ES2900425T3 - Métodos de inactivación vírica en columna - Google Patents

Abstract

Un método de inactivación de virus presente durante la producción de un polipéptido de interés, que comprende: (a) unir el polipéptido a una matriz de cromatografía de afinidad o una matriz de cromatografía de modo mixto, y (b) realizar una etapa de inactivación vírica lavando la matriz de cromatografía unida al polipéptido con una solución de lavado a pH de menos de aproximadamente 4,0, en el que la solución de lavado comprende una concentración suficiente de una sal para reducir sustancialmente la elución del polipéptido durante la etapa de inactivación vírica, en el que la concentración de la sal es de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 4,0 M.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de inactivación vírica en columna

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de inactivación de virus que está presente durante la producción de un polipéptido de interés. En particular, la presente invención se refiere a un método de inactivación vírica en columna usando una solución de lavado de bajo pH y alta salinidad que inactiva eficazmente virus con pérdida mínima en recuperación del polipéptido.

Antecedentes técnicos

Con la llegada de la tecnología de proteínas recombinantes, puede producirse una proteína de interés usando líneas celulares cultivadas manipuladas para expresar la proteína. El uso de la proteína recombinante deseada para aplicaciones farmacéuticas, sin embargo, en general está supeditado a la capacidad de recuperar de forma fiable niveles adecuados de la proteína de las impurezas tales como proteínas de la célula hospedadora, aditivos de cultivo celular y virus. Se han empleado diversos métodos de cromatografía para retirar las impurezas y para recuperar la proteína.

Se conocen en la técnica varios métodos para inactivar virus basados en diferentes mecanismos. Cada método, sin embargo, tiene sus propias desventajas, y puede no ser adecuado u óptimo para algunos productos proteínicos. Por ejemplo, cuando se usa bajo pH para inactivar virus, tiene el potencial de precipitar proteínas, provocar agregación del producto y/o alterar la conformación de determinadas proteínas, lo que puede dar lugar a pérdida de producto. Además, durante el proceso de purificación de la proteína, la etapa de inactivación vírica a bajo pH se realiza típicamente después de que la proteína de interés haya eluido de la columna de cromatografía y se haya mantenido en un depósito o recipiente, especialmente si la pérdida de producto significativa puede estar provocada por lavado a bajo pH. Añadir una etapa adicional en un depósito o recipiente para inactivar virus es un motivo de molestia.

Por lo tanto, hay necesidades de desarrollar etapas de inactivación vírica en columna que puedan inactivar eficazmente virus y al mismo tiempo puedan mejorar el rendimiento del producto de una manera conveniente.

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método de inactivación de virus que está presente durante la producción de un polipéptido de interés, que comprende: (a) unir el polipéptido a una matriz de cromatografía, y (b) realizar una etapa de inactivación de virus lavando la matriz de cromatografía unida al polipéptido con una solución de lavado a un pH menor de aproximadamente 4,0, en el que la solución de lavado comprende una concentración suficiente de sal para reducir sustancialmente la elución del polipéptido durante la etapa de inactivación vírica, siendo dicha concentración de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 4,0 M. Las realizaciones que forman parte del alcance de la invención se describen en las reivindicaciones. Cualquier otra realización analizada en la descripción es por referencia únicamente.

En determinadas realizaciones, la matriz de cromatografía es una matriz de cromatografía de afinidad. En determinadas realizaciones, la matriz de cromatografía de afinidad es una columna de proteína A. En determinadas realizaciones, la columna de proteína A se selecciona del grupo que consiste en MABSELECT™, MABSELECT™ SuRe, MABSELECT™ SuRe LX, ESHMUNO® A, AMSPHERE™ JWT203, TOYOPEARL® AF-rProtein A-650F, PROSEP®-vA Ultra, PROSEP® Ultra Plus y PROSEP®-vA High Capacity, y cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el ligando de proteína A se inmoviliza en una matriz seleccionada del grupo que consiste en matriz basada en dextrano, matriz basada en agarosa, matriz basada en poliestireno, matriz hidrófila basada en polivinil etilo, matriz rígida basada en polimetacrilato, matriz porosa basada en polímero, matriz de poro controlado basada en vidrio y cualquier combinación de las mismas.

En determinadas realizaciones, la matriz de cromatografía es una matriz de cromatografía de modo mixto. En determinadas realizaciones, la matriz de cromatografía es una matriz de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto. En determinadas realizaciones, la matriz de cromatografía de modo mixto se selecciona del grupo que consiste en CAPTO™ Adhere, CAPTO™ MMC, ESHMUNO® HCX, CAPTO™ MMC ImpRes, CAPTO™ Blue, NUVIA™ cPrime, BLUE SEPHAROSE® Fast Flow, CAPTO™ Adhere ImpRes, CHT™ Ceramic Hydroxyapatite, CFT™ Ceramic Fluoroapatite y cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la matriz de cromatografía de modo mixto se selecciona del grupo que consiste en matriz basada en dextrano, matriz basada en agarosa, matriz basada en poliestireno, matriz hidrófila basada en polímero de polivinil etilo, matriz macroporosa basada en polímero altamente reticulado, matriz basada en hidroxiapatita ((Ca5(PO4)3OH)2), matriz basada en fluoroapatita ((Ca5(PO4)3F)2) y cualquier combinación de las mismas.

En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés es un polipéptido que contiene CH2/CH3. En determinadas realizaciones, el polipéptido que contiene CH2/CH3 es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés comprende un factor de coagulación. También se divulga FIX-Fc, FVIII-Fc o FVII-Fc. En determinadas realizaciones divulgadas, el polipéptido es un híbrido de monómero-dímero. En determinadas realizaciones divulgadas, el polipéptido comprende además un resto heterólogo. En una realización, el resto heterólogo se selecciona del grupo que consiste en albúmina, polipéptido de unión a albúmina, Fc, PAS, el péptido C terminal (CTP) de la subunidad p de gonadotropina coriónica humana, polietilenglicol (PEG), hidroxietilalmidón (HES), moléculas pequeñas de unión a albúmina y cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés se produce de forma recombinante en un cultivo celular. En determinadas realizaciones, el cultivo celular es un cultivo de células humanas. En una realización, el cultivo de células humanas es células de riñón embrionario humano (HEK) 293.

En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés se recoge después de producción recombinante en el cultivo celular. En determinadas realizaciones, el polipéptido se une a la matriz de cromatografía a un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0.

En determinadas realizaciones, la elución del polipéptido durante la etapa de inactivación vírica se reduce hasta menos de un 30 %. En determinadas realizaciones, la elución del polipéptido durante la etapa de inactivación vírica se reduce hasta menos de un 25 %, menos de un 20 %, menos de un 15 %, menos de un 10 % o menos de un 5 %.

En determinadas realizaciones, el pH de la solución de lavado es de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0. En otras realizaciones, el pH de la solución de lavado es de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,0, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 3,5 o de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 4,0. En determinadas realizaciones, el pH de la solución de lavado es aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,9, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9 o aproximadamente 4,0.

En determinadas realizaciones, la concentración de la sal en la solución de lavado es de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 2,5 M, de aproximadamente 2,5 M a aproximadamente 3,0 M, de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 3,5 M o de aproximadamente 3,5 M a aproximadamente 4 M.

En determinadas realizaciones, la sal en la solución de lavado es una sal de sodio, una sal de potasio o una sal de amonio.

En determinadas realizaciones, la solución de lavado comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en un polímero, un disolvente orgánico, un detergente y arginina o un derivado de arginina. En determinadas realizaciones, el método comprende más de una etapa de inactivación vírica, en el que pueden usarse soluciones de lavado idénticas o diferentes. En determinadas realizaciones, al menos una de las soluciones de lavado comprende arginina, un derivado de arginina o una mezcla de los mismos. En determinadas realizaciones, al menos una de las soluciones de lavado comprende un detergente.

En determinadas realizaciones, el método comprende además eluir el polipéptido de la matriz de cromatografía con una solución de elución. En determinadas realizaciones, al menos aproximadamente un 70 % del polipéptido se recupera en la solución de elución. En determinadas realizaciones, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % del polipéptido se recupera en la solución de elución.

Breve descripción de los dibujos/figuras

Figura 1. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene sulfato de amonio 2 M a pH 3,5. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 2. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene arginina 1 M a pH 4,7. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 3. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene LDAO CMC 4x (o al 0,18 % p/p). UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 4. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene NaCl 2 M y PEG al 20 % a pH 3,0. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 5. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene NaCl 2 M y etanol al 2 % a pH 3,0. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 6. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene sulfato de amonio 2 M y etanol al 2 % a pH 3,0. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 7. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene sulfato de amonio 2 M y acetona al 2 % a pH 3,0. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 8. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene sulfato de amonio 2 M a pH 3,0. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 9. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene sulfato de amonio 2 M y TRITON™ X-100 al 2 % a pH 3,0. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 10. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de proteína A usando una solución de lavado que contiene NaCl 2 M a pH 3,0. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 11. El cromatograma que muestra la separación de proteínas en una columna de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto usando una solución de lavado que contiene sulfato de amonio 2 M a pH 3,5 y 4,0. UV²⁸⁰ indica la concentración de proteína en las fracciones recogidas.

Figura 12. La concentración de sulfato de amonio se redujo de 2 M a cero sobre un gradiente de 9 CV a pH 3,0 para determinar la concentración mínima de sulfato de amonio requerida para mantener el anticuerpo unido a la resina de proteína A a valores de bajo pH. Se requiere sulfato de amonio 1700 mM para mantener el anticuerpo unido a la resina a bajo pH.

Figura 13. Concentración de proteína, conductividad y pH frente a volúmenes de columna usando un lavado a pH 3,0 con sulfato de amonio 2 M, glicina 100 mM. El alto nivel de sulfato de amonio evitó la elución a bajo pH del anticuerpo, posibilitando potencialmente la inactivación vírica en columna.

Figura 14. Concentración de proteína, conductividad y pH frente a volúmenes de columna usando un lavado a pH 3,5 con sulfato de amonio 2 M, citrato 100 mM para mantener el anticuerpo unido a la resina de intercambio aniónico de modo mixto (Capto Adhere) a bajo pH.

Figura 15. Concentración de proteína, conductividad y pH frente a volúmenes de columna usando un lavado a pH 8,0 con sulfato de amonio 2 M, fosfato 50 mM para mantener el anticuerpo unido a la resina de intercambio catiónico de modo mixto (Capto MMC) a alto pH.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

Durante toda esta divulgación, el término "un/o" o "una" entidad se refiere a una o más de esta entidad; por ejemplo, se entiende que "un polipéptido" representa uno o más polipéptidos. Por tanto, las expresiones "un/o" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" pueden usarse indistintamente en este documento.

Además, "y/o" cuando se usa en este documento debe aceptarse como divulgación específica de cada uno de los dos elementos o componentes especificados con o sin el otro. Por tanto, el término "y/o" como se usa en una frase tal como "A y/o B" en este documento pretende incluir "A y B," "A o B," "A" (en solitario) y "B" (en solitario). Asimismo, el término "y/o" como se usa en una frase tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (en solitario); B (en solitario); y C (en solitario).

Como se usa en este documento, el término "aproximadamente" permite el grado de variación inherente en los métodos y en los instrumentos usados para medición o cuantificación. Por ejemplo, dependiendo del nivel de precisión de los instrumentos usados, el error típico basado en el número de muestras medidas y el error de redondeo, el término "aproximadamente" incluye, sin limitación, ± 10 %.

Se entiende que en cualquier parte que se describan aspectos en este documento con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos análogos de otro modo descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que se refiere esta divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3.a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta divulgación.

Las unidades, prefijos y símbolos se indican en la forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Salvo que se indique de otro modo, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amínica a carboxílica. Los encabezados proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos de la divulgación, que se puede obtener por referencia a la memoria descriptiva como un todo. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

El término "polipéptido", como se usa en este documento, se refiere a una cadena secuencial de aminoácidos unidos conjuntamente mediante enlaces peptídicos. El término se usa para hacer referencia a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud, pero un experto en la materia entenderá que el término no está limitado a cadenas largas y puede referirse a una cadena mínima que comprende dos aminoácidos unidos conjuntamente mediante un enlace peptídico. Si un solo polipéptido es la unidad de funcionamiento diferenciada y requiere asociación física permanente con otros polipéptidos para formar la unidad de funcionamiento diferenciada, los términos "polipéptido" y "proteína", como se usan en este documento, se usan indistintamente. Si la unidad funcional diferenciada está compuesta de más de un polipéptido que se asocia físicamente con otro, el término "proteína", como se usa en este documento, se refiere a los múltiples polipéptidos que se acoplan físicamente y funcionan conjuntamente como la unidad diferenciada. Por tanto, como se usa en este documento, un "péptido", un "fragmento peptídico", una "proteína", una "cadena de aminoácidos", una "secuencia de aminoácidos" o cualquier otro término usado para hacer referencia a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen genéricamente en la definición de un "polipéptido", incluso a aunque cada uno de estos términos pueda tener un significado más específico. El término "polipéptido" puede usarse en lugar de, o indistintamente con cualquiera de estos términos. El término incluye además polipéptidos que han experimentado modificaciones postraduccionales o posteriores a la síntesis, por ejemplo, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos que no son de origen natural.

"Polipéptido expresado de forma recombinante" y "polipéptido recombinante", como se usa en este documento, se refiere a un polipéptido expresado a partir de una célula hospedadora que se ha genomanipulado para que exprese ese polipéptido. El polipéptido expresado de forma recombinante puede ser idéntico o similar a polipéptidos que se expresan normalmente en la célula hospedadora. El polipéptido expresado de forma recombinante también puede ser exógeno a la célula hospedadora, es decir, heterólogo a los péptidos expresados normalmente en la célula hospedadora. Como alternativa, el polipéptido expresado de forma recombinante puede ser quimérico porque partes del polipéptido contienen secuencias de aminoácidos que son idénticas o similares a polipéptidos expresados normalmente en la célula hospedadora, mientras que otras partes son exógenas a la célula hospedadora. Las células hospedadoras incluyen, aunque sin limitación, células procariotas, células eucariotas, células vegetales, células de levadura, células animales, células de insecto, células aviares y células de mamífero. Como se usa en este documento, las expresiones "polipéptido expresado de forma recombinante" y "polipéptido recombinante" también abarcan un anticuerpo producido por un hibridoma.

El término "expresión" o "expresa" se usa en este documento para hacer referencia a la transcripción y traducción que se producen dentro de una célula hospedadora. El nivel de expresión de un gen de producto en una célula hospedadora puede determinarse basándose en la cantidad de ARNm correspondiente que esté presente en la célula o la cantidad de la proteína codificada por el gen de producto que se produce por la célula. Por ejemplo, ARNm transcrito a partir de un gen de producto se cuantifica de forma deseable por hibridación de Northern. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pág. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La proteína codificada por un gen de producto puede cuantificarse ensayando la actividad biológica de la proteína o empleando ensayos que son independientes de dicha actividad, tal como transferencia de Western, ELISA, HPLC, forteBIO, ensayo de Bradford, absorbancia a 280 nm o radioinmunoensayo usando anticuerpos que puedan reaccionar con la proteína. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pág. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

El término "solución" se refiere a una mezcla de uno o más líquidos (disolventes) con uno o más sólidos (solutos), tal como una sal, un polímero o un polipéptido. Como se usa en este documento, una solución incluye una solución de tampón.

Un "tampón" es una solución que resiste cambios en el pH mediante la acción de sus componentes de conjugado ácido-base. En Tampones se describen diversos tampones que pueden emplearse dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del tampón. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975). Se conocen muchos tampones en la técnica para su uso en soluciones de tampón e incluyen, aunque sin limitación, histidina, citrato, fosfato, succinato, tris(hidroximetil)aminometano (Tris), acetato, glicina, aconitato, maleato, ftalato, cacodilato, barbitol, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), bis(2-hidroxietil)imino-tris-(hidroximetil)metano (Bistris), ácido N-(2-acetamido)iminodiacético (ADA), piperazina-N,N-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES), 1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino]propano (bistrispropano), ácido N-(acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N,N'-bis(2-hidroxietil)-2-amino-etanosulfónico (BES), ácido N-tris(hidroximetil)metil-2-amino-etanosulfónico (TES), ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-etanosulfónico (HEPES), ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-propanosulfónico (HEPPS), N-tris(hidroximetil)metilglicina (Tricina), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (Bicina), glicilglicina, ácido N-tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), 1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino]propano (Bistrispropano), así como combinaciones de estos.

La expresión "tampón de carga" se refiere al tampón, en que el polipéptido que se está purificando se aplica a un dispositivo de purificación, por ejemplo, una columna de cromatografía o un cartucho de filtro. Típicamente, el tampón de carga se selecciona de modo que pueda conseguirse la separación del polipéptido de interés de las impurezas indeseadas.

Las expresiones "solución de lavado" y "tampón de lavado" se usan indistintamente en este documento y se refieren al tampón usado para retirar uno o más contaminantes, tales como impurezas relacionadas con el proceso, del dispositivo de purificación unido al polipéptido (por ejemplo, una matriz de cromatografía) sin retirar cantidades significativas del polipéptido de interés. La solución de lavado puede comprender una sal, un detergente, un disolvente, un polímero o cualquier combinación de los mismos.

Las expresiones "solución de elución" y "tampón de elución" se usan indistintamente en este documento y se refieren al tampón, que se usa típicamente para retirar (eluir) el polipéptido de interés del dispositivo de purificación (por ejemplo, una columna cromatográfica o cartucho de filtro) al que se aplicó anteriormente. Típicamente, la solución de elución se selecciona de modo que pueda conseguirse la separación del polipéptido de interés de las impurezas indeseadas. A menudo, la concentración de un ingrediente particular, tal como una sal particular (por ejemplo, NaCl) en la solución de elución se varía durante el procedimiento de elución (gradiente). El gradiente puede ser continuo o escalonado (interrumpido por periodos de retención). En determinadas realizaciones, se usa bajo pH, tal como un valor de pH por debajo de 4,5, en una solución de elución.

El término "cromatografía" se refiere al proceso por el que un soluto de interés, típicamente un polipéptido, en una mezcla se separa de otros solutos en una mezcla como un resultado de diferencias en tasas a las que los solutos individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase que se mueve, o en procesos de unir y eluir. Las etapas de cromatografía de la presente invención pueden emplear cualquier tipo de método cromatográfico. Por ejemplo, dichos métodos incluyen, sin limitación: cromatografía de gases, cromatografía de líquidos (por ejemplo, cromatografía de líquidos de alto rendimiento); cromatografía de afinidad (tal como cromatografía de afinidad de proteína A o anticuerpo-antígeno); cromatografía de fluidos supercríticos; cromatografía de intercambio iónico (tal como cromatografía de intercambio aniónico o catiónico); cromatografía de exclusión por tamaño; cromatografía en fase inversa; cromatografía bidimensional; cromatografía en lecho móvil simulado, cromatografía de gases de pirólisis, cromatografía de proteínas rápida (FPLC); cromatografía de contracorriente; cromatografía quiral; cromatografía de fase normal acuosa (ANP); cromatografía de modo mixto; y cromatografía de seudoafinidad.

Todas las etapas cromatográficas de la invención pueden realizarse por cualquier medio mecánico. La cromatografía puede realizarse en una columna. La columna puede procesarse con o sin presión y desde la parte superior a la parte inferior o desde la parte inferior a la parte superior. La dirección del flujo de fluido en la columna puede invertirse durante el proceso de cromatografía. La cromatografía también puede realizarse usando un proceso discontinuo en que el soporte sólido se separa del líquido usado para cargar, lavar y eluir la muestra mediante cualquier medio adecuado, incluyendo gravedad, centrifugación o filtración. La cromatografía puede realizarse también poniendo en contacto la muestra con un filtro que absorbe o retiene algunas moléculas en la muestra más fuertemente que otras.

La expresión "cromatografía de afinidad" se refiere a una técnica de separación de proteínas en que un polipéptido de interés se une de forma reversible y específica a un ligando bioespecífico. Preferiblemente, el ligando bioespecífico se fija covalentemente a un material de fase sólida cromatográfica y es accesible al polipéptido de interés en solución según contacta la solución con el material de fase sólida cromatográfica. El polipéptido de interés (por ejemplo, anticuerpo, enzima o proteína receptora) retiene su afinidad de unión específica por el ligando bioespecífico (antígeno, sustrato, cofactor u hormona, por ejemplo) durante las etapas cromatográficas, mientras otros solutos y/o proteínas en la mezcla no se unen apreciable o específicamente al ligando. La unión del polipéptido de interés al ligando inmovilizado permite pasar las proteínas contaminantes o impurezas proteínicas a través del medio cromatográfico mientras la proteína de interés permanece unida específicamente al ligando inmovilizado en el material de fase sólida. El polipéptido de interés unido específicamente se retira entonces en forma activa del ligando inmovilizado con bajo pH, alto pH, alta salinidad, ligando competidor y similares, y se pasa a través de la columna cromatográfica con el tampón de elución, libre de las proteínas contaminantes o impurezas proteínicas que se dejaron pasar anteriormente a través de la columna. Puede usarse cualquier componente como ligando para purificar su proteína de unión específica respectiva, por ejemplo, anticuerpo.

Las expresiones "proteína A" y "ProA" se usan indistintamente en este documento y abarcan la proteína A recuperada de la fuente natural de la misma, proteína A producida sintéticamente (por ejemplo, por síntesis peptídica o por técnicas recombinantes), y variantes de las mismas que conservan la capacidad de unirse a proteínas que tienen una región CH2/CH3, tal como una región Fc. La proteína A puede adquirirse en el mercado, por ejemplo, en Repligen, Pharmacia y Fermatech. La proteína A en general se inmoviliza en un material de soporte de fase sólida. El término "ProA" también se refiere a una resina o columna de cromatografía de afinidad que contiene matriz de soporte sólido cromatográfico al que se fija covalentemente la proteína A.

En la práctica, la cromatografía de proteína A implica usar proteína A inmovilizada en un soporte sólido. También puede usarse proteína G y proteína LG para cromatografía de afinidad. El soporte sólido es una matriz no acuosa a la que se adhiere proteína A. Dichos soportes incluyen agarosa, sepharose, vidrio, sílice, poliestireno, carbón con colodión, arena y cualquier otro material adecuado. Dichos materiales son bien conocidos en la técnica. Puede usarse cualquier método adecuado para fijar la segunda proteína al soporte sólido. Los métodos para fijar proteínas a soportes sólidos adecuados son bien conocidos en la técnica. Dichos soportes sólidos, con y sin proteína A inmovilizada, están fácilmente disponibles en muchas fuentes comerciales incluyendo tales como Vector Laboratory (Burlingame, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), BioRad (Hercules, CA), Amersham Biosciences (parte de GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y Millipore (Billerica, MA). Proteína A inmovilizada en una matriz de vidrio poroso está disponible en el mercado como PROSEP®-A (Millipore). La fase sólida también puede ser una matriz basada en agarosa. Proteína A inmovilizada en matriz de agarosa está disponible en el mercado como MABSELECT™ (GE Healthcare, Uppsala, Suecia).

La expresión "cromatografía de modo mixto" se refiere a un proceso de purificación usando adsorbentes de modo mixto que proporcionan múltiples modos de interacción, tal como interacción hidrófoba, de intercambio catiónico, de intercambio aniónico y de enlaces de hidrógeno entre el polipéptido de interés y los ligandos adsorbentes. Una resina de intercambio aniónico de modo mixto es una que tiene tanto grupos de intercambio aniónico como grupo hidrófobos en el ligando. Las resinas de cromatografía de modo mixto disponible en el mercado incluyen, aunque sin limitación, CAPTO™ MMC, CAPTO™ MMC ImpRes, CAPTO™ Blue, BLUE SEPHAROSE™ 6 Fast Flow, CAPTO™ Adhere y CAPTO™ Adhere ImpRes de GE Healthcare Life Sciences, o ESHMUNO® HCX de EMD Millipore, o NUVIA™ cPrime, CHT™ Ceramic Hydroxyapatite, y CFT™ Ceramic Fluoroapatite de Bio-Rad.

Las expresiones "resina de intercambio aniónico", "adsorbente de intercambio aniónico" o "matriz de intercambio aniónico" se usan en este documento para hacer referencia a una fase sólida que está cargada positivamente, por ejemplo, que tiene uno o más ligandos cargados positivamente, tal como grupos amino cuaternario, fijados a la misma. Las resinas de intercambio aniónico disponibles en el mercado incluyen DEAE SEPHAROSE™ Fast Flow, Q SEPHAROSE™ Fast Flow, Q SEPHAROSE™ High Performance, Q SEPHAROSE™ XL, CAPTO™ DEAE, CAPTO™ Q y CAPTO™ Q ImpRes de GE Healthcare Life Sciences, o FRACTOGEL® EMD TMAE HiCap, FRACTOGEL® EMD DEAE y ESHMUNO® Q de EMD Millipore, o UNOSPHERE™ Q y NUVIA™ Q de Bio-Rad.

Las expresiones "resina de intercambio catiónico", "adsorbente de intercambio catiónico" o "matriz de intercambio catiónico" se refieren a una fase sólida que está cargada negativamente y que, por tanto, tiene cationes libres para intercambio con cationes en una solución acuosa que ha pasado sobre o a través de la fase sólida. Un ligando cargado negativamente fijado a la fase sólida para formar la resina de intercambio catiónico puede ser, por ejemplo, un carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico disponibles en el mercado incluyen carboximetil-celulosa, sulfopropilo (SP) inmovilizado en agarosa (por ejemplo, SP SEPHAROSE™ XL, SP-SEPHAROSE™ Fast Flow, SP SEPHAROSE™ High Performance, CM SEPHAROSE™ Fast Flow, CM SEPHAROSE™ High Performance, CAPTO™ S y CAPTO™ SP ImpRes de GE Healthcare Life Sciences, o FRACTOGEL® EMD SE HiCap, FRACTOGEL® EMD SO3-, FRACTOGEL® EMD COO-, ESHMUNO® S y ESHMUNO® CPX de EMD Millipore, o UNOSPHERE™ S y NUVIA™ S de Bio-Rad).

Como se usa en este documento, las expresiones "reduce sustancialmente la elución del polipéptido" o "reducción sustancial de la elución del polipéptido" pretenden significar que menos de un 30 % del polipéptido diana se eluye de la matriz de cromatografía en una solución de lavado de bajo pH y alta salinidad. En una realización, menos de un 25 %, menos de un 20 %, menos de un 15 %, menos de un 10 % o menos de un 5 % del polipéptido diana se eluye de la matriz de cromatografía en una solución la lavado de bajo pH y alta salinidad.

Como se usa en este documento, las expresiones "porcentaje de recuperación" y "porcentaje de pureza" pretenden significar la recuperación o pureza conseguida cuando un compuesto diana (por ejemplo, una proteína) se transporta a través de una etapa o procedimiento de purificación, en comparación con la cantidad o pureza del compuesto diana en la muestra antes de la etapa o procedimiento de purificación. Conseguir un aumento en el porcentaje de pureza implica obtener un producto con niveles reducidos de contaminantes (en proporción al compuesto diana) cuando una muestra se compara antes y después de una etapa o procedimiento de purificación. Los porcentajes preferidos dentro del significado de porcentaje de recuperación y porcentaje de pureza como se definen anteriormente incluyen, sin limitación, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % y al menos aproximadamente un 99 %.

Los métodos para la determinación del rendimiento o pureza de un polipéptido son conocidos por los expertos en la materia. El rendimiento o pureza de un polipéptido puede determinarse mediante cualquier método de análisis adecuado reconocido en la técnica (por ejemplo, intensidad de banda en un gel teñido con plata, electroforesis en gel de poliacrilamida, ELISA, HPLC y similares). Un método ejemplar es cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), descrito en este documento a continuación. La pureza puede determinarse usando valores relativos de "área bajo la curva" (ABC), que pueden obtenerse típicamente para los picos en un cromatograma, tal como un cromatograma de HPLC. Opcionalmente, las purezas se determinan por medios cromatográficos u otros medios usando una curva patrón generada usando un material de referencia de pureza conocida. La pureza también puede determinarse en una base ponderal en peso.

Como se usa en este documento, el término "inactivar" u otras formas de esta palabra (por ejemplo, inactivación, inactivado, inactiva, etc.) cuando se usan en referencia a virus pretende indicar no solamente inactivación vírica completa (es decir, nada de virus infeccioso detectable), sino también la disminución o reducción detectable de las concentraciones víricas infecciosas (es decir, niveles en atenuación o atenuados de virus infeccioso detectable). Por tanto, la disminución o reducción de las concentraciones víricas infecciosas se incluye dentro del significado de "inactivación vírica" (y otras formas de este término) se indique o no dicha disminución o reducción explícitamente en este documento. Los métodos de cuantificación para inactivación vírica son bien conocidos en la técnica. Pueden usarse métodos tales como ensayos de placas. Los ensayos de placas determinan el número de unidades formadoras de placas (ufp) en una muestra de virus, suponiendo que cada placa formada es representativa de una partícula vírica infecciosa o ensayos de TCID50, donde un ensayo de dilución de valoración cuantifica la cantidad de virus requerida para destruir un 50 % de los hospedadores infectados o para producir un efecto citopático en un 50 % de las células de histocultivo inoculadas.

El término "polímero" se refiere a una molécula formada por enlace covalente de dos o más monómeros, donde los monómeros no son aminoácidos. Ejemplos no limitantes de polímeros incluyen polietilglicol, polipropilglicol y copolímeros de etilen- y propilenglicol.

El término "detergente" se refiere a tensioactivos no iónicos o zwiteriónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 u 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); condensado de octilfenol y óxido de etileno (también conocido como Octoxinol-9, t-octilfenoxipolietoxietanol, TRITON™ o TRITON™ X-100); 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1 -propanosulfonato (CHAPS); 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1 -propanosulfonato (CHAPSO); dodecil sulfato de sodio (SDS), laurel sulfato de sodio, octil glucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína, lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropilbetaína (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio o metil oleil-taurato de disodio; y etilsulfato de 1 -etil-1 -(2-hidroxietil)-2-isoheptadecilimidazolinio (por ejemplo, la gama MONAQUAT™, Mona Industries, Inc., Paterson, Nueva Jersey). Ejemplos no limitantes de productos comerciales que comprenden compuestos similares a TRITON™ X-100 incluyen CONGO™ N1, DOWFAX™ 9N, IGEPAL™ CO, MAKON™, NEUTRONYX® 600's, NONIPOL™ NO, POLYTERGENT® B, RENEX™ 600's, SOLAR™ NO, STEROX™, SERFONIC™ N, T-DET-N™, TERGITOL™ NP y TRITON™ N.

El término "anticuerpo" se usa para indicar una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente a una diana, tal como una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o combinaciones de los anteriores, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en este documento, el término abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpo (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv), mutantes Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos generados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, anticuerpos monovalentes o monoespecíficos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una parte de determinación antigénica de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno siembre que los anticuerpos muestren la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), basadas en la identidad de sus dominios constantes de la cadena pesada denominados alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente.

La expresión "polipéptido que contiene Fc", como se usa en este documento, se refiere a una proteína en que uno o más polipéptidos están ligados a una región Fc o una variante o derivado de la misma. El término "Fc" o "región Fc" se refiere a una región C de una cadena pesada de IgG, incluyendo cualquier variante funcional de Fc de IgG que conserva la capacidad de unirse a proteína A. Un ejemplo de un polipéptido que contiene Fc es ENBREL® (etanercept) que es una proteína de fusión que fusiona un receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) al extremo constante del anticuerpo IgG1.

La expresión "polipéptido que contiene CH2/CH3", como se usa en este documento se refiere a una proteína en que uno o más polipéptidos están ligados a los dominios CH2/CH3 de una cadena pesada de IgG, o una variante funcional o derivado de la misma.

Una proteína "de fusión" o "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos ligada a una segunda secuencia de aminoácidos con la que no está ligada de forma natural en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos que existen normalmente en proteínas separadas pueden ponerse juntas en el polipéptido de fusión, o las secuencias de aminoácidos que existen normalmente en la misma proteína pueden colocarse en una nueva disposición en el polipéptido de fusión, por ejemplo, fusión de un dominio de factor VIII de la invención con un dominio Fc de inmunoglobulina. Una proteína de fusión se crea, por ejemplo, por síntesis química, o creando y traduciendo un polinucleótido en que las regiones peptídicas están codificadas en la relación deseada. Una proteína quimérica puede comprender además una segunda secuencia de aminoácidos asociada con la primera secuencia de aminoácidos mediante un enlace covalente no peptídico o un enlace no covalente.

El término "ligado", como se usa en este documento, se refiere a una primera secuencia de aminoácidos unida covalente o no covalentemente a una segunda secuencia de aminoácidos. La expresión "ligado covalentemente" o "ligamiento covalente" se refiere a un enlace covalente, por ejemplo, un enlace disulfuro, un enlace peptídico o uno o más aminoácidos, por ejemplo, un conector, entre los dos restos que están ligados juntos. La primera secuencia de aminoácidos puede unirse o yuxtaponerse directamente a la segunda secuencia de aminoácidos o, como alternativa, una secuencia intermedia puede unir covalentemente la primera secuencia a la segunda secuencia. El término "ligado" significa no solamente una fusión de una primera secuencia de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos en el extremo C o el extremo N, sino que también incluye la inserción de la primera secuencia de aminoácidos completa (o la segunda secuencia de aminoácidos) en dos aminoácidos cualesquiera en la segunda secuencia de aminoácidos (o la primera secuencia de aminoácidos, respectivamente).

La expresión "resto heterólogo" se refiere a un polipéptido u otro resto que derive de una entidad distinta de la de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, un polipéptido heterólogo puede ser sintético, o derivar de una especie diferente, tipo celular diferente de un individuo, o el mismo tipo o diferente de célula de individuos distintos. En una realización, un resto heterólogo puede ser un polipéptido fusionado a otro polipéptido para producir un polipéptido o proteína de fusión. En otra realización, un resto heterólogo puede ser no polipeptídico tal como PEG conjugado con un polipéptido o proteína.

La expresión "híbrido de monómero-dímero", como se usa en este documento, se refiere a una proteína quimérica que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, que están asociadas entre sí mediante un enlace covalente, en el que la primera cadena comprende una molécula biológicamente activa, por ejemplo, un factor de coagulación tal como factor IX, factor VIII o factor VII, y una región Fc, y la segunda cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una región Fc sin el factor de coagulación. La construcción de híbrido de monómero-dímero, por tanto, es un híbrido que comprende un aspecto monomérico que tiene solamente una molécula biológicamente activa y un aspecto dimérico que tiene dos regiones Fc.

Como se usa en este documento, el término "semivida" se refiere a una semivida biológica de un polipéptido particular in vivo. La semivida puede representarse por el tiempo requerido para que la mitad de la cantidad administrada a un sujeto se elimine de la circulación y/u otros tejidos en el animal.

El término "hibridoma", como se usa en este documento, se refiere a una célula creada por fusión de una célula inmortalizada derivada de una fuente inmunológica y una célula productora de anticuerpos. El hibridoma resultante es una célula inmortalizada que produce anticuerpos. Las células individuales usadas para crear el hibridoma pueden ser de cualquier fuente mamífera incluyendo, aunque sin limitación, rata, hámster, cerdo, conejo, oveja, cerdo, cabra y ser humano. El término también abarca líneas celulares de trioma, que se producen cuando la descendencia de fusiones de mieloma heterohíbrido, que son el producto de una fusión entre células humanas y una línea celular de mieloma murino, se fusionan posteriormente con un plasmocito. Además, se entiende que el término incluye cualquier línea celular híbrida inmortalizada que produce anticuerpos tal como, por ejemplo, cuadromas (véase, por ejemplo, Milstein et a l, Nature, 537:3053 (1983)).

II. Producción y purificación de polipéptidos de interés

A. Polipéptidos de interés

La presente invención puede usarse para inactivar un virus que esté presente durante la producción de cualquier polipéptido que se exprese en una célula hospedadora. El polipéptido puede expresarse a partir de un gen que es endógeno a la célula hospedadora, o a partir de un gen que se introduce en la célula hospedadora a través de genomanipulación. El polipéptido puede ser uno que se produzca en la naturaleza o, como alternativa, puede tener una secuencia que se manipuló o seleccionó artificialmente por el hombre. Un polipéptido manipulado puede ensamblarse a partir de otros segmentos polipeptídicos que se producen individualmente en la naturaleza, o puede incluir uno o más segmentos que no se producen de forma natural.

Un polipéptido de interés a menudo tiene una actividad biológica o química deseable. Por ejemplo, la presente invención puede emplearse para inactivar virus que está presente durante la producción de una enzima, receptor, anticuerpo, hormona, factor regulador, antígeno, agente de unión farmacéutica o comercialmente relevante, etc.

Lo siguiente es una descripción detallada de algunos de los polipéptidos que pueden expresarse en un cultivo celular y purificarse de acuerdo con el método de inactivación vírica de la presente invención.

Factores de coagulación

En algunas realizaciones, la proteína de interés comprende un factor de coagulación. Factor de coagulación, como se usa en este documento, significa cualquier molécula, o análogo de la misma, que evita o disminuye la duración de un episodio hemorrágico en un sujeto con un trastorno hemostático. Por ejemplo, un factor de coagulación usado en la invención puede ser un factor de coagulación de longitud completa, un factor de coagulación maduro o un factor de coagulación quimérico. En otras palabras, significa cualquier molécula que tenga actividad coagulante. La actividad coagulante, como se usa en este documento, significa la capacidad de participar en una secuencia en cadena de reacciones bioquímicas que culmina en la formación de un coágulo de fibrina y/o reduce la gravedad, duración o frecuencia de la hemorragia o episodio hemorrágico. Pueden encontrarse ejemplos de factores de coagulación en la patente de Estados Unidos n.° 7.404.956.

El factor de coagulación puede ser un factor que participa en la ruta extrínseca. El factor de coagulación puede ser un factor que participa en la ruta intrínseca. Como alternativa, el factor de coagulación puede ser un factor que participa tanto en la ruta extrínseca como en la intrínseca.

Ejemplos no limitantes de factores de coagulación incluyen factor I (fibrinógeno), factor II (protrombina), tromboplastina tisular, factor V (proacelerina, factor lábil), factor VII (factor estable, proconvertina), factor VIII (factor antihemofílico A), factor IX (factor antihemofílico B o factor de Christmas), factor X (factor de Stuart-Prower), factor XI (precedente de tromboplastina plasmática), factor XII (factor de Hageman), factor XIII (factor estabilizante de fibrina), factor de Von Willebrand (VWF), precalicreína (factor de Fletcher), cininógeno de alto peso molecular (HMWK) (factor de Fitzgerald), fibronectina, antitrombina III, cofactor de heparina II, proteína C, proteína S, proteína Z, plasminógeno, alfa 2-antiplasmina, activador tisular de plasminógeno (tPA), urocinasa, inhibidor-1 del activador tisular de plasminógeno (PAI1) e inhibidor-2 del activador de plasminógeno (PAI2).

En una realización, el factor de coagulación puede ser un factor de coagulación humano o un factor de coagulación no humano, por ejemplo, derivado de un primate no humano, un cerdo o cualquier mamífero. El factor de coagulación puede ser un factor de coagulación quimérico, por ejemplo, el factor de coagulación puede comprender una parte de un factor de coagulación humano y una parte de un factor de coagulación porcino o una parte de un primer factor de coagulación no humano y una parte de un segundo factor de coagulación no humano.

En otra realización, el factor de coagulación puede ser un factor de coagulación activado. Como alternativa, el factor de coagulación puede ser una forma inactiva de un factor de coagulación, por ejemplo, un zimógeno. El factor de coagulación inactivo puede experimentar activación posterior a ligarse a al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina. El factor de coagulación inactivo puede activarse posterior a su administración a un sujeto. Como alternativa, el factor de coagulación inactivo puede activarse antes de su administración.

Factor FIX

"Proteína de factor IX" o "proteína FIX", como se usa en este documento, significa proteína de factor FIX funcional en su función normal en la coagulación, salvo que se especifique de otro modo. Por tanto, el polipéptido FIX incluye polipéptidos variantes que son funcionales y los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos variantes funcionales. En una realización, los polipéptidos FIX son los polipéptidos FIX humanos, bovinos, porcinos, caninos, felinos y murinos. Las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas de longitud completa de FIX son conocidas, como lo son michas variantes funcionales, por ejemplo, fragmentos, mutantes y versiones modificadas. Los polipéptidos FIX incluyen FIX de longitud completa, FIX de longitud completa menos Met en el extremo N, FIX de longitud completa menos la secuencia señal, FIX maduro (menos la secuencia señal y el propéptido) y FIX maduro con una Met adicional en el extremo N. El FIX puede prepararse por medio recombinante ("factor IX recombinante" o "rFIX"), es decir, no se produce de forma natural o derivado de plasma.

Se conoce una gran cantidad de variantes de FIX funcionales. La publicación internacional número WO 02/040544 A3, que en este documento se incorpora por referencia en su totalidad, divulga mutantes que muestran resistencia aumentada a la inhibición por heparina en la página 4, líneas 9-30 y página 15, líneas 6-31. La publicación internacional número WO 03/020764 A2 divulga mutantes de FIX con inmunogenia reducida de linfocitos T en las tablas 2 y 3 (en las páginas 14-24) y en la página 12, líneas 1-27. La publicación internacional número WO 2007/149406 A2 divulga moléculas FIX mutantes funcionales que muestran estabilidad proteínica aumentada, semivida aumentada in vivo e in vitro, y resistencia aumentada a proteasas en la página 4, línea 1 a página 19, línea 11. El documento WO 2007/149406 A2 también divulga moléculas FIX quiméricas y otras variantes en la página 19, línea 12 a página 20, línea 9. La publicación internacional número WO 08/118507 A2 divulga mutantes de FIX que muestran actividad coagulante aumentada en la página 5, línea 14 a página 6, línea 5. La publicación internacional número WO 09/051717 A2 divulga mutantes de FIX que tienen un número aumentado de sitios de glucosilación ligados a N y/o ligados a O, lo que provoca una semivida y/o recuperación aumentadas en la página 9, línea 11 a página 20, línea 2. La publicación internacional número WO 09/137254 A2 también divulga mutantes del factor IX con números aumentos de sitios de glucosilación en la página 2, párrafo [006] a página 5, párrafo [011] y página 16, párrafo [044] a página 24, párrafo [057]. La publicación internacional número WO 09/130198 A2 divulga moléculas de FIX mutantes funcionales que tienen un número aumentado de sitios de glucosilación, lo que provoca una semivida aumentada, en la página 4, línea 26 a página 12, línea 6. La publicación internacional número WO 09/140015 A2 divulga mutantes de FIX funcionales que tienen un número aumentado de residuos de Cys, que pueden usarse para la conjugación de polímero (por ejemplo, PEG), en la página 11, párrafo [0043] a página 13, párrafo [0053]. Los polipéptidos FIX descritos en la solicitud internacional n.° PCT/US2011/043569 presentada el 11 de julio de 2011 y publicada como documento WO 2012/006624 el 12 de enero de 2012 también se divulgan en este documento.

En una realización, el polipéptido de interés es un polipéptido FIX de acción prolongada o de larga duración que es un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido FIX y un compañero de unión a FcRn. En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés es rFIX-Fc que es una proteína de fusión que comprende una sola molécula del FIX de coagulación recombinante (rFIX) humano ligado covalentemente a la región Fc dimérica de inmunoglobulina G1 (IgG1) sin secuencia intermedia. La expresión "compañero de unión a FcRn" se define en este documento.

Factor VIII

"Proteína de factor VIII" o "proteína FVIII", como se usa en este documento, significa proteína de factor VIII funcional en su función normal en la coagulación, salvo que se especifique de otro modo. Por tanto, el término FVIII incluye proteínas variantes que son funcionales. En una realización, la proteína FVIII es la proteína FVIII humana, porcina, canina, rata o murina. Una proteína FVIII funcional puede ser una proteína de fusión tal como, aunque sin limitación, una proteína de fusión que comprende un FVIII con un dominio B completa o parcialmente eliminado, al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio Fc o ambos. Se ha construido una miríada de variantes de FVIII funcionales y pueden usarse como proteínas FVIII recombinantes como se describe en este documento. Véanse las publicaciones PCT n.2 WO 2011/069164 A2, WO 2012/006623 A2, WO 2012/006635 A2 o WO 2012/006633 A2. El FVIII puede ser un FVIII monocatenario o un FVIII bicatenario.

Se conoce una gran cantidad de variantes de FVIII funcionales. Además, se han identificado cientos de mutaciones no funcionales en FVIII en pacientes con hemofilia. Véase, por ejemplo, Cutler et al., Hum. Mutat. 19: 274-8 (2002), incorporado en este documento por referencia en su totalidad. Además, comparaciones entre FVIII de seres humanos y otras especies han identificado residuos conservados que probablemente se requieren para la función. Véase, por ejemplo, Cameron et al., Thromb. Haemost. 79: 317-22 (1998) y el documento US 6.251.632.

La secuencia de aminoácidos de FVIII humano se dedujo del ADNc como se muestra en la patente de Estados Unidos n.° 4.965.199. El FVIII humano maduro natural derivado de la secuencia de ADNc (es decir, sin el péptido señal secretor, pero antes de otro procesamiento postraduccional) puede encontrarse como SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2013/123457 A1. El FVIII con el dominio B parcial o completamente eliminado es funcional y se ha usado en productos terapéuticos de FVIII comerciales. Véase, por ejemplo, el documento EP 506757 B2.

En una realización descrita en este documento, el polipéptido de interés es un polipéptido FVIII de acción prolongada o de larga duración que es un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido FVIII y un compañero de unión a FcRn. En determinadas realizaciones descritas en este documento, el polipéptido de interés es rFVIII-Fc que es una proteína de fusión que comprende una sola molécula del FVIII de coagulación recombinante (rFVIII) humano ligado covalentemente a la región Fc dimérica de inmunoglobulina G1 (IgG1) sin secuencia intermedia.

Factor VII

"Proteína de factor VII" o "proteína FVII", como se usa en este documento, significa proteína de factor VII funcional en su función normal en la coagulación, salvo que se especifique de otro modo. Puede ser una forma madura de factor VII o una variante del mismo. El factor VII es una serina proteasa que es parte de la secuencia en cadena de la coagulación. El FVII incluye un dominio Gla, dos dominios EGF (EGF-1 y EGF-2) y un dominio serina proteasa (o dominio peptidasa S1) que está muy conservado entre todos los miembros de la familia de la peptidasa S1 de serina proteasas, tal como, por ejemplo, con quimotripsina. El FVII se produce como un zimógeno monocatenario, un polipéptido bicatenario similar a zimógeno activado (por ejemplo, FVII activable) y una forma bicatenaria completamente activada.

Como se usa en este documento, una proteína o polipéptido "similar a zimógeno" se refiere a una proteína que se ha activado por escisión proteolítica, pero aún muestra propiedades que se asocian con un zimógeno, tales como, por ejemplo, baja o ninguna actividad, o una conformación que se parece a la conformación de la forma de zimógeno de la proteína. Por ejemplo, cuando no está unido a tromboplastina tisular, la forma activada bicatenaria de FVII es una proteína similar a zimógeno; conserva una conformación similar al zimógeno FVII sin escindir y, por tanto, muestra actividad muy baja. Tras la unión a tromboplastina tisular, la forma activada bicatenaria de FVII experimenta cambio conformacional y adquiere su actividad completa como factor de coagulación.

Variantes de FVII ejemplares incluyen aquellas con actividad específica aumentada, por ejemplo, mutaciones que aumentan la actividad de FVII aumentando su actividad enzimática (Kcat o Km). Dichas variantes se han descrito en la técnica e incluyen, por ejemplo, formas mutantes de la molécula como se describe, por ejemplo, en Persson et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98: 13583 (2001); Petrovan y Ruf, J. Biol. Chem. 276: 6616 (2001); Persson et al., J. Biol. Chem. 276: 29195 (2001); Soejima et a l, J. Biol. Chem. 276: 17229 (2001); Soejima et a l, J. Biol. Chem. 247: 49027 (2002).

En una realización, el polipéptido de interés es un polipéptido FVII de acción prolongada o de larga duración que es un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido FVII y un compañero de unión a FcRn. En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés es rFVII-Fc que es una proteína de fusión que comprende una sola molécula del FVII de coagulación recombinante (rFIX) humano ligado covalentemente a la región Fc dimérica de inmunoglobulina G1 (IgG1) sin secuencia intermedia.

Factores de coagulación quiméricos

En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés comprende un factor de coagulación quimérico. En determinadas realizaciones, el factor de coagulación quimérico comprende un factor de coagulación y un dominio CH2/CH3. CH2 y CH3 son dos dominios constantes ubicados en la región Fc de una cadena pesada de IgG. El dominio CH2 de una región Fc de IgG humana habitualmente se extiende desde el aminoácido 231 al aminoácido 341 de acuerdo con el sistema de numeración como se describe en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD, incorporado en este documento por referencia en su totalidad. El dominio CH3 de una región Fc de IgG humana habitualmente se extiende desde el aminoácido 342 a 447 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat et al., 1991. Un dominio CH2/CH3 incluye cualquier derivado funcional o variante de los dominios CH2 y CH3.

En determinadas realizaciones, el factor de coagulación quimérico comprende un factor de coagulación y una región Fc. En una realización, el factor de coagulación quimérico es FIX-Fc, FVIII-Fc o FVII-Fc. Se describen diversos ejemplos de polipéptidos quiméricos e híbridos FIX-Fc, FVIII-Fc o FVII-Fc, por ejemplo, en las publicaciones de Estados Unidos n.° 2013/0202595 A 1,2013/0108629 A1, y la patente de Estados Unidos n.° 8.329.182.

En una realización, el polipéptido de interés es un factor de coagulación de acción prolongada o de larga duración que es un polipéptido quimérico que comprende un factor de coagulación y un compañero de unión a FcRn. En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés es una proteína de fusión que comprende una sola molécula de factor de coagulación recombinante humano ligado covalentemente a la región Fc dimérica de inmunoglobulina G1 (IgG1) sin secuencia intermedia.

Restos heterólogos

En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés es un polipéptido quimérico que comprende una molécula biológicamente activa y al menos un resto heterólogo. En una realización, la molécula biológicamente activa es un factor de coagulación. En una realización, el resto heterólogo puede prolongar la semivida del factor de coagulación.

En determinadas realizaciones, el resto heterólogo es una IgG o un fragmento de la misma, una albúmina o un fragmento de la misma, un resto de unión a albúmina, una secuencia PAS, una secuencia polimérica homoaminoacídica (HAP), transferrina o un fragmento de la misma y cualquier combinación de los mismos, o un resto no polipeptídico que comprende polietilenglicol (PEG), poli(ácido siálico), hidroxietil almidón (HES), un derivado de los mismos y cualquier combinación de los mismos.

En una realización, el resto heterólogo comprende una primera región Fc. En otra realización, el resto heterólogo comprende una segunda región Fc.

Como se usa en este documento, la expresión "región Fc" se define como la parte de un polipéptido que corresponde a la región Fc de inmunoglobulina natural, es decir, formada por la asociación dimérica de los dominios Fc respectivos de sus dos cadenas pesadas. Una región Fc natural forma un homodímero con otra región Fc.

En una realización, la "región Fc" se refiere a la parte de una sola cadena pesada de inmunoglobulina que empieza en la región de bisagra exactamente cadena arriba del sitio de escisión con papaína (es decir, el residuo 216 en IgG, aceptando el primer residuo de la región constante de la cadena pesada como 114) y finalizando en el extremo C del anticuerpo. Por consiguiente, una región Fc completa comprende al menos un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.

La región Fc de una región constante de inmunoglobulina, dependiendo del isotipo de la inmunoglobulina, puede incluir los dominios CH2, CH3 y CH4, así como la región de bisagra. Las proteínas quiméricas que comprenden una región Fc de un inmunoglobulina confieren varias propiedades deseables a una proteína quimérica, incluyendo estabilidad aumentada, semivida sérica aumentada (véase Capon et al., 1989, Nature 337: 525) así como unión a receptores de Fc tal como el receptor de Fc neonatal (FcRn) (patentes de Estados Unidos n.° 6.086.875, 6.485.726, 6.030.613; documento WO 03/077834; documento US2003-0235536A1).

En otra realización, la "región Fc" incluye una secuencia de aminoácidos de un dominio Fc o derivada de un dominio Fc. En determinadas realizaciones, una región Fc comprende al menos uno de: un dominio de bisagra (por ejemplo, región de bisagra superior, media y/o inferior) (aproximadamente los aminoácidos 216-230 de una región Fc de anticuerpo de acuerdo con la numeración EU), un dominio CH2 (aproximadamente los aminoácidos 231-340 de una región Fc de anticuerpo de acuerdo con la numeración EU), un dominio CH3 (aproximadamente los aminoácidos 341 -438 de una región Fc de anticuerpo de acuerdo con la numeración EU), un dominio CH4, o una variante, parte o fragmento de los mismos. En otras realizaciones, una región Fc comprende un dominio Fc completo (es decir, un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3). En algunas realizaciones, una región Fc comprende, consiste esencialmente en o consiste en un dominio de bisagra (o una parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una parte del mismo), un dominio de bisagra (o una parte del mismo) fusionado a un dominio CH2 (o una parte del mismo), un dominio CH2 (o una parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una parte del mismo), un dominio CH2 (o una parte del mismo) fusionado tanto a un dominio de bisagra (o una parte del mismo) como a un dominio CH3 (o una parte del mismo). En otras realizaciones más, una región Fc carece de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). En una realización particular, una región Fc comprende o consiste en los aminoácidos correspondientes a los números EU 221 a 447.

Las regiones Fc de la invención pueden emplear variantes de Fc reconocidas en la técnica que se sabe que confieren un cambio (por ejemplo, una potenciación o reducción) en la función efectora y/o unión a FcR o FcRn. Específicamente, una molécula de unión de la invención puede incluir, por ejemplo, un cambio (por ejemplo, una sustitución) en una o más de las posiciones aminoacídicas divulgadas en las publicaciones PCT internacionales WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 y WO06/085967A2; las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; o las patentes de Estados Unidos 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; 7.083.784; 7.404.956 y 7.317.091. En una realización, el cambio específico (por ejemplo, la sustitución específica de uno o más aminoácidos divulgados en la técnica) puede hacerse en una o más de las posiciones aminoacídicas divulgadas. En otra realización, puede hacerse un cambio diferente en una o más de las posiciones aminoacídicas divulgadas (por ejemplo, la sustitución diferente de una o más posiciones aminoacídicas divulgadas en la técnica).

En determinadas realizaciones, un polipéptido quimérico usado de acuerdo con la invención comprende una o más regiones Fc truncadas que son, no obstante, suficientes para conferir propiedades de unión al receptor de Fc (FcR) a la región Fc. Por ejemplo, la parte de una región Fc que se une a FcRn (es decir, la parte de unión a FcRn) comprende de aproximadamente los aminoácidos 282-438 de IgG1, numeración de EU (siendo los sitios de contacto principales los aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291,308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos aminoacídicos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3). Por tanto, una región Fc de la invención puede comprender o consistir en una parte de unión a FcRn. Las partes de unión a FcRn pueden derivar de cadenas pesadas de cualquier isotipo, incluyendo IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4.

El compañero de unión a FcRn ("BP de FcRn") comprende compañeros de unión al receptor de Fc neonatal (FcRn) funcionales, salvo que se especifique de otro modo. Un compañero de unión a FcRn es cualquier molécula que pueda unirse específicamente por el receptor FcRn con transporte activo consiguiente por el receptor FcRn del compañero de unión a FcRn. Por tanto, la expresión BP de FcRn incluye cualquier variante de Fc de IgG que sea funcional. Por ejemplo, la región de la parte Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basándose en cristalografía de rayos X (Burmeister et al. 1994, Nature 372: 379). El área de contacto principal del Fc con el FcRn está cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3, los contactos de Fc-FcRn están todos dentro de una sola cadena pesada de Ig. Los BP de FcRn incluyen IgG completa, el fragmento Fc de IgG y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión completa de FcRn. Los sitios de contacto principales incluyen los residuos aminoacídicos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291,308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos aminoacídicos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Las referencias hechas a numeración de aminoácidos de inmunoglobulinas o fragmentos o regiones de inmunoglobulina se basan todas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD. El receptor FcRn se ha aislado de varias especies de mamífero incluyendo seres humanos. Las secuencias del FcRn humano, FcRn de rata y FcRn de ratón son conocidas (véase, por ejemplo, Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180: 2377, incorporado en este documento por referencia en su totalidad). Un BP de FcRn puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina con o sin la región de bisagra de la inmunoglobulina. Se proporciona variantes de BP de FcRn ejemplares en los documentos WO 2004/101740 y WO 2006/074199).

En determinadas realizaciones, el resto heterólogo es una albúmina o un fragmento de la misma. La seroalbúmina humana (HSA o HA), una proteína de 609 aminoácidos en su forma de longitud completa, es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica del suero y también funciona como transportador de ligandos endógenos y exógenos. El término "albúmina", como se usa en este documento, incluye albúmina de longitud completa o un fragmento, variante, derivado o análogo funcional de la misma. Ejemplos adicionales de albúmina o los fragmentos o variantes de la misma se divulgan en las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2008/0194481A1,2008/0004206 A1,2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1 o 2008/0153751 A1 o las publicaciones de solicitud PCT n.22008/033413 A2, 2009/058322 A1 o 2007/021494 A2.

En determinadas realizaciones, el resto heterólogo es un resto de unión a albúmina, que comprende un péptido de unión a albúmina, un dominio bacteriano de unión a albúmina, un fragmento de anticuerpo de unión a albúmina o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, la proteína de unión a albúmina puede ser una proteína bacteriana de unión a albúmina, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo incluyendo anticuerpos de dominio (véase la patente de Estados Unidos n.° 6.696.245). Una proteína de unión a albúmina, por ejemplo, puede ser un dominio bacteriano de unión a albúmina, tal como la proteína G estreptocócica (Konig, T. y Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Otros ejemplos de péptidos de unión a albúmina que pueden usarse como compañero de conjugación son, por ejemplo, los que tienen una secuencia consenso Cys-Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Cys, en la que Xaa 1 es Asp, Asn, Ser, Thr o Tip; Xaa 2 es Asn, Gln, H es, Ile, Leu o Lys; Xaa 3 es Ala, Asp, Phe, Trp o Tyr; y Xaa 4 es Asp, Gly, Leu, Phe, Ser o Thr como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos 2003/0069395 o Dennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043).

En otras realizaciones, el resto heterólogo es una secuencia PAS. Una secuencia PAS, como se usa en este documento, significa una secuencia de aminoácidos que comprende principalmente residuos de alanina y serina o que comprende principalmente residuos de alanina, serina y prolina, formando la secuencia de aminoácidos una conformación de enrollamiento aleatorio en condiciones fisiológicas. Por consiguiente, la secuencia PAS es un componente básico, un polímero de aminoácidos o un casete de secuencia que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en alanina, serina y prolina, que puede usarse como parte del resto heterólogo en la proteína quimérica. Además, los expertos en la materia son conscientes de que un polímero de aminoácidos también puede formar una conformación de enrollamiento aleatorio cuando se añaden residuos distintos de alanina, serina y prolina como constituyente minoritario en la secuencia PAS.

Ejemplos no limitantes de las secuencias PAS que forman una conformación de enrollamiento aleatorio comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 17), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 18), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 19), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 20), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 21), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 22) y ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 23) o cualquier combinación de las mismas. Ejemplos adicionales de secuencias PAS son conocidas de, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2010/0292130 A1 y la publicación de solicitud PCT n.° W o 2008/155134 A1.

En otras realizaciones más, el resto heterólogo es un polímero homoaminoacídico (HAP) rico en glicina. La secuencia HAP puede comprender una secuencia repetitiva de glicina, que tiene al menos 50 aminoácidos de longitud. En una realización, la secuencia HAP puede prolongar la semivida de un resto fusionado a o ligado a la secuencia HAP. Ejemplos no limitantes de la secuencia HAP incluyen, aunque sin limitación (Gly)ⁿ, (Gly4Ser)ⁿ o S(Gly4Ser)ⁿ, en la que n es de 1 a 20, de 20 a 40 o de 40 a 200. Véase, por ejemplo, Schlapschy M et al., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007).

En determinadas realizaciones, el resto heterólogo es transferrina o un fragmento de la misma. Puede usarse cualquier transferrina para preparar las proteínas quiméricas usadas de acuerdo con la invención. Como ejemplo, Tf humana de tipo silvestre (Tf) es una proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 kDa (sin tener en cuenta la glucosilación), con dos dominios principales, N (aproximadamente 330 aminoácidos) y C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parecen originarse a partir de una duplicación génica. Véanse los números de acceso a GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM039847 y S95936 (ncbi.nlm.nih.gov/). Las transferrina comprende dos dominios, dominio N y dominio C. El dominio N comprende dos subdominios, dominio N1 y dominio N2, y el dominio C comprende dos subdominios, dominio C1 y dominio C2.

En una realización, la parte de transferrina de la proteína quimérica incluye una variante de empalme de transferrina. En un ejemplo, una variante de empalme de transferrina puede ser una variante te empalme de transferrina human, por ejemplo, acceso a Genbank AAA61140. En otra realización, la parte de transferrina de la proteína quimérica incluye uno o más dominios de la secuencia de transferrina, por ejemplo, dominio N, dominio C, dominio N1, dominio N2, dominio C1, dominio C2 o cualquier combinación de los mismos.

En otras realizaciones, el resto heterólogo es un polímero soluble conocido en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, polietilenglicol, copolímero de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano o poli(alcohol vinílico).

El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, en una realización, el peso molecular es entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa para facilitar la manipulación y fabricación. Pueden usarse otros tamaños, dependiendo del perfil deseado (por ejemplo, la duración de la liberación mantenida deseada, los efectos, si los hay, sobre la actividad biológica, la facilidad de manipulación, el grado o ausencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína o análogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 200 a aproximadamente 100000 kDa.

En algunas realizaciones, el polietilenglicol puede tener una estructura ramificada. Se describen polietilenglicoles ramificados, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol.

56: 59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18: 2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem.

10: 638-646 (1999).

En determinadas realizaciones, el resto heterólogo es un hidroxietil almidón (HES) o un derivado del mismo. E1HES es un derivado de amilopectina de origen natural y se degrada por la alfa-amilasa en el organismo. E1HES es un derivado sustituido del carbohidrato polimérico amilopectina, que está presente en almidón de maíz a una concentración de hasta un 95 % en peso. El HES presenta propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de reposición de la volemia y en tratamiento de hemodilución en clínica (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); y Weidler et a l, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41,494-498 (1991)).

El HES se caracteriza principalmente por la distribución de peso molecular y el grado de sustitución. El grado de sustitución, indicado como DS, se refiere a la sustitución molar, es conocido por los expertos en la materia. Véase Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), como se indica anteriormente, en particular pág.

273. En una realización, el HES tiene un peso molecular medio (media ponderada) de 1 a 300 kDa, de 2 a 200 kDa, de 3 a 100 kDa o de 4 a 70 kDa. El HES puede presentar además un grado molar de sustitución de 0,1 a 3, preferiblemente de 0,1 a 2, más preferido, de 0,1 a 0,9, preferiblemente de 0,1 a 0,8, y una relación entre la sustitución C2:C6 en el intervalo de 2 a 20 con respecto a los grupos hidroxietilo. En determinadas realizaciones, el resto heterólogo puede ser mezclas de hidroxietil almidones que tienen diferentes pesos moleculares medios y/o diferentes grados de sustitución y/o diferentes relaciones de sustitución C2: C6.

En otras realizaciones más, el resto heterólogo no polipeptídico es un polímero, por ejemplo, poli(ácidos siálicos) (PSA) o un derivado de los mismos. Los poli(ácidos siálicos) (PSA) son polímeros no ramificados de origen natural de ácido siálico producidos por determinadas cepas bacterianas y en mamíferos en determinadas células. Roth J., et al. (1993) en Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds. Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhauser Verlag, Basel, Suiza), pág. 335-348. Pueden producirse en diversos grados de polimerización de n = aproximadamente 80 o más residuos de ácido siálico hasta n = 2 por hidrólisis ácida limitada o por digestión con neuraminidasas, o por fraccionamiento de las formas naturales derivadas de forma bacteriana del polímero. Se han descrito diversos métodos de fijación o conjugación de poli(ácidos siálicos) a un polipéptido (por ejemplo, véase la patente de Estados Unidos n.° 5.846.951; documento WO-A-0187922 y documento US 2007/0191597 A1).

Se divulga descripción más detallada y las secuencias de los restos heterólogos que pueden usarse en esta invención, por ejemplo, en los documentos WO 2013/123457 A1 y WO 2013/106787 A1.

En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés es un híbrido de monómero-dímero que comprende un factor de coagulación. En una realización, el híbrido de monómero-dímero es una proteína quimérica que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, que se asocian entre sí por un enlace disulfuro, en el que la primera cadena comprende un factor de coagulación, por ejemplo, factor VIII y una región Fc y la segunda cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una región Fc sin el factor de coagulación. Se describen diversos ejemplos de híbridos de monómero-dímero que comprenden uno o más factores de coagulación en la patente de Estados Unidos n.° 8.329.182.

Anticuerpos

En algunas realizaciones, el polipéptido de interés comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno particular. Cualquier anticuerpo que pueda expresarse en una célula hospedadora puede usarse de acuerdo con la presente invención. En una realización, el polipéptido de interés es un anticuerpo monoclonal.

Anticuerpos particulares pueden prepararse, por ejemplo, preparando y expresando genes sintéticos que codifican las secuencias de aminoácidos indicadas o mutando genes de la línea germinal humana para proporcionar un gen que codifique las secuencias de aminoácidos indicadas. Además, estos anticuerpos pueden producirse, por ejemplo, usando uno o más de los siguientes métodos.

Están disponibles numerosos métodos para obtener anticuerpos, particularmente anticuerpos humanos. Un método ejemplar incluye cribar colecciones de expresión de proteínas, por ejemplo, colecciones de presentación en fagos o ribosomas. La presentación en fagos se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.223.409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; documento WO 92/18619; documento WO 91/17271; documento WO 92/20791; documento WO 92/15679; documento WO 93/01288; documento WO 92/01047; documento WO 92/09690; y documento WO 90/02809. La presentación de Fab en fagos se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.25.658.727; 5.667.988 y 5.885.793.

Además del uso de colecciones de presentación, pueden usarse otros métodos para obtener un anticuerpo. Por ejemplo, puede usarse una proteína o un péptido de la misma como antígeno en un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón, hámster o rata.

Pueden generarse anticuerpos humanizados remplazando secuencias de la región variable Fv que no están directamente implicados en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas. Se proporcionan métodos generales para generar anticuerpos humanizados por Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202­ 1207, por Oi etal. (1986) BioTechniques 4: 214 y por la patente de Estados Unidos n.° 5.585.089; patente de Estados Unidos n.° 5.693.761; patente de Estados Unidos n.° 5.693.762; patente de Estados Unidos n.° 5.859.205; y patente de Estados Unidos n.° 6.407.213. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o parte de regiones variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Las fuentes de dicho ácido nucleico son bien conocidas por los expertos en la materia y, por ejemplo, pueden obtenerse de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, como se describe anteriormente, de genes de inmunoglobulina de la línea germinal, o de construcciones sintéticas. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado entonces puede clonarse en un vector de expresión apropiado.

Los anticuerpos pueden estar en forma de anticuerpos de longitud completa, o en forma de fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')², Fd, dAb y scFv. Formas adicionales incluyen una proteína que incluye un solo dominio variable, por ejemplo, un dominio de camélido o camelizado. Véase, por ejemplo, el documento U.S. 2005­ 0079574 y Davies et al. (1996) Protein Eng. 9(6): 531-7.

En determinadas realizaciones, el anticuerpos puede ser un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv monocatenario. Típicamente, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo monoespecífico.

En otra realización, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, humanizado, con injerto de CDR, quimérico, mutado, de afinidad madurada, desinmunizado, sintético o generado in vitro de otro modo, y combinaciones de los mismos.

Las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo pueden ser sustancialmente de longitud completa. La proteína puede incluir al menos una, o dos, cadenas pesadas completas, y al menos una, o dos, cadenas ligeras completas, o puede incluir un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv monocatenario). En otras realizaciones más, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena pesada elegida de, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE; particularmente, elegida de, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, más particularmente, IgG1 (por ejemplo, IgG1 humana). Típicamente, la región constante de la cadena pesada es humana o una forma modificada de una región constante humana. En otra realización, el anticuerpo tiene una región constante de la cadena ligera elegida de, por ejemplo, kappa o lambda, particularmente, kappa (por ejemplo, kappa humana).

Los métodos de la invención pueden usarse para preparar polipéptidos que comprenden anticuerpos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos que tienen dominios constantes de inmunoglobulina de anticuerpo humano acoplados a uno o más dominios variables de inmunoglobulina de anticuerpo murino, y/o anticuerpos no humanos, o fragmentos de los mismos. Ejemplos específicos de anticuerpos adecuados para su uso en la presente invención incluyen anticuerpos disponibles en el mercado tales como muromonab-CD3 (ORTHOCLONE OKT-3®, Ortho Biotech), abciximab (R.EOPRO®, Lilly), rituximab (RITUXAN®, Biogen IDEC), natalizumab (TYSABRI®, Biogen IDEC), dacliximab (z En APAX®, Roche Laboratories), basiliximab (SIMULECT®, Novartis), infliximab (Re M iCADE®, Centocor), palivizumab (SYNAGIS®, MedImmune), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), gemtuzuman ozogamicina (m YLo TARG™, Wyeth-Ayerst), alemtuzumab (CAMPATH®, Berlex) y cualquier combinación de los mismos.

Ejemplos de anticuerpos o conjugados de anticuerpo/citotoxina o anticuerpos/luminóforo contemplados para su uso en la invención incluyen los que reconocen uno o más de los siguientes antígenos: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de lL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, PDGF-p, v Eg F, Tg F, TGF-p2, TGF-p1, receptor de EGF, receptor de VEGF, complemento C5, IgE, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto génico que se expresa en asociación con cáncer pulmonar), HER-2, una glucoproteína asociada a tumor TAG-72, el antígeno SK-1, epítopos asociados a tumor que están presentes en niveles elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o pancreático, epítopos asociados a cáncer o polipéptidos expresados en células de cáncer de mama, colon, escamocelular, próstata, pancreático, pulmonar y/o renal y/o en células de melanoma, glioma o neuroblastoma, receptores de TRAIL 1, 2, 3 y 4, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3), leucointegrina adhesina, la glucoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor VIIa-tromboplastina tisular), MHC I, antígeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos), receptor de Fc-y-1 , HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, L-selectina, IFN-y, virus sincitial respiratorio, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), Streptococcus mutans y Staphylococcus aureus.

Los métodos de la invención también pueden usarse para anticuerpos antiidiotípicos, o polipéptidos sustancialmente similares incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos antiidiotípicos contra: un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral gp72; un anticuerpo contra el gangliósido GD3; o un anticuerpo contra el gangliósido GD2.

Receptores

En algunas realizaciones, el polipéptido de interés comprende un receptor. Los receptores son típicamente glucoproteínas transmembranarias que funcionan reconocimiento un ligando de señalización extracelular. Los receptores típicamente tienen un dominio proteína cinasa además del dominio de reconocimiento de ligando, que inicia una ruta de señalización fosforilando moléculas intracelulares diana tras la unión al ligando, dando lugar a cambios en el desarrollo o metabólicos dentro de la célula. El receptor puede modificarse para retirar el uno o más dominios transmembranarios y/o intracelulares, en cuyo lugar puede fijarse opcionalmente un dominio de Ig.

Una gran familia de receptores es las tirosina cinasas receptoras (RTK). La familia de RTK incluye receptores que son cruciales para una diversidad de funciones en numerosos tipos celulares (véase, por ejemplo, Yarden y Ullrich, Ann. Rev. Biochem, 57: 433-478, 1988; Ullrich y Schlessinger, Cell 61: 243-254, 1990, incorporado en este documento). Ejemplos no limitantes de RTK incluyen miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), tirosina cinasa con receptores de inmunoglobulina y de dominios de homología-1 de EGF (TIE-1) y TIE-2 (Sato etal., Nature 376(6535): 70-74 (1995), incorporado en este documento por referencia) y receptor de c-Met, de los que algunos de ellos se ha sugerido que promueven la angiogénesis, directa o indirectamente (Mustonen y Alitalo, J Cell Biol. 129: 895-898, 1995). Otros ejemplos no limitantes de RTK incluyen cinasa hepática fetal 1 (FLK-1) (a veces denominada receptor que contiene dominio de inserción de cinasa (KDR) (Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991) o receptor 2 del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGFR-2)), tirosina cinasa-1 de tipo fins (Flt-1) (DeVries et al. Science 255; 989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5: 519-524, 1990), a veces denominado receptor 1 del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGFR-1), neuropilina-1, endoglina, endosialina y Ax1.

Receptores acoplados a proteína G

En algunas realizaciones, el polipéptido de interés comprende un receptor acoplado a proteína G (GPCR). Los GPCR son proteínas que tienen siete dominios transmembranarios. Tras la unión de un ligando a un GPCR, se transduce una señal dentro de la célula, que provoca un cambio en una propiedad biológica o fisiológica de la célula.

Los GPCR, junto con las proteínas G y efectores (enzimas intracelulares y canales que se modulan por proteínas G), son los componentes de un sistema de señalización modular que conecta el estado de los segundos mensajeros intracelulares con aportes extracelulares. Estos genes y productos génicos son posibles agentes causantes de enfermedad.

La superfamilia de proteínas GPCR ahora contiene más de 250 tipos de parálogos, receptores que representan variantes generadas por duplicaciones génicas (u otros procesos), en oposición a los ortólogos, el mismo receptor de diferentes especies. La superfamilia puede descomponerse en cinco familias: familia I, receptores tipificados por el receptor de rodopsina y beta2-adrenérgico y actualmente representada por más de 200 miembros únicos; familia II, la familia recientemente caracterizada de receptor de la hormona paratiroidea/calcitonina/secretina; familia III, la familia del receptor metabotrópico de glutamato en mamíferos; familia IV, la familia del receptor de AMPc, importante en la quimiotaxis y el desarrollo de D. discoideum; y familia V, los receptores de feromonas de acoplamiento fúngico tales como STE2.

Factores de crecimiento y otras moléculas de señalización

En algunas realizaciones, el polipéptido de interés comprende un factor de crecimiento o una molécula de señalización. Los factores de crecimiento típicamente son glucoproteínas que se secretan por células y se unen a y activan receptores en otras células, iniciando un cambio metabólico o en el desarrollo en la célula receptora.

Polipéptidos que contienen CH2/CH3

Cualquier polipéptido que contenga un dominio CH2/CH3 es adecuado para su uso de acuerdo con la presente invención. En una realización, el polipéptido que contiene CH2/CH3 es una forma soluble del receptor de TNF fusionado a una región Fc (TNFR-Fc). Un TNFR-Fc disponible en el mercado es conocido como etanercept (ENBREL®, Immunex Corporation), que es un polipéptido de fusión dimérico que consiste en la parte de unión a ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) de 75 kilodalton humano (p75) ligada a la parte Fc de IgG1 humana. El componente Fc de etanercept contiene el dominio peso constante 2 (CH2), el dominio pesado constante 3 (CH3) y la región de bisagra, pero no el dominio pesado constante 1 (CH1) de IgG1 humana. Debe apreciarse que una región Fc puede contener uno o todos los dominios descritos anteriormente. Etanercept se produce por tecnología de ADN recombinante en un sistema de expresión celular de mamífero de ovario de hámster chino (CHO). Consiste en 934 aminoácidos y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 150 kilodalton (Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.).

Ortos polipéptidos que pueden purificarse de acuerdo con la invención incluyen polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden al menos una parte de una región Fc de un anticuerpo. Un polipéptido fusionado a un dominio Fc (por ejemplo, un dominio CH2/CH3) e idéntico o sustancialmente similar a uno de los siguientes polipéptidos es adecuado para su uso en el presente método divulgado: un ligando flt3, un ligando CD40, eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, ligando Fas, ligando para el activador receptor de NF-kappa B (RANKL), ligando inductor de apoptosis relacionado con factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL), linfopoyetina derivada del estroma tímico, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, factor de crecimiento de mastocitos, factor de crecimiento de células madre, factor de crecimiento epidérmico, RANTES, hormona del crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a insulina, hormona paratiroidea, interferones, factores de crecimiento nervioso, glucagón, interleucinas 1 a 18, factores estimulantes de colonias, linfotoxina-p, factor de necrosis tumoral (TNF), factor inhibidor de leucemia, oncostatina-M, diversos ligandos para moléculas de superficie celular ELK y Hek (tal como los ligandos para cinasas relacionadas con eph o LERKS) y cualquier combinación de los mismos.

Los polipéptidos adecuados para purificación de acuerdo con la invención también incluyen polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden dominios CH2/CH3 de un anticuerpo más un receptor para cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente o polipéptidos sustancialmente similar a dichos receptores. Estos receptores incluyen: ambas formas de TNFR (denominadas p55 y p75), receptores de interleucina-1 (tipo 1 y 2), receptor de interleucina-4, receptor de interleucina-15, receptor de interleucina-17, receptor de interleucina-18, receptor de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, receptor de factor estimulante de colonias de granulocitos, receptores para oncostatina-M y factor inhibidor de leucemia, activador receptor de NF-kappa B (RANK), receptores para TRAIL (receptores 1,2, 3 y 4 de TRAIL) y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como el receptor de Fas o inductor de apoptosis (AIR), así como cualquier combinación de los mismos.

Otros polipéptidos adecuados para su uso en el presente método incluyen antígenos de diferenciación (denominados polipéptidos CD) o sus ligandos o polipéptidos sustancialmente similar a cualquiera de estos, que se fusionan a dominios CH2/CH3 de un anticuerpo. Dichos antígenos se divulgan en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japón, 1996). Se divulgan polipéptidos CD similares en seminarios y conferencias posteriores en la serie de procedimientos mencionada anteriormente. Ejemplos de dichos antígenos incluyen CD27, CD30, CD39, CD40, y ligandos para los mismos (ligando de CD27, ligando de CD30, etc.). Varios de los antígenos CD son miembros de la familia del receptor de TNF, que también incluye ligando 41BB y OX40. Los ligandos a menudo son miembros de la familia de TNF, como son el ligando 41BB y el ligando OX40. Por consiguiente, los miembros de las familias de TNF y TNFR pueden purificarse de acuerdo con la presente invención.

Los polipéptidos enzimáticamente activos o sus ligandos también pueden purificarse de acuerdo con la invención. Ejemplos incluyen polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden dominios CH2/CH3 de un anticuerpo fusionados a la totalidad o parte de uno de los siguientes polipéptidos o sus ligandos o un polipéptido sustancialmente similar a uno de estos: miembros de la familia de metaloproteinasa-disintegrina, diversas cinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador tisular del plasminógeno, factor VIII, factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A­ I, globinas, un antagonista de IL-2, alfa-1 antitripsina, enzima convertidora de TNF-alfa, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente, otras numerosas enzimas y sus ligandos, y cualquier combinación de los mismos.

B. Producción de polipéptidos de interés en un cultivo celular

Células

Un polipéptido de interés primero se expresa y se produce en una célula hospedadora. Las células hospedadoras incluyen, aunque sin limitación, células procariotas, células eucariotas, células vegetales, células de levadura, células animales, células de insecto, células aviares, células de mamífero y células humanas.

Ejemplos no limitantes de células procariotas que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen células bacterianas, tales como bacterias gramnegativas o grampositivas, por ejemplo, Escherichia coli.

Ejemplos no limitantes de células de mamífero que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/1, ECACC n.2: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 a Tc C Cc L 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervicouterino humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, a Tc C CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL5 1); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Además, pueden utilizarse muchísimas líneas celulares disponible en el mercado y no disponibles en el mercado que expresan polipéptidos o proteínas, de acuerdo con la presente invención.

Las células hospedadoras también pueden seleccionarse o manipularse para modificar sus rutas de modificación postraduccional. Por ejemplo, las células pueden seleccionarse o manipularse para modificar una ruta de glucosilación proteínica.

Procesos de cultivo celular para la producción de polipéptido de interés

Diversos métodos de preparación de células de mamífero para la producción de proteínas o polipéptidos por cultivo discontinuo o semicontinuo son bien conocidos en la técnica. Un ácido nucleico suficiente para conseguir la expresión (típicamente un vector que contiene el gen que codifica el polipéptido o proteína de interés y cualquier elemento de control genético unido de forma funcional) puede introducirse en la línea celular hospedadora por muchísimas técnicas bien conocidas. Típicamente, las células se criban para determinar las células hospedadoras que han captado realmente el vector y expresan el polipéptido o proteína de interés. Los métodos tradicionales de detección de un polipéptido o proteína de interés particular expresada por células de mamífero incluyen, aunque sin limitación, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, citometría de flujo, microscopia de inmunofluorescencia, SDS-PAGE, transferencias de Western, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), técnicas de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), ensayos de actividad biológica y cromatografía de afinidad. Un experto en la materia será consciente de otras técnicas apropiadas para detectar polipéptidos o proteínas expresadas. Si múltiples células hospedadoras expresan el polipéptido o proteína de interés, algunas o todas las técnicas enumeradas pueden usarse para determinar las células que expresan ese polipéptido o proteína a los niveles más altos.

C. Purificación de polipéptido de interés

Los procedimientos para la purificación de proteínas a partir de cultivo celular dependen inicialmente del sitio de expresión de la proteína. Puede provocarse que algunas proteínas se secreten directamente desde la célula en el medio de crecimiento circundante; otras se generan de forma intracelular. Para las últimas proteínas, la primera etapa de un proceso de purificación implica la lisis de la célula, que puede hacerse mediante una diversidad de métodos, incluyendo cizallamiento mecánico, choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Dicha alteración libera los contenidos completos de la célula en el homogeneizado, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de retirar debido a su pequeño tamaño. Estos se retiran en general por centrifugación diferencial o por filtración. Surge el mismo problema, aunque a menor escala, con proteínas secretadas directamente, debido a la muerte natural de las células y liberación de proteínas intracelulares de la célula hospedadora en el transcurso del ciclo de producción de proteínas.

Una vez se ha obtenido una solución aclarada que contiene la proteína de interés, su separación de las otras proteínas producidas por la célula, así como de otras impurezas se intenta habitualmente usando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía. Estas técnicas separan mezclas de proteínas basándose en su carga, grado de hidrofobia, tamaño o afinidad de unión específica.

III. Inactivación de virus durante el proceso de purificación de proteínas

Una preocupación crucial durante el proceso de purificación de proteínas es la inactivación o retirada de contaminaciones víricas. Cuando un polipéptido de interés se produce de forma recombinante en un cultivo celular, el ADN recombinante que codifica el polipéptido debe transfectarse en las células productoras de proteína. Los virus pueden permanecer en el cultivo después de transfección y contaminar las muestras proteínicas. Además, las células usadas para expresar proteínas de interés pueden codificar genomas víricos en su ADN o contener de otro modo virus endógenos, que es otra posible fuente de contaminación a un producto terapéutico derivado de células. Un producto terapéutico derivado biológicamente, tal como un polipéptido producido en un cultivo celular, debe experimentar al menos dos etapas robustas de purificación de virus para cumplir los requisitos de seguridad de las agencias reguladoras tales como la FDA para garantizar que no se administran virus activos a un paciente.

Se conocen varios métodos en la técnica para inactivar virus. Por ejemplo, puede usarse arginina para inactivación vírica, tal como el método descrito en la publicación de Estados Unidos n.° 2012/0015424 A1. Cada método, sin embargo, tiene sus propias desventajas, y puede no ser adecuado u óptimo para algunos productos proteínicos.

Cuando se usa bajo pH para inactivar virus, tiene el potencial de precipitar proteínas, provocar agregación del producto y/o alterar la conformación de determinadas proteínas, lo que puede dar lugar a pérdida de producto. Además, durante el proceso de purificación de la proteína, la etapa de inactivación vírica a bajo pH se realiza típicamente después de que la proteína de interés haya eluido de la columna de cromatografía y se haya mantenido en un depósito o recipiente, especialmente si se sabe que la proteína diana eluye de la matriz en condiciones de bajo pH, provocando pérdida significativa de producto. Por ejemplo, un polipéptido que contiene CH2/CH3 tal como un anticuerpo monoclonal o FIX-Fc se eluye de la columna de proteína A a valores de pH por debajo de 4,5.

La presente invención proporciona un método novedoso de inactivación vírica en columna como se define en las reivindicaciones, que comprende lavar una matriz de cromatografía unida al polipéptido con una solución de lavado de bajo pH y alta salinidad que inactiva de forma eficaz los virus y maximiza la recuperación del polipéptido. Realizar la etapa de inactivación a bajo pH sobre un polipéptido unido a una matriz de cromatografía mejora la estabilidad del polipéptido porque el polipéptido unido tiende a conservar su conformación natural y no puede agregarse entre sí. Además, la presencia de alta salinidad en la solución de lavado reduce significativamente la elución del polipéptido en condiciones de bajo pH.

La presente invención proporciona un método de inactivación de virus que está presente durante la producción de un polipéptido de interés, que comprende: (a) unir el polipéptido a una matriz de cromatografía, y (b) realizar una etapa de inactivación vírica lavando la matriz de cromatografía unida al polipéptido con una solución de lavado a un pH de menos de aproximadamente 4,0. La solución de lavado usada de acuerdo con la presente invención comprende una concentración suficiente de sal para reducir sustancialmente la elución del polipéptido durante la etapa de inactivación vírica. La reducción sustancial de la elución del polipéptido se debe probablemente a interacciones hidrófobas potenciadas entre el polipéptido y la matriz.

Los métodos de la presente invención son útiles para inactivar una amplia gama de virus con envuelta. Los virus que pueden inactivarse mediante realizaciones de la presente invención incluyen, sin limitación, virus con envuelta clasificados tales como, por ejemplo, virus de leucemia de mamífero o aviar, virus del herpes, virus de la viruela, hepadnavirus, flavivirus, togavirus, coronavirus, virus de la hepatitis, retrovirus, ortomixovirus, paramixovirus, radovirus, bunyavirus, filovirus, reovirus, virus de la encefalitis, virus Sindbis, virus de la estomatitis vesicular, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la rinotraqueítis, virus de Epstein Barr, citomegalovirus, virus de la gripe, virus Sendai, virus de la variolovacuna o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo, un polipéptido que contiene CH2/CH3, un factor de coagulación, un receptor y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el polipéptido de interés es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.

En algunas realizaciones, el polipéptido de interés comprende un factor de coagulación. En determinadas realizaciones, el polipéptido de interés es FIX-Fc, FVIII-Fc o FVII-Fc. En determinadas realizaciones, el polipéptido es un híbrido de monómero-dímero. En determinadas realizaciones, el polipéptido comprende además un resto heterólogo.

Pueden usarse muchas técnicas de cromatografía conocidas en la técnica en la presente invención. En algunas realizaciones, la matriz de cromatografía es una matriz de cromatografía de afinidad. En una realización, la matriz de cromatografía de afinidad es una columna de proteína A. En otra realización más, la columna de proteína A se selecciona del grupo que consiste en MABSELECT™, MABSELECT™ SuRe, MABSELECT™ SuRe LX, ESHMUNO® A, AMSPHERE™ JWT203, TOYOPEARL® AF-rProtein A-650F, PROSEP®-vA Ultra, PROSEP® Ultra Plus, PROSEP®-vA High Capacity, y cualquier combinación de las mismas. Ejemplos no limitantes de matriz de cromatografía que puede usarse para inmovilizar el ligando de proteína incluyen matriz basada en dextrano, matriz basada en agarosa, matriz basada en poliestireno, matriz hidrófila basada en polivinil etilo, matriz rígida basada en polimetacrilato, matriz porosa basada en polímero, matriz de poro controlado basada en vidrio y cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, la matriz de cromatografía es una matriz de cromatografía de modo mixto. En una realización, la matriz de cromatografía es una matriz de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto. En una realización, la matriz de cromatografía de modo mixto se selecciona del grupo que consiste en CAPTO™ Adhere, CAPTO™ MMC, ESHMUNO® HCX, CAPTO™ MMC ImpRes, CAPTO™ Blue, NUVIA™ cPrime, BLUE SEPHAROSE® Fast Flow, CAPTO™ Adhere ImpRes, CHT™ Ceramic Hydroxyapatite, CFT™ Ceramic Fluoroapatite y cualquier combinación de las mismas. Ejemplos no limitantes de matriz de cromatografía de modo mixto incluyen matriz basada en dextrano, matriz basada en agarosa, matriz basada en poliestireno, matriz basada en polímero hidrófilo de polivinil etilo, matriz basada en polímero macroporoso altamente reticulado, matriz basada en hidroxiapatita ((Ca⁵(PO⁴)³OH)²), matriz basada en fluoroapatita ((Cas(PO4)3F)2) y cualquier combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, el polipéptido de interés en primer lugar se recoge después de producirse de forma recombinante en cultivo celular. En determinadas realizaciones, el polipéptido se carga en la matriz de cromatografía a un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0. En algunas realizaciones, el pH del tampón de carga es de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0 o de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0. En una realización, el pH del tampón de carga es aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,5 o aproximadamente 8,0.

Una o más etapas de lavado pueden realizarse antes de eluir el polipéptido de la matriz de cromatografía. Pueden usarse soluciones de lavado iguales o diferentes en estas etapas de lavado.

En determinadas realizaciones, el pH de la solución de lavado es de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,0, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 3,5 o de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 4,0. En determinadas realizaciones, el pH de la solución de lavado es aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,9, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9 o aproximadamente 4,0. En una realización, el pH de la solución de lavado es 3,0. En otra realización, el pH de la solución de lavado es 3,5.

Ejemplos no limitantes de sales que pueden añadirse a la solución o a cualquier tampón usado de acuerdo con la presente invención incluyen sales de sodio, sales de potasio, sales de calcio, sales de magnesio, sales de bario, sales de cinc, sales de aluminio, sales de amonio, sales de cloruro, sales de fluoruro, sales de bromuro, sales de yoduro, sales de carbonato, sales de nitrato, sales de fosfato, sales de sulfato, sales de acetato y combinación de las mismas. En una realización, la sal es cloruro de sodio (NaCl). En otra realización, la sal es sulfato de amonio.

En determinadas realizaciones, la concentración de la sal en la solución de lavado es mayor de aproximadamente 0,5 M. En algunas realizaciones, la concentración de la sal en la solución de lavado es de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 2,5 M, de aproximadamente 2,5 M a aproximadamente 3,0 M, de aproximadamente 3,0 M a aproximadamente 3,5 M o de aproximadamente 3,5 M a aproximadamente 4 M. En algunas realizaciones, la concentración de la sal en la solución de lavado es aproximadamente 0,5 M, aproximadamente 0,6 M, aproximadamente 0,7 M, aproximadamente 0,8 M, aproximadamente 0,9 M, aproximadamente 1,0 M, aproximadamente 1,1 M, aproximadamente 1,2 M, aproximadamente 1,3 M, aproximadamente 1,4 M, aproximadamente 1,5 M, aproximadamente 1,6 M, aproximadamente 1,7 M, aproximadamente 1,8 M, aproximadamente 1,9 M, aproximadamente 2,0 M, aproximadamente 2,1 M, aproximadamente 2,2 M, aproximadamente 2,3 M, aproximadamente 2,4 M, aproximadamente 2,5 M, aproximadamente 2,6 M, aproximadamente 2,7 M, aproximadamente 2,8 M, aproximadamente 2,9 M, aproximadamente 3,0 M, aproximadamente 3,1 M, aproximadamente 3,2 M, aproximadamente 3,3 M, aproximadamente 3,4 M, aproximadamente 3,5 M, aproximadamente 3,6 M, aproximadamente 3,7 M, aproximadamente 3,8 M, aproximadamente 3,9 M o aproximadamente 4,0 M. En una realización específica, la concentración de sal es aproximadamente 2 M. En otra realización específica, la concentración de sal es aproximadamente 3 M.

La solución de lavado puede comprender además uno o más componentes distintos tales como un polímero, un disolvente orgánico, un detergente, arginina o un derivado de arginina.

En determinadas realizaciones, el polímero es un polietilenglicol (PEG), un polipropilenglicol o una mezcla de los mismos. En una realización, el polímero es PEG. En una realización específica, el polímero es PEG 3350. En algunas realizaciones, la concentración del polímero es de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 20 %. En algunas realizaciones, la concentración del polímero es de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 15 %, de un 0,1 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 15 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 15 % o de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 20 %. En algunas realizaciones, la concentración del polímero es de aproximadamente un 0,1 %, aproximadamente un 0,5 %, aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 6 %, aproximadamente un 7 %, aproximadamente un 8 %, aproximadamente un 9 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 11 %, aproximadamente un 12 %, aproximadamente un 13 %, aproximadamente un 14 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 16 %, aproximadamente un 17 %, aproximadamente un 18 %, aproximadamente un 19 % o aproximadamente un 20 %.

En determinadas realizaciones, el disolvente orgánico es etanol, metanol, isopropanol, acetona, etilenglicol, propilenglicol, hexaetilenglicol o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, la concentración del disolvente orgánico es de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 20 %. En algunas realizaciones, la concentración del disolvente orgánico es de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 15 %, de un 0,1 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 15 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 15 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 15 % o de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 20 %. En algunas realizaciones, la concentración del disolvente orgánico es de aproximadamente un 0,1 %, aproximadamente un 0,5 %, aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 6 %, aproximadamente un 7 %, aproximadamente un 8 %, aproximadamente un 9 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 11 %, aproximadamente un 12 %, aproximadamente un 13 %, aproximadamente un 14 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 16 %, aproximadamente un 17 %, aproximadamente un 18 %, aproximadamente un 19 % o aproximadamente un 20 %.

En determinadas realizaciones, el detergente se selecciona del grupo que consiste en condensado de octilfenol y óxido de etileno (por ejemplo, TRITON™ X-100); 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS); 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO); óxido de laurildimetil amina (LDAO); polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 u 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); dodecil sulfato de sodio (SDS); laurel sulfato de sodio, octil glucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína, lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio o metil oleil-taurato de disodio; etilsulfato de 1 -etil-1 -(2-hidroxietil)-2-isoheptadecilimidazolinio (por ejemplo, la gama MONAQUAT™); y cualquier combinación de los mismos. Otros ejemplos de productos comerciales que comprenden compuestos similares a TRITON™ X-100 incluyen, aunque sin limitación, CONCO™ NI, DOWFAX™ 9N, IGEPAL™ CO, MAKON™, NEUTRONYX® 600's, NONIPOL™ NO, POLYTERGENT® B, RENEX™ 600's, SOLAR™ NO, STEROX™, SERFONIC™ N, T-DET-N™, TERGITOL™ NP y TRITON™ N.

En algunas realizaciones, la concentración del detergente es de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 8 %. En algunas realizaciones, la concentración del detergente es de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 7 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 6 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,5 %, de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,1 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 8 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 7 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 6 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 0,5 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 8 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 7 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 6 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 8 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 7 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 6 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 3 % o de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 %.

En algunas realizaciones, la concentración del detergentes es de aproximadamente un 0,01 %, aproximadamente un 0,05 %, aproximadamente un 0,1 %, aproximadamente un 0,5 %, aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 6 %, aproximadamente un 7 % o aproximadamente un 8 %.

En determinadas realizaciones, se realiza más de una etapa de inactivación vírica en columna durante la purificación del polipéptido. En una realización, se usan soluciones de lavado idénticas en múltiples etapas de inactivación vírica.

En otra realización, se usan soluciones de lavado diferentes en múltiples etapas de inactivación vírica.

En algunas realizaciones, al menos una de las soluciones de lavado comprende arginina, un derivado de arginina o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, la concentración de arginina es de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1 M. En algunas realizaciones, la concentración de arginina es de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,5 M o de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M. En algunas realizaciones, la concentración de arginina es aproximadamente 0,1 M, aproximadamente 0,2 M, aproximadamente 0,3 M, aproximadamente 0,4 M, aproximadamente 0,5 M, aproximadamente 0,6 M, aproximadamente 0,7 M, aproximadamente 0,8 M, aproximadamente 0,9 M o aproximadamente 1 M.

En algunas realizaciones, al menos una de las soluciones de lavado comprende un detergente. En una realización, el detergente es óxido de laurildimetil amina (LDAO). En otra realización, el detergente es condensado de octilfenol y óxido de etileno (por ejemplo, TRITON™ X-100). En otras realizaciones, el detergente comprende un compuesto muy similar a TRITON™ X-100 (por ejemplo, CONCO™ NI, DOWFAX™ 9N, IGEPAL™ CO, MAKON™, NEUTRONYX® 600's, NONIPOL™ NO, POLYTERGENT® B, RENEX™ 600's, SOLAR™ NO, STEROX™, SERFONIC™ N, T-DET-N™, TERGITOL™ NP y TRITON™ N).

En determinadas realizaciones, la elución del polipéptido durante la etapa de lavado de bajo pH para la inactivación vírica se reduce hasta menos de un 30 %. En determinadas realizaciones, la elución del polipéptido durante la etapa de lavado de bajo pH se reduce hasta menos de un 25 %, menos de un 20 %, menos de un 15 %, menos de un 10 % o menos de un 5 %.

Después de las etapas de lavado, el polipéptido de interés se eluye de la matriz de cromatografía con una solución de elución. En determinadas realizaciones, el pH de la solución de elución es menos de 4,5. En una realización, el pH de la solución de elución es aproximadamente 3,0. En otra realización, el pH de la solución de elución es aproximadamente 3,4.

En determinadas realizaciones, al menos aproximadamente un 70 % del polipéptido se recupera en la solución de elución. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % del polipéptido se recupera en la solución de elución.

Pueden realizarse etapas adicionales de inactivación vírica antes, o después, del método de inactivación vírica en columna divulgado en este documento.

El polipéptido de interés eluido puede someterse a etapas adicionales de purificación antes, o después, del método de purificación divulgado en este documento. Los métodos convencionales incluyen, aunque sin limitación, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, afinidad, exclusión por tamaño e hidroxiapatita), filtración en gel, centrifugación o solubilidad diferencial, precipitación en etanol o por cualquier otra técnica disponible para la purificación de proteínas (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2.a edición, Springer-Verlag, Nueva York, 1987; Higgins, S. J. y Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; y Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997). Pueden añadirse inhibidores de proteasa tales como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF), leupeptina, pepstatina o aprotinina a alguna o todas las fases para reducir o eliminar la degradación del polipéptido o proteína durante el proceso de purificación. Los inhibidores de proteasa son particularmente deseados cuando las células deben lisarse para aislar y purificar el polipéptido o proteína expresada. Un experto en la materia apreciará que la técnica exacta de purificación variará dependiendo del carácter del polipéptido o proteína a purificar, el carácter de las células a partir de las que se expresa el polipéptido o proteína, y la composición del medio en que se cultivan las células.

El método de inactivación vírica de la presente invención puede usarse para ayudar a posibilitar procesos que utilizan múltiples columnas de cromatografía de afinidad como lecho móvil simulado o cromatografía en tándem que genera múltiples combinaciones de elución. En lugar de combinar las combinaciones de elución para realizar inactivación vírica a bajo pH, lo que puede provocar un largo mantenimiento a valores bajos de pH y una mayor pérdida de producto, o ir a través del tedioso y largo proceso de realizar inactivación vírica a bajo pH en las combinaciones individuales, la presente invención realiza inactivación vírica a bajo pH durante los ciclos individuales de cromatografía en tándem o en lecho móvil simulado, obviando, por tanto, la necesidad de inactivación vírica de las combinaciones de elución.

La descripción anterior tiene que entenderse como representativa solamente y no se pretende que sea limitante.

La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que pertenece a las habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2.a Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1992), DNA Cloning, D. N. Glover ed., volúmenes I y II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. patente de Estados Unidos n.°: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames y S. J. Higgins eds. (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames y S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller y M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vol. 154 y 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres (1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV, D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplos

Ejemplo 1

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene sulfato de amonio 2 M a pH 3,5

El objetivo de los experimentos mostrados en los ejemplos 1 a 10 es demostrar la viabilidad y aplicabilidad de una etapa de inactivación vírica a bajo pH usando ProA y un polipéptido diana. El polipéptido se unión a ProA en condiciones convencionales antes de aplicar una alta concentración salina a neutral pH a la columna. Después se aplicó un lavado posterior a alta salinidad y bajo pH para inactivar el virus mientras el polipéptido permanecía unido al adsorbente. Se realizó una serie de lavados antes de que se recuperara el polipéptido usando una solución de elución.

El objetivo del primer experimento fue determinar si podía realizarse inactivación vírica en columna con pérdida mínima de recuperación usando lavado con sulfato de amonio 2 M a pH 3,5.

En este experimento, en primer lugar se equilibró (EQ) una columna MABSELECT™ SuRe de 0,66 cm de diámetro (7,2 ml; 21 cm) con 4 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio (fosfatoNa) 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4. Entonces se cargaron 256 ml de líquido de cultivo celular recogido (HCCF) filtrado (a 0,22 gm) que contenía FIX-Fc producido de forma recombinante en la columna (25,5 mg de rFIXFc por ml de resina).

La carga fue seguida de siete etapas de lavado como se indica en la tabla 1 a continuación. El polipéptido diana posteriormente se eluyó con citrato 25 mM, NaCl 150 mM, pH 3,4. El caudal de la cromatografía fue constante a 300 cm/h o 1,7 ml/min, excepto en que se usó una tasa menor (100 cm/h) durante la etapa de lavado de bajo pH (lavado 4).

Tabla 1. Tam ones individuales usados en el eem lo 1.

La figura 1 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La recuperación del polipéptido fue de un 84 % en el eluido, lo que es sorprendente dado el bajo pH del lavado 4 (pH = 3,5) porque dicho lavado de bajo pH habitualmente daría lugar a disociación del polipéptido de la columna y provocaría pérdida sustancial de producto. La eliminación vírica medida por PCR fue 4,96 log¹⁰. La eliminación e inactivación combinada proporcionada por los lavados de columna fue mayor a > 6,39 log¹⁰, lo que indica que el bajo pH puede proporcionar inactivación eficaz de los virus.

Se ensayaron muestras para virus infeccioso por ensayo de placas y para ácidos nucleicos víricos por ensayo de Q-PCR. La carga de la columna fue 25,5 mg de rFIXFc por ml de resina. las tablas 2 y 3 resumen los resultados de eliminación vírica de X-MLV medida por la infectividad y qPCR, respectivamente.

La carga se enriqueció con 8,79 log¹⁰ de X-MLV (UFP) y se calculó una inactivación retrovírica > 6,39 log¹⁰. Cuando se midió por qPCR, la carga se enriqueció con 8,77 log¹⁰ de X-MLV (GC) y se calculó un factor de reducción de 4,96 log¹⁰. Estos resultados muestran una eliminación retrovírica robusta por la columna MABSELECT™ SuRe a altas cargas y tampón adicional de bajo pH/alta salinidad. Los resultados de infectividad muestran la inactivación retrovírica total después de exponer la resina MABSELECT™ SuRe a una hora de tampón de bajo pH/alta salinidad.

T l 2. D limin i n X-MLV r n MAB ELE T™ R r inf ivi

Tabla 3. Datos de eliminación de X-MLV por etapa con MABSELECT™ SuRe por Qpcr

Por lo tanto, los resultados anteriores demuestran que una solución de lavado de bajo pH y alta salinidad puede inactivar de forma eficaz virus durante una proceso de purificación por cromatografía de proteína A sin retirar la mayoría del polipéptido diana de la columna.

Ejemplo 2

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene arginina HCl 1 M a pH 4,7

El objetivo de este experimento fue comparar los efectos de la inactivación vírica en columna usando una solución de lavado que contenía arginina HCl 1 M a pH 4,7.

En este experimento, la columna de proteína A y el polipéptido diana fueron iguales que en el ejemplo 1. En primer lugar se equilibró una columna MabSelect SuRe de 7,0 ml (20,5 cm), y después se cargaron 157 ml de HCCF que contenía proteína de fusión a Fc en la columna. La tabla 4 a continuación resume las soluciones de tampón usadas en cada etapa. El polipéptido diana se unió a Pro A en condiciones convencionales. Después se aplicó un lavado 3 modificado posterior que contenía arginina para inactivar el virus mientras el polipéptido permanecía unido al adsorbente. El caudal de la cromatografía fue constante a 300 cm/h o 1,7 ml/min, excepto en que se usó una tasa menor (100 cm/h o 0,56 ml/min) durante la etapa de lavado con arginina (lavado 3).

Tabla 4. Tam ones individuales usados en el eem lo 2.

La figura 2 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La recuperación del polipéptido fue de un 83 % en el eluido, lo que es comparable al porcentaje de recuperación usando una solución de lavado de pH 3,5 y sulfato de amonio 2 M como se muestra en el ejemplo 1. La eliminación vírica medida por PCR fue > 5,54 log¹⁰, y la eliminación e inactivación combinada proporcionada por los lavados de columna fue mayor a > 6,39 log¹⁰. Ambos números son muy similares a los del ejemplo 1.

Estos resultados indican que las soluciones de lavado que contienen arginina 1 M a pH 4,7 o pH 3,5 con sulfato de amonio 2 M pueden proporcionar un nivel similar de inactivación vírica y recuperación de proteína.

Ejemplo 3

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene óxido de laurildimetil amina (LDAO) CMC 4x

El objetivo de este experimento fue comparar los efectos de la inactivación vírica en columna usando una solución de lavado que contenía óxido de laurildimetil amina (LDAO) a una concentración micelar crítica (CMC) 4x.

En este experimento, la columna de proteína A y el polipéptido diana aún fueron iguales que en el ejemplo 1. Se equilibró una columna MABSELECT™ SuRe de 7,0 ml (20,5) y después se cargó con 256 ml de HCCF que contenía proteína de fusión a Fc. La tabla 5 a continuación resume las soluciones de tampón usadas en cada etapa. El polipéptido diana se unió a Pro A en condiciones convencionales. Después se aplicó un lavado 4 modificado posterior que contenía LDAO CMC 4x para inactivar el virus mientras el polipéptido permanecía unido al adsorbente. El caudal de la cromatografía fue constante a 300 cm/h o 1,7 ml/min, excepto en que se usó una tasa menor (100 cm/h o 0,56 ml/min) durante la etapa de lavado con detergente (lavado 4).

T l . T m n in ivi l n l m l .

La figura 3 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La recuperación del polipéptido fue de un 85 % en el eluido, lo que es comparable al porcentaje de recuperación usando una solución de lavado de pH 3,5 y sulfato de amonio 2 M. La eliminación vírica medida por PCR fue 5,11 log¹⁰, y la eliminación e inactivación combinada proporcionada por los lavados de columna fue mayor a > 6,40 log¹⁰. Ambos números son similares a los del ejemplo 1.

Estos resultados indican que las soluciones de lavado que contienen LDAO CMC 4x o pH 3,5 con sulfato de amonio 2 M pueden proporcionar un nivel similar de inactivación vírica.

Ejemplo 4

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene PEG al 20 % y NaCl 2 M a pH 3,0

Se usaron diversas soluciones de lavado de bajo pH en los ejemplos 4 a 10 para explorar adicionalmente la viabilidad y aplicabilidad de una etapa de inactivación vírica en columna. Se usó cromatografía de proteína A y un anticuerpo monoclonal en los siguientes experimentos. El anticuerpo monoclonal se unión a ProA en condiciones convencionales antes de aplicar una alta concentración salina a neutral pH a la columna. Después se aplicó un lavado posterior a alta salinidad y bajo pH (aproximadamente pH 3,0) para inactivar el virus mientras el anticuerpos permanecía unido al adsorbente. Se realizó una serie de lavados antes de que se recuperara el anticuerpo usando una solución de elución. El objetivo de este experimento fue determinar si podía realizarse inactivación vírica en columna con pérdida mínima de recuperación usando un lavado de pH 3,0, NaCl 2 M, glicina 100 mM con PEG al 20 %.

En este experimento, en primer lugar se equilibró (EQ) una columna MABSELECT™ SuRe de 0,6 cm de diámetro con 5 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio 75 mM, NaCl 100 mM, pH 7,3. Después se cargaron 50 ml de HCCF filtrado (a 0,22 pm) que contiene el polipéptido de interés en la columna hasta < 35 g/l^resina. La columna se exploró con 3 CV de tampón de equilibrado.

La carga fue seguida de 5 CV de lavado con Bis-Tris 100 mM, NaCl 2 M, pH 7,0 (lavado 1), seguido de 5 CV de lavado de bajo pH con glicina 100 mM, PEG 3350 al 20 %, NaCl 2 M, pH 3,0 (lavado 2). La columna entonces se lavó con 5 CV de Bis-Tris 100 mM, NaCl 2 M, pH 7,0 (lavado 3), seguido de 5 CV de lavado con Bis-Tris 100 mM, pH 7,0 (lavado 4). El polipéptido diana se eluyó posteriormente con glicina 100 mM, pH 3,0 (elución).

La figura 4 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La tabla 6 a continuación resume las condiciones usadas en cada etapa. El caudal de la cromatografía fue constante a 250 cm/h o 1,42 ml/min, excepto en que se usó una tasa menor (50 cm/h) durante la etapa de regeneración. La tabla 7 resume el porcentaje de recuperación calculado para cada etapa de cromatografía.

T l . T m n in ivi l n l m l 4.

Tabla 7. Porcentaje de recuperación en cada etapa de cromatografía usando una solución de lavado que contiene PE l 2 N l 2 M H

Como se muestra en la figura 4 y tabla 7, se observó pérdida de producto solamente mínima (19,5 % del polipéptido diana) durante el lavado de bajo pH (F4, lavado 2) con PEG al 20 % y NaCl 2 M a pH 3,0. La mayoría del producto (73,8 % del polipéptido diana) se recuperó en el tampón de elución (F7).

Ejemplo 5

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene etanol al 2 % y NaCl 2 M a pH 3,0

El objetivo de este experimento fue determinar si podía realizarse inactivación vírica en columna con pérdida mínima de recuperación usando un lavado de pH 3,0, NaCl 2 M, glicina 100 mM con etanol al 2 %.

En este experimento, la columna de proteína A y el polipéptido diana fueron iguales que en el ejemplo 4. Todas las soluciones de tampón usadas en cada etapa también fueron iguales a las enumeradas en la tabla 6, excepto en que la solución de tampón de lavado de bajo pH (lavado 2) fue glicina 100 mM, etanol al 2 %, NaCl 2 M, pH 3,0. Todos los caudales fueron iguales que en el ejemplo 4.

La figura 5 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La tabla 8 resume el porcentaje de recuperación calculado para cada etapa de cromatografía. Tabla 8. Porcentaje de recuperación en cada etapa de cromatografía usando una solución de lavado que contiene n l l 2 N l 2 M H .

Como se muestra en la figura 5 y tabla 8, se observó pérdida de producto solamente mínima (18,2% del polipéptido diana) durante el lavado de bajo pH (F4, lavado 2) con PEG al 20 % y NaCl 2 M a pH 3,0. La mayoría del producto (70,7% del polipéptido diana) se recuperó en el tampón de elución (F7).

Ejemplo 6

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene etanol al 2 % y sulfato de amonio 2 M a pH 3,0

El objetivo de este experimento fue determinar si podía realizarse inactivación vírica en columna con pérdida mínima de recuperación usando un lavado de pH 3,0, sulfato de amonio 2 M, glicina 100 mM con etanol al 2 %.

En este experimento, la columna de proteína A y el polipéptido diana fueron iguales que en el ejemplo 4. Todas las soluciones de tampón usadas en cada etapa también fueron iguales a las enumeradas en la tabla 6, excepto en que la solución de tampón de lavado de bajo pH (lavado 2) fue glicina 100 mM, etanol al 2 %, sulfato de amonio 2 M, pH 3,0 y sulfato de amonio 2 M remplazando el NaCl 2 M en las soluciones de lavado 1 y lavado 3. Todos los caudales fueron iguales que en el ejemplo 4.

La figura 6 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La tabla 9 resume el porcentaje de recuperación calculado para cada etapa de cromatografía. Tabla 9. Porcentaje de recuperación en cada etapa de cromatografía usando una solución de lavado que contiene n l l 2 lf m ni 2 M H .

Como se muestra en la figura 6 y tabla 9, se observó pérdida de producto solamente insignificante (0,2 % del polipéptido diana) durante el lavado de bajo pH (F4, lavado 2) con etanol al 2 % y sulfato de amonio 2 M a pH 3,0. La mayoría del producto (92,3% del polipéptido diana) se recuperó en el tampón de elución (F7).

Ejemplo 7

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene acetona al 2 % y sulfato de amonio 2 M a pH 3,0

El objetivo de este experimento fue determinar si podía realizarse inactivación vírica en columna con pérdida mínima de recuperación usando un lavado de pH 3,0, sulfato de amonio 2 M, glicina 100 mM con acetona al 2 %.

En este experimento, la columna de proteína A y el polipéptido diana fueron iguales que en el ejemplo 4. Todas las soluciones de tampón usadas en cada etapa también fueron iguales a las enumeradas en la tabla 6, excepto en que la solución de tampón de lavado de bajo pH (lavado 2) fue glicina 100 mM, acetona al 2 %, sulfato de amonio 2 M, pH 3,0 y sulfato de amonio 2 M remplazando el NaCl 2 M en las soluciones de lavado 1 y lavado 3. Todos los caudales fueron iguales que en el ejemplo 4.

La figura 7 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La tabla 10 resume el porcentaje de recuperación calculado para cada etapa de cromatografía.

Tabla 10. Porcentaje de recuperación en cada etapa de cromatografía usando una solución de lavado que contiene n l 2 lf m ni 2 M H .

Como se muestra en la figura 7 y tabla 10, se observó pérdida de producto solamente insignificante (0,2 % del polipéptido diana) durante el lavado de bajo pH (F4, lavado 2) con acetona al 2 % y sulfato de amonio 2 M a pH 3,0. La mayoría del producto (más de un 96,3 % del polipéptido diana) se recuperó en el tampón de elución (F7).

Ejemplo 8

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene sulfato de amonio 2 M a pH 3,0

El objetivo de este experimento fue determinar si podía realizarse inactivación vírica en columna con pérdida mínima de recuperación usando un lavado de pH 3,0, sulfato de amonio 2 M, glicina 100 mM sin ningún otro modificador

En este experimento, la columna de proteína A y el polipéptido diana aún fueron iguales que en el ejemplo 4. En primer lugar se equilibró una columna MABSELECT™ SuRe de 6,6 ml (19,4 cm) y después se cargó en 25,8 g/l de resina usando 50 ml de anticuerpo en HCCF. Se usó un caudal de 250 cm/h excepto durante la etapa de regeneración (50 cm/h). Todas las soluciones de tampón usadas en cada etapa también fueron iguales a las enumeradas en la tabla 6, excepto en que la solución de tampón de lavado de bajo pH (lavado 2) fue glicina 100 mM, sulfato de amonio 2 M, pH 3,0 y sulfato de amonio 2 M remplazando el NaCl 2 M en las soluciones de lavado 1 y lavado 3. Todos los caudales fueron iguales que en el ejemplo 4. El lavado de pH 3,0, sulfato de amonio 2 M, glicina 100 mM se usó para mantener el anticuerpo unido a la resina a bajo pH. El lavado de bajo pH, alto contenido de sulfato de amonio se intercaló con un tampón de lavado neutro, de alto contenido de sulfato de amonio (pH 7,0, sulfato de amonio 2 M) para garantizar que estaban presentes altos niveles de sulfato de amonio según se descendía el pH hasta 3,0 y también cuando se elevaba posteriormente hasta 7,0. Sin esto, se producía elución significativa del producto antes y después de la etapa de lavado. Se usó exceso de tampón de lavado en cada etapa para garantizar el intercambio de tampón adecuado. La figura 8 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La tabla 11 resume el porcentaje de recuperación calculado para cada etapa de cromatografía.

Tabla 11. Porcentaje de recuperación en cada etapa de cromatografía usando una solución de lavado que contiene sulfato de amonio 2 M a pH 3,0.

Como se muestra en la figura 8 y tabla 11, se observó pérdida de producto solamente muy mínima (1,9 % del polipéptido diana) durante el lavado de bajo pH (F4, lavado 2) con sulfato de amonio 2 M a pH 3,0. La mayoría del producto (94,4% del polipéptido diana) se recuperó en el tampón de elución (F7). El porcentaje del pico que era anticuerpo monomérico, un 96,0 %, no se alteró por el lavado de alto contenido de sulfato de amonio.

El tampón de lavado de alta salinidad, bajo pH no aumentó la eliminación de la proteína de la célula hospedadora (HCP) en la etapa de proteína A. Los niveles de HCP en el eluido fueron típicamente iguales o mayores a los conseguidos usando un lavado simple de pH neutro, de cloruro de sodio. Es probable que los altos niveles de sulfato de amonio en el lavado de bajo pH potenciara las interacciones entre HCP y los anticuerpos o HCP y la resina de proteína A. También es posible que el sulfato de amonio disminuyera la solubilidad de la HCP, reduciendo la eliminación.

Se realizó un experimento adicional en condiciones similares a las previas, pero con el cloruro de sodio sustituyendo el sulfato de amonio. La pérdida de rendimiento fue mayor usando una etapa de lavado con NaCl 2 M, pH 3,0 (17,0 %) en comparación con la etapa de lavado de sulfato de amonio 2 M pH 3,0 (1,9 %). Como el sulfato de amonio es un cosmótropo más fuerte que el cloruro de sodio, se requiere menor concentración para evitar la elución del anticuerpo. Se cree que usar una concentración mayor de cloruro de sodio (3 M) evitaría la elución del anticuerpo y permitiría la inactivación vírica en columna.

Ejemplo 9

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene TRITON™ X-100 al 2 % y NaCl 2 M a pH 3,0

El objetivo de este experimento fue determinar si podía realizarse inactivación vírica en columna con pérdida mínima de recuperación usando un lavado de pH 3,0, NaCl 2 M, glicina 100 mM con TRITON™ X-100 al 2 %.

En este experimento, la columna de proteína A y el polipéptido diana aún fueron iguales que en el ejemplo 4. Todas las soluciones de tampón usadas en cada etapa también fueron iguales a las enumeradas en la tabla 6, excepto en que la solución de tampón de lavado de bajo pH (lavado 2) fue glicina 100 mM, TRITON™ X-100 al 2 %, NaCl 2 M, pH 3,0. Todos los caudales fueron iguales que en el ejemplo 4.

La figura 9 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La tabla 12 resume el porcentaje de recuperación calculado para cada etapa de cromatografía.

Tabla 12. Porcentaje de recuperación en cada etapa de cromatografía usando una solución de lavado que contiene TRITON™ X-100 al 2 % NaCl 2 M a pH 3,0.

Como se muestra en la figura 9 y tabla 12, se observó pérdida de producto solamente muy mínima (2,3 % del polipéptido diana) durante el lavado de bajo pH (F4, lavado 2) con TRITON™ X-100 al 2 % y NaCl 2 M a pH 3,0. La mayoría del producto (86,2% del polipéptido diana) se recuperó en el tampón de elución (F7).

Ejemplo 10

Inactivación vírica en columna usando una solución de lavado

que contiene NaCl 2 M a pH 3,0

El objetivo de este experimento fue determinar si podía realizarse inactivación vírica en columna con pérdida mínima de recuperación usando un lavado de pH 3,0, NaCl 2 M, glicina 100 mM sin ningún otro modificador

En este experimento, la columna de proteína A y el polipéptido diana aún fueron iguales que en el ejemplo 4. Todas las soluciones de tampón usadas en cada etapa también fueron iguales a las enumeradas en la tabla 6, excepto en que la solución de tampón de lavado de bajo pH (lavado 2) fue glicina 100 mM, NaCl 2 M, pH 3,0. Todos los caudales fueron iguales que en el ejemplo 4.

La figura 10 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía. La tabla 13 resume el porcentaje de recuperación calculado para cada etapa de cromatografía. Tabla 13. Porcentaje de recuperación en cada etapa de cromatografía usando una solución de lavado que contiene N l 2 M H .

Como se muestra en la figura 10 y tabla 13, se observó pérdida de producto solamente mínima (17,9 % del polipéptido diana) durante el lavado de bajo pH (F4, lavado 2) con NaCl 2 M a pH 3,0. La mayoría del producto (71,6% del polipéptido diana) se recuperó en el tampón de elución (F7).

Tomados conjuntamente, los resultados de los ejemplos 1 a 10 demuestran que la inactivación vírica en columna usando una solución de lavado de bajo pH y alta salinidad podía realizarse de forma eficaz con pérdida mínima de recuperación.

Ejemplo 11

Inactivación vírica en columna en

una columna de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto

usando una solución de lavado de bajo pH que contiene sulfato de amonio 2 M

El objetivo del siguiente experimento es demostrar la posible viabilidad y aplicabilidad de una etapa de inactivación vírica en columna usando una solución de lavado de bajo pH y alta salinidad con otros tipos de cromatografía tal como una cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto.

En este experimento, se cargaron 6 ml de combinación de producto filtrado a 0,22 micrómetros que contenía un anticuerpo monoclonal de una etapa de purificación de intercambio aniónico a 10 mg/ml de mAb cargado en una columna de 1,7 ml que contenía resina CAPTO™ Adhere a pH 8,0. Se aplicó un tampón de lavado de alta salinidad a pH 8,0 a la columna (lavado 1). Después se aplicó un lavado modificado posterior (lavado 2-4) para mantener la condición de alta salinidad, pero bajar el pH hasta donde sea adecuado para inactivación vírica, mientras el anticuerpo permanecía unido al absorbente.

La tabla 14 a continuación muestra las condiciones usadas en cada etapa. El caudal de la cromatografía fue constante a 100 cm/h.

T l 14. T m n in ivi l n l m l 11.

La figura 11 es un cromatograma que muestra la concentración de proteína y el pH en cada fracción durante las etapas de cromatografía.

Las soluciones de lavado usadas en este experimento provocaron eliminación mínima del polipéptido diana (20,6 %) a estos bajos pH (3,5 y 4,0). La recuperación global fue de un 77,4 % en este experimento.

Se realizó un experimento similar en una columna de cromatografía de intercambio aniónico convencional (no de modo mixto) usando las mismas soluciones de lavado de bajo pH y alta salinidad. En contraste, la recuperación global del polipéptido fue solamente de un 49,8 % en este experimento, lo que indica que se eluyó una cantidad significativa del polipéptido durante el lavado de bajo pH. Este experimento indica que la inactivación vírica de bajo pH no puede realizarse mientras el producto está unido a una resina de intercambio aniónico convencional usando alta salinidad en el tampón.

Tomados conjuntamente, estos resultados indican que la inactivación vírica en columna usando una solución de lavado de bajo pH y alta salinidad podría realizarse de forma eficaz con pérdida mínima de recuperación en determinados métodos de cromatografía, tal como cromatografía de afinidad y cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto.

Ejemplo 12

Inactivación de virus

El bajo pH puede dañar los anticuerpos. Se inactivo una proteína de fusión a Fc mediante los tiempos y valores de pH requeridos para inactivación vírica. Se desarrolló un método novedoso de inactivación vírica a bajo pH en columna. Se produjo el mAb de IgG1 humanizada en células de ovario de hámster chino (CHO) recombinantes cultivadas en medio sin suero. Como se describe en este ejemplo, los anticuerpos se retuvieron en proteína A y CAPTO ADHERE® a pH 3,0 usando sulfato de amonio 2 M para aumentar las interacciones hidrófobas. Se demostró la inactivación de xMuLV en columna en proteína A con sulfato de amonio 2 M pH 3-3,5, arginina 1 M y el detergente LDAO. La inactivación en columna ayuda a minimizar la exposición a bajo pH, elimina la conductividad añadida durante la acidificación de la combinación y automatiza las etapas de inactivación de bajo pH. La inactivación en columna proporciona beneficio para cromatografía semicontinua en múltiples columnas, que genera muchas combinaciones de inactivación de bajo pH. Como se describe en este ejemplo, los anticuerpos se retuvieron en CAPTO MMC® a pH 8,0 usando sulfato de amonio 2 M para aumentar las interacciones hidrófobas.

La proteína de fusión a Fc se produjo en células HEK293 cultivadas en medio sin suero. Se midió el virus de leucemia murina xenotrópico (X-MLV) con ensayos basados en PCR e infectividad. La tabla 15 muestra la inactivación vírica y eliminación de xMulV proporcionadas por tampones de lavado de proteína A con una proteína de fusión a Fc.

Tabla 15. Inactivación vírica y eliminación de xMulV proporcionadas por tampones de lavado de proteína A con una proteína de fusión a Fc.

El ligando de proteína A se une a los dominios CH2 y CH3 de un Fc de anticuerpo a través de interacciones hidrófobas, iónicas y de enlace de hidrógeno. En una parte de este ejemplo, se cargó una columna MABSELECT™ SuRe de 6,6 ml (19,4 cm) con 50 ml de HCCF con 2,2 mg/ml de anticuerpo. La columna se lavó con tampón BisTris 100 mM con sulfato de amonio 2000 mM a pH 6,6. Después se aplicó un tampón de lavado de bajo pH con sulfato de amonio (citrato de sodio 100 mM, sulfato de amonio 2000 mM a pH 3,0). La concentración de sulfato de amonio entonces se redujo hasta cero sobre un gradiente de 9 CV. El caudal para todas las etapas fue 250 cm/h.

Como se muestra en la figura 12, el anticuerpo empezó a desorber a aproximadamente 1700 mM y se eluyó completamente a aproximadamente 200 mM de sulfato de amonio. La figura 12 muestra que se requiere al menos 1700 mM de sulfato de amonio para mantener el anticuerpo unido a proteína A a pH 3,0. Como se requería al menos 1700 mM de sulfato de amonio para mantener el anticuerpo unido a la resina a bajo pH, la solubilidad del anticuerpo se midió como una función del pH, de la concentración del anticuerpo y el sulfato de amonio. Se descubrió que el anticuerpo era soluble en sulfato de amonio 1000 mM, pero no en sulfato de amonio 1500 mM. La precipitación se observó con sulfato de amonio 1500 mM a valores de pH entre 3,5 y 8,0 y con concentraciones de anticuerpo entre 10 y 30 mg/ml.

En una parte de este ejemplo, en primer lugar se equilibró una columna MabSelect SuRe de 6,6 ml (19,4 cm) y después se cargó en 25,8 g/l de resina usando 50 ml de anticuerpo en HCCF. Se usó un caudal de 250 cm/h excepto durante la etapa de regeneración (50 cm/h).

Un lavado de pH 3,0, sulfato de amonio 2 M, glicina 100 mM se usó para mantener el anticuerpo unido a la resina a bajo pH. El lavado de bajo pH, alto contenido de sulfato de amonio se intercaló con un tampón de lavado neutro, de alto contenido de sulfato de amonio (pH 7,0, sulfato de amonio 2 M) para garantizar que estaban presentes altos niveles de sulfato de amonio según se descendía el pH hasta 3,0 y también cuando se elevaba posteriormente hasta 7,0. Sin esto, se producía elución significativa del producto antes y después de la etapa de lavado. Se usó exceso de tampón de lavado en cada etapa para garantizar el intercambio de tampón adecuado. La secuencia de etapas y los tampones usados son idénticos a los usados en el ejemplo 8. La concentración de proteína, la conductividad y pH en cada etapa se muestran en la figura 8. La figura 13 indica que lavado con sulfato de amonio 2 M mantiene el anticuerpo unido a proteína A a pH 3,0.

En una parte de este ejemplo, en primer lugar se equilibró una columna CAPTO ADHERE® de 1,7 ml (5,0 cm) y después se cargó con 6 ml de 11,4 g/l de anticuerpo en tampón Tris 50 mM pH 8,0. Posteriormente, se aplicó un tampón de lavado de alta salinidad de pH 8,0 y después un tampón de lavado de alta salinidad de pH 3,5 a la resina.

Se usó exceso de tampón de lavado en cada etapa para garantizar el intercambio de tampón adecuado. Todas las etapas se realizaron a 100 cm/h. Véase la tabla 16.

T l 1 . n i m n r r ir l fi r 14 l m l 12.

La figura 14 muestra que lavado con sulfato de amonio 2 M mantiene el anticuerpo unido a CAPTO ADHERE® a pH 3,5. Como se muestra en la figura 14, se observó pérdida mínima de producto durante el lavado con sulfato de amonio 2 M, pH 3,5, lo que es sorprendente porque a este pH tanto el producto como la resina tienen una carga positiva. Es probable que el producto permanezca unido a la resina debido a las interacciones hidrófobas potenciadas en este tampón de alta salinidad. La mayoría del producto (79,0 %) se recuperó en la combinación de elución. El porcentaje del pico que era anticuerpo monomérico (98,4 %) no se alteró por el lavado de alto contenido de sulfato de amonio.

En una parte de este ejemplo, se cargó una columna de 1,7 ml (5,1 cm) con resina de modo mixto CAPTO MMC® con 6 ml de 12,4 mg/ml de anticuerpo en un tampón citrato 50 mM, pH 4,5. Posteriormente se aplicó un lavado de alta salinidad de pH 4,5 y después un lavado de alta salinidad de pH 8,0. Se usó exceso de tampón de lavado en cada etapa para garantizar el intercambio de tampón adecuado. La concentración de proteína, la conductividad y pH en cada etapa se muestran en la figura 15. Los tampones usados en cada etapa se muestran en la tabla 17. Todas las etapas se realizaron a 100 cm/h.

T l 17. n i m n r r ir l fi r 1 l m l 12.

La figura 15 muestra que lavado con sulfato de amonio 2 M mantiene el anticuerpo unido a CAPTO MMC® a pH 8,0. Como se muestra en la figura 15, se observó pérdida mínima de producto durante el lavado con sulfato de amonio 2 M, pH 8,0, lo que es sorprendente porque a este pH tanto el producto como la resina tienen una carga positiva y se esperaría que se produjera elución del anticuerpo. El porcentaje de recuperación en la combinación de eluido fue de un 94,1 %. Es probable que el producto permanezca unido a la resina debido a las interacciones hidrófobas potenciadas en este tampón de alta salinidad.

Se realizó un experimento similar usando resina TMAE HiCap. La resina TMAE HiCap es una resina de intercambio aniónico que carece de las propiedades de interacción hidrófoba de la resina CAPTO ADHERE™. Se produjo pérdida significativa de producto durante los lavados de bajo pH y la recuperación global fue de un 49,8 %. El producto que eluyó durante el lavado de bajo pH precipitó en la columna y en los instrumentos. El experimento de resina TMAE HiCap indica que las sales cosmótropas no podían conservar la adsorción del mAb en la resina de intercambio aniónico a bajo pH.

El método de inactivación vírica de bajo pH en columna muestra que los anticuerpos se retenían en proteína A y CAPTO ADHERE® a pH 3,0 usando sulfato de amonio 2 M para aumentar las interacciones hidrófobas. Se demostró la inactivación de xMuLV en columna en proteína A con sulfato de amonio 2 M pH 3-3,5, arginina 1 M y el detergente LDAO.

Estos datos muestran que la inactivación en columna ayuda a minimizar la exposición al bajo pH, elimina la conductividad añadida durante la acidificación de la combinación, automatiza la etapa de inactivación de bajo pH y ayuda a posibilidad la cromatografía semicontinua en múltiples columnas.

La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 61/882.488, presentada el 25 de septiembre de 2014 y la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 62/028.657, presentada el 24 de julio de 2014.

TABLA DE SECUENCIAS

Tabla 15. Secuencias polinucleotídicas de FVIII

A. F V III-F c con el d o m in io B e lim in a d o

1.051 gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa gaagcggaag actatgatga 1101 tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat. gatgacaact 1151 C ^V, CCT.'1",GCG*C r.ar.ccaaati: cgctcagttg ccaagaagca tcct.aaaact 1201 tgggtacatc acattgccgc tgaagaggag gactgggaei: ^a tgctcccct i251 agtc.ct.cgce cccgatgaca gaagttataa aagtcaacai: ttgascsatg 1301 gccctcagcg gattggtagg ¿13.'.;CaCcí3.::i3 aagtccgatt fcatggcatac 1351. acagatgaaa caí.tíaagac tegtgaage: atteagea.tg aaccaggaat 1401 cctgggacct ttactctatg gggaagt.rgg agacacacr.g ttgar.tat.at 1451 at.aa ^o aaaea ageaageaga ce:a:. e:i ^{3 '-'.3} t t. ^3. cec.ca cyyaa tcact 1501 gatgtccgte clateatacte aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt 1551 gaaggatttt ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag 1601 tgactgtaga agatgggcca actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc 1651 tattactcta gtttcgttaa tatggagaga gatetagett caggactcat 1701 tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtaga.tcaa agaggaaace 1751 agataatgte agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag .1801 aaccgsaget ggtaccccac agagaatata caacgctttc tccecaatce' 1851 agctggagtg cagcttgagg atccagagtt ccaagcetcc aacatcatgc 1901 acagcatcaa tggctatgtt tttgatagtt tgcagttgtc agt.tt.gt.ttg 1951 catgaggtgg catactggta cattctaagc attggagcac agaetgactt 2001 cctttctg te ttcttctctg gatata.cc11 caaacacaaa stggtctatg 2051 aagacacact cacectatte ccattctcag gagaaactgt cttcatateg 2101 atggaaaacc. caggtctatq gattctgggg tgccacaact cagactttcg 2151 ga¿\cagaggc atgaccgect tactgaaggt ttctagttgt CJctGcl3.Gfci3Gcl:

2201 ctggtgatta ti:,acgaggac sgtrafcgaag atattteage atacttgctg 2251 agtaaaaaca ataceatega accaagaagc ttctctcaaa acccaccagt 2801 cttgaaacgc ca _{z c á} aoggg aaataactcg cactacccc ^t cagtcagatc.

2351 aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa

B. FVIII-Fc de longitud completa

351 tcatgctgtt ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg 401 atgatcagac cagtcaaagg gagaaagaag atgataaagt cttccctggt 451 ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg aaagagaatg gtccaatggc 501 ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat gtggacctgg 551 taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 601 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact 651 ttttgctgta tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact 701 ccttgatgca ggatagggat gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg 751 cacacagtca arggttatgt aaacaggtct ctgccaggtc tgattggatg 801 ccacaggaaa tcagtctart ggcatgtgat tggaatgggc accactcctg 851 aagtgcactc aatattcccc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 901 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttccLLa ctgctcaaac 951 actcttgatg gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc 1001 accaacatga tggcatggaa gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag 1051 gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa gaagcggaag actatgatga 1101 tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat gatgacaact 1151 ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1201 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt 1251 agtcctcgcc cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg 1301 gccctcagcg gattggtagg aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac 1351 acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct attcagcatg aatcaggaat 1401 cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg ttgattatat 1451 ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctc.a cggaatcact 1501 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacartt 1551 gaaggatttt ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag 1601 tgactgtaga agatgggcca actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc 1651 tattactcta gtttcgttaa tatggagaga gatctagctt caggactcat B. F V III-F c de lo ng itud c o m p le ta

1701 tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa agaggaaacc 1751 agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1801 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc 1851 agctggagtg cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc 1901 acagcatcaa tggctatgtt tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg 1951 catgaggtgg catactggta cattctaagc attggagcac agactgactt 2001 cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa atggtctatg 2051 aagacacact caccctattc ceattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2101 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg 2151 gaacagaggc atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca 2201 ctggtgatta ttacgaggac agttatgaag atatttcagc atacttgctg 2251 agtaaaaaca atgccattga accaagaagc ttctcccaga attcaagaca 2301 ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt ccagaaaatg 2351 acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2401 atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc 2451 tactccacat gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga 2501 ctttttctga tgatccatca cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg 2551 tctgaaatga cacacttcag gccacagctc catcacagtg gggaca~ggt 2601 atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag aaactgggga 2651 caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2701 tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac 2751 tgataataca agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata 2801 gtcaattaga taccactcta tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag 2851 tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa aataatgatt caaagttgtt 2901 agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga aaaaatgtat 2951 cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct 3001 gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt B. F V III-F c de lo ng itud c o m p le ta

3051 838 Q 8 0338 C aaaacttcca ataatteage aactaataga aagaetcaca 3101 ttgatggcce atcattatta attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat.

3151 313.ttaga3a gtgacactga gtttaaaaaa gtgacacctt tgattcatga 3201 cagaatgett atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta aatcafcatgt 3251 G:38:3.tr.3-33.80 tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaa.aaaa 3301 gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa 3351 gatgctatte ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa 3401 agaactctct gaactctggg caaggccGca gtccaaagca attagtatcc 3451 fctaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag aatttcttgt ctgagaaaaa 3501 caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac ^{888 Q’GJ 3} 0. ^{Q'.t 3;} ggactcaaag 3551 agatggtttt Lccaagcagc agaaacccat ttcttactaa cttggataat 3601 ttacatgaaa ^{8 18 8 88 C el C 3} caatcaagaa aaaaaaatt.c aggaagaaat 3651.308883 CJ 38 CJ C¡ 8i o.8 C 8 li ti 3 ct tecaacracraa Lgtagu-ttitg cetcagatac 3701 atacae tgac tggcacizaag aatttcatga agaacctttt ctt&ctgagc 3751. actaggcaaa atgtagaagg t.tcatatgac; ggggcatatg ctccagtact 3301 tcaagactct aggtcattaa atgattcaac ³ el ³ti.^{8 C¡ 8} 3.03. ^{3 3 Cf 33 30 3 C3} 3851 cagctcatct ^{C C C -83 88 8} 3 ^.8 ggggaggaag ^{3 3 38 C C.8 CJ} :'A3. aggcttggga 3S01 3atea&acea agcaaatt.gt agagaaatat gcatgcacea caaggatstc 3951 tcetaataca agccagcaga actttgtcac gcaacgtagfc aagagagctt 4001 ⁰(^{J' 3 3 til C 8 ¿i 0 u} cagactccca ctagaagaaa ^{C .8 Q el 8} C ^{ti ti Q 3} aaaaaggata 4051 actgtggacg acacctcaac ccagtggtcc aaaaae-atga aacatctgac 4101 cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag aaaggggcca 4151 ttactcagtc tcccttatca gattgeetta cgaggagtca tageatccct

4251 t.3 L.L8 Q8 O O I -atatatotga cc.c.gggtcct attccaagac aactcttctc 4301 atcttccagc ageatettat agaaagaaag aLtctggggt ecaagaaaqc 4551 agtcatt te::. ■:aeaaggagc caaaaaaaat aacct t::ote tagccattct B. FVIII-Fc de longitud completa

4401 aaccfctggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc ctggggacaa 4451 gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4501 aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt 4551 tcacatttat cagaaggacc tattccctac ggaaactagc aatgggtctc 4601 ctggccatct ggatctcgtg gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga 4651 gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct ggaaaagttc cctttctgag 4701 agtagcaaca gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta ttggatcctc 4751 ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4801 tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat 4851 tttgtccctg aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg 4901 agggacaaaa taagcccgaa atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg 4951 actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca gtcttgaaac gccatcaacg 5001 ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa attgactatg 5051 atgar.ac.Gat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5101 gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta 5151 ttttattgct gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc 5201 cacar.gt.tct aagaaacagg gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag 5251 aaagt.fc.gttt tccaggaatt tactgatggc tcctfctactc agcccttata 5301 ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca tatataagag 5351 cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5401 ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca 5451 aggagcagaa cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt 5501 acttttggaa agtgcaacat catatggcac ccactaaaga tgagtttgac 5551 tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt gacctggaaa aagatgtgca 5601 ctcaggcctg attggacccc ttctggt.ctg ccacactaac acactgaacc 5651 ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gttr.tt.cacc 5701 atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa B. FVIII-Fc de longitud completa

5751 ctgcagggct ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga 5801 attatcgctt ccatgcaatc aatggctaca taatggatac actacctggc 5851 ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga tggtatctgc tcagcatggg 5901 cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat gtgttcactg 5951 tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6001 gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt 6051 ggaatgcctt attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc 6101 tggtgtacag caataagtgt cagactcccc tgggaatggc ttctggacac 6151 attagagatt ttcagattac agcttcagga caatatggac agtgggcccc 6201 aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc tggagcacca 6251 aggagccctt ttcttgcatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6301 cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagitctcca gcctctacat 6351 ctctcagttt atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt 6401 atcgaggaaa ttccactgga accttaatgg tcttctttgg caatgtggat 6451 tcatctggga taaaacacaa tatttttaac cctccaatta ttgctcgata 6501 catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact cttcgcatgg 6551 agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6601 agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa 6651 tatgtttgcc acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga 6701 ggagtaatgc ctggagacct caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa 6751 gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca ggagtaacta ctcagggagt 6801 aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc atctccagca 6851 gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6901 gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga 6951 cccaccgtta ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc 7001 accagattgc cctgaggatg gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc 7051 tacgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagctccag aactcctggg

C. H íb rido de h e te ro d ím e ro de F V III-F c

C. H íb rido de h e te ro d ím e ro de F V III-F c

1 atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tqcgattctg 51 ctttagtgcc accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg 101 actatatgca aagtgatctc ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct 151 cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac acctcagtcg tgtacaaaaa 201 gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc gctaagccaa 251 ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 301 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct 351 tcatgctgtt ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg 401 atgatcagac cagtcaaagg gagaaagaag atgataaagt cttccctggt 451 ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg aaagagaatg gtccaatggc 501 ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat gtggacctgg 551 taaaagactt gaatrcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 601 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact 651 ttttgctgta tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact 701 ccttgatgca ggatagggat gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg 751 cacacagtca atggttatgt aaacaggtct ctgccaggtc tgattggatg 801 ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc accactcctg 851 aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 901 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac 951 actcttgatg gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc 1001 accaacatga tggcatggaa gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag 1051 gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa gaagcggaag actatgatga 1101 tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat gatgacaact 1151 ctccttcctt tatccaaat^ cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact C. H íb rido de h e te ro d ím e ro de F V III-F c

1201 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt 1251 agtcctcgcc cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg 1301 gccctcagcg gattggtagg aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac 1351 acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct attcagcatg aatcaggaat 1401 cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg ttgattatat 1451 ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1501 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt 1551 gaaggatttt ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag 1601 tgactgtaga agatgggcca actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc 1651 tattactcta gtttcgttaa tatggagaga gatctagctt caggactcat 1701 tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa agaggaaacc 1751 agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1801 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc 1851 agctggagtg cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc 1901 acagcatcaa tggctatgtt tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg 1951 catgaggtgg catactggta cattctaagc attggagcac agactgactt 2001 cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa atggtctatg 2051 aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2101 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg 2151 gaacagaggc atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca 2201 ctggtgatta ttacgaggac agttatgaag atatttcagc ataottgctg ^-J -L aCjtaaaaaCa

2301 tcacacatgc ccaccgtgcc cagctccaga actcctgggc ggaccgtcag 2351 tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 2401 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt 2451 caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 2501 agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc

C. Híbrido de heterodímero de FVIII-Fc

751 tttttcacca tctttgatga gaccaaaagc tggtacttca ctgaaaatat 801 ggaaagaaac tgcagggctc cctgcaatat ccagatggaa gatcccactt 851 ttaaagagaa r.tatcgcttc catgcaatca atggctacat aatggataca 901 ctacctggct tagtaatggc tcaggatcaa aggattcgat. ggtatctgct 951 cagcatgggc agcaatgaaa acatccattc tattcatttc agtggacatg 1001 tgttcacr.gr, acgaaaaaaa gaggagtata aaatggcact gta.caat.ctc 1051 tatccaggtg tttttgagac agtggaaatg ttaccatcca aagctggaat 1101 ttggcgggtg gaatgcctta ttggcgagca tctacatgct gggatgagca 1151 cactttttct ggtgtacagc aataagtgtc agactcccct gggaatggct 1201 tctggacaca ttagagattt tcagattaca gcttcaggac aatatggaca 1251 gtgggcccca aagctggcca gacttcatta ttccggatca atcaatgcct 1301 ggagcaccaa ggagcccttt tcttggatca aggtggatct gttggcacca 1351 atgattattc acggcatcaa gacccagggt gcccgtcaga. agttctccag 1401 cctctacatc tctcagttta tcatcatgta tagtcttgat gggaagaagt 1451 ggcagaetta tcgagga aat tccaci.ggaa ccctaatggt cttct.tt.ggc 1501 aacgtggatt catctgggat aaaacacaat atttttaacc ctccaarfcat 1551 tgctcgatac atccgtttgc acccaactca ttatagcatt cgcagcactc 1601 tccgcatgga gttgatgggc tgtgatttaa atagttgcag catgccattg 1651 ggaatggaga gtaaagcaat atcagatgca cagatfcactg cttcatccta 1701 e 111 accaat atg11Lgcca cct.ggtot.cc t:tcaaaagct cgac 11cacc 1751 tccaagggag qagcaatgcc tgqagacctc agqtqaataa tccaaaagag 1301 tggctgcaag tggacttcea gaagscaatg aaagr.cacag gagtaactac: 1351 tcagggagta aaatctctgc ttaccagcat gtatgtgaag gagttcctca 1901 tc.tccagcag t■:: agat.ggc caV.cag■.gua. ct.cl.c11111 tcag aaLg gc 1951 aaagtaaagg tttttcaggg aaatcaagac tccttcacac ctgtggcgaa 2001 etc teragac ccaccgttac tgact.cgct.a ccttcgaatt cacccccaca 2051 gttgggtgca ccagattgcc ctgaggatgg aggttctggg ctgc.gag.gca

Tabla 16: Secuencias polipeptídicas de FVIII

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AY\/KVDSCPE 351 EPQ1RMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDKSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSC'Y LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNgASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNOIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS., NIMHSINGYV FpSLQLSyCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF ..PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR 7ÍQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE 801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 851 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 951 TKDEFDCFAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1001 FALFFTIFDE TKSWYFTEKM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNEN1HS 1HFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1201 LAPMI1HGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS 1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LR1HPQSWVH QIALRMEVLG 1451 CEAQD1YDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW 1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW 1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 1651 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK

601 NRSWYLTENI ORFLPNPAGV OLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKYTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNSRHPST RQKQFNATTI PENDIEKTDP WFAHRTPMPK 801 IQNVS SSDLL MLLRQSPTPH GLSLSDLQEA KYETFSDDPS PGAIDSNNSL 851 SEMTIIFRPQL HH5GDMVFTP ESGLQLRLNE KLGTTAATEL KKLDFKVSST 901 SNNLISTIPS DNLAAGTDNT SSLGPPSMPV HYDSQLDTTL FGKKSSPLTE 951 SGGPLSLSEE NNDSKLLESG LMNSQESSWG KNVSSTESGR LFKGKRAHGP 1001 ALLTKDNALF KVSISLLKTN K7SNNSATNR KTHIDGPSLL IENSPSVWQN 1051 ILESDTEFKK VTPLIHDRML MDKNATALRL NHMSNKTTSS KNMEMVQQKK 1101 EGPIPPDAQN PDMSFFKMLF LPESARWIQR THGKNSLNSG QGPSPKQLVS 1151 LGPEKSVEGQ NFLSEKNKW VGKGEFTKDV GLKEMVFPSS RNLFLTNLDN 1201 LHENNTHNQE KKIQEEIEKK ETLIQENWL PQIHTVTGTK NFMKNLFLLS 1251 TRQNVEGSYD GAYAPVLQDf RSLNDSTNRT KKHTAHFSKK GEEENLEGLG 1301 NQTKQIVEKY ACTTRISPNT SQQNFVTQRS KRALKQFRLP LEETELEKRI 1351 IVDDTSTQWS KNMKHLTPST LTQIDYNEKE KGAITQSPLS DCLTRSHSIP 1401 QANRSPLPIA KVSSFPSIRP IYLTRVLFQD NSSHLPAiASY RKKDSGVQES 1451 SHFLQGAKKN NLSLAILTLE MTGDQREVGS LGTSATNSVT YKKVENTVLP 1501 KPDLPKTSGK VELLPKVHIY QKDLWPTETS NGSPGHLDLV EGSLLQGTEG 1551 AIKWNEANRP GKVPFLRVAT ESSAKTPSKL LDPLAWDNHY GTQIPKEEWK 1601 SQEKSPEKTA FKKKDTILSL NACESNHAIA AINEGQNKPE IEVTWAKQGR 1651 TERLCSQNPP VLKRHQRE1T RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1701 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFX 1751 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR 1801 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1851 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1901 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG 1951 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 2001 VFETVEMLPS KAGIííRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 2051 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII

Tabla 17: Secuencias polinucleotídicas de FIX

2901 tgttggactc Ggacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 2951 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga 3001 ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 3051 aatgagaatt cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gaaaaaccac 3101 aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta 3151 ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgaa ataaacaagt tggggtgggc 3201 gaagaactcc agcatgagat occcgcgctg gaggatcatc cagccggcgt 3251 cccggaaaac gattccgaag cccaaccttt catagaaggc ggcggtggaa 3301 tcgaaatctc gtagcacgtg tcagtcctgc tcctcggcca cgaagtgcac 3351 gcagttgccg gccgggtcgc gcagggcgaa ctcccgcccc cacggctgct 3401 cgccgatctc ggtcatggcc ggcccggagg cgtcccggaa gttcgtggac 3451 acgacctccg accactcggc gtacagctcg tccaggccgc gcacccacac 3501 ccaggccagg gtgttgtccg gcaccacctg gacctggacc gcgctgatga 3551 acagggtcac gtcgtcccgg accacaccgg cgaagtcgtc ctccacgaag 3601 tcccgggaga acccgagccg gtcggtccag aactcgaccg ctccggcgac 3651 gtcgcgcgcg gtgagcaccg gaaeggcact ggtcaacttg gccatggttt 3701 agttcctcac cttgtcgtat tatactatgc cgatatacta tgccgatgat 3751 taattgtcaa cacgtgctga tcagatccga aaatggatat acaagctccc 3801 gggagctttt tgcaaaagcc taggcctcca aaaaagcctc ctcactactt 3851 ctggaatagc tcagaggcag aggcggcctc ggcctctgca taaataaaaa 3901 aaattagtca gccatggggc ggagaatggg cggaactggg cggagttagg 3951 ggcgggatgg gcggagttag gggcgggact atggttgctg actaattgag 4001 atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagccaggg gactttccac 4051 acctggatgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct 4101 ggggagcctg gggactttcc acaccctcgt cgagctaget tcgtgaggct 4151 ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 4201 ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg 4251 ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctcegcctt tttcccgagg 4301 gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt 4351 cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg 4401 cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt 4451 ccacctggct ccagtacgtg attcttgatc ccgagctgga gccaggggcg 4501 ggccttgcgc tttaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 4551 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 4601 tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg 4651 ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaggat 4701 ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg 4751 tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac 4801 cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 4851 ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 4901 gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctc 4951 cagggggctc aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag 5001 tcacccacac aaaggaaagg cgcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg 5051 tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat cagttctgga 5101 gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 5151 gagtttcccc acactgagtg cgtggagact gaagttaggc cagcttggca 5201 cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcrtggt 5251 tcattctcaa gcctcagaca atggttcaaa gtttttttct tccatttcag 5301 gtgtagtgaa cacgtggtcq cggccgcgcc gccaccatgg agacagacac 5351 actcc'gcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggatcc actggtgaca 5401 aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaacicct gggaggaccg 5451 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg 5501 gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg 5551 aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggagca taatgccaag 5601 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt 5651 cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca 5701 aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 5751 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg 5801 cgatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct 5B51 tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 5901 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt 5951 cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 6001 tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 6051 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgagagat ctggccggct 6101 gggcccgttt cgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat 6151 tctaegcgta ccggtcatca tcaccatcac cattgagttt aaacccgctg 6201 atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 6251 cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 6301 taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 6351 tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 6401 atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa 6451 agaaccagtg gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 6501 gaaagaacat gtgagcaaaa ggcccgcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 6551 gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 6601 caaaaatcga cgctcaagtc agagctggcg aaacccgaca ggactataaa 6651 gataccaggc gtttccccct agaacctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 6701 accctgccgc ti.accqgata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 6751 ggcgctttct catagctcac cctgtagyLa tctcagttcg gtgtaggtcg 6801 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 6851 tgcgccttat ccgqtaacta tcqtcttgaq tccaacccqq taaqacacqa 6901 cttatcgcca ctggcagcac ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 6951 atgtaggrgg tcctacagag ttcttgaagt ggtggcct.aa ctacggctac 7001 actagaagaa cagtatttgc tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 7051 cggaaaaaga gttcgtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 7101 gcggtgcttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 7151 tctcaacaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 7201 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gacattaacc tataaaaata 7251 ggcgtatcac gagccccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 7301 aacctcrgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaaga

Tabla 18: Secuencias polipeptídicas de FIX

Tabla 19: Secuencias polinucleotídicas de FVII

Tabla 20: Secuencias polipeptídicas de FVII

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método de inactivación de virus presente durante la producción de un polipéptido de interés, que comprende: (a) unir el polipéptido a una matriz de cromatografía de afinidad o una matriz de cromatografía de modo mixto, y (b) realizar una etapa de inactivación vírica lavando la matriz de cromatografía unida al polipéptido con una solución de lavado a pH de menos de aproximadamente 4,0,

en el que la solución de lavado comprende una concentración suficiente de una sal para reducir sustancialmente la elución del polipéptido durante la etapa de inactivación vírica, en el que la concentración de la sal es de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 4,0 M.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la matriz de cromatografía de afinidad es una columna de proteína A.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la columna de proteína A comprende un ligando de proteína A que se inmoviliza en una matriz seleccionada del grupo que consiste en matriz basada en dextrano, matriz basada en agarosa, matriz basada en poliestireno, matriz hidrófila basada en polivinil etilo, matriz rígida basada en polimetacrilato, matriz porosa basada en polímero, matriz de poro controlado basada en vidrio y cualquier combinación de las mismas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la matriz de cromatografía de modo mixto se selecciona del grupo que consiste en matriz basada en dextrano, matriz basada en agarosa, matriz basada en poliestireno, matriz basada en polímero hidrófilo de polivinil etilo, matriz basada en polímero macroporoso altamente reticulado, matriz basada en hidroxiapatita ((Ca5(PO4)3OH)2), matriz basada en fluoroapatita ((Cas(PO4)3F)2) y cualquier combinación de las mismas.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el pH de la solución de lavado es de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0 y en el que la sal es una sal de amonio.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el pH de la solución de lavado es de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0 y en el que la sal es una sal de potasio.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el pH de la solución de lavado es de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 3,5 y en el que la sal es sulfato de amonio.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el pH de la solución de lavado es de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 3,5 y en el que la sal es cloruro de sodio.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de la sal es de aproximadamente 2,0 M a aproximadamente 2,5 M.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de la sal es de aproximadamente 2,5 M a aproximadamente 3,0 M.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el método comprende múltiples etapas de inactivación vírica.

12. El método de la reivindicación 11, en el que las múltiples etapas de inactivación vírica usan soluciones de lavado idénticas o diferentes.

13. El método de la reivindicación 12, en el que al menos una de las soluciones de lavado comprende un detergente.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el polipéptido se une a la matriz de cromatografía de afinidad o la matriz de cromatografía de modo mixto a un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el método comprende además eluir el polipéptido de la matriz de cromatografía de afinidad o la matriz de cromatografía de modo mixto con una solución de elución, opcionalmente en el que al menos un 70 % del polipéptido se recupera en la solución de elución.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el polipéptido comprende un factor de coagulación.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el factor de coagulación es factor XI (FXI).

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el polipéptido comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.