ES2897823T3 - Poli(N)polimerasa inmovilizada - Google Patents

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Abstract

Poli(N)polimerasa caracterizada por que la Poli(N)polimerasa es una Poli(N)polimerasa bacteriana e inmovilizada sobre un soporte sólido mediante unión covalente, en la que la Poli(N)polimerasa se selecciona del grupo que consiste en poli(A)polimerasa, poli(U)polimerasa, poli(G)polimerasa y poli(C)polimerasa, en la que la Poli(N)polimerasa se obtiene mediante un procedimiento que comprende hacer reaccionar un grupo funcional de un residuo aminoacídico de la Poli(N)polimerasa con un soporte sólido activado químicamente de modo que se forme un enlace covalente y en la que el grupo funcional se selecciona de aminas primarias en el extremo N de cada cadena polipeptídica y en la cadena lateral de lisina, grupos a-carboxilo en el extremo C, grupos β-carboxilo y grupos γ-carboxilo de ácido aspártico y glutámico, y grupos sulfhidrilo o tiol de cisteínas.

Description

DESCRIPCIÓN
Poli(N)polimerasa inmovilizada
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una Poli(N)polimerasa (PNP) como se define en las reivindicaciones que está inmovilizada, a procedimientos para producir dicha PNP y a usos de la misma. Se divulga además un reactor enzimático que comprende la p Np para producir moléculas de ácido ribonucleico polinucleotidilado (poli(N)ARN) que son útiles en genoterapia, inmunoterapia, proteinoterapia de reposición y/o vacunación. Además, la presente invención se refiere a un kit que comprende la PNP.
Antecedentes de la invención
La genoterapia y la vacunación genética pertenecen a los procedimientos más prometedores y de rápido desarrollo de la medicina moderna. Pueden proporcionar opciones muy específicas e individuales para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades. En particular, las enfermedades genéticas hereditarias, pero también las enfermedades autoinmunitarias, las enfermedades cancerosas o relacionadas con tumores, así como las enfermedades inflamatorias, pueden ser objeto de dichos enfoques de tratamiento. Además, se prevé evitar la aparición (temprana) de dichas enfermedades mediante estos enfoques.
Las moléculas terapéuticas de ácido ribonucleico (ARN) representan una clase prometedora de fármacos. Los tratamientos basados en ARN incluyen moléculas mensajeras (ARNm) que codifican antígenos para su uso como vacunas (Fotin-Mleczek et al., 2012, J. Gene Med. 14(6): 428-439). Además, se prevé usar moléculas de ARN para tratamientos de remplazo, por ejemplo, proporcionando proteínas ausentes, tales como factores de crecimiento o enzimas a los pacientes (Kariko et al., 2012, Mol. Ther. 20(5): 948-953; Kormann et al., 2012, Nat. Biotechnol. 29(2): 154-157). Además, el uso terapéutico de moléculas de ARN inmunoestimulantes no codificantes (Heidenreich et al., Int J Cancer. 21 de diciembre de 2014. doi: 10.1002/ijc.29402.) y otros ARN no codificantes como tales como microARN y ARN no codificantes largos se tienen en cuenta (Esteller, 2011, Nat. Rev. Genet. 1512(12): 861-74).
Los tratamientos basados en ARN presentan algunas propiedades superiores sobre la transfección de células con ADN. Como se sabe en general, la transfección de moléculas de ADN puede dar lugar a problemas importantes, tales como el riesgo de que el ADN se integre en el genoma del huésped, lo que puede influir en la expresión de los genes del huésped y posiblemente desencadenar la expresión de un oncogén o la destrucción de un gen oncoinhibidor. Además, un gen (y, por tanto, la proteína codificada) que es esencial para el huésped, tal como un gen implicado en la regulación del crecimiento celular, también se puede inactivar mediante la integración del ADN exógeno en la región codificante del gen respectivo. Por tanto, existen varios riesgos asociados con la aplicación de ADN a un paciente. Estos riesgos no se producen si se usa ARN, en particular ARNm, en lugar de ADN.
Otra ventaja de usar ARN en lugar de ADN es que no se tiene que administrar ningún elemento promotor derivado de virus in vivo y no se puede producir integración en el genoma. Además, no hay necesidad de que el ARN supere la barrera al núcleo. El uso de ARN en lugar de ADN para genoterapia o vacunación genética minimiza o incluso evita el riesgo de integración genómica no deseada y generación de anticuerpos anti-ADN. Sin embargo, el ARN es una especie molecular bastante inestable que se puede degradar fácilmente por las RNasas ubicuas después de la administración. In vivo, la degradación del ARN influye en la semivida del ARN y, por tanto, es un mecanismo para regular la expresión génica eucariota (Friedel et al., 2009, Nucleic Acid Research, 1-12). Cada ARNm natural tiene su semivida individual dependiendo del gen del que deriva el ARNm. Por un lado, los ARN inestables son importantes para lograr la expresión génica transitoria en distintos puntos en el tiempo, mientras que los ARN de larga duración pueden estar asociados con la acumulación de proteínas distintas o la expresión continua de genes.
Para genoterapia y vacunación genética, se desea un ARN estable. Esto se debe, por un lado, al hecho de que el producto codificado por la secuencia de ARN se acumulará in vivo. Por otro lado, el ARN debe mantener su integridad estructural y funcional cuando se prepara para una forma farmacéutica adecuada, en el transcurso de su almacenamiento y cuando se administra. Esto también es decisivo para la autorización de una especialidad farmacéutica.
Se ha informado de que el contenido de G/C de las moléculas de ácido nucleico puede influir en su estabilidad. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico que comprenden una cantidad incrementada de residuos de guanina (G) y/o citosina (C) pueden ser funcionalmente más estables que las moléculas de ácido nucleico que contienen una gran cantidad de nucleótidos de adenina (A) y timina (T) o uracilo (U). En este contexto, el documento WO 02/098443 proporciona una composición farmacéutica que contiene un ARNm que se estabiliza mediante modificaciones de secuencia en la región traducida. Dicha modificación de secuencia se aprovecha de la degeneración del código genético. En consecuencia, los codones que contienen una combinación menos favorable de nucleótidos (menos favorable en términos de estabilidad del ARN) se pueden sustituir por codones alternativos sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada. Este procedimiento de estabilización de ARN está limitado por las disposiciones de la secuencia de nucleótidos específica de cada molécula de ARN individual que no puede salir del espacio de la secuencia de aminoácidos deseada. Además, ese enfoque está restringido a regiones codificantes del ARN.
Como una opción alternativa para la estabilización del ARNm, se ha descubierto que las moléculas de ARNm eucariotas naturales contienen elementos estabilizadores característicos. Por ejemplo, pueden comprender las denominadas regiones no traducidas (UTR) en su extremo 5' (UTR 5') y/o en su extremo 3' (UTR 3'), así como otros rasgos característicos estructurales, tales como una estructura de caperuza 5' o una cola de poli(adenilato) 3' (también indicada cola poli(A) o secuencia de poli(A)). Tanto la UTR 5' como la UTR 3' se transcriben típicamente a partir del ADN genómico y son, por tanto, un elemento del ARNm prematuro. Los rasgos estructurales característicos del ARNm maduro, tal como la caperuza 5' y la cola de poli(A) 3', se añaden normalmente al ARNm transcrito (prematuro) durante el procesamiento del ARNm.
Una cola de poli(A) 3' es típicamente una secuencia monótona de nucleótidos de adenina, que se añade enzimáticamente mediante poli(A)polimerasas (PAP) al extremo 3' del ARNm naciente. La secuencia de poli(A) se añade al extremo 3' de las moléculas de ARN mediante la maquinaria de escisión/poliadenilación ubicua. Después de la escisión, la mayoría de los pre-ARNm, con la excepción de los transcritos de histona dependientes de la replicación, adquieren una cola poliadenilada. En este contexto, el procesamiento del extremo 3' es un proceso cotranscripcional nuclear que promueve el transporte de ARNm desde el núcleo al citoplasma y afecta la estabilidad y la traducción de los ARNm.
La formación de este extremo 3' se produce en una reacción de dos etapas dirigida por la maquinaria de escisión/poliadenilación y depende de la presencia de dos elementos de secuencia en los precursores de ARNm (pre-ARNm); un hexanucleótido AAUAAA (señal de poliadenilación) altamente conservado y una secuencia en dirección 3' rica en G/U. En una primera etapa, los pre-ARNm se escinden entre estos dos elementos. En una segunda etapa, estrechamente acoplada a la primera etapa, el extremo 3' recién formado se prolonga mediante la adición de una secuencia de poli(A) que consiste en 200-250 adenilatos que afecta posteriormente a todos los aspectos del metabolismo del ARNm, incluyendo la exportación, estabilidad y traducción del ARNm (Dominski y Marzluff, 2007, Gene 396(2): 373-90). Las estructuras de caperuza 5' también se pueden introducir en ARN transcrito in vitro (Pascolo S., 2006, Methods Mol Med., 127:23-40).
Típicamente, la cola de poli(A) de un ARNm de mamífero contiene aproximadamente 250 nucleótidos de adenina. Se descubrió que la longitud de tal cola de poli(A) es un elemento potencialmente crucial para la estabilidad del ARNm individual. En este contexto, Holtkamp et al. informó de que una cola de poli(A) que consiste en 120 nucleótidos daba como resultado una estabilidad incrementada y una eficacia de traducción incrementada del ARNm en comparación con un ARNm con una cola de poli(A) más corta (Holtkamp et al., 2006, Blood, Vol. 108, págs. 4009-4017).
Independientemente de los factores que influyan en la estabilidad del ARNm, la traducción eficaz de las moléculas de ácido nucleico administradas por parte de las células o tejido diana es crucial para cualquier enfoque que use moléculas de ácido nucleico para genoterapia o vacunación genética. Junto con la regulación de la estabilidad, también la traducción de la mayoría de los ARNm se regula por elementos característicos estructurales como las UTR, la caperuza 5' y la cola de poli(A) 3'. En este contexto, se ha informado de que la longitud de la cola de poli(A) puede desempeñar una función importante para la eficiencia traduccional, así como de que tiene un efecto atenuador sobre la traducción.
También se ha informado de que las colas de poli(U) 3' tienen aparentemente el mismo efecto de estabilidad del ARNm que las colas de poli(A) 3' (Horton y Landweber, 2000, Nucleic Acids Research, 28(23): 4750-4754). Por tanto, se puede esperar razonablemente que también las colas de poliuridina (poli(U)), policitidina (poli(C)) y poliguanosina (poli(G)) tengan el mismo efecto que una cola de poli(A).
Como ya se explica anteriormente, el ARN es en general una especie molecular bastante inestable. Sin embargo, para el uso de ARN como medicamento, en particular en el campo de genoterapia, inmunoterapia del cáncer, proteinoterapia de reposición y vacunación, se desea que las moléculas de ARN sean estables y desencadenen una respuesta específica y bien definida en el organismo de un paciente. Para este propósito y también por razones reguladoras, las moléculas de ARN deben ser homogéneas, en particular en vista de la longitud de la cola de polinucleotidilo (poli(N)) que tiene una fuerte influencia en la estabilidad y traducción de la molécula de ARN y, de este modo, en el efecto terapéutico deseado. Por tanto, la reacción de polinucleotidilación debe realizarse de una manera bien definida y reproducible para controlar específicamente las condiciones de reacción, en particular el tiempo de la reacción. Además, dichas moléculas de poli(N)ARN homogéneas deben producirse en grandes cantidades para que estén disponibles para un uso completo como medicamento. Además, la producción de moléculas de ARN debe ser rentable para garantizar el suministro de medicamentos de bajo coste no solo para los pacientes en países que tienen un sistema de salud bien desarrollado, sino también en países con un sistema de salud pública comparativamente deficiente correlacionado con altos costes de tratamiento personal.
Hasta la fecha, la polinucleotidilación se realiza usando Poli(N)polimerasas (PNP) que están en solución conjuntamente con todos los demás componentes de la reacción, tales como ARN y nucleótidos. Después de la reacción de polinucleotidilación, el poli(N)ARN se separa y la PNP en general se descarta. Por tanto, la reacción de polinucleación del estado de la técnica requiere grandes cantidades de PNP y un procedimiento de purificación más avanzado. Sin embargo, para obtener un poli(N)ARN homogéneo, es decir, moléculas de ARN que tengan una cola de poli(N) de básicamente la misma longitud, la separación de los componentes de la reacción debe ser lo más rápida posible para terminar la reacción después de un periodo de tiempo específico. Los kits de poliadenilación disponibles actualmente tampoco son adecuados para producir moléculas de poli(N)ARN a escala industrial. El kit de adición de colas de poli(A) de Life Technologies, por ejemplo, solo es adecuado para cantidades muy pequeñas.
Kerwitz et al. (2003, The EMBO Journal, 22(14): 3705-3714) describen una proteína de fusión bovina His6-GST-PAP para estudiar la interacción entre la poli(A)polimerasa y PABPN1 en un experimento de reducción de GST. Sin embargo, el objetivo del estudio no fue la producción de moléculas de poli(N/A)ARN estables y homogéneas. Gershon y Khilko (1995, Journal of Immunological Methods, 183(1):65-76) usan la subunidad catalítica de una poli(A)polimerasa del virus de la variolovacuna para enlace quelante para la inmovilización reversible de proteínas marcadas con oligohistidina en el detector de resonancia de plasmón de superficie BIAcore. De nuevo, no se usó una PNP/PAP bacteriana ni la enzima usada para la producción de moléculas de poli(N/A)ARN estables y homogéneas. No se ha descrito ni sugerido una inmovilización de la subunidad catalítica de una poli(A)polimerasa del virus de la variolovacuna por medio de unión covalente. Además, el documento no divulga la inmovilización de poli(A)polimerasas bacterianas, ni divulga el uso de la poli(A)polimerasa inmovilizada para producir moléculas de ácido ribonucleico polinucleotidilado.
M. Prakash (2010, Enzyme Biotechnology, Discovery Publishing Pvt. Ltd) describen la unión de anticuerpos antipoli(A)polimerasa con poli(A)polimerasa de hepatoma goteando sobre papel DBM. De nuevo, no se usó una PNP/PAP bacteriana ni la enzima usada para la producción de moléculas de poli(N/A)ARN estables y homogéneas.
La solicitud de patente US 2012/0214171 A1 divulga la inmovilización de ARN polimerasas que no son comparables estructuralmente ni con respecto a su actividad biológica a las PNP/PAP inmovilizadas reivindicadas. La inmovilización se logra usando marcas de oligohistidina sobre soportes sólidos funcionalizados. El documento no sugiere la inmovilización de ARN polimerasas por medio de unión covalente ni nada con respecto a los beneficios del uso de ARN polimerasas de origen biológico específico. El documento tampoco menciona ni sugiere la inmovilización de poli(A/N)polimerasas ni ningún beneficio del uso de dichas enzimas. Por tanto, las PNP y los procedimientos de reacción de polinucleotidilación del estado de la técnica no producen de forma directa ni rentable moléculas de poli(N/A)ARN homogéneas.
Estos y otros problemas se resuelven mediante la materia objeto reivindicada, en particular mediante el empleo de una poli(N/A)polimerasa inmovilizada como se define en las reivindicaciones.
Sumario de la invención
Como solución a los problemas analizados anteriormente, la presente invención proporciona una Poli(N)polimerasa (PNP) caracterizada por que la Poli(N)polimerasa es una Poli(N)polimerasa bacteriana e inmovilizada sobre un soporte sólido mediante unión covalente, en la que la Poli(N)polimerasa se selecciona del grupo que consiste en poli(A)polimerasa, poli(U)polimerasa, poli(G)polimerasa y poli(C)polimerasa, en la que la Poli(N)polimerasa se obtiene mediante un procedimiento que comprende hacer reaccionar un grupo funcional de un residuo aminoacídico de la Poli(N)polimerasa con un soporte sólido activado químicamente de modo que se forme un enlace covalente y en la que el grupo funcional se selecciona de aminas primarias en el extremo N de cada cadena polipeptídica y en la cadena lateral de lisina, grupos a-carboxilo en el extremo C, grupos p-carboxilo y grupos Y-carboxilo de ácido aspártico y glutámico, y grupos sulfhidrilo o tiol de cisteínas. La presente invención proporciona además un procedimiento para producir p Np y usos de la misma. Se proporcionan además un reactor enzimático y un kit que comprende la PNP.
La inmovilización de la PNP sobre un soporte sólido tiene varias ventajas sobre los procedimientos clásicos en los que la PNP está libre en solución conjuntamente con los otros componentes de la reacción de polinucleotidilo, tales como moléculas de ARN, nucleótidos, sales, componentes tamponantes, etc.
En primer lugar, una PNP que se inmoviliza sobre un soporte sólido se puede usar repetidamente y para que diferentes moléculas de ARN se polinuleotidilen, lo que hace que la reacción de polinucleotidilación sea mucho más eficaz en el tiempo (separación más rápida), rentable y más ecológica, ya que se necesitan menos productos químicos y otros materiales para la disposición de la PNP y su separación del ARN polinudeotidilado. La inmovilización potenció la estabilidad de la enzima PNP (por ejemplo, poli(A)polimerasa (PAP)) ya que se reducen la agregación y desnaturalización de la proteína. La reacción se puede llevar a cabo en modo discontinuo o incluso semidiscontinuo.
En segundo lugar, la inmovilización de PNP facilita la purificación del ARN polinucleotidilado (poli(N)ARN). De hecho, la simple eliminación de la mezcla de reacción proporciona la separación de la p Np de los otros componentes de reacción y se pueden evitar etapas de separación tales como desnaturalización térmica, extracción y precipitación. Esto también reduce las impurezas (por ejemplo, proteínas PNP desnaturalizadas o fragmentos) en la solución de poli(N)ARN producida.
La inmovilización es un aspecto importante cuando se habla de moléculas de poli(N)ARN homogéneas con respecto a la longitud de la cola de poli(N), ya que la longitud de la cola de poli(N) se determina significativamente mediante la proporción molar entre ARN y nucleótido proporcionada en la reacción de polimerización. Por lo tanto, se puede proporcionar PNP en una cantidad que no limite la reacción y se produzcan colas de poli(N) homogéneas.
En tercer lugar, la inmovilización saturada proporciona una cantidad estable y constante de enzima PNP que está disponible en cada ciclo de reacción. De este modo, los otros componentes de la reacción se pueden añadir en exceso para que la enzima PNP funcione de forma saturada, lo que permite un buen control de la longitud de la cola de poli(N) por unidad de tiempo.
Por tanto, la inmovilización de enzimas PNP supera varios inconvenientes de los procedimientos de producción de poli(N)ARN del estado de la técnica.
En el contexto de la presente invención, la Poli(N)polimerasa o preferentemente una poli(A)polimerasa es de origen bacteriano. En general, las poli(N/A)polimerasas bacterianas son monómeros que se pueden inmovilizar más fácilmente, además, estas enzimas bacterianas en general están bien caracterizadas. En el contexto de la invención, es preferente una estrategia de inmovilización por medio de al menos un grupo tiol de dichas enzimas PN/AP, por ejemplo, permitiendo un enlace entre la enzima PNP y un soporte sólido que se selecciona del grupo que consiste en enlace disulfuro, enlace tioéster y tioéter. Más preferentemente, la poli(N/A)polimerasa se inmoviliza por medio de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína y/o por medio de una unión covalente que es un puente disulfuro o un enlace tioéter. Esta forma de inmovilización también evita el empleo de grupos amino que están presentes frecuentemente en el centro activo de las enzimas PNP. Claramente, una inmovilización por medio de un aminoácido que está presente en el centro activo de una enzima PNP afectará de manera importante a la actividad biológica de la enzima. Dado que los residuos de cisteína en general no son muy frecuentes en la secuencia de aminoácidos e incluso se encuentran con menos frecuencia en el centro activo de una proteína, estos residuos se eligen preferentemente para la fijación al soporte sólido.
Preferentemente, para la inmovilización por medio de un grupo tiol de la enzima PN/AP, el soporte sólido comprende un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en tiol, haloacetilo, disulfuro de piridilo, epoxi, maleimida y mezclas de los mismos; preferentemente, el grupo reactivo se selecciona del grupo que consiste en tiol, epoxi, maleimida y mezclas de los mismos, más preferentemente el grupo reactivo se selecciona del grupo que consiste en tiol, maleimida y mezclas de los mismos. Los grupos reactivos adecuados para generar enlaces tioéter comprenden soportes activados con epoxi, soportes activados con maleimida y soportes activados con haloacetilo (yodoacetilo, bromoacetilo). En el contexto de la producción farmacéutica de poli(N/A)ARN, son preferentes los soportes tiol, maleimida y epoxi.
Para someter a prueba adicionalmente el concepto de inmovilización y para facilitar una inmovilización dirigida y estable de una enzima PN/AP, los autores de la invención generaron una poli(A)polimerasa bacteriana mutada (poli(A)polimerasa de Escherichia coli), en la que cada residuo de cisteína natural de la proteína se ha sustituido con un residuo de alanina, y en la que se ha introducido una cisteína N terminal (unida por medio de un elemento conector al extremo N de la proteína). Los autores de la invención descubrieron sorprendentemente que dicha poli(A)polimerasa bacteriana mutada mostraba actividad enzimática en solución. En otro experimento, los autores de la invención muestran que dicha poli(A)polimerasa bacteriana mutada inmovilizada sobre un soporte sólido por medio de un enlace disulfuro covalente mostraba actividad enzimática similar en comparación con la respectiva enzima soluble demostrando sorprendentemente que la inmovilización se toleraba bien y no obstaculizaba la actividad enzimática de la enzima. Además, los autores de la invención descubrieron sorprendentemente que la poli(A)polimerasa bacteriana inmovilizada presentaba una estabilidad a largo plazo mejorada y una estabilidad térmica mejorada. En esencia, los autores de la invención muestran que la inmovilización de enzimas PNP es factible como se demuestra aquí para la poli(A)polimerasa de E. coli. Por lo tanto, los resultados demuestran que la inmovilización de enzimas PNP es factible y aplicable y muestra ventajas sobre las enzimas solubles tales como estabilidad mejorada, actividad a largo plazo y reutilizabilidad. Esto fue bastante inesperado, ya que cabría esperar que la inmovilización pudiera dar lugar de alguna manera a una alteración del rendimiento enzimático de la enzima. La presente invención presenta reglas y estrategias generales para obtener enzimas PN/AP inmovilizadas. El experto en la técnica puede usarlas para generar no solo PAP inmovilizadas, sino también PNP, así como PNP de origen bacteriano distinto de E. coli. Por tanto, se puede esperar razonablemente que los resultados anteriores también sean transferibles a PNP en general, así como a PNP de otras bacterias como E. coli o que se puedan someter a prueba para su funcionalidad como se describe en el presente documento.
Por último, la invención se refiere a un kit y a un reactor enzimático que comprende la PNP inmovilizada. El reactor enzimático permite el aumento de escala de la reacción de polinucleotidilación para proporcionar altos rendimientos de moléculas de ARN polinucleotidiladas homogéneamente de una manera reproducible y rápida. La automatización de la reacción de polinucleotidilación y la separación del ARN polinucleotidilado conjuntamente con la utilización renovada de PNP proporciona, por tanto, una producción ecológica y económica de moléculas de poli(N)ARN homogéneas. El kit es útil para la automatización y proporciona un estándar de alta calidad debido a la disposición de un entorno de reacción controlado y homogéneo. En este contexto, los autores de la invención mostraron que la poli(A)polimerasa bacteriana inmovilizada sobre un soporte sólido podía reutilizarse para diversos ciclos de poliadenilación enzimática en un reactor enzimático hasta que se generaba una longitud de cola de poli(A) deseada. La presente invención también presenta reglas y estrategias generales de diseños de reactor enzimático de poli(A/N) y su(s) aplicación(es).
Por tanto, la poli(N/A)polimerasa inmovilizada de acuerdo con la presente invención proporciona la producción de moléculas de ARN polinucleotidiladas y poliadeniladas homogéneas y estables, respectivamente.
Por lo tanto, la presente invención proporciona una Poli(N)polimerasa inmovilizada como se define en las reivindicaciones. La Poli(N)polimerasa se selecciona del grupo que consiste en poli(A)polimerasa, poli(U)polimerasa, poli(G)polimerasa y poli(C)polimerasa. Preferentemente, la Poli(N)polimerasa es una poli(A)polimerasa.
La Poli(N)polimerasa se inmoviliza preferentemente sobre el soporte sólido mediante unión covalente.
En un modo de realización preferente de la presente invención, la Poli(N)polimerasa se inmoviliza mediante unión covalente a un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo, soporte sólido activado con maleimida o una mezcla de los mismos. Opcionalmente, la Poli(N)polimerasa se inmoviliza por medio de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína. En un modo de realización preferente de la presente invención, la Poli(N)polimerasa se inmoviliza mediante unión covalente a un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, soporte sólido funcionalizado con epoxi, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo, soporte sólido activado con maleimida o una mezcla de los mismos. Opcionalmente, la Poli(N)polimerasa se inmoviliza por medio de un grupo tiol.
Opcionalmente, la unión covalente es un puente disulfuro o un enlace tioéter. Opcionalmente, la unión covalente es un puente disulfuro, un enlace tioéster o un enlace tioéter.
En otro modo de realización preferente de la presente invención, el soporte sólido comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex, agarosa, sílice, microesferas magnéticas, microesferas de metacrilato y nanopartículas, preferentemente el soporte sólido comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex, agarosa, sílice, microesferas magnéticas y nanopartículas.
Más preferentemente, el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada con tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo, agarosa activada con maleimida, microesferas de epoxi-metacrilato y mezclas de los mismos, incluso más preferentemente, el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada con tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo, agarosa activada con maleimida y mezclas de los mismos.
En otro modo de realización, el soporte sólido comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex, agarosa, sílice, microesferas magnéticas, microesferas de metacrilato y nanopartículas, preferentemente el soporte sólido comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex, agarosa, sílice, microesferas magnéticas y nanopartículas.
Más preferentemente, el soporte sólido comprende un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en tiol, haloacetilo, disulfuro de piridilo, epoxi, maleimida y mezclas de los mismos, incluso más preferentemente el soporte sólido comprende un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en tiol, haloacetilo, disulfuro de piridilo, maleimida y mezclas de los mismos.
Preferentemente, la Poli(N)polimerasa deriva de Escherichia coli, Streptomyces coelicolor, Meiothermus silvanus, Bacillus subtilis, Thermus aquaticus, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Citrobacter koseri, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Trabulsiella guamensis, Kluyvera ascorbata, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Enterococcus gallinarum, Grimontia indica o Salinivibrio costicola. Es más preferente que la Poli(N)polimerasa comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 1 a 22, y más preferentemente comprenda una secuencia de aminoácidos que sea al menos un 80 % idéntica a SEQ ID NO: 1, 2 o 3. Lo más preferentemente, la PNP comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % o un 95 % idéntica a SEQ ID NO: 1 a 15. En otro modo de realización muy preferente, la PNP comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % o un 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos como se representa en una cualquiera de SEQ ID NO: 16 a 22.
Incluso más preferentemente, la Poli(N)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, de forma alternativa al menos un 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos como se representa en una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 22 y 24 a 155, preferentemente comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, de forma alternativa al menos un 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 16 a 22, 24 a 155 o 203, más preferentemente al menos un 80 %, de forma alternativa al menos un 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 17 a 22, 32 a 83, 85-111, 113-139, 141-145, 146-148, 150­ 152, 154-155 o 203 incluso más preferentemente al menos un 80 %, de forma alternativa al menos un 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 58-83, 85-111, 113-139 o 203, y lo más preferentemente al menos un 80 %, de forma alternativa al menos un 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 113.
En un modo de realización preferente de la presente invención, la Poli(N)polimerasa comprende al menos un residuo de cisteína recién introducido en comparación con una poli(N/A)polimerasa natural, preferentemente la poli(N/A)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en una cualquiera de SEQ Id NO: 17-22, 32-155 o 203, y/o comprende solo un residuo de cisteína o está mutada para comprender solo un residuo de cisteína, preferentemente la poli(N/A)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 16-22, 24-83, 85-111, 113-139, 141-144, 146-148, 150-152, 154­ 155 o 203.
En un modo de realización más preferente, la Poli(N)polimerasa comprende un elemento conector como se representa en SEQ ID NO: 156-180 y/o comprende una marca de purificación como se representa en SEQ ID NO: 181-201.
Se proporciona además un procedimiento para producir la Poli(N)polimerasa como se define en las reivindicaciones, siendo preferentemente una poli(A)polimerasa como se define en las reivindicaciones, que comprende una etapa de a) hacer reaccionar un grupo funcional de un residuo aminoacídico de una Poli(N)polimerasa con un soporte sólido activado químicamente de modo que se forme un enlace covalente y en la que el grupo funcional se selecciona de aminas primarias en el extremo N de cada cadena polipeptídica y en la cadena lateral de lisina, grupos a-carboxilo en el extremo C, grupos p-carboxilo y grupos Y-carboxilo de ácido aspártico y glutámico, y grupos sulfhidrilo o tiol de cisteínas.
Opcionalmente, la etapa a) comprende la formación de un puente disulfuro o enlace tioéter, preferentemente, la etapa a) comprende la formación de un enlace covalente entre un residuo de cisteína de la Poli(N)polimerasa y un grupo tiol, un grupo haloacetilo, un disulfuro piridilo, un grupo epoxi o un grupo maleimida del soporte sólido, más preferentemente la etapa a) comprende la formación de un enlace covalente entre un residuo de cisteína de la Poli(N)polimerasa y un grupo tiol, un grupo haloacetilo, un disulfuro de piridilo o un grupo maleimida del soporte sólido. En un modo de realización opcional, el soporte sólido es un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo, soporte sólido activado con epoxi o soporte sólido activado con maleimida, preferentemente el soporte sólido es un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo o soporte sólido activado con maleimida.
En un modo de realización de la presente invención, el procedimiento comprende, además, antes de la etapa a), una etapa de b) expresar la Poli(N)polimerasa en un huésped de expresión adecuado. En un modo de realización adicional de la presente invención, el procedimiento comprende, además, antes de la etapa a) y, si está presente, después de la etapa b), una etapa de c) purificar la Poli(N)polimerasa de un huésped de expresión.
Preferentemente, la etapa c) comprende purificar la Poli(N)polimerasa por medio de cromatografía de afinidad, preferentemente, la Poli(N)polimerasa comprende una marca de afinidad como se representa en una cualquiera de SEQ ID NO: 181-201.
La Poli(N)polimerasa es una Poli(N)polimerasa bacteriana seleccionada del grupo que consiste en poli(A)polimerasa, poli(U)polimerasa, poli(G)polimerasa y poli(C)polimerasa, preferentemente la Poli(N)polimerasa es una poli(A)polimerasa.
También se proporciona un uso de la Poli(N)polimerasa como se define en las reivindicaciones, siendo preferentemente una poli(A)polimerasa, estando inmovilizada sobre un soporte sólido para producir moléculas de ácido ribonucleico polinucleotidilado (poli(N)ARN), preferentemente moléculas de ácido ribonucleico poliadenilado (poli(A)ARN). Preferentemente, se usa la Poli(N)polimerasa como se define anteriormente. Es particularmente preferente el uso de una poli(A)polimerasa, opcionalmente de una poli(A)polimerasa de origen bacteriano, más preferentemente de una poli(A)polimerasa como se define en el presente documento o como se define en las reivindicaciones.
En un modo de realización preferente de la presente invención, el uso comprende una etapa de i) poner en contacto la Poli(N)polimerasa con moléculas de ARN y nucleótidos en condiciones adecuadas para formar un enlace covalente entre los nucleótidos y las moléculas de ARN. Opcionalmente, el ARN es ARN mensajero (ARNm).
Los nucleótidos se pueden seleccionar del grupo que consiste en trifosfato de adenosina (ATP), trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de uridina (UTP), trifosfato de guanosina (GTP), análogos nucleotídicos y mezclas de los mismos.
En un modo de realización de la presente invención, la etapa i) se realiza durante al menos 5 min o se realiza durante al menos 10 a 120 min o se realiza durante 180 minutos o más.
En un modo de realización preferente de la presente invención, en la etapa i) están presentes de 0,5 a 2 moles de ARN; y/o en el que en la etapa i) están presentes de 50 a 500 moles de nucleótidos, preferentemente los nucleótidos son ATP.
Puede comprender además una etapa de ii) aislar las moléculas de poli(N)ARN, opcionalmente mediante filtración o cromatografía, preferentemente la filtración comprende ultrafiltración y/o diafiltración.
En un modo de realización preferente de la presente invención, las moléculas de poli(N)ARN producidas usando la PNP o PAP de la presente invención son esencialmente homogéneas o al menos un 80 % de las moléculas de poli(N)ARN tienen la misma longitud.
Preferentemente, cada una de las moléculas de poli(N)ARN comprende al menos 120 nucleotidilatos, preferentemente al menos 120 adenilatos.
En un modo de realización opcional de la presente invención, las moléculas de poli(N)ARN producidas son para su uso en genoterapia, inmunoterapia, proteinoterapia de reposición y/o vacunación.
En un modo de realización de la presente invención, los nucleótidos son ATP y las moléculas de poli(N)ARN son moléculas de ARN poli(adenilado) (poli(N)ARN).
Se proporciona además un reactor enzimático que comprende una Poli(N)polimerasa inmovilizada sobre un soporte sólido o que comprende una Poli(N)polimerasa como se describe en el presente documento o que comprende una Poli(N)polimerasa obtenible mediante el procedimiento descrito en el presente documento. Preferentemente, la Poli(N)polimerasa es una poli(A)polimerasa.
Opcionalmente, la enzima comprende, además
a) al menos un recipiente de reacción, también indicado módulo de reacción (11), que comprende la Poli(N)polimerasa inmovilizada,
b) uno o más dispositivos para medir y/o ajustar al menos un parámetro seleccionado del grupo que consiste en pH, concentración de sal, concentración de magnesio, concentración de fosfato, temperatura, presión, caudal, concentración de ARN y concentración de nucleótidos.
En un modo de realización preferente, el reactor enzimático comprende, además
c) un módulo de captura (13);
d) un módulo de alimentación (14); y/o
e) un módulo de transcripción in vitro (IVT) (16), preferentemente, el módulo de IVT es para la transcripción de ARN in vitro.
Opcionalmente, el módulo de IVT (16) y/o el módulo de alimentación (14) comprenden un dispositivo de regulación y control de la temperatura (12).
El reactor enzimático puede comprender además f) al menos una unidad de sensor (15), opcionalmente estando la al menos una unidad de sensor (15) presente en el módulo de reacción (11), el módulo de captura (13) y/o los módulos de alimentación (14 y 16). Opcionalmente, la al menos una unidad de sensor comprende al menos un electrodo selectivo de iones, que es preferentemente sensible a H+ , Na+, K+ , Mg2+, Ca2+, Cl- y/o PO43-.
Opcionalmente, el módulo de reacción (11) comprende además una membrana de filtración (6), siendo preferentemente una membrana de ultrafiltración, más preferentemente la membrana de filtración (6) o la membrana de ultrafiltración tiene un peso molecular de corte en un intervalo de 10 kDa a 500 MDa, preferentemente en un intervalo de 50 kDa a 300 MDa, más preferentemente de 100 kDa a 100 MDa, incluso más preferentemente de 500 kDa a 50 MDa, y lo más preferentemente de 750 kDa a 25 MDa, tal como 1 MDa. En un modo de realización preferente, el módulo de captura (13) comprende una resina para capturar las moléculas de poli(N)ARN producidas y para separar las moléculas de ácido nucleico producidas de otros componentes solubles de la mezcla de reacción. Más preferentemente, el módulo de captura (13) comprende una unidad de sensor (15).
En un modo de realización incluso más preferente, el módulo de reacción (11) comprende además un módulo de reflujo (19).
En un modo de realización, el reactor enzimático comprende más de un módulo de reacción (11).
Preferentemente, el recipiente de reacción comprende un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo, soporte sólido activado con epoxi o soporte sólido activado con maleimida, más preferentemente el recipiente de reacción comprende un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo o soporte sólido activado con maleimida; incluso más preferentemente, el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada con tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo, microesferas de epoxi-metacrilato y agarosa activada con maleimida, lo más preferentemente, el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada con tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo y agarosa activada con maleimida.
En otro modo de realización preferente de la presente invención, el reactor enzimático es adecuado para el uso que se describe en el presente documento.
Se proporciona además un kit que comprende una Poli(N)polimerasa, caracterizado por que la Poli(N)polimerasa está inmovilizada sobre un soporte sólido, preferentemente la Poli(N)polimerasa como se define adicionalmente en el presente documento, tal como una Poli(N)polimerasa o poli(A)polimerasa de origen bacteriano, o producible por el procedimiento descrito en el presente documento, un tampón de reacción de Poli(N)polimerasa y monofosfatos nucleosídicos, opcionalmente una mezcla de nucleótidos, además opcionalmente una ARN polimerasa y opcionalmente un tampón de transcripción in vitro de ARN. Preferentemente, la Poli(N)polimerasa es una poli(A)polimerasa.
Breve explicación de los dibujos
Figura 1: Procedimientos de inmovilización para una poli(N/A)polimerasa: La poli(N/A)polimerasa (proteína) se puede acoplar mediante fuerzas físicas pasivas (A), mediante captura por afinidad (B) o mediante enlace covalente (C) a un material de soporte adecuado (S). Como materiales de soporte, se ejemplifica una superficie plana (rectángulo alargado) y dos soportes globulares diferentes (círculo esférico, triángulo), tales como microesferas. (A): El acoplamiento por medio de adsorción física (flecha) se puede producir en diversos residuos, a menudo aleatorios, en una proteína. La adsorción física se basa en interacciones intermoleculares físicas débiles que incluyen interacciones electrostáticas, hidrófobas, de Van der Waals y de enlace de hidrógeno. (B): El acoplamiento por medio de afinidad, que comprende bioafinidad, se puede producir en posiciones especificadas en una proteína. La inmovilización por bioafinidad se basa en interacciones fuertes de dos biomoléculas, donde un compañero de interacción se fusiona con la proteína (cuadrado negro) y el otro compañero de interacción se recubre sobre el material de soporte respectivo (círculo negro). (C): El acoplamiento por medio de un enlace covalente (barra-campana) se puede producir por medio de residuos reactivos específicos en una proteína, tales como residuos de cisteína. Un enlace covalente es un enlace químico fuerte. Los residuos reactivos en la proteína y los grupos reactivos en el material de soporte, como se describe en el presente documento, deben estar presentes para formar enlaces covalentes.
Figura 2: Representación esquemática de una reacción de poliadenilación que tiene lugar en un reactor (discontinuo) enzimático (1) de la invención. La poli(A)polimerasa (PAP) se inmoviliza sobre un soporte sólido, en este caso se inmoviliza sobre microesferas (B). Las poli(A)polimerasas catalizan la fijación de adenilatos al ARN dando como resultado una cola de poli(A) fijada covalentemente al extremo 3' de las moléculas de ARN (reacción). Después de que se haya producido la reacción, las moléculas de poli(A)ARN se separan de las poli(A)polimerasas inmovilizadas en el reactor enzimático por medio de una membrana de ultrafiltración que no permite el paso de las poli(A)polimerasas inmovilizadas sobre, en este caso ejemplar, microesferas. La flecha indica el tubo de entrada y salida para introducir y retirar componentes de la reacción en el recipiente del reactor enzimático.
Figura 3: Ejemplos de diferentes configuraciones para los biorreactores enzimáticos que contienen PN/AP inmovilizadas (A) Reactores discontinuos de depósito agitado, (B) Reactores semidiscontinuos (de depósito agitado), (C) Reactor de ultrafiltración de depósito agitado, (D) Reactores discontinuos de recirculación, (E) Reactores de lecho compactado continuo. Se indican diferentes componentes de los tipos de reactor: (11) recipiente del reactor/módulo de reacción, (2) enzima inmovilizada, (3) agitador, (4) entrada, (5) salida, (6) dispositivo de ultrafiltración (línea diagonal: membrana de ultrafiltración), (7) tubo de alimentación para dispositivo de ultrafiltración, (8) tubo de recirculación, (9) depósito de sustrato/tampón, (10) depósito de lecho compactado, que contiene enzimas. Figura adaptada de (Illanes, Andrés, ed. Enzyme biocatalysis: principles and applications. Springer Science & Business Media, 2008).
Figura 4: Representación esquemática de una reacción de poliadenilación que tiene lugar en un módulo de reacción (1) comprendido en un reactor enzimático (1) de la invención. Además del modo de realización mostrado en la figura 2, el reactor enzimático comprende además un módulo de alimentación (14), que contiene todos los componentes esenciales para la reacción de poliadenilación (tampón, ATP, Ribolock) y un módulo de transcripción (ARN) in vitro (IVT) (16) que puede tener un dispositivo para ajustar y controlar la temperatura (12) para el ARN molde generado en una reacción de IVT (16). Además, el módulo de alimentación y el módulo de IVT pueden tener unidades de sensor (15) para supervisar los requisitos de reacción esenciales (pH, temperatura, iones, ARN) por medio de luz uV, fluorescencia o potenciometría de iones, respectivamente. Además, todos los componentes del módulo de alimentación (14) se calientan (calentador (17)) hasta la temperatura de reacción durante el flujo de alimentación en el tubo de entrada (4) al reactor enzimático discontinuo. También hay un tubo de entrada (4) presente entre el módulo de IVT (16) y el módulo de reacción (11). También hay unidades de sensor (15) incluidas en el módulo de reacción (11), el módulo de captura (13), el módulo de alimentación (14) y el módulo de IVT (15). Un módulo de captura (13) para capturar temporalmente las moléculas de ARN poliadeniladas está conectado al módulo de reacción (11), un dispositivo de filtración (6), un tubo de salida (5) y un módulo de control (18). El módulo de control (18) puede distinguir el ARN de acuerdo con las longitudes de la cola de poliA deseadas. Los poli(A)ARN con longitudes de cola de poliA deseadas se introducen en el módulo de captura, mientras que los poli(A)ARN con longitudes de poliA demasiado cortas se realimentan por medio del módulo de reflujo (19) al módulo de reacción (11).
Figura 5: Caracterización de la actividad de mutantes de PAP de E. coli genomanipulados. Esta figura muestra el poli(A)ARN producido después de realizar una reacción de poliadenilación en un pequeño molde de ARN (60 nucleótidos). Los datos muestran que las tres PAP mutantes (1: mut1; 2: mut2; 3: mut3) son enzimáticamente activas en solución. Se proporciona una descripción detallada del experimento en la sección de ejemplos, ejemplo 1.
Figura 6: SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie de proteínas PAP recombinantes mut1 (A) y mut2 (B). Después de volver a tamponar en tampón de inmovilización, las PAP recombinantes mut1 y mut2 se inmovilizaron eficazmente usando soportes sólidos de tiopropil-Sepharose 6B (TS). (A) Línea 1: PAP mut1; línea 2: PAP mut1 retamponada; línea 3: muestra irrelevante; línea 4: PAP-TS mut1; línea 5: muestra irrelevante. (B) Línea 1: PAP mut2; línea 2: PAP mut2 retamponada; línea 3: muestra irrelevante; línea 4: PAP-TS mut2. Se proporciona una descripción detallada del experimento en la sección de ejemplos, ejemplo 1.
Figura 7: La proteína PAP mut2 inmovilizada (PAP-TS mut2) conserva la actividad a largo plazo. Se supervisó la actividad de poliadenilación de PAP-TS mut2 y se comparó con la actividad de la respectiva enzima mutante soluble mut2. Se realizaron ensayos de adición de colas de poli(A)polimerasa después de almacenamiento de las respectivas enzimas a 4 °C durante 5, 14 y 22 días. La figura muestra el resultado de PAP mut2 (soluble: carriles 1-3, inmovilizada: carriles 4-6) después de almacenamiento de la enzima durante 5 días (carril 1 y 4), 14 días (carril 2 y 5) y 22 días (carril 3 y 6). Se proporciona una descripción detallada del experimento en la sección de ejemplos, ejemplo 2. nt = número de nucleótidos.
Figura 8: PAP-TS mut2 inmovilizada muestra estabilidad térmica mejorada. Las proteínas PAP mut2 soluble y PAP-TS mut2 inmovilizada se preincubaron a 37 °C durante 10, 30, 90 y 180 minutos. A continuación, se realizó un ensayo de adición de colas de poli(A)polimerasa para evaluar la actividad de poliadenilación. (A) muestra el resultado de la proteína mut2 soluble. (B) muestra el resultado de la proteína mut2 PAP-TS inmovilizada. Carril 1: 10 min de preincubación a 37 °C; carril 2: 30 min de preincubación a 37 °C; carril 3: 90 min de preincubación a 37 °C; carril 4: 180 min de preincubación a 37 °C. La barra horizontal en los carriles 1 y 2 resalta la diferencia en la actividad después de la agresión térmica, mostrando que la PAP-TS mut2 inmovilizada tiene estabilidad térmica mejorada. En el ejemplo 3 se proporciona una descripción detallada del experimento. nt = número de nucleótidos.
Figura 9: Reactor enzimático a pequeña escala que consiste en una entrada que comprende un dispositivo de inyección (4) y un módulo de reacción (11) que comprende una unidad de filtración (6) y un módulo de captura (13). El poli(N/A)ARN (23) producido se puede recoger después de centrifugación en el módulo de captura (13). En el ejemplo 4 se proporciona una descripción detallada del experimento.
Figura 10: Reutilizabilidad de microesferas de PAP-TS mut2 inmovilizada en el reactor de poliadenilación. En un reactor enzimático (tal como en la figura 9), las microesferas de PAP-TS mut2 se reutilizaron durante varios ciclos de reacción. El alargamiento de la cola de poli(A) a lo largo del tiempo muestra que las microesferas de PAP-TS mut2 inmovilizada de la invención se pueden reutilizar durante varios ciclos de reacción. Se indican los tamaños de banda respectivos del ARN. Carril 1: inicio de la reacción; carril 2: un ciclo durante 10 minutos; carril 3: dos ciclos de reacción, de 10 minutos cada uno; carril 4: 6 ciclos de reacción, de 10 minutos cada uno. M: número de nucleótidos, indicado por el carril de marcador. En el ejemplo 4 se proporciona una descripción detallada del experimento.
Figura 11: Uso de un reactor enzimático de la invención para generar moléculas de poli(A)ARN con una longitud de cola de poli(A) definida. En un reactor enzimático, tal como en la figura 9, las microesferas de PAP-TS mut2 se reutilizaron durante varios ciclos de reacción. Se inyectó una cantidad definida de ATP 50 |jM en intervalos de tiempo de 10 min hasta que se obtuvo la longitud de cola de poli(A) deseada de 200 adenosinas. Carril 1: inicio de la reacción, la banda a 60 nucleótidos (nt) muestra el molde de ARN; carril 2: progreso de la reacción 10 min después del inicio; carril 3: progreso de la reacción 10 min después de la alimentación de ATP; carril 4: progreso de la reacción 10 min después de una alimentación de ATP adicional; carril 5: progreso de la reacción 10 min después de una alimentación de ATP adicional; carril 6: progreso de la reacción 10 min después de una alimentación de ATP adicional; la línea discontinua (indicada por un asterisco) muestra que por medio de las alimentaciones de ATP, se logró un alargamiento de la cola de poli(A). M: número de nucleótidos, indicado por el carril de marcador. En el ejemplo 4 se proporciona una descripción detallada del experimento.
Definiciones
Por motivos de claridad y legibilidad, se proporcionan las siguientes definiciones. Cualquier rasgo característico técnico mencionado para estas definiciones se puede leer en todos y cada uno de los modos de realización de la invención. Se pueden proporcionar específicamente definiciones y explicaciones adicionales en el contexto de estos modos de realización. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento en general tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En general, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular, química orgánica y química e hibridación de ácidos nucleicos son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Se usan técnicas estándar para la síntesis de péptidos y ácidos nucleicos. Las técnicas y procedimientos se realizan en general de acuerdo con procedimientos convencionales en la técnica y diversas referencias generales (por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), que se proporcionan a lo largo de este documento.
Enzima: Las enzimas son biomoléculas catalíticamente activas que realizan reacciones bioquímicas tales como transcripción de ARN dependiente de ADN (por ejemplo, ARN polimerasas) o digestión de ADN bicatenario (por ejemplo, endonucleasas de restricción). Las enzimas se componen típicamente de aminoácidos y/o ARN (ribozimas, ARNnp). La Poli(N)polimerasa y más específicamente la poli(A)polimerasa de la invención son enzimas.
Proteína: Una proteína típicamente comprende uno o más péptidos o polipéptidos. Típicamente, una proteína se pliega en una forma tridimensional, que puede ser necesaria para que la proteína ejerza su función biológica. Se entiende típicamente que la secuencia de una proteína o péptido es el orden, es decir, la sucesión de sus aminoácidos.
Proteína recombinante: La expresión "proteína recombinante" se refiere a proteínas producidas en un sistema heterólogo, es decir, en un organismo que no produce de forma natural dicha proteína, o una variante de dicha proteína. En caso de que una proteína se exprese a partir de un vector de expresión típico en un huésped de expresión que también exprese de forma natural esta proteína, sin embargo, no en cantidades tan incrementadas, dicha proteína también se tiene que entender como "proteína recombinante". Dicha proteína recombinante también puede comprender elementos necesarios para la purificación de la proteína, por ejemplo, marcas de purificación, por ejemplo, marcas de oligohistidina (marcas de HIS). Se dan ejemplos de marcas de purificación en SEQ ID NO: 181-201. Típicamente, los sistemas heterólogos usados en la técnica para producir proteínas recombinantes son bacterias (por ejemplo, Escherichia (E.) coli), levadura (por ejemplo, Saccharomyces (S.) cerevisiae) o determinadas líneas de cultivo celular de mamífero.
Huésped de expresión: Un huésped de expresión indica un organismo que se usa para la producción de proteínas recombinantes. Los huéspedes de expresión generales son bacterias, tales como E. coli, levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, o también células de mamíferos, tales como células humanas.
Poli(N)pol¡merasa (PNP): Otra expresión es polinucleotidil polimerasa. Las PNP catalizan la fijación covalente de residuos nucleotídicos al extremo 3' de ARN, en particular ARNm, formando de este modo una secuencia de poli(N). La PNP puede ser una poli(A)polimerasa, poli(U)polimerasa, poli(C)polimerasa o poli(G)polimerasa. En general, estas polimerasas tienen preferencia por un nucleótido específico, sin embargo, también pueden usar otros nucleótidos si están disponibles, por ejemplo, las poli(U)polimerasas tienen actividad para ATP, UTP y GTP (Lunde et al., 2012, Nucleic acid research 4o.19: 9815-9824). Siempre que se use en el presente documento la expresión Poli(N)polimerasa o PNP, se debe entender que esta expresión significa una Poli(N)polimerasa o PNP de origen bacteriano. Además, siempre que se use en el presente documento la expresión Poli(N)polimerasa o PNP, se debe entender que esta expresión comprende, como un modo de realización muy preferente, una poli(A)polimerasa o PAP, más preferentemente una poli(A)polimerasa bacteriana o PAP bacteriana. Por tanto, se entiende que todos los modos de realización que se describen en el presente documento en otra parte para hacer referencia a Poli(N)polimerasa o PNP se refieren a poli(A)polimerasa o PAP también, en particular se entiende que se refieren a una poli(A)polimerasa o PAP de origen bacteriano. Esta conexión a menudo se expresa mediante las expresiones "poli(N/A)polimerasa" o "PN/AP".
Poli(A)polimerasa (PAP): Cataliza la fijación covalente de adenosina al extremo 3' de ARN, en particular ARNm.
Otras expresiones para PAP son (polinucleótido) adenililtransferasa, poliApolimerasa, poliadenilato sintetasa, ATP-ARN adenililtransferasa y poliadenilato polimerasa, estas expresiones se pueden usar de manera intercambiable. La poli(A)polimerasa de la presente invención tiene preferencia por el ATP y transfiere la fijación de monofosfatos de adenosina al extremo 3' de ARN, en particular ARNm. Si al menos un monofosfato de adenosina ya está fijado al ARN, el siguiente monofosfato de adenosina se fija al mismo, formando una secuencia de poli(A). La expresión "poli(N/A)polimerasa" o la abreviatura "PNP/PAP" se usa para indicar Poli(N)polimerasa, así como poli(A)polimerasa. El mismo principio se aplica a la cola de poli(N/A) o la secuencia poli(N/A) y otras. Secuencia de poli(N): Una secuencia poli(N), también denominada cola de poli(N) o cola de poli(N) 3', normalmente se entiende que es una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, de hasta aproximadamente 400 nucleótidos, por ejemplo, de aproximadamente 20 a aproximadamente 400, preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 400, más preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 300, incluso más preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, lo más preferentemente de aproximadamente 60 a aproximadamente 250 nucleótidos, que se añade preferentemente al extremo 3' de un ARN, en particular ARNm. Una secuencia de poli(N) se localiza típicamente en el extremo 3' de un ARN(m). En el contexto de la presente invención, una secuencia de poli(N) puede estar localizada dentro de un ARN(m) o cualquier otra molécula de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, en un vector, por ejemplo, en un vector que sirve como molde para la generación de un ARN, preferentemente un ARNm, por ejemplo, mediante transcripción del vector. En el contexto de la presente invención, la expresión "secuencia de poli(A)" comprende además también elementos de secuencia, preferentemente elementos de secuencia artificiales, que forman parte de la UTR 3' o se localizan en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico artificial, y que preferentemente comprenden hasta 1100 nucleótidos, más preferentemente al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o al menos 1000 nucleótidos. Los nucleótidos pueden ser adenosina, citidina, uridina, guanosina, nucleótidos modificados, análogos nucleotídicos y mezclas de los mismos. Por tanto, la secuencia de poli(N) puede comprender diferentes nucleótidos, es decir, puede ser una secuencia heteropolimérica.
Secuencia de poli(A): Una secuencia poli(A), también denominada cola de poli(A) o cola de poli(A) 3', normalmente se entiende que es una secuencia de nucleótidos de adenina, por ejemplo, de hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, por ejemplo, de aproximadamente 20 a aproximadamente 400, preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 400, más preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 300, incluso más preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, lo más preferentemente de aproximadamente 60 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenosina, que se añade preferentemente al extremo 3' de un ARNm. Una secuencia de poli(A) se localiza típicamente en el extremo 3' de un ARN, en particular ARNm. En el contexto de la presente invención, una secuencia de poli(A) puede estar localizada dentro de un ARN(m) o cualquier otra molécula de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, en un vector, por ejemplo, en un vector que sirve como molde para la generación de un ARN, preferentemente un ARNm, por ejemplo, mediante transcripción del vector. En el contexto de la presente invención, la expresión "secuencia de poli(A)" comprende además también elementos de secuencia, preferentemente elementos de secuencia artificiales, que forman parte de la UTR 3' o se localizan en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico artificial, y que preferentemente comprenden hasta 1100 nucleótidos de adenina, más preferentemente al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o al menos 1000 nucleótidos de adenina. En general, la secuencia de poli(A) consiste en monofosfatos de adenosina.
Polinucleotidilación: Se entiende típicamente que la polinudeotidilación es la adición de una secuencia de poli(N) a una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ARN. Como se usa en el contexto de la presente invención, el término se puede referir a la polinucleotidilación de ARN como un proceso celular, así como a la polinucleotidilación llevada a cabo por reacción enzimática in vitro o por síntesis química.
Poliadenilación: Se entiende típicamente que la poliadenilación es la adición de una secuencia de poli(A), es decir, una secuencia de monofosfato de adenosina, a una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ARN. Como se usa en el contexto de la presente invención, el término se puede referir a la poliadenilación de ARN como un proceso celular, así como a la poliadenilación llevada a cabo por reacción enzimática in vitro o por síntesis química.
ARN, ARNm: ARN es la abreviatura habitual de ácido ribonucleico. Es una molécula de ácido nucleico, es decir, un polímero que consiste en nucleótidos. Estos nucleótidos normalmente son monómeros de monofosfato de adenosina, monofosfato de uridina, monofosfato de guanosina y monofosfato de citidina que están conectados entre sí a lo largo de una denominada cadena principal. La cadena principal está formada por enlaces fosfodiéster entre el glúcido, es decir, la ribosa, de un primer monómero y un resto fosfato de un segundo monómero contiguo. La sucesión específica de los monómeros se denomina secuencia de ARN. Normalmente, el ARN se puede obtener mediante transcripción de una secuencia de ADN, por ejemplo, dentro de una célula. En las células eucariotas, la transcripción se realiza típicamente dentro del núcleo o las mitocondrias. In vivo, la transcripción de ADN normalmente da como resultado el denominado ARN prematuro, que se tiene que procesar en el denominado ARN mensajero, normalmente abreviado como ARNm. El procesamiento del ARN prematuro, por ejemplo, en organismos eucariotas, comprende una variedad de modificaciones postranscripcionales diferentes tales como empalme, adición de caperuza 5', poliadenilación, exportación desde el núcleo o las mitocondrias y similares. La suma de estos procesos también se denomina maduración de ARN. El ARN mensajero maduro normalmente proporciona la secuencia de nucleótidos que se puede traducir en una secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína particular. Típicamente, un ARNm maduro comprende una caperuza 5', una UTR 5', un marco abierto de lectura, una UTR 3' y una secuencia de poli(A). Aparte del ARN mensajero, existen varios tipos de ARN no codificante, que pueden estar implicados en la regulación de la transcripción y/o la traducción y la inmunoestimulación y que también se pueden producir mediante transcripción in vitro.
Las moléculas de ARN cortas también se pueden sintetizar mediante procedimientos químicos, mientras que los ARN largos se producen típicamente mediante reacciones de transcripción in vitro que contienen un molde de ADN adecuado con un promotor derivado de bacteriófago, una ARN polimerasa, por ejemplo, ARN polimerasa de bacteriófago SP6, T3 o T7 y trifosfatos ribonucleosídicos (NTP).
ADN: ADN es la abreviatura habitual de ácido desoxirribonucleico. Es una molécula de ácido nucleico, es decir, un polímero que consiste en monómeros nucleotídicos. Estos nucleótidos normalmente son monómeros de monofosfato de desoxiadenosina, monofosfato de desoxitimidina, monofosfato de desoxiguanosina y monofosfato de desoxicitidina que están, por sí mismos, compuestos por un resto glucídico (desoxirribosa), un resto de base y un resto fosfato y polimerizados por una estructura de cadena principal característica. La estructura de cadena principal está formada típicamente por enlaces fosfodiéster entre el resto glucídico del nucleótido, es decir, desoxirribosa, de un primer monómero y un resto fosfato de un segundo monómero contiguo. El orden específico de los monómeros, es decir, el orden de las bases ligadas a la cadena principal de glúcido/fosfato, se denomina secuencia de ADN. El ADN puede ser monocatenario o bicatenario. En la forma bicatenaria, los nucleótidos de la primera hebra típicamente hibridan con los nucleótidos de la segunda hebra, por ejemplo, mediante emparejamiento de bases de A/T y emparejamiento de bases de G/C.
Secuencia de una molécula de ácido nucleico/secuencia de ácido nucleico: Se entiende típicamente que la secuencia de una molécula de ácido nucleico es el orden particular e individual, es decir, la sucesión de sus nucleótidos.
Secuencia de moléculas de aminoácidos/secuencia de aminoácidos: Se entiende típicamente que la secuencia de una proteína o péptido es el orden, es decir, la sucesión de sus aminoácidos.
Identidad de secuencia: Dos o más secuencias son idénticas si presentan la misma longitud y orden de nucleótidos o aminoácidos. El porcentaje de identidad típicamente describe el grado en el que dos secuencias son idénticas, es decir, típicamente describe el porcentaje de nucleótidos que corresponden en su posición en la secuencia a nucleótidos idénticos de una secuencia de referencia. Para la determinación del grado de identidad, se considera que las secuencias a comparar presentan la misma longitud, es decir, la longitud de la secuencia más larga de las secuencias a comparar. Esto significa que una primera secuencia que consiste en 8 nucleótidos/aminoácidos es un 80 % idéntica a una segunda secuencia que consiste en 10 nucleótidos/aminoácidos que comprende la primera secuencia. En otras palabras, en el contexto de la presente invención, la identidad de secuencias preferentemente se refiere al porcentaje de nucleótidos/aminoácidos de una secuencia que tienen la misma posición en dos o más secuencias que tienen la misma longitud. Los huecos normalmente se consideran posiciones no idénticas, independientemente de su posición real en una alineación.
La identidad de la secuencia se puede determinar usando una serie de programas, que se basan en diversos algoritmos, tales como BLASTN, ScanProsite, el programa informático laser gene, etc. Como alternativa, se puede usar el paquete de programas BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica con los parámetros predeterminados. Además, se puede emplear el programa Sequencher (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, e E. UU.) que usa el algoritmo "dirtydata" para comparaciones de secuencias.
La identidad entre dos secuencias proteínicas o de ácido nucleico se define como la identidad calculada con el programa needle en la versión disponible en abril de 2011. Needle forma parte del paquete de programas EMBOSS, disponible gratuitamente, que se puede descargar desde el sitio web correspondiente. Los parámetros estándar usados son gapopen 10,0 ("penalización por abertura de hueco"), gapextend 0,5 ("penalización por extensión de hueco"), datafile EONAFULL (matriz) en el caso de ácidos nucleicos.
Vector: El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferentemente a una molécula de ácido nucleico artificial. Un vector en el contexto de la presente invención es adecuado para incorporar o albergar una secuencia de ácido nucleico deseada, tal como una secuencia de ácido nucleico que comprende un marco abierto de lectura. Dichos vectores pueden ser vectores de almacenamiento, vectores de expresión, vectores de clonación, vectores de transferencia, etc. Un vector de almacenamiento es un vector que permite el almacenamiento conveniente de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, de una molécula de ARNm. Por tanto, el vector puede comprender una secuencia correspondiente, por ejemplo, a una secuencia de ARNm deseada o una parte de la misma, tal como una secuencia correspondiente al marco abierto de lectura y la UTR 3' de un ARNm. Se puede usar un vector de expresión para la producción de productos de expresión tales como ARN, por ejemplo, ARNm, o péptidos, polipéptidos o proteínas. Por ejemplo, un vector de expresión puede comprender secuencias necesarias para la transcripción de un tramo de secuencia del vector, tal como una secuencia promotora, por ejemplo, una secuencia promotora de ARN polimerasa. Un vector de clonación es típicamente un vector que contiene un sitio de clonación, que se puede usar para incorporar secuencias de ácido nucleico en el vector. Un vector de clonación puede ser, por ejemplo, un vector plasmídico o un vector bacteriofágico. Un vector de transferencia puede ser un vector que es adecuado para transferir moléculas de ácido nucleico a células u organismos, por ejemplo, vectores víricos. Un vector en el contexto de la presente invención puede ser, por ejemplo, un vector de ARN o un vector de ADN. Preferentemente, un vector es una molécula de ADN. Preferentemente, un vector en el sentido de la presente solicitud comprende un sitio de clonación, un marcador de selección, tal como un factor de resistencia a antibióticos, y una secuencia adecuada para la multiplicación del vector, tal como un origen de replicación. Preferentemente, un vector en el contexto de la presente solicitud es un vector plasmídico.
Región no traducida 3' (UTR 3'): En general, el término "UTR 3'" se refiere a una parte de la molécula de ácido nucleico artificial que está localizada 3' (es decir, "posterior") de un marco abierto de lectura y que no se traduce en proteína. Típicamente, una UTR 3' es la parte de un ARNm que está localizada entre la región codificante de la proteína (marco abierto de lectura (ORF) o secuencia codificante (CDS)) y la secuencia de poli(N/A) del ARN(m). En el contexto de la invención, una UTR 3' de la molécula de ácido nucleico artificial puede comprender más de un elemento UTR 3', que pueden ser de diferente origen, tales como elementos de secuencia derivados de la UTR 3' de varios genes naturales (no relacionados). En consecuencia, el término UTR 3' también puede comprender elementos que no están codificados en el molde a partir del que se transcribe un ARN, pero que se añaden después de la transcripción durante la maduración, por ejemplo, una secuencia de poli(N/A). Un UTR 3' del ARNm no se traduce en una secuencia de aminoácidos. La secuencia de UTR 3' en general está codificada por el gen, que se transcribe en el ARNm respectivo durante el proceso de expresión génica. La secuencia genómica se transcribe en primer lugar en ARNm prematuro, que comprende intrones opcionales. El ARNm prematuro a continuación se procesa adicionalmente en ARNm maduro en un proceso de maduración. Este proceso de maduración comprende las etapas de añadir caperuza 5', empalmar el ARNm prematuro para escindir los intrones opcionales y modificaciones del extremo 3', tales como polinucleotidilación/poliadenilación del extremo 3' del ARNm prematuro y escisiones con endo/exonucleasas opcionales, etc. En el contexto de la presente invención, una UTR 3' corresponde a la secuencia de un ARNm maduro que está localizado entre el codón finalizador de la región codificante de la proteína, preferentemente inmediatamente 3' al codón finalizador de la región codificante de la proteína y la secuencia de poli(N/A) del ARNm. La expresión "corresponde a" significa que la secuencia de UTR 3' puede ser una secuencia de ARN, tal como en la secuencia de ARNm usada para definir la secuencia de UTR 3', o una secuencia de ADN, que corresponde a dicha secuencia de ARN. En el contexto de la presente invención, la expresión "una UTR 3' de un gen", tal como "una UTR 3' de un gen de proteína ribosómica", es la secuencia que corresponde a la UTR 3' del ARNm maduro derivado de este gen, es decir, el ARNm obtenido por transcripción del gen y maduración del ARNm prematuro. La expresión "UTR 3' de un gen" engloba la secuencia de ADN y la secuencia de ARN (tanto hebra de sentido como la de antisentido y tanto madura como inmadura) de la uTr 3'. Como se usa en el presente documento, la expresión "elemento de UTR 3'" típicamente se refiere a un fragmento de una UTR 3' como se define en el presente documento. En particular, la expresión comprende cualquier elemento de secuencia de ácido nucleico, que se localiza 3' con respecto al ORF en la molécula de ácido nucleico artificial, preferentemente el ARNm, de acuerdo con la invención. En consecuencia, la expresión cubre, por ejemplo, elementos de secuencia derivados de la UTR 3' de un gen heterólogo, así como elementos tales como una secuencia de poli(C) o un tallo-bucle de histona.
Región no traducida 5' (UTR 5'): Típicamente, se entiende que una UTR 5' es una sección particular de ARN mensajero (ARNm). Está localizada 5' del marco abierto de lectura del ARNm. Típicamente, la UTR 5' comienza con el sitio de inicio de la transcripción y termina un nucleótido antes del codón de inicio del marco abierto de lectura. La UTR 5' puede comprender elementos para controlar la expresión génica, que también se denominan elementos reguladores. Dichos elementos reguladores pueden ser, por ejemplo, sitios de unión al ribosoma. La UTR 5' se puede modificar postranscripcionalmente, por ejemplo, mediante la adición de una caperuza 5'. En el contexto de la presente invención, una UTR 5' corresponde a la secuencia de un ARNm maduro, que está localizado entre la caperuza 5' y el codón de inicio. Preferentemente, la UTR 5' corresponde a la secuencia que se extiende desde un nucleótido localizado 3' a la caperuza 5', preferentemente desde el nucleótido localizado inmediatamente 3' a la caperuza 5', hasta un nucleótido localizado 5' al codón de inicio de la región codificante de la proteína, preferentemente al nucleótido localizado inmediatamente 5' al codón de inicio de la región codificante de la proteína. El nucleótido localizado inmediatamente 3' a la caperuza 5' de un ARNm maduro típicamente corresponde al sitio de inicio de la transcripción. La expresión "corresponde a" significa que la secuencia de UTR 5' puede ser una secuencia de ARN, tal como en la secuencia de ARNm usada para definir la secuencia de UTR 5', o una secuencia de ADN, que corresponde a dicha secuencia de ARN. En el contexto de la presente invención, la expresión "una UTR 5' de un gen" es la secuencia que corresponde a la UTR 5' del ARNm maduro derivado de este gen, es decir, el ARNm obtenido por transcripción del gen y maduración del ARNm prematuro. La expresión "UTR 5' de un gen" engloba la secuencia de ADN y la secuencia de ARN de la UTR 5'.
Análogo nucleotídico/nucleótido modificado/trifosfato nucleosídico modificado: Las expresiones "análogo nucleotídico" o "nucleótido modificado" indican un nucleótido que todavía es sustrato de una Poli(N)polimerasa o poli(A)polimerasa y, por tanto, se puede fijar a una molécula de ARN para formar una estructura de cola, es decir, una secuencia de nucleótidos/análogos nucleotídicos, pero está químicamente modificado y difiere de los cuatro nucleótidos estándar adenosina, citidina, uridina y guanosina. La expresión también incluye análogos nucleotídicos sintéticos y análogos nucleotídicos que dan lugar a la finalización de la reacción de polinucleotidilación/poliadenilación y/o que obstaculizan la acción de exonucleasas estabilizando así la cola de poli(N) y, por tanto, la molécula de poli(N)ARN. Además, los análogos nucleotídicos también pueden estar comprendidos en la propia molécula de ARN fuera de la cola de poli(N).
La expresión "trifosfato nucleosídico modificado", como se usa en el presente documento, se refiere a modificaciones químicas que comprenden modificaciones de la cadena principal, así como modificaciones del glúcido o modificaciones de la base. Estos trifosfatos nucleosídicos modificados también se denominan en el presente documento análogos (nucleotídicos), nucleósidos/nucleótidos modificados o modificaciones nucleotídicas/nucleosídicas.
Caperuza 5': Una "caperuza 5'" es una entidad, típicamente una entidad nucleotídica modificada, que en general "tapa" el extremo 5' de un ARNm maduro. Una caperuza 5' típicamente puede estar formada por un nucleótido modificado (análogo de caperuza, por ejemplo, m7G(5')ppp(5')G(m7G)), en particular por un derivado de un nucleótido de guanina. Preferentemente, la caperuza 5' está ligada al extremo 5' de una molécula de ácido nucleico, preferentemente un ARN, por medio de un enlace 5'-5'-trifosfato. Una caperuza 5' puede estar metilada, por ejemplo, m7GpppN (por ejemplo, m7G(5')ppp(5')G(m7G)), en la que N es el nucleótido 5' terminal del ácido nucleico que porta la caperuza 5', típicamente el extremo 5' de un ARN. Dicha estructura de caperuza 5' se denomina cap0. In vivo, las reacciones de adición de la caperuza se catalizan por enzimas de adición de caperuza. In vitro, una caperuza en 5' puede estar formada por un nucleótido modificado, en particular por un derivado de un nucleótido de guanina. Preferentemente, la caperuza 5' está unida al extremo 5' mediante un enlace 5'-5'-trifosfato.
Una caperuza 5' puede estar metilada, por ejemplo, m7GpppN, en la que N es el nucleótido 5' terminal del ácido nucleico que porta la caperuza 5', típicamente el extremo 5' de un ARN. m7GpppN es la estructura de caperuza 5' que se produce de forma natural en el ARNm, típicamente denominada estructura cap0.
Las enzimas, tales como la enzima nucleósido 2'-O-metiltransferasa específica de caperuza, crean un enlace 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido 5' terminal de un ARNm y un nucleótido de caperuza de guanina en el que la caperuza de guanina contiene una metilación N7 y el nucleótido 5' terminal del ARNm contiene un 2'-O-metilo. Esta estructura se denomina estructura cap1.
Otros ejemplos de estructuras de caperuza 5' incluyen glicerilo, residuo (resto) abásico desoxi invertido, 4',5'-metilen nucleótido, 1-(beta-D-eritrofuranosil) nucleótido, 4'-tio nucleótido, nucleótido carbocíclico, 1,5-anhidrohexitol nucleótido, L-nucleótidos, alfa-nucleótido, nucleótido de base modificada, treo-pentofuranosil nucleótido, 3',4'-seco nucleótido acíclico, 3,4-dihidroxibutil nucleótido acíclico, 3,5-dihidroxipentil nucleótido acíclico, resto nucleotídico 3'-3' invertido, resto abásico 3'-3'-invertido, resto nucleotídico 3'-2'-invertido, resto abásico 3'-2'-invertido, 1,4-butanodiol fosfato, 3' fosforamidato, hexilfosfato, aminohexilfosfato, 3'-fosfato, 3'-fosforotioato, fosforoditioato o resto metilfosfonato que forma puentes o que no forma puentes. Otras estructuras de caperuza 5' modificadas que se pueden usar en el contexto de la presente invención son capí (mutilación adicional de la ribosa del nucleótido contiguo de m7GpppN), cap2 (metilación adicional de la ribosa del 2.° nucleótido en dirección 3' de m7GpppN), cap3 (metilación adicional de la ribosa del 3.° nucleótido en dirección 3' de m7GpppN), cap4 (metilación adicional de la ribosa del 4.° nucleótido en dirección 3' de m7GpppN), ARCA (análogo anti-CAP invertido), ARCA modificado (por ejemplo, ARCA modificado con fosfotioato), inosina, N1-metil-guanosina, 2'-fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, ANB-guanosina y 2-azido-guanosina.
Purificación: Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "purificación" o "purificar" significa que el ácido nucleico deseado en una muestra se separa y/o se aísla de impurezas, intermedios, subproductos y/o componentes de reacción presentes en la misma o que las impurezas, intermedios, subproductos y/o componentes de reacción al menos se agotan de la muestra que comprende el ácido nucleico. Ejemplos no limitantes de constituyentes no deseados de muestras que contienen a Rn que, por lo tanto, se tienen que agotar pueden comprender fragmentos degradados o fragmentos que han surgido como resultado de la finalización prematura de la transcripción, o también transcritos excesivamente largos si los plásmidos no se linealizan completamente. Además, los intermedios se pueden agotar de la muestra, tal como, por ejemplo, ADN molde. Adicionalmente, los componentes de reacción tales como enzimas, proteínas, ADN y ARN bacteriano, moléculas pequeñas tales como espermidina, componentes tamponantes, etc. pueden que se tengan que agotar de la muestra de ARN. Un ejemplo de una impureza proteínica presente en una muestra puede ser la enzima poli(A)polimerasa. Además, se pueden separar impurezas tales como disolventes orgánicos y nucleótidos u otras moléculas pequeñas. Una posibilidad es la purificación por medio de cromatografía de afinidad, como es bien conocido por los expertos en la técnica. Se dan marcas de purificación o afinidad adecuadas en SEQ ID NO: 181-201.
Inmovilización: El término "inmovilización" se refiere a la fijación de una molécula, en particular la Poli(N)polimerasa o poli(A)polimerasa de la presente invención, a un material inerte e insoluble que también se denomina soporte sólido.
Reactor enzimático: Un "reactor enzimático", también denominado "reactor de poliadenilación", puede ser cualquier reactor enzimático que comprenda un recipiente adecuado para comprender la Poli(N)polimerasa o preferentemente poli(A)polimerasa de la presente invención inmovilizada sobre un soporte sólido. El reactor enzimático es además adecuado para comprender los otros componentes de la reacción de polinucleotidilación/poliadenilación, tales como nucleótidos, en particular trifosfato de adenosina (ATP) y moléculas de ARN, así como agua, componentes tamponantes y sales y es adecuado para realizar la reacción de polinucleotidilación/poliadenilación. Eso significa que el reactor enzimático es adecuado para que el operario pueda aplicar las condiciones de reacción deseadas, por ejemplo, temperatura, concentración del componente de reacción, concentración de sal y tampón, presión y valor de pH. El reactor enzimático permite además la introducción y retirada de los componentes de reacción.
Componentes de reacción: "Componentes de reacción" o "componentes de la reacción de polinucleotidilación/adenilación" indican los componentes de la reacción de polinucleotidilación/poliadenilación, es decir, Poli(N)polimerasa o poli(A)polimerasa inmovilizada, respectivamente, nucleótidos o ATP, respectivamente, y ARN. Componentes adicionales son agua, componentes tamponantes y sales. En el transcurso de la reacción, surgen moléculas de poli(N/A)ARN que también se consideran componentes de reacción.
Aminoácidos recién introducidos: "Aminoácidos recién introducidos" indica aminoácidos que se introducen recientemente en una secuencia de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos natural. Normalmente, mediante mutagénesis, la secuencia de aminoácidos natural se cambia para tener una determinada cadena lateral aminoacídica en una posición deseada dentro de la secuencia de aminoácidos. En la presente invención, en particular el aminoácido cisteína se introduce recientemente en la secuencia de aminoácidos en una o más posiciones deseadas, ya que la cadena lateral de la cisteína, que es un grupo tiol, permite la inmovilización fácil y directa de la poli(N/A)polimerasa sobre un soporte sólido por medio de la formación de un puente disulfuro o enlace tioéter, dependiendo del grupo funcional del soporte sólido.
Grupo funcional: El término se debe entender de acuerdo con el conocimiento general de los expertos en la técnica e indica un resto químico que está presente en una molécula, en particular en el soporte sólido, y que puede participar en un enlace covalente o no covalente con otra molécula química, tal como una poli(N/A)polimerasa. Grupos funcionales ejemplares en el contexto de la invención son tiol, haloacetilo, disulfuro de piridilo, epoxi y un grupo maleimida.
Secuencia de aminoácidos natural: La expresión se debe entender de acuerdo con el conocimiento general de los expertos en la técnica e indica la secuencia de aminoácidos en la forma en que se produce en la naturaleza sin ninguna mutación o modificación aminoacídica por parte del ser humano. También se denomina "secuencia natural". "Poli(N/A)polimerasa natural" indica una poli(N/A)polimerasa que tiene la secuencia de aminoácidos como se produce en la naturaleza. La presencia o ausencia de una metionina N terminal, que depende del huésped de expresión usado, normalmente no cambia el estado de una proteína que se considera que tiene su secuencia natural u original.
Mutado, mutante: El término se debe entender de acuerdo con el conocimiento general de los expertos en la técnica. Una secuencia de aminoácidos se denomina "mutada" si contiene al menos un aminoácido adicional, eliminado o intercambiado en su secuencia de aminoácidos en comparación con su secuencia de aminoácidos natural u original, es decir, si contiene una mutación aminoacídica. Las proteínas mutadas también se denominan mutantes. "Mutado para que comprenda solo un residuo de cisteína" indica que la secuencia de aminoácidos se ha cambiado a nivel de aminoácidos de modo que la secuencia de aminoácidos contenga solo un residuo de cisteína. Esto puede incluir que se introdujo un residuo de cisteína por medio de mutagénesis dirigida al sitio o que se eliminaron uno o más residuos de cisteína, dejando solo un residuo de cisteína en la secuencia de aminoácidos. En general se entiende el término "mutante" como una proteína que difiere de su correspondiente secuencia natural en al menos un aminoácido. El término "mutante" también se usa en el presente documento si las proteínas naturales están prolongadas en el extremo C o en el extremo N. En el contexto de la invención, las proteínas PAP derivadas de Escherichia coli de acuerdo con, por ejemplo, SEQ ID NO: 16-18, 24-140 o 203 se consideran proteínas PAP de E. coli mutantes.
Homogéneo: "Homogéneas" o "esencialmente homogéneas" en el contexto de moléculas de ARN polinucleotidiladas/poliadeniladas indica que las moléculas de ARN comprenden una cola de poli(N/A) de esencialmente la misma longitud. "Esencialmente la misma longitud" indica que al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de las moléculas de ARN comprenden una cola de poli(N/A) que tiene el mismo número de nucleótidos/residuos de adenosina.
Genoterapia: Se puede entender típicamente que genoterapia significa un tratamiento del organismo de un paciente o elementos aislados del organismo de un paciente, por ejemplo, tejidos/células aisladas, mediante ácidos nucleicos que codifican un péptido o proteína. Típicamente puede comprender al menos una de las etapas de a) administración de un ácido nucleico, preferentemente una molécula de ácido nucleico artificial como se define en el presente documento, directamente al paciente, por cualquier vía de administración, o in vitro a células/tejidos aislados del paciente, que da como resultado la transfección de las células del paciente in vivo/ex vivo o in vitro; b) transcripción y/o traducción de la molécula de ácido nucleico introducida; y opcionalmente c) readministración de las células transfectadas aisladas al paciente, si el ácido nucleico no se ha administrado directamente al paciente.
Vacunación (genética): Se puede entender típicamente que "vacunación genética" o "vacunación" es vacunación mediante la administración de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno o un inmunógeno o fragmentos del mismo. La molécula de ácido nucleico se puede administrar al organismo de un sujeto o a células aisladas de un sujeto. Tras la transfección de determinadas células del organismo o tras la transfección de las células aisladas, el antígeno o inmunógeno se puede expresar por esas células y posteriormente se puede presentar al sistema inmunitario, provocando una respuesta inmunitaria adaptativa, es decir, específica de antígeno.
En consecuencia, la vacunación genética típicamente comprende al menos una de las etapas de a) administración de un ácido nucleico, preferentemente una molécula de ácido nucleico artificial como se define en el presente documento, a un sujeto, preferentemente un paciente, o a células aisladas de un sujeto, preferentemente un paciente, que normalmente da como resultado la transfección de las células del sujeto, in vivo o in vitro; b) transcripción y/o traducción de la molécula de ácido nucleico introducida; y opcionalmente c) readministración de células transfectadas aisladas al sujeto, preferentemente al paciente, si el ácido nucleico no se ha administrado directamente al paciente.
Inmunoterapia: Se debe entender el término "inmunoterapia" de acuerdo con el conocimiento general de los expertos en los campos de medicina y tratamiento. También se usan en este contexto las expresiones "tratamiento biológico" o "bioterapia". Es el tratamiento de una enfermedad induciendo, potenciando o suprimiendo una respuesta inmunitaria en el organismo de un paciente y comprende en particular inmunoterapia contra el cáncer. La inmunoterapia también se está aplicando en muchas otras áreas de enfermedades, incluyendo alergias, enfermedades reumatoides, autoinmunidad y trasplantes, así como en muchas infecciones, tales como VIH/SIDA y hepatitis.
Proteinoterapia de reposición: Se debe entender la expresión "proteinoterapia de reposición" de acuerdo con el conocimiento general de los expertos en los campos de medicina y tratamiento e indica, en su sentido más amplio, que una proteína que está ausente en un paciente o no disponible en la cantidad necesaria se proporciona al paciente o se "remplaza". En general, esto se hace administrando al paciente una infusión intravenosa que contiene la enzima. La enzimoterapia de reposición está disponible, por ejemplo, para enfermedades lisosómicas, tales como enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, MPS I, MPS II (síndrome de Hunter), MPS VI y glucogenosis de tipo II. La enzimoterapia de reposición no afecta el defecto genético subyacente, pero aumenta la concentración de la enzima carente.
Cantidad farmacéuticamente eficaz: Se entiende típicamente que una cantidad farmacéuticamente eficaz en el contexto de la invención es una cantidad que es suficiente para inducir un efecto farmacéutico, tal como una respuesta inmunitaria, la alteración de un nivel patológico de un péptido o proteína expresada, o la sustitución de un producto génico ausente, por ejemplo, en el caso de una situación patológica.
Semivida: El término "semivida", como se usa en el presente documento en el contexto de la administración de un poli(N/A)ARN a un paciente, se define como el tiempo necesario para que la concentración plasmática de un fármaco en un paciente se reduzca a la mitad. Puede haber más de una semivida asociada con el poli(N/A)ARN dependiendo de múltiples mecanismos de eliminación, redistribución y otros mecanismos bien conocidos en la técnica. Normalmente, las semividas alfa y beta se definen de modo que la fase alfa se asocia con la redistribución y la fase beta se asocia con la eliminación.
Síntesis química de ARN: La síntesis química de fragmentos relativamente cortos de oligonucleótidos con estructura química definida proporciona un acceso rápido y económico a oligonucleótidos personalizados de cualquier secuencia deseada. Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN solo en la dirección 5' a 3', la síntesis química de oligonucleótidos no tiene esta limitación, aunque se lleva a cabo muy a menudo en la dirección opuesta, es decir, de 3' a 5'. Actualmente, el procedimiento se implementa como síntesis en fase sólida usando el procedimiento de fosforamidita y componentes básicos de fosforamidita derivados de nucleósidos protegidos (A, C, G y U), o nucleósidos modificados químicamente.
Para obtener el oligonucleótido deseado, los componentes básicos se acoplan secuencialmente a la cadena oligonucleotídica creciente en una fase sólida en el orden requerido por la secuencia del producto en un procedimiento completamente automatizado. Una vez completado el ensamblaje de la cadena, el producto se libera de la fase sólida a la solución, se desprotege y se recoge. La aparición de reacciones secundarias establece límites prácticos para la longitud de los oligonucleótidos sintéticos (hasta aproximadamente 200 residuos nucleotídicos), porque el número de errores se incrementa con la longitud del oligonucleótido que se sintetiza. Los productos a menudo se aíslan mediante HPLC para obtener los oligonucleótidos deseados con alta pureza.
Los oligonucleótidos sintetizados químicamente encuentran una variedad de aplicaciones en biología molecular y medicina. Se usan muy habitualmente como oligonucleótidos de antisentido, ARN interferente pequeño, cebadores para la secuenciación y amplificación de ADN, sondas para detectar ADN o ARN complementario por medio de hibridación molecular, herramientas para la introducción dirigida de mutaciones y sitios de restricción, y para la síntesis de genes artificiales.
En el contexto de la invención, se puede usar ARN sintetizado químicamente para poliadenilación enzimática. Transcripción de ARN in vitro: La "transcripción de ARN in vitro" es un procedimiento que permite la síntesis dirigida por molde de moléculas de ARN de cualquier secuencia en un sistema sin células (in vitro). Se basa en la genomanipulación de un molde que incluye una secuencia promotora bacteriofágica (por ejemplo, del colífago T7) en dirección 5' de la secuencia de interés, seguida de la transcripción usando la ARN polimerasa correspondiente.
Ejemplos particulares de ARN polimerasas dependientes de ADN son las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Se puede obtener un molde de ADN para la transcripción in vitro de ARN clonando un ácido nucleico, en particular ADNc correspondiente al ARN respectivo a transcribir in vitro, e introduciéndolo en un vector apropiado para transcripción in vitro de ARN, por ejemplo, en ADN plasmídico. En un modo de realización preferente de la presente invención, el molde de ADN se linealiza con una enzima de restricción adecuada, antes de transcribirlo in vitro. El ADNc se puede obtener mediante retrotranscripción de ARNm o síntesis química. Además, el molde de ADN para la síntesis de ARN in vitro también se puede obtener mediante síntesis génica.
Los procedimientos para la transcripción de ARN in vitro son conocidos en la técnica (Geall et al. (2013) Semin. Immunol. 25(2): 152-159; Brunelle et al. (2013) Methods Enzymol. 530:101-14). Una mezcla de reacción ejemplar usada en dicho procedimiento incluye típicamente:
1) un molde de ADN linealizado con una secuencia promotora que tiene una alta afinidad de unión por su respectiva ARN polimerasa tal como ARN polimerasas codificadas por bacteriófagos;
2) trifosfatos ribonucleosídicos (NTP) para las cuatro bases (adenina, citosina, guanina y uracilo);
3) opcionalmente, un análogo de caperuza como se define a continuación (por ejemplo, m7G(5')ppp (5')G (m7G));
4) opcionalmente, otro nucleótido modificado como se define a continuación;
5) una ARN polimerasa dependiente de ADN que se puede unir a la secuencia promotora dentro del molde de ADN linealizado (por ejemplo, ARN polimerasa T7, T3 o SP6);
6) opcionalmente, un inhibidor de ribonucleasa (RNasa) para inactivar cualquier RNasa contaminante;
7) una pirofosfatasa para degradar el pirofosfato, que inhibe la transcripción;
8) MgCl2, que aporta iones Mg2+ como cofactor para la polimerasa;
9) un tampón para mantener un valor de pH adecuado, que también puede contener antioxidantes (por ejemplo, DTT) y/o poliaminas como espermidina en concentraciones óptimas, habitualmente basado en Tris-HCl o HEPES.
El ARN transcrito in vitro se puede usar en técnicas analíticas (por ejemplo, análisis de hibridación), estudios estructurales (para RMN y cristalografía de rayos X), en estudios bioquímicos y genéticos (por ejemplo, como reactivos de antisentido), como moléculas funcionales (ribozimas y aptámeros) y en vacunación (genética), genoterapia e inmunoterapia. En el contexto de la invención, se puede usar ARN transcrito in vitro para poliadenilación enzimática.
Descripción detallada de la invención
Para resolver los problemas mencionados anteriormente, la presente invención usa una Poli(N)polimerasa como se define en las reivindicaciones, o preferentemente una poli(A)polimerasa, en particular una poli(A)polimerasa bacteriana inmovilizada sobre un soporte sólido.
La poli(N/A)polimerasa se puede inmovilizar sobre el soporte sólido mediante unión covalente como se define en las reivindicaciones. La inmovilización puede ser por medio de cualquier cadena lateral de aminoácidos de la enzima PNP/PAP o por medio del extremo N o C. Se puede emplear cualquier reacción de acoplamiento, incluyendo química clic o Sephadex G-10 activada con amino para el acoplamiento a través de grupos carboxilo libres. Sin embargo, la inmovilización debe considerar que la enzima tiene que ser accesible para los sustratos de reacción, es decir, las moléculas de ARN y los nucleótidos. Debe considerar además suficiente espacio para la cola de poli(N/A) emergente en la molécula de ARN. En general, es conocido en la técnica en la técnica que la inmovilización de enzimas tales como PNP/PAP de la invención debe evitar impedimentos estéricos, agregación enzimática y desnaturalización (Mateo et al. (2007) Enzyme and Microbial Technology 40.6: 1451-1463.). Por tanto, es beneficioso inmovilizar la PNP/PAP por medio de un aminoácido que está localizado en la superficie de la proteína cuando se pliega correctamente en su forma tridimensional y no está dentro del centro activo de la enzima, es decir, no está implicado catalíticamente en la transferencia del monofosfato nucleosídico o el monofosfato del análogo nucleosídico desde el respectivo trifosfato nucleosídico o trifosfato del análogo nucleosídico a (poli(N/A))ARN. Este aspecto es importante para que la PNP/PAP conserve su actividad biológica, aunque esté inmovilizada sobre un soporte sólido.
En general, la inmovilización de una enzima se puede realizar de diversas formas, como se ejemplifica en diversas revisiones, que incluyen (Datta et al. (2013) 3 Biotech 3.1: 1-9; Kim y Herr (2013) Biomicrofluidics 7.4: 041501).
Las estrategias de acoplamiento comprenden principalmente, pero no se limitan a, atrapamiento, encapsulación, adsorción física, interacciones de bioafinidad y enlace covalente. En la figura 1 se proporciona una representación esquemática de posibles estrategias de inmovilización para la PNP/PAP de la presente invención. Un soporte de inmovilización, es decir, el soporte sólido de la invención puede comprender metales, silicio, vidrio, polidimetilsiloxano (PDMS), materiales plásticos, membranas porosas, papeles, sol-geles a base de alcoxisilano, agarosa, Sepharose, polimetilacrilato, poliacrilamida, celulosa y sílice, soportes monolíticos y adsorbentes de lecho expandido.
La Poli(N)polimerasa o poli(A)polimerasa se inmoviliza sobre el soporte sólido mediante unión covalente.
Se considera que la inmovilización covalente tiene la ventaja de que la proteína respectiva a inmovilizar y el soporte sólido correspondiente tienen la unión más fuerte y estable, lo que se supone que minimiza el riesgo de que las proteínas se disocien del soporte sólido, también denominado fuga enzimática.
Para conseguir la unión de la PNP/PAP al soporte sólido, el soporte sólido respectivo se tiene que activar químicamente por medio de reactivos que sean reactivos. A continuación, el soporte sólido activado reacciona con los grupos funcionales en los residuos aminoacídicos y las cadenas laterales de la PNP/PAP para formar enlaces covalentes.
Los grupos funcionales que son adecuados para la unión covalente comprenden aminas primarias (-NH2) que existen en el extremo N de cada cadena polipeptídica y en la cadena lateral de lisina (Lys, K), grupos a-carboxilo, tales como en el extremo C, y los grupos p- y Y-carboxilo de ácido aspártico y glutámico, y grupos sulfhidrilo o tiol de cisteínas. Estos grupos funcionales se localizan preferentemente en la superficie expuesta al disolvente de la PNP/PAP correctamente plegada en tridimensionalmente.
Las aminas primarias (-NH2) proporcionan un objetivo simple para diversas estrategias de inmovilización. Esto implica el uso de grupos químicos que reaccionan con aminas primarias. Las aminas primarias tienen carga positiva a pH fisiológico; por lo tanto, se producen predominantemente en las superficies externas de la proteína y son en su mayoría accesibles a procedimientos de inmovilización.
Los materiales de soporte sólido adecuados para la inmovilización por medio de aminas primarias comprenden, pero no se limitan a, materiales de soporte activados con formaldehído y glutaraldehído, materiales de soporte activados con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES), materiales de soporte activados con bromuro de cianógeno (CnBr), materiales de soporte activados con ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) e imidoésteres, materiales de soporte activados con azlactona y materiales de soporte activados con carbonildiimidazol (CDI).
El grupo carboxilo es un resto frecuente (-COOH) en el extremo C de cada cadena polipeptídica y en las cadenas laterales de ácido aspártico (Asp, D) y ácido glutámico (Glu, E), normalmente localizado en la superficie de la estructura proteínica. Se pueden usar ácidos carboxílicos para inmovilizar la PNP/PAP a través del uso de una reacción mediada por carbodiimida. La 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y otras carbodiimidas provocan la conjugación directa de carboxilatos (-COOH) con aminas primarias (-NH2).
Los posibles soportes sólidos comprenden, pero no se limitan a, resina de diaminodipropilamina (DADPA) agarosa que permite la reticulación directa mediada por EDC, que normalmente provoca la polimerización aleatoria de proteínas.
En un modo de realización preferente de la invención, la inmovilización covalente es por medio de un grupo único y mutuamente reactivo en la superficie de la proteína (por ejemplo, grupo tiol de cisteína) y el soporte sólido (por ejemplo, soporte sólido activado con tiol, tal como como Sepharose activada con tiol o maleimida o soporte activado con epoxi tal como epoxi metacrilato). Además, la reacción entre los dos grupos reactivos debe ser muy selectiva. Además, la reacción de acoplamiento debe funcionar eficazmente en condiciones fisiológicas (es decir, en tampones acuosos alrededor de pH neutro) para evitar la desnaturalización de la proteína durante la etapa de inmovilización. Por último, es deseable que el grupo reactivo de la proteína se pueda obtener usando técnicas de expresión de proteínas recombinantes o que ya esté presente de forma natural en la superficie de la proteína. Muchos grupos reactivos usados para la inmovilización covalente (véase anteriormente) habitualmente están presentes múltiples veces en una proteína. Sin embargo, debido a la naturaleza fuerte de los enlaces covalentes, múltiples enlaces podrían alterar la conformación tridimensional o destruir el núcleo catalítico u otros dominios proteínicos pertinentes. Por lo tanto, a menudo se requiere una química complicada para conseguir la inmovilización orientada de enzimas (por ejemplo, bloqueo químico de otros grupos reactivos en la enzima tales como etanolamina para bloquear grupos amina reactivos excesivos). La inmovilización covalente específica de sitio permitiría inmovilizar las enzimas de una manera definida y orientada. Sin embargo, este procedimiento requiere la presencia de grupos únicos y mutuamente reactivos en la proteína (por ejemplo, grupo tiol de cisteína) y el soporte (por ejemplo, Sepharose activada con tiol). Además, la reacción entre los dos grupos reactivos debe ser muy selectiva. Además, la reacción de acoplamiento debe funcionar eficazmente en condiciones fisiológicas (es decir, en tampones acuosos alrededor de pH neutro) para evitar la desnaturalización de la proteína durante la etapa de inmovilización. Por último, es deseable que el grupo reactivo de la proteína se pueda obtener usando técnicas de expresión de proteínas recombinantes.
Los grupos tiol, también denominados grupos sulfhidrilo, que tienen la estructura R-SH, permiten una inmovilización selectiva de proteínas y péptidos, ya que se producen habitualmente en frecuencias más bajas (Hansen et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA106.2: 422-427). Los grupos tiol se pueden usar para reacciones de inmovilización directa de PNP/PAP a materiales de soporte sólido activados, formando enlaces tioéter (R-S-R) preparados mediante la alquilación de tioles o enlaces disulfuro (R-S-S-R) derivados del acoplamiento de dos grupos tiol. Los grupos tiol necesarios para esas reacciones pueden tener diferentes fuentes:
a) Grupos tiol de residuos de cisteína libres inherentes o naturales, en particular grupos tiol que no participan en los puentes disulfuro de la proteína correctamente plegada tridimensionalmente.
b) A menudo, como parte de la estructura secundaria o terciaria de una proteína, los residuos de cisteína se unen conjuntamente entre sus cadenas laterales por medio de enlaces disulfuro. Los grupos tiol se pueden generar a partir de puentes disulfuro existentes usando agentes reductores.
c) Los grupos tiol se pueden generar usando reactivos de tiolación, que añaden grupos tiol a aminas primarias. d) Los grupos tiol se pueden introducir genéticamente añadiendo un residuo de cisteína en el extremo C o N o sustituyendo un residuo aminoacídico dentro de la proteína por otro aminoácido, en particular una cisteína. Los grupos tiol también se pueden introducir introduciendo un residuo de cisteína en la secuencia de aminoácidos natural, preferentemente en una región de la proteína que no es importante para la actividad catalítica de la proteína ni importante para su integridad estructural, tal como a menudo las estructuras de bucle o giro.
En un modo de realización preferente, las PNP/PAP se acoplan covalentemente al soporte sólido por medio del grupo tiol de cisteína (natural o introducida) a un material de soporte, más preferentemente se acoplan por medio de un enlace disulfuro a un soporte sólido activado con tiol, por medio de un enlace tioéter a un soporte sólido activado con maleimida o a un soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo o a un soporte activado con epoxi, más preferentemente a un soporte sólido activado con tiol, por medio de un enlace tioéter a un soporte sólido activado con maleimida o a un soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo. El soporte sólido activado con tiol contiene grupos químicos que pueden reaccionar con el grupo tiol de la PNP/PAP, tales como maleimidas, epoxi, haloacetilos y disulfuros de piridilo. Los soportes sólidos adecuados incluyen tiol-Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada con tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice y microesferas de epoxi metacrilato. Más preferentemente, el soporte sólido activado con tiol contiene grupos químicos que pueden reaccionar con el grupo tiol de la PNP/PAP, tales como maleimidas, haloacetilos y disulfuros de piridilo. Incluso más preferente, los soportes sólidos adecuados incluyen tiol-Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada con tiol a base de sílice y microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice. Ejemplos específicos de Sepharose activada con tiol son tiol-Sepharose 4B HiTrap o tiol-Sepharose 4B. Los soportes funcionalizados con disulfuro de piridilo adecuados incluyen nanopartículas tales como Nanosprings® de STREM chemicals o cualquier soporte que contenga amina tiolado por un disulfuro de N-hidroxisuccinimida-piridilo como disulfuro de NHS-PEG4-piridilo. En otros ejemplos, el soporte sólido comprende nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo y/o agarosa activada con maleimida.
El soporte sólido puede ser una mezcla de los soportes sólidos mencionados en el presente documento. Sin embargo, es preferente tener el mismo grupo funcional presentado en el soporte sólido, es decir, el grupo tiol. Por ejemplo, en un solo reactor enzimático se pueden usar tiol-Sepharose, tiopropil-Sepharose y Sephadex activada con tiol para la inmovilización de la PNP/PAP.
Preferentemente, el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada por tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo, agarosa activada con maleimida, microesferas de epoxi metacrilato y mezclas de los mismos. Preferentemente, el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada por tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo, agarosa activada con maleimida y mezclas de los mismos.
En un modo de realización preferente de la invención, el soporte sólido de acuerdo con la presente invención es tiopropil-Sepharose 6B (proporcionada, por ejemplo, por GE Healthcare).
Los autores de la invención consideran que esta estrategia es en general ventajosa porque, habitualmente, solo existe un número bajo de grupos tiol libres existentes en la secuencia de aminoácidos de las enzimas (Hansen et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA106.2: 422-427).
Esto permite una forma de inmovilización prácticamente específica de sitio y eficaz. Es preferente dicha inmovilización orientada. Adicionalmente, esta estrategia de inmovilización puede evitar múltiples acontecimientos de acoplamiento al soporte sólido. Además, el acoplamiento covalente por medio de grupos tiol de la respectiva PNP/PAP puede tener la ventaja de un enlace muy fuerte que, lo más importante, minimiza el peligro de una disociación incontrolada del material de soporte y la enzima.
Si una PNP/PAP se puede acoplar covalentemente por medio del grupo tiol de una cisteína al soporte sólido, un experto en la técnica debe considerar varios aspectos:
I) Si varios residuos de cisteína están presentes en la estructura primaria de la proteína, los grupos tiol libres, es decir, los residuos de cisteína no ligados a otros residuos de cisteína por medio de puentes disulfuro, se pueden identificar usando algoritmos de predicción de puentes disulfuro (Yaseen, Ashraf y Yaohang Li. BMC bioinformatics 14. Supl. 13 (2013): S9.).
II) Los grupos tiol que existen de forma libre no deben estar presentes en el núcleo catalítico u otras partes funcional o estructuralmente pertinentes de la PNP/PAP, ya que esto reduciría o incluso podría destruir la actividad enzimática de la enzima. Opcionalmente, un experto en la técnica puede ejecutar en primer lugar la presente publicación sobre la estructura de PNP/PAP o la publicación sobre las relaciones de estructura-función para identificar dichos residuos de cisteína potenciales.
III) Si varios grupos tiol libres están presentes en la secuencia primaria de la proteína, que no están localizados en el núcleo catalítico u otras partes funcional o estructuralmente pertinentes de la PNP/PAP, las cisteínas respectivas se pueden sustituir con un aminoácido diferente, preferentemente serina (tamaño similar) o alanina (carga similar) o valina, preferentemente por medios genéticos. Esto puede ayudar a evitar múltiples acontecimientos de acoplamiento al soporte sólido. Las herramientas de visualización de proteínas (por ejemplo, PDB viewer, Guex y Peitsch (1997) Electrophoresis 18: 2714-2723) pueden ayudar a un experto en la técnica a decidir si los residuos de cisteína respectivos se deben sustituir en la PNP/PAP. De forma alternativa, el experto puede emplear fácilmente cualquiera de las estrategias de inmovilización descritas en el presente documento y someter a prueba la PNP/PAP para su actividad catalítica. Además, también se puede estimar el efecto de determinadas sustituciones de cisteína y/o mutaciones puntuales, incluso sin conocimiento estructural, usando herramientas de predicción basadas en aprendizaje automático (Rost et al. (2004) Nucl. Acids Res. 32. Supl. 2: W321-W326).
IV) Si los grupos tiol libres están presentes en la secuencia de aminoácidos de la respectiva PNP/PAP, un experto en la técnica también puede usar las publicaciones recientes sobre la estructura proteínica respectiva, si está disponible, para evaluar si estos residuos de cisteína son accesibles para interacciones químicas (es decir, enlace covalente a un material de soporte), o si estos residuos de cisteína están enterrados en el interior de la estructura tridimensional de la proteína. Un experto en la técnica puede usar algoritmos para predecir si una cisteína respectiva está enterrada o es accesible libremente realizando cálculos que comprenden cálculos de profundidad del residuo o cálculos de área de superficie accesible al disolvente (Xu, Dong, Hua Li y Yang Zhang. Journal of Computational Biology 20.10 (2013): 805-816). De forma alternativa, el experto puede emplear fácilmente cualquiera de las estrategias de inmovilización descritas en el presente documento y someter a prueba la PNP/PAP para su actividad catalítica.
V) Si no hay residuos de cisteína accesibles libremente presentes en la estructura primaria de la respectiva PNP/PAP, se pueden introducir residuos de cisteína por diversos medios. Por ejemplo, se pueden introducir residuos de cisteína en el extremo N o extremo C de la PNP/PAP mediante procedimientos que comprenden genomanipulación, prolongando el extremo N o el extremo C o por sustitución del aminoácido lo más N terminal o lo más C terminal. Además, un experto en la técnica puede introducir conectores flexibles, en particular, si el extremo N o C de la PNP/PAP presenta características funcionales o estructurales importantes. De nuevo, también se pueden introducir residuos de cisteína en cualquier otra región adecuada de la proteína mediante sustitución de aminoácidos dentro de estas regiones. Idealmente, dichos residuos deben estar localizados en la superficie de la proteína y posiblemente en estructuras de bucle o giro que a menudo no desempeñan una función en la integridad estructural de la proteína o son pertinentes para su actividad enzimática. Preferentemente, un aminoácido que ocupa un espacio similar en la estructura tridimensional de una proteína, tal como serina, se puede considerar para una sustitución de S por C y, viceversa, si se van a eliminar residuos de cisteína.
De forma alternativa, o además de eso, los residuos de cisteína se pueden sustituir con cualquier otro aminoácido. Por ejemplo, la secuencia de PNP/PAP natural se puede alinear con múltiples secuencias relacionadas de otros organismos para identificar sustituciones aminoacídicas adecuadas que no influyan en la actividad enzimática. Un experto en la técnica conocerá la manera de encontrar secuencias similares y la manera de alinear esas secuencias y la manera de identificar aminoácidos adecuados para sustituir cisteínas naturales en una PNP/PAP.
El residuo de cisteína usado preferentemente para el acoplamiento puede estar presente en la enzima natural, es decir, en la secuencia de aminoácidos natural de PNP/PAP, si está en una posición adecuada para el acoplamiento, o se puede introducir en la secuencia de aminoácidos de la enzima en una posición adecuada tal como el extremo N o C de la enzima. El residuo de cisteína se puede acoplar al extremo N o C directamente, es decir, formando un enlace peptídico con el aminoácido N o C terminal de la PNP/PAP natural, o por medio de un conector como se define en el presente documento. De forma alternativa, el aminoácido N o C terminal de la enzima natural se puede sustituir con un residuo de cisteína.
Elementos conectores en particular preferentes de acuerdo con la presente invención comprenden elementos conectores como se representa en s Eq ID NO: 156-180.
En un modo de realización preferente de la invención, se usa un conector flexible GGGGSGGGGS (de acuerdo con SEQ ID NO: 170).
Adicionalmente, cualquier residuo de cisteína presente en la enzima natural que no sea adecuado para acoplamiento a un soporte sólido se puede sustituir opcionalmente con otro aminoácido, tal como serina o alanina o valina, para evitar cualquier acoplamiento residual mediante este residuo de cisteína.
En un modo de realización incluso más preferente, la PNP/PAP se inmoviliza mediante unión covalente a un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo o soporte sólido activado con maleimida; muy preferentemente la PNP/PAP se inmoviliza mediante unión covalente a un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo, soporte activado con epoxi o soporte sólido activado con maleimida. En un modo de realización en particular preferente, la PNP/PAP se inmoviliza por medio de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína. Y lo más preferentemente, la unión covalente es un puente disulfuro o un enlace tioéter.
Preferentemente, el soporte sólido comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex, agarosa, sílice, microesferas magnéticas y nanopartículas o casi cualquier otro material que se pueda funcionalizar con cualquiera de los grupos funcionales mencionados en el presente documento, en particular con grupos tiol, epoxi, disulfuro de piridilo o malemida. También se pueden usar mezclas de los materiales de soporte sólido.
En un modo de realización preferente, la PNP/PAP se inmoviliza por medio de un grupo tiol que está presente en la PNA/P natural. En otro modo de realización preferente, la PNP/PAP se inmoviliza por medio de un grupo tiol recién introducido, es decir, por medio de un residuo de cisteína recién introducido. En otro modo de realización preferente, la PNP/PAP se inmoviliza por medio de un grupo tiol de un residuo de cisteína mientras se han eliminado uno o más residuos de cisteína, es decir, se han remplazado por residuos de alanina y/o serina.
En principio, la introducción de residuos de cisteína en PNP/PAP es posible por medio de la sustitución de aminoácidos con cisteína en cualquier posición de la secuencia primaria de la proteína o prolongando los extremos N o C libres. Sin embargo, un experto en la técnica debe considerar varios aspectos importantes si se va a introducir un residuo de cisteína en PNP/PAP por medio de sustitución:
I) Los aminoácidos que son en particular importantes para la actividad catalítica de PNP/PAP no se deben sustituir por cisteína.
II) Otros residuos aminoacídicos que están localizados en la superficie de PNP/PAP son objetivos potenciales para sustitución con cisteína. En particular, los residuos de serina que tienen un tamaño similar al de los residuos de cisteína pueden ser objetivos preferentes.
III) Los aminoácidos que no están en la superficie de PNP/PAP no se deben cambiar a cisteína, ya que sus grupos tiol podrían no estar en una posición especial para reaccionar con el soporte sólido respectivo. Además, una sustitución de residuos localizados en el interior de la proteína puede alterar localmente la estructura de la proteína.
Dentro del alcance de la presente invención, no solo se puede usar la PNP/PAP natural, sino también variantes funcionales de la misma. Las variantes funcionales de la PNP/PAP tienen una secuencia que difiere de la de PNP/PAP natural en una o más sustituciones, eliminaciones o adiciones aminoacídicas, lo que da como resultado una identidad de secuencia con la PNP/PAP natural de al menos un 80 %, preferentemente de al menos un 81 %, 82 %, 83 %, 84 % u 85 %, más preferentemente de al menos un 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 %, incluso más preferentemente de al menos un 95 %, 96 % y lo más preferentemente de al menos un 97 %, 98 % o 99 %. Las variantes definidas como anteriormente son variantes funcionales, si conservan la función biológica de la enzima original y natural, es decir, la capacidad de polinucleotidilar o poliadenilar ARN. La actividad enzimática de la variante funcional de PNP/PAP es al menos un 50 %, 60 % o 70 %, preferentemente al menos un 75 %, 80 % u 85 %, más preferentemente al menos un 87 %, 89 %, 91 % o 93 % y lo más preferentemente al menos un 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la enzima natural derivada de Escherichia coli, Streptomyces coelicolor, Meiothermus silvanus, Bacillus subtilis, Thermus aquaticus, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Citrobacter koseri, Salmonella bongori, Salmonella entérica, Trabulsiella guamensis, Kluyvera ascorbata, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Enterococcus gallinarum, Grimontia indica o Salinivibrio costicola, tales como PAP-I de E. coli.
Preferentemente, la poli(N/A)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 1 a 22, 24 a 155 y 203. Más preferentemente, la poli(N/A)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 1 a 15. Más preferentemente, la poli(N/A)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 16 a 22, 24 a 155 y 203. SEQ ID NO: 16 a 22, 24 a 155 y 203 son secuencias mutantes, en las que se han introducido residuos de cisteína adicionales para facilitar la unión a un soporte sólido o se han eliminado residuos de cisteína, por ejemplo, por sustitución con residuos de alanina y/o serina y/o valina para tener una unión dirigida al sitio al soporte sólido. En SEQ ID NO: 18, 20, 22, 58 a 84 y 143 a 145, se ha fijado un conector de glicina, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de 6 residuos de glicina al extremo C que sirve como conector a una cisteína C terminal. Dichos conectores también facilitan la unión de la enzima a un soporte sólido mientras que permiten la flexibilidad de la cadena polipeptídica que puede ser necesaria para la actividad enzimática.
En SEQ ID NO: 85 a 112, 146 a 149 y 154 se ha fijado un conector flexible, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la secuencia GGGGSGGGGS, al extremo C que sirve como conector a una cisteína C terminal. Dichos conectores también pueden facilitar la unión de la enzima a un soporte sólido mientras que permiten la flexibilidad de la cadena polipeptídica que puede ser necesaria para la actividad enzimática.
En SEQ ID NO: 113 a 140, 150 a 153, 155 y 203, se ha fijado un conector flexible y un tramo de oligohistidina, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la secuencia GGGGGSGGGGSHHHHHH al extremo C que sirve como conector a una cisteína C terminal. El tramo de oligohistidina se puede usar para la purificación de la proteína genomanipulada (por ejemplo, cuando se expresa en un sistema heterólogo, por ejemplo, en bacterias). Se dan más ejemplos de marcas de afinidad/purificación en SEQ ID NO: 181-201.
Cuando se van a introducir residuos para que sirvan como punto de fijación para la inmovilización sobre un soporte sólido, tales como residuos de cisteína, esto se puede hacer en el extremo N o C o dentro de la secuencia de aminoácidos.
Antes de modificar la secuencia de aminoácidos, es útil usar datos estructurales tridimensionales para evaluar si la parte respectiva de la secuencia es pertinente para la integridad estructural de la proteína o desempeña una función en la actividad enzimática de p Np/PAP. Lo mismo se aplica si un residuo se debe remplazarse o eliminar dentro de la secuencia de aminoácidos. Un residuo, tal como un residuo de cisteína, para inmovilizar la enzima a un soporte sólido se debe exponer al disolvente y no debe ser pertinente para la integridad estructural o la función biológica de la enzima. De este modo, se identificó que Cys 346 en SEQ ID NO: 1 estaba expuesta al disolvente y, por tanto, era adecuada para inmovilizar la PNP/PAP a un soporte sólido. Lo más preferentemente, la poli(N/A)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos como se representa en SEC ID NO: 1 a 22, 24 a 155 y 203.
En particular preferente, la Poli(N)polimerasa es una poli(A)polimerasa, preferentemente poli(A)polimerasa I (PAP-I), opcionalmente derivada de E. coli, tal como Escherichia coli B7A (Toh et al., 2011), que está codificada por el gen pcnB (SEQ ID NO: 1).
Preferentemente, la poli(A)polimerasa de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 % o al menos un 85 %, incluso más preferentemente al menos un 90 %, o un 95 % o lo más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % idéntica a cualquiera de los aminoácidos representados en s Eq ID NO: 1 a 22, 24 a 155 y 203 o a una secuencia de PNP/PAP natural existente en la naturaleza.
Además, en modos de realización donde se usa un conector flexible de 6 glicinas (por ejemplo, SEQ ID NO: 18, 20, 22, 58-84 y 143-145), o en modos de realización donde se usa un conector Gg GGs Gg GGS flexible (por ejemplo, SEQ ID NO: 85-112, 146-148 y 154), esos conectores también se pueden diseñar de forma diferente (otros conectores de glicina-serina, longitud de conector diferente, etc.), tales como los elementos conectores representados en SEQ ID NO: 156-180.
Además, en modos de realización donde se ha introducido una marca de purificación (por ejemplo, SEQ ID NO: 113-140, 150-153 y 155), esas marcas de purificación también se pueden diseñar de manera diferente, por ejemplo, de acuerdo con las marcas de purificación SEQ ID NO: 181-201.
En otro modo de realización preferente, la poli(N/A)polimerasa comprende al menos un residuo de cisteína recién introducido en comparación con una poli(N/A)polimerasa natural. Preferentemente, la PNP/PAP de la invención comprende solo un residuo de cisteína o se muta para que comprenda solo un residuo de cisteína (véase la sección de ejemplos), por ejemplo, de acuerdo con SEQ ID NO: 16-22, 24-83, 85-111, 113-139, 141-144, 146­ 148, 150-152, 154-155 o 203.
Además de la definición de "aminoácidos recién introducidos", el aminoácido recién introducido, tal como el residuo de cisteína recién introducido, se puede introducir en la secuencia de aminoácidos natural o una mutada entre dos residuos aminoacídicos ya existentes en la secuencia de aminoácidos natural mutada o se puede introducir en el lugar de un residuo aminoacídico ya existente en la secuencia de aminoácidos natural o mutada, es decir, se intercambia un aminoácido existente por la secuencia de aminoácidos recién introducida. Además, se pueden introducir determinados aminoácidos o tramos de aminoácidos (o marcas) adecuados para la purificación de la enzima recombinante, por ejemplo, tal como marcas de oligohistidina (marca de HIS), marcas FLAG, etc.
Es posible identificar los residuos en la variante o mutante que correspondan a los de la enzima natural alineando las secuencias de aminoácidos de las enzimas naturales y variantes usando un programa informático de alineación conocido por el experto.
En un modo de realización preferente de la invención, la poli(A)polimerasa es una PAP de Escherichia coli mutada de acuerdo con SEQ ID NO: 113. En dicha PAP mutada, todos los residuos de cisteína naturales se han sustituido con una alanina. Además, la PAP mutada comprende adicionalmente un conector flexible C terminal y un tramo de oligohistidina y una cisteína C terminal (véase la sección de ejemplos). Los autores de la invención muestran que dicha enzima es activa en solución y que permanece activa cuando se inmoviliza sobre un soporte sólido.
El soporte sólido opcionalmente comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex, agarosa, sílice, microesferas magnéticas, nanopartículas, por ejemplo, Nanosprings™ (obtenible de STREM chemicals, Cambridge, Reino Unido), microesferas de epoxi metacrilato y mezclas de los mismos.
En un modo de realización preferente, el soporte sólido es tiopropil-Sepharose 6B.
Existen varios enfoques diferentes en la técnica para unir el soporte sólido respectivo a proteínas que contienen grupo tiol. Los grupos químicos reactivos con tiol presentes en materiales de soporte activados con tiol incluyen maleimidas, epoxi, haloacetilos, disulfuros de piridilo y otros agentes reductores de disulfuro. La mayoría de estos grupos se conjugan con tioles en la proteína respectiva por alquilación (normalmente la formación de un enlace tioéter) o intercambio de disulfuro (formación de un enlace disulfuro). Los términos "funcionalizado" y "activado" con respecto al soporte sólido se usan de manera intercambiable y se refieren al grupo químico que está disponible en la superficie del soporte sólido para la inmovilización de la PNP/PAP.
Los reactivos activados con maleimida reaccionan específicamente con grupos tiol (-SH) en condiciones casi neutras (pH 6,5-7,5) para formar enlaces tioéter estables. La química de la maleimida es la base de la mayoría de los reticulantes y reactivos de marcaje diseñados para la conjugación de grupos tiol. Los compuestos que contienen tiol, tal como ditiotreitol (DTT) y beta-mercaptoetanol (BME), se deben excluir de los tampones de reacción usados con maleimidas, porque competirán por los sitios de acoplamiento.
Los haloacetilos reaccionan con grupos tiol a pH fisiológico. La reacción del grupo yodoacetilo prosigue por sustitución nucleófila de yodo con un átomo de azufre de un grupo tiol, lo que da como resultado un enlace tioéter estable. El uso de un ligero exceso del grupo yodoacetilo sobre el número de grupos tiol a pH 8,3 garantiza la selectividad de tiol. Las cadenas laterales de histidilo y los grupos amino reaccionan en forma no protonada con grupos yodoacetilo por encima de pH 5 y pH 7, respectivamente. Para limitar la generación de yodo libre, que tiene el potencial de reaccionar con residuos de tirosina, histidina y triptófano, las reacciones y preparaciones de yodoacetilo se deben realizar en la oscuridad.
Los disulfuros de piridilo reaccionan con grupos tiol en un amplio intervalo de pH (el óptimo es pH 4 a 5) para formar enlaces disulfuro. Durante la reacción, se produce un intercambio de disulfuro entre el grupo -SH de la molécula y el grupo 2-piridilditiol del reactivo. Como resultado, se libera piridina-2-tiona y se puede medir espectrofotométricamente (Amáx = 343 nm) para supervisar el progreso de la reacción. Estos reactivos se pueden usar como reticulantes y para introducir grupos tiol en proteínas. El intercambio de disulfuro se puede realizar a pH fisiológico, aunque la velocidad de reacción es más lenta que en condiciones ácidas. Se puede obtener más información sobre los grupos reactivos de disulfuro de piridilo de Van der Vlies et al. (2010, Bioconjugate Chem., 21 (4), págs. 653-662).
Otro soporte sólido muy potente es un soporte sólido funcionalizado con epoxi. El epoxi comprende el grupo funcional representado en la fórmula (I):
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Se pueden usar matrices activadas con epoxi para acoplar ligandos de forma estable a través de grupos amino, tiol, fenólicos o hidroxilo, dependiendo del pH empleado en la reacción de acoplamiento. La inmovilización por medio de grupos epoxi también se describe por Mateo et al., "Multifunctional epoxy supports: a new tool to improve the covalent immobilization of proteins. The promotion of physical adsorptions of proteins on the supports before their covalent linkage", Biomacromolecules 1.4 (2000): 739-745. Si la reacción de inmovilización tiene lugar a un pH entre 7,5-8,5, es decir, en condiciones fisiológicas, la fijación se produce en los grupos tiol, si la reacción tiene lugar a un pH entre 9 y 11, la fijación se produce en los residuos de amina y si la reacción tiene lugar a un pH por encima de 11, la fijación se produce en los grupos hidroxilo.
Los soportes sólidos adecuados incluyen tiol-Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada por tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo, agarosa activada con maleimida, microesferas de epoxi metacrilato y mezclas de los mismos. Existen varios materiales de soporte activados con tiol disponibles comercialmente que comprenden Sepharose activada con tiol tal como tiol-Sepharose 4B (GE Healthcare, Chalfont St Gile, Reino Unido) y agarosa activada con tiol que se usan preferentemente para inmovilizar PNP/PAP que contienen grupos tiol. Los materiales de soporte sólido en particular preferentes se seleccionan del grupo que consiste en soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo, soporte sólido activado con maleimida y mezclas de los mismos. Los más preferentes son un soporte sólido activado con tiol y un soporte sólido activado con maleimida. Es preferente un soporte sólido seleccionado del grupo que consiste en tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada por tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo, agarosa activada con maleimida y mezclas de los mismos. Es más preferente un soporte sólido seleccionado de tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, agarosa activada con maleimida y otro soporte que contenga amina tiolado por un disulfuro de N-hidroxisuccinimida-piridilo como disulfuro de NHS-PEG4-piridilo. Lo más preferentemente, el soporte sólido es tiol-Sepharose 4B. Ejemplos de resinas activadas con epoxi son epoxi metacrilato Purolite® ECR8205 y epoxi metacrilato Purolite® ECR8214, por ejemplo, que son obtenibles de Purolite® Corp., Llantrisant, Reino Unido, que se producen por medio de reticulación en presencia de un agente porógeno que permite el control de la porosidad, o microesferas de epoxi metacrilato ECR8204F que se son obtenibles de Lifetech™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA EE. UU.). Las microesferas ECR82o4f tienen un diámetro de 150-300 |jm (media = 198) y poros de 300-600 A. En otros ejemplos, el soporte sólido comprende nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo y/o agarosa activada con maleimida.
La PNP/PAP inmovilizada en Sepharose se puede volver a solubilizar usando agentes reductores tales como DTT o mercaptoetanol, o pH bajo para reutilizar potencialmente el material de soporte.
Lo más preferentemente, la unión covalente entre el soporte sólido y la PNP/PAP es un puente disulfuro o un enlace tioéter.
Soportes sólidos ejemplares son tiol-Sepharose 4B activada (GE, Fairfield, CT, EE. UU.), tiopropil-Sepharose 6B (GE, Fairfield, CT, EE. UU.), Sephadex G-10 activada con tiol (GE, Fairfield, CT, EE. UU.), agarosa activada con tiol (Cube Biotech, Monheim, Alemania), agarosa activada con maleimida (Cube Biotech, Monheim, Alemania) o metacrilato activado con epoxi (Purolite® ECR8205 o Purolite® ECR8214).
La PNP de la presente invención se selecciona de un grupo que consiste en poli(A)polimerasa, poli(C)polimerasa, poli(G)polimerasa y poli(U)polimerasa. Son preferentes poli(A/U)polimerasas (poli(U)polimerasa = PUP) de eucariotas, pertenecientes a la familia de polimerasa beta, que comprenden la uridililtransferasa terminal 4 de Homo sapiens (uniprot: ZCCHC11), Cit-1 de Schizosaccharomyces pombe (uniprot: 013833), ARN uridililtransferasa 4 de Trypanosoma brucei (uniprot: A4UBD5), proteína 2 de poli(A)ARN polimerasa de Saccharomyces cerevisiae (uniprot: P53632), mientras que sería preferente Cit-1 de Schizosaccharomyces pombe.
Lo más preferentemente, la PNP de la presente invención es una poli(A)polimerasa (PAP).
La poli(N/A)polimerasa es de origen bacteriano. La poli(N/A)polimerasa puede derivar de cualquier bacteria. Preferentemente, la poli(N/A)polimerasa deriva de una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Escherichia coli (E. co li), Streptomyces coelicolor, Meiothermus silvanus (M. Silvanus), Bacillus subtilis, Thermus aquaticus (T. aquaticus), Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Citrobacter koseri, Salmonella bongori, tal como N268-08, Salmonella enterica, Trabulsiella guamensis, Kluyvera ascorbata, tal como la disponible en la ATCC Bacteriology Collection, cepa n.° ATCC33433, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Enterococcus gallinarum, tal como cepa EGD-AAK12, Grimontia indica y Salinivibrio costicola. T. aquaticus y M.silvanus son bacterias termófilas. En comparación con la PNP/PAP derivada de E. coli, sus PNP/PAP pueden funcionar a temperaturas incrementadas debido a una estabilidad térmica mejorada. Además, la estabilidad térmica mejorada puede dar lugar a una semivida/vida útil más larga de dichas enzimas inmovilizadas.
En un modo de realización preferente, la PNP/PAP deriva de bacterias termófilas, tales como las del orden bacteriano "Thermales", que se pueden usar en el contexto de la presente invención, incluyendo las enzimas PNP/PAP bacterianas del género de bacterias "Thermus", "Meiothermus", "Marinithermus", "Oceanithermus" o " Vulcanithermus".
En un modo de realización preferente, la Poli(N)polimerasa no es una poli(A)polimerasa bovina, humana o derivada de virus.
Preferentemente, la PNP/PAP deriva de E. coli, M. silvanus o T. aquaticus.
En un modo de realización preferente, la Poli(N)polimerasa de acuerdo con la presente invención es una poli(A)polimerasa y deriva de M. silvanus o T. aquaticus, por ejemplo, de acuerdo con SEQ ID NO: 2-3, 19-22 y 141-155.
En un modo de realización en particular preferente, la Poli(N)polimerasa de acuerdo con la presente invención es una poli(A)polimerasa y deriva de E. coli.
En particular preferente, la Poli(N)polimerasa es una poli(A)polimerasa, preferentemente poli(A)polimerasa I (PAP-I), opcionalmente derivada de E. coli, tal como Escherichia coli B7A (Toh et al., 2011)., que está codificada por el gen pcnB (SEQ ID NO: 1).
Preferentemente, la poli(A)polimerasa de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 % o al menos un 85 %, incluso más preferentemente al menos un 90 %, o un 95 % o lo más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % idéntica a cualquiera de los aminoácidos representados en s Eq ID NO: 1 a 22, 24 a 155 y 203 o a una secuencia de PNP/PAP natural existente en la naturaleza.
Además, los modos de realización de conector flexible de 6 glicinas también se pueden diseñar de manera diferente (conector de glicina-serina, diferente longitud de conector, etc.).
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir la poli(N/A)polimerasa de la presente invención que es una poli(N/A)polimerasa bacteriana que comprende una etapa de a) hacer reaccionar un grupo funcional de un residuo aminoacídico de una Poli(N)polimerasa con un soporte sólido activado químicamente de modo que se forme un enlace covalente y en el que el grupo funcional se selecciona de aminas primarias en el extremo N de cada cadena polipeptídica y en la cadena lateral de lisina, grupos a-carboxilo en el extremo C, grupos pcarboxilo y grupos Y-carboxilo de ácido aspártico y glutámico, y grupos sulfhidrilo o tiol de cisteínas, como se explica anteriormente y como se ejemplifica en la sección de ejemplos a continuación. La inmovilización es por medio de un enlace covalente. Más preferentemente, la inmovilización en la etapa a) da lugar a la formación de un puente disulfuro o enlace tioéter. Específicamente, es preferente que la etapa a) comprenda la formación de un enlace covalente entre un residuo cisteína de la poli(N/A)polimerasa y un grupo tiol, un grupo haloacetilo, un grupo epoxi, un disulfuro de piridilo o un grupo maleimida del soporte sólido. En otro modo de realización preferente, el soporte sólido es un soporte sólido activado con tiol, un soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, un soporte sólido activado con epoxi, un soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo o un soporte sólido activado con maleimida.
En un modo de realización opcional, en la etapa a) del procedimiento de la invención, el pH en el tampón de reacción está en el intervalo de 5 a 9, preferentemente de 7 a 8 y más preferentemente de 7,5 ± 0,5.
El tampón de reacción usado en la etapa a) puede comprender un agente tamponante bien conocido por los expertos. Ejemplos de agentes tamponantes son tampón fosfato, tampón Tris, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), tampón acetato y más. Preferentemente, el agente tamponante es un tampón Tris o tampón fosfato, más preferentemente un tampón fosfato, por ejemplo, K2HPO4-KH2PO4. El tampón en la etapa a) puede comprender además una sal inorgánica, preferentemente una sal liotrópica, tal como una sal de sodio o potasio, más preferentemente, el tampón en la etapa a), también indicado "tampón de acoplamiento" o "tampón de inmovilización" o "tampón de reacción", comprende sulfato de sodio o cloruro de sodio. La sal inorgánica puede estar presente en una concentración de al menos 0,3 mM, al menos 0,4 M, al menos 0,5, al menos 7,5 M o más preferentemente al menos 10 mM, o más preferentemente al menos 100 mM, incluso más preferentemente 500 mM. Opcionalmente, el tampón de reacción en la etapa a) puede comprender EDTA.
En un modo de realización preferente, en la etapa a) el tampón de reacción comprende K2HPO4-KH2PO4 100 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, a pH 7,5.
Después de la etapa a), la PPasa inmovilizada en el soporte sólido se lava y se almacena en tampón de almacenamiento. La PPasa inmovilizada obtenida se puede almacenar en tampón de almacenamiento a 4-5 °C. En un modo de realización preferente, después de la etapa a) el tampón de almacenamiento comprende Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 0,1 %, glicerina al 50 %, pH 7,5.
Se debe indicar que en los modos de realización donde la inmovilización de la enzima PAP se consigue por medio de puentes disulfuro, los tampones de inmovilización y los tampones de almacenamiento no deben contener agentes reductores tales como mercaptoetanol o DTT.
Opcionalmente, el procedimiento para producir la PNP/PAP comprende, además, antes de la etapa a), una etapa de b) expresar la poli(N/A)polimerasa en un huésped de expresión adecuado. El huésped de expresión adecuado se puede seleccionar de un grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula de mamífero. Preferentemente, el huésped de expresión es una célula bacteriana, más preferentemente E. coli. La expresión de proteínas se puede realizar mediante procedimientos estándar bien conocidos por los expertos, tales como los descritos en Ceccarelli y Rosano "Recombinant protein expression in microbial systems", Frontiers E-books, 2014, Merten "Recombinant Protein Production with Prokaryotic and Eukaryotic Cells. A Comparative View on Host Physiology", Springer Science & Business Media, 2001, y otros. También existen proveedores comerciales que producen PNP/PAP bajo demanda, tales como Genscript, Piscataway, NJ, EE. UU.
Opcionalmente, el procedimiento de producción de la PNP/PAP de la presente invención comprende, además, antes de la etapa a) y, si está presente, después de la etapa b), una etapa de c) purificar la poli(A)polimerasa de un huésped de expresión. La purificación de proteínas también se puede realizar por medio de procedimientos estándar conocidos por los expertos. Se puede obtener más información de Janson "Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications", John Wiley & Sons, 2012, y Burgess y Deutscher "Guide to Protein Purification", Academic Press, 2009.
Para la purificación de enzimas PAP recombinantes, se pueden emplear marcas de purificación habitualmente conocidas en la técnica, preferentemente marcas de purificación de acuerdo con SEQ ID NO: 181-201.
La PNP/PAP producida se puede almacenar en un tampón ejemplar que comprende Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 50 %, Triton® X-100 al 0,1 %, a pH 7,5 y a -20 °C.
En un modo de realización preferente, la PNP/PAP producida y purificada se puede almacenar en Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM, DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, Triton X-100 al 0,1 %, glicerol al 50 %, pH 7,5 a -20 °C.
Se proporciona además el uso de una Poli(N)polimerasa que se inmoviliza sobre un soporte sólido para producir moléculas de ácido ribonucleico (poli(N)ARN) polinucleotidilado.
Además de la definición de "ARN" dada anteriormente, en modos de realización preferentes el término "ARN" engloba además moléculas de ARN, tales como ARN vírico, ARN retrovírico y ARN de replicón, ARN interferente pequeño (ARNip), ARN de antisentido, ARN guía de CRISPR/Cas9, ribozimas, aptámeros, riboconmutadores, ARN inmunoestimulante (ARNies), ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosómico (ARNr), ARN nuclear pequeño (ARNnp), ARN nucleolar pequeño (ARNnup), microARN (miARN) y ARN que interactúa con Piwi (ARNpi) etc. La producción opcionalmente comprende una etapa de i) poner en contacto la Poli(N)polimerasa con moléculas de ARN y nucleótidos en condiciones adecuadas para formar un enlace covalente entre los nucleótidos y las moléculas de ARN. Las condiciones de reacción adecuadas se describirán a continuación en el presente documento. Las moléculas de ARN pueden ser casi de cualquier origen, de cualquier composición de nucleótidos y de cualquier longitud.
En un modo de realización preferente, las moléculas de ARN se producen por medio de transcripción de ARN in vitro usando ARN polimerasas fágicas, por ejemplo, ARN polimerasa T7 o ARN polimerasa SP6.
En un modo de realización preferente, el ARN que se va a polinucleotidilar o poliadenilar es ARN mensajero (ARNm).
Los nucleótidos usados para producir moléculas de poli(N/A)ARN se pueden seleccionar del grupo que consiste en trifosfato de adenosina (a Tp ), trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de uridina (UTP), trifosfato de guanosina (GTP), análogos nucleotídicos y mezclas de los mismos. Los análogos nucleotídicos útiles son casi cualquier análogo químico de los nucleótidos estándar A, U, G y C, es decir, cualquier nucleótido que comprenda al menos un grupo químico o función química que no se produzca en nucleótidos naturales. El único requisito previo es que el análogo nucleotídico debe ser un sustrato de cualquier PNP/PAP de la presente invención que se pueda someter a prueba en una reacción simple de polinucleotidilación o poliadenilación, tal como se describe en la sección de ejemplos. También es posible usar una mezcla de nucleótidos estándar y análogos nucleotídicos. En este contexto, los trifosfatos nucleosídicos modificados como se definen en el presente documento son análogos nucleotídicos/modificaciones, por ejemplo, modificaciones de la cadena principal, modificaciones del glúcido o modificaciones de la base. Una modificación de la cadena principal en relación con la presente invención es una modificación en la que los fosfatos de la cadena principal de los nucleótidos se modifican químicamente. Una modificación del glúcido en relación con la presente invención es una modificación química del glúcido de los nucleótidos. Además, una modificación de la base en relación con la presente invención es una modificación química del resto de base de los nucleótidos. En este contexto, los análogos nucleotídicos o modificaciones se seleccionan preferentemente de análogos nucleotídicos que son aplicables para transcripción y/o traducción.
Modificaciones del glúcido: Los nucleósidos y nucleótidos modificados, que se pueden usar en el contexto de la presente invención, se pueden modificar en el resto glucídico. Por tanto, una "modificación del glúcido" incluye explícitamente modificaciones del resto glucídico de nucleósidos y nucleótidos modificados. Por ejemplo, el grupo hidroxilo (OH) 2' se puede modificar o remplazar con varios sustituyentes "oxi" o "desoxi" diferentes. Ejemplos de modificaciones del grupo hidroxilo "oxi" 2' incluyen, pero no se limitan a, alcoxi o ariloxi (-OR, por ejemplo, R = H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o glúcido); polietilenglicoles (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; ácidos nucleicos "bloqueados" (ANB) en los que el hidroxilo 2' está conectado, por ejemplo, mediante un puente de metileno, al carbono 4' del mismo glúcido ribosa; y grupos amino (-O-amino, en los que el grupo amino, por ejemplo, NRR, puede ser alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino) o aminoalcoxi. Las modificaciones "desoxi" incluyen hidrógeno, amino (por ejemplo, NH2 ; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroarilamino o aminoácido); o el grupo amino se puede fijar al glúcido a través de un conector, en el que el conector comprende uno o más de los átomos C, N y O. El grupo glucídico también puede contener uno o más carbonos que poseen la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en ribosa. Por tanto, un nucleótido modificado puede incluir nucleótidos que contienen, por ejemplo, arabinosa como glúcido.
Modificaciones de la cadena principal: En los nucleósidos y nucleótidos modificados, también se puede modificar la cadena principal de fosfato. Los grupos fosfato de la cadena principal se pueden modificar remplazando uno o más de los átomos de oxígeno con un sustituyente diferente. Además, los nucleósidos y nucleótidos modificados pueden incluir el remplazo completo de un resto fosfato no modificado con un fosfato modificado como se describe en el presente documento. Ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen, pero no se limitan a, fosforotioato, fosforoselenatos, boranofosfatos, ésteres de boranofosfato, hidrogenofosfonatos, fosforamidatos, alquil o arilfosfonatos y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen los dos oxígenos no conectores remplazados con azufre. El conector de fosfato también se puede modificar mediante el remplazo de un oxígeno conector con nitrógeno (fosforamidatos con puentes), azufre (fosforotioatos con puentes) y carbono (metilenfosfonatos con puentes).
Modificaciones de la base: Los nucleósidos y nucleótidos modificados, que se pueden usar en la presente invención, se pueden modificar adicionalmente en el resto de nucleobase. Ejemplos de nucleobases encontradas en el ARN incluyen, pero no se limitan a, adenina, guanina, citosina y uracilo. Por ejemplo, los nucleósidos y nucleótidos descritos en el presente documento se pueden modificar químicamente en la cara del surco mayor. En algunos modos de realización, las modificaciones químicas del surco mayor pueden incluir un grupo amino, un grupo tiol, un grupo alquilo o un grupo halo.
En modos de realización en particular preferentes de la presente invención, los análogos nucleotídicos/modificaciones se seleccionan de modificaciones de la base, que se seleccionan preferentemente de 2-amino-6-cloropurinarribósido-5'-trifosfato, 2-aminopurinarribósido-5'-trifosfato; 2-aminoadenosina-5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxicitidina-trifosfato, 2-tiocitidina-5'-trifosfato, 2-tiouridina-5'-trifosfato, 2'-fluorotimidina-5'-trifosfato, 2'-O-metilinosina-5'-trifosfato, 4-tiouridina-5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina-5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina-5'-trifosfato, 5-bromocitidina-5'-trifosfato, 5-bromouridina-5'-trifosfato, 5-bromo-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, 5-bromo-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato, 5-yodocitidina-5'-trifosfato, 5-yodo-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, 5-yodouridina-5'-trifosfato, 5-yodo-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato, 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 5-metiluridina-5'-trifosfato, 5-propinil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, 5-propinil-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato, 6-azacitidina-5'-trifosfato, 6-azauridina-5'-trifosfato, 6-cloropurinarribósido-5'-trifosfato, 7-deazaadenosina-5'-trifosfato, 7-deazaguanosina-5'-trifosfato, 8-azaadenosina-5'-trifosfato, 8-azidoadenosina-5'-trifosfato, bencimidazolribósido-5-trifosfato, N1-metiladenosina-5-trifosfato, N1-metilguanosina-5'-trifosfato, N6-metiladenosina-5'-trifosfato, 06-metilguanosina-5'-trifosfato, seudouridina-5-trifosfato o puromicina-5-trifosfato, xantosina-5'-trifosfato. Se da preferencia particular a nucleótidos para modificaciones de la base seleccionados del grupo de nucleótidos modificados en la base que consisten en 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 7-deaza-guanosina-5'-trifosfato, 5-bromocitidina-5'-trifosfato y seudouridina-5-trifosfato.
En algunos modos de realización, los nucleósidos modificados incluyen ribonucleósido de piridin-4-ona, 5-azauridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tiouridina, 4-tio-seudouridina, 2-tio-seudouridina, 5-hidroxiuridina, 3-metiluridina, 5-carboximetiluridina, 1-carboximetilseudouridina, 5-propiniluridina, 1-propinilseudouridina, 5-taurinometiluridina, 1-taurinometilseudouridina, 5-taurinometil-2-tiouridina, 1-taurinometil-4-tiouridina, 5-metiluridina, 1-metilseudouridina, 4-tio-1-metilseudouridina, 2-tio-1-metilseudouridina, 1-metiM-deazaseudouridina, 2-tio-1 -metil-1-deazaseudouridina, dihidrouridina, dihidroseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-dihidroseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-seudouridina y 4-metoxi-2-tio-seudouridina.
En algunos modos de realización, los nucleósidos modificados incluyen 5-aza-citidina, seudoisocitidina, 3-metilcitidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1-metilseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-seudoisocitidina, 2-tio-citidina, 2-tio-5-metilcitidina, 4-tio-seudoisocitidina, 4-tio-1-metilseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deaza-seudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-seudoisocitidina, zebularina, 5-azazebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxicitidina, 2-metoxi-5-metilcitidina, 4-metoxiseudoisocitidina y 4-metoxi-1-metilseudoisocitidina.
En otros modos de realización, los nucleósidos modificados incluyen 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 7-deazaadenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina, 7-deaza-8-aza-2-aminopurina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metiladenosina, N6-metiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina y 2-metoxi-adenina.
En otros modos de realización, los nucleósidos modificados incluyen inosina, 1-metil-inosina, wyosina, wybutosina, 7-deaza-guanosina, 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deaza-guanosina, 6-tio-7deaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metilinosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metilguanosina, N2-metilguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina y N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina.
En algunos modos de realización, el nucleótido se puede modificar en la cara del surco mayor y puede incluir remplazar el hidrógeno en C-5 del uracilo con un grupo metilo o un grupo halo. En modos de realización específicos, un nucleósido modificado es 5'-O-(1-tiofosfato)-adenosina, 5'-O-(1-tiofosfato)-citidina, 5'-O-(1-tiofosfato)-guanosina, 5'-O-(1-tiofosfato)-uridina o 5'-O-(1-tiofosfato)-seudouridina.
En otros modos de realización específicos, los nucleótidos modificados incluyen modificaciones nucleosídicas seleccionadas de 6-aza-citidina, 2-tio-citidina, a-tio-citidina, seudo-iso-citidina, 5-aminoalil-uridina, 5-yodo-uridina, N1-metil-seudouridina, 5,6-dihidrouridina, a-tio-uridina, 4-tio-uridina, 6-aza-uridina, 5-hidroxi-uridina, desoxitimidina, 5-metil-uridina, pirrolo-citidina, inosina, a-tio-guanosina, 6-metil-guanosina, 5-metil-citidina, 8-oxoguanosina, 7-deaza-guanosina, N1-metil-adenosina, 2-amino-6-cloro-purina, N6-metil-2-amino-purina, seudo-isocitidina, 6-cloro-purina, N6-metil-adenosina, a-tio-adenosina, 8-azido-adenosina, 7-deaza-adenosina. Se han descrito previamente otros nucleótidos modificados en el documento WO 2013/052523.
La etapa i) se realiza preferentemente durante al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o 90 minutos, o incluso 180 minutos o más, preferentemente durante al menos 5 minutos o se realiza durante 180 minutos o más, preferentemente a una temperatura adecuada para la enzima respectiva, por ejemplo, a 37 ± 3 °C, preferentemente a 37 °C, o a 50-80 °C en el caso de PNP/PAP derivadas de organismos bacterianos termófilos, tales como Thermus aquaticus o M. silvanus (por ejemplo, de acuerdo con SEQ ID NO: 2­ 3, 19-22, 141-155). Más preferentemente, la etapa i) se realiza durante al menos 10 a 120 minutos o se realiza durante 180 minutos o más, o al menos de 10 a 300 minutos, preferentemente de 15, 20, 25 o 30 a 90 minutos, más preferentemente de 30 a 60 minutos, más preferentemente de 30 a 100 minutos, incluso más preferentemente de 30 a 200 minutos. La reacción de polinucleotidilación/poliadenilación se puede realizar en una solución acuosa que comprende un tampón y sales. Preferentemente, la reacción se realiza a un pH en el intervalo de 6,5 a 8,5, preferentemente en el intervalo de 7,0 a 8,0, más preferentemente en el intervalo de 7,2 a 8,0, incluso más preferentemente a un pH de 7,9 ± 0,1, lo más preferentemente a un pH de 7,9. Los tampones adecuados se seleccionan de tampón fosfato, tampón tris, tampón acetato y otros. Preferentemente, el tampón es un tampón Tris. Las sales adecuadas que se pueden incluir en la mezcla de reacción conjuntamente con la PN/SP, las moléculas de ARN y los nucleótidos son NaCl, MnCh, MgCh y otros.
Un tampón de reacción de polinucleotidilación/poliadenilación ejemplar comprende Tris-HCl 50 mM, NaCl 250 mM, MgCl2 10 mM, pH 7,9 y se puede almacenar a 25 °C (Cao y Sarkar (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 10380-10384).
Se puede encontrar más información sobre las condiciones de reacción adecuadas en Bernstein y Ross (1989, Trends Biochem Sci 14: 373-377), Gallie (1991, Genes Dev 5: 2108-2116), Harland y Misher (1988, Development 102: 837-852) y Khaleghpour et al. (2001, Molecular Cell 7: 205-216).
Para obtener una población de moléculas de ácido nucleico que compartan aproximadamente el mismo grado de poliadenilación, es decir, que tengan aproximadamente el mismo número de nucleotidilatos/adenilatos fijados a sus extremos 3' y, por tanto, sean esencialmente homogéneas con respecto a la longitud de la cola de poli(N/A), la reacción de polinucleotidilación/poliadenilación se debe detener preferentemente siempre después del mismo tiempo de incubación. Preferentemente, la reacción se detiene mediante la separación rápida de la mezcla de reacción que comprende las moléculas de ARN, los nucleótidos y las moléculas de poli(N/A)ARN de las PNP/PAP inmovilizadas para evitar la introducción de productos químicos adicionales. Las técnicas estándar usan inactivación por calor, tal como 60 °C durante al menos 20 min. Sin embargo, en este caso, la PAP se desnaturaliza y no se puede usar para más reacciones de polinucleotidilación.
Un aspecto importante a este respecto es que la reacción de polinucleotidilación/poliadenilación se realiza con una cantidad molar de ARN que es menor que la cantidad molar de enzima y por encima de la afinidad de la enzima por el ARN. Esto da lugar a la saturación del ARN/poli(N/A)ARN con la enzima y la reacción de polimerización se produce al mismo tiempo en todas las moléculas de ARN/poli(N/A)ARN introducidas. Por tanto, la cantidad de nucleótido usada determina la longitud de la cola de poli(N/A).
Esto tiene el efecto de que se puede conseguir una longitud promedio reproducible de colas de poli(N/A) en las moléculas de ARN después de un determinado periodo de tiempo. De este modo, se puede obtener una cola de poli(N/A) de considerablemente la misma longitud y, por tanto, moléculas de poli(N/A)ARN que son esencialmente homogéneas, incluso en reacciones separadas oportunas.
En el uso de la presente invención, una mezcla de reacción como en la etapa i) comprende de 0,5 a 2 moles de ARN, preferentemente de 0,75 a 1,5 moles de ARN, más preferentemente de 0,8 a 1,2 moles de ARN, incluso más preferentemente de 0,9 a 1,1 moles de ARN y lo más preferentemente 1 mol de ARN. Además, la mezcla de reacción comprende en la etapa i) de 50 a 500 moles de nucleótidos, preferentemente de 75 a 400 moles de nucleótidos, más preferentemente de 100 a 300 moles de nucleótidos, incluso más preferentemente de 120 a 200 moles de nucleótidos y lo más preferentemente 150 moles de nucleótidos. En un modo de realización preferente de la presente invención, la mezcla de reacción como en la etapa i) comprende de 0,5 a 2 moles de ARN y de 50 a 500 moles de nucleótidos, preferentemente de 0,75 a 1,5 moles de ARN y de 75 a 400 moles de nucleótidos, más preferentemente de 0,8 a 1,2 moles de ARN y de 100 a 300 moles de nucleótidos, incluso más preferentemente de 0,9 a 1,1 moles de ARN y de 120 a 200 moles de nucleótidos, y lo más preferentemente 1 mol de ARN y 150 moles de nucleótidos.
En el uso de la presente invención, la mezcla de reacción comprende en la etapa i) de 50 a 500 moles de ATP, preferentemente de 75 a 400 moles de ATP, más preferentemente de 100 a 300 moles de ATP, incluso más preferentemente de 120 a 200 moles de ATP y lo más preferentemente 150 moles de ATP. En un modo de realización preferente de la presente invención, la mezcla de reacción como en la etapa i) comprende de 0,5 a 2 moles de ARN y de 50 a 500 moles de ATP, preferentemente de 0,75 a 1,5 moles de ARN y de 75 a 400 moles de ATP, más preferentemente de 0,8 a 1,2 moles de ARN y de 100 a 300 moles de ATP, incluso más preferentemente de 0,9 a 1,1 moles de ARN y de 120 a 200 moles de ATP, y lo más preferentemente 1 mol de ARN y 150 moles de ATP.
1 mol de ARN y 150 moles de nucleótidos dan como resultado una cola de poli(N) de aproximadamente 150 residuos nucleosídicos. Por tanto, lo más relevante es la proporción de ARN:nucleótido. Como la PNP/PAP inmovilizada se satura en la reacción, las moléculas de ARN se nucleotidilan de igual manera al mismo tiempo hasta el agotamiento de los nucleótidos. De este modo, la reacción da lugar a moléculas de a Rn polinucleotidiladas de manera sustancialmente homogénea. Los expertos pueden calcular fácilmente las cantidades de sustrato para conseguir colas de poli(A) de diferentes longitudes basándose en la información anterior. Si es necesario, se puede realizar una calibración estándar.
Los expertos pueden elegir de técnicas de separación estándar (por ejemplo, basadas en el peso molecular o la carga), tales como procedimientos cromatográficos, que son bien conocidos en la técnica y que se emplean típicamente después de la polinucleotidilación/poliadenilación para separar o purificar los productos de reacción. Por lo tanto, el uso de la presente invención preferentemente comprende además una etapa de ii) aislar las moléculas de poli(N)ARN mediante filtración o cromatografía. Opcionalmente, la filtración comprende ultrafiltración y/o diafiltración. Los materiales y dispositivos de filtración y cromatografía adecuados se pueden obtener, por ejemplo, de GE (Fairfield, CT, EE. UU.), Merck Millipore (Billerica, MA, EE. UU.), Pall Corp. (Port Washington, NY, Ee . UU.). En otro modo de realización preferente, la PNP/PAP se inmoviliza sobre un soporte sólido que es material de columna y los nucleótidos, moléculas de ARN y moléculas de poli(N/A)ARN están en el flujo directo de la columna.
Preferentemente, al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, 90 %, 95 % o 98 % de las moléculas de ARN polinucleotidiladas/poliadeniladas se caracterizan por la misma longitud de la secuencia de poli(N/A) 3' terminal. En este contexto, "la misma longitud" se refiere a una situación donde el número de adenilatos en la secuencia de poli(A) 3' terminal varía de un valor dado (tal como 160 adenilatos, 380 adenilatos, 430 adenilatos, 1000 adenilatos, etc.) en no más de un 10 %, más preferentemente no más de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o no más de un 1 %.
En general, la longitud de una cola de poli(N/A) de las moléculas de poli(N/A)ARN producidas mediante el uso de la PNP/PAP de la presente invención es mayor de 30 nucleótidos de longitud. En otro modo de realización, la cola de poli(N/A) tiene más de 35 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos o más de aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000 nucleótidos). Preferentemente, cada una de las moléculas de poli(N/A)ARN comprende al menos 120 nucleotidilatos/adenilatos. En algunos modos de realización, las moléculas de poli(N/A)ARN incluyen de aproximadamente 30 a aproximadamente 10.000 nucleótidos (por ejemplo, de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 750, de 30 a 1.000, de 30 a 1.500, de 30 a 2.000, de 30 a 2.500, de 50 a 100, de 50 a 250, de 50 a 500, de 50 a 750, de 50 a 1.000, de 50 a 1.500, de 50 a 2.000, de 50 a 2.500, de 50 a 3.000, de 100 a 500, de 100 a 750, de 100 a 1000, de 100 a 1500, de 100 a 2.000, de 100 a 2.500, de 100 a 3.000, de 500 a 750, de 500 a 1.000, de 500 a 1.500, de 500 a 2.000, de 500 a 2.500, de 500 a 3.000, de 1.000 a 1.500, de 1.000 a 2.000, de 1.000 a 2.500, de 1.000 a 3.000, de 1.500 a 2.000, de 1.500 a 2.500, de 1.500 a 3.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 2.500 y de 2.500 a 3.000).
Lo más preferentemente, las moléculas de poli(N/A)ARN incluyen de 500 a 5000 nucleótidos.
Las moléculas de poli(N/A)ARN producidas usando la PNP/PAP de la presente invención son para su uso en genoterapia, inmunoterapia, por ejemplo, inmunoterapia contra el cáncer, proteinoterapia de reposición y/o vacunación.
En un modo de realización preferente, los nucleótidos en el uso de la PNP/PAP de la presente invención son ATP y las moléculas de poli(N)ARN son moléculas de ARN poli(adenilado) (poli(A)ARN).
Se proporciona además un reactor enzimático que comprende una poli(N/A)polimerasa de la presente invención que se inmoviliza sobre un soporte sólido o una poli(N/A)polimerasa obtenible mediante el procedimiento descrito en el presente documento. Reactores enzimáticos ejemplares se representan en las figuras 2, 4 y 9.
Opcionalmente, el reactor enzimático comprende, además
a) al menos un recipiente de reacción que comprende la poli(N/A)polimerasa inmovilizada,
b) uno o más dispositivos para medir/supervisar y/o ajustar al menos un parámetro seleccionado del grupo que consiste en pH, osmolalidad, concentración de sal, tal como NaCl, concentración de magnesio y manganeso, concentración de fosfato o tris (tris(hidroximetil)aminometano), temperatura, presión, caudal (entrada, salida), concentración de ARN y concentración de nucleótidos.
En un modo de realización preferente, el recipiente de reacción del reactor enzimático comprende un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo, soporte sólido activado con epoxi o soporte sólido activado con maleimida. Preferentemente, el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada por tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo, microesferas de epoxi metacrilato y agarosa activada con maleimida.
Opcionalmente, el reactor enzimático comprende uno o más dispositivos para introducir y/o retirar los componentes de la reacción de polinucleotidilación/poliadenilación, tales como agua, PNP/PAP, moléculas de ARN, nucleótidos, por ejemplo, ATP, UTP, CTP, GTP, análogos nucleotídicos y mezclas de los mismos, moléculas de poli(N/A)ARN, sales, componentes tamponantes, etc. a o desde el reactor enzimático, en particular el recipiente de reacción del reactor enzimático.
Además, para proporcionar una distribución de sustrato homogénea dentro del recipiente de reacción, el recipiente de reacción puede comprender un dispositivo de agitación dependiendo del soporte sólido que se usa para la inmovilización de la PNP/PAP. Claramente, el dispositivo de agitación y la velocidad de agitación se deben ajustar para minimizar las fuerzas de cizallamiento que podrían afectar negativamente a la inmovilización de la PNP/PAP de la invención. Otro procedimiento para distribuir homogéneamente los componentes de la reacción es un movimiento uniforme del recipiente de reacción, opcionalmente de todo el reactor enzimático, o un flujo directo continuo y posiblemente repetido de los componentes de la reacción excepto de la PNP/PAP inmovilizada que permanece en el recipiente de reacción.
Cualquier reactor enzimático conocido por un experto en la técnica se puede usar de acuerdo con la presente invención.
En general, un reactor enzimático comprende un recipiente o una serie de recipientes, usados para realizar la reacción enzimática deseada, por ejemplo, la reacción de polinucleotidilación/poliadenilación, en particular mediante PNP/PAP inmovilizadas (como se define anteriormente). Por tanto, el reactor enzimático puede contener todos los componentes de reacción necesarios para realizar la reacción de polinucleotidilación/poliadenilación y para producir moléculas de poli(N/A)ARN.
En un modo de realización, un reactor enzimático comprende uno o más módulos de reacción usados para realizar la reacción enzimática deseada. Por tanto, el reactor enzimático puede contener todos los componentes de reacción necesarios para realizar esta reacción, también indicada como mezcla de reacción. La mezcla de reacción comprende al menos las PNP/PAP inmovilizadas y nucleótidos adecuados y una molécula de ARN como sustrato. Claramente, otras enzimas, componentes tamponantes, sales, etc. también pueden estar presentes en la mezcla de reacción dependiendo de la aplicación específica (por ejemplo, en modos de realización donde la poliadenilación y la transcripción del ARN in vitro se realizan simultáneamente).
En la figura 2, figura 4 y figura 9 se proporcionan modos de realización ejemplares de reactores enzimáticos de acuerdo con la presente invención.
Los tipos de reactores importantes que se pueden usar para la presente invención comprenden, pero no se limitan a, variantes de reactores discontinuos de depósito agitado, reactores semidiscontinuos de depósito agitado, reactores discontinuos de recirculación, reactores de ultrafiltración de depósito agitado y reactores de lecho compactado continuo (Illanes, Andrés, ed. Enzyme biocatalysis: principles and applications. Springer Science & Business Media, 2008, capítulo 5), figura 3.
Todos los tipos de reactores pueden tener adicionalmente dispositivos de calentamiento/enfriamiento, dispositivos de presión y los reactores agitados pueden contener elementos para controlar la eficacia de agitación. Además, algunos reactores pueden estar conectados a una configuración de filtración que comprende, por ejemplo, un dispositivo de ultrafiltración.
Un reactor enzimático (de cualquier tipo), incluyendo tubos, recipientes y otras partes (sensores), para su uso en la presente invención puede estar hecho de vidrio o acero, tal como acero inoxidable de acuerdo con la norma europea EN 10088, por ejemplo, 1.43XX, 1.44XX, 1.45XX, u otro, dependiendo de la presión que se aplique a la reacción. El material del recipiente de reacción también se debe seleccionar para que no presente unión de ninguno de los componentes de reacción a las paredes del recipiente, lo que puede introducir contaminación en la siguiente reacción. Además, el material no debe tener ninguna influencia sobre la propia reacción, ni presentar riesgo de fuga de productos químicos peligrosos (por ejemplo, bisfenol A) o alérgenos (por ejemplo, metales pesados). El material también se debe seleccionar para que no sea corrosivo, tal como acero inoxidable, o no influya negativamente de ninguna manera en la inmovilización de la PNP/PAP de la invención.
Los reactores discontinuos de depósito agitado (figura 3A) pueden consistir en un depósito o recipiente que contenga un agitador rotatorio. El recipiente puede estar equipado con deflectores fijos para mejorar la eficacia de agitación en el recipiente. El recipiente se puede cargar con la PNP/PAP inmovilizada en un tampón de reacción respectivo y los otros componentes de reacción. En dicho reactor, la PNP/PAP inmovilizada y las moléculas de ARN tienen tiempos de residencia idénticos. Después de que se haya producido la reacción enzimática, y después de vaciar el reactor discontinuo, la PNA/P inmovilizada, el ATP y las moléculas de poli(N/A)ARN se tienen que separar. Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante un dispositivo o membrana de filtro con un tamaño de poro más pequeño que el tamaño de la PNP/PAP inmovilizada y mayor que el tamaño de las moléculas de poli(N/A)ARN. De forma alternativa, la separación se puede realizar por medio de centrifugación e idealmente la PNP/PAP inmovilizada se puede reciclar para otro ciclo de reacción. De forma alternativa, el recipiente de reacción comprende un dispositivo que permite la separación directa de la PNA/P inmovilizada de los otros componentes de reacción de modo que la PNP/PAP pueda permanecer en el recipiente de reacción.
Es preferente en particular un reactor discontinuo de depósito agitado en el contexto de la presente invención. En este contexto, es preferente en particular usar PNP/pAp inmovilizada en Sepharose como soporte sólido en el recipiente de reacción.
En otro modo de realización preferente, el reactor enzimático que comprende la PNP/PAP inmovilizada es un reactor semidiscontinuo de depósito agitado.
Los reactores semidiscontinuos de depósito agitado (figura 3B) se pueden construir similares a los reactores discontinuos de depósito agitado (véase anteriormente, véase la figura 3A) con la principal diferencia de que se puede aplicar un flujo continuo de entrada y salida por medio de los tubos de entrada y salida. Un rasgo característico de dicho tipo de reactor es que la PNP/PAP inmovilizada y las moléculas de ARN no tienen tiempos de residencia idénticos en el reactor. El medio de reacción, compuesto de tampón, sales, nucleótidos y ARN, se puede bombear al depósito o recipiente por medio de una entrada que puede estar localizada en el fondo del depósito, y el tampón de reacción que contiene las moléculas de poli(N/A)ARN se puede extraer por medio de una salida fijada en la parte superior. Opcionalmente, las moléculas de poli(N/A)ARN y otros componentes de reacción se alimentan constante y repetidamente al recipiente del reactor para que tengan una buena distribución de los componentes de reacción que no están inmovilizados. El flujo de entrada y salida se puede controlar mediante un dispositivo de bombeo de modo que se pueda producir la reacción enzimática. Además, los tubos de salida pueden tener filtros de peso molecular de corte para evitar la contaminación del producto por PNP/PAP inmovilizada o la PNP/PAP inmovilizada se puede inmovilizar en una red o una estructura sólida en forma de panal dentro del recipiente de reacción. Los filtros de peso molecular de corte del tubo de salida pueden tener un peso molecular de corte en un intervalo de 10 kDa a 500 MDa, preferentemente en un intervalo de 50 kDa a 300 MDa, más preferentemente de 100 kDa a 100 MDa, incluso más preferentemente de 500 kDa a 50 MDa, y lo más preferentemente de 750 kDa a 25 MDa, tal como 1 MDa. Una ventaja de dicho modo de realización es que la PNP/PAP inmovilizada no se tiene que separar de los otros componentes de reacción, tales como las moléculas de poli(N/A)ARN.
En otro modo de realización preferente, el reactor enzimático que contiene una PNP/PAP inmovilizada es un reactor de ultrafiltración de depósito agitado.
Un reactor de ultrafiltración de depósito agitado (figura 3C) se puede construir similar a los reactores discontinuos de depósito agitado (véase anteriormente, véase la figura 3A y 3B), con la principal diferencia de que un pequeño dispositivo de ultrafiltración está conectado al recipiente de reacción donde tiene lugar la separación del producto (poli(N/A)ARN) y la PNA/P inmovilizada. Esta separación se puede facilitar por medio de un dispositivo de ultrafiltración o diafiltración. En ultrafiltración, las membranas comprenden una red porosa diferenciada. La solución mezclada se bombea a través de la membrana, las moléculas más pequeñas pasan a través de los poros (ATP, ARN) mientras que las moléculas más grandes (poli(N/A)ARN, PNP/PAP inmovilizada) se retienen. Las presiones de funcionamiento típicas para ultrafiltración son de 1 a 10 bar. Las propiedades de retención de las membranas de ultrafiltración se expresan como peso molecular de corte (PMC). Este valor se refiere al peso molecular (PM) aproximado de un soluto globular diluido (es decir, una proteína típica) que se retiene en un 90 % por la membrana. Sin embargo, la forma de una molécula puede tener un efecto directo sobre su retención por una membrana. Por ejemplo, moléculas alargadas tales como ARN o moléculas de poliN/A ARN pueden encontrar su camino a través de poros que retendrán una especie globular del mismo peso molecular (Latulippel y Zydney (2011) Journal of Colloid and Interface Science, 357(2), páginas 548-553). Son preferentes en este contexto membranas, por ejemplo, membranas de celulosa, que tienen pesos moleculares de corte nominales en un intervalo de 10 kDa a 500 MDa, preferentemente en un intervalo de 50 kDa a 300 MDa, más preferentemente de 100 kDa a 100 MDa, incluso más preferentemente de 500 kDa a 50 MDa, y lo más preferentemente de 750 kDa a 25 MDa, tal como 1 MDa.
Por último, la PNP/PAP inmovilizada se puede capturar en el dispositivo de ultrafiltración y devolverse a la cámara de reacción.
En otro modo de realización preferente, el reactor enzimático que comprende la PNP/PAP inmovilizada de la presente invención es un reactor discontinuo de recirculación.
Los reactores discontinuos de recirculación (figura 3D) pueden comprender un primer recipiente, conectado por medio de tubos de entrada y de salida a un segundo recipiente. El primer recipiente se carga con PNP/PAP inmovilizada. El segundo recipiente contiene los otros componentes de reacción. En un reactor discontinuo de recirculación de este tipo, la PNP/PAP inmovilizada se compacta densamente en el primer recipiente, o se inmoviliza sobre una red o un soporte sólido en forma de panal a través del que circula constantemente agua con los otros componentes de reacción. Después de que se haya producido la reacción enzimática, el medio de reacción, que contiene los componentes de la reacción, incluyendo las moléculas de poli(N/A)ARN, se puede vaciar y usar para la separación de las moléculas de poli(N/A)ARN de los otros componentes de reacción, tal como por filtración o cromatografía. Una ventaja de dicho modo de realización es que la PNP/PAP inmovilizada no se tiene que separar de los otros componentes y, en particular, del poli(N/A)ARN, por otros medios. Otra ventaja es que la reacción se puede repetir (por medio de circulación del producto poli(N/A)ARN de vuelta al recipiente de reacción) hasta que se consigue la longitud deseada de la cola de poli(N/A).
En otro modo de realización preferente, el reactor enzimático que comprende una PNP/PAP inmovilizada es un reactor de lecho compactado continuo.
Los reactores de lecho compactado continuo (figura 3E) pueden consistir en un recipiente que comprende PNP/PAP inmovilizada en un soporte sólido. El recipiente puede estar compactado densamente, formando de este modo un lecho que contiene la PNP/PAP inmovilizada en un soporte sólido. Un rasgo característico de dicho tipo de reactor es que la PNP/PAP inmovilizada y las moléculas de ARN no tienen tiempos de residencia idénticos en el reactor. El medio de reacción, compuesto de los componentes de reacción, incluyendo nucleótidos y ARN, se puede bombear al reactor de lecho compactado por medio de una entrada que puede estar localizada en el fondo del depósito, y el medio de reacción que contiene el producto de poli(N/A)ARN se puede extraer por medio de una salida fijada en la parte superior del depósito. El flujo de entrada y salida se puede controlar mediante un dispositivo de bombeo de modo que se pueda producir la reacción enzimática. Además, los tubos de salida pueden tener filtros de peso molecular de corte para evitar la contaminación del producto por PNP/PAP inmovilizada. Los filtros de peso molecular de corte del tubo de salida pueden tener un peso molecular de corte en un intervalo de 10 kDa a 500 MDa, preferentemente en un intervalo de 50 kDa a 300 MDa, más preferentemente de 100 kDa a 100 MDa, incluso más preferentemente de 500 kDa a 50 MDa, y lo más preferentemente de 750 kDa a 25 MDa, tal como 1 MDa. Una ventaja de dicho modo de realización es que la PNP/PAP inmovilizada no se tiene que separar de los otros componentes de reacción por otros medios.
Opcionalmente, el reactor enzimático (1) comprende
a) un módulo de reacción (11) para llevar a cabo reacciones de poliadenilación; y opcionalmente
c) un módulo de captura (13) para capturar temporalmente el poli(N/A)ARN;
d) un módulo de alimentación (14) para controlar la alimentación de componentes de una mezcla de reacción en el módulo de reacción (11) y/o
e) un módulo de transcripción (ARN) in vitro (IVT) (16) para la producción de molde de ARN. El módulo de IVT (16) y el módulo de alimentación (14) pueden tener un dispositivo para ajustar y controlar la temperatura (12). Además, todos los componentes del módulo de alimentación (14) se calientan opcionalmente hasta la temperatura de reacción (mediante un dispositivo para ajustar y controlar la temperatura (12) o un calentador (17) ) durante el flujo de alimentación por medio de un tubo de entrada (4) al reactor enzimático (1). Se proporciona un dibujo esquemático de un reactor de poliadenilación ejemplar en la figura 4.
De acuerdo con un modo de realización preferente de la presente invención, el reactor enzimático (1) comprende f) al menos una unidad de sensor (15). La recopilación y análisis de datos por la al menos una unidad de sensor (15) permite el control del sistema de bomba integrado (activador) para alimentaciones repetidas de componentes de la mezcla de reacción, por ejemplo, componentes tamponantes o nucleótidos (por ejemplo, ATP).
De acuerdo con otro modo de realización preferente de la presente invención, el reactor enzimático (1) funciona en modo semicontinuo o en modo continuo. El término semicontinuo como se usa en el presente documento se refiere al funcionamiento de la reacción de poliadenilación como una serie repetitiva de reacciones. Por ejemplo, se deja que la reacción prosiga durante un tiempo finito, momento en el que se retira el producto, se añaden nuevos reactantes y se repite la reacción completa. La expresión flujo continuo como se usa en el presente documento se refiere a una reacción que se lleva a cabo continuamente en un núcleo de biorreactor con reactantes complementarios añadidos constantemente a través de una línea de alimentación de entrada y productos retirados constantemente a través de un acceso de salida. Un reactor de flujo continuo controla el aporte de reactivo y la retirada de producto a través de caudales controlados del dispositivo, lo que es ventajoso para reacciones con limitaciones de reactivo y productos inhibidores.
El módulo de reacción comprende además una membrana de filtración (6) para separar el poli(N/A)ARN producido de la mezcla de reacción y posteriormente recoger el poli(N/A)ARN en el módulo de captura (13). La introducción de una membrana de filtración en un sistema de flujo, por ejemplo, una membrana de ultrafiltración se usa para la separación de componentes de alto peso molecular, tales como, por ejemplo, enzimas y/o polinucleótidos inmovilizados o no inmovilizados. Dichas membranas típicamente tienen un peso molecular de corte en un intervalo de 10 kDa a 500 MDa, preferentemente en un intervalo de 50 kDa a 300 MDa, más preferentemente de 100 kDa a 100 MDa, incluso más preferentemente de 500 kDa a 50 MDa, y lo más preferentemente de 750 kDa a 25 MDa, tal como 1 MDa.
Las membranas de filtración adecuadas pueden consistir en diversos materiales conocidos por los expertos en la técnica (Van de Merbel, 1999. J. Chromatogr. A 856(1-2): 55-82). Por ejemplo, las membranas pueden consistir en celulosa regenerada o modificada o en materiales sintéticos. Los últimos incluyen polisulfona (PSU), poliacrilonitrilo (PAN), polimetilmetacrilato (PMMA), mezclas de poliariletersulfonas, polivinilpirrolidona y poliamida (Polyamix.RTM, disponible de Gambro Dialysatoren, GmBH, Hechingen, Alemania). Por ejemplo, las polisulfonas incluyen polietersulfona (poli(oxi-1,4-10 fenilsulfonil-1,4-fenilo), abreviado PES). En algunos modos de realización ejemplares, se puede utilizar polietersulfona como una membrana semipermeable para el uso de acuerdo con la divulgación. En algunos casos, las membranas de PES incluyen una mayor hidrofilia (y/o la humectabilidad mejorada de la membrana con agua) en comparación con las membranas de PSU. En algunos modos de realización, la humectabilidad de membranas de PES, por ejemplo, puede incrementarse más mediante la inclusión del polímero polivinilpirrolidona soluble en agua.
Un parámetro importante que influye en el flujo de moléculas a través de la membrana de filtración es el tamaño de poro o la distribución del tamaño de poro. Una membrana de filtración normalmente se caracteriza por su valor de peso molecular de corte (PMC), es decir, una limitación de tamaño específico, que se define como la masa molecular del compuesto más pequeño, que se retiene en más de un 90 %. Para cada aplicación, es necesario seleccionar un valor de PMC adecuado para que los compuestos de alto peso molecular se retengan suficientemente, pero al mismo tiempo se garantice un transporte rápido del analito. La membrana de filtración de la unidad de filtración (6) puede ser una membrana de ultrafiltración, y preferentemente tiene de peso molecular de corte en un intervalo 10 kDa a 500 MDa, preferentemente en un intervalo de 50 kDa a 300 MDa, más preferentemente de 100 kDa a 100 MDa, incluso más preferentemente de 500 kDa a 50 MDa, y lo más preferentemente de 750 kDa a 25 MDa. En un modo de realización específico, el PMC es 1 MDa. Opcionalmente, la membrana de filtración se selecciona del grupo que consiste en celulosa regenerada, celulosa modificada, PES, PSU, PAN, PMMA, poli(alcohol vinílico) (PVA) y poliariletersulfona (PAES).
El módulo de captura (13) opcionalmente comprende una resina (por ejemplo, resina de oligo d(T)), para capturar las moléculas de poli(N)ARN producidas y para separar las moléculas de ácido nucleico producidas de otros componentes solubles de la mezcla de reacción. Opcionalmente, el módulo de captura (13) comprende una unidad de sensor (15) para medir la concentración de las moléculas de poli(N)ARN producidas, un medio para purificar el poli(N)ARN producido capturado y/o un medio para eluir las moléculas de poli(N)ARN producidas capturadas, preferentemente por medio de un tampón de elución.
En un modo de realización preferente, el módulo de reacción (11) del reactor enzimático (1) comprende además un módulo de reflujo (19) para opcionalmente devolver la mezcla de reacción filtrada (que comprende poli(A)ARN) al módulo de reacción (11) desde el módulo de control (18), mientras que el módulo de control (18) intermedio puede distinguir entre ARN con longitudes de poliA de N<120 nucleótidos (nt) y N>120 nt. El ARN con longitudes de poliA de N>120 nt se introduce en el módulo de captura por medio de una salida (5), mientras que el ARN con longitudes de poliA <120 nt se realimenta al reactor enzimático discontinuo por medio del módulo de reflujo (19). En un modo de realización específico, la mezcla de reacción se vuelve a introducir en el módulo de reacción (11) por medio del módulo de reflujo (19) hasta que se obtiene una longitud de cola de poli(A) deseada.
En un modo de realización preferente, el reactor enzimático comprende además varias unidades de sensor (15) que pueden estar presentes en el módulo de reacción (11), el módulo de captura (13) y/o los módulos de alimentación (14 y 16). Las unidades de sensor (15) pueden ser adecuadas para la medición ultrarrápida de la concentración de moléculas de ácido nucleico separadas, la concentración de trifosfatos nucleosídicos y/u otros parámetros de reacción, tales como el valor de pH, la concentración de reactante, flujo de entrada y salida, temperatura y/o salinidad, opcionalmente, las unidades de sensor miden la concentración de ácidos nucleicos separados mediante análisis fotométrico.
Las unidades de sensor (15) también pueden medir otros parámetros de reacción en la mezcla de reacción filtrada, preferentemente en las que los otros parámetros de reacción son el valor de pH y/o la salinidad.
De acuerdo con algunos modos de realización, el reactor enzimático, más específicamente la una o más unidades de sensor (15), comprende al menos un electrodo selectivo de iones, preferentemente para medir la concentración de uno o más tipos de iones en un líquido comprendido en al menos un compartimento del reactor enzimático, en el que el ion se selecciona preferentemente del grupo que consiste en H+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cly PO43-.
En el contexto de la presente invención, la expresión "electrodo selectivo de iones" se refiere a un transductor (por ejemplo, un sensor) que convierte la actividad de un ion específico disuelto en una solución en un potencial eléctrico, en el que se puede medir el potencial eléctrico, por ejemplo, usando un voltímetro o un pehachímetro. En particular, la expresión "electrodo selectivo de iones" como se usa en el presente documento comprende un sistema, que comprende o consiste en una membrana que tiene permeabilidad selectiva, en el que la membrana típicamente separa dos electrolitos. Un electrodo selectivo de iones como se usa en el presente documento típicamente comprende una parte sensora, que preferentemente comprende una membrana que tiene permeabilidad selectiva y un electrodo de referencia. La membrana es típicamente una membrana selectiva de iones, que se caracteriza por diferentes permeabilidades para diferentes tipos de iones. Preferentemente, el al menos un electrodo selectivo de iones del reactor enzimático comprende una membrana seleccionada del grupo que consiste en una membrana de vidrio, una membrana de estado sólido, una membrana de base líquida y una membrana compuesta.
En modos de realización preferentes, el al menos un electrodo selectivo de iones comprende o consiste en un sistema que comprende una membrana, preferentemente una membrana como se describe en el presente documento, más preferentemente una membrana electroquímica, que tiene diferentes permeabilidades para diferentes tipos de iones, en el que la membrana, preferentemente una membrana como se describe en el presente documento, más preferentemente una membrana electroquímica, preferentemente separa dos electrolitos. En un modo de realización, la membrana comprende o consiste en una capa de un electrolito sólido o una solución de electrolito en un disolvente inmiscible con agua. La membrana preferentemente está en contacto con una solución de electrolito en uno o ambos lados. En un modo de realización preferente, el electrodo selectivo de iones comprende un electrodo de referencia interno. Dicho electrodo de referencia interno se puede remplazar en algunos modos de realización, por ejemplo, por un contacto metálico o por un aislante y una capa semiconductora. Un electrodo selectivo de iones permite una medición altamente sensible, rápida, exacta y no destructiva de las actividades de los iones o concentraciones de los iones en diferentes medios. Además de mediciones directas de actividades de los iones o concentraciones de los iones, pueden servir, en particular mediante el uso de una curva de calibración, para la supervisión continua de cambios de concentración, como elementos para el control de la dosificación de agentes o como electrodos indicadores muy precisos en valoraciones potenciométricas.
En modos de realización preferentes, el reactor enzimático comprende al menos un electrodo selectivo de iones, preferentemente como se describe en el presente documento, para medir la concentración de uno o más tipos de iones en al menos un compartimento del reactor enzimático. Por ejemplo, el al menos un electrodo selectivo de iones se puede usar para medir la concentración de uno o más tipos de iones en un módulo de reacción, un módulo de alimentación (14) o un módulo de captura (13) o el módulo de IVT (16) del reactor. Por supuesto, es posible tener una o más unidades de sensor y electrodos selectivos de iones en el reactor enzimático, es decir, uno o más o cada uno del módulo de captura (13), el módulo de reacción (11), el módulo de alimentación (14) o el módulo de IVT (16). Preferentemente, el al menos un electrodo selectivo de iones se usa para medir la concentración de uno o más tipos de iones en el módulo de reacción, más preferentemente en el núcleo de reacción o en el compartimento de filtración. Además, el al menos un electrodo selectivo de iones puede estar comprendido en una unidad de sensor del reactor enzimático, preferentemente como se define en el presente documento. El uno o más electrodos selectivos de iones pueden estar localizados en el módulo de reacción (11), el módulo de captura (13), los módulos de alimentación (14) o el módulo de IVT (16) del reactor enzimático. En el contexto de la presente invención, la frase "el reactor enzimático comprende al menos un electrodo selectivo de iones" se puede referir, por tanto, a una situación donde el al menos un electrodo selectivo de iones forma parte del reactor enzimático, o a una situación donde el al menos un electrodo selectivo de iones es una entidad física separada con respecto al reactor enzimático, pero que se usa en conexión con el reactor enzimático.
Preferentemente, el al menos un electrodo selectivo de iones se conecta a un potenciómetro, preferentemente un potenciómetro multicanal (por ejemplo, un potenciómetro CITSens Ion de 6 canales, resolución alta-20; C-CIT Sensors AG, Suiza). En un modo de realización preferente, el al menos un electrodo selectivo de iones es preferentemente un electrodo de tubo, más preferentemente seleccionado del grupo que consiste en un electrodo de tubo selectivo de Mg2+, un electrodo de tubo selectivo de Na+, un electrodo de tubo selectivo de Cl-, un electrodo de tubo selectivo de PO43-, un electrodo de tubo selectivo de pH y un electrodo de tubo selectivo de Ca2+, preferentemente usando en conexión con un potenciómetro. Incluso más preferentemente, el reactor enzimático (1) comprende al menos un electrodo selectivo de iones, en el que el al menos un electrodo selectivo de iones se selecciona preferentemente del grupo que consiste en un electrodo de minitubo selectivo de Mg2+ CITSens Ion, un electrodo de minitubo selectivo de Na+ CITSens Ion, un electrodo de minitubo selectivo de Cl-CITSens Ion, un electrodo de minitubo selectivo de PO43- CITSens Ion, un electrodo de minitubo selectivo de pH CITSens Ion y un electrodo de minitubo selectivo de Ca2+ CITSens Ion (todos de C-CIT Sensors AG, Suiza), preferentemente en conexión con un potenciómetro, más preferentemente con un potenciómetro multicanal, tal como un potenciómentro CITSens Ion de 6 canales, alta resolución (C-CIT Sensors Ag , Suiza).
Los electrodos selectivos de iones tienen numerosas ventajas para uso práctico. Por ejemplo, no afectan a la solución sometida a prueba permitiendo, por tanto, mediciones no destructivas. Además, los electrodos selectivos de iones son móviles, adecuados para determinaciones directas, así como sensores de valoración, y rentables. La principal ventaja del uso de un electrodo selectivo de iones en un reactor enzimático (por ejemplo, un reactor de poliadenilación) es la posibilidad de medir in situ sin recogida de muestras y de forma no destructiva.
Los electrodos selectivos de iones permiten supervisar muy específicamente la reacción de poliadenilación y, en particular, la reacción catalizada por la poli(N/A)polimerasa inmovilizada de acuerdo con la invención.
Las unidades de sensor (15) pueden estar equipadas además para el análisis de parámetros cruciales del procedimiento, tales como el valor de pH, la conductividad y la concentración de nucleótidos en la mezcla de reacción. Preferentemente, la unidad de sensor del módulo de reacción de poliadenilación (11) o el módulo de IVT (16) comprende un sensor, tal como una cubeta de lectura de UV para la medición de UV 260/280 nm, para la medición ultrarrápida de la concentración de nucleótidos durante la reacción de poliadenilación. Preferentemente, el sensor de las unidades de sensor mide la concentración de nucleótidos, como un parámetro de procedimiento, mediante análisis fotométrico.
Además de las mediciones en línea descritas de las unidades de sensor (15), o además de las mediciones en línea descritas del módulo de control (18), se pueden realizar las mismas mediciones en módulos de análisis separados (como controles en línea). Por ejemplo, el progreso de la reacción de poliadenilación se puede analizar en línea por medio de electroforesis en gel, fotometría, etc.
Además, el reactor enzimático se puede adaptar para llevar a cabo el procedimiento como se describe en el presente documento y/o puede comprender la PNP/PAP como se describe en el presente documento y/o puede ser adecuado para el uso descrito en el presente documento.
En un modo de realización preferente, el reactor enzimático descrito anteriormente adicionalmente comprende una unidad de reacción para la producción simultánea de ARN a partir de un molde de ADN por medio de transcripción enzimática de ARN in vitro.
En un modo de realización, la transcripción de ARN in vitro tiene lugar en un módulo de reacción de IVT (16) y las moléculas de ARN producidas en la reacción de IVT en el módulo de reacción de IVT (16) se introducen en el módulo de reacción de poliadenilación (11). En un modo de realización, la transcripción del ARN in vitro tiene lugar en el mismo módulo de reacción (11), en paralelo a una reacción de poliadenilación.
En modos de realización donde la reacción de poliadenilación y la reacción de ARN in vitro tienen lugar en un reactor enzimático y/o en un módulo de reacción (11), el preferente en particular usar PNP/PAP inmovilizadas que se inmovilizan sobre un soporte sólido por medio de enlaces tioéter (R-S-R) de acuerdo con la presente invención. Los enlaces tioéter son en particular preferentes en dicho modo de realización porque los tampones de reacción comunes de las ARN polimerasas contienen agentes reductores (por ejemplo, DTT), que pueden reducir los enlaces disulfuro (lo que provocaría una fuga de enzima) pero no reducen los enlaces tioéter.
Se proporciona además un kit que comprende una PNP/PAP, caracterizado por que la PNP/PAP se inmoviliza sobre un soporte sólido, preferentemente la PNP/PAP es una PNP/PAP microbiana, preferentemente de origen bacteriano, o una PNP/PAP como se describe en el presente documento, y al menos un tampón seleccionado del grupo que consiste en tampón de reacción, tampón de almacenamiento y combinaciones de los mismos incluyendo, por ejemplo, nucleótidos, sales, etc.
En un modo de realización de ese aspecto de la invención, el kit adicionalmente comprende una ARN polimerasa y un tampón adecuado para la transcripción de ARN in vitro.
En modos de realización preferentes de este aspecto, el poli(N)ARN producido de acuerdo con la presente invención se puede usar en genoterapia, vacunación (genética) o inmunoterapia.
Ejemplos
Los ejemplos mostrados a continuación son meramente ilustrativos y describirán la presente invención de otra manera. No se interpretará que estos ejemplos limitan la presente invención.
Ejemplo 1: Inmovilización de poli(A)polimerasa I de Escherichia cotí en tiopropil-Sepharose 6B
El objetivo de este experimento era obtener poli(A)polimerasa (PAP) funcional e inmovilizada de forma estable. Se generaron mutantes PAP de Escherichia coli, el mutante 1 (denominado "mut1"), el mutante 2 (denominado "mut2") y el mutante 3 (denominado "mut3") y se caracterizaron en cuanto a su actividad enzimática. Como estrategia de inmovilización, se sometió a prueba la inmovilización sobre soportes sólidos de tiopropil-Sepharose 6B. Las condiciones de reacción, respectivamente el pH, se eligieron de modo que se promoviera la formación de enlaces disulfuro (R-S-S-R) por medio de grupos sulfhidrilo (-SH) por medio de residuos de cisteína presentes en las proteínas mutantes PAP.
Los mutantes de PAP inmovilizados obtenidos se caracterizaron y se sometieron a prueba adicionalmente en cuanto a actividad enzimática (es decir, su actividad de poliadenilación) y estabilidad (véase el ejemplo 2-3) y también se usaron en un reactor de poliadenilación (véase el ejemplo 4). A continuación, se proporciona una descripción detallada del procedimiento de inmovilización y un análisis de los resultados.
1.1 Diseño de proteínas PAP m utl y mut2 y mut3 de Escherichia coli
Los tres mutantes de PAP (mutl, de acuerdo con SEQ ID NO: 140; mut2, de acuerdo con SEQ ID NO: 113; mut3, de acuerdo con SEQ ID NO: 203) se generaron mediante c-LEcta (optimización de codones, síntesis génica, subclonación, expresión de proteínas, purificación de proteínas por medio de una marca de 6H C terminal). Todas las enzimas mutantes se diseñaron para que comprendieran una extensión C terminal que comprende un elemento conector flexible ((G4S)2) y una marca de purificación de oligohistidina (marca de 6h , marca de HIS) y un residuo de cisteína lo más C terminal que permite un acoplamiento estable y funcional de las proteínas a soportes sólidos de tiopropil-Sepharose 6B. Además, la secuencia de la enzima mut2 se cambió de manera que todos los residuos de cisteína naturales se sustituyeron con residuos de alanina (C88A, C256A, C346A). La secuencia de la enzima mut3 se cambió después del análisis BLAST de la secuencia natural de PAP de E. coli frente a una base de datos no redundante para identificar posibles sustituciones aminoacídicas. Las sustituciones más comunes se aplicaron a todas las cisteínas naturales dando lugar a las siguientes sustituciones: C88S, C256R, C346A. El diseño de proteína de mut2 y mut3 se eligió para permitir una forma dirigida de inmovilización, facilitada exclusivamente por medio del residuo de cisteína lo más C terminal.
1.2 Caracterización de la actividad inicial de proteínas PAP mutantes genomanipuladas
Para caracterizar la actividad enzimática de las enzimas PAP mutantes mut1, mut2 y mut3, se realizó un ensayo de adición de colas de poli(A)polimerasa usando un ARN de 60 nucleótidos de longitud (de acuerdo con SEQ ID NO: 202; sintetizado por Biomers, Ulm, Alemania, HPLC-PAGE) como molde de ARN. Se incubó 1 |jg de ARN molde con ATP y enzimas PAP mutantes durante 1 h a 37 °C en tampón de adición colas (del kit de adición de colas de poli(A)polimerasa A-Plus, Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Alemania; ATP 1 mM, 2 U de Ribolock™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) seguido de inactivación por calor a 80 °C durante 5 minutos y almacenamiento en hielo. A continuación, se purificó el ARN usando el siguiente procedimiento: Se mezclaron 18 j l de muestra de ARN, 2 j l de WFI, 36 j l de microesferas AmpureXP (Agencourt, Beckman Coulter, Brea, Ca , EE. UU.) y 27 j l de isopropanol y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. La muestra se colocó en una placa magnética durante 5 minutos hasta que la solución se volvió completamente transparente para separar las microesferas magnéticas. Las microesferas unidas al ARN se lavaron dos veces con etanol al 85 % recién preparado. Las microesferas se secaron al aire durante 5 minutos y el ARN se eluyó con 20 j l de tampón Tris/EDTA (TE). El contenido de ARN de las muestras respectivas se midió fotométricamente (véase la figura 5).
1.3 Retamponamiento de proteínas PAP mut1 y mut2 de Escherichia coli recombinantes
Las proteínas PAP mut1 y mut2 recombinantes purificadas obtenidas se reconstituyeron en tampón de almacenamiento (Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, Triton® X-100 al 0,1 %, pH 7,5). Para los experimentos de inmovilización, las proteínas PAP mut1 y mut2 recombinantes se volvieron a tamponar en tampón de inmovilización (K2HPO4-KH2PO4 100 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM) usando Vivaspin-20 (peso molecular de corte (PMC) de 10 kDa; Sartorius, Gottingen, Alemania) para obtener una concentración final de proteína de 700 ng/jl. La SDS-PAGE y la posterior tinción con azul de Coomassie se realizaron de acuerdo con protocolos estándar conocidos en la técnica para analizar la integridad de los mutantes de PAP mut1 y mut2 (véase la figura 5). Los mutantes de PAP mut1 y mut2 retamponados obtenidos se usaron en experimentos de inmovilización (véase a continuación).
1.4 Retamponamiento de tiopropil-Sepharose 6B
Después de hinchar 0,85 g de microesferas de tiopropil-Sepharose 6B liofilizadas (GE Healthcare, Chicago, EE. UU., 17-0420-01) en agua para inyección (WFI) y la posterior granulación, las microesferas de tiopropil-Sepharose 6B se llenaron hasta 6,8 g con WFI. Para los experimentos de inmovilización, las microesferas se lavaron minuciosamente con tampón de inmovilización, se granularon y se descartó el sobrenadante. Las microesferas retamponadas obtenidas se usaron en experimentos de inmovilización (véase a continuación). 1.5 Procedimiento de inmovilización
Se transfirieron 0,1 mg de PAP mut1 y mut2 retamponadas recombinantes en tampón de inmovilización que comprendía microesferas de tiopropil-Sepharose 6B retamponadas (denominadas "TS") y se hicieron rotar durante 1 h a temperatura ambiente para permitir la inmovilización. Los mutantes de PAP inmovilizados (denominados "PAP-TS mut1" y "PAP-TS mut2") se granularon y el sobrenadante se almacenó a 4-8 °C. Los mutantes PAP-TS se lavaron minuciosamente con tampón de almacenamiento y se almacenaron en tampón de almacenamiento a 4-8 °C. Se realizaron SDS-PAGE y posterior tinción con azul de Coomassie para analizar la eficacia de inmovilización de los mutantes de PAP en las microesferas. En la figura 6 se proporciona una fotografía de los geles respectivos.
1.6 Resultados y análisis
Como se muestra en la figura 5, las tres proteínas mutantes de PAP genomanipuladas (mut1, mut2, mut3) muestran una actividad de poliadenilación enzimática comparable, porque se generó una cantidad comparable de ARN poliadenilado. Los datos sugieren que todas las proteínas PAP de E. coli mutantes genomanipuladas son activas en solución. Los datos también implican que los residuos de cisteína C88, C256 y C346 no son cruciales para la actividad de la enzima (en mut2 y mut3 estas cisteínas se han sustituido con otros aminoácidos). Además, los datos muestran que la adición de un elemento C terminal que comprende un conector, una marca de HIS y una cisteína lo más C terminal no impide la actividad enzimática. Estos resultados sugieren que la genomanipulación según la invención de PAP de E. coli puede ser ampliamente transferible para generar otros mutantes de PAP funcionales de origen bacteriano en general, por ejemplo, mutantes de PAP de acuerdo con SEQ ID NO: 16-22, 24-112, 114-139, 141-155.
Como se muestra en la figura 6, las proteínas mutantes PAP de E. coli genomanipuladas y purificadas mut1 y mut2 muestran el tamaño de banda esperado de aproximadamente 55 kDa (véase la figura 6 (A) y (B), línea 1, respectivamente). Además, el tampón elegido para la inmovilización no afectó a la integridad de las proteínas respectivas (véase la figura 6 (A) y (B), línea 2, respectivamente).
Además, los autores de la invención demuestran que las proteínas mutantes de PAP genomanipuladas mut1 y mut2 se inmovilizaron con éxito en el soporte sólido elegido. Para la interpretación de los resultados, se debe enfatizar que en condiciones reductoras de SDS PAGE, el enlace disulfuro entre el soporte sólido y las proteínas mutantes de PAP se reduce y, en consecuencia, la aparición de una banda a 55 kDa es un marcador para la inmovilización exitosa de las proteínas (véase la figura 6 (A) y (B), línea 4, respectivamente).
En resumen, los resultados muestran que la estrategia de inmovilización usando los mutantes de PAP genomanipulados según la invención funciona, lo que sugiere que la inmovilización usando otros mutantes de PAP de E. coli que comprendan un elemento conector también funcionaría (por ejemplo, de acuerdo con SEQ ID NO: 18, 58-112, 114-139). Además, la genomanipulación según la invención de las enzimas PAP de E. coli también se puede transferir a otras enzimas PAP, por ejemplo, a PAP derivadas de Meiothermus silvanus o Thermus aquaticus (por ejemplo, de acuerdo con SEQ ID NO: 20, 22, 143-155). Se debe apreciar que se pueden usar otros elementos conectores conocidos en la técnica para la genomanipulación de proteínas PAP mutantes (por ejemplo, conectores de acuerdo con SEQ ID NO: 156-180).
Ejemplo 2: Pruebas de actividad a largo plazo de PAP-TS mut2 inmovilizada
2.1 Procedimiento experimental
La PAP-TS mut2 inmovilizada ("TS" indica inmovilización en tiopropil-Sepharose 6B) (obtenida de acuerdo con el ejemplo 1) se sometió a otra prueba en cuanto a su actividad enzimática en un ensayo de adición de colas de poli(A)polimerasa usando un modelo de ARN de 60 nucleótidos de longitud (de acuerdo con SEQ ID: 202; sintetizado por Biomers, Ulm, Alemania, HPLC-PAGE) como molde de ARN, y se realizó. Se incubó 1 |jg de molde de ARN con ATP y PAP-TS mut2 o la PAP mut2 soluble respectiva durante 1 h a 37 °C en tampón de adición colas (del kit de adición de colas de poli(A)polimerasa A-Plus™, Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Alemania; ATP 1 mM, 2 U de Ribolock™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) seguido de inactivación por calor a 80 °C durante 5 minutos y almacenamiento en hielo. El ARN poliadenilado se analizó en una PAGE de un 15 % de TBE-UREA y posteriormente se tiñó con Sybr® Gold (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para evaluar la actividad de poliadenilación de PAP mut2.
Para someter a prueba la estabilidad y la actividad a largo plazo de PAP mut2 inmovilizada, se almacenó PAP-TS mut2 a 4 °C y se realizaron ensayos de adición de colas de poli(A)polimerasa después de 5, 14 y 22 días. Los resultados se compararon con mut2 que no estaba inmovilizada. Los resultados se muestran en la figura 7. 2 2 Resultados y análisis
Como se muestra en la figura 7, tanto PAP mut2 como PAP-TS mut2 mostraron una buena actividad enzimática comparable (véase la figura 7), indicada por la prolongación/alargamiento del ARN de 60 nucleótidos a aproximadamente 500 nucleótidos.
Además, la PAP-TS mut2 mostró una actividad a largo plazo incrementada apreciable en comparación con la enzima mut2 soluble.
En resumen, los resultados muestran claramente que para una inmovilización funcional de PAP de E. coli, la sustitución de los residuos de cisteína naturales por alanina (C88A, C256A, C346A) es posible y no da lugar a una pérdida de actividad enzimática, permitiendo de este modo una inmovilización dirigida de la proteína PAP mut2 por medio de su residuo de cisteína los más C terminal. Los datos también indican que se consiguió una estabilidad a largo plazo y una actividad enzimática a largo plazo para la proteína mut2 inmovilizada (PAP-TS mut2). En consecuencia, las microesferas de PAP-TS mut2 son adecuadas para un uso repetitivo en reacciones de poliadenilación. En consecuencia, las microesferas de PAP-TS mut2 se pueden aplicar en reactores de poliadenilación de acuerdo con la presente invención (véase el ejemplo 4).
Se debe apreciar que también se espera que el hallazgo del presente ejemplo sea transferible a otras PAP, por ejemplo, a otros mutantes de PAP derivados de E. coli donde las cisteínas naturales se han sustituido por serina y/o valina y/o alanina para que comprendan solo un residuo de cisteína (de acuerdo con SEQ ID NO: 16-18, 24­ 83, 85-111, 113-139) o mutantes de PAP derivados de otras bacterias, tales como Meiothermus silvanus o Thermus aquaticus que solo comprenden un residuo de cisteína (por ejemplo, de acuerdo con SEQ ID NO: 19­ 22, 141-144, 146-148, 150-152, 154-155). En general, esta estrategia de inmovilización (por medio de un grupo -SH de solo una cisteína) permite una forma de inmovilización dirigida al sitio (por ejemplo, por medio de soportes activados con tiol, soportes activados con maleimida, soportes activados con epoxi, etc.) y garantiza la flexibilidad del enzima PAP que es fundamentalmente importante para la actividad enzimática de la proteína. Ejemplo 3: Pruebas de estabilidad térmica y actividad de PAP-TS mut2 inmovilizada
3.1 Procedimiento experimental
Para caracterizar más la estabilidad y actividad de la proteína mutante mut2 inmovilizada (PAP-TS mut2; obtenida de acuerdo con el ejemplo 1), la proteína soluble PAP mut2 y la proteína inmovilizada PAP-TS mut2 que se almacenaron a 4 °C durante 22 días (véase el ejemplo 2) se sometieron adicionalmente a agresión térmica durante hasta 180 minutos a 37 °C en tampón de ensayo de adición de colas. Posteriormente, PAP mut2 y PAP-TS mut2 sometidas a agresión térmica se caracterizaron en cuanto a actividad enzimática en un ensayo de adición de colas de poli(A)polimerasa (realizado de acuerdo con el ejemplo 2); la reacción de adición de colas se inició a través de la adición del molde de ARN y ATP. Los resultados del experimento se muestran en la figura 8.
3.2 Resultados y análisis:
Como se muestra en la figura 8, se observó una estabilidad térmica incrementada apreciable para PAP-TS mut2 inmovilizada en comparación con mut2 soluble. La PAP-TS mut2 inmovilizada no muestra una disminución en la actividad de poliadenilación después de agresión térmica durante 30 minutos, mientras que la mut2 soluble muestra una disminución sustancial en la actividad enzimática después de agresión térmica durante 30 minutos (véase la figura 8, carriles 1 y 2, indicados por una barra horizontal). Los datos sugieren que la inmovilización de mut2 en un soporte sólido mejora la estabilidad térmica. Una estabilidad térmica mejorada de las microesferas de PAP-TS mut2 puede ser ventajosa para reacciones de larga duración en un reactor de poliadenilación de acuerdo con la presente invención (véase el ejemplo 4). Estos hallazgos se pueden transferir ampliamente a otras enzimas pAp inmovilizadas de acuerdo con la presente invención.
Ejemplo 4: Uso de microesferas de PAP-TS mut2 en un reactor de poliadenilación
Las microesferas de PAP-TS mut2 obtenidas de acuerdo con el ejemplo 1 se usaron en un reactor de poliadenilación a pequeña escala para someter a prueba la reutilizabilidad de las microesferas de PAP-TS mut2 (véase la sección 4.1). Además, el prototipo de reactor de poliadenilación se usó para una reacción de poliadenilación de ARN controlada, dando como resultado productos de poli(A)ARN con una longitud de cola de poli(A) definida, a través de alimentaciones repetitivas de a Tp (véase la sección 4.2).
En la figura 9 se proporciona un dibujo esquemático del reactor usado para ese ejemplo específico. El reactor consiste esencialmente en un módulo de reacción (11) donde se produce la reacción de poliadenilación, un módulo de alimentación (14). El reactor enzimático comprende adicionalmente una unidad de filtración (6) y un módulo de captura (13) donde se puede recoger (23) el ARN poliadenilado producido (23). Los componentes tamponantes (por ejemplo, ATP), así como el ARN poliadenilado producido se pueden reinyectar en la cámara de reacción (11) por medio de un tubo de entrada que comprende un tubo de entrada (4) en forma de dispositivo de inyección.
4.1 Prueba de reutilizabilidad de microesferas de PAP-TS mut2 en el reactor de poliadenilación
Se introdujeron microesferas de PAP-TS mut2, así como tampón de adición de colas (del kit de adición de colas de poli(A)polimerasa A-Plus™, Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Alemania) ATP 1 mM 2 U de Ribolock™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y molde de ARN (SEQ ID NO: 202) en una columna Vivaspin® 500 (PMC 1 MDa, Sartorius, Gottingen, Alemania) y se incubaron a 37 °C en intervalos de 10 min (durante 0, 10, 20 y 60 minutos de tiempo total de incubación). Después de cada etapa de incubación, las reacciones se centrifugaron (3000 g) y el tampón y el molde de ARN se reutilizaron y se reintrodujeron en la cámara de reacción. Adicionalmente, las muestras del flujo directo se almacenaron en hielo para su posterior análisis. El ARN poliadenilado, así como las muestras de flujo directo se analizaron en una PAGE de un 15 % de TBE-UREA y posteriormente se tiñeron con Sybr® Gold (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para evaluar la poliadenilación del ARN. El resultado del experimento se muestra en la figura 10.
4.2. Producción de una longitud de cola de poliA definida mediante alimentación controlada de ATP en el reactor enzimático
Para generar ARN poliadenilado con una longitud de cola de poliA definida, se introdujeron microesferas de PAP-TS mut2 y tampón de adición de colas (del kit de adición de colas de poli(A)polimerasa A-Plus™, Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Alemania) 2 U de Ribolock™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU., ATP 50 |jM en la columna Vivaspin® 500 (PMC 1 MDa, Sartorius, Gottingen, Alemania) y se incubaron a 37 °C durante varios ciclos de 10 minutos (hasta un tiempo total de incubación de 50 minutos). Después de cada ciclo de incubación, las reacciones se centrifugaron y el flujo directo se almacenó en hielo para su posterior análisis. Posteriormente, se reintrodujo ATP 50 j M adicional a la cámara de reacción y la reacción se incubó de nuevo. El produjo final, así como las muestras de flujo directo se analizaron en una PAGE de un 15 % de TBE-UREA y posteriormente se tiñeron con Sybr® Gold (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para evaluar la poliadenilación del ARN. Se estimaron las longitudes de las colas de poliA en comparación con una escala de ARNmc de intervalo bajo (New England BioLabs Inc.). El resultado del experimento se muestra en la figura 11.
4.3 Resultados y análisis
La figura 10 muestra que las microesferas de PAP-TS mut2 se pueden usar de manera repetitiva. Después de volver a añadir los componentes tamponantes (incluyendo el poli(A)ARN) a la PAP-TS mut2 inmovilizada, la longitud de la cola de poli(A) del ARN podía prolongarse más. Este rasgo característico es en particular importante en el contexto de un reactor enzimático de acuerdo con la presente invención. Se debe enfatizar que las microesferas de PAP-TS mut2 son enzimáticamente activas incluso después de varias etapas de centrifugación.
La figura 11 muestra que las microesferas de PAP-TS mut2 usadas en un reactor enzimático de acuerdo con la figura 9 se pueden usar para generar ARN poliadenilado de una longitud definida. En la presente configuración experimental, se alimentó ATP 50 j M (introducido por medio de inyección) a la cámara de reacción hasta que se obtuvo la longitud de cola de poli(A) deseada de 200 nt. En esta configuración, se observó un alargamiento lineal de la cola de poli(A) a lo largo del tiempo (aproximadamente 25 adenosinas en 10 minutos). Usar las microesferas de PAP-TS mut2 de la invención en una configuración de reactor enzimático de acuerdo con la presente invención posibilita la producción controlada de ARN poliadenilado con colas de poli(A) definidas.
Resumiendo lo anterior, los resultados muestran que PAP-TS mut2 inmovilizada es muy adecuada para su uso en un reactor enzimático y para uso repetido. Claramente, estos resultados se pueden transferir a otros ajustes y configuraciones del reactor enzimático de acuerdo con la presente invención (véanse las figuras 2-4).
Ejemplo 5: Preparación de ARN
5.1 Preparación de construcciones de ADN y ARN
Para el presente ejemplo, se prepara una secuencia de ADN que codifica la proteína hemaglutinina (HA) del virus de la gripe A (A/Netherlands/602/2009(H1N1)) y se usa para reacciones de transcripción de ARN in vitro posteriores. De acuerdo con una primera preparación, se prepara la secuencia de ADN que codifica el ARNm mencionado anteriormente. La construcción R2564 (SEQ iD NO: 23) se prepara introduciendo una TOP-UTR 5' derivada de la proteína ribosómica 32L4, modificando la secuencia codificante natural introduciendo una secuencia optimizada en GC para estabilización, seguida de una secuencia estabilizadora derivada de la UTR 3' de albúmina, un tramo de 64 adenosinas (secuencia de poli(A)), un tramo de 30 citosinas (secuencia de poli(C)) y un tallo y bucle de histona. En SEQ ID NO: 23 se muestra la secuencia del ARNm correspondiente.
5.2 Transcripción in vitro
El plásmido de ADN respectivo preparado de acuerdo con la sección 1 anterior se transcribe in vitro usando polimerasa T7. Posteriormente, el a Rn se purifica con PureMessenger® (CureVac, Tübingen, Alemania).
Ejemplo 6: pcnB (C88A, C256A, SEQ ID NO: 16) de Escherichia coli inmovilizada en tiol-Sepharose 4B 6.1 Reconstitución de pcnB recombinante
Se reconstituyen 3 mg de proteína mutante pcnB (C88A, C256A) recombinante purificada (pedido personalizado de Genscript, Piscataway, NJ, EE. UU.) directamente en 10 ml de tampón de acoplamiento (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, en ddH2O desgasificada) para obtener una concentración final de 300 |jg/ml. La solución de enzima podría usarse a continuación para acoplamiento a tiol-Sepharose 4B (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.).
6.2 Preparación de la columna con tiol-Sepharose 4B
En primer lugar, se suspenden 3 g de tiol-Sepharose 4B liofilizada en 20 ml de ddH2O y se añaden suavemente a una columna de cromatografía de 20 ml. Después de lavar la resina 10 veces con 20 ml de ddH2O, se cierra el fondo de la columna y se equilibra la resina de tiol-Sepharose con 10 ml de tampón durante 10 minutos. Después del flujo directo del tampón de acoplamiento, se cierra la columna y se añaden 10 ml de solución enzimática. Se deja que tenga lugar el acoplamiento de pcnB a la resina durante 2 h a temperatura ambiente. Después del acoplamiento, la columna se lava con 15 ml de tampón de reacción. Se analiza el flujo directo en cuanto a la proteína vestigial después de las etapas de lavado usando un NanoDrop™ (280 nm, ThermoScientific, Wilmington, DE, EE. UU.). A continuación, se bloquea el exceso de sitios reactivos incubando la resina de tiol-Sepharose en 10 ml de cisteína 50 mM durante 30 min. Después de eso, las proteínas unidas débilmente se retiran mediante tres lavados con 25 ml de tampón de acoplamiento.
6.3 Adición de colas de poli(A) (150 bases) de ARN transcrito in vitro usando el reactor enzimático
A continuación, la resina se equilibra con 15 ml de tampón de reacción (Tris-HCl 50 jM pH 8,0, NaCl 0,25 M, MgCl2 10 jM, en ddH2O desgasificada) durante 10 minutos. Después del flujo directo del tampón, se añaden 10 ml de ARN R2564 transcrito in vitro purificado (50 mg, correspondientes a 75 pmol) en tampón de reacción que contiene ATP 0,045 jM y se incuban durante 30 minutos a 37 °C. El flujo directo que contiene el ARN R2564 con cola de poli(A) se somete a procedimientos de ultrafiltración para retirar los componentes tamponantes y remplazarlos con ddH2O ultrapura. Posteriormente, el poli(A)ARN se somete a mediciones de calidad e integridad. La mayoría de las moléculas de ARN tienen una cola de 150 bases.
6.4 Limpieza y reutilización del reactor de linealización
Después de que se produjera la reacción de poliadenilación, el reactor enzimático se lava varias veces con tampón de acoplamiento. Después de eso, se puede cargar un nuevo molde de ARN en el reactor. De forma alternativa, el reactor se puede almacenar a 4 °C durante varias semanas.
Ejemplo 7: pcnB (SEQ ID NO: 2) de Thermus aquaticus inmovilizada en tiol-Sepharose 4B
7.1 Reconstitución de pcnB recombinante
Se reconstituyen 3 mg de proteína pcnB de Thermus aquaticus natural/original recombinante purificada (pedido personalizado de Genscript, Piscataway, NJ, EE. UU.) directamente en 10 ml de tampón de acoplamiento (Tris-HCl 0,1 jM pH 7,5, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, en ddH2O desgasificada) para obtener una concentración final de 300 jg/ml. La solución de enzima podría usarse a continuación para acoplamiento a tiol-Sepharose 4B (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido).
7.2 Preparación de la columna con tiol-Sepharose 4B
En primer lugar, se suspenden 3 g de tiol-Sepharose 4B liofilizada en 20 ml de ddH2O y se añaden suavemente a una columna de cromatografía de 20 ml. Después de lavar la resina 10 veces con 20 ml de ddH2O, se cierra el fondo de la columna y se equilibra la resina de tiol-Sepharose con 10 ml de tampón durante 10 minutos. Después del flujo directo del tampón de acoplamiento, se cierra la columna y se añaden 10 ml de solución enzimática. Se deja que tenga lugar el acoplamiento de pcnB a la resina durante 2 h a temperatura ambiente. Después del acoplamiento, la columna se lava con 15 ml de tampón de reacción. Se analiza el flujo directo en cuanto a la proteína vestigial después de las etapas de lavado usando un NanoDrop™ (280 nm, ThermoScientific, Wilmington, DE, EE. UU.). A continuación, se bloquea el exceso de sitios reactivos incubando la resina de tiol-Sepharose en 10 ml de cisteína 50 mM durante 30 min. Después de eso, las proteínas unidas débilmente se retiran mediante tres lavados con 10 ml de NaCl 1 M y tres lavados adicionales con 25 ml de tampón de acoplamiento.
7.3 Adición de colas de poli(A) (200 bases) de ARN transcrito in vitro usando el reactor de adición de colas A continuación, la resina se equilibra con 15 ml de tampón de reacción (Tris-HCl 50 |jM pH 8,0, NaCl 0,25 M, MgCl2 10 j M, en ddH2O desgasificada) durante 10 minutos. Después del flujo directo del tampón, se añaden 10 ml de ARN R5264 transcrito in vitro purificado (50 mg, correspondientes a 75 pmol) en tampón de reacción que contiene ATP 0,06 j M y se incuban durante 45 minutos a 50 °C. El flujo directo que contiene el ARN R5264 con cola de poli(A) se somete a procedimientos de ultrafiltración para retirar los componentes tamponantes y remplazarlos con ddH2O ultrapura. Posteriormente, el ARN con cola se somete a mediciones de calidad e integridad. La mayoría de las moléculas de ARN tienen una cola de poli(A) de 200 bases.
7.4 Limpieza y reutilización del reactor de linealización
Después de que se produjera la reacción de adición d colas, el reactor de adición de colas se lava varias veces con tampón de acoplamiento. Después de eso, se puede cargar un nuevo molde de ARN en el reactor. De forma alternativa, el reactor se puede almacenar a 4 °C durante varias semanas.
Ejemplo 8: pcnB (436 (6xG)C) de Meiothermus silvanus inmovilizada en tiol-Sepharose 4B (SEQ ID NO: 22)
8.1 Reconstitución de pcnB recombinante
Se reconstituyen 3 mg de proteína mutante pcnB de Meiothermus silvanus natural recombinante purificada (pedido personalizado de Genscript, Piscataway, NJ, EE. UU.) directamente en 10 ml de tampón de acoplamiento (Tris-HCl 0,1 j M pH 7,5, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, en ddH2O desgasificada) para obtener una concentración final de 300 jg/ml. La solución de enzima podría usarse a continuación para acoplamiento a tiol-Sepharose 4B (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido).
8.2 Preparación de la columna con tiol-Sepharose 4B
En primer lugar, se suspenden 3 g de tiol-Sepharose 4B liofilizada en 20 ml de ddH2O y se añaden suavemente a una columna de 20 ml. Después de lavar la resina 10 veces con 20 ml de ddH2O, se cierra el fondo de la columna y se equilibra la resina de tiol-Sepharose con 10 ml de tampón durante 10 minutos. Después del flujo directo del tampón de acoplamiento, se cierra la columna y se añaden 10 ml de solución enzimática. Se deja que tenga lugar el acoplamiento de pcnB a la resina durante 2 h a temperatura ambiente. Después del acoplamiento, la columna se lava con 15 ml de tampón de reacción. Se analiza el flujo directo en cuanto a la proteína vestigial después de las etapas de lavado usando un NanoDrop™ (280 nm, ThermoScientific, Wilmington, DE, EE. UU.). A continuación, se bloquea el exceso de sitios reactivos incubando la resina de tiol-Sepharose en 10 ml de cisteína 50 mM durante 30 min. Después de eso, las proteínas unidas débilmente se retiran mediante tres lavados con 10 ml de NaCl 1 M y tres lavados adicionales con 25 ml de tampón de acoplamiento.
8.3 Adición de colas de poli(A) (400 bases) de ARN transcrito in vitro usando el reactor de adición de colas A continuación, la resina se equilibra con 15 ml de tampón de reacción (Tris-HCl 50 j M pH 8,0, NaCl 0,25 M, MgCl2 10 j M, en ddH2O desgasificada) durante 10 minutos. Después del flujo directo del tampón, se añaden 10 ml de ARN R5264 transcrito in vitro purificado (50 mg, correspondientes a 75 pmol) en tampón de reacción que contiene ATP 0,12 j M y se incuban durante 45 minutos a 50 °C. El flujo directo que contiene el ARN R5264 con cola de poli(A) se somete a procedimientos de ultrafiltración para retirar los componentes tamponantes y remplazarlos con ddH2O ultrapura. Posteriormente, el ARN con cola se somete a mediciones de calidad e integridad. Se espera que la mayoría de las moléculas de ARN tengan un tamaño de cola de 400 bases.
8.4 Limpieza y reutilización del reactor de linealización
Después de que se produjera la reacción de adición d colas, el reactor de adición de colas se lava varias veces con tampón de acoplamiento. Después de eso, se puede cargar un nuevo molde de ARN en el reactor. De forma alternativa, el reactor se puede almacenar a 4 °C durante varias semanas.
Se incuba la resina de tiol-Sepharose en 10 ml de cisteína 50 mM durante 30 min. Después de eso, las proteínas unidas débilmente se retiran mediante tres lavados con 10 ml de NaCl 1 M y tres lavados adicionales con 25 ml de tampón de acoplamiento.
7.3 Adición de colas de poli(A) (200 bases) de ARN transcrito in vitro usando el reactor de adición de colas A continuación, la resina se equilibra con 15 ml de tampón de reacción (Tris-HCl 50 |jM pH 8,0, NaCI 0,25 M, MgCl2 10 j M, en ddH2O desgasificada) durante 10 minutos. Después del flujo directo del tampón, se añaden 10 ml de ARN R5264 transcrito in vitro purificado (50 mg, correspondientes a 75 pmol) en tampón de reacción que contiene ATP 0,06 j M y se incuban durante 45 minutos a 50 °C. El flujo directo que contiene el ARN R5264 con cola de poli(A) se somete a procedimientos de ultrafiltración para retirar los componentes tamponantes y remplazarlos con ddH2O ultrapura. Posteriormente, el ARN con cola se somete a mediciones de calidad e integridad. La mayoría de las moléculas de ARN tienen una cola de poli(A) de 200 bases.
7.4 Limpieza y reutilización del reactor de linealización
Después de que se produjera la reacción de adición d colas, el reactor de adición de colas se lava varias veces con tampón de acoplamiento. Después de eso, se puede cargar un nuevo molde de ARN en el reactor. De forma alternativa, el reactor se puede almacenar a 4 °C durante varias semanas.
Ejemplo 8: pcnB (436 (6xG)C) de Meiothermus silvanus inmovilizada en tiol-Sepharose 4B (SEQ ID NO: 22)
8.1 Reconstitución de pcnB recombinante
Se reconstituyen 3 mg de proteína mutante pcnB de Meiothermus silvanus natural recombinante purificada (pedido personalizado de Genscript, Piscataway, NJ, EE. UU.) directamente en 10 ml de tampón de acoplamiento (Tris-HCl 0,1 j M pH 7,5, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, en ddH2O desgasificada) para obtener una concentración final de 300 jg/ml. La solución de enzima podría usarse a continuación para acoplamiento a tiol-Sepharose 4B (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido).
8.2 Preparación de la columna con tiol-Sepharose 4B
En primer lugar, se suspenden 3 g de tiol-Sepharose 4B liofilizada en 20 ml de ddH2O y se añaden suavemente a una columna de 20 ml. Después de lavar la resina 10 veces con 20 ml de ddH2O, se cierra el fondo de la columna y se equilibra la resina de tiol-Sepharose con 10 ml de tampón durante 10 minutos. Después del flujo directo del tampón de acoplamiento, se cierra la columna y se añaden 10 ml de solución enzimática. Se deja que tenga lugar el acoplamiento de pcnB a la resina durante 2 h a temperatura ambiente. Después del acoplamiento, la columna se lava con 15 ml de tampón de reacción. Se analiza el flujo directo en cuanto a la proteína vestigial después de las etapas de lavado usando un NanoDrop™ (280 nm, ThermoScientific, Wilmington, DE, EE. UU.). A continuación, se bloquea el exceso de sitios reactivos incubando la resina de tiol-Sepharose en 10 ml de cisteína 50 mM durante 30 min. Después de eso, las proteínas unidas débilmente se retiran mediante tres lavados con 10 ml de NaCl 1 M y tres lavados adicionales con 25 ml de tampón de acoplamiento.
8.3 Adición de colas de poli(A) (400 bases) de ARN transcrito in vitro usando el reactor de adición de colas A continuación, la resina se equilibra con 15 ml de tampón de reacción (Tris-HCl 50 j M pH 8,0, NaCl 0,25 M, MgCl2 10 j M, en ddH2O desgasificada) durante 10 minutos. Después del flujo directo del tampón, se añaden 10 ml de ARN R5264 transcrito in vitro purificado (50 mg, correspondientes a 75 pmol) en tampón de reacción que contiene ATP 0,12 j M y se incuban durante 45 minutos a 50 °C. El flujo directo que contiene el ARN R5264 con cola de poli(A) se somete a procedimientos de ultrafiltración para retirar los componentes tamponantes y remplazarlos con ddH2O ultrapura. Posteriormente, el ARN con cola se somete a mediciones de calidad e integridad. Se espera que la mayoría de las moléculas de ARN tengan un tamaño de cola de 400 bases.
8.4 Limpieza y reutilización del reactor de linealización
Después de que se produjera la reacción de adición d colas, el reactor de adición de colas se lava varias veces con tampón de acoplamiento. Después de eso, se puede cargar un nuevo molde de ARN en el reactor. De forma alternativa, el reactor se puede almacenar a 4 °C durante varias semanas.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Poli(N)polimerasa caracterizada por que la Poli(N)polimerasa es una Poli(N)polimerasa bacteriana e inmovilizada sobre un soporte sólido mediante unión covalente, en la que la Poli(N)polimerasa se selecciona del grupo que consiste en poli(A)polimerasa, poli(U)polimerasa, poli(G)polimerasa y poli(C)polimerasa, en la que la Poli(N)polimerasa se obtiene mediante un procedimiento que comprende hacer reaccionar un grupo funcional de un residuo aminoacídico de la Poli(N)polimerasa con un soporte sólido activado químicamente de modo que se forme un enlace covalente y en la que el grupo funcional se selecciona de aminas primarias en el extremo N de cada cadena polipeptídica y en la cadena lateral de lisina, grupos a-carboxilo en el extremo C, grupos p-carboxilo y grupos Y-carboxilo de ácido aspártico y glutámico, y grupos sulfhidrilo o tiol de cisteínas.
2. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la Poli(N)polimerasa es una poli(A)polimerasa.
3. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la Poli(N)polimerasa se inmoviliza mediante unión covalente a un soporte sólido activado con tiol, soporte sólido funcionalizado con haloacetilo, soporte sólido funcionalizado con epoxi, soporte sólido funcionalizado con disulfuro de piridilo, soporte sólido activado con maleimida o una mezcla de los mismos.
4. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la Poli(N)polimerasa se inmoviliza por medio de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína.
5. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la unión covalente es un puente disulfuro, un enlace tioéster o un enlace tioéter.
6. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el soporte sólido comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex, agarosa, sílice, microesferas magnéticas, microesferas de metacrilato y nanopartículas, preferentemente el soporte sólido comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en Sepharose, tiopropil-Sepharose, Sephadex, agarosa, sílice, microesferas magnéticas y nanopartículas.
7. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el soporte sólido comprende un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en tiol, haloacetilo, disulfuro de piridilo, epoxi, maleimida y mezclas de los mismos.
8. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en tiol-Sepharose activada, tiopropil-Sepharose, Sephadex activada con tiol, agarosa activada con tiol, matriz activada por tiol a base de sílice, microesferas magnéticas activadas con tiol a base de sílice, nanopartículas funcionalizadas con disulfuro de piridilo, agarosa activada con maleimida y mezclas de los mismos.
9. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la Poli(N)polimerasa deriva de Escherichia coli, Streptomyces coelicolor, Meiothermus silvanus, Bacillus subtilis, Thermus aquaticus, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Citrobacter koseri, Salmonella bongori, Salmonella entérica, Trabulsiella guamensis, Kluyvera ascorbata, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Enterococcus gallinarum, Grimontia indica o Salinivibrio costicola.
10. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la Poli(N)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos como se representa en una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 22, 24 a 155 o 203.
11. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la Poli(N)polimerasa comprende al menos un residuo de cisteína recién introducido en comparación con una Poli(N)polimerasa natural, preferentemente la Poli(N)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en una cualquiera de SEQ ID nO: 17-22, 32-155 o 203.
12. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la Poli(N)polimerasa comprende solo un residuo de cisteína o se muta para que comprenda solo un residuo de cisteína, preferentemente la Poli(N)polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 16-22, 24-83, 85-111, 113-139, 141-144, 146-148, 150-152, 154-155 o 203.
13. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la Poli(N)polimerasa comprende un elemento conector como se representa en SEQ ID NO: 156-180.
14. La Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la Poli(N)polimerasa comprende una marca de purificación como se representa en SEQ ID NO: 181-201.
15. Procedimiento para producir la Poli(N)polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende hacer reaccionar un grupo funcional de un residuo aminoacídico de una Poli(N)polimerasa con un soporte sólido activado químicamente de modo que se forme un enlace covalente y en la que el grupo funcional se selecciona de aminas primarias en el extremo N de cada cadena polipeptídica y en la cadena lateral de lisina, grupos a-carboxilo en el extremo C, grupos p-carboxilo y grupos Y-carboxilo de ácido aspártico y glutámico, y grupos sulfhidrilo o tiol de cisteínas.
16. Procedimiento para producir moléculas de ácido ribonucleico polinucleotidiladas (poli(N)ARN) que comprende una etapa de i) poner en contacto la Poli(N)polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que se inmoviliza sobre un soporte sólido con moléculas de ARN y nucleótidos en condiciones adecuadas para formar un enlace covalente entre los nucleótidos y las moléculas de ARN.
17. Reactor enzimático que comprende una Poli(N)polimerasa inmovilizada sobre un soporte sólido mediante unión covalente y que comprende una Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o que comprende una Poli(N)polimerasa obtenible mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15.
18. Un kit que comprende Poli(N)polimerasa caracterizado por que la Poli(N)polimerasa se inmoviliza sobre un soporte sólido mediante unión covalente, en el que la Poli(N)polimerasa es la Poli(N)polimerasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o la Poli(N)polimerasa obtenible mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, un tampón de reacción de Poli(N)polimerasa y monofosfatos nucleosídicos.
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