ES2901608T3

ES2901608T3 - Caracterización holográfica de agregados proteicos

Info

Publication number: ES2901608T3
Application number: ES17750639T
Authority: ES
Inventors: David G Grier; Michael D Ward; Xiao Zhong; Chen Wang; Laura A Philips; David B Ruffner; Fook Chiong Cheong
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 2016-02-08
Filing date: 2017-02-07
Publication date: 2022-03-23
Anticipated expiration: 2037-02-07
Also published as: WO2017139279A2; JP7130242B2; US20220326130A1; US20210199551A1; WO2017139279A3; TW201732258A; US11747258B2; US11385157B2; EP3414517A4; EP3414517A2; JP2019513973A; DK3414517T3; EP3414517B1; TWI731030B

Abstract

Un método para caracterizar una muestra de una pluralidad de agregados proteicos, que comprende: hacer fluir la muestra a través de un volumen de observación de un microscopio holográfico; generar un primer conjunto de hologramas basado en microscopía holográfica de video de un primer conjunto de agregados proteicos dentro del volumen de observación por primera vez; caracterizar cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto de agregados proteicos como una esfera; y determinar el índice de refracción y el radio de la esfera caracterizada del primer conjunto de agregados proteicos; generar un segundo conjunto de hologramas basado en microscopía holográfica de video de un segundo conjunto de agregados proteicos dentro del volumen de observación por segunda vez; caracterizar cada uno de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos como una esfera; y determinar el índice de refracción y el radio para cada uno de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos; en donde la caracterización de cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto y el segundo conjunto comprende además modelar cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto y del segundo conjunto como un grupo fractal de dimensión fractal D donde: **(Ver fórmula)** Por la presente, Φ es la fracción de volumen de proteínas, a0 es el radio de la proteína y apes el radio del agregado proteico.

Description

DESCRIPCIÓN

Caracterización holográfica de agregados proteicos

Antecedentes de la invención

Las proteínas y los agregados proteicos son cada vez más importantes para aplicaciones comerciales. La caracterización de los agregados proteicos representa un desafío, en particular para la implementación a gran escala y con respecto a la caracterización en tiempo real o casi en tiempo real. La tendencia de las proteínas a agruparse en grupos es una problemática importante en la fabricación de productos biofarmacéuticos a base de proteínas y en la evaluación de su seguridad. Además de reducir la eficacia terapéutica, los agregados proteicos provocan respuestas inmunitarias que dan lugar a eventos clínicos adversos con el potencial de dañar la salud de las personas afectadas. Detectar, contar y caracterizar los agregados proteicos es esencial para comprender las vías críticas responsables de la agregación de proteínas. Las tecnologías establecidas para la caracterización de partículas, tal como la dispersión dinámica de la luz, funcionan bien para la caracterización in situ de agregados a escala submicrométrica. Otros, tal como las imágenes de microflujo, funcionan mejor para agregados visibles de más de cinco micrómetros aproximadamente. Comparativamente, pocas técnicas establecidas sondean el intervalo subvisible de 100 nm a 10 pm. La necesidad de técnicas de caracterización mejoradas es particularmente aguda en aplicaciones que requieren monitoreo en tiempo real de agregados subvisibles en su entorno nativo.

La tendencia de las proteínas a agruparse y la capacidad de detectarlas y caracterizarlas es una consideración importante. Existe la necesidad de sistemas y métodos para caracterizar proteínas con precisión y rapidez.

El documento "Holographic Characterization of Protein Aggregates" (Chen Wang y otros, Journal of Pharmaceutical Sciences, Sociedad Estadounidense de Farmacología, EE. UU., Vol. 105, Núm. 3, 2 de febrero de 206, páginas 1074 a 1085) describe el uso de microscopía holográfica de video para detectar, contar y caracterizar agregados proteicos individuales a escala micrométrica a medida que fluyen por un canal de microfluidos en su tampón nativo.

El documento "Flow Visualization and Flow Cytometry with Holographic Video Microscopy" (Fook Cheong y otros, Optics Express, vol. 17, Núm. 15, 1 de julio de 2009, páginas 13071 a 13079) describe el uso del análisis de una secuencia de video capturada por un microscopio holográfico en línea cuadro por cuadro para detectar los movimientos tridimensionales de partículas coloidales individuales y medir simultáneamente sus tamaños e índices de refracción.

Resumen de la invención

La invención se refiere a un método para caracterizar una muestra de una pluralidad de agregados proteicos de acuerdo con la reivindicación 1. Las características opcionales o preferidas se establecen en las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de las figuras

Las características anteriores y otras de la presente descripción se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas, tomadas junto con las figuras adjuntas. Entendiendo que estas figuras representan solo varias modalidades de acuerdo con la descripción y, por lo tanto, no deben considerarse limitantes de su alcance, la descripción se describirá con especificidad y detalle adicionales mediante el uso de los dibujos adjuntos.

La Figura 1A ilustra una holografía medida de un agregado de BSA de 1 micrómetro de diámetro. La Figura 1B ilustra un ajuste basado en la teoría de dispersión de la luz de Lorenz-Mie.

La Figura 2 muestra los agregados proteicos que fluyen por un canal de microfluidos en forma de hologramas a medida que pasan a través de un haz láser. Un holograma experimental típico se reproduce como una imagen en escala de grises en la figura. Cada holograma se graba con una cámara de video y se compara con las predicciones de la teoría de Lorenz-Mie para medir el radio de cada agregado, ap, e índice de refracción, np. La gráfica de dispersión insertada muestra datos experimentales para 3000 agregados subvisibles de insulina bovina, donde cada punto de datos representa las propiedades de un solo agregado y los colores denotan la densidad de probabilidad relativa p(ap, np) para observaciones en el plano (ap, np).

La Figura 3A es un diagrama de dispersión de radio ap e índice de refracción npobtenido con la caracterización holográfica de una dispersión coloidal heterogénea compuesta por una mezcla de cuatro tipos diferentes de partículas. Se grafican los resultados para 20 000 partículas. Los cruces superpuestos indican la especificación del fabricante para cada una de las cuatro poblaciones. Estos resultados establecen la capacidad de la caracterización holográfica para diferenciar partículas tanto por composición así como también por tamaño. La Figura 3B muestra hologramas medidos de esferas de poliestireno coloidal en agua junto con ajustes, estos demuestran el intervalo de tamaños de partículas susceptibles de caracterización holográfica. Estos ejemplos típicos se obtuvieron para esferas con radios ap = 0,237 mm (región de interés de 224 píxeles x 224 píxeles), 0,800 mm (356 píxeles x 356 píxeles) y 10,47 mm (608 píxeles x 608 píxeles). El ajuste a cada holograma produce valores para el radio de la partícula, ap, y el índice de refracción, np. Los perfiles radiales, b(r), se obtienen a partir de estos hologramas y sus ajustes al promediar la intensidad normalizada sobre los ángulos alrededor del centro de cada característica, y se grafican como una función de la distancia r desde el centro de la característica. Los datos experimentales se trazan como curvas más oscuras (azules) dentro de las regiones sombreadas que representan la incertidumbre de la medición en ese radio. Los ajustes se superponen como curvas más claras (naranja) y se acercan bastante a los datos experimentales.

Las Figuras 4A-4D muestran la influencia de la morfología agregada en la caracterización holográfica. Hologramas de agregados típicos que se disponen en orden de discrepancia creciente entre los hologramas medidos y ajustados. La Figura 4A muestra regiones de interés de 160 píxeles x 160 píxeles del campo de visión del microscopio, centradas en las características identificadas automáticamente como complejos candidatos de BSA-PAH. La Figura 4B muestra ajustes a la teoría de Lorenz-Mie para hologramas formados por esferas. La Figura 4C muestra perfiles radiales del holograma experimental (curvas negras) superpuestos con el perfil radial de los ajustes (curvas rojas). Las regiones sombreadas representan la incertidumbre experimental estimada. La Figura 4D muestra reconstrucciones de Rayleigh-Sommerfeld de las estructuras tridimensionales de los agregados obtenidas de los hologramas experimentales. Las imágenes en escala de grises son proyecciones de las reconstrucciones, que se asemejan a imágenes equivalentes de campo claro con un enfoque óptimo. Los círculos superpuestos indican estimaciones de ajuste para el tamaño de partícula.

Las Figuras 5A-5F ilustran el impacto de los contaminantes en la distribución medida del radio ap e índice de refracción n^p de complejos BSA-PAH. La Figura 5A (índice de refracción) y la Figura 5B (distribución de tamaño) ilustran los resultados de BSA en complejo con PAH en tampón Tris (1100 agregados). La Figura 5C (índice de refracción) y la Figura 5D (distribución de tamaño) ilustran los resultados para la misma muestra de las Figuras 5A y 5B pero con NaCl 0,1 M (1200 agregados); la Figura 5E (índice de refracción) y la Figura 5F (distribución de tamaño) ilustran los resultados de una muestra preparada en las mismas condiciones que las Figuras 5C y 5D con esferas de silicona añadidas (1600 características). Cada punto en los gráficos de dispersión (Figuras 5a , 5C y 5E) representa las propiedades de un solo agregado y se coloreó por la densidad relativa de observaciones, p(a^p, n^p). Las Figuras 5B, 5D y 5F presentan la distribución de tamaño asociada p(ap) dentro de una región sombreada que representa el error instrumental y estadístico

La Figura 6A muestra datos combinados para las tres muestras de BSA. La Figura 6B muestra los datos reescalados de acuerdo con la Ecuación 4.

La Figura 7 ilustra un sistema informático para su uso con determinadas implementaciones.

Las Figuras 8A-8B muestran una comparación de distribuciones de tamaño medidas con imágenes de microflujo y caracterización holográfica. Cada punto representa el número de partículas por mililitro de solución en un intervalo de ± 100 nm alrededor del radio central del punto. La Figura 8A muestra una muestra sin sal añadida (muestra de las Figuras 5A-5B). La Figura 8B muestra una muestra con NaCl añadido (muestra de las Figuras 5C-5D).

La Figura 9 muestra una caracterización de complejos BSA-PAH por dispersión dinámica de la luz (DLS). Los valores representan el porcentaje, P(ah), de la intensidad de la luz dispersa debido a los dispersores de un radio hidrodinámico dado, ah. La flecha indica un pequeño pico en ambas distribuciones alrededor de ah = 2,8 mm.

Las Figuras 10A y 10B muestran datos de caracterización holográfica para esferas de silicona dispersas en agua desionizada. La región sombreada en gris indica el intervalo de índices de refracción esperados para estas partículas con base en su composición. La Figura 10A muestra una muestra monodispersa (600 esferas). La Figura 10B muestra una muestra polidispersa (600 esferas).

Las Figuras 11A-11D muestran la medición holográfica de la densidad de probabilidad relativa, r(ap,np), de radio de partícula e índice de refracción para suspensiones de complejos BSA-PAH enriquecidos con esferas de silicona añadidas. La Figura 11A muestra una muestra preparada en las mismas condiciones que en las Figuras 5A-5B enriquecida con las esferas monodispersas de la Figura 10A (características de 2000). La Figura 11B muestra una muestra preparada en las mismas condiciones que en la Figura 5C-5D enriquecida con las esferas polidispersas de la Figura 10B (1600 características). Las Figuras 11C y 11D muestran la densidad de probabilidad relativa proyectada, r(ap), para el radio de partícula de los datos de la Figura 11A y la Figura 11B, respectivamente.

Las Figuras 12A-12C ilustran los resultados que muestran la distinción de proteína y aceite de silicona por separado: La Figura 12A muestra 1 mg/ml de IgG humana en tampón PBS, la Figura 12B muestra 3 mg/ml de aceite de silicona en tampón PBS. Estas muestras se mezclaron como se muestra en la Figura 12C, con concentraciones finales de 0,5 mg/ml de IgG humana y 1,5 mg/ml de aceite de silicona en tampón PBS. Todas las mediciones se realizaron mediante el uso de un objetivo de 40X (Nikon 0.75NA) y un canal de microfluidos de 100 |jm de profundidad (j-Slide VI 0.1 sin recubrimiento)

Descripción detallada de las modalidades preferidas

En la siguiente descripción detallada, se hace referencia a las figuras adjuntas, que forman parte de esta. En los dibujos, los símbolos similares identifican típicamente componentes similares, a menos que se indique de cualquier otra manera. Las modalidades ilustrativas descritas en la descripción detallada y las figuras no pretenden ser limitantes. Pueden usarse otras modalidades y pueden realizarse otros cambios, sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

La caracterización holográfica de los agregados proteicos fractales proporciona información sobre el tamaño y el índice de refracción de los agregados individuales en solución. Los datos de caracterización de un solo agregado pueden combinarse en la distribución conjunta para el tamaño y el índice de refracción en una dispersión de agregados, sin suposiciones a priori sobre la naturaleza de la distribución. La interpretación de la distribución conjunta del índice de tamaño medido para un conjunto de agregados proteicos en términos de un modelo de medio efectivo para la dispersión por agregados fractales produce una estimación de la dimensión fractal media de los agregados y, por lo tanto, su morfología. Cuando esta interpretación se aplica a dispersiones de albúmina de suero bovino agregada, la dimensión fractal extraída, D= 1,2 coincide con informes anteriores basados en técnicas de medición ex situ como la microscopía electrónica y la microscopía de fuerza atómica. El éxito de este análisis de escala de población promediada da confianza a los datos de caracterización de un solo agregado en los que se basa y, por lo tanto, a la propuesta novedosa de que la caracterización holográfica puede usarse para analizar el tamaño, la estructura y la morfología de agregados proteicos a escala micrométrica.

La tendencia de las proteínas a agregarse en grupos está implicada en los procesos patológicos y también afecta la eficacia de los productos farmacéuticos a base de proteínas. Aquí, se introduce un método basado en microscopía holográfica de video para detectar, contar y caracterizar agregados proteicos individuales que rápidamente acumula estadísticas de población en agregados subvisibles en solución en su estado natural, sin dilución o condiciones especiales de solvente, y sin la necesidad de químicos o etiquetas ópticas. El uso de microscopía holográfica de video, incluido el análisis de Lorenz-Mie, es conocido para la caracterización de partículas esféricas homogéneas. Los agregados proteicos presentan un desafío único ya que no son homogéneos ni esféricos. Los agregados proteicos suelen tener una forma irregular y pueden ser estructuras delgadas muy ramificadas. En la presente descripción se describen sistemas y métodos que usan una determinación de las propiedades de una esfera efectiva, una que incluye el agregado y el medio fluido circundante e intersticial. Las estimaciones del radio y el índice de refracción de esta esfera definida se ajustan a las del agregado proteico real mediante el uso de modelos, como el modelo fractal. En una aplicación, los sistemas y métodos se usan sin caracterización de los materiales, para proporcionar información con respecto al "recuento" de los agregados proteicos en su entorno nativo, en una modalidad casi en tiempo real.

Los ejemplos de prueba de concepto de este método se realizan a través de mediciones en agregados de albúmina de suero bovino (BSA) e insulina bovina (BI) en el intervalo de radios de 300 nm a 10 pm. La acumulación de mediciones resueltas por partículas en distribuciones conjuntas para el tamaño de los agregados y el índice de refracción ofrece información sobre la influencia de las condiciones de crecimiento en el mecanismo de agregación de proteínas. Un análisis de escala de esta distribución conjunta produce estimaciones para la dimensión fractal de los agregados que son consistentes con las mediciones ex situ y, por lo tanto, ofrece información sobre la morfología de los agregados. El éxito de este análisis de escala sugiere que los resultados para los tamaños de un solo grupo y los índices de refracción reflejan con precisión las propiedades de los agregados individuales.

La técnica de medición, tal como la modalidad de la Figura 2, se basa en la microscopía holográfica de video en línea, una técnica que crea hologramas de objetos individuales en el campo de visión del microscopio. Un microscopio holográfico ilumina su muestra con un haz láser colimado en lugar de una fuente de luz incoherente convencional. La luz dispersada por un objeto pequeño, como un agregado de proteína, por lo tanto interfiere con el resto del haz en el plano focal de un microscopio óptico. El microscopio amplía el patrón de interferencia y lo proyecta sobre la cara de una cámara de video, que registra el patrón de intensidad que varía espacialmente, /(r). Cada imagen en la secuencia de video resultante es una instantánea holográfica de los dispersores que pasan a través del haz láser y puede analizarse con predicciones basadas en la teoría de dispersión de la luz de Lorenz-Mie para medir el radio de cada agregado a^p, índice de refracción, n^p, y posición tridimensional, rp. La caracterización holográfica se desarrolló originalmente para analizar partículas esféricas (ver, por ejemplo, Lee SH, Roichman Y, Yi GR, Kim SH, Yang SM, van Blaaderen A, y otros, Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy. Optar Express. 2007; 15: 18275-18282, incorporado en la presente descripción como referencia). Generalizar rigurosamente el análisis para dar cuenta de la estructura detallada de objetos asféricos y no homogéneos es prohibitivamente lento debido a la complejidad analítica y la carga computacional asociadas. El modelo esférico idealizado se usa para caracterizar agregados proteicos entendiendo que los resultados deben interpretarse como una referencia a una esfera efectiva que comprende tanto el agregado de proteínas como el medio fluido que llena la esfera efectiva.

La Figura 2 ilustra unos agregados proteicos que fluyen por un canal de microfluidos y forman hologramas a medida que pasan a través de un haz láser. Un holograma experimental típico se reproduce como una imagen en escala de grises en la figura. Cada holograma se graba con una cámara de video y se compara con las predicciones de la teoría de Lorenz-Mie para medir el radio de cada agregado, ap, e índice de refracción, n^p. El gráfico de dispersión muestra datos experimentales para 3000 agregados subvisibles de insulina bovina, cada punto de datos representa las propiedades de un solo agregado y los colores indican la densidad de probabilidad relativa p(a^p, n^p) para observaciones en el plano (a^p, n^p).

El sistema y los métodos de caracterización holográfica proporcionan la detección de agregados proteicos que tienen un radio de un intervalo de tamaño aceptable, tal como dentro del intervalo de 200 nm (300 nm, 400 nm, 500 nm) a 20 |jm (10 |jm, 1 |jm, 900 nm, 800 nm). Además, el recuento de agregados proteicos se habilita dentro del intervalo de tamaño, lo que permite la determinación de la densidad numérica de los agregados proteicos (en el intervalo de tamaño). Además, los sistemas y métodos permiten la identificación de agregados proteicos dentro de subintervalos del intervalo de tamaño aceptable. Algunas técnicas, tal como la dispersión dinámica de la luz (DLS), cubren el extremo inferior del mismo intervalo de tamaño y pueden sondear partículas más pequeñas. Otras técnicas, tal como las imágenes de microflujo (MFI), funcionan en el extremo superior del mismo intervalo de tamaño y pueden sondear partículas que son aún más grandes. El presente enfoque de la caracterización holográfica une los dominios de funcionamiento de estas otras técnicas. El intervalo especificado refleja la implementación actual y puede ampliarse mediante la elección de hardware óptico y mediante la modificación del software que se usa para analizar hologramas. El extremo inferior del intervalo también se limita por la longitud de onda de la luz. El extremo superior del intervalo no se limita teóricamente de esta forma, pero puede limitarse en la práctica por consideraciones de complejidad computacional.

Para lograr la caracterización holográfica, el sistema y los métodos caracterizan los agregados proteicos en el intervalo de tamaño aceptable. La caracterización incluye: a) medir el radio con análisis de Lorenz-Mie; b) medir el índice de refracción efectivo del agregado con análisis de Lorenz-Mie; c) estimar la porosidad de un agregado individual con base en su índice de refracción efectivo con relación al de la proteína en sí; d) estimar la porosidad media de un conjunto de agregados con base en la forma de la distribución de los datos de caracterización de una sola partícula (mediante el uso de la ecuación (1) (establecida más abajo), suponiendo que los agregados pueden modelarse como si tuvieran una geometría fractal); e) medir la morfología de un agregado individual con base en la retropropagación del holograma del agregado. En una modalidad adicional, la etapa de retropropagación es una vía distinta y paralela para analizar los mismos datos, y puede incluir 1) retropropagación de Fresnel, 2) retropropagación de Rayleigh-Sommerfeld y/o 3) deconvolución de Rayleigh-Sommerfeld. Este término índice de refracción efectivo se refiere al índice de refracción del material dentro de un volumen esférico que incorpora tanto la partícula en estudio como el medio intercalado dentro de esa partícula. Esta "esfera efectiva" tiene un tamaño y un índice de refracción que reflejan las propiedades correspondientes de la partícula de interés. Esta partícula podría ser una esfera coloidal, una partícula coloidal asférica, un agregado de partículas coloidales o un agregado de moléculas tal como un agregado de proteína. El índice de refracción efectivo medido no es el índice de refracción del medio ni de un grupo de proteínas puras, sino una combinación de todos los componentes del agregado. Cuando hay más solvente incorporado en el agregado, el índice de refracción efectivo estará más cerca del índice de refracción del solvente, y cuando hay menos solvente, estará más lejos del índice de refracción del solvente. El índice de refracción efectivo proporciona información sobre la proporción del volumen de la esfera efectiva que rellenado con el medio y, por lo tanto, proporciona información útil sobre la morfología de la partícula.

Con referencia a la modalidad de la Figura 2, el instrumento de caracterización holográfica usa una lente de objetivo de microscopio convencional (Nikon Plan Apo, 100x, abertura numérica 1.45, inmersión en aceite), que, en combinación con una lente de tubo estándar, produce un sistema de aumento de 135 nm/píxel en la cara de una cámara de video monocromática (NEC TI-324AII). La muestra se ilumina con el haz colimado de un láser de estado sólido (Coherent Verdi) que entrega 10 mW de luz a la longitud de onda de vacío de la muestra de 532 nm. Esta luz se extiende sobre los 3 mm de diámetro del haz, en este ejemplo, y produce una irradiancia máxima de 1,5 mW/mm2. Para esferas coloidales de escala micrométrica, este instrumento puede medir el radio de una partícula individual con precisión nanométrica, su índice de refracción dentro de una parte por mil, y puede detectar su posición dentro de un nanómetro en el plano y dentro de 3 nanómetros a lo largo del eje óptico. Cada ajuste puede realizarse en una fracción de segundo, por ejemplo, unas pocas decenas de milisegundos, mediante el uso de la detección automática de características y algoritmos de reconocimiento de imágenes. Un solo ajuste es suficiente para caracterizar un solo agregado proteico.

Para caracterizar la población de agregados en una dispersión de proteínas, la muestra se hace fluir a través del volumen de observación del microscopio en un canal de microfluidos. Dado el tiempo de exposición de la cámara de 0,1 ms, los resultados no son sensibles al desenfoque de movimiento para velocidades de flujo de hasta 100 jm/s. En condiciones típicas, no más de diez agregados proteicos pasan a través del campo de visión de 86 jim x 65 jim a la vez. Estas condiciones simplifican el análisis holográfico al minimizar la superposición entre los patrones de dispersión de partículas individuales. Cada partícula típicamente se agrega y típicamente se graba en múltiples cuadros de video a medida que se mueve a través del campo de visión. Dichas secuencias de mediciones se vinculan en trayectorias mediante el uso de un algoritmo de máxima verosimilitud y se informan los valores medios para cada trayectoria. Estas consideraciones establecen un límite superior para el intervalo de concentraciones agregadas accesibles de 108agregados/ml. En el otro extremo, 10 min de datos son suficientes para detectar, contar 4 y caracterizar agregados en concentraciones tan bajas como 10 agregados/ml. Esta sensibilidad se compara favorablemente con la dispersión dinámica de la luz y el análisis de seguimiento de nanopartículas. En una modalidad, se puede adquirir un conjunto de datos que consiste de 5000 partículas en aproximadamente 5 minutos.

El diagrama de dispersión insertado en la Figura 2 muestra resultados típicos para agregados subvisibles de insulina bovina. Cada punto representa las propiedades de un solo agregado y es comparable en tamaño a los errores estimados en el radio y el índice de refracción. Los colores representan la densidad local p(ap, np) de puntos de datos registrados en el plano (ap, np), calculado con un estimador de densidad de kernel, donde el rojo indica los valores más probables.

La caracterización holográfica puede generalizarse para admitir partículas asféricas y no homogéneas. Sin embargo, los cálculos de dispersión de luz asociados son complejos desde el punto de vista computacional. Los agregados proteicos se caracterizan mediante el uso de la teoría de la dispersión de luz para esferas isotrópicas y homogéneas entendiendo que los agregados pueden apartarse de este modelo idealizado. El ejemplo típico de la Figura 1, sin embargo, demuestra que el modelo esférico explica bien los patrones de dispersión de una sola partícula que se observan en el sistema.

Calibración del instrumento de caracterización holográfica

La caracterización holográfica se basa en cuatro parámetros de calibración instrumental: la longitud de onda de vacío de la iluminación láser, el aumento del tren óptico, el recuento de oscuridad de la cámara y la relación señal-ruido de un solo píxel en el nivel de iluminación de funcionamiento. Todos estos pueden medirse una vez y usarse después para todos los análisis subsecuentes.

La longitud de onda de vacío del láser la especifica el fabricante y se verifica de forma independiente a cuatro cifras significativas mediante el uso de un espectrómetro de fibra (Ocean Optics, HR4000). El aumento del sistema del microscopio se mide a cuatro cifras significativas mediante el uso de una escala micrométrica de precisión (Ted Pella, número de catálogo 2285-16). El recuento de oscuridad de la cámara se mide al bloquear la iluminación láser y calcular el valor medio de la imagen en cada píxel. El ruido de la imagen se estima a partir de imágenes holográficas con la métrica de desviación absoluta media (MAD).

Además de estas calibraciones instrumentales, la obtención de resultados precisos también requiere un valor exacto del índice de refracción del medio a la longitud de onda del láser y a la temperatura de la muestra. Para los tampones acuosos del presente estudio, este valor se obtuvo a cuatro cifras significativas con un refractómetro de Abbe (Edmund Optics). La aproximación de este valor con el índice de refracción del agua pura, nm= 1,335, a la temperatura de medición de 21 ± 1 °C, produce errores sistemáticos en el radio estimado y el índice de refracción de no más de 0,1 %.

Intervalo de funcionamiento de la caracterización holográfica

El intervalo de funcionamiento del instrumento de caracterización holográfica se establece mediante mediciones en dispersiones acuosas de esferas coloidales que se destinan a usarse como patrones de tamaño de partículas. Las franjas de interferencia en los hologramas de cada partícula deben estar separadas por al menos un píxel en el plano focal del microscopio. Este requisito se satisface al establecer el plano focal 5 pm por debajo de la interfaz vidrio-agua en la celda de muestra. El desplazamiento axial accesible más grande se establece tanto por la necesidad de ajustar varias franjas concéntricas en el campo de visión de la cámara como por la reducción del contraste de la imagen debajo del nivel de ruido de la cámara. Este límite superior es de aproximadamente 100 pm para este instrumento. En una modalidad preferida, las muestras se pasan a través de canales de microfluido con una longitud de trayectoria óptica de 30 pm para garantizar buenas condiciones de formación de imágenes para todos los agregados, independientemente de su altura en el canal.

El extremo inferior del intervalo de tamaños de partículas detectables se limita a la mitad de la longitud de onda de la luz en el medio. Las partículas más pequeñas que esto producen hologramas detectables, que pueden ajustarse a la teoría de Lorenz-Mie. Sin embargo, estos ajustes no separan correctamente el tamaño de partícula del índice de refracción. Si se conoce el índice de refracción de la partícula a priori, estas mediciones pueden producir estimaciones confiables para el radio de la partícula. Para la modalidad de ejemplo, el límite inferior práctico lo establece el intervalo dinámico de 8 bits de la cámara a ap >200 nm. Los patrones de dispersión de la luz de las partículas más pequeñas carecen del contraste necesario para una detección y caracterización fiables.

Para la modalidad de ejemplo, el límite de tamaño superior se establece en ap <10 pm por la profundidad del canal. No se espera que la configuración de ejemplo descrita permita observar de manera fiable e identificar correctamente agregados proteicos de forma irregular mucho mayores de 10 pm. Es probable que los grandes agregados transitorios se rompan por cizallamiento hidrodinámico en el flujo de Poiseuille dentro del canal. Es probable que los agregados altamente asimétricos sustancialmente más grandes que la longitud de onda de la luz se identifiquen erróneamente como dos o más características distintas mediante el algoritmo de identificación de características desarrollado para la caracterización holográfica automatizada de esferas. No se hace ningún esfuerzo para corregir este artefacto, aunque su presencia se confirma al comparar los resultados de la caracterización holográfica con los resultados obtenidos al volver a analizar los mismos datos para la obtención de imágenes de microflujo mediante el uso de los métodos de la siguiente sección.

Mediciones de morfología holográfica

Los mismos hologramas que se usan para la caracterización holográfica a través del análisis de Lorenz-Mie también pueden usarse para visualizar la morfología tridimensional de agregados individuales a través de la retropropagación de Rayleigh-Sommerfeld con deconvolución volumétrica. Esta técnica usa la difracción integral de Rayleigh-Sommerfeld para reconstruir el campo de luz volumétrico responsable de la distribución de intensidad observada. El objeto responsable del patrón de dispersión aparece en esta reconstrucción en forma de cáusticos que crea en el campo de luz. Para objetos con características comparables en tamaño a las longitudes de onda de la luz, se demostró que estos cáusticos detectan con precisión la posición y orientación de esas características en tres dimensiones. La deconvolución del conjunto de datos volumétricos que se obtiene con la función de dispersión de puntos para el núcleo de difracción de Rayleigh-Sommerfeld elimina los artefactos de imágenes dobles y produce una representación tridimensional del dispersor.

Las reconstrucciones volumétricas de agregados proteicos pueden proyectarse en el plano de imagen para obtener el equivalente de imágenes de campo claro en el plano de mejor enfoque. Esto brinda el beneficio de la gran profundidad de enfoque efectiva de la microscopía holográfica en comparación con la microscopía de campo brillante convencional. Las imágenes resultantes son útiles para el análisis de imágenes de microflujo, incluido el análisis de la morfología de los agregados proteicos. Esta información, a su vez, puede usarse para evaluar la tasa de identificaciones de características falsas en el análisis de Lorenz-Mie y, por lo tanto, la tasa a la que los agregados más grandes se identifican erróneamente como grupos de agregados más pequeños.

La investigación de la morfología agregada con microscopía de deconvolución holográfica es un complemento útil para la caracterización holográfica a través del análisis de Lorenz-Mie. Mientras que los ajustes de Lorenz-Mie ocurren en cuestión de milisegundos, la retropropagación de Rayleigh-Sommerfeld es cientos de veces más lenta. Este estudio se centra, por tanto, en la información que puede obtenerse rápidamente a través de la caracterización de Lorenz-Mie.

Ejemplos

Preparación del material

Las muestras de insulina bovina de páncreas (PM: 5733,49 Da, Sigma-Aldrich, Número CAS: 11070-73-8) se prepararon de acuerdo con métodos previamente publicados con modificaciones para investigar la agregación de insulina inducida solo por agitación. La insulina se disolvió a una concentración de 5 mg/ml en tampón Tris-HCI 10 mM (Life Technologies,Número CAS 77-86-1), el pH se ajustó a 7,4 con ácido clorhídrico al 37 % (Sigma Aldrich,Número CAS: 7647-01-0). A continuación, la solución se centrifugó a 250 rpm durante 1 h para inducir la agregación, momento en el que la muestra todavía parecía sustancialmente transparente.

Las soluciones de albúmina de suero bovino (BSA) (Mw: 66 500 Da, Sigma Aldrich,Número CAS: 9048-46-8) se agregaron mediante la formación de complejos con poli(clorhidrato de alilamina) (PAH) (Mw: 17 500 g/mol,Número CAS: 71550-12-4, grado medio de polimerización: 1207) [33, 34]. Se disolvieron la BSA y PAH en tampón Tris 10 mM (Life Technologies,Número CAS: 77-86-1) para alcanzar concentraciones de 1,22 mg/ml y 0,03 mg/ml, respectivamente. Los reactivos se mezclaron mediante agitación con vórtex para asegurar la disolución y se formaron agregados después de dejar que la muestra se equilibrara durante una hora.

Se prepararon muestras adicionales en condiciones comparables con la adición de NaCl 0,1 M (Sigma Aldrich,Número CAS 7647-14-5) para facilitar la formación de complejos y de esta manera promover la agregación.

La muestra patrón de mezcla estequiométrica de esferas coloidales es una mezcla de cuatro poblaciones de esferas coloidales monodispersas en la que cada población tiene un tamaño y una composición de medios distintos. Las esferas monodispersas se adquirieron de Bangs Laboratories como dispersiones acuosas de sólidos al 10 %. Las suspensiones concentradas (stock) se diluyeron mil veces con agua desionizada y luego se combinaron en volúmenes iguales para crear una mezcla heterogénea. Las cuatro poblaciones de esta mezcla son esferas de poliestireno de diámetro 2ap= 0,71 ± 0,09 pm (código de catálogo PS03N, número de lote 9402) y 2ap= 1,58 ± 0,14 pm (código de catálogo PS04N, número de lote 9258) y esferas de sílice de diámetro 2ap= 0,69 ± 0,07 pm (código de catálogo SS03N, número de lote 8933) y 2ap= 1,54 ± 0,16 pm (código de catálogo SS04N, número de lote 5305). El intervalo de tamaño de partícula citado se estimó por el fabricante mediante el uso de dispersión dinámica de la luz para las esferas más pequeñas y mediante el principio de Coulter para las esferas más grandes.

Las esferas de silicona compuestas de polidimetilsiloxano (PDMS) se sintetizaron mediante hidrólisis catalizada por bases y copolimerización de dietoxidimetilsilano difuncional (DEDMS) (Sigma-Aldrich,Número CAS 78-62-6, 3 % en volumen) y trietoximetilsilano trifuncional (TEMS) (Sigma-Aldrich,Número CAS 2031-67-6, 2 % en volumen) siguiendo un protocolo estándar [Obey y otros, J. Colloid Interface Sci. 1994, 163: 454-463; Goller y otros, Colloids Surfaces, 1997; 123-124: 183-193.] Se agrega una mezcla de DEDMS y TEMS con estequiometría 60:40 en agua desionizada (Millipore MilliQ, 93 % en volumen) al (28-30) % en peso y una solución de hidróxido de amonio (ACROS Organics 2 % en volumen) para obtener un volumen total de 10 ml. La muestra se agitó vigorosamente con un agitador vórtex durante 4 min a temperatura ambiente para iniciar la nucleación y luego se dejó polimerizar en un soporte giratorio a 10 rpm durante tres horas. A continuación, se mezclaron esferas de silicona completamente desarrolladas con suspensiones de agregados proteicos -4 en una fracción de volumen de 10 para obtener una concentración efectiva 6 de esferas de 4 x 10/ml.

Estas esferas polimerizadas comparten la mayoría de las propiedades con las gotas de aceite de silicona sin polimerizar. Su índice de refracción medio, 1,388 ± 0,002, excede el de DEDMS, 1,381 y TEMS, 1,383, determinado con un refractómetro de Abbe (Edmund Optics) y por caracterización holográfica.

Verificación de precisión y exactitud

Los datos de la Figura 3 se obtuvieron mediante la caracterización holográfica de un modelo de dispersión coloidal que consiste de una mezcla estequiométrica de cuatro tipos distintos de esferas coloidales monodispersas. Cada uno de los cuatro picos de la Figura 3A representa las propiedades de una de esas poblaciones. En cada caso, la distribución de propiedades medida holográficamente es consistente con la especificación del fabricante. Esta concordancia, junto con pruebas complementarias en publicaciones anteriores, establece la precisión y exactitud de la caracterización holográfica resuelta por partículas.

Este conjunto de datos también ilustra la capacidad única de la caracterización holográfica para caracterizar dispersiones coloidales heterogéneas. Otras técnicas podrían resolver la distribución de tamaño de cualquiera de los componentes coloidales monodispersos individualmente. Sin embargo, ninguna otra técnica podría resolver las cuatro poblaciones de esta mezcla.

Las Figuras 4A - 4D ofrecen una demostración experimental del intervalo de tamaños de partículas en el que la caracterización holográfica produce resultados útiles. Los 3 hologramas presentados aquí se registraron para 3 esferas de poliestireno diferentes dispersas en agua, una con un radio de ap% 0,237 mm, en el extremo pequeño del intervalo efectivo de la técnica, uno con un radio de ap % 0,800 mm, y el tercero con un radio de ap % 10,47 mm. Estos hologramas medidos (Figura 4A) se presentan junto con los correspondientes ajustes píxel por píxel (Figura 4B) para las predicciones de la teoría de la dispersión de la luz, que se parametrizaron por la posición tridimensional, el radio y el índice de refracción de cada partícula. La calidad de un ajuste se puede evaluar al trazar el perfil radial (Figura 4C) de la intensidad de imagen normalizada, b(r). Esto se obtiene al promediar el patrón de intensidad bidimensional sobre los ángulos alrededor del centro del patrón de dispersión. Las curvas obtenidas de los datos medidos se trazan en la Figura 4D dentro de las regiones sombreadas que representan las incertidumbres de medición. Las curvas obtenidas de los ajustes se superponen con los datos experimentales para su comparación. Los ajustes siguen los datos experimentales extremadamente bien en todo el intervalo de tamaños de partículas.

Caracterización de agregados de insulina subvisibles

Aunque la muestra de insulina bovina parecía transparente bajo inspección visual, los datos de la Figura 2 revelan una concentración de (3,9 ± 0,5) * 107 agregados subvisibles de insulina bovina por mililitro, que corresponde a una fracción de volumen de aproximadamente 10'3. La incertidumbre en este valor es el resultado de errores de identificación de características para las partículas más grandes y la incertidumbre en la velocidad del flujo. Los agregados con radios inferiores a 200 nm no se detectan por el sistema de caracterización holográfica y, por lo tanto, no se cuentan en estos totales. La distribución de las características de las partículas alcanza su punto máximo en un radio de 1,6 pm, y es amplia y multimodal. No se registraron agregados con radios superiores a 4,2 pm, lo que sugiere que tales agregados 4 a gran escala están presentes en concentraciones inferiores a 10/ml.

Los índices de refracción de los agregados varían en un amplio intervalo desde justo por encima del tampón, nn= 1,335, a un poco más de 1,42. Este intervalo es significativamente más pequeño que el valor de alrededor de 1,54 que se esperaría para cristales de proteína completamente densos. Sin embargo, este límite superior observado es consistente con las recientes mediciones de coincidencia de índices del índice de refracción de los agregados proteicos. Estas últimas mediciones se realizaron mediante la perfusión de agregados proteicos con fluido con índice coincidente y, por lo tanto, arrojan una estimación del índice de refracción de la proteína en sí. La caracterización holográfica, por el contrario, analiza un dispersor efectivo compuesto tanto por la proteína de índice más alto como por el tampón de índice más bajo que llena la esfera. Se demostró que una esfera tan efectiva tiene un índice de refracción efectivo intermedio entre los dos medios en una relación que depende de la porosidad real de la partícula. Las estructuras más porosas o abiertas tienen índices de refracción efectivos más pequeños. Además, se ha visto que la influencia de la porosidad en el índice de refracción efectivo es proporcionalmente mayor para partículas con radios mayores.

El modelo de esfera efectiva tiene en cuenta las tendencias generales en los datos de caracterización holográfica bajo la suposición de que los agregados proteicos tienen estructuras irregulares abiertas. Esta propuesta es consistente con estudios ex situ previos que demostraron que la insulina bovina forma agregados filamentosos.

La capacidad particular de la caracterización holográfica para registrar tanto el tamaño como el índice de refracción de partículas coloidales individuales ofrece, por lo tanto, información sobre la morfología de los agregados proteicos in situ y sin diluir y sin ninguna otra preparación especial. Esta capacidad también permite la caracterización holográfica para distinguir los agregados proteicos de los contaminantes comunes, tal como las gotas de aceite de silicona y las partículas de caucho, que plantean problemas para otras técnicas analíticas.

Caracterización de agregados BSA subvisibles

La Figura 5 muestra resultados de caracterización holográfica comparables para las dos muestras de albúmina de suero bovino. Los datos de la Figura 5A se obtuvieron para la muestra preparada sin sal adicional. En cuanto a la muestra de insulina 6, la caracterización holográfica de la muestra de BsA revela ± 0,5 * 10 agregados/ml en el intervalo de radios que van de 300 nm a 2,5 pm, y un radio de pico de 0,5 pm. No se observaron agregados con radios superiores a 2,8 pm, lo que sugiere que los agregados más grandes están presentes en concentraciones por debajo de 104/ml.

El panel superior en la Figura 5A es una proyección de la distribución conjunta, p(ap, np), en la distribución de tamaños agregados, p(ap). Esta proyección se parece más a los resultados proporcionados por otras técnicas de medición de tamaño, tal como la dispersión dinámica de la luz. Aunque la concentración observada de agregados proteicos subvisibles está por debajo del umbral de detección de d Ls , las mediciones de DLS revelan una concentración de aproximadamente 109 agregados/ml cuyos radios son inferiores a 100 nm y, por tanto, demasiado pequeños para la caracterización holográfica. En cuanto a las muestras de BI, la anticorrelación entre ap y np evidente en la Figura 5A-5F sugiere que los complejos BSA-PAH tienen una estructura abierta. Esto es consistente con estudios ex situ previos que demuestran que b Sa se agrega en estructuras débilmente ramificadas.

La adición de sal mejora la formación de complejos y aumenta el tamaño medio de los agregados en casi un factor de dos, y también amplía sustancialmente la distribución de los tamaños de los agregados. Estas tendencias se pueden ver en la Figura 5B. Las Figuras 5A-5F también incluyen proyecciones de las densidades de probabilidad relativa, p(ap), que enfatizan cómo la distribución del tamaño de los agregados cambia con las condiciones de crecimiento. Lo que omiten estas proyecciones es el cambio sorprendente en la distribución conjunta de los radios agregados y los índices de refracción de la Figura 5A a la Figura 5B. Este cambio sugiere que los agregados más grandes que crecen en presencia de sal añadida son sustancialmente más porosos. Esta información sobre la morfología de los agregados no la ofrecerían únicamente las distribuciones de tamaño.

Papel de la morfología agregada

Imágenes de microflujo

Las Figuras 4A-4D presentan comparaciones directas entre la caracterización holográfica y las MFI para una muestra representativa de 6 complejos BSA-PAH con morfologías que varían desde grupos compactos casi esféricos hasta estructuras alargadas extendidas. El holograma de cada agregado se compara con un ajuste de mínimos cuadrados no lineal con las predicciones de la teoría de Lorenz-Mie. La reducción del estadístico X2 de estos ajustes se usa para organizar los resultados desde los mejores ajustes en la parte superior hasta los peores ajustes en la parte inferior. Cada uno de los hologramas medidos también se usa para reconstruir una imagen volumétrica del agregado individual a través de microscopía de deconvolución de Rayleigh-Sommerfeld. El tamaño del grupo reconstruido puede compararse con el radio efectivo obtenido a partir de la caracterización holográfica.

Incluso los dos grupos más compactos de la Figura 4A parecen ser sustancialmente asféricos. Sus hologramas, sin embargo, se reproducen muy bien por los ajustes no lineales. Las métricas X2 para estos ajustes son cercanas a la unidad, lo que sugiere que el modelo describe adecuadamente el proceso de dispersión de la luz y que el ruido de un solo píxel se estimó correctamente. Los valores del radio del agregado son consistentes con el tamaño estimado a partir de la reconstrucción de Rayleigh-Sommerfeld. Los círculos con los radios que se determinaron holográficamente se superponen a las imágenes de campo claro reenfocadas numéricamente en la Figura 4D para su comparación. Este éxito es consistente con comparaciones previas de análisis de Lorenz-Mie y Rayleigh-Sommerfeld para esferas coloidales y bastones coloidales.

Los errores aumentan a medida que los agregados se vuelven cada vez más estructurados y asimétricos. Aun así, las estimaciones del tamaño característico están razonablemente en concordancia con el tamaño aparente de las reconstrucciones de campo claro, incluso en el peor de los casos. Esta robustez surge porque el tamaño efectivo del dispersor influye fuertemente en el tamaño y el contraste del pico de dispersión central y el mínimo de intensidad inmediatamente circundante. Por lo tanto, los ajustes fieles en esta región del patrón de interferencia producen valores razonables para el tamaño del dispersor. El contraste general del patrón en su conjunto codifica el índice de refracción del dispersor y, por lo tanto, es muy bajo para los grupos de estructura abierta.

Estos ejemplos representativos son consistentes con demostraciones anteriores de que la caracterización holográfica produce datos de caracterización útiles para esferas imperfectas y partículas asféricas. Particularmente para agregados más grandes, el valor estimado del índice de refracción describe una esfera efectiva. Sin embargo, el radio estimado es una métrica razonablemente robusta para el tamaño del agregado.

Independientemente de la capacidad de la caracterización holográfica para proporcionar información sobre la morfología, estos resultados demuestran que la microscopía holográfica detecta y cuenta de manera útil los agregados proteicos subvisibles en solución. Estas detecciones por sí mismas proporcionan información que es útil para caracterizar el estado de agregación de la solución de proteína in situ sin requerir una preparación amplia de la muestra. La gran profundidad de campo efectiva de la microscopía holográfica sirve para aumentar la velocidad de análisis con relación al análisis de imágenes de partículas convencional.

Al igual que la caracterización holográfica, MFI produce mediciones de radio resueltas por partículas que pueden usarse para calcular la concentración de partículas en contenedores de tamaño específico. Estos resultados pueden compararse directamente con las distribuciones de tamaño proyectadas producidas por la caracterización holográfica. Los datos de las Figuras 8A-8B muestran tal comparación para los complejos BSA-PAH con y sin sal añadida que se presentan en la Figura 5C-5D. Los resultados se presentan como el número de agregados, N(ap), por mililitro en un intervalo de tamaño de ± 100 nm alrededor del centro de cada contenedor en ap. Los datos de caracterización holográfica de la Figura 5B y 5D se reescalan en este gráfico para su comparación. Estudios independientes demuestran que el análisis de MFI produce estimaciones de tamaño fiables para agregados con radios mayores de 1 nm. La difracción provoca errores de medición sustanciales para partículas más pequeñas. Por lo tanto, recopilamos los resultados de MFI para partículas más pequeñas en contenedores de 600 nm de ancho en la Figura 8A y 8B, con la normalización correspondiente. El extremo inferior del intervalo de este contenedor se corresponde con los radios más pequeños informados por la caracterización holográfica. La concordancia entre la caracterización holográfica y las MFI es razonablemente buena en todo el intervalo de tamaños de partículas graficado. Ambas técnicas producen valores consistentes para la concentración total de 107 agregados/mL. Las MFI informan sistemáticamente un mayor número de agregados en el extremo grande del intervalo de tamaño y menos en el extremo pequeño. Esta diferencia se puede atribuir a los agregados más alargados e irregulares, tal como el último ejemplo de la Figura 4A-4D, cuyo tamaño se subestima por la caracterización holográfica. Este efecto de la morfología en la caracterización del tamaño holográfico se discutió previamente. Incluso en estos casos, la caracterización holográfica detecta correctamente la presencia de las partículas y las identifica como objetos de escala micrométrica. Tanto las MFI como la caracterización holográfica producen resultados consistentes para la densidad numérica total de agregados.

Para partículas en el extremo más pequeño del intervalo de tamaño, MFI proporciona recuentos de partículas pero no datos de caracterización útiles. La caracterización holográfica, por el contrario, ofrece estimaciones de tamaño fiables en este régimen. En toda la gama de tamaños considerados, la caracterización holográfica también proporciona estimaciones de los índices de refracción de las partículas.

Dispersión dinámica de la luz

Para verificar la presencia de agregados proteicos subvisibles en nuestras muestras, también realizamos mediciones de DLS. Mientras que la caracterización holográfica y las MFI producen mediciones resueltas por partículas, la DLS es una técnica de caracterización en masa. Los valores informados por DLS reflejan el porcentaje, P(ah), de luz dispersa que puede atribuirse a objetos de un radio hidrodinámico dado, ah. Por lo tanto, la distribución de tamaño que se obtiene se pondera por las características de dispersión de la luz de los objetos. Las intensidades de dispersión pueden traducirse al menos aproximadamente en concentraciones de partículas si las partículas son más pequeñas que la longitud de onda de la luz y si todas tienen el mismo índice de refracción. Las comparaciones directas no son posibles cuando los índices de refracción de las partículas varían con el tamaño, como es el caso de los agregados proteicos. En tales casos, DLS es útil para confirmar la presencia de dispersores dentro de un intervalo de tamaños. La Figura 6 presenta datos de DLS para las mismas muestras de complejos BSA-PAH que se presentan en la Figura 3. Para ambas muestras, la DLS revela la presencia de una gran cantidad de dispersores con radios menores a 100 nm. El umbral de detección de DLS para dispersores de este tamaño es aproximadamente 108 agregados/mL, según se determinó por estudios independientes. Concluimos que ambas muestras tienen al menos esta concentración de agregados de diámetro submicrométrico. Dichos objetos son más pequeños que el límite de detección para nuestra implementación de microscopía holográfica de video y, por lo tanto, no se resolvieron en la Figura 3.

La distribución cambia a tamaños más grandes en la muestra con sal añadida, lo que coincide con los resultados de la caracterización holográfica. Ambas muestras muestran una señal muy pequeña, se indica mediante una flecha en la Figura 9, para objetos subvisibles cuyo radio hidrodinámico es de 2,8 nm. Esto confirma la presencia de tales dispersores en nuestra muestra a una concentración apenas por encima del umbral de detección de DLS para objetos de ese tamaño.

La muestra con sal añadida también tiene un pico claro alrededor de ah= 400 ± 20 nm que se encuentra en el intervalo de detección de caracterización holográfica. El pico correspondiente en la Figura 5C aparece en un radio sustancialmente mayor, ap= 770 ± 20 nm. Una fuente probable de esta discrepancia es que la caracterización holográfica informa el radio de una esfera delimitadora efectiva, mientras que DLS informa el radio hidrodinámico, que puede ser sustancialmente más pequeño para estructuras abiertas. Otro factor que contribuye es que los agregados más grandes tienen índices de refracción efectivos más bajos y, por lo tanto, dispersan la luz proporcionalmente con menos fuerza que los agregados más pequeños. Este efecto también desplaza hacia abajo la distribución de tamaño aparente en las mediciones de DLS. Sin embargo, no afecta la caracterización holográfica, que informa tanto el tamaño como el índice de refracción de cada objeto de forma independiente.

Diferenciación holográfica de esferas de silicona a partir de agregados proteicos

DLS no puede distinguir los agregados proteicos de otras poblaciones de partículas en suspensión. MFI puede diferenciar algunos de estos contaminantes por morfología: las gotas de silicona, por ejemplo, suelen ser esféricas, mientras que los agregados proteicos suelen tener formas irregulares. La diferenciación morfológica funciona mejor para partículas que son sustancialmente más grandes que la longitud de onda de la luz, cuyas características estructurales no se ven oscurecidas por la difracción. A través de la información que proporciona sobre los índices de refracción de partículas individuales, la caracterización holográfica ofrece una vía adicional para distinguir objetos a escala micrométrica por composición. Demostramos esta capacidad al realizar mediciones de caracterización holográfica en muestras de BSA que se adulteran deliberadamente con esferas de silicona.

Caracterización holográfica de esferas de silicona

Las Figuras 10A-10B muestran datos de caracterización holográfica para esferas de silicona dispersas en agua desionizada. La muestra de la Figura 10A es comparativamente monodispersa con un radio promediado de la muestra de 0,75 ± 0,09 nm. Las partículas de la Figura 10B se extraen de una distribución más amplia de tamaños, con un radio medio de 0,87 ± 0,28 nm. Ambas muestras de esferas tienen índices de refracción consistentes con los valores reportados previamente para polidimetilsiloxano con 40 % de entrecruzamiento, np= 1,388 ± 0,005. Este intervalo se indica con una región sombreada en las Figuras 10A-10B.

A diferencia de los agregados proteicos, los índices de refracción de estas partículas no se correlacionan con sus tamaños. Esto se ve más fácilmente en la muestra polidispersa en la Figura 10B y es consistente con las gotas que tienen densidad uniforme y sin porosidad. Esperamos ver la misma distribución de propiedades de una sola partícula cuando estas esferas de silicona se codispersan con agregados proteicos.

Detección diferencial de esferas de silicona

Los datos de la Figura 11A se obtuvieron de una muestra de BSA preparada en las mismas condiciones que la Figura 5A pero con la adición de esferas de silicona monodispersas a una concentración de 4 x 106 partículas/ml. La distribución resultante de las propiedades de las partículas es claramente bimodal con una población que se asemeja a la obtenida a partir de agregados proteicos solos y la otra tiene un índice de refracción consistente con el de las esferas de silicona, np= 1,388 ± 0,005. La muestra de la Figura 11B se preparó de manera similar en condiciones comparables a las de la Figura 5C con la adición de esferas de silicona polidispersas de la muestra de la Figura 10B. La consistencia entre las características asociadas a los agregados proteicos en las Figuras 5A-5D y las Figuras 11A-11B demuestran que tanto el protocolo de preparación de muestras como la técnica de caracterización holográfica producen resultados reproducibles de una muestra a otra, y que la caracterización holográfica de los agregados proteicos no está influenciada por el presencia de partículas de impurezas extrañas.

Curiosamente, ambas distribuciones presentan un pequeño pico alrededor de ap= 2,8 nm que corresponde al pico en los datos DLS de la Figura 9. Esta característica no está presente en las Figuras 3A-3F. Es probable que esta población muy pequeña de agregados más grandes estuviera presente en esas muestras, pero a una concentración justo por debajo del umbral de detección en una medición de 10 minutos.

Las distribuciones de características asociadas a las gotas de silicona en las Figuras 11A-11B también concuerdan bien con los datos de caracterización holográfica de las gotas solas de las Figuras 10A-10B. Estos resultados demuestran que los datos del índice de refracción de la caracterización holográfica pueden ser útiles para distinguir los agregados proteicos de las gotas de aceite de silicona. Tal diferenciación no sería posible basándose solo en la distribución de tamaño, como puede verse en los datos proyectados en las Figuras 11A-11D.

La caracterización holográfica no puede diferenciar las gotas de silicona de los grupos de proteínas cuyo índice de refracción es el mismo que el de la silicona. Tal ambigüedad surge para las partículas más pequeñas que se analizan en las Figuras 11A-11D. Las gotas de silicona esféricas a veces pueden distinguirse de los agregados proteicos de forma irregular en estas condiciones mediante el uso de datos morfológicos obtenidos mediante análisis de deconvolución de los mismos hologramas. La distinción en estos casos aún sería menos clara que la que puede obtenerse con la medición de masa resonante (RMM), que diferencia la silicona de la proteína por el signo de su flotabilidad relativa. En los casos en que las partículas específicas no puedan diferenciarse de manera inequívoca, la presencia de gotas de silicona aún puede inferirse de los datos de caracterización holográfica porque tales partículas crean un grupo en el plano (ap,np) cuyo índice de refracción es independiente del tamaño. Las abundancias relativas de las dos poblaciones pueden inferirse, por ejemplo, mediante métodos de agrupamiento estadístico.

Discusión de resultados de ejemplo

Como sonda óptica de las propiedades de los agregados proteicos, la caracterización holográfica es ortogonal a técnicas no ópticas como el principio de Coulter o la medición de masa resonante (RMM). Como técnica de imagen, está relacionada con las imágenes de microflujo (MFI) y el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Sin embargo, la caracterización holográfica se beneficia de su gran profundidad de campo efectiva y su capacidad para monitorear el índice de refracción y el tamaño. Dado que las MFI y la caracterización holográfica pueden analizar una sola partícula con una sola instantánea, ambas son intrínsecamente más rápidas que NTA, que se basa en el análisis de series de tiempo.

La caracterización holográfica también está relacionada con las técnicas de dispersión de la luz, tal como la dispersión dinámica de la luz (DLS) y el oscurecimiento de la luz (LO). Ofrece una mayor sensibilidad de recuento para objetos de escala micrométrica que la dispersión dinámica de la luz y acceso a partículas más pequeñas que el oscurecimiento de la luz, sin requerir dilución. A diferencia de otras técnicas de dispersión, la caracterización holográfica no requiere los índices de refracción de las partículas como entradas, sino que proporciona el índice de refracción como salida.

Las comparaciones entre estas técnicas se resumen en la Tabla I, que es una comparación de técnicas de caracterización de alto rendimiento para agregados proteicos subvisibles. El intervalo de tamaño se refiere al radio de la esfera efectiva detectado por cada método. La cuarta columna indica si la técnica es capaz de medir la morfología agregada. Las referencias describen evaluaciones independientes de las capacidades de las técnicas para caracterizar agregados proteicos.

Método ^Tamaño

_[pin]Número/ml Morfología Comentarios

Caracterización holográfica 0,3-10 Í Q * 1 & Sí Mide tanto el tamaño como el índice de refracción

No requiere patrones de calibración.

Permite diferenciar por tamaño y composición.

Dispersión dinámica de la luz (DLS) 0,001-1 1«* 10iSÍ No Mide tamaño promediado de la muestra.

[27, 45] No diferenciación.

Zona de detección eléctrica (ESZ) 0,1-1000 i- IS i* No Requiere electrolito compatible.

Principio de Coulter [44] Típicamente requiere dilución de la muestra.

Requiere la calibración con patrones de peso.

El intervalo de tamaño se determina por selección de abertura.

No diferenciación.

Oscurecimiento de la luz (LO) [39, 44] 1-200 IOs-l<35 No Típicamente requiere dilución de la muestra.

Sensible a las variaciones del índice de refracción.

Requiere la calibración con patrones de peso.

No diferenciación.

Análisis dinámico de imágenes (DIA) 1^t00 10 * 1 i? Sí Diferenciación basada en la morfología Imágenes de microflujo (MFI) más que en la composición.

[39, 47]

Análisis de seguimiento de 0,03-1 W - l t P No El tiempo de medición aumenta con el nanopartículas(NTA) [27] radio de la partícula.

No diferenciación.

Medición de resonancia magnética 0,3-4 Irf* 10® No El tamaño de la partícula se estima (RMM) Arquímedes [39, 45, 47] indirectamente a partir de la masa.

Diferenciación entre partículas boyantes negativas y positivas.

TABLA I

Las mediciones presentadas aquí demuestran que la microscopía holográfica de video junto con el análisis de Lorenz-Mie pueden detectar, contar y caracterizar agregados proteicos subvisibles. La adquisición de datos es rápida, típicamente tarda más de 15 minutos y no requiere una preparación especial de la muestra. Una implementación es efectiva para agregados 4 que varían en un radio de 300 nm a 10 pm y en concentraciones de 10 agregados/ml a 108 agregados/ml. Los mismos hologramas que se usan para las mediciones de caracterización también pueden interpretarse para estimar la morfología de agregados proteicos individuales mediante retropropagación numérica. La calibración es sencilla y solo requiere la longitud de onda del láser, el aumento del microscopio y el índice de refracción del medio. Se cree que la caracterización holográfica de los agregados proteicos será útil para evaluar la estabilidad de las formulaciones biofarmacéuticas, para el control del proceso durante la fabricación y para el aseguramiento de la calidad tanto en el punto de venta como potencialmente en el punto de uso.

Anticorrelación entre tamaño agregado e índice de refracción

Como se indicó anteriormente, se observa una fuerte anticorrelación entre el tamaño agregado y el índice de refracción que se revelan en las Figuras 5A, 5C y 5E. Esto no se habría detectado mediante ninguna técnica de caracterización de partículas de la técnica anterior. Los valores para el índice de refracción de una sola partícula, además, son sustancialmente más pequeños que el valor de aproximadamente 1,45 que se esperaría para las proteínas en la longitud de onda de la formación de imágenes. De hecho, el índice de refracción estimado para las partículas más grandes no es mucho mayor que el del agua, 1,335.

La anticorrelación entre el tamaño y el índice de refracción junto con valores bajos para el índice de refracción se identificaron como características distintivas de la porosidad de las partículas. Sin embargo, en lugar de ser homogéneamente porosos, se cree que los agregados proteicos tendrán la estructura fractal que surge naturalmente a través del crecimiento por agregación.

Para probar esta idea, se modeló un agregado de proteínas como un grupo fractal de dimensión fractal D. El modelo fractal se seleccionó por su relación conocida con la geometría de agregados aleatorios y por simplicidad debido a la dependencia de un solo parámetro, la dimensión fractal D, para predecir la densidad. Un experto en la técnica apreciará que pueden usarse otros modelos apropiados para predecir las propiedades del agregado de proteínas, incluida la densidad. La fracción de volumen q> de proteínas de radio a0 dentro de un agregado de radio ap por lo tanto es

Esta proporción del grupo se compone de un material con índice de refracción ri⁰. El resto del volumen presumiblemente se llena con el medio fluido, que tiene un índice de refracción más bajo, r ^m. El índice de refracción aparente, r ^p , de la partícula como un todo viene dado por la teoría del medio efectivo

donde el factor de Lorenz-Lorentz es

A partir de esto,

Incluso si n0 y a0 no se conocen independientemente, esta relación de escala proporciona un medio para caracterizar la morfología de una población de agregados mediante la estimación de la dimensión fractal promediada para el conjunto.

Los datos de la Figura 6A-6B muestran los resultados de tal análisis. La Figura 6A compila todos los datos de las Figuras 5A, 5C y 5E bajo la suposición de que surgiría la misma morfología en los tres conjuntos de condiciones de crecimiento. Esta suposición se confirma en la Figura 6B que muestra los mismos datos graficados de acuerdo con la relación de escala en la Ec. (4). En particular, la tendencia lineal en la Figura 6B apoya las suposiciones subyacentes a la Ec. (4), incluido la suposición de que las tres poblaciones de agregados tienen comportamientos de crecimiento consistentes.

Las líneas discontinuas superpuestas a los datos de la Figura 6B indican pendientes consistentes con D= 1, 1,2 y 1,4, se obtiene la mejor concordancia para D= 1,2. Este resultado sugiere que los agregados de BSA son filamentosos, con pocas ramificaciones. El modelo fractal puede usarse para grumos densos (D = 3), cadenas lineales (D = 1) así como también estructuras intermedias (típicamente D> 3> 1). La aparente simetría esférica de los hologramas sugiere, por tanto, que los agregados se componen de grupos de filamentos. Esto es consistente con los estudios de microscopía electrónica de agregación de BSA en condiciones comparables. La estimación de la dimensión fractal a través de la caracterización holográfica mejora la microscopía electrónica porque puede realizarse i r situ y no conlleva ninguna de las transformaciones estructurales inherentes a la preparación de la muestra. La caracterización holográfica también ofrece ventajas sobre la dispersión de luz convencional porque no requiere estimaciones del índice de refracción del monómero. Todos los datos de calibración necesarios para la medición están disponibles a partir de los datos de caracterización de una sola partícula y la calibración general del instrumento.

El éxito de este análisis de escala proporciona evidencia adicional de que los valores estimados holográficamente para el radio y el índice de refracción de los agregados proteicos individuales reflejan con precisión las propiedades reales de los agregados. Este resultado no es irrazonable dada la simetría observada de los hologramas de un solo agregado, como el ejemplo de la Figura 1A, y su facilidad para ajustarse al resultado de Lorenz-Mie para esferas ideales. Estas observaciones sugieren que la caracterización holográfica puede ser efectiva para analizar las propiedades de los agregados proteicos individuales y, por lo tanto, para evaluar las propiedades de las dispersiones de los agregados proteicos. Más allá de proporcionar información sobre la distribución de tamaño de los agregados proteicos, la caracterización holográfica también ofrece información sobre la composición y la morfología a través del índice de refracción.

La información proporcionada por la caracterización holográfica debería proporcionar información útil para formular dispersiones de proteínas, particularmente en aplicaciones donde el tamaño de los agregados debe controlarse y limitarse. De manera similar, las implementaciones en tiempo real de la caracterización holográfica deberían ser útiles para el control de procesos y el aseguramiento de la calidad en tales aplicaciones.

Diferenciación

Las Figuras 5A, 5C y 5E ilustran la capacidad, en una modalidad, de los sistemas y métodos descritos en la presente descripción para proporcionar diferenciación. En este contexto, "diferenciación" es la capacidad de distinguir un material deseado, tal como agregados proteicos, de otros materiales en una suspensión. Los datos del índice de refracción proporcionados por la caracterización holográfica pueden usarse para distinguir los agregados proteicos de los contaminantes tal como las gotas de silicona. Esto es importante porque los contaminantes, incluidas las gotas de silicona y las partículas de caucho, a menudo llegan a las soluciones de proteínas y pueden confundirse con agregados proteicos cuando se usan otras técnicas de caracterización. Tal identificación errónea puede sugerir que hay un problema con el producto, cuando no existe ningún problema, o no identificar un lote de producto contaminado.

Además, las Figuras 12A-12C ilustran IgG humana, aceite de silicona y los dos combinados en una muestra. Como puede observarse, los agregados proteicos (Figura 12A) y el aceite de silicona (Figura 12B) tienen firmas muy diferentes y son claramente distinguibles cuando están en la misma muestra (Figura 12C). La firma de aceite de silicona es un ejemplo de libro de texto de la caracterización holográfica de emulsiones de aceite, mientras que la proteína puede distinguirse fácilmente.

Mediante el uso de los sistemas y métodos descritos en la presente descripción, pueden diferenciarse los objetos por sus índices de refracción, que es una capacidad única. Por lo tanto, la diferenciación es por la composición real, con la que está directamente relacionado el índice de refracción, más que por algún otro aspecto como la morfología (que puede ser la misma para diferentes materiales, por lo que se obtienen resultados falsos, ya sean falsos positivos o falsos negativos). Por ejemplo, una técnica popular usa la morfología para distinguir la silicona de la proteína, bajo la suposición de que las gotas de silicona son esféricas y los agregados proteicos no. Sin embargo, esta suposición falla en varios casos importantes, incluso para pequeños agregados proteicos donde el tamaño está por debajo de la capacidad de la técnica para diferenciarlos de las esferas.

Implementación informática

Como se muestra en la Figura 7, por ejemplo, un medio accesible por ordenador 120 (por ejemplo, como se describió en la presente descripción, un dispositivo de almacenamiento tal como un disco duro, disquete, dispositivo de memoria, CD-ROM, RAM, ROM, etc., o una colección de estos) puede proporcionarse (por ejemplo, en comunicación con el sistema de procesamiento 110). El medio accesible por ordenador 120 puede ser un medio accesible por ordenador no transitorio. El medio accesible por ordenador 120 puede contener instrucciones ejecutables 130 en el mismo. Además o alternativamente, puede proporcionarse un sistema de almacenamiento 140 por separado del medio accesible por ordenador 120, que puede proporcionar las instrucciones al sistema de procesamiento 110 para configurar el sistema de procesamiento para ejecutar determinados procedimientos, procesos y métodos ilustrativos, como se describió en la presente descripción, por ejemplo. Las instrucciones pueden incluir una pluralidad de conjuntos de instrucciones. Por ejemplo, en algunas implementaciones, las instrucciones pueden incluir instrucciones para aplicar energía de radiofrecuencia en una pluralidad de bloques de secuencia a un volumen, donde cada uno de los bloques de secuencia incluye al menos una primera etapa. Las instrucciones pueden incluir además instrucciones para repetir la primera etapa sucesivamente hasta que la magnetización al comienzo de cada uno de los bloques de secuencia sea estable, instrucciones para concatenar una pluralidad de segmentos de imagen, que corresponden a la pluralidad de bloques de secuencia, en un solo segmento de imagen continuo e instrucciones para codificar al menos un parámetro de relajación en el único segmento de formación de imágenes continuo.

El sistema 100 también puede incluir un dispositivo de visualización o salida, un dispositivo de entrada tal como un teclado, ratón, pantalla táctil u otro dispositivo de entrada, y puede conectarse a sistemas adicionales a través de una red lógica. Muchas de las modalidades descritas en la presente descripción pueden practicarse en un entorno de red mediante el uso de conexiones lógicas a uno o más ordenadores remotos que tengan procesadores. Las conexiones lógicas pueden incluir una red de área local (LAN) y una red de área amplia (WAN) que se presentan aquí a manera de ejemplo y no de limitación. Estos entornos de redes son habituales en las redes informáticas de oficinas, toda la empresa, intranets e Internet y pueden usar una amplia variedad de protocolos de comunicación diferentes. Los expertos en la técnica apreciarán que tales entornos informáticos de red pueden típicamente abarcar muchos tipos de configuraciones de sistemas informáticos, que incluyen ordenadores personales, dispositivos portátiles, sistemas de multiprocesadores, electrónicos programables para consumo o basados en microprocesadores, ordenadores en red, miniordenadores, ordenadores centrales y similares. Las modalidades de la invención también pueden practicarse en entornos informáticos distribuidos donde las tareas se realizan mediante dispositivos de procesamiento local y remoto que están conectados (ya sea mediante enlaces cableados, enlaces inalámbricos o mediante una combinación de enlaces cableados o inalámbricos) a través de una red de comunicaciones. En un entorno de sistema informático distribuido, los módulos de programa pueden localizarse en dispositivos de almacenamiento de memoria tanto remotos como locales.

Se describen varias modalidades en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que pueden implementarse mediante un producto de programa que incluye instrucciones ejecutables por ordenador, tales como código de programa, ejecutado por ordenadores en entornos en red. Generalmente, los módulos del programa incluyen rutinas, programas, objetos, componentes, estructuras de datos, etc. que realizan tareas particulares o implementan tipos de datos abstractos particulares. Las instrucciones ejecutables por ordenador, las estructuras de datos asociadas y los módulos de programa representan ejemplos de código de programa para ejecutar pasos de los métodos descritos en la presente descripción. La secuencia particular de tales instrucciones ejecutables o estructuras de datos asociadas representa ejemplos de actos correspondientes para implementar las funciones descritas en tales etapas.

Las implementaciones de software y web de la presente invención podrían lograrse con técnicas de programación estándar con lógica basada en reglas y otra lógica para lograr las diversas etapas de búsqueda en bases de datos, etapas de correlación, etapas de comparación y etapas de decisión. Además debe tenerse en cuenta que las palabras "componente" y "módulo", como se usan en la presente descripción y en las reivindicaciones, están destinadas a abarcar implementaciones que usan una o más líneas de código de software y/o implementaciones de hardware y/o equipos para recibir entradas manuales.

Con respecto al uso de sustancialmente cualquier término en plural y/o singular en la presente descripción, los expertos en la técnica pueden traducir del plural al singular y/o del singular al plural según sea apropiado para el contexto y/o aplicación. Las diversas permutaciones de singular/plural pueden establecerse expresamente en la presente descripción en aras de la claridad.

La anterior descripción de las modalidades ilustrativas se ha presentado con fines de ilustración y descripción. No se pretende que sea exhaustiva o limitativa con respecto a la forma precisa descrita, y son posibles modificaciones y variaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para caracterizar una muestra de una pluralidad de agregados proteicos, que comprende:

hacer fluir la muestra a través de un volumen de observación de un microscopio holográfico;

generar un primer conjunto de hologramas basado en microscopía holográfica de video de un primer conjunto de agregados proteicos dentro del volumen de observación por primera vez;

caracterizar cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto de agregados proteicos como una esfera; y

determinar el índice de refracción y el radio de la esfera caracterizada del primer conjunto de agregados proteicos;

generar un segundo conjunto de hologramas basado en microscopía holográfica de video de un segundo conjunto de agregados proteicos dentro del volumen de observación por segunda vez;

caracterizar cada uno de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos como una esfera; y

determinar el índice de refracción y el radio para cada uno de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos;

en donde la caracterización de cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto y el segundo conjunto comprende además modelar cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto y del segundo conjunto como un grupo fractal de dimensión fractal D donde:

Por la presente, 0 es la fracción de volumen de proteínas, ao es el radio de la proteína y aPes el radio del agregado proteico.

2. El método de la reivindicación 1, en donde además la fracción de volumen de proteína tiene un índice de refracción de no y un volumen restante es un medio fluido con un índice de refracción de nm, lo que produce el índice de refracción aparente del agregado proteico de np.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además caracterizar la morfología del primer conjunto de agregados proteicos y el segundo conjunto de agregados proteicos con base en la estimación de una dimensión fractal promediada para el conjunto.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la estimación de la dimensión fractal promediada para el conjunto comprende:

donde

5. El método de la reivindicación 1, que comprende además monitorear la síntesis de la pluralidad de partículas con base en la comparación del índice de refracción y radio de la primera partícula y el radio e índice de refracción de la segunda partícula.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el flujo de la muestra a través del volumen de observación del microscopio holográfico es a una velocidad de hasta 100 ^m s-1.

7. El método de la reivindicación 1, que comprende además, antes de generar el primer conjunto de hologramas, añadir sal.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la determinación del índice de refracción y el radio comprende la aplicación de la teoría de Lorenz-Mie.

9. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar si concluyó la síntesis de la pluralidad de partículas.

10. El método de la reivindicación 1, en donde la determinación del índice de refracción y el radio de los agregados proteicos del primer conjunto de agregados proteicos y la determinación del índice de refracción y el radio de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos comprenden determinar una densidad de probabilidad para el índice de refracción y el radio de los agregados proteicos del primer conjunto de agregados proteicos y la determinación de una densidad de probabilidad para el índice de refracción y el radio de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos, respectivamente.

11. El método de la reivindicación 1, en donde al menos un agregado de proteínas está presente tanto en el primer conjunto de agregados proteicos como en el segundo conjunto de agregados proteicos y además en donde se determina la trayectoria del al menos un agregado proteico.