ES2898088T3 - Inmuno-PETE - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para enriquecer, a partir de una muestra, una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden regiones del gen V, J y, opcionalmente, C o D, del receptor de células inmunitarias, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una mezcla de reacción, en la que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibridan a las regiones del gen V de los polinucleótidos diana; b) extender los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias hibridados con una polimerasa, y, a continuación, retirar los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias no extendidos, si están presentes, en el que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos comprenden al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, al menos una porción de la región de C del receptor de células inmunitarias y al menos una porción de la región de J del receptor de células inmunitarias; c) hibridar un primer adaptador universal al sitio de hibridación de adaptador de [PUENTE] de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos; en el que dicho adaptador universal es un adaptador bicatenario, que comprende: una región con protuberancia monocatenaria en 5' que se puede hibridar al sitio de hibridación de adaptador de PUENTE de dichos cebadores extendidos; d) ligar los primeros adaptadores universales hibridados a los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, y, a continuación, retirar los adaptadores no ligados, si están presentes; e) hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias a las porciones de la región de J de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, en el que los cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen J en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5' o hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias a las porciones de la región de C de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, en el que los cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen C en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5'; y f) extender los cebadores específicos para el gen J o cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias hibridados con una polimerasa, formando, de este modo, una pluralidad de productos bicatenarios estructuralmente diferentes, comprendiendo cada uno al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, y al menos una porción de la región de J o región de C del receptor de células inmunitarias flanqueada por una secuencia de primer y segundo adaptador universal, comprendiendo dicha mezcla de reacción i) una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen V, opcionalmente regiones del gen D, opcionalmente regiones del gen C y regiones del gen J del receptor de células inmunitarias; y ii) una pluralidad de cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias estructuralmente distintos, en el que la pluralidad comprende al menos 10 cebadores estructuralmente distintos que tienen las siguientes regiones de 5' a 3': [5'-Fos], [PUENTE], [CÓDIGO DE BARRAS] y [FW], en las que: [5'-Fos] comprende un fosfato en 5'; 5 [PUENTE] comprende un sitio de hibridación de adaptador de 2-8 nucleótidos de longitud; [CÓDIGO DE BARRAS] comprende una región de código de barras de al menos 6 nucleótidos de longitud, en la que cada nucleótido de la región de código de barras se selecciona independientemente del grupo que consiste en N y W; y [FW] de cada cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias comprende una región estructuralmente distinta que se hibrida específicamente a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias.
Description
DESCRIPCIÓN
Inmuno-PETE
Antecedentes de la invención
El sistema inmunitario adaptativo puede generar una amplia gama de diversas moléculas de unión. Por ejemplo, la recombinación, inserción aleatoria, deleción y sustitución tienen el potencial de crear entre 1015 y 1020 clonotipos de receptores de linfocitos T (TCR) y considerablemente más clonotipos de receptores de linfocitos B (BCR) debido al mayor número de secuencias de VDJ, como así como hipermutación somática. Los clonotipos de linfocitos B o T indiferenciados pueden estar sujetos a presiones de selección positiva y negativa, donde las células que expresan determinadas secuencias de receptor inmunitario se expanden o delecionan respectivamente. Como tal, el repertorio de secuencias de BCR o TCR puede incluir información con respecto al desarrollo inmunológico, enfermedades, el estado de un trasplante de un órgano (por ejemplo, tolerado o rechazado) o la presencia o ausencia de un trastorno autoinmunitario, cáncer o infección. Además, la secuenciación de alto rendimiento de los repertorios de BCR o TCR se ha convertido en una potente herramienta para estudiar o examinar la inmunología básica, enfermedad, trastornos autoinmunitarios, cáncer, infección, trasplante de un órgano y similares. El documento WO 2014/145992 A1 (ADAPTIVE BIOTECHNOLOGIES COr P) ya divulga algunos procedimientos generales para la secuenciación de alto rendimiento cuantitativa de ADN o ARN que codifica receptores inmunitarios adaptativos.
Breve sumario de la invención
En el presente documento se describen procedimientos y composiciones mejorados para el enriquecimiento de dianas por extensión del cebador (PETE) de secuencias de receptor inmunitario (TCR o BCR, o una combinación de los mismos). Se puede usar los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, por ejemplo, para secuenciación de alto rendimiento y/u obtención del perfil del repertorio inmunitario. En algunos casos, los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento pueden proporcionar sensibilidad incrementada, fondo disminuido o eficacia incrementada en la preparación de colecciones de secuenciación de alto rendimiento de polinucleótidos para receptor inmunitario. En algunos casos, los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento pueden proporcionar una detección incrementada de clonotipos de células inmunitarias infrecuentes, requisitos para muestras reducidos o una combinación de los mismos. En algunos modos de realización, se proporciona la mejora por el uso secuencial de dos cebadores flanqueantes para el enriquecimiento de secuencias de receptor inmunitario por PETE, donde un primer cebador flanqueante se hibrida a un polinucleótido diana y se extiende con una polimerasa, y un segundo cebador flanqueante se hibrida al primer cebador flanqueante extendido y se extiende con una polimerasa. Por tanto, la muestra se enriquece con polinucleótidos diana que contienen el sitio de hibridación del primer cebador y un complemento del sitio de hibridación del segundo cebador.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para enriquecer, a partir de una muestra, una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden regiones del gen V, J y, opcionalmente, C o D, del receptor de células inmunitarias, comprendiendo el procedimiento:
a) proporcionar una mezcla de reacción, en la que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibridan a las regiones del gen V de los polinucleótidos diana;
b) extender los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias hibridados con una polimerasa, y, a continuación, retirar los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias no extendidos, si están presentes, en el que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos comprenden al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, al menos una porción de la región de C del receptor de células inmunitarias y al menos una porción de la región de J del receptor de células inmunitarias;
c) en el que dicho adaptador universal es un adaptador bicatenario, que comprende: una región con protuberancia monocatenaria en 5' que se puede hibridar al sitio de hibridación de adaptador de PUENTE de dichos cebadores extendidos,
d) ligar los primeros adaptadores universales hibridados a los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, y, a continuación, retirar los adaptadores no ligados, si están presentes;
e) hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias a las porciones de la región de J de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, en el que los cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen J en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5' o hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias a las porciones de la región de C de
los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, en el que los cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen C en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5'; y
f) extender los cebadores específicos para el gen J o cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias hibridados con una polimerasa, formando, de este modo, una pluralidad de productos bicatenarios estructuralmente diferentes, comprendiendo cada uno al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, y al menos una porción de la región de J o región de C del receptor de células inmunitarias flanqueada por una secuencia de primer y segundo adaptador universal,
comprendiendo dicha mezcla de reacción
i) una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen V, opcionalmente regiones del gen D, opcionalmente regiones del gen C y regiones del gen J del receptor de células inmunitarias; y
ii) una pluralidad de cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias estructuralmente distintos, en el que la pluralidad comprende al menos 10 cebadores estructuralmente distintos que tienen las siguientes regiones de 5' a 3':
[5'-Fos], [PUENTE], [CÓDIGO DE BARRAS] y [FW], en las que:
[5'-Fos] comprende un fosfato en 5';
[PUENTE] comprende un sitio de hibridación de adaptador de 2-8 nucleótidos de longitud;
[CÓDIGO DE BARRAS] comprende una región de código de barras de al menos 6 nucleótidos de longitud, en la que cada nucleótido de la región de código de barras se selecciona independientemente del grupo que consiste en N y W; y
[FW] de cada cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias comprende una región estructuralmente distinta que se hibrida específicamente a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias.
En algunos modos de realización, [CÓDIGO DE BARRAS] comprende una región de código de barras de desde 6 a 16 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la [FW] de cada cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibrida específicamente a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de linfocitos T. En algunos modos de realización, la [FW] de cada cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibrida específicamente a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de linfocitos B. En algunos modos de realización, la pluralidad comprende al menos 10 de los cebadores expuestos en SEQ ID No: 1-121.
En algunos modos de realización, el [PUENTE] consiste en 6 nucleótidos consecutivos, preferentemente de la secuencia CGA TCT. En algunos modos de realización, [CÓDIGO DE BARRAS] consiste en trece nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en N y W, preferentemente de la secuencia WNN NNN WNN NNN W. En algunos modos de realización, la composición comprende al menos 50, preferentemente todos los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 1-121.
En algunos modos de realización, una porción de los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen D del receptor de células inmunitarias y una porción de los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad no comprenden regiones del gen D del receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen D del receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, una porción de los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen C del receptor de células inmunitarias y una porción de los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad no comprenden regiones del gen C del receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen C del receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, la mezcla de reacción comprende una pluralidad de cebadores específicos para el gen C (para el segmento C) del receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, la pluralidad de cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias se hibridan a uno de los polinucleótidos diana estructuralmente diferentes.
En algunos modos de realización, e) y f) se repiten de 2 a 15 veces calentando para desnaturalizar los productos bicatenarios, enfriando para hibridar cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias no
extendidos a las porciones de la región de J de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos y extendiendo los cebadores hibridados. En algunos modos de realización, la retirada de cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias no extendidos comprende digerir por digestión con ADN monocatenario exonucleasa. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además amplificar productos bicatenarios que comprenden primer y segundo adaptadores universales por PCR universal. En algunos modos de realización, los polinucleótidos diana estructuralmente diferentes son ADNc. En algunos modos de realización, antes de la etapa a), se incluye una etapa de síntesis de ADNc para preparar ADNc a partir de ARN total o ARNm. En algunos modos de realización, la etapa e) se modifica de modo que la pluralidad de cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias se sustituyan con una pluralidad de cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias, formando, de este modo, una pluralidad de productos bicatenarios estructuralmente diferentes, comprendiendo cada uno al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias y al menos una porción de la región de C del receptor de células inmunitarias.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 ilustra un modo de realización de una reacción de inmuno-PETE. El modo de realización ilustrado es una reacción de enriquecimiento de dianas por extensión del cebador (PETE) del receptor de linfocitos T (TCR) con dos cebadores.
La FIG. 2 es una imagen de los productos de extensión del cebador ejemplares obtenidos por el ensayo de inmuno-PETE del ejemplo 1 analizado por electroforesis en gel de agarosa.
La FIG. 3 es un diagrama de Venn que demuestra el número de clones y solapamiento entre datos de secuenciación desduplicados y desdesduplicados de productos de extensión del cebador ejemplares obtenidos por el ensayo de inmuno-PETE del ejemplo 1.
La FIG. 4 ilustra un modo de realización de una reacción de inmuno-PETE. El modo de realización ilustrado es una reacción de inmuno-PETE basada en ARN o ARNm.
La FIG. 5 es una imagen de los productos de extensión del cebador ejemplares obtenidos por el ensayo de inmuno-PETE del ejemplo 3 analizado por electroforesis en gel de agarosa.
La FIG. 6 es un gráfico que muestra el clonotipado de las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T usando linfocitos T clasificados por FACS humanos.
La FIG. 7 es un gráfico que muestra el clonotipado de las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T usando cantidades de entrada de ADN bajas de células de muestra de tejido FFPE.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica. Véanse, por ejemplo, Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4.a ed. 2007); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Lab Press (Cold Spring Harbor, NY 1989). Se pretende que el término "un" o "una" signifique "uno/a o más". Se pretende que el término "comprende" y variaciones del mismo, tales como "comprenden" y "que comprende", cuando preceden a la enumeración de una etapa o un elemento, signifiquen que la adición de otras etapas o elementos es opcional y no está excluida. Cualquier procedimiento, dispositivo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento se puede usar en la práctica de la presente invención. Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar el entendimiento de determinados términos usados con frecuencia en el presente documento y no están destinadas a limitar el alcance de la presente divulgación.
Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente todo" en referencia a retirar sustancialmente todo un componente de una mezcla de reacción significa retirar al menos un 90 %, 95 %, 99 % o más de un componente.
Como se usa en el presente documento, el término "receptor de células inmunitarias" se refiere a un receptor de linfocitos T (TCR) o un receptor de linfocitos B (BCR) (es decir, un anticuerpo). El BCR puede estar en una forma unida a membrana o en una forma secretada.
"Receptor de linfocitos T" o "TCR" se refiere al complejo de reconocimiento de antígenos de un linfocito T. El TCR está compuesto por dos cadenas de proteínas diferentes (por ejemplo, alfa y beta o gamma y delta). Cada cadena está compuesta por dos dominios extracelulares que contienen una región variable (V), una región de unión (J) y una región constante (C). La región variable contiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) hipervariables. Las cadenas de TCR beta y delta contienen además una región de diversidad (D) entre las regiones
de V y J. Se genera otra diversidad del TCR por recombinación VJ (para cadenas alfa y gamma) y VDJ (para cadenas beta y delta). Los términos también se refieren a diversas formas recombinantes y heterólogas, incluyendo TCR solubles expresados a partir de un sistema heterólogo.
El receptor de linfocitos B o "BCR" se refiere al complejo de reconocimiento de antígenos secretado o unido a membrana de un linfocito B. El BCR está compuesto por dos cadenas de proteínas diferentes (por ejemplo, pesada y ligera). Cada cadena contiene una región variable (V), una región de unión (J) y una región constante (C). La región variable contiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) hipervariables. Las cadenas pesadas pueden contener además una región de diversidad (D) entre las regiones de V y J. Se genera otra diversidad de BCR por recombinación VJ (para cadenas ligeras) y VDJ (para cadenas pesadas), así como hipermutación somática de cadenas recombinadas. Los términos también se refieren a diversas formas recombinantes y heterólogas.
Como se usa en el presente documento, el término "código de barras" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se puede detectar e identificar. Los códigos de barras pueden ser de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más nucleótidos de longitud. Los códigos de barras pueden emplear códigos de corrección de errores de modo que uno o más errores en la síntesis, replicación y/o secuenciación se puedan corregir para identificar la secuencia de código de barras. Los ejemplos de códigos de corrección de errores y su uso en códigos de barras e identificación y/o secuenciación de códigos de barras incluyen, pero no se limitan a, los descritos en los documentos U.S. 2010/0.323.348; y U.S. 8.715.967. En algunos casos, los códigos de barras están diseñados para tener un número mínimo de nucleótidos distintos con respecto a todos los demás códigos de barras de una población. El número mínimo puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más. Por tanto, por ejemplo, una población de códigos de barras que tiene un número mínimo de al menos 5 nucleótidos distintos diferirá en al menos 5 posiciones de nucleótido de todos los demás códigos de barras en la población.
Como se usa en el presente documento, el término "identificador múltiple", "MID" y similares, se refiere a un código de barras que identifica una fuente o muestra. Como tales, todos o sustancialmente todos los polinucleótidos con código de barras MID de una única fuente o muestra compartirán un MID de la misma secuencia; mientras que todos o sustancialmente todos (por ejemplo, al menos un 90 % o un 99 %) los polinucleótidos con código de barras MID de diferentes fuentes o muestras tendrán una secuencia de código de barras MID diferente. Los polinucleótidos de diferentes fuentes o muestras y que tienen diferentes MID, a continuación, se pueden mezclar y secuenciar en paralelo mientras se mantiene la información de fuente/muestra. Por tanto, las lecturas de secuencia se pueden asignar a muestras individuales.
Como se usa en el presente documento, el término "identificador universal", "identificador molecular universal", "identificador molecular único", "UID" y similares, se refiere a un código de barras que identifica un polinucleótido al que está fijado. Típicamente, todos o sustancialmente todos (por ejemplo, al menos un 90 % o un 99 %) los códigos de barras UID en una mezcla de polinucleótidos con códigos de barras UID son únicos.
El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y polímeros de los mismos en forma mono o bien bicatenaria. A menos que se limite específicamente, el término engloba ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también engloba implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones redundantes), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, se pueden lograr sustituciones de codones redundantes generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
"Polimerasa" se refiere a una enzima que realiza la síntesis dirigida por molde de polinucleótidos. Una ADN polimerasa puede añadir nucleótidos libres solo al extremo 3' de la hebra recién formada. Esto da como resultado el alargamiento de la hebra recién formada en una dirección 5'-3'. Ninguna ADN polimerasa conocida puede comenzar una nueva cadena (de novo). La ADN polimerasa puede añadir un nucleótido solo a un grupo 3'-OH preexistente y, por lo tanto, necesita un cebador en el que pueda añadir el primer nucleótido. Los ejemplos no limitantes de polimerasas incluyen ADN polimerasas procarióticas (por ejemplo, Pol I, Pol II, Pol III, Pol IV y Pol V), ADN polimerasa eucariótica, telomerasa, retrotranscriptasa y ARN polimerasa. La retrotranscriptasa es una ADN polimerasa dependiente de ARN que sintetiza ADN de un molde de ARN. La familia de retrotranscriptasas contiene tanto la funcionalidad de la ADN polimerasa como la funcionalidad de la RNasa H, que degrada el ARN con emparejamiento de bases a ADN. La ARN polimerasa es una enzima que sintetiza ARN usando ADN como molde durante el procedimiento de transcripción génica. La ARN polimerasa polimeriza ribonucleótidos en el extremo 3' de un transcrito de ARN.
En algunos modos de realización, se puede usar una polimerasa de las siguientes en una reacción de extensión
del cebador mediada por polimerasa, de modificación de extremos (por ejemplo, transferasa terminal, degradación o pulido) o de amplificación: polimerasas de arqueas (por ejemplo, Thermococcus litoralis (Vent, GenBank: a Aa 72101), Pyrococcus furiosus (Pfu, GenBank: D12983, bAa 02362), Pyrococcus woesii, Pyrococcus GB-D (Deep Vent, GenBank: AAA67131), Thermococcus kodakaraensis KODI (KOD, GenBank: BD175553, BAA06142; Thermococcus sp., cepa KOD (Pfx, GenBank: AAE68738)), Thermococcus gorgonarius (Tgo, Pdb: 4699806), Sulfolobus solataricus (GenBank: NC002754, P26811), Aeropyrum pernix (GenBank: BAA81109), Archaeglobus fulgidus (GenBank: 029753), Pyrobaculum aerophilum (GenBank: AAL63952), Pyrodictium occultum (GenBank: BAA07579, BAA07580), Thermococcus, 9 grados, Nm (GenBank: AAA88769, Q56366), Thermococcus fumicolans (GenBank: CAA93738, P74918), Thermococcus hydrothermalis (GenBank: CAC18555), Thermococcus sp. GE8 (GenBank: CAC12850), Thermococcus sp. JDF-3 (GenBank: AX135456; WO0132887), Thermococcus sp. TY (GenBank: CAA73475), Pyrococcus abyssi (GenBank: P77916), Pyrococcus glycovorans (GenBank: CAC12849), Pyrococcus horikoshii (GenBank: NP 143776), Pyrococcus sp. Ge23 (GenBank: CAA90887), Pyrococcus sp. ST700 (GenBank: CAC 12847), Thermococcuspacificus (GenBank: AX411312.1), Thermococcus zillig ii (GenBank: DQ3366890), Thermococcus aggregans, Thermococcus barossii, Thermococcus celer (GenBank: DD259850.1), Thermococcus profundus (GenBank: E14137), Thermococcus siculi (GenBank: DD259857.1), Thermococcus thioreducens, Thermococcus onnurineus NA1, Sulfolobus acidocaldarium, Sulfolobus tokodaii, Pyrobaculum calidifontis, Pyrobaculum islandicum (GenBank: AAF27815), Methanococcus jannaschii (GenBank: Q58295), especie TOK de Desulforococcus, Desulfurococcus, Pyrolobus, Pyrodictium, Staphylothermus, Vulcanisaetta, Methanococcus (GenBank: P52025) y otras de arqueas B, tales como GenBank AAC62712, P956901, BAAA07579)), polimerasas de bacterias termófilas de las especies de Thermus (por ejemplo, flavus, ruber, thermophilus, lacteus, rubens, aqualicus), Bacillus stearothermophilus, Thermotoga marítima, Methanothermus fervidus, polimerasa de KOD, polimerasa de TNA1, Thermococcus sp., 9 grados, N-7, T4, T7, phi29, Pyrococcus furiosus, P. abyssi, T. gorgonarius, T. litoralis, T. zilligii, T. sp. GT, P. sp. GB-D, KOD, Pfu, T. gorgonarius, T. zilligii, T. litoralis y Thermococcus sp. 9N-7.
En algunos modos de realización, la polimerasa puede incluir una ARN polimerasa de un eucariota, tal como ARN polimerasa I, ARN polimerasa II, ARN polimerasa III, ARN polimerasa IV o ARN polimerasa V. La polimerasa puede incluir una ARN polimerasa bacteriana, así como ARN polimerasas de fagos y víricas. En algunos aspectos, la ARN polimerasa puede incluir una ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3, ARN polimerasa K11, ARN polimerasa K1F, ARN polimerasa N4 o ARN polimerasa SP6. En algunos modos de realización, la ARN polimerasa (por ejemplo, ARN polimerasa de E. coli) puede incluir una ARN polimerasa natural, mutante o genomanipulada artificialmente. Como se usa en el presente documento, "una ARN polimerasa genomanipulada artificialmente" consiste en, o comprende, al menos una sustitución, deleción o inserción de aminoácido con respecto a la ARN polimerasa natural de la que se obtiene o deriva la ARN polimerasa genomanipulada artificialmente.
En algunos modos de realización, la polimerasa puede incluir una retrotranscriptasa (RT). La RT es una ADN polimerasa dependiente de ARN que sintetiza ADN bicatenario (ADNc) de un molde de ARN monocatenario. La familia de RT contiene tanto la funcionalidad de la ADN polimerasa como la funcionalidad de la RNasa H, que degrada el ARN con emparejamiento de bases a ADN. Las RT se asocian predominantemente con retrovirus, aunque los no retrovirus también usan RT (por ejemplo, virus de la hepatitis B). En algunos aspectos, la polimerasa puede incluir una RT del virus de la inmunodeficiencia humana (por ejemplo, VIH-1), virus de la leucemia murina de Moloney (por ejemplo, M-MLV), virus linfotrópico de linfocitos T humano (por ejemplo, HTLV), virus de la mieloblastosis aviar (por ejemplo, AMV), virus del sarcoma de Rous (por ejemplo, RSV), RT SuperScript (por ejemplo, SuperScript IV) o telomerasa RT (por ejemplo, TERT). En algunos modos de realización, la RT puede incluir una RT recombinante (por ejemplo, una r T que tenga una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácido en comparación con la RT natural correspondiente). En algunos aspectos, la RT incluye la transcripción de fragmentos de ARN de diversos tamaños (por ejemplo, 1 kb, 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb o más).
El término "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima que es estable con respecto al calor, es resistente al calor y retiene suficiente actividad para efectuar reacciones de extensión de polinucleótido posteriores y no se desnaturaliza (inactiva) de forma irreversible cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de ácidos nucleicos son bien conocidas en la técnica y se ejemplifican, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 4.683.202, 4.683.195 y 4.965.188. Como se usa en el presente documento, una polimerasa termoestable es adecuada para su uso en una reacción de termociclado, tal como la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"), una reacción de extensión del cebador o una reacción de modificación de extremos (por ejemplo, transferasa terminal, degradación o pulido). La desnaturalización irreversible para los propósitos en el presente documento se refiere a la pérdida permanente y completa de actividad enzimática. Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos de manera apropiada para formar productos de extensión de polinucleótido que sean complementarios a una hebra de ácido nucleico molde. Las ADN polimerasas termoestables de bacterias termófilas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de Thermotoga marítima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, especie sps17 de Thermus, especie Z05 de Thermus, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana, Thermosipho africanus y otras ADN polimerasas termoestables divulgadas anteriormente.
En algunos casos, la ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) polimerasa puede ser una polimerasa de tipo A natural modificada. Otro modo de realización de la invención, en general, se refiere a un procedimiento en el que una polimerasa de tipo A modificada, por ejemplo, en una reacción de extensión del cebador, de modificación de extremos (por ejemplo, transferasa terminal, degradación o pulido) o de amplificación, se puede seleccionar de cualquier especie del género Meiothermus, Thermotoga o Thermomicrobium. Otro modo de realización de la invención, en general, se refiere a un procedimiento en el que la polimerasa, por ejemplo, en una reacción de extensión del cebador, de modificación de extremos (por ejemplo, transferasa terminal, degradación o pulido) o de amplificación, se puede aislar de cualquiera de Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus, Thermus caldophilus o Thermus filiformis. Otro modo de realización de la invención, en general, engloba un procedimiento en el que la polimerasa de tipo A modificada, por ejemplo, en una reacción de extensión del cebador, de modificación de extremos (por ejemplo, transferasa terminal, degradación o pulido) o de amplificación, se puede aislar de Bacillus stearothermophilus, Sphaerobacter thermophilus, Dictoglomus thermophilum o Escherichia coli. En otro modo de realización, la invención, en general, se refiere a un procedimiento en el que la polimerasa de tipo A modificada, por ejemplo, en una reacción de extensión del cebador, de modificación de extremos (por ejemplo, transferasa terminal, degradación o pulido) o de amplificación, puede ser una polimerasa con E507K de Taq mutante. Otro modo de realización de la invención, en general, se refiere a un procedimiento en el que se puede usar una polimerasa termoestable para efectuar la amplificación del ácido nucleico diana.
Como se usa en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido que se une a una región específica de una molécula de ácido nucleico molde monocatenario e inicia la síntesis de ácido nucleico por medio de una reacción enzimática mediada por polimerasa, extendiéndose desde el extremo 3' del cebador y complementaria a la secuencia de la molécula molde. Los cebadores de amplificación por PCR se pueden denominar cebadores "directos" e "inversos", siendo uno complementario a una hebra de ácido nucleico y el otro complementario al complemento de esa hebra. Típicamente, un cebador comprende menos de aproximadamente 100 nucleótidos y preferentemente comprende menos de aproximadamente 30 nucleótidos. Los cebadores ejemplares varían de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 nucleótidos. Los cebadores pueden comprender, por ejemplo, bases de ARN y/o ADN, así como bases no naturales. La direccionalidad de la hebra recién formada (la hebra hija) es opuesta a la dirección en la que la ADN polimerasa se mueve a lo largo de la hebra molde.
Como se usa en el presente documento, el término "cebador universal" y "cebadores universales" se refiere a un cebador que se puede hibridar a y soportar la amplificación de polinucleótidos diana que tienen un sitio de unión a cebador universal complementario compartido. De forma similar, el término "par de cebadores universales" se refiere a un par de cebadores directo e inverso que se pueden hibridar a y soportar la amplificación por PCR de polinucleótidos diana que tienen sitios de unión a cebador universal directo e inverso complementario compartido. Dicho(s) cebador(es) universal(es) y sitio(s) de unión a cebador universal pueden permitir la amplificación universal mediada por cebador único o doble (por ejemplo, PCR universal) de las regiones de interés en el polinucleótido diana.
Como se usa en el presente documento, el término "muestra" se refiere a cualquier muestra biológica que comprende moléculas de ácido nucleico, que comprenden típicamente ADN y/o ARN. Las muestras pueden ser tejidos, células o extractos de los mismos, o pueden ser muestras purificadas de moléculas de ácido nucleico. El uso del término "muestra" no implica necesariamente la presencia de una secuencia diana dentro de las moléculas de ácido nucleico presentes en la muestra. En algunos casos, la "muestra" comprende células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos B y/o linfocitos T) o una fracción de las mismas (por ejemplo, una fracción enriquecida con ADN genómico, ARN total o ARNm). En algunos modos de realización, una muestra puede comprender una población de células (tales como linfocitos T humanos) clasificadas por FACS o una muestra de tejido incluido en parafina fijado con formol (FFPE).
Como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones en las que un cebador/sonda se hibridará a su diana, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no a otras secuencias de ácido nucleico presentes en la mezcla compleja. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Una guía extensa con respecto a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). En general, las condiciones altamente rigurosas se seleccionan para que estén aproximadamente 5-10 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tf) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. En general, se seleccionan condiciones de restricción baja para que estén aproximadamente 15-30 °C por debajo de la Tf. La Tf es la temperatura (en una fuerza iónica, pH y concentración nucleica definidos) a la que un 50 % de los cebadores/sondas complementarios a la diana se hibridan a la secuencia diana en equilibrio. Las condiciones rigurosas incluyen aquellas en las que la concentración de sal es menor de aproximadamente 1,0 M de iones de sodio, típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de iones de sodio (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos de aproximadamente 30 °C para cebadores/sondas cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos de aproximadamente 60 °C para cebadores/sondas largos (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida.
Descripción detallada de la invención
I. Introducción
La presente invención proporciona un procedimiento para el enriquecimiento de dianas por extensión del cebador (PETE) que incluye dos cebadores flanqueantes y composiciones para realizar y usar el procedimiento para PETE con cebadores flanqueantes (FP-PETE). El uso de dos cebadores flanqueantes incrementa la restricción de la etapa de enriquecimiento en comparación con los procedimientos que requieren solo un cebador único o cebo único para el enriquecimiento de cada polinucleótido diana estructuralmente distinto. Por tanto, en algunos casos, el procedimiento para FP-PETE proporciona un enriquecimiento de dianas mejorado o sinérgico en comparación con otros procedimientos para el enriquecimiento de dianas, tales como, por ejemplo, procedimientos para el enriquecimiento de dianas por extensión con cebador único.
Además, a diferencia de los procedimientos basados en PCR múltiple en los que múltiples primeros y segundos cebadores de amplificación están en la misma mezcla de reacción al mismo tiempo, el procedimiento para FP-PETE puede incluir una etapa de retirada de los primeros cebadores no extendidos antes de introducir los segundos cebadores en una mezcla de reacción. Por tanto, en algunos casos, el procedimiento puede reducir o eliminar la competencia entre los primer y segundo cebadores. Como tal, en algunos casos, el primer o segundo cebadores, o ambos, se pueden usar en concentraciones significativamente mayores en la mezcla de reacción de FP-PETE en comparación, por ejemplo, con procedimientos basados en PCR múltiple. Adicionalmente, o de forma alternativa, se puede usar un número incrementado de primeros o segundos cebadores en la mezcla de reacción de FP-PETE en comparación, por ejemplo, con procedimientos basados en PCR múltiple.
El uso de un gran número de primeros o segundos cebadores, una alta concentración de primeros o segundos cebadores o una combinación de los mismos, puede proporcionar un enriquecimiento mejorado, por ejemplo, para flujos de trabajo con muestras de secuenciación de alto rendimiento en los que se seleccionan como diana un gran número de secuencias de polinucleótido diferentes y son conocidas secuencias de hibridación flanqueantes para las secuencias diana. Dichos flujos de trabajo con muestras de secuenciación de alto rendimiento incluyen, pero no se limitan a, flujos de trabajo de obtención del perfil del repertorio inmunitario en los que las secuencias de receptor de linfocitos B (BCR) o de receptor de linfocitos T (TCR) se enriquecen a partir de una muestra, se secuencian y analizan. Los procedimientos para el enriquecimiento de dianas por extensión con cebadores flanqueantes para flujos de trabajo de obtención del perfil del repertorio inmunitario se denominan "inmuno-PETE".
Las condiciones de hibridación, incluyendo las ejemplificadas en el presente documento, son fácilmente determinables por un experto en la técnica y pueden incluir calcular la longitud del cebador/sonda, la concentración de sal y la temperatura preferente para limitar la hibridación no específica. En general, los cebadores/sondas más largos requieren mayores temperaturas para una hibridación correcta, mientras que los cebadores/sondas más cortos requieren menores temperaturas. La hibridación, en general, depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para hibridar secuencias de ácido nucleico complementarias (por ejemplo, cebadores/sondas) presentes en un entorno (por ejemplo, una mezcla de reacción) por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de homología entre un cebador/sonda y el ADN desnaturalizado, mayor puede ser la temperatura de hibridación mientras se minimiza la hibridación no específica. En consecuencia, mayores temperaturas de hibridación relativas tienden a hacer que las condiciones de reacción sean más "rigurosas", mientras que menores temperaturas de hibridación hacen que las condiciones de reacción sean menos rigurosas. Se pueden encontrar detalles y explicaciones adicionales de la restricción de la hibridación, por ejemplo, en Ausubel et al., (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)).
En un aspecto, la presente invención usa primeros o segundos cebadores (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-121, 122 204, 205-213, etc.) que se hibridan selectivamente a determinados polinucleótidos diana. La frase "se hibrida selectivamente (o específicamente) a" se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula (por ejemplo, un polinucleótido diana) a una secuencia de nucleótidos particular (por ejemplo, un cebador o sonda que comprende SEQ ID NO: 1-213) en condiciones de hibridación rigurosas cuando el polinucleótido diana está presente en una mezcla de reacción (por ejemplo, ARN total, ARNm, ADNc o ADNg).
En un modo de realización, el primer o segundo cebadores descritos en el presente documento son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios) a los polinucleótidos diana. En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios en al menos 5, al menos 10, en al menos 15, al menos 20 o más nucleótidos) a los polinucleótidos diana. En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios en su longitud completa a los polinucleótidos diana.
En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios) a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios o sustancialmente
complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios en al menos 5, al menos 10, en al menos 15, al menos 20 o más nucleótidos) a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios en su longitud completa a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias.
Aún en otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios) a una región del gen J del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios en al menos 5, al menos 10, en al menos 15, al menos 20 o más nucleótidos) a una región del gen J del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios en su longitud completa a una región del gen J del receptor de células inmunitarias.
En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios) a una región del gen C del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios en al menos 5, al menos 10, en al menos 15, al menos 20 o más nucleótidos) a una región del gen C del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, el primer o segundo cebadores son complementarios en su longitud completa a una región del gen C del receptor de células inmunitarias.
En algunos modos de realización, los polinucleótidos diana que comprenden ADN genómico o ADNc de la invención se pueden identificar en condiciones de hibridación rigurosas usando las secuencias de cebador/sonda divulgadas aquí (por ejemplo, que comprenden una cualquiera o más de SEQ ID NO: 1-213). Lo siguiente es un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación realizadas en un termociclador y no es limitante: a) desnaturalización de la muestra que contiene los polinucleótidos diana a 98 °C durante 2 minutos; b) hibridación de cebadores/sondas a 60 °C durante 20 minutos; c) extensión de cebadores/sondas usando polimerasa a 65 °C durante 2 minutos; d) adición de exonucleasa I a la mezcla de reacción a 37 °C durante 10 minutos, incrementar la temperatura a 80 °C durante otros 10 minutos, mantener a 4 °C.
En un modo de realización, los polinucleótidos diana que se hibridan selectivamente a una cualquiera de las secuencias de cebador/sonda divulgadas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-213) pueden ser de cualquier longitud, por ejemplo, al menos 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 200, 500 o más nucleótidos o tener menos de 500, 200, 100 o 50 nucleótidos, etc.).
En un modo de realización, un primer cebador se hibrida a una región de un polinucleótido para receptor de células inmunitarias diana que está en 3' con respecto a una región de interés o en un extremo 3' de una región de interés. Por ejemplo, la región de interés puede incluir al menos una porción de la región de V, al menos una porción de la región de C, la región de diversidad (D) si está presente, y al menos una porción de la región de J del receptor de células inmunitarias. En algunos casos, el primer cebador se hibrida a una región de la región estructural (por ejemplo, una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3) de la región de V del receptor de células inmunitarias. En algunos casos, el primer cebador se hibrida a la región de C (por ejemplo, que comprende un cebador para el segmento C) del receptor de células inmunitarias. A continuación, se puede extender el primer cebador por una polimerasa en una primera reacción de extensión. A continuación, los primeros cebadores no extendidos y otro ácido nucleico monocatenario (por ejemplo, ADN genómico desnaturalizado) se pueden retirar, por ejemplo, por digestión con ADN monocatenario exonucleasa. En una segunda reacción, un segundo cebador se hibrida a una región del primer cebador extendido que está en 3' con respecto a la región de interés o en un extremo 3' de una región de interés. Por tanto, los primer y segundo cebadores flanquean la región de interés cuando se hibridan a sus respectivas dianas. En algunos casos, el segundo cebador se hibrida a una región del gen J del primer cebador extendido. En algunos casos, el segundo cebador se hibrida a una región del gen V del primer cebador extendido. En algunos casos, el segundo cebador se hibrida a una región del gen C del primer cebador extendido. A continuación, se puede extender el segundo cebador por una polimerasa en una segunda reacción de extensión.
De forma alternativa, se puede hibridar un primer cebador a una región del gen J de un polinucleótido para receptor de células inmunitarias diana que está en 3' con respecto a una región de interés o en un extremo 3' de una región de interés. A continuación, el primer cebador hibridado se puede extender por una polimerasa. A continuación, los primeros cebadores no extendidos y otro ácido nucleico monocatenario (por ejemplo, ADN genómico desnaturalizado) se pueden retirar, por ejemplo, por digestión con ADN monocatenario exonucleasa. En una segunda reacción, se puede hibridar un segundo cebador a una región de la región estructural del primer cebador extendido y extender con una polimerasa.
En un modo de realización, se puede preparar ADN complementario (ADNc) a partir de ARN o ARNm para su uso en los procedimientos para PETE descritos en el presente documento. En un aspecto, el ADNc se prepara a partir de ARN total o ARNm aislado y/o purificado de una célula, lisado celular, muestra o tejido. En un modo de
realización, el ARN puede incluir ARN total obtenido usando procedimientos de extracción y/o aislamiento de ARN conocidos en la técnica (por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4.a edición, vol. 1, capítulo 6 (2012); minikit RNeasy (número de catálogo: 74104), Qiagen, Germantown, MD). En otro modo de realización, el ADNc se puede sintetizar de transcritos de ARN total o ARNm usando kits disponibles comercialmente (por ejemplo, retrotranscriptasa SuperScript III™ (número de catálogo: 18080093) o el kit de síntesis de ADNc SuperScript® VILO TM (número de catálogo: 11754050), ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). En otro modo de realización, se puede preparar ADNc a partir de transcritos de ARN total o ARNm obtenidos de sangre completa, leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC), linfocitos clasificados, cultivo de linfocitos, tejido tumoral en fresco o congelado en fresco o tejido incluido en parafina fijado con formol (FFPE) (por ejemplo, kit RNeasy FFPE, Qiagen, Germantown, MD). En un aspecto, la síntesis de ADNc se puede iniciar en o cerca del extremo 3' del transcrito de ARNm y termina en o cerca del extremo 5' del ARNm para generar moléculas de ADNc de "longitud completa".
En un modo de realización, el ARNm purificado de una muestra (por ejemplo, célula, lisado celular o tejido) se puede cebar con un cebador oligo-dT (por ejemplo, un cebador poli-T), una mezcla de cebadores aleatorios (por ejemplo, una mezcla o hexámeros, heptámeros, octámeros, nanómeros, etc., aleatorios) o uno o más cebadores para la región constante (para el segmento C) del receptor inmunitario específico de isotipo (por ejemplo, que comprenden SEQ ID NO: 205-213 de la tabla 6) en condiciones de hibridación suficientes para iniciar la síntesis de ADNc (véase la FIG. 4). En un aspecto, el cebador oligo-dT facilita que el extremo 3' de los ARNm en la muestra se represente en las moléculas de ADNc resultantes. En otro aspecto, el uno o más cebadores para el segmento C del receptor inmunitario específico de isotipo permite la hibridación del cebador para el segmento C a una secuencia complementaria entre el uno o más transcritos de ARNm presentes en la muestra. En un modo de realización, las moléculas de ADNc resultantes se pueden usar en uno o más de los ensayos de PETE como se describe en el presente documento para producir uno o más productos de extensión del cebador que se pueden usar para identificar isotipos del receptor inmunitarios en la muestra. En consecuencia, las moléculas de ARN o ARNm de la muestra se pueden someter, en primer lugar y preferentemente, a una síntesis de la segunda hebra para producir moléculas de ADNc bicatenario. En un modo de realización, se prepara ADNc usando un cebador oligo-dT como se expone en este párrafo. En otro modo de realización, el ADNc se prepara usando una mezcla de cebadores aleatorios de hexámeros, heptámeros, octámeros, nanómeros, etc., como se expone en este párrafo. En otro modo de realización, se prepara ADNc usando al menos un cebador para el segmento C del receptor inmunitario específico de isotipo. En otro modo de realización, se puede preparar ADNc usando uno o más cebadores para la región del gen C. Por ejemplo, Glanville et al., (PNAS, (2009) 106.48, 20216-21) divulga el uso de un cebador para la región constante de la cadena pesada humana, cebador para la región constante kappa humana y cebador para la región constante lambda humana para preparar ADNc a partir de ARN total y/o ARNm a partir de muestras humanas. Aún en otro modo de realización, se prepara ADNc usando al menos uno de los cebadores para el segmento C del receptor inmunitario específico de isotipo expuestos en SEQ ID NO: 205-213.
Una vez preparado, el ADNc sintetizado se puede purificar por cualquier procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, microesferas paramagnéticas de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) o microesferas paramagnéticas AMPure (Beckman Coulter, Brea, CA), columnas de filtración o centrifugación (por ejemplo, minikit RNeasy (número de catálogo: 74104), Qiagen, Germantown, MD). A continuación, el ADNc purificado puede servir como molde para cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En un modo de realización, se puede usar una pluralidad de cebadores específicos para el gen V (por ejemplo, que comprenden SEQ ID NO: 1-121) en la primera ronda de extensión del cebador (extensión gPE), seguido de una segunda ronda de extensión usando uno o más cebadores para el segmento C (por ejemplo, que comprenden SEQ ID NO: 205-213, véase la tabla 6). De forma alternativa, el ADNc preparado como se describe en el presente documento se puede usar como molde de partida para los ensayos de PETE descritos en el presente documento (por ejemplo, ejemplo 1), donde se puede usar una pluralidad de cebadores específicos para el gen V (por ejemplo, que comprenden SEQ ID NO: 1-121) en la primera ronda de extensión del cebador (extensión gPE), seguido de una segunda ronda de extensión (extensión PE2) usando una pluralidad de cebadores específicos para el gen J (por ejemplo, que comprenden SEQ ID NO: 122-204).
II. Composiciones
En el presente documento se describen composiciones para realizar un inmuno-PETE. Dichas composiciones pueden incluir uno o más, o todos, de los siguientes: cebadores, conjuntos de cebadores, productos de extensión por polimerasa de dichos cebadores o conjuntos de cebadores (por ejemplo, hibridados a un polinucleótido diana), polinucleótidos diana (por ejemplo, polinucleótidos diana monocatenarios), mezclas de reacción, ADN polimerasas dependientes de ADN, ADN polimerasas dependientes de ARN, ADN monocatenario exonucleasas, nucleótidos, tampones, sales y similares.
En un modo de realización, se proporciona una composición que contiene una pluralidad de primeros cebadores. En algunos casos, la pluralidad de primeros cebadores son cebadores específicos para genes del receptor de células inmunitarias. La pluralidad de cebadores específicos para genes del receptor de células inmunitarias se puede configurar para hibridarse, y, por tanto, enriquecerse en una etapa de extensión mediada por polimerasa, a una pluralidad de polinucleótidos diana en una muestra que codifican genes del receptor de células inmunitarias.
Los primeros cebadores pueden incluir un fosfato 5' terminal ("[5'-Fos]"). El fosfato 5' terminal puede permitir la ligación del extremo 5' del primer cebador, o un producto de extensión por polimerasa del mismo, a un 3'-OH de un polinucleótido contiguo.
Los primeros cebadores pueden incluir una región [PUENTE]. La región [PUENTE] puede incluir un sitio de hibridación de adaptador de al menos 2 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el sitio de hibridación de adaptador es de al menos 4 nucleótidos de longitud, de al menos 6 nucleótidos de longitud, de al menos 8 nucleótidos de longitud, de 2 a 10 nucleótidos de longitud o de 2 a 8 nucleótidos de longitud. La región [PUENTE] puede ser complementaria a una región con protuberancia en 5' monocatenaria de un adaptador bicatenario, de modo que cuando la región con protuberancia en 5' monocatenaria del adaptador bicatenario se hibrida a la región [PUENTE], un 3'-OH del adaptador se puede ligar al [5'-Fos] del primer cebador o un producto de extensión por polimerasa del mismo. En algunos modos de realización, [PUENTE] comprende o consiste en 6 nucleótidos consecutivos que son complementarios a una región con protuberancia en 5' monocatenaria de un adaptador bicatenario. En algunos modos de realización, [PUENTE] comprende o consiste en la secuencia CGA TCT.
Los primeros cebadores pueden incluir una región [CÓDIGO DE BARRAS] que es o contiene un código de barras. La región [CÓDIGO DE BARRAS] puede ser o contener un UID, un MID o una combinación de los mismos. En algunos casos, la región [CÓDIGO De BARRAS] comprende un UID. La región [CÓDIGO DE BARRAS] puede ser de cualquier longitud de 2 a aproximadamente 50 o más nucleótidos. Para los códigos de barras UID, en general, la longitud y composición del código de barras se selecciona para codificar más secuencias que polinucleótidos diana únicos existen con respecto al código de barras. Como tal, para la obtención del perfil del repertorio inmunitario, donde las estimaciones de diversidad son, en general, significativamente mayores de 103 y cada secuencia única se puede representar en una muestra múltiples veces, el código de barras UID puede ser de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, en algunos casos, el código de barras puede ser de 6 a 16 nucleótidos de longitud, de 8 a 14 nucleótidos de longitud o de 10 a 13 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, el código de barras es de 13 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el código de barras comprende nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en N y W. En un modo de realización ejemplar, el código de barras tiene una secuencia de WNN NNN WNN NNN W.
Los primeros cebadores pueden incluir una región [FW]. La región [FW] puede ser o contener una secuencia estructuralmente distinta que se hibride específicamente a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de una región del gen V del receptor de células inmunitarias de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias (TCR o BCR), en la que, tras la hibridación a la región del gen V de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias, el primer cebador se puede extender en la dirección de la región del gen J del polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, la región [FW] se hibrida a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un polinucleótido diana que codifica el TCR. En algunos modos de realización, la región [FW] se hibrida a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un polinucleótido diana que codifica el BCR. Se pueden usar los primeros cebadores que contienen una región [FW] en un procedimiento inmuno-PETE con segundos cebadores que se hibridan a la región del gen J de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, los primeros cebadores incluyen las siguientes regiones: [5'-Fos], [PUENTE], [CÓDIGO DE BARRAS] y [FW]. En algunos modos de realización, los primeros cebadores incluyen las siguientes regiones de 5' a 3': [5'-Fos], [PUENTE], [CÓDIGO DE BARRAS] y [FW].
De forma alternativa, los primeros cebadores pueden incluir una región específica para J ([J]) que se hibride específicamente a una región del gen J de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias, en la que, tras la hibridación a la región del gen J de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias (TCR o BCR), el primer cebador se puede extender en la dirección de la región del gen V del polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, la región de [J] se hibrida a una región del gen J de un polinucleótido diana que codifica el TCR. En algunos modos de realización, la región de [J] se hibrida a una región del gen J de un polinucleótido diana que codifica el BCR. Se pueden usar los primeros cebadores que contienen una región de [J] en un procedimiento inmuno-PETE con segundos cebadores que se hibridan a la región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, los primeros cebadores incluyen las siguientes regiones: [5'-Fos], [PUENTE], [CÓDIGO DE BARRAS] y [J]. En algunos modos de realización, los primeros cebadores incluyen las siguientes regiones de 5' a 3': [5'-Fos], [PUENTE], [CÓDIGO DE BARRAS] y [J]. En otro modo de realización, los primeros cebadores pueden incluir una región específica para constante ([C]) que se hibride específicamente a una región del gen C de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias, en la que, tras la hibridación a la región del gen C de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias (TCR o BCR), el primer cebador se puede extender en una dirección en 3', a través de la región del gen C del polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, la región de [C] se hibrida a una región del gen C de un polinucleótido diana que codifica el TCR. En algunos modos de realización, la región de [C] se hibrida a una región del gen C de un polinucleótido diana que codifica el BCR. En algunos modos de realización, se pueden usar primeros cebadores que contengan una región para C [C] en un procedimiento inmuno-PETE con segundos cebadores que se hibriden a la región específica para V ([V]) que se hibrida específicamente a una región del gen
V de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias. En algunos modos de realización, los primeros cebadores incluyen las siguientes regiones: [5'-Fos], [PUENTE], [CÓDIGO DE BARRAS] y [C]. En algunos modos de realización, donde la muestra incluye ARNm purificado o ARN total, los primeros cebadores pueden incluir un cebador para el segmento C que sea complementario a y se hibride en condiciones de hibridación con una región del gen C de un polinucleótido que codifica el receptor de células inmunitarias, o un complemento del mismo.
En un aspecto, la presente invención usa primeros cebadores (por ejemplo, SEQ ID NO: 205-213) que se pueden hibridar selectivamente a determinados polinucleótidos diana. La frase "se hibrida selectivamente (o específicamente) a"' se refiere a la unión, duplicación o hibridación de una molécula (por ejemplo, un polinucleótido diana) a una secuencia de nucleótidos particular (por ejemplo, un cebador o sonda que comprende SEQ ID NO: 205-213) en condiciones de hibridación rigurosas cuando el polinucleótido diana está presente en una mezcla de reacción (por ejemplo, ARN total, ARNm, ADNc o ADNg).
Como se describe en el presente documento, los polinucleótidos diana que codifican una cadena p o cadena 5 de TCR pueden contener una región de D que está situada entre una región de V y una región de J, mientras que los polinucleótidos diana que codifican una cadena a o cadena y de TCR pueden carecer de una región de D, de modo que la región de V y la región de J sean contiguas. De forma similar, los polinucleótidos diana que codifican una cadena pesada de BCR pueden contener una región de D que está situada entre una región de V y una región de J, mientras que los polinucleótidos diana que codifican una cadena ligera de BCR pueden carecer de una región de D, de modo que la región de V y la región de J sean contiguas.
Como tales, los productos de extensión del primer cebador de los primeros cebadores que contienen una región [FW] que están moldeados por una cadena p o cadena 5 de TCR o cadena pesada de BCR, por ejemplo, pueden contener una región de VDJ, o una porción de la región de V, una región de D y una región de J. De forma similar, los productos de extensión del primer cebador de los primeros cebadores que contienen una región [FW] que están moldeados por una cadena a o cadena y de TCR o una cadena ligera de BCR pueden carecer de una región de D y, por tanto, contener una región de V o porción de la misma contigua a una región de J. De forma alternativa, los productos de extensión del primer cebador de los primeros cebadores que contienen una región de [J] que están moldeados por una cadena p o cadena 5 de TCR o cadena pesada de BCR, por ejemplo, pueden contener una región de VDJ, o una porción de la región de J, una región de D y una región de V. De forma similar, los productos de extensión del primer cebador de los primeros cebadores que contienen una región de [J] que están moldeados por una cadena a o cadena y de TCR o una cadena ligera de BCR pueden carecer de una región de D y, por tanto, contener una región de J o porción de la misma contigua a una región de V.
En algunos modos de realización, la pluralidad de primeros cebadores contiene al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 25, al menos 50, al menos 100 o todos los cebadores expuestos en la tabla 1 (SEQ ID No: 1-121). En un modo de realización, la pluralidad de primeros cebadores contiene al menos 1 de los cebadores expuestos en SEQ ID No: 1-121. En algunos modos de realización, la pluralidad de primeros cebadores contiene al menos 2, al menos 5, al menos 10 o todos los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 205-213. En un modo de realización, la pluralidad de primeros cebadores contiene al menos 1 de los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 205-213. En un modo de realización, la pluralidad de primeros cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios) a una región del gen C del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, los primeros cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios en al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20 o más nucleótidos) a una región del gen del receptor C de células inmunitarias. En otro modo de realización, los primeros cebadores son complementarios en su longitud completa a una región del gen C del receptor de células inmunitarias.
Tabla 1:
En un modo de realización, se proporciona una composición que contiene una pluralidad de segundos cebadores. En algunos casos, la pluralidad de segundos cebadores son cebadores específicos para genes del receptor de células inmunitarias. La pluralidad de cebadores específicos para genes del receptor de células inmunitarias se puede configurar para hibridarse, y, por tanto, enriquecerse en una etapa de extensión mediada por polimerasa, a una pluralidad de polinucleótidos diana en una muestra que codifican genes del receptor de células inmunitarias. Los segundos cebadores pueden incluir un sitio de unión a cebador universal, o un complemento del mismo, y una región de hibridación a receptor de células inmunitarias. En algunos casos, los segundos cebadores incluyen de 5'
a 3' un sitio de unión a cebador universal y una región de hibridación a receptor de células inmunitarias. En algunos casos, la región de hibridación a receptor de células inmunitarias del segundo cebador es complementaria a y se hibrida en condiciones de hibridación con una región del gen J de un polinucleótido que codifica el receptor de células inmunitarias, o un complemento del mismo. En algunos casos, la región de hibridación a receptor de células inmunitarias del segundo cebador es complementaria a y se hibrida en condiciones de hibridación con una región de V de un polinucleótido que codifica el receptor de células inmunitarias (por ejemplo, una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3), o un complemento del mismo. En algunos casos, la región de hibridación a receptor de células inmunitarias del segundo cebador es complementaria a y se hibrida en condiciones de hibridación con una región del gen C de un polinucleótido que codifica el receptor de células inmunitarias, o un complemento del mismo.
Como se describe en el presente documento, los polinucleótidos diana que codifican una cadena p o cadena 5 de TCR pueden contener una región de D que está situada entre una región de V y una región de J, mientras que los polinucleótidos diana que codifican una cadena a o cadena y de TCR pueden carecer de una región de D, de modo que la región de V y la región de J sean contiguas. De forma similar, los polinucleótidos diana que codifican una cadena pesada de BCR pueden contener una región de D que está situada entre una región de V y una región de J, mientras que los polinucleótidos diana que codifican una cadena ligera de BCR pueden carecer de una región de D, de modo que la región de V y la región de J sean contiguas.
Los productos de extensión del segundo cebador de los segundos cebadores que contienen una región de [J] o una [FW] que están moldeados por un producto de extensión del primer cebador moldeado por una cadena p o cadena 5 de TCR o cadena pesada de BCR, por ejemplo, pueden contener una región de VDJ, o una porción de la región de V, una región de D y una porción de una región de J. De forma similar, los productos de extensión del segundo cebador de los segundos cebadores que contienen una región de [J] o una [FW] que están moldeados por el producto de extensión del primer cebador moldeado por una cadena a o cadena y de TCR o una cadena ligera de BCR pueden carecer de una región de D, y, por tanto, contienen una región de V o porción de la misma contigua a una región de J o porción de la misma.
En algunos modos de realización, la pluralidad de segundos cebadores contiene al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 25, al menos 50, al menos 75, o todos los cebadores expuestos en la tabla 2 (SEQ ID No: 122-204. En un modo de realización, la pluralidad de segundos cebadores contiene al menos 1 de los cebadores expuestos en SEQ ID No: 122-204. En algunos modos de realización, la pluralidad de segundos cebadores contiene al menos 2, al menos 5, al menos 10 o todos los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 205-213. En un modo de realización, la pluralidad de segundos cebadores contiene al menos 1 de los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 205-213.
En un modo de realización, los segundos cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios) a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, los segundos cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios en al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20 o más nucleótidos) a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, los segundos cebadores son complementarios en su longitud completa a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias.
Aún en otro modo de realización, los segundos cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios) a una región del gen J del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, los segundos cebadores son complementarios o sustancialmente complementarios (es decir, al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % complementarios en al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20 o más nucleótidos) a una región del gen J del receptor de células inmunitarias. En otro modo de realización, los segundos cebadores son complementarios en su longitud completa a una región del gen J del receptor de células inmunitarias.
Tabla 2:
En el presente documento se describen polinucleótidos diana y composiciones que contienen dichos polinucleótidos diana. En algunos casos, una composición que contiene dichos polinucleótidos diana contiene además una polimerasa dependiente de ADN y/o una ADN polimerasa dependiente de ARN, una ligasa, un primer cebador o pluralidad de primeros cebadores, un segundo cebador o pluralidad de segundos cebadores, productos de extensión por polimerasa del primer o segundo cebador o una combinación de los mismos. En general, los polinucleótidos diana codifican receptores de células inmunitarias, tales como receptores de linfocitos B (es decir, anticuerpos) o receptores de linfocitos T, un complemento de los mismos o porciones de los mismos. Los polinucleótidos diana pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Los polinucleótidos diana pueden ser ADN (por ejemplo, ADN genómico). Los polinucleótidos diana pueden ser ARN (por ejemplo, ARNm). Los polinucleótidos diana pueden ser ADNc generado por retrotranscripción de ARNm. En un modo de realización ejemplar, los polinucleótidos diana son ADN genómico o ADNc que se desnaturaliza por calor para formar dianas monocatenarias.
En algunos modos de realización, los polinucleótidos diana se obtienen de una muestra enriquecida con células inmunitarias. Por ejemplo, los polinucleótidos diana se pueden obtener de una muestra enriquecida con linfocitos T, enriquecida con linfocitos B, enriquecida con linfocitos T y linfocitos B, enriquecida con linfocitos o enriquecida con leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC). En algunos casos, los polinucleótidos diana se obtienen de una muestra enriquecida con una fracción de linfocitos T o linfocitos B. Por ejemplo, la muestra se puede enriquecer con linfocitos T que expresen TCR con a/p. Como otro ejemplo, la muestra se puede enriquecer con linfocitos T que expresen TCR con y/S. Como aún otro ejemplo, la muestra se puede enriquecer con linfocitos B que expresen un determinado isotipo de BCR, o un conjunto de dichos isotipos, tales como IgA, IgG, IgM, IgE o una combinación de los mismos. Como aún otro ejemplo, la muestra se puede enriquecer con linfocitos B que expresen BCR con cadena ligera kappa. Como aún otro ejemplo, la muestra se puede enriquecer con linfocitos B que expresen BCR con cadena ligera lambda. Como aún otro ejemplo, la muestra se puede enriquecer con linfocitos T que expresen TCR con a/p o TCR con y/5, en la que la muestra se obtiene por citometría de flujo. Como aún otro ejemplo, la muestra puede ser una muestra de tejido FFPE que contenga linfocitos infiltrantes. Como aún otro ejemplo, la muestra puede ser una muestra de tejido FFPE, en la que la muestra contenga, o se sospeche que contiene, una o más células tumorales. Los procedimientos para enriquecer la muestra con un tipo de célula inmunitaria específica incluyen, pero no se limitan a, procedimientos que emplean una o más de las siguientes: ultracentrifugación, centrifugación en gradiente FICOLl ™ o citometría de flujo (por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)).
En el presente documento se describen mezclas de reacción que contienen polinucleótidos diana (por ejemplo, polinucleótidos diana que codifican los receptores de linfocitos B o T, un complemento de los mismos o porciones de los mismos), primeros cebadores, productos de extensión del primer cebador (por ejemplo, monocatenarios o hibridados a un polinucleótido diana), segundos cebadores, productos de extensión del segundo cebador (por ejemplo, monocatenarios o hibridados a un polinucleótido diana), adaptadores (por ejemplo, adaptadores bicatenarios, tales como adaptadores para puente) o una combinación de los mismos. En algunos casos, la mezcla de reacción contiene además una ADN polimerasa dependiente de ADN y/o una ADN polimerasa dependiente de ARN y reactivos para la extensión de cebador mediada por polimerasa y dirigida por molde (por ejemplo, cationes divalentes, tales como cationes de magnesio, nucleótidos trifosfato, tampones, sales, etc.). En algunos casos, la ADN polimerasa presenta actividad de desplazamiento de hebra. En algunos casos, la ADN polimerasa presenta actividad exonucleasa. En algunos casos, la ADN polimerasa no presenta o no presenta actividad de desplazamiento de hebra sustancial. En algunos casos, la ADN polimerasa no presenta o no presenta actividad exonucleasa sustancial. En algunos casos, la ADN polimerasa es termoestable. En algunos casos, la mezcla de reacción contiene ADN ligasa. En algunos modos de realización, la ADN polimerasa dependiente de ARN es una telomerasa. En algunos modos de realización, la ADN polimerasa dependiente de ARN carece de actividad exonucleasa 3'-5'. En algunos modos de realización, la ADN polimerasa dependiente de ARN es termoestable.
En algunos modos de realización, la mezcla de reacción contiene una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en la que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno
regiones del gen V, opcionalmente regiones del gen D, opcionalmente regiones del gen C y regiones del gen J del receptor de células inmunitarias (por ejemplo, polinucleótidos diana que codifican las regiones de VJ, VDJ o VJ y VDJ del receptor de células inmunitarias); y una pluralidad de primeros cebadores que tienen regiones [FW]. En algunos modos de realización, la mezcla de reacción contiene una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en la que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen V, opcionalmente regiones del gen D, opcionalmente regiones del gen C y regiones del gen J del receptor de células inmunitarias (por ejemplo, regiones de VJ, VDJ o VJ y VDJ del receptor de células inmunitarias); y una pluralidad de primeros cebadores que tienen regiones de [J] o regiones de [C].
En algunos modos de realización, los primeros cebadores de la mezcla de reacción se hibridan a los polinucleótidos diana de la mezcla de reacción. En algunos modos de realización, la mezcla de reacción contiene una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes hibridados a una pluralidad de productos de extensión del primer cebador (es decir, productos de una reacción de extensión mediada por ADN polimerasa y dirigida por molde). En algunos modos de realización, la mezcla de reacción contiene una pluralidad de polinucleótidos diana que codifican el receptor de células inmunitarias estructuralmente diferentes hibridados a una pluralidad de productos de extensión por ADN polimerasa del primer cebador.
En algunos modos de realización, la mezcla de reacción contiene una pluralidad de polinucleótidos diana monocatenarios, comprendiendo cada uno de los polinucleótidos diana individuales los siguientes de las regiones de 5' a 3': una secuencia de adaptador específica de secuenciador, opcionalmente un código de barras identificador múltiple (MID), un código de barras identificador molecular único (UID), al menos una porción de una región de la región estructural 3 del receptor de células inmunitarias, una región CDR3 del receptor de células inmunitarias, una región de diversidad (D) del receptor de células inmunitarias opcional, una región constante (C) del receptor de células inmunitarias opcional y al menos una porción de una región de J del receptor de células inmunitarias o los complementos de la misma. En algunos casos, una pluralidad de este tipo de polinucleótidos diana monocatenarios son productos de extensión del primer cebador. En algunos casos, una pluralidad de este tipo de polinucleótidos diana monocatenarios son los productos de extensión del primer cebador ligados a un adaptador que comprende un sitio de unión a cebador universal y opcionalmente un código de barras MID.
En algunos modos de realización, la mezcla de reacción contiene una pluralidad de polinucleótidos diana monocatenarios, comprendiendo cada uno de los polinucleótidos diana individuales los siguientes de las regiones de 5' a 3': una secuencia de adaptador específica de secuenciador, opcionalmente un código de barras identificador múltiple (MID), un código de barras identificador molecular único (UID), al menos una porción de una región del gen J del receptor de células inmunitarias, una región de D opcional, una región constante (C) del receptor de células inmunitarias opcional, una región CDR3 del receptor de células inmunitarias y al menos una porción de una región de la región estructural 3 del receptor de células inmunitarias, o los complementos de la misma. En algunos casos, una pluralidad de este tipo de polinucleótidos diana monocatenarios son productos de extensión del primer cebador. En algunos casos, una pluralidad de este tipo de polinucleótidos diana monocatenarios son los productos de extensión del primer cebador ligados a un adaptador que comprende un sitio de unión a cebador universal y opcionalmente un código de barras MID.
En algunos modos de realización, una mezcla de reacción puede contener uno o más de los productos de extensión del primer cebador anteriores (por ejemplo, productos de extensión del primer cebador ligados a adaptador) hibridados a una pluralidad de productos de extensión del segundo cebador. En los casos donde los primeros cebadores se hibridan a una región de la región estructural de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias, los segundos cebadores se pueden configurar para hibridarse a una región del gen J o región del gen C de los productos de extensión del primer cebador. En los casos donde los primeros cebadores se hibridan a un complemento de una región de J o región de C de un polinucleótido diana que codifica el receptor de células inmunitarias, los segundos cebadores se pueden configurar para hibridarse a una región de la región estructural de los productos de extensión del primer cebador.
En el presente documento se describen adaptadores para aplicaciones de secuenciación o amplificación en dirección 3'. La fijación de un adaptador a uno o ambos extremos de un polinucleótido diana, producto de extensión del primer cebador o producto de extensión del segundo cebador, puede fijar un código de barras UID, un código de barras MID, un sitio de unión a cebador universal o un complemento del mismo, o una combinación de los mismos. Los adaptadores que contienen un sitio de unión a cebador universal o un complemento del mismo se pueden denominar adaptadores universales. En algunos modos de realización, los adaptadores se fijan por ligación. En algunos modos de realización, los adaptadores se fijan hibridando un cebador que contiene una secuencia de adaptador (por ejemplo, una secuencia de adaptador que comprende o consiste en un sitio de unión a cebador universal o complemento del mismo) a un polinucleótido diana, producto de extensión del primer cebador o producto de extensión del segundo cebador. En algunos modos de realización, el cebador que contiene una secuencia de adaptador es un segundo cebador que se puede hibridar a un producto de extensión del primer cebador y extender con una polimerasa como se describe en el presente documento. En algunos modos de realización, los primeros adaptadores se ligan a un producto de extensión del primer cebador y los segundos adaptadores se fijan por hibridación de un segundo cebador que contiene un adaptador de este tipo al producto de extensión del primer cebador y que extiende el segundo cebador.
En algunos modos de realización, uno o más adaptadores son adaptadores para puente. Los adaptadores para puente se pueden hibridar a una región [PUENTE] de un producto de extensión del cebador (por ejemplo, un producto de extensión del primer cebador) y ligar a un [5'-Fos] del producto de extensión del primer cebador. Los adaptadores para puente pueden contener una región bicatenaria y una región con protuberancia monocatenaria en 5', en la que la región con protuberancia monocatenaria en 5' sea complementaria a y se hibride en condiciones de hibridación con la región [PUENTE] del producto de extensión del cebador (por ejemplo, un producto de extensión del primer cebador). La región con protuberancia monocatenaria en 5' puede ser de al menos 2 nucleótidos de longitud, de al menos 4 nucleótidos de longitud, de al menos 6 nucleótidos de longitud, de al menos 8 nucleótidos de longitud, de 2 a 10 nucleótidos de longitud o de 2 a 8 nucleótidos de longitud. En algunos modos de realización, la región con protuberancia monocatenaria en 5' comprende o consiste en 6 nucleótidos consecutivos que son complementarios a la región [PUENTE] del producto de extensión del primer cebador. En algunos modos de realización, la región con protuberancia monocatenaria en 5' comprende o consiste en la secuencia AGA TCG.
Los adaptadores para puente pueden contener un código de barras y un sitio de unión a cebador universal como se describe en el presente documento. En algunos casos, el adaptador para puente contiene un código de barras MID. En algunos casos, el adaptador para puente contiene un código de barras MID y un sitio de unión a cebador universal. En algunos casos, el código de barras está codificado en la región bicatenaria del adaptador para puente. En algunos casos, el sitio de unión a cebador universal está codificado en la región bicatenaria del adaptador para puente. En algunos casos, el código de barras (por ejemplo, código de barras MID) y el sitio de unión a cebador universal están codificados en la región bicatenaria del adaptador para puente. En algunos modos de realización, con respecto a la hebra del adaptador para puente que contiene la región con protuberancia monocatenaria en 5', en algunos casos, el sitio de unión a cebador universal puede estar en 3' del código de barras (por ejemplo, código de barras MID).
II. Procedimientos
En el presente documento se describen procedimientos para realizar el enriquecimiento de dianas por extensión del cebador (PETE) con cebadores flanqueantes (FP-) de los polinucleótidos diana de una muestra. En algunos modos de realización, los polinucleótidos diana codifican receptores de células inmunitarias o porciones de los mismos. En dichos modos de realización, los procedimientos se pueden denominar inmuno-PETE. Los procedimientos descritos en el presente documento pueden utilizar una pluralidad de primeros cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias, comprendiendo cada uno una región [FW] en un extremo 3' para su hibridación a una región de la región estructural (por ejemplo, región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3) de un polinucleótido diana que codifica un receptor de células inmunitarias. En dichos modos de realización, la pluralidad de segundos cebadores comprenden cada uno una región de [J] para flanquear la región de interés. De forma alternativa, los procedimientos pueden utilizar una pluralidad de primeros cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias, comprendiendo cada uno una región de [J] en un extremo 3' para su hibridación a una región de J de un polinucleótido diana que codifica un receptor de células inmunitarias. En dichos modos de realización, la pluralidad de segundos cebadores comprenden cada uno una región [FW] de modo que los primer y segundo cebadores flanqueen la región de interés en los polinucleótidos diana. En otro modo de realización, los procedimientos pueden utilizar una pluralidad de primeros cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias, comprendiendo cada uno una región de segmento C en un extremo 3' para su hibridación a una región del gen C de un polinucleótido diana que codifica un receptor de células inmunitarias. En dichos modos de realización, la pluralidad de segundos cebadores pueden comprender cada uno una región del gen [V] de modo que los primer y segundo cebadores flanqueen la región de interés en los polinucleótidos diana.
En algunos modos de realización, el procedimiento incluye: a) proporcionar una mezcla de reacción que contiene: i) una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes como se describe en el presente documento, en el que los polinucleótidos diana individuales codifican regiones del gen V, opcionalmente regiones del gen D, opcionalmente regiones del gen C y regiones del gen J del receptor de células inmunitarias; y, ii) una pluralidad de cebadores específicos para el gen V o cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias (es decir, primeros cebadores) como se describe en el presente documento, en el que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibridan a las regiones del gen V de los polinucleótidos diana o en el que los cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias se hibridan a las regiones del gen C de los polinucleótidos diana; b), extender los cebadores específicos para el gen V o cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias hibridados con una polimerasa para generar cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos o cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias extendidos (es decir, productos de extensión del primer cebador) y, a continuación, retirar los cebadores específicos para el gen V o C del receptor de células inmunitarias no extendidos, si están presentes, generando, de este modo, cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos que contienen al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, y al menos una porción de la región de J del receptor de células inmunitarias o al menos una porción de la región de C del receptor de células
inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, y al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias. En algunos casos, la retirada de cebadores específicos para el gen V o C del receptor de células inmunitarias no extendidos incluye poner en contacto los cebadores específicos para el gen V o C del receptor de células inmunitarias no extendidos con una enzima ADN monocatenario exonucleasa y, de este modo, digerir los cebadores específicos para el gen V o C del receptor de células inmunitarias no extendidos.
En algunos casos, la retirada de cebadores específicos para el gen V o C del receptor de células inmunitarias no extendidos incluye la inmovilización reversible en fase sólida de productos de extensión del primer cebador monocatenarios o polinucleótidos bicatenarios que contienen el polinucleótido diana monocatenario hibridado al producto de extensión del primer cebador monocatenario. En algunos casos, la retirada de cebadores específicos para el gen V o C del receptor de células inmunitarias no extendidos incluye purificación en columna basada en resina (por ejemplo, sílice (por ejemplo, microesferas de sílice)) o en membrana o por lotes de ADN bicatenario a partir de ADN monocatenario o purificación de un tamaño seleccionado de ADN monocatenario o bicatenario de la mezcla de reacción. En algunos casos, la retirada incluye retirar ADN mono- o bicatenario, o una combinación de los mismos, que tiene un tamaño de menos de aproximadamente 100 bases o pares de bases. En algunos casos, la retirada incluye retirar ADN mono- o bicatenario, o una combinación de los mismos, que tiene un tamaño de más de aproximadamente 1000 bases o pares de bases. En algunos casos, la retirada incluye purificar de la muestra productos de extensión del cebador o productos de extensión del cebador que contienen ADN bicatenario, o una combinación de los mismos, que tienen un tamaño de más de aproximadamente 100 bases o pares de bases y menos de aproximadamente 1000 bases o pares de bases. En algunos casos, la retirada retira además ADN genómico o ADN genómico desnaturalizado (por ejemplo, monocatenario) de la muestra. En algunos modos de realización, la retirada retira además ADNc desnaturalizado de la muestra.
En algunos modos de realización, el procedimiento incluye: c) hibridar un primer adaptador universal (por ejemplo, un adaptador para puente que contiene un sitio de unión a cebador universal) a un sitio de hibridación de adaptador de [PUENTE] de los cebadores específicos para el gen V o C del receptor de células inmunitarias extendidos; d) ligar el primer adaptador universal hibridado a los cebadores específicos para el gen V o C del receptor de células inmunitarias extendidos, y, a continuación, retirar los adaptadores no ligados, si están presentes. En algunos casos, la retirada de adaptadores no ligados incluye la inmovilización reversible en fase sólida de productos de extensión del primer cebador monocatenarios ligados a adaptador o polinucleótidos bicatenarios que contienen el polinucleótido diana monocatenario hibridado a dicho producto de extensión del primer cebador monocatenario ligado a adaptador. En algunos casos, la retirada de adaptadores no ligados incluye purificación en columna basada en resina (por ejemplo, sílice (por ejemplo, microesferas de sílice)) o en membrana o por lotes de ADN bicatenario a partir de a Dn monocatenario o purificación de un tamaño seleccionado de ADN mono- o bicatenario de la mezcla de reacción. En algunos casos, la retirada incluye retirar de una mezcla de reacción ADN mono- o bicatenario, o una combinación de los mismos, que tiene un tamaño de menos de aproximadamente 100 bases o pares de bases. En algunos casos, la retirada incluye retirar de una mezcla de reacción ADN mono- o bicatenario, o una combinación de los mismos, que tiene un tamaño de más de aproximadamente 1000 bases o pares de bases. En algunos casos, la retirada incluye purificar de la muestra los productos de extensión del cebador ligados a adaptador o ADN bicatenario que contiene dichos productos de extensión del cebador ligados a adaptador, o una combinación de los mismos, que tengan un tamaño de más de aproximadamente 100 bases o pares de bases y menos de aproximadamente 1000 bases o pares de bases.
En algunos modos de realización, el procedimiento incluye: e) hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias (es decir, segundos cebadores) a las porciones de la región de J de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos (es decir, productos de extensión del primer cebador), en el que los cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen J en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5' o hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias (es decir, segundos cebadores) a las porciones de la región de V de los cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias extendidos (es decir, productos de extensión del primer cebador), en el que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen V en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5'; y, f) extender los cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias hibridados o extender los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias con una polimerasa, formando, de este modo, una pluralidad de productos bicatenarios estructuralmente diferentes que comprenden un cebador específico para el gen J del receptor de células inmunitarias extendido o cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias extendido (es decir, producto de extensión del segundo cebador) hibridado a un cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias extendido (por ejemplo, ligado a adaptador) o cebador específico para el gen C del receptor de células inmunitarias extendido, comprendiendo cada producto bicatenario al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, y al menos una porción de la región de J del receptor de células inmunitarias flanqueada por una secuencia de primer y segundo adaptador universal o al menos una porción de la región de C del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, y al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias flanqueada por una secuencia de primer y segundo adaptador universal.
En algunos modos de realización, la e) hibridación y f) extensión se pueden repetir múltiples veces calentando para desnaturalizar los productos bicatenarios producidos en la extensión de f) (por ejemplo, productos de ADN bicatenario que comprenden productos de extensión del primer cebador (por ejemplo, cebador específico para el gen V o C del receptor de células inmunitarias extendido ligado a adaptador) hibridado a productos de extensión del segundo cebador (por ejemplo, cebador específico para el gen J o V del receptor de células inmunitarias extendido)), enfriando para hibridar segundos cebadores no extendidos a productos de extensión del primer cebador (por ejemplo, productos de extensión del primer cebador ligados a adaptador) y extendiendo los cebadores hibridados. En algunos casos, e) y f) se repiten 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más veces. En algunos casos, e) y f) se repiten de 2 a 15 veces, de 3 a 12 veces, de 5 a 10 veces o de 5 a 15 veces.
Como se describe en el presente documento, después de la extensión de los segundos cebadores hibridados, se proporciona un polinucleótido que contiene al menos una porción de una región de J, una región de D opcional, una región de C opcional y al menos una porción de una región de V, flanqueada por sitios de unión a cebador universal, o un complemento de los mismos. Este polinucleótido se puede amplificar por PCR universal con una mezcla de reacción de amplificación que contiene el polinucleótido, un cebador universal directo y un cebador universal inverso.
Ejemplos
Ejemplo 1: Protocolo experimental: inmuno-PETE usando ADNg de PBMC humanos
Un esquema de un modo de realización ejemplar de inmuno-PETE se ilustra en la FIG. 1.
Se generó una agrupación de cebadores seleccionados de SEQ ID NO: 1-121 (es decir, agrupación de primeros cebadores (mezcla de cebadores de gPE)) y una agrupación de los cebadores seleccionados de SEQ ID NO: 122 204 (es decir, agrupación de segundos cebadores (mezcla de cebadores de PE2)). La concentración de cebadores en cada agrupación de cebadores se ajustó a 100 |jM y las agrupaciones se diluyeron a una concentración de trabajo de 12 j M. Como control, se analizó en una reacción separada un procedimiento para el enriquecimiento de dianas usando un panel previamente sometido a prueba de sondas de ácido nucleico relacionadas con oncología. Se usó ADN genómico de PBMC humanos de entrada a 100 ng por reacción. Las mezclas de reacción se prepararon e incubaron como se representa a continuación, en la tabla 3.
Tabla 3
Mezcla de hibridación de cebadores
Disponer una alícuota de 13 j l de mezcla de hibridación de cebadores en cada tubo de reacción
Añadir agua y muestras a los tubos de reacción y mezclar como se indica anteriormente en la tabla
Colocar en termociclador y ejecutar el programa Hib. y extend. 7-28
Mezcla maestra de polimerasa
En la etapa de mantener a 60 °C, añadir 10 j l de mezcla maestra de polimerasa en cada tubo y mezclar
Ir a ejecutar, editar, omitir etapa y continuar con la ejecución del programa Hib. y extend. 7-28
Añadir exonucleasa 1 a las muestras 1 j l
Ejecutar el programa Exo. 17-28
Realizar limpieza con AMPure en una proporción de 1,4
Mezcla maestra de ligación
Disponer una alícuota de 29 |jl de mezcla maestra de ligación en cada tubo de reacción Añadir 20 j l de producto de extensión gPE y mezclar
Añadir 1 j l de adaptador con CB (código de barras) C7/P7 (25 uM)
Incubar a 25 °C durante 5 minutos
Añadir 50 j l de agua para alcanzar un volumen de 100 j l
Realizar limpieza con AMPure en una proporción de 0,7X
Mezcla maestra de extensión del cebador 2 (PE2)
Disponer una alícuota de 32 j l de mezcla maestra de PE2 en cada tubo de reacción Añadir 18 j l de producto de ligación y mezclar
Colocar en termociclador y ejecutar el programa PE2 durante 15 ciclos
Realizar limpieza con AMPure en una proporción de 1X
Mezcla maestra para PETE CR, 50 ul
Colocar en termociclador y ejecutar el programa PETE CR
Realizar limpieza con AMPure en una proporción de 0,9X
Los protocolos de termociclado se representan en la tabla 4.
Tabla 4:
Programa Hib. y extend. 7-28
98 °C - 2 minutos
80 °C - 0 segundos
60 °C - 20 minutos
60 °C - mantener
65 °C - 2 minutos
80 °C - 10 minutos
4 °C - mantener
Programa Exo. I 7-28
37 °C - 10 minutos
80 °C - 10 minutos
4 °C - mantener
Programa PE2
98 °C - 1 minuto
15 ciclos
98 °C - 10 segundos
80 °C - 20 segundos
64 °C - 20 segundos
72 °C - 30 segundos
4 °C - mantener
Programa PETE CR
98 °C - 1 minuto
24 ciclos
98 °C - 10 segundos
60 °C - 20 segundos
72 °C - 30 segundos
4 °C - mantener
Las reacciones de inmuno-PETE se analizaron por electroforesis en gel de agarosa (FIG. 2). La colección de TCR
(generada con los primeros cebadores (seleccionados de SEQ ID NO: 1-121) y los segundos cebadores (seleccionados de SEQ ID NO: 122-204) y la colección de RH-4 (generada con el panel de oncología de sondas (control)) se diluyeron a una concentración final de 4 nM y se agruparon en una proporción de TCR con respecto a RH-4 de 4:1 para la secuenciación en Illumina. La secuenciación se realizó en el instrumento Illumina MiSeq usando secuenciación de ciclo a 2x250 de extremos emparejados. Se generaron y analizaron más de 15 millones de lecturas de pases filtrados.
Resultados:
Los resultados de la colección de TCR y la colección de RH-4 se resumen en la tabla 5.
Tabla 5: Resumen de secuenciación
Lecturas totales Lecturas PF % de lecturas identificadas (PF) VC Min. Máx.
15805692 |15271036 I 85,4589 I 0.8277 | 17.7223 | 67.7366 |
Se analizó además una submuestra aleatoria de 150.000 secuencias, correspondiente a 50x el número esperado de secuencias de V(D)J diferentes en la muestra genómica de entrada. Esta submuestra de datos de secuenciación se desduplicó. Los datos desduplicados (12K) y desdesduplicados (150K) se procesaron para identificar polinucleótidos que contenían regiones de V(D)J reordenados. Los resultados se resumen en la tabla 6.
Tabla 6: Resultado de alineación de TCR
De las 1081 secuencias asignadas en la muestra de 12k a 99 clones, un 100 % tiene el mismo clon asignado cuando estaban presentes en el conjunto de 150k. Había, en total, 108 clones asignados a ambos conjuntos, solapándose 99 clones entre los dos conjuntos. Se representa un diagrama de Venn del solapamiento entre el conjunto de 12k y el conjunto de 150k en la FIG. 3.
Un análisis de los clones de TCR mejor clasificados de la muestra antes y después de la desduplicación mostró que la clasificación puede cambiar como resultado de la desduplicación, como se muestra en la tabla 7.
Tabla 7: Clasificación de los 10 mejores clones para los isotipos TCRop y TCRyS
TRA - los 10 mejores - No desduplicado TRA - los 10 mejores - Desduplicado
TRB - los 10 meores - No desdu licado TRB - los 10 meores - Desdu licado
TRG - los 10 mejores - No desduplicado TRG - los 10 mejores - Desduplicado
Ejemplo 2: Protocolo experimental: inmuno-PETE basado en ARN o arnm
Se proporciona una modificación del ensayo de inmuno-PETE (por ejemplo, como se expone en el ejemplo 1) para el material de partida que comprende ARN total o ARNm purificado. Se puede obtener ARN total o ARNm purificado de sangre completa, PBMC, linfocitos clasificados, cultivo de linfocitos, tejido tumoral en fresco o congelado en fresco, muestras de tejido FFPE y similares. Un esquema que explica un procedimiento ejemplar para inmuno-PETE basado en ARN o ARNm se expone en la FIG. 4. En resumen, se introduce una etapa de síntesis de ADNc antes del procedimiento inmuno-PETE esencialmente expuesto en el ejemplo 1.
Aquí, se añade un cebador oligo-dT, conjunto de cebadores aleatorios (por ejemplo, hexámeros, heptámeros, octámeros o nanómeros, etc.) o uno o más cebadores para el segmento C (por ejemplo, que comprenden uno o
más cebadores para el segmento C seleccionados de SEQ ID NO: 205-213; véase la tabla 8) a una alícuota de ARN total o ARNm purificado para formar una mezcla de reacción. Se añade una retrotranscriptasa (por ejemplo, SuperScript III™) y componentes de amplificación (tales como tampones, dNTP y sales (por ejemplo, MgCh)) a la mezcla de reacción para iniciar la síntesis de la primera y la segunda hebra para formar moléculas de ADNc bicatenario. Las moléculas de ADNc se pueden purificar, por ejemplo, usando microesferas SPRI, y cuantificar para su uso posterior. A continuación, se usa el ADNc purificado como molde de partida para el protocolo de inmuno-PETE expuesto en el ejemplo 1. Por ejemplo, se usa ADNc purificado como molde de partida y se usa un conjunto de sondas específicas para el gen V (por ejemplo, que comprende SEQ ID NO: 1-121) en la primera ronda de extensión (agrupación de cebadores de gPE), seguido de la segunda ronda de extensión usando el conjunto de sondas para el segmento C (agrupación de cebadores de PE2, por ejemplo, que comprende SEQ ID NO: 205 213). De forma alternativa, la primera ronda de extensión puede incluir el uso de cebadores de gPE para el segmento C, seguido de una segunda ronda de extensión usando la pluralidad de cebadores de PE2 específicos para el gen V (por ejemplo, que comprenden SEQ ID NO: 122-204).
Se logran varias ventajas a través de la aplicación de una etapa de síntesis de ADNc al ensayo de inmuno-PETE (por ejemplo, como se describe en el ejemplo 1) que incluyen (1) sensibilidad del ensayo mejorada (existen más copias de ARNm del receptor inmunitario en las células inmunitarias en comparación con la única copia del locus V(D)J reordenado somáticamente en el ADN genómico); (2) disminución del sesgo de amplificación (uso de menos cebadores/sondas para el segmento C en comparación con los cebadores/sondas para el segmento J en el protocolo de inmuno-PETE del ejemplo 1); (3) identificación de isotipos del receptor inmunitario (las amplificaciones resultantes del ensayo de inmuno-PETE basado en ARN o ARNm abarcan el dominio del receptor inmunitario V(D)J. Para TCR, existen genes constantes en a-1, p-1 y p-2. Para las inmunoglobulinas, los isotipos distinguibles son k y A para las cadenas ligeras e IgA, IgD, IgG e IgM para las cadenas pesadas). Como tal, el ensayo de inmuno-PETE basado en ARN total y/o ARNm es ventajoso para la secuenciación de alto rendimiento y/u obtención del perfil del repertorio inmunitario.
Tabla 8
Ejemplo 3: Inmuno-PETE y panel de dianas de oncología combinados
En aplicaciones de inmunooncología, sería ventajoso obtener el perfil tanto de las mutaciones somáticas en un genoma de células tumorales como en el repertorio de clonotipos de linfocitos T infiltrantes de tumor, usando una muestra de tejido tumoral (por ejemplo, biopsia tumoral o tejido tumoral FFPE). No es práctico diseñar y optimizar un ensayo de este tipo por el diseño repetido de múltiples cebadores de PCR múltiple opuestos (directos e inversos). Sin embargo, inmuno-PETE minimiza las interacciones sonda-sonda (o cebador-cebador) usando un algoritmo de diseño que diseña por separado conjuntos de sondas de gPE y conjuntos de sondas de PE2 para minimizar los dímeros de cebadores. El algoritmo de diseño también puede colocar cebadores en hebras /- de ADN genómico de modo que los cebadores no se apunten entre sí en la misma etapa de reacción, para evitar la producción de una diana más corta. Otro rasgo característico del ensayo de inmuno-PETE es que cada una de las dos etapas de hibridación y extensión de las sondas del ensayo se produce en reacciones separadas (distintas) después de la retirada de las sondas residuales de la etapa previa. Aquí, se demostró que el ensayo de inmuno-PETE eficazmente selecciona como diana genes del cáncer y receptores de linfocitos T en un ensayo combinado, sin optimización anterior del conjunto de sondas combinadas, donde no existía solapamiento o coordenadas de sonda entre las dianas de oncología y de los genes del TCR.
Diseño experimental:
Para demostrar la utilidad de enriquecer las dianas tanto en el genoma de células tumorales como en las dianas de TCR reordenadas somáticamente de las células inmunitarias, se combinó un panel de oncología (panel distintivo o "dis") que contenía 181 regiones diana de 21 genes del cáncer con un panel de sondas para el gen V (n=60) y J (n=13) que seleccionan como diana TCRB. Específicamente, se usaron SEQ ID NO: 1-60 como sondas para el gen V y se usaron SEQ ID NO: 188-200 como sondas para el gen J. Cada uno de los paneles se sometió a prueba independientemente, pero no se realizaron intentos para optimizar el conjunto de sondas combinadas, todas las sondas se usaron en concentraciones equimolares.
Protocolo:
Se usó ADN genómico humano (Promega, n.° de cat. G1471) como entrada a 100 ng o 450 ng por reacción. Esta muestra de ADN es una mezcla de múltiples donantes; no se espera que contenga mutaciones somáticas pertinentes para oncología y, suponiendo que se ha aislado de PBMC, contiene ADN genómico de linfocitos T. Se espera que el repertorio de TCRB sea muy diverso debido a la naturaleza agrupada de la muestra de ADN. Las mezclas de reacción se prepararon e incubaron como se expone en la tabla 9.
Tabla 9
Marca múltiple de Qiagen y Phusion HS2 MM (6 1 muestras)
Mezclar y colocar en termociclador
Ejecutar el programa <gPE Taq - Hib. y extend.>
Retirar los tubos del termociclador
Añadir 1 ul de exonucleasa I a la muestra y mezclar
Colocar en termociclador
Ejecutar el programa <Exonucleasa y destrucción por calor>
Retirar los tubos del termociclador
Preparar la mezcla maestra de ligación
Mezcla maestra de ligación (6 1 muestras)
Añadir 25 ul a la muestra y mezclar
Añadir 1 ul de adaptador con código de barras a cada muestra
Colocar en termociclador
Ejecutar el programa <Ligación>
Preparar el reactivo de KapaPure para la limpieza de ligación
Reactivo de KapaPure para la limpieza de ligación (6 1 muestras)
Retirar los tubos del termociclador
Preparar la mezcla de reactivos para PE2
Mezcla de reactivos para PE2 (6 1 muestras)
Colocar en termociclador
Ejecutar el programa <PE2_PETE-CR>
gPE Taq - Hib. y extend. SOP
Exonucleasa y destrucción por calor
PE2 PETE-CR SubCyc 55-65
Etapa mperat iempo
aturalizació 98 °C 1 min
emp. interm 80 °C 0 s
Hibridación (aumento 55 °C 30 s
ibridación b 55 °C 30 s
ibridación 65 °C 30 s
Extensión 72 °C 30 s
snaturaliza 98 °C 10 s
Hibridació 64 °C 15 s
Extensión 72 °C 30 s 
Detener 4 °C 
ntener (M)
ciclos para
Resultados:
Después de completar el protocolo de inmuno-PETE expuesto en la tabla 9, se analizó una alícuota de los productos de reacción del ADNg de entrada a 100 ng y 450 ng por electroforesis en gel de agarosa (FIG. 5). En la FIG. 5, los carriles 1-8 se corresponden como sigue, carril 1: escalera de PM; carriles 2,3: solo panel de oncología, ADNg a 100 ng; carriles 5, 6: solo panel de oncología, ADNg a 450 ng; carril 4: panel de oncología TCRB, ADNg a 100 ng; carril 7: panel de oncología TCRB, ADNg a 450 ng; carril 8: sin molde (SM), control negativo.
Las colecciones enriquecidas se secuenciaron usando el secuenciador IMumina MiSeq y el kit de secuenciación de Illumina MiSeq v3 usando 2x300 ciclos según los protocolos del fabricante.
Análisis de secuenciación:
El análisis de las dianas de oncología en el ensayo de panel combinado se proporciona en la tabla 10. Se evaluaron un total de 543.000 pares de lectura para cada uno de los ADNg de entrada a 100 ng y 450 ng. Para la muestra de ADNg a 450 ng, se identificaron un total de 153.138 pares únicos. Por comparación, se identificaron 118.098 pares únicos en la muestra de ADNg a 100 ng. Adicionalmente, el análisis de las dianas de TCRB en el ensayo de panel combinado para cada uno de los ADNg de entrada a 100 ng o 450 ng se resume en la tabla 11.
Tabla 10
Tabla 11
Aquí, los datos demuestran el potencial de los ensayos de inmuno-PETE para secuenciar tanto dianas de oncología en el genoma de células tumorales como en el repertorio de clonotipos de linfocitos T infiltrantes de tumor. El ensayo combinado es una reacción en un único tubo que requiere tan solo entrada de ADN a 100 ng, lo que lo hace, por tanto, adecuado para el análisis de biopsias de tejido tumoral o muestras de tejido FFPE en aplicaciones de inmunooncología.
Los ensayos de inmunosecuenciación compatibles con tipos de muestras clínicamente pertinentes, tales como población de linfocitos T enriquecida o tejido incluido en parafina fijado con formol (FFPE) proporcionarían una valiosa utilidad clínica.
El ejemplo 4 demuestra inmuno-PETE, como se describe en el presente documento, en el contexto de linfocitos T clasificados por FACS; mientras que el ejemplo 5 demuestra inmuno-PETE en el contexto de células de tejido FFPE.
Ejemplo 4: inmuno-PETE usando linfocitos T humanos clasificados por FACS positivos para antígeno Diseño experimental:
Las secuencias de aminoácidos de CDR3 se determinaron para las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T. Aquí, se realizó el inmuno-PETE esencialmente como se expone en el ejemplo 1 con ADN extraído de linfocitos T humanos fijados con formol que se clasificaron por FACS para el antígeno M1 (usando entrada de ADN a 113 ng, 57 ng u 11 ng; véanse la tabla 12 y la FIG. 6).
Resultados:
Se determinó el clonotipado de las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T, véanse la tabla 12 y la FIG. 6. Tabla 12
Tipo de muestra ng Recuento de linfocitos T *
113 18.880
Linfocitos T específicos para M1 clasificados por FACS 57 9.440
11 1.888
27 443
Linfocitos T específicos para M1 90 % en FFPE, 10 % en tumor
6 100
* 1 molde de TCR por 6 pg de ADN
Conclusión:
Este ejemplo demostró la capacidad de predecir las secuencias de CDR3 para alfa y beta del receptor de linfocitos T con cantidades de entrada bajas en linfocitos T clasificados por FACS. La población de linfocitos T fue altamente clonal, como se esperaba, y las secuencias de CDR3 observadas con mayor frecuencia fueron las mismas para todas las cantidades de entrada, tanto para las cadenas alfa como beta.
Aquí, el ensayo de inmuno-PETE utilizó como máximo entrada de ADN a 113 ng y tan solo entrada de ADN a 11 ng, lo que lo hace, por tanto, muy adecuado para el análisis de biopsias de tejido tumoral o muestras de tejido FFPE en aplicaciones de inmunooncología.
-Diseño experimental:
Como en el ejemplo 4, las secuencias de aminoácidos de CDR3 se determinaron para las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T. Aquí, los linfocitos T humanos que se clasificaron por FACS para el antígeno M1 se mezclaron con células epiteliales basales alveolares humanas de adenocarcinoma (A549) en una proporción de 1:9. Las células mezcladas se sedimentaron y fijaron con formol e incluyeron en parafina (FFPE). El ADN se extrajo del sedimento de células de FFPE seccionado, y se realizó el inmuno-PETE esencialmente de acuerdo con el ejemplo 1 con entrada de ADN a 6 ng o bien a 27 ng. La cantidad de entrada de ADN se determinó con qPCR (kit de cuantificación y CC de ADN genómico humano KAPA, número de catálogo 07960590001, Roche Diagnostics Corp., IN, EE. UU.).
Resultados:
Se determinó el clonotipado de las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T, véanse la tabla 12 y la FIG. 7.
Conclusión:
Este ejemplo demuestra la capacidad de predecir las secuencias de CDR3 para alfa y beta del receptor de linfocitos T en cantidades de entrada bajas en células de tejido FFPE mezcladas con células tumorales (proporción de 1:9). La población de linfocitos T fue altamente clonal, como se esperaba, y las secuencias de CDR3 observadas con mayor frecuencia fueron las mismas para ambas cantidades de entrada, tanto para las cadenas alfa como beta.
Aquí, el ensayo de inmuno-PETE utilizó entrada de ADN a menos de 30 ng, lo que lo hace muy adecuado para el análisis de biopsias de tejido tumoral o muestras de tejido FFPE en aplicaciones de inmunooncología.
Claims (17)
1. Un procedimiento para enriquecer, a partir de una muestra, una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden regiones del gen V, J y, opcionalmente, C o D, del receptor de células inmunitarias, comprendiendo el procedimiento:
a) proporcionar una mezcla de reacción, en la que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibridan a las regiones del gen V de los polinucleótidos diana;
b) extender los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias hibridados con una polimerasa, y, a continuación, retirar los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias no extendidos, si están presentes, en el que los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos comprenden al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, al menos una porción de la región de C del receptor de células inmunitarias y al menos una porción de la región de J del receptor de células inmunitarias;
c) hibridar un primer adaptador universal al sitio de hibridación de adaptador de [PUENTE] de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos; en el que dicho adaptador universal es un adaptador bicatenario, que comprende: una región con protuberancia monocatenaria en 5' que se puede hibridar al sitio de hibridación de adaptador de PUENTE de dichos cebadores extendidos;
d) ligar los primeros adaptadores universales hibridados a los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, y, a continuación, retirar los adaptadores no ligados, si están presentes;
e) hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias a las porciones de la región de J de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, en el que los cebadores específicos para el gen J del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen J en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5' o hibridar una pluralidad de cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias a las porciones de la región de C de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos, en el que los cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias comprenden una región de hibridación del gen C en 3' y una región de segundo adaptador universal en 5'; y
f) extender los cebadores específicos para el gen J o cebadores específicos para el gen C del receptor de células inmunitarias hibridados con una polimerasa, formando, de este modo, una pluralidad de productos bicatenarios estructuralmente diferentes, comprendiendo cada uno al menos una porción de la región de V del receptor de células inmunitarias, opcionalmente la región de D del receptor de células inmunitarias, y al menos una porción de la región de J o región de C del receptor de células inmunitarias flanqueada por una secuencia de primer y segundo adaptador universal,
comprendiendo dicha mezcla de reacción
i) una pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen V, opcionalmente regiones del gen D, opcionalmente regiones del gen C y regiones del gen J del receptor de células inmunitarias; y
ii) una pluralidad de cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias estructuralmente distintos, en el que la pluralidad comprende al menos 10 cebadores estructuralmente distintos que tienen las siguientes regiones de 5' a 3':
[5'-Fos], [PUENTE], [CÓDIGO DE BARRAS] y [FW], en las que:
[5'-Fos] comprende un fosfato en 5';
[PUENTE] comprende un sitio de hibridación de adaptador de 2-8 nucleótidos de longitud;
[CÓDIGO DE BARRAS] comprende una región de código de barras de al menos 6 nucleótidos de longitud, en la que cada nucleótido de la región de código de barras se selecciona independientemente del grupo que consiste en N y W; y
[FW] de cada cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias comprende una región estructuralmente distinta que se hibrida específicamente a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de células inmunitarias.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que e) y f) se repiten de 2 a 15 veces calentando para desnaturalizar los productos bicatenarios, enfriando para hibridar cebadores específicos para el gen J o C del
receptor de células inmunitarias no extendidos a las porciones de la región de J de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos o las porciones de la región de C de los cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias extendidos y extendiendo los cebadores hibridados.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la retirada de cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias no extendidos comprende digerir por digestión con ADN monocatenario exonucleasa.
4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el procedimiento comprende además amplificar productos bicatenarios que comprenden primer y segundo adaptadores universales por PCR universal.
5. El procedimiento de las reivindicaciones 2-4, en el que el procedimiento comprende además determinar un isotipo o clonotipo de al menos uno de la pluralidad de productos bicatenarios estructuralmente diferentes o productos bicatenarios amplificados.
6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el [CÓDIGO DE BARRAS] comprende una región de código de barras de 6 a 16 nucleótidos de longitud.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la [FW] de cada cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibrida específicamente a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de linfocitos T.
8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la [FW] de cada cebador específico para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibrida específicamente a una región de la región estructural 1, región estructural 2 o región estructural 3 de un gen V del receptor de linfocitos B.
9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la pluralidad comprende al menos 10 de los cebadores expuestos en SEQ ID No: 1-121.
10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el [PUENTE] consiste en 6 nucleótidos consecutivos, preferentemente de la secuencia CGA TCT.
11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el [CÓDIGO DE BARRAS] consiste en trece nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo que consiste en N y W, preferentemente de la secuencia WNN NNN WNN NNN W.
12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la composición comprende al menos 50, preferentemente todos los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 1-121.
13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cada uno de la pluralidad de cebadores específicos para el gen V del receptor de células inmunitarias se hibrida a uno de la pluralidad de polinucleótidos diana estructuralmente diferentes.
14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que una porción de los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen D del receptor de células inmunitarias y una porción de los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad no comprenden regiones del gen D del receptor de células inmunitarias.
15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen D del receptor de células inmunitarias.
16. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en el que una porción de los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen C del receptor de células inmunitarias y una porción de los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad no comprenden regiones del gen C del receptor de células inmunitarias.
17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los polinucleótidos diana individuales de la pluralidad comprenden cada uno regiones del gen C del receptor de células inmunitarias.
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|---|---|---|---|---|
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| EP4050113A1 (en) * | 2017-01-17 | 2022-08-31 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for immune repertoire sequencing |
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| US20220073983A1 (en) * | 2018-07-18 | 2022-03-10 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for immune repertoire sequencing |
| WO2020036926A1 (en) * | 2018-08-17 | 2020-02-20 | Cellecta, Inc. | Multiplex preparation of barcoded gene specific dna fragments |
| CN109797437A (zh) * | 2019-01-18 | 2019-05-24 | 北京爱普益生物科技有限公司 | 一种检测多个样品时测序文库的构建方法及其应用 |
| CA3145114A1 (en) * | 2019-08-16 | 2021-02-25 | Chris Raymond | Targeted hybrid capture methods for determination of t cell repertoires |
| EP4031679A1 (en) | 2019-09-20 | 2022-07-27 | F. Hoffmann-La Roche AG | Immune repertoire profiling by primer extension target enrichment |
| EP4172357B1 (en) * | 2020-06-24 | 2024-05-15 | Claret Bioscience, LLC | Methods and compositions for analyzing nucleic acid |
| CN117098854A (zh) | 2021-03-26 | 2023-11-21 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 杂交缓冲液配制品 |
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| WO2024081858A1 (en) * | 2022-10-13 | 2024-04-18 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Kras/tp53 neoantigen specific t cell receptors |
Family Cites Families (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| CA2122450C (en) | 1991-11-01 | 2004-07-13 | Charles Phillip Morris | Solid phase amplification process |
| US5422252A (en) | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| US5648211A (en) | 1994-04-18 | 1997-07-15 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification using thermophilic enzymes |
| DE60027040T2 (de) | 1999-10-29 | 2006-11-23 | Stratagene California, La Jolla | Zusammensetzungen und methoden zur verwendung von dna polymerasen |
| WO2004027054A1 (en) | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Prokaria Ehf. | Thermostable rna ligase from thermus phage |
| US20050123956A1 (en) | 2003-09-25 | 2005-06-09 | Affymetrix, Inc. | Methods for modifying DNA for microarray analysis |
| US20070020640A1 (en) | 2005-07-21 | 2007-01-25 | Mccloskey Megan L | Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis |
| DE102006020885A1 (de) | 2006-05-05 | 2007-11-08 | Qiagen Gmbh | Einführung von Sequenzelementen in Nukleinsäuren |
| EP2057181B1 (en) | 2006-08-30 | 2012-02-08 | Bioventures, Inc. | Methods and substances for isolation and detection of small polynucleotides |
| US20120077684A1 (en) | 2007-12-26 | 2012-03-29 | O'hara Shawn Mark | Methods and Compositions Including Diagnostic Kits For The Detection In Samples Of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus |
| US20100120097A1 (en) | 2008-05-30 | 2010-05-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| US8586310B2 (en) | 2008-09-05 | 2013-11-19 | Washington University | Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction |
| US20100323348A1 (en) | 2009-01-31 | 2010-12-23 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods and Compositions for Using Error-Detecting and/or Error-Correcting Barcodes in Nucleic Acid Amplification Process |
| US20120058902A1 (en) * | 2009-06-25 | 2012-03-08 | Livingston Robert J | Method of measuring adaptive immunity |
| CA2765949C (en) | 2009-06-25 | 2016-03-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of measuring adaptive immunity |
| EP2496705B1 (en) | 2009-11-05 | 2018-01-03 | Becton Dickinson and Company | Sequence-specific methods for homogenous, real-time detection of lamp products |
| CN110878345A (zh) | 2010-09-21 | 2020-03-13 | 安捷伦科技有限公司 | 通过分子计数提高等位基因调用的置信度 |
| GB2497912B (en) | 2010-10-08 | 2014-06-04 | Harvard College | High-throughput single cell barcoding |
| WO2012048340A2 (en) * | 2010-10-08 | 2012-04-12 | President And Fellows Of Harvard College | High-throughput immune sequencing |
| ES2683037T3 (es) * | 2011-12-09 | 2018-09-24 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Diagnóstico de tumores malignos linfoides y detección de enfermedad residual mínima |
| SG11201404243WA (en) | 2012-01-26 | 2014-08-28 | Nugen Technologies Inc | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation |
| US9487828B2 (en) | 2012-05-10 | 2016-11-08 | The General Hospital Corporation | Methods for determining a nucleotide sequence contiguous to a known target nucleotide sequence |
| AU2013267609C1 (en) | 2012-05-31 | 2019-01-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for accurate sequencing of DNA |
| WO2014110272A1 (en) | 2013-01-09 | 2014-07-17 | The Penn State Research Foundation | Low sequence bias single-stranded dna ligation |
| CA2902207A1 (en) | 2013-02-21 | 2014-08-28 | Toma Biosciences, Inc. | Methods, compositions, and kits for nucleic acid analysis |
| SG11201506991VA (en) * | 2013-03-15 | 2015-10-29 | Adaptive Biotechnologies Corp | Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set |
| US10087481B2 (en) | 2013-03-19 | 2018-10-02 | New England Biolabs, Inc. | Enrichment of target sequences |
| CN105849264B (zh) | 2013-11-13 | 2019-09-27 | 纽亘技术公司 | 用于鉴别重复测序读数的组合物和方法 |
| EP4219744A3 (en) | 2014-01-27 | 2023-08-30 | The General Hospital Corporation | Methods of preparing nucleic acids for sequencing |
| WO2015148219A1 (en) | 2014-03-28 | 2015-10-01 | Clarient Diagnostic Services, Inc. | Accurate detection of rare genetic variants in next generation sequencing |
| CA2957633A1 (en) | 2014-08-06 | 2016-02-11 | Nugen Technologies, Inc. | Digital measurements from targeted sequencing |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| US10760120B2 (en) | 2015-01-23 | 2020-09-01 | Qiagen Sciences, Llc | High multiplex PCR with molecular barcoding |
| EP3274470B1 (en) | 2015-03-25 | 2023-06-21 | Angle Europe Limited | Solid phase nucleic acid target capture and replication using strand displacing polymerases |
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| WO2017096394A1 (en) | 2015-12-04 | 2017-06-08 | Color Genomics, Inc. | High-efficiency hybrid capture compositions, and methods |
-
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