 5.797.898, 5.770.219 y 5.783.208, y solicitud de patente estadounidense 2005/0065463). Una composición de vacuna de este tipo formulada para el suministro de material particulado balístico puede comprender un péptido SLC45A2 aislado dado a conocer en el presente documento inmovilizado sobre una superficie de un sustrato de soporte. Un sustrato de soporte puede incluir, pero no se limita a, una microcápsula, una micropartícula, una microesfera, una nanocápsula, una nanopartícula, una nanoesfera o una combinación de las mismas.

Las microestructuras o los materiales particulados balísticos que sirven como sustrato de soporte para un péptido SLC45A2, anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A2) o anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A24) dados a conocer en el presente documento pueden estar compuestos por material biodegradable y material no biodegradable, y tales sustratos de soporte pueden estar compuestos por polímeros sintéticos, sílice, lípidos, hidratos de carbono, proteínas, lectinas, agentes iónicos, agentes reticulantes y otros componentes de microestructura disponibles en la técnica. Los protocolos y reactivos para la inmovilización de un péptido descrito en el presente documento en un sustrato de soporte compuesto por tales materiales están ampliamente disponibles comercialmente y en la técnica.

Una composición de vacuna también puede comprender un péptido SLC45A2, anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A2) o anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A24) dado a conocer en el presente documento inmovilizado o encapsulado y un sustrato de soporte. Un sustrato de soporte puede incluir, pero no se limita a, una microesfera lipídica, una nanopartícula lipídica, un etosoma, un liposoma, un niosoma, un fosfolípido, un esfingosoma, un tensioactivo, un transferosoma, una emulsión o una combinación de los mismos. La formación y el uso de liposomas y otras formulaciones de nanoportadores y microportadores lipídicos son generalmente conocidos por los expertos habituales en la técnica, y el uso de liposomas, micropartículas, nanocápsulas y similares ha ganado un uso generalizado en la administración de agentes terapéuticos (por ejemplo, patente estadounidense 5.741.516). Se han revisado numerosos métodos de preparaciones de liposomas y similares a liposomas como posibles portadores de fármacos, incluyendo la encapsulación de péptidos (patentes estadounidenses 5.567.434; 5.552.157; 5.565.213; 5.738.868 y 5.795.587).

Además de los métodos de administración descritos en el presente documento, también se contemplan varias técnicas alternativas para administrar las composiciones de vacuna dadas a conocer. A modo de ejemplo no limitativo, puede administrarse una composición de vacuna por sonoforesis (es decir, ultrasonidos) que se ha usado y descrito en la patente estadounidense 5.656.016 para potenciar la velocidad y la eficacia de la penetración del fármaco en y a través del aparato circulatorio; inyección intraósea (patente estadounidense 5.779.708) o administración controlada por retroalimentación (patente estadounidense 5.697.899).

Puede emplearse cualquiera de una variedad de adyuvantes en las vacunas tal como se describen en el presente documento para potenciar de manera inespecífica la respuesta inmunitaria. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador inespecífico de las respuestas inmunitarias, tal como lípido A, Bortadella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvantes adecuados están disponibles comercialmente como, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) y Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.). Otros adyuvantes adecuados incluyen alumbre, microesferas biodegradables, monofosforil lípido A y Quil-A.

Un péptido puede formularse en una composición en forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

En cualquier caso, la composición puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Además, la prevención de la acción de los microorganismos puede provocarse mediante conservantes tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, incluyendo, pero sin limitarse a, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los péptidos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros componentes. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son técnicas de secado a vacío o liofilización que producen un polvo del principio activo más cualquier componente adicional deseado a partir de un medio líquido previamente esterilizado por filtración del mismo. El medio líquido debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido debe volverse isotónico en primer lugar antes de la inyección con suficiente solución salina o glucosa. También se contempla la preparación de composiciones altamente concentradas para inyección directa, donde se prevé que el uso de DMSO como disolvente dé como resultado una penetración extremadamente rápida, administrando altas concentraciones de los agentes activos a un área pequeña.

La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas debe mantenerse mínimamente a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína.

La absorción prolongada de una composición inyectable puede provocarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.

A. Kits de detección y vacunación

Puede incluirse en un kit un péptido SLC45A2, un anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A2), un anticuerpo anti-(complejo péptido SLC45A2-HLA-A24) o un anticuerpo anti-péptido SLC45A2 tal como se describen en el presente documento. El anticuerpo o péptido SLC45A2 en el kit puede marcarse de manera detectable o inmovilizarse sobre una superficie de un sustrato de soporte también comprendido en el kit. El/los anticuerpo(s) o péptido(s) SLC45A2 puede(n) proporcionarse en el kit, por ejemplo, en una forma adecuada, tal como estériles, liofilizados o ambos.

El sustrato de soporte comprendido en un kit tal como se describe en el presente documento puede seleccionarse basándose en el método a realizar. A modo de ejemplo no limitativo, un sustrato de soporte puede ser una placa o microplaca de múltiples pocillos, una membrana, un filtro, un papel, una emulsión, una perla, una microperla, una microesfera, una nanoperla, una nanoesfera, una nanopartícula, un etosoma, un liposoma, un niosoma, un transferosoma, una tira reactiva, una tarjeta, una tira de celuloide, un portaobjetos de vidrio, un microportaobjetos, un biosensor, un aparato de flujo lateral, un microchip, un panal, una partícula de sílice, una partícula magnética o una monocapa autoensamblante.

Según sea apropiado para el método que esté realizándose, un kit puede comprender además uno o más aparatos para administrar una composición a un sujeto o para manipular de otro modo una composición tal como se describe en el presente documento. A modo de ejemplo no limitativo, un kit puede incluir un aparato que es una jeringa, un gotero, un aplicador de partículas balísticas (por ejemplo, los aplicadores dados a conocer en las patentes estadounidenses 5.797.898, 5.770.219 y 5.783.208, y la solicitud de patente estadounidense 2005/0065463), una Scoopula, una cubierta de microportaobjetos, un soporte o cubierta para tiras reactivas, etc.

Un reactivo de detección para marcar un componente del kit puede estar comprendido opcionalmente en un kit para realizar un método tal como se describe en el presente documento. El reactivo de marcaje o detección puede seleccionarse de un grupo que comprende reactivos usados habitualmente en la técnica y que incluyen, sin limitación, elementos radiactivos, enzimas, moléculas que absorben luz en el intervalo UV y fluoróforos tales como fluoresceína, rodamina, auramina, rojo Texas, azul AMCA y amarillo Lucifer. Además, se proporciona un kit que comprende uno o más recipientes y un agente proteico BST ya marcado con un reactivo de detección seleccionado de un grupo que comprende un elemento radiactivo, una enzima, una molécula que absorbe luz en el intervalo UV y un fluoróforo.

Cuando los reactivos y/o componentes que comprende un kit se proporcionan en forma liofilizada (liofilizado) o como un polvo seco, el liofilizado o el polvo pueden reconstituirse mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente puede ser un tampón farmacéuticamente aceptable estéril y/u otro diluyente. Se prevé que un disolvente de este tipo también pueda proporcionarse como parte de un kit.

Cuando los componentes de un kit se proporcionan en una y/o más disoluciones líquidas, la disolución líquida puede ser, a modo de ejemplo no limitativo, una disolución acuosa estéril. Las composiciones también pueden formularse en una composición administrativa. En este caso, el propio recipiente puede ser una jeringa, una pipeta, un aplicador tópico o similares, a partir del cual puede aplicarse la formulación a un área afectada del cuerpo, inyectarse en un sujeto y/o aplicarse o mezclarse con los demás componentes del kit.

V. EJEMPLOS

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Donantes, líneas celulares y anticuerpos

Se obtuvieron muestras de sangre periférica (PB) de donantes sanos con HLA A*0201 y HLA A*2402.

Se mantuvieron las líneas celulares de melanoma en RPMI1640 con L-glutamina 4 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM, piruvato de sodio 10 mM y penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 mg/ml y FBS al 10% (TCB). Se cultivaron melanomas uveales con RPMI1640 que incluía FBS al 10%, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 mg/ml. Se usó LCL como células alimentadoras y se cultivaron con RPMI1640 que contenía FBS al 10%, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 mg/ml. Los medios CTL para cultivo de células T contenían FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, pmercaptoetanol, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 mg/ml.

Inmunoprecipitación de HLA y detección de péptidos unidos mediante espectrometría de masas en tándem

Se eluyeron directamente los péptidos asociados a tumor de moléculas de HLA de clase I aisladas de muestras de tejido tumoral o líneas de células tumorales recién extraídas. Se cortaron en trozos pequeños las muestras de tumor (~250 mg) y se digirieron en un tampón de cóctel enzimático en medio RPMI1640 libre de suero hasta la digestión completa, luego se lavaron y se lisaron las células tumorales y se recogió el sobrenadante. Después de medir la concentración de proteína, se incubaron los lisados de células tumorales con anticuerpo W6/32 (específico para HLA-A, -B y -C) y luego se purificaron usando perlas de resina. Se eluyeron los péptidos unidos a HLA de clase I y se confirmó la presencia de HLA mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se analizaron las fracciones de elución positivas mediante espectrometría de masas, tal como se describe a continuación.

Para la espectrometría de masas en tándem (EM/EM) en la fase de descubrimiento, se inyectaron péptidos unidos a CMH de clase I eluidos en un sistema de HPLC de alta sensibilidad (Dionex 3000 RSLC), se separaron por cromatografía de fase inversa en agua-acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% en una columna C18 (Agilent Technologies) de 1,8 micrómetros y se analizaron en un espectrómetro de masas Orbitrap Elite (Thermo Scientific) mediante adquisición dependiente de datos. El algoritmo Mascot buscó espectros EM/EM adquiridos frente a la base de datos completa de proteínas humanas SwissProt usando tolerancia de masa original de 10 ppm, tolerancia a iones de fragmentos de 0,8 d, oxidación de Met, sin selectividad enzimática. Se cotejaron los resultados de la búsqueda con las especificidades de unión a CMH apropiadas usando NetMHC 3.4 [101].

Generación y expansión de células T CD8 específicas de SLC45A2

Se generaron CTL específicos de antígeno tumoral de la manera descrita anteriormente (Li 2005). Se estimularon PBMC de leucocitaféresis positivas para HLA-A*0201 mediante DC autólogas pulsadas con péptido de antígeno tumoral. Para la inducción de células dendríticas, se cultivaron PBMC adherentes con GMCSF e ^{i L - 4}en medio AIM-V (Invitrogen Life Technologies) durante 6 días y luego se añadieron IL1b, IL-6, TNF-a y PGE2 para la maduración. Después de 1 día, se pulsaron las DC maduras con 40 ug/ml de péptido a 2 x 106 células/ml de albúmina sérica humana (HAS) al 1%/PBS en presencia de 3 ug/ml de p2-microglubulina durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de lavar con HSA al 1%/PBS, se mezclaron las DC con las PBMC a 1,5 x 106 células/ml/pocillo en una placa de 48 pocillos. Se añadió inicialmente IL-21 (30 ng/ml) y 3~4 días después del cultivo. Se añadieron IL-2 e IL-7 1 día después de la estimulación secundaria para expandir las células T específicas activadas.

Seis días después de la estimulación secundaria, se tiñeron las células con tetrámero conjugado con péptido SLC45A2^382-390/CMH-PE y anticuerpo CD8-APC, y luego se clasificaron las células positivas para CD8 y tetrámero mediante ARIA II. Se expandieron las células T CD8 específicas de SLC45A2 clasificadas mediante el protocolo de expansión rápida (REP) con células alimentadoras de PBL y LCL con IL-21.

Tinción con tetrámero de péptido-CMH

Se confirmaron mediante tinción las células T CD8 específicas de SLC45A2 con tetrámero de complejo péptido SLC45A2^382-390/CMH para HLA A*0201 o complejo péptido SLC45A2^393-402/CMH para HLA A*2402. Se incubaron las células T CD8 con tetrámero conjugado con PE durante 20 minutos, se lavaron y luego se tiñeron con anticuerpo CD8 conjugado con APC durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, se analizaron las células mediante citometría de flujo (analizador LSRFortessa X-20). Los tetrámeros de HLA-A*A0201 y HLA-A*A2402 que contienen SLSC45A2^{382 -390}y SLC45A2^393-402, respectivamente, fueron adquiridos del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson.

Análisis de repertorio de TCR de células T CD8 específicas de SLC45A2

Para evaluar el repertorio de TCR-V^p, se usó el kit de repertorio de TCR-V^pIOTest Beta Mark. Este kit incluye anticuerpos que cubren 24 antígenos de TCR-V^pde regiones TCR-V^py aproximadamente el 70% del repertorio de TCR-V^phumano normal: V^p1, V^p2, V^p3, V^p4, V^p5.1, V^p5.2, V^p5.3, V^p7.1, V^p7.2, V^p8, V^p9, V^p11, V^p12, V^p13.1, V^p13.2, V^p13.6, V^p14, V^p16, V^p17, V^p18, V^p20, V^p21.3, V^p22 y V^p23. Se conjugaron estos anticuerpos con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE). Cuando se realizó un ensayo de repertorio de TCR-V^p, se añadió aloficocianina (APC) anti-CD8.

Ensayo de liberación de 51cromo

Se analizaron las células T CD8 específicas de SLC45A2 para determinar la lisis específica de dianas que expresan o no SLC45A2 usando un ensayo de liberación de 51Cromo (51Cr) convencional. Se etiquetaron las dianas con 100 uCi de 51Cr durante 2 horas y, después de tres lavados, las dianas marcadas se sembraron en placa por pocillo en triplicado a 2000 dianas por pocillo. Se incubaron las células efectoras con dianas como razón efector:diana (E:T) diversas. Después de 4 horas, se recogieron 30 ul de sobrenadante de cada pocillo y se midió el 51Cr mediante un contador gamma. Se calculó el porcentaje de lisis específica.

Ensayo de unión a péptidos

Se incubaron células T CD8 específicas de SLC45A2, Mart-1 y g100 (1X105 células) con células T2 (4X104 células) preincubadas con péptido SLC45A2^382-390, M^27-35o G^154-162, respectivamente, a diversas concentraciones (100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0 nM). 48 horas después de la incubación, se midió la producción de IFN-y mediante un ensayo ELISA. RT-PCR y RT-PCR cuantitativa

Para el análisis de la expresión de ARNm del antígeno de diferenciación de melanocitos, se realizó RT-PCR. En resumen, se extrajo el ARN celular total mediante el procedimiento de guanidina-isotiocianato/cloruro de cesio. Se sintetizó ADNc a partir de 1 ug de ARN con kits de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad y se amplificó mediante 30 ciclos de PCR con cebadores específicos para SLC45A2, MART-1, gp100 y tirosinasa. Las secuencias de cebadores se enumeran en la tabla complementaria 1. La producción de PCR se realizó en un gel de agarosa al 2% y se visualizó mediante Gel Red.

Se realizó la PCR en tiempo real con cebadores de SLC45A2, MART-1, gp100 y tirosinasa usando la mezcla maestra de PCR Power Syber green (Applied biosystems life technologies). Se normalizaron los valores por la cantidad del gen que codifica para GAPDH.

Se trataron Mel526 y A375 (BRAF V600E+) y MeWo (BRAF silvestre) con inhibidor de BRAF V600E, dabrafenib (50 nM), o inhibidor de MEK, trametinib (50 nM) (GlaxoSmithKline), o ambos durante 48 horas. Se usaron los melanomas no tratados como control.

Análisis de RNAseq

Se realizó secuenciación de transcriptoma completo (RNAseq) por el Instituto Avera de Genética Humana en muestras tumorales usando el kit Illumina TruSeq Stranded Total RNA con Ribo-Zero Gold. Se usaron aproximadamente 200 millones de lecturas desde ambos extremos para cada muestra de ARN tumoral. Se procesaron los archivos BCL (salida sin procesar de Illumina HigSeq) con ISIS v2.4.60 para demultiplexar y convertir al formato FASTQ. Los archivos FASTQ y las lecturas de secuencia se alinearon con el genoma (Hg19) usando BWA usando parámetros adecuados para una ejecución específica (por ejemplo, 3 apareamientos erróneos con 2 en las primeras 40 regiones semilla para una ejecución de secuenciación de 51 bases). Luego, se sometieron los archivos BAM alineados a duplicación de marcas, realineación y recalibración usando los programas Picard y GATK antes de cualquier análisis posterior. Se procesaron los datos de RNAseq usando los algoritmos TopHat, TopHat-Fusion y Cufflinks.

Análisis estadístico

Se realizó el análisis de los datos usando GraphPad prism versión 6.0e. Se analizaron los datos normalmente distribuidos usando pruebas paramétricas (Anova o prueba de la t para datos independientes). Se consideraron significativas las diferencias de las pruebas estadísticas si los valores de p fueron <0,05.

Ejemplo 2

La expresión de SLC45A2 está muy restringida a melanomas

Se evaluó la expresión de SLC45A2 en diversas células de melanoma, incluyendo células de melanoma cutáneo, uveal y mucoso. Se analizó la expresión de ARNm de SLC45A2 en células tumorales de diversos tipos, incluyendo líneas celulares de melanoma, mediante RT-PCR (tabla 1). Se detectó ARNm de SLC45A2 en la mayoría de las células de melanoma, pero no en células tumorales de otros tipos (figuras 1A-C). También se examinó la expresión de SLC45A2 en células de melanoma metastásico que se originaron en diferentes sitios (tabla 2). 11 de las 16 células de melanoma metastásico sometidas a prueba expresaron ARNm de SLC45A2 (figura 1A). Se comparó la razón de expresión de SLC45A2 con la de otros antígenos de diferenciación de melanoma (MDA) tales como MART-1, gp100 y tirosinasa en diversas células de melanoma. Se encontró que los diferentes antígenos de diferenciación de melanoma mostraban una razón de expresión similar, 78,7-84,8% (tabla 3). La comparación de la expresión del gen MDA en melanomas y melanocitos primarios se muestra en las figuras 13A-B.

Tabla 1. Secuencias de cebadores para el gen MDA humano para RT-PCR.

Tabla 2. Expresión de SLC45A2 y tipo de HLA en células de melanoma.

Tabla 3. Comparación de la razón de expresión de MDA en líneas celulares de melanoma.

Se analizó la expresión génica relativa de SLC45A2 en tejidos normales y tejidos cancerosos usando los datos de los portales Genotype-Tissue Expression (GTEx) y The Cancer Genome Atlas (TCGA). La expresión del gen SLC45A2 no se detectó o se detectó a un nivel bajo en diversos tejidos normales (figura 8). Sin embargo, MART-1 y gp100 mostraron una expresión significativamente mayor en muchas muestras de tejido normal, particularmente piel normal. SLC45A2 mostró una alta expresión en tejidos de melanoma cutáneo y uveal junto con los otros MDA (figura 8). SLC45A2 se expresó en la mayoría de las células de melanoma cutáneo, incluyendo las células de melanoma metastásico, pero no en células tumorales de otros tipos, lo que indica que la expresión de SLC45A2 es específica de melanoma.

Ejemplo 3

identificación del epítopo de células T CD8 derivadas de SLC45A2 restringido a HLA A*0201 y A*2402

Se analizaron varias líneas celulares de melanoma derivadas de pacientes del MDACC y muestras de tumores de melanoma recién extraídas para determinar los péptidos unidos a HLA de clase I en superficie usando inmunoprecipitación de HLA-A,B,C, elución ácida y espectrometría de masas en tándem (EM/EM). Se detectaron seis péptidos diferentes derivados de SLC45A2 que se predice que se unen a 4 alelos de HLA diferentes a partir de múltiples muestras, lo que demuestra que constituyen antígenos asociados a tumores compartidos (tabla 4). En la tabla 5 se muestran evidencias adicionales de que estos péptidos se procesan y presentan de manera natural: se transdujeron las células de melanoma Mel888 con vectores lentivirales para expresar o bien HLA-A*0201, A*2402 o bien A*0301. Se realizó el análisis de inmunopeptidoma en células Mel888 parentales y transducidas tal como se describió anteriormente. De esta manera, también se detectaron 5 de los 6 péptidos identificados en la tabla 4 en las células transducidas, pero sólo si expresaban el alelo de HLA apropiado (tabla 5 y figura 2). Tal como se muestra, se confirmaron los péptidos novedosos SLC45A2382-390 (SLYSYFQKV; SEQ ID NO:1) y SLC45A2393-402 (SYIGLKGLYF, SEQ ID NO:2) mediante elución de Mel888 transducidas con HLA A*0201 o A*2402 usando análisis de EM.

Tabla 4. Péptidos derivados de SLC45A2 detectados mediante análisis de espectrometría de masas de líneas celulares de melanoma.

Tabla 5. Confirmación de procesamiento de péptidos naturales y presentación mediante transducción de HLA.

La puntuación Ion del péptido detectado se enumera en el lado izquierdo de la tabla a continuación de la línea celular de melanoma SLC45A2 transducida con HLA específica. En la tabla, “-"indica que no se detectó el péptido.

Ejemplo 4

Inducción células T CD8 específicas de SLC45A2

Se generaron células T CD8 específicas de SLC45A2 estimulando PBMC autólogas positivas para HLA-A*0201 o A*2402 con células dendríticas (DC) pulsadas con péptido SLC45A2382-390 o SLC45A2393-402 tratadas con IL-21. Según el programa temporal representado en la figura 3A, las PBMC restringidas a HLA-A*0201 y A*2402 se estimularon mediante DC pulsadas con péptido SLC45A2382-390 y SLC45A2393-402, respectivamente, tratadas con IL-21. Después de una estimulación secundaria, se indujeron células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2 a una frecuencia de aproximadamente el 2-25% de la población activada por linfocitos y el 6,68-30% de la población activada por CD8 (panel superior de la figura 3B). Se clasificaron las células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2 y se expandieron mediante el protocolo de expansión rápida (REP). Después del REP, la frecuencia de la población positiva para el tetrámero de SLC45A2 fue del 91-99% de la población activada por linfocitos y del 97-99% de la población activada por CD8 (panel central de la figura 3B). Las células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2 apenas se observaron en estas PBMC de donantes sanos. Las células T CD8 específicas de SLC45A2 también se indujeron con éxito a partir de PBMC de otros dos donantes sanos restringidos a HLA A*0201 o A*2402 (figura 10).

Para investigar la clonalidad de las células T CD8 específicas de SLC45A2, se analizó el repertorio de TCR-Vp usando anticuerpos Vp correspondientes a 24 especificidades diferentes. La cadena Vp de las células T CD8 específicas de SLC45A2 inducidas de cada donante incluía Vp3, Vp14, Vp18, Vp21.3 y Vp23 (panel inferior de la figura 3B, figura 10). Las células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2, clasificadas de un solo pocillo y expandidas mediante REP, mostraron una población principal de Vp con un intervalo del 92-99%.

Para el análisis del fenotipo de las células T CD8 específicas de SLC45A2 inducidas, se sometió a prueba la expresión de CD45RA, CCR7, CD62L y CD28 en células T CD8 positivas para el tetrámero de SLC45A2 mediante citometría de flujo. Las células T CD8 específicas de SLC45A2 no expresaron CD45RA, CCR7 ni CD62L, pero sí expresaron CD28, lo que sugiere que tienen un fenotipo similar a las células T de memoria efectora (figura 3C). Ejemplo 5

Reconocimiento específico de antígeno y función de las células T CD8 específicas de SLC45A2

Para determinar la capacidad de las células T CD8 específicas de SLC45A2 para reconocer y destruir las células de melanoma que expresan SLC45A2, se realizó un ensayo de liberación de 51Cr convencional usando líneas celulares de melanoma que expresan SLC45A2 en diversas razones E:T. Se usaron células Mel526, Mel624, FM6 y MeWo como dianas, que expresan tanto SLC45A2 como HLA A*0201 (tabla 2). Se encontró que las células T CD8 específicas de SLC45A2 destruían eficazmente las diversas líneas celulares de melanoma (figura 4A). Esto mostró que las células T CD8 específicas de SLC45A2 podían reconocer el epítopo de SLC45A2 SLYSYFQKV (SEQ ID NO:1) procesado de manera endógena por células de melanoma. Como controles, las células de melanoma HLA-A*0201 negativas para la expresión de SLC45A2 (A375) y las células de melanoma que expresaban SLC45A2 pero eran negativas para HLA-A*0201 (Mel888) no se lisaron por células T CD8 específicas de SLC45A2. La transducción de células Mel888 con HLA-A*0201 hizo que las células fueran susceptibles de lisis por células T CD8 específicas de SLC45A2, lo que indica que las células T CD8 específicas de SLC45A2 tienen una respuesta restringida a HLA-A*0201. También se examinó la actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 contra células de melanoma metastásico derivadas de diferentes tejidos. Todas las células de melanoma metastásico que se usaron en este estudio fueron positivas para HLA-A*0201.

Además, se encontró que las células T específicas para el epítopo restringido a HLA-A*2402 SYIGLKGLYF (SEQ ID NO:2) lisaron un panel de líneas celulares de melanoma que expresan HLA-A*2402: Similar a las células T restringidas a ^{H l A - A * 0 2 0 1 ,}las células T restringidas a A*2402 lisaron eficazmente células Mel888, Mel2381, Mel2508, Mel2400, Mel2412 y Mel2559 que expresan la proteína SLC45A2; sin embargo, las células Mel2461 y Mel2333 positivas para A*2402 que no expresaban la proteína SLC45A2 no se lisaron (figura 4B).

Ejemplo 6

Avidez funcional de CTL específicos de SLC45A2

Para evaluar la avidez funcional para el reconocimiento de dianas de las células T CD8 específicas de SLC45A2, se examinó la capacidad de los CTL específicos de SLC45A2 para producir IFN-y en presencia de células T2 preincubadas con péptido SLC45A2382-390 (SLYSYFQKV, SEQ ID NO:1) a diversas concentraciones usando un ensayo ELISA. Se usaron células T2 preincubadas con péptidos de control de unión a HLA-A*0201 MART-^127-35(AAGIGILTV, SEQ ID NO:17) y gp100-,54-162 (KTWGQYWQV, SEQ ID NO:18) para confirmar una respuesta específica de péptido de las células T CD8 específicas de SLC45A2. Se comparó la capacidad de unión de los péptidos respectivos entre CTL específicos de SLC45A2, MART-1 y gp100 (figura 4C). Curiosamente, las células T CD8 específicas de SLC45A2 fueron capaces de producir una alta producción de IFN-y en respuesta a las células T2 pulsadas con péptidos tan bajo como 0,1 ug/ml y mostraron una producción disminuida de IFN-gamma a una concentración de péptido de 0,01 ug/ml (panel superior de la figura 4C). La producción de IFN-y por las células T CD8 específicas de MART-1 fue significativamente menor que la producción de IFN-y por las células T CD8 específicas de SLC45A2 a las mismas concentraciones de péptido (panel inferior de la figura 4C). Además, la afinidad de unión de las células T CD8 específicas de gp100 fue similar a la afinidad de unión de las células T CD8 específicas de SLC45A2. Estos datos sugieren que las células T CD8 específicas de SLC45A2 podrían responder con una alta afinidad a las dianas que expresan SLC45A2. Estos resultados son consistentes con las afinidades de unión a HLA predichas de los péptidos SLC45A2, gp100 y MART-1 para HLA-A*0201, que son de 7 nM, 9 nM y 2498 nM, respectivamente.

Ejemplo 7

Baja expresión de SLC45A2 y baja actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 hacia melanocitos Dado que SLC45A2 es una proteína de diferenciación de melanocitos, se investigó la expresión de SLC45A2 en melanocitos normales y se determinó la actividad citotóxica de células T CD8 específicas de SLC45A2 contra melanocitos normales. Se aislaron melanocitos epidérmicos humanos, 3C0661 y 4C0197, de piel neonatal ligeramente pigmentada. 3C0661 expresó tanto HLA A*0201 como A*2402 y 4C0197 fue positivo para HlA A*0201 y negativo para A*2402 (figura 11). Tal como se muestra en la figura 5A, estos melanocitos expresaron SLC45A2, pero la expresión fue significativamente menor en los melanocitos en comparación con las células de melanoma. Sin embargo, otras proteínas de diferenciación de melanocitos tales como MART-1, gp100 y tirosinasa se expresaron en melanocitos a un nivel similar a su expresión en células de melanoma (figura 5A). Además, se compararon los niveles de expresión de ARN de SLC45A2, MART-1, gp100 y tirosinasa entre melanocitos y células de melanoma usando secuenciación de ARN y datos de TCGA. Se encontró que la expresión de SLC45A2 fue menor en melanocitos en comparación con melanoma, mientras que la expresión de MART-1 y gp100 en melanocitos fue significativamente mayor y similar a su expresión en células de melanoma (tabla 6).

Tabla 6. Expresión de antígeno de diferenciación de melanocitos en melanomas y tejidos normales.

Tejido

normal de

Gtex

Líneas

celulares

Tumores de

TCGA

Se investigó la citotoxicidad de las células T CD8 específicas de SLC45A2, MART-1 y gp100 contra melanocitos primarios derivados de 2 donantes sanos positivos para HLA-A*0201. Las células T CD8 específicas de MART-1 y gp100 mostraron el 35-42% y el 55-65% de citotoxicidad contra los melanocitos, respectivamente, pero sorprendentemente, las células T CD8 específicas de SLC45A2 mostraron menos del 8% de citotoxicidad contra los mismos melanocitos (figura 5B). Además, las células T CD8 específicas de SLC45A2 generadas a partir de otros donantes sanos también tenían una baja toxicidad contra los melanocitos (figuras 12A-B). Además, se encontró que las células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a HLA A*2402 no eran citotóxicas contra los melanocitos positivos para A*2402, 3C0661 (figura 5C). Estos resultados sugieren que, a diferencia de otros MDA tales como MART-1 y gp100, las células T CD8 específicas de SLC45A2 pueden destruir eficazmente las células de melanoma sin destruir los melanocitos normales.

Ejemplo 8

Expresión SLC45A2 y citotoxicidad de células T CD8 específicas de SLC45A2 contra células de melanoma uveal y mucoso

Se derivaron células de melanoma uveal 202, 92.1, UPMD1 y UPMD2 de tumores primarios y se derivaron células OMM1 de un tumor metastásico. Todas las células de melanoma uveal que se usaron en este estudio expresaron ARNm de SLC45A2 (figura 6A).

Se investigó la citotoxicidad de células T CD8 específicas de SLC45A2 contra células de melanoma uveal. Se observó que las células OMM1 y las células 202 positivas para SLC45A2 eran destruidas por células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a HLA A*0201 (figura 6B). A continuación, se examinó la citoxicidad de células T CD8 específicas de MART-1 y gp100 contra melanomas uveales. Las células T CD8 específicas de MART-1 mostraron menos citotoxicidad para células de melanoma uveal que las células T CD8 específicas de SLC45A2 y gp100. Las células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a A*2402 destruyeron las células UPMD2 que expresan SLC45A2 y HLA A*2402. Cuando se pulsaron las células UPMD2 con péptido restringido a A*2402, SLC45A2s93-4ü2, se aumentó la citotoxicidad de las células T CD8 específicas de SLC45A2. Las células UPMD1 positivas para SLC45A2 pero negativas para HLA A*2402 no se lisaron por la células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a A*2402 (figura 6C).

En melanoma mucoso, se sometió a prueba la expresión y citotoxicidad de SLC45A2 por células T CD8 específicas de SLC45A2. Las células de melanoma mucoso expresaron SLC45A2 a niveles similares a la expresión de otros MDA (figura 6D). Las células T CD8 específicas de SLC45A2 restringidas a A*0201 lisaron células de melanoma mucoso 2170 que expresan SLC45A2 y HLA A*0201, pero no células 2042 que expresan SLC45A2 y no HLA A*0201 (figura 6E). La actividad citotóxica contra células de melanoma mucoso era similar entre las células T CD8 específicas deSLC45A2, MART-1 ygp100. Estos resultados indican que las células T CD8 específicas de SLC45A2 pueden destruir de manera eficaz las células de melanoma uveal y las células de melanoma mucoso que expresan SLC45A2 y el tipo de HLA apropiado.

Ejemplo 9

Expresión de SLC45A2 potenciada y destrucción de células de melanoma tras el tratamiento con inhibidores de la ruta de MAPK

Al igual que otras proteínas de diferenciación de melanocitos tales como MART-1, gp100 y tirosinasa, el gen SLC45A2 está regulado por el factor de transcripción MITF (J Biol Chem, 2002, 277:402-406., Gen Soci Ame, 2008 178:761-769). Los niveles de proteína MITF son suprimidos por BRAF oncogénico a través de la fosforilación y degradación mediadas por ERK (J Cell Biol, 2005, 170:703-708). Por tanto, se investigó a continuación si los inhibidores de BRAF o MEK pueden modular la expresión de SLC45A2. Se trataron las células de melanoma con un inhibidor específico de BRAF V600E, dabrafenib (50 nM), o un inhibidor de MEK, trametinib (50 nM), o ambos durante 48 horas y se analizó la expresión de ARNm de SLC45A2 y MART-1 mediante RT-PCR. Tal como se muestra en la figura 7A, se observó un aumento significativo de SLC45A2 y MART-1 en las células Mel526 (que expresan BRAF V600E mutado) después del tratamiento con inhibidores de BRAF o MEK, mientras que las células MeWo (que expresan BRAF silvestre) no mostraron una expresión aumentada de SLC45A2 y MART-1. Para evaluar el efecto destructor de las células T CD8 específicas de SLC45A2 contra las células de melanoma después del tratamiento con inhibidores de BRAF y MEK, se realizó el ensayo de liberación de 51Cr en células de melanoma tratadas con un inhibidor de BRAF, un inhibidor de MEK o ambos durante 48 horas. Las células T CD8 específicas de SLC45A2 mostraron una citotoxicidad aumentada en células de melanoma tratadas con un inhibidor de BRAF, un inhibidor de MEK o ambos en comparación con la de células de melanoma no tratadas (figura 7B). Estos datos indicaron que la inhibición de la ruta de MAPK aumenta la expresión de SLC45A2 regulada por MITF, lo que potencia el reconocimiento de la diana y la citotoxicidad de las células T CD8 específicas de SLC45A2.

Conclusiones: es importante destacar que las células T CD8 específicas de SLC45A destruyeron eficazmente las células de melanoma, pero no los melanocitos normales, mientras que las células T CD8 específicas de MART-1 y gp100 destruyeron tanto los melanocitos como las células de melanoma. Además, el tratamiento con inhibidores de BRAF y MEK aumentó la expresión de SLC45A, el reconocimiento de la diana y la citotoxicidad de las células T CD8 específicas de SLC45A2 en células de melanoma. En conjunto, este estudio identificó novedosos péptidos, SLC45A2382-390 y SLC45A2393-402, restringidos a HLA-A*0201 y A*2402, respectivamente, y demostró que SLC45A2, como antígeno de diferenciación del melanoma, puede ser una diana eficaz con alta eficacia y baja toxicidad para la inmunoterapia en el melanoma. Este hallazgo de SLC45A2 como un antígeno específico de melanoma podría ser importante para el desarrollo de la inmunoterapia de células T adoptiva.

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Patente estadounidense 5.741.957

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Patente estadounidense 5.783.208

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Claims

REIVINDICACIONES

i . Un péptido aislado de 35 aminoácidos de longitud o menos para su uso en el tratamiento de melanoma excluyendo melanoma uveal, en el que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402.
2. Un medio de cultivo celular que comprende el péptido según la reivindicación 1.
3. Una composición farmacéutica que comprende un péptido de 35 aminoácidos de longitud o menos para su uso en el tratamiento de melanoma excluyendo melanoma uveal, en la que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2382-390 (SEQ ID No :1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2), en la que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402, y un excipiente.
4. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en la que

- la preparación farmacéutica se formula para administración parenteral, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inhalación o inyección subcutánea,

- la preparación farmacéutica se formula para inyección o inhalación como pulverizador nasal, y/o

- el péptido está comprendido en un liposoma, en una nanopartícula que contiene lípidos o en un portador a base de lípidos.
5. El péptido según la reivindicación 1 o una composición farmacéutica según la reivindicación 3 o 4 para su uso en el tratamiento de melanoma excluyendo melanoma uveal, en los que se administra una segunda terapia contra el cáncer al sujeto que va a tratarse y en los que la segunda terapia contra el cáncer se elige preferiblemente de la lista de: una quimioterapia, una radioterapia, una inmunoterapia o una cirugía, en los que el péptido o la composición farmacéutica se administra a dicho sujeto en una cantidad eficaz para fomentar que los linfocitos T citotóxicos (CTL) en el sujeto lisen o destruyan las células cancerosas en el sujeto.
6. Un método in vitro para inducir la proliferación de una población de células T, que comprende poner en contacto células T in vitro con un péptido en una cantidad suficiente para unirse a un HLA-A*0201 o un HLA-A2 en las células T y fomentar la proliferación de una o más de las células T, preferiblemente en el que las células T son linfocitos T citotóxicos (CTL) y/o células T CD8+, en el que el péptido tiene 35 aminoácidos de longitud o menos y en el que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC^{4 5}A^2393-402(SEQ ID N^o:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402.
7. Las células T tal como se obtienen mediante el método según la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de melanoma excluyendo melanoma uveal, en las que las células T se administran a un sujeto, preferiblemente en las que el sujeto es un ser humano.
8. Un anticuerpo que se une de manera selectiva a un péptido o que se une de manera selectiva a un complejo péptido - HLA-A2 para su uso en el tratamiento de melanoma excluyendo melanoma uveal, preferiblemente en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, está comprendido en antisueros policlonales, es un fragmento de anticuerpo, es un anticuerpo humano o humanizado, o está comprendido en un constructo de fusión, un constructo de fusión soluble, un ImmTAC o una inmunotoxina, en el que el péptido tiene 35 aminoácidos de longitud o menos y en el que el péptido comprende la secuencia de SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) o SLC45A2393-402 (S^eQ ID NO:2) o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SLC45A2382-390 (SEQ ⁱD NO:1) o SLC^{4 5}A^2393-402(SEQ ID NO:2), en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2, HLA-A*0201, HLA-A24 o HLA-A*2402.
9. El péptido para su uso según la reivindicación 1 o 5, el medio de cultivo celular según la reivindicación 2, la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, 4 o 5, el método según la reivindicación 6, o el anticuerpo para su uso según la reivindicación 8, en los que el péptido tiene 30 aminoácidos de longitud o menos, 25 aminoácidos de longitud o menos, 20 aminoácidos de longitud o menos o 15 aminoácidos de longitud o menos.
10. El péptido para su uso según la reivindicación 1 o 5, el medio de cultivo celular según la reivindicación 2, la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, 4 o 5, el método según la reivindicación 6, o el anticuerpo para su uso según la reivindicación 8, en los que

- el péptido comprende o consiste en SLC45A2382-390 (SEQ ID NO:1) y en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A2 o HLA-A*0201, o

- el péptido comprende o consiste en SLC45A2393-402 (SEQ ID NO:2) y en el que el péptido se une de manera selectiva a HLA-A24 o HLA-A*2402.
11. El péptido para su uso según la reivindicación 1o 5, o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, 4 o 5, en los que el melanoma es melanoma cutáneo, melanoma mucoso o melanoma metastásico.