ES2897211T3 - Uso de una composición de implante seco para la preparación de una formulación de implante acuoso inyectable - Google Patents

Uso de una composición de implante seco para la preparación de una formulación de implante acuoso inyectable Download PDF

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Abstract

Una composición de implante seco que consiste esencialmente en una mezcla de partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas de hueso natural de un tamaño de 50 a 200 μm y fragmentos de un material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente que pasan a través de un tamiz de 0,5 mm, por lo que la relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno es de 1,8 a 4,5.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de una composición de implante seco para la preparación de una formulación de implante acuoso inyectable
ANTECEDENTES
La invención se refiere a una nueva composición de implante seco para preparar una nueva formulación de implante acuoso inyectable para utilizar en la regeneración del tejido, especialmente en la regeneración tisular bucal, en particular en la regeneración del hueso alveolar, del cemento radicular o del ligamento periodontal (LPD), que es apta para ser inyectada en las bolsas periodontales a través de un sistema cónico y una cánula de calibre 18, así como la nueva formulación de implante acuoso inyectable preparada utilizando esa composición de implante seco, un proceso y un kit para preparar esa nueva formulación de implante acuoso inyectable.
Existen diversos factores de riesgo para la enfermedad periodontal, tales como mala higiene bucal, tabaquismo, diabetes, obesidad, disposición genética, edad y status socio-económico que facilitan la acumulación bacteriana, la formación de biopelículas e infección del surco gingival y por lo tanto la formación de una inflamación gingival o gingivitis. Si no se trata, la inflamación progresa a lo largo de la raíz del diente y causa la destrucción del LPD y el hueso alveolar circundante, que luego se denomina periodontitis. A medida que la enfermedad periodontal progresa, se desarrollan bolsas entre el diente y el tejido blando y continúan creciendo hasta que el diente pierde su estabilidad y puede caerse. Los signos clínicos de la enfermedad periodontal son inflamación de los tejidos blandos, sangrado al sondaje (tisular), posiblemente acompañado de supuración, y pérdida radiográfica del hueso alveolar. Un dentista puede determinar la presencia y grado de la enfermedad periodontal utilizando una sonda para medir la profundidad de las bolsas periodontales, es decir, la profundidad entre el tejido blando o el hueso y el diente, que se refiere a la pérdida de la inserción clínica (dental).
La Regeneración Tisular Guiada (RTG) es un procedimiento quirúrgico ampliamente utilizado para tratar la pérdida de estructuras periodontales. En este procedimiento, el periodoncista obtiene acceso a la raíz enferma y al hueso circundante mediante incisiones de los tejidos blandos para levantar un colgajo. La siguiente etapa es el desbridamiento del hueso enfermo, de los tejidos blandos y de la superficie de la raíz mediante instrumentos de mano adecuados, dispositivos ultrasónicos o láser donde se extraen los tejidos enfermos y a la superficie de la raíz se le extrae la placa y se cepilla. Después del desbridamiento, los defectos óseos más grandes se llenan con un material de regeneración ósea. Las barreras de regeneración tisular guiada, como Geistlich Bio-Gide®, descritas en EP-B1-1676592 y disponibles comercialmente en Geistlich Pharma AG, se colocan sobre el material de regeneración ósea en defectos óseos más profundos. El periodoncista cierra el colgajo por medio de suturas apropiadas. A continuación, se reforman la encía, la inserción epitelial, el hueso y la inserción periodontal entre el hueso y el diente. Aunque este procedimiento ha sido eficaz, las incisiones en la encía causan malestar del paciente, dolor, hinchazón, recesión gingival, dientes sensibles, un largo tiempo de curación y aumentan la posibilidad de reinfección.
Se han utilizado numerosos materiales naturales y sintéticos y composiciones como materiales de regeneración ósea en el sitio de un defecto óseo.
Geistlich Bio-Oss®, disponible comercialmente en Geistlich Pharma AG, es un conocido material sustituto óseo natural osteoconductor que promueve el crecimiento óseo en defectos óseos periodontales. Este material se fabrica a partir de hueso natural mediante un proceso descrito en las patentes US Nos. 5.167.961 y 5.417.975, que permite la preservación de la arquitectura trabecular y la estructura nanocristalina del hueso natural, lo que da como resultado una excelente matriz osteoconductora que no se reabsorbe o se reabsorbe muy lentamente.
Para reducir los inconvenientes mencionados anteriormente relacionados con las incisiones en la encía, se necesita una formulación de implante inyectable.
Para una fácil aceptación por parte de los pacientes cuando se inyectan en bolsas periodontales y una cómoda inyección manual con una jeringa, esa formulación de implante acuoso inyectable debe ser extruible a través de una cánula de un diámetro no mayor que una cánula o aguja de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm), preferentemente con una fuerza no superior a 60 N.
Para una regeneración óptima del tejido bucal, en particular para la regeneración del hueso alveolar, del cemento radicular o del ligamento periodontal, es deseable que la formulación inyectada de implante proporcione una matriz de hidroxiapatita y colágeno cercana al entorno natural in vivo en el que se produce dicha regeneración.
La hidroxiapatita derivada del hueso natural está más cerca del entorno natural in vivo en el que se produce la regeneración que la hidroxiapatita sintética (no biológica) o la cerámica.
Las partículas que se obtienen moliendo la hidroxiapatita derivada del hueso natural tienen una forma más irregular y longitudinal que las partículas redondeadas obtenidas moliendo hidroxiapatita sintética o cerámica: Por lo tanto, presentan un mayor riesgo de obstrucción de una cánula de calibre 18. Véase la Fig. 5 que representa en el lado izquierdo una micrografía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas en inglés) de partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivada de hueso natural y en el lado derecho una SEM de partículas beta-TCP sintéticas. Los resultados de la extrusión a través de cánulas de formulaciones que contienen partículas de hidroxiapatita sintética o cerámica son, por lo tanto, sólo en parte predictivos de extrusión de formulaciones similares que contienen partículas de hidroxiapatita derivadas de hueso natural.
Una característica importante del hueso natural humano es la morfología y el tamaño muy pequeño (nano-tamaño) de los cristales de hidroxiapatita, que para el mineral óseo humano es: grupo espacial hexagonal P63/m, aproximadamente de 30 a 50 nm de longitud (eje c: [0,0,1]) y de 14 a 25 nm de longitud (ejes a y b: [1,0,0] y [0,1,0]). Véase Weiner, S. et al., 1992, FASEB, 6:879-885. Para estar más cerca del entorno natural en el que tiene lugar la regeneración, es deseable utilizar partículas nanocristalinas de hidroxiapatita derivadas de hueso natural, preferentemente con una morfología y tamaño de cristales cercanos a los del hueso natural humano.
US2012/0107401 describe matrices osteoconductoras implantables fluibles que comprenden una mezcla de partículas minerales de 0,1-2 mm de cerámica, como hidroxiapatita sintética y beta-TCP o hidroxiapatita derivada de hueso natural, colágeno soluble o colágeno insoluble derivado de una fuente humana o animal, y un agente terapéutico que incluye una estatina. Se enseña que esas matrices osteoconductoras implantables fluibles son adecuadas como masillas o como geles que pueden inyectarse, pulverizarse o instilarse en el sitio del tejido diana. Se enseña que la relación p/p entre cerámica y colágeno es de 0,15 a 22,5 (reivindicación 4) o de 1,5 a 11,5 (reivindicación 5), las únicas relaciones específicas entre cerámica y colágeno descritas son 5 y 4,83 (reivindicación 2 y [0089], [0090]).
La patente US N° 7.322.825 describe un método de tratamiento de la enfermedad periodontal mediante inyección en bolsas periodontales de una composición que es una mezcla de partículas óseas finamente molidas de hidroxiapatita microcristalina con un tamaño de 50 a 400 pm y partículas de "colágeno libre" de menos de 1 mm de diámetro, describiéndose que esas partículas de "colágeno libre" son fibrillas pequeñas de colágeno no entrecruzado o gel que contiene colágeno fibrilar y, opcionalmente, un espesante fisiológicamente compatible. Esa mezcla sólo tiene una viscosidad lo suficientemente baja como para pasar a través de una aguja de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm), después de una infusión de energía adicional mediante la aplicación de calor, por ejemplo, a través de radiación de microondas. Según esa patente, el colágeno entrecruzado tal como Avitene o Collastat no puede cortarse en trozos lo suficientemente pequeños como para pasar por una aguja de calibre 18. Para las composiciones específicamente descritas, la relación vol/vol entre hidroxiapatita y colágeno es de 0,5 a 1,5.
El método de tratamiento de la enfermedad periodontal de la patente US N° 7.322.825 no ha sido utilizado en forma generalizada. El colágeno no entrecruzado, tal como el "colágeno libre", dista mucho de ser un entorno natural in vivo deseable para la regeneración del tejido bucal, en particular para la regeneración del hueso alveolar, el cemento radicular o el ligamento periodontal.
La patente US N° 5.352.715 describe una formulación cerámica inyectable para la reparación y el aumento de tejidos blandos y duros que comprende partículas cerámicas de fosfato de calcio y colágeno en un portador fluido farmacéuticamente aceptable, en donde las partículas cerámicas de fosfato de calcio tienen un tamaño de 50 a 250 pm y la relación p/p entre las partículas cerámicas de fosfato y colágeno es de 1/19 a 1/1, preferentemente de 1/4 a 1/2. Según la enseñanza de esa patente, las partículas cerámicas de fosfato cálcico son preferentemente partículas cerámicas sinterizadas de origen no biológico (sintético) y el colágeno está sustancialmente libre de entrecruzamiento, es decir, desprovisto de telopéptidos, siendo el colágeno preferido un colágeno reconstituido atelopéptido purificado. Esa formulación cerámica inyectable puede pasar a través de una aguja de calibre 20 (diámetro interior de 0,603 mm).
Una combinación de colágeno privado de telopéptido y partículas sintéticas de fosfato de calcio dista mucho del entorno natural in vivo en el que tiene lugar la regeneración.
EP-0270254-A2 describe una composición de implante seco que comprende una mezcla que contiene, en peso sin humedad, 2-40 % de colágeno atelopéptido fibrilar reconstituido, sustancialmente libre de entrecruzamiento y 60-98 % de un fosfato tricálcico tal como hidroxiapatita con un rango de tamaños de 100-2000 pm, siendo la relación de masa entre el fosfato tricálcico y el colágeno atelopéptido por lo tanto de 1,5 a 49. La composición de implante seco se trata con radiación gamma para mejorar las propiedades biológicas y de manipulación.
Una combinación de colágeno privado de telopéptidos y partículas sintéticas de fosfato tricálcico dista mucho del entorno natural in vivo en el que tiene lugar la regeneración.
Una formulación de implante acuoso inyectable que contiene colágeno no puede esterilizarse mediante radiación gamma o de rayos X. La estabilidad durante un largo período (más de 6 meses) de una composición de implante acuoso estéril inyectable requeriría condiciones asépticas drásticas de preparación y almacenamiento que no siempre están disponibles fácilmente: Por lo tanto, es deseable proporcionar una composición de implante seco que sea estable durante un largo período y apta para dar por rehidratación una formulación de implante acuoso inyectable.
SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN
El problema o el objetivo de la invención consiste en encontrar una composición de implante seco que pueda ser utilizada para preparar una formulación de implante acuoso inyectable para utilizar en la regeneración tisular bucal, en particular en la regeneración de hueso alveolar, cemento de la raíz o el LPD, siendo esa formulación de implante acuoso inyectable extruible a través de un sistema cónico y una cánula de calibre 18 y sin los inconvenientes de las formulaciones de implante de la técnica anterior.
Al variar los métodos de preparación, los componentes y las proporciones de los componentes en más de 300 prototipos de composiciones de implante seco que comprenden partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas de hueso natural y colágeno fibroso entrecruzado naturalmente y someter las formulaciones obtenidas por rehidratación y mezcla homogénea de las composiciones de implantes secos a una prueba de extrusión mediante una cánula de calibre 18 (descrita en el Ejemplo 9), los inventores han encontrado características de esas composiciones de implantes secos que inesperadamente proporcionan capacidad de extrusión a través de un sistema cónico y una cánula de calibre 18 de las formulaciones de implantes acuosos rehidratadas y mezcladas homogéneamente, estas últimas proporcionan una matriz cercana al entorno natural en el que tiene lugar la regeneración.
Ese objetivo antes mencionado es alcanzado por la invención según lo definido en las reivindicaciones adjuntas.
La invención se refiere a:
- una composición de implante seco que consiste esencialmente en una mezcla de partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas de hueso natural de un tamaño de 50 a 200 pm y fragmentos de un material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente que pasan a través de un tamiz de 0,5 mm, por lo que la relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno es de 1,8 a 4,5,
- el uso de esa composición de implante seco para la preparación por rehidratación y mezcla homogénea de 25-45 % p/p de la composición de implante seco antes mencionada con un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable, una formulación de implante acuoso inyectable para su uso en la regeneración tisular bucal que es extruible a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm), y
- una formulación de implante acuoso inyectable para utilizar en la regeneración tisular bucal que se puede extruir a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) con una fuerza no superior a 60 N, que comprende 25-45 % p/p de la composición de implante seco antes mencionada rehidratada y mezclada homogéneamente con agua estéril o con una solución salina isotónica estéril.
La expresión "consiste esencialmente en una mezcla de..." significa que una proporción muy elevada, normalmente al menos 99 % en peso del implante seco consiste en la mezcla mencionada y como máximo 6 % de una sal mineral, como por ejemplo, cloruro sódico, los demás componentes, normalmente, como máximo 1 % en peso del implante seco, derivan de una fuente natural y no afectan significativamente al comportamiento de extrusión de la formulación de implante acuoso inyectable. Tales componentes pueden ser grasa, ceniza sulfatada, glucosamina, galactosamina y partes de proteínas residuales en cantidades muy pequeñas tales como periostina, decorina y lumicano o proteínas similares. Los demás componentes no incluyen ningún polímero sintético, en particular ningún óxido de polietileno, óxido de polipropileno o lubricante sintético. Los demás componentes no incluyen ninguna estatina ni ninguna hidroxiapatita artificial, es decir, hidroxiapatita de origen no biológico.
Las "partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas de hueso natural" son partículas derivadas de hueso natural mediante un proceso que permite la preservación de la estructura nanocristalina del hueso natural. Dicho proceso debe realizarse a una temperatura lo suficientemente baja, de modo que no haya recristalización de la parte mineral del hueso natural, normalmente una temperatura que no exceda los 700 °C.
Un proceso de este tipo adecuado se describe en la patente US N° 5.167.961 o 5.417.975: Implica degradar materia orgánica en hueso desengrasado calentando con amoníaco, extrayendo los productos de degradación solubilizados lavando con agua corriente a temperaturas inferiores a 60 °C y tratando el mineral óseo en aire a temperaturas entre 250 °C y 600 °C, como para permitir la preservación de la estructura trabecular y la estructura nanocristalina del hueso natural, proporcionando hidroxiapatita nanocristalina con una impureza orgánica muy baja o contenido de proteínas muy bajo. Las partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas del hueso natural pueden obtenerse moliendo y tamizando la hidroxiapatita nanocristalina mencionada anteriormente.
Las partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas del hueso natural también pueden obtenerse convenientemente moliendo y tamizando gránulos pequeños Geistlich Bio-Oss® (disponibles en Geistlich Pharma AG, CH-6110, Suiza).
Las "partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas del hueso natural" adecuadas para su incorporación en la composición de la invención tienen un tamaño de 50 a 200 pm.
De hecho, cuando las partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas del hueso natural tienen un tamaño superior a 200 |jm, la formulación del implante obtenida por rehidratación y mezcla homogénea tiende a obstruir las cánulas de jeringa de calibre 18 (0,838 mm de diámetro interior) y cuando las partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas del hueso natural tienen un tamaño inferior a 50 jm , hay un mayor riesgo de inflamación causada por esas pequeñas partículas.
Por lo tanto, el tamaño del rango de 50 a 200 jm es fundamental.
Preferentemente las partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas del hueso natural tienen un tamaño de 100 a 180 jm . Los riesgos de inflamación u obstrucción se reducen al mínimo.
La expresión "material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente" se refiere al material de colágeno fibroso derivado de un material tisular natural mediante un proceso que permite conservar su estructura de telopéptido y la mayor parte de su entrecruzamiento natural. Tal material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente es un material insoluble de colágeno que no ha sido sometido a ningún tratamiento enzimático, ningún entrecruzamiento químico ni ningún entrecruzamiento físico (tal como por ejemplo por tratamiento térmico DeHydro DHT, radiación UV etc..). De hecho, cualquiera de estos últimos tratamientos puede cambiar significativamente la estructura de telopéptido y/o el entrecruzamiento natural presentes en el material del tejido natural.
El material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente es derivado adecuadamente de tejidos de origen natural que contienen de 50 a 100 % p/p de colágeno y de 0 a 50 % p/p de elastina, preferentemente de 70 a 95 % p/p y de 5 a 30 % p/p de elastina, medido por determinación de desmosina/iodesmosina según una modificación de un método conocido que implica hidrólisis y RPHPLC (véase por ejemplo, Guida E. et al. 1990 Development and validation of a high performance chromatography method for the determination of desmosines in tissues in Journal of Chromatography or Rodriguqe P 2008 Quantification of Mouse Lung Elastin During Prenatal Development in The Open Respiratory Medicine Journal). Ejemplos de estos tejidos son la membrana peritoneal o pericárdica de vertebrados, en particular de mamíferos (por ejemplo, porcinos, bovinos, equinos, ovinos, caprinos, lapinos), la membrana de la placenta, la submucosa del intestino delgado (SID) y la dermis. Estos tejidos son preferentemente porcinos, bovinos o equinos. Los tejidos interesantes son la membrana peritoneal porcina, bovina o equina y la dermis.
Preferentemente, el material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente se selecciona del grupo que consiste en dermis porcina y membrana peritoneal o pericárdica porcina.
Normalmente, el colágeno es predominantemente colágeno tipo I, colágeno tipo III o una mezcla de los mismos. El colágeno también puede incluir una proporción de colágeno tipo II, tipo IV, tipo VI o tipo VIII, o cualquier combinación de éstos o de cualquier tipo de colágeno.
Normalmente, el material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente contiene de 50 a 100 % p/p de colágeno y de 0 a 50 % p/p de elastina, preferentemente de 70 a 95 % p/p y de 5 a 30 % p/p de elastina.
Un material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente adecuado derivado de un tejido natural es una membrana de colágeno de peritoneo o pericardio porcino, bovino o equino preparada por un proceso similar al descrito en el "Ejemplo" de EP-B1-1676592, que comprende un tratamiento alcalino, un tratamiento ácido y un tratamiento con disolventes orgánicos, seguido de una molienda en fragmentos que atraviesan un tamiz de 0,5 mm.
Otro material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente adecuado derivado de un tejido natural es el Geistlich Bio-Gide® (disponible comercialmente en Geistlich Pharma AG) que se ha molido en fragmentos que atraviesan un tamiz de 0,5 mm.
Otro material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente adecuado derivado de un tejido natural es la dermis porcina preparada por un proceso similar al descrito en el Ejemplo 7 de EP-B1-2654816, que comprende un tratamiento alcalino, un tratamiento ácido, una liofilización y una limpieza mediante disolventes orgánicos, seguido de una molienda en fragmentos que atraviesan un tamiz de 0,5 mm.
Es interesante que el material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente incluya fibras de colágeno maduras que muestran una triple helicidad, como lo muestra la Espectroscopia de Dicroismo Circular. Estas fibras forman en efecto un andamio que favorece la colonización por células de regeneración de tejidos bucales, en particular células para la regeneración de huesos y células para la regeneración del ligamento LPD.
El material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente debe estar presente en fragmentos que pasen a través de un tamiz de 0,5 mm. Tales fragmentos se obtienen generalmente moliendo el colágeno fibroso entrecruzado naturalmente por un procedimiento que involucra un molino centrífugo y tamizado de los fragmentos de colágeno.
La característica del material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente de estar presente en fragmentos que pasan a través de un tamiz de 0,5 mm es fundamental para la extrusión a través de un sistema cónico y una cánula de calibre 18 (0,838 mm de diámetro interior). De hecho, como demuestran los experimentos realizados en numerosos prototipos, cuando se utilizan fragmentos más grandes del material entrecruzado naturalmente, por ejemplo, fragmentos que atraviesan un tamiz de 0,6 o 0,7 mm en la composición del implante seco, existe un riesgo sustancial de que la formulación del implante obtenida por rehidratación y mezcla homogénea de la composición del implante seco obstruya la cánula de calibre 18.
La relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno es otro parámetro fundamental para la extrusión a través de un sistema cónico y una cánula de calibre 18 (0,838 mm de diámetro interior).
De hecho, como demuestran los experimentos realizados en numerosos prototipos, cuando la relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno es inferior a 1,8 o superior a 4,5, la formulación del implante obtenida por rehidratación y mezcla homogénea no es fácilmente inyectable, la fuerza requerida para la extrusión a través de un sistema cónico y una cánula de calibre 18 (0,838 mm de diámetro interior) es demasiado elevada. Se trata de un resultado inesperado para el que no parece haber una explicación directa. La fuerza necesaria para la extrusión aumenta abruptamente de 1,8 a 1,5, pero sólo aumenta moderadamente de 4,5 a 6. Sin embargo, como demuestran los experimentos realizados en numerosos prototipos, cuando la relación es superior a 4,5, por ejemplo 5, la reproducibilidad de la fuerza necesaria para extruir la formulación del implante no es suficiente. La alta reproducibilidad requerida para un producto de implante comercial sólo se logra cuando la relación entre la hidroxiapatita nanocristalina y el colágeno es de 1,8 a 4,5.
El rango de la relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 1,8 a 4,5 es por lo tanto fundamental.
Preferentemente la relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno es de 2,5 a 4,2. Dentro de ese rango, la fuerza necesaria para la extrusión suele ser menor.
Preferentemente la relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno es de 2,5 a 4,0. En efecto, se ha encontrado la mayor reproducibilidad de los resultados de la extrusión con una fuerza pequeña para las formulaciones de implantes acuosos inyectables con esa relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno.
Para mejorar la capacidad de extrusión de la formulación de implantes acuosos inyectables, es conveniente que la composición de implantes secos se haya esterilizado mediante radiación gamma o rayos X, utilizando las dosis de radiación habituales para la esterilización, normalmente 27-33 kGy. Tal tratamiento rompe de hecho ciertos enlaces en el colágeno fibroso naturalmente entrecruzado y favorece así su fluidez y su capacidad de extrusión.
La expresión "formulación de implante acuoso inyectable" se refiere a la formulación del implante preparada por rehidratación y mezcla homogénea del 25-45 % p/p de la composición del implante seco con un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable, que es capaz de ser convenientemente inyectada en el cuerpo humano o animal para la regeneración de tejido bucal, en particular en las bolsas periodontales, siendo extruible a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm).
Normalmente, la formulación de implante acuoso inyectable se puede extruir a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) con una fuerza no superior a 60 N.
Generalmente, ese vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable es agua estéril, una solución salina isotónica estéril, sangre o fracciones de la misma, generalmente la propia sangre del paciente.
La formulación de implante acuoso inyectable se obtiene preferentemente por rehidratación y mezcla homogénea de 25-45 % p/p de la composición de implante seco, más preferentemente 30-40 % p/p de la composición de implante seco, con agua estéril, una solución salina isotónica estéril o sangre. Cuando se utiliza esa cantidad de la composición de implante seco, la formulación de implante acuoso inyectable es una nueva formulación que se puede extruir de una jeringa a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) con una fuerza no superior a 60 N.
Cuando la formulación de implante acuoso inyectable se obtiene mediante rehidratación y mezcla homogénea de 30­ 40 % p/p de la composición de implante seco definida anteriormente con agua estéril o solución salina isotónica estéril, la fuerza necesaria para extruir la formulación de implante acuoso inyectable a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) es inferior a 40 N, preferentemente inferior a 20 N.
Cuando la formulación de implante acuoso inyectable se obtiene mediante rehidratación y mezcla homogénea del 30­ 40 % p/p de la composición de implante seco definida anteriormente con sangre, la fuerza necesaria para extruir la formulación de implante acuoso inyectable que contiene 30-40 % p/p de la composición de implante seco en un vehículo farmacéuticamente aceptable es inferior a 45 N, preferentemente inferior a 25 N.
La composición de implante seco utilizada en la invención puede ser preparada por un proceso que comprende las etapas siguientes:
(a) proporcionar partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas de hueso natural de un tamaño de 50 a 200 |jm, (b) preparar el material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente molido mediante un proceso que comprende un tratamiento alcalino, un tratamiento ácido y un tratamiento con disolventes orgánicos, y molienda en fragmentos que pasen por un tamiz de 0,5 mm,
(c) agregar a una solución acuosa la mezcla de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente molida obtenida en (b), mezclando vigorosamente para obtener una suspensión de colágeno, agregar las partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 50 a 200 jm preparadas en (a) y mezclar vigorosamente, permaneciendo el pH a 4,2 hasta 7,5,
(d) secar la composición mezclada que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina y colágeno obtenida en (c) y
(e) esterilizar por radiación gamma o de rayos X la composición de implante seco obtenida en (d). Las partículas de hidroxiapatita nanocristalina de cerámica derivadas de hueso natural son partículas derivadas de hueso natural mediante un proceso que permite la preservación de la estructura nanocristalina del hueso natural, según lo descrito anteriormente.
El mineral óseo de alta pureza obtenido por el proceso anterior puede ser molido y tamizado de tal forma que tenga el tamaño requerido.
De forma alternativa, las partículas de cerámica derivadas de hueso natural con el tamaño requerido pueden ser producidas a partir de Geistlich Bio-Oss® (disponible comercialmente en Geistlich Pharma AG) utilizando etapas de molienda y tamizado.
El colágeno fibroso entrecruzado naturalmente molido de la etapa (b) puede ser preparado mediante un proceso similar al descrito en el Ejemplo 7 de EP-B1-2654815, que comprende moler en agua pieles de porcino, bovino, equino, caprino o lapino a trozos de 0,5 a 30 mm, eliminar el agua con un disolvente soluble en agua tal como alcohol o cetona, desengrasar con un hidrocarburo clorado tal como dicloroetano o cloruro de metileno o un hidrocarburo no clorado tal como hexano o tolueno, tratar el colágeno con una base inorgánica fuerte a un pH superior a 12,0 y con un ácido inorgánico fuerte a un pH de 0 a 1, liofilizar y limpiar las fibras de colágeno seco de la esponja obtenidas mediante disolventes orgánicos tales como alcoholes, éteres, cetonas e hidrocarburos clorados, retirar los disolventes al vacío, y moler más la esponja de colágeno limpia en fragmentos que pasan por un tamiz de 0,5 mm mediante un procedimiento que implica un molino centrífugo y tamizado de los fragmentos de colágeno.
El colágeno fibroso entrecruzado naturalmente molido de la etapa (b) también puede ser preparado mediante un proceso similar al descrito en EP-B1-1676592, que comprende la liberación de carne y grasa mediante un tratamiento mecánico de membranas porcinas, bovinas, equinas, peritoneales o de miocardio, lavándose con agua, tratar con una solución de hidróxido de sodio al 1-5 %, lavar con agua, acidificar con ácido clorhídrico al 0,2-0,8 %, lavar con agua hasta un pH de 3,5, neutralizar con una solución de NaHCO3 , lavar con agua, deshidratar con un disolvente soluble en agua tal como alcohol o cetona, desengrasado con un hidrocarburo tal como hexano, y moler adicionalmente las membranas de colágeno limpiadas en fragmentos que pasan a través de un tamiz de 0,5 mm mediante un procedimiento que implica un molino centrífugo y tamizado de los fragmentos de colágeno.
En la etapa (c) se agrega el colágeno fibroso entrecruzado naturalmente molido preparado en la etapa (b) a una solución acuosa y se mezcla vigorosamente para obtener una suspensión de colágeno, luego se agregan las partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 50 a 200 jm preparadas en la etapa (a) a la suspensión de colágeno y se mezcla vigorosamente.
Normalmente, el pH medido en la etapa (c) es de 4,2 a 7,5, preferentemente de 4,5 a 7,5.
La etapa (d) generalmente comprende el secado de la composición mezclada que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina y colágeno obtenido en (c) por liofilización o secado al aire, preferentemente bajo presión reducida.
El contenido de agua de la composición de implante seco obtenido en la etapa (b) es generalmente del 3-7 %, medido por la valoración de Karl Fischer.
La etapa (d) es opcionalmente seguida por la etapa (e) de esterilización por radiación gamma o rayos X, generalmente usando las dosis de radiación habituales para la esterilización, típicamente 27-33 kGy.
La invención se refiere además a una nueva formulación de implante acuoso inyectable para utilizar en la regeneración tisular bucal que se puede extruir a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) con una fuerza no superior a 60 N, que comprende 25-45 % p/p de la composición de implante seco antes mencionada rehidratada y mezclada homogéneamente con agua estéril o con una solución salina isotónica estéril.
Cuando la formulación de implante acuoso inyectable comprende 30-40 % p/p de la composición de implante seco mencionada anteriormente rehidratada y mezclada homogéneamente con agua estéril o con una solución salina isotónica estéril, la fuerza necesaria para extruir la formulación de implante acuoso inyectable a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) es inferior a 40 N, frecuentemente inferior a 20 N.
Se ha observado que las células que forman el hueso pueden crecer in vitro en la formulación de implante acuoso inyectable de la invención. Esto muestra la alta biocompatibilidad de la formulación de implante acuoso inyectable, que proporciona al implante una matriz muy cercana al entorno natural in vivo en el que se produce la regeneración. La invención también se refiere a un proceso para preparar la formulación de implante acuoso inyectable antes mencionada que comprende rehidratar y mezclar homogéneamente 25-45 % p/p, respectivamente 30-40 % p/p, de la composición de implante seco definida anteriormente con agua estéril o solución salina isotónica estéril.
La mezcla homogénea del material rehidratado es esencial para su extrusión de la jeringa con baja fuerza.
Es conveniente rehidratar y mezclar homogéneamente la composición de implante seco con agua estéril o con una solución salina isotónica estéril en una jeringa equipada con un dispositivo de mezcla.
Una jeringa apropiada es el sistema de mezcla de jeringas Medmix (MEDMIX, SP 003-00M-02 /B, número de catálogo 507211) representado en la Fig. 1.
La invención se refiere además a una jeringa lista para usar que contiene la formulación inyectable del implante. Dicha jeringa lista para usar puede prepararse mucho antes de la inyección en condiciones estériles muy estrictas preparando la formulación de implante seco definida anteriormente y rehidratando y mezclando homogéneamente 25­ 45 % p/p de la composición de implante seco definida anteriormente con agua estéril o con una solución salina isotónica estéril e introduciendo en la jeringa la formulación de implante acuoso inyectable.
Esta jeringa lista para usar también puede prepararse poco antes de la inyección de una jeringa equipada con un dispositivo de mezcla que contiene la composición de implante seco mencionada anteriormente rehidratando y mezclando homogéneamente en la jeringa esa composición de implante seco con agua estéril, una solución salina isotónica estéril o sangre.
La invención se refiere además a un kit para preparar la formulación de implante acuoso inyectable antes mencionada para utilizar en la regeneración tisular bucal, que comprende:
- una jeringa equipada con un dispositivo de mezcla que contiene una composición de implante seco tal como se ha definido anteriormente, un sistema cónico y una cánula de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) de 25,4 mm de longitud
- un recipiente lleno con una cantidad adecuada de agua estéril o solución isotónica estéril.
Preferentemente, el recipiente lleno con una cantidad adecuada de agua estéril o solución isotónica estéril es una jeringa con una cánula. El líquido se puede introducir de forma conveniente en la jeringa equipada con un dispositivo de mezcla que contiene la composición de implante seco.
La invención se refiere además a las formulaciones de implante inyectables antes mencionadas para usar para promover la regeneración del hueso alveolar, del cemento de la raíz o del LPD implantando en la cavidad bucal la formulación de implante inyectable antes mencionada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La invención se describirá con más detalle con referencia a ejemplos ilustrativos de las formas de realización preferidas de la invención y las figuras que acompañan en las cuales:
La Fig. 1 representa el sistema de mezcla con jeringa Medmix (MEDMIX, SP 003-00M-02 /B, número de catálogo 507211), (1) es la jeringa que contiene el biomaterial seco, (2) es el tapón de la jeringa con una salida luer de orificio abierto, que es compatible con cualquier cánula luer, (3) es el tapón con orificio abierto para cerrar la jeringa durante el proceso de mezcla, (4) es el dispositivo de mezcla, que es un mezclador flexible una vez que se ha retirado el émbolo y (5) es el émbolo, que puede retirarse para mezclar el material en la jeringa y puede volver a colocarse después para expulsar el material.
La Fig. 2 es una copia del procedimiento de mezcla de Medmix tal como se indica en las instrucciones de funcionamiento que se adjuntan al sistema de mezcla de jeringas Medmix.
Las Figuras 3A y 3B representan las curvas de extrusión de las formulaciones de implante acuoso inyectable obtenidas rehidratando y mezclando homogéneamente las composiciones de implante seco 2 y 4 en los ejemplos con solución salina isotónica (curvas (1) y (3) o sangre humana fresca (curvas (2) y (4), respectivamente.
La Fig. 4 es una imagen de microscopía que utiliza un microscopio de disco de centrifugado confocal CV1000 con excitación por iluminación láser de 561 nm de la formulación de implante acuoso inyectable 4 obtenida rehidratando y mezclando homogéneamente la composición de implante seco 4 (preparada en el Ejemplo 6) con sangre humana: los glóbulos rojos MC3T3 CytoLight cultivados se visualizan en brillante.
La Fig. 5 representa en el lado izquierdo una micrografía electrónica de barrido (SEM) de partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas de hueso natural y en el lado derecho una SEM de partículas beta-TCP sintéticas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin limitar su alcance.
Ejemplo 1 Preparación de las materias primas
1) Preparación de partículas finas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 100 a 150 pm o 125 a 180 pm
Se produjeron partículas finas de minerales óseos de hidroxiapatita nanocristalina a partir de hueso cortical o esponjoso, como se describe en los Ejemplos 1 a 4 de US-A-5417975, utilizando una etapa adicional de tamizado entre 100 y 150 pm o entre 125 y 180 pm, respectivamente. Alternativamente, se produjeron partículas finas de mineral óseo de hidroxiapatita nanocristalina mediante molienda de gránulos pequeños Geistlich Bio-Oss® (disponible en Geistlich Pharma AG, CH-6110, Suiza), un impacto cuidadoso mediante una pistola y una etapa de tamizado adicional entre 100 y 150 pm o entre 125 y 180 pm, respectivamente.
Las partículas finas de mineral óseo de hidroxiapatita nanocristalina previamente preparadas, con un tamaño entre 100 y 150 pm o entre 125 y 180 pm, se almacenaron en botellas de vidrio hasta su uso.
2) Preparación del colágeno A
Las pieles de cerdo se molieron en una picadora de carne hasta obtener trozos de 1 a 20 mm. Se eliminó el agua usando un disolvente soluble en agua tal como un alcohol o una cetona. Se desgrasaron las fibras de colágeno utilizando un hidrocarburo clorado tal como dicloroetano o cloruro de metileno o un hidrocarburo no clorado tal como hexano o tolueno.
Después de retirar el disolvente, se trató el colágeno con una base inorgánica fuerte a un pH superior a 12 durante un período de 6 a 24 horas y se trató con un ácido inorgánico fuerte a un pH de 0 a 1 durante un período de 1 a 12 horas. Se eliminó el exceso de ácido enjuagando con agua y se homogeneizó la suspensión a una suspensión homogénea de fibras de colágeno del 0,5 al 2 % en presencia de un regulador de la dilatación tal como una sal inorgánica. Se secó la suspensión por liofilización y se limpiaron sucesivamente las fibras de colágeno secas de la esponja obtenida con diferentes disolventes orgánicos tales como alcoholes, éteres, cetonas e hidrocarburos clorados, evaporándose los disolventes al vacío hasta un residuo de disolvente inferior al 1 %.
Se cortaron a mano trozos de 1 x 1 cm de la esponja de colágeno limpiada con tijeras. Se molieron los trozos cortados utilizando, en primer lugar, un molino de corte que incluye un tamiz de 0,5 a 4,0 mm, luego un molino centrífugo (Retsch, ZM200) con un tamiz de 0,5 mm que incluye orificios trapezoidales. Se molieron alternativamente directamente los trozos cortados con tijeras con el molino centrífugo.
Se obtuvo así un colágeno A compuesto por fragmentos de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente que pasan a través de un tamiz de 0,5 mm.
3) Preparación de colágeno B
Se liberaron completamente las membranas peritoneales de cerdos jóvenes de carne y grasa por medios mecánicos, se lavaron bajo agua corriente y se trataron con solución de NaOH al 2% durante 12 horas. Luego se lavaron las membranas bajo agua corriente y se acidificaron con HCl al 0,5%. Después de que el material se había acidificado a través de todo su espesor (alrededor de 15 min) se lavó el material hasta que se obtuvo un pH de 3,5. Luego se encogió el material con solución salina al 7%, se neutralizó con solución de NaHCO3 al 1% y se lavó bajo agua corriente. Luego se deshidrató el material con acetona y se desengrasó con n-hexano.
Se secó el material utilizando éter de etanol y se molió con un molino de corte (por ejemplo Pulverisette 25 de Fritsch: véase www.fritsch.de./produkte/mahlen/schneidmuehlen/pulverisette-25 o SM300 de Retsch: www.retsch.de/de/produkte/zerklemem/schneidiTiuehlen.htliTi) que incluye un tamiz trapezoidal de 0,5 a 1,0 mm. Se molieron adicionalmente los segmentos de fibra de colágeno cortados mediante un molino centrífugo (Retsch, ZM200) con un tamiz de 0,5 mm que incluía orificios trapezoidales.
Se obtuvo así un colágeno B compuesto por fragmentos de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente que pasan a través de un tamiz de 0,5 mm.
Ejemplo 2 Secado y esterilización de composiciones mezcladas que contienen partículas de hidroxiapatita nanocristalina y colágeno
Se secaron las composiciones mezcladas que contenían partículas de hidroxiapatita nanocristalina y colágeno (obtenidas como se describe en los Ejemplos 3 a 8 siguientes) por liofilización o secado al aire bajo presión reducida y se esterilizaron por radiación gamma o rayos X.
1) Liofilización
De la jeringa de 50 ml, se cargó la masa en jeringas de 1ml de Copolímero de Olefina Cíclica (COC) desde la parte posterior. Se llenó un volumen de aproximadamente 0,5 ml por cada 1ml de jeringa. Las jeringas se almacenaron cerradas de ambos lados durante 5 horas en un refrigerador a 4 °C. A continuación, se abrieron las jeringas en ambos lados y se colocaron en una placa metálica en el liofilizador, estando cada jeringa en una posición tumbada, por ejemplo, tiene una gran superficie de contacto con la placa metálica. A continuación, se inició el siguiente programa de liofilización:
1. Congelación en 7 horas a -40°C
2. Mantener 4 horas a -40°C
3. Secado primario a -10°C y 850jbar durante 20 horas
4. Secado secundario a 20°C y Í00|jbar durante 6 horas
Alternativamente, la masa viscosa de hidroxiapatita nanocristalina y colágeno no se liofilizó en jeringas, sino en placas de acero inoxidable o en pequeñas formas de acero inoxidable de menos de 25mm de diámetro y menos de 10mm de profundidad. Se trituró el material seco obtenido tras la liofilización en partículas de 0,1 a 2 mm de tamaño mediante un molino centrífugo (Retsch, ZM200) con tamices de 1,5 mm hasta 10 mm. El triturado por un molino condujo a partículas más pequeñas de hidroxiapatita nanocristalina en el producto final reconstituido.
Alternativamente, para la trituración, se extruyó la masa viscosa de hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de una salida luer estándar de una jeringa y se formó como líneas rectas en placas de acero inoxidable. Luego se liofilizó el material como tal.
2) Secado al aire
Se secó alternativamente la masa viscosa de hidroxiapatita nanocristalina y colágeno, por ejemplo, formada como líneas rectas por aire en un horno de vacío a 30°C y 10 mbar durante 24 horas.
Las líneas rectas secas se rompieron en palos de 5 a 10 mm de largo a mano.
Luego se cargó el material granulado o los pequeños palos en un sistema de mezcla de jeringa de 3 ml (MEDMIX, SP 003-00M-02/B, número de catálogo 507211) con tapón de jeringa con luer de orificio abierto y tapón de orificio abierto (MEDMIX, CP 000-76M/D, número de catálogo 506964).
3) Esterilización
Se esterilizó la composición de implante seco obtenida mediante liofilización o secado al aire a presión reducida en la jeringa mediante radiación gamma o rayos X con 27-33 kGy.
El contenido de agua en el producto seco justo después de la esterilización fue del 3-7 %, medido por la valoración de Karl Fisher.
Ejemplo 3 Preparación de la composición de implante seco 1 que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 100 a 150 jm o 125 a 180 jm y colágeno A, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 4,0
Preparación de la composición de hidroxiapatita nanocristalina- colágeno
Se mezclaron agua y ácido clorhídrico (2M) en un vaso de precipitados con una espátula. Se agregó el colágeno molido A obtenido en el Ejemplo 1 y se introdujo cuidadosamente en el líquido para humedecer todo el colágeno. Se cerró el vaso con una tapa de rosca y se mezcló de forma homogénea la suspensión de agua y colágeno con un Speedmixer (CosSearch GmbH, Speedmixer DAC400,1FVZ) durante 4 minutos con 2500 rpm. Se calentó ligeramente la suspensión de colágeno durante el procedimiento de mezcla. A continuación, se enfrió la suspensión de colágeno durante 30 minutos en el refrigerador a 4°C.
Se mezcló la suspensión de colágeno con un Speedmixer durante 2 minutos con 2500 rpm. A continuación, se agregaron en el vaso con la suspensión de colágeno las partículas finas de mineral óseo de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de entre 100 y 150 pm o 125 y 180 pm preparadas en el Ejemplo 1 y se mezcló la masa con el Speedmixer durante 2 minutos con 2000 rpm. El pH resultante fue de alrededor de 4,5.
Las cantidades de material utilizadas en los experimentos anteriores se especifican en la siguiente tabla:
Figure imgf000011_0001
Secado de la composición de hidroxiapatita nanocristalina-colágeno
El secado por liofilización o secado al aire a presión reducida y la esterilización se realizó como se describe en el Ejemplo 2.
Se obtuvo así la composición de implante seco 1 que contenía partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 100 a 150 pm o 125 a 180 pm y colágeno A con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 4,0 y proporcionando un pH de 4,5 después de la rehidratación con agua desmineralizada realizada según lo descrito en el Ejemplo 9.
Ejemplo 4 Preparación de la composición de implante seco 2 que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y colágeno B, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 4,0.
Preparación de la composición de hidroxiapatita nanocristalina- colágeno
Se introdujo cuidadosamente el colágeno molido B obtenido en el Ejemplo 1 en el agua desmineralizada para humedecer todo el colágeno. Se cerró el vaso con una tapa de rosca y se mezcló de forma homogénea la suspensión de agua y colágeno con un Speedmixer durante 1 minuto con 2500 rpm. Luego, se calentó la suspensión de colágeno hasta 70°C en un baño de agua durante 4 horas. A continuación, se enfrió la suspensión de colágeno durante 30 minutos a temperatura ambiente o en un refrigerador o en un baño de agua.
Se mezcló la suspensión de colágeno con un Speedmixer durante 2 minutos con 2500 rpm. A continuación, se agregaron en el vaso con la suspensión de colágeno las partículas finas de mineral óseo de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de entre 125 y 180 pm preparadas en el Ejemplo 1 y se mezcló la masa con el Speedmixer durante 2 minutos con 2000 rpm. El pH resultante fue de 6,2.
Las cantidades de material utilizadas en los experimentos anteriores se especifican en la siguiente tabla:
Figure imgf000011_0002
Secado de la composición de hidroxiapatita nanocristalina-colágeno
El secado por liofilización o secado al aire a presión reducida y la esterilización se realizó como se describe en el Ejemplo 2.
Se obtuvo así la composición de implante seco 2 que contenía partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y colágeno B con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 4,0 y proporcionando un pH de 6,2 después de la rehidratación con agua desmineralizada realizada según lo descrito en el Ejemplo 9.
Ejemplo 5 Preparación de la composición de implante seco 3 que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y una mezcla de 2 partes de colágeno A por 1 parte de colágeno B, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 2,67.
Preparación de la composición de hidroxiapatita nanocristalina- colágeno
Se mezclaron agua y ácido clorhídrico (2M) en un vaso de precipitados con una espátula. Se introdujo cuidadosamente el colágeno molido B obtenido en el Ejemplo 1 en el líquido para humedecer todo el colágeno. Se cerró el vaso con una tapa de rosca y se mezcló de forma homogénea la suspensión de agua y colágeno con un Speedmixer durante 2 minutos con 2500 rpm con un pH resultante entre 0,9 y 1. Luego, se calentó la suspensión de colágeno hasta 70°C en un baño de agua durante 20 minutos. A continuación, se enfrió la suspensión de colágeno durante 30 minutos en un baño de agua a 25°C.
Se agregó el colágeno molido A obtenido en el Ejemplo 1 y se introdujo cuidadosamente en la suspensión de colágeno para humedecer todo el colágeno. Luego se mezcló la suspensión con un Speedmixer durante 4 minutos con 2500 rpm.
Finalmente, se agregaron en el vaso con la suspensión de colágeno las partículas finas de mineral óseo de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de entre 125 y 180 mm preparadas en el Ejemplo 1 y se mezcló la masa con el Speedmixer durante 2 minutos con 2000 rpm. El pH resultante fue de alrededor de 4,5.
Las cantidades de material utilizadas en los experimentos anteriores se especifican en la siguiente tabla:
Figure imgf000012_0001
Secado de la composición de hidroxiapatita nanocristalina-colágeno
El secado por liofilización o secado al aire a presión reducida y la esterilización se realizó como se describe en el Ejemplo 2.
Se obtuvo así la composición de implante seco 3 que contenía partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y una mezcla de 2 partes de colágeno A por 1 parte de colágeno B, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 2,67 y proporcionando un pH de 4,5 después de la rehidratación con agua desmineralizada realizada según lo descrito en el Ejemplo 9.
Ejemplo 6 Preparación de la composición de implante seco 4 que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y una mezcla de 2 partes de colágeno A por 1 parte de colágeno B, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 2,67.
Preparación de la composición de hidroxiapatita nanocristalina- colágeno
Se introdujo cuidadosamente el colágeno molido B obtenido en el Ejemplo 1 en el agua desmineralizada para humedecer todo el colágeno. Se cerró el vaso con una tapa de rosca y se mezcló de forma homogénea la suspensión de agua y colágeno con un Speedmixer durante 1 minuto con 2500 rpm. Luego, se calentó la suspensión de colágeno hasta 70°C en un baño de agua durante 20 min. A continuación, se enfrió la suspensión de colágeno durante 30 minutos en un baño de agua a 25°C.
Se agregó el colágeno molido A obtenido en el Ejemplo 1 y se introdujo cuidadosamente en la suspensión de colágeno para humedecer todo el colágeno. Luego se mezcló la suspensión con un Speedmixer durante 4 minutos con 2500 rpm.
Finalmente, se agregaron en el vaso con la suspensión de colágeno las partículas finas de mineral óseo de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de entre 125 y 180 pm preparadas en el Ejemplo 1 y se mezcló la masa con el Speedmixer durante 2 minutos con 2000 rpm. El pH resultante fue de 6,0.
Las cantidades de material utilizadas en los experimentos anteriores se especifican en la siguiente tabla:
Figure imgf000013_0001
Secado de la composición de hidroxiapatita nanocristalina-colágeno
El secado por liofilización o secado al aire a presión reducida y la esterilización se realizó como se describe en el Ejemplo 2.
Se obtuvo así la composición de implante seco 4 que contenía partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y una mezcla de 2 partes de colágeno A por 1 parte de colágeno B, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 2,67 y proporcionando un pH de 6,0 después de la rehidratación con agua desmineralizada realizada según lo descrito en el Ejemplo 9.
Ejemplo 7 Preparación de la composición de implante seco 5 que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y colágeno A, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 4,0
Preparación de la composición de hidroxiapatita nanocristalina- colágeno
Se introdujo cuidadosamente el colágeno molido A en el agua desmineralizada para humedecer todo el colágeno. Se agregaron las partículas finas de mineral óseo de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de entre 125 y 180 pm preparadas en el ejemplo 1 y se cerró el vaso con una tapa de rosca. Se mezcló de forma homogénea la mezcla de hidroxiapatita nanocristalina - agua-colágeno con el mezclador Vortex durante 1 minuto y una cuchara durante 1 minuto.
El pH resultante fue de 6,1.
Las cantidades de material utilizadas se describen en la siguiente tabla:
Figure imgf000013_0002
Secado de la composición de hidroxiapatita nanocristalina-colágeno
El secado por liofilización o secado al aire a presión reducida y la esterilización se realizó como se describe en el Ejemplo 2.
Se obtuvo así la composición de implante seco 5 que contenía partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y colágeno A, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 4,0, y proporcionando un pH de 6,1 después de la rehidratación con agua desmineralizada realizada según lo descrito en el Ejemplo 9.
Ejemplo 8 Preparación de la composición de implante seco 6 que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y colágeno A, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno A de 2,0
Preparación de la composición de hidroxiapatita nanocristalina- colágeno
Se introdujo cuidadosamente el colágeno molido A en el agua desmineralizada para humedecer todo el colágeno. Se agregaron las partículas finas de mineral óseo de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de entre 125 y 180 pm preparadas en el ejemplo 1 y se cerró el vaso con una tapa de rosca. Se mezcló de forma homogénea la mezcla de hidroxiapatita nanocristalina - agua-colágeno con el mezclador Vortex durante 1 minuto y una cuchara durante 1 minuto.
El pH resultante fue de 5,8.
Las cantidades de material utilizadas se describen en la siguiente tabla:
Figure imgf000014_0001
Secado de la composición de hidroxiapatita nanocristalina-colágeno
El secado por liofilización o secado al aire a presión reducida y la esterilización se realizó como se describe en el Ejemplo 2.
Se obtuvo así la composición de implante seco 6 que contenía partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 pm y colágeno A, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 2,0, y proporcionando un pH de 5,8 después de la rehidratación con agua desmineralizada realizada según lo descrito en el Ejemplo 9.
Ejemplo 9 Preparación de una jeringa lista para usar que contiene una formulación de implante acuoso inyectable mediante rehidratación de la composición de implante seco en la jeringa.
1) Preparación de una jeringa lista para usar que contiene una formulación de implante acuoso inyectable obtenida mediante rehidratación y mezcla homogénea de la composición de implante seco
a) utilizando un adaptador Luer-Lok de válvula de llave de paso de 3 vías y una jeringa de 1ml
2) Se rehidrataron las composiciones de hidroxiapatita nanocristalina-colágeno secas y estériles en la jeringa con 1 ml de producto utilizando un adaptador Luer (Luer-Lok) de válvula de llave de paso de 3 vías (BD Connecta, llave de paso de 3 vías, número de catálogo 394600), jeringas Vaclok (Qosina, jeringa Vaclok, número de catálogo C1097) y una jeringa suplementaria normal de un solo uso de 1ml (Luer-Lok).
El líquido para rehidratar el colágeno fue agua desmineralizada, una solución salina isotónica, una solución de PBS de pH 7,4 que contenía 150 mM de tampón de fosfato sódico (preparada disolviendo NaH2 PO4 en agua desmineralizada y ajustando el pH con hidróxido sódico), o sangre.
Se conocía o midió el peso del biomaterial seco (composición de implante seco obtenida en uno de los Ejemplos 3 a 8) en la jeringa. Se llenó una cantidad de líquido rehidratante en la jeringa suplementaria, como para obtener una pasta inyectable que contenía 38% en peso de biomaterial seco.
Luego se conectó la jeringa del producto a la válvula de la llave de paso de 3 vías y se cerró la contrapartida de 180° de la válvula de la llave de paso de 3 vías con un tapón de cierre. En la tercera posición (a 90° de la jeringa del producto) de la válvula de llave de paso de 3 vías se conectó al sistema una jeringa Vaclok de 60 ml. Se evacuó el aire de la jeringa del producto tirando del émbolo de la jeringa Vaclok y bloqueándolo a un volumen de 50 ml. A continuación, se hizo girar 180° la válvula de 3 vías para mantener el vacío en la jeringa de producto, mientras que se reemplazó la jeringa Vaclok por la jeringa suplementaria llena de líquido. A continuación, la válvula de 3 vías se giró 180°. Debido al vacío, el líquido fluyó automáticamente a la jeringa de producto y humedeció el producto. Para garantizar la transferencia completa de líquido en la jeringa del producto, se retiró el émbolo de la jeringa de producto. El material se dejó reposar durante 30 segundos para permitir la rehidratación antes de empujar el material desde la jeringa de producto hacia la jeringa suplementaria y hacia atrás, esta secuencia se repitió 40 veces para obtener un material mezclado homogéneamente. Después del procedimiento de mezcla, se reemplazó la válvula de la llave de paso de 3 vías por el aplicador, que es un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) de extremo romo.
La formulación de implante acuoso reconstituida inyectable obtenida por rehidratación y mezcla homogénea de cada una de las composiciones de implante seco 1 a 6 con agua desmineralizada tenía un pH cercano al pH medido antes de la liofilización, es decir, alrededor de 4,5, 6,2, 4,5, 6,0, 6,1 y 5,8, respectivamente.
b) Utilizando un sistema de mezcla de jeringa Medmix de 3 ml
Alternativamente, se rehidrataron las partículas de material seco con agua desmineralizada, una solución salina isotónica, una solución de PBS de pH 7,4 que contenía 150 mM de tampón de fosfato sódico o sangre, en el sistema de mezcla de jeringa Medmix (MEDMIX, SP 003-00M-02/B, número de catálogo 507211) con tapón de jeringa con Luer de orificio abierto y tapón de orificio abierto (MEDMIX, CP 000-76M/D, número de catálogo 506964), representado en la Fig. 1 en la que (1) es la jeringa que contiene el biomaterial seco, (2) es el tapón de la jeringa con una salida luer de orificio abierto, que es compatible con cualquier cánula luer, (3) es el tapón de orificio abierto para cerrar la jeringa durante el proceso de mezcla, (4) es el dispositivo de mezcla, que es un mezclador flexible una vez que se retira el émbolo, (5) es el émbolo, que se puede quitar para mezclar el material en la jeringa y se puede volver a colocar después para expulsar el material.
Se siguió el procedimiento de mezcla de Medmix descrito en la Fig. 2. Para obtener un resultado óptimo, después de la etapa 4, se empuja el émbolo 3 veces para empujar el líquido en el material para humedecerlo y realizar la etapa de mezcla (etapa 6) durante 60 segundos. En la etapa 8 se elimina todo el aire.
3) Prueba de extrusión
Se analizó la capacidad de extrusión de la formulación de implante acuoso reconstituida inyectable obtenida con un dispositivo de análisis de tensión y presión (Zwick & Roell, BT1-FR2,5TS.D14). La jeringa preparada y lista para usar preparada anteriormente se colocó verticalmente en un soporte de jeringa y se presionó el émbolo hacia abajo desde la máquina mientras que se midió la fuerza de la presión del producto fuera de la jeringa a través del aplicador que comprende un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (0,838 mm de diámetro interior) de extremo romo (Nordson EFD, punta de precisión 18GA 1 pulgada, número de catálogo 7018110) con el siguiente programa:
o Fuerza hasta la resistencia: 0,1 N
o Velocidad hasta la resistencia: 100 mm/min
o Velocidad de prueba: 1 mm/s, posición controlada
o Fin de la prueba: límite de fuerza, 150 N
o Sensor de fuerza: 200 N
Para todas las formulaciones de implantes inyectables analizadas obtenidas mediante rehidratación y mezcla homogénea con agua desmineralizada, una solución salina isotónica o una solución de PBS, especialmente para formulaciones de implantes inyectables, preparadas a partir de composiciones de implantes secos 1 a 6, la fuerza medida no superó 40 N.
Para todas las formulaciones de implantes inyectables analizadas obtenidas mediante rehidratación y mezcla homogénea con sangre, especialmente para formulaciones de implantes inyectables, preparadas a partir de composiciones de implantes secos 1 a 6, la fuerza medida no superó 45 N.
Para las formulaciones de implantes inyectables obtenidas mediante rehidratación y mezcla homogénea con agua desmineralizada, una solución salina isotónica o una solución PBS, preparadas a partir de las composiciones de implantes secos 1, 2, 3, 5 y 6, la fuerza medida no superó los 20 N.
Para formulaciones de implantes inyectables obtenidas mediante rehidratación y mezcla homogénea con sangre, preparadas a partir de la composición de implante seco 1 (que contenía partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 100 a 150 pm o 125 a 180 pm y colágeno A, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 4,0) y composición de implante seco 2 (que contenía partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 mm y colágeno B, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 4,0), la fuerza medida no superó 25 N.
Véase las Figs. 3A y 3B, que representan las curvas de extrusión de las formulaciones de implantes inyectables obtenidas mediante rehidratación y mezcla homogénea de las composiciones de implantes secos 2 y 4 con solución salina isotónica o sangre humana fresca, respectivamente.
- en la Fig. 3A, (1) y (2) son las curvas de extrusión de la composición de implante seco 2 (que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 mm y colágeno B, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 4,0) rehidratada con solución salina isotónica y sangre humana fresca, respectivamente.
- en la Fig 3B, (3) y (4) son las curvas de extrusión de la composición de implante seco 4 (que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 125 a 180 mm y una mezcla de 2 partes de colágeno A por 1 parte de colágeno B, con una relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno de 2,67) rehidratada con solución salina isotónica y sangre humana fresca, respectivamente.
Ejemplo 10 Biocompatibilidad: Prueba in vitro sobre el crecimiento de dos líneas celulares formadoras de hueso en la formulación inyectable de implante acuoso de la invención
Se analizaron las células de:
- MC3T3 CytoLight Red, una línea celular de preosteoblastos originaria de la bóveda craneal del ratón (ATCC CRL-2593) que se transdujo para expresar proteína fluorescente roja en el citoplasma utilizando Cytolight Red Lentivirus (Essen Bioscience), o
- MG63 (línea celular derivada del osteosarcoma humano)
para determinar su capacidad de colonizar la formulación inyectable de implante acuoso de la invención como sigue.
Estas células se cultivaron en condiciones recomendadas por el proveedor, a saber, para los glóbulos rojos Cytolight MC3T3: cultivo en aMEM (GIBCO) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS, Lubio), 1% de penicilinaestreptomicina (GIBCO) y 0,5 |jg/ml de puromicina (Sigma) y para las células MG63: cultivo en DMEM (GIBCO) suplementado con FBS al 10% (Lubio), 1% de penicilina-estreptomicina (GIBCO). Se introdujo una capa de esas células en los pocillos de una placa de múltiples paredes y se agregaron aproximadamente 1 ml de biomaterial sobre la capa de células de cada pocillo utilizando jeringas Medmix de 3 ml que contenían formulaciones de implantes inyectables 1 a 4 obtenidas rehidratando y mezclando homogéneamente las composiciones de implantes secos 1 a 4 (preparadas en los ejemplos 3 a 6) con sangre humana o con una solución salina isotónica. Se cultivaron las células durante 8 días.
Estos experimentos mostraron para cada una de las formulaciones inyectables de implante 1 a 4 la colonización del biomaterial por cada una de las líneas celulares MC3T3 CytoLight Red y M63.
Véase la Fig. 4, que es una imagen de microscopía que utiliza un microscopio de disco de centrifugado confocal CV1000 (Yokogawa) con excitación por iluminación láser de 561 nm de la formulación de implante acuoso inyectable 4 obtenida rehidratando y mezclando homogéneamente la composición de implante seco 4 (preparada en el Ejemplo 6) con sangre humana: los glóbulos rojos MC3T3 CytoLight cultivados se visualizan en brillante.
Estos experimentos muestran que las células que forman el hueso pueden crecer in vitro en la formulación de implante acuoso inyectable de la invención. Esto demuestra la alta biocompatibilidad de esa formulación de implante acuoso inyectable que proporciona al implante una matriz muy cercana al entorno natural in vivo en el que se produce la regeneración.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de implante seco que consiste esencialmente en una mezcla de partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas de hueso natural de un tamaño de 50 a 200 pm y fragmentos de un material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente que pasan a través de un tamiz de 0,5 mm, por lo que la relación p/p entre hidroxiapatita nanocristalina y colágeno es de 1,8 a 4,5.
2. La composición de implante seco de la reivindicación 1, en donde la relación p/p entre hidroxiapatita y colágeno es de 2,5 a 4,2.
3. La composición de implante seco de la reivindicación 1, en donde la relación p/p entre hidroxiapatita y colágeno es de 2,5 a 4,0.
4. La composición de implante seco de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las partículas de hidroxiapatita tienen un tamaño de 100 a 180 pm.
5. La composición de implante seco de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que ha sido esterilizada por radiación gamma o de rayos X.
6. La composición de implante seco de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente se selecciona del grupo que consiste en dermis porcina y membrana peritoneal o pericárdica porcina.
7. Uso de la composición de implante seco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación por rehidratación y mezcla homogénea de 25-45 % p/p de la composición de implante seco con un vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable, una formulación de implante acuoso inyectable en la regeneración tisular bucal que es extruible a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) con una fuerza que no es superior a 60 N.
8. El uso de la reivindicación 7, en donde el vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable es agua estéril, una solución salina isotónica estéril, sangre o fracciones de la misma.
9. Una formulación de implante acuoso inyectable para utilizar en la regeneración tisular bucal que se puede extruir a través de un sistema cónico y una cánula de 25,4 mm de longitud de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) con una fuerza no superior a 60 N, que comprende 25-45 % p/p de la composición de implante seco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 rehidratada y mezclada homogéneamente con agua estéril o con una solución salina isotónica estéril.
10. Un proceso para preparar una formulación de implante acuoso inyectable de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende la rehidratación y mezcla homogénea del 25-45 % p/p de la composición de implante seco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en agua estéril o en una solución salina isotónica estéril.
11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la rehidratación y mezcla homogénea del 25-45 % p/p de la composición de implante seco se realiza en una jeringa equipada con un dispositivo de mezcla.
12. Un proceso para preparar la composición de implante seco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar partículas de hidroxiapatita nanocristalina derivadas de hueso natural de un tamaño de 50 a 200 pm, (b) preparar el material de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente molido mediante un proceso que comprende un tratamiento alcalino, un tratamiento ácido y un tratamiento con disolventes orgánicos, y molienda en fragmentos que pasen por un tamiz de 0,5 mm,
(c) agregar a una solución acuosa la mezcla de colágeno fibroso entrecruzado naturalmente molida obtenida en (b), mezclando vigorosamente para obtener una suspensión de colágeno, agregar las partículas de hidroxiapatita nanocristalina con un tamaño de 50 a 200 pm preparadas en (a) y mezclar vigorosamente, permaneciendo el pH a 4,2 hasta 7,5,
(d) secar la composición mezclada que contiene partículas de hidroxiapatita nanocristalina y colágeno obtenida en (c) y
(e) esterilizar por radiación gamma o de rayos X la composición de implante seco obtenida en (d).
13. Jeringa lista para usar que contiene una formulación de implante acuoso inyectable de la reivindicación 9 para su uso en la regeneración tisular bucal.
14. Un kit para preparar la formulación de implante acuoso inyectable para utilizar en la regeneración tisular bucal de la reivindicación 9, que comprende:
- una jeringa equipada con un dispositivo de mezcla que contiene la composición de implante seco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un sistema cónico y una cánula de calibre 18 (diámetro interior de 0,838 mm) de 25,4 mm de longitud
- un recipiente lleno con una cantidad adecuada de agua estéril o solución isotónica estéril.
15. Un kit de acuerdo con la reivindicación 14, para utilizar en la regeneración tisular bucal, en donde el recipiente que comprende agua estéril o una solución isotónica estéril es una jeringa con una cánula.
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