ES2900803T3 - Citómetro de flujo - Google Patents
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Abstract
Un sistema de detección de luz que comprende: una célula de flujo (60) a través de la cual una corriente de líquido transporta y alinea hidrodinámicamente las células o partículas para que pasen en una sola fila a través de una zona de visualización de la célula de flujo; un espejo cóncavo (406) para reflejar la luz que se propaga desde la zona de visualización; y caracterizado porque el sistema comprende un detector (408) para medir la pérdida de luz axial producida por una célula o partícula en la zona de visualización al detectar la luz reflejada por el espejo cóncavo, donde el espejo cóncavo está configurado para dirigir tanto la luz dispersa hacia adelante como la luz restante de un haz de iluminación que pasa a través de la célula o partícula en la zona de visualización hacia el detector para determinar el tamaño de la célula o partícula en la zona de visualización, donde el detector está en modo heterodino midiendo la interferencia coherente de la luz dispersada hacia adelante y la luz restante, donde el espejo cóncavo y el detector están dispuestos de manera que se produzca un patrón de interferencia de la luz dispersa hacia adelante y la luz restante en la parte relevante del detector.
Description
DESCRIPCIÓN
Citómetro de flujo
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad según el Título 35 de la Sección 119 del Código de los EE. UU. para la Solicitud de patente provisional de los EE. UU. Número de serie. 61/911.859, que se titula "Flow Cytometer", depositada el 4 de diciembre de 2013. Esta solicitud está relacionada con el número de serie de la solicitud de patente internacional PCT/US13/43453 titulada "Flow Cytometer", depositada el 30 de mayo de 2013, que reivindica el beneficio de prioridad según el Título 35 de la Sección 119 del Código de los EE. UU. Para la Solicitud de patente provisional de los EE. UU. número de serie 61/653.245, titulada "Pulseless Peristaltic Pump", depositada el 30 de mayo de 2012, la Solicitud de patente provisional de los EE. UU. número de serie 61/653.328, titulada "Composite Microscope Objective with a Dispersion Compensation Plate", depositada el 30 de mayo de 2012, la Solicitud de patente provisional de los EE. UU.
61/715.819, titulada "Wavelength Division Multiplexing for Extended Light Source", depositada el 18 de octubre de 2012, la Solicitud de patente provisional de los EE. UU. número de serie 61/715.836 titulado "Diode Laser Based Optical Excitation System", depositada el 19 de octubre de 2012 y la Solicitud de patente provisional de los EE. UU. 61/816.819 titulada "A Simple Fluidic System for Supplying Pulsation Free Liquid to Flow Cell", depositada el 29 de abril de 2013.
ANTECEDENTES
Campo técnico
La presente descripción se refiere en general al campo técnico de la citometría de flujo y, más particularmente, a la estructura y funcionamiento de un citómetro de flujo mejorado junto con varios subconjuntos individuales incluidos en el mismo.
Antecedentes
La citometría de flujo es una técnica biofísica empleada en el recuento celular, clasificación, detección de biomarcadores e ingeniería de proteínas. En la citometría de flujo, las células suspendidas en una corriente de líquido pasan a través de un aparato de detección electrónico. La citometría de flujo permite el análisis multiparamétrico simultáneo de características físicas y/o químicas de hasta miles de células por segundo.
La citometría de flujo tiene varias aplicaciones, incluso en los campos de la biología molecular, patología, inmunología, biología vegetal y biología marina. La citometría de flujo también tiene una amplia aplicación en medicina (especialmente en trasplantes, hematología, inmunología y quimioterapia de tumores, diagnóstico prenatal, genética y en la clasificación de espermatozoides para la preselección de sexo). En biología marina, las propiedades autofluorescentes del plancton fotosintético pueden aprovecharse mediante citometría de flujo para caracterizar la abundancia y la composición de la comunidad. En la ingeniería de proteínas, la citometría de flujo se usa junto con la presentación de levaduras y la presentación de bacterias para identificar variantes de proteínas que se muestran en la superficie celular con las propiedades deseadas. Una variación común de la citometría de flujo es la clasificación física de partículas en función de sus propiedades, purificando así una población de interés.
Los citómetros de flujo se conocen en la técnica, por ejemplo, por el documento EP 0 889 319 A1; el documento BROGIOLI DORIANO Y COL.: "Heterodyne near— field scattering", APPLIED PHYSICS LETTERS, AMERICAN INSTITUTE OF PHYSICS, EE. UU., volumen 81, No. 22, 25 de noviembre de 2002 (2002-11-25), páginas 4109 a 4111; el documento WO 01/27590 A2; y el documento WO 2013/181453 A2.
RESUMEN DE LA DESCRIPCIÓN
La presente invención proporciona un sistema de detección de luz según la reivindicación 1, donde se incorporan otras realizaciones en las reivindicaciones dependientes.
La presente descripción proporciona una bomba peristáltica que es simple de fabricar y operar.
La presente descripción proporciona un dispositivo capaz de colimar un haz de luz de una fuente de luz extendida a lo largo de una distancia extendida sin expandir significativamente el diámetro del haz.
La presente descripción proporciona un sistema de multiplexación por división de longitud de onda (WDM, por su sigla en inglés) para separar un haz de luz en múltiples bandas de colores. El sistema WDM puede ser compatible con detectores semiconductores de bajo ruido. Además, debido a la diversidad de sondas fluorescentes, el sistema WDM puede reconfigurarse.
Un citómetro de flujo puede incluir:
1. un subsistema óptico basado en diodo láser (LD, por su sigla en inglés) para hacer incidir un haz de luz sobre las partículas que atraviesan una zona de visualización;
2. un objetivo de microscopio compuesto para recoger y obtener imágenes de la luz dispersada o fluorescente por partículas que atraviesan la zona de visualización;
3. un subsistema fluídico para suministrar un flujo de cubierta de líquido a la zona de visualización;
4. una bomba peristáltica para inyectar un flujo de muestra de líquido que transporta partículas que pasan junto con el flujo de vaina de líquido a través de la zona de visualización;
5. una fibra óptica multimodo que recibe luz dispersa y fluorescente de la zona de visualización en la que el objetivo del microscopio compuesto recopila imágenes; y
6. un multiplexor por división de longitud de onda para separar ópticamente la luz recibida a través de la fibra óptica en bandas de color.
El subsistema óptico basado en LD para iluminar partículas que pasan a través de la zona de visualización del citómetro de flujo generalmente puede incluir:
1. un diodo láser orientado con su eje lento paralelo a la dirección del flujo;
2. una lente colimante que convierte el haz divergente del LD en un haz colimado de forma elíptica con su eje mayor perpendicular al flujo;
3. un sistema de lentes de enfoque que reduce el haz de láser en la zona de visualización a un ancho óptimo en la dirección perpendicular al flujo; y
4. finalmente un elemento de enfoque cilíndrico de alta energía colocado en la proximidad de la zona de visualización con su eje perpendicular a la dirección del flujo.
El elemento de enfoque cilíndrico de alta energía puede transponer el perfil de campo lejano del LD a lo largo de su eje lento a su conjugado de Fourier en la zona de visualización a lo largo de la dirección del flujo, mientras mantiene el perfil del haz transversal, de modo que el perfil del haz de láser en la zona de visualización es óptimo para aplicaciones de citometría de flujo.
El objetivo del microscopio compuesto generalmente puede incluir:
1. un espejo esférico cóncavo;
2. una placa transparente de compensación de aberraciones con una zona de visualización del citómetro de flujo ubicada entre el espejo y la placa. La luz de dispersión y fluorescencia emitida por las partículas en la zona de visualización es recogida por el espejo y reflejada hacia la placa de compensación. Las aberraciones ópticas que se originan en el espejo se reducen significativamente después de que la luz pasa a través de la placa de compensación. La zona de visualización puede estar ubicada dentro de una célula de flujo provista por una cubeta de vidrio rectangular con un pequeño canal rectangular a través del cual fluye un líquido portador de partículas. El espejo cóncavo puede estar hecho de un material ópticamente transparente, como vidrio o plásticos de calidad óptica, de forma plano-convexa con un revestimiento altamente reflectante en la cara convexa para el reflejo interno. La cara plana del espejo puede estar acoplada en gel o unida a una superficie lateral de la cubeta. La placa de compensación plano-asférica puede estar hecha de un material transparente, como vidrio o plásticos de calidad óptica, con la cara plana acoplada en gel o adherida a la cara opuesta de la cubeta. El espejo de forma plano-convexa y la placa de compensación asférica también pueden formarse integralmente con la cubeta. La zona de visualización puede estar en una corriente de chorro, con tanto el espejo cóncavo como la placa de compensación siendo independientes de la zona de visualización, y el espejo puede ser un espejo cóncavo de superficie frontal.
El sistema fluídico puede incluir generalmente un depósito de líquido de vaina del que una bomba de líquido extrae el líquido de vaina. A continuación, el líquido de la vaina fluye desde la bomba de líquido hasta la entrada de un acoplamiento en T. Un brazo de salida del acoplamiento en T se conecta a una derivación que devuelve una fracción del líquido de la vaina bombeado al depósito de líquido de la vaina con el líquido de la vaina devuelto fluyendo hacia el aire dentro del depósito de líquido de la vaina. Un segundo brazo de salida del acoplamiento en T se conecta a una trayectoria de vaina que incluye una cápsula de depósito seguida de un filtro de partículas y, a continuación, la célula de flujo. El líquido de la vaina que sale de la célula de flujo va, a continuación, al tanque de desechos. La resistencia fluídica a lo largo de la derivación está diseñada para ser menor que la resistencia fluídica a lo largo de la trayectoria de la vaina. En consecuencia,
solo una pequeña fracción del líquido de la vaina pasa a través de la célula de flujo. Cabe señalar que el caudal de la vaina típico en aplicaciones de citometría de flujo es de unas pocas decenas de mililitros por minuto. Por lo tanto, la derivación permite utilizar bombas de líquido de mayor caudal que no solo son mucho menos costosas y más confiables, sino que también operan a una frecuencia de pulsación más alta que es mucho más fácil de atenuar. Dado que la salida de la trayectoria de derivación se conecta al aire, también sirve como un gran condensador fluídico para reducir significativamente la pulsación en el líquido de la vaina que fluye a lo largo de la trayectoria de la vaina. Durante el funcionamiento, la porción de entrada del cartucho de filtro se llena de aire. Por lo tanto, el cartucho de filtro también sirve como un condensador fluídico, para reducir aún más la pulsación en el líquido de la vaina en la célula de flujo a un nivel insignificante. Debido a la gran resistencia fluídica en la célula de flujo, el aire atrapado cerca de la entrada del cartucho de filtro se comprime. Si se apaga la bomba de líquido, el aire comprimido en el cartucho de filtro que se empuja hacia el depósito de líquido de la vaina se almacena en la cápsula del depósito cuyo tamaño se elige para impedir que el aire atrapado llegue al acoplamiento en T.
La bomba peristáltica generalmente puede incluir una pluralidad de rodillos ubicados en la periferia de un rotor que mueve los rodillos circularmente dentro de la pista curva arqueada de una carcasa y un tubo compresible que los rodillos comprimen contra la pista. La pista de la carcasa de la bomba peristáltica puede tener un rebaje, por lo que el tubo compresible se descomprime progresivamente hasta la expansión completa y, a continuación, se comprime hasta el cierre completo cada vez que uno de los rodillos pasa por el rebaje. La ubicación y la forma del rebaje mantienen sustancialmente sin variaciones el volumen total de líquido dentro del tubo compresible desde el rebaje hasta la salida de la bomba. El efecto de la expansión del tubo cuando un rodillo pasa por la salida de la bomba es compensado por la compresión del tubo cuando otro rodillo diferente inmediatamente aguas arriba de la salida de la bomba se mueve hacia la sección de compresión del rebaje. La pista de la carcasa de la bomba puede contener una pluralidad de rebajes, proporcionando una pluralidad de rodillos aguas arriba de la salida de la bomba para modificar progresivamente la compresión del tubo en múltiples secciones a lo largo del tubo compresible. Las ubicaciones y formas de la pluralidad de rebajes están diseñadas de manera que la modificación de la compresión del tubo en estas secciones compensa sustancialmente el efecto debido a la expansión del tubo cerca de la salida de la bomba. El tubo compresible se mantiene completamente cerrado debajo del rodillo excepto en las secciones de entrada y salida. Se puede utilizar un motor de velocidad variable para impulsar la bomba. Cuando un rodillo llega a la sección de salida, la rotación del motor puede acelerarse programáticamente para compensar la expansión del tubo.
Un multiplexor por división de longitud de onda ("WDM") puede incluir al menos dos elementos ópticos. El primer elemento óptico colima un haz de luz recibido de una fuente de luz extendida, como la luz de un orificio de alfiler o de una fibra óptica multimodo. El primer elemento óptico magnifica la fuente de luz extendida, por ejemplo, según lo definido por el orificio, o el núcleo de la fibra óptica multimodo, a una imagen que tiene un tamaño similar a la sección transversal efectiva del primer elemento óptico, creando así un haz de luz colimada entre el primer elemento óptico y su imagen. Un segundo elemento óptico se coloca cerca de la imagen y transmite el primer elemento óptico con un aumento unitario por la trayectoria óptica. De esta manera, el segundo elemento óptico duplica efectivamente la longitud del camino colimado. Los elementos ópticos adicionales en la misma configuración de retransmisión de imágenes de 1:1 también puede incluirse para ampliar aún más la trayectoria óptica colimada. La arquitectura de retransmisión de imágenes de aumento unitario en cascada de la presente descripción extiende la longitud del camino óptico colimado sin una gran expansión del haz. Como resultado, las técnicas WDM bien establecidas en la industria de las comunicaciones ópticas se pueden adaptar fácilmente para la detección de luz fluorescente. En particular, las bandas de colores múltiples presentes en el haz de luz se pueden separar usando filtros dicroicos ubicados a lo largo de la trayectoria óptica con la luz separada enfocada firmemente en pequeños puntos compatibles con fotodetectores semiconductores de bajo ruido.
En un WDM, el primer elemento óptico puede ser una lente y el segundo elemento puede ser un espejo cóncavo, aunque es evidente para los expertos en la materia que otros tipos de lentes refractivos y/o también se pueden utilizar componentes ópticos reflectantes para lograr el mismo objetivo de diseño. La trayectoria óptica en el WDM de la presente descripción se puede plegar usando filtros dicroicos. En una configuración, la trayectoria de la luz se puede plegar en zig zag. Para facilitar la reconfiguración confiable del citómetro de flujo, cada filtro dicroico puede unirse a un soporte mecánico que tiene una superficie de referencia que es ópticamente paralela a la superficie reflectante del filtro. Como resultado, todos los filtros del WDM se pueden colocar con precisión a lo largo de la trayectoria óptica haciendo referencia al soporte del filtro contra un plano óptico común. El haz colimado que pasa a través del filtro dicroico se ramifica aún más en múltiples bandas de colores utilizando filtros dicroicos secundarios. Es evidente para los expertos en la materia que los filtros dicroicos se pueden insertar en cualquier lugar a lo largo de la trayectoria del haz largo, estrecho y colimado que ofrece la imagen de retransmisión de la presente descripción para permitir así la entrega de un haz muy enfocado a los fotodetectores utilizando una variedad de configuraciones ópticas, como la configuración de estrella analizada en la Patente de los Estados Unidos No. 6.683.314, la configuración ramificada analizada en la Patente de los Estados Unidos No. 4.727.020 y otros tipos de configuración óptica WDM ampliamente practicada en la industria de las comunicaciones ópticas. En lugar de espejos cóncavos, el WDM puede reemplazarse por filtros dicroicos curvos para aumentar aún más el número de bandas de colores seleccionadas por el WDM.
Un sistema óptico para hacer incidir haces de luz en una zona de visualización en la que un flujo de muestra que transporta objetos y un flujo de vaina pasa a través incluye una primera fuente de luz para emitir un primer haz de luz a lo largo de una primera trayectoria de haz para iluminar los objetos en la zona de visualización en una primera ubicación, una segunda fuente de luz para emitir un segundo haz de luz a lo largo de una segunda trayectoria del haz para iluminar objetos en la
zona de visualización en una segunda ubicación, un elemento óptico que comprime el haz para reducir los anchos del primero y el segundo haz de luz en sus ejes principales a un ancho menor que el ancho del flujo de la vaina, y un primer elemento de compensación cromática ubicado en al menos uno de la primera trayectoria del haz y la segunda trayectoria del haz para compensar la aberración cromática en la zona de visualización de modo que la primera ubicación y las segundas ubicaciones están en un plano común paralelo a la dirección del flujo de la muestra. La longitud de onda de la segunda fuente de luz es diferente de la longitud de onda de la primera fuente de luz. La compensación cromática permite compensar las propiedades de las trayectorias, resultantes, por ejemplo, de las diferentes longitudes de onda, las diferentes longitudes de trayectoria, diferentes ubicaciones en la trayectoria de flujo, etc. Esto se aplica también para múltiples elementos de compensación en diferentes trayectorias, en particular cuando se utilizan dos, tres o más longitudes de onda para la iluminación.
Un sistema óptico incluye una primera fuente de luz para emitir un primer haz de luz para iluminar objetos en una primera ubicación en una zona de visualización, un objetivo de microscopio compuesto para obtener imágenes de la luz dispersada y fluorescente por los objetos en la primera ubicación de la zona de visualización en un plano de imagen externo al microscopio compuesto, y un divisor de haz para reflejar o transmitir luz dispersa y fluorescente, donde la fuente de luz y el plano de imagen están en dos caras del divisor de haz. El microscopio compuesto incluye un espejo cóncavo y una placa correctora de aberraciones. La placa correctora de aberraciones es una lente asférica que tiene una primera zona con energía óptica negativa y una segunda zona con energía óptica positiva radialmente dentro de la primera zona. La zona de visualización se coloca entre el espejo cóncavo y la placa correctora de aberraciones. Esto permite una acumulación compacta, ya que la iluminación y la detección de la luz dispersada y fluorescente por los objetos en la zona de visualización puede realizarse desde la misma cara del objetivo del microscopio.
Un sistema de detección de luz axial incluye un espejo cóncavo para reflejar la luz que se propaga desde una zona de visualización y un detector para medir la pérdida de luz axial producida por un objeto en la zona de visualización al detectar la luz reflejada por el espejo cóncavo. Esto permite una detección efectiva de la pérdida de luz que puede servir como base para una mejor interpretación de los valores medidos.
Un sistema de monitorización de energía para ajustar la energía de una fuente de luz incluye una primera fuente de luz para emitir un primer haz de luz, una segunda fuente de luz para emitir un segundo haz de luz, un primer filtro dicroico para reflejar el primer haz de luz y que pasa el segundo haz de luz, un segundo filtro dicroico para reflejar el segundo haz de luz, un primer detector para medir la energía residual del primero y el segundo haz de luz aguas abajo del primer filtro dicroico sobre una base de multiplexación por división de tiempo, y un conjunto de control con el primer detector y la primera y la segunda fuentes de luz solidarios, donde el conjunto de control ajusta la energía de una o más de la primera y la segunda fuente de luz basándose en la energía residual medida del primero y el segundo haz de luz por el primer detector. Esto permite una detección efectiva de la energía luminosa que puede servir como base para una mejor interpretación de los valores medidos, así como un procedimiento de control efectivo, en particular cuando se controlan o adaptan las respectivas fuentes de luz.
Un sistema óptico incluye un objetivo adaptado para obtener imágenes de luz dispersada y fluorescente por un objeto iluminado dentro de una zona de visualización, un miembro de transmisión óptica para propagar la luz recibida de la lente asférica, un multiplexor por división de longitud de onda (WDM) para recibir luz propagada por el miembro de transmisión óptica. El objetivo incluye una lente asférica con una primera zona con energía óptica negativa y una segunda zona dentro de la primera zona con energía óptica positiva, y un espejo cóncavo para reflejar la luz dispersada y fluorescente por el objeto iluminado a través de la lente asférica, donde la zona de visualización está ubicada entre dicho espejo cóncavo y la lente asférica. El WDM incluye un primer elemento óptico que produce un haz de luz con una imagen sustancialmente del mismo tamaño que el tamaño efectivo de dicho primer elemento óptico, al menos un filtro dicroico ubicado entre dicho primer elemento óptico y dicha imagen, un segundo elemento óptico situado en una de dichas ramas y un elemento óptico de retransmisión de imagen situado cerca de la imagen producida por dicho primer elemento óptico en la otra rama. El filtro dicroico separa el haz de luz en dos ramas de colores distintivos. El haz de luz en dicha rama es enfocado a un punto por dicho segundo elemento óptico. El elemento óptico de retransmisión de imágenes produce una imagen de dicho primer elemento óptico con un aumento sustancialmente unitario. Esto permite un funcionamiento combinado adaptado del objetivo del microscopio y el WDM, así como el acoplamiento óptico entre ellos. En particular, el objetivo del microscopio y el WDM, así como el acoplamiento óptico, pueden adaptarse para coincidir entre sí con respecto a la longitud de onda y otros parámetros.
Un sistema óptico incluye una fuente de luz para emitir un haz de luz para iluminar un objeto en una zona de visualización, un espejo cóncavo para recibir y reflejar la luz dispersada y fluorescente por el objeto iluminado, una lente asférica con una primera zona con energía óptica negativa y una segunda zona dentro de la primera zona con energía óptica positiva, donde la luz reflejada por el espejo cóncavo pasa a través de la lente asférica, y donde la zona de visualización está ubicada entre dicho espejo cóncavo y la lente asférica, un miembro de transmisión óptica para recibir y propagar luz desde la lente asférica y un multiplexor para recibir luz del miembro de transmisión óptica y separar la luz en al menos dos colores. Esto permite un funcionamiento combinado adaptado del sistema de iluminación, el objetivo del microscopio y el WDM, así como el acoplamiento óptico entre ellos. En particular, el sistema de iluminación, el objetivo del microscopio y el WDM, así como el acoplamiento óptico, pueden adaptarse para coincidir entre sí con respecto a la longitud de onda y otros parámetros.
Un aparato para obtener imágenes de luz dispersada y fluorescente por un objeto iluminado dentro de una zona de visualización incluye un sistema de suministro de fluido para llevar un objeto a una zona de visualización, una fuente de luz para iluminar el objeto en la zona de visualización, un espejo cóncavo ubicado en una cara de la zona de visualización para reflejar la luz dispersada y fluorescente por el objeto iluminado, y una lente asférica ubicada en la otra cara de la zona de visualización para recibir la luz reflejada por el espejo cóncavo y formar una imagen en un plano de imagen, la lente asférica que tiene una primera zona con energía óptica negativa y una segunda zona radialmente dentro de la primera zona con energía óptica positiva. Esto permite una operación combinada adaptada del sistema de suministro de fluido, el sistema de iluminación y el objetivo del microscopio. En particular, el sistema de suministro de fluido, el sistema de iluminación y el objetivo del microscopio pueden adaptarse para coincidir entre sí con respecto a la longitud de onda y otros parámetros.
Un procedimiento óptico para hacer incidir haces de luz en una zona de visualización incluye dirigir un primer haz de luz para iluminar objetos en una zona de visualización para producir luz dispersa y fluorescente, reflejar la luz dispersada y fluorescente utilizando un espejo cóncavo hacia una placa correctora de aberraciones, corregir aberraciones en la luz reflejada con la placa correctora de aberraciones, donde la placa correctora de aberraciones tiene una primera zona con energía óptica negativa una segunda zona radialmente dentro de la primera zona con energía óptica positiva, y reflejar o transmitir la luz corregida utilizando un divisor de haz.
Un procedimiento óptico para detectar luz incluye reflejar la luz que se propaga desde una zona de visualización usando un espejo cóncavo y medir la pérdida de luz axial producida por un objeto en la zona de visualización mediante la detección de la luz reflejada por el espejo cóncavo.
Un procedimiento de recopilación e imagen de luz dispersada o fluorescente por objetos en una visualización incluye entregar un objeto a una zona de visualización, iluminar el objeto en la zona de visualización para producir luz dispersa y fluorescente, reflejar la luz dispersada y fluorescente utilizando un espejo cóncavo hacia una placa correctora de aberraciones transparente, y corregir las aberraciones esféricas en la luz reflejada con la placa correctora de aberraciones transparente, donde la placa correctora de aberraciones transparente tiene una primera zona con energía óptica negativa y una segunda zona radialmente dentro de la primera zona con energía óptica positiva.
Un objetivo de microscopio compuesto adaptado para obtener imágenes de luz dispersada y fluorescente por un objeto presente dentro de una zona de visualización comprende una zona de visualización, una disposición de espejo cóncavo, un área de salida y una disposición de formación de haz de iluminación, donde la zona de visualización está dispuesta entre la disposición de espejo cóncavo y el área de salida, y donde el espejo cóncavo está dispuesto para reflejar la luz dispersa y fluorescente que incide desde un objeto presente en la zona de visualización al área de salida, y donde la disposición de formación del haz de iluminación está dispuesta de manera que un haz de iluminación que entra en la disposición de formación del haz de iluminación se forma previa y definitivamente en la zona de visualización. Según otros ejemplos de realización, puede proporcionarse una placa correctora de aberraciones, en particular, una lente asférica, en el área de salida. Esto permite una construcción efectiva del objetivo del microscopio. Cabe señalar que la placa correctora de aberraciones no es necesaria cuando se proporciona una forma de espejo cóncava que permite una formación de imágenes suficiente de la luz dispersada y fluorescente de un objeto en la zona de visualización. Si es necesario, puede disponerse una placa correctora de aberraciones, en particular una lente asférica, en el área de salida.
Un multiplexor por división de longitud de onda (WDM) para separar la luz emitida desde una fuente de luz en múltiples bandas de colores comprende una disposición óptica de formación de imágenes, una disposición de filtro dicroico, un fotodetector semiconductor y una disposición óptica de enfoque, donde la disposición óptica de formación de imágenes forma una haz de luz de la luz emitida desde una fuente de luz y produce una imagen de sustancialmente el mismo tamaño que el tamaño efectivo de dicha disposición óptica de formación de imágenes, y donde la disposición de filtro dicroico está ubicada entre dicha disposición óptica de formación de imágenes y dicha imagen, y separa la haz de luz en una primera rama y una segunda rama de colores distintivos, donde el fotodetector semiconductor está ubicado en la primera rama y donde la disposición óptica de enfoque está ubicada entre la disposición del filtro dicroico y el fotodetector semiconductor para enfocar el haz de luz sobre el fotodetector semiconductor. Por consiguiente, puede proporcionarse una disposición de detección efectiva, que puede funcionar con un detector de semiconductores. El detector de semiconductores puede ser un fotodetector de semiconductores. El detector de semiconductores puede ser un fotodiodo de avalancha o un detector de nanotubos de carbono. Por consiguiente, se puede lograr una relación señal/ruido reducida.
En lo que antecede, se han esbozado, más bien, a grandes rasgos, las características y ventajas técnicas de la presente solicitud a fin de que se comprenda mejor la descripción a continuación. En lo sucesivo, se describirán características y ventajas adicionales que constituyen el objeto de las reivindicaciones. Los expertos en la materia deben apreciar que la concepción y el aspecto específico descrito, pueden ser fácilmente utilizados como base para modificar o diseñar otras estructuras para llevar a cabo los mismos propósitos de la presente solicitud. Las nuevas características, que se cree que son características de los aspectos, tanto en lo que respecta a su organización como a su procedimiento de funcionamiento, junto con otros objetos y ventajas, se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción cuando se considere en relación con las figuras que la acompañan. Sin embargo, debe entenderse expresamente que cada una de las figuras se proporciona únicamente con fines de ilustración y descripción y no pretende ser una definición de los límites de las presentes reivindicaciones. Las realizaciones y aspectos de las figuras 1 a 36 no son realizaciones y aspectos de
la invención reivindicada. Las realizaciones y aspectos de las figuras 37 y 38 no son realizaciones y aspectos de la invención reivindicada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una realización de un citómetro de flujo según la presente descripción que incluye:
a) un subsistema de iluminación óptica basado en LD;
b) un objetivo de microscopio compuesto sobre el que incide la luz emitida desde el subsistema de iluminación óptica basado en LD, el objetivo de microscopio compuesto teniendo un canal de paso de fluido formado a través del mismo con una zona de visualización de iluminación de partículas ubicada dentro de una cubeta del mismo; c) un sistema fluídico para suministrar un flujo libre de pulsaciones de líquido de vaina al canal de paso de fluido formado a través del objetivo de microscopio compuesto;
d) una bomba peristáltica para introducir un flujo libre de pulsaciones de líquido de muestra que transporta células o partículas a analizar en el flujo de líquido suministrado por el sistema fluídico; y
e) un multiplexor por división de longitud de onda ("WDM") que tiene una configuración en zig-zag para separar un haz de luz en varias bandas de colores diferentes, el WDM recibe luz a través de una fibra óptica que se dispersa desde las células o partículas a medida que pasan a través del canal de paso de fluido del objetivo del microscopio compuesto y se iluminan en el mismo mediante la luz emitida por el subsistema de iluminación óptica basado en LD.
La FIG. 2 es una vista esquemática que representa un LD emisor de flanco de alta energía típico que ilustra los ejes rápido y lento de la luz emitida desde el mismo.
La FIG. 2A muestra un perfil de campo lejano típico para un haz de láser emitido desde el chip LD representado en la FIG.
2.
La FIG. 3A representa una vista tridimensional de un subsistema de iluminación óptica convencional basado en LD para instrumentos de citometría de flujo junto con la célula de flujo del sistema.
La FIG. 3B representa un perfil típico dependiente del tiempo de dispersión de luz desde una célula o partícula que pasa a través del haz de láser representado en la FIG. 3A en su foco dentro de la célula de flujo del sistema.
La FIG. 4A es una vista en alzado de una configuración alternativa del subsistema de iluminación óptica basada en LD de la técnica anterior a través del líquido que fluye a través del canal de paso de fluido con el perfil del haz en el foco del mismo en la zona de visualización del sistema de citómetro de flujo.
La FIG. 4B es una vista en planta a lo largo del líquido que fluye a través del canal de paso de fluido del subsistema alternativo de iluminación óptica basado en LD de la técnica anterior representado en la FIG. 4A.
FIG. 5A es una vista en alzado a través del líquido que fluye a través del canal de paso de fluido del objetivo de microscopio compuesto representado en la FIG. 1, donde el eje lento del LD se orienta transversalmente al flujo de líquido según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 5B es una vista en planta a lo largo del líquido que fluye a través del canal de paso de fluido del objetivo del microscopio compuesto representado en la FIG. 1, donde el eje lento del LD está orientado transversalmente al flujo de líquido, según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 5C representa un perfil típico dependiente del tiempo de dispersión de luz desde una célula o partícula que pasa a través del canal de paso de fluido del objetivo de microscopio compuesto representado en la FIG. 1.
La FIG. 5D representa una vista en perspectiva de la lente cilíndrica del subsistema óptico basado en LD, con el objetivo de microscopio compuesto solidario, según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 5E representa una vista ampliada del perfil del haz mostrado en la FIG. 5D.
La FIG. 6 es una vista en perspectiva de una realización alternativa de un subsistema de iluminación óptica basado en LD según un aspecto de la presente descripción adaptado para su uso en un sistema de citómetro de flujo donde una corriente de chorro de líquido pasa a través de la zona de visualización.
La FIG. 6A es una vista en perspectiva ampliada de la realización alternativa de un subsistema de iluminación óptica basado en LD de la FIG. 6 que representa con mayor detalle la corriente de chorro de líquido que pasa a través de la zona de visualización.
La FIG. 7 es una vista en perspectiva de una realización alternativa de un subsistema de iluminación óptica basado en LD según un aspecto de la presente descripción adaptado para su uso en un sistema de citómetro de flujo que orienta el eje lento del LD paralelo a la dirección del líquido que fluye a través del canal de paso de fluido del objetivo de microscopio compuesto representado en la FIG. 1.
La FIG. 8 es una vista en perspectiva de un objetivo de microscopio compuesto según un aspecto de la presente descripción adaptado para su uso en el sistema de citómetro de flujo representado en la FIG. 1, el objetivo de microscopio compuesto tiene un canal de paso de fluido formado a través del mismo con la zona de visualización de iluminación de partículas ubicada dentro de una cubeta en el mismo.
La FIG. 8A es una vista en perspectiva de un objetivo de microscopio combinado según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 8B ilustra el objetivo de microscopio combinado representado en la FIG. 8A con una célula de flujo solidaria según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 9A es una vista en alzado en sección transversal del objetivo de microscopio compuesto tomada a lo largo de la línea 9A-9A en la FIG. 8 que incluye trazados de rayos desde tres (3) ubicaciones separadas espacialmente en la zona de visualización hasta un plano de imagen para el objetivo que ilustra la dispersión y la propagación de la emisión de fluorescencia.
Las FIG. 9B1-9B3 son diagramas de puntos cerca del plano de imagen representado en la FIG. 9A para las tres (3) ubicaciones de emisión de luz separadas espacialmente representadas en la FIG. 9A.
La FIG. 10 es una vista en alzado en sección transversal similar a la de la FIG. 9A para un objetivo de microscopio compuesto de realización alternativa según un aspecto de la presente descripción que incluye trazados de rayos desde tres (3) ubicaciones separadas espacialmente en una zona de visualización en el mismo hasta un plano de imagen para el objetivo que ilustra la dispersión y la propagación de la emisión de fluorescencia.
La FIG. 11 es una vista en perspectiva de incluso otra realización alternativa de un objetivo de microscopio compuesto según un aspecto de la presente descripción, adaptado para su uso en el sistema de citómetro de flujo representado en la FIG. 1, un objetivo de microscopio compuesto de una realización alternativa que tiene un canal de paso de fluido formado a través del mismo con la zona de visualización de iluminación de partículas ubicada dentro de una cubeta del mismo.
La FIG. 12 es una vista en perspectiva de una realización de un objetivo de microscopio compuesto según un aspecto de la presente descripción adaptada para su uso en el sistema de citómetro de flujo representado en la FIG. 1, adaptado para su uso donde una zona de visualización está situada dentro de la corriente de chorro representada en las FIG. 6 y 6A.
La FIG. 13 es una vista en perspectiva de una realización de un objetivo de microscopio compuesto según un aspecto de la presente descripción adaptado para su uso donde una zona de visualización está ubicada en la superficie de un portaobjetos de microscopio.
La FIG. 14 es un diagrama esquemático que representa un sistema fluídico según un aspecto de la presente descripción para suministrar un flujo de vaina de líquido estable a una célula de flujo de citómetro de flujo que incluye:
1. una pequeña cápsula ubicada entre una bomba de líquido de vaina y la célula de flujo; y
2. un filtro de partículas ubicado entre la cápsula pequeña y la célula de flujo, tanto el filtro de partículas como la cápsula pequeña proporcionan depósitos de aire para amortiguar las pulsaciones de la bomba.
La FIG. 15 es un diagrama esquemático que representa una realización de un subsistema fluídico similar al ilustrado en la FIG. 14 que reemplaza la cápsula pequeña con un tramo de tubo para proporcionar un depósito de aire.
Las FIG. 16A y 16B son histogramas que comparan los tiempos de vuelo de partículas medidos en la célula de flujo cuando la porción de entrada del filtro de partículas tiene aire atrapado en la misma (FIG. 16A) y cuando no hay aire dentro del sistema fluídico entre la bomba de líquido de vaina y la célula de flujo (FIG. 16B).
La FIG. 17 es una vista en perspectiva de una bomba peristáltica de 3 rodillos según un aspecto de la presente descripción que representa los rodillos de la bomba, el tubo y la carcasa de la bomba circundante.
Las FIG. 18A a 18D representan vistas simplificadas para varios estados de la bomba peristáltica de 3 rodillos representada en la FIG. 17 con los rodillos en diferentes ubicaciones.
La FIG. 19 es una vista en sección transversal longitudinal detallada del tubo de la bomba peristáltica siendo parcialmente comprimido por el rodillo de la bomba.
Las FIG. 19A y 19B son vistas en sección transversal detalladas ortogonales a la longitud del tubo de la bomba peristáltica tomadas a lo largo de las líneas 19A y 19B de la FIG. 19 que ilustra la compresión parcial del tubo por el rodillo.
Las FIG. 20A y 20B son diagramas esquemáticos que ilustran los rodillos y el tubo de la bomba vistos a lo largo de las coordenadas circulares de la bomba para representar el flujo sin pulso proporcionado por la bomba peristáltica.
La FIG. 21 es un gráfico que muestra la relación funcional con respecto a la posición del rodillo cuando sale de la sección de salida del tubo compresible de:
1. el volumen total de líquido en la mitad de salida de la bomba; así como también
2. los volúmenes de líquido en la bomba:
a. sección de rebaje; y
b. sección de salida.
La FIG. 22 es una vista en planta simplificada de una bomba peristáltica de 4 rodillos según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 23 es una vista en planta simplificada de una bomba peristáltica de 6 rodillos según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 24A es una ilustración en sección transversal longitudinal de rodillos y un tubo compresible para una bomba peristáltica de 3 rodillos que minimiza las pulsaciones según un aspecto de la presente descripción que tiene un rotor con velocidad programable.
La FIG. 24B es una vista en planta simplificada que ilustra la bomba peristáltica de 3 rodillos que minimiza las pulsaciones según un aspecto de la presente descripción que tiene un rotor con velocidad programable.
La FIG. 24C es un gráfico que representa la bomba peristáltica que minimiza las pulsaciones, representada en la FIG.
24B que tiene un rotor de velocidad programable:
1. tasa de cambio de volumen negativa con respecto a la posición del rodillo;
2. velocidad del rotor; y
3. caudal de la bomba.
La FIG. 25 es un diagrama que ilustra el trazado de rayos ópticos para un multiplexor de división de longitud de onda de 6 puertos ("WDM") ejemplar que usa una configuración en zig-zag según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 25A ilustra una vista superior de un conjunto de detección de luz del WDM ilustrado en la FIG. 25 según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 25B ilustra una vista en perspectiva frontal del conjunto de detección de luz del WDM ilustrado en las FIG. 25 y 25A.
La FIG. 26 es un diagrama que ilustra el trazado de rayos de dispositivos de colimación de la técnica anterior que muestra la limitación del dispositivo para colimar una fuente de luz extendida.
La FIG. 27 es una ilustración en perspectiva de una realización de un WDM de 6 puertos que usa una combinación de configuraciones en zig-zag y ramificadas según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 28 es una ilustración en perspectiva de otra realización de un WDM que tiene filtros dicroicos cóncavos según un aspecto de la presente descripción.
Las FIG. 29A y 29B son ilustraciones en perspectiva que representan un procedimiento de ensamblaje para construir un ensamblaje de filtro dicroico reemplazable para un w Dm reconfigurable según la presente descripción.
La FIG. 29C es una ilustración en perspectiva de un conjunto de filtro dicroico reemplazable construido según las ilustraciones de las FIG. 29A y 29B.
Las FIG. 30A y 30B son ilustraciones en perspectiva de un WDM según un aspecto de la presente descripción que muestra la instalación en el WDM del conjunto de filtro dicroico reemplazable representado en la FIG. 29C y su eliminación del mismo.
La FIG. 31 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema óptico con una única fuente de luz según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 32 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema óptico con múltiples fuentes de luz según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 33 ilustra una vista ampliada de haces de luz mostrados en la FIG. 32.
La FIG. 34 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema óptico con elementos de compensación cromática según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 35 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema de monitorización de energía según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 36 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema óptico según un aspecto de la presente descripción. La FIG. 37 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema de detección de pérdida de luz axial según un aspecto de la presente descripción.
La FIG. 38 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema de detección de pérdida de luz axial con un segundo sistema de detección de luz solidario según un aspecto de la presente descripción.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Citómetro de flu jo
Un sistema de citómetro de flujo puede incluir uno o más de los siguientes componentes.
1. Una célula de flujo a través de la cual una corriente líquida, generalmente llamada flujo de vaina, transporta y alinea hidrodinámicamente las células o partículas para que pasen en una sola fila a través de la célula de flujo.
2. Un sistema de subsistema de medición acoplado a la célula de flujo que detecta las células o partículas que pasan a través de la célula de flujo y suele ser:
a. un subsistema de medición de impedancia o conductividad; o
b. un subsistema de iluminación óptica junto con un subsistema de detección óptica.
3. Un subsistema de conversión para convertir la señal de salida del subsistema de medición en datos procesables por ordenador.
4. Un ordenador para analizar los datos producidos por el subsistema de conversión.
El subsistema de iluminación óptica proporciona un haz de luz colimado y a continuación enfocado, generalmente luz láser de una sola longitud de onda, que incide sobre la corriente de líquido enfocada hidrodinámicamente que pasa a través de la célula de flujo. En consecuencia, el sistema de citómetro de flujo puede tener una o más fuentes de luz que pueden incluir:
1. una o más lámparas, por ejemplo, mercurio o xenón;
2. uno o más láseres de alta energía refrigerados por agua, por ejemplo, láser de argón, criptón o colorante; 3. uno o más láseres refrigerados por aire de baja energía, por ejemplo, argón (488 nm), HeNe (rojo-633 nm), HeNe (verde) y HeCd (UV); y/o
4. uno o más láseres de diodo (azul, verde, rojo y violeta).
El subsistema de detección óptica incluye uno o más detectores dirigidos donde la corriente de líquido enfocada pasa a través del haz de luz. Dichos detectores pueden incluir:
1. detectores en línea con el haz de luz (Forward Scatter o FSC, por su sigla en inglés);
2. detectores perpendiculares al mismo (Side Scatter o SSC, por su sigla en inglés); y
3. detectores de fluorescencia.
Cada partícula suspendida que pasa a través del haz dispersa la luz, y el material fluorescente presente en la partícula o adherido a la partícula excitada por la luz incidente emite luz en una longitud de onda más larga que la de la luz incidente.
Detectar y analizar cambios de brillo en una combinación de luz dispersa y fluorescente en cada detector (uno para cada pico de emisión fluorescente) permite derivar varios tipos de información sobre la estructura física y química de cada partícula individual. El FSC se correlaciona con el volumen celular. Debido a que la luz se dispersa desde los componentes internos dentro de una célula, el SSC depende de la complejidad interna de la partícula (es decir, la forma del núcleo, la cantidad y tipo de gránulos citoplasmáticos o la rugosidad de la membrana). Algunos citómetros de flujo omiten un detector de fluorescencia y solo detectan luz dispersa. Otros citómetros de flujo forman imágenes de la fluorescencia, la luz dispersa y la luz transmitida de cada célula. El subsistema de conversión del sistema de citómetro de flujo, que puede incluir uno o más amplificadores que pueden ser lineales o logarítmicos, generalmente incluye uno o más convertidores analógicos a digitales ("ADC", por su sigla en inglés) para convertir la señal de salida del subsistema de medición en datos que a continuación son procesados por el ordenador.
Los citómetros de flujo modernos suelen incluir hasta cuatro (4) láseres y numerosos detectores de fluorescencia. Aumentar el número de láseres y detectores permite marcar las células con varios anticuerpos diferentes y puede identificar con mayor precisión una población diana por sus marcadores fenotípicos. Algunos instrumentos pueden incluso capturar imágenes digitales de células individuales, lo que permite el análisis de la ubicación de una señal fluorescente dentro o sobre la superficie de las células.
La FIG. 1 representa un citómetro de flujo según un aspecto de la presente descripción identificado por el número de referencia general 40. El citómetro de flujo 40 puede incluir:
1. un subsistema óptico 50 basado en LD;
2. un objetivo de microscopio compuesto 60;
3. un subsistema fluídico 70 para suministrar un flujo de vaina de líquido;
4. una bomba peristáltica 80 para inyectar un flujo de muestra líquida que contiene partículas a analizar en el flujo de la vaina de líquido suministrado por el subsistema fluídico 70, el flujo de la muestra líquida que se enfoca hidrodinámicamente por el flujo de la vaina de líquido pasa a través de una zona de visualización con el objetivo de microscopio compuesto 60 que reúne y capta la luz dispersa y/o fluorescente por partículas en la zona de visualización;
5. una fibra óptica 852 que recibe luz dispersa y/o fluorescente por partículas en la zona de visualización que el objetivo del microscopio compuesto 60 recoge y convierte en imágenes;
6. un multiplexor de división de longitud de onda 90 ("WDM 90") para procesar ópticamente la dispersión y/o luz fluorescente recibida de la fibra óptica 852; y
7. un sistema fotodetector 938 para detectar la luz procesada por el WDM 90.
Subsistema óptico 50
En la mayoría de los instrumentos, las partículas de interés, como las células sanguíneas o las microesferas, son transportadas por el flujo de la vaina utilizando un enfoque hidrodinámico hacia una zona de visualización dentro de una cubeta o chorro de agua y allí se iluminan mediante un haz de láser enfocado. La técnica proporciona los medios para identificar y contar con precisión las partículas de interés sin verse abrumado por el ruido de fondo que se produce fuera de una ventana de tiempo de registro (Practical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley (2003) ISBN 0471411256). Para aumentar la sensibilidad de detección, la sección transversal del haz de láser enfocado suele ser elíptica, con el eje menor a lo largo de la dirección del flujo. Para mantener la integridad del umbral, el perfil del láser debe tener un perfil liso o en forma de campana a lo largo de la dirección del flujo. Un procedimiento común para producir tal haz es alargar un haz gaussiano circular casi colimado 5 a lo largo de la dirección del flujo con un expansor de haz hecho de prisma o par de lentes cilíndricas, y, a continuación, enfocar el haz hacia abajo con una lente esférica. Dado que la forma del haz en el foco es la transformada espacial de Fourier del haz en el campo lejano, esto produce un punto elíptico de forma gaussiana con un eje menor a lo largo del flujo.
Los láseres convencionales son caros, voluminosos y consumen mucha energía. Más recientemente, se han puesto a disposición diodos láser ("LD"). A diferencia de los láseres convencionales, la nueva generación de LD es rentable, compacta y energéticamente eficiente, y muestra una gran promesa para la nueva generación de instrumentos biomédicos compactos. Un LD emite luz que tiene una sección transversal elíptica con el eje mayor de la elipse, frecuentemente llamado eje rápido, perpendicular a la unión de LD, y el eje menor de la elipse, frecuentemente llamado eje lento, paralelo a la unión de LD. Desafortunadamente, la calidad del haz de un LD típico, particularmente a lo largo de su eje rápido, deja mucho que desear, impidiendo su amplia aceptación en aplicaciones de citometría de flujo.
En principio, la calidad del haz de LD se puede mejorar significativamente mediante el filtrado espacial. Si se coloca un pequeño orificio o una fibra óptica monomodo en el punto focal de una lente, de modo que solo acepte el modo espacial de orden más bajo, el haz que pasa a través del orificio o la fibra óptica monomodo tendrá una forma gaussiana casi perfecta. La Patente de los Estados Unidos No. 5.788.927 describe el hecho de que dicho haz puede colimarse y expandirse en la dirección del flujo a través del citómetro, y finalmente enfocarse hacia un haz gaussiano de forma elíptica con un eje menor a lo largo de la dirección del flujo. Desafortunadamente, el tamaño de la instrumentación de escritorio limita el diámetro de un orificio a menos de 5 micrones. El tamaño del núcleo de una fibra óptica monomodo de longitud de onda visible también tiene una dimensión similar. El desafío de fabricar un filtro espacial de tal precisión y mantener su estabilidad a largo plazo no solo aumenta el costo del sistema láser basado en LD, sino que también reduce su confiabilidad.
Más recientemente, en un esfuerzo por reducir los lóbulos laterales posibles debido al efecto de borde de la apertura numérica limitada de la lente colimante, la Patente de los Estados Unidos No. 6.713.019 ("la patente '019") describe la rotación del LD en noventa grados (90°) de modo tal que su eje lento quede paralelo a la dirección del flujo. A continuación, se introduce una sección de difusión de haz, como una lente cilíndrica cóncava, para difundir el haz colimado en la dirección perpendicular al flujo, seguido de una sección de formación de punto de haz, como una lente de enfoque esférica, para formar un punto elíptico dentro de la zona de visualización de partículas del citómetro. Como se describe en detalle en la patente '019, el haz de láser después de la sección de formación de puntos es extremadamente astigmático. En particular, el ancho del haz en la zona de visualización en la dirección perpendicular al flujo es comparable o incluso más amplio que el ancho del canal de flujo. Esto no solo reduce la cantidad de energía láser que incide sobre la partícula y, en consecuencia, la intensidad de la señal, sino que también aumenta la dispersión de fondo no deseada desde la interfaz de la célula de flujo de líquido. En lugar de rotar el LD, las Patentes de los Estados Unidos No. 7.385.682 y No. 7.561.267 describen el uso de una lente asférica de gran apertura numérica para la colimación LD. Sin embargo, tal diseño no puede corregir el efecto de franja inherente al perfil del haz del LD. En consecuencia, existe actualmente la necesidad de un sistema óptico simple basado en LD para uso en citómetros de flujo que pueda producir de manera confiable un haz elíptico enfocado con forma casi gaussiana a lo largo de su eje menor y un ancho a lo largo del eje mayor.
Según un aspecto de la presente descripción, el subsistema óptico 50 puede incluir un LD 501 que, como se muestra con mayor detalle en la FIG. 2, emite un haz de luz divergente desde un borde del mismo. Como se representa más gráficamente en las FIG. 2 y 2A, el haz de luz divergente tiene un perfil en sección transversal de forma elíptica con un eje mayor, también conocido como eje rápido, y un eje menor, también conocido como eje lento. El haz de luz divergente emitido por el LD 501 puede incidir sobre una lente de colimación 502 que convierte el haz de luz divergente emitido por el LD 501 en un haz de luz colimado que tiene una sección transversal elíptica. Aunque no es esencial, el subsistema óptico 50 también puede incluir un espejo opcional 503 colocado para dirigir el haz de luz elíptico colimado hacia el objetivo del microscopio compuesto 60. Una lente plano-convexa 504, colocada cerca del objetivo del microscopio compuesto 60, puede reducir el eje mayor del haz de luz de forma elíptica que está orientado perpendicular a la dirección en la que la muestra de líquido y la vaina de líquido circundante fluyen a través de la zona de visualización dentro del objetivo del microscopio compuesto 60. En la zona de visualización, el ancho del haz de luz de forma elíptica:
1. perpendicular a la dirección en la que el flujo de la muestra de líquido pasa a través de la zona de visualización puede ser ligeramente menor que el ancho del flujo de la vaina de líquido; mientras que
2. Todavía es lo suficientemente ancho para que las partículas en el flujo de la muestra pasen a través de una porción casi plana del haz de luz de forma elíptica a la intensidad máxima del haz.
Según un aspecto de la presente descripción, es evidente para los expertos en la materia que la lente plano-convexa 504 puede ser reemplazada por otros tipos de elementos ópticos tales como una lente doble acromática o una combinación de lentes esféricas, cilíndricas. Lentes y/o pares de prismas. Alternativamente, el espejo 503 y la lente 504 también pueden reemplazarse con un espejo cóncavo. Para aplicaciones sensibles a la polarización del citómetro de flujo 40, también se puede colocar un elemento acondicionador de polarización opcional, tal como una placa de media onda, en la sección colimada del haz de luz que se extiende desde la lente de colimación 502 a la lente 504. Finalmente, antes de pasar a través de la zona de visualización, el haz de luz puede atravesar una lente cilíndrica 505 de alta energía, colocada junto a la zona de visualización. Como se muestra en la FIG. 1, el eje de la lente cilíndrica 505 está orientado perpendicular a la dirección en la que el flujo de la muestra de líquido pasa a través de la zona de visualización, y la distancia focal de la lente cilíndrica 505 produce un enfoque ajustado del eje menor del haz de luz en la zona de visualización.
Una ventaja del subsistema óptico 50 en comparación con el subsistema óptico convencional basado en LD se puede discernir más claramente en las FIG. 2 y 2A. La mayoría de los diodos láser disponibles comercialmente adecuados para
su uso en un citómetro de flujo emiten un haz de luz desde un borde del mismo. Como se muestra en la FIG. 2, una sección de ganancia 509 de tal chip LD 510 está altamente confinada en la dirección transversal indicada por una flecha 511. En consecuencia, para lograr una alta energía de salida, los fabricantes de LD a menudo sacrifican la calidad del haz, particularmente a lo largo de la dirección del eje transversal o rápido que está orientado paralelo a la flecha 511. La FIG. 2A muestra esta característica de la luz emitida desde un LD donde múltiples franjas 512 debidas al confinamiento de la ganancia son claramente visibles en el campo lejano en la dirección del eje menor del haz de luz emitido. Cabe señalar que las franjas 512 que aparecen en la ilustración de la FIG. 2A contienen solo una pequeña cantidad de energía total en el haz de luz y, por lo tanto, tienen poco impacto en la caracterización convencional M-cuadrada del perfil del haz correspondiente. Sin embargo, como se analiza con mayor detalle a continuación, las franjas 512 tienen un efecto perjudicial sobre el rendimiento de los citómetros de flujo convencionales. Alternativamente, el confinamiento de ganancia a lo largo de la dirección del eje lento de un borde que emite LD que está orientado perpendicular a la flecha 511 es mucho más relajado. En consecuencia, como se muestra en la FIG. 2A, el perfil del haz de campo lejano es mucho más suave a lo largo del eje lento del haz de luz del LD.
La FIG. 3A representa un subsistema óptico convencional basado en LD para un citómetro de flujo. Los elementos representados en la FIG. 3A, que son comunes al subsistema óptico 50 ilustrado en la FIG. 1, llevan el mismo número de referencia que se distingue por la designación con una comilla simple ('). Como se muestra en la FIG. 3A, el subsistema óptico convencional orienta el eje rápido del LD 501 paralelo a la dirección en la que el flujo de la muestra líquida pasa a través de la zona de visualización. En su configuración más simplificada, el perfil de haz elíptico del LD 501' es transpuesto directamente por la lente de enfoque esférico 504' a la zona de visualización. En un intento por lograr una relación de aspecto óptima para el haz de luz enfocado, varios subsistemas ópticos convencionales basados en LD también han incluido elementos ópticos de conformación del haz además de los representados en la FIG. 3A.
El efecto perjudicial de las franjas 512 a lo largo del eje rápido del LD 501' para configuraciones de subsistemas ópticos convencionales aparece claramente en el perfil de tiempo de dispersión de luz representado en la FIG. 3B. Dado que la intensidad de la dispersión o de la fluorescencia es directamente proporcional a la energía del láser local que incide sobre una partícula, cualquier estructura fina en el perfil del haz de luz a lo largo de la dirección en la que el flujo de la muestra líquida pasa a través de la zona de visualización aparecerá en el perfil de tiempo de la señal producido por el citómetro de flujo. Tales estructuras en el perfil de tiempo son indistinguibles de las señales generadas por partículas pequeñas y, por lo tanto, harán que el citómetro de flujo se dispare falsamente e identifique erróneamente las partículas. Además, las franjas 512 también darán lugar a incertidumbre en la medición de otros parámetros citométricos, como en el área y el ancho del pulso representado en la FIG. 3B.
Las FIG. 4A y 4B representan otro subsistema óptico de la técnica anterior para aplicaciones de citometría de flujo basadas en l D descritas en la patente '019 identificada anteriormente. Aquellos elementos representados en las FIG. 4A y 4B que son comunes al subsistema óptico 50 ilustrado ya sea en la FIG. 1 o 3A tienen el mismo número de referencia distinguido con una designación de doble comilla ("). Como se muestra en las FIG. 4A y 4B, mediante la orientación del eje lento del LD 501 "paralelo a la dirección en la que el flujo de la muestra líquida pasa a través de la zona de visualización del subsistema óptico representado en las FIG. 4A y 4B supera efectivamente el problema producido por las franjas 512 como se describió anteriormente. Desafortunadamente, el elemento difusor de haz 513" colocado antes de la lente de enfoque esférica 504" en las FIG. 4A y 4B para difundir el haz de luz perpendicular a la dirección en la que el flujo de la muestra de líquido pasa a través de la zona de visualización produce un haz de luz muy astigmático cerca de la zona de visualización. Específicamente, enfocar este haz de luz astigmático en la zona de visualización en la dirección en la que el flujo de la muestra de líquido pasa a través de la zona de visualización aumenta el ancho del haz de luz perpendicular a la dirección en la que el flujo de la muestra de líquido pasa a través de la zona de visualización, de modo que el ancho del haz se vuelve similar o incluso más ancho que el flujo de la vaina. En consecuencia, el subsistema óptico representado en las FIG. 4A y 4B no solo disminuye la cantidad de energía luminosa que incide sobre las partículas que fluyen a través de la zona de visualización, el subsistema óptico también aumenta la dispersión indeseable de luz desde la interfaz entre el flujo de la vaina de líquido y las partes adyacentes del objetivo del microscopio compuesto 60.
La FIG. 5 destaca las principales diferencias entre el subsistema óptico descrito en la patente '019 y el subsistema óptico 50 representado en la FIG. 1. En lugar de colocar un elemento difusor de haz fuera del plano 513 "antes de la lente de enfoque de haz esférico 504 como se muestra en la FIG. 4, la lente cilíndrica de alta energía 505, representada en las FIG. 5A y 5B como un plano cilíndrico lente convexa, puede colocarse a lo largo del haz de luz después de la lente 504 de enfoque de haz esférico y puede yuxtaponerse con el objetivo del microscopio compuesto 60. Como se muestra en las FIG. 5A y 5B, la lente cilíndrica 505 puede enfocar el eje menor del haz de luz en la zona de visualización mientras deja el eje mayor del haz de luz esencialmente sin cambios. En consecuencia, el subsistema óptico 50 representado en las FIG. 1, 5A y 5B pueden establecer un perfil de haz de luz en la zona de visualización que es elíptica con:
1. un eje menor estrechamente enfocado que se extiende a través de los flujos combinados de muestra de líquido y vaina; y
2. un perfil de eje menor suave en la dirección de la muestra de líquido combinada y los flujos de la vaina que es el conjugado de Fourier del perfil del haz de campo lejano a lo largo del eje lento de LD 501.
Mientras tanto, como se muestra en la FIG. 5B, el ancho del haz fuera del plano puede no verse afectado por la lente cilindrica 505. La FIG. 5C muestra un perfil de tiempo medido de la luz dispersada desde una micropartícula utilizando el subsistema óptico 50 representado en las FIG. 1, 5A y 5B. El LD 501 utilizado para realizar la medición presentada en la FIG. 5C es el mismo que se utiliza para generar el perfil de tiempo medido de la luz dispersada a partir de una micropartícula que aparece en la FIG. 3B. Como se muestra en la FIG. 5C, los lóbulos laterales provocados por las franjas 512 a lo largo del eje rápido del LD 501 ya no tienen ningún efecto material sobre el rendimiento del citómetro de flujo 40.
La FIG. 5D ilustra una vista en perspectiva de la lente cilíndrica 505 del subsistema óptico 50 basado en LD con el objetivo de microscopio compuesto 60 solidario según algunas realizaciones de la presente descripción. Un haz de luz puede pasar a través de la lente cilíndrica 505 y una cubeta 603 del objetivo del microscopio 60 sustancialmente a lo largo del eje z y establecer un perfil 524 del haz en un plano x-y en la zona de visualización dentro de un canal de flujo 604 del objetivo del microscopio compuesto 60.
La FIG. 5E ilustra una vista ampliada del perfil de haz 524 mostrado en la FIG. 5D según algunas realizaciones de la presente descripción. La FIG. 5E muestra que el eje menor del haz de luz puede estar a lo largo del eje y, y sustancialmente paralelo a la dirección de la muestra de líquido y los flujos de la vaina, y el eje mayor del haz de luz puede estar a lo largo del eje x y sustancialmente perpendicular a la dirección de la muestra líquida y los flujos de vaina.
La FIG. 6 representa otro subsistema óptico alternativo basado en láser de diodo según algunas realizaciones de la presente descripción adaptadas para su uso en un citómetro de flujo. Aquellos elementos representados en las FIG. 6 y 6A que son comunes al subsistema óptico 50 ilustrado en la FIG. 1, 5a y 5B tienen el mismo número de referencia distinguido con una designación de triple comilla ("'). El subsistema óptico 50'" representado en las FIG. 6A y 6B es casi idéntico al mostrado en las FIG. 1, 5A y 5B, excepto que la zona de visualización ocurre sin un objetivo de microscopio compuesto 60 porque ocurre en una corriente de chorro de flujo libre 519 que incluye tanto la muestra como los flujos de vaina emitidos desde una boquilla 518. En consecuencia, para la configuración del subsistema óptico 50'” representado en las FIG. 6A y 6B, la lente cilíndrica de alta energía 505 se separa de la zona de visualización que está ubicada dentro de la corriente de chorro 519.
En las realizaciones ejemplares de la presente descripción representadas en las FIG. 1, 5A, 5B, 6A y 6B, el eje menor, es decir, el eje lento, del LD 501 está sustancialmente orientado perpendicular a la dirección en la que el flujo de la muestra de líquido pasa a través de la zona de visualización. Sin embargo, será evidente para los expertos en la materia que, utilizando una configuración óptica alternativa, el eje mayor, es decir, el eje rápido, del LD 501 se puede reorientar para que sea perpendicular a la dirección en la que el flujo de la muestra líquida pasa a través de la zona de visualización. La FIG. 7 representa un ejemplo de una configuración alternativa de este tipo de elementos ópticos. Aquellos elementos descritos en la FIG. 7 que son comunes al subsistema óptico 50 ilustrado en las FIG. 1, 5A, 5B, 6A y 6B tienen el mismo número de referencia distinguido con una designación de comilla cuádruple ("'). Como se muestra, el eje lento del LD 501"" está orientado en la dirección z. A continuación, el haz de luz emitido desde el LD 501"" se gira a la dirección y en el plano por un par de espejos de reflejo de noventa grados (90°) 523a y 523b. En la ilustración de la FIG. 7, una normal al primer espejo de reorientación de haz de luz de forma elíptica 523a está orientada en el plano x-y a cuarenta y cinco grados (45°) con respecto al eje x, y una normal al segundo espejo de reorientación de haz de luz de forma elíptica 523b está orientado en el plano y-z a cuarenta y cinco grados (45°) con respecto al eje z.
Objetivo de m icroscopio compuesto 60
Los citómetros de flujo modernos incluyen un filtro espacial, generalmente un orificio mecánico o una fibra óptica de núcleo grande, ubicado en una ubicación de imagen de una lente de objetivo para impedir que la luz de fondo no deseada ingrese al detector o detectores del citómetro. Debido a que las partículas permanecen en la zona de visualización del citómetro durante unos pocos microsegundos, se deben usar objetivos de microscopio con gran apertura numérica para maximizar la eficiencia de recolección de luz. Para soportar múltiples haces de láser de excitación separados espacialmente en citómetros de flujo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4.727.020, también es deseable usar un objetivo con un gran campo de visión. Con el fin de alcanzar estos objetivos, las Patente de los Estados Unidos No. 6,5100,07 y 7.110.192 describe un diseño de objetivo usando un apocromático modificado con una lente hemisférica cercana acoplada con gel o unida con epoxi como el elemento óptico más cercano a la muestra seguida por múltiples lentes de menisco. Si bien estos objetivos de microscopio proporcionan una apertura numérica y un campo de visión satisfactorios, han sacrificado significativamente la calidad de la imagen, y, por lo tanto:
1. limitan el uso efectivo del filtro espacial; y
2. presentan una discriminación deficiente de la luz de fondo.
Además, dichos objetivos de microscopio refractivo son voluminosos, costosos de fabricar y, a menudo, exhiben una aberración cromática grave. Para superar estas limitaciones, el Tratado de Cooperación en Materia de Patentes Publicadas ("PCT") Solicitud de Patente No. WO 01/27590 describe un diseño objetivo alternativo basado en un espejo cóncavo esférico. El diseño ofrece una gran apertura numérica y una buena calidad de imagen a lo largo del eje óptico. Sin embargo, debido a sus malas características fuera del eje, tal diseño no es adecuado para citómetros de flujo que tienen múltiples haces de láser separados espacialmente.
La FIG. 8 representa una realización según la presente descripción para el objetivo de microscopio compuesto 60 representado en las FIG. 1, 5A, 5B y 7. Como se muestra en la f Ig . 8, el objetivo del microscopio compuesto 60 puede representar una zona de visualización que se encuentra dentro de una cubeta de vidrio 603 de forma prismática dentro de un pequeño canal de flujo 604, que puede tener una forma de sección transversal rectangular, a través del cual pasa la partícula transportada por la muestra líquida combinada y los flujos de vaina. Un espejo de superficie trasera plano cóncavo 601 incluido en el objetivo de microscopio compuesto 60 puede estar hecho de un material ópticamente transparente que puede tener un índice de refracción similar al de la cubeta de vidrio 603, tal como vidrio o plásticos de calidad óptica. Para minimizar la pérdida óptica, el espejo de superficie trasera 601 puede incluir una superficie frontal plana que está acoplada ópticamente a una superficie plana contigua de la cubeta de forma prismática 603. El acoplamiento óptico del espejo de la superficie trasera 601 a la cubeta 603 puede emplear un gel de coincidencia de índice, adhesivo óptico o unión óptica directa. Alternativamente, el espejo de la superficie trasera 601 también puede formarse integralmente con la cubeta 603.
El objetivo de microscopio compuesto 60 también puede incluir una placa correctora planoasférica 602 que también está hecha de un material ópticamente transparente que puede tener un índice de refracción similar al de la cubeta de vidrio 603, tal como vidrio o plásticos de calidad óptica. Para reducir la pérdida óptica, una superficie plana de la placa correctora 602 puede acoplarse ópticamente a una superficie plana contigua de la cubeta de forma prismática lateral 603 de la misma que es diametralmente opuesta al espejo de la superficie trasera 601. El acoplamiento óptico de la placa correctora 602 a la cubeta 603 puede emplear un gel de coincidencia de índice, adhesivo óptico o unión óptica directa. La superficie asférica de la placa correctora 602 más alejada de la placa correctora 602 puede llevar un recubrimiento antirreflectante para reducir la pérdida de transmisión óptica, aunque dicho recubrimiento no es un requisito obligatorio para un objetivo de microscopio compuesto 60 según algunas realizaciones de la presente descripción. La forma de la superficie asférica de la placa correctora 602 es similar a la de una cámara de Schmidt clásica (Schmidt, B., Mitt. Hamburgo Sternwart 7 (36) 1932). Como saben los expertos en la materia, la placa correctora de una cámara de Schmidt incluye una zona neutral de forma circular donde la placa correctora no desvía los rayos de luz que pasan a través de la placa. Para su uso en el objetivo del microscopio compuesto 60, fuera de la zona neutra de la placa correctora 602, donde el grosor de la placa es más delgado, la placa correctora 602 puede tener energía óptica negativa mientras que, dentro de la zona neutra, la placa correctora 602 puede tener energía óptica positiva. La forma exacta de la placa correctora asférica 602 puede obtenerse fácilmente usando cualquier herramienta de trazado de rayos ópticos disponible comercialmente por cualquier persona con experiencia normal en la técnica. Cabe señalar que, en el citómetro de flujo 40, el haz de luz generado por el subsistema óptico 50 representado en las FIG. 1, 5A, 5B y 7, entra en la cubeta 603 perpendicularmente al canal de flujo 604 a través de una (1) de las dos (2) caras de la cubeta 603 que no se apoyan en el espejo de la superficie trasera 601 o la placa correctora 602.
Objetivo de m icroscopio combinado 65
La FIG. 8A ilustra una vista en perspectiva de un objetivo de microscopio combinado 65 según algunas realizaciones de la presente descripción. El objetivo de microscopio combinado 65 puede incluir el objetivo de microscopio compuesto 60, como se ilustra en la FIG. 8 y la lente cilíndrica 505. La lente cilíndrica 505 puede dirigir un haz de luz a la zona de visualización en el canal de flujo 604 para iluminar las partículas en el flujo de la muestra. Después de que las partículas se iluminen en la zona de visualización, el objetivo del microscopio compuesto 60 puede recoger la luz de formación de imágenes dispersada y fluorescente por partículas dentro de la zona de visualización.
La FIG. 8B ilustra una vista en perspectiva del objetivo de microscopio combinado 65 con una célula de flujo 619 solidaria según algunas realizaciones de la presente descripción. La muestra líquida 623 puede bombearse desde un tubo de muestra 621 a una sección de flujo 620 de la célula de flujo 619 mediante una bomba 624. La bomba 624 puede ser la bomba peristáltica 80, como se ilustra en la FIG. 17. La vaina de líquido 622 también se puede bombear a la sección de flujo 620 de la célula de flujo 619. La bomba para bombear la vaina de líquido 622 al interior de la célula de flujo 619 puede ser parte del sistema fluídico 70, como se ilustra en la FIG. 14 o 15. La muestra líquida 623 puede combinarse con la vaina de líquido 622 en la sección de flujo 620 de la célula de flujo 619 y a continuación enfocarse hidrodinámicamente dentro de la zona de visualización dentro del canal de flujo 604 del objetivo de microscopio combinado 65. El objetivo de microscopio combinado 65 o el objetivo de microscopio compuesto 60 pueden colocarse en la célula de flujo 619. Los expertos en la materia también pueden referirse a una combinación del objetivo del microscopio 65 o el objetivo del microscopio compuesto 60 y la célula de flujo 619 como una célula de flujo. El área de la sección transversal de la sección de flujo 620 en la parte superior de la célula de flujo 619 puede ser más pequeña que el área de la sección transversal de la sección de flujo 620 en la parte inferior de la célula de flujo 619 para facilitar el enfoque hidrodinámico de la muestra líquida 623 en la zona de visualización. Cabe señalar que los diversos aspectos de la presente descripción no se limitan a la dirección específica de la vaina de líquido o el flujo de la muestra y la forma específica de la célula de flujo o el objetivo del microscopio.
La FIG. 9A representa el resultado del trazado de rayos para la realización del objetivo de microscopio compuesto 60 ilustrado en la FIG. 8. Como se muestra en la FIG. 9A, las emisiones de dispersión y fluorescencia de tres (3) ubicaciones separadas espacialmente en el canal de flujo 604 cerca del centro de la cubeta 603 pueden:
1. propagarse inicialmente hacia el espejo de la superficie trasera 601 y pasar primero a través de la cubeta 603 para ser reflejadas internamente por el espejo de la superficie trasera 601;
2. a continuación, pasar a través de la cubeta 603;
3. posteriormente, pasar a través de la placa correctora asférica 602; y
4. finalmente, formar tres (3) imágenes distintas cerca de un plano de imagen 605.
Cabe señalar que los rayos que atraviesan el objetivo del microscopio compuesto 60 representado en la FIG. 9A son ópticamente uniformes y la luz emitida cerca del centro de la cubeta 603 atraviesa la placa correctora 602 con una incidencia casi normal. En consecuencia, el objetivo del microscopio compuesto 60 introduce muy poca dispersión cromática en la luz emitida cerca del centro de la cubeta 603.
Además, es bien sabido en la comunidad astrofísica que la cámara Schmidt ofrece la combinación incomparable de una relación focal rápida y un gran campo de visión con un rendimiento óptico limitado por difracción cercana. El principal inconveniente de una cámara Schmidt convencional es que la superficie de la imagen se encuentra dentro del instrumento. Para el objetivo de microscopio compuesto 60, la luz cerca del centro de la cubeta 603 se propaga de manera opuesta a la de una cámara Schmidt convencional y, por lo tanto, la superficie de la imagen se encuentra fuera del objetivo del microscopio compuesto 60. En consecuencia, la presente descripción aprovecha al máximo el rendimiento óptico de la cámara Schmidt sin experimentar su limitación. Las FIG. 9B1 a 9B3 representan diagramas de puntos cerca del plano de imagen 605 para tres (3) ubicaciones de emisión, 606, 607, 608 en la zona de visualización dentro del canal de flujo 604 que pueden estar separados 150 micrones entre sí. Los diámetros de todas las imágenes representadas en las FIG. 9B1 a 9B3 pueden tener menos de 35 micrones.
La luz emitida desde la zona de visualización dentro del canal de flujo 604 del objetivo de microscopio compuesto 60 representado en las FIG. 8 y 9A que atraviesa la placa correctora asférica 602 puede sufrir una pequeña cantidad de aberración cromática. La FIG. 10 representa una realización alternativa para el objetivo de microscopio compuesto 60 representado en las FIG. 1, 5A, 5B y 7 según algunas realizaciones de la presente descripción. Los elementos representados en la FIG. 10 que son comunes al objetivo de microscopio compuesto 60 ilustrado en las FIG. 8 y 9A llevan el mismo número de referencia que se distingue con una designación de comilla simple ('). Las formas del espejo de superficie trasera 601' y la placa correctora de aberraciones 602' representadas en la FIG. 10 se modifican ligeramente para producir imágenes afocales colimadas de los lugares de emisión cerca de la zona de visualización dentro del canal de flujo 604'. En la FIG. 10, el objetivo de microscopio compuesto 60' puede incluir una lente doble de compensación cromática 609 insertada entre la placa correctora 602' y el plano de imagen 605'. Además de enfocar la luz emitida desde la placa correctora 602' sobre el plano de imagen 605', la lente doble 609 también puede servir para reducir más la aberración cromática residual introducida por la placa correctora asférica 602'.
No es esencial que la superficie plana de la placa correctora 602 esté acoplada ópticamente a la cubeta 603. La FIG. 11 representa una realización alternativa del objetivo de microscopio compuesto 60 según algunas realizaciones de la presente descripción. Aquellos elementos representados en la FIG. 11 que son comunes al objetivo de microscopio compuesto 60 ilustrado en la FIG. 8 y 9A tienen el mismo número de referencia distinguido con una designación de doble comilla ("). La FIG. 11 representa la placa correctora de aberraciones 602" ópticamente desacoplada de la cubeta 603". Aunque no es esencial para el funcionamiento del objetivo de microscopio compuesto 60", para mejorar la eficiencia de transmisión de luz, ambas superficies de la placa correctora 602" y la superficie plana expuesta de la cubeta 603" pueden llevar un revestimiento antirreflectante. Se entiende que la placa correctora 602” mostrada en la FIG. 11 puede mantenerse en relación fija con el espejo de superficie trasera combinado 601 y la cubeta 603 mediante un soporte mecánico no representado en la FIG. 11. Similar al objetivo de microscopio compuesto 60 y 60' representado respectivamente en las FIG. 9A y 10, el objetivo de microscopio compuesto 60" con placa correctora separada 602" puede configurarse para proporcionar una imagen de longitud focal finita o un sistema afocal que, a su vez, se enfoca a un plano de imagen de distancia finita mediante una lente de doblete de compensación cromática adicional 609 .
La FIG. 12 representa incluso otra realización alternativa del objetivo de microscopio compuesto 60. Aquellos elementos representados en la FIG. 12 que son comunes al objetivo de microscopio compuesto 60 ilustrado en la FIG. 8, 9A y 11 tienen el mismo número de referencia distinguido con una designación de triple comilla ("'). El objetivo de microscopio compuesto 60'” representado en la figura 12 está adaptado para recoger emisiones de dispersión y fluorescencia de células u otras partículas microscópicas transportadas en la corriente de chorro 519 emitida por la boquilla 518. El objetivo de microscopio compuesto 60'” puede incluir un espejo de superficie frontal cóncavo, de forma esférica 610 y una placa correctora de aberraciones 612. El espejo de la superficie frontal 610 puede estar hecho de vidrio u otro tipo de material duro con un revestimiento altamente reflectante en la superficie cóncava 611 o de metal con la superficie cóncava pulida 611. Similar a la placa correctora 602, la placa correctora plano-asférica 612 puede estar hecha de una pieza delgada de material transparente, tal como vidrio o plásticos de calidad óptica. La superficie asférica puede formarse en ambas caras de la placa correctora 612. Ambas superficies de la placa correctora 612 pueden revestirse con un revestimiento antirreflectante para reducir la pérdida de transmisión óptica, aunque tal revestimiento no es un requisito obligatorio para una placa correctora 612 según algunas realizaciones de la presente descripción. Se entiende que el espejo de la superficie frontal 610 y la placa correctora 612 pueden mantenerse en una relación fija entre sí mediante un soporte
mecánico no representado en la FIG. 12. La luz de dispersión y fluorescencia emitida por las células u otros tipos de partículas microscópicas en la zona de visualización dentro de la corriente de chorro 519 puede ser reflejada por la superficie cóncava 611 del espejo de la superficie frontal 610. La aberración debida al reflejo de la superficie cóncava 611 puede ser corregida por la placa correctora 612 después de que la luz atraviese la placa correctora 612. Los expertos en la materia entenderán que el objetivo de microscopio compuesto 60'" puede configurarse para proporcionar una imagen enfocada finita similar a la representada en la FIG. 9A, o una imagen afocal colimada que se enfoca a una distancia finita del objetivo de microscopio compuesto 60'” mediante un doblete de corrección de aberración cromática similar a la lente doble 609 representada en la FIG. 10.
La FIG. 13 representa una adaptación del objetivo de microscopio compuesto 60 para obtener imágenes de especímenes fijados a la superficie de un sustrato transparente tal como un portaobjetos de vidrio. Aquellos elementos representados en la FIG. 13 que son comunes al objetivo de microscopio compuesto 60 ilustrado en la FIG. 8, 9A y 11 tienen el mismo número de referencia distinguido con una designación de comilla cuádruple ("'). El objetivo de microscopio compuesto 60”” representado en la FIG. 13 puede incluir dos (2) elementos ópticos, uno un espejo de superficie trasera plano-cóncavo 617 hecho de un material transparente, como vidrio o plásticos de calidad óptica, y una placa correctora de aberraciones 618. Como se muestra en la FIG. 13, el espécimen del que se va a formar la imagen puede fijarse a una superficie frontal 615 de un portaobjetos 616 transparente, normalmente de vidrio. El portaobjetos 616 puede acoplarse ópticamente, por ejemplo, usando una capa delgada de fluido de coincidencia de índices, a la superficie plana del espejo de la superficie trasera 617. La luz de dispersión y fluorescencia emitida por el espécimen puede:
1. propagarse inicialmente a través del portaobjetos 616 y el espejo de la superficie trasera 617;
2. ser reflejado internamente por el espejo de la superficie trasera 617 a través del portaobjetos 616;
3. a continuación, pasar a través de la placa correctora 618; y
4. finalmente formar una imagen en un plano de imagen que se encuentra más allá de la placa correctora 618. Subsistema flu íd ico 70
El rendimiento de un citómetro de flujo depende fundamentalmente de un flujo de vaina de líquido estable. En particular, los citómetros de flujo que tienen múltiples haces de láser de excitación separados espacialmente o que realizan la clasificación de las gotas se basan en una velocidad constante del flujo de la vaina de líquido para la sincronización del tiempo. Como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5.245.318, los citómetros de flujo convencionales proporcionan un flujo de vaina de líquido estable mediante el uso de un sistema fluídico hermético que:
1. aplica presión de aire constante en un depósito de líquido de vaina para empujar el fluido a través de la célula de flujo; o
2. aspira el fluido del depósito de líquido de la vaina a través de la célula de flujo utilizando una bomba de vacío. Estos sistemas son voluminosos, costosos de fabricar y propensos a fallar. Más recientemente, la Patente de los Estados Unidos No. 8.187.888 describió incluso un subsistema de líquido de vaina que bombea el flujo de líquido vaina desde el depósito de líquido vaina en la zona de visualización y la bomba de líquido de una pérdida vaina que bombea líquido de vaina de residuos de la zona de visualización al tanque de desechos. Aunque parece que el subsistema de líquido de vaina descrito nunca se ha utilizado en citómetros de flujo de velocidad crítica, esta patente informa que el subsistema de líquido de vaina descrito supera la mayoría de los inconvenientes de la estabilización del flujo de líquido de vaina convencional mediante:
1. Amortiguación de las pulsaciones de la bomba al localizar:
a. un condensador fluídico entre la bomba de líquido de la vaina y la célula de flujo; y b. otro condensador fluídico entre la célula de flujo y la bomba de residuos; y
2. un controlador de bomba cuyo funcionamiento responde a un sensor de presión que mide la diferencia de presión entre la entrada y la salida de la célula de flujo.
Sin embargo, el subsistema de líquido de vaina descrito tiene otras limitaciones. Por ejemplo, el sensor de presión ubicado cerca de la salida de la célula de flujo podría ser una fuente potencial de contaminación.
La FIG. 14 representa un subsistema fluídico 70 según algunas realizaciones de la presente descripción que incluye un depósito de líquido de vaina 702 y una bomba de líquido 701 que extrae el líquido de vaina del depósito de líquido de vaina 702. La bomba de líquido 701 puede ser una bomba de diafragma, una bomba peristáltica, una bomba de pistón o cualquier tipo de bomba de fluido continuo. Una salida de la bomba de líquido 701 puede conectarse a una entrada de un acoplamiento en T 703 que recibe el líquido de vaina de la bomba de líquido 701. El acoplamiento en T 703 puede tener
dos (2) salidas. La primera salida puede conectarse a un conducto de derivación 710 para devolver una fracción del líquido de la vaina recibida por el acoplamiento en T 703 desde la bomba de líquido 701 de regreso al depósito de líquido de la vaina 702. Devolver una fracción del líquido de la vaina recibida por el acoplamiento en T 703 desde la bomba de líquido 701 al depósito de líquido de la vaina 702 es ventajoso por dos (2) razones.
1. Como se muestra en la FIG. 14, el conducto de derivación 710 se deja abierto a la atmósfera circundante, lo que amortigua efectivamente la pulsación para reducir así significativamente la pulsación inherente al funcionamiento de la bomba de líquido 701.
2. Devolver una fracción del líquido de la vaina recibida por el acoplamiento en T 703 de la bomba de líquido 701 al depósito de líquido de la vaina 702 también reduce efectivamente el rendimiento de la bomba de líquido 701, lo que permite el uso de bombas comparativamente de alto caudal y bajo costo en el citómetro de flujo 40.
La resistencia al flujo del conducto de derivación 710 se denomina "r" y la resistencia al flujo de la trayectoria desde el acoplamiento en T 703 al canal de flujo 604 de la cubeta 603 se denomina "R". La resistencia de salida a la bomba de vaina Rp es, a continuación, igual a:
Dado que R » r, el comportamiento de la bomba de líquido 701 está dominado, por lo tanto, por la resistencia del conducto de derivación 710 cuyas propiedades dinámicas de fluido pueden ser insensibles a la temperatura. Por consiguiente, la configuración del subsistema fluídico 70 representado en la FIG. 14 también puede proporcionar un mecanismo simple para lograr un flujo de líquido de vaina insensible a la temperatura hacia el canal de flujo 604. Como se muestra en la FIG.
14, la segunda salida del acoplamiento en T 703 se conecta al canal de flujo 604 que se extiende a través de la cubeta 603 primero a través de una pequeña cápsula de depósito 704 y, a continuación, a través de un cartucho de filtro 705. Como se muestra en la FIG. 15, una pieza de tubo 704', que puede tener, por ejemplo, aproximadamente 4 pies de largo, puede sustituirse con la pequeña cápsula de depósito 704. Durante la inicialización del subsistema fluídico 70, algo de aire queda atrapado en el cartucho de filtro 705 cerca de su entrada que, como se muestra en la FIG. 15, está situado encima de una salida del cartucho de filtro 705. El aire atrapado en el cartucho de filtro 705 puede actuar como un condensador fluídico adicional reduciendo efectivamente a un nivel insignificante la pulsación en el líquido de vaina emitido al canal de flujo 604. Debido a la gran resistencia fluídica en el canal de flujo 604, el aire atrapado dentro del cartucho de filtro 705 se comprime. Cuando se apaga la bomba de líquido 701, un elemento atrapado en el cartucho de filtro 705 se empuja hacia el acoplamiento en T 703 de manera análoga a un condensador de descarga. Sin la cápsula de depósito pequeño 704, algo de aire expulsado del cartucho de filtro 705 alcanza el conducto de derivación 710 debido a su baja resistencia fluídica y será expulsado del subsistema fluídico 70 una vez que la bomba de líquido 701 se encienda de nuevo. Sin suministro de aire adicional, tal escenario se repetirá hasta que la mayor parte del aire se purgue del subsistema fluídico 70, haciendo que el cartucho de filtro 705 pierda su eficacia como amortiguador de pulsaciones. El propósito de la cápsula de depósito pequeño 704 o la pieza de tubo 704' es, por lo tanto, proporcionar un depósito para aislar el cartucho de filtro 705 del conducto de derivación 710, asegurando que el aire atrapado dentro del cartucho de filtro 705 permanezca dentro del subsistema fluídico 70 a pesar de que se repite en -apagado de operaciones de la bomba de líquido 701.
El efecto de amortiguación de pulsaciones del aire atrapado cerca de la entrada del cartucho de filtro 705 es claramente evidente en los histogramas representados en las FIG. 16A y 16B. La FIG. 16A representa tiempos de vuelo de partículas medidos en el canal de flujo 604 cuando una bolsa de aire queda atrapada cerca de la entrada del cartucho de filtro 705. La FIG. 16B representa tiempos de vuelo de partículas medidos en el canal de flujo 604 cuando el aire atrapado se purga del subsistema fluídico 70. El resultado representado en los histogramas de las FIG. 16A y 16B se fabrica utilizando dos (2) haces de láser en forma de borde de cuchillo enfocados cerca del centro del canal de flujo 604 que están separados aproximadamente 200 micrómetros. El eje horizontal de las FIG. 16A y 16B es el tiempo de vuelo que tarda una partícula de un haz de láser al otro medido registrando el tiempo máximo de llegada de la luz dispersada desde la partícula a noventa grados (90°) de los haces de excitación. En ambos casos, el tiempo medio de vuelo de las partículas para cruzar los dos haces de láser es el mismo. Como se muestra en la FIG. 16A, cuando el cartucho de filtro 705 retiene algo de aire, todas las partículas tardan aproximadamente la misma cantidad de tiempo en cruzar los dos haces de láser. Si el cartucho de filtro 705 no retiene aire, como se muestra en la FIG. 16B, la distribución de los tiempos de vuelo no solo se amplía, sino que también se vuelve bimodal. En otras palabras, algunas partículas tardan menos tiempo mientras que otras tardan más que la cantidad de tiempo promedio en cruzar los dos haces de láser, un fenómeno que puede atribuirse fácilmente a la pulsación de la velocidad del líquido de la vaina en el canal de flujo 604.
En las realizaciones de la presente descripción discutidas hasta ahora, la resistencia fluídica a lo largo del conducto de derivación 710 así como entre el acoplamiento en T 703 y el canal de flujo 604 puede no ser ajustable. Como resultará evidente para los expertos en la materia, los limitadores de flujo, como un limitador fijo o válvulas ajustables 712, 712' y 711,711', pueden insertarse ventajosamente en el conducto de derivación 710 y entre el acoplamiento en T 703 y el canal 604 para permitir ajustar el caudal a través del canal de flujo 604. Alternativamente, la velocidad del líquido de vaina que
fluye a través del canal de flujo 604 también puede ajustarse usando una bomba de líquido 701 que es impulsada por un motor de CC sin escobillas de velocidad variable.
Bomba peristáltica 80
Las bombas peristálticas son bombas volumétricas en las que un conjunto de rodillos que se mueven lineal o circularmente comprime progresivamente un tubo compresible para impulsar el fluido a través del tubo. Las bombas peristálticas se utilizan ampliamente, en especial para bombear fluidos limpios/estériles o agresivos, a fin de evitar la contaminación cruzada con los componentes expuestos de la bomba. La bomba peristáltica convencional presenta una pulsación. Cada vez, un rodillo sale del tubo cerca de la salida de la bomba por acción del aumento temporal del volumen del tubo cuando el tubo comprimido vuelve a expandirse a su forma original. La pulsación es indeseable en aplicaciones que requieren un flujo suave. En el pasado, se hicieron muchos intentos de reducir la pulsación. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 3.726.613 y No. 3826593 presentaron una prensa operada por leva que ejerce de manera sincrónica una presión externa sobre el tubo para compensar la expansión del tubo. En la Patente de los Estados Unidos No. 4.834.630, una pluralidad de tubos montados sobre rodillos segmentados se une en la entrada y salida de la bomba mediante acopladores en forma de T de modo que las pulsaciones de los tubos individuales se reducirían efectuando un promedio. La Patente de los Estados Unidos No. 7.645.127 propuso un tubo de bomba con un diámetro interior ligeramente mayor cerca de la entrada de modo que la descompresión del tubo cerca de la salida de la bomba se compense por la compresión de un tubo de mayor volumen cerca de la entrada. Los diversos procedimientos aumentaron significativamente la complejidad de la bomba peristáltica o tuvieron un éxito limitado en la reducción del efecto de pulsación.
En la FIG. 17, se ilustra una bomba peristáltica 80 según algunas realizaciones de la presente descripción. La bomba puede incluir una carcasa 809 con una pista curvada arqueada 808, tres rodillos 810, 811 y 812 unidos a un rotor 816 giratorio dentro de la carcasa 809, y un tubo compresible 807 intercalado entre la pista curvada arqueada 808 de la carcasa 809 y los rodillos 810, 811 y 812, en particular en la superficie 814 de los rodillos 810, 811 y 812. Como se muestra esquemáticamente en las FIG. 18A a 18D, los rodillos 810, 811 y 812 de la bomba peristáltica 80 están espaciados a distancias, separaciones o espaciamientos angulares sustancialmente iguales entre sí alrededor del perímetro del rotor 816. Los rodillos 810, 811, 812 pueden girar alrededor de un eje longitudinal de los mismos, de modo que se produce una fricción limitada entre los rodillos y el tubo compresible. Esto también puede aplicarse a los rodillos descritos a continuación. Por simplicidad, se supone en las siguientes discusiones que el rotor 816 gira en sentido antihorario, aunque debe entenderse que los análisis se aplican igualmente bien a una bomba peristáltica con rotor giratorio en sentido horario. El tubo compresible 807 de la carcasa 809 se puede dividir en varias secciones:
1. una sección abierta entre el punto 801 y el punto 806 donde el tubo compresible 807 no experimenta compresión;
2. una sección de entrada de la bomba entre el punto 801 y el punto 802 donde el tubo compresible 807 se comprime progresivamente hasta que se cierra completamente cuando un rodillo rueda sobre la sección;
3. dos secciones de bombeo entre el punto 802 y el punto 803, así como entre el punto 804 y el punto 805 en las que el tubo compresible 807 está completamente cerrado por el rodillo;
4. una sección de rebaje entre el punto 803 y el punto 804 en la que el tubo compresible 807 se expande progresivamente desde completamente cerrado a completamente abierto a medida que un rodillo rueda a través de la parte de expansión de la sección de rebaje desde el punto 803 al punto 813;
5. a continuación, el tubo compresible 807 se comprime progresivamente hasta que se cierra completamente a medida que un rodillo rueda a través de una parte de compresión de la sección de rebaje desde el punto 813 al punto 804; y
6. la sección de salida entre el punto 805 y el punto 806 donde el tubo compresible 807 se expande progresivamente desde completamente cerrado hasta completamente abierto a medida que un rodillo rueda a través de la sección.
En otras palabras, cuando un rodillo rueda en sentido antihorario sobre el tubo compresible 807 desde el punto de entrada 801 al punto de salida 806, el espacio interior del tubo compresible 807 puede: 123
1. disminuir progresivamente desde completamente abierto en el punto 801 hasta completamente cerrado en el punto 802 y permanecer cerrado hasta el punto 803;
2. a continuación, expandirse progresivamente hacia atrás para abrirse completamente en el punto 813;
3. a continuación, reducirse progresivamente hasta estar completamente cerrado en el punto 804, y permanecer cerrado hasta que el rodillo alcance el punto 805; y
4. finalmente, expandirse progresivamente hacia atrás para abrirse completamente en el punto 806.
El tamaño del espacio dentro del tubo compresible 807 se ilustra esquemáticamente en las FIG. 18A a 18D, como el espacio entre el círculo punteado y el tubo sólido compresible 807. Como se ilustra en las FIG. 18A a 18D, en esta realización de la bomba peristáltica 80, las distancias, separaciones o espaciamientos angulares entre los puntos 801 y 803, los puntos 802 y 813, los puntos 813 y 805, así como entre los puntos 804 y 806 pueden ser idénticos al ángulo entre los rodillos adyacentes. Como resultado, cuando el rodillo 810 rueda a través de la sección de bombeo desde el punto 804 al punto 805, como se muestra en las FIG. 18A a 18B, su interacción con el tubo compresible 807 puede determinar completamente el caudal de fluido de la bomba peristáltica 80. Una vez que el rodillo 810 alcanza la sección de salida entre los puntos 805 y 806, como se muestra en la FIG. 18C, el tubo compresible 807 debajo del rodillo 810 puede comenzar a expandirse progresivamente y puede comenzar a crecer un espacio. Mientras tanto, el rodillo 811 puede llegar a la parte de compresión de la sección de rebaje y comenzar a comprimir progresivamente el tubo compresible 807. En la bomba peristáltica 80, la forma de la parte de compresión de la sección de rebaje entre el punto 813 y el punto 804 a lo largo del tubo compresible 807 es tal que el volumen de líquido expulsado por la compresión del rodillo inferior 811 en la parte de compresión de la sección de rebaje entre el punto 813 y el punto 804 puede llenar sustancialmente el volumen creado por la expansión del tubo compresible 807 debajo del rodillo 810 en la sección de salida entre el punto 805 y el punto 806. Durante este período, el tubo compresible 807 está parcialmente abierto debajo de ambos rodillos 810 y 811 y completamente cerrado debajo del rodillo 812. En consecuencia, la acción de bombeo puede ser entregada principalmente por el rodillo 812. En particular, dado que por diseño el volumen total de líquido en la sección del tubo compresible 807 entre el punto 813 y el punto 816 permanece sustancialmente constante durante este período, el caudal de la bomba peristáltica 80 en el estado mostrado en la FIG. 18C puede permanecer sustancialmente igual que en el estado mostrado en las FIG. 18A y 18B. Una vez que el rodillo 810 pasa el punto 806, el rodillo 811 alcanza la sección de bombeo entre el punto 804 y el punto 805. Cabe señalar que no hay diferencia física entre los rodillos 810, 811 y 812, por lo que el caudal de la bomba peristáltica 80 puede permanecer sustancialmente constante durante todo el procedimiento.
El mecanismo de la bomba peristáltica sin pulsos según algunas realizaciones de la presente descripción puede entenderse más claramente si se observa a lo largo de una coordenada circular que sigue el movimiento de los rodillos. Con referencia a la FIG. 19, se denomina V al volumen del fluido dentro de un tubo compresible 819 desde la salida hasta el rodillo más cercano 820 que cierra el tubo compresible 819, es decir, la cantidad de fluido representada por el área sombreada 818 mostrada en la FIG. 19. Claramente, V depende de la posición angular, Q, del rodillo 820, así como 5, la cantidad de compresión del tubo ejercida por todos los demás rodillos aguas abajo.
En consecuencia, el caudal, F, de una bomba peristáltica está relacionado con la derivada del tiempo de Ve por:
- F =^ =^ r + Y ^ L ^ l (3)
d t dd 1dS¡ dt
Aquí R es la velocidad de rotación del rotor y los subíndices se utilizan para identificar múltiples rodillos aguas abajo. El primer término del lado derecho de la ecuación (3) representa la contribución del rodillo que cierra el tubo. Por lo tanto, la derivada parcial
dv
d 0
es independiente de Q. El término de suma representa contribuciones de todos los demás rodillos aguas abajo que comprimen parcialmente el tubo compresible 819. Ahora AS es el cambio de área de la sección transversal debido a la compresión del tubo compresible 819 por el rodillo 817, y L es la longitud del tubo donde su forma de la sección transversal se ve afectada por la compresión del tubo. A continuación, es obvio para un experto en la materia que L es proporcional a la compresión del tubo 5, y AS proporcional a su cuadrado, 52. En consecuencia, AV, el volumen de fluido perdido debido a la compresión del tubo compresible 807 por el rodillo, sigue la ecuación (4):
donde D es el diámetro interior del tubo compresible y G es el espacio mínimo indicado en las FIG. 19, 19A y 19B que también se representa en las FIG. 18A a 18D por el espacio entre el círculo punteado y la pista sólida 808 de la carcasa 809. La FIG. 19A y 19B son vistas en sección transversal detalladas ortogonales a la longitud del tubo de la bomba peristáltica tomadas a lo largo de las líneas 19A y 19B de la FIG. 19 que ilustra la compresión parcial del tubo por el rodillo. La FIG. 19A muestra el área de la sección transversal 818a tomada a lo largo de la línea 19A en la FIG. 19. La FIG. 19B muestra el área en sección transversal 818b tomada a lo largo de la línea 19B en la FIG. 19. Ahora con referencia a las FIG. 20A y 20B, en el sistema de coordenadas circular, la FIG. 20A corresponde al estado de la bomba mostrado en las FIG. 18A y 18B. Durante este período, no hay ningún rodillo aguas abajo del rodillo 810’ y el término de suma en la ecuación (3) desaparece. La FIG. 20B corresponde al estado de la bomba mostrado en la FIG. 18C. El tubo compresible 807 está cerrado por el rodillo 812’ y parcialmente comprimido por los rodillos 810’ y 811’. Sin embargo, los cambios volumétricos introducidos por los dos rodillos 810’ y 811' se cancelan sustancialmente entre sí. En consecuencia, el
término de suma es la ecuación (3) también se desvanece. Como resultado, el caudal de la bomba peristáltica 80 puede permanecer sustancialmente constante independientemente de las posiciones de los rodillos.
La forma del tubo compresible 807 que satisface el requisito anterior se puede derivar fácilmente de la ecuación (4). Con referencia a la FIG. 18C, si los huecos de la vía curvada arqueada 808 en la parte de compresión de la sección de rebaje entre el punto 813 y el punto 804, Gi3,4, y en la sección de salida entre el punto 805 y el punto 806, Gs,6, siguen la ecuación:
a continuación, el volumen total de fluido en las dos secciones puede permanecer sustancialmente constante, como se muestra en la FIG. 21. En la bomba peristáltica 80, la forma de la carcasa de la bomba 809 puede ser simétrica con respecto a su línea central, de modo que la mitad de entrada de la carcasa de la bomba 809 es la imagen especular de la mitad de salida de la carcasa 809, como se muestra en la FIG. 17. Por lo tanto, la bomba peristáltica 80 puede funcionar tanto en rotación en sentido antihorario como en sentido horario con muy poca pulsación, aunque se entiende que la simetría no es necesaria para realizar una bomba peristáltica sin pulsos según algunas realizaciones de la presente descripción. Por ejemplo, siempre que los huecos de la pista curva arqueada 808 en la sección entre el punto 813 y el punto 803, Gi3,3, y en la sección entre el punto 802 y el punto 801, G2,i , sigan la ecuación (6)
una bomba peristáltica según algunas realizaciones de la presente descripción exhibirá poca pulsación cuando el rotor 816 gire en el sentido de las agujas del reloj.
La FIG. 22 representa una realización alternativa de una bomba peristáltica según algunas realizaciones de la presente descripción. Aquellos elementos representados en la FIG. 22 que son comunes al subsistema óptico 80 ilustrado en la FIG. 17 tienen el mismo número de referencia distinguido con una designación de comilla simple ('). La bomba peristáltica 80’ puede incluir una pista curvada arqueada 808' que tiene dos (2) rebajes 818 y 819, y cuatro (4) rodillos 820, 821,822 y 823. En la realización representada en la FIG. 22, la pérdida de volumen de fluido debido a la expansión del tubo cerca de la salida de la bomba es compensada por el efecto combinado de la compresión del tubo compresible por los rodillos 820 y 823 cerca de los dos rebajes 818 y 819.
La FIG. 23 representa otra realización alternativa más de una bomba peristáltica según la presente descripción. Los elementos representados en la FIG. 23 que son comunes a la bomba peristáltica 80 ilustrada en la FIG. 17 y la bomba peristáltica 80’ ilustrada en la FIG. 22 llevan el mismo número de referencia que se distingue mediante una designación de comilla simple ("). La bomba peristáltica 80" puede incluir seis (6) rodillos 820, 821, 822, 823, 824, 825 y una pista curva arqueada 808" que tiene dos rebajes 818 "y 819". En la bomba peristáltica 80 ” , la pérdida de volumen de fluido debido a la expansión del tubo cerca de la salida de la bomba es compensada por la acción del rodillo inmediatamente aguas arriba del único rebaje 818” u 819” cerca de la salida de la bomba.
La pulsación debida a la expansión de un tubo compresible comprimido cerca de la salida de una bomba peristáltica también puede superarse mediante una bomba peristáltica que tenga una velocidad de rotor programable. Desde la FIG.
24A a la 24C, se ilustran aspectos pertinentes de un mecanismo de realización alternativo para minimizar la pulsación de la bomba peristáltica según la presente descripción para una bomba peristáltica de 3 rodillos. Como se muestra en la FIG.
24B, la pista 828 es sustancialmente circular entre la entrada de la bomba y la sección de salida de la bomba. En consecuencia, como lo indica el espacio entre el círculo punteado 829 y la curva sólida de la pista 828, el tubo compresible está completamente cerrado por varios de los tres (3) rodillos 825, 826, 827 de la bomba entre la entrada y la salida de la bomba. La FIG. 24A ilustra esquemáticamente en un sistema de coordenadas circular las posiciones de los rodillos para la bomba peristáltica representada en la FIG. 24B. Dado que solo hay un rodillo aguas abajo del que cierra el tubo, la ecuación 3 está mucho más simplificado:
Aquí, la compresión del tubo 5 (0) se expresa explícitamente como una función de la posición del rodillo 0. Los términos entre paréntesis representan la tasa de cambio del volumen de fluido con respecto a la posición del rodillo. El primer término es la contribución del rodillo que cierra el tubo, es decir, el rodillo 827 en la FIG. 24A, y el segundo término la contribución del rodillo en la sección de salida. Cabe señalar que, por definición, la tasa de cambio de volumen es negativa y el segundo término entre paréntesis desaparece cuando no hay ningún rodillo en la sección de salida. La curva de puntos de la FIG. 24C es un gráfico representativo de la tasa de cambio de volumen negativo con respecto a la posición del rodillo. El golpe a lo largo de la curva, debido a la expansión del tubo cuando un rodillo sale del tubo cerca de la salida de la bomba, es la causa de la pulsación en las bombas peristálticas convencionales que tienen una velocidad de rotor constante. Sin embargo, para la bomba peristáltica representada en las FIG. 24A a 24C, la velocidad del rotor, R, mostrada como una curva discontinua en la FIG. 24C, se puede configurar para variar en sincronismo con la posición del rotor e inversamente proporcional a la tasa de cambio del volumen de fluido. En consecuencia, la tasa de flujo de la bomba, que es el producto de la velocidad del rotor y la tasa de cambio del volumen de fluido, puede permanecer constante, como lo indica la línea continua en la parte superior de la FIG. 24C. Cabe señalar que los términos dentro del paréntesis de la ecuación (7) pueden estar determinados únicamente por la estructura mecánica de la bomba. Por lo tanto, el perfil de
velocidad del rotor se puede generar fácilmente a partir de la forma de la pista 828 según la ecuación (4). Para los expertos en la materia, hay muchas formas de realizar un rotor programable, por ejemplo, con un motor paso a paso o un servomotor de CC.
Dispositivo WDM 90
En muchos instrumentos de detección de fluorescencia multicolor, como los citómetros de flujo, (Practical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley (2003) ISBN 0471411256), la luz de fluorescencia emitida por el objeto de interés es:
1. recogido por un objetivo de microscopio;
2. reimpreso a través de un pequeño orificio o una fibra óptica multimodo;
3. a continuación colimado y separado en múltiples bandas de colores; y
4. finalmente detectado por un fotodetector, como un tubo fotomultiplicador (PMT, por su sigla en inglés), un fotodiodo (PIN, por su sigla en inglés) o fotodiodo de avalancha (APD, por su sigla en inglés).
Un PMT es esencialmente un tipo especial de tubo de electrones. Este dispositivo de la "era anterior a los semiconductores" es voluminoso y costoso. Además, tiene una eficiencia cuántica más pobre y una respuesta espectral menos reproducible que los detectores de semiconductores basados en silicio, particularmente en la región espectral del rojo al infrarrojo cercano biológicamente importante. A pesar de las desventajas, el PMT tiene excelentes características de ruido. Por ejemplo, la corriente oscura de un PMT típico de 13 mm (por ejemplo, el R9305 de Hamamatsu Corporation of Japan) es solo de InA. Por el contrario, la corriente oscura de un a Pd sería 10 veces mayor incluso si su área activa se redujera a 1/20 th de la del PMT. Como resultado, el PMT ha sido el detector de luz de bajo nivel de facto en muchos citómetros de flujo de detección de fluorescencia comerciales. Solo en ciertas aplicaciones científicas donde la tasa de eventos es baja y la corriente oscura puede ser discriminada por costosas técnicas de conteo de fotones, el PMT ha sido reemplazado por detectores APD (véase, High-Throughput Flow Cytometric DNA Fragment Sizing, A.V. Orden, R.A. Keller y W. P.Ambrose, Anal. Chem., 2000, 72 (1), páginas 37 a 41). Más recientemente, también se promovió una matriz APD en modo Geiger como reemplazo del PMT. (Por ejemplo, el contador de fotones de píxeles múltiples de Hamamatsu Photonics de Japón y el fotomultiplicador de estado sólido de SensL Inc. de Irlanda). Sin embargo, estos detectores también tienen una alta corriente oscura y no son lineales a una alta tasa de eventos.
La única industria en la que el APD ha encontrado una amplia aceptación es la de las comunicaciones ópticas. Se sabe que, si el área activa del APD se reduce a menos de 1 mm2, la corriente oscura correspondiente se reducirá al mismo nivel que un PMT. En la comunicación óptica, la luz es un haz de láser de fibra óptica monomodo. Un haz de este tipo puede colimarse fácilmente y a continuación enfocarse hacia un área mucho menor de 1 mm2. Cabe señalar que los dispositivos de separación de colores utilizados en los instrumentos de detección de luz fluorescente, como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 6.683.314 y sus referencias son casi idénticas en función y arquitectura a los multiplexores por división de longitud de onda (WDM) ampliamente utilizados en comunicaciones ópticas, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos No. 4.482.994 y No. 5.786.915. Una de las razones fundamentales que impiden el uso del APD de área pequeña en la instrumentación de detección de fluorescencia es el bien conocido teorema de la conservación etendue: la luz de fluorescencia que entra a través de una fibra óptica estenopeica o multimodo es una fuente de luz extendida con una etendue cientos de veces mayor que la de un haz de láser de una fibra óptica monomodo. En consecuencia, como se ilustra en la FIG. 26, no se puede colimar en una distancia extendida a menos que el diámetro del haz se expanda significativamente. Desafortunadamente, cuanto mayor sea el diámetro del haz, mayor será el desafío técnico para enfocarlo en un punto pequeño. Dado que la separación de color eficiente solo se puede lograr de manera económica con un haz de luz colimada, el APD de área pequeña no se ha considerado viable para aplicaciones de detección de luz de fluorescencia multicolor. Claramente, sería muy deseable una tecnología capaz de colimar un gran haz de luz de extensión a lo largo de una distancia extendida sin expandir significativamente el diámetro del haz. Tal tecnología permitiría un dispositivo tipo WDM para la detección de luz fluorescente con características comparables a los detectores semiconductores de bajo ruido.
La FIG. 25 muestra el trazado de rayos ópticos para un multiplexor de división de longitud de onda de 6 puertos ejemplar de la presente descripción usando la configuración en zig-zag. Como se muestra en la FIG. 25, la luz de fluorescencia que atraviesa un orificio o se emite desde la faceta de una fibra óptica multimodo, como la fibra óptica 852 representada en la FIG. 1, forma un objeto extendido o una fuente de luz en la ubicación 901, es decir, la entrada óptica del WDM 90. El tamaño del objeto se define por el diámetro del orificio o el diámetro del núcleo de la fibra óptica multimodo. Cabe señalar que el tamaño práctico del orificio o el diámetro del núcleo de la fibra óptica multimodo se mide en milímetros, a diferencia del diámetro de las fibras ópticas monomodo que se miden en micrómetros. En consecuencia, la extensión de la fuente de luz de fluorescencia, definida como el producto del tamaño del haz y su ángulo de divergencia, es cientos de veces mayor que su contraparte en la comunicación óptica. Según el teorema de la conservación de etendue (Julio Chaves, Introduction to Nonimaging Optics, CRC Press, 2008 ), la luz de una fuente tan extendida, similar a la de un flash, solo se puede mantener colimada a una distancia muy limitada, particularmente cuando el diámetro de la porción colimada necesita ser pequeño.
Como se muestra en la FIG. 25, un elemento óptico de colimación, en este caso una lente doble acromática 902, puede capturar la luz de la fuente 901 y proyectar una imagen ampliada del objeto cerca de una lente de enfoque final 905. El tamaño de la imagen cercana a la lente 905 puede mantenerse aproximadamente igual que el tamaño efectivo del elemento óptico de colimación 902. En consecuencia, el haz de luz que se propaga entre el elemento óptico de colimación 902 y la lente de enfoque 905 puede colimarse efectivamente. Como se muestra en la FIG. 25, siempre que el factor de aumento se mantenga pequeño, por ejemplo, menos de alrededor de 10, utilizando una lente singlete simple como lente de enfoque 905, el haz de luz colimado puede enfocarse fácilmente hacia un punto más pequeño que el del haz de luz recibida por el WDM 90 en la ubicación 901. La capacidad de enfocar el haz de luz hasta un tamaño tan pequeño permite colocar un detector semiconductor de área pequeña en un punto focal 906 de la lente de enfoque 905 para una detección fotográfica efectiva.
Un filtro dicroico 903, orientado en un ángulo inclinado, puede insertarse en la trayectoria óptica entre el elemento óptico de colimación 902 y la lente de enfoque 905. El filtro dicroico 903 puede pasar la banda de color de interés y reflejar los colores restantes en el haz de luz para su procesamiento adicional dentro del WDM 90. Puede insertarse un filtro de paso de banda opcional 904 después del filtro dicroico 903 para mejorar aún más la capacidad de aislamiento de color del WDM 90.
La luz reflejada por el filtro dicroico 903 puede incidir sobre un segundo elemento óptico 907, tal como un espejo cóncavo. El espejo cóncavo 907 puede tener un radio de curvatura aproximadamente igual a la distancia entre el elemento óptico de colimación 902 y la imagen cerca de la lente de enfoque 905. El espejo cóncavo 907 crea por tanto una segunda imagen de la lente de colimación 902 cerca de una segunda lente de enfoque 908. El haz de luz entre el espejo cóncavo 907 y la segunda imagen en la lente 908 puede tener sustancialmente el mismo diámetro que el haz de luz entre la lente de colimación 902 y la primera imagen cerca de la lente de enfoque 905. Por lo tanto, el espejo cóncavo 907 de formación de imágenes de retransmisión duplica efectivamente la trayectoria del haz colimado sin expandir el diámetro del haz. Nuevamente, el haz extendido pero colimado se puede enfocar fácilmente hacia un punto más pequeño que el de la fuente de luz en 901. El diámetro del punto puede ser menor que 1 mm, por ejemplo, alrededor de 600 jm . A continuación, puede insertarse un segundo filtro dicroico 909 entre el espejo cóncavo de formación de imágenes de retransmisión 907 y la segunda imagen cerca de la lente de enfoque 908. El segundo filtro dicroico 909 puede pasar otra banda de color en el haz de luz recibido por el WDM 90 en la ubicación 901 y reflejar el resto del haz de luz que incide para su procesamiento adicional. El primero y el segundo filtro dicroico 903 y 909 pueden insertarse aproximadamente a medio camino entre el elemento óptico de colimación 902 y la lente de enfoque 905 y entre el espejo cóncavo de formación de imágenes de retransmisión 907 y la segunda imagen cerca de la lente de enfoque 908, respectivamente.
Como se muestra en la FIG. 25, los elementos ópticos de colimación de retransmisión adicionales 910, 911, 912, 913 y los filtros dicroicos 914, 915, 916, 917 se pueden conectar en cascada de la misma manera para producir múltiples imágenes cerca de las lentes de enfoque 918, 919, 920 y 921, cada una de estas imágenes correspondiente a una banda de luz de color específica recibida por el WDM 90 en la ubicación 901. Como se muestra en la FIG. 25, debido a la arquitectura de retransmisión de imágenes de 1:1 de la presente descripción, los puntos de luz producidos por las lentes de enfoque 905, 908, 918, 919, 920 y 921 son todos más pequeños que la fuente del haz de luz y, por lo tanto, pueden ser capturados fácilmente por el APD de áreas pequeñas.
Aunque la FIG. 25 ilustra un multiplexor de división de longitud de onda de 6 puertos para un haz de luz de la fuente de luz extendida, para los expertos en la materia es evidente que los WDM que tienen diferentes números de puertos se pueden construir fácilmente según algunas realizaciones de la presente descripción. También es evidente para los expertos en la materia que, aunque el WDM 90 puede usar dobletes acromáticos como el primer elemento óptico de colimación, también se pueden usar lentes singlete ya que las imágenes creadas antes de las lentes de enfoque 905, 908, 918, 919, 920 y 921 son casi monocromáticos. En lugar de utilizar espejos cóncavos para retransmitir el haz de luz reflejado por los filtros dicroicos, también se pueden utilizar ópticas refractivas, como una lente convexa, como elemento de retransmisión para extender la trayectoria del haz de luz colimado. Sin embargo, una de las ventajas de la arquitectura en zig-zag utilizada en el WDM 90 es la posibilidad de usar detectores de matriz, lo que conduciría a un WDM más compacto adecuado para la instrumentación portátil.
La FIG. 25A ilustra una vista superior de un conjunto de detección de luz 937 con el WDM 90 ilustrado en la FIG. 25 según algunas realizaciones de la presente descripción. El conjunto de detección de luz 937 puede incluir el WDM 90 y un sistema de fotodetector 938. Un haz de luz que emite desde la faceta de la fibra óptica 852 puede ser procesado por el WDM 90 y detectado por el sistema fotodetector 938. Los espejos cóncavos 907, 910, 911, 912 y 913 y los filtros dicroicos 903, 909, 914, 915, 916 y 917 pueden formarse en dos caras de un bloque de referencia 935. El bloque de referencia 935 puede estar hecho de vidrio o de cualquier material que permita que la luz pase a través de él. Por consiguiente, un patrón óptico en zig-zag, como se ilustra en la FIG. 25 puede estar formado entre el elemento óptico de colimación 902, los filtros dicroicos 903, 909, 914, 915, 916 y 917, el bloque de referencia 935, los espejos cóncavos 907, 910, 911, 912 y 913, y la lente de enfoque. 905, 908, 918, 919, 920 y 921. Después de ser procesado por el WDM 90, el haz de luz que emite desde la faceta de la fibra óptica 852 puede dividirse en múltiples bandas de colores con diferentes longitudes de onda para ser detectadas por los fotodetectores 940, 941, 942, 943, 944 y 945, respectivamente. El fotodetector puede ser, entre otros, un detector de semiconductores, un fotodetector de avalancha (APD) y un detector de nanotubos de carbono.
En algunas realizaciones, los espejos cóncavos 907, 910, 911, 912 y 913 pueden formarse estructuralmente en un conjunto de retransmisión 939. Los expertos en la materia deben entender que el espejo cóncavo se puede reemplazar por una lente convexa, que también es capaz de converger y transmitir el haz de luz.
En algunas realizaciones, el filtro dicroico se puede reemplazar con un espejo para impedir que el haz de luz entre en un fotodetector cuando un usuario desea disminuir el número de canales de señal de luz a detectar. Los expertos en la materia deben entender que el filtro dicroico también puede ser reemplazado por un espejo dicroico, un divisor de haz o cualquier elemento óptico que pueda dividir o filtrar un haz de luz.
La FIG. 25B ilustra una vista frontal del conjunto de detección de luz 937 con el WDM 90 ilustrado en las FIG. 25 y 25A, según algunas realizaciones de la presente descripción. El conjunto de detección de luz 937 puede tener una cubierta superior 940 que se puede abrir. Por lo tanto, el usuario puede abrir la cubierta superior 940 para cambiar los espejos dicroicos 903, 909, 914, 915, 916 y 917 y modificar el sistema de detección de luz 938 o el WDM 90 en el interior.
La FIG. 26 ilustra un trazado de rayos ópticos para un dispositivo de colimación de la técnica anterior. La técnica representada en la FIG. 26 se usa ampliamente en instrumentos de fluorescencia multicolor convencionales, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6.683.314. Como se muestra en la FIG. 26, el haz de luz diverge rápidamente más allá de la imagen 924 creada por el elemento óptico de colimación 923. En consecuencia, la única opción para construir un dispositivo multicolor es insertar filtros dicroicos entre el elemento de colimación 923 y su imagen 924.
Debido a la restricción de la conservación del extremo, el diámetro del haz colimado debe expandirse significativamente para aceptar múltiples filtros dicroicos en la sección. El haz expandido crea un serio desafío para reenfocar el haz colimado hacia puntos pequeños adecuados para detectores de semiconductores de área pequeña. Para superar estas dificultades, algunos fabricantes de instrumentos han optado por utilizar un PMT exclusivamente para la detección de fluorescencia, como en los citómetros de flujo tradicionales fabricados por Becton-Dickinson, Beckman Coulter y Partec y la serie MegaBACE de secuenciadores de ADN de GE Amersham. Otros instrumentos, como los analizadores de perlas multiplexados Luminex, han seleccionado ciertas bandas de color con fluorescencia brillante conocida y utilizan un APD de área grande para detectar la luz en las bandas de color seleccionadas.
La FIG. 27 ilustra una vista en perspectiva de una realización alternativa para un WDM 90 de 6 puertos usando una combinación de configuraciones en zig-zag y ramificadas. El diseño es una modificación de la configuración en zig-zag representada en la FIG. 25. En la realización alternativa representada en la FIG. 27, el filtro de paso de banda 904 de la FIG. 25 puede sustituirse por un filtro dicroico 904'. El filtro 904' está posicionado para dejar pasar un color y refleja otros colores a noventa grados (90°). La longitud de la trayectoria óptica del haz de luz que pasa a través del filtro dicroico 904' y el que se refleja desde el 904' son sustancialmente iguales, de modo que un brazo es enfocado por las lentes 905 y el otro por la lente 905' a pequeños puntos compatibles con detectores semiconductores de área pequeña colocados en la ubicación focal 906 y 906'. Como se muestra en la FIG. 25, el color restante de la luz reflejada por el filtro dicroico 903 es retransmitido por un espejo cóncavo 907 y la configuración que incluye los elementos ópticos 903, 904', 905 y 905' se conecta en cascada dos (2) veces más para formar un WDM de 6 puertos.
La FIG. 28 ilustra una vista en perspectiva de una realización alternativa para un WDM de 8 puertos 90. El reemplazo de los espejos cóncavos 907 y 910 en la FIG. 27 con filtros dicroicos de forma cóncava 907' y 910', el WDM representado en la FIG. 28 puede proporcionar 2 bandas de color más en comparación con los WDM representados en las FIG. 25 y 27.
A lo largo de los años se han desarrollado numerosas sondas de fluorescencia para su uso en una citometría de flujo. Más recientemente, múltiples proteínas de fluorescencia también se han convertido en una herramienta importante en los estudios biomédicos. Para adaptarse a diferentes tipos de sondas de fluorescencia, se han desarrollado varias técnicas para permitir al usuario la selección de filtros dicroicos adecuados para sus necesidades particulares. Un desafío importante para los filtros dicroicos reemplazables es evitar el contacto directo de la superficie del filtro recubierta con cualquier marco de referencia de citómetro de flujo duro. El contacto directo repetido entre la superficie revestida del filtro y cualquier marco de referencia duro puede dañar un filtro dicroico reemplazable. Actualmente, la mayoría de las soluciones convencionales que abordan este problema utilizan espaciadores mecánicos maquinados con precisión para mantener los filtros dicroicos reemplazables en su lugar. Un ejemplo de tal solución aparece en la Patente de los Estados Unidos No. 6.683.314. Sin embargo, tal solución se vuelve poco confiable si el área activa del detector es menor de 1,0 mm2.
Las FIG. 29A y 29B representan la fabricación de un conjunto de filtro dicroico reemplazable 934 ilustrado en la FIG. 29C adecuado para detectores de áreas pequeñas. El montaje del conjunto de filtro dicroico reemplazable 934 comienza en la FIG. 29A que representa la construcción de una plantilla de referencia para su fabricación. La plantilla de referencia puede ser una escalera hecha de dos (2) placas de vidrio 925 y 926 ópticamente paralelas. Unir las dos (2) placas de vidrio 925 y 926 juntas en contacto óptico puede asegurar que una superficie 929 de la placa de vidrio 925 se vuelva ópticamente paralela a una superficie 930 de la placa de vidrio 926. A continuación, se puede presionar una superficie frontal 932 de un filtro dicroico reemplazable 927 contra la superficie 929 de la plantilla. Un soporte de filtro 928, que se ajusta holgadamente al filtro dicroico 927, puede incluir una superficie de referencia 931 y una ranura de filtro 933. Durante el montaje del filtro dicroico reemplazable, la ranura del filtro 933 puede llenarse parcialmente con adhesivo epoxi y la superficie de referencia 931 del portafiltro 928 puede presionarse contra la superficie 930 de la plantilla mientras que el
portafiltro 928 se desliza hacia el filtro dicroico 927. Mientras el adhesivo epoxi fragua, parte del filtro dicroico 927 permanece asentado dentro de la ranura del filtro 933 mientras se aplica presión contra el filtro dicroico 927 y el portafiltro 928. Debería ser evidente para los expertos en la materia que el adhesivo epoxi puede ser curable por UV o térmicamente, o fabricado mezclando componentes de una mezcla A/B. La FIG. 29C representa un filtro dicroico fabricado como se muestra en las FIG. 29A y 29b y como se describió anteriormente. El procedimiento de montaje representado en las FIG.
29A y 29B y descrito anteriormente puede asegurar que la superficie frontal 932 del conjunto de filtro dicroico reemplazable 934 pueda ser ópticamente paralelo a la superficie de referencia 931, y tener una hendidura con respecto a esta última a un espaciado determinado con precisión por el espesor de la placa de vidrio 925 . El filtro dicroico 927 representado en las FIG. 29A, 29B y 29C pueden ser los filtros dicroicos 903, 909, 914, 915, 916 o 917 usados con el WDM ilustrado en la FIG. 25 o el filtro dicroico 903 o el filtro 904' usado con el WDM ilustrado en la FIG. 27.
Las FIG. 30A y 30B representan una realización de la presente descripción en la que el conjunto de filtro dicroico reemplazable 934 mencionado anteriormente se usa en el WDM 90 para procesar ópticamente un haz de luz desde una fuente de luz extendida. Una característica notable del WDM 90 es un bloque de referencia de vidrio 935 que tiene una superficie ópticamente plana. Como resultará evidente para los expertos en la materia, el bloque de referencia de vidrio 935 puede estar hecho de otros materiales. Como se muestra en la FIG. 30B, cuando se instala un filtro dicroico 927, la superficie de referencia 931 del conjunto de filtro dicroico reemplazable 934 puede deslizarse contra la superficie plana del bloque de vidrio de referencia 935 y mantenerse en contacto con el mismo mediante un tornillo accionado por resorte 936. En consecuencia, la superficie frontal revestida 932 del conjunto de filtro dicroico reemplazable 934 puede permanecer ópticamente paralela al plano óptico y ubicada con precisión. Mientras tanto, la hendidura de la superficie frontal 932 con respecto a la superficie de referencia 931 puede protegerla del contacto físico con cualquier objeto durante la sustitución del filtro. Es evidente para los expertos en la materia que son posibles muchas modificaciones y variaciones de las realizaciones descritas del conjunto de filtro dicroico reemplazable 934. Por ejemplo, una realización alternativa de la presente descripción puede ser un pedestal ensamblado usando un primero y un segundo plano óptico redondo. Cuando se ensambla el conjunto de filtro dicroico reemplazable 934, la superficie de referencia de un soporte de filtro puede descansar contra una superficie del primer plano óptico y la superficie revestida del filtro dicroico puede descansar contra la superficie plana del segundo plano óptico. A continuación, la unión de epoxi puede mantener la superficie revestida del filtro dicroico ópticamente paralela a la superficie de referencia de un portafiltros, pero con una hendidura a una distancia determinada con precisión por el grosor del segundo plano óptico.
Sistema óptico con una sola fuente de luz 41
La FIG. 31 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema óptico con una única fuente de luz 41 según algunas realizaciones de la presente descripción. El sistema óptico con una única fuente de luz 41 puede incluir un subsistema óptico 50 basado en LD, un objetivo de microscopio compuesto 60, un WDM 90 y un sistema de detección de luz 938. El haz de luz puede propagarse sustancialmente a lo largo del eje z y entrar en el objetivo del microscopio compuesto 60 desde el subsistema 50 óptico basado en LD para iluminar las partículas presentes dentro de la zona de visualización dentro del objetivo del microscopio compuesto 60. La luz dispersada y fluorescente por las partículas, a continuación, puede ser reflejada por el espejo cóncavo 601, corregida por la placa correctora 602 y recogida por la fibra óptica 852 sustancialmente a lo largo del eje x. La fibra óptica 852 puede fijarse mediante un soporte de fibra 940.
Las longitudes de onda comunes de las fuentes de luz pueden incluir, entre otras, 375 nm, 405 nm, 440 nm, 488 nm, 502 nm, 534 nm, 561 nm, 591 nm, 637 nm y 637 nm. El sistema de detección de luz 938 puede tener circuitos solidarios para procesar señales de luz. Cuantos más puertos tenga el WDM 90, más canales de señal de luz podrá utilizar el usuario.
Sistema óptico con múltiples fuentes de luz 42
La FIG. 32 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema óptico con múltiples fuentes de luz 42 según algunas realizaciones de la presente descripción. El sistema óptico con múltiples fuentes de luz 42 puede incluir múltiples subsistemas ópticos 50 basados en LD, múltiples WDM 90, múltiples sistemas de detección de luz 938 y un objetivo de microscopio compuesto 60 con una zona de visualización. El número de WDM 90 puede corresponder al número de subsistemas ópticos 50 basados en LD. En la FIG. 32, el sistema óptico con múltiples fuentes de luz 42 incluye tres diodos láser 501 para emitir múltiples haces de luz con diferentes longitudes de onda, tres lentes colimantes 502 delante de los tres LD para colimar los haces de luz respectivamente, tres filtros dicroicos 506, 507, y 508 para haces de luz de paso con cierto intervalo de longitud de onda o haces de luz reflectantes con cierto intervalo de longitud de onda, una lente plano-convexa 504 para dar forma a los haces de luz en el eje mayor, una lente cilíndrica 505 para enfocar los haces de luz en tres ubicaciones separadas espacialmente en el canal de flujo 604, un objetivo de microscopio compuesto 60 para dirigir la luz dispersada y fluorescente por las partículas iluminadas en tres ubicaciones separadas espacialmente para ser recolectadas por tres fibras ópticas 852, respectivamente, tres fibras ópticas 852 para recolectar dispersión y emisiones de fluorescencia y transmisión de las emisiones a tres WDM 90, respectivamente, y tres WDM 90 y sistemas de detección de luz 938 para procesar y detectar la luz de dispersión y fluorescencia, respectivamente. La dirección de los haces de luz que entran en el objetivo del microscopio compuesto 60 puede ser perpendicular a la dirección de las emisiones de dispersión y fluorescencia a ser recogidas por la fibra óptica 852. Cabe señalar que la lente plano-convexa 504 y la lente cilíndrica 505 pueden reemplazarse con cualquier formador de haz convencional y cualquier lente de enfoque. También debe tenerse en cuenta que los diversos aspectos de la presente descripción no se limitan a números específicos de diodos láser, lentes de colimación, filtros dicroicos, lentes plano-convexos, objetivos de microscopios
compuestos, fibras ópticas, WDM y sistemas de detección de luz y longitudes de onda específicas, ni a la dirección de cada haz de luz.
La FIG. 33 ilustra una vista ampliada de los haces de luz 509 y 510 que se muestran en la FIG. 32. Los haces de luz 509 y 510 se emiten desde diferentes diodos láser 501 con diferentes longitudes de onda y a continuación se enfocan en ubicaciones divididas espacialmente en el canal de flujo 604 dentro del objetivo de microscopio compuesto 60.
Sistema óptico con elementos de compensación cromáticos 51
La FIG. 34 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema óptico con elementos de compensación cromática 51 según un aspecto de la presente descripción según algunas realizaciones de la presente descripción. El sistema óptico con elementos de compensación cromática 51 puede incluir el sistema óptico con múltiples fuentes de luz 42, como se muestra en la FIG. 32 y múltiples elementos de compensación cromática 514, 515 y 516. Cada uno de los elementos de compensación cromática 514, 515 y 516 puede colocarse en las trayectorias de los haces de luz que emiten desde las fuentes de luz 511, 512 y 513, respectivamente, y compensar la aberración cromática en la zona de visualización. Como tales, los haces de luz emitidos desde las fuentes de luz 511, 512 y 513 con diferentes longitudes de onda pueden enfocarse en tres ubicaciones divididas espacialmente en un plano común que está en la zona de visualización y sustancialmente paralelo a la dirección de un flujo de muestra. Las propiedades ópticas de los elementos de compensación cromática 514, 515 y 516 pueden ser diferentes entre sí. Por ejemplo, sus espesores y formas pueden ser diferentes para adaptarse a varios haces de luz con diferentes longitudes de onda.
En algunas realizaciones, el sistema óptico mostrado en la FIG. 34 puede necesitar solo uno o dos elementos de compensación cromática para compensar la aberración cromática en la zona de visualización. Cabe señalar que los diversos aspectos de la presente descripción no se limitan a números o propiedades ópticas de los elementos de compensación cromática específicos.
Sistema de monitorización de energía 43
La FIG. 35 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema 43 de monitorización de energía según algunas realizaciones de la presente descripción. El sistema de monitorización de energía 43 puede incluir una primera fuente de luz 513 para emitir un primer haz de luz, una segunda fuente de luz 512 para emitir un segundo haz de luz, un primer filtro dicroico 519 para reflejar el primer haz de luz y pasar el segundo haz de luz, un segundo filtro dicroico 518 para reflejar el segundo haz de luz, un primer detector 401 para medir la energía residual del primero y el segundo haz de luz aguas abajo del primer filtro dicroico 519 sobre una base de multiplexación por división de tiempo, y un conjunto de control 522 con el primer detector 401, la primera fuente de luz 513 y la segunda fuente de luz 512 solidarios. El primer detector 401 puede colocarse cerca del primer filtro dicroico 519 o acoplarse al mismo. La primera y la segunda fuente de luz 513 y 512 pueden emitir haces de luz con diferentes longitudes de onda.
Para reducir la interferencia entre la energía residual del primero y el segundo haz de luz, el primer detector 401 puede medir la energía residual del primer haz de luz cuando la segunda fuente de luz 512 está apagada o medir la energía residual del segundo haz de luz cuando la primera fuente de luz 513 está apagada. La energía residual del primero y el segundo haz de luz puede incluir la energía del primer haz de luz que pasa a través del primer filtro dicroico 519 y la energía del segundo haz de luz reflejada por el primer filtro dicroico 519.
En algunas realizaciones, el conjunto de control 522 puede incluir un circuito de retroalimentación para aumentar la energía de la fuente de luz cuando la energía residual de la fuente de luz cae por debajo de un cierto nivel o para disminuir la energía de la fuente de luz cuando la energía residual de la fuente de luz aumenta por encima de cierto nivel.
En algunas realizaciones, se puede aplicar un segundo detector 400 con el sistema de monitorización de energía 43 y colocarlo cerca o acoplado al segundo filtro dicroico 518 para medir la energía residual del segundo haz de luz aguas abajo del segundo filtro dicroico 518. La energía residual del segundo haz de luz aguas abajo del segundo filtro dicroico 518 puede incluir la energía del segundo haz de luz que pasa a través del segundo filtro dicroico 518. El segundo detector 400 también puede estar acoplado al circuito de control 522. Cuando el segundo detector 400 se aplica al sistema de monitorización de energía 43, es posible que el primer detector 401 sólo necesite monitorizar la energía residual del primer haz de luz.
En algunas realizaciones, una tercera fuente de luz 511 para emitir un tercer haz de luz y un tercer filtro dicroico 517 para reflejar la tercera luz también se pueden aplicar con el sistema de monitorización de energía 43. La tercera fuente de luz 511 también se puede acoplar al circuito de control 522. Como tal, el primer detector 401 puede medir la energía residual del primero, el segundo y el tercer haz de luz aguas abajo del primer filtro dicroico 519 sobre una base de multiplexación por división de tiempo.
En algunas realizaciones, el segundo detector 400 puede medir la energía residual del segundo y el tercer haz de luz aguas abajo del segundo filtro dicroico 518 sobre una base de multiplexación por división de tiempo. La energía residual del segundo y tercer haz de luz aguas abajo del segundo filtro dicroico 518 puede incluir la energía del segundo haz de
luz que pasa a través del segundo filtro dicroico 518 y la energía del tercer haz de luz reflejada por el segundo filtro dicroico 518.
En algunas realizaciones, un tercer detector (no mostrado en la FIG. 35) también puede aplicarse con el sistema de monitorización de energía 43 y colocarse cerca o acoplarse al tercer filtro dicroico 517 para medir la energía residual del tercer haz de luz aguas abajo del tercer filtro dicroico 517. El tercer detector también se puede acoplar al circuito de control 522. La energía residual del tercer haz de luz en la parte inferior del tercer filtro dicroico 517 puede incluir la energía del tercer haz de luz que pasa a través del tercer filtro dicroico 517.
El segundo haz de luz puede ser detectado por el primer detector 401 o el segundo detector 400. El tercer haz de luz puede ser detectado por el primer detector 401, el segundo detector 400 o el tercer detector que está colocado cerca o está acoplado al tercer filtro dicroico 517. El circuito de control 522 puede controlar el funcionamiento de los detectores y las fuentes de luz.
Los expertos en la materia deben entender que el filtro dicroico también puede ser reemplazado por un espejo dicroico o un divisor de haz. Cabe señalar también que los diversos aspectos de la presente descripción no se limitan a números específicos de fuentes de luz, filtros dicroicos y detectores.
Sistema óptico 44
La FIG. 36 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema óptico 44 según algunas realizaciones de la presente descripción. El sistema óptico 44 puede incluir un objetivo de microscopio compuesto 60, como se muestra en la FIG. 8, una fuente de luz 403 y un divisor de haz 402. La fuente de luz 403 puede emitir haces de luz para iluminar objetos en una zona de visualización, que está ubicada en un canal de flujo 604 dentro de una cubeta 603. El objetivo de microscopio compuesto 60 puede obtener imágenes de luz dispersada y fluorescente por los objetos en la zona de visualización en un plano 404 de imagen externo al objetivo del microscopio compuesto 60. La fuente de luz 403 y el plano de imagen 404 pueden estar ubicados en dos caras del divisor de haz 402.
El objetivo del microscopio compuesto 60 puede incluir un espejo cóncavo 601 y una placa correctora de aberraciones 602 acoplada a las dos caras de la cubeta 603. La placa correctora de aberraciones 602 puede ser una lente asférica que tiene una primera zona con energía óptica negativa y una segunda zona con energía óptica positiva radialmente dentro de la primera zona. Una zona neutra puede ser la porción más delgada de la placa correctora de aberraciones 602 y estar ubicada entre la primera zona y la segunda zona. La lente asférica puede ser una lente planoasférica. El espejo cóncavo puede ser un espejo de superficie trasera plano-cóncavo o un espejo de superficie frontal. El espejo cóncavo 604 y la placa correctora de aberraciones 602 pueden estar hechos de un material ópticamente transparente.
En la FIG. 36, el haz de luz que emite desde la fuente de luz 403 puede ser reflejado por el divisor de haz 402 y entrar en el objetivo del microscopio compuesto 60 para iluminar objetos en la zona de visualización. La luz dispersada y fluorescente por los objetos puede ser reflejada por el espejo cóncavo 604, transmitida a través de la placa correctora de aberraciones 602 y el divisor de haz 402, y formar una imagen en el plano de imagen 404 externo al objetivo del microscopio compuesto 60. La fuente de luz 403 puede incluir múltiples diodos láser 403a, 403b y 403c que emiten múltiples haces de luz con diferentes longitudes de onda para iluminar objetos en múltiples ubicaciones en el canal de flujo 604. Por consiguiente, pueden formarse múltiples imágenes 404a, 404b, 404c en el plano de imagen 404.
En algunas realizaciones, las ubicaciones de la fuente de luz 403 y el plano de imagen 404 pueden intercambiarse. Por consiguiente, el haz de luz que se emite desde la fuente de luz 403 puede transmitirse a través del divisor de haz 402 y entrar en el objetivo del microscopio compuesto 60 para iluminar objetos en la zona de visualización. La luz dispersada y fluorescente por los objetos puede ser reflejada por el espejo cóncavo 604, transmitida a través de la placa correctora de aberraciones.
602, reflejada por el divisor de haz 402 y formar una imagen en el plano de imagen 404 externo al objetivo del microscopio compuesto 60.
En algunas realizaciones, la zona de visualización puede estar ubicada en una corriente de chorro o una superficie de un sustrato que contiene objetos (no se muestran en la FIG. 36). Los objetos pueden introducirse en la zona de visualización mediante un sistema fluídico, tal como un sistema fluídico mostrado en la FIG. 14 o 15.
En algunas realizaciones, la luz dispersada y fluorescente obtenida en el plano de imagen 404 puede ser recibida por una fibra (no mostrada en la FIG. 36) que transmite la luz a un fotodetector. La luz dispersada y fluorescente puede ser procesada por un multiplexor por división de longitud de onda (WDM) (no mostrado en la FIG. 36) antes de ser detectada por el fotodetector. El WDM puede configurarse como un WDM ilustrado en las FIG. 25, 25A y 25B. El fotodetector puede ser, entre otros, un fotodetector semiconductor, un contador de fotones de múltiples píxeles y un detector de nanotubos de carbono.
En algunas realizaciones, la fuente de luz 403 puede emitir luz coherente o luz incoherente. La fuente de luz 403 pueden ser diodos láser únicos o múltiples, diodos emisores de luz, dispositivos de iluminación que emiten un haz de luz o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, puede insertarse una lente de compensación cromática (no mostrada en la figura) entre el lugar 602 del corrector de aberraciones y el plano 404 de la imagen a fin de que sirva para reducir la aberración cromática residual.
Sistema de detección de pérdida de luz axial 45
La FIG. 37 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema 45 de detección de pérdida de luz axial según algunas realizaciones de la presente descripción. El sistema de detección de pérdida de luz axial 45 incluye un espejo cóncavo 406 para reflejar la luz que se propaga desde una zona de visualización y un detector 408 para medir la pérdida de luz axial producida por el objeto en la zona de visualización al detectar la luz reflejada por el espejo cóncavo 406. La luz reflejada por el espejo cóncavo 406 incluye luz dispersa hacia adelante (FSC) y luz restante del haz de luz que entra en la zona de visualización desde una fuente de luz 412 para irradiar el objeto en el mismo, que se denomina pérdida de luz axial (ALL, por su sigla en inglés). La pérdida de luz axial del haz de luz a lo largo de su dirección de propagación resulta del paso del objeto a través del haz de luz. El haz de luz es bloqueado o absorbido por el objeto.
El sistema de detección de pérdida de luz axial 45 utiliza el espejo cóncavo 406 para dirigir tanto el FSC como la luz restante al detector 408 con el fin de determinar el tamaño del objeto. El FSC y la luz restante pueden tener la misma longitud de onda y, por lo tanto, las señales de FSC y la luz restante detectadas por el detector 408 pueden ser proporcionales al cuadrado de la suma de sus campos eléctricos de la siguiente manera:
Efsc representa el campo eléctrico del FSC. Eall representa el campo eléctrico de la luz restante.
Por el contrario, un sistema de detección de ALL convencional descrito en la técnica anterior normalmente requiere un orificio colocado a lo largo de la trayectoria del haz de láser para bloquear el FSC con el fin de detectar la luz restante del haz de láser. En consecuencia, las señales de la luz restante detectadas por un detector ALL son proporcionales al cuadrado de su campo eléctrico de la siguiente manera:
Además, un sistema de detección con FSC convencional descrito en la técnica anterior normalmente requiere una máscara colocada a lo largo de la trayectoria del haz de láser para bloquear la luz restante del haz de láser con el fin de detectar el FSC. En consecuencia, las señales de luz del FSC detectadas por un detector de FSC son proporcionales al cuadrado de su campo eléctrico, como se indica a continuación:
Aparentemente, ni el sistema de detección ALL convencional ni el sistema de detección con FSC convencional podrían funcionar sin usar un orificio o una máscara.
En algunas realizaciones, el espejo cóncavo 406 puede ser un espejo elipsoidal o una combinación de un espejo plano y una lente. El detector 408 es un detector de pérdida de luz axial para determinar el tamaño del objeto.
En algunas realizaciones, el detector 408 está en modo heterodino detectando la interferencia coherente del FSC y la luz restante. Las longitudes de onda del FSC y la luz restante pueden ser las mismas.
En algunas realizaciones, se puede usar una fuente de luz 412 que emite un haz de luz para iluminar el objeto en la zona de visualización. El eje óptico del haz de luz es sustancialmente perpendicular a la dirección de flujo del objeto.
En algunas realizaciones, se pueden usar múltiples fuentes de luz 412 que emiten haces de luz con diferentes longitudes de onda para iluminar los objetos en la zona de visualización. Cuando se aplican múltiples fuentes de luz 412 al sistema de detección de pérdida de luz axial 45, se puede colocar un filtro 407 aguas arriba del detector 408 para separar la luz irradiada por la primera fuente de luz y reflejada por el espejo cóncavo 406 y la luz irradiada por la segunda fuente de luz y reflejada por el espejo cóncavo 406. Como tal, el detector 408 puede medirlos por separado, por ejemplo, sobre una base de multiplexación por división de tiempo.
En algunas realizaciones, la zona de visualización puede estar ubicada dentro de un objetivo 410 de microscopio. La zona de visualización puede estar ubicada en un canal de flujo 409, una corriente de chorro o un sustrato. En algunas realizaciones, se puede acoplar una lente cilíndrica 411 al objetivo 410 del microscopio para enfocar los haces de luz emitidos desde la fuente de luz 412 a la zona de visualización. El eje óptico de la lente cilíndrica 411 es sustancialmente perpendicular al eje óptico de la luz reflejada por el espejo cóncavo 406.
La FIG. 38 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un sistema de detección de pérdida de luz axial 45 con un segundo sistema de detección de luz 413 solidario según algunas realizaciones de la presente descripción. El sistema 45 de detección de pérdida de luz axial puede utilizar un objetivo de microscopio compuesto 60, como se ilustra en la FIG. 8. El objetivo del microscopio compuesto 60 puede incluir un segundo espejo cóncavo 415 y una placa correctora de aberraciones 414 ubicada en dos caras de la zona de visualización del objetivo del microscopio compuesto 60. Los ejes ópticos del segundo espejo cóncavo 415 y la placa correctora de aberraciones 414 son sustancialmente paralelos al eje óptico de la luz reflejada por el espejo cóncavo 406. El FSC y la luz restante que se propaga desde la zona de visualización pueden ser reflejados por el espejo cóncavo 406 y detectados por el detector 408, mientras que la luz fluorescente de dispersión lateral es reflejada por el segundo espejo cóncavo 415, propagarse fuera del objetivo del microscopio compuesto 60 a través de la placa correctora de aberraciones 414, y ser detectados por el segundo sistema 413 de detección de luz.
En algunas realizaciones, uno o más circuitos de control pueden tener uno o más del detector 408, el segundo sistema de detección de luz 413 y la fuente de luz 412 solidarios para procesar las señales de luz detectadas. Como sabe un experto en la materia, el circuito de control puede incluir un amplificador para amplificar las señales de luz detectadas, un filtro de ruido para reducir la interferencia de ruido y un procesador para procesar las señales de luz detectadas y generar la información correspondiente con respecto a las propiedades del objeto.
Objetivo de m icroscopio combinado alternativo
Las FIG. 11, 12 y 13 ilustran la construcción de un objetivo de microscopio compuesto 60 adaptado para formar imágenes de luz dispersada y fluorescente por un objeto presente dentro de una zona de visualización. El objetivo de microscopio compuesto ilustrado comprende una zona de visualización, una disposición de espejo cóncavo 601,610, 617, un área de salida y una disposición de formación de haz de iluminación 505, como se ilustra en la FIG. 8A. Cabe señalar que, en las figuras 11, 12 y 13, no se ilustra la disposición de formación de haces. La zona de visualización de la Fig. 11 puede estar ubicada, por ejemplo, en un canal 604 de una cubeta 603. En la FIG. 12, la zona de visualización puede estar ubicada, por ejemplo, a lo largo de las gotitas de la corriente de chorro 519 que sale de la boquilla 518. En la FIG. 13, la zona de visualización puede estar ubicada, por ejemplo, en el plano del sustrato. El área de salida del objetivo del microscopio es un área a través de la cual pasa la luz dispersa y la luz fluorescente que incide en un objeto presente en la zona de visualización, cuya luz dispersa y fluorescente es reflejada por el espejo cóncavo del objetivo del microscopio. La placa correctora de aberraciones 602 de la FIG. 11, 612 en la FIG. 12 y 618 en la FIG. 13 puede estar ubicada en el área de salida. Cabe señalar que la placa correctora se puede utilizar, en particular, en combinación con un espejo esférico 601, 610, 617. Sin embargo, la placa correctora puede omitirse cuando se utiliza un espejo cóncavo que ya implementa una forma de corrección. Por consiguiente, el área de salida no tiene que incluir un corrector, si un espejo cóncavo tiene una forma adecuada y no se requiere la ganancia de la placa correctora. Como se puede ver en las f Ig . 11, 12 y 13, la zona de visualización está dispuesta entre la disposición de espejo cóncavo y el área de salida. El espejo cóncavo 601, 610, 617 está dispuesto para reflejar la luz fluorescente y dispersa que incide desde un objeto presente en la zona de visualización hacia el área de salida. La disposición de formación de haz de iluminación 505 se ilustra, por ejemplo, en la FIG. 8A. La FIG. 8A ilustra una disposición de la FIG. 11 que tiene una disposición de haz de iluminación 505 adjunta a la cubeta 603. La disposición de haz de iluminación 505 está dispuesta de manera que un haz de iluminación que entra en la disposición de formación de haz de iluminación se forma de manera previa y definitiva en la zona de visualización. Una trayectoria de un haz de iluminación procedente de un sistema de iluminación se puede ver, por ejemplo, en las FIG. 1 o 3A. Las FIG. 11, 12 y 13, así como la FIG. 8A, ilustran el hecho de que la disposición cóncava del espejo, la zona de visualización y el área de salida están dispuestas a lo largo de un primer eje, también denominado eje x. La FIG. 9A ilustra el hecho de que una imagen óptica de la zona de visualización, por ejemplo, dentro del canal 604 en la FIG. 9A se forma fuera del objetivo del microscopio compuesto en el plano de imagen 605 con las ubicaciones de imagen 606, 607 y 608. La disposición de formación de haz de iluminación 505 está dispuesta de modo que un haz de iluminación incida en la zona de visualización a lo largo de un segundo eje, también denominado eje z, que es sustancialmente perpendicular a dicho eje x. La cubeta 603 descrita anteriormente puede fabricarse de un material óptico transparente, donde la zona de visualización se forma en la cubeta, en particular en el canal 604 de la cubeta 603. El canal se extiende a lo largo de un tercer eje, también denominado eje y, que es sustancialmente perpendicular al eje x y al eje z, de modo que un flujo de líquido en el canal fluye a lo largo del eje y, como se ilustra, por ejemplo, en la FIG. 5d , donde la zona de visualización está ubicada dentro del canal. Las FIG. 8 y 8A ilustran el hecho de que la cubeta 603 puede ser de sección transversal rectangular en un plano del primer eje/eje x y segundo eje/eje z. Cabe señalar que la sección transversal de la cubeta 603 también puede tener una forma en la que un flujo de vaina que cubre el flujo de la muestra fuerza el flujo de la muestra a una sección transversal rectangular. La sección transversal del canal 604 puede ser constante a lo largo del eje y, pero también puede variar a lo largo del eje y. En particular, el canal puede tener una sección transversal enfocada en el área de la zona de visualización. El área de visualización puede incluir una pluralidad de puntos de visualización predefinidos distribuidos a lo largo del eje y para diferentes longitudes de onda de iluminación, como se puede ver en la FIG. 33, o a lo largo del eje z, que puede ser un punto focal variable que varía a lo largo del eje z, cuando se ajusta el objetivo 60 con respecto al sistema de iluminación 50, como se describirá más adelante. Aunque el elemento 505 puede asignarse al sistema de iluminación 50, el elemento 505 también puede ser parte del objetivo 60, en particular puede estar unido a la cubeta 603. La disposición de formación del haz de iluminación 505 está adaptada para comprimir un haz de iluminación, de modo que el haz de iluminación en la zona de visualización tenga una dimensión comprimida a lo largo del eje y. La disposición de formación del haz de iluminación 505 puede ser una lente cilíndrica, en particular con un eje cilíndrico paralelo al eje x, como se puede ver en las FIG. 5D y 5E. Debe observarse que la disposición de formación del haz de
iluminación puede ensamblarse mediante una pluralidad de elementos ópticos, de modo que la disposición 505 puede no tener un eje definido. La disposición correctora de aberraciones 602, 612, 618 puede estar dispuesta en el área de salida, como se puede ver en las FIG. 11, 12 y 13. La disposición correctora de aberraciones puede ser una lente asférica hecha de material ópticamente transparente. Como se puede ver en la FIG. 9A, dicha disposición correctora de aberraciones puede tener una primera zona con energía óptica negativa, una segunda zona radialmente dentro de la primera zona con energía óptica positiva y una zona neutra entre la primera zona y la segunda zona. La zona neutra de la FIG. 9A es más delgada que cada una de la primera zona y la segunda zona, de modo que la luz reflejada desde la disposición de espejo cóncavo que pasa a través de dicha disposición correctora de aberraciones forma un área focal. Aunque la FIG. 9A ilustra una placa correctora con porciones convexas y cóncavas, cabe señalar que la energía óptica positiva y negativa se puede lograr utilizando diferentes materiales ópticos en diferentes ubicaciones de la placa correctora. La disposición 601 de espejo cóncavo, la zona de visualización y la disposición 602 correctora de aberraciones forman una cámara de Schmidt invertida. La disposición cóncava del espejo puede estar formada por una lente plano-convexa, como se puede ver en la FIG. 11. El espejo cóncavo puede ser un espejo de superficie trasera plano-cóncavo. El espejo de la superficie trasera plano-cóncavo puede estar hecho de un material ópticamente transparente. Como se puede ver en la FIG. 8A, una superficie plana de dicho espejo de superficie trasera plano-cóncavo está acoplado ópticamente a una superficie plana de dicha cubeta. Espejo de superficie trasera plano-cóncavo significa que, aunque el cuerpo de la lente óptica es un cuerpo de lente plano-convexo, la superficie, cuando se ve en el espejo, que es el interior del cuerpo óptico, es cóncava. La superficie plana de dicho espejo de la superficie trasera plano-cóncavo también puede acoplarse ópticamente a dicho sustrato transparente plano, como se puede ver en la FIG. 13. Dicho espejo cóncavo también puede ser un espejo de superficie frontal, como se puede ver en la FIG. 12. Cabe señalar que el espejo de la FIG. 12 también se puede usar en combinación con una cubeta, y el espejo de la FIG. 11 también se puede utilizar para una corriente de chorro. La disposición de espejo cóncavo, la disposición correctora de aberraciones y la disposición de formación del haz de iluminación pueden unirse a la cubeta mediante al menos uno de entre un gel de coincidencia de índice, un fluido de coincidencia de índice, un material adhesivo óptico y una unión por contacto óptico. Cabe señalar que también se puede usar una combinación para unir.
Como se puede ver en las FIG. 1, 3A, 31, 32 o 34 a 38, el objetivo de microscopio compuesto 60 puede combinarse con o comprender un sistema de iluminación. Aunque no es obligatorio, la iluminación puede ser un sistema de iluminación como se describe anteriormente, en particular con una fuente de láser 501, una disposición óptica de colimación 502 para formar un haz de láser colimado y una disposición de conformación de haz 504, 505 adaptada para dar forma a un haz colimado, donde la disposición de formación de haz incluye la disposición de formación de haz de iluminación 505. La fuente de láser puede ser un diodo láser y la disposición de colimación puede disponerse con respecto al diodo láser para formar un haz colimado. Como alternativa, la fuente de láser puede ser un láser convencional con una disposición óptica para formar un haz colimado de una sección transversal deseada. El diodo láser y la disposición óptica de colimación, o alternativamente el láser convencional con la óptica, están adaptados para formar un haz que tiene una sección transversal elíptica que tiene un eje mayor y un eje menor, donde el eje menor está orientado sustancialmente a lo largo del eje y, y el eje mayor está orientado sustancialmente a lo largo del eje x, como se puede ver en la FIG. 5E. La disposición de conformación de haz puede incluir una disposición 504 de compresión de haz óptico de eje mayor que está adaptada para comprimir al menos el eje mayor del haz elíptico colimado. La disposición de formación del haz de iluminación 505 está adaptada para comprimir al menos el eje menor del haz elíptico colimado. Esto se puede ver, por ejemplo, en las FIG. 1, 3A o 6.
La zona de visualización puede moverse a lo largo del eje z con respecto al sistema de iluminación para variar el enfoque del haz elíptico comprimido dentro de la zona de visualización a lo largo del eje z. Esto permite un escaneo a lo largo del eje z. En particular, esto permite detectar o escanear las propiedades de una célula en la zona de visualización en diferentes ubicaciones. Debe entenderse que el objetivo 60, el sistema de iluminación 50 o ambos pueden moverse de manera controlable. También debe entenderse que la variación del enfoque también se puede lograr moviendo componentes individuales del sistema de iluminación, por ejemplo, uno de los espejos 523b, 523a o el elemento 504, como se ilustra en la FIG. 7. También se pueden mover componentes individuales del objetivo para variar el enfoque a lo largo del eje z. La actuación puede realizarse, por ejemplo, mediante actuadores piezoeléctricos o actuadores acústicos. En particular, el enfoque variable se puede lograr mediante una modulación o una oscilación sinusoidal del componente respectivo. Por consiguiente, la cubeta se puede mover con respecto a la fuente de láser para variar espacialmente un foco de la fuente de láser en el canal. A este fin, se puede proporcionar un conjunto de control adaptado para controlar el movimiento de componentes del objetivo de microscopio compuesto a lo largo del eje z para variar espacialmente un foco de la fuente láser en el canal. Cabe señalar que también se puede lograr una variación del enfoque a lo largo del eje y o incluso del eje x.
Multiplexor por división de longitud de onda (WDM) combinado con un fotodetector de semiconductores
Las FIG. 25, 27 y 28 ilustran un multiplexor por división de longitud de onda (WDM) para separar la luz emitida desde una fuente de luz en múltiples bandas de colores. El multiplexor por división de longitud de onda puede comprender una disposición óptica de formación de imágenes 902, una disposición de filtro dicroico 903, 904, un fotodetector de semiconductor 906 y una disposición óptica de enfoque 905. La disposición óptica de formación de imágenes 902 forma un haz de luz a partir de la luz emitida desde una fuente de luz 901 y produce una imagen sustancialmente del mismo tamaño que el tamaño efectivo de dicha disposición óptica de formación de imágenes. La fuente de luz puede ser una salida de una fibra óptica, fibra que puede transferir la luz detectada desde el objetivo del microscopio 60 al WDM. La
disposición de filtro dicroico 903, 904 puede estar ubicada entre dicha disposición óptica de formación de imágenes 902 y dicha imagen, y separa el haz de luz en una primera rama y una segunda rama de colores distintivos. Como se puede ver en la FIG. 25, la primera rama se desplaza hacia el elemento 905, mientras que la segunda rama se desplaza hacia el elemento 907. El fotodetector de semiconductor 906 está ubicado en la primera rama detrás de la disposición óptica de enfoque 905, que está ubicada entre la disposición de filtro dicroico 903, 904 y el fotodetector de semiconductor 906 para enfocar el haz de luz sobre el fotodetector de semiconductor. Luz significa una onda electromagnética, coherente o no coherente, particularmente con una longitud de onda que transita por los elementos ópticos utilizados. En particular, el término luz no se limita a la parte visible de la luz, por ejemplo, luz entre 380 nm y 780 nm. Cabe señalar que también se pueden usar luz infrarroja y luz ultravioleta, si los componentes ópticos usados son capaces de funcionar con tales longitudes de onda. La disposición de elemento óptico de enfoque 905 está ubicada en o cerca de un plano de imagen de dicha imagen. Cabe señalar que la disposición de formación de imágenes 902 así como la disposición de enfoque 905 pueden estar compuestas por más de un elemento óptico. En particular, se puede combinar una pluralidad de lentes para formar la disposición de formación de imágenes 902 o la disposición de enfoque 905. Asimismo, los filtros dicóticos pueden estar compuestos por más de un filtro o elemento óptico. En particular para componer propiedades particulares de las respectivas disposiciones. La disposición óptica de enfoque y el fotosensor semiconductor pueden disponerse entre sí de manera que el haz de luz se enfoque en un punto que tenga un diámetro de menos de 1,0 mm, particularmente de menos de 0,6 mm. En particular, cuando se utilizan sensores semiconductores, la relación señal/ruido SNR puede reducirse significativamente. Como se puede ver en la FIG. 25, el multiplexor por división de longitud de onda descrito anteriormente puede comprender además una disposición 907 óptica de retransmisión de imágenes. Esta disposición óptica de retransmisión de imágenes puede estar ubicada en o cerca de un plano de imagen producido por dicha disposición óptica de formación de imágenes en la segunda rama, donde dicha disposición óptica de retransmisión de imágenes está adaptada para producir una imagen de dicha disposición óptica de formación de imágenes en una tercera rama que tiene sustancialmente del mismo tamaño que la imagen de la segunda rama. La tercera rama de la FIG. 25 es el haz que viaja desde el elemento 907 hacia el elemento 909. El tamaño efectivo del elemento óptico es el área donde los haces del objeto transitan por el elemento óptico. En consecuencia, producir una imagen sustancialmente del mismo tamaño que el tamaño efectivo de dicho elemento óptico significa que entre el elemento óptico y la imagen el haz está dentro de un tubo virtual paralelo. Con fines ilustrativos, en el caso hipotético del objeto es un orificio de alfiler, el elemento óptico produce un haz colimado. La disposición óptica de retransmisión de imágenes 907 puede ser un espejo cóncavo. Alternativamente, la disposición óptica de retransmisión de imágenes 907 puede ser una combinación de una lente y un espejo, en particular un espejo plano. El multiplexor por división de longitud de onda descrito anteriormente puede comprender además una disposición de filtro dicroico adicional 909, donde la disposición de filtro dicroico adicional está ubicada entre dicha disposición 907 óptica de retransmisión de imagen y una imagen producida por dicha disposición 907 óptica de retransmisión de imagen. Dicha disposición de filtro dicroico adicional 909 de la tercera rama produce una cuarta rama y una quinta rama del haz de luz que tiene colores distintivos. La cuarta rama de la FIG. 25 es el haz que viaja desde el filtro dicroico 909 hacia el elemento de enfoque 908, mientras que la quinta rama es el haz que viaja desde el filtro dicroico hacia el elemento 910. El multiplexor por división de longitud de onda descrito anteriormente puede comprender además una disposición óptica de enfoque adicional 908 y un fotodetector de semiconductor adicional, donde la disposición óptica de enfoque adicional 908 está ubicada en la cuarta rama y enfoca el haz de luz en la cuarta rama para enfocar el haz de luz sobre el fotodetector semiconductor adicional. El multiplexor por división de longitud de onda puede comprender además una pluralidad de disposiciones ópticas de retransmisión de imágenes 910, 911, 912, 913, una pluralidad de disposiciones de filtros dicroicos 914, 915, 916, 917, una pluralidad de fotodetectores semiconductores y una pluralidad de disposiciones ópticas de enfoque 918 , 919, 920, 921, donde cada una de la pluralidad de disposiciones ópticas de enfoque está dispuesta entre una respectiva de la pluralidad de disposiciones de filtros dicroicos y una respectiva de la pluralidad de fotodetectores de semiconductores para formar una disposición en cascada, como se puede ver en la FIG.
25. Los puntos enfocados adicionales pueden tener un diámetro de menos de 1.0 mm, particularmente de menos de 0.6 mm para múltiples bandas coloreadas de dicho haz de luz. La pluralidad de disposiciones de filtros dicroicos está dispuesta en un plano común, como se puede ver en la FIG. 25A. El multiplexor por división de longitud de onda puede comprender además una base óptica en planta paralela que tiene una primera superficie y una segunda superficie paralelas a la misma, en la que la pluralidad de disposiciones de filtros dicroicos están dispuestas paralelas, preferiblemente en apoyo a la primera superficie de la base óptica en planta paralela, como se ha descrito en relación con el WDM 90. Las disposiciones de los filtros dicroicos se ensamblan usando una plantilla que incluye dos placas de vidrio ópticamente planas unidas entre sí en contacto óptico, donde las disposiciones de los filtros dicroicos se unen a un portafiltros usando la plantilla de manera que una superficie de filtro revestida de las disposiciones de los filtros dicroicos tenga una hendidura y quede ópticamente paralela a una superficie de referencia del portafiltros, como se puede ver en las FIG. 29A, B y C. La superficie de referencia del portafiltros descansa contra una superficie ópticamente plana de un bloque de referencia incluido en el multiplexor de división de longitud de onda proporcionando alineación al instalar las disposiciones de filtro dicroico en el multiplexor de división de longitud de onda. Las respectivas disposiciones ópticas de retransmisión de imágenes pueden formarse en la segunda superficie de la base óptica en planta paralela, como se puede ver en la FIG. 25A. Al menos uno de los fotodetectores de semiconductores es un fotodetector de avalanchas. Como alternativa o adicionalmente, al menos uno de los fotodetectores de semiconductores es un detector de nanotubos de carbono.
Aplicabilidad industrial
Aunque se ha descrito con cierto detalle una realización de la presente descripción de un sistema óptico basado en LD para aplicación de citometría de flujo, y también se han descrito realizaciones igualmente ventajosas para un instrumento de citometría de flujo basado en corriente, resultará evidente para los expertos en la materia que son posibles muchas
modificaciones y variaciones de la realización descrita a la luz de las enseñanzas anteriores sin apartarse de los principios y conceptos de la descripción tal como se establece en las reivindicaciones.
Aunque se ha descrito con cierto detalle una realización de la presente descripción del dispositivo de multiplexación por división de longitud de onda para separar el haz de luz de una fuente de luz extendida en múltiples bandas de color, y también se han descrito varias otras realizaciones igualmente ventajosas, resultará evidente para los expertos en la materia que son posibles muchas modificaciones y variaciones de las realizaciones descritas a la luz de las enseñanzas anteriores sin apartarse de los principios y conceptos de la descripción como se establece en las reivindicaciones.
Aunque la presente descripción describe ciertas realizaciones ejemplares, debe entenderse que dicha descripción es puramente ilustrativa y no debe interpretarse como limitante.
Claims (13)
1. Un sistema de detección de luz que comprende:
una célula de flujo (60) a través de la cual una corriente de líquido transporta y alinea hidrodinámicamente las células o partículas para que pasen en una sola fila a través de una zona de visualización de la célula de flujo;
un espejo cóncavo (406) para reflejar la luz que se propaga desde la zona de visualización; y caracterizado porque el sistema comprende
un detector (408) para medir la pérdida de luz axial producida por una célula o partícula en la zona de visualización al detectar la luz reflejada por el espejo cóncavo,
donde el espejo cóncavo está configurado para dirigir tanto la luz dispersa hacia adelante como la luz restante de un haz de iluminación que pasa a través de la célula o partícula en la zona de visualización hacia el detector para determinar el tamaño de la célula o partícula en la zona de visualización,
donde el detector está en modo heterodino midiendo la interferencia coherente de la luz dispersada hacia adelante y la luz restante,
donde el espejo cóncavo y el detector están dispuestos de manera que se produzca un patrón de interferencia de la luz dispersa hacia adelante y la luz restante en la parte relevante del detector.
2. El sistema de detección de luz de la reivindicación 1, donde el detector (408) es un detector de pérdida de luz axial para medir la pérdida de luz axial producida por la célula o partícula en la zona de visualización con el fin de determinar el tamaño de la célula o partícula en la zona de visualización.
3. El sistema de detección de luz de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que comprende además una primera fuente de luz (412) que emite un primer haz de luz para irradiar la célula o partícula en la zona de visualización, donde el primer haz de luz tiene un eje de irradiación que es sustancialmente perpendicular a la dirección del flujo de la célula o partícula en la zona de visualización.
4. El sistema de detección de luz de la reivindicación 3, donde la pérdida de luz axial del primer haz de luz resulta de la célula o partícula en la zona de visualización que pasa a través del primer haz de luz, y donde el eje óptico de la luz restante es sustancialmente paralelo al eje de irradiación.
5. El sistema de detección de luz de la reivindicación 4, donde la luz dispersa hacia adelante y la luz restante tienen la misma longitud de onda.
6. El sistema de detección de luz de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una segunda fuente de luz (413) que emite un segundo haz de luz para irradiar la célula o partícula en la zona de visualización, donde la longitud de onda del segundo haz de luz es diferente de la longitud de onda del primer haz de luz.
7. El sistema de detección de luz de la reivindicación 6, que comprende además un filtro (407) aguas arriba del detector (45) para separar la luz irradiada por la primera fuente de luz (412) y reflejada por el espejo cóncavo (406) de la luz irradiada por la segunda fuente de luz (413) y reflejada por el espejo cóncavo (406) para que el detector las mida por separado.
8. El sistema de detección de luz de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la zona de visualización está ubicada dentro de un objetivo de microscopio.
9. El sistema de detección de luz de la reivindicación 8, que comprende además una lente cilíndrica (411) con un objetivo de microscopio solidario, donde el eje óptico de la lente cilíndrica es sustancialmente perpendicular al eje óptico de la luz reflejada por el espejo cóncavo.
10. El sistema de detección de luz de cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9, que comprende además un segundo espejo cóncavo (415) y una placa correctora de aberraciones (414) ubicada en dos caras de la zona de visualización del objetivo del microscopio, donde los ejes ópticos del segundo espejo cóncavo y la placa correctora de aberraciones son sustancialmente paralelos al eje óptico de la luz reflejada por el espejo cóncavo.
11. El sistema de detección de luz de la reivindicación 10, donde la luz dispersada lateralmente desde la célula o partícula en la zona de visualización y fluorescente gracias a dicha célula o partícula es reflejada por el segundo espejo cóncavo (415) y se propaga fuera del objetivo del microscopio a través de la placa correctora de aberraciones (414), donde la placa correctora de aberraciones es una lente asférica que tiene una primera zona con energía óptica negativa y una segunda zona con energía óptica positiva radialmente dentro de la primera zona.
12. El sistema de detección de luz de la reivindicación 11, que comprende además un segundo sistema de detección de luz para detectar y procesar la luz dispersada por una cara y fluorescente por la célula o partícula en la zona de visualización del objetivo del microscopio.
13. El sistema de detección de luz de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el espejo cóncavo (406) es un espejo elipsoidal.
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