ES2901608T3 - Caracterización holográfica de agregados proteicos - Google Patents
Caracterización holográfica de agregados proteicos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2901608T3 ES2901608T3 ES17750639T ES17750639T ES2901608T3 ES 2901608 T3 ES2901608 T3 ES 2901608T3 ES 17750639 T ES17750639 T ES 17750639T ES 17750639 T ES17750639 T ES 17750639T ES 2901608 T3 ES2901608 T3 ES 2901608T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein aggregates
- protein
- aggregates
- refractive index
- radius
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 140
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 140
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 title claims abstract description 105
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 238000010865 video microscopy Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 84
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 2
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 49
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 34
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 27
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 27
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 24
- 238000012008 microflow imaging Methods 0.000 description 21
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 15
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 10
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 10
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 9
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- YYLGKUPAFFKGRQ-UHFFFAOYSA-N dimethyldiethoxysilane Chemical compound CCO[Si](C)(C)OCC YYLGKUPAFFKGRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 238000012538 light obscuration Methods 0.000 description 5
- -1 poly(allylamine hydrochloride) Polymers 0.000 description 5
- 238000012055 resonant mass measurement Methods 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 229920002518 Polyallylamine hydrochloride Polymers 0.000 description 4
- 102100039641 Protein MFI Human genes 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011066 ex-situ storage Methods 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 238000011192 particle characterization Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- NKLYMYLJOXIVFB-UHFFFAOYSA-N triethoxymethylsilane Chemical compound CCOC([SiH3])(OCC)OCC NKLYMYLJOXIVFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000001246 colloidal dispersion Methods 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000275 quality assurance Methods 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010945 base-catalyzed hydrolysis reactiony Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001093 holography Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000005055 memory storage Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000011861 particles by composition Substances 0.000 description 1
- 239000011860 particles by size Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012731 temporal analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000700 time series analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- CPUDPFPXCZDNGI-UHFFFAOYSA-N triethoxy(methyl)silane Chemical compound CCO[Si](C)(OCC)OCC CPUDPFPXCZDNGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
- G01N15/0211—Investigating a scatter or diffraction pattern
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
- G01N15/0227—Investigating particle size or size distribution by optical means using imaging; using holography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
- G01N15/147—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle the analysis being performed on a sample stream
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N2015/0038—Investigating nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N2015/0042—Investigating dispersion of solids
- G01N2015/0053—Investigating dispersion of solids in liquids, e.g. trouble
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
- G01N15/0211—Investigating a scatter or diffraction pattern
- G01N2015/0222—Investigating a scatter or diffraction pattern from dynamic light scattering, e.g. photon correlation spectroscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
- G01N15/0227—Investigating particle size or size distribution by optical means using imaging; using holography
- G01N2015/0233—Investigating particle size or size distribution by optical means using imaging; using holography using holography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1434—Optical arrangements
- G01N2015/1454—Optical arrangements using phase shift or interference, e.g. for improving contrast
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Holo Graphy (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
Un método para caracterizar una muestra de una pluralidad de agregados proteicos, que comprende: hacer fluir la muestra a través de un volumen de observación de un microscopio holográfico; generar un primer conjunto de hologramas basado en microscopía holográfica de video de un primer conjunto de agregados proteicos dentro del volumen de observación por primera vez; caracterizar cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto de agregados proteicos como una esfera; y determinar el índice de refracción y el radio de la esfera caracterizada del primer conjunto de agregados proteicos; generar un segundo conjunto de hologramas basado en microscopía holográfica de video de un segundo conjunto de agregados proteicos dentro del volumen de observación por segunda vez; caracterizar cada uno de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos como una esfera; y determinar el índice de refracción y el radio para cada uno de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos; en donde la caracterización de cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto y el segundo conjunto comprende además modelar cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto y del segundo conjunto como un grupo fractal de dimensión fractal D donde: **(Ver fórmula)** Por la presente, Φ es la fracción de volumen de proteínas, a0 es el radio de la proteína y apes el radio del agregado proteico.
Description
DESCRIPCIÓN
Caracterización holográfica de agregados proteicos
Antecedentes de la invención
Las proteínas y los agregados proteicos son cada vez más importantes para aplicaciones comerciales. La caracterización de los agregados proteicos representa un desafío, en particular para la implementación a gran escala y con respecto a la caracterización en tiempo real o casi en tiempo real. La tendencia de las proteínas a agruparse en grupos es una problemática importante en la fabricación de productos biofarmacéuticos a base de proteínas y en la evaluación de su seguridad. Además de reducir la eficacia terapéutica, los agregados proteicos provocan respuestas inmunitarias que dan lugar a eventos clínicos adversos con el potencial de dañar la salud de las personas afectadas. Detectar, contar y caracterizar los agregados proteicos es esencial para comprender las vías críticas responsables de la agregación de proteínas. Las tecnologías establecidas para la caracterización de partículas, tal como la dispersión dinámica de la luz, funcionan bien para la caracterización in situ de agregados a escala submicrométrica. Otros, tal como las imágenes de microflujo, funcionan mejor para agregados visibles de más de cinco micrómetros aproximadamente. Comparativamente, pocas técnicas establecidas sondean el intervalo subvisible de 100 nm a 10 pm. La necesidad de técnicas de caracterización mejoradas es particularmente aguda en aplicaciones que requieren monitoreo en tiempo real de agregados subvisibles en su entorno nativo.
La tendencia de las proteínas a agruparse y la capacidad de detectarlas y caracterizarlas es una consideración importante. Existe la necesidad de sistemas y métodos para caracterizar proteínas con precisión y rapidez.
El documento "Holographic Characterization of Protein Aggregates" (Chen Wang y otros, Journal of Pharmaceutical Sciences, Sociedad Estadounidense de Farmacología, EE. UU., Vol. 105, Núm. 3, 2 de febrero de 206, páginas 1074 a 1085) describe el uso de microscopía holográfica de video para detectar, contar y caracterizar agregados proteicos individuales a escala micrométrica a medida que fluyen por un canal de microfluidos en su tampón nativo.
El documento "Flow Visualization and Flow Cytometry with Holographic Video Microscopy" (Fook Cheong y otros, Optics Express, vol. 17, Núm. 15, 1 de julio de 2009, páginas 13071 a 13079) describe el uso del análisis de una secuencia de video capturada por un microscopio holográfico en línea cuadro por cuadro para detectar los movimientos tridimensionales de partículas coloidales individuales y medir simultáneamente sus tamaños e índices de refracción.
Resumen de la invención
La invención se refiere a un método para caracterizar una muestra de una pluralidad de agregados proteicos de acuerdo con la reivindicación 1. Las características opcionales o preferidas se establecen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de las figuras
Las características anteriores y otras de la presente descripción se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas, tomadas junto con las figuras adjuntas. Entendiendo que estas figuras representan solo varias modalidades de acuerdo con la descripción y, por lo tanto, no deben considerarse limitantes de su alcance, la descripción se describirá con especificidad y detalle adicionales mediante el uso de los dibujos adjuntos.
La Figura 1A ilustra una holografía medida de un agregado de BSA de 1 micrómetro de diámetro. La Figura 1B ilustra un ajuste basado en la teoría de dispersión de la luz de Lorenz-Mie.
La Figura 2 muestra los agregados proteicos que fluyen por un canal de microfluidos en forma de hologramas a medida que pasan a través de un haz láser. Un holograma experimental típico se reproduce como una imagen en escala de grises en la figura. Cada holograma se graba con una cámara de video y se compara con las predicciones de la teoría de Lorenz-Mie para medir el radio de cada agregado, ap, e índice de refracción, np. La gráfica de dispersión insertada muestra datos experimentales para 3000 agregados subvisibles de insulina bovina, donde cada punto de datos representa las propiedades de un solo agregado y los colores denotan la densidad de probabilidad relativa p(ap, np) para observaciones en el plano (ap, np).
La Figura 3A es un diagrama de dispersión de radio ap e índice de refracción npobtenido con la caracterización holográfica de una dispersión coloidal heterogénea compuesta por una mezcla de cuatro tipos diferentes de partículas. Se grafican los resultados para 20 000 partículas. Los cruces superpuestos indican la especificación del fabricante para cada una de las cuatro poblaciones. Estos resultados establecen la capacidad de la caracterización holográfica para diferenciar partículas tanto por composición así como también por tamaño. La Figura 3B muestra hologramas medidos de esferas de poliestireno coloidal en agua junto con ajustes, estos demuestran el intervalo de tamaños de partículas susceptibles de caracterización holográfica. Estos ejemplos típicos se obtuvieron para esferas con radios ap = 0,237 mm (región de interés de 224 píxeles x 224 píxeles), 0,800 mm (356 píxeles x 356 píxeles) y 10,47 mm (608 píxeles x 608 píxeles). El ajuste a cada holograma produce valores para el radio de la partícula, ap, y el índice de refracción, np. Los perfiles radiales, b(r), se obtienen a partir
de estos hologramas y sus ajustes al promediar la intensidad normalizada sobre los ángulos alrededor del centro de cada característica, y se grafican como una función de la distancia r desde el centro de la característica. Los datos experimentales se trazan como curvas más oscuras (azules) dentro de las regiones sombreadas que representan la incertidumbre de la medición en ese radio. Los ajustes se superponen como curvas más claras (naranja) y se acercan bastante a los datos experimentales.
Las Figuras 4A-4D muestran la influencia de la morfología agregada en la caracterización holográfica. Hologramas de agregados típicos que se disponen en orden de discrepancia creciente entre los hologramas medidos y ajustados. La Figura 4A muestra regiones de interés de 160 píxeles x 160 píxeles del campo de visión del microscopio, centradas en las características identificadas automáticamente como complejos candidatos de BSA-PAH. La Figura 4B muestra ajustes a la teoría de Lorenz-Mie para hologramas formados por esferas. La Figura 4C muestra perfiles radiales del holograma experimental (curvas negras) superpuestos con el perfil radial de los ajustes (curvas rojas). Las regiones sombreadas representan la incertidumbre experimental estimada. La Figura 4D muestra reconstrucciones de Rayleigh-Sommerfeld de las estructuras tridimensionales de los agregados obtenidas de los hologramas experimentales. Las imágenes en escala de grises son proyecciones de las reconstrucciones, que se asemejan a imágenes equivalentes de campo claro con un enfoque óptimo. Los círculos superpuestos indican estimaciones de ajuste para el tamaño de partícula.
Las Figuras 5A-5F ilustran el impacto de los contaminantes en la distribución medida del radio ap e índice de refracción np de complejos BSA-PAH. La Figura 5A (índice de refracción) y la Figura 5B (distribución de tamaño) ilustran los resultados de BSA en complejo con PAH en tampón Tris (1100 agregados). La Figura 5C (índice de refracción) y la Figura 5D (distribución de tamaño) ilustran los resultados para la misma muestra de las Figuras 5A y 5B pero con NaCl 0,1 M (1200 agregados); la Figura 5E (índice de refracción) y la Figura 5F (distribución de tamaño) ilustran los resultados de una muestra preparada en las mismas condiciones que las Figuras 5C y 5D con esferas de silicona añadidas (1600 características). Cada punto en los gráficos de dispersión (Figuras 5a , 5C y 5E) representa las propiedades de un solo agregado y se coloreó por la densidad relativa de observaciones, p(ap, np ). Las Figuras 5B, 5D y 5F presentan la distribución de tamaño asociada p(ap) dentro de una región sombreada que representa el error instrumental y estadístico
La Figura 6A muestra datos combinados para las tres muestras de BSA. La Figura 6B muestra los datos reescalados de acuerdo con la Ecuación 4.
La Figura 7 ilustra un sistema informático para su uso con determinadas implementaciones.
Las Figuras 8A-8B muestran una comparación de distribuciones de tamaño medidas con imágenes de microflujo y caracterización holográfica. Cada punto representa el número de partículas por mililitro de solución en un intervalo de ± 100 nm alrededor del radio central del punto. La Figura 8A muestra una muestra sin sal añadida (muestra de las Figuras 5A-5B). La Figura 8B muestra una muestra con NaCl añadido (muestra de las Figuras 5C-5D).
La Figura 9 muestra una caracterización de complejos BSA-PAH por dispersión dinámica de la luz (DLS). Los valores representan el porcentaje, P(ah), de la intensidad de la luz dispersa debido a los dispersores de un radio hidrodinámico dado, ah. La flecha indica un pequeño pico en ambas distribuciones alrededor de ah = 2,8 mm.
Las Figuras 10A y 10B muestran datos de caracterización holográfica para esferas de silicona dispersas en agua desionizada. La región sombreada en gris indica el intervalo de índices de refracción esperados para estas partículas con base en su composición. La Figura 10A muestra una muestra monodispersa (600 esferas). La Figura 10B muestra una muestra polidispersa (600 esferas).
Las Figuras 11A-11D muestran la medición holográfica de la densidad de probabilidad relativa, r(ap,np), de radio de partícula e índice de refracción para suspensiones de complejos BSA-PAH enriquecidos con esferas de silicona añadidas. La Figura 11A muestra una muestra preparada en las mismas condiciones que en las Figuras 5A-5B enriquecida con las esferas monodispersas de la Figura 10A (características de 2000). La Figura 11B muestra una muestra preparada en las mismas condiciones que en la Figura 5C-5D enriquecida con las esferas polidispersas de la Figura 10B (1600 características). Las Figuras 11C y 11D muestran la densidad de probabilidad relativa proyectada, r(ap), para el radio de partícula de los datos de la Figura 11A y la Figura 11B, respectivamente.
Las Figuras 12A-12C ilustran los resultados que muestran la distinción de proteína y aceite de silicona por separado: La Figura 12A muestra 1 mg/ml de IgG humana en tampón PBS, la Figura 12B muestra 3 mg/ml de aceite de silicona en tampón PBS. Estas muestras se mezclaron como se muestra en la Figura 12C, con concentraciones finales de 0,5 mg/ml de IgG humana y 1,5 mg/ml de aceite de silicona en tampón PBS. Todas las mediciones se realizaron mediante el uso de un objetivo de 40X (Nikon 0.75NA) y un canal de microfluidos de 100 |jm de profundidad (j-Slide VI 0.1 sin recubrimiento)
Descripción detallada de las modalidades preferidas
En la siguiente descripción detallada, se hace referencia a las figuras adjuntas, que forman parte de esta. En los dibujos, los símbolos similares identifican típicamente componentes similares, a menos que se indique de cualquier otra manera. Las modalidades ilustrativas descritas en la descripción detallada y las figuras no pretenden ser limitantes. Pueden usarse otras modalidades y pueden realizarse otros cambios, sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
La caracterización holográfica de los agregados proteicos fractales proporciona información sobre el tamaño y el índice de refracción de los agregados individuales en solución. Los datos de caracterización de un solo agregado pueden combinarse en la distribución conjunta para el tamaño y el índice de refracción en una dispersión de agregados, sin suposiciones a priori sobre la naturaleza de la distribución. La interpretación de la distribución conjunta del índice de tamaño medido para un conjunto de agregados proteicos en términos de un modelo de medio efectivo para la dispersión por agregados fractales produce una estimación de la dimensión fractal media de los agregados y, por lo tanto, su morfología. Cuando esta interpretación se aplica a dispersiones de albúmina de suero bovino agregada, la dimensión fractal extraída, D= 1,2 coincide con informes anteriores basados en técnicas de medición ex situ como la microscopía electrónica y la microscopía de fuerza atómica. El éxito de este análisis de escala de población promediada da confianza a los datos de caracterización de un solo agregado en los que se basa y, por lo tanto, a la propuesta novedosa de que la caracterización holográfica puede usarse para analizar el tamaño, la estructura y la morfología de agregados proteicos a escala micrométrica.
La tendencia de las proteínas a agregarse en grupos está implicada en los procesos patológicos y también afecta la eficacia de los productos farmacéuticos a base de proteínas. Aquí, se introduce un método basado en microscopía holográfica de video para detectar, contar y caracterizar agregados proteicos individuales que rápidamente acumula estadísticas de población en agregados subvisibles en solución en su estado natural, sin dilución o condiciones especiales de solvente, y sin la necesidad de químicos o etiquetas ópticas. El uso de microscopía holográfica de video, incluido el análisis de Lorenz-Mie, es conocido para la caracterización de partículas esféricas homogéneas. Los agregados proteicos presentan un desafío único ya que no son homogéneos ni esféricos. Los agregados proteicos suelen tener una forma irregular y pueden ser estructuras delgadas muy ramificadas. En la presente descripción se describen sistemas y métodos que usan una determinación de las propiedades de una esfera efectiva, una que incluye el agregado y el medio fluido circundante e intersticial. Las estimaciones del radio y el índice de refracción de esta esfera definida se ajustan a las del agregado proteico real mediante el uso de modelos, como el modelo fractal. En una aplicación, los sistemas y métodos se usan sin caracterización de los materiales, para proporcionar información con respecto al "recuento" de los agregados proteicos en su entorno nativo, en una modalidad casi en tiempo real.
Los ejemplos de prueba de concepto de este método se realizan a través de mediciones en agregados de albúmina de suero bovino (BSA) e insulina bovina (BI) en el intervalo de radios de 300 nm a 10 pm. La acumulación de mediciones resueltas por partículas en distribuciones conjuntas para el tamaño de los agregados y el índice de refracción ofrece información sobre la influencia de las condiciones de crecimiento en el mecanismo de agregación de proteínas. Un análisis de escala de esta distribución conjunta produce estimaciones para la dimensión fractal de los agregados que son consistentes con las mediciones ex situ y, por lo tanto, ofrece información sobre la morfología de los agregados. El éxito de este análisis de escala sugiere que los resultados para los tamaños de un solo grupo y los índices de refracción reflejan con precisión las propiedades de los agregados individuales.
La técnica de medición, tal como la modalidad de la Figura 2, se basa en la microscopía holográfica de video en línea, una técnica que crea hologramas de objetos individuales en el campo de visión del microscopio. Un microscopio holográfico ilumina su muestra con un haz láser colimado en lugar de una fuente de luz incoherente convencional. La luz dispersada por un objeto pequeño, como un agregado de proteína, por lo tanto interfiere con el resto del haz en el plano focal de un microscopio óptico. El microscopio amplía el patrón de interferencia y lo proyecta sobre la cara de una cámara de video, que registra el patrón de intensidad que varía espacialmente, /(r). Cada imagen en la secuencia de video resultante es una instantánea holográfica de los dispersores que pasan a través del haz láser y puede analizarse con predicciones basadas en la teoría de dispersión de la luz de Lorenz-Mie para medir el radio de cada agregado ap , índice de refracción, np , y posición tridimensional, rp. La caracterización holográfica se desarrolló originalmente para analizar partículas esféricas (ver, por ejemplo, Lee SH, Roichman Y, Yi GR, Kim SH, Yang SM, van Blaaderen A, y otros, Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy. Optar Express. 2007; 15: 18275-18282, incorporado en la presente descripción como referencia). Generalizar rigurosamente el análisis para dar cuenta de la estructura detallada de objetos asféricos y no homogéneos es prohibitivamente lento debido a la complejidad analítica y la carga computacional asociadas. El modelo esférico idealizado se usa para caracterizar agregados proteicos entendiendo que los resultados deben interpretarse como una referencia a una esfera efectiva que comprende tanto el agregado de proteínas como el medio fluido que llena la esfera efectiva.
La Figura 2 ilustra unos agregados proteicos que fluyen por un canal de microfluidos y forman hologramas a medida que pasan a través de un haz láser. Un holograma experimental típico se reproduce como una imagen en escala de grises en la figura. Cada holograma se graba con una cámara de video y se compara con las predicciones de la teoría de Lorenz-Mie para medir el radio de cada agregado, ap, e índice de refracción, np . El gráfico de dispersión muestra datos experimentales para 3000 agregados subvisibles de insulina bovina, cada punto de datos representa las
propiedades de un solo agregado y los colores indican la densidad de probabilidad relativa p(ap, np ) para observaciones en el plano (ap, np ).
El sistema y los métodos de caracterización holográfica proporcionan la detección de agregados proteicos que tienen un radio de un intervalo de tamaño aceptable, tal como dentro del intervalo de 200 nm (300 nm, 400 nm, 500 nm) a 20 |jm (10 |jm, 1 |jm, 900 nm, 800 nm). Además, el recuento de agregados proteicos se habilita dentro del intervalo de tamaño, lo que permite la determinación de la densidad numérica de los agregados proteicos (en el intervalo de tamaño). Además, los sistemas y métodos permiten la identificación de agregados proteicos dentro de subintervalos del intervalo de tamaño aceptable. Algunas técnicas, tal como la dispersión dinámica de la luz (DLS), cubren el extremo inferior del mismo intervalo de tamaño y pueden sondear partículas más pequeñas. Otras técnicas, tal como las imágenes de microflujo (MFI), funcionan en el extremo superior del mismo intervalo de tamaño y pueden sondear partículas que son aún más grandes. El presente enfoque de la caracterización holográfica une los dominios de funcionamiento de estas otras técnicas. El intervalo especificado refleja la implementación actual y puede ampliarse mediante la elección de hardware óptico y mediante la modificación del software que se usa para analizar hologramas. El extremo inferior del intervalo también se limita por la longitud de onda de la luz. El extremo superior del intervalo no se limita teóricamente de esta forma, pero puede limitarse en la práctica por consideraciones de complejidad computacional.
Para lograr la caracterización holográfica, el sistema y los métodos caracterizan los agregados proteicos en el intervalo de tamaño aceptable. La caracterización incluye: a) medir el radio con análisis de Lorenz-Mie; b) medir el índice de refracción efectivo del agregado con análisis de Lorenz-Mie; c) estimar la porosidad de un agregado individual con base en su índice de refracción efectivo con relación al de la proteína en sí; d) estimar la porosidad media de un conjunto de agregados con base en la forma de la distribución de los datos de caracterización de una sola partícula (mediante el uso de la ecuación (1) (establecida más abajo), suponiendo que los agregados pueden modelarse como si tuvieran una geometría fractal); e) medir la morfología de un agregado individual con base en la retropropagación del holograma del agregado. En una modalidad adicional, la etapa de retropropagación es una vía distinta y paralela para analizar los mismos datos, y puede incluir 1) retropropagación de Fresnel, 2) retropropagación de Rayleigh-Sommerfeld y/o 3) deconvolución de Rayleigh-Sommerfeld. Este término índice de refracción efectivo se refiere al índice de refracción del material dentro de un volumen esférico que incorpora tanto la partícula en estudio como el medio intercalado dentro de esa partícula. Esta "esfera efectiva" tiene un tamaño y un índice de refracción que reflejan las propiedades correspondientes de la partícula de interés. Esta partícula podría ser una esfera coloidal, una partícula coloidal asférica, un agregado de partículas coloidales o un agregado de moléculas tal como un agregado de proteína. El índice de refracción efectivo medido no es el índice de refracción del medio ni de un grupo de proteínas puras, sino una combinación de todos los componentes del agregado. Cuando hay más solvente incorporado en el agregado, el índice de refracción efectivo estará más cerca del índice de refracción del solvente, y cuando hay menos solvente, estará más lejos del índice de refracción del solvente. El índice de refracción efectivo proporciona información sobre la proporción del volumen de la esfera efectiva que rellenado con el medio y, por lo tanto, proporciona información útil sobre la morfología de la partícula.
Con referencia a la modalidad de la Figura 2, el instrumento de caracterización holográfica usa una lente de objetivo de microscopio convencional (Nikon Plan Apo, 100x, abertura numérica 1.45, inmersión en aceite), que, en combinación con una lente de tubo estándar, produce un sistema de aumento de 135 nm/píxel en la cara de una cámara de video monocromática (NEC TI-324AII). La muestra se ilumina con el haz colimado de un láser de estado sólido (Coherent Verdi) que entrega 10 mW de luz a la longitud de onda de vacío de la muestra de 532 nm. Esta luz se extiende sobre los 3 mm de diámetro del haz, en este ejemplo, y produce una irradiancia máxima de 1,5 mW/mm2. Para esferas coloidales de escala micrométrica, este instrumento puede medir el radio de una partícula individual con precisión nanométrica, su índice de refracción dentro de una parte por mil, y puede detectar su posición dentro de un nanómetro en el plano y dentro de 3 nanómetros a lo largo del eje óptico. Cada ajuste puede realizarse en una fracción de segundo, por ejemplo, unas pocas decenas de milisegundos, mediante el uso de la detección automática de características y algoritmos de reconocimiento de imágenes. Un solo ajuste es suficiente para caracterizar un solo agregado proteico.
Para caracterizar la población de agregados en una dispersión de proteínas, la muestra se hace fluir a través del volumen de observación del microscopio en un canal de microfluidos. Dado el tiempo de exposición de la cámara de 0,1 ms, los resultados no son sensibles al desenfoque de movimiento para velocidades de flujo de hasta 100 jm/s. En condiciones típicas, no más de diez agregados proteicos pasan a través del campo de visión de 86 jim x 65 jim a la vez. Estas condiciones simplifican el análisis holográfico al minimizar la superposición entre los patrones de dispersión de partículas individuales. Cada partícula típicamente se agrega y típicamente se graba en múltiples cuadros de video a medida que se mueve a través del campo de visión. Dichas secuencias de mediciones se vinculan en trayectorias mediante el uso de un algoritmo de máxima verosimilitud y se informan los valores medios para cada trayectoria. Estas consideraciones establecen un límite superior para el intervalo de concentraciones agregadas accesibles de 108agregados/ml. En el otro extremo, 10 min de datos son suficientes para detectar, contar 4 y caracterizar agregados en concentraciones tan bajas como 10 agregados/ml. Esta sensibilidad se compara favorablemente con la dispersión dinámica de la luz y el análisis de seguimiento de nanopartículas. En una modalidad, se puede adquirir un conjunto de datos que consiste de 5000 partículas en aproximadamente 5 minutos.
El diagrama de dispersión insertado en la Figura 2 muestra resultados típicos para agregados subvisibles de insulina bovina. Cada punto representa las propiedades de un solo agregado y es comparable en tamaño a los errores estimados en el radio y el índice de refracción. Los colores representan la densidad local p(ap, np) de puntos de datos registrados en el plano (ap, np), calculado con un estimador de densidad de kernel, donde el rojo indica los valores más probables.
La caracterización holográfica puede generalizarse para admitir partículas asféricas y no homogéneas. Sin embargo, los cálculos de dispersión de luz asociados son complejos desde el punto de vista computacional. Los agregados proteicos se caracterizan mediante el uso de la teoría de la dispersión de luz para esferas isotrópicas y homogéneas entendiendo que los agregados pueden apartarse de este modelo idealizado. El ejemplo típico de la Figura 1, sin embargo, demuestra que el modelo esférico explica bien los patrones de dispersión de una sola partícula que se observan en el sistema.
Calibración del instrumento de caracterización holográfica
La caracterización holográfica se basa en cuatro parámetros de calibración instrumental: la longitud de onda de vacío de la iluminación láser, el aumento del tren óptico, el recuento de oscuridad de la cámara y la relación señal-ruido de un solo píxel en el nivel de iluminación de funcionamiento. Todos estos pueden medirse una vez y usarse después para todos los análisis subsecuentes.
La longitud de onda de vacío del láser la especifica el fabricante y se verifica de forma independiente a cuatro cifras significativas mediante el uso de un espectrómetro de fibra (Ocean Optics, HR4000). El aumento del sistema del microscopio se mide a cuatro cifras significativas mediante el uso de una escala micrométrica de precisión (Ted Pella, número de catálogo 2285-16). El recuento de oscuridad de la cámara se mide al bloquear la iluminación láser y calcular el valor medio de la imagen en cada píxel. El ruido de la imagen se estima a partir de imágenes holográficas con la métrica de desviación absoluta media (MAD).
Además de estas calibraciones instrumentales, la obtención de resultados precisos también requiere un valor exacto del índice de refracción del medio a la longitud de onda del láser y a la temperatura de la muestra. Para los tampones acuosos del presente estudio, este valor se obtuvo a cuatro cifras significativas con un refractómetro de Abbe (Edmund Optics). La aproximación de este valor con el índice de refracción del agua pura, nm= 1,335, a la temperatura de medición de 21 ± 1 °C, produce errores sistemáticos en el radio estimado y el índice de refracción de no más de 0,1 %.
Intervalo de funcionamiento de la caracterización holográfica
El intervalo de funcionamiento del instrumento de caracterización holográfica se establece mediante mediciones en dispersiones acuosas de esferas coloidales que se destinan a usarse como patrones de tamaño de partículas. Las franjas de interferencia en los hologramas de cada partícula deben estar separadas por al menos un píxel en el plano focal del microscopio. Este requisito se satisface al establecer el plano focal 5 pm por debajo de la interfaz vidrio-agua en la celda de muestra. El desplazamiento axial accesible más grande se establece tanto por la necesidad de ajustar varias franjas concéntricas en el campo de visión de la cámara como por la reducción del contraste de la imagen debajo del nivel de ruido de la cámara. Este límite superior es de aproximadamente 100 pm para este instrumento. En una modalidad preferida, las muestras se pasan a través de canales de microfluido con una longitud de trayectoria óptica de 30 pm para garantizar buenas condiciones de formación de imágenes para todos los agregados, independientemente de su altura en el canal.
El extremo inferior del intervalo de tamaños de partículas detectables se limita a la mitad de la longitud de onda de la luz en el medio. Las partículas más pequeñas que esto producen hologramas detectables, que pueden ajustarse a la teoría de Lorenz-Mie. Sin embargo, estos ajustes no separan correctamente el tamaño de partícula del índice de refracción. Si se conoce el índice de refracción de la partícula a priori, estas mediciones pueden producir estimaciones confiables para el radio de la partícula. Para la modalidad de ejemplo, el límite inferior práctico lo establece el intervalo dinámico de 8 bits de la cámara a ap >200 nm. Los patrones de dispersión de la luz de las partículas más pequeñas carecen del contraste necesario para una detección y caracterización fiables.
Para la modalidad de ejemplo, el límite de tamaño superior se establece en ap <10 pm por la profundidad del canal. No se espera que la configuración de ejemplo descrita permita observar de manera fiable e identificar correctamente agregados proteicos de forma irregular mucho mayores de 10 pm. Es probable que los grandes agregados transitorios se rompan por cizallamiento hidrodinámico en el flujo de Poiseuille dentro del canal. Es probable que los agregados altamente asimétricos sustancialmente más grandes que la longitud de onda de la luz se identifiquen erróneamente como dos o más características distintas mediante el algoritmo de identificación de características desarrollado para la caracterización holográfica automatizada de esferas. No se hace ningún esfuerzo para corregir este artefacto, aunque su presencia se confirma al comparar los resultados de la caracterización holográfica con los resultados obtenidos al volver a analizar los mismos datos para la obtención de imágenes de microflujo mediante el uso de los métodos de la siguiente sección.
Mediciones de morfología holográfica
Los mismos hologramas que se usan para la caracterización holográfica a través del análisis de Lorenz-Mie también pueden usarse para visualizar la morfología tridimensional de agregados individuales a través de la retropropagación de Rayleigh-Sommerfeld con deconvolución volumétrica. Esta técnica usa la difracción integral de Rayleigh-Sommerfeld para reconstruir el campo de luz volumétrico responsable de la distribución de intensidad observada. El objeto responsable del patrón de dispersión aparece en esta reconstrucción en forma de cáusticos que crea en el campo de luz. Para objetos con características comparables en tamaño a las longitudes de onda de la luz, se demostró que estos cáusticos detectan con precisión la posición y orientación de esas características en tres dimensiones. La deconvolución del conjunto de datos volumétricos que se obtiene con la función de dispersión de puntos para el núcleo de difracción de Rayleigh-Sommerfeld elimina los artefactos de imágenes dobles y produce una representación tridimensional del dispersor.
Las reconstrucciones volumétricas de agregados proteicos pueden proyectarse en el plano de imagen para obtener el equivalente de imágenes de campo claro en el plano de mejor enfoque. Esto brinda el beneficio de la gran profundidad de enfoque efectiva de la microscopía holográfica en comparación con la microscopía de campo brillante convencional. Las imágenes resultantes son útiles para el análisis de imágenes de microflujo, incluido el análisis de la morfología de los agregados proteicos. Esta información, a su vez, puede usarse para evaluar la tasa de identificaciones de características falsas en el análisis de Lorenz-Mie y, por lo tanto, la tasa a la que los agregados más grandes se identifican erróneamente como grupos de agregados más pequeños.
La investigación de la morfología agregada con microscopía de deconvolución holográfica es un complemento útil para la caracterización holográfica a través del análisis de Lorenz-Mie. Mientras que los ajustes de Lorenz-Mie ocurren en cuestión de milisegundos, la retropropagación de Rayleigh-Sommerfeld es cientos de veces más lenta. Este estudio se centra, por tanto, en la información que puede obtenerse rápidamente a través de la caracterización de Lorenz-Mie.
Ejemplos
Preparación del material
Las muestras de insulina bovina de páncreas (PM: 5733,49 Da, Sigma-Aldrich, Número CAS: 11070-73-8) se prepararon de acuerdo con métodos previamente publicados con modificaciones para investigar la agregación de insulina inducida solo por agitación. La insulina se disolvió a una concentración de 5 mg/ml en tampón Tris-HCI 10 mM (Life Technologies,Número CAS 77-86-1), el pH se ajustó a 7,4 con ácido clorhídrico al 37 % (Sigma Aldrich,Número CAS: 7647-01-0). A continuación, la solución se centrifugó a 250 rpm durante 1 h para inducir la agregación, momento en el que la muestra todavía parecía sustancialmente transparente.
Las soluciones de albúmina de suero bovino (BSA) (Mw: 66 500 Da, Sigma Aldrich,Número CAS: 9048-46-8) se agregaron mediante la formación de complejos con poli(clorhidrato de alilamina) (PAH) (Mw: 17 500 g/mol,Número CAS: 71550-12-4, grado medio de polimerización: 1207) [33, 34]. Se disolvieron la BSA y PAH en tampón Tris 10 mM (Life Technologies,Número CAS: 77-86-1) para alcanzar concentraciones de 1,22 mg/ml y 0,03 mg/ml, respectivamente. Los reactivos se mezclaron mediante agitación con vórtex para asegurar la disolución y se formaron agregados después de dejar que la muestra se equilibrara durante una hora.
Se prepararon muestras adicionales en condiciones comparables con la adición de NaCl 0,1 M (Sigma Aldrich,Número CAS 7647-14-5) para facilitar la formación de complejos y de esta manera promover la agregación.
La muestra patrón de mezcla estequiométrica de esferas coloidales es una mezcla de cuatro poblaciones de esferas coloidales monodispersas en la que cada población tiene un tamaño y una composición de medios distintos. Las esferas monodispersas se adquirieron de Bangs Laboratories como dispersiones acuosas de sólidos al 10 %. Las suspensiones concentradas (stock) se diluyeron mil veces con agua desionizada y luego se combinaron en volúmenes iguales para crear una mezcla heterogénea. Las cuatro poblaciones de esta mezcla son esferas de poliestireno de diámetro 2ap= 0,71 ± 0,09 pm (código de catálogo PS03N, número de lote 9402) y 2ap= 1,58 ± 0,14 pm (código de catálogo PS04N, número de lote 9258) y esferas de sílice de diámetro 2ap= 0,69 ± 0,07 pm (código de catálogo SS03N, número de lote 8933) y 2ap= 1,54 ± 0,16 pm (código de catálogo SS04N, número de lote 5305). El intervalo de tamaño de partícula citado se estimó por el fabricante mediante el uso de dispersión dinámica de la luz para las esferas más pequeñas y mediante el principio de Coulter para las esferas más grandes.
Las esferas de silicona compuestas de polidimetilsiloxano (PDMS) se sintetizaron mediante hidrólisis catalizada por bases y copolimerización de dietoxidimetilsilano difuncional (DEDMS) (Sigma-Aldrich,Número CAS 78-62-6, 3 % en volumen) y trietoximetilsilano trifuncional (TEMS) (Sigma-Aldrich,Número CAS 2031-67-6, 2 % en volumen) siguiendo un protocolo estándar [Obey y otros, J. Colloid Interface Sci. 1994, 163: 454-463; Goller y otros, Colloids Surfaces, 1997; 123-124: 183-193.] Se agrega una mezcla de DEDMS y TEMS con estequiometría 60:40 en agua desionizada (Millipore MilliQ, 93 % en volumen) al (28-30) % en peso y una solución de hidróxido de amonio (ACROS Organics 2 % en volumen) para obtener un volumen total de 10 ml. La muestra se agitó vigorosamente con un agitador vórtex durante 4 min a temperatura ambiente para iniciar la nucleación y luego se dejó polimerizar en un soporte giratorio a 10 rpm durante tres horas. A continuación, se mezclaron esferas de silicona completamente desarrolladas con
suspensiones de agregados proteicos -4 en una fracción de volumen de 10 para obtener una concentración efectiva 6 de esferas de 4 x 10/ml.
Estas esferas polimerizadas comparten la mayoría de las propiedades con las gotas de aceite de silicona sin polimerizar. Su índice de refracción medio, 1,388 ± 0,002, excede el de DEDMS, 1,381 y TEMS, 1,383, determinado con un refractómetro de Abbe (Edmund Optics) y por caracterización holográfica.
Verificación de precisión y exactitud
Los datos de la Figura 3 se obtuvieron mediante la caracterización holográfica de un modelo de dispersión coloidal que consiste de una mezcla estequiométrica de cuatro tipos distintos de esferas coloidales monodispersas. Cada uno de los cuatro picos de la Figura 3A representa las propiedades de una de esas poblaciones. En cada caso, la distribución de propiedades medida holográficamente es consistente con la especificación del fabricante. Esta concordancia, junto con pruebas complementarias en publicaciones anteriores, establece la precisión y exactitud de la caracterización holográfica resuelta por partículas.
Este conjunto de datos también ilustra la capacidad única de la caracterización holográfica para caracterizar dispersiones coloidales heterogéneas. Otras técnicas podrían resolver la distribución de tamaño de cualquiera de los componentes coloidales monodispersos individualmente. Sin embargo, ninguna otra técnica podría resolver las cuatro poblaciones de esta mezcla.
Las Figuras 4A - 4D ofrecen una demostración experimental del intervalo de tamaños de partículas en el que la caracterización holográfica produce resultados útiles. Los 3 hologramas presentados aquí se registraron para 3 esferas de poliestireno diferentes dispersas en agua, una con un radio de ap% 0,237 mm, en el extremo pequeño del intervalo efectivo de la técnica, uno con un radio de ap % 0,800 mm, y el tercero con un radio de ap % 10,47 mm. Estos hologramas medidos (Figura 4A) se presentan junto con los correspondientes ajustes píxel por píxel (Figura 4B) para las predicciones de la teoría de la dispersión de la luz, que se parametrizaron por la posición tridimensional, el radio y el índice de refracción de cada partícula. La calidad de un ajuste se puede evaluar al trazar el perfil radial (Figura 4C) de la intensidad de imagen normalizada, b(r). Esto se obtiene al promediar el patrón de intensidad bidimensional sobre los ángulos alrededor del centro del patrón de dispersión. Las curvas obtenidas de los datos medidos se trazan en la Figura 4D dentro de las regiones sombreadas que representan las incertidumbres de medición. Las curvas obtenidas de los ajustes se superponen con los datos experimentales para su comparación. Los ajustes siguen los datos experimentales extremadamente bien en todo el intervalo de tamaños de partículas.
Caracterización de agregados de insulina subvisibles
Aunque la muestra de insulina bovina parecía transparente bajo inspección visual, los datos de la Figura 2 revelan una concentración de (3,9 ± 0,5) * 107 agregados subvisibles de insulina bovina por mililitro, que corresponde a una fracción de volumen de aproximadamente 10'3. La incertidumbre en este valor es el resultado de errores de identificación de características para las partículas más grandes y la incertidumbre en la velocidad del flujo. Los agregados con radios inferiores a 200 nm no se detectan por el sistema de caracterización holográfica y, por lo tanto, no se cuentan en estos totales. La distribución de las características de las partículas alcanza su punto máximo en un radio de 1,6 pm, y es amplia y multimodal. No se registraron agregados con radios superiores a 4,2 pm, lo que sugiere que tales agregados 4 a gran escala están presentes en concentraciones inferiores a 10/ml.
Los índices de refracción de los agregados varían en un amplio intervalo desde justo por encima del tampón, nn= 1,335, a un poco más de 1,42. Este intervalo es significativamente más pequeño que el valor de alrededor de 1,54 que se esperaría para cristales de proteína completamente densos. Sin embargo, este límite superior observado es consistente con las recientes mediciones de coincidencia de índices del índice de refracción de los agregados proteicos. Estas últimas mediciones se realizaron mediante la perfusión de agregados proteicos con fluido con índice coincidente y, por lo tanto, arrojan una estimación del índice de refracción de la proteína en sí. La caracterización holográfica, por el contrario, analiza un dispersor efectivo compuesto tanto por la proteína de índice más alto como por el tampón de índice más bajo que llena la esfera. Se demostró que una esfera tan efectiva tiene un índice de refracción efectivo intermedio entre los dos medios en una relación que depende de la porosidad real de la partícula. Las estructuras más porosas o abiertas tienen índices de refracción efectivos más pequeños. Además, se ha visto que la influencia de la porosidad en el índice de refracción efectivo es proporcionalmente mayor para partículas con radios mayores.
El modelo de esfera efectiva tiene en cuenta las tendencias generales en los datos de caracterización holográfica bajo la suposición de que los agregados proteicos tienen estructuras irregulares abiertas. Esta propuesta es consistente con estudios ex situ previos que demostraron que la insulina bovina forma agregados filamentosos.
La capacidad particular de la caracterización holográfica para registrar tanto el tamaño como el índice de refracción de partículas coloidales individuales ofrece, por lo tanto, información sobre la morfología de los agregados proteicos in situ y sin diluir y sin ninguna otra preparación especial. Esta capacidad también permite la caracterización holográfica
para distinguir los agregados proteicos de los contaminantes comunes, tal como las gotas de aceite de silicona y las partículas de caucho, que plantean problemas para otras técnicas analíticas.
Caracterización de agregados BSA subvisibles
La Figura 5 muestra resultados de caracterización holográfica comparables para las dos muestras de albúmina de suero bovino. Los datos de la Figura 5A se obtuvieron para la muestra preparada sin sal adicional. En cuanto a la muestra de insulina 6, la caracterización holográfica de la muestra de BsA revela ± 0,5 * 10 agregados/ml en el intervalo de radios que van de 300 nm a 2,5 pm, y un radio de pico de 0,5 pm. No se observaron agregados con radios superiores a 2,8 pm, lo que sugiere que los agregados más grandes están presentes en concentraciones por debajo de 104/ml.
El panel superior en la Figura 5A es una proyección de la distribución conjunta, p(ap, np), en la distribución de tamaños agregados, p(ap). Esta proyección se parece más a los resultados proporcionados por otras técnicas de medición de tamaño, tal como la dispersión dinámica de la luz. Aunque la concentración observada de agregados proteicos subvisibles está por debajo del umbral de detección de d Ls , las mediciones de DLS revelan una concentración de aproximadamente 109 agregados/ml cuyos radios son inferiores a 100 nm y, por tanto, demasiado pequeños para la caracterización holográfica. En cuanto a las muestras de BI, la anticorrelación entre ap y np evidente en la Figura 5A-5F sugiere que los complejos BSA-PAH tienen una estructura abierta. Esto es consistente con estudios ex situ previos que demuestran que b Sa se agrega en estructuras débilmente ramificadas.
La adición de sal mejora la formación de complejos y aumenta el tamaño medio de los agregados en casi un factor de dos, y también amplía sustancialmente la distribución de los tamaños de los agregados. Estas tendencias se pueden ver en la Figura 5B. Las Figuras 5A-5F también incluyen proyecciones de las densidades de probabilidad relativa, p(ap), que enfatizan cómo la distribución del tamaño de los agregados cambia con las condiciones de crecimiento. Lo que omiten estas proyecciones es el cambio sorprendente en la distribución conjunta de los radios agregados y los índices de refracción de la Figura 5A a la Figura 5B. Este cambio sugiere que los agregados más grandes que crecen en presencia de sal añadida son sustancialmente más porosos. Esta información sobre la morfología de los agregados no la ofrecerían únicamente las distribuciones de tamaño.
Papel de la morfología agregada
Imágenes de microflujo
Las Figuras 4A-4D presentan comparaciones directas entre la caracterización holográfica y las MFI para una muestra representativa de 6 complejos BSA-PAH con morfologías que varían desde grupos compactos casi esféricos hasta estructuras alargadas extendidas. El holograma de cada agregado se compara con un ajuste de mínimos cuadrados no lineal con las predicciones de la teoría de Lorenz-Mie. La reducción del estadístico X2 de estos ajustes se usa para organizar los resultados desde los mejores ajustes en la parte superior hasta los peores ajustes en la parte inferior. Cada uno de los hologramas medidos también se usa para reconstruir una imagen volumétrica del agregado individual a través de microscopía de deconvolución de Rayleigh-Sommerfeld. El tamaño del grupo reconstruido puede compararse con el radio efectivo obtenido a partir de la caracterización holográfica.
Incluso los dos grupos más compactos de la Figura 4A parecen ser sustancialmente asféricos. Sus hologramas, sin embargo, se reproducen muy bien por los ajustes no lineales. Las métricas X2 para estos ajustes son cercanas a la unidad, lo que sugiere que el modelo describe adecuadamente el proceso de dispersión de la luz y que el ruido de un solo píxel se estimó correctamente. Los valores del radio del agregado son consistentes con el tamaño estimado a partir de la reconstrucción de Rayleigh-Sommerfeld. Los círculos con los radios que se determinaron holográficamente se superponen a las imágenes de campo claro reenfocadas numéricamente en la Figura 4D para su comparación. Este éxito es consistente con comparaciones previas de análisis de Lorenz-Mie y Rayleigh-Sommerfeld para esferas coloidales y bastones coloidales.
Los errores aumentan a medida que los agregados se vuelven cada vez más estructurados y asimétricos. Aun así, las estimaciones del tamaño característico están razonablemente en concordancia con el tamaño aparente de las reconstrucciones de campo claro, incluso en el peor de los casos. Esta robustez surge porque el tamaño efectivo del dispersor influye fuertemente en el tamaño y el contraste del pico de dispersión central y el mínimo de intensidad inmediatamente circundante. Por lo tanto, los ajustes fieles en esta región del patrón de interferencia producen valores razonables para el tamaño del dispersor. El contraste general del patrón en su conjunto codifica el índice de refracción del dispersor y, por lo tanto, es muy bajo para los grupos de estructura abierta.
Estos ejemplos representativos son consistentes con demostraciones anteriores de que la caracterización holográfica produce datos de caracterización útiles para esferas imperfectas y partículas asféricas. Particularmente para agregados más grandes, el valor estimado del índice de refracción describe una esfera efectiva. Sin embargo, el radio estimado es una métrica razonablemente robusta para el tamaño del agregado.
Independientemente de la capacidad de la caracterización holográfica para proporcionar información sobre la morfología, estos resultados demuestran que la microscopía holográfica detecta y cuenta de manera útil los agregados proteicos subvisibles en solución. Estas detecciones por sí mismas proporcionan información que es útil para caracterizar el estado de agregación de la solución de proteína in situ sin requerir una preparación amplia de la muestra. La gran profundidad de campo efectiva de la microscopía holográfica sirve para aumentar la velocidad de análisis con relación al análisis de imágenes de partículas convencional.
Al igual que la caracterización holográfica, MFI produce mediciones de radio resueltas por partículas que pueden usarse para calcular la concentración de partículas en contenedores de tamaño específico. Estos resultados pueden compararse directamente con las distribuciones de tamaño proyectadas producidas por la caracterización holográfica. Los datos de las Figuras 8A-8B muestran tal comparación para los complejos BSA-PAH con y sin sal añadida que se presentan en la Figura 5C-5D. Los resultados se presentan como el número de agregados, N(ap), por mililitro en un intervalo de tamaño de ± 100 nm alrededor del centro de cada contenedor en ap. Los datos de caracterización holográfica de la Figura 5B y 5D se reescalan en este gráfico para su comparación. Estudios independientes demuestran que el análisis de MFI produce estimaciones de tamaño fiables para agregados con radios mayores de 1 nm. La difracción provoca errores de medición sustanciales para partículas más pequeñas. Por lo tanto, recopilamos los resultados de MFI para partículas más pequeñas en contenedores de 600 nm de ancho en la Figura 8A y 8B, con la normalización correspondiente. El extremo inferior del intervalo de este contenedor se corresponde con los radios más pequeños informados por la caracterización holográfica. La concordancia entre la caracterización holográfica y las MFI es razonablemente buena en todo el intervalo de tamaños de partículas graficado. Ambas técnicas producen valores consistentes para la concentración total de 107 agregados/mL. Las MFI informan sistemáticamente un mayor número de agregados en el extremo grande del intervalo de tamaño y menos en el extremo pequeño. Esta diferencia se puede atribuir a los agregados más alargados e irregulares, tal como el último ejemplo de la Figura 4A-4D, cuyo tamaño se subestima por la caracterización holográfica. Este efecto de la morfología en la caracterización del tamaño holográfico se discutió previamente. Incluso en estos casos, la caracterización holográfica detecta correctamente la presencia de las partículas y las identifica como objetos de escala micrométrica. Tanto las MFI como la caracterización holográfica producen resultados consistentes para la densidad numérica total de agregados.
Para partículas en el extremo más pequeño del intervalo de tamaño, MFI proporciona recuentos de partículas pero no datos de caracterización útiles. La caracterización holográfica, por el contrario, ofrece estimaciones de tamaño fiables en este régimen. En toda la gama de tamaños considerados, la caracterización holográfica también proporciona estimaciones de los índices de refracción de las partículas.
Dispersión dinámica de la luz
Para verificar la presencia de agregados proteicos subvisibles en nuestras muestras, también realizamos mediciones de DLS. Mientras que la caracterización holográfica y las MFI producen mediciones resueltas por partículas, la DLS es una técnica de caracterización en masa. Los valores informados por DLS reflejan el porcentaje, P(ah), de luz dispersa que puede atribuirse a objetos de un radio hidrodinámico dado, ah. Por lo tanto, la distribución de tamaño que se obtiene se pondera por las características de dispersión de la luz de los objetos. Las intensidades de dispersión pueden traducirse al menos aproximadamente en concentraciones de partículas si las partículas son más pequeñas que la longitud de onda de la luz y si todas tienen el mismo índice de refracción. Las comparaciones directas no son posibles cuando los índices de refracción de las partículas varían con el tamaño, como es el caso de los agregados proteicos. En tales casos, DLS es útil para confirmar la presencia de dispersores dentro de un intervalo de tamaños. La Figura 6 presenta datos de DLS para las mismas muestras de complejos BSA-PAH que se presentan en la Figura 3. Para ambas muestras, la DLS revela la presencia de una gran cantidad de dispersores con radios menores a 100 nm. El umbral de detección de DLS para dispersores de este tamaño es aproximadamente 108 agregados/mL, según se determinó por estudios independientes. Concluimos que ambas muestras tienen al menos esta concentración de agregados de diámetro submicrométrico. Dichos objetos son más pequeños que el límite de detección para nuestra implementación de microscopía holográfica de video y, por lo tanto, no se resolvieron en la Figura 3.
La distribución cambia a tamaños más grandes en la muestra con sal añadida, lo que coincide con los resultados de la caracterización holográfica. Ambas muestras muestran una señal muy pequeña, se indica mediante una flecha en la Figura 9, para objetos subvisibles cuyo radio hidrodinámico es de 2,8 nm. Esto confirma la presencia de tales dispersores en nuestra muestra a una concentración apenas por encima del umbral de detección de DLS para objetos de ese tamaño.
La muestra con sal añadida también tiene un pico claro alrededor de ah= 400 ± 20 nm que se encuentra en el intervalo de detección de caracterización holográfica. El pico correspondiente en la Figura 5C aparece en un radio sustancialmente mayor, ap= 770 ± 20 nm. Una fuente probable de esta discrepancia es que la caracterización holográfica informa el radio de una esfera delimitadora efectiva, mientras que DLS informa el radio hidrodinámico, que puede ser sustancialmente más pequeño para estructuras abiertas. Otro factor que contribuye es que los agregados más grandes tienen índices de refracción efectivos más bajos y, por lo tanto, dispersan la luz proporcionalmente con menos fuerza que los agregados más pequeños. Este efecto también desplaza hacia abajo la distribución de tamaño
aparente en las mediciones de DLS. Sin embargo, no afecta la caracterización holográfica, que informa tanto el tamaño como el índice de refracción de cada objeto de forma independiente.
Diferenciación holográfica de esferas de silicona a partir de agregados proteicos
DLS no puede distinguir los agregados proteicos de otras poblaciones de partículas en suspensión. MFI puede diferenciar algunos de estos contaminantes por morfología: las gotas de silicona, por ejemplo, suelen ser esféricas, mientras que los agregados proteicos suelen tener formas irregulares. La diferenciación morfológica funciona mejor para partículas que son sustancialmente más grandes que la longitud de onda de la luz, cuyas características estructurales no se ven oscurecidas por la difracción. A través de la información que proporciona sobre los índices de refracción de partículas individuales, la caracterización holográfica ofrece una vía adicional para distinguir objetos a escala micrométrica por composición. Demostramos esta capacidad al realizar mediciones de caracterización holográfica en muestras de BSA que se adulteran deliberadamente con esferas de silicona.
Caracterización holográfica de esferas de silicona
Las Figuras 10A-10B muestran datos de caracterización holográfica para esferas de silicona dispersas en agua desionizada. La muestra de la Figura 10A es comparativamente monodispersa con un radio promediado de la muestra de 0,75 ± 0,09 nm. Las partículas de la Figura 10B se extraen de una distribución más amplia de tamaños, con un radio medio de 0,87 ± 0,28 nm. Ambas muestras de esferas tienen índices de refracción consistentes con los valores reportados previamente para polidimetilsiloxano con 40 % de entrecruzamiento, np= 1,388 ± 0,005. Este intervalo se indica con una región sombreada en las Figuras 10A-10B.
A diferencia de los agregados proteicos, los índices de refracción de estas partículas no se correlacionan con sus tamaños. Esto se ve más fácilmente en la muestra polidispersa en la Figura 10B y es consistente con las gotas que tienen densidad uniforme y sin porosidad. Esperamos ver la misma distribución de propiedades de una sola partícula cuando estas esferas de silicona se codispersan con agregados proteicos.
Detección diferencial de esferas de silicona
Los datos de la Figura 11A se obtuvieron de una muestra de BSA preparada en las mismas condiciones que la Figura 5A pero con la adición de esferas de silicona monodispersas a una concentración de 4 x 106 partículas/ml. La distribución resultante de las propiedades de las partículas es claramente bimodal con una población que se asemeja a la obtenida a partir de agregados proteicos solos y la otra tiene un índice de refracción consistente con el de las esferas de silicona, np= 1,388 ± 0,005. La muestra de la Figura 11B se preparó de manera similar en condiciones comparables a las de la Figura 5C con la adición de esferas de silicona polidispersas de la muestra de la Figura 10B. La consistencia entre las características asociadas a los agregados proteicos en las Figuras 5A-5D y las Figuras 11A-11B demuestran que tanto el protocolo de preparación de muestras como la técnica de caracterización holográfica producen resultados reproducibles de una muestra a otra, y que la caracterización holográfica de los agregados proteicos no está influenciada por el presencia de partículas de impurezas extrañas.
Curiosamente, ambas distribuciones presentan un pequeño pico alrededor de ap= 2,8 nm que corresponde al pico en los datos DLS de la Figura 9. Esta característica no está presente en las Figuras 3A-3F. Es probable que esta población muy pequeña de agregados más grandes estuviera presente en esas muestras, pero a una concentración justo por debajo del umbral de detección en una medición de 10 minutos.
Las distribuciones de características asociadas a las gotas de silicona en las Figuras 11A-11B también concuerdan bien con los datos de caracterización holográfica de las gotas solas de las Figuras 10A-10B. Estos resultados demuestran que los datos del índice de refracción de la caracterización holográfica pueden ser útiles para distinguir los agregados proteicos de las gotas de aceite de silicona. Tal diferenciación no sería posible basándose solo en la distribución de tamaño, como puede verse en los datos proyectados en las Figuras 11A-11D.
La caracterización holográfica no puede diferenciar las gotas de silicona de los grupos de proteínas cuyo índice de refracción es el mismo que el de la silicona. Tal ambigüedad surge para las partículas más pequeñas que se analizan en las Figuras 11A-11D. Las gotas de silicona esféricas a veces pueden distinguirse de los agregados proteicos de forma irregular en estas condiciones mediante el uso de datos morfológicos obtenidos mediante análisis de deconvolución de los mismos hologramas. La distinción en estos casos aún sería menos clara que la que puede obtenerse con la medición de masa resonante (RMM), que diferencia la silicona de la proteína por el signo de su flotabilidad relativa. En los casos en que las partículas específicas no puedan diferenciarse de manera inequívoca, la presencia de gotas de silicona aún puede inferirse de los datos de caracterización holográfica porque tales partículas crean un grupo en el plano (ap,np) cuyo índice de refracción es independiente del tamaño. Las abundancias relativas de las dos poblaciones pueden inferirse, por ejemplo, mediante métodos de agrupamiento estadístico.
Discusión de resultados de ejemplo
Como sonda óptica de las propiedades de los agregados proteicos, la caracterización holográfica es ortogonal a técnicas no ópticas como el principio de Coulter o la medición de masa resonante (RMM). Como técnica de imagen, está relacionada con las imágenes de microflujo (MFI) y el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Sin embargo, la caracterización holográfica se beneficia de su gran profundidad de campo efectiva y su capacidad para monitorear el índice de refracción y el tamaño. Dado que las MFI y la caracterización holográfica pueden analizar una sola partícula con una sola instantánea, ambas son intrínsecamente más rápidas que NTA, que se basa en el análisis de series de tiempo.
La caracterización holográfica también está relacionada con las técnicas de dispersión de la luz, tal como la dispersión dinámica de la luz (DLS) y el oscurecimiento de la luz (LO). Ofrece una mayor sensibilidad de recuento para objetos de escala micrométrica que la dispersión dinámica de la luz y acceso a partículas más pequeñas que el oscurecimiento de la luz, sin requerir dilución. A diferencia de otras técnicas de dispersión, la caracterización holográfica no requiere los índices de refracción de las partículas como entradas, sino que proporciona el índice de refracción como salida.
Las comparaciones entre estas técnicas se resumen en la Tabla I, que es una comparación de técnicas de caracterización de alto rendimiento para agregados proteicos subvisibles. El intervalo de tamaño se refiere al radio de la esfera efectiva detectado por cada método. La cuarta columna indica si la técnica es capaz de medir la morfología agregada. Las referencias describen evaluaciones independientes de las capacidades de las técnicas para caracterizar agregados proteicos.
Método Tamaño
[pin] Número/ml Morfología Comentarios
Caracterización holográfica 0,3-10 Í Q * 1 & Sí Mide tanto el tamaño como el índice de refracción
No requiere patrones de calibración.
Permite diferenciar por tamaño y composición.
Dispersión dinámica de la luz (DLS) 0,001-1 1«* 10iSÍ No Mide tamaño promediado de la muestra.
[27, 45] No diferenciación.
Zona de detección eléctrica (ESZ) 0,1-1000 i- IS i* No Requiere electrolito compatible.
Principio de Coulter [44] Típicamente requiere dilución de la muestra.
Requiere la calibración con patrones de peso.
El intervalo de tamaño se determina por selección de abertura.
No diferenciación.
Oscurecimiento de la luz (LO) [39, 44] 1-200 IOs-l<35 No Típicamente requiere dilución de la muestra.
Sensible a las variaciones del índice de refracción.
Requiere la calibración con patrones de peso.
No diferenciación.
Análisis dinámico de imágenes (DIA) 1^t00 10 * 1 i? Sí Diferenciación basada en la morfología Imágenes de microflujo (MFI) más que en la composición.
[39, 47]
Análisis de seguimiento de 0,03-1 W - l t P No El tiempo de medición aumenta con el nanopartículas(NTA) [27] radio de la partícula.
No diferenciación.
Medición de resonancia magnética 0,3-4 Irf* 10® No El tamaño de la partícula se estima (RMM) Arquímedes [39, 45, 47] indirectamente a partir de la masa.
Diferenciación entre partículas boyantes negativas y positivas.
TABLA I
Las mediciones presentadas aquí demuestran que la microscopía holográfica de video junto con el análisis de Lorenz-Mie pueden detectar, contar y caracterizar agregados proteicos subvisibles. La adquisición de datos es rápida, típicamente tarda más de 15 minutos y no requiere una preparación especial de la muestra. Una implementación es efectiva para agregados 4 que varían en un radio de 300 nm a 10 pm y en concentraciones de 10 agregados/ml a 108 agregados/ml. Los mismos hologramas que se usan para las mediciones de caracterización también pueden interpretarse para estimar la morfología de agregados proteicos individuales mediante retropropagación numérica. La
calibración es sencilla y solo requiere la longitud de onda del láser, el aumento del microscopio y el índice de refracción del medio. Se cree que la caracterización holográfica de los agregados proteicos será útil para evaluar la estabilidad de las formulaciones biofarmacéuticas, para el control del proceso durante la fabricación y para el aseguramiento de la calidad tanto en el punto de venta como potencialmente en el punto de uso.
Anticorrelación entre tamaño agregado e índice de refracción
Como se indicó anteriormente, se observa una fuerte anticorrelación entre el tamaño agregado y el índice de refracción que se revelan en las Figuras 5A, 5C y 5E. Esto no se habría detectado mediante ninguna técnica de caracterización de partículas de la técnica anterior. Los valores para el índice de refracción de una sola partícula, además, son sustancialmente más pequeños que el valor de aproximadamente 1,45 que se esperaría para las proteínas en la longitud de onda de la formación de imágenes. De hecho, el índice de refracción estimado para las partículas más grandes no es mucho mayor que el del agua, 1,335.
La anticorrelación entre el tamaño y el índice de refracción junto con valores bajos para el índice de refracción se identificaron como características distintivas de la porosidad de las partículas. Sin embargo, en lugar de ser homogéneamente porosos, se cree que los agregados proteicos tendrán la estructura fractal que surge naturalmente a través del crecimiento por agregación.
Para probar esta idea, se modeló un agregado de proteínas como un grupo fractal de dimensión fractal D. El modelo fractal se seleccionó por su relación conocida con la geometría de agregados aleatorios y por simplicidad debido a la dependencia de un solo parámetro, la dimensión fractal D, para predecir la densidad. Un experto en la técnica apreciará que pueden usarse otros modelos apropiados para predecir las propiedades del agregado de proteínas, incluida la densidad. La fracción de volumen q> de proteínas de radio a0 dentro de un agregado de radio ap por lo tanto es
Esta proporción del grupo se compone de un material con índice de refracción ri0. El resto del volumen presumiblemente se llena con el medio fluido, que tiene un índice de refracción más bajo, r m . El índice de refracción aparente, r p , de la partícula como un todo viene dado por la teoría del medio efectivo
donde el factor de Lorenz-Lorentz es
A partir de esto,
Incluso si n0 y a0 no se conocen independientemente, esta relación de escala proporciona un medio para caracterizar la morfología de una población de agregados mediante la estimación de la dimensión fractal promediada para el conjunto.
Los datos de la Figura 6A-6B muestran los resultados de tal análisis. La Figura 6A compila todos los datos de las Figuras 5A, 5C y 5E bajo la suposición de que surgiría la misma morfología en los tres conjuntos de condiciones de crecimiento. Esta suposición se confirma en la Figura 6B que muestra los mismos datos graficados de acuerdo con la relación de escala en la Ec. (4). En particular, la tendencia lineal en la Figura 6B apoya las suposiciones subyacentes a la Ec. (4), incluido la suposición de que las tres poblaciones de agregados tienen comportamientos de crecimiento consistentes.
Las líneas discontinuas superpuestas a los datos de la Figura 6B indican pendientes consistentes con D= 1, 1,2 y 1,4, se obtiene la mejor concordancia para D= 1,2. Este resultado sugiere que los agregados de BSA son filamentosos, con pocas ramificaciones. El modelo fractal puede usarse para grumos densos (D = 3), cadenas lineales (D = 1) así como también estructuras intermedias (típicamente D> 3> 1). La aparente simetría esférica de los hologramas sugiere, por tanto, que los agregados se componen de grupos de filamentos. Esto es consistente con los estudios de microscopía electrónica de agregación de BSA en condiciones comparables. La estimación de la dimensión fractal a través de la caracterización holográfica mejora la microscopía electrónica porque puede realizarse i r situ y no conlleva
ninguna de las transformaciones estructurales inherentes a la preparación de la muestra. La caracterización holográfica también ofrece ventajas sobre la dispersión de luz convencional porque no requiere estimaciones del índice de refracción del monómero. Todos los datos de calibración necesarios para la medición están disponibles a partir de los datos de caracterización de una sola partícula y la calibración general del instrumento.
El éxito de este análisis de escala proporciona evidencia adicional de que los valores estimados holográficamente para el radio y el índice de refracción de los agregados proteicos individuales reflejan con precisión las propiedades reales de los agregados. Este resultado no es irrazonable dada la simetría observada de los hologramas de un solo agregado, como el ejemplo de la Figura 1A, y su facilidad para ajustarse al resultado de Lorenz-Mie para esferas ideales. Estas observaciones sugieren que la caracterización holográfica puede ser efectiva para analizar las propiedades de los agregados proteicos individuales y, por lo tanto, para evaluar las propiedades de las dispersiones de los agregados proteicos. Más allá de proporcionar información sobre la distribución de tamaño de los agregados proteicos, la caracterización holográfica también ofrece información sobre la composición y la morfología a través del índice de refracción.
La información proporcionada por la caracterización holográfica debería proporcionar información útil para formular dispersiones de proteínas, particularmente en aplicaciones donde el tamaño de los agregados debe controlarse y limitarse. De manera similar, las implementaciones en tiempo real de la caracterización holográfica deberían ser útiles para el control de procesos y el aseguramiento de la calidad en tales aplicaciones.
Diferenciación
Las Figuras 5A, 5C y 5E ilustran la capacidad, en una modalidad, de los sistemas y métodos descritos en la presente descripción para proporcionar diferenciación. En este contexto, "diferenciación" es la capacidad de distinguir un material deseado, tal como agregados proteicos, de otros materiales en una suspensión. Los datos del índice de refracción proporcionados por la caracterización holográfica pueden usarse para distinguir los agregados proteicos de los contaminantes tal como las gotas de silicona. Esto es importante porque los contaminantes, incluidas las gotas de silicona y las partículas de caucho, a menudo llegan a las soluciones de proteínas y pueden confundirse con agregados proteicos cuando se usan otras técnicas de caracterización. Tal identificación errónea puede sugerir que hay un problema con el producto, cuando no existe ningún problema, o no identificar un lote de producto contaminado.
Además, las Figuras 12A-12C ilustran IgG humana, aceite de silicona y los dos combinados en una muestra. Como puede observarse, los agregados proteicos (Figura 12A) y el aceite de silicona (Figura 12B) tienen firmas muy diferentes y son claramente distinguibles cuando están en la misma muestra (Figura 12C). La firma de aceite de silicona es un ejemplo de libro de texto de la caracterización holográfica de emulsiones de aceite, mientras que la proteína puede distinguirse fácilmente.
Mediante el uso de los sistemas y métodos descritos en la presente descripción, pueden diferenciarse los objetos por sus índices de refracción, que es una capacidad única. Por lo tanto, la diferenciación es por la composición real, con la que está directamente relacionado el índice de refracción, más que por algún otro aspecto como la morfología (que puede ser la misma para diferentes materiales, por lo que se obtienen resultados falsos, ya sean falsos positivos o falsos negativos). Por ejemplo, una técnica popular usa la morfología para distinguir la silicona de la proteína, bajo la suposición de que las gotas de silicona son esféricas y los agregados proteicos no. Sin embargo, esta suposición falla en varios casos importantes, incluso para pequeños agregados proteicos donde el tamaño está por debajo de la capacidad de la técnica para diferenciarlos de las esferas.
Implementación informática
Como se muestra en la Figura 7, por ejemplo, un medio accesible por ordenador 120 (por ejemplo, como se describió en la presente descripción, un dispositivo de almacenamiento tal como un disco duro, disquete, dispositivo de memoria, CD-ROM, RAM, ROM, etc., o una colección de estos) puede proporcionarse (por ejemplo, en comunicación con el sistema de procesamiento 110). El medio accesible por ordenador 120 puede ser un medio accesible por ordenador no transitorio. El medio accesible por ordenador 120 puede contener instrucciones ejecutables 130 en el mismo. Además o alternativamente, puede proporcionarse un sistema de almacenamiento 140 por separado del medio accesible por ordenador 120, que puede proporcionar las instrucciones al sistema de procesamiento 110 para configurar el sistema de procesamiento para ejecutar determinados procedimientos, procesos y métodos ilustrativos, como se describió en la presente descripción, por ejemplo. Las instrucciones pueden incluir una pluralidad de conjuntos de instrucciones. Por ejemplo, en algunas implementaciones, las instrucciones pueden incluir instrucciones para aplicar energía de radiofrecuencia en una pluralidad de bloques de secuencia a un volumen, donde cada uno de los bloques de secuencia incluye al menos una primera etapa. Las instrucciones pueden incluir además instrucciones para repetir la primera etapa sucesivamente hasta que la magnetización al comienzo de cada uno de los bloques de secuencia sea estable, instrucciones para concatenar una pluralidad de segmentos de imagen, que corresponden a la pluralidad de bloques de secuencia, en un solo segmento de imagen continuo e instrucciones para codificar al menos un parámetro de relajación en el único segmento de formación de imágenes continuo.
El sistema 100 también puede incluir un dispositivo de visualización o salida, un dispositivo de entrada tal como un teclado, ratón, pantalla táctil u otro dispositivo de entrada, y puede conectarse a sistemas adicionales a través de una
red lógica. Muchas de las modalidades descritas en la presente descripción pueden practicarse en un entorno de red mediante el uso de conexiones lógicas a uno o más ordenadores remotos que tengan procesadores. Las conexiones lógicas pueden incluir una red de área local (LAN) y una red de área amplia (WAN) que se presentan aquí a manera de ejemplo y no de limitación. Estos entornos de redes son habituales en las redes informáticas de oficinas, toda la empresa, intranets e Internet y pueden usar una amplia variedad de protocolos de comunicación diferentes. Los expertos en la técnica apreciarán que tales entornos informáticos de red pueden típicamente abarcar muchos tipos de configuraciones de sistemas informáticos, que incluyen ordenadores personales, dispositivos portátiles, sistemas de multiprocesadores, electrónicos programables para consumo o basados en microprocesadores, ordenadores en red, miniordenadores, ordenadores centrales y similares. Las modalidades de la invención también pueden practicarse en entornos informáticos distribuidos donde las tareas se realizan mediante dispositivos de procesamiento local y remoto que están conectados (ya sea mediante enlaces cableados, enlaces inalámbricos o mediante una combinación de enlaces cableados o inalámbricos) a través de una red de comunicaciones. En un entorno de sistema informático distribuido, los módulos de programa pueden localizarse en dispositivos de almacenamiento de memoria tanto remotos como locales.
Se describen varias modalidades en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que pueden implementarse mediante un producto de programa que incluye instrucciones ejecutables por ordenador, tales como código de programa, ejecutado por ordenadores en entornos en red. Generalmente, los módulos del programa incluyen rutinas, programas, objetos, componentes, estructuras de datos, etc. que realizan tareas particulares o implementan tipos de datos abstractos particulares. Las instrucciones ejecutables por ordenador, las estructuras de datos asociadas y los módulos de programa representan ejemplos de código de programa para ejecutar pasos de los métodos descritos en la presente descripción. La secuencia particular de tales instrucciones ejecutables o estructuras de datos asociadas representa ejemplos de actos correspondientes para implementar las funciones descritas en tales etapas.
Las implementaciones de software y web de la presente invención podrían lograrse con técnicas de programación estándar con lógica basada en reglas y otra lógica para lograr las diversas etapas de búsqueda en bases de datos, etapas de correlación, etapas de comparación y etapas de decisión. Además debe tenerse en cuenta que las palabras "componente" y "módulo", como se usan en la presente descripción y en las reivindicaciones, están destinadas a abarcar implementaciones que usan una o más líneas de código de software y/o implementaciones de hardware y/o equipos para recibir entradas manuales.
Con respecto al uso de sustancialmente cualquier término en plural y/o singular en la presente descripción, los expertos en la técnica pueden traducir del plural al singular y/o del singular al plural según sea apropiado para el contexto y/o aplicación. Las diversas permutaciones de singular/plural pueden establecerse expresamente en la presente descripción en aras de la claridad.
La anterior descripción de las modalidades ilustrativas se ha presentado con fines de ilustración y descripción. No se pretende que sea exhaustiva o limitativa con respecto a la forma precisa descrita, y son posibles modificaciones y variaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Claims (11)
1. Un método para caracterizar una muestra de una pluralidad de agregados proteicos, que comprende:
hacer fluir la muestra a través de un volumen de observación de un microscopio holográfico;
generar un primer conjunto de hologramas basado en microscopía holográfica de video de un primer conjunto de agregados proteicos dentro del volumen de observación por primera vez;
caracterizar cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto de agregados proteicos como una esfera; y
determinar el índice de refracción y el radio de la esfera caracterizada del primer conjunto de agregados proteicos;
generar un segundo conjunto de hologramas basado en microscopía holográfica de video de un segundo conjunto de agregados proteicos dentro del volumen de observación por segunda vez;
caracterizar cada uno de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos como una esfera; y
determinar el índice de refracción y el radio para cada uno de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos;
en donde la caracterización de cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto y el segundo conjunto comprende además modelar cada uno de los agregados proteicos del primer conjunto y del segundo conjunto como un grupo fractal de dimensión fractal D donde:
Por la presente, 0 es la fracción de volumen de proteínas, ao es el radio de la proteína y aPes el radio del agregado proteico.
2. El método de la reivindicación 1, en donde además la fracción de volumen de proteína tiene un índice de refracción de no y un volumen restante es un medio fluido con un índice de refracción de nm, lo que produce el índice de refracción aparente del agregado proteico de np.
3. El método de la reivindicación 1, que comprende además caracterizar la morfología del primer conjunto de agregados proteicos y el segundo conjunto de agregados proteicos con base en la estimación de una dimensión fractal promediada para el conjunto.
5. El método de la reivindicación 1, que comprende además monitorear la síntesis de la pluralidad de partículas con base en la comparación del índice de refracción y radio de la primera partícula y el radio e índice de refracción de la segunda partícula.
6. El método de la reivindicación 1, en donde el flujo de la muestra a través del volumen de observación del microscopio holográfico es a una velocidad de hasta 100 ^m s-1.
7. El método de la reivindicación 1, que comprende además, antes de generar el primer conjunto de hologramas, añadir sal.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la determinación del índice de refracción y el radio comprende la aplicación de la teoría de Lorenz-Mie.
9. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar si concluyó la síntesis de la pluralidad de partículas.
10. El método de la reivindicación 1, en donde la determinación del índice de refracción y el radio de los agregados proteicos del primer conjunto de agregados proteicos y la determinación del índice de refracción y el radio de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos comprenden determinar una densidad de probabilidad para el índice de refracción y el radio de los agregados proteicos del primer conjunto de agregados proteicos y la determinación de una densidad de probabilidad para el índice de refracción y el radio de los agregados proteicos del segundo conjunto de agregados proteicos, respectivamente.
11. El método de la reivindicación 1, en donde al menos un agregado de proteínas está presente tanto en el primer conjunto de agregados proteicos como en el segundo conjunto de agregados proteicos y además en donde se determina la trayectoria del al menos un agregado proteico.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662292842P | 2016-02-08 | 2016-02-08 | |
PCT/US2017/016857 WO2017139279A2 (en) | 2016-02-08 | 2017-02-07 | Holographic characterization of protein aggregates |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2901608T3 true ES2901608T3 (es) | 2022-03-23 |
Family
ID=59564000
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES17750639T Active ES2901608T3 (es) | 2016-02-08 | 2017-02-07 | Caracterización holográfica de agregados proteicos |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11385157B2 (es) |
EP (1) | EP3414517B1 (es) |
JP (1) | JP7130242B2 (es) |
DK (1) | DK3414517T3 (es) |
ES (1) | ES2901608T3 (es) |
TW (1) | TWI731030B (es) |
WO (1) | WO2017139279A2 (es) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9316578B2 (en) | 2008-10-30 | 2016-04-19 | New York University | Automated real-time particle characterization and three-dimensional velocimetry with holographic video microscopy |
US11085864B2 (en) | 2014-11-12 | 2021-08-10 | New York University | Colloidal fingerprints for soft materials using total holographic characterization |
JP7130242B2 (ja) * | 2016-02-08 | 2022-09-05 | ニュー・ヨーク・ユニヴァーシティー | タンパク質凝集体のホログラフィ特徴付け |
EP3891560A4 (en) * | 2018-12-04 | 2022-01-26 | The Regents of the University of California | PORTABLE UV HOLOGRAPHIC MICROSCOPE FOR HIGH CONTRAST LIQUID CRYSTAL IMAGING |
US11543338B2 (en) | 2019-10-25 | 2023-01-03 | New York University | Holographic characterization of irregular particles |
US11948302B2 (en) | 2020-03-09 | 2024-04-02 | New York University | Automated holographic video microscopy assay |
Family Cites Families (158)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3069654A (en) | 1960-03-25 | 1962-12-18 | Paul V C Hough | Method and means for recognizing complex patterns |
US3551018A (en) | 1969-05-01 | 1970-12-29 | Karl A Stetson | Total internal reflection holography |
JPS5596976A (en) | 1979-01-17 | 1980-07-23 | Ricoh Co Ltd | Hologram recorder |
FR2476839A1 (fr) | 1980-02-25 | 1981-08-28 | Anvar | Procede de determination du diametre d'une particule en suspension dans un fluide par utilisation d'un rayonnement electromagnetique coherent |
JPS58155636A (ja) | 1982-03-12 | 1983-09-16 | Hitachi Ltd | ホログラフイ電子顕微鏡 |
DE3303876A1 (de) | 1983-02-05 | 1984-08-09 | M.A.N. Maschinenfabrik Augsburg-Nürnberg AG, 8000 München | Holografisches differenzverfahren |
US4540285A (en) | 1983-05-16 | 1985-09-10 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Photothermal method of determining calorific properties of coal |
US4740079A (en) | 1984-10-29 | 1988-04-26 | Hitachi, Ltd. | Method of and apparatus for detecting foreign substances |
GB8703228D0 (en) | 1987-02-12 | 1987-03-18 | Hugle W B | Positional detection of objects |
US4986659A (en) | 1988-02-29 | 1991-01-22 | Aerometrics, Inc. | Method for measuring the size and velocity of spherical particles using the phase and intensity of scattered light |
JP2776862B2 (ja) | 1989-01-13 | 1998-07-16 | 株式会社日立製作所 | 反射電子線ホログラフイー装置 |
JPH03251888A (ja) | 1990-02-28 | 1991-11-11 | Shimadzu Corp | ホログラフイカメラ |
JPH03251388A (ja) | 1990-02-28 | 1991-11-08 | Sony Corp | ロボット |
US5095207A (en) | 1991-01-07 | 1992-03-10 | University Of Wisconsin - Milwaukee | Method of three-dimensional atomic imaging |
US5146086A (en) | 1991-03-19 | 1992-09-08 | Chevron Research And Technology Company | Method and apparatus for imaging porous media and method for fabricating novel optical materials |
GB9203239D0 (en) | 1992-02-14 | 1992-04-01 | Imperial College | Holographic imaging |
US5373727A (en) | 1993-04-16 | 1994-12-20 | New Mexico Tech Research Foundation | Miniporopermeameter |
US6797942B2 (en) | 2001-09-13 | 2004-09-28 | University Of Chicago | Apparatus and process for the lateral deflection and separation of flowing particles by a static array of optical tweezers |
US5995153A (en) | 1995-11-02 | 1999-11-30 | Prime Image, Inc. | Video processing system with real time program duration compression and expansion |
ATE357663T1 (de) | 1996-04-25 | 2007-04-15 | Genicon Sciences Corp | Teilchenförmiges markierungsmittel verwendendes analytassay |
US7041510B2 (en) | 1996-04-25 | 2006-05-09 | Bioarray Solutions Ltd. | System and method for programmable illumination pattern generation |
US20040004717A1 (en) | 1996-11-13 | 2004-01-08 | Reed Wayne F. | Automatic mixing and dilution methods and apparatus for online characterization of equilibrium and non-equilibrium properties of solutions containing polymers and/or colloids |
US6480285B1 (en) | 1997-01-28 | 2002-11-12 | Zetetic Institute | Multiple layer confocal interference microscopy using wavenumber domain reflectometry and background amplitude reduction and compensation |
US5939716A (en) | 1997-04-02 | 1999-08-17 | Sandia Corporation | Three-dimensional light trap for reflective particles |
US5880841A (en) | 1997-09-08 | 1999-03-09 | Erim International, Inc. | Method and apparatus for three-dimensional imaging using laser illumination interferometry |
US6055106A (en) | 1998-02-03 | 2000-04-25 | Arch Development Corporation | Apparatus for applying optical gradient forces |
US7133203B2 (en) | 1998-02-03 | 2006-11-07 | Arch Development Corporation | Apparatus for applying optical gradient forces |
GB9810865D0 (en) | 1998-05-20 | 1998-07-22 | Zeneca Ltd | Nucleic acid sequence identification |
US6097488A (en) | 1998-06-22 | 2000-08-01 | Princeton University | Method and apparatus for measuring micro structures, anisotropy and birefringence in polymers using laser scattered light |
US6281994B1 (en) | 1998-12-22 | 2001-08-28 | Nippon Telegraph And Telephone Corporation | Method and apparatus for three-dimensional holographic display suitable for video image display |
JP2001034148A (ja) | 1999-07-26 | 2001-02-09 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | 立体映像表示方法および装置 |
JP2000225302A (ja) | 1999-02-04 | 2000-08-15 | Mitsubishi Chemicals Corp | 粒度分布の特徴量の推定方法、粒子の製造方法及びこれらに用いる装置 |
AU4328000A (en) | 1999-03-31 | 2000-10-16 | Verizon Laboratories Inc. | Techniques for performing a data query in a computer system |
US6608716B1 (en) * | 1999-05-17 | 2003-08-19 | New Mexico State University Technology Transfer Corporation | Optical enhancement with nanoparticles and microcavities |
DE19954933A1 (de) | 1999-11-10 | 2001-05-17 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Anordnung zur Einkopplung einer optischen Pinzette und/oder eines Bearbeitungsstrahles in ein Mikroskop |
AU2254901A (en) | 1999-12-06 | 2001-06-12 | Emory University | Systems and methods for providing functional magnetic resonance imaging data analysis services |
DE60124524T2 (de) | 2000-04-25 | 2007-03-08 | Asml Holding, N.V. | Optisches reduktionssystem mit kontrolle der belichtungspolarisation |
TW531661B (en) | 2000-10-06 | 2003-05-11 | Arch Dev Corp | Method of controllably filling an array of small particles, method of controllably manipulating an array of optical traps, and apparatus for controllably manipulating an array of optical traps |
US20030007894A1 (en) | 2001-04-27 | 2003-01-09 | Genoptix | Methods and apparatus for use of optical forces for identification, characterization and/or sorting of particles |
WO2002086557A2 (en) * | 2001-04-25 | 2002-10-31 | New Mexico State University Technology Transfer Corporation | Plasmonic nanophotonics methods, materials, and apparatuses |
CA2724743C (fr) | 2001-06-29 | 2014-11-25 | Universite Libre De Bruxelles | Procede et dispositif destines a l'obtention par microscopie d'images en trois dimensions d'un echantillon |
US7338168B2 (en) | 2001-07-06 | 2008-03-04 | Palantyr Research, Llc | Particle analyzing system and methodology |
US20030021016A1 (en) | 2001-07-27 | 2003-01-30 | Grier David G. | Parallel scanned laser confocal microscope |
US7186985B2 (en) | 2001-07-30 | 2007-03-06 | Dxray, Inc. | Method and apparatus for fabricating mercuric iodide polycrystalline films for digital radiography |
US6519033B1 (en) | 2001-11-19 | 2003-02-11 | Point Source Technologies, Llc | Identification of particles in fluid |
FR2830962B1 (fr) | 2001-10-12 | 2004-01-30 | Inst Nat Rech Inf Automat | Dispositif et methode de traitement d'image pour detection de lesions evolutives |
US6735960B2 (en) | 2001-10-30 | 2004-05-18 | Carnegie Institution Of Washington | Composition and method for hydrogen storage |
EP1451646B1 (en) | 2001-12-04 | 2018-09-19 | Ecole Polytechnique Féderale de Lausanne (EPFL) | Apparatus and method for digital holographic imaging |
US6737634B2 (en) | 2002-01-16 | 2004-05-18 | The University Of Chicago | Use of multiple optical vortices for pumping, mixing and sorting |
US7318902B2 (en) | 2002-02-04 | 2008-01-15 | Colorado School Of Mines | Laminar flow-based separations of colloidal and cellular particles |
GB2385481B (en) | 2002-02-13 | 2004-01-07 | Fairfield Imaging Ltd | Microscopy imaging system and method |
IL164459A0 (en) | 2002-04-10 | 2005-12-18 | Arryx Inc | Apparatus and method to generate and control optical traps to manipulate small particles |
US20040180363A1 (en) | 2002-04-12 | 2004-09-16 | Dymeka Gossett Rooks Pitts Pllc | Configurable dynamic three dimensional array |
US7324282B2 (en) | 2002-05-14 | 2008-01-29 | Arryx, Inc. | Apparatus, system and method for applying optical gradient forces |
EP1549954B1 (en) | 2002-05-14 | 2008-11-26 | Arryx, Inc. | Broad spectrum optically addressed sensor |
US6710874B2 (en) | 2002-07-05 | 2004-03-23 | Rashid Mavliev | Method and apparatus for detecting individual particles in a flowable sample |
EP3229240A1 (en) | 2002-07-31 | 2017-10-11 | Premium Genetics (UK) Limited | System and method of sorting materials using holographic laser steering |
US7699767B2 (en) | 2002-07-31 | 2010-04-20 | Arryx, Inc. | Multiple laminar flow-based particle and cellular separation with laser steering |
US6863406B2 (en) | 2002-08-01 | 2005-03-08 | The University Of Chicago | Apparatus and method for fabricating, sorting, and integrating materials with holographic optical traps |
US7515953B2 (en) | 2002-08-01 | 2009-04-07 | The Johns Hopkins University | Techniques for identifying molecular structures and treating cell types lining a body lumen using fluorescence |
MY134335A (en) | 2002-09-11 | 2007-12-31 | Jfe Eng Corp | Process for producing gas clathrate and production apparatus |
US7109473B2 (en) | 2002-09-16 | 2006-09-19 | University Of Chicago | Transverse optical accelerator and generalized optical vortices |
EP1545762A2 (en) | 2002-09-27 | 2005-06-29 | Carlsberg A/S | Spatially encoded polymer matrix |
US20060003252A1 (en) | 2002-12-02 | 2006-01-05 | Taku Hirayama | Chemical amplification type silicone based positive photoresist composition |
US7351953B2 (en) | 2003-04-10 | 2008-04-01 | Arryx, Inc. | Apparatus and method to generate and control optical traps to manipulate small particles |
WO2004100175A1 (en) | 2003-05-08 | 2004-11-18 | The University Court Of The University Of St Andrews | Fractionation of particles |
AU2004241455A1 (en) | 2003-05-16 | 2004-12-02 | University Of Chicago | Optical fractionation methods and apparatus |
IL156856A (en) | 2003-07-09 | 2011-11-30 | Joseph Shamir | Method for particle size and concentration measurement |
WO2005027031A2 (en) | 2003-09-12 | 2005-03-24 | Cyvera Corporation | Method and apparatus for labeling using diffraction grating-based encoded optical identification elements |
CN101382619A (zh) | 2003-10-28 | 2009-03-11 | 阿而利克斯公司 | 使用全息光学俘获操纵和处理材料的***和方法 |
GB2408587A (en) | 2003-11-28 | 2005-06-01 | Univ Hertfordshire | Optical particle manipulation systems |
CA2550902C (en) * | 2003-12-22 | 2013-06-25 | Versamatrix A/S | Apparatus and methods for analysis and sorting of particles such as polymer beads |
US20070242269A1 (en) | 2004-03-06 | 2007-10-18 | Michael Trainer | Methods and apparatus for determining characteristics of particles |
US7612355B2 (en) | 2004-04-12 | 2009-11-03 | The Regents Of The University Of California | Optoelectronic tweezers for microparticle and cell manipulation |
JP2005337730A (ja) | 2004-05-24 | 2005-12-08 | Nara Institute Of Science & Technology | 測定システム |
US20060029634A1 (en) | 2004-08-06 | 2006-02-09 | Berg Michael C | Porous structures |
WO2006034129A2 (en) | 2004-09-17 | 2006-03-30 | Jmar Research, Inc. | Systems and methods for detecting scattered light from a particle using illumination incident at an angle |
US7473890B2 (en) | 2004-11-23 | 2009-01-06 | New York University | Manipulation of objects in potential energy landscapes |
WO2006058187A2 (en) | 2004-11-23 | 2006-06-01 | Robert Eric Betzig | Optical lattice microscopy |
WO2006063335A2 (en) | 2004-12-10 | 2006-06-15 | Arryx, Inc. | Automated extraction and purification of samples using optical tweezers |
US7586684B2 (en) | 2005-01-21 | 2009-09-08 | New York University | Solute characterization by optoelectronkinetic potentiometry in an inclined array of optical traps |
US7218112B2 (en) | 2005-05-12 | 2007-05-15 | Siemens Aktiengesellschaft | Combined MR/PET system |
WO2006130728A2 (en) | 2005-05-31 | 2006-12-07 | The Regents Of The University Of California | Single-cell raman spectroscopy for the non-destructive, non-invasive analysis of cells and cellular components |
US7230424B1 (en) | 2005-06-17 | 2007-06-12 | Fonar Corporation | Magnetic resonance imaging |
JP2009501081A (ja) | 2005-07-12 | 2009-01-15 | アリックス インコーポレイテッド | ホログラフィック光学ピンセットを利用して多次元コロイド構造を形成する方法および装置 |
JP4581946B2 (ja) | 2005-09-29 | 2010-11-17 | セイコーエプソン株式会社 | 画像表示装置 |
US8149416B2 (en) | 2005-10-17 | 2012-04-03 | Arryx, Inc. | Apparatus and method for dynamic cellular probing and diagnostics using holographic optical forcing array |
US9056291B2 (en) | 2005-11-30 | 2015-06-16 | Micronics, Inc. | Microfluidic reactor system |
US7491928B2 (en) | 2005-12-05 | 2009-02-17 | New York University | Extended optical traps by shape-phase holography |
US20090132074A1 (en) | 2005-12-08 | 2009-05-21 | Nec Corporation | Automatic segment extraction system for extracting segment in music piece, automatic segment extraction method, and automatic segment extraction program |
US20070177774A1 (en) | 2006-01-30 | 2007-08-02 | Nanogate Optoelectronics Robot, Inc. | Fingerprint Recognition System Having Detecting Pore and Method Thereof |
JP2007279475A (ja) | 2006-04-10 | 2007-10-25 | Pulstec Industrial Co Ltd | ホログラム記録装置及びホログラム記録方法 |
US7788067B2 (en) | 2006-05-12 | 2010-08-31 | Artium Technologies, Inc. | Means and methods for signal validation for sizing spherical objects |
US8073658B2 (en) | 2006-06-05 | 2011-12-06 | Cambridge Research & Instrumentation, Inc. | Monte Carlo simulation using GPU units on personal computers |
WO2008127376A2 (en) | 2006-10-17 | 2008-10-23 | The Regents Of The University Of California | Biological cell sorting and characterization using aerosol mass spectrometry |
US7835051B2 (en) | 2006-10-17 | 2010-11-16 | New York University | Volumetric imaging of holographic optical traps |
WO2008063809A2 (en) | 2006-10-24 | 2008-05-29 | New York University | Three-dimensional holographic ring traps |
US7605919B2 (en) * | 2006-10-30 | 2009-10-20 | Brightwell Technologies Inc. | Method and apparatus for analyzing particles in a fluid |
US7847238B2 (en) | 2006-11-07 | 2010-12-07 | New York University | Holographic microfabrication and characterization system for soft matter and biological systems |
US20080150532A1 (en) | 2006-12-21 | 2008-06-26 | General Electric Company | Method and apparatus for measuring t1 relaxation |
WO2008078736A1 (ja) | 2006-12-27 | 2008-07-03 | Nec Corporation | 同一性判定装置、同一性判定方法および同一性判定用プログラム |
US8331019B2 (en) | 2007-01-26 | 2012-12-11 | New York University | Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional nanorod structures |
EP2492921A1 (en) | 2007-01-26 | 2012-08-29 | New York University | Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures |
EP2160352A2 (en) | 2007-05-24 | 2010-03-10 | Simone Arca | Method for the production of binary clathrate hydrates of hydrogen |
WO2008146616A1 (ja) | 2007-05-25 | 2008-12-04 | Nec Corporation | 画像音響区間群対応付け装置と方法およびプログラム |
JP2009002276A (ja) | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Nippon Soken Inc | 粒子状物質の捕集量検出方法及び捕集量検出装置と排ガス浄化装置 |
JP4424396B2 (ja) | 2007-09-03 | 2010-03-03 | ソニー株式会社 | データ処理装置および方法、並びにデータ処理プログラムおよびデータ処理プログラムが記録された記録媒体 |
US7782459B2 (en) * | 2007-09-24 | 2010-08-24 | Process Metrix | Laser-based apparatus and method for measuring agglomerate concentration and mean agglomerate size |
US8791985B2 (en) | 2007-10-30 | 2014-07-29 | New York University | Tracking and characterizing particles with holographic video microscopy |
US20100259263A1 (en) | 2007-11-14 | 2010-10-14 | Dominic Holland | Longitudinal registration of anatomy in magnetic resonance imaging |
CN101925865A (zh) | 2007-11-22 | 2010-12-22 | 国立大学法人京都工艺纤维大学 | 数字全息装置以及相位片阵列 |
US20110225196A1 (en) | 2008-03-19 | 2011-09-15 | National University Corporation Hokkaido University | Moving image search device and moving image search program |
US7908300B2 (en) | 2008-04-02 | 2011-03-15 | Honeywell International Inc. | Guided entry system for individuals for annotating process deviations |
JP2011525967A (ja) | 2008-06-05 | 2011-09-29 | ジ アドミニストレイターズ オブ ザ チューレン エデュケイショナル ファンド | ポリマー合成中の機能進化をモニタリングする方法及び装置 |
US7929132B2 (en) * | 2008-07-11 | 2011-04-19 | University Of Utah Research Foundation | Transmission microscopy using light emitted from nanoparticles |
GB0813907D0 (en) | 2008-07-30 | 2008-09-03 | Univ Durham | Sub-micron 3d holographic lithpgraphy |
JP5690268B2 (ja) | 2008-08-26 | 2015-03-25 | ザ ユニバーシティー コート オブザ ユニバーシティー オブ グラスゴー | 測定システム、位置決定装置、波長決定装置、及び屈折率決定装置 |
US20100055031A1 (en) | 2008-08-28 | 2010-03-04 | Dong June Ahn | Ice nanorods for hydrogen storage |
DE102008044828B3 (de) | 2008-08-28 | 2010-04-15 | Siemens Aktiengesellschaft | Verwendung eines Magnetresonanz-Sequenzmodells zur formalen Beschreibung einer Messsequenz |
US9316578B2 (en) | 2008-10-30 | 2016-04-19 | New York University | Automated real-time particle characterization and three-dimensional velocimetry with holographic video microscopy |
US8759482B2 (en) | 2009-10-19 | 2014-06-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Kinetically efficient substrate for lipoic acid ligase |
US8763623B2 (en) | 2009-11-06 | 2014-07-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for handling solids in microfluidic systems |
CN102753954A (zh) | 2009-12-22 | 2012-10-24 | 纽约大学 | 利用光学力将胶粒分成多个通道:棱镜光学分离 |
US8405395B2 (en) | 2010-04-15 | 2013-03-26 | The General Hospital Corporation | Method for simultaneous multi-slice magnetic resonance imaging |
EP2378307A1 (en) | 2010-04-15 | 2011-10-19 | Commissariat à l'Énergie Atomique et aux Énergies Alternatives | Method and apparatus for compensating for B1 inhomogeneity in magnetic resonance imaging by nonselective three-dimensional tailored RF pulses |
WO2011149526A2 (en) | 2010-05-25 | 2011-12-01 | Arryx, Inc. | Methods and apparatuses for detection of positional freedom of particles in biological and chemical analyses and applications in immunodiagnostics |
US9519129B2 (en) | 2010-11-05 | 2016-12-13 | New York University | Method and system for measuring porosity of particles |
KR101829947B1 (ko) * | 2010-11-12 | 2018-02-19 | 유니베르시테 리브레 드 브룩크젤즈 | 투명 입자를 특성화 하기 위한 광학적 방법 |
US9767341B2 (en) * | 2010-12-14 | 2017-09-19 | The Regents Of The University Of California | Method and device for holographic opto-fluidic microscopy |
US8723518B2 (en) | 2011-03-18 | 2014-05-13 | Nicole SEIBERLICH | Nuclear magnetic resonance (NMR) fingerprinting |
US8653818B2 (en) | 2011-04-08 | 2014-02-18 | Siemens Aktiengesellschaft | Parallel transmission RF pulse design with local SAR constraints |
US9267891B2 (en) | 2011-06-06 | 2016-02-23 | The Regents Of The University Of California | Multiplex fluorescent particle detection using spatially distributed excitation |
KR101911763B1 (ko) | 2011-07-11 | 2018-10-26 | 도레이 카부시키가이샤 | 성형 재료, 도료 조성물 및 성형 재료의 제조 방법 |
WO2013019640A1 (en) * | 2011-07-29 | 2013-02-07 | The Regents Of The University Of California | Lensfree holographic microscopy using wetting films |
TWI654419B (zh) * | 2011-08-29 | 2019-03-21 | 美商安美基公司 | 用於非破壞性檢測-流體中未溶解粒子之方法及裝置 |
US20140170735A1 (en) | 2011-09-25 | 2014-06-19 | Elizabeth A. Holmes | Systems and methods for multi-analysis |
JP6087834B2 (ja) | 2011-11-01 | 2017-03-01 | 株式会社日立製作所 | 磁気共鳴イメージング装置およびアンテナ装置 |
CN102411298B (zh) * | 2011-11-30 | 2014-11-05 | 昆明理工大学 | 一种三维实时超分辨数字全息记录方法 |
CN104115074B (zh) | 2011-12-02 | 2017-07-04 | Csir公司 | 全息图处理方法和*** |
CN104105979B (zh) | 2012-02-09 | 2018-05-22 | 皇家飞利浦有限公司 | 与mri装置组合使用的数据探测设备 |
US9188529B2 (en) | 2012-02-24 | 2015-11-17 | New York University | Holographic microrefractometer for determining refractive index of a medium |
US9625551B2 (en) | 2012-04-16 | 2017-04-18 | Ali Caglar Ozen | Magnetic resonance apparatus and data acquisition method with decoupling between transmit and receive coils |
CN109813923A (zh) * | 2013-02-18 | 2019-05-28 | 赛拉诺斯知识产权有限责任公司 | 用于采集和传输测定结果的***和方法 |
US20170209864A1 (en) | 2013-03-15 | 2017-07-27 | Gpb Scientific, Llc | Methods and systems for processing particles |
EP3068298A4 (en) | 2013-11-15 | 2018-02-21 | New York University | Self calibrating parallel transmission by spin dynamic fingerprinting |
US9816948B2 (en) | 2014-04-18 | 2017-11-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Computerized tomography detection of microbial damage of plant tissues |
US10261154B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Case Western Reserve University | Nuclear magnetic resonance (NMR) fingerprinting tissue classification and image segmentation |
US9897675B2 (en) | 2014-05-28 | 2018-02-20 | Case Western Reserve University | Magnetic resonance fingerprinting (MRF) with simultaneous multivolume acquisition |
KR102383995B1 (ko) * | 2014-06-25 | 2022-04-07 | 뉴욕 유니버시티 | 인라인 입자 특징화 |
US11085864B2 (en) * | 2014-11-12 | 2021-08-10 | New York University | Colloidal fingerprints for soft materials using total holographic characterization |
WO2017040158A1 (en) * | 2015-08-28 | 2017-03-09 | Schlumberger Technology Corporation | Microrheology of fluids used at wellsite |
CN108351288B (zh) | 2015-09-18 | 2021-04-27 | 纽约大学 | 精密浆料中大杂质颗粒的全息检测和表征 |
JP7130242B2 (ja) * | 2016-02-08 | 2022-09-05 | ニュー・ヨーク・ユニヴァーシティー | タンパク質凝集体のホログラフィ特徴付け |
KR20170141029A (ko) * | 2016-06-14 | 2017-12-22 | 조선대학교산학협력단 | 형태학적 셀파라미터 기반 적혈구 검사 방법 및 이에 사용되는 디지털 홀로그래픽 현미경 |
EP3575773A1 (en) | 2018-05-28 | 2019-12-04 | Universität für Bodenkultur Wien | A method for determining a three-dimensional particle distribution in a medium |
US11543338B2 (en) | 2019-10-25 | 2023-01-03 | New York University | Holographic characterization of irregular particles |
EP3922979B1 (en) | 2020-06-08 | 2023-06-07 | Universität für Bodenkultur Wien | Method for determining a focal length of a particle in a medium |
EP3922977A1 (en) | 2020-06-08 | 2021-12-15 | Universität für Bodenkultur Wien | Method for determining a property of a particle in a medium |
-
2017
- 2017-02-07 JP JP2018541149A patent/JP7130242B2/ja active Active
- 2017-02-07 ES ES17750639T patent/ES2901608T3/es active Active
- 2017-02-07 US US16/076,265 patent/US11385157B2/en active Active
- 2017-02-07 TW TW106103963A patent/TWI731030B/zh active
- 2017-02-07 DK DK17750639.1T patent/DK3414517T3/da active
- 2017-02-07 WO PCT/US2017/016857 patent/WO2017139279A2/en active Application Filing
- 2017-02-07 EP EP17750639.1A patent/EP3414517B1/en active Active
-
2022
- 2022-05-27 US US17/826,848 patent/US11747258B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017139279A2 (en) | 2017-08-17 |
JP7130242B2 (ja) | 2022-09-05 |
US20220326130A1 (en) | 2022-10-13 |
US20210199551A1 (en) | 2021-07-01 |
WO2017139279A3 (en) | 2017-10-26 |
TW201732258A (zh) | 2017-09-16 |
US11747258B2 (en) | 2023-09-05 |
US11385157B2 (en) | 2022-07-12 |
EP3414517A4 (en) | 2020-02-19 |
EP3414517A2 (en) | 2018-12-19 |
JP2019513973A (ja) | 2019-05-30 |
DK3414517T3 (da) | 2021-12-13 |
EP3414517B1 (en) | 2021-10-06 |
TWI731030B (zh) | 2021-06-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2901608T3 (es) | Caracterización holográfica de agregados proteicos | |
Wang et al. | Holographic characterization of protein aggregates | |
US10634604B2 (en) | Automated real-time particle characterization and three-dimensional velocimetry with holographic video microscopy | |
US11977015B2 (en) | Colloidal fingerprints for soft materials using total holographic characterization | |
EP2866099B1 (en) | Tracking and characterizing particles with holographic video microscopy | |
JP7009402B2 (ja) | コロイドの粒度分布を決定するシステム | |
JP7042811B2 (ja) | ダイナミックフォーカスシステム及び方法 | |
Dannhauser et al. | Optical signature of erythrocytes by light scattering in microfluidic flows | |
Emmerich et al. | Optical inline analysis and monitoring of particle size and shape distributions for multiple applications: Scientific and industrial relevance | |
JP2019534463A (ja) | Huモーメントを用いるホログラフィック特性評価 | |
Wu et al. | Particle characterization with on-line imaging and neural network image analysis | |
Go et al. | Deep learning-based hologram generation using a white light source | |
CN104390895A (zh) | 基于显微成像的图像灰度测量颗粒粒径的方法 | |
Kovacevic et al. | Shape identification of primary particles in potash alum aggregates using three-dimensional tomography data | |
Nikitin et al. | Study of laser beam scattering by inhomogeneous ensemble of red blood cells in a shear flow | |
RU2629594C1 (ru) | Способ измерения характеристик деформируемости эритроцитов (варианты) | |
Monakhova et al. | A Comparative Study of Different Software Packages for Nanoparticle Tracking Analysis | |
Tai et al. | A forward reconstruction, holographic method to overcome the lens effect during 3D detection of semi-transparent, non-spherical particles | |
Cheong et al. | Flow visualization and flow cytometry with holographic video microscopy | |
RU2585113C2 (ru) | Способ измерения параметров распределения эритроцитов по деформируемости | |
Guan et al. | Dual-angle Mueller Matrix Polarimetry For Single Cell | |
Chakraborty et al. | Measuring the three-dimensional morphology of crystals using regular reflection of light | |
Altman | Probing the Structure and Dynamics of Colloidal Materials with Holographic Microscopy and Effective Medium Theory | |
WO2024159227A2 (en) | Systems and methods for measuring particle size in tissue and turbid media | |
Zepeda | Point Cloud Analysis Underlies Unbiased Adaptive Single Particle Tracking Methods |