ES2899361T3

ES2899361T3 - Anticuerpos anti-PD-L1

Info

Publication number: ES2899361T3
Application number: ES17724263T
Authority: ES
Inventors: Bruce Keyt; Leonard George Presta; Ramesh Baliga
Original assignee: IGM Biosciences Inc
Current assignee: IGM Biosciences Inc
Priority date: 2016-05-09
Filing date: 2017-05-09
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2037-05-09
Also published as: EP3455257A1; CA3021669A1; US10954302B2; IL262295B1; IL262295A; JP2019519492A; PL3455257T3; JP6979971B2; CN109311985B; KR20190003989A; WO2017196867A1; EP3455257B1; US20190338031A1; KR102343742B1; SG11201809336QA; IL262295B2; US20240002514A1; HUE055972T2; AU2017264683B2; CN109311985A

Abstract

Un anticuerpo anti-PD-Ll aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende: (i) un HVR-H1 que comprende la secuencia de GFSLTSYDIS (SEQ ID NO: 4); (ii) un HVR-H2 que comprende la secuencia de VIWTGVGTN (SEQ ID NO: 5); y (iii) un HVR-H3 que comprende la secuencia de DPYYYGMDY (SEQ ID NO: 6); y la región variable de cadena ligera comprende: (iv) un HVR-L1 que comprende la secuencia de RASQDISIWLS (SEQ ID NO: 1); (v) un HVR-L2 que comprende la secuencia de KASNLHT (SEQ ID NO: 2); y (vi) un HVR-L3 que comprende la secuencia de LQSQSFPRT (SEQ ID NO: 3).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-PD-LI

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a anticuerpos anti-PD-L1 aislados y a su preparación y usos.

Antecedentes de la invención

[0002] La proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) es un receptor de superficie celular que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, que incluye proteínas solubles y de superficie celular que están implicadas en los procesos de reconocimiento, unión y adhesión de las células. Los miembros iniciales de esta familia se descubrieron debido a su efecto funcional sobre el aumento de la proliferación de células T tras la adición de anticuerpos monoclonales (Hutloff y col. (1999) Nature 397:263-266; Hansen y col. (1980) Immunogenics 10:247-260). Se han identificado dos ligandos de glucoproteína de superficie celular para PD-1, denominados PD-L1 y PD-L2, y se ha mostrado que regulan negativamente la activación de las células T y la secreción de citocinas al unirse a PD-1 (Freeman y col. (2000) J Exp Med. 192:1027-34; Latchman y col. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter y col. (2002) Eur J Immunol 32:634-43; Ohigashi y col. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53). Tanto PD-L1 como PD-L2 son homólogos de B7 que se unen a PD-1, pero no se unen a otros miembros de la familia de CD28 (Blank y col. (2004)). También se ha mostrado que la expresión de PD-L1 en la superficie celular está regulada positivamente a través de la estimulación con IFN-y.

[0003] Se ha encontrado la expresión de PD-L1 en varios cánceres murinos y humanos, incluidos carcinoma de pulmón, ovario y colon humano, así como diversos mielomas (Iwai y col. (2002) PNAS 99:12293-7; Ohigashi y col. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53). También se ha sugerido que PD-L1 desempeña un papel en la inmunidad tumoral al aumentar la apoptosis de clones de células T específicos de antígeno (Dong y col. (2002) Nat Med 8:793-800). Como tal, la orientación de la interacción entre PD-1 y PD-L1 es un área de particular interés para la intervención terapéutica. Los anticuerpos anti-PD-Ll se han divulgado, por ejemplo, en los documentos WO 2016/000619 A1; Rosenberg y col. (The Lancet 2016;387:1909-1920), Medina y col. (Pharmacotherapy 2016;36:317-334), Maekawa y col. (PLOS One 2014;9:e98415), WO 2013/079174 A1, WO 2015/112805 A1 y WO 2015/181342 A1. Existe la necesidad de composiciones terapéuticas, tales como anticuerpos anti-PD-Ll, dirigidos contra dianas en esta vía.

Resumen de la invención

[0004] Los aspectos de la invención incluyen un anticuerpo anti-PD-L1 aislado y un fragmento de unión a antígeno del mismo, así como composiciones que contienen tal anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y dicho anticuerpo anti-PD-L1 mencionado anteriormente, fragmento de unión a antígeno del mismo y composiciones para su uso en el tratamiento de enfermedades o afecciones mediadas por la señalización de PD-L1.

[0005] El anticuerpo anti-PD-L1 aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende: (i) una secuencia HVR-H1 que comprende la secuencia de GFSLTSYDIS (SEQ ID NO: 4); (ii) una secuencia de HVR-H2 que comprende la secuencia de VIWTGVGTN (SEQ ID NO: 5); (iii) una secuencia de HVR-H3 que comprende la secuencia de DPYYYGMDY (SEQ ID NO: 6); y la región variable de cadena ligera comprende: (iv) un HVR-L1 que comprende la secuencia de RASQDISIWLS (SEQ ID NO: 1); (v) un HVR-L2 que comprende la secuencia de KASNLHT (SEQ ID NO: 2); y (vi) un HVR-L3 que comprende la secuencia de LQSQSFPRT (SeQ ID NO: 3).

[0006] En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En algunas realizaciones, la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de estructura. En algunas realizaciones, al menos una porción de la secuencia de estructura comprende una secuencia de estructura humana. En algunas realizaciones, al menos una porción de la secuencia de estructura comprende una secuencia de estructura humana de consenso. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura comprende una secuencia de la región de estructura 1 (FR1) seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 y 11. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura comprende una región de estructura 2 (FR2) seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15 y 16. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura comprende una secuencia de la región de estructura 3 (FR3) seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura comprende una secuencia de la región de estructura 4 (FR4) seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 25 y 26. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura comprende una secuencia FR1 seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 y 11; una secuencia de FR2 seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15 y 16; una secuencia de FR3 seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24; y una secuencia de FR4 seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NOS: 25 y 26.

[0007] En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de estructura. En algunas realizaciones, al menos una porción de la secuencia de estructura comprende una secuencia de estructura humana. En algunas realizaciones, al menos una porción de la secuencia de estructura comprende una secuencia de estructura humana de consenso. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura comprende una secuencia de la región de estructura 1 (FR1) seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 27, 28 y 29. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura comprende una región de estructura 2 (FR2) seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 30 y 31. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura comprende una secuencia de la región de estructura 3 (FR3) seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 32 y 33. En algunas realizaciones, la secuencia de estructura comprende una secuencia de la región de estructura 4 (FR4) seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 34 y 35. En algunas realizaciones, la región de estructura comprende: una secuencia FR1 seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 27, 28 y 29; una secuencia FR2 seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ Id NO: 30 y 31; una secuencia FR3 seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 32 y 33; y una secuencia FR4 seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 34 y 35.

[0008] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-Ll aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 45 y/o un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 46. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-LI aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:45 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:46.

[0009] En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

[0010] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-Ll aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39,40, 41 o 42 y/o un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 43 o 44. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-Ll aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41 o 42 y/o un dominio variable de cadena ligera que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 43 o 44. En algunas realizaciones, el anticuerpo: (i) se une sustancialmente al mismo epítopo que un anticuerpo anti-PD-Ll que comprende un dominio variable de cadena pesada de una cualquiera de las SEQ ID No : 36, 37, 38, 39, 40, 41 o 42, y un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID NO: 43 o 44; o (ii) compite por unirse al mismo epítopo que un anticuerpo anti-PD-Ll que comprende un dominio variable de cadena pesada de una cualquiera de las SEQ Id NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41 o 42, y un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID NO: 43 o 44. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-Ll, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, elaborado mediante el proceso de: (a) cultivar una célula que expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de una cualquiera de las SEQ ID NO: 36 , 37, 38, 39, 40, 41 o 42, y un dominio variable de cadena ligera de una cualquiera de las SEQ ID NO: 43 o 44; y (b) aislar el anticuerpo de la célula o de un medio de cultivo celular en el que se cultiva la célula. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

[0011] En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es monoespecífico. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno es biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno se une a una proteína PD-L1 y a una proteína de superficie celular. En algunas realizaciones, la proteína de superficie celular se selecciona de entre el grupo que consiste en: CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA y TIGIT. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es multiespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno se une a una proteína PD-L1 y a una o más proteínas de superficie celular. En algunas realizaciones, las proteínas de superficie celular se seleccionan de entre el grupo que consiste en: CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA y TIGIT.

[0012] En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno se selecciona de entre el grupo que consiste en: Fab, Fab', F(ab)², F(ab')², Fv y scFv. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena ligera kappa o una cadena ligera lambda. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un isotipo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un isotipo IgG y el anticuerpo es de una subclase seleccionada de entre el grupo que consiste en: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un isotipo IgM. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena J. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un isotipo IgA y donde el anticuerpo es de una subclase seleccionada de entre el grupo que consiste en: IgAI e IgA2. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena J. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo híbrido IgG/IgM o IgG/IgA que comprende una cadena J. En algunas realizaciones, la cadena J es una cadena J modificada que comprende un resto de unión extraño. En todas las realizaciones, el resto de unión extraño puede, por ejemplo, seleccionarse de entre el grupo que consiste en: anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, conjugados de fármaco y anticuerpo, moléculas de tipo anticuerpo, fragmentos de unión a antígeno de moléculas de tipo anticuerpo, proteínas solubles y unidas a la membrana, ligandos y receptores. En algunas realizaciones, el resto extraño es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo y se selecciona de entre el grupo que consiste en: Fab, Fab', F(ab)², F(ab')², Fv y scFv. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno es scFv.

[0013] En algunas realizaciones, el resto de unión extraño afecta una vía de señalización de células T. En algunas realizaciones, un resto de unión extraño antagoniza una vía de señalización inhibidora de células T. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño se une a una proteína de superficie celular seleccionada de entre el grupo que consiste en: CTLA-4, PD-1, TIM3, LAG3, BTLA, VISTA y TIGIT. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño se une a una proteína de albúmina o un fragmento de una proteína de albúmina. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño comprende un péptido de unión a albúmina. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño comprende un fragmento de anticuerpo de unión a albúmina. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo de unión a albúmina se selecciona de entre el grupo que consiste en: Fab, scFv, VHH, scFab y dAb. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño comprende un péptido de unión a FcRn. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño comprende un fragmento de anticuerpo de unión a FcRn. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo de unión a FcRn se selecciona de entre el grupo que consiste en: Fab, scFv, VHH, scFab y dAb. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño comprende un dominio Fc.

[0014] Los aspectos de la invención incluyen un anticuerpo IgM, IgA, IgG/IgM o IgG/IgA, o fragmento de unión a antígeno, que comprende una cadena J modificada que comprende un resto de unión extraño, donde el anticuerpo se une a una proteína de superficie celular, y donde el resto de unión extraño comprende el anticuerpo anti-PD-Ll, o un fragmento de unión a antígeno, como se describe en esta invención. En algunas realizaciones, la proteína de superficie celular se selecciona de entre el grupo que consiste en: CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, PD-1, TIm3, LAG3, BTLA, VISTA y TIGIT.

[0015] En algunas realizaciones, el resto de unión extraño se une a una célula efectora. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona de entre el grupo que consiste en: células T, células citolíticas naturales (NK), macrófagos y neutrófilos. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño se une a una proteína CD3 (p. ej., una proteína CD3s) en la célula T. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula NK. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño se une a una diana en la célula NK seleccionada de entre el grupo que consiste en: CD16, CD64 y NKG2D. En algunas realizaciones, la célula efectora es un macrófago. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño se une a un CD14 en el macrófago. En algunas realizaciones, la célula efectora es un neutrófilo. En algunas realizaciones, el resto de unión extraño se une a CD16b o CD 177 en el neutrófilo.

[0016] En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, es un antagonista de PD-L1. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno antagoniza una vía de señalización de PD-L1. En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, antagoniza una interacción entre una proteína PD-L1 y una proteína PD-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno inhibe la unión entre una proteína PD-L1 y una proteína PD-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno bloquea la unión entre una proteína PD-L1 y una proteína PD-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno se une a una proteína PD-L1 e inhibe una o más funciones de una proteína PD-1.

[0017] Los aspectos de la invención incluyen un polinucleótido que codifica una cadena pesada y una cadena ligera del anticuerpo anti-PD-L1 como se define en las reivindicaciones. Los aspectos de la invención incluyen un vector que comprende el polinucleótido como se define en las reivindicaciones. Los aspectos de la invención incluyen una célula hospedadora que comprende el vector como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula procariota. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula eucariota.

[0018] Los aspectos de la invención permiten kits que comprenden un anticuerpo anti-PD-L1 como se define en las reivindicaciones.

[0019] Los aspectos de la invención incluyen procedimientos para producir el anticuerpo anti-PD-L1 aislado como se define en las reivindicaciones, comprendiendo el procedimiento: transfectar una célula hospedadora con un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada y una cadena ligera del anticuerpo anti-PD-L1, cultivar la célula hospedadora en condiciones adecuadas para producir el anticuerpo anti-PD-L1; y aislar el anticuerpo anti-PD-L l

[0020] Los aspectos de la invención incluyen el anticuerpo aislado para su uso en el tratamiento del cáncer.

[0021] Los aspectos de la invención permiten procedimientos para inhibir una o más funciones de una proteína PD-1, comprendiendo los procedimientos poner en contacto la proteína PD-L1 con el anticuerpo como se describe en esta invención. El procedimiento puede llevarse a cabo in vitro. El procedimiento puede llevarse a cabo in vivo en un sujeto mamífero.

[0022] Los aspectos de la invención permiten un procedimiento para inhibir el crecimiento de una célula tumoral que expresa PD-L1, comprendiendo el procedimiento administrar el anticuerpo como se describe en esta invención a un sujeto que tiene la célula tumoral, de ese modo (i) inhibiendo el crecimiento o la proliferación de la célula tumoral o (ii) induciendo la muerte de la célula tumoral.

[0023] Los aspectos de la invención permiten una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo como se describe en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0024] Los aspectos de la invención permiten un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene cáncer, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición farmacéutica como se describe en esta invención. Los aspectos de la invención permiten el uso de un anticuerpo como se describe en esta invención en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematológico o un cáncer epitelial. En algunas realizaciones, el cáncer hematológico es una leucemia, linfoma, mieloma o síndrome mielodisplásico. En algunas realizaciones, la leucemia es una leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena crónica, o leucemia linfocítica crónica. En algunas realizaciones, el linfoma es linfoma de Hodgkin o linfoma no Hodgkin. En algunas realizaciones, el cáncer epitelial es cáncer de pulmón no microcítico, de vejiga urinaria, renal, de hígado, colorrectal, ovárico, gástrico, esofágico, pancreático, tiroideo, de mama o nasofaríngeo. En algunas realizaciones, el cáncer de mama es un cáncer de mama negativo de receptores hormonales negativos o triple negativo. En algunas realizaciones, el cáncer es melanoma. En algunas realizaciones, el cáncer es glioblastoma.

[0025] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica o medicamento puede comprender además una cantidad efectiva de un segundo agente terapéutico. Los aspectos de la invención permiten procedimientos de cribado de una muestra para determinar la presencia de un polipéptido PD-L1 en la muestra, comprendiendo los procedimientos: poner en contacto la muestra con el anticuerpo anti-PD-Ll descrito en esta invención; y determinar si el anticuerpo anti-PD-Ll se une a un polipéptido PD-L1 en la muestra, donde la presencia de tal unión es indicativa de la presencia del polipéptido PD-L1 en la muestra. El anticuerpo anti-PD-L1 puede marcarse de forma detectable, y determinar si el anticuerpo anti-PD-Ll se une al polipéptido PD-L1 puede comprender detectar el marcaje detectable.

Breve descripción de los dibujos

[0026]

La FIG. 1 es una representación esquemática de un ensayo ELISA indirecto.

La FIG.2 es una representación esquemática de un ensayo de citometría de flujo que se usó para determinar la reactividad y la especificidad de los anticuerpos anti-PD-L1 humanos.

FIG. 3, El panel A es un gráfico que muestra la actividad de tres sobrenadantes de hibridomas en el ELISA indirecto junto con los anticuerpos de control positivo y negativo. El panel B es un gráfico que muestra datos de ejemplo del cribado de FACS de sobrenadantes de hibridomas junto con controles positivos y negativos.

La FIG. 4 es una representación esquemática de un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 basado en la expresión de luciferasa impulsada por NFAT en una línea celular indicadora basada en Jurkat que sobreexpresa PD-1 y se suprime en presencia de células CHO que sobreexpresan el antígeno PD-L1.

FIG.5, El panel A es un gráfico que muestra datos de ejemplo del cribado de sobrenadantes de hibridomas en un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1. El panel B es una descripción esquemática de la estrategia y los resultados de cribado de hibridomas.

FIG. 6, El panel A es un gráfico de barras que muestra la distribución de secuencias derivadas de NGS de cadenas ligeras 3C5-2G12. El panel B es un gráfico de barras que muestra la distribución de secuencias derivadas de NGS de cadenas pesadas 3C5-2G12. No todas las cadenas pesadas se expresaron al mismo nivel.

La FIG. 7 es una imagen de un gel híbrido teñido con Coomassie (izquierda) y una transferencia Western con un anticuerpo anti-cadena J. Las imágenes muestran la formación de pentámero de IgM completamente ensamblado, así como la incorporación de la cadena J.

La FIG. 8 es un gráfico que muestra los datos de bloqueo de PD-L1 de los formatos de anticuerpo 3C5.2G12 IgM, 3C5.2G12 IgM cadena J y 3C5.2G12 IgG.

FIG. 9, El panel A es un gráfico que muestra la reactividad cruzada de 3C5.2G12 con Cyno PD-L1. El panel B es un gráfico que muestra la falta de reactividad cruzada de 3C5.2G12 con PD-L1 de ratón. El panel C es un gráfico que muestra la falta de reactividad cruzada de 3C5.2G12 con PD-L2 humano.

La FIG. 10 es un gráfico que muestra los datos de bloqueo de PD-L1 de los anticuerpos de formato 3C5.2G12 IgM y 3C5.2G12 IgG, así como los anticuerpos IgG h3C5-1, IgG h3C5-2, IgG h3C5-3 e IgG h3C5-4.

La FIG. 11 muestra la unión del anticuerpo anti-PD-L1 S70 IgG marcado con fluorescencia (Panel A) o el anticuerpo anti-PD-L1 3C5 marcado con fluorescencia (Panel B) a células CHO recombinantes que expresan PD-L1 humano, donde las células estaban unidas previamente con diluciones seriadas de S70 sin marcar (cuadrados cerrados) o 3C5 (círculos cerrados). Los resultados demuestran que S70 puede bloquear la unión de 3C5 y 3C5 puede bloquear la unión de S70.

Descripción detallada de la invención

Técnicas generales

[0027] La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la materia. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edición (Sambrook y col., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" (Goding, Academic Press, 3a edición, 1996); "Antibody Engineering" (R.E. Kontermann & S. Dubel, 2013); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel y col., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis y col., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas y col., 2001).

[0028] Para los propósitos de la presente invención, se definen los siguientes términos a continuación.

Definiciones

[0029] Para los propósitos de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa.

[0030] Los términos "PD-L1" y "ligando 1 de proteína de muerte celular programada 1", como se usan de manera intercambiable en esta invención, se refieren a cualquier PD-L1 de cualquier fuente de vertebrados, incluidos mamíferos tales como primates (p. ej., seres humanos) y roedores (p. ej., ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. "PD-L1 humano" incluye específicamente el polipéptido humano PD-L1 de 290 aminoácidos de longitud de SEQ ID NO: 48 (UniProtKB - Q9NZQ7).

[0031] El término "PD-L1" abarca PD-L1 "de longitud completa" sin procesar, así como cualquier forma de PD-L1 resultante del procesamiento dentro de la célula. El término también abarca las variantes de origen natural de PD-L1, p. ej., variantes de corte y empalme, variantes alélicas e isoformas. Los polipéptidos de PD-L1 descritos en esta invención pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o prepararse con procedimientos recombinantes o sintéticos. Un "polipéptido PD-L1 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido PD-L1 correspondiente derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos PD-L1 de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido PD-L1 de secuencia nativa" abarca específicamente formas truncadas o secretadas de PD-L1 de origen natural (p. ej., una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de origen natural (p. ej., formas de corte y empalme alternativos) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. Los polipéptidos PD-L1 de secuencia nativa divulgados en esta invención son polipéptidos maduros o de secuencia nativa de longitud completa que comprenden secuencias de aminoácidos de longitud completa de PD-L1. El término "PD-L1" abarca específicamente polipéptidos PD-L1 humanos nativos, que incluyen, sin limitación, el polipéptido PD-L1 humano de SEQ ID NO: 48, con o sin el péptido señal N-terminal en los aminoácidos 1 a 18.

[0032] Los términos "PD-1" y "proteína de muerte celular programada 1", como se usan de manera intercambiable en esta invención, se refieren a cualquier PD-1 de cualquier fuente de vertebrados, incluidos mamíferos tales como primates (p. ej., seres humanos) y roedores (p. ej., ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. "PD-1 humano" incluye específicamente el polipéptido humano PD-1 de 288 aminoácidos de longitud proporcionado en UniProtKB - Q15116.

[0033] El término "PD-1" abarca PD-1 "de longitud completa" sin procesar, así como cualquier forma de PD-1 resultante del procesamiento dentro de la célula. El término también abarca las variantes de origen natural de PD-1, p. ej., variantes de corte y empalme, variantes alélicas e isoformas. Los polipéptidos PD-1 descritos en esta invención pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o prepararse con procedimientos recombinantes o sintéticos. Un "polipéptido PD-1 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido PD-1 correspondiente derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos PD-1 de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido PD-1 de secuencia nativa" abarca específicamente formas truncadas o secretadas de PD-1 de origen natural (p. ej., una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de origen natural (p. ej., formas de corte y empalme alternativos) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. Los polipéptidos PD-1 de secuencia nativa divulgados en esta invención son polipéptidos maduros o de secuencia nativa de longitud completa que comprenden secuencias de aminoácidos de longitud completa de PD-1. El término "PD-1" engloba específicamente polipéptidos PD-1 humanos nativos, que incluyen, sin limitación, el polipéptido PD-1 humano de UniProtKB - Q15116, con o sin un péptido señal N-terminal.

[0034] Un "epítopo" es el sitio en la superficie de una molécula de antígeno al que se une una única molécula de anticuerpo. Generalmente, un antígeno tiene varios o muchos epítopos diferentes y reacciona con muchos anticuerpos diferentes. El término incluye específicamente epítopos lineales y epítopos conformacionales.

[0035] La "cartografía de epítopos" es el proceso de identificar los sitios de unión, o epítopos, de los anticuerpos en sus antígenos diana. Los epítopos de anticuerpos pueden ser epítopos lineales o epítopos conformacionales. Los epítopos lineales están formados por una secuencia continua de aminoácidos en una proteína. Los epítopos conformacionales están formados por aminoácidos que son discontinuos en la secuencia de la proteína, pero que se acercan al plegar la proteína en su estructura tridimensional.

[0036] "Agolpamiento de epítopos", como se define en esta invención, es el proceso de agrupación de anticuerpos basándose en los epítopos que reconocen. Más particularmente, el agrupamiento de epítopos comprende procedimientos y sistemas para discriminar las propiedades de reconocimiento de epítopos de diferentes anticuerpos, combinados con procesos informáticos para acumular anticuerpos basándose en sus propiedades de reconocimiento de epítopos e identificar anticuerpos que tienen especificidades de unión distintas.

[0037] Un anticuerpo se une "esencialmente al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia cuando los dos anticuerpos reconocen epítopos idénticos o que se superponen estéricamente. Los procedimientos rápidos y más ampliamente usados para determinar si dos epítopos se unen a epítopos idénticos o que se solapan estéricamente son los ensayos de competición, que pueden configurarse en una gran cantidad de formatos diferentes, usando antígeno marcado o bien anticuerpo marcado. Usualmente, el antígeno se inmoviliza en una placa de 96 pocillos y se mide la capacidad de los anticuerpos no marcados para bloquear la unión de los anticuerpos marcados usando marcajes radiactivos o enzimáticos. Preferentemente, tal anticuerpo se une esencialmente al mismo epítopo de PD-L1 que el unido a un anticuerpo que comprende un HVR-H1 de GFSLTSYDIS (SEQ ID NO: 4); una secuencia HVR-H2. de VIWTGVGTN (SEQ ID NO: 5); y una secuencia HVR-H3 de DPYYYGMDY (SEQ ID NO: 6). Tal anticuerpo puede comprender una secuencia de HVR-H1 que tiene al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 4, una secuencia de HVR-H2 que tiene al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 5, y una secuencia de HVR-H3 que tiene al menos aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 6. En este contexto, "PD-L1" es preferentemente el polipéptido PD-L1 humano de SEQ ID NO: 48, con o sin su péptido señal N-terminal.

[0038] Una "modificación" de una posición/residuo de aminoácido, como se usa en esta invención, se refiere a un cambio de una secuencia de aminoácidos primaria en comparación con la secuencia de aminoácidos inicial, donde el cambio es el resultado de una alteración de la secuencia que implica dichos residuos/posiciones de aminoácido. Por ejemplo, las modificaciones típicas incluyen la sustitución del residuo (o en dicha posición) por otro aminoácido (p. ej., una sustitución conservadora o no conservadora), la inserción de uno o más (generalmente menos de 5 o 3) aminoácidos adyacentes a dicho residuo/posición, y la deleción de dicho residuo/posición. Una "sustitución de aminoácidos" o variación de la misma, se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada (inicial) por un residuo de aminoácido diferente. General y preferentemente, una modificación da como resultado una alteración en al menos una actividad física o bioquímica del polipéptido variante en comparación con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de partida (o de "tipo silvestre"). Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, la actividad física o bioquímica que se altera puede ser la afinidad de unión, la capacidad de unión y/o el efecto de unión sobre una molécula diana.

[0039] El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos de longitud completa que tienen una región Fc de inmunoglobulina), moléculas monocatenarias, así como fragmentos de anticuerpo (p. ej., Fab, F(ab')²y Fv). El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa de manera intercambiable con "anticuerpo" en esta invención. La unidad básica de anticuerpo de 4 cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. A menos que se especifique lo contrario, el término "anticuerpo" se usa en esta invención en el sentido más amplio y específicamente incluye todos los isotipos, subclases y formas de anticuerpos, que incluyen los anticuerpos IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y sus fragmentos, preferentemente fragmentos de unión a antígeno. Los anticuerpos preferidos en esta invención incluyen anticuerpos IgG, IgM e IgA y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas realizaciones, un anticuerpo de un primer isotipo, tal como IgM, puede modificarse para incluir secuencias de otro isotipo, tal como IgG, para producir anticuerpos híbridos, cuyos ejemplos no limitantes incluyen los anticuerpos híbridos IgG/IgM e IgG/IgA.

[0040] A menos que se establezca de otro modo, el término "anticuerpo" incluye específicamente anticuerpos IgG1, IgG2 (IgG2a,IgG2b), IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD e IgM humanos y no humanos nativos, que incluyen las variantes de origen natural. Por tanto, por ejemplo, la secuencia de IgM humana se encuentra disponible con el número de acceso a GenBank X14940.1, mientras las variantes se han notificado como GenBank CAB37838.1, CAC20458.1, AFM37312.1, X57331.1 y J00260.1.

[0041] El término "nativo" con referencia a un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o una cadena J) se utiliza en esta invención para referirse a un polipéptido que tiene una secuencia que ocurre en la naturaleza, sin importar su modo de preparación. Por tanto, los términos "nativo" y "secuencia nativa" se usan en esta invención de manera intercambiable, y abarcan de forma expresa polipéptidos recombinantes con una secuencia que se encuentra en la naturaleza.

[0042] El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en esta invención, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir , los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigen contra un único sitio antigénico. Es más, en contraste con las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter de que el anticuerpo se obtuvo a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo a través de cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usar de acuerdo con la presente invención se pueden elaborar mediante el procedimiento de hibridoma, descrito por primera vez por Kohler y col. (1975) Nature 256:495, o se pueden elaborar mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, p. ej., la patente de Estados Unidos n.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de colecciones de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson y col. (1991) Nature 352:624-628 y Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597, por ejemplo.

[0043] Los anticuerpos monoclonales en esta invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie, así como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81:6851-6855).

[0044] Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej. murinos) son anticuerpos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, una rata, un conejo o un primate no humano, que tiene la especificidad, la afinidad y/o la capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana también son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Es más, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones pueden realizarse para refinar adicionalmente el desempeño de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá básicamente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o básicamente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o básicamente todas las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase, Jones y col. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332:323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

[0045] Un anticuerpo "aislado" en esta invención es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural en una célula hospedadora recombinante. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos, así como también subproductos de la producción no deseados. En una realización preferida, un anticuerpo aislado en esta invención se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso, o más de 98 % en peso o más de 99 % en peso, determinado por procedimientos de SDS-PAGE o SEC-HPLC (2) hasta un punto suficiente como para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal mediante el uso de un secuenciador de aminoácidos, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras, usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción argéntica. Habitualmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

[0046] En el caso de las IgG, la unidad de 4 cadenas generalmente es de aproximadamente 150.000 dáltones. Cada cadena L está ligada a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están ligadas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L tiene también puentes disulfuro intracatenarios espaciados en intervalos regulares. Cada cadena H tiene en el extremo N-terminal un dominio variable (V^h), seguido por tres dominios constantes (C^h) para cada una de las cadenas a y y y cuatro dominios C^hpara los isotipos p y s. Cada cadena L tiene en el extremo N-terminal un dominio variable (V^l), seguido de un dominio constante en su otro extremo. El V^lestá alineado con el V^hy el C^lestá alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (C^h1). Se cree que los residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El emparejamiento de un V ^hy V^ljuntos forma un solo sitio de unión a antígeno.

[0047] La IgM es una glicoproteína que forma polímeros donde múltiples inmunoglobulinas están ligadas de forma covalente entre sí con enlaces disulfuro. La IgM existe principalmente como un pentámero pero también como un hexámero y por lo tanto contiene 10 o 12 sitios de unión a antígeno. La forma pentamérica normalmente contiene un polipéptido adicional, llamado la cadena J, pero también puede estar hecho en ausencia de la cadena J. La molécula de IgM pentamérica tiene un peso molecular de aproximadamente 970 kDa. Debido a su naturaleza polimérica, la IgM posee gran avidez y es particularmente efectiva en la activación del complemento. A diferencia de la IgG, la cadena pesada en los monómeros de IgM está compuesta de un dominio variable y cuatro constantes. Los dominios constantes de IgM se designan en esta invención como CM1 o Cp1, CM2 o Cp2, CM3 o Cp3 y CM4 o Cp4, donde las designaciones "CM" y "Cp" se usan de manera intercambiable.

[0048] El término "IgM" se usa en esta invención en el sentido más amplio y específicamente incluye moléculas de IgM monoespecíficas y multiespecíficas (incluyendo biespecíficas), tales como, por ejemplo, las moléculas de unión a IgM multiespecíficas divulgadas en la publicación PCT/US2014/054079.

[0049] El término "unidad de unión a IgM" o "unidad de unión al anticuerpo IgM" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un polipéptido de región constante de cadena pesada de anticuerpo IgM, que comprende al menos un dominio constante Cp4, fusionado a una secuencia de dominio variable (V^h) que se une a una diana (p. ej., antígeno), con o sin una secuencia de dominio variable de cadena ligera (V^l) de anticuerpo asociada.

[0050] El término "unidad de unión a IgM biespecífica" o "unidad de unión al anticuerpo IgM biespecífica" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un par de polipéptidos de región constante de cadena pesada de anticuerpo IgM, que comprenden al menos un dominio constante Cp4, fusionados a una secuencia de dominio variable (V^h), donde cada secuencia de dominio variable se une a una diana diferente, con o sin secuencias de dominio variable de cadena ligera (V^l) de anticuerpo asociadas. En una realización, el anticuerpo IgM biespecífico comprende dos regiones de unión a antígeno V^hV^l, cada una capaz de unirse a un epítopo diferente en un antígeno o epítopos en dos antígenos diferentes. Las unidades de unión al anticuerpo IgM biespecíficas pueden ser de longitud completa de una sola especie, o pueden ser quimerizadas o humanizadas. Los anticuerpos IgM biespecíficos de la presente invención tienen una estructura de anillo hexamérica o pentamérica que comprende cinco o seis unidades de unión a IgM biespecíficas.

[0051] El término "IgM multiespecífica" se utiliza en esta invención en el sentido más amplio para referirse a anticuerpos IgM con dos o más especificidades de unión. Por tanto, el término "multiespecífico" incluye "biespecífico", p. ej. anticuerpos biespecíficos o unidades de unión biespecíficas, que incluyen pentámeros de IgM que comprenden al menos dos subunidades monoespecíficas, donde cada una se une a un antígeno diferente (AA, BB), o cinco o seis subunidades biespecíficas, donde cada una se une a dos antígenos diferentes (AB, AB). Por tanto, los pentámeros de IgM biespecífica y multiespecífica pueden incluir cinco unidades de unión biespecíficas idénticas, unidades de unión de IgM monoespecíficas, donde al menos dos de ellas tienen especificidades de unión diferentes, o cualquier combinación de las mismas.

[0052] Una "cadena pesada de anticuerpo IgM de longitud completa" es un polipéptido que consiste en la dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal en un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada constante de anticuerpo (CM1 o Cpl), un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CM2 o Cp2), un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CM3 o Cp3) y un dominio constante 4 de cadena pesada de anticuerpo (CM4 o Cp4). Los anticuerpos IgM de longitud completa biespecíficos tales como se definen en esta invención comprenden cinco o seis monómeros (unidades de unión), cada uno con dos sitios de unión a antígeno, que específicamente se unen a dos dianas de unión diferentes (epítopos). El extremo C-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa denota el último aminoácido en el extremo C-terminal de la cadena pesada o ligera. El extremo N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa designa el primer aminoácido en el extremo N-terminal de la cadena pesada o ligera.

[0053] La IgA nativa es una proteína tetramérica que comprende dos cadenas ligeras idénticas (k o A) y dos cadenas pesadas idénticas (a). En el ser humano, existen dos isotipos de IgA, IgA1 e IgA2. IgA, de manera similar a IgG, contiene tres dominios constantes (CA1-CA3 o Ca1-Ca3), con una región bisagra entre los dominios Cal y Ca2, donde las designaciones "CA" y "Ca" se usan de manera intercambiable. Todos los isotipos de IgA tienen una "pieza final" de 18 aminoácidos, que está localizada en el extremo C-terminal respecto al dominio Ca3, que permite la formación de Ig polimérica (véase, p. ej., Garcia-Pardo y col., 1981, J. Biol. Chem. 256, 11734-11738 y Davis y col., 1988, Eur. J. Immunol.

18, 1001-1008). La IgA de suero es un monómero pero también se puede polimerizar. En su forma de secreción, la IgA comprende de 2-5 de las unidades de 4 cadenas básicas, ligadas mediante una cadena J, que puede incluir una pieza final, y puede estar asociada por un componente de secreción. Los anticuerpos IgA se pueden dividir adicionalmente en las subclases IgAI e IgA2. El término anticuerpo "IgA" se usa en esta invención para incluir específicamente todas las subclases, es decir, anticuerpos IgA1 e IgA2, que incluyen formas diméricas y multiméricas, con y sin un componente de secreción, así como los fragmentos, preferentemente fragmentos de unión a antígeno, de tales anticuerpos. Para los propósitos de la presente invención, el anticuerpo IgA preferentemente es un dímero, donde las dos piezas finales están conectadas por una cadena J.

[0054] El término "IgA" se usa en esta invención en el sentido más amplio y específicamente incluye moléculas de IgA monoespecíficas y multiespecíficas, tales como, por ejemplo, las moléculas de unión a IgA multiespecíficas divulgadas en la publicación PCT n.° PCT/US2015/015268.

[0055] El término "IgA multiespecífica" se usa en esta invención en el sentido más amplio para referirse a anticuerpos IgA con dos o más especificidades de unión. Por tanto, el término "multiespecífico" incluye "biespecífico", p. ej., anticuerpos biespecíficos o unidades de unión biespecífica, que incluyen dímeros de IgA que comprenden dos subunidades monoespecíficas, donde cada una se une a un antígeno diferente (AA, BB), o dos subunidades biespecíficas, donde cada una se une a dos antígenos diferentes (AB, AB).

[0056] En una realización, las moléculas de IgA multiespecíficas diméricas consisten en dos unidades de unión monoespecíficas, donde cada unidad de unión tiene especificidad de unión respecto a una diana de unión diferente (AA, BB). En otra realización, en las moléculas de IgA diméricas al menos una de las dos unidades de unión tiene dos especificidades de unión diferentes (es decir, es biespecífica, por ejemplo, AA, AB o AA, BC). En otra realización, cada una de las dos unidades de unión tiene dos especificidades, que pueden ser iguales (AB, AB) o diferentes (AC, CD o AB, AC, por ejemplo).

[0057] El término "unidad de unión al anticuerpo IgA biespecífica" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un par de polipéptidos de región constante de cadena pesada de anticuerpo IgA, que comprenden al menos un dominio constante CA3, fusionados a una secuencia de dominio variable (V^h), donde cada secuencia de dominio variable se une a una diana diferente, con o sin secuencias de dominio variable de cadena ligera (V^l) de anticuerpo asociadas. En una realización, el anticuerpo IgA biespecífico comprende dos regiones de unión a antígeno V ^hV^l, cada una capaz de unirse a un epítopo diferente en un antígeno o epítopos en dos antígenos diferentes. Las unidades de unión al anticuerpo IgA biespecífico pueden ser de longitud completa de una sola especie, o estar quimerizadas o humanizadas.

[0058] Una "cadena pesada de anticuerpo IgA de longitud completa" es un polipéptido que consiste en la dirección de extremo N-terminal a extremo C-terminal en un dominio variable de cadena pesada (Vh ) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada constante de anticuerpo (CA1 o Cal), un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CA2 o Ca2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CA3 o Ca3). Los anticuerpos IgA de longitud completa biespecíficos o multiespecíficos según la invención comprenden dos monómeros (unidades de unión), cada uno de los cuales puede ser monoespecífico o biespecífico, con o sin un componente de secreción. Por tanto, los anticuerpos IgA multiespecíficos de la presente invención pueden incluir unidades de unión monoespecíficas y biespecíficas, siempre y cuando el anticuerpo IgA resultante tenga al menos dos especificidades de unión. El extremo C-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa denota el último aminoácido en el extremo C-terminal de la cadena pesada o ligera. El extremo N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa designa el primer aminoácido en el extremo N-terminal de la cadena pesada o ligera.

[0059] Para más detalles de la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a Edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71 y capítulo 6..

[0060] El término "interfaz", tal como se usa en esta invención, se usa para referirse a una región que comprende aquellos residuos de aminoácidos de "contacto" (u otros grupos que no son aminoácidos, tales como, por ejemplo, grupos carbohidrato), en una primera región constante de cadena pesada de anticuerpo que interactúa con uno o más residuos de aminoácidos de "contacto" (u otros grupos que no son aminoácidos) en una segunda región constante de cadena pesada de anticuerpo.

[0061] El término "interfaz asimétrica" se usa para referirse a una interfaz (tal como se define anteriormente en esta invención) formada entre dos cadenas de anticuerpo, tal como una primera y una segunda región constante de cadena pesada de IgM y/o entre una región constante de cadena pesada de IgM y su cadena ligera coincidente, donde los residuos de contacto en la primera y la segunda cadena son diferentes por diseño, que comprende residuos de contacto complementarios. La interfaz asimétrica se puede crear mediante interacciones de botones/ojales y/o acoplamiento de puentes salinos (intercambios de carga) y/u otras técnicas conocidas en la materia, tal como por ejemplo, mediante la estrategia de CrossMab para el acoplamiento de una cadena pesada p a su cadena ligera coincidente.

[0062] Una "cavidad" u "ojal" se refiere al menos a una cadena lateral de aminoácido que está rebajada a partir de la interfaz del segundo polipéptido y, por lo tanto, aloja una protuberancia ("botón") correspondiente en la interfaz adyacente del primer polipéptido. La cavidad (ojal) puede existir en la interfaz original o puede introducirse sintéticamente (p. ej., alterando el ácido nucleico que codifica la interfaz). Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfaz del segundo polipéptido se altera para codificar la cavidad. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "original" en la interfaz del segundo polipéptido es reemplazado por ADN que codifica al menos un residuo de aminoácido "de importación" que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo de aminoácido original. Se apreciará que puede haber más de un residuo de importación original y correspondiente. El límite superior para el número de residuos originales que son reemplazados es el número total de residuos en la interfaz del segundo polipéptido. Los residuos de importación preferidos para la formación de una cavidad son usualmente residuos de aminoácidos de origen natural y se seleccionan preferiblemente de entre alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V) y glicina (G). Los residuos de aminoácidos más preferidos son serina, alanina o treonina, lo más preferentemente alanina. El residuo original para la formación de la protuberancia puede tener un volumen de cadena lateral grande, tal como tirosina (Y), arginina (R), fenilalanina (F) o triptófano (W).

[0063] Un residuo de aminoácido "original" es aquel que se reemplaza por un residuo de "importación" que puede tener un volumen de cadena lateral más pequeño o más grande que el residuo original. El residuo de aminoácido de importación puede ser un residuo de aminoácido de origen natural o de origen no natural, pero preferentemente es el primero.

[0064] Por "residuo de aminoácido de origen no natural" se entiende un residuo que no está codificado por el código genético, pero que es capaz de unirse de manera covalente a uno o más residuos de aminoácidos adyacentes en la cadena polipeptídica. Son ejemplos de residuos de aminoácidos de origen no natural norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácidos tales como aquellos descritos en Ellman y col., Meth. Enzym.

202:301-336 (1991), por ejemplo. Para generar tales residuos de aminoácidos de origen no natural, se pueden usar los procedimientos de Noren y col. Science 244: 182 (1989) y Ellman y col., anteriormente. En resumen, esto implica la activación química de un ARNt supresor con un residuo de aminoácido de origen no natural, seguido de transcripción y traducción del ARN in vitro. Los procedimientos pueden implicar reemplazar al menos un residuo de aminoácido original en una cadena pesada de IgM, pero se puede reemplazar más de un residuo original. Normalmente, no más del total de residuos en la interfaz del primero o segundo polipéptido comprenderá residuos de aminoácidos originales que se reemplazan. Los residuos originales preferidos para el reemplazo están "enterrados". Por "enterrado" se entiende que el residuo se encuentra esencialmente inaccesible al solvente. El residuo de importación preferido no es cisteína para evitar la posible oxidación o desemparejamiento de los enlaces disulfuro.

[0065] La protuberancia es "posicionable" en la cavidad lo que significa que la ubicación espacial de la protuberancia y la cavidad en la interfaz del primer polipéptido y el segundo polipéptido respectivamente y los tamaños de la protuberancia y la cavidad son tales que la protuberancia se puede ubicar en la cavidad sin perturbar de forma significativa la asociación normal del primer y el segundo polipéptidos en la interfaz. Dado que las protuberancias tales como Tyr, Phe y Trp no se extienden típicamente de forma perpendicular desde el eje de la interfaz y tienen conformaciones preferidas, la alineación de una protuberancia con una cavidad correspondiente depende del modelado del par protuberancia/cavidad basándose en una estructura tridimensional tal como aquella obtenida mediante cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear (RMN). Esto se puede lograr usando técnicas ampliamente aceptadas en la materia, que incluyen técnicas de modelización molecular.

[0066] Por "ácido nucleico original" se entiende el ácido nucleico que codifica a un polipéptido de interés que se puede "alterar" (es decir, que se puede mutar o modificar genéticamente) para codificar una protuberancia o cavidad. El ácido nucleico original o de partida puede ser un ácido nucleico de origen natural o puede comprender un ácido nucleico que ha sido sometido a alteración anterior (p. ej., un fragmento de anticuerpo humanizado). Por "alterar" el ácido nucleico se entiende que el ácido nucleico original muta al insertar, delecionar o reemplazar al menos un codón que codifica un residuo de aminoácido de interés. Normalmente, un codón que codifica un residuo original es reemplazado por un codón que codifica un residuo de importación. Las técnicas para modificar genéticamente un ADN de esta manera se han revisado en Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991), e incluyen mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis en casete y mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo.

[0067] La protuberancia o cavidad se puede "introducir" en la interfaz del primer o segundo polipéptido mediante medios sintéticos, p. ej., mediante técnicas recombinantes, síntesis peptídica in vitro, aquellas técnicas para introducir residuos de aminoácidos de origen no natural previamente descritas, mediante acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas. Por consiguiente, la protuberancia o cavidad que se "introduce" es "de origen no natural" o "no nativa", lo que significa que no existe en la naturaleza o en el polipéptido original (p. ej., un anticuerpo monoclonal humanizado).

[0068] Preferentemente, el residuo de aminoácido de importación para formar la protuberancia tiene un número relativamente pequeño de "rotámeros" (p. ej., aproximadamente 3-6). Un "rotámero" es una conformación favorable energéticamente de una cadena lateral de aminoácido. El número de rotámeros para los diversos residuos de aminoácidos se revisa en Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987).

[0069] El término "cadena J de secuencia nativa" o "cadena J nativa", tal como se usa en esta invención, se refiere a la cadena J de los anticuerpos IgM o IgA de secuencia nativa de cualquier especie de animal, que incluye la cadena J humana madura, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 47.

[0070] El término "cadena J modificada" se usa en esta invención para referirse a variantes de polipéptidos de cadena J de secuencia nativa que comprenden un resto de unión extraño introducido en la secuencia nativa. La introducción se puede lograr mediante cualquier medio, que incluye la fusión directa o indirecta de un resto de unión extraño o mediante enlazamiento a través de un ligador químico. El término "cadena J humana modificada" abarca de forma específica, sin limitación, una cadena J humana de secuencia nativa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 modificada por la introducción de un resto de unión. El término abarca de forma específica, sin limitación, una cadena J humana de secuencia nativa de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 modificada mediante la introducción de un resto de unión extraño que no interfiere con la polimerización eficiente (dimerización) de IgM o IgA y la unión de tales polímeros (dímeros) a una diana.

[0071] El término "resto de unión" se usa en esta invención en el sentido más amplio para abarcar cualquier entidad química capaz de unión específica a una diana, tal como un antígeno. Los ejemplos de restos de unión incluyen, sin limitación, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, conjugados de fármaco y anticuerpo, moléculas de tipo anticuerpo, fragmentos de unión a antígeno de moléculas de tipo anticuerpo, ligandos y receptores. Los restos de unión preferidos son polipéptidos (que incluyen los péptidos), preferentemente con una función biológica. Un ejemplo de función biológica es la capacidad de un resto de unión para unirse y activar o bloquear la actividad de una vía de señalización.

[0072] El término "polipéptido" se usa en esta invención en el sentido más amplio e incluye secuencias peptídicas. El término "péptido" generalmente describe las cadenas moleculares lineales de aminoácidos que contienen hasta aproximadamente 60, preferentemente hasta aproximadamente 30 aminoácidos ligados de forma covalente por enlaces peptídicos.

[0073] El término "extraño" con referencia a un "resto de unión" se utiliza en esta invención para referirse a un resto de unión no presente en una secuencia de polipéptido nativa de referencia en la misma ubicación. Por tanto, una secuencia de polipéptido extraño (que incluye secuencias de péptidos), puede estar comprendida dentro de la secuencia nativa correspondiente pero en una localización diferente. La secuencia "extraña" puede no estar presente en la secuencia nativa correspondiente en ninguna localización.

[0074] El término "unión específica" o "se une específicamente a" o "específica de" se refiere a la unión de un resto de unión a una diana de unión, tal como la unión de un anticuerpo a un antígeno diana, p. ej., un epítopo en un polipéptido, péptido, u otra diana particular (p. ej., una diana de glicoproteína), y significa una unión que es diferente de forma medible de una interacción no específica (p. ej., una interacción no específica puede ser la unión a la albúmina de suero bovino o caseína). La unión específica se puede medir, por ejemplo, al determinar la unión de un resto de unión, o un anticuerpo, o un anticuerpo modificado por la introducción de un resto de unión, a una molécula diana comparada con la unión a una molécula de control. Por ejemplo, la unión específica puede determinarse mediante competencia con una molécula de control similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana sin marcar. En este caso, la unión específica se indica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe de forma competitiva mediante el exceso de diana sin marcar. El término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específica para" un epítopo o un polipéptido particular en una diana de polipéptido particular tal como se usa en esta invención se puede exhibir, por ejemplo, mediante una molécula con una Kd para la diana de al menos alrededor de 200 nM, alternativamente al menos alrededor de 150 nM, alternativamente al menos alrededor de 100 nM, alternativamente al menos alrededor de 60 nM, alternativamente al menos alrededor de 50 nM, alternativamente al menos alrededor de 40 nM, alternativamente al menos alrededor de 30 nM, alternativamente al menos alrededor de 20 nM, alternativamente al menos alrededor de 10 nM, alternativamente al menos alrededor de 8 nM, alternativamente al menos alrededor de 6 nM, alternativamente al menos alrededor de 4 nM, alternativamente al menos alrededor de 2 nM, alternativamente al menos alrededor de 1 nM, o mayor. En ciertos casos, el término "unión específica" se refiere a la unión donde una molécula se une a un epítopo o polipéptido particular en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epítopo del polipéptido.

[0075] "Afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en esta invención, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (p. ej., anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X respecto a su compañero Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd). Por ejemplo, la Kd puede ser de aproximadamente 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, o más fuerte. La afinidad puede calcularse usando métodos comunes conocidos en la técnica, que incluyen los descritos en esta invención. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos por más tiempo. Se conoce en la materia una variedad de procedimientos para medir la afinidad de unión.

[0076] Tal como se usa en esta invención, la "Kd" o "valor de Kd" se refiere a una constante de disociación medida mediante una técnica apropiada para el par de anticuerpo y diana, por ejemplo usando ensayos de resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizados a aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR).

[0077] Los términos "conjugado" [sustantivo], "conjugado" [verbo] y "conjugación" se refieren a todas y cada una de las formas de ligamiento covalentes o no covalentes, e incluyen, sin limitación, fusión genética directa o química, acoplamiento a través de un ligador o un agente de reticulación y asociación no covalente.

[0078] El término "fusión" se usa en esta invención para referirse a la combinación de secuencias de aminoácidos de diferente origen en una cadena polipeptídica mediante combinación en marco de sus secuencias de codificación de nucleótidos. El término "fusión" abarca de forma explícita fusiones internas, es decir, inserción de secuencias de diferente origen dentro de una cadena polipeptídica, además de la fusión a uno de sus extremos terminales. El término "fusión" se usa en esta invención para referirse a la combinación de secuencias de aminoácidos de diferente origen.

[0079] El término "valente", tal como se usa en esta invención, denota la presencia de una cantidad especificada de sitios de unión en un anticuerpo. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" designan la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente. Por tanto, si en un anticuerpo IgA biespecífico según la presente invención cada unidad de unión es bivalente, el anticuerpo IgA biespecífico tendrá 4 valencias.

[0080] El término "epítopo" incluye cualquier determinante molecular capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Un determinante epitópico incluye agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilo o sulfonilo y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo. Una "región de unión" es una región en una diana de unión unida mediante una molécula de unión.

[0081] La "especificidad poliepitópica" hace referencia a la capacidad de unirse de forma específica a dos o más epítopos diferentes en una o más dianas iguales o diferentes. "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de unión de un solo epítopo. Un anticuerpo puede unirse a cada epítopo con una afinidad de al menos 10-7M, o 10-8 M o mejor.

[0082] El término "diana" o "diana de unión" se usa en el sentido más amplio e incluye específicamente polipéptidos, sin limitación, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, células y otras moléculas con o sin función biológica como existen en la naturaleza.

[0083] El término "antígeno" se refiere a una entidad o fragmento del mismo que puede unirse a un anticuerpo o desencadenar una respuesta inmunitaria celular. Un inmunógeno se refiere a un antígeno que 22 puede provocar una respuesta inmunitaria en un organismo, particularmente un animal, más particularmente un mamífero que incluye un ser humano. El término antígeno incluye regiones conocidas como determinantes antigénicos o epítopos, tal como se define anteriormente.

[0084] Tal como se usa en esta invención, el término "inmunogénico" se refiere a sustancias, que provocan la producción de anticuerpos y/o activan células T y/u otras células inmunitarias reactivas dirigidas contra un antígeno del inmunógeno.

[0085] Un "sitio de unión a antígeno" o "región de unión a antígeno" de un anticuerpo de la presente invención contiene seis regiones hipervariables (HVR) que contribuyen en diversos grados a la afinidad del sitio de unión por el antígeno. El término "región determinante de complementariedad" o "CDR" se usa de manera intercambiable en esta invención con el término "región hipervariable" o "HVR". Hay tres HVR de dominio variable de cadena pesada (HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3) y tres HVR de dominio variable de cadena ligera (HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3). El alcance de las regiones HVR y de estructura (FR) está determinado por la comparación con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos en las que aquellas regiones han sido definidas según una variabilidad entre las secuencias y/o información estructural de los complejos de anticuerpo/antígeno. Es más, puede que ciertos anticuerpos tengan sitios de unión para un antígeno no asociados a HVR. Tales sitios de unión están específicamente incluidos dentro de la presente definición.

[0086] El término "célula hospedadora", tal como se utiliza en la solicitud actual, denota cualquier tipo de sistema celular que puede diseñarse para generar los anticuerpos según la invención actual. En una realización, se usan células de ovario de hámster chino (CHO) como células hospedadoras.

[0087] Tal como se usa en esta invención, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de manera intercambiable y todas dichas designaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria en cuestión y los cultivos derivados de esta sin importar el número de transferencias. Se entiende también que no toda la progenie puede ser precisamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a mutaciones inadvertidas o deliberadas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada en la célula originalmente transformada.

[0088] Un ácido nucleico está "unido de forma operativa" cuando está en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o secuencia líder de secreción se encuentra unido de forma operativa al ADN de un polipéptido si se expresa como preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido de forma operativa a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia, o un sitio de unión a ribosoma se une de forma operativa a una secuencia codificante si se ubica de manera que facilite la traducción. Generalmente, "unido de forma operativa" significa que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas, y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. El enlace se logra mediante unión en sitios de restricción convenientes. En caso de que no existan tales sitios, se usan adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

[0089] Los términos "anticuerpo anti-PD-L1", "anticuerpo de PD-L1" o "un anticuerpo que se une a PD-L1" se refieren todos a un anticuerpo que puede unirse a PD-L1 con suficiente afinidad, de tal modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para el orientamiento hacia PD-L1. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-PD-LI se une a un epítopo de PD-L1 que se conserva entre PD-L1 de diferentes especies.

[0090] En una realización, un "anticuerpo de PD-L1" se usa en esta invención para referirse específicamente a un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 que (i) comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-42 o 45, y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 43, 44 o 46; y (ii) comprende los HVR proporcionados en las SEQ ID NO: 1-6.

[0091] El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variable difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos. El dominio "variable" o "V" media la unión del antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables denominados regiones de estructura (FR, por sus siglas en inglés) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervariables" que tienen cada una 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan y, en algunos casos forman parte, de la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas y en estrecha proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)).

[0092] Un anticuerpo "intacto" es aquel que comprende un sitio de unión a antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y al menos dominios constantes de cadena pesada de la clase de anticuerpo particular. Por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto comprende un sitio de unión al antígeno, un dominio constante de cadena ligera CL y al menos los dominios constantes de cadena pesada CH1 (Cy1 ), CH2 (Cy2) y CH3 (Cy3). Un anticuerpo IgM intacto comprende un sitio de unión a antígeno, un dominio constante de cadena ligera CL y al menos los dominios constantes de cadena pesada CM1 (Cp1), CM2 (Cp2), CM3 (Cp3) y CM4 (Cp4). Un anticuerpo IgA intacto comprende un sitio de unión a antígeno, un dominio constante de cadena ligera CL y al menos los dominios constantes de cadena pesada CA1 (Cal), CA2 (Ca2) y CA3 (Ca3). Un anticuerpo IgD intacto comprende un sitio de unión a antígeno, un dominio constante de cadena ligera CL y al menos los dominios constantes de cadena pesada CD1 (C61), CD2 (C62) y CD3 (C63). Un anticuerpo IgE intacto comprende un sitio de unión a antígeno, un dominio constante de cadena ligera CL y al menos los dominios constantes de cadena pesada CE1 (Cs1), CE2 (Cs2), CE3 (Cs3) y CE4 (Cs4). Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de una secuencia nativa (p. ej., dominios constantes de una secuencia nativa humana) o una variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, un anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

[0093] "Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente, la región variable y/o de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo no limitantes incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; (véanse la patente U.S. n.° 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata y col., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpos monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo intacto y, por tanto, conserva la capacidad de unirse al antígeno. Los expertos en la materia entenderán que se puede generar un fragmento de anticuerpo a partir de cualquier anticuerpo intacto, p. ej., a partir de un anticuerpo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, separando al menos una porción de unión a antígeno del anticuerpo del resto de sus cadenas ligeras y pesadas para crear un fragmento de unión a antígeno. En ciertos aspectos, un fragmento de anticuerpo puede comprender una región de unión a antígeno de un anticuerpo, así como uno o más dominios adicionales de una cadena ligera y/o pesada del anticuerpo. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede comprender una región de unión a antígeno que comprende un dominio VH y VL, un dominio constante de cadena ligera CL y uno o más dominios constantes de cadena pesada, p. ej., un dominio c H l (Cy1), un dominio CM1 (Cp1 ), un dominio CA1 (Cal), un dominio CD1 (C61) o un dominio CE1 (Ce1).

[0094] En el caso de los fragmentos de anticuerpos IgG, la digestión con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idéntico, llamados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH) y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo IgG produce un único fragmento grande F(ab')2 que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab ligados por disulfuro que tiene actividad de unión a antígeno divalente y todavía es capaz de reticular el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio de cadena pesada CH1 que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en esta invención de Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

[0095] El fragmento Fc de un anticuerpo IgG comprende las porciones carboxi-terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan por secuencias en la región Fc, región que también es la parte reconocida por los receptores de Fc (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de células.

[0096] "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una asociación no covalente fuerte. En una especie Fv monocatenaria (scFv), un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada pueden ligarse covalentemente por un ligador peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a aquella en una especie Fv bicatenaria. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácidos para la unión de antígeno y confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque a una afinidad menor que todo el sitio de unión.

[0097] "Fv monocatenario" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende adicionalmente un ligador polipeptídico entre los dominios VH y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para un resumen de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.

[0098] El término "antagonista", como se usa en esta invención, se refiere a una molécula que causa una disminución en una función o actividad en comparación con la misma función o actividad en ausencia de la molécula. Un "antagonista" de una vía de señalización es, por lo tanto, una molécula cuya presencia provoca una disminución en una función o actividad de la vía de señalización. El término "antagonizar", como se usa en esta invención, se refiere a provocar una disminución en una función o actividad. Un anticuerpo "bloqueante" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos bloqueantes o anticuerpos antagonistas preferidos son capaces de inhibir en forma sustancial o total una actividad biológica del antígeno.

[0099] Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de interés, p. ej., un antígeno diana epitópico de PD-L1, es aquel que se une al antígeno con suficiente afinidad como para que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico para orientarse a una célula o tejido que expresa el antígeno, y no reacciona significativamente de forma cruzada con otras proteínas. Con respecto a la unión de un anticuerpo a una molécula diana, el término "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico de" un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido diana particular significa unión que es cuantificablemente diferente de una interacción no específica. La unión específica puede medirse, por ejemplo, determinando la unión de una molécula comparada con la unión de una molécula de control, que generalmente es un molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica puede determinarse mediante competencia con una molécula de control similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana sin marcar. En este caso, se indica unión específica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe de forma competitiva mediante el exceso de diana sin marcar. El término "unión específica" se refiere a la unión donde una molécula se une a un epítopo o polipéptido particular en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epítopo del polipéptido.

[0100] Un anticuerpo que "inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan un epítopo de PD-L1" o un anticuerpo "inhibidor del crecimiento" es aquel que da como resultado una inhibición cuantificable del crecimiento de células cancerosas que expresan o sobreexpresan un epítopo de PD-L1. El epítopo de PD-L1 puede ser un polipéptido transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido producido y secretado por una célula cancerosa. Los anticuerpos anti-PD-Ll inhibidores del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de las células tumorales que expresan PD-L1 en más del 20 %, preferentemente de aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, e incluso más preferentemente, en más del 50 % (p. ej., de aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %) en comparación con un control apropiado, siendo el control típicamente células tumorales no tratadas con el anticuerpo que se está ensayando.

[0101] Los anticuerpos que "inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan un epítopo de PD-L1" también pueden (i) inhibir el crecimiento o la proliferación de una célula a la que se unen; (ii) inducir la muerte de una célula a la que se unen; o (iii) inhibir la metástasis de una célula a la que se unen.

[0102] El término "agonista", como se usa en esta invención, se refiere a una molécula que provoca un aumento en una función o actividad en comparación con la misma función o actividad en ausencia de la molécula. Un "agonista" de una vía de señalización es, por lo tanto, una molécula cuya presencia provoca un aumento en una función o actividad de la vía de señalización. El término "agonizar", como se usa en esta invención, se refiere a provocar un aumento en una función o actividad.

[0103] El término "vía de señalización inhibidora de células T", como se usa en esta invención, se refiere a una vía de señalización de células T que conduce a una disminución, bloqueo o detención cualitativa o cuantitativa de una respuesta inmunitaria de células T.

[0104] El término "vía de señalización estimuladora de células T", como se usa en esta invención, se refiere a una vía de señalización de células T que conduce a un aumento cualitativo o cuantitativo o al mantenimiento de una respuesta inmunitaria de células T.

[0105] Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Un “tumor” comprende una o más células cancerosas. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o neoplasias malignas linfoides. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen carcinoma de células escamosas (p. ej., carcinoma de célula escamosa epitelial), cáncer de piel, melanoma, cáncer de pulmón que incluye cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar no microcítico ("NSCLC"), adenocarcinoma pulmonar y carcinoma escamoso pulmonar, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático (p.ej., adenocarcinoma ductal pancreático), glioblastoma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovarios (p. ej., carcinoma de ovario seroso de alto grado), cáncer de hígado (p. ej., carcinoma hepatocelular (CHC)), cáncer de vejiga (p.ej., cáncer de vejiga urotelial), cáncer testicular (tumor de células germinales), hepatoma, cáncer de mama, cáncer de cerebro (p. ej., astrocitoma), cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o útero, carcinoma de la glándula salival, cáncer de riñón o renal (p. ej., carcinoma de células renales, nefroblastoma o tumor de Wilms), cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cuello. Los ejemplos adicionales de cáncer incluyen, sin limitación, retinoblastoma, tecomas, arrenoblastomas, hepatoma, neoplasias hematológicas incluyendo linfoma no Hodgkin (LNH), mieloma múltiple y neoplasias malignas hematológicas agudas, carcinoma endometrial o uterino, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, carcinoma de la glándula salival, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinomas de esófago, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas laríngeos, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, schwannoma, oligodendroglioma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas y carcinomas del tracto urinario.

[0106] El término "cáncer metastásico" significa el estado de cáncer en el que las células cancerosas de un tejido de origen se transmiten desde el sitio original a uno o más sitios en otras partes del cuerpo, por los vasos sanguíneos o linfáticos, para formar uno o más tumores secundarios en uno o más órganos además del tejido de origen. Un ejemplo destacado es el cáncer de mama metastásico.

[0107] Como se usa en esta invención, un "cáncer asociado a PD-L1" es un cáncer que está asociado con la expresión o sobreexpresión de un gen o producto génico de PD-L1, que puede ser cualquier cáncer que se caracteriza por células que expresan niveles normales o elevados de uno o más productos del gen PD-L1, en relación con las células de control adecuadas. Las células de control adecuadas pueden ser células de un individuo que no está afectado por un cáncer que expresa o sobreexpresa PD-L1, o pueden ser células no cancerosas del sujeto que lo necesita, o bien pueden ser células no cancerosas de otro individuo que está afectado por un cáncer que expresa o sobreexpresa PD-L1.

[0108] Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que están asociados con algún grado de proliferación celular anormal. El trastorno de proliferación celular puede ser cáncer.

[0109] "Tumor", como se usa en esta invención, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y toda célula y tejido precanceroso y canceroso.

[0110] Los términos "predictivo" y "pronóstico", como se usan en esta invención, también son intercambiables, en el sentido de que los procedimientos de predicción o pronóstico deben permitir a la persona que practica el procedimiento seleccionar los pacientes que se consideran (usualmente antes del tratamiento, pero no necesariamente) tienen más probabilidades de responder al tratamiento con un agente anticanceroso, incluido un anticuerpo anti-PD-Ll.

[0111] Los términos "tratar", "tratamiento" o "tratando" como se usan en esta invención se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, donde el objeto es impedir o ralentizar (atenuar) una afección o trastorno patológico diana. Un sujeto necesitado de tratamiento incluye aquellos que ya padecen una afección o el trastorno particular así como aquellos propensos a padecer el trastorno o aquellos en los que ha de prevenirse el trastorno.

Composiciones anti-PD-L1

[0112] Los aspectos de la invención incluyen anticuerpos anti-PD-L1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se define en las reivindicaciones adjuntas, que incluyen específicamente, sin limitación, anticuerpos IgM, IgG e IgA. El anticuerpo se une, preferentemente específicamente, a un polipéptido PD-L1, como se describe en esta invención. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que incluye, p. ej., fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv y diacuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo anti-PD-L1 a su epítopo antigénico respectivo. Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacterianas y son capaces de inhibir la interacción entre una proteína PD-L1 y un receptor o ligando al que se une. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es capaz de inducir la muerte de una célula a la que se une. Para propósitos de detección, los anticuerpos de la presente invención pueden marcarse de forma detectable, enlazarse a un soporte sólido o similar.

[0113] En un aspecto, se proporciona el anticuerpo anti-PD-L1, donde el anticuerpo tiene una o más de las siguientes actividades: (i) inhibe la interacción entre una proteína PD-L1 y un receptor o ligando (por ejemplo, una proteína PD-1) al que la proteína PD-L1 es capaz de unirse; (ii) inhibe la metástasis tumoral in vivo; (iii) inhibe el crecimiento tumoral in vivo; (iv) disminuye el tamaño del tumor in vivo; (v) exhibe actividad citotóxica en una célula tumoral que expresa PD-L1 in vivo; o (vi) exhibe actividad citostática en una célula tumoral que expresa PD-L1 in vivo. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo antagonista que inhibe la interacción entre PD-L1 y PD-1. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-PD-L1 es capaz de unirse a una proteína PD-L1 y de ese modo inhibir una o más funciones (p. ej., una o más funciones inmunosupresoras) de una proteína PD-1.

[0114] El anticuerpo comprende las tres secuencias de HVR de cadena pesada proporcionadas en las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 y las tres secuencias de HVR de cadena ligera proporcionadas en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3. El anticuerpo comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende las tres secuencias de HVR de cadena pesada proporcionadas en las SEQ ID NO: 4, 5 y 6, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las tres secuencias de HVR de cadena ligera que se proporcionan en las SEQ ID NO: 1, 2 y 3.

[0115] Los aspectos de la invención incluyen tales anticuerpos anti-PD-L1 cuyas secuencias de cadena pesada y cadena ligera comprenden una secuencia de estructura. Las secuencias de estructura de acuerdo con las realizaciones de la invención incluyen, por ejemplo, secuencias de línea germinal de ADN y proteína humana, así como secuencias de estructura de consenso que derivan de cualquier número de secuencias de proteína humana y/o línea germinal de ADN. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena ligera de anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de estructura humana o una secuencia de estructura humana de consenso. En algunas realizaciones, una secuencia de cadena pesada de anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de estructura humana o una secuencia de estructura humana de consenso.

[0116] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región 1 de estructura de cadena pesada (FR1) que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de FR1 de cadena pesada proporcionadas en las SEQ ID NO: 7-11. En ciertas realizaciones, un anticuerpo comprende una secuencia de f R1 de cadena pesada como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 7-11.

[0117] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región 2 de estructura de cadena pesada (FR2) que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de FR2 de cadena pesada proporcionadas en las SEQ ID NO: 12-16. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de f R2 de cadena pesada como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 12-16.

[0118] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región 3 de estructura de cadena pesada (FR3) que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de FR3 de cadena pesada proporcionadas en las SEQ ID NO: 17-24. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de f R3 de cadena pesada como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 17-24.

[0119] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región 4 de estructura de cadena pesada (FR4) que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de FR4 de cadena pesada proporcionadas en las SEQ ID NO: 25-26. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de f R4 de cadena pesada como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 25-26.

[0120] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región 1 de estructura de cadena ligera (FR1) que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de FR1 de cadena ligera proporcionadas en las SEQ ID NO: 27-29. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de FR1 de cadena ligera como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 27-29.

[0121] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región 2 de estructura de cadena ligera (FR2) que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de FR2 de cadena ligera proporcionadas en las SEQ ID NO: 30-31. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de FR2 de cadena ligera como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 30-31.

[0122] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región 3 de estructura de cadena ligera (FR3) que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de FR3 de cadena ligera proporcionadas en las SEQ ID NO: 32-33. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de FR3 de cadena ligera como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 32-33.

[0123] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de la región 4 de estructura de cadena ligera (FR4) que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de FR4 de cadena ligera proporcionadas en las SEQ ID NO: 34-35. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de FR4 de cadena ligera como se proporciona en cualquiera de las SEQ ID NO: 34-35.

[0124] En un aspecto, se proporciona el anticuerpo que se une a PD-L1, donde el anticuerpo comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a cualquiera de las secuencias de dominio variable de cadena pesada proporcionadas en las SEQ ID NO: 36-42 o 45. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada proporcionada en cualquiera de las SEQ ID NO: 36-42 o 45.

[0125] En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90%, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a cualquiera de las secuencias de dominio variable de cadena ligera proporcionadas en las SEQ ID NO: 43, 44 o 46. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada proporcionada en cualquiera de las SEQ ID NO: 43, 44 o 46.

[0126] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia de dominio variable de cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 45, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90%, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia del dominio variable de cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 46. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 45 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 46.

[0127] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 36, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 43. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 36 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 43.

[0128] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en las SEQ ID NO: 37, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 37, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 43.

[0129] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 38, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 43. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 38 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 43.

[0130] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 39, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 43. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 39 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 43.

[0131] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 36, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 44. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 36 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 44.

[0132] En una realización, el anticuerpo anti-PD-LI comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 37, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 44. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 37 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 44.

[0133] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 38, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 44. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 38 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 44.

[0134] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 39, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 44. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 39 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 44.

[0135] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 40, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 43. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 40 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 43.

[0136] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 41, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 43. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 41 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 43.

[0137] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 42, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 43. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 42 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 43.

[0138] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 40, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 44. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 40 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 44.

[0139] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 41, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 44. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 41 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 44.

[0140] En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 42, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, tal como aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % idéntica a la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 44. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada como se proporciona en la SEQ ID NO: 42 y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera como se proporciona en la SEQ ID NO: 44.

[0141] En algunas realizaciones, un anticuerpo que comprende cualquiera de las secuencias o combinaciones de secuencias que se enumeran en esta invención es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

[0142] En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de estructura de consenso de cadena pesada del subgrupo III de VH humano (VH3). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de estructura de consenso de cadena pesada del subgrupo II de VH humano (VH2). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de estructura de consenso de cadena pesada del subgrupo I de VH humano (VH1). Se proporcionan ejemplos de secuencias de FR1 de cadena pesada de VH3 en las SEQ ID NO: 10 y 11. Se proporcionan ejemplos de secuencias de FR2 de cadena pesada de VH3 en las SEQ ID NO: 15 y 16. Se proporcionan ejemplos de secuencias de FR3 de cadena pesada de VH3 en las SEQ ID NO: 22, 23 y 24.

[0143] En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de estructura de consenso de cadena ligera kappa humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de estructura de consenso de cadena ligera lambda humana.

[0144] Como se conoce en la materia, y como se describe con mayor detalle en esta invención, la posición/límite del aminoácido que delinea una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y las diversas definiciones conocidas en la materia (como se describe a continuación). Algunas posiciones dentro de un dominio variable pueden verse como posiciones hipervariables híbridas en el sentido de que estas posiciones pueden considerarse dentro de una región hipervariable bajo un conjunto de criterios mientras que se considera que están fuera de una región hipervariable bajo un conjunto diferente de criterios. Una o más de estas posiciones también se pueden encontrar en regiones hipervariables extendidas (como se define más adelante). La divulgación proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones hipervariables híbridas. En una realización, estas posiciones hipervariables incluyen una o más de las posiciones 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 y 101-102 en un dominio variable de cadena pesada. En una realización, estas posiciones hipervariables híbridas incluyen una o más de las posiciones 24 29, 35-36, 46-49, 56 y 97 en un dominio variable de cadena ligera.

[0145] Los anticuerpos de acuerdo con aspectos de la invención incluyen específicamente todos los isotipos, subclases y formas de anticuerpos, incluyendo, sin limitación, los anticuerpos IgG, IgM, IgA, IgD e IgE y sus fragmentos, preferentemente fragmentos de unión a antígeno. Los anticuerpos preferidos en esta invención incluyen anticuerpos IgG, IgM e IgA y sus fragmentos de unión a antígeno, que se pueden modificar para incluir secuencias de otros isotipos, tales como IgG, para producir anticuerpos quiméricos.

[0146] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo IgG. En ciertas realizaciones, el anticuerpo IgG es de una subclase seleccionada de entre el grupo que consiste en: IgG1, IgG2 (IgG2a, IgG2b), IgG3 o IgG4.

[0147] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo IgM. Los anticuerpos IgM se describen en la solicitud PCT publicada WO2015/053887.

[0148] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo IgA. En ciertas realizaciones, el anticuerpo IgA es de una subclase seleccionada de entre el grupo que consiste en: IgA1 o IgA2. Los anticuerpos IgA se describen en la solicitud PCT publicada WO2015/120474.

[0149] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo IgM que comprende una cadena J modificada. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo IgA que comprende una cadena J modificada. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo IgG/IgM híbrido que comprende una cadena J modificada. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo IgG/IgA híbrido que comprende una cadena J modificada. Los anticuerpos IgM, IgA, IgG/IgM e IgG/IgA que comprenden una cadena J modificada se describen en la solicitud PCT publicada WO2015/153912.

[0150] Los anticuerpos de acuerdo con las realizaciones de la invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos IgG biespecíficos se describen, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2014/0120096.

[0151] Los aspectos de la invención incluyen anticuerpos IgM biespecíficos con especificidades de unión a dos regiones de unión diferentes. Los anticuerpos IgM biespecíficos se describen en la solicitud PCT publicada WO2015/053887.

[0152] Los aspectos de la invención incluyen anticuerpos IgA biespecíficos con especificidades de unión a dos regiones de unión diferentes. Los anticuerpos IgA biespecíficos se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT publicada WO2015/120474.

[0153] Los aspectos de la invención incluyen anticuerpos IgG/IgM e IgG/IgA híbridos. Tales anticuerpos se describen en la solicitud PCT publicada WO2015/153912.

[0154] En una realización particular, un anticuerpo anti-PD-L1 de longitud completa es un anticuerpo IgG.

[0155] En una realización particular, un anticuerpo anti-PD-L1 de longitud completa es un anticuerpo IgM. En una realización, un anticuerpo IgM anti-PD-L1 de longitud completa comprende una cadena J modificada que comprende un resto de unión extraño.

[0156] En una realización particular, un anticuerpo anti-PD-L1 de longitud completa es un anticuerpo IgA. En una realización, un anticuerpo IgA anti-PD-L1 de longitud completa comprende una cadena J modificada que comprende un resto de unión extraño.

[0157] En una realización particular, un anticuerpo anti-PD-Ll de longitud completa es un anticuerpo IgG/IgM híbrido. En una realización, un anticuerpo IgG/IgM híbrido anti-PD-L1 de longitud completa comprende una cadena J modificada que comprende un resto de unión extraño.

[0158] En una realización particular, un anticuerpo anti-PD-L1 de longitud completa es un anticuerpo IgG/IgA híbrido. En una realización, un anticuerpo IgG/IgA anti-PD-L1 de longitud completa comprende una cadena J modificada que comprende un resto de unión extraño.

[0159] Las secuencias de aminoácidos a las que se refiere esta invención se proporcionan en la Tabla 1, a continuación:

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos

[0160] Los aspectos de la invención incluyen anticuerpos que comprenden una cadena J que comprende un resto de unión que antagoniza una vía de señalización inhibidora de células T, sin interferir con la capacidad del anticuerpo IgM, IgA, IgG/IgM o IgG/IgA para unirse a su diana o dianas de unión (p. ej., PD-L1). La molécula de acuerdo con realizaciones de la invención unión puede, por ejemplo, ser un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgA, o un anticuerpo híbrido de IgG/IgM o IgG/IgA, que puede contener una pieza de cola de IgM o IgA en la cadena pesada de IgG y por tanto combina las propiedades de IgG e IgM o IgA, incluyendo la capacidad de incorporar y formar polímeros con una cadena J modificada cuyo resto de unión antagoniza una vía de señalización inhibidora de células T. Para detalles adicionales sobre anticuerpos híbridos de IgG/IgM e IgG/IgA, véase, por ejemplo Koteswara y col., Clinical Immunology 2001, 101(1 ):21 -31.

[0161] Las vías de señalización inhibidora de células T se conocen en la materia e incluyen, sin limitación, las descritas en Pardoll, Drew M. "The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy". Nature Reviews Cancer 12.4 (2012): 252-264. Los ejemplos no limitantes de vías de señalización inhibidoras de células T y componentes de las mismas se describen con más detalle a continuación.

[0162] La muerte celular programada 1 (PD-1) y su ligando, el ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1) están implicados generalmente en la actividad inmunosupresora de las células T. La PD-1 es una proteína receptora inhibidora de superficie celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas, se expresa sobre la superficie de células T y está implicada en la regulación de la función de las células T en la inmunidad y la autotolerancia. El PD-L1 interactúa con PD-1 en la superficie de las células T e inhibe la proliferación de las células T bloqueando la progresión del ciclo celular y la producción de citocinas. Id. Los ejemplos de las funciones inmunosupresoras de PD-1 incluyen, pero sin limitación, agotamiento, anergia y quiescencia de las células T que expresan PD-1. Como se revisó anteriormente, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-PD-L1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, es capaz de unirse a una proteína PD-L1 y de ese modo inhibir una o más de las funciones inmunosupresoras de una proteína PD-1.

[0163] La proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y se ha mostrado que transmite una señal inhibidora a las células T. La isoforma unida a la membrana de CTLA-4 funciona como un homodímero interconectado por un enlace disulfuro, mientras que la isoforma soluble funciona como un monómero. P. ej., Pardoll en 255.

[0164] Otro ejemplo de una vía de señalización inhibidora de células T es la vía de señalización que implica inmunoglobulina de células T y dominio 3 de mucina (TIM3). La TIM3 es una glicoproteína de superficie celular que se expresa en la superficie de las células T y funciona como una molécula inhibidora que está implicada en la terminación de las células Th1. Id.

[0165] Otro ejemplo de una vía de señalización inhibidora de células T es la vía de señalización que implica el gen 3 de activación de linfocitos (LAG3). LAG3 pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y funciona como inhibidor de la proliferación celular, activación y homeostasis de las células T. Id.

[0166] Otro ejemplo de una vía de señalización inhibidora de células T es la vía de señalización que involucra a la proteína atenuadora de linfocitos B y T (BTLA). BTLA es una proteína de superficie celular que funciona inhibiendo las células T mediante la interacción con miembros de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral. Se sabe que BTLA regula negativamente las respuestas inmunitarias de las células T. Id.

[0167] Otro ejemplo de una vía de señalización inhibidora de células T es la vía de señalización que implica el supresor de Ig de dominio V de la activación de células T (VISTA). VISTA es un regulador de la función de las células T que se expresa en las células hematopoyéticas y los leucocitos, y funciona suprimiendo la activación de las células T. P. ej., Lines JL, y col., Cancer research. 2014;74(7):1924-1932.

[0168] Otro ejemplo de una vía de señalización inhibidora de células T es la vía de señalización que implica el inmunorreceptor de células T de proteína con dominios Ig e ITIM (TIGIT). TIGIT se expresa en varias clases de células T y se une con alta afinidad al receptor de poliovirus. TIGIT suprime la activación de las células T al promover la generación de células dendríticas inmunorreguladoras maduras. P. ej., Yu X. y col., Nat Immunol. Ene 2009;10(1):48-57.

[0169] Como se revisó anteriormente, los anticuerpos de acuerdo con realizaciones de la invención pueden comprender un resto de unión en la cadena J que antagoniza una vía de señalización inhibidora de células T. En algunas realizaciones, un resto de unión en la cadena J se une a una diana en una vía de señalización inhibidora de células T y, de ese modo, bloquea o disminuye las señales inhibidoras que son recibidas por una célula T a través de la vía. Como resultado, la respuesta inmunitaria de las células T no se bloquea, detiene o disminuye o, al menos, la inhibición de la respuesta inmunitaria de las células T se reduce o disminuye. El resto de unión en la cadena J de un anticuerpo en cuestión se puede usar para antagonizar cualquier vía de señalización inhibidora de células T, incluyendo, pero sin limitación, las vías de señalización inhibidoras que implican las proteínas enumeradas en la Tabla 2, a continuación. Los números de acceso a GenBank correspondientes a las secuencias de proteínas humanas de estas dianas de la vía de señalización inhibidora de células T se proporcionan en la Tabla 2, a continuación.

Tabla 2: Información de secuencia para las dianas de la vía de señalización inhibidora de células T

[0170] Los aspectos de la invención incluyen anticuerpos anti-PD-L1 que tienen una cadena J que comprende un resto de unión que reduce el aclaramiento del anticuerpo de la circulación de un sujeto, aumentando de ese modo la vida media del anticuerpo en el sujeto. La unión de albúmina es conocida en la materia como una estrategia general para mejorar la farmacocinética de una proteína. Por ejemplo, se ha mostrado que la asociación no covalente con la albúmina prolonga la vida media de las proteínas de vida corta. P. ej., Dennis, Mark S. y col., J. Biol. Chem., 2002, 277:35035-35043. Como tal, el uso de albúmina (albúmina de suero humano), proteínas similares a la albúmina o péptidos de unión a la albúmina como un resto de unión en una cadena J en el anticuerpo anti-PD-L1 en cuestión proporciona una estrategia eficaz para manipular la farmacocinética del anticuerpo. Además, se sabe que el receptor de Fc neonatal (FcRn) proporciona una vía de reciclaje que proporciona a las moléculas de inmunoglobulina una vida media circulante más prolongada. P. ej., Roopenian DC y col., Nature Reviews Immunology 7, 715-725 (2007). Como tal, el uso de proteínas de unión a FcRn, dominios Fc que se unen a FcRn o restos de anticuerpos que se unen a FcRn también proporciona una estrategia eficaz para manipular la farmacocinética de un anticuerpo.

[0171] En algunas realizaciones, un resto de unión en una cadena J de un anticuerpo anti-PD-Ll sujeto comprende una proteína albúmina. Las proteínas albúminas son proteínas solubles no glicosiladas que se encuentran comúnmente en el plasma sanguíneo. Se sabe que las proteínas albúminas interactúan con la vía de reciclaje mediada por FcRn y, como resultado, tienen una vida media circulatoria extraordinariamente larga.

[0172] En ciertas realizaciones, un resto de unión en una cadena J del anticuerpo anti-PD-Ll en cuestión se une a una proteína albúmina, conectándose de ese modo a una proteína albúmina y aprovechando la vía de reciclaje mediada por FcRn. Como tal, en algunas realizaciones, un resto de unión en una cadena J del anticuerpo anti-PD-L1 en cuestión comprende un péptido de unión a albúmina. Se describen ejemplos no limitantes de péptidos de unión a albúmina en la publicación de patente de EE.UU. n° US20050287153. En algunas realizaciones, un resto de unión en una cadena J del anticuerpo anti-PD-L1 en cuestión comprende un resto de anticuerpo de unión a albúmina. Los ejemplos no limitantes de restos de anticuerpos que se unen a la albúmina incluyen Fab anti-albúmina, scFv anti-albúmina, VHH anti-albúmina (p. ej., una molécula de anticuerpo de tipo camélido), scFab anti-albúmina y dAb anti-albúmina (p. ej., un anticuerpo de dominio humano).

[0173] En algunas realizaciones, un resto de unión en una cadena J del anticuerpo anti-PD-Ll en cuestión comprende un péptido de unión a FcRn. En ciertas realizaciones, un resto de unión en una cadena J del anticuerpo anti-PD-LI en cuestión comprende un resto de anticuerpo de unión a FcRn. Los ejemplos no limitantes de restos de anticuerpos que se unen a FcRn incluyen Fab anti-FcRn, scFv anti-FcRn, VHH anti-FcRn, scFab anti-FcRn y dAb anti-FcRn.

[0174] En algunas realizaciones, un resto de unión en una cadena J del anticuerpo anti-PD-Ll en cuestión comprende un dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina que está unida por un receptor FcRn. Los restos de unión que se pueden incluir en una cadena J del anticuerpo anti-PD-Ll en cuestión para reducir el aclaramiento del anticuerpo anti-PD-L1 incluyen, sin limitación, los restos de unión que se proporcionan a continuación en la Tabla 3. En la Tabla 3 también se proporcionan ejemplos no limitantes de proteínas que se pueden usar para generar un resto de anticuerpo que se puede usar como un resto de unión en una cadena J del anticuerpo anti-PD-L1 en cuestión.

Tabla 3: Información de secuencia para restos de unión reductores del aclaramiento

[0175] Un resto de unión en la cadena J del anticuerpo en cuestión puede incluir, sin limitación: anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, conjugados de fármaco y anticuerpo, fragmentos de unión a antígeno de conjugado de anticuerpo y fármaco, moléculas de tipo anticuerpo, fragmentos de unión a antígeno de moléculas de tipo anticuerpo, proteínas solubles y unidas a la membrana, ligandos y receptores. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en: Fab, Fab', F(ab)², F(ab')², Fv y anticuerpo scFv.

En una realización preferida, el resto de unión en una cadena J es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo (también denominado un "fragmento de anticuerpo"), que incluye anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos y multiespecíficos y fragmentos de anticuerpo, que funciona como un antagonista de una vía de señalización inhibidora de células T. En una realización preferida, el fragmento de anticuerpo es un Fv monocatenario (scFv).

[0176] Los aspectos de la invención incluyen un anticuerpo IgM, IgA, IgG/IgM o IgG/IgA, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína de superficie celular (p. ej., una proteína CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA o TIGIT), donde el anticuerpo IgM, IgA, IgG/IgM o IgG/IgA, o un fragmento de unión a antígeno, comprende una cadena J modificada que comprende un resto de unión extraño, que comprende el anticuerpo anti-PD-Ll, o fragmento de unión a antígeno, como se describe en esta invención.

[0177] En algunos aspectos, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos en esta invención. También se proporcionan células hospedadoras que comprenden cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, las células hospedadoras pueden ser células CHO, células de E. coli o células de levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos descritos en esta invención y comprende cultivar células hospedadoras en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular.

[0178] Los anticuerpos de acuerdo con las realizaciones de la invención se pueden emplear en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como ELISA, ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pág. 147-158, CRC Press, Inc.).

[0179] Un marcaje de detección puede ser útil para localizar, visualizar y cuantificar un evento de unión o reconocimiento. Un anticuerpo marcado de la invención puede detectar receptores de superficie celular. Otro uso de anticuerpos marcados de forma detectable es un procedimiento de inmunocaptura basada en perlas que comprende conjugar una perla con un anticuerpo marcado con fluorescencia y detectar una señal de fluorescencia tras la unión de un ligando. Metodologías de detección de unión similares utilizan el efecto de resonancia de plasmón superficial (SPR) para medir y detectar interacciones anticuerpo-antígeno.

[0180] Los marcajes de detección tales como tintes fluorescentes y tintes quimioluminiscentes (Briggs y col (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids", J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058) proporcionan una señal detectable y son generalmente aplicables para marcar anticuerpos, preferentemente con las siguientes propiedades: (i) el anticuerpo marcado debe producir una señal muy alta con un fondo bajo para que pequeñas cantidades de anticuerpos puedan detectarse con sensibilidad tanto en ensayos libres de células como basados en células; y (ii) el anticuerpo marcado debe ser fotoestable para que la señal fluorescente pueda ser observada, monitorizada y registrada sin un fotoblanqueo significativo. Para aplicaciones que implican la unión de superficie celular del anticuerpo marcado a membranas o superficies celulares, especialmente células vivas, los marcajes preferentemente (iii) tienen buena solubilidad en agua para lograr una concentración de conjugado eficaz y sensibilidad de detección y (iv) no son tóxicos para las células vivas, para no interrumpir los procesos metabólicos normales de las células o causar la muerte celular prematura.

[0181] La cuantificación directa de la intensidad de la fluorescencia celular y la enumeración de eventos marcados con fluorescencia, p. ej., la unión a la superficie celular de los conjugados péptido-tinte, se puede realizar en un sistema (FMAT® 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, California) que automatiza los ensayos de mezcla y lectura no radiactivos con células vivas o perlas (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). Los usos de anticuerpos marcados también incluyen ensayos de unión a receptores de superficie celular, ensayos de inmunocaptura, ensayos de inmunoabsorción ligados a fluorescencia (FLISA), escisión de caspasa (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo" , (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6372907), apoptosis (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51) y ensayos de citotoxicidad. La tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico se puede usar para identificar la regulación positiva o negativa de una molécula que se orienta a la superficie celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).

[0182] Los anticuerpos marcados de la invención son útiles como biomarcadores y sondas de formación de imágenes mediante los diversos procedimientos y técnicas de formación de imágenes biomédicas y moleculares tales como: (i) MRI (formación de imágenes por resonancia magnética); (ii) MicroCT (tomografía computarizada); (iii) SPECT (tomografía computarizada por emisión de fotón único); (iv) PET (tomografía por emisión de positrones) Chen y col (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) bioluminiscencia; (vi) fluorescencia; y (vii) ultrasonidos. La inmunogammagrafía es un procedimiento de formación de imágenes en el que se administran anticuerpos marcados con sustancias radiactivas a un paciente animal o humano y se toma una fotografía de los sitios del cuerpo donde se localiza el anticuerpo (documento US 6528624). Los biomarcadores de formación de imágenes pueden medirse y evaluarse objetivamente como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica.

[0183] Los procedimientos de mareaje de péptidos son bien conocidos. Véanse Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem.

3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer y col (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work y E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., Nueva York; Lundblad, R. L. y Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vol. I y II, CRC Press, Nueva York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlín y Nueva York; y Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez y col (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis y col. (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li y col. (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier y col. (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.

[0184] Los péptidos y proteínas marcados con dos restos, un indicador fluorescente y un apagador en una proximidad suficiente experimentan transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Los grupos indicadores son típicamente tintes fluorescentes que se excitan con la luz a una determinada longitud de onda y transfieren energía a un grupo aceptor o apagador, con el desplazamiento de Stokes apropiado para la emisión con el brillo máximo. Los tintes fluorescentes incluyen moléculas con aromaticidad extendida, tales como fluoresceína y rodamina, y sus derivados. El indicador fluorescente puede apagarse parcial o significativamente por el resto apagador en un péptido intacto. Tras la escisión del péptido por una peptidasa o proteasa, se puede medir un aumento detectable de la fluorescencia (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34).

[0185] Los anticuerpos marcados de la invención también pueden usarse como un agente de purificación por afinidad. En este proceso, el anticuerpo marcado se inmoviliza sobre una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el antígeno a purificar y, posteriormente, el soporte se lava con un disolvente adecuado que retirará sustancialmente todo el material de la muestra excepto el antígeno a purificar, que se une a la variante de polipéptido inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará el antígeno de la variante polipeptídica.

[0186] En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos anti-PD-Ll que pueden encontrar uso en esta invención como agentes terapéuticos. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados y humanos.

Anticuerpos policlonales

[0187] Los anticuerpos policlonales se generan preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede resultar útil conjugar el antígeno relevante (especialmente cuando se usan péptidos sintéticos) con una proteína que es inmunogénica en la especie que se inmuniza. Por ejemplo, el antígeno puede conjugarse con hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, p. ej., éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación mediante residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (mediante residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2 o R'N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

[0188] Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, p. ej., 100 pg o 5 pg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, se aplica un refuerzo de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund a los animales mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Entre 7 y 14 días después, se extrajeron muestras de sangre de los animales y se ensayan en el suero los títulos de anticuerpo. Se aplica refuerzo a los animales hasta que el título se estabiliza. También es posible producir los conjugados en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, se usan adecuadamente agentes de agregación tales como alumbre para potenciar la respuesta inmunitaria.

Anticuerpos monoclonales

[0189] Puede prepararse un anticuerpo monoclonal (AcM) contra un antígeno de interés usando cualquier técnica conocida en la materia. Estas incluyen, pero sin limitación, la técnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 495-497), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor y col., 1983, Immunology Today 4:72) y la técnica del hibridoma del VEB (Cole y col., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). The Selected Lymphocyte Antibody Method (SLAM) (Babcook, J.S., y col., A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93 (15): pág. 7843-8.) y (McLean GR, Olsen OA, Watt IN, Rathanaswami P, Leslie KB, Babcook JS, Schrader JW. Recognition of human cytomegalovirus by human primary immunoglobulins identifies an innate foundation to an adaptive immune response. J Immunol. 15 abr 2005;174(8):4768-78. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluidas IgG, IgM, IgE, IgA e IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los AcM de uso en esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo.

[0190] Los anticuerpos monoclonales se pueden elaborar mediante el procedimiento del hibridoma, descrito por primera vez por Kohler y col., Nature 256:495 (1975), o se pueden elaborar mediante procedimientos de ADN recombinante (patente de EE. UU. n.° 4.816.567).

[0191] En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado tal como se describió anteriormente, para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán de forma específica a la proteína usada para inmunización. Como alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aíslan y luego se fusionan con una línea celular de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press , 1986)).

[0192] Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado, cuyo medio contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas (también denominadas compañeras de fusión). Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo selectivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

[0193] Las células de mieloma compañeras de fusión preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio selectivo que selecciona frente a las células parentales no fusionadas. Las líneas de células de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA. USA, y SP-2 y derivados, p. ej., células X63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Manassas, Va., EE. UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

[0194] En el medio de cultivo en el que se hacen crecer las células de hibridoma se ensaya la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).

[0195] La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard descrito en Munson y col., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[0196] Una vez que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer por procedimientos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal, p. ej., mediante inyección ip de las células en ratones.

[0197] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, el líquido ascítico o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de anticuerpos tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (p. ej., usando proteína A o proteína G-Sepharose) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc.

[0198] El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia mediante procedimientos convencionales (p. ej., con sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que luego se transfectan en células hospedadoras, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) o células de mieloma que no producen de otra forma proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y col., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pliickthun, Immunol. Revs. 130, 151-188 (1992) .

[0199] Además, se pueden aislar anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos a partir de colecciones de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando colecciones de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) por transposición de cadena (Marks y col., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategias para la construcción de colecciones de fagos muy grandes (Waterhouse y col., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

[0200] El ADN que codifica el anticuerpo puede modificarse para producir polipéptidos de anticuerpos quiméricos o de fusión, por ejemplo, sustituyendo el dominio constante de cadena pesada y cadena ligera humana (secuencias CH y CO para las secuencias murinas homólogas (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o fusionando la secuencia codificante de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico (polipéptido heterólogo). Las secuencias de polipéptidos no inmunoglobulínicos pueden sustituir a los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

Anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos

[0201] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-PD-Ll es un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos, p. ej., en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567 y en Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (p. ej., una región variable que deriva de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo con "cambio de clase" donde la clase o subclase cambió respecto a la del anticuerpo parental. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

[0202] En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, mientras que mantiene la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano parental. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables donde las HVR (o porciones de las mismas) derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) derivan de secuencias de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen por residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (p. ej., el anticuerpo del cual derivan los residuos de HVR), p. ej., para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de anticuerpo.

[0203] Un anticuerpo anti-PD-Ll de acuerdo con las realizaciones de la invención puede ser un anticuerpo humanizado o humano. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos o de conejo) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras secuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una HVR del receptor son remplazados por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como de ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de estructura Fv de inmunoglobulina humana se remplazan por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados pueden comprender también residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la HVR o secuencias de estructura importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá básicamente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o básicamente todas las FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (p. ej., una región Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).

[0204] Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la materia. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos "importados", que se toman típicamente de un dominio variable "de importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de HVR o HVR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE. UU. n.° 4.816.567) donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en que algunos residuos de HVR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

[0205] La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se usarán en la elaboración de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta de HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando el anticuerpo está destinado para uso terapéutico humano. La reducción o eliminación de una respuesta de HAMA es un aspecto significativo del desarrollo clínico de agentes terapéuticos adecuados. Véanse, por ejemplo, Khaxzaeli y col., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers y col., Transplantation (1986), 41:572; Shawler y col., J.

Immunol. (1985), 135:1530; Sears y col., J. Biol. Respuesta Mod. (1984), 3:138; Miller y col., Blood (1983), 62:988; Hakimi y col., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann y col., Nature (1988), 332:323; Junghans y col., Cancer Res. (1990), 50:1495. Como se describe en esta invención, la invención proporciona anticuerpos que se humanizan de tal manera que la respuesta de HAMA se reduce o se elimina. Pueden obtenerse además variantes de estos anticuerpos usando procedimientos rutinarios conocidos en la materia, algunos de los cuales se describen adicionalmente más adelante. Según el procedimiento llamado "de mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a la colección completa de secuencias humanas de dominio variable conocidas. Se identifica la secuencia del dominio V humano que es más cercana a la del roedor y se acepta la región de estructura humana (FR) dentro de ella para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia y col., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro procedimiento usa una región de estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región estructural puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol.

151:2623 (1993)).

[0206] Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo como se describe en esta invención puede servir como una secuencia inicial (parental) para la diversificación de la secuencia o secuencias de estructura y/o hipervariables. Una secuencia de estructura seleccionada a la que se liga una secuencia hipervariable de partida se denomina en esta invención región de estructura humana aceptora. Aunque que las regiones de estructura humanas aceptoras pueden ser de, o derivar de, una inmunoglobulina humana (las regiones VL y/o VH de la misma), preferentemente las regiones de estructura de referencia humanas aceptoras son de, o se derivan de, una secuencia de estructura de consenso humana, ya que se ha demostrado que tales regiones de estructura tienen inmunogenicidad mínima o nula en pacientes humanos.

[0207] Cuando el aceptor deriva de una inmunoglobulina humana, se puede seleccionar opcionalmente una secuencia de estructura humana que se selecciona basándose en su homología con la secuencia de estructura donante alineando la secuencia de estructura donante con varias secuencias de estructura humanas en una colección de secuencias de estructura humanas, y seleccionar la secuencia de estructura más homóloga como aceptor.

[0208] Si bien el aceptor puede ser idéntico en secuencia a la secuencia de estructura humana seleccionada, ya sea de una inmunoglobulina humana o una región de estructura de consenso humano, la presente invención contempla que la secuencia aceptora pueda comprender sustituciones de aminoácidos preexistentes en relación con la secuencia de inmunoglobulina humana o secuencia de estructura de consenso humana. Estas sustituciones preexistentes son preferentemente mínimas; usualmente diferencias de cuatro, tres, dos o un aminoácido sólo en relación con la secuencia de inmunoglobulina humana o la secuencia de estructura de consenso.

[0209] En algunas realizaciones, los residuos de la región hipervariable de un anticuerpo no humano se incorporan en las regiones de estructura humanas aceptoras VL y/o VH. Por ejemplo, se pueden incorporar residuos correspondientes a los residuos de CDR de Kabat, los residuos de bucle hipervariable de Chothia, los residuos de Abm, y/o residuos de contacto. Opcionalmente, se incorporan los siguientes residuos de la región hipervariable extendida: 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3), 26-35B (HI), 50-65, 47-65 o 49- 65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3).

[0210] Si bien la "incorporación" de residuos de la región hipervariable se discute en esta invención, se apreciará que esto se puede lograr de diversas maneras, por ejemplo, se puede generar un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos deseada mutando un ácido nucleico que codifica la secuencia del dominio variable de ratón, de modo que los residuos de estructura de la misma se cambien a residuos de estructura humana aceptores, o mutando un ácido nucleico que codifica la secuencia del dominio variable humano, de modo que los residuos del dominio hipervariable se cambien a residuos no humanos, o sintetizando un ácido nucleico que codifique la secuencia deseada, etc.

[0211] Como se describe en esta invención, las variantes injertadas en regiones hipervariables pueden generarse mediante mutagénesis de Kunkel del ácido nucleico que codifica las secuencias aceptoras humanas, usando un oligonucleótido separado para cada región hipervariable. Kunkel y col., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Se pueden introducir cambios apropiados en las regiones de estructura y/o hipervariables usando técnicas rutinarias, para corregir y restablecer las interacciones región hipervariable-antígeno apropiadas.

[0212] La presentación en fagos (fagémidos) (también denominada en esta invención presentación en fagos en algunos contextos) puede usarse como un procedimiento conveniente y rápido para generar y cribar muchos anticuerpos variantes potenciales diferentes en una colección generada por aleatorización de secuencias. Sin embargo, el experto en la materia dispone de otros procedimientos para elaborar y cribar anticuerpos alterados.

[0213] La tecnología de presentación en fagos (fagémidos) ha proporcionado una herramienta poderosa para generar y seleccionar proteínas novedosas que se unen a un ligando, tal como un antígeno. El uso de las técnicas de presentación en fagos (fagémidos) permite la generación de grandes colecciones de variantes de proteínas que pueden clasificarse rápidamente para aquellas secuencias que se unen a una molécula diana con alta afinidad. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos variantes se fusionan generalmente con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la cubierta vírica, tal como la proteína del gen III o la proteína del gen VIII. Se han desarrollado sistemas de presentación de fagémidos monovalentes donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína o polipéptido se fusiona con una secuencia de ácido nucleico que codifica una porción de la proteína del gen III. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman y Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). En un sistema de presentación de fagémidos monovalentes, la fusión génica se expresa a niveles bajos y las proteínas del gen III de tipo silvestre también se expresan de modo que se retiene la infectividad de las partículas. En muchas patentes se han divulgado procedimientos para generar colecciones de péptidos y cribar esas colecciones (p. ej. patente de EE. UU. n.° 5.723.286, patente de EE. UU. n.° 5.432.018, patente de EE. UU. n.° 5.580.717, patente de EE. UU. n.° 5.427.908 y patente de EE. UU. n.° 5.498.530).

[0214] Se han preparado colecciones de anticuerpos o polipéptidos que se unen a antígenos de una serie de formas que incluyen la alteración de un único gen mediante la inserción de secuencias de ADN aleatorias o la clonación de una familia de genes relacionados. Se han descrito procedimientos para la presentación de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno usando presentación de fago (fagémido) en las patentes de EE. UU. n.° 5.750.373, 5.733.743, 5.837.242, 5.969.108, 6.172.197, 5.580.717y 5.658.727. Se criba luego en la colección la expresión de anticuerpos o proteínas de unión a antígenos con las características deseadas.

[0215] Los procedimientos para sustituir un aminoácido de elección en un ácido nucleico molde están bien establecidos en la materia, algunos de los cuales se describen en esta invención. Por ejemplo, los residuos de la región hipervariable pueden sustituirse utilizando el procedimiento de Kunkel. Véase, p. ej., Kunkel y col., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).

[0216] La secuencia de oligonucleótidos incluye uno o más de los conjuntos de codones diseñados para que se alteren los residuos de la región hipervariable. Un conjunto de codones es un conjunto de diferentes secuencias de tripletes de nucleótidos usadas para codificar los aminoácidos variantes deseados. Los conjuntos de codones se pueden representar usando símbolos para designar nucleótidos particulares o mezclas equimolares de nucleótidos como se muestra a continuación según el código de la IUB.

Códigos de la IUB: G guanina; A adenina; T timina; C citosina; R (A o G); Y (C o T); M (A o C); K (G o T); S (C o G); W (A o T); H (A o C o T); B (C o G o T); V (A o C o G); D (A o G o T) H (A o C o T); N (A o C o G o T).

[0217] Por ejemplo, en el conjunto de codones DVK, D pueden ser los nucleótidos A o G o T; V puede ser A o G o C; y K puede ser G o T. Este conjunto de codones puede presentar 18 codones diferentes y puede codificar los aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly y Cys.

[0218] Los conjuntos de oligonucleótidos o cebadores se pueden sintetizar usando procedimientos estándares. Se puede sintetizar un conjunto de oligonucleótidos, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida, que contiene secuencias que representan todas las combinaciones posibles de tripletes de nucleótidos proporcionados por el conjunto de codones y que codificarán el grupo de aminoácidos deseado. La síntesis de oligonucleótidos con "degeneración" de nucleótidos seleccionados en ciertas posiciones es bien conocida en esa materia. Tales conjuntos de nucleótidos que tienen ciertos conjuntos de codones se pueden sintetizar usando sintetizadores comerciales de ácidos nucleicos (disponibles, por ejemplo, en Applied Biosystems, Foster City, CA), o se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, en Life Technologies, Rockville, Md. ). Por lo tanto, un conjunto de oligonucleótidos sintetizados que tienen un conjunto de codones particular típicamente incluirá una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, con las diferencias establecidas por el conjunto de codones dentro de la secuencia global. Los oligonucleótidos tienen secuencias que permiten la hibridación con un molde de ácido nucleico de dominio variable y también pueden incluir sitios de enzimas de restricción con propósitos de clonación.

[0219] En un procedimiento, se pueden crear secuencias de ácido nucleico que codifican variantes de aminoácidos mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos. Esta técnica es bien conocida en la materia como la describen Zoller y col. Acids Res. 10:6487-6504 (1987). Brevemente, las secuencias de ácido nucleico que codifican aminoácidos variantes se crean hibridando un conjunto de oligonucleótidos que codifica los conjuntos de codones deseados con un molde de ADN, donde el molde es la forma monocatenaria del plásmido que contiene una secuencia de molde de ácido nucleico de región variable. Después de la hibridación, se usa la ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaria completa del molde que incorporará así el cebador oligonucleotídico y contendrá los conjuntos de codones proporcionados por el conjunto de oligonucleótidos.

[0220] Generalmente, se usan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios del molde a cualquier lado del nucleótido o nucleótidos que codifican la mutación o mutaciones. Esto asegura que el oligonucleótido hibridará apropiadamente con la molécula de molde de ADN monocatenario. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente usando técnicas conocidas en la materia tales como la descrita por Crea y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).

[0221] El molde de ADN se genera mediante aquellos vectores que derivan de los vectores del bacteriófago M13 (los vectores M13 mp 18 y M13 mp 19 disponibles comercialmente son adecuados), o bien de aquellos vectores que contienen un origen de replicación de fago monocatenario como se describe por Viera y col., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Por tanto, el ADN que se va a mutar se puede insertar en uno de estos vectores para generar un molde monocatenario. La producción del molde monocatenario se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook y col., anteriormente.

[0222] Para alterar la secuencia de ADN nativo, el oligonucleótido hibrida con el molde monocatenario en condiciones de hibridación adecuadas. Se añade luego una enzima polimerizadora de ADN, usualmente la ADN polimerasa de T7 o el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, para sintetizar la hebra complementaria del molde usando el oligonucleótido como cebador para la síntesis. Por tanto, se forma una molécula heterodúplex de tal manera que una hebra de ADN codifica la forma mutada del gen 1 y la otra hebra (el molde original) codifica la secuencia nativa inalterada del gen 1. Esta molécula heterodúplex se transforma luego en una célula hospedadora adecuada, usualmente un procariota tal como E. coli JM101. Después de hacer crecer las células, se siembran en placas de agarosa y se criban usando el cebador oligonucleotídico radiomarcado con un 32-fosfato para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado.

[0223] El procedimiento descrito inmediatamente antes puede modificarse de tal modo que se cree una molécula homodúplex en la que ambas cadenas del plásmido contienen la mutación o mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: el oligonucleótido monocatenario se reasocia con el molde monocatenario como se describió anteriormente. Una mezcla de tres desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxirribotimidina (dTT), se combina con una tiodesoxirribocitosina modificada llamada dCTP- (aS) (que se puede obtener de Amersham). Esta mezcla se añade al complejo molde-oligonucleótido. Tras la adición de ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una hebra de ADN idéntica al molde excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva hebra de ADN contendrá dCTP- (aS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerlo de la digestión con endonucleasas de restricción. Después de cortar la hebra molde del heterodúplex bicatenario con una enzima de restricción apropiada, la hebra molde puede digerirse con nucleasa ExoIII u otra nucleasa apropiada más allá de la región que contiene el sitio o sitios que se van a mutagenizar. Luego, la reacción se detiene para dejar una molécula que es solo parcialmente monocatenaria. Se forma luego un homodúplex de ADN bicatenario completo usando ADN polimerasa en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótido, ATP y ADN ligasa. Esta molécula homodúplex puede luego transformarse en una célula hospedadora adecuada.

[0224] Como se indicó anteriormente, la secuencia del conjunto de oligonucleótidos tiene una longitud suficiente para hibridar con el ácido nucleico molde y también puede contener, aunque no necesariamente, sitios de restricción. El molde de ADN puede ser generado por aquellos vectores que derivan de vectores del bacteriófago M13 o bien vectores que contienen un origen de replicación de fago monocatenario como describen Viera y col. Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Por tanto, el ADN que se va a mutar se debe insertar en uno de estos vectores para generar un molde monocatenario. La producción del molde monocatenario se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook y col., anteriormente.

[0225] Según otro procedimiento, la unión de antígenos puede restaurarse durante la humanización de anticuerpos mediante la selección de regiones hipervariables reparadas (véase la solicitud de n.° de ser. 11/061.841 depositada el 18 de octubre de 2005. El procedimiento incluye incorporar regiones hipervariables no humanas en una región de estructura aceptora e introducir además una o más sustituciones de aminoácidos en una o más regiones hipervariables sin modificar la secuencia de estructura aceptora. Como alternativa, la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos puede ir acompañada de modificaciones en la secuencia de estructura aceptora.

[0226] Según otro procedimiento, se puede generar una colección proporcionando conjuntos de oligonucleótidos en dirección 5' y 3', teniendo cada conjunto una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, estando las diferentes secuencias establecidas por los conjuntos de codones proporcionados dentro de la secuencia de los oligonucleótidos. Los conjuntos de oligonucleótidos en dirección 5' y 3', junto con una secuencia de ácido nucleico molde de dominio variable, pueden usarse en una reacción en cadena de la polimerasa para generar una "colección" de productos de PCR. Los productos de PCR pueden denominarse "casetes de ácido nucleico", ya que pueden fusionarse con otras secuencias de ácido nucleico relacionadas o no relacionadas, por ejemplo, proteínas de la cubierta vírica y dominios de dimerización, usando técnicas de biología molecular establecidas.

[0227] La secuencia de los cebadores de PCR incluye uno o más de los conjuntos de codones diseñados para las posiciones accesibles al disolvente y muy diversas en una región hipervariable. Como se describió anteriormen te, un conjunto de codones es un conjunto de diferentes secuencias de tripletes de nucleótidos usadas para codificar los aminoácidos variantes deseados.

[0228] Los selectores de anticuerpos que cumplan con los criterios deseados, seleccionados a través de etapas de cribado/selección apropiadas, pueden aislarse y clonarse usando técnicas recombinantes estándares.

[0229] Es además importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad de unión por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la materia. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y presentan las probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta forma, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias del receptor e importadas, de forma tal que se logre la característica del anticuerpo deseada, tal como una mejor afinidad por el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente implicados en influenciar la unión a antígeno.

[0230] Se contemplan diversas formas de un anticuerpo anti-PD-LI humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab. Como alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG, IgM o IgA intacto. En algunas realizaciones, un anticuerpo intacto puede ser un anticuerpo IgM intacto.

[0231] Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (p. ej., ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de la línea germinal da como resultado una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana a tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Véanse, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann y col., Year in Immuno. 7:33 (1993); patentes de Ee .UU. n.° 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; y WO 97/17852.

[0232] Como alternativa, la tecnología de presentación en fagos (McCafferty y col., Nature 348:552-553 (1990)) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, se clonan genes del dominio V de anticuerpo en marco en un gen de proteína de recubrimiento mayor o bien menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación en fagos puede realizarse en una variedad de formatos revisados, p. ej., en Johnson, Kevin Sy Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos del gen V para la presentación en fagos. Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una matriz diversa de anticuerpos antioxazolona de una pequeña colección combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos contra una matriz diversa de antígenos (incluidos los autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith y col., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse también las patentes de EE .UU. n° 5.565.332 y 5.573.905.

[0233] Como se discutió anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B activadas in vitro (véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.567.610 y 5.229.275).

[0234] En algunas realizaciones, los anticuerpos de esta divulgación son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra PD-L1 se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones a los que se refiere esta invención como HuMAb Mouse™ y KM Mouse™, respectivamente, y se denominan colectivamente en esta invención "ratones de Ig humana".

[0235] El HuMab Mouse™ (Medarex, Inc.) contiene miniloci de gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias no reorganizadas de inmunoglobulina humana de cadena pesada (p y y) y ligera k, junto con mutaciones orientadas que inactivan los loci endógenos de cadena p y k (véase, p. ej., Lonberg y col., 1994, Nature 368 (6474):856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben una expresión reducida de IgM o k de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes humanos de cadena pesada y ligera introducidos experimentan un cambio de clase y una mutación somática para generar anticuerpos monoclonales de IgGK humana de alta afinidad (Lonberg, N y col. (1994), anteriormente; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y el uso del HuMAb Mouse™, y las modificaciones genómicas que portan tales ratones, se describen con más detalle en Taylor, L. y col. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. y col. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y col al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi y col. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. y col. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon y col., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. y col. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. y col. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse además, las patentes de EE. UU. n.° 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay; patentes de EE. UU. n.° 5.545.807 de Surani y col.; publicaciones PCT n.° w O 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y publicación PCT n.° WO 01/14424 de Korman y col.

[0236] Los anticuerpos humanos de acuerdo con esta divulgación se pueden crear usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Este ratón se denomina en esta invención "KM Mouse™" y se describe en detalle en la publicación PCT WO 02/43478 de Ishida y col.

[0237] Más aún, en la materia están disponibles sistemas animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y se pueden usar para crear anticuerpos anti-PD-Ll de esta divulgación. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.); tales ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati y col.

[0238] Además, en la materia están disponibles sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y se pueden usar para crear anticuerpos anti-PD-Ll de esta divulgación. Por ejemplo, pueden usarse ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; tales ratones se describen en Tomizuka y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Además, en la materia se han descrito vacas que portan transcromosomas de cadena ligera y pesada humana (p. ej., Kuroiwa y col. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 y solicitud PCT n° WO 2002/092812) y pueden usarse para crear anticuerpos anti-PD-Ll de esta divulgación.

Fragmentos de anticuerpos

[0239] En ciertas circunstancias, existen ventajas en usar fragmentos de anticuerpos en lugar de anticuerpos completos. El menor tamaño de los fragmentos permite un aclaramiento rápido y puede conducir a un mejor acceso a tumores sólidos.

[0240] Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos derivaban mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, p. ej., Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y col., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, ahora pueden producirse estos fragmentos directamente mediante células hospedadoras recombinantes. Todos los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar y secretar en E. coli, permitiendo por tanto la producción de grandes cantidades deestos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las colecciones de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. Como alternativa, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otro enfoque, es posible aislar los fragmentos F(ab')2 directamente del cultivo de células hospedadoras recombinantes. El fragmento Fab y F(ab')2 con mayor semivida in vivo que comprende residuos de un epítopo de unión al receptor de rescate se describen en la patente de e E. UU. n.° 5.869.046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el facultativo experto. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv o sFv). Véanse los documentos WO 93/16185; patente de EE. UU. n.° 5.571.894 y patente de EE. UU. n.° 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos carentes de regiones constantes, por tanto son adecuadas para la unión no específica reducida durante el uso in vivo. Pueden construirse proteínas de fusión de sFv para procurar la fusión de una proteína efectora, en el extremo amino o bien carboxi de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, anteriormente. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", p. ej., como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.641.870 por ejemplo.

Anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos

[0241] Como se revisó anteriormente, los anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo pueden unirse a dos epítopos diferentes de una proteína PD-L1 como se describe en esta invención.. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de unión a PD-L1 con un sitio de unión para otra proteína (p. ej., una proteína de superficie celular, p. ej. un antígeno tumoral). Como alternativa, una unidad de unión a anti-PD-Ll se puede combinar con una unidad de unión que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (p. ej., CD3) o receptores de Fc para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16), para enfocar y localizar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa PD-L1. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico puede comprender una unidad de unión que se une a PD-L1 y una segunda unidad de unión que se une a otra diana de unión, p. ej., una proteína de superficie celular, tal como un antígeno tumoral. Los ejemplos no limitantes de proteínas de superficie celular que pueden servir como dianas de unión incluyen: CD20, EGFR, HER2, CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA y TIGIT. Los números de acceso a Genbank correspondientes a CTLA-4, TIM3, LAG3, VISTA y TIGIT se pueden encontrar en la Tabla 2. La secuencia de aminoácidos de CD20 humana se proporciona en UniProtKB número P11836. La secuencia de aminoácidos del EGFR humano se proporciona en UniProtKB número P00533. La secuencia de aminoácidos de HER2 humano (ERBB2 humano) se proporciona en UniProtKB número P04626.

[0242] Los anticuerpos biespecíficos también pueden usarse para localizar agentes citotóxicos en células que expresan PD-L1. Estos anticuerpos poseen una unidad de unión a PD-L1 y una unidad de unión que se une al agente citotóxico (p. ej., saporina, anti-interferón-a, alcaloide de la vinca, cadena A de ricina, metotrexato o isótopo radioactivo de hapteno). Pueden prepararse los anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (p. ej., anticuerpos biespecíficos de F(ab')2).

[0243] Los procedimientos para elaborar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y col., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza mediante etapas de cromatografía por afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos de producto son bajos Se divulgan procedimientos similares en los documentos WO 93/08829 y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Genomanipulación de la función efectora

[0244] Puede ser deseable modificar un anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, p. ej., para mejorar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede lograr introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región constante de cadena pesada (es decir, una región Fc) del anticuerpo. Como alternativa o adicionalmente, se puede introducir un residuo o residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o un aumento de la muerte celular mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Véanse Caron y col., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, BJ Immunol. 148:2918-2922 (1992). También se pueden preparar anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff y col., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Como alternativa, se puede genomanipular un anticuerpo para que tenga un mayor número de regiones Fc (p. ej., una molécula de IgG genomanipulada para tener dos o más regiones Fc) y, de ese modo, pueda tener capacidades mejoradas de lisis del complemento y ADCC. Véase Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design. 3:219-230 (1989). Para aumentar la vida media en suero de un anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente de EE. UU. 5.739.277, por ejemplo. Como se usa en esta invención, el término "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo de un molécula que comprende el epítopo (p. ej., un anticuerpo IgG).

Variantes de anticuerpo

[0245] Además de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos en esta invención, se contempla que se pueden preparar variantes de anticuerpos anti-PD-L1. Se pueden preparar variantes de anticuerpos anti-PD-Ll mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN codificante, y/o mediante síntesis del anticuerpo o polipéptido deseado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo anti-PD-Ll, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje a la membrana.

[0246] Las variaciones en los anticuerpos anti-PD-LI descritos en esta invención pueden realizarse, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservadoras y no conservadoras expuestas, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo o polipéptido que da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo o polipéptido de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es mediante la sustitución de al menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo anti-PD-L1. Se puede encontrar una guía para determinar qué residuo de aminoácido puede insertarse, sustituirse o eliminarse sin afectar adversamente la actividad deseada comparando la secuencia del anticuerpo anti-PD-L1 con la de moléculas de proteína conocidas homólogas y minimizando el número de cambios de secuencias de aminoácidos realizados en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido por otro aminoácido que tiene una estructura y/o propiedades químicas similares, tal como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las inserciones o deleciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar haciendo sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probando en las variantes resultantes la actividad exhibida por la secuencia nativa de longitud completa o madura.

[0247] Se proporcionan en esta invención fragmentos de anticuerpo anti-PD-Ll. Tales fragmentos pueden estar truncados en el extremo N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína o un anticuerpo nativo de longitud completa. Ciertos fragmentos pueden carecer de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo anti-PD-Ll.

[0248] Los fragmentos de anticuerpo anti-PD-Ll se pueden preparar mediante cualquiera de una serie de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptidos deseados se pueden sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo implica generar fragmentos de anticuerpo o polipéptido por digestión enzimática, p. ej., tratando la proteína con una enzima conocida por escindir proteínas en sitios definidos por residuos de aminoácidos particulares, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislando el fragmento deseado. Aún otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un anticuerpo o fragmento de polipéptido deseado, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se emplean en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los fragmentos de anticuerpo anti-PD-Ll comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con los anticuerpos anti-PD-Ll de longitud completa divulgados en esta invención.

[0249] Las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 4 con el título de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la Tabla 4, o como se describe más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los productos.

Tabla 4

[0250] Las modificaciones sustanciales en la función o la identidad inmunológica de un anticuerpo anti-PD-L1 se consiguen seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el grueso de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos, basándose en las propiedades de la cadena lateral:

(1) hidrófobo: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácido: asp, glu;

(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromático: trp, tyr, phe.

[0251] Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservados o, más preferentemente, en los sitios restantes (no conservados).

[0252] Las variaciones se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la materia tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida a sitio), barrido de alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida a sitio (Carter y col., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagénesis en casete (Wells y col., Gene, 34:315 (1985)), mutagénesis por selección de restricción (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) u otras técnicas conocidas se pueden realizar en el ADN clonado para producir el ADN variante del anticuerpo anti-PD-L1.

[0253] El análisis de barrido de aminoácidos también se puede emplear para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos estánlos aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). La alanina también se prefiere típicamente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra con frecuencia tanto en posiciones enterradas como expuestas (Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., NY.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución de alanina no procura cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isotérico.

[0254] Cualquier residuo de cisteína que no esté implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo anti-PD-L1 también puede sustituirse, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. A la inversa, se pueden añadir un enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo anti-PD-Ll para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

[0255] Un tipo de variante de sustitución particularmente preferido implica la sustitución de uno o más residuos de regiones hipervariables de un anticuerpo parental (p. ej., un anticuerpo humano o humanizado). Generalmente, la variante o variantes resultantes seleccionadas para un desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo parental a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar tales variantes de sustitución implica la maduración por afinidad usando presentación en fagos. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (p. ej., 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se presentan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. En las variantes presentadas en fagos se criba luego su actividad biológica (p. ej., afinidad de unión) como se divulga en esta invención. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de barrido de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión de antígeno. Como alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar la estructura cristalina de un complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el polipéptido PD-L1. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas proporcionadas en esta invención. Una vez que se generan tales variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en esta invención y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para su desarrollo adicional.

[0256] Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-PD-Ll se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-PD-Ll.

Modificaciones de anticuerpos

[0257] Las modificaciones covalentes de anticuerpos anti-PD-Ll se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácidos diana de un anticuerpo anti-PD-LI con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N-terminales o C-terminales del anticuerpo anti-PD-LI. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular el anticuerpo anti-PD-Ll con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para usar en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-PD-Ll, y viceversa. Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, p. ej., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo.

[0258] Otras modificaciones incluyen la desamidación de los residuos de glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la mutilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983)), la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

[0259] Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-PD-Ll incluida dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del anticuerpo o polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" pretende significar con los propósitos de esta invención eliminar uno o más restos carbohidrato encontrados en el anticuerpo anti-PD-LI de secuencia nativa (mediante la retirada de la glicosilación subyacente o bien mediante la deleción de la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa del anticuerpo anti-PD-LI. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y en las proporciones de los diversos restos de carbohidratos presentes.

[0260] La glicosilación de anticuerpos y otros polipéptidos está típicamente ligada a N o bien ligada a O. Ligada a N se refiere al enlazamiento del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido menos prolina, son las secuencias de reconocimiento para el enlazamiento enzimático del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere al enlazamiento de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

[0261] La adición de sitios de glicosilación a un anticuerpo anti-PD-LI se consigue convenientemente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de forma tal que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligados a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición, o sustitución, de uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo anti-PD-LI original (para los sitios de glicosilación ligados a O). La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-PD-L1 puede alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el anticuerpo anti-P-LI en bases preseleccionadas de tal forma que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

[0262] Otro medio para aumentar el número de restos carbohidrato en un anticuerpo anti-PD-LI es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Tales procedimientos se describen en la materia, p. ej., en los documentos WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pág.

259-306 (1981).

[0263] La retirada de restos carbohidratos presentes en un anticuerpo anti-PD-LI se puede conseguir química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican residuos de aminoácidos que sirven como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin, y col., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge y col., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La escisión enzimática de los restos carbohidrato en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endoglicosidasas y exoglicosidasas según describen Thotakura y col., Meth. Enzymol. 138:350 (1987).

Inmunoconjugados

[0264] Los aspectos de la invención incluyen inmunoconjugados (denominados de manera intercambiable "conjugados de anticuerpo-fármaco" o "ADC") que comprenden un anticuerpo (como se describe en esta invención) conjugado con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (p. ej., ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Los ejemplos no limitantes de toxinas incluyen las descritas en el documento WO 2014144871 y en la patente de EE. UU. n.° 8.466.260.

Un inmunoconjugado o "ADC" de acuerdo con las realizaciones de la invención puede ser de Fórmula I, a continuación, donde un anticuerpo está conjugado (es decir, enlazado covalentemente) a uno o más restos de fármaco (D) a través de un ligador opcional (L). Los ADC pueden incluir conjugados de fármaco tioMAb ("TDC").

Ab-(L-D)p I

[0265] Por consiguiente, un anticuerpo puede conjugarse con un fármaco directamente o bien mediante un ligador. En la Fórmula I, p es el número medio de restos de fármaco por anticuerpo, que puede variar, p. ej., de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos de fármaco por anticuerpo y, en ciertas realizaciones, de 1 a aproximadamente 8 restos de fármaco por anticuerpo. Los aspectos de la divulgación incluyen una composición que comprende una mezcla de compuestos de fármaco-anticuerpo de Fórmula I, donde la carga media de fármaco por anticuerpo es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 4.

[0266] Un ligador puede comprender uno o más componentes ligadores. Los ejemplos de componentes ligadores incluyen los descritos en la patente de EE. UU. n.° 8.466.260. Los componentes ligadores, incluyendo extensor, espaciador y unidades de aminoácidos, pueden sintetizarse mediante procedimientos conocidos en la materia, tales como los descritos en el documento U.S. 2005/0238649 A1. Otros ejemplos no limitantes de ligadores incluyen los descritos en el documento WO 2015095953.

[0267] Se divulgan inmunoconjugados que contienen maitansinoides, procedimientos para elaborarlos y su uso terapéutico, por ejemplo, en Erickson, y col (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433; las patentes de EE. UU. n.° 5.208.020, 5.416.064, US 2005/0276812 A1y la patente europea EP 0425235 B1.

[0268] En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una dolastatina o un análogo o derivado peptídico de dolastatina, p. ej., una auristatina (patentes de Ee . UU. n.° 5.635.483 y 5.780.588).

[0269] En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. Para la preparación de conjugados de la familia de la calicheamicina véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company).

[0270] Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con un anticuerpo incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las patentes de EE. UU. n.° 5.053.394, 5.770.710, así como esperamicinas, descritas en la patente de EE. UU. n.° 5.877.296.

Formulaciones farmacéuticas

[0271] Las composiciones anti-PD-Ll habilitadas por la invención (p. ej., anticuerpos anti-PD-Ll, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos anti-PD-Ll, o ADC, como se describen en esta invención) pueden administrarse por cualquier vía que sea apropiada para la condición a ser tratada. Típicamente, la administración se consigue por vía parenteral, es decir, mediante infusión, administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y/o epidural.

[0272] En una realización, se administra una composición mediante infusión intravenosa. La dosificación administrada mediante infusión está en el intervalo de aproximadamente 1 pg/m2 a aproximadamente 10.000 pg/m2 por dosis, generalmente una dosis por semana para un total de una, dos, tres o cuatro dosis. En algunas realizaciones, la dosificación varía de aproximadamente 1 pg/m2 a aproximadamente 1.000 pg/m2, de aproximadamente 1 pg/m2 a aproximadamente 800 pg/m2, de aproximadamente 1 pg/m2 a aproximadamente 600 pg/m2, de aproximadamente 1 pg/m2 a aproximadamente 400 pg/m2, de aproximadamente 1 pg/m2 a aproximadamente 200 pg/m2, o de aproximadamente 1 pg/m2 a aproximadamente 100 pg/m2. En algunas realizaciones, la dosificación varía de aproximadamente 10 pg/m2 a aproximadamente 500 pg/m2, de aproximadamente 10 pg/m2 a aproximadamente 300 pg/m2, o de aproximadamente 10 pg/m2 a aproximadamente 200 pg/m2.

[0273] En algunas realizaciones, la dosis se administra una vez al día, una vez a la semana, varias veces a la semana, pero con menos frecuencia que una vez al día, varias veces al mes pero con menos frecuencia que una vez al día, varias veces al mes pero con menos frecuencia que una vez a la semana, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses, una vez al año o de forma intermitente para mitigar o aliviar los síntomas de la enfermedad. La administración puede continuar en cualquiera de los intervalos divulgados hasta la remisión del tumor o los síntomas del cáncer que se está tratando. La administración puede continuar después de que se logre la remisión o mitigación de los síntomas cuando dicha remisión o mitigación se prolongue por tal administración continua.

[0274] En un aspecto, la invención permite formulaciones farmacéuticas que comprenden al menos una composición anti-PD-Ll. En algunas realizaciones, una formulación farmacéutica comprende (1) una composición anti-PD-Ll y (2) un portador farmacéuticamente aceptable.

[0275] Las formulaciones terapéuticas que comprenden un anticuerpo anti-PD-LI usadas de acuerdo con la presente invención se preparan para ser almacenadas mezclando un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico bencílico; alquilparabenos, tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, maltosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; modificadores de la tonicidad tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; tensioactivos tales como polisorbato; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ej., complejos de Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones farmacéuticas para usar para la administración in vivo son generalmente estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0276] Los ingredientes activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas coloidales de suministro del fármaco (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).

[0277] Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen una composición anti-PD-LI, cuyas matrices están en forma de artículos moldeados, p. ej., películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE. UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de Y etilo, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido glicólico-ácido láctico como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Si bien los polímeros tales como acetato de etilenvinilo y ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a humedad a 37 °C, lo que da como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

[0278] Se puede formular una composición anti-PD-Ll en cualquier forma adecuada para su suministro a una célula/tejido diana. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden formular como inmunoliposomas. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que es útil para el suministro de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, de manera similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la materia, tales como los descritos en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); patentes de EE.UU. n.° 4.485.045 y 4.544.545; y WO97/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Se divulgan liposomas con tiempo de circulación potenciado en la patente de EE. UU. n.° 5.013.556.

[0279] Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para procurar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico. Véase Gabizon y col., J. National Cancer Inst.

81(19): 1484 (1989).

[0280] Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Artículos manufacturados y kits

[0281] Los aspectos de la invención permiten que los artículos manufacturados contengan materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de una enfermedad o trastorno mediado por PD-L1, p. ej., un cáncer que expresa PD-L1. El artículo manufacturado comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado a este. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar el trastorno o enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tenga un tapón que pueda perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es una composición anti-PD-Ll. La etiqueta o el prospecto indican que la composición se usa para el tratamiento de la enfermedad o trastorno. La etiqueta o prospecto comprenderá además instrucciones para administrar la composición de anticuerpo al paciente. Adicionalmente, el artículo manufacturado puede comprender además un segundo recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI, por su sigla en inglés), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

[0282] También se proporcionan kits que son útiles para diversos propósitos, p. ej., para ensayos de destrucción de células que expresan PD-L1, o para purificación o inmunoprecipitación del polipéptido PD-L1 a partir de células. Para el aislamiento y purificación del polipéptido PD-L1, un kit puede contener un anticuerpo anti-PD-Ll acoplado a perlas (p. ej., perlas de sefarosa). Se pueden proporcionar kits que contienen los anticuerpos para la detección y cuantificación del polipéptido PD-L1 in vitro, p. ej., en un ELISA o una transferencia Western. Como con el artículo manufacturado, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado a este. El recipiente contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-PD-L1, o un fragmento del mismo de unión a antígeno, de la invención. Pueden incluirse recipientes adicionales que contengan, p. ej., diluyentes, tampones y/o anticuerpos de control. La etiqueta o prospecto puede proporcionar una descripción de la composición así como instrucciones para el uso previsto in vitro o de detección.

Procedimientos de uso

[0283] Los aspectos de la invención permiten el uso de una o más composiciones anti-PD-Ll (p. ej., anticuerpos anti-PD-Ll, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos anti-PD-Ll, o ADC), como se describe en esta invención, en el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de una enfermedad o afección que está mediada al menos en parte por PD-L1 (p. ej., por una interacción entre PD-1 y PD-L1), que incluye pero sin limitación el tratamiento de diversos cánceres y enfermedades inmunes. Los usos de ejemplo no limitativos se describen con más detalle a continuación.

A. Procedimientos terapéuticos

[0284] Una composición anti-PD-Ll permitida por la invención puede usarse, por ejemplo, en procedimientos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo. En un aspecto, la invención permite procedimientos para inhibir una interacción entre una proteína PD-L1 y uno o más receptores o ligandos (p. ej., una proteína PD-1). En un aspecto, la invención permite procedimientos para inhibir el crecimiento o la proliferación celular, in vivo o bien in vitro, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una célula con una composición anti-PD-L1 en condiciones permisivas para la unión de un anticuerpo anti-PD-Ll, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en la composición con PD-L1. "Inhibir el crecimiento o la proliferación celular" significa disminuir el crecimiento o la proliferación de una célula en al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o hasta 100 %, e incluye inducir la muerte celular. En ciertas realizaciones, la célula es una célula tumoral. Una composición anti-PD-Ll de acuerdo con las realizaciones permitidas por la invención puede: (i) inhibir la interacción entre una proteína PD-L1 y un receptor o ligando al que la proteína PD-L1 es capaz de unirse (p. ej., una proteína PD- 1); (ii) inhibir la metástasis tumoral in vivo; (iii) inhibir el crecimiento tumoral in vivo; (iv) disminuir el tamaño del tumor in vivo; (v) exhibir actividad citotóxica sobre una célula tumoral que expresa PD-L1 in vivo; o (vi) exhibir actividad citostática sobre una célula tumoral que expresa PD-L1 in vivo. En algunos aspectos, una composición anti-PD-Ll puede unirse a una proteína PD-L1 y de ese modo inhibir una o más funciones de una proteína PD-1 (p. ej., inhibir una o más funciones inmunosupresoras de una proteína PD-1). Por consiguiente, en algunos aspectos, los procedimientos terapéuticos de uso en cuestión implican poner en contacto una proteína PD-L1 con un anticuerpo anti-PD-Ll, o un fragmento de unión a antígeno, como se describe en esta invención, inhibiendo de ese modo una o más funciones (p. ej., una o más funciones inmunosupresoras) de una proteína PD-1.

[0285] Los aspectos de la invención permiten procedimientos para inhibir una interacción entre una proteína PD-1 y una proteína PD-L1 poniendo en contacto la proteína PD-L1 con un anticuerpo anti-PD-Ll como se describe en esta invención. En algunas realizaciones, el procedimiento se lleva a cabo in vivo administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-Ll a un sujeto que necesita terapia para inhibir una interacción entre una proteína PD-1 y una proteína PD-L1 en el sujeto.

[0286] En un aspecto, una composición anti-PD-Ll permitida por la invención se usa para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular, tal como el cáncer. Los ejemplo de tipos de cáncer incluyen, sin limitación, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, cáncer biliar, cáncer de mama (p. ej., cáncer de mama triple negativo, cáncer de mama negativo de receptor hormonal), cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer esofágico, gástrico, de cabeza y cuello, cáncer nasofaríngeo, linfoma de Hodgkin, cáncer de pulmón (p. ej., cáncer pulmonar no microcítico), cáncer medular de tiroides, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer pancreático, glioma, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, melanoma y glioblastoma.

[0287] En algunos aspectos, el cáncer es un cáncer epitelial. Los cánceres epiteliales que son adecuados para tratamiento con las composiciones anti-PD-LI en cuestión incluyen, sin limitación, cáncer de pulmón no microcítico, de vejiga urinaria, renal, de hígado, colorrectal, de ovario, gástrico, esofágico, pancreático, renal, de tiroides o de mama (p. ej., cáncer de mama negativo de receptor hormonal o cáncer de mama triple negativo).

[0288] En algunos aspectos, un cáncer es un cáncer hematológico. Los cánceres hematológicos que son adecuados para el tratamiento con las composiciones anti-PD-LI en cuestión incluyen, sin limitación, leucemia, linfoma, mieloma, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin.

[0289] En algunos aspectos, un cáncer es un melanoma o un glioblastoma.

[0290] En una realización preferida, el cáncer es un melanoma. En una realización preferida, el cáncer es cáncer renal. En una realización preferida, el cáncer es cáncer de vejiga urinaria. En una realización preferida, el cáncer es cáncer de pulmón. En una realización preferida, el cáncer es cáncer de pulmón no microcítico. En una realización preferida, el cáncer es cáncer de pulmón microcítico.

[0291] En un aspecto, la invención permite procedimientos para tratar un trastorno proliferativo celular que comprenden administrar a un individuo una cantidad eficaz de una composición anti-PD-Ll. En algunas realizaciones, se puede administrar una composición anti-PD-Ll a un mamífero no humano que expresa PD-L1 con la que el anticuerpo reacciona de forma cruzada (p. ej., un primate, cerdo, rata o ratón) con propósitos veterinarios o como modelo animal de enfermedad humana. Con respecto a lo último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de las composiciones anti-PD-LI permitidas por la invención (p. ej., probar las dosificaciones y cursos temporales de administración).

[0292] Una composición anti-PD-LI permitida por la invención (así com cualquier agente terapéutico o adyuvante adicional) puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, en caso de desearse para el tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, una composición anti-PD-Ll puede administrarse adecuadamente mediante infusión pulsada, particularmente con dosis decrecientes de la composición. La dosificación puede ser mediante cualquier vía adecuada, p. ej., mediante inyecciones tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

[0293] Las composiciones anti-PD-Ll permitidas de acuerdo con las realizaciones de la invención generalmente se formulan, dosifican y administran de una manera consistente con las buenas prácticas médicas. Los factores a ser considerados en este contexto incluyen el trastorno particular a ser tratado, el mamífero particular a ser tratado, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el procedimiento de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los facultativos médicos.

Procedimientos de cribado

[0294] Los aspectos de la invención permiten procedimientos para determinar la presencia de un polipéptido PD-L1 en una muestra sospechosa de contener el polipéptido PD-L1, donde el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une al polipéptido PD-L1 y determinar la unión del anticuerpo al polipéptido PD-L1 en la muestra, donde la presencia de tal unión es indicativa de la presencia del polipéptido PD-L1 en la muestra. Opcionalmente, la muestra puede contener células (p. ej., células cancerosas) sospechosas de expresar un polipéptido PD-L1. El anticuerpo empleado en el procedimiento puede opcionalmente estar marcado de forma detectable, enlazado a un soporte sólido o similar.

[0295] Otra realización de la presente invención permite un procedimiento para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, donde el procedimiento comprende (a) poner en contacto una muestra de prueba que comprende células obtenidas del mamífero con un anticuerpo que se une a un polipéptido PD-L1 y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido PD-L1 en la muestra de prueba, donde la formación de un complejo es indicativa de la presencia de un tumor que expresa PD-L1 en el mamífero. Opcionalmente, el anticuerpo se marca de forma detectable, se enlaza a un soporte sólido o similar, y/o la muestra de prueba se obtiene de un individuo sospechoso de tener un tumor canceroso. La detección de anticuerpos se puede lograr mediante diferentes técnicas como se describe en esta invención, por ejemplo, formación de imágenes por IHC y PET.

Ensayos de actividad

[0296] Las composiciones anti-PD-Ll permitidas de acuerdo con las realizaciones de la invención se pueden utilizar en diversos ensayos conocidos en la materia. En un aspecto, se puede usar una composición anti-PD-Ll en un ensayo de actividad biológica. Un ensayo de actividad biológica puede medir, p. ej., la capacidad de una composición anti-PD-Ll para inhibir el crecimiento o la proliferación celular (p. ej., Actividad de "destrucción celular"), o la capacidad para inducir la muerte celular, incluida la muerte celular programada (apoptosis) .

[0297] En algunas realizaciones, se puede usar una composición anti-PD-Ll en un ensayo in vitro para medir la inhibición del crecimiento o la proliferación celular. Los ensayos para inhibir el crecimiento o la proliferación celular son bien conocidos en la materia. Ciertos ensayos para la proliferación celular, ejemplificados por los ensayos de "destrucción celular" descritos en esta invención, miden la viabilidad celular. Uno de tales ensayos es el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-GloTM, que se encuentra comercialmente disponible en Promega (Madison, WI). Ese ensayo determina el número de células viables en un cultivo basándose en la cuantificación del ATP presente, lo cual es indicativo de las células con actividad metabólica. Véanse Crouch y col. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, patente de EE. UU. n.° 6602677. El ensayo puede llevarse a cabo en un formato de 96 o 384 pocillos, lo cual lo hace susceptible de un ensayo automático de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés). Véase Cree y col (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. El procedimiento de ensayo implica añadir un único reactivo (reactivo CellTiter-Glo®) directamente a las células cultivadas. Esto da como resultado la lisis celular y la generación de una señal luminiscente producida por una reacción de luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente, la cual es directamente proporcional al número de células viables presentes en el cultivo. Los datos pueden registrarse por medio de un luminómetro o dispositivo de formación de imágenes por cámara de CCD. La salida de luminiscencia está expresada como unidades relativas de luz (URL).

[0298] Otro ensayo para la proliferación celular es el ensayo "MTT", un ensayo colorimétrico que mide la oxidación del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio a formazano por la reductasa mitocondrial. Al igual que el ensayo CellTiter-GloTM, este ensayo indica el número de células metabólicamente activas presentes en un cultivo celular. Véase, p. ej., Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63y Zhang y col. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882.

[0299] En un aspecto, se puede utilizar una composición anti-PD-Ll en un ensayo para medir su capacidad para inducir la muerte celular in vitro. Los ensayos para la inducción de la muerte celular son bien conocidos en la materia. En algunas realizaciones, tales ensayos miden, p. ej., la pérdida de integridad de la membrana según lo indicado por la captación de yoduro de propidio (PI), azul tripán (véase Moore y col. (1995) Cytotechnology, 17:1-11) o 7AAD. En un ensayo de captación de PI ejemplar, las células se cultivan en medio Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) suplementado con f Bs inactivado por calor al 10 % (Hyclone) y L-glutamina 2 mM. Por tanto, el ensayo se realiza en ausencia de complemento y células efectoras inmunes. Las células se siembran a una densidad de 3 x 106 por placa en placas de 100 x 20 mm y se dejan adherir durante la noche. El medio se retira y se reemplaza por medio fresco solo o medio que contiene diversas concentraciones de la composición anti-PD-Ll. Las células se incuban durante un período de tiempo de 3 días. Después del tratamiento, las monocapas se lavan con PBS y se separan mediante tripsinización. Luego, las células se centrifugan a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 °C, el sedimento se resuspende en 3 ml de tampón de unión de Ca2+ frío (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl ² 2,5 mM) y se divide en alícuotas en 12 x 75 tubos de tapón colador de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la retirada de grupos de células. Luego, los tubos reciben PI (10 pg/ml). Las muestras se analizan usando un citómetro de flujo FACSCAN™ y el software FACSCONVERT™ CelIQuest (Becton Dickinson). Por tanto, se identifican las composiciones anti-PD-Ll que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular según se determina mediante la captación de PI.

[0300] En un aspecto, se puede probar en una composición anti-PD-Ll su capacidad para inducir apoptosis (muerte celular programada) in vitro. Un ensayo ejemplar para anticuerpos que inducen apoptosis es un ensayo de unión a anexina. En un ensayo de unión a anexina ejemplar, las células se cultivan y se siembran en placas como se discutió en el párrafo anterior. El medio se retira y se reemplaza por medio fresco solo o medio que contenga 0,001 a 10 pg/ml del anticuerpo. Después de un período de incubación de tres días, las monocapas se lavan con PBS y se separan mediante tripsinización. Luego, las células se centrifugan, se resuspenden en tampón de unión de Ca2+ y se dividen en alícuotas en tubos como se discutió en el párrafo anterior. Luego, los tubos reciben anexina marcada (p. ej., anexina V-FITC) (1 pg/ml). Las muestras se analizan usando un citómetro de flujo FACSCAN™ y el software FACSCONVERT™ CellQuest (BD Biosciences). Por tanto, se identifican los anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de unión a anexina en relación con el control. Otro ensayo ejemplar para anticuerpos que inducen apoptosis es un ensayo colorimétrico ELISA de ADN de histona para detectar la degradación internucleosómica del ADN genómico. Tal ensayo se puede realizar usando, p. ej., el kit ELISA de detección de muerte celular (Roche, Palo Alto, CA).

[0301] Las células para usar en cualquiera de los ensayos in vitro anteriores incluyen células o líneas celulares que expresan naturalmente PD-L1 o que han sido genomanipuladas para expresar PD-L1. Tales células incluyen células tumorales que expresan o sobreexpresan PD-L1 en relación con células normales del mismo origen tisular. Tales células también incluyen líneas celulares (incluidas líneas celulares tumorales) que expresan PD-L1 y líneas celulares que normalmente no expresan PD-L1 pero que han sido transfectadas con ácido nucleico que codifica PD-L1.

[0302] En un aspecto, se prueba en una composición anti-PD-Ll su capacidad para inhibir el crecimiento o la proliferación celular in vivo. En ciertas realizaciones, se prueba en una composición anti-PD-L1 su capacidad para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Los sistemas modelos in vivo, tales como los modelos de xenoinjertos, pueden usarse para tales pruebas. En un sistema de xenoinjerto ejemplar, las células tumorales humanas se introducen en un animal no humano adecuadamente inmunodeprimido, p. ej., un ratón SCID. Se administra al animal una composición anti-PD-Ll permitida por la invención. Se mide la capacidad de la composición anti-PD-L1 para inhibir o disminuir el crecimiento tumoral. En ciertas realizaciones del sistema de xenoinjerto anterior, las células tumorales humanas son células tumorales de un paciente humano. En ciertas realizaciones, las células tumorales humanas se introducen en un animal no humano adecuadamente inmunodeprimido mediante inyección subcutánea o mediante trasplante en un sitio adecuado, tal como una almohadilla de grasa mamaria.

Ensayos de unión y otros ensayos

[0303] Los aspectos de la invención permiten procedimientos para inhibir una interacción entre una proteína PD-1 y una proteína PD-L1 poniendo en contacto la proteína PD-L1 con un anticuerpo anti-PD-Ll como se describe en esta invención. En algunas realizaciones, el procedimiento se lleva a cabo in vitro.

[0304] En un aspecto, se prueba en un anticuerpo anti-PD-LI su actividad de unión a antígeno. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, en un anticuerpo anti-PD-LI se prueba su capacidad de unirse a PD-L1 expresado en la superficie de una célula, p. ej., una célula tumoral. Se puede usar un ensayo FACS para tal prueba.

[0305] En un aspecto, los ensayos de competición pueden usarse para identificar uno o más anticuerpos (p. ej., uno o más anticuerpos monoclonales) que compiten con un anticuerpo monoclonal descrito en esta invención por unirse a PD-L1. En ciertas realizaciones, tal anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (p. ej., un epítopo lineal o conformacional) que está unido por un anticuerpo descrito en esta invención. Los ensayos de competición ejemplares incluyen, pero sin limitación, ensayos de rutina tales como aquellos proporcionados en Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Se proporcionan ejemplos de procedimientos detallados para cartografiar un epítopo al cual se une un anticuerpo en Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Se dice que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si cada uno bloquea la unión del otro en un 50 % o más.

[0306] En un ensayo de competición ejemplar, se incuba PD-L1 inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a PD-L1 (p. ej., un anticuerpo monoclonal descrito en esta invención) y un segundo anticuerpo no marcado en que se está probando su capacidad de competir con el primer anticuerpo por la unión a PD-L1. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridomas. Como control, se incuba PD-L1 inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a PD-L1, se retira el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcaje asociada a PD-L1 inmovilizada. Si la cantidad de marcaje asociada a PD-L1 inmovilizada se ve sustancialmente reducida en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por la unión a PD-L1. En ciertas realizaciones, la PD-L1 inmovilizada está presente sobre la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que expresa PD-L1 sobre su superficie.

[0307] En un aspecto, se pueden caracterizar adicionalmente los anticuerpos anti-PD-L1 purificados mediante una serie de ensayos que incluyen, pero sin limitación, secuenciación N-terminal, análisis de aminoácidos, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de exclusión por tamaño no desnaturalizante, espectrometría de masas, cromatografía de intercambio de iones y digestión con papaína.

[0308] Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con propósitos ilustrativos, la invención en su sentido más amplio es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Generación y cribado de hibridomas murinos

1.1 Protocolo y programa de inmunización:

[0309] Se utilizaron proteínas de fusión recombinantes que incluían una porción extracelular de i) PD-L1 humana con un marcaje HIS (Sino Bio, n.° de cat 10084-H084) y ii) PD-L1 de Cynomolgus con un marcaje HIS Sino Bio, n° de cat 90251-C08H) como antígenos en un protocolo de inmunización. Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos contra PD-L1, se inmunizaron y cribaron tres cepas diferentes de ratones. Se inmunizaron Balb/C (3), C57/Black 6 (3) y Swiss Webster (3) seis veces con proteínas alternas (PD-L1 humana y cyno) los días 0, 7, 14, 21, 28 y 35. La primera inmunización se dosificó a 50 ug de las proteínas y las inmunizaciones posteriores se dosificaron a 25 pg. Se realizó una administración subcutánea del antígeno con adyuvante MagicMouse cerca de los ganglios linfáticos inguinales izquierdo y derecho, los ganglios linfáticos braquiales izquierdo y derecho y los ganglios linfáticos axiales izquierdo y derecho a 50 pl/sitio. Se extrajo sangre de los 9 ratones el día 0 antes de la primera inmunización (antes de la toma de muestra) y el día 42 para evaluar los títulos de suero para la respuesta de anticuerpos. El suero se cribó mediante ELISA (descrito a continuación) y se usaron ratones con títulos suficientes de inmunoglobulinas anti-PD-L1 humana para las fusiones. Se aplicó refuerzo a los ratones por vía intravenosa con PD-L1 humana recombinante 3 días antes del sacrificio y la retirada de los bazos.

1.2 Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos contra PD-L1.

[0310] Los esplenocitos de ratón aislados de un ratón Swiss Webster se fusionaron con una línea celular de mieloma de ratón siguiendo protocolos estándares. Los hibridomas resultantes se cribaron luego para la producción de anticuerpos específicos de antígeno.

[0311] La suspensión de células individuales de esplenocitos de un ratón Swiss Webster inmunizado se fusionó con células Sp2/0, una línea celular de mieloma de ratón no secretora, con PEG. Las células se sembraron en placa a ~1x105/pocillo en una placa de microvaloración estéril de 96 pocillos de fondo plano seguido de 2 semanas de selección con 1xHAT en DMEM-F12 completo, FBS al 10 %, Glutamax, piruvato de sodio, HEPES, aminoácidos no esenciales y pen/estrep. Después de dos semanas, las células se cultivaron en un medio donde la selección de HAT se reemplazó por HT. Se cribaron luego en los pocillos individuales mediante ELISA (descrito a continuación) los anticuerpos IgG e IgM monoclonales anti-PD-L1 humana. Los hibridomas secretores de anticuerpos se volvieron a sembrar y se cribaron de nuevo para comprobar si todavía eran positivos de IgG o IgM anti-PD-L1 humana. Se subclonaron luego los anticuerpos anti-PD-L1 humana mediante dilución limitante. Los clones estables se apartaron del medio HT en DMEM-F12+FBS al 10%+Glutamax+pen-estrep y se cultivaron para generar pequeñas cantidades de anticuerpo para su posterior caracterización. Los hibridomas también se congelaron en 10 % de DMSO, 90 % de FBS.

1.3 Detección de anticuerpos de PD-L1 humanos específicos de IgG murina en sobrenadantes

ELISA de captura indirecta:

[0312] En el primer cribado, la detección del anticuerpo productor de sueros de ratón o hibridomas se llevó a cabo mediante un protocolo ELISA indirecto y diluciones únicas de los sueros o sobrenadantes de hibridomas. Los cribados posteriores se realizaron con diluciones de sueros de ratón o sobrenadantes de hibridomas. El formato del ELISA es como se muestra en el esquema de la FIG. 1.

[0313] Se recubrieron placas de proteína de alta unión de noventa y seis pocilios con 50 ul de Fc de IgG antihumano de cabra en PBS a lug/ml (Southern Biotech, n.° de cat 2014-01) durante la noche a 4C. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y Tween20 al 0,05 % y luego se secaron golpeando varias veces sobre toallas de papel. Las placas se bloquearon con 200 ul de leche al 1 % durante 1 hora a TA. Las etapas de lavado y secado se repitieron como anteriormente y las placas se incubaron con 50 ul de proteína quimera de Fc de B7-H1 (PD-L1) humana recombinante 200 ng/ml en leche al 1 % (R & D, n.° de cat 156-87-1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Para cribar la especificidad, se usaron quimera de Fc de PD-L1 de mono cynomolgus recombinante (Sino Biological, n.° de cat 90251-C02H), quimera Fc de PD-L1 de ratón recombinante (Sino Biologicals, n.° de cat 50010-M02H), o proteína quimera Fc de PD-L2 humana recombinante (Sino Biological, n.° de cat 10292-H02H) en lugar de la quimera Fc de PD-L1 humana. Después de lavar y secar las placas como se indicó anteriormente, el anticuerpo de control positivo (de ratón anti-PD-L1 humana, 29E.2A3, BioLegend, n.° de cat 329702) y su control de isotipo (IgG2b k de ratón, BioLegend, n.° de cat 400302) se diluyeron en serie 3 veces en leche al 1 % a partir de 3 ug/ml hasta 0,1 ng/ml y se añadieron 50 ul de los anticuerpos titulados a sus respectivos pocillos en todas las placas. Cada uno de los sobrenadantes de hibridoma se diluyó 1:3 en leche al 1 %. Se añadieron cincuenta pl de los sobrenadantes a los pocillos respectivos. Las placas se incubaron durante 1 h a TA. Se lavaron y secaron como se indicó anteriormente y luego se incubaron con 50 ul de Fc de IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) 1:5000 durante 1 hora a TA (Jackson Immuno Research, n.° de cat. 115-035 071). Después de repetir la etapa de lavado y secado, las placas se revelaron durante 20-30 min con 50 ul de sustrato TMB (BD OptiIEIA, n.° de cat 555214). La reacción se detuvo con 50 ul de H2SO42N y se leyó la absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro Spectramax Gemini. Los datos de ejemplo para sobrenadantes de hibridomas diluidos en serie se muestran en la FIG. 3, panel A.

1.4 Detección de la unión de anticuerpos a células que expresan PD-L1 humana

Reactividad de unión por citometría de flujo:

[0314] Se usaron líneas celulares tales como células Granta (DSMZ ACC n.° 342) o Promega 187103 (Promega, n.° de cat 187106) que expresan PD-L1 humana sobre su superficie celular para determinar la reactividad y especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 humana en los sobrenadantes de hibridoma mediante citometría de flujo como se muestra en la FIG. 2.

[0315] Las células se repusieron con medio fresco el día antes de la tinción. El día de la tinción, las células se desalojaron usando HyQtase (GE Health & Life Sciences n.° de cat SV30030.01). Después de aspirar todo el medio, las células se aclararon con 10 ml de PBS sin calcio ni magnesio. Después de aspirar el PBS, las células se incubaron con 5 ml de HyQtase durante 5 min a 37 °C. Las células se desalojaron luego golpeando ligeramente el matraz para crear una suspensión de células individuales. La HyQtase se neutralizó añadiendo una cantidad igual de medio y se determinaron los recuentos de células vivas usando la exclusión con azul tripán en un contador de células (BioRad TC20). La densidad de las células se ajustó a 1,5x10e4 células por 60 pl de tampón de FACS de FBS al 2 %.

Tinción comprimida [3 (placas de sobr. de hibridoma) a 1 (placa de células que expresan PD-L1)].

[0316] Se añadieron células a 1,5x104/pocillo en 60 ul de tampón de FACS con FBS al 2 % (BD Pharmingen, n° de cat.

554656) a placas de 96 pocillos de fondo en "v". Con una pipeta multicanal de 12 pocillos, se añadieron 10 ul del sobrenadante de cada pocillo de las placas de hibridoma a las células correspondientes a los pocillos. Esto se repitió con 3 placas de sobrenadante de hibridoma, combinando sobrenadantes de 3 pocillos de hibridoma en cada pocillo que contenía células. El control positivo 29E.2A3 (BioLegend, n.° de cat 329702) y el control de isotipo IgG2b k (BioLegend, n.° de cat 400302) se añadieron a las células 1 ug/ml y se designaron como pocillos de control. Las placas se incubaron a 4 °C durante 30 min. Después de lavar las células con 150 pl de tampón de FACS de FBS al 2 %, las placas se centrifugaron (centrífuga Sorvall Legend XIR) a 1200 rpm durante 5 min y los sobrenadantes se aspiraron suavemente sin alterar los sedimentos celulares. La unión del anticuerpo se detectó incubando las células con IgG anti-ratón de cabra AF647 (Jackson ImmunoResearch, n.° de cat 115-605-164) a 4 °C durante 30 min. La etapa de lavado se repitió como anteriormente y las células se resuspendieron en 60 pl de FACS de FBS al 2 % con 7_AAD 1:100 (BD Pharm, n.° de cat 68981E). Se adquirieron mil eventos de las muestras para cada muestra en un FACSCalibur (Becton Dickinson) y el análisis se realizó en la plataforma de citometría de flujo FLOJO®. La unión detectada en los sobrenadantes se comparó con los controles positivos y de isotipo y se marcaron los pocillos positivos.

Deconvolución de los pocillos de hibridoma positivos de FACS:

[0317] Cada uno de los pocillos positivos de placas/pocillos comprimidos fueron descomprimidos a placas/pocillos individuales donde en los sobrenadantes de hibridoma del pocillo individual de cada una de las 3 placas comprimidas se probó individualmente la tinción positiva en células Promega 187103 según el protocolo anterior. La unión se comparó con el control de isotipo que identifica el hibridoma productor de anticuerpo anti-PD-L1, y los pocillos positivos para ELISA que muestran altos niveles de unión a células que expresan PD-L1 se adelantaron al siguiente cribado. Los datos de ejemplo para el cribado de FACS de sobrenadantes de hibridomas se muestran en la FIG. 3, panel B.

ELISA de captura indirecta: titulación de sobrenadantes positivos de FACS.

[0318] La titulación de los sobrenadantes positivos del primer cribado de los hibridomas se llevó a cabo usando el protocolo ELISA indirecto descrito anteriormente, donde los sobrenadantes se diluyeron en serie 3 veces en leche al 1 % antes de añadirse a los pocillos. La concentración de anticuerpo murino en sobrenadantes de hibridomas seleccionados se estimó mediante ELISA indirecto usando el anticuerpo comercial 29E.2A3 de concentración conocida. En los sobrenadantes positivos luego se probó la funcionalidad en el ensayo de bloqueo de PD1/PD-L1.

Ejemplo 2: Prueba de sobrenadantes de hibridomas positivos de FACS y ELISA en un ensayo funcional para bloqueo de PD-1/PD-L1

[0319] Si bien los ensayos de cribado descritos anteriormente pueden identificar clones que pueden unirse a PD-L1 como antígeno recubierto sobre una placa o sobre una superficie celular, los anticuerpos que se quieren desarrollar es necesario que bloqueen eficazmente la interacción de PD-1 con PD-L1. Para probar la capacidad de los anticuerpos positivos de FACS y ELISA identificados anteriormente para bloquear esta interacción, se usa un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 (Promega) con una lectura basada en luminiscencia (Figura 4).

[0320] Brevemente, las células CHO congeladas con expresión superficial de PD-L1 (Promega CS187103) se descongelaron a 37 °C y se resuspendieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen). Se añadió medio que contenía 7.500 células a pocillos de una placa de 384 pocillos durante 16 h a 37 °C y 5 % de CO². El medio fue reemplazado por 10 ul de RPMI FBS al 2 % que contiene anticuerpo. Se añadieron 10 ul adicionales de medio que contiene 10.000 células Jurkat genomanipuladas (Promega CS187105) a los pocillos y se incubó durante 5 h a 37 °C con 5 % de CO². Las células se mezclaron con 20 pl de tampón de lisis que contenía luciferina (Promega, Cell Titer Glo) para medir la actividad del indicador luciferasa. La salida de luz se midió con el lector de placas EnVision. La CE⁵⁰se determinó mediante un ajuste de una curva de 4 parámetros usando el software Prism.

[0321] Los datos de ejemplo del cribado de sobrenadantes de hibridomas en el ensayo de bloqueo se muestran en la FIG.

5 , Panel A. La estrategia de cribado de hibridomas y los resultados se resumen en la FIG.5 , Panel B. En total, se cribaron ~ 3000 sobrenadantes de hibridoma y se procuraron 121 clones positivos de ELISA. De estos, 9 eran clones positivos de FACS y solo uno (3C5) exhibía actividad funcional en el bioensayo. Este clon se subclonó adicionalmente y se usó uno de los subclones 3C5-2G12 para llevar a cabo la secuenciación de nueva generación con el fin de identificar las secuencias VH y VL como se describe a continuación.

Ejemplo 3: Secuenciación de hibridomas con protocolo de secuenciación de nueva generación (NGS)

[0322] Los hibridomas típicos tienen múltiples cadenas ligeras y pesadas expresadas y una o más de estas pueden ser la secuencia responsable de la actividad observada en los ensayos funcionales. Se aplicaron procedimientos de secuenciación de nueva generación (NGS) para identificar la secuencia de hibridomas identificados como positivos en ELISA, FACS y ensayos de bloqueo. Brevemente, el ARN fue extraído de los hibridomas (1x106 células) y se generó ADN monocatenario usando un protocolo de RACE-PCR. Para amplificar tanto las cadenas pesadas como las ligeras, se usaron cebadores degenerados para las regiones de IgG de ratón e IgK de ratón. Los cebadores se diseñaron para cubrir la región variable de FR1 a FR4. Las muestras se codificaron con barras y se secuenciaron por extremos apareados usando un secuenciador MiSeq NGS (Illumina). Los archivos Fastq resultantes se analizaron usando un software personalizado de Panoply Bio (Carlsbad, CA). Las secuencias se alinearon por los extremos apareados superpuestos y se identificaron las CDR usando las regiones estructural de ratón. Los datos se reunieron basándose en la frecuencia de cada secuencia. Se pueden encontrar una serie de truncamientos en este proceso de ensamblaje de secuencias, por lo que las secuencias elegidas para la clonación y las pruebas adicionales se basaron en los siguientes criterios:

1) Presencia de las 3 CDR

2) Aparición múltiple en la familia de secuencias

3) La frecuencia más alta de CDR

4) Sin truncamientos aparentes en el extremo N

[0323] En los hibridomas, es probable que el clon más dominante tenga las secuencias más frecuentes. Usualmente, puede haber otros clones que se unirán a la diana igual de bien, o mejor o peor, pero pueden no expresarse tan bien o no crecer tan bien en cultivo. En la familia de secuencias obtenidas a partir de cadenas ligeras, una secuencia era dominante sobre todas las demás basándose en estos criterios. Como se muestra en la FIG. 6, Panel A, una secuencia aparecía 24 veces y se reproduce a continuación.

Secuencia de cadena ligera 3C5-2G12:

D I Q M N Q S P S S L S A S L G D T I T I T C R A S Q D I S I W L S W Y Q Q K P G N I P E L L I Y K A S N L H T G V P P

R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S Q S F P R T F G G G T K L E I K ( S E Q I D N O : 4 6 )

[0324] Sin embargo, los datos de NGS de la secuenciación de cadenas pesadas mostraban múltiples secuencias con altas frecuencias como se muestra en la FIG. 6 , Panel B. Por lo tanto, se usaron filtros adicionales para decidir qué secuencias presentaban la mayor probabilidad de codificar el anticuerpo activo producido por este hibridoma. Por ejemplo, la secuencia que aparece con más frecuencia en este conjunto aparecía 47 veces, pero tenía un gran truncamiento N-terminal y faltaba CDR1, por lo que no se consideró. En su lugar, se eligió para la prueba la secuencia de frecuencia más alta con las tres CDR y sin truncamientos en el extremo N-terminal. Esta secuencia aparecía 19 veces en este conjunto de secuencias, contiene las tres CDR y parece tener un extremo N intacto (similar a la línea germinal).

Secuencia de cadena pesada 3C5-2G12:

Q V Q L K E S G P G L V A P S Q S L S I T C T V S G F S L T S Y D I S W V R Q P P G K G L E W L G V I W T G V G T N

Y N S A F M S R L S I S K D N S K S Q V F L K M N S L Q T D D T A M Y Y C V R D P Y Y Y G M D Y W G Q G T S V

T V S S ( S E Q I D N O : 4 5 )

Ejemplo 4: Producción y prueba de 3C5-2G12 IgG e IgM

1. Generación de constructos de ADN con mutaciones diseñadas:

[0325] Síntesis de constructo de ADN. Todos los constructos de ADN con mutaciones diseñadas están sintetizados por los proveedores comerciales (p. ej., Genescript, Lake Pharma), con sitios de restricción compatibles en ambos extremos para subclonar en vectores de expresión respectivos.

[0326] Construcción de vectores de expresión Los constructos de ADN sintetizados se volvieron a suspender en tampón Tris-EDTA a 1 pg/ml. El ADN (1 pg) se sometió a digestión enzimática y el gen sintetizado se separó del ADN plasmídico portador mediante electroforesis. El ADN digerido se ligó a ADN plasmídico de vector de expresión predigerido mediante técnicas estándares de biología molecular. El ADN ligado se transformó en bacterias competentes y se colocó en placas de LB con múltiples antibióticos selectivos. Se eligieron varias colonias bacterianas y las preparaciones de ADN se elaboraron mediante técnicas de biología molecular estándares. El ADN preparado se verificó mediante secuenciación. Solo los clones bacterianos con 100 % de coincidencia de secuencia de ADN con la secuencia de ADN diseñada se usaron para la preparación de ADN plasmídico y posteriormente para la transfección celular.

[0327] Las secuencias para las secuencias VH y VL de 3C5-2G12 en el contexto de las cadenas pesadas y ligeras de IgG e IgM se muestran a continuación.

HC de anticuerpo 3C5-2G12 IgG1:

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYBISWVRQ

PPGKGLEWLGVIWTGVGTNYNSAFMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCVRDPYYY

GMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS

GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP

CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS

RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ^{( S E Q I D N O : 4 9 )}

HC de anticuerpo 3C5-2G12 IgM:

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYDISWVRQ

PPGKGLEWLGVIWTGVGTNYNSAFMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCVRDPYYY

GMDYWGQGTSVTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNS

DIS S TRG FP SVLRGGKYAAT S QVL L P S KDVMQGT DE HWCKVQHPNGNKEKNVP L PVIAE L P P

KV3VFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPT

TYKVTSTLTI KESDWLSQSMFT CRVDHRGL T FQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPS FASIFLT

KS TKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGER

FTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFV

QWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCWAHEALPNRVTE

RTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY ^{( S E Q I D N O :} 50)

LC de anticuerpo 3C5-2G12 IgG, IgM:

M E T D T L L L W V L L L W V P G S T G D I Q M N Q S P S S L S A S L G D T I T I T C R A S Q D I S I W L S W Y Q Q

K P G N I P E L L I Y K A S N L H T G V P P R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S Q S F P R T F G

G G T K L E I K R T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S

G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C

( S E Q I D N O : 5 1 )

3C5-2G12 IgM secuencia de la cadena J del anticuerpo J:

Q E D E R I V L V D N K C K C A R I T S R I I R S S E D P N E D I V E R N I R I I V P L N N R E N I S D P T S P L R T R F V

Y H L S D L C K K C D P T E V E L D N Q I V T A T Q S N I C D E D S A T E T C Y T Y D R N K C Y T A V V P L V Y G

G E T K M V E T A L T P D A C Y P D ( S E Q I D N O : 4 7 )

[0328] El ADN correspondiente a estas secuencias se sintetizó y se transfectó en células HEK293 para producir proteína que luego se purificó usando la matriz de afinidad del anticuerpo de camélido específico de IgM. Como se muestra en la FIG. 7 , la cadena J era capaz de incorporarse en la IgM, y la forma pentamérica de IgM con la cadena J correspondiente era claramente distinguible de la forma hexamérica sin una cadena J.

2. Expresión, purificación y caracterización de proteínas

[0329] a. Transfección. El ADN de cadena pesada, ligera y J se transfectó en células CHO o HEK293. El ADN para vectores de expresión típicamente se mezcló en una relación 1:1:1 con PEI y luego se añadió a las células CHO-S. La transfección de PEI con células CHO-S se realizó según las técnicas establecidas (véase Biotechnology and Bioengineering, Vol 87, 553-545).

b. Inmunoprecipitación

[0330]

i. IgM Capture Select (BAC, Thermo Fisher). Las proteínas de IgM de sobrenadantes de células CHO transfectadas se purifican parcialmente mediante inmunoprecipitación con matriz de afinidad de IgM Capture Select según el protocolo del fabricante (GE Life Sciences). Después de incubación a temperatura ambiente durante 2 horas, la matriz de afinidad se separó del sobrenadante mediante centrifugación. La matriz se lavó adicionalmente con PBS 3 veces antes de retirar con cuidado el PBS. La proteína capturada se eluyó de la matriz al incubar con tampón de proteína NuPage LDS (Life Technology) durante 5 minutos.

c. Electroforesis en gel

[0331]

i. PAGE-SDS no reductora: la PAGE-SDS no reductora separa la IgM nativa y sus formas mutantes según el tamaño. La IgM pentamérica, compuesta de cadenas pesadas y ligeras homodiméricas, produce una banda de proteína de aproximadamente 1.000.000 de peso molecular. Se añadió tampón de muestra NuPage LDS (Life Technologies) a las muestras de proteína de IgM a 25 °C durante 30 minutos antes de cargar en el gel. Se usó gel Bis-Tris al 3-12 % de NativePage Novex (Life Technologies) con tampón de migración de SDS Tris-acetato de Novex (Life Technologies). El gel migró hasta que el frente del tinte alcanzó la parte inferior del gel.

ii. Reducción de PAGE-SDS: Se añadieron el tampón de muestra NuPage LDS (Life Technologies) y el agente reductor de NuPage ditiotreitol (Life Technologies) a las muestras de proteína de IgM y se calentaron a 80 °C durante 10 minutos antes de cargar gel Bis-Tris al 4-12 % NuPage Novex (Life Technologies). Se usó tampón de migración de MES SDS NuPage (Life Technologies) para la electroforesis en gel. Los geles migraron hasta que el frente del tinte alcanzó la parte inferior del gel. Después de que completarse la electroforesis, se retiró el gel del aparato y se tiñó usando tinción de azul coloidal (Life Technologies).

iii. Transferencia Western: se lavó un gel de acrilamida migrado en las condiciones descritas anteriormente en una solución de etanol al 20 % durante 10 minutos y luego la proteína se transfirió a una membrana iBlot PVDF (Invitrogen) usando el sistema iBlot Dry Blotting (Invitrogen) a 20 V durante 10 minutos. Después de la transferencia, la membrana de PVDF se bloqueó usando seroalbúmina bovina al 2 %, Tween 20 al 0,05 % durante al menos 12 horas. Se añadió una dilución 1/500 de cadena J de anticuerpo de Pierce (ThermoFisher) a la membrana, se incubó durante 1 hora y, a continuación, se añadió una dilución 1/5000 de IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch) y se dejó incubar a oscuras durante 30 minutos. Por último, se añadió el sustrato quimioluminiscente Super Signal West Pico (ThermoFisher) a la transferencia y la señal resultante se visualizó usando el sistema de formación de imágenes ChemiDoc-It HR410 (UVP) o exponiendo la transferencia a una película de rayos X.

Ejemplo 5: Prueba funcional de 3C5-2G12 IgG e IgM

[0332] Como anteriormente, las células CHO congeladas con expresión superficial de PD-L1 (Promega CS187103) se descongelaron a 37 °C y se resuspendieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen). Se añadió medio que contenía 7.500 células a pocillos de una placa de 384 pocillos durante 16 h a 37 °C y 5 % de CO². El medio fue reemplazado por 10 ul de RPMI FBS al 2 % que contiene anticuerpo 3C5-1G12 o anticuerpo de control. Se añadieron 10 ul adicionales de medio que contiene 10.000 células Jurkat genomanipuladas (Promega CS187105) a los pocillos y se incubó durante 5 h a 37 °C con 5 % de CO². Las células se mezclaron con 20 pl de tampón de lisis que contenía luciferina (Promega, Cell Titer Glo) para medir la actividad del indicador luciferasa. La salida de luz se midió con el lector de placas EnVision. La CE⁵⁰se determinó mediante un ajuste de una curva de 4 parámetros usando el software Prism.

[0333] Los datos de ejemplo de la prueba de preparaciones de anticuerpos 3C5-2G12 purificados en el ensayo de bloqueo se muestran en la FIG. 8. Los formatos IgM e IgM+J parecen muy potentes (61 pM y 96 pM) y más que el formato IgG en este ensayo.

Ejemplo 6: Prueba de reactividad cruzada de 3C5-2G12 IgG e IgM

[0334] La quimera humana recombinante de PD-L1 Fc (Sino Biological, n.° de cat 10084-H02H), quimera de mono Cynomolgus recombinante de PD-L1 Fc (Sino Biological, n.° de cat 90251-C02H), quimera de ratón recombinante de PD-L1 Fc (Sino Biologicals, n.° de cat 50010-M02H) y proteína quimera humana recombinante de PD-L2 Fc (Sino Biological, n.° de cat 10292-H02H) se recubrieron directamente sobre placas ELISA a 1 ug/ml para incubación durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y Tween al 0,05 % y se secaron golpeando varias veces sobre toallas de papel. Todas las placas se bloquearon con 200 ul de leche al 1 % durante 1 hora a TA. Después de lavar y secar las placas como se indicó anteriormente, se diluyeron cada uno de los anticuerpos 3C5.2G12 IgG, 3C5.2G12 IgM y 3C5.2G12 IgM+wtJ 1:3 en leche al 1 % a partir de 3 ug/ml hasta 0,1 ng/ml. Se añadieron cincuenta pl de los anticuerpos diluidos a los respectivos pocillos de todas las placas. El anticuerpo de control positivo (de ratón anti-PD-L1 humana, 29E.2A3 (BioLegend, n.° de cat 329702) y su control de isotipo IgG2b k de ratón (BioLegend, n.° de cat 400302) se diluyeron en serie 3 veces en leche al 1 % a partir de 3 ug/ml hasta 0,1 ng/ml y se añadieron 50 ul de los anticuerpos titulados a sus respectivas placas/pocillos. De manera similar, se titularon anticuerpos de rata anti-PD-L1 de ratón (BioLegend, n.° de cat 124302) e isotipo IgG2b de rata (BioLegend, n.° de cat 400622), anti-PD-L2 humano (BioLegend, n.° de cat 345502) con isotipo IgG1 de ratón (BioLegend, n.° de cat 4011402) como anteriormente y se añadieron a sus respectivas placas/pocillos. Las placas se incubaron durante 1 h a TA. Se lavaron y secaron como se indicó anteriormente y luego se incubaron todos los 3C5.2G12 con 50 ul de anticuerpo de cabra anti-cadena ligera kappa humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) 1:5000 durante 1 h a TA (Jackson Immuno Research, n.° de cat 115-035-071). Para los pocillos de control, se diluyeron los anticuerpos secundarios apropiados, de cabra anti-ratón con HRP (Southern Biotech, n.° de cat 1033) y de ratón anti-rata con HRP (Southern Biotech, n.° de cat 3070-05) y se incubaron como anteriormente. Después de repetir la etapa de lavado y secado, las placas se revelaron durante 20-30 min con 50 ul de sustrato TMB (BD OptiIEIA, n.° de cat 555214). La reacción se detuvo con 50 ul de H2SO42N y se leyó la absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro Spectramax Gemini. Los datos de ejemplo para 3C5.2G12 diluido en serie se muestran en la FIG. 9, Panel A, Panel B y Panel C.

Ejemplo 7: Humanización de 3C5-2G12 IgG e IgM

[0335] La humanización del anticuerpo 3C5-2G12 se llevó a cabo en ambos formatos (IgG e IgM). Las secuencias y combinaciones que se produjeron para la prueba se muestran a continuación.

h3C5H1-hIgG1:

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYDISWIRQ PPGKGLEWIGVIWTGVGTNYNP5LKSRVTISVDISKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDPYYY GMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY5KLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ^{( S E Q I D N O : 5 2 )}

h 3 C 5 H 2 - h l g G 1 :

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYDISWIRQ PPGKGLEWLGVIWTGVGTNYNPSLKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDPYYY GMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEHESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ^{( S E Q I D N O : 5 3 )}

h 3 C 5 H 3 - h l g G 1 :

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTSYDISWVRQ PPGKGLEWLGVIWTGVGTNYNPSFKSRLTISKDTSKNQVSLKMSSLTAADTAVYYCVRDPYYY GMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ^{( S E Q I D N O : 5 4 )}

h 3 C 5 H 4 - h l g G 1 :

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQVQLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTSYDISWIRQ PPGKGLEWLGVIWTGVGTNYNPS FKSRLTISKDNSKNQVSLKMS SLTAADTAVYYCVRDPYYY GMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ^{( S E Q I D N O :} 55)

h 3 C 5 L 1 - h K a p p a :

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISIWLSWYQQKPGKA PKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSQSFPRTFGQGTKLEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ^{( S E Q I D N O : 5 6 )}

h 3 C 5 L 2 - h K a p p a :

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQDISIWLSWYQQKPGKA

PKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQSQSFPRTFGQGTKLEI

KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ^{( S E Q I D N O : 5 7 )}

[0336] Las siguientes combinaciones se hicieron en forma de IgG usando técnicas estándares descritas anteriormente y se purificaron usando Proteína A.

h3C5H1-h3C5L1

h3C5H2- h3C5L2

h3C5H3- h3C5L2

h3C5H4- h3C5L2

[0337] Los resultados de probar cada uno de estos anticuerpos en el ensayo de bloqueo de PD-L1 se muestran en la FIG.

10. Todos los cambios conservadores realizados durante el proceso de humanización parecen haber tenido poco impacto sobre la actividad de bloqueo del anticuerpo humanizado.

Ejemplo 8: Cartografía de epítopos

[0338] La cartografía de epítopos peptídicos se llevó a cabo creando una colección de todos los péptidos lineales de 15 aminoácidos superpuestos que cubren los aminoácidos 19 a 132 del dominio extracelular de PD-L1 (Q9NZQ7, SEQ ID NO: 48), mediante síntesis directa sobre un soporte sólido usando el sistema PEPSCAN™.

[0339] La unión del anticuerpo se cuantificó en el sistema PEPSCAN™ usando una lectura automática de tipo ELISA. La unión a la matriz de péptidos se determinó para el anticuerpo 3C5 (formato IgG) y el anticuerpo de control YW243.55S70 (denominado en esta invención "S70"), un anticuerpo de referencia que se une a PD-L1. Se divulgan secuencias de cadena pesada y cadena ligera de S70 en la patente de EE. UU. n.° 8.217.149. El epítopo de hPD-L1 que se une al anticuerpo S70 se cartografió claramente en la secuencia de aminoácidos QDAGVYRCm iS (aminoácidos 107 a 117 de la SEQ ID NO: 48). Este epítopo incluye tres aminoácidos (R113, M115 y S117) de los catorce residuos discontinuos de hPD-L1 calculados que entran en contacto con hPD-1. Véase Lin, DY y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:3011-3016 (2008).

[0340] El epítopo 3C5 solo pudo determinarse parcialmente usando condiciones de unión de baja rigurosidad (p. ej., tampón de muestra 0,1X usado en el preacondicionamiento de anticuerpos y las reacciones ELISA). Los resultados de la unión eran consistentes con el epítopo 3C5 que se solapa parcialmente con el epítopo S70. Los resultados de la unión no descartaban la posibilidad de que otras regiones de hPD-L1 también se unieran a 3C5, p. ej., como un epítopo conformacional o discontinuo. Como se muestra en el Ejemplo 9, a continuación, los anticuerpos 3C5 y S70 compiten de forma cruzada por la unión a PD-L1 humana (véase el Ejemplo 9, a continuación), proporcionando un apoyo adicional de que los epítopos de los dos anticuerpos se solapan.

Ejemplo 9: Bloqueo cruzado de anticuerpos

[0341] El análisis de bloqueo cruzado de anticuerpos se realizó mediante el siguiente procedimiento. Se incubaron células CHO que expresan PD-L1 humana (20.000-30.000 por reacción) con diluciones tituladas no marcadas de cualquiera de 3C5 (IgG), S70, o un anticuerpo IgG de control de isotipo irrelevante durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron y luego se incubaron con una concentración constante de 3C5 o S70 marcado con Alexa Fluor® 647 (1 pg/ml) durante 30 min a 4 °C. Las intensidades de tinción fluorescente se determinaron usando el sistema FACSCalibur™. La competición por el anticuerpo idéntico era un control positivo mientras que la falta de competición por el anticuerpo irrelevante era un control negativo. Los resultados del bloqueo cruzado se muestran en la FIG. 11, Panel A y Panel B. Los resultados demuestran el bloqueo cruzado mutuo de la unión a PD-L1 humana por 3C5 y S70.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-PD-Ll aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena pesada comprende:

(i) un HVR-H1 que comprende la secuencia de GFSLTSYDIS (SEQ ID NO: 4);

(ii) un HVR-H2 que comprende la secuencia de VIWTGVGTN (SEQ ID NO: 5); y

(iii) un HVR-H3 que comprende la secuencia de DPYYYGMDY (SEQ ID NO: 6);

y la región variable de cadena ligera comprende:

(iv) un HVR-L1 que comprende la secuencia de RASQDISIWLS (SEQ ID NO: 1);

(v) un HVR-L2 que comprende la secuencia de KASNLHT (SEQ ID NO: 2); y

(vi) un HVR-L3 que comprende la secuencia de LQSQSFPRT (SEQ ID NO: 3).

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 o 45 y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 43, 44 o 46.

3. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, elaborado mediante el proceso de:

(a) cultivar una célula que expresa un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41,42 o 45 y un dominio variable de cadena ligera de cualquiera de las SEQ ID NO: 43, 44 o 46; y

(b) aislar el anticuerpo de la célula o de un medio de cultivo celular en el que se cultiva la célula.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

(A) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 45 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 46;

(B) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 36, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 43;

(C) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 37, y comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 43;

(D) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 38, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 43;

(E) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 39, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 43;

(F) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 36, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44;

(G) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 37, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44;

(H) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 38, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44;

(I) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 39, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44;

(J) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 40, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 43;

(K) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 41, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 43;

(L) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 42, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 43;

(M) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 40, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44;

(N) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 41, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44; o

(O) una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 42, y una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es biespecífico.

6. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, según la reivindicación 5, donde el anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno se une a una proteína PD-L1 y una proteína de superficie celular.

7. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-6, donde el fragmento de unión a antígeno se selecciona de entre el grupo que consiste en: Fab, Fab', F(ab)², F(ab')², Fv y scFv.

8. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el anticuerpo comprende una cadena ligera kappa o una cadena ligera lambda, y donde el anticuerpo es un isotipo IgM o IgA, o es un anticuerpo híbrido IgG/IgM o IgG/IgA.

9. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, según la reivindicación 8, donde el anticuerpo comprende una cadena J.

10. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, según la reivindicación 9, donde la cadena J es una cadena J modificada que comprende un resto de unión extraño seleccionado de entre el grupo que consiste en: anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, conjugados de anticuerpo-fármaco, moléculas de tipo anticuerpo, fragmentos de unión a antígenos de moléculas de tipo anticuerpo, proteínas solubles y unidas a la membrana, ligandos y receptores, y donde el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en: Fab, Fab', F(ab)², F(ab')², Fv, scFv y anticuerpo de dominio único.

11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, según la reivindicación 10, donde el resto de unión extraño:

(a) se une a una proteína de superficie celular seleccionada de entre el grupo que consiste en: CTLA-4, TIM3, LAG3, BTLA, VISTA y TIGIT;

(b) comprende una proteína albúmina o un fragmento de una proteína albúmina;

(c) comprende un péptido de unión a albúmina o un fragmento de anticuerpo;

(d) comprende un péptido de unión a FcRn o un fragmento de anticuerpo de unión a FcRn;

(e) se una a una célula efectora seleccionada de entre el grupo que consiste en linfocitos T, células citolíticas naturales (NK), macrófagos y neutrófilos; o

(f) se une a CD3 en las células T.

12. Un anticuerpo IgM, IgA, IgG/IgM o IgG/IgA que comprende una cadena J modificada que comprende un resto de unión extraño, donde el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, se une a una proteína de superficie celular, y donde el resto de unión extraño comprende un anticuerpo anti-PD-L1, o un fragmento de unión a antígeno, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

13. Un polinucleótido que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-L1 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Un vector o una célula hospedadora recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 13.

15. Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-PD-LI aislado, comprendiendo el procedimiento:

transfectar una célula hospedadora con un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo anti-PD-Ll según cualquiera de las reivindicaciones 1-12; cultivar la célula hospedadora en condiciones adecuadas para producir el anticuerpo anti-PD-Ll; y aislar el anticuerpo anti-PD-Ll.

ticuerpo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en el tratamiento del cáncer.