ES2896401T3 - Proteínas recombinantes exentas de Phe para su uso en el tratamiento de la fenilcetonuria - Google Patents

Proteínas recombinantes exentas de Phe para su uso en el tratamiento de la fenilcetonuria Download PDF

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Abstract

Una proteína recombinante exenta de Phe, en donde la proteína se selecciona de secuencias que tienen al menos 85 % de identidad de secuencia con la Id de sec. n.°: 12 y en donde toda la Phe ha sido sustituida por un LNAA seleccionado de Tyr, Trp, Thr, Ile, Leu, Val, Met o His.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas recombinantes exentas de Phe para su uso en el tratamiento de la fenilcetonuria
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo del tratamiento de la afección denominada de forma general fenilcetonuria (PKU) o enfermedad de Folling, que es un trastorno metabólico hereditario en seres humanos y animales, que da lugar a una acumulación de L-fenilalanina y de sus metabolitos. En particular, la invención se refiere a proteínas exentas de fenilalanina (proteínas exentas de Phe) para su uso en pacientes que padecen fenilcetonuria, a métodos para preparar las proteínas exentas de Phe, a composiciones que comprenden las proteínas exentas de Phe, y a productos alimenticios medicados que comprenden las proteínas exentas de Phe.
Antecedentes de la invención
En 1934, un médico noruego, Asbjorn Folling, observó que varios pacientes con retraso mental severo tenían un olor extraño. Dedujo que procedía de algo denominado “ácido fenilacético” . La orina de los pacientes también tenía un nivel muy alto de una sustancia química denominada “fenilcetona” , lo que queda reflejado en el nombre de la enfermedad, fenilcetonuria. Folling también pensó que lo más probable era que la enfermedad fuera hereditaria, y fue el primero en sugerir el uso de una dieta para tratarla. Desde entonces, se han hecho grandes avances en la comprensión y tratamiento de la PKU.
La fenilcetonuria (PKU), uno de los errores congénitos más frecuentes del metabolismo de los aminoácidos, resulta de un deterioro en la capacidad de metabolizar el aminoácido esencial fenilalanina (Phe)[1] y convertirlo en su derivado hidroxilado tirosina (Tyr). La PKU clásica es un trastorno metabólico poco frecuente, y se ha clasificado como una enfermedad huérfana según las definiciones estadounidenses y europeas. La PKU resulta normalmente de una deficiencia en una enzima hepática denominada fenilalanina hidroxilasa (PAH) pero también puede resultar de deficiencias en las enzimas necesarias para producir piridoxalfosfato, un cofactor obligado de la PAH. La deficiencia enzimática lleva a la acumulación de Phe en la sangre y en otros tejidos. La fenilalanina se encuentra en la leche materna, en muchos tipos de fórmulas para bebés y en la mayoría de los alimentos, especialmente aquellos que contienen una alta concentración de proteínas, tales como carne, huevos y productos lácteos. Si no se trata la PKU, la fenilalanina se acumulará en la sangre y llevará eventualmente a una discapacidad intelectual irreversible y a problemas en el sistema nervioso central (cerebro y médula espinal). La afección no tratada se caracteriza por retraso mental, microcefalia, retraso en el habla, convulsiones, eccema, anomalías de la conducta y otros síntomas. La buena noticia es que el tratamiento temprano puede prevenir todos o la mayor parte de los problemas. Los bebés nacidos con PKU deben iniciar el tratamiento con fórmula especial poco después del nacimiento. El tratamiento principal para pacientes clásicos de PKU es una dieta estricta con restricción de Phe suplementada con una fórmula médica que contiene aminoácidos libres salvo Phe y otros nutrientes que abarcan las demandas del organismo de aminoácidos esenciales. En Estados Unidos, la recomendación actual es que la dieta para la PKU debe mantenerse durante la toda la vida. Los pacientes que se diagnostican temprano y mantienen una dieta estricta pueden tener una esperanza de vida normal con un desarrollo mental normal.
Sin embargo, el cumplimiento de una dieta estricta restringida en Phe suplementada con una fórmula médica, disminuirá a medida que el sujeto envejece y esta disminución en el cumplimiento puede causar más tarde el desarrollo de una disfunción cognitiva. Un cumplimiento inadecuado puede deberse al sabor y olor desagradables de las formulaciones de aminoácidos, así como al deseo de vivir como personas normales que no padecen de PKU.
La presente invención proporciona proteínas recombinantes exentas de Phe para su uso en el tratamiento de la PKU. Dichas proteínas pueden utilizarse tal cual o pueden incorporarse a los alimentos. Las proteínas recombinantes exentas de Phe según la invención tienen ventajas sobre las proteínas alimenticias medicinales conocidas utilizadas en el tratamiento de la PKU, ya que tienen propiedades mejoradas con respecto a i) gusto, ii) olfato, iii) palatabilidad y iv) textura y, lo que mejora la aceptabilidad y el cumplimiento de las proteínas de la presente invención y de las composiciones/alimento medicinal que las contienen.
A continuación se hace un resumen general de la enfermedad y de las opciones de tratamiento.
Incidencia y cribado en el recién nacido
La incidencia de la PKU es de aproximadamente uno por cada 15.000 nacimientos (1/15.000). Afecta aproximadamente a 700.000 personas en todo el planeta[5]. La prevalencia total en el nacimiento de PKU en poblaciones europeas, chinas y coreanas es de ~ 1/10.000. La incidencia media de PKU varía ampliamente en diferentes poblaciones humanas (Tabla 1). Los blancos estadounidenses se ven afectados con una tasa de 1 en 10.000. Turquía tiene la tasa documentada más alta del planeta, con 1 en 2600 nacimientos, mientras que países tales como Finlandia y Japón tienen tasas extremadamente bajas con menos de un caso de PKU en 100.000 nacimientos. Un estudio realizado en 1987 en Eslovaquia informa de una población gitana con una incidencia extremadamente alta de PKU (un caso en 40 nacimientos) debido a la frecuencia de matrimonios entre primos.
La PKU se incluye comúnmente en el panel de cribado de enfermedades del recién nacido de la mayoría de los países, con diversas técnicas de detección. La mayoría de los bebés en los países desarrollados se someten a cribado de enfermedades para determinar la PKU poco después del nacimiento. El cribado de la PKU se realiza con el ensayo de inhibición bacteriana (prueba de Guthrie), inmunoensayos con detección fluorométrica o fotométrica, o medición de aminoácidos con mass spectrometry (espectrometría de masas - MS/MS) en tándem. Las mediciones realizadas utilizando MS/MS determinan la concentración de Phe y la relación de Phe a Tyr.
Si un niño no se somete al cribado durante la prueba de evaluación rutinaria del recién nacido (de forma típica, realizada 2-7 días después del nacimiento, utilizando muestras extraídas mediante punción del talón neonatal), la enfermedad puede presentarse clínicamente con convulsiones, albinismo (pelo y piel excesivamente claros), y un “olor rancio” del sudor y la orina del bebé. En la mayor parte de los casos, deberá repetirse la prueba aproximadamente a las dos semanas de edad para verificar la prueba inicial y descubrir cualquier fenilcetonuria que inicialmente pasara inadvertida. Los niños afectados detectados y tratados tienen menos probabilidad de desarrollar problemas neurológicos o de tener convulsiones y retraso mental, aunque dichos trastornos clínicos siguen siendo posibles.
Rutas metabólicas de la Phe
La Phe existe como enantiómeros D y L, y la L-Phe es un aminoácido esencial requerido en la síntesis de proteínas en seres humanos[6]. Existen muchos procesos (Figura 1) que contribuyen al flujo de L-Phe en seres humanos. La ruta principal es la enzima PAH que convierte normalmente el aminoácido fenilalanina en el aminoácido tirosina. Sin embargo, también se producen reacciones por otras rutas metabólicas en el tejido hepático normal pero son de menor importancia. Como con muchos otros metabolitos, las concentraciones de Phe se regulan a un nivel de estado estacionario con un flujo dinámico de entrada y salida. La perturbación persistente del flujo en su caso dará lugar eventualmente a la alteración de las concentraciones en estado estacionario y a la acumulación de Phe[7]. La Phe en exceso puede metabolizarse a fenilcetonas a través de la ruta minoritaria, una ruta metabólica de transaminasa con glutamato. Los metabolitos incluyen fenilacetato, fenilpiruvato y fenetilamina. Los niveles elevados de fenilalanina en sangre y la detección de fenilcetonas en la orina son formas de diagnosticar PKU; sin embargo, la mayoría de los pacientes son diagnosticados durante el cribado neonatal de enfermedades.
La enzima PAH requiere tetrahidrobiopterina (BH4) como cofactor esencial, que se forma en tres etapas. Durante la reacción de hidroxilación, la BH4 se convierte en la pterina inactiva, BH2, dihidrobiopterina (quinona). La enzima dihydropteridine reductase (dihidropteridina reductasa - DHPR) regenera BH4 (Figura 2). La BH4 es también un cofactor obligado de la tirosina hidroxilasa, de la triptófano hidroxilasa y de la óxido nítrico sintasa y es por lo tanto necesaria para la producción de dopamina, catecolaminas, melanina, serotonina y óxido nítrico. Defectos bien en la PAH o en la producción o reciclado de BH4 pueden dar lugar a una hiperfenilalaninemia.
La fenilalanina es un large neutral amino acid (aminoácido neutro grande - LNAA). Los LNAA compiten por el transporte a través de la blood-brain barrier (barrera hematoencefálica - BHE) a través del large neutral amino acid transporter (transportador de aminoácidos neutros grandes LNAAT). Si la fenilalanina está en exceso en la sangre, saturará el transportador. Niveles excesivos de fenilalanina tienden a reducir los niveles intratecales de otros LNAA (Tyr, Trp, Thr, Ile, Leu, Val, Met y His) en el cerebro. Dado que estos aminoácidos, especialmente Tyr y Trp, son necesarios para la síntesis de proteínas y de neurotransmisores, la acumulación de Phe impide el desarrollo del cerebro, provocando retraso mental.
Los niveles de fenilalanina se controlan de forma típica dos veces a la semana en neonatos, una vez a la semana en bebés, cada dos o cada 3 semanas en niños pequeños y, posteriormente, con periodicidad mensual, incluso durante la vida adulta. Debe prestarse atención a la variabilidad en los niveles de fenilalanina en sangre y al mantenimiento dentro del intervalo recomendado. Durante el embarazo se recomienda tomar muestras semanales de fenilalanina.
Tipos de PKU
La PKU clásica está causada por una mutación en el gen de la enzima PAH, que convierte la Phe en otros compuestos esenciales en el organismo. Otras mutaciones no PAH también pueden causar PKU. El gen PAH está situado en el cromosoma 12, en las bandas 12q22-q24.1. Se han descubierto más de 400 mutaciones en el gen PAH causantes de enfermedades. La deficiencia de PAH causa un espectro de trastornos que incluyen la PKU clásica y la hiperfenilalaninemia (una acumulación menos severa de fenilalanina).
Se sabe que la PKU es un trastorno genético autosómico recesivo. Esto significa que ambos progenitores deben tener al menos un alelo mutado del gen PAH. El niño debe heredar ambos alelos mutados, uno de cada progenitor. Por lo tanto, es posible que un progenitor con la enfermedad tenga un hijo sin ella si el otro progenitor posee un alelo funcional del gen de la PAH. Sin embargo, un niño con dos progenitores con PKU heredará dos alelos mutados siempre y, por lo tanto, la enfermedad.
La PKU puede existir en ratones, que se han utilizado ampliamente en experimentos para encontrar un tratamiento eficaz para la misma. La disponibilidad de un ratón mutante que imite estrechamente la enfermedad humana, denominado PAHenu2, proporciona un modelo ideal para investigar la transferencia de genes in vivo y valiosa información sobre la patología y biología de la PKU. Numerosos estudios genéticos y bioquímicos han confirmado la fiabilidad de este modelo de ratón en su parecido con el fenotipo metabólico y neurobiológico de la PKU humana. Recientemente se ha secuenciado el genoma del macaco, y se ha comprobado que el gen que codifica la fenilalanina hidroxilasa tiene la misma secuencia que, en seres humanos, se consideraría una mutación de PKU.
La hiperfenilalaninemia por deficiencia de tetrahidrobiotina es rara, que explica aproximadamente un 1-5 % de todos los casos de PKU. Estos pacientes tienen una PAH normal, pero carecen de la capacidad de biosintetizar o reciclar el cofactor tetrahidrobiopterina (BH4). La BH4 es necesaria para la correcta actividad de la enzima. La deficiencia de tetrahidrobiopterina puede estar producida por defectos en cuatro genes distintos. Estos tipos se conocen como HPABH4A, HPABH4B, HPABH4C y HPABH4D.
Tratamiento de la PKU
La base del tratamiento con PKU es una dieta baja en Phe que evite la aparición de los cambios neurológicos y psicológicos. Dado que los cambios neurológicos aparecen antes de transcurrido un mes desde el nacimiento, se recomienda que la restricción dietética se inicie pronto y continúe durante la infancia cuando el desarrollo neuronal es máximo. Las anomalías neurológicas clínicas, el rendimiento neuropsicológico afectado y la obtención de imágenes cerebrales en adultos con PKU han llevado a una opinión consensuada de que debe seguirse la dieta de PKU durante toda la vida. Se requiere un régimen aún más estricto de restricción de Phe para las mujeres con PKU que contemplen formar una familia, especialmente durante el embarazo, ya que las concentraciones elevadas de Phe en sangre son teratogénicas para el feto en desarrollo. Se requiere una dieta previa a la concepción con un intervalo objetivo de S-Phe de entre 100 y 360 pmol/l en las madres afectadas.
Una dieta de restricción de Phe puede reducir los niveles plasmáticos de Phe y puede prevenir las deficiencias mentales de los pacientes con PKU. Sin embargo, el cumplimiento del tratamiento dietético disminuye a medida que los pacientes se hacen mayores. Dado que algunos pacientes no son capaces de cumplir rigurosamente la dieta restringida en fenilalanina durante la vida, se han desarrollado regímenes de tratamiento alternativos. Por otra parte, las mujeres embarazadas con PKU/HPA tienen una necesidad particular de mantener bajos los niveles de Phe, ya que un alto nivel de Phe afecta al embrión y al feto (PKU materna). El UK MRC Study Group sobre la PKU concluyó que existe la necesidad de una alternativa a la dieta baja en Phe. El NIH Consensus Panel también animó a la investigación sobre terapias terapéuticas para la PKU que incluyeran terapia enzimática y terapia génica. La Figura 3 muestra varios tipos de opciones de tratamiento disponibles en la práctica o en teoría para la terapia de PKU[8].
Modificaciones dietéticas
Si la PKU se diagnostica lo suficientemente temprano, un recién nacido afectado puede crecer con desarrollo normal del cerebro, pero únicamente gestionando y controlando los niveles de Phe a través de la dieta, o una combinación de dieta y medicación. Un intervalo de salud óptimo de Phe en plasma está entre 120 y 360 pmol/l, y una persona con PKU debe controlar su Phe durante toda la vida, según lo determinado por expertos consultados por National Institutes of Health (NIH). La mayoría de los alimentos naturales contienen proteínas contienen un 2,4-9 % de Phe en peso[9]. Todos los pacientes con PKU deben adherirse a una dieta especial baja en Phe para un desarrollo óptimo del cerebro (menos de 500 mg/día). La dieta requiere restringir o eliminar severamente los alimentos con alto contenido de Phe, tales como carne, pollo, pescado, huevos, nueces, queso, legumbres, leche y otros productos lácteos. Deben controlarse los alimentos amiláceos, tales como patatas, pan, pasta y maíz. Es posible seguir amamantando a los bebés para proporcionar todos los beneficios de la leche materna, pero la cantidad también debe controlarse y se requerirán suplementos para los nutrientes que falten. El edulcorante aspartamo (L-aspartil -L-Phe metiléster) presente en muchos alimentos y refrescos dietéticos también debe evitarse ya que el metabolismo del dipéptido aspartamo liberará Phe, ácido L-aspártico y metanol.
Las dietas con bajo contenido de Phe incluyen con frecuencia: alimentos naturales con bajo contenido de Phe (algunas frutas y hortalizas), alimentos de especialidad con bajo contenido de proteínas (pasta, pan con bajo contenido de proteínas, etc.), fórmula y barritas de sustitución de proteínas exentas de Phe, comprimidos, cápsulas, etc. Se utilizan fórmulas infantiles suplementarias en estos pacientes para proporcionar los aminoácidos y otros nutrientes necesarios que de cualquier otro modo no estarían presentes en una dieta con bajo contenido en fenilalanina. A medida que el niño crece, estos pueden sustituirse por pastillas, fórmulas y alimentos especialmente formulados. Dado que la Phe es necesaria para la síntesis de muchas proteínas, es necesaria para un crecimiento adecuado, pero los niveles deben controlarse estrictamente en pacientes con PKU. Además, debe suplementarse tirosina, que normalmente se deriva de la fenilalanina.
La suplementación diaria con alimento medicinal modificado con aminoácidos (AA) (fórmula de PKU) y con alimentos con bajo contenido de proteínas es necesaria para un tratamiento con éxito de la PKU. Pero como se ha mencionado anteriormente, el sabor y olor de las fórmulas con AA son desagradables, por lo que cambiar la forma de AA a proteínas sin Phe mejoraría el sabor, la palatabilidad y la aceptabilidad del alimento medicinal de PKU y llevaría en último término a un mejor cumplimiento de la dieta. El glicomacropéptido (GMP), un glicofosfopéptido de 64 aminoácidos escindido de la casína Kdurante la fabricación de queso, se encuentra en el lactosuero bovino[9, 10]. La proteína GMP es baja en Phe de forma natural y puede purificarse adicionalmente para contener solo 2,5-5,0 mg de Phe por g de polvo de GMP[9]. Pueden elaborarse diversos alimentos y bebidas con GMP para mejorar el sabor, variedad y conveniencia de la dieta de PKU. Proporciona una fuente alternativa de proteína de sabor agradable que puede mejorar el cumplimiento de la dieta y el control metabólico de la PKU[11, 12]. Sin embargo, el GMP solo no posee un perfil de aminoácidos adecuado para el tratamiento de la PKU por lo que se requiere un suplemento con aminoácidos que incluya histidina, leucina, triptófano y tirosina[13]. Por lo tanto, desarrollar una serie de proteínas recombinantes que tengan un perfil de aminoácidos adecuado como fórmulas de AA y que contengan Phe baja o nula compensará la deficiencia de GMP para el tratamiento de la PKU.
Terapia enzimática para la PKU
Existe un interés creciente en la terapia de sustitución enzimática para enfermedades metabólicas. Se están desarrollando dos sistemas enzimáticos para el tratamiento de la PKU: la enzima PAH y la enzima degradante de la Phe procedente de plantas, la fenilalanina amonio-liasa (PAL)[1].
Terapia de sustitución enzimática con PAH
La terapia de sustitución enzimática es una opción viable para suministrar PAH activa[14]. Sin embargo, para que funcione, será necesario administrar el cofactor de la pAh , la B H 4 , sea por vía oral o por adición de la enzima de reciclado (BH2 a BH4) dihidropteridina reductasa. Aunque el requisito del cofactor es una desventaja en el uso de la PAH para la terapia de sustitución enzimática, hay varias ventajas, que incluyen que la proteína se expresa bien en bacterias, particularmente la forma doblemente truncada; la proteína expresada en la forma humana de la enfermedad; la proteína se PEGila fácilmente y conserva su actividad enzimática, a diferencia de muchas otras enzimas que se han probado; y la proteína PEGilada es muy estable después de la PEGilación. Otra ventaja de la terapia de sustitución de la PAH es que el suplemento adicional de Tyr puede ser innecesario en la terapia de PKU. Sin embargo, la sensibilidad inherente a las proteasas y la posible inmunogenicidad de la PAH han impedido la adopción de este abordaje. La exploración de la PAH pegilada en forma de molécula inyectable de acción prolongada para la PKU está en curso, pero debido a los inconvenientes de la enzima, su viabilidad como agente terapéutico sigue siendo discutible171. Además, utilizar este método terapéutico requiere el uso de suplementación con BH4 a dosis altas, lo que actualmente es demasiado costoso para que la mayoría de los pacientes con PKU puedan permitírselo. Por lo tanto, la terapia de sustitución enzimática con PAH no será una buena elección.
Terapia de sustitución enzimática con PAL
Una terapia enzimática alternativa para la PKU implica el uso de la PAL, una enzima que puede sustituir a la PAH. Al ser una enzima no de mamífero, la PAL está ampliamente distribuida en plantas, hongos y bacterias. La PAL pegilada derivada de algas está actualmente en investigación para el tratamiento potencial de pacientes con PKU que no responden a BH4. Las PAL pueden catalizar la conversión de L-fenilalanina a metabolitos inocuos del ácido transcinámico y amonio sin necesidad de cofactor. En comparación con la PAH, la terapia con PAL para la PKU tiene algunas ventajas. La PAL no requiere cofactores para degradar Phe y el ácido transcinámico tiene una toxicidad muy baja y no tiene efectos embriotóxicos en animales experimentales. El producto de la PAL, el ácido transcinámico, se convierte en el hígado en ácido benzoico, que después se excreta a través de la orina principalmente como hipurato. La PAL es muy estable en un amplio intervalo de temperatura.
La PAL se investigó para tratar la PKU ya en 1980 y los estudios de terapia de sustitución enzimática en pacientes humanos con PKU comenzaron con la administración oral de PAL en cápsulas de gelatina con recubrimiento entérico. Sin embargo, cuando se administraron por vía oral las PAL libres, las enzimas se inactivaron rápidamente en el tracto gastrointestinal debido a la proteólisis intestinal. Por lo tanto, era necesario un pretratamiento para proteger la enzima PAL de la acidez gástrica y de las proteasas pancreáticas. Si bien se lograron pruebas farmacológicas y fisiológicas de interés utilizando estudios de modelos de PKU en ratones, la sensibilidad extrema de la PAL a un pH bajo y la degradación proteolítica intestinal ha obstaculizado la progresión con éxito de esta terapia a los ensayos clínicos[14]. Sin embargo, si se encuentra una PAL estable en medio ácido, la formulación encapsulada puede ayudar a reducir la Phe en plasma. Por ejemplo, la PAL inmovilizada dentro de células artificiales fue más eficaz que una dieta exenta de fenilalanina en ratas con PKU para reducir la Phe en plasma y en los fluidos intestinales y líquido cefalorraquídeo. La administración oral de PAL en cápsulas con recubrimiento entérico (ENC) también puede reducir los niveles plasmáticos de fenilalanina. Sin embargo, la administración oral de PAL puede necesitar combinarse con dieta restringida en Phe para obtener un mejor control del nivel de Phe en plasma [19].
Aunque la administración oral de PAL sea más cómoda para el paciente, debe considerarse una modalidad parenteral para la terapia con PAL. La propiedad altamente inmunogénica de la PAL es un problema grave para la terapia parenteral con PAL, ya que puede llevar a una semivida corta de la enzima en sangre y a respuestas inmunitarias no deseadas. Para superar estos problemas se investigaron reactores enzimáticos multitubulares con PAL inmovilizada (procedente de R.
glutinis) que dieron lugar a una eliminación rápida del 77 % de la Phe en muestras sanguíneas de pacientes con PKU[1]. Se mostró una reducción sostenida de la Phe en menos de 1 h, in vitro. El uso repetido de reactores de PAL en animales no produjo reacciones inmunitarias no deseadas. Sin embargo, las fibras huecas extracorpóreas que contienen PAL no pueden administrarse fácilmente a niños pequeños, aunque puede recomendarse para el tratamiento de la PKU en mujeres embarazadas.
Otra modo de reducir el grado de reacciones inmunitarias es la PEGilación[1] [16]. Las semividas de PAL nativa y de PAL PEGilada lineal fueron de 6 y 20 h después de la 1a inyección, respectivamente. Se ha demostrado que la PAL PEGilada [17] [18] (PEG-PAL, Biomarin Pharmaceuticals) suprime la inmunogenicidad y se investiga actualmente en ensayos clínicos en Fase 3 en Estados Unidos. La actividad de la PAL es baja debido a que también cataliza la reacción inversa; por lo tanto, puede requerirse una dosis grande.
Muchas patentes, por ejemplo US-5753487, EP-0260919A1, EP-0260919B1, US-4757015, EP-0703788B1, EP-0703788A1, US-4562151, US-4636466, US-4681850, US-4248704, US-4598047, EP-0140707A2, EP-0140714A2, US-4584273, US-4584273, EP-0136996A2, JP-60172282, JP-61139383, JP-58086082, US-7531341, US-20070048855, US-4574117, etc. se refieren a células microbianas productoras de PLA, a la secuencia de la PLA, a la fermentación, al agente estabilizante, a variantes y a variantes químicamente modificadas.
Terapia génica
En las últimas 2 décadas ha seguido utilizándose terapia génica para el tratamiento de la PKU. El centro de atención ha sido la sustitución del gen mutante humano de la PAH en células somáticas de pacientes con PKU[20]. La terapia génica es un método experimental, pero muy prometedor para el tratamiento de la PKU. Los avances en el tratamiento de la PKU mediante terapia génica se han acelerado por la disponibilidad de modelos preclínicos de la enfermedad. El trabajo inicial sobre la terapia génica para niños con PKU se consideró inadecuado ya que la terapia implicaba la administración de agentes inmunosupresores para bloquear la respuesta inmunitaria al vector para prolongar el efecto terapéutico. La terapia génica de PKU utilizando vectores víricos ha tenido cierto éxito en la corrección fenotípica de ratones PAHenu2 in vivo. La infusión de vectores recombinantes adenovíricos en el hígado dio lugar a un aumento significativo en la actividad de la PAH dando lugar a una normalización completa de los niveles de Phe en suero transcurrida semana de tratamiento. Sin embargo, el efecto no persistió y administraciones repetidas no produjeron los resultados originales debido a los anticuerpos neutralizantes contra los vectores víricos. Además, no se observaron cambios fenotípicos y los ratones permanecieron hipopigmentados. En otro estudio, el suministro de un VAA recombinante al hígado por inyección en la vena porta dio lugar a la corrección de los niveles de Phe en ratones macho. Las hembras siguieron sin responder al tratamiento a menos que fueran ovariectomizadas y tratadas con testosterona. Se demostró que la base bioquímica subyacente a este dimorfismo sexual se debía a un nivel inferior de BH4, controlado principalmente por el estrógeno, y que supone un factor limitante de la tasa de la actividad de la PAH. Se han abandonado otros ensayos que implicaban el uso de vectores recombinantes retrovirales tras observarse que estos vectores podían inducir trastornos similares a la leucemia.
La terapia génica dirigida al hígado utilizando vectores recombinantes adenoasociados de serotipo vírico 8 (rAAV8) ha logrado la corrección a largo plazo (hasta 1 año) de la concentración de Phe en sangre en ratones Pahenu2 sin inducir rechazo inmunomediado observado tras la terapia adenovírica. Sin embargo, la terapia mediada por rAAV8 no proporciona una corrección permanente de la deficiencia de PAH hepática; se cree que la regeneración gradual pero continua de hepatocitos lleva eventualmente a la eliminación de los genomas del vector rAAV episómicos y a la pérdida de la expresión de la PAH. La reinyección de vector del mismo serotipo es ineficaz debido a la destrucción mediada por anticuerpos del vector.
Las investigaciones iniciales que utilizaron vectores no víricos para la PKU no han tenido éxito hasta el momento. La inyección de ADNp puro en la vena porta o la inyección hidrodinámica con un plásmido accionado por el promotor CMV dio lugar a una expresión transitoria de PAH y a una reducción marginal de los niveles en suero de Phe, que no se mantuvo más allá de 24 h. Actualmente se investigan mejoras en el diseño y la ingeniería del vector utilizando elementos reguladores y/o potenciadores, así como aislantes, para prolongar la expresión de la PAH.
Además de los informes sobre transfección hepática, hay algunos estudios innovadores en músculo como blanco para la terapia génica, dado que el músculo adulto carece de división celular continua. Para introducir el sistema de hidroxilación de la Phe en un tejido distinto al del hígado, la administración génica debe incluir no solo la enzima PAH sino también genes de transporte que codifiquen el sistema enzimático completo necesario para sintetizar y reciclar la BH4. A pesar del impresionante desafío técnico, Ding et al.[21] demostraron que esto es posible en ratones. Una ventaja de este enfoque es la facilidad para acceder a vectores en comparación con la terapia génica dirigida al hígado[8].
Sin embargo, la seguridad y toxicidad y el potencial de mutagénesis insercional después de la transferencia de genes víricos siguen siendo un problema. Son necesarias mejoras para eliminar completamente cualquier posibilidad de respuestas inmunitarias. Además, después del desafortunado fallecimiento de un paciente con otro error congénito del metabolismo (deficiencia de ornitina transcarbamilasa)[22], fue evidente que había problemas importantes que abordar antes de que pudiera utilizarse ampliamente una estrategia de terapia génica en pacientes con PKU.
Terapia con BH4
La (6R)-L-eritro-5,6,7,8-tetrahidrobioterina (BH4) es un cofactor en la hidroxilación de Phe a Tyr por la PAH[5]. La deficiencia de BH4 supone aproximadamente el 2 % de las concentraciones altas de Phe detectadas durante el cribado neonatal. La BH4 se sintetiza de novo a partir de GTP por una ruta de tres enzimas que incluye GTP ciclohidrolasa I (GTPCH I), 6-piruvoiltetrahidrobiopterina sintasa (PTP) y sepiapterina reductasa (SPR) (Figura 4), y es abundante en el hígado. Durante varias décadas, la BH4 se ha utilizado clínicamente para tratar la deficiencia de BH4, una afección que también puede dar lugar a niveles elevados de Phe en sangre. Varios estudios recientes indican que aproximadamente el 30-50 % de los pacientes con PKU responden a dosis farmacológicas de BH4, y muestran una reducción en los niveles de Phe en sangre después de una dosis de la misma. Sin embargo, incluso algunos pacientes con una mutación en el gen que codifica la PAH, que da lugar a una ausencia evidente de actividad enzimática, podrían mostrar cierta respuesta. La experiencia muestra que la mayor parte de los pacientes con respuesta a BH4 siguen necesitando restricción de proteína natural y el uso continuado de alimentos medicinales con bajo contenido de Phe. Desde hace tres décadas se dispone de una formulación de BH4 en comprimidos (diclorhidrato). Aunque esta formulación se ha utilizado ampliamente en estudios experimentales, no se ha evaluado en ensayos clínicos formales y no se ha registrado. Además, la BH4 muestra una eficacia limitada en algunos genotipos de la PKU y su síntesis química es muy costosa[23].
Muchas chaperonas farmacológicas, que son moléculas pequeñas que mejoran la estabilidad de las proteínas rectificando el plegamiento de las proteínas, se han ensayado en estudios in vitro quqe consideran a la PKU un trastorno de plegamiento incorrecto de proteínas[25]. Varios investigadores han demostrado que la proteína PAH plegada incorrectamente puede estabilizarse mediante terapia con BH4[26, 27]. La BH4 evitó la degradación de variantes de plegamiento de proteínas, lo que demuestra su efecto como chaperona química. Se ha realizado un cribado de alta producción con más de 1000 compuestos farmacológicos, y se descubrieron cuatro compuestos que mejoraban la estabilidad térmica de la PAH de tipo salvaje y de otros mutantes[28].
Actualmente se dispone de una formulación más reciente de la BH4 [diclorhidrato de sapropterina (nombre comercial: Kuvan®), Biomarin Pharmaceuticals] que es más estable a temperatura ambiente para el tratamiento de la PKU en Estados Unidos y Europa. El cofactor sintético de la PAH, Kuvan® (Figura 5), que actúa como chaperona en la proteína PAH plegada incorrectamente por determinadas mutaciones de PAH de sentido erróneo, ha logrado una corrección parcial o completa de la PAH en algunos pacientes. Kuvan® es el primer fármaco en el tratamiento de la PKU aprobado como fármaco huérfano por la Administración de Medicamentos y Alimentos (Food and Drug Administration - FDA) estadounidense. La terapia con sapropterina también puede ofrecer una relajación del régimen dietético estricto en pacientes con PKU l e v e . La combinación de sapropterina con una dieta baja en Phe aumenta la estabilidad de las concentraciones de Phe en sangre y puede mejorar la tolerancia a la Phe[30, 31].
El coste de la terapia diaria con BH4 es muy elevado, por ejemplo, en la dosis más alta de 20 mg/kg/día, es de 100.000 a 150.000 USD para el paciente adulto promedio en comparación con el coste de la dieta restringida en Phe, incluido el uso de alimentos medicinales, que es, de forma típica, de 15.000 a 20.000 dólares estadounidenses al año. La corta semivida (3,3-5,1 h) de la terapia con BH4 requiere dosificación frecuente, lo que acrecienta además el coste del tratamiento[5]. Además, desarrollar formas asequibles de sustitutos de BH4 o de formas farmacéuticas de liberación sostenida pueden lograr la reducción del coste de la terapia. Los suplementos de BH4 pueden suministrarse con terapia dietética clásica para lograr mejores resultados.
Para reducir el coste de la BH4, algunas patentes han proporcionado métodos para la síntesis química de BH4[33], formulaciones sólidas estables de BH4[34] y la producción eficaz de biopterinas (BP) mediante biotransformantes[35-38]. La Escherichia coli recombinante muestran una productividad significativamente mayor, hasta 4,0 g de biopterina/l de caldo de cultivo[38], lo que sugiere la posibilidad de producción comercial de BH4 por biotransformación. Hay algunas patentes (WO/2002/018587A1, US-20040014167, US-20060008869, US-20090104668, WO/2006/085535A1, EP-1314782A1, EP-1314782A4 y CN1449442A) que se refieren a métodos para producir compuestos de BP utilizando enzimas de biosíntesis de BH4. Aunque la BP puede biotransformarse por la ruta enzimática de rescate utilizando la enzima de biosíntesis de BH4, SPR y también DHPR, la sepiapterina como precursora de la biotransformación de BH4 también es costosa.
Terapia con aminoácidos neutros grandes
La terapia con large neutral amino acid (aminoácidos neutros grandes - LNAA) es un tratamiento alternativo emergente para personas mayores con PKU. El concepto subyacente al tratamiento con LNAA es que Phe y otras LNAA (arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, tirosina y valina) comparten el mismo sistema de transporte, creando una inhibición competitiva del transporte de LNAA entre los mismos[39, 4 ]. Por lo tanto, la sumplementación con LNAA bloquea la captación de Phe al controlar activamente los sitios receptores celulares, reduciendo de forma efectiva la concentración de Phe en el cerebro. Sin embargo, el efecto de la suplementación de LNAA sobre la concentración de Phe en sangre podría ser resultado de otros factores, entre los que se incluyen estimular el anabolismo o mejorar potencialmente el efecto competitivo de los LNAA como resultado de la disminución de la ingesta de proteínas naturales, más que influir directamente en los mecanismos de transporte. Esto está en línea con el hallazgo de que la concentración en sangre de Phe disminuye cuando se dan suplementos de aminoácidos con mayor frecuencia junto con no LNAA[8].
Se ha observado que la suplementación con preparaciones comerciales de LNAA reduce los niveles en el cerebro y en circulación de Phe en ratones con PKU, y reduce los niveles en el cerebro de Phe en adultos con PKU sin dieta, medidos por espectroscopía de resonancia magnética. Los LNAA pueden ser ideales para adultos jóvenes, para pacientes con mal cumplimiento terapéutico y para pacientes con diagnóstico tardío con bajo cumplimiento terapéutico y para los que la fórmula bebible puede ser una carga para el paciente y para los cuidadores. A los adultos y adolescentes mayores que rechazan las restricciones dietéticas se les puede prescribir una preparación de LNAA de dosis alta. Los resultados a largo plazo merecen un estudio adicional. Las mujeres jóvenes en edad fértil necesitan darse cuenta de que este fármaco no protege al feto de los efectos teratogénicos de la Phe.
Aunque el tratamiento con LNAA no sustituye completamente a la dieta de PHA, ayuda a facilitar la restricción dietética de los pacientes tratados permitiendo una mayor cantidad de proteína alimenticia natural (Figura 6). Si bien el tratamiento dietético es siempre muy individual, la dieta de LNAA puede permitir la inclusión de pan, arroz, pasta y otros granos habituales, eliminando la necesidad de comprar alimentos costosos con bajo contenido de proteínas. El tratamiento con LNAA puede ser especialmente útil para aquellos que tienen dificultades para cumplir la dieta. La ‘dieta relajada’ asociada con la terapia de LNAA no solo mejora las opciones dietéticas para quienes viven en entornos de atención a largo plazo, sino también la calidad de vida. Se han comunicado mejoras significativas en la concentración y una disminución del comportamiento de autolesiones en adultos no tratados previamente con una dieta normal y suplemento de LNAA.
PreKUlab Company ha desarrollado algunos comprimidos de LNAA (series PreKUnil y Avonil, NeoPhe) (http://www.prekulab.com/products2/neophe-tablets.html). Los comprimidos deben combinarse con cierta cantidad de proteína natural para que la dieta contenga suficiente proteína. Después de muchos años de experimentos y ensayos con comprimidos PreKUnil, un grupo de expertos en bioquímica y genética molecular obtuvo una nueva fórmula para el tratamiento de la PKU, los comprimidos NeoPhe, que ha sido eficaz para reducir las concentraciones sanguíneas de Phe. Sin embargo, es necesario realizar un estudio a largo plazo de NeoPhe y placebo para establecer la eficiencia y tolerancia de NeoPhe en el tratamiento a largo plazo de la PKU. Además, el sabor y el olor también serán un problema para que las personas acepten dichos comprimidos de LNAA. Por lo tanto, la sustitución proteica con alto contenido de LNAA, pero con contenido bajo o nulo de Phe, controlaría el Phe en plasma a un nivel adecuado, a la vez que mejora el sabor, la palatabilidad y la aceptabilidad del alimento medicinal para la PKU.
Como aparece en la descripción de las diversas opciones de tratamiento para la PKU, ninguna de las opciones conocidas proporciona una solución óptima para los pacientes que padecen PKU:
Dieta restringida en Phe con suplemento medicinal
La proteína alimenticia medicinal que se suplementa a una dieta con Phe restringida contiene aminoácidos que tienen un sabor y olor desagradables y, por lo tanto, puede ser difícil cumplir el régimen de tratamiento.
El glicomacropéptido (GMP) no está exento de Phe y por sí solo no posee un perfil de aminoácidos adecuado para el tratamiento de la PKU. Por lo tanto, el tratamiento debe suplementarse con aminoácidos tales como, por ejemplo, histidina, leucina, triptófano y tirosina y, por consiguiente, no se evitan los problemas relacionados con el gusto y el olfato.
El suplemento con LNAA, por ejemplo, en forma de comprimidos de LNAA como se ha descrito anteriormente, también tiene el inconveniente del mal sabor y olor y, además, la dosis es 1 comprimido por kg de peso corporal, lo que significa que, por ejemplo, una persona de 60 kg debe ingerir 60 comprimidos al día, es decir, 15 comprimidos 4 veces al día o 20 comprimidos 3 veces al día junto con una comida. Lo más probable es que esto también produzca problemas de cumplimiento terapéutico.
Terapia de sustitución enzimática
Como se describe en la presente descripción, la terapia de sustitución enzimática con
i) PAH requiere una dosis alta de BH-4, que es muy costosa, y
ii) PAL requiere una dosis grande ya que su actividad es baja.
Terapia con BH4
Los estudios han mostrado que la mayoría de los pacientes que responden a la BH4 siguen necesitando al menos cierta restricción de proteína natural y el uso continuado de alimento medicinal con bajo contenido de Phe. Por lo tanto, los problemas de sabor y olor no se superan totalmente. Además, los costes son muy elevados.
Como se observa de lo anterior, todas las opciones de tratamiento actuales para la PKU tienen algunas desventajas. Por lo tanto persiste la necesidad de desarrollar una opción de tratamiento de la PKU sin necesidad de suplementar aminoácidos de mal sabor y mal olor y que sea mucho más barata que las opciones relacionadas con la terapia de sustitución enzimática.
Descripción de la invención
Se han sugerido anteriormente proteínas sin contenido de Phe o con bajo contenido de Phe, p. ej., en WO 2013/148332. De forma general, los puntos de partida han sido encontrar péptidos o proteínas adecuados, pero estos péptidos o proteínas pueden ser difíciles de producir a un precio razonable para un paciente de PKU. Hace una década se propuso el concepto de proporcionar proteínas o péptidos con poca o ninguna Phe para pacientes con PKU, pero es difícil elaborar dicho producto a un precio razonable. Un paciente con PKU necesita, en promedio, 70 gramos de proteínas al día, y quizá durante décadas. El fármaco proteínico comercial más barato cuesta aproximadamente 1000 USD por gramo. Basándose en la presente invención, sería posible obtener una marcada reducción del precio debida a la selección del i) sistema de expresión, ii) vector y iii) proteínas iniciales y posibles mutaciones de las mismas. Por lo tanto, el propósito es permitir la producción de una proteína para un paciente con PKU a un coste razonable y evitar o reducir el mal olor y el mal sabor.
La presente invención implica la selección de una proteína inicial adecuada que tenga un contenido relativamente bajo de Phe, y modificar las proteínas seleccionadas para eliminar el contenido de Phe y/o intercambiar los aminoácidos para obtener composiciones de aminoácidos deseables incluida una mayor cantidad de LNAA.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una proteína recombinante exenta de Phe, en donde la proteína se selecciona de secuencias que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con la Id de sec. n.°: 12 y en donde toda la Phe se ha sustituido por LNAA seleccionados de Tyr, Trp, Thr, Ile, Leu, Val, Met o His.
Las proteínas deben tener todos o la mayor parte de los aminoácidos esenciales y tiene un alto contenido de Tyr y/o Trp. Además, las proteínas también deben contener composiciones ideales de aminoácidos, tales como alto contenido de Tyr, Leu, y otros LNAA que incluyen Val, Ile, Trp, Met, etc.
Añadiendo p. ej. secuencias de Gln similares a gliadina a una proteína sintética exenta de Phe también puede dar lugar a una mejor estructura y textura.
En una realización, la proteína recombinante exenta de Phe según la invención se selecciona de secuencias que tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con la Id de sec. n.° 12 y en donde toda la Phe se ha sustituido por LNAA seleccionados de Tyr, Trp, Thr, Ile, Leu, Val, Met o His.
En otra realización, la proteína recombinante exenta de Phe según la invención tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con las Id de sec. n. ° 28-29 o la Id de sec. n.° 76.
En otra realización, la proteína recombinante exenta de Phe según la invención tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con las Id de sec. n.° 28-30 o la Id de sec. n.° 76.
En otra realización adicional, la proteína recombinante exenta de Phe tiene un 100 % de identidad de secuencia con las Id de sec. n. ° 28-30 o la Id de sec. n. ° 76.
En primer lugar, los alimentos medicinales benefician a todos los pacientes con PKU; en segundo lugar, las proteínas recombinantes no tienen mal sabor y olor, con lo que aumentará el cumplimiento del paciente; en tercer lugar, si se incorporan LNAA ricos en proteínas recombinantes, la dieta del paciente con PKU puede permitir la inclusión de pan, arroz, pasta normales y otros granos, eliminando la necesidad de comprar alimentos costosos con bajo contenido de proteínas.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un alimento medicinal que comprende una proteína recombinante exenta de Phe como se ha descrito anteriormente.
Un adulto necesita ingerir normalmente 60-80 g de proteína al día. Todos los pacientes con PKU deben controlar su dieta de Phe durante toda la vida. Un paciente de PKU consume normalmente de 15.000 a 20.000 USD anuales en alimentos medicinales. La dificultad de la dieta de PKU refleja su naturaleza muy restrictiva, así como la necesidad de consumir una fórmula de aminoácidos (AA) exenta de Phe todos los días para satisfacer las necesidades de proteína. El sabor y olor de las fórmulas AA pueden ser muy desagradables; se necesitan nuevas opciones dietéticas para mejorar la aceptabilidad y variedad de la dieta baja en Phe. El GMP (glicomacropéptido) tiene propiedades funcionales adecuadas para elaborar alimentos con bajo contenido de Phe y puede convertirse en una variedad de productos de sabor agradable con alto contenido de proteína, pero con bajo contenido de Phe. pero el inconveniente de este tratamiento es que no puede sustituir completamente la necesidad de un sustituto de proteína suplementario porque el GMP natural (64 aa) no incluye otros aminoácidos tales como tirosina y triptófano. Además, el proceso de purificación del GMP es relativo complicado y costoso. Por lo tanto, la búsqueda de sustitutos, incluidas las proteínas recombinantes con bajo contenido de Phe o exentas de Phe con una composición de aminoácidos equilibrada, proporcionará una alternativa a las fórmulas sintéticas basadas en AA y a las fórmulas con GMP. Además, un sistema de alto nivel de expresión y un proceso de purificación económico reducirán eficazmente el coste total de este alimento medicinal.
Sistemas de expresión para su uso según la invención
Las proteínas de la presente invención pueden ser sintetizadas por células hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleótido que codifica una proteína de la presente invención unido de forma operativa a una o más secuencias de control.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína exenta de Phe de la presente invención.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína exenta de Phe de la presente invención.
En una realización, el vector se selecciona del grupo que consiste en la Id de sec. n.° 15 (pHT01), Id de sec. n.° 16 (pHT43), Id de sec. n.° 17 (pHT 100), Id de sec. n.° 18 (pHT223), Id de sec. n.° 19 (pHT250), Id de sec. n. ° 20 (pHT431), id de sec. n.° 21 (pHT432) e Id de sec. n.° 22 (pHT433).
Se introduce una construcción o vector que comprende un polinucleótido en una célula hospedadora de modo que la construcción o vector se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante. El término “célula hospedadora” abarca cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de célula hospedadora dependerá en gran medida del gen que codifica la proteína y su origen.
La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una proteína exenta de Phe o de una proteína con bajo contenido de Phe, por ejemplo, una célula procariota o eucariota.
La célula hospedadora procariota puede ser una bacteria, como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis o E. coli, u otros sistemas procariotas de expresión elevada. Actualmente, se prefiere Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis.
Por lo tanto, en una realización, el microorganismo recombinante que comprende el vector de la presente invención es B. licheniformis. En otra realización, el microorganismo recombinante es B. licheniformis CICC10266.
La célula hospedadora eucariota puede ser una célula de mamífero, insecto, planta u hongo. La célula fúngica puede ser una célula de levadura. Ejemplos adecuados son Pichia pastoris X-33, GS115, Yarrowia lipolytica, Lactuca sativa L., Pisum sativum y Nicotiana benthamiana.
Los genes antibióticos exógenos del genoma de la célula hospedadora pueden identificarse y eliminar antes de utilizar la célula hospedadora. Además, los genes para la formación de esporas también pueden desactivarse antes del uso.
Selección del sistema de expresión
Es importante utilizar un sistema de expresión que pueda producir una proteína recombinante a un nivel alto y el sistema debe ser GRAS (generalmente considerado seguro).
Los inventores consideraron en primer lugar un organismo GRAS como sistema de expresión para reducir el coste de la etapa de purificación. Entre todos los microorganismos GRAS, Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis son los dos más económicos de cultivar debido a su rápida velocidad de crecimiento y a un medio de cultivo económico. Como se observa en los ejemplos de la presente invención, estos sistemas son sistemas de expresión adecuados para proporcionar proteínas con bajo o ningún contenido de Phe.
Podrían producirse un gran número de proteínas naturales y recombinantes en gran cantidad mediante diversos sistemas de e x p r e s i ó n , que incluyen E. coli, Bacillus, otras bacterias, levaduras (Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris), hongos filamentosos, células de insectos y de mamíferos. Como muestra la Tabla 1, varias proteínas recombinantes expresadas en levadura, Aspergillus niger y Trichoderma reesei pueden alcanzar hasta 10 g/l. La micoproteína derivada del hongo Fusarium venenatum se ha utilizado en alimentos durante muchos años[42]. La micoproteína producida por Quorn Company ofrece muchos alimentos que utilizan micoproteínas como sustituto de la carne. La mayoría de las personas pueden tolerar micoproteínas.
Tabla 1 Ejemplos de expresión de proteínas secretoras recombinantes utilizando distintos sistemas de producción
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Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis se seleccionan como hospedadores de expresión
Aunque muchos sistemas de expresión de proteínas son alternativas, los sistemas de expresión microbiana son los sistemas de expresión de proteínas recombinantes utilizados habitualmente. La proteína recombinante exenta de Phe de la presente invención se utilizará como alimento medicinal, por lo que se prefiere la selección de un sistema de expresión microbiana Generally Recognized as Safe (generalmente reconocido como seguro - GRAS) para la expresión de proteínas recombinantes. Saccharomyces cerevisiae, Bacillus y Aspergillus niger son los sistemas de expresión microbiana GRAS habitualmente utilizados. Sin embargo, la proteína de expresión secretora en Saccharomyces cerevisiae y Aspergillus niger tiene algunas desventajas, tales como tiempo de cultivo prolongado (4-8 días), productividad baja de proteínas, la manipulación genética es más compleja que en organismos procariotas y el elevado coste de producción.
Las cepas de Bacillus gram positivas, particularmente, B. subtilis, B. megaterium y B. licheniformis designadas como organismos GRAS, están exentas de cualquier endotoxina y tienen un tiempo de cultivo corto en comparación con E. coli. Además, B. subtilis, B. megaterium y B. licheniformis ofrecen una alta capacidad biosintética y un aparato de secreción eficiente que guía las proteínas expresadas directamente al sobrenadante del cultivo.
Por lo tanto, en el presente contexto, el enfoque se centra en desarrollar los dos sistemas de expresión de proteínas con B. subtilis y B. licheniformis. Hay disponible una cantidad de información relativamente mayor sobre transcripción, traducción, plegado de la proteína y mecanismos de secreción, manipulación genética y fermentación a gran escala de B. subtilis. Las excelentes capacidades de secreción de proteínas de B. licheniformis también lo han convertido en un hospedador atractivo para la producción a gran escala de enzimas utilizadas comercialmente.
Como se demuestra en los ejemplos de la presente memoria, sistemas de expresión adecuados son B. subtilis, concretamente B. subtilis cepa WB800N, que es una cepa que carece de ocho proteasas extracelulares) y B. licheniformis. Otras cepas preferidas son B. subtilis CICC10073 y C. licheniformis CIC10266 como también se desprende de los ejemplos de la presente memoria.
Selección y hallazgo de una cepa adecuada
Como sucede en los seres humanos, distintos individuos tienen capacidades significativamente distintas para manejar ciertas cosas, y cepas distintas de B. subtilis y B. licheniformis tienen capacidades distintas para producir una proteína diana de la presente invención. Por lo tanto, la selección y el hallazgo de una buena cepa es un paso importante para reducir el coste de fabricación de este producto.
Una buena cepa debería cumplir los tres requisitos siguientes:
(1) Fácil de cultivar en un medio barato y simple;
(2) Alto nivel de expresión y secreción de proteínas;
(3) Fácil para la manipulación génica y tener una elevada eficiencia de transformación.
Los requisitos (1) y (2) relacionados con el coste de fabricación son factores clave evidentes. El requisito (3) es importante ya que la provisión de las proteínas recombinantes exentas de Phe según la invención implica la manipulación genética para incorporar el gen de la proteína diana en la cepa seleccionada y mejorar las propiedades de secreción y expresión de las proteínas de la cepa. Sin embargo, la mejora de las cepas de B. subtilis y B. licheniformis se ha visto obstaculizada como en muchas otras cepas de Bacillus por la ausencia o por la baja eficiencia de transformación (< 103 transformantes/pg de ADN). La transformación genética de B. licheniformis es más difícil que la de B. subtilis. La eficiencia de transformación de las células de B. licheniformis naturales es deficiente y requiere rutinariamente un largo período de tiempo con dificultades para obtener finalmente un transformante deseado. Esto se debe principalmente a la existencia de dos restriction modification systems (sistemas de modificación de restricción -RMS) de tipo I en B. licheniformis. Dado que hay implicadas muchas etapas de operación genética para lograr una proteína exenta de Phe recombinante deseada, una cepa con una eficiencia de transformación relativamente alta es la clave para acortar el tiempo de investigación y desarrollo. Los inventores seleccionarán cepas procedentes de fuentes naturales y centros de almacenamiento para encontrar cepas con una alta eficiencia de transformación natural. Mientras tanto, se utilizarán métodos de modificación genética para mejorar la eficiencia de transformación de las cepas de B. subtilis y B. licheniformis con origen genético claro.
Como se ha mencionado anteriormente, Bacillus subtilis WB800N es una cepa potencial, pero también son adecuadas otras cepas tales como B. subtilis CICC10073 y B. licheniformis CIC1026, tal como se demuestra en los ejemplos de la presente memoria. Por ejemplo, algunas cepas de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis pueden producir proteasa alcalina o alfa-amilasa en niveles muy altos. Estos genes pueden ser sustituidos por los genes exentos de Phe o de bajo contenido en Phe para producir las proteínas de la presente invención, muy probablemente con un nivel de producción elevado.
Selección y hallazgo de una proteína de partida adecuada
La proteína recombinante exenta de Phe producida se utilizará como alimento medicinal para pacientes con PKU, por lo que se utilizará la integración del gen diana en el genoma de B. subtilis y B. licheniformis para no utilizar plásmidos libres considerando la seguridad alimentaria.
La proteína recombinante exenta de Phe para la PKU
i) no debe contener Phe,
ii) debe tener un contenido equilibrado de los otros 19 aminoácidos esenciales,
iii) preferiblemente, debe ser rica en contenido de LNAA,
iv) debe fabricarse de forma económica (expresión alta con un proceso de purificación simple).
Los enfoques generales son:
(1) Seleccionar una o varias proteínas de entre proteínas de expresión elevada expresadas en microorganismos GRAS, y una cepa GRAS;
(2) Modificar las proteínas seleccionadas para eliminar Phe e intercambiar aminoácidos para obtener composiciones de aminoácidos deseables, incluyendo aumentar la cantidad de LNAA;
(3) Simplificar el proceso de purificación: incorporación de etiquetas de purificación tales como el polipéptido similar a elastina, cuya solubilidad se ve afectada drásticamente por la temperatura. Por lo tanto, el aislamiento del producto proteínico puede hacerse simplemente calentando el cultivo a 35-60 0C y/o eliminando las principales proteínas extracelulares para reducir las impurezas;
(4) Si es necesario, eliminar los genes antibióticos y los genes de formación de esporas para lograr una cepa de producción muy segura.
Los detalles aparecen en los ejemplos de la presente memoria.
Para identificar proteínas con bajo contenido de Phe, nivel elevado de expresión y secretadas en el cultivo, se analizaron cientos de proteínas procedentes de bases de datos de genomas de B. subtilis, B. licheniformis y B. megaterium, especialmente proteínas con altos niveles de secreción natural en cepas de Bacillus, tales como la aamilasa, proteasas que incluyen proteasa alcalina, serina proteasa alcalina, celulasa y xilanasa, lipasa. En particular, la serina proteasa alcalina y la proteasa alcalina parecen ser adecuadas para su uso, véanse los ejemplos de la presente memoria.
El problema clave es identificar las proteínas de origen natural como punto de partida para obtener proteínas exentas de Phe. Las proteínas de origen natural deben ser no tóxicas. Además, las proteínas deben ser relativamente fáciles de producir en un microorganismo y el microorganismo debe permitir la producción con un rendimiento relativamente alto. Para ello, los inventores de la presente invención han descubierto que especialmente B. subtilis y B. licheniformis tienen genes que codifican proteínas con un contenido bajo adecuado de Phe como punto de partida para las proteínas recombinantes exentas de Phe de la presente invención.
En la Tabla 2 de la presente memoria se proporciona una visión general de las proteínas utilizadas como puntos de partida de las Id. de sec. n.° 1-14); sus ácidos nucleicos correspondientes tienen las Id de sec. n.° 59-73.
Tabla 2. Proteínas seleccionadas para expresión recombinante en B. subtilis y B. licheniformis.
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El o los grupos de Phe de las Id. de sec. n.° 1-14 pueden eliminarse o sustituirse por uno o más aminoácidos esenciales adicionales, especialmente con LNAA tales como Tyr, Trp, Thr, Ile, Leu, Val, Met y His, sobre todo como se ha demostrado en los experimentos comunicados en la presente memoria descriptiva Tyr, Lys, Cys, Met, Val.
Pueden eliminarse también uno o más de los otros aminoácidos de las proteínas o ser sustituidos por otro aminoácido para obtener una proteína recombinante con una composición de aminoácidos optimizada con fines nutritivos.
Por lo tanto, pueden eliminarse uno o más de los aminoácidos pequeños (Ala, Gly y Ser) en las proteínas también o ser sustituidos por LNAA (Tyr, Trp y Met).
Ejemplos de proteínas recombinantes exentas de Phe o con bajo contenido de Phe son los de las Id. de sec. n.° 1­ 14, donde los grupos Phe han sido sustituidos por otros LNAA tales como Tyr, Trp, Thr, Ile, Leu, Val, Met y His, sobre todo como se ha mostrado en los experimentos comunicados en la presente memoria, Tyr, Lys, Cys, Met, Val. Otros ejemplos son las proteínas exentas de Phe 10266apr-W4 (Id. de sec. n.° 76) y 10073aprE-W7 (Id de sec. n.° 80).
La mejor constitución de aminoácidos de proteínas exentas de Phe tienen todos los aminoácidos esenciales y el contenido de LNAA es lo más alto posible, especialmente, el contenido de Tyr es el más alto posible. Como ejemplo, el contenido de LNAA es de hasta 80 % y de Tyr es de hasta 40 %.
Como se observa en los ejemplos de la presente memoria descriptiva y en las Id. de sec. n.° 76 e Id de sec. n. ° 80, el contenido de LNA puede ser de 30 % o más, como el intervalo de 30 - 40 % (con respecto al número de aminoácidos); el contenido de Tyr puede ser de 4 % o más tal como de 4-10 % (con respecto al número de aminoácidos),
La longitud de las proteínas recombinantes exentas de Phe puede ser de 40-300 aminoácidos, pero estas proteínas deben ser bien digeridas por la pepsina, tirosinasa y otras proteasas del tracto gastrointestinal humano para liberar todos los aminoácidos para su absorción como nutrientes.
Otro ejemplo es el péptido antimicrobiano de Bacillus subtilis (PDB código 2B9K) Id de sec. n.°: 25. Este péptido contiene un 21 % de aminoácidos aromáticos (F, Y y W), 21 % de aminoácidos alifáticos más M (I, L, V, M) y 15 % de aminoácidos con carga positiva (H, K, R), una composición de aminoácidos más cercana a la composición de NeoPhe. Las 3 Phe se sustituirán por Tyr o Trp o Leu, y también pueden introducirse otras mutaciones para hacerlas bien digeribles en el tracto gastrointestinal humano. El péptido puede expresarse con otros péptidos, proteínas o todos juntos para aumentar el tamaño de la proteína y mejorar las composiciones de aminoácidos.
Otro ejemplo es la enhanced green fluorescent protein (proteína fluorescente verde mejorada - EGFP), Id. de sec. n.° 14. Esta proteína contiene un 10 % de aminoácidos aromáticos (F, Y y W), 31 % de aminoácidos alifáticos más M y T (I, L, V, M, T) y 15 % de aminoácidos con carga positiva (H, K, R), una composición de aminoácidos más cercana a la composición de NeoPhe. Toda la Phe se sustituirá por Tyr o Trp o Leu, y también pueden introducirse otras mutaciones para hacerla bien digerible en el tracto gastrointestinal humano, y aumentar adicionalmente el contenido de Tyr y Leu. Esta proteína puede expresarse con un nivel elevado en Bacillus subtilis.
Para más ejemplos, véase la Tabla 4 y los ejemplos de la presente memoria.
Una proteína inicial es adecuada para una de las proteínas mencionadas en la presente descripción (véase, p. ej., la Tabla 2 anterior) tras la introducción de un contenido elevado de Tyr y Trp, que puede seguir siendo expresando por Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis a niveles elevados y que puede digerirse bien en el tracto gastrointestinal humano.
Las proteínas de partida se mutan para obtener una composición deseada de aminoácidos. La composición deseada de aminoácidos varía para diferentes proteínas exentas de Phe. La primera generación de proteína se obtiene, de forma típica, mediante la mutación de Phe a LNAA. La segunda generación de proteínas se creará a partir de un candidato que contenga un contenido elevado de Tyr, Trp, Leu y otros aminoácidos que se muestran en la Tabla 3, en la columna de NeoPhe. Sin embargo, la proteína debe expresarse en Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis a un nivel alto y debe ser bien digerida en el tracto gastrointestinal humano. Algunos ejemplos candidatos se proporcionan en la Tabla 4.
Tabla 3 Comparación de las composiciones de aminoácidos del producto de primera generación de maprE y los productos de segunda generación con la composición de aminoácidos cercana a NeoPhe (LNAA)
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Tabla 4 Composiciones de aminoácidos (%) de las proteínas candidatas seleccionadas o sus formas truncadas
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En los ejemplos de la presente memoria descriptiva se proporcionan ejemplos de proteínas mutadas preparadas basadas en las proteínas seleccionadas identificadas en la Tabla 2.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas mutadas preparadas se muestran a continuación con indicación relativa a las mutaciones.
Id. de sec. n.° 26: Proteína mutada de la Id de sec. n.° 7: aprE50Y189Y AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASYVP-SEPYTN QDGSSHGTH VAGTIAALN NSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGI EWAISNNMDVINMSLGGPTGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAA-GNEGSSGSTVGYPAKYP-STIAVGAVNSSNQRASYSSAGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAG AAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSLYYGKGLINVQAAAQ
Id. de sec. n.° 27: Proteína mutada de la Id de sec. n.° 7: aprE50Y189Y AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASYVP-SETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGI EWAISNNMDVINMSLGGPTGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAA-GNEGSSGSTVGYPAKYP-STIAVGAVNSSNQRASYSSAGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAG AAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSLYYGKGLINVQAAAQCC
Id. de sec. n.° 28: Proteína mutada con Id. de sec. n.° 12: Blapr58Y188Y AQTVPYGIPLIKADKVQAQGYKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASYV-AGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPNVSLYAVKVLNSSGSGSYSGIVS GIEWATTNGMDVINMSLGGPSGSTAMKQAVDNAYARGVVVVAAA-GNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASYSSVGAELEVMAPGAGVYSTYP TSTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSS-WYYGKGLINVEAAAQ
Id. de sec. n.° 29: Proteína mutada con Id. de sec. n.° 12: Blapr58Y188Y260WCC AQTVPYGIPLIKADKVQAQGYKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASYV-AGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPNVSLYAVKVLNSSGSGSYS- GIVSGIEWATTNGM DVI N M SLGG PSGSTAM KQAVDNAYARGVVVAAA- GNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASYSSVGAELEVMAP-GAGVYSTYPTSTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYL-GSSWYYGKGLINVEAAAQCC
Id. de sec. n.° 30: Proteína mutada con Id. de sec. n.° 12: Blapr58C188Y260W AQTVPYGIPLIKADKVQAQGYKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVG-GASCVAGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPNVSLYAVKVLNSSGSGS YSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGPSGSTAMKQAVDNAYARGWVVAAA-GNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASYSSVGAELEVMAPGAGVYSTYP TSTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSS-WYYGKGLINVEAAAQ
Id. de sec. n.° 31: Proteína mutada de la Id de sec. n.° 5: estA17Y19Y41C58Y AEHNPVVMVHGIGGASYNYAGIKSYLVSQGWSRD- KLYAV DCWDKT GTNYNNGPVLS RYV QKVLDETGAKKVDIVAHSMGGANTLYYIKNLDGGNKVANVVTLGGANRLTTGKALPG TDPNQKILYTSIYSSADMIVMNYLSRLDGARNVQIHGVGHIGLLYSSQVNS-LIKEGLNGGGQNTN
Id. de sec. n.° 32: Proteína mutada de la Id de sec. n.° 5: estA17W19Y41C58Y AEHNPVVMVHGIGGASWNYAGIKSYLVSQGWSRD- KLYAVDCWDKTGTNYNNGPVLSRYV-QKVLDETGAKKVDIVAHSMGGANTLYYIKNLDGGNKVANVVTLGGANRLTTGKALPG TDPNQKILYTSIYSSADMIVMNYLSRLDGARNVQIHGVGHIGLLYSSQVNS-LIKEGLNGGGQNTN
Id. de sec. n.° 33: Proteína mutada de la Id de sec. n.° 6: estB20Y21M40C ESVHNPVVLVHGISGASYNYMAIKNYLISQGWQSNKLYAIDCYDKTGNLNNGPQLA-SYV-DRVLKETGAKKVDIVAHSMGGANTLYYIKYLGGGNKIQNVVTLGGANGLVSSTALPGT DPNQKILYTSIYSLNDQIVINSLSRLQGARNIQLYGIGHIGLLSNS-QVNGYIKEGLNGGGLNTN
Id. de sec. n.° 34: Proteína mutada con Id. de sec. n.° 11: ALAB-V4 KQVTKCELSQLLKDIDGYGGIALPELICTMVHTSGYDTQAIVENNESTEY-GLVQISNKLWCKSSQVPQSRNICDISCDKVLDDDITDDIMCAKKILDIKGIDYWLAHKAL CTEKLEQWLCEKL
Id. de sec. n.° 35: Proteína mutada con Id. de sec. n.° 11: ALAB-M1V3 KQMTKCELSQLLKDIDGYGGIALPELICTMVHTSGYDTQAIVENNESTEY-GLVQISNKLWCKSSQVPQSRNICDISCDKVLDDDITDDIMCAKKILDIKGIDYWLAHKAL CTEKLEQWLCEKL
Id. de sec. n.° 36: Proteína mutada con Id. de sec. n.° 11: ALAB-Y1V3 KQMTKCELSQLLKDIDGYGGIALPELICTMVHTSGYDTQAIVENNESTEY-GLVQISNKLWCKSSQVPQSRNICDISCDKVLDDDITDDIMCAKKILDIKGIDYWLAHKAL CTEKLEQWLCEKL
Id. de sec. n.° 37: Proteína mutada con Id. de sec. n.° 11: ALAB-H1V3 KQHTKCELSQLLKDIDGYGGIALPELICTMVHTSGYDTQAIVENNESTEY-GLVQISNKLWCKSSQVPQSRNICDISCDKVLDDDITDDIMCAKKILDIKGIDYWLAHKAL CTEKLEQWLCEKL
Para lograr una buena proteína exenta de Phe, las proteínas identificadas como proteínas iniciales se modificarán según los siguientes principios para mantener inalterada la estructura de las proteínas diana cuando se sustituye Phe por LNAAs. Por ejemplo,
(1) Si hay una Phe en la región de la hélice alfa, la Phe podría ser sustituida por Lys, Trp, Ile, Val, Met y Leu (2) Si hay una Phe en la zona marginal de la hélice alfa, la Phe podría ser sustituida por His, Cys, Thr, Arg y Tyr. (3) Si hay una Phe en la zona de un bucle, la Phe podría ser sustituida por Tyr.
(4) Es posible que algunas proteínas no tengan restos de Cys, la Phe podría ser sustituida por Cys cuando la Phe está en la zona marginal de la hélice alfa o en la zona de bucle.
(5) Expresión para ensayar la proteína exenta de Phe en el sistema de Bacillus. El nivel de expresión de la proteína exenta de Phe debe ser próximo a, o mayor que, el de la proteína nativa.
La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican para las proteínas exentas de Phe de la invención.
En las siguientes secuencias se dan:
Id. de sec. n.° 38. secuencia génica aprE50Y189Y261L: péptido señal (marcado en verde y cursiva)+ propéptido (marcado en rojo y subrayado) péptido maduro. Los sitios de mutación están marcados en negrita y en amarillo. GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTAC-GATGGCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAG AAAT ACATT GTCGGATTT AAACAGACAAT GAGT GCCAT GAGTT CCGCCAA-GAAAAAGGATGTTATTTCTGAAAAAGGCGGAAAGGTTCAAAAGCAATTTAAGTATGT T AACGCGGCCGCAGCAACATTGGAT GAAAAAGCT GT AAAAGAATT GAAAAAA-GAT CCGAGCGTT GCATAT GT GGAAGAAGATCAT ATTGCACAT GAAT AT GCGCAAT CT GTTCCTTATGGCATTTCTCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGC-TACACAGGCTCTAACGTAAAAGTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCAT CCT GACTT AAACGTCAGAGGCGGAGCAAGCT ACGT AC-CTTCTGAAACAAACCCATACCAG-GACGGCAGTTCTCACGGTACGCATGTAGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACTC AATCGGTGTTCTGGGCGTAGCGCCAAGCGCATCATTATATGCAGTAAAAGTGCTT-GAT
TCAACAGGAAGCGGCCAAT AT AGCT GGATT ATT AACGGCATT GAGTGGGCCATTTC
CAACAAT AT GGAT GTTATCAACAT GAGCCTTGGCGGACCT ACTGGTTC-TACAGCGCTGAAAACAGTCGTTGACAAAGCCGTTTCCAGCGGTATCGTCGTTGCT GCCGCAGCCGGAAACGAAGGTTCATCCGGAAGCACAAGCACAGTCGGC-TACCCT GCAAAA-T ATCCTT CTACT ATTGCAGT AGGTGCGGT AAACAGCAGCAACCAAAGAGCTT CAT A CTCCAGCGCAGGTTCTGAGCTTGATGTGATGGCTCCTGGCGTGTCCATCCAAA-GCACAC-TTCCTGGAGGCACTTACGGCGCTTATAACGGAACGTCCATGGCGACTCCTCACGT TGCCGGAGCAGCAGCGTTAATTCTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAACGCG-CAAGTCCGTGATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATATCTTGGAAACTCTCTCTACTAT GGAAAAGGGTTAATCAACGTACAAGCAGCTGCACAATAA
Id. de sec. n.° 39. secuencia génica de aprE50Y189Y261LCC (péptido señal+ propéptido péptido maduro) GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTAC-GATGGCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAG AAAT ACATT GTCGGATTT AAACAGACAAT GAGT GCCAT GAGTT CCGCCAA-GAAAAAGGAT GTT ATTT CT GAAAAAGGCGGAAAGGTT CAAAAGCAATTTAAGT ATGT T AACGCGGCCGCAGCAACATTGGAT GAAAAAGCT GT AAAAGAATT GAAAAAA-GAT CCGAGCGTTGCAT ATGT GGAAGAAGAT CATATT GCACAT GAATAT GCGCAAT CT GTTCCTTATGGCATTTCTCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGC-TACACAGGCTCTAACGTAAAAGTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCAT CCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGAGCAAGCTACGTAC-CTTCTGAAACAAACCCATACCAG-GACGGCAGTTCTCACGGTACGCATGTAGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACTC AATCGGTGTTCTGGGCGTAGCGCCAAGCGCATCATTATATGCAGTAAAAGTGCTT-GAT-TCAACAGGAAGCGGCCAATATAGCTGGATTATTAACGGCATTGAGTGGGCCATTTC CAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGACCTACTGGTTC-TACAGCGCTGAAAACAGTCGTTGACAAAGCCGTTTCCAGCGGTATCGTCGTTGCT GCCGCAGCCGGAAACGAAGGTTCATCCGGAAGCACAAGCACAGTCGGC-TACCCTGCAAAA-TATCCTTCTACTATTGCAGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCTTCATA CTCCAGCGCAGGTTCTGAGCTTGATGTGATGGCTCCTGGCGTGTCCATCCAAA-GCACAC-TTCCTGGAGGCACTTACGGCGCTTATAACGGAACGTCCATGGCGACTCCTCACGT TGCCGGAGCAGCAGCGTTAATTCTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAACGCG-CAAGTCCGTGATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATATCTTGGAAACTCTCTCTACTAT GGAAAAGGGTT AATCAACGT ACAAGCAGCTGCACAAT GTTGCT AA
Id. de sec. n.° 40. Secuencia del gen Blapr58Y188Y260W (péptido señal+ prop-péptido péptido maduro)
ATG ATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGCTTGGGATGCTGAC-GGCCTTAA TGCTCGTGTTCAC-GA TGGCCTTCAGCGA TTCCGCGTCTGCTGCTCAGCCGGCGAAAAATGTTGAAAAG GATT ATATT GTCGGATTTAAGT CGGGAGT GAAAACCG-CATCCGTCAAAAAGGACATCATCAAAGAGAGCGGCGGAAAAGTGGACAAGCAGTT TAGAATCATCAACGCGGCAAAAGCGAAGCTAGACAAAGAAGCGCTTGAG-GAAGT CAAAAAT GAT CCGGAT GT CGCTT ATGT GGAAGAGGATCACGTAGCT CAT GC TTT GGCGCAAACCGTT CCTT ACGGCATT CCTCT CATT AAAGCGGACAAAGT G-CAGGCTCAAGGCTACAAGGGAGCGAACGTAAAAGTCGCCGTCCTGGATACAGGAA T CCAAGCTT CT CAT CCGGACTT GAACGT AGT CGGCGGAGCAAGCT AC-GTAGCTGGCGAA-GCTTATAACACCGACGGCAACGGACACGGCACGCATGTTGCCGGTACAGTAGCTG CGCTTGACAATACAACGGGTGTATTAGGCGTTGCGCCGAACGTATCCTTGTAC-GCGGTTAAAGTGCTGAATTCAAGCGGAAGCGGATCTTACAGCGGCATTGTAAGCG GAATCGAGTGGGCGACGACAAACGGCATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGAG-GAC-CATCAGGCTCAACAGCGATGAAACAGGCGGTTGACAATGCATATGCAAGAGGGGT TGTCGTTGTGGCGGCTGCTGGGAACAGCGGATCTTCAGGAAACAC-GAATACAATCGGC-TATCCTGCGAAATACGACTCTGTCATCGCAGTTGGCGCGGTAGACTCTAACAGCAA CAGAGCTTCATATTCCAGCGTCGGAGCAGAGCTTGAAGTCATGGCTCCTGGCG-CAGGCGTG-TACAGCACTTACCCAACCAGCACTTATGCAACATTGAACGGAACGTCAATGGCTTC TCCTCATGTAGCGGGAGCAGCAGCTTTGATCTTGTCAAAACATCCGAAC
CTTTCAGCTTCACAAGTCCGCAACCGTCTCTCCAGTACGGCGACTTATTTGGGAAG CTCCTGGTACTAT GGAAAAGGT CT GAT CAAT GT CGAAGCT GCCGCT CAAT AA
Id. de sec. n.° 41. Secuencia del gen Blapr58Y188Y260WCC (péptido señal+ prop-péptido péptido maduro)
ATG ATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGCTTGGGATGCTGAC-GGCCTTAATGCTCGTGTTCAC-GA TGGCCTTCAGCGA TTCCGCGTCTGCTGCTCAGCCGGCGAAAAATGTTGAAAAG GATT ATATT GTCGGATTTAAGT CGGGAGT GAAAACCG-CATCCGTCAAAAAGGACATCATCAAAGAGAGCGGCGGAAAAGTGGACAAGCAGTT TAGAATCATCAACGCGGCAAAAGCGAAGCTAGACAAAGAAGCGCTTGAG-GAAGT CAAAAAT GAT CCGGAT GT CGCTT ATGT GGAAGAGGATCACGTAGCT CAT GC TTT GGCGCAAACCGTT CCTT ACGGCATT CCTCT CATT AAAGCGGACAAAGT G-CAGGCTCAAGGCTACAAGGGAGCGAACGTAAAAGTCGCCGTCCTGGATACAGGAA T CCAAGCTT CT CAT CCGGACTT GAACGT AGT CGGCGGAGCAAGCT AC-GTAGCTGGCGAA-GCTTATAACACCGACGGCAACGGACACGGCACGCATGTTGCCGGTACAGTAGCTG CGCTTGACAATACAACGGGTGTATTAGGCGTTGCGCCGAACGTATCCTTGTAC-GCGGTTAAAGTGCTGAATTCAAGCGGAAGCGGATCTTACAGCGGCATTGTAAGCG GAATCGAGTGGGCGACGACAAACGGCATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGAG-GAC-CATCAGGCTCAACAGCGATGAAACAGGCGGTTGACAATGCATATGCAAGAGGGGT TGTCGTTGTGGCGGCTGCTGGGAACAGCGGATCTTCAGGAAACAC-GAATACAATCGGC-TATCCTGCGAAATACGACTCTGTCATCGCAGTTGGCGCGGTAGACTCTAACAGCAA CAGAGCTTCATATTCCAGCGTCGGAGCAGAGCTTGAAGTCATGGCTCCTGGCG-CAGGCGTG-TACAGCACTTACCCAACCAGCACTTATGCAACATTGAACGGAACGTCAATGGCTTC TCCTCATGTAGCGGGAGCAGCAGCTTTGATCTTGTCAAAACATCCGAAC-CTTTCAGCTTCACAAGTCCGCAACCGTCTCTCCAGTACGGCGACTTATTTGGGAAG CTCCTGGTACTATGGAAAAGGTCTGATCAATGTCGAAGCTGCCGCTCAATGTT- GCTAA
Id. de sec. n. ° 42. Secuencia del gen Blapr58C188Y260W (péptido señal+ prop-péptido péptido maduro)
ATG ATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGCTTGGGATGCTGAC-GGCCTTAATGCTCGTGTTCAC-GA TGGCCTTCAGCGA TTCCGCGTCTGCTGCTCAGCCGGCGAAAAATGTTGAAAAG GATT ATATT GTCGGATTTAAGT CGGGAGT GAAAACCG-CATCCGTCAAAAAGGACATCATCAAAGAGAGCGGCGGAAAAGTGGACAAGCAGTT TAGAATCATCAACGCGGCAAAAGCGAAGCTAGACAAAGAAGCGCTTGAG-GAAGT CAAAAAT GAT CCGGAT GT CGCTT ATGT GGAAGAGGATCACGTAGCT CAT GC TTT GGCGCAAACCGTT CCTT ACGGCATT CCTCT CATT AAAGCGGACAAAGT G-CAGGCTCAAGGCTACAAGGGAGCGAACGTAAAAGTCGCCGTCCTGGATACAGGAA TCCAAGCTTCTCATCCGGACTTGAACGTAGTCGGCGGAGCAAGCTGCG-TAGCTGGCGAA-GCTTATAACACCGACGGCAACGGACACGGCACGCATGTTGCCGGTACAGTAGCTG CGCTTGACAATACAACGGGTGTATTAGGCGTTGCGCCGAACGTATCCTTGTAC-GCGGTTAAAGTGCTGAATTCAAGCGGAAGCGGATCTTACAGCGGCATTGTAAGCG GAATCGAGTGGGCGACGACAAACGGCATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGAG-GAC-CATCAGGCTCAACAGCGATGAAACAGGCGGTTGACAATGCATATGCAAGAGGGGT TGTCGTTGTGGCGGCTGCTGGGAACAGCGGATCTTCAGGAAACAC-GAATACAATCGGC-TATCCTGCGAAATACGACTCTGTCATCGCAGTTGGCGCGGTAGACTCTAACAGCAA CAGAGCTTCATATTCCAGCGTCGGAGCAGAGCTTGAAGTCATGGCTCCTGGCG-CAGGCGTG-TACAGCACTTACCCAACCAGCACTTATGCAACATTGAACGGAACGTCAATGGCTTC TCCTCATGTAGCGGGAGCAGCAGCTTTGATCTTGTCAAAACATCCGAAC-CTTTCAGCTTCACAAGTCCGCAACCGTCTCTCCAGTACGGCGACTTATTTGGGAAG CTCCTGGTACTATGGAAAAGGTCTGATCAATGTCGAAGCTGCCGCTCAATAA
Id de sec. n.° 43. estA17Y19Y41C58Y
GCTGAACACAATCCAGTCGTTATGGTTCACGGTATTGGAGGGGCATCATA-CAATTATGCGG-GAATTAAGAGCTATCTCGTATCTCAGGGCTGGTCGCGGGACAAGCTGTATGCAGTT GATTGTTGGGACAAGACAGGCACAAATTATAACAATGGACCGGTATTATCACGA-TATGTG
CAAAAGGTTTT AGAT GAAACGGGT GCGAAAAAAGT GGAT ATT GTCGCT CACAGCAT GGGGGGCGCGAACACACTTT ACT ACAT AAAAAATCT GGACGGCGGAAAT AAAGTT -GCAAAC-GTCGTGACGCTTGGCGGCGCGAACCGTTTGACGACAGGCAAGGCGCTTCCGGG AACAGAT CCAAAT CAAAAGATTTT ATACACAT CCATTTACAGCAGTGCCGA-T AT GATT GT CAT GAATT ACTT ATCAAGATTAGATGGT GCT AGAAACGTT CAAATCCAT GGCGTTGGACACATCGGCCTTCTGTACAGCAGCCAAGTCAACAGCCTGATTAAA-GAAGGGCTGAACGGCGGGGGCCAGAATACGAATTAA
Id. de sec. n.° 44. estA17W19Y41C58Y GCTGAACACAATCCAGTCGTTATGGTTCACGGTATTGGAGGGG-CATCATGGAATTATGCGG-GAATTAAGAGCTATCTCGTATCTCAGGGCTGGTCGCGGGACAAGCTGTATGCAGTT GATTGTTGGGACAAGACAGGCACAAATTATAACAATGGACCGGTATTATCACGA-TATGTG-CAAAAGGTTTTAGATGAAACGGGTGCGAAAAAAGTGGATATTGTCGCTCACAGCAT GGGGGGCGCGAACACACTTTACTACATAAAAAATCTGGACGGCGGAAATAAAGTT-GCAAAC-GTCGTGACGCTTGGCGGCGCGAACCGTTTGACGACAGGCAAGGCGCTTCCGGG AACAGATCCAAATCAAAAGATTTTATACACATCCATTTACAGCAGTGCCGA-TATGATTGTCATGAATTACTTATCAAGATTAGATGGTGCTAGAAACGTTCAAATCCAT GGCGTTGGACACATCGGCCTTCTGTACAGCAGCCAAGTCAACAGCCTGATTAAA-GAAGGGCTGAACGGCGGGGGCCAGAATACGAATTAA
Id. de sec. n.° 45. estB20Y21 M40C GAGTCAGTACATAATCCTGTCGTTCTTGTTCATGGAATAAGTGGTGCATCATACAAC-TA-TATGGCTATTAAAAACTACTTAATTTCTCAAGGCTGGCAAAGCAACAAACTGTACGC AATTGATTGTTATGATAAAACAGGAAACAACCTAAATAACGGCCCGCAGCTT-GCTTCAT-ATGTTGACCGTGTTTTAAAAGAGACTGGGGCAAAAAAAGTAGATATTGTGGCTCATA GTATGGGAGGCGCCAATACGCTGTACTATATTAAATATTTAGGCGGGGGCAATAA-GAT-TCAAAATGTCGTAACGCTTGGAGGGGCTAATGGTTTAGTGTCATCAACCGCGCTGC CGGGCACAGACCCTAATCAAAAGATCCTCTATACATCTATTTACAG-TCTCAATGATCAAATT-GTCATCAATAGCTTGTCTCGGTTACAAGGAGCGCGAAACATCCAGCTTTATGGCAT CGGTCATATTGGCTTGCTTTCTAATAGCCAAGTGAACGGCTATATCAAA-GAAGGGCTGAATGGCGGAGGCCTCAATACAAATTAA
Id. de sec. n.° 46. ALAB-V4
AAGCAAGT CACAAAAT GTGAGCTGTCCCAGCTGCT GAAAGACATA-GATGGTTATGGAGGCATCGCTTTGCCTGAATTGATCTGTACCATGGTTCACACCAG TGGTTATGACACACAAGCCATAGTTGAAAACAATGAAAGCACGGAA-TATGGACTCGTCCAGATCAGTAATAAGCTTTGGTGCAAGAGCAGCCAGGTCCCTCA GTCAAGGAACATCTGTGACATCTCCTGTGACAAGGTCCTG-GATGATGACATTACTGATGACATAATGTGTGCCAAGAAGATCCTGGATATTAAAGGA ATTGACTACTGGTTGGCCCATAAAGCCCTCTGCACTGAGAAGCTGGAACAG-TGGCTTTGTGAGAAGTTGTGA
Id. de sec. n.°: NO47. ALAB-M1V3 AAGCAAATGACAAAATGTGAGCTGTCCCAGCTGCTGAAAGACATA-GATGGTTATGGAGGCATCGCTTTGCCTGAATTGATCTGTACCATGGTTCACACCAG TGGTTATGACACACAAGCCATAGTTGAAAACAATGAAAGCACGGAA-TATGGACTCGTCCAGATCAGTAATAAGCTTTGGTGCAAGAGCAGCCAGGTCCCTCA GTCAAGGAACATCTGTGACATCTCCTGTGACAAGGTCCTG-GATGATGACATTACTGATGACATAATGTGTGCCAAGAAGATCCTGGATATTAAAGGA ATTGACTACTGGTTGGCCCATAAAGCCCTCTGCACTGAGAAGCTGGAACAG-TGGCTTTGTGAGAAGTTGTGA
Id. de sec. n.° 48. ALAB-Y1V3 AAGCAATATACAAAATGTGAGCTGTCCCAGCTGCTGAAAGACATA-GATGGTTATGGAGGCATCGCTTTGCCTGAATTGATCTGTACCATGGTTCACACCAG TGGTTATGACACACAAGCCATAGTTGAAAACAATGAAAGCACGGAA-TATGGACTCGTCCAGATCAGTAATAAGCTTTGGTGCAAGAGCAGCCAGGTCCCTCA GTCAAGGAACATCTGTGACATCTCCTGTGACAAGGTCCTG
GAT GAT GACATT ACT GAT GACAT AAT GT GTGCCAAGAAGAT CCTGGAT ATTAAAGGA
ATT GACT ACTGGTT GGCCCAT AAAGCCCTCT GCACT GAGAAGCTGGAACAG-T GGCTTT GT GAGAAGTT GTGA
Id. de sec. n.° 49. ALAB-H1V3
AAGCAACAT ACAAAAT GTGAGCTGTCCCAGCTGCT GAAAGACATA-GATGGTTATGGAGGCATCGCTTTGCCTGAATTGATCTGTACCATGGTTCACACCAG TGGTTATGACACACAAGCCATAGTTGAAAACAATGAAAGCACGGAA-T AT GGACTCGT CCAGATCAGT AAT AAGCTTTGGT GCAAGAGCAGCCAGGTCCCTCA GT CAAGGAACAT CTGT GACAT CTCCTGT GACAAGGTCCT G-GATGATGACATTACTGATGACATAATGTGTGCCAAGAAGATCCTGGATATTAAAGGA ATTGACTACTGGTTGGCCCATAAAGCCCTCTGCACTGAGAAGCTGGAACAG-TGGCTTTGTGAGAAGTTGTGA
Los nucleótidos pueden ser de ADN genómico, ADNc, ARN codificante y ARN no codificante.
Vectores de expresión
Unos buenos vectores de expresión secretores de Bacillus deben incluir los siguientes elementos génicos:
(1) promotor fuerte,
(2) péptido señal adecuado,
(3) sitio de clonación múltiple (MCS,),
(4) replicón estable y de alto número de copias y un gen de resistencia a antibióticos.
La presente invención se refiere también a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una proteína de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse conjuntamente para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción cómodos para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la proteína en tales sitios. De forma alternativa, el polinucleótido puede expresarse insertando el polinucleótido en una construcción de ácido nucleico que comprenda el polinucleótido en un vector adecuado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se sitúa en el vector de modo que la secuencia codificante se une de forma operativa con secuencias de control adecuadas para expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que puede someterse de forma conveniente a procedimientos de ADN recombinante y conseguir la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá de forma típica de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se introducirá el vector. El vector puede ser un plásmido circular lineal o cerrado.
Como se demuestra en los ejemplos en la presente memoria, vectores de expresión adecuados son pHT01 y pHT43 (Id de sec. n.°: 15 y 16, respectivamente) así como mutantes de los mismos, pHT100, pHT223 y pHT250 (mutantes de pHT01) y pHT431, pHT432 y pHT433 (mutantes de pHT43); ver las Id. de sec. n. °: 15-22.
Todos los vectores anteriores utilizan el promotor fuerte que precede al operón groESL de Bacillus subtilis fusionado al operador lac, permitiendo su inducción mediante la adición de IPTG (isopropil beta-D-1-tiogalactopiranósido).
Otros vectores adecuados aparecen de los ejemplos y figuras de la presente memoria incluidos tres vectores de integración que contienen un gen modificado de la proteasa alcalina de B, licheniformis. El plásmido pEBKan194-GFP (Figura 13), que de forma natural es sensible a temperaturas superiores a 42 qC, se utiliza para la construcción de diversos vectores knockout y knockin. Se utilizaron vectores con el brazo homólogo ascendente y descendente de apr, xylA, gntP y ywaD de B. licheniformis CICC10266 (pEBkan194-GFP-aprFR1, pEBkan194-GFP-XylFR y pEBkan194-GFP-gntPFR) para obtener pEBkan194-GFP-aprFR1-10266apr-W4, pEBkan194-GFP-XylFR-10266apr-W4, pEBkan194-GFP-gntpFR-10266apr-W4. Los productos podrían transformarse en E. coli como se demuestra en los ejemplos de la presente memoria.
Pueden utilizarse otros cuatro vectores knockin con los fragmentos génicos de brazo homólogo ascendente y descendente de apr, xylA, gntP y ywaD de B. licheniformis CICC10266 (pEBkan194-GFP-yd-eDLC, pEBkan194-GFP-XylFR, pEBkan194-GFP-gntPFR y pEBkan194-GFP-ywaDFR) p. ej. para obtener pEBkan194-GFP-aprFR2-10073aprE-W7 (Figura 14), pEBkan194-GFP-XylFR-10073aprE-W7 (Figura 15), pEBkan194-GFP-gntpFR-10073maprEW7 (Figura 16), pEBkan194-GFP-ywaDFR-10073aprE-W7 (Figura 17). Los clones positivos se identifican mediante PCR de colonias. Los clones de E. coli identificados con los plásmidos correctos se conservaron y utilizaron para la extracción de plásmidos. Como se muestra en los ejemplos, los plásmidos pueden utilizarse para la electrotransformación de la cepa B. licheniformis CICC10266 (úapryhfN).
Como se muestra en los ejemplos y figuras, las secuencias de ADN introducidas pueden contener un segmento de ADN cromosómico de B. licheniformis que se encuentra corriente arriba en el extremo 5' del promotor del gen apr, un promotor apr fuerte, el péptido señal de apr, la proteasa alcalina modificada y el extremo corriente abajo 3' del gen apr. La secuencia modificada del gen apr de B. licheniformis y la secuencia aminoacídica de la proteína madura exenta de Phe se muestran en las Id de sec. n.°: 73-74.
El vector también puede contener uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia tanto biocida como vírica, resistencia a metales pesados y similares.
Marcadores adecuados pueden ser ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o neomicina.
Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la proteína o de cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una o más ubicaciones precisas en el o los cromosomas.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita que el vector se replique de modo autónomo en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. El término “origen de replicación” o “ replicador plasmídico” se refiere a un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.
Se han utilizado cuatro orígenes de replicación distintos en el presente contexto y que proceden de los plásmidos comunes de Bacillus pHT43, pWB980, pHY300PLK y pHIS1525.
Los vectores pHT43 y pHT01 o el resto de vectores recombinantes mencionados anteriormente se utilizan principalmente para los ensayos de expresión de estas proteínas. Sin embargo, se prefiere un sistema de expresión en Bacillus que no necesite inductor y el que el gen producto se integre en el ADN cromosómico. La cepa de producción final será muy similar a la cepa no modificada genéticamente, p. ej., sin plásmido libre introducido, sin genes de antibiótico introducidos, los sistemas de expresión pueden ser los mismos que estos sistemas naturales de expresión para la proteasa alcalina y alfa-amilasa procedentes de las cepas de B. subtilis y B. licheniformis. Además, puede desactivarse el gen de formación de esporas, como se describe en la presente memoria.
Construcciones de ácido nucleico
La presente invención se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica una proteína exenta de Phe de la presente invención, unidas de forma operativa a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en un hospedador adecuado en condiciones compatibles con la secuencia de control.
El polinucleótido puede manipularse de diversas formas para obtener la expresión de la proteína exenta de Phe. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan ADN recombinante son muy conocidas para un experto.
La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido reconocido por una célula hospedadora para la expresión de un polinucleótido que codifica una proteína exenta de Phe de la presente invención. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora incluidos promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos en la célula hospedadora.
Ejemplos de promover adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula bacteriana son los promotores obtenidos de bacterias, virus u otros, tales como Pgrac o mutantes del promotor Pgra P100, P233 o p250 (Id. de sec. n.° 17, 18 y 19, respectivamente.
Se utilizaron también otros promotores para la expresión de proteínas recombinantes exentas de Phe, tales como promotores constructivos (P43, PaprE, PnprE, PamyE, PsipS, PBlapr y PamyS) y autoinducibles (pcry32a y PAPasa). Las secuencias de estos promotores se proporcionan como las Id. de sec. n.°: 50-58, respectivamente.
Los promotores pGAP y pAOXI de Pichia pastoris pueden dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en P. pastoris.
Los promotores hp4d de Yarrowia lipolytica pueden dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en Y. lipolytica.
La secuencia de control también puede ser un terminador de transcripción, reconocida por una célula hospedadora para finalizar la transcripción. El terminador está unido de forma operativa al extremo 3' del polinucleótido que codifica una proteína. Puede utilizarse cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora, tales como TAA, TGA, TAG.
La secuencia de control también puede ser una región líder no traducida de un ARNm que sea importante para la traducción por la célula hospedadora. La secuencia líder está unida de forma operativa al extremo 5' del polinucleótido que codifica una proteína exenta de Phe de la invención. Puede utilizarse cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula hospedadora.
En los ejemplos no se ha utilizado ninguna secuencia líder, sino que se utiliza un péptido señal para la secreción y un propéptido, que no forman parte del producto final, tales como aprE y Blapr que necesitan un péptido señal y un propéptido para expresión secretada en B. subtilis y B. licheniformis.
Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores recombinantes de expresión de la presente invención son bien conocidos para un experto.
Construcción y selección de un vector de expresión elevada que no requiera un inductor
Para reducir el coste de la producción mediante fermentación a gran escala, se prefiere la expresión sin inductor (IPTG, xilosa, lactosa u otros compuestos). Algunos promotores constructivos y autoinducibles se clonarán en para construir el vector de expresión.
Aunque pueden encontrarse muchos vectores de expresión de B. subtilis en varias referencias bibliográficas, los vectores de expresión comerciales siguen siendo escasos. Muchos plásmidos en B. subtilis son inestables y tienen un número de copias bajo. Además, el nivel de expresión de la proteína recombinante es también relativo bajo. Los presentes inventores adquirieron dos plásmidos de expresión con inducción por IPTG, pHT01 y pHT43 de MoBiTec y construyeron un plásmido de expresión constructiva, pWB980. Sin embargo, el nivel de expresión de la proteína diana de los inventores es menor en comparación con otras cepas salvajes citadas en la bibliografía cuando se utilizan los plásmidos pHT01 y pHT43. Los dos plásmidos son inestables en E.coli y tienen bajo número de copias en B. subtilis. Además, el plásmido pWB980 es un plásmido derivado de pUB110 no lanzadera e inestable durante el cultivo. Además, la transformación genética del plásmido pWB980 se ha visto obstaculizada por eficiencias de transformación bajas.
Para superar estos problemas y mejorar el nivel de expresión de proteínas diana, deben construirse y ensayarse en B. subtilis algunos vectores lanzadera e integrados de E. coli - B. subtilis. Aunque no existe un vector de expresión comercial para B. licheniformis, pero sí algunos de E. coli - B. subtilis, pueden utilizarse vectores lanzadera en B. licheniformis.
Eliminación de todos los genes de resistencia a antibióticos del hospedador de expresión
Para resolver la inestabilidad de los plásmidos recombinantes en Bacillus, se construirán vectores integrados para integrar el gen diana en el genoma de B. subtilis y de B. licheniformis. Los genes que codifican las proteínas exentas de Phe podrían insertarse en el genoma de B.subtilis en al menos nueve locus (genes de amilasa y de ocho proteasas). Los genes que codifican las proteínas exentas de Phe pueden insertarse en el genoma de B. licheniformis en al menos tres locus (genes de proteasa, amilasa y cloranfenicol acetiltransferasa). Sin embargo, el gen de resistencia a antibióticos exógeno también se integra inevitablemente en el genoma de B. subtilis y B. licheniformis. Además, se han insertado varios genes exógenos de resistencia a antibióticos en la cepa B. subtilis WB800N (cepa deficiente en ocho proteasas extracelulares) que se utiliza habitualmente como hospedador de expresión. La proteína recombinante exenta de Phe según la presente invención se producirá a gran escala, de modo que se eliminarán los genes de resistencia a antibióticos exógenos del genoma de B. subtilis y de B. licheniformis para la protección del medio ambiente.
Copias múltiples de los genes del producto con múltiples rutas secretoras
Puede insertarse más de una copia del polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora para aumentar la producción de la proteína. Puede obtenerse un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo un gen marcador seleccionable y amplificable en el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, de este modo, pueden seleccionarse copias adicionales del polinucleótido, cultivando las células en presencia del agente de selección adecuado.
Múltiples copias de los genes del producto integradas en el genoma pueden aumentar el nivel de expresión. Si las múltiples copias de genes se vinculan a distintas señales de secreción que se secretarán a través de diferentes rutas metabólicas, puede aumentarse de forma adicional el rendimiento del producto. La ausencia de una membrana externa en Bacillus simplifica las rutas de secreción de proteínas, lo que permite que el organismo secrete altos niveles de proteínas extracelulares. B. subtilis y B. licheniformis tienen tres y cinco rutas diferentes de secreción de proteínas, respectivamente. La ruta Sec constituye la ruta de secreción principal en B. subtilis y B. licheniformis. De forma alternativa, un pequeño número de proteínas extracelulares con funciones específicas se secretan a través de la ruta Tat o de los transportadores ABC en B. subtilis. Se descubrió que la formación de cuerpos de inclusión es un factor limitante en B. subtilis cuando se sobrecarga la ruta de secreción. Por lo tanto, se ensayarán muchos péptidos señal para aumentar el nivel de secreción de la proteína diana.
Como se observa en los ejemplos de la presente memoria, pueden insertarse al menos 2 copias, como 3 copias o más.
Deleción de genes para la miscelánea de proteínas extracelulares principales
Para simplificar el proceso de purificación y reducir el coste, puede identificarse y eliminarse la miscelánea de proteínas extracelulares principales de B. subtilis y B. licheniformis. Dos genes que codifican las principales proteínas extracelulares en B. subtilis WB800N se identifican como flagelina y superóxido dismutasa. Estos dos genes pueden inactivarse.
Inactivación de los principales genes implicados en la formación de esporas
Para evitar la formación de esporas durante la fermentación, para extender el tiempo de cultivo para la producción de proteínas y para reducir el riesgo de formación de esporas en el biorreactor, se delecionarán los principales genes implicados en la formación de esporas en B. subtilis y B. licheniformis.
Métodos para producir proteínas exentas de Phe
Las proteínas exentas de Phe de la presente invención pueden fabricarse mediante un método que comprende i) cultivar una célula hospedadora recombinante de la presente invención en condiciones que llevan a la producción de la proteína y, ii) recuperar la proteína.
Las células hospedadoras se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la proteína exenta de Phe utilizando un método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, las células pueden cultivarse en placas multipocillo, cultivo en matraz de agitación o fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluida la fermentación continua, discontinua, semicontinua o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio adecuado y en condiciones que permiten expresar y/o aislar la proteína. El cultivo se lleva a cabo en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. El cultivo se lleva a cabo en primer lugar en algunos medios nutritivos que comprenden fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. A continuación se optimizarán adicionalmente un medio adecuado, las condiciones de cultivo y el progreso del cultivo de alta densidad celular en fermentación a pequeña escala o a gran escala.
Optimización de la fermentación y escalado
La producción de proteína recombinante depende habitualmente de las condiciones de fermentación. Todas las composiciones del medio de cultivo, la temperatura de cultivo, el oxígeno disuelto y el pH son factores importantes que afectan al crecimiento celular y a la expresión de las proteínas. Un nivel de expresión mayor que 10 g/l es un desafío en el límite de capacidad de las bacterias. La mayoría de estos factores deben optimizarse hasta lograr las mejores condiciones. Estos factores se investigarán bien a pequeña escala y, a continuación, se dimensionarán a la escala de fabricación.
Estrategias de purificación
Se desea un proceso de purificación simple y barato para mantener bajo todo el coste de fabricación. Un sistema de expresión GRAS sin plásmido libre permitirá que el producto contenga cierto nivel de impurezas procedentes del caldo de cultivo. La eliminación de la mayoría de estas proteínas extracelulares a través de la deleción de sus genes limita las impurezas de proteína, lo que es importante para mantener bajo el contenido de Phe del producto. Se añadirá a los genes de proteína diana una etiqueta determinada, por ejemplo, una etiqueta sensible a la temperatura. Por lo tanto, la proteína diana puede precipitar cuando se la temperatura aumenta hasta cierto nivel.
En principio puede utilizarse cualquier proceso de purificación adecuado incluidos métodos industriales comunes como filtración o, de forma alternativa, purificación utilizando sílice (p. ej., sílice no derivatizada, fase estacionaria en configuraciones cromatográficas, etc.)
Optimización de proteínas recombinantes
La composición de aminoácidos de proteína recombinante se optimizará según los requisitos nutricionales de la PKU y según los requisitos de tratamiento de la enfermedad, tales como un aumento en el contenido de LNAA. Listado de secuencias
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Realizaciones específicas
Las realizaciones de la invención surgen a partir de las reivindicaciones anexas, que de este modo se incluyen en la presente descripción de la invención.
En particular, los microorganismos recombinantes de la presente invención pueden prepararse mediante un método que comprende las etapas de:
i Hacer mutaciones específicas de Phe en la secuencia de ácido nucleico utilizando mutagénesis dirigida para sustituir codones de Phe únicos por codones de LNAA únicos,
ii. Eliminación del enzima de restricción (Dpnl) y purificación de la secuencia de ácido nucleico mutada seguida de ligación en un vector termosensible que puede iniciar la recombinación en círculo rodante en fragmentos génicos homólogos introducidos de una cepa de producción final de Bacillus (CICC10266) a temperaturas de 42 °C o superiores y que lleva un gen que proporciona resistencia a kanamicina y otro gen que codifica para una proteína fluorescente verde (pEBKan194-GFP),
iii. Transformación de dicho vector que lleva la secuencia de ácido nucleico mutada en E. coli (DH5a o TOP10), seguido de PCR de colonias de los transformantes con éxito,
iv. Extracción de dicho vector que lleva la secuencia mutada de ácido nucleico de dichos transformantes de E. coli, y electrotransformación en una cepa de producción final de B. licheniformis de la que previamente se ha eliminado completamente el gen salvaje de dicha secuencia de ácido nucleico, (CICC10266 es Aapr yhfN '), selección para el crecimiento de transformantes resistentes a la kanamicina y fluorescentes a 42-44 0C, v. integración de la secuencia de ácido nucleico mutada en los genes diana de la cepa de producción final de B.
licheniformis o B. subtilis en dichas áreas de homología introducidas en ese vector que a continuación se selecciona en placas duplicadas para determinar la pérdida de resistencia a la kanamicina, con la presencia de dicha secuencia de ácido nucleico mutada confirmada mediante secuenciación.
El vector de la etapa (iii) puede comprender secuencias reguladoras, promotoras y secuencias señal asociadas con la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje.
El microorganismo recombinante puede transformarse con otros vectores generados según las etapas (i) a (iii) con diferentes fragmentos génicos en los que se produce la recombinación, de modo que se integren copias adicionales de dicha secuencia de ácido nucleico recombinante exento de Phe o con Phe bajo en el genoma de Bacillus en varias ubicaciones diana.
Figuras
Figura 1. Metabolismo de PHE en seres humanos. La ingesta de L-Phe se hace por la dieta y se recicla a través de grupos de aminoácidos. La hidroxilación mediante PAH con su cofactor BH4, en presencia de O2 molecular, produce L-Tyr. El metabolismo alternativo de L-Phe mediante descarboxilación o transaminación produce varios metabolitos que se excretan a la orina[6].
Figura 2. La enzima fenilalanina hidroxilasa convierte fenilalanina en tirosina junto con el cofactor tetrahidrobiopterina (BH4).
Figura 3. La figura presenta las diferentes opciones de tratamiento disponibles en la práctica o en teoría, observando diferentes localizaciones en el organismo.
Figura 4. Rutas biosintéticas de la BH4. La sepiapterina reductasa (SPR) cataliza la formación de BH4 a partir de 6 -piruvoiltetrahidropterina y de BH2 a partir de sepiapterina en una ruta de rescate[24]. DHFR, dihidrofolato reductasa.
Figura 5. Estructura química del diclorhidrato de sapropterina (nombre comercial: Kuvan®)[32].
Figura 6. Diferencias dietéticas entre la dieta de LNAA y la dieta de PKU tradicional.
Figura 7. Análisis por SDS-PAGE de la expresión de estB en la cepa de B. subtilis WB800N. M: marcador de proteína; carril 1, control; carril 2, la cepa recombinante se indujo con IPTG en medio LB durante 2,5 h Figura 8. Análisis SDS-PAGE de la expresión de estA en la cepa de B. subtilis WB800N. M: marcador proteico; carriles 1 y 2, control; carril 3; la cepa recombinante se indujo con IPTG en medio LB durante 2,5 h
Figura 9. Análisis SDS-PAGE de la expresión de aprE en la cepa de B. subtilis WB800N. M: marcador de proteína; carril 1 , control; carril 2 , la cepa recombinante se indujo con IPTG en medio LB durante 4 h
Figura 10. Análisis por SDS-PAGE de la expresión de maprE en la cepa de B. subtilis WB800N. M: marcador de proteína; carril 1, control; carril 2, la cepa recombinante se indujo con IPTG en medio LB durante 4 h
Figura 11. Análisis por SDS-PAGE de la expresión de maprE en la cepa de B. subtilis WB800N con el vector pHT432 (izquierda) y pHT01 (derecha). M: marcador de proteína; carril 1, control; carril 2, la cepa recombinante se indujo con IPTG en medio LB durante 4 h
Figura 12. Digestión con pepsina (12 A) y tripsina (12 B) de Blapr desnaturalizada con calor para indicar que la Blapr cocinada se digiere bien en el tracto GI humano
Figura 13. Diagrama esquemático del plásmido termosensible pEBkan194-GFP
Figura 14. Diagrama esquemático del plásmido termosensible pEBkan194-GFP-aprFR2-10073aprE-W7
Figura 15. Diagrama esquemático del plásmido termosensible pEBkan194-GFP-xylAFR-10073aprE-W7
Figura 16. Diagrama esquemático del plásmido termosensible pEBkan194-GFP-gntPFR-10073aprE-W7
Figura 17. Diagrama esquemático del plásmido termosensiblepEBkan194-GFP-ywaDFR-10073aprE-W7
Figura 18. Análisis SDS-PAGE de la producción de 10266apr-W4 utilizando la cepa YRBLS025 en un fermentador de 5 l con los medios SC2 y SC3. Carril M, marcador de bajo peso molecular (TaKaRa); carriles 1 - 6 , 5 pl de sobrenadante de cultivo de 18, 20, 22, 24, 26 y 28 h con medio SC2, respectivamente; carriles 7 - 12, 5 pl de sobrenadante de cultivo de 18, 20, 22, 24, 26 y 28 h con medio SC3, respectivamente.
Figura 19. Análisis de SDS - PAGE de la producción de 10266apr-W4 utilizando la cepa YRBLS025 en un fermentador de 50 l con medio SC3. Carril M, marcador de bajo peso molecular (TaKaRa); carriles 12 h - 36 h, 5 pl de sobrenadante de cultivo de 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 36 h, respectivamente.
Figura 20. Análisis SDS - PAGE de la producción de 10266apr-W4 utilizando la cepa YRBLS025 en un fermentador de 500 l con medio SC3. Carril M, marcador de bajo peso molecular (TaKaRa); carriles 1 - 7, 5 pl de sobrenadante de cultivo de 8 , 10, 14, 18, 20, 22 y 25 h, respectivamente.
Figura 21. Listado de secuencias.
Abreviaturas:
PKU fenilcetonuria
HPA hiperfenilalaninemias
Phe fenilalanina
PAL fenilalanina amoniaco liasa
PAH o gen Pah; PAH o enzima Pah-fenilalanina hidroxilasa
GMP glicomacropéptido
LNAA aminoácidos neutros grandes
GTPCH I GTP ciclohidrolasa I
PTPS 6 -Piruvoil tetrahidropterina sintasa
SPR Sepiapterina reductasa
BH4 Tetrahidrobioterina
BP Biopterinas
aa aminoácido
Definiciones
ADNc: El término “ADNc” significa una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura sometida a corte y empalme obtenida de una célula. El ADNc carece de secuencias de intrón que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito primario inicial de ARN es un precursor del ARNm que se procesa mediante una serie de etapas, incluido el corte y empalme, antes de aparecer como un ARNm maduro empalmado.
Secuencia codificante: El término “secuencia codificante” significa un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de la enzima o de la variante de la enzima. Los límites de la secuencia codificante están determinados de forma general por un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio ATG, GTG o TTG, y finaliza con un codón de parada tales como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.
Secuencias de control: La expresión “ secuencias de control” significa las secuencias de ácidos nucleicos necesarias para expresar un polinucleótido que codifica una proteína o variante de la presente invención. Cada secuencia de control debe ser nativa (es decir, del mismo gen) o extraña (es decir, de un gen distinto) para el polinucleótido que codifica la proteína o variante de la misma, o nativas o extrañas entre sí. Dichas secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada de la transcripción y de la traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores que tienen el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la unión de la secuencia de control con la región codificante del polinucleótido que codifica la proteína o variante de la misma.
Expresión: El término “expresión” incluye cualquier etapa implicada en la producción de una proteína de la misma, aunque no de forma limitativa, la transcripción, la modificación posterior a la transcripción, la traducción, la modificación posterior a la traducción, y la secreción.
Vector de expresión: El término “vector de expresión” significa una molécula de ADN, linear o circular, que comprende un segmento que codifica un polinucleótido que codifica una variante, y que está unido de forma operativa a secuencias de control que permiten su expresión.
Célula hospedadora: El término “célula hospedadora” significa cualquier tipo celular susceptible de transformación, transfección, transducción o similares con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido como se describe en la presente memoria.
Aislado: El término “ aislado” se refiere a una sustancia en una forma o entorno que no existe en la naturaleza. Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen i) cualquier sustancia que no es de origen natural+, ii) cualquier sustancia que incluya, aunque no de forma limitativa, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se elimina al menos parcialmente de uno o más o de todos los constituyentes de origen natural con los que está asociado en la naturaleza, iii) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con relación a esa sustancia como aparece en la naturaleza, o iv) cualquier sustancia modificada aumentando la cantidad de la sustancia con relación a otros componentes con los que está asociada de modo natural.
Construcción de ácido nucleico: La expresión “construcción de ácido nucleico” significa una molécula de ácido nucleico, tanto monocatenaria como bicatenaria, que está aislada de un gen de origen natural, o se ha modificado para incluir segmentos de ácidos nucleicos de un modo que no se produciría de forma natural o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.
Unido de forma operativa: La expresión “ unido de forma operativa” significa una configuración en la que una secuencia de control se sitúa en una posición adecuada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de modo que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.
Exento de Phe o bajo en Phe: La expresión “exento de Phe” significa que la proteína en cuestión no contiene ningún grupo Phe. La expresión “bajo en Phe” significa que la proteína en cuestión contiene un máximo del 5 % de grupos Phe.
Célula hospedadora recombinante: La expresión “célula hospedadora recombinante” o “célula hospedadora” pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico recombinante, como un vector recombinante. Una célula hospedadora recombinante puede ser una célula aislada o línea celular cultivada en un cultivo o puede ser una célula que reside en un tejido u organismo vivo.
Identidad de secuencia: como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, “ identidad” también se refiere al grado de relación de secuencias entre polipéptidos según se determina por la coincidencia entre las cadenas de dichas secuencias. La “ identidad” y la “ similitud” pueden calcularse fácilmente con métodos conocidos.
En el presente contexto, la homología entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro “ identidad de secuencia” . Las alineaciones de secuencias y el cálculo de puntuaciones de homología pueden hacerse utilizando una alineación Smith-Waterman completa, útil para las alineaciones de proteínas y ADN. Las matrices de puntuación predeterminadas BLOSUM50 y la matriz de identidad se utilizan para alineaciones de proteínas y de ADN, respectivamente. La penalización para el primer resto en un hueco es -12 para proteínas y -16 para ADN, mientras que la penalización para restos adicionales en un hueco es -2 para proteínas y -4 para ADN. La alineación puede hacerse con la versión de paquete v20u6 de FASTA.
Pueden hacerse alineaciones múltiples de secuencias de proteínas utilizando “ClustalW” . Pueden hacerse alineaciones múltiples de secuencias de ADN pueden realizarse utilizando la alineación de proteínas como plantilla, sustituyendo los aminoácidos por el codón correspondiente de la secuencia de ADN.
De forma alternativa, pueden utilizarse programas informáticos distintos para alinear secuencias de aminoácidos y secuencias de ADN. La alineación de dos secuencias de aminoácidos se determina p. ej. utilizando el programa Needle del paquete informático EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle aplica el algoritmo de alineación global. La matriz de sustitución utilizada es BLOSUM62, la penalización por abertura de huecos es 10, y la penalización por extensión de huecos es 0,5.
El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos; p. ej. Id. de sec. n.°: 7 y una secuencia de aminoácidos distinta (p. ej. Id de sec. n.°: 76) se calcula como el número de emparejamientos exactos en una alineación de ambas secuencias, dividido por la longitud de la “ Id. de sec. n.°: 7” o de la secuencia de aminoácidos de la “ Id. de sec. n.°: 76” , la que sea más corta. El resultado se expresa como porcentaje de identidad.
Se produce un emparejamiento exacto cuando las dos secuencias tienen restos de aminoácidos idénticos situados en las mismas posiciones del solapamiento.
Si procede, puede determinarse el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos mediante el método Wilbur-Lipman (51) utilizando el uso del programa informático LASER-GENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiple: Penalización de hueco de 10 y penalización de longitud de hueco de 10. Los parámetros de alineación entre parejas son Ktuple=3, penalización de hueco=3 y ventanas=20.
En una realización particular, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido con, o con respecto a, los aminoácidos de la Id de sec. n.°: 1 se determina mediante i) la alineación de las dos secuencias de aminoácidos utilizando el programa Needle con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de apertura de hueco de 10, y una penalización de extensión de hueco de 0.5; ii) contando el número de coincidencias exactas en el alineación; iii) dividiendo el número de coincidencias exactas por la longitud de la secuencia de aminoácidos más corta de las dos y, iv) convirtiendo el resultado de la división de iii) en porcentaje. El porcentaje de identidad respecto de, o con, otras secuencias de la invención se calcula de modo análogo.
A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de referencia, es decir 100 % idéntica, o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el % de identidad sea menor que 100 %. Dichas alteraciones se seleccionan de: al menos una deleción, sustitución (incluida la sustitución conservadora y no conservadora) o inserción de aminoácidos, y en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones de los extremos amino o carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier lugar entre dichas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia, o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Las variantes conservadoras de aminoácidos también pueden comprender restos de aminoácidos que no sean de origen natural. Los aminoácidos de origen no natural incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metil-glicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, nitro-glutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidin carboxílico, deshidroprolina, 3-metilprolina y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenil-alanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. En la técnica se conocen varios métodos para incorporar restos de aminoácidos de origen no natural en las proteínas. Por ejemplo, puede utilizarse un sistema in vitro en donde las mutaciones terminadoras se suprimen utilizando ARNt supresores aminoacilados químicamente. En la técnica se conocen métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar el ARNt. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se llevan a cabo en un sistema acelular que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos comerciales. Las proteínas se purifican por cromatografía. (52-55). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en ovocitos de Xenopus por microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores aminoacilados químicamente (56). En un tercer método, las células de E. coli se cultivan en ausencia del aminoácido natural a sustituir (p. ej., fenilalanina) y en presencia del uno o más aminoácidos no naturales deseados (p. ej., 2-azafenilalanina, 3- azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural se incorpora a la proteína en lugar de su análogo natural. (57). Los restos de aminoácidos de origen nativo pueden convertirse en especies no naturales mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis dirigida para expandir aún más la gama de sustituciones.
Vector. El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “ plásmido” , que se refiere de forma general a un lazo de ADN bicatenario circular al que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN, pero también incluye moléculas bicatenarias lineales tales como las que resultan de la amplificación mediante la polymerase chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa - PCR) o del tratamiento de un plásmido circular con una enzima de restricción. Otros vectores incluyen cósmidos, bacterial artificial chromosomes (cromosomas artificiales bacterianos -BAC) y yeast artificial chromosomes (cromosomas artificiales de levadura - YAC). Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde segmentos adicionales de ADN pueden ligarse al genoma vírico. Algunos vectores tienen capacidad de dirigir la expresión de genes a los que están unidos de forma operativa.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Proteínas con menor contenido de Phe procedentes de Bacillus y de humanos
De la información publicada disponible, se han seleccionado las proteínas núm. 1 a 10 procedentes de B. subtilis, núm. 11 procedente de humanos, núm. 12 y 13 procedentes de B. licheniformis para la expresión según su contenido de Phe o para nivel de expresión elevado en su hospedador nativo (Tabla 2).
Tabla 2. Proteínas seleccionadas para expresión recombinante en B. subtilis y B. licheniformis.
Figure imgf000032_0001
Expresión de estas proteínas en Bacillus
Se utilizaron la cepa B. subtilis WB800N y los vectores pHT43 y pHT01 (MoBiTec) para la expresión de las proteínas recombinantes. pHT43 y pHT01 son iguales, salvo que pHT43 contiene el péptido señal amyQ mientras que pHT01 no. Las células se cultivaron de forma rutinaria en medio LB a 37 °C con aireación. Se añadieron antibióticos en caso necesario (ampicilina a 100 pg/ml para E. coli y cloranfenicol a 10 pg/ml para B. subtilis). El promotor Pgrac del vector pHT01 fue sustituido por los mutantes P100, P223 y P250 del promotor Pgrac para mejorar el nivel de expresión, dando lugar a los nuevos plásmidos recombinantes pHT100, pHT223 y pHT250, respectivamente. El promotor Pgrac del vector pHT43 fue sustituido por los mutantes P431, P432 y P433 del promotor Pgrac, dando lugar a los nuevos plásmidos recombinantes pHT431, pHT432 y pHT433, respectivamente. Todos los vectores anteriores utilizan el promotor fuerte que precede al operón groESL de Bacillus subtilis fusionado al operador lac, lo que permite su inducción añadiendo ITPG. Las secuencias de pHT43, pHT01, P100, P223, P250, P431, P432 y P433 tienen las Id de sec. n.° 14-21, respectivamente.
El material genético correspondiente a las proteínas de interés es el ADN. La mayor parte de los genes que codifican las proteínas de interés están clonados de B. subtilis y B. licheniformis. Solo los fragmentos génicos que codifican para ALAB y EGFP fueron de síntesis artificial. Todos los genes se insertaron en el vector mediante digestión con enzimas de restricción y ligado con ligasa T4 de ADN. Las secuencias de nucleótidos correspondientes a las secuencias de aminoácidos son las Id. de sec. n.°: 59-72, respectivamente.
Todos los productos de PCR de los genes candidatos se sometieron a digestión doble con BamH I y Sma I y, a continuación, se ligaron a los vectores pHT01, pHT43, pHT100, pHT223, pHT250, pHT431, pHT432 y pHT433, que se habían digerido con la misma endonucleasa de restricción para formar los vectores recombinantes. Los productos ligados se transformaron primero en E. coli DH5a, se analizó su correcta inserción mediante secuenciación de ADN y, a continuación, se introdujeron en B. subtilis WB800N (nprE aprE epr bpr mpr:: ble npr8:: bsrñvpr wprA:: hyg cm:: neo). El protocolo de preparación de células competentes de B. subtilis y la electrotransformación se adoptaron de Xue et al.[58], 1992. Todas las cepas recombinantes de B. subtilis crecen aeróbicamente a 37 °C en medio YT 2 x (16 g de triptona, 10 g de casaminoácidos, 5 g de NaCl). Cuando la DO600 de las cepas recombinantes llegan a 0,7-0,8, el medio YT 2x se divide en 2 partes y se induce con IPTG 1 mM en una parte para inducción (t = 0 h). Se recogen muestras en puntos temporales distintos para su análisis (t = 2-6 h). Las muestras se recogieron por centrifugación para el análisis con SDS-PAGE.
La expresión de estB (carril 2 en la Figura 7), estA (carril 3 en la Figura 8 ) y aprE (carril 2 en la Figura 9) en cepas de B. subtilis WB800N con el vector pHT43 se observó en SDS-PAGE, respectivamente.
Los niveles de expresión de aprE en B. subtilis mejoraron aproximadamente un 10 % - 300 % cuando se utilizaron los nuevos plásmidos recombinantes, en comparación con los vectores comerciales pHT01 y pHT43. El nivel de expresión más alto se obtuvo cuando se utilizó el vector pHT431. En general, los vectores de expresión extracelulares con un péptido señal amilQ (pHT431, pHT432 y pHT433) son mejores que los vectores intracelulares (pHT 100, pHT223 y pHT250).
Expresión de proteínas recombinantes sin Phe
Se sustituyeron tres restos de Phe en aprE por Tyr y Leu con mutagénesis dirigida o utilizando el Kit de mutagénesis Multipoint (TaKaRa, Japón), dando lugar a aprEF50YF189YF261 L (maprE). El cebador de mutación y se diseñó y se envió para su síntesis a una empresa en china (http://www.tianyibiotech.com). La mutagénesis dirigida es un proceso directo y simple, pero los sitios de mutación deben sustituirse uno a uno. El procedimiento principal incluye las siguientes etapas: amplificar los plásmidos de molde utilizando iniciadores sintéticos, digerir los productos de PCR con la enzima Dpnl, transformar el producto purificado en E. coli DH5a o TOP10 y enviar a secuenciar 3-5 clones a una empresa (www.tsingke.net). Para la mutagénesis multipunto simultánea, el proceso sigue el manual de Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa, Japón). Se sustituyeron cuatro restos de Phe en estA por otros aminoácidos mediante mutagénesis dirigida, dando lugar a estAF17YF19YF41CF58Y (mestA1) y estAF17WF19YF41CF58Y (mestA2). La proteína a-lactoalbúmina humana que contiene cuatro restos de Phe es la proteína nutritiva más importante de la leche humana. Para producir ALAB exenta de Phe, el primer Phe de la ALAB se sustituye por Met, y todos los demás restos de Phe de la ALAB son sustituidos por Val, dando lugar a ALABF3MF31Vf53VF80V3 (mALAB). Todos los genes mutados se insertaron en el vector pHT43 para los ensayos de expresión en B. subtilis, cepa WB800. Todos los plásmidos recombinantes se identificaron mediante PCR y secuenciación de colonias.
Todos los genes mutados se confirmaron por secuenciación (www.tsingke.net). El producto de PCR de todos los genes mutativos se sometió a digestión doble con BamH I y Sma I y, a continuación, se ligaron al vector de expresión pHT43 u otros plásmidos digeridos con las mismas endonucleasas de restricción. Los productos ligados se transformaron en E. coli DH5a o TOP10. Los clones positivos se identificaron mediante PCR de colonias, que es un método habitual utilizado en biología molecular utilizando la microcolonia como patrón de PCR. Seguidamente, se enviaron 3-5 clones positivos para su secuenciación (www.tsingke.net). Los clones de E. coli identificados con los plásmidos correctos se conservan y utilizan para la extracción de plásmido. Los plásmidos lanzadera recombinantes también se utilizaron posteriormente para su electrotransformación en B. subtilis o B. licheniformis. Los clones positivos se seleccionaron en placas de cloranfenicol. Se seleccionaron 4-8 clones positivos y se inocularon en medio YT 2 x para su expresión. Todas las cepas recombinantes de B. subtilis crecen aeróbicamente a 37 0C en medio YT 2 x. Cuando la OD600 de las cepas recombinantes llega a 0,7-0,8, el cultivo YT 2x se divide en 2 partes. Una parte se induce con IPTG 1 mM y la otra se utiliza como control sin adición de IPTG. Se recogen muestras en puntos temporales distintos para su análisis (t = 2-6 h). Las muestras se recogieron por centrifugación para el análisis con SDS-PAGE.
El maprE se ha expresado con éxito con una banda de 30 kDa en SDS-PAGE (Figura 10). Sin embargo, no se observó expresión de mestA1, mestA2 y mALAB. Los niveles de expresión de mestA1, mestA2 y mALAB fueron demasiado bajos.
Métodos para aumentar los niveles de expresión de proteínas recombinantes sin Phe
Los péptidos del promotor y de la señal de secreción suelen ser importantes para la expresión y secreción de una proteína recombinante. El nivel de expresión aumentó aproximadamente 3 veces al sustituir el promotor Pgrac por sus mutantes y la combinación con el péptido señal de secreción de amyQ (Figura 11, pHT432 contiene el péptido señal amyQ de la a-amilasa de B. amyloliquifaciens y el mutante del promotor Pgrac P250, pHT01 no contiene el péptido señal y utiliza el promotor original de Pgrac).
El nivel de expresión aumentó aproximadamente 3 veces al sustituir el promotor Pgrac por sus mutantes y la combinación con el péptido señal de secreción de amyQ
Digestión de Blapr con pepsina y tripsina
Para el ensayo de digestión con pepsina, se llevaron a ebullición 20 mg de proteína Blapr en 5 ml de solución durante 5 min para simular un proceso de cocción. Después se añadió 1 mg de pepsina en 1 ml de solución a pH 2. La mezcla de reacción se ajustó a pH 2. Después de 2 horas se tomó una muestra para su análisis mediante espectrometría de masas. Blapr se digirió completamente a péptidos pequeños (A, Figura 12)
Para el ensayo de digestión con tripsina, se llevaron a ebullición 20 mg de proteína Blapr en 5 ml de solución durante 5 min para simular un proceso de cocción. Después se añadió 1 mg de tripsina en 1 ml de solución a pH 7. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7. Después de 2 horas, se tomó una muestra para su análisis mediante espectrometría de masas. Blapr se digirió completamente a péptidos pequeños (B, Figura 12)
Ejemplo 2
Producción y purificación de proteína exenta de Phe
1. Obtención de los genes que codifican la proteína exenta de Phe
Se sustituyeron tres restos de Phe (F50, F189, F261) y un resto de Gln (Q19) en aprE de la cepa de Bacillus subtilis CICC10073 por Trp mediante PCR de mutagénesis dirigida estándar o utilizando un Multi-points Mutagenesis Kit (TaKaRa, Japón) dando lugar a 10073aprE-19W50W189W261W (10073aprE-W7). Se sustituyeron cuatro restos de Phe (F21, F50, F188, F260) en apr de la cepa de Bacillus licheniformis CICC10266 por Trp y Tyr mediante PCR de mutagénesis dirigida o con un kit de mutagénesis Multipoint (TaKaRa, Japón), lo que produjo 10266apr-21W50Y188W260W (10266apr-W4). Todos los cebadores de PCR fueron sintetizados por una compañía china (http://www.tianyibiotech.com). Para la mutagénesis dirigida, es un proceso PCR estándar, pero los sitios de mutación deben sustituirse uno a uno. El procedimiento completo incluye las siguientes etapas: amplificar los plásmidos de molde utilizando iniciadores sintéticos, digerir los productos de PCR con la enzima Dpnl, transformar el producto purificado en DH5a o TOP10 de E. coli y enviar 3-5 clones a secuenciar a una empresa de servicios (www.tsingke.net). Para hacer la mutagénesis multipunto simultánea, el proceso se describe en el manual del Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa, Japón). Todos los genes mutantes se confirmaron por secuenciación (www.tsingke.net).
2. Sustitución del gen Knockin 10266apr-W4 en CICC10266 (apr yhfN)
2.1 Cepa hospedadora inicial
Se usó Bacillus licheniformis CICC10266 (APR yhfN) en la construcción de las cepas de producción exentas de Phe para la proteína 10266apr-W4. CICC10266 (apr yhfN) es una proteasa alcalina apr y un derivado de gens defectuosos de la proteasa intracelular yhfN. Se usó Bacillus licheniformis CICC10266 (úapr yhfN) en la construcción de las cepas de producción exentas de Phe para la proteína 10073aprE-W7. CICC10266 (úapr yhfN) es una deleción del gen de la proteasa alcalina y de un derivado defectuoso del gen de la proteasa intracelular yhfN.
2.2 Secuencias de ADN introducidas
Las secuencias de ADN introducidas pueden contener un segmento de ADN cromosómico de B. licheniformis que se encuentra secuencia arriba en 5' del promotor del gen apr, un promotor apr fuerte, el péptido señal de apr, la proteasa alcalina modificada y secuencia abajo en 3' del gen apr. La secuencia génica modificada del gen apr de B. licheniformis y la secuencia de aminoácidos de la proteína madura exenta de Phe se muestran en las Id de sec. n.°: 73-74.
2.3 Construcción de Bacillus licheniformis recombinante con el gen 10266apr-W4
Para desarrollar mejores cepas bacterianas que puedan sobreproducir la proteína exenta de Phe se utilizó el abordaje de generar múltiples copias génicas en el cromosoma de la cepa bacteriana. En la presente invención se utilizaron tres sitios distintos en el cromosoma de B. licheniformis, apr (locus de la proteasa alcalina), xyl (locus de la xilosa isomerasa) y gnt (locus de la gluconato permeasa) como sitios de integración. Para integrar el gen en los tres sitios, se construyeron tres vectores de integración que contenían el gen de la proteasa alcalina de B. licheniformis modificado. El método de integración génica en la presente invención aprovecha el efecto estimulante de la replicación por círculo rodante de plásmidos termosensibles en la recombinación intramolecular. El plásmido pEBKan194-GFP (Figura 13), que de forma natural es sensible a temperaturas superiores a 42 0C, se utiliza para la construcción de diversos vectores knockout y knockin. Los integrantes pueden seleccionarse sobre la base del crecimiento a 42-44 0C.
Construcción de los tres vectores de integración con 10266apr-W4.
En primer lugar se amplificó la secuencia de ADN introducida que contenía el gen 10266apr-W4 y, a continuación, se insertó en tres vectores de integración con los fragmentos génicos del brazo homólogo anterior y posterior de los genes apr, xylA y gntP de B. licheniformis CICC10266 (pEBkan194-GFP-aprFR1, pEBkan194-GFP-XyIFR y pEBkan194-GFP-gntPFR) mediante el kit ClonExpress II One Step Cloning (www.vazvme.com/). respectivamente, dando lugar respectivamente a pEBkan194-GFP-aprFR1-10266apr-W4, pEBkan194-GFP-XyIFR-10266apr-W4, pEBkan194-GFP-gntpFR-10266apr-W4. Los productos se transformaron en E. coli. Los clones que contenían los plásmidos deseados se identificaron mediante PCR de colonias, que es un método habitual utilizado en biología molecular utilizando la microcolonia como patrón de PCR. Después, se enviaron 3-5 clones para su secuenciación (www.tsingke.net). Los clones de E. coli identificados con los plásmidos correctos se conservaron y utilizaron para la extracción de plásmidos. Los plásmidos se utilizaron para la electrotransformación de la cepa de B. licheniformis CICC10266 (APR yhfN). El protocolo de preparación de células de B. licheniformis competentes y la electrotransformación se adoptaron de Xue et al.[1], 1999.
Selección de cepas con el gen 10266apr-W4 integrado
Los clones positivos se seleccionaron en placas de resistencia a kanamicina y fluorescencia verde. Los clones positivos se inocularon en 30 ml de medio LB y se cultivaron a 42-44 °C. Se tomaron muestras cada 8-12 h y se identificó el entrecruzamiento único homólogo entre los vectores integrativos y el genoma de la cepa de B. licheniformis CICC10266 (apr yhfN) mediante PCR y secuenciación de colonias. A continuación, los clones recombinantes de un solo cruce se inocularon posteriormente en 30 ml de medio LB y se cultivaron a 42-44 °C. Se tomaron muestras cada 8-12 h y se sembraron por estría en placas de resistencia a kanamicina y en una placa sin antibiótico. Los clones que mostraron pérdida de resistencia se utilizaron para identificar el entrecruzamiento doble homólogo mediante PCR y secuenciación de colonias. Tras la confirmación se obtuvo una cepa sin marcadores con una copia del gen 10266apr-W4 integrado (10266 (yhfN Aapr::10266apr-W4) que se utilizó como cepa hospedadora para el trabajo posterior para integrar más copias.
Para integrar más copias del gen Blapr-W4, los tres vectores integrantes pueden aplicarse uno a uno. En la presente invención se utilizaron dos cepas integrativas sin marcadores, 10266 (yhfN Aapr::10266apr-W4 xylA::10266ape-W4) y 10266 (yhfN Aapr:: 10266apr-W4 gntP::10266apr-W4), y se obtuvieron dos copias del gen 10266apr-W4 mediante análisis de entrecruzamiento único homólogo y de entrecruzamiento doble como se ha descrito anteriormente. Se generará una cepa con tres copias del gen 10266apr-W4 a partir de cualquiera de las cepas con dos copias.
3. Sustitución del gen Knockin 10073aprE-W7 en CICC10266 (Aapr yhfN)
El proceso completo para la construcción de cepas para expresar 10073aprE-W7 es muy similar al descrito para la expresión de 10266apr-W4. La secuencia de ADN introducida que contenía el gen 10073aprE-W7 se amplificó y se insertó en cuatro vectores knockin con los fragmentos génicos de brazo homólogo ascendente y descendente de apr, xylA, gntP y ywaD de B. licheniformis CICC10266 (pEBkan194-GFP-ydeDLC, pEBkan194-GFP-XyIFR, pEB-kan194-GFP-gntPFR y pEBkan194-GFP-ywaDFR) utilizando el kit ClonExpress II One Step Cloning (www.vazvme.com/). dando lugar a pEBkan194-GFP-aprFR2-10073aprE-W7 (Figura 14), pEBkan194-GFP-XyIFR-10073aprE-W7 (Figura 15), pEBkan194-GFP-gntpFR-10073maprEW7 (Figura 16), pEBkan194-GFP-ywaDFR-10073aprE-W7 (Figura 17). Los clones positivos se identificaron mediante PCR de colonias. Después, se enviaron 3-5 clones positivos para su secuenciación (www.tsingke.net). Los clones de E. coli identificados con los plásmidos correctos se conservaron y utilizaron para la extracción de plásmidos. A continuación se utilizaron los plásmidos se para la electrotransformación de la cepa de B. licheniformis CICC10266 (AapryhfN). El protocolo de preparación de células de B. licheniformis competentes y la electrotransformación se adoptaron de Xue et al.[1], 1999.
Los clones positivos se seleccionaron en placas de resistencia a kanamicina y fluorescencia verde. Los clones positivos se inocularon en 30 ml de medio LB y se cultivaron a 42-44 0C. Se tomaron muestras cada 8-12 h y se identificó el entrecruzamiento único homólogo entre los vectores de sustitución dentro del genoma de la cepa de B. licheniformis CICC10266 (Aapr yhfN) mediante PCR y secuenciación de colonias. A continuación, los clones recombinantes de un solo cruce se inocularon posteriormente en 30 ml de medio LB y se cultivaron a 42-44 0C. Se tomaron muestras cada 8-12 h y se sembraron por veteado en placas de resistencia a kanamicina y una placa sin antibiótico. Los clones que mostraron pérdida de resistencia se utilizaron para identificar el entrecruzamiento doble homólogo mediante PCR y secuenciación de colonias. Por último se obtuvieron cuatro cepas con sustituciones sin marcadores con una copia del gen 10073aprE-W7 (10266 (Aapr yhfN xy/A::10073aprE-W7), 10266 (Aapr yhfN gntP::10073aprE-W7) y 10266 (Aapr yhfN ywaD::10073aprE-W7)) en cada uno de los cuatro sitios, que se utilizaron como cepas hospedadoras para integrar más copias de 10073apr-W7.
Los vectores pEBkan194-GFP-XyIFR-10073aprE-W7 y pEBkan194-GFP-gntpFR-10073maprEW7 se utilizaron a continuación para electrotransformar la cepa 10266 (yhfNAapr:. 10073aprE-W7). Se obtuvieron dos cepas sin marcadores 10266 (yhfNAapr.:10073aprE-W7 xy/A::10073aprE-W7) y 10266 (yhfN Aapr::10073aprE-W7 gntP::10073aprE-W7) mediante análisis de entrecruzamiento único homólogo y de entrecruzamiento doble como se ha descrito anteriormente.
El vector pEBkan194-GFP-ywaDFR-10073aprE-W7 se utilizó a continuación para electrotransformación de la cepa 10266 (yhfNAapr.:10073aprE-W7gntP::10073aprE-W7). Por último se obtuvo una cepa marcadores 10266 (yhfNAapr.:10073aprE-W7gntP::10073aprE-W7ywaü::10073aprE-W7) con tres copias del gen 10073aprE-W7 mediante análisis de entrecruzamiento simple homólogo y de entrecruzamiento doble homólogo como se ha descrito anteriormente.
4. Expresión de 10266apr-W4 y 10073aprE-W7
Todas las cepas recombinantes de copia única y múltiple de los genes 10266apr-W4 y 10073aprE-W7 se utilizaron para expresar la proteína en un matraz con agitación. Los clones positivos se recogieron y se inocularon en 10 ml de medio LB (extracto de levadura 5 g/l, peptona 10 g/l y NaCl 10 g/l). Las cepas recombinantes se cultivaron a 37 °C durante la noche. A continuación se utilizaron 2 ml de este precultivo para inocular 50 ml del medio SC1 (torta de soja en polvo 45 g/l, harina de maíz 40 g/l, extracto de levadura 2,5 g/l, K2HPO4 • 3 H2O 2,85 g/l, NaH2PO4 • 2 H2O 5,85 g/l, CaCl2, 0,2 g/l y desespumante 1 ml/l) en un matraz de 250 ml. Todas las cepas recombinantes de B. licheniformis crecieron aeróbicamente a 37 °C en medio SC durante 24-32 h. Se recogieron muestras en puntos temporales distintos para su análisis (t = 2-6 h). Las muestras se recogieron por centrifugación para el análisis con SDS-PAGE y determinación de la concentración de proteína total (Tabla 3). El contenido de proteína se determinó con un método espectrofotométrico utilizando BSA como patrón[2].
Tabla 3. Expresión de 10073aprE-W7 en el sistema de B. licheniformis.
Figure imgf000036_0001
5. Producción de la proteína exenta de Phe 10266apr-W4
Se utilizó la cepa YRBLS025 (10266 (yhfN ñapr.:10266apr-W4 gntP:: 10266apr-W4)) que contiene dos copias del gen 10266apr-W4 para producir 10266apr-W4 en el fermentador. Esta cepa se sembró por estría sobre medio LB de agar nutritivo a 30 0C durante 7 días y se guardó a 4 0C.
5.1 Fermentación en un fermentador de 5 l
Se seleccionó un único clon de la placa de LB y se inoculó en 10 ml de medio LB. Las cepas recombinantes se cultivaron a 37 0C durante la noche. A continuación se utilizaron 3 ml de este precultivo para inocular 120 ml de medio LB en un matraz de 500 ml y cultivo a 37 0C y 200 rpm. Después de 10-12 h de cultivo, el cultivo de siembra de 120 ml se inoculó en un fermentador de 5 l con 2,5 l de los medios de fermentación SC2 y SC3. Se utilizaron los siguientes medios SC2 y SC3 con las composiciones (concentraciones finales en g/l).
Medio SC2: Torta de soja en polvo 63,6, harina de maíz 56, extracto de levadura 2,5, K2HPO4 • 3 H2O 2,85, NaH2PO4 • 2 H2O 5,85, CaCI2, 0,2 y desespumante 2 ml/l.
Medio SC3: Torta de soja en polvo 79,4, harina de maíz 70,6, extracto de levadura 2,5, K2HPO4 • 3 H2O 2,85, NaH2PO4 • 2 H2O 5,85, CaCI2, 0.2 y desespumante 2 ml/l.
El pH medio se ajustó a 7,5 añadiendo 1 mol/l de solución de NaOH antes de la esterilización. El medio de fermentación SC2 y SC3 se esterilizó en autoclave por separado durante 25 min a 121 0C. El cultivo se llevó a cabo durante 24-36 h a 37 °C con agitación a 200-800 rpm y aireación a 0,4-1 litro min-1 litro-1. El oxígeno disuelto (DO) se controló al 25 % - 60 %. Se recogieron muestras en puntos temporales distintos para su análisis (t = 2-4 h). Las muestras se recogieron por centrifugación para el análisis de SDS-PAGE y determinación de la concentración de proteína total. La 10266apr-W4 se ha expresado correctamente con una banda de 30 kDa en SDS-PAGE (Figura 18). La concentración total de proteínas llegó a 4,44 g/l y 5,19 g/l cuando se utilizaron SC2 y SC3 como medio de fermentación, respectivamente (Tabla 4).
Tabla 4. Producción de 10266aprE-W4 en un fermentador de 5 l con medios SC2 y SC3
Figure imgf000036_0002
5.2 Fermentación en termentador de 50 l
Se seleccionó un único clon de la placa de LB y se inoculó en 10 ml de medio LB. Las cepas recombinantes se cultivaron a 37 0C durante la noche. A continuación se utilizaron 3 ml de este precultivo para inocular 120 ml de medio LB en un matraz de 500 ml y se cultivó a 37 °C y 200 rpm. Después de 10-12 h de cultivo cuando la DO600 estaba en 12-14, los 80 ml del cultivo de siembra se inocularon en un fermentador de 5 l con 2,5 l de medio de fermentación SC1. Después de 8-10 h de cultivo con la DO600 en 15-17, se inocularon 1,5 l de cultivo de siembra en un fermentador de 50 l con 30 l de medio de fermentación SC3.
El pH medio se ajustó a 7,5 añadiendo 1 mol/l de solución de NaOH antes de la esterilización. El medio de fermentación SC2 y SC3 se esterilizó en autoclave por separado durante 25 min a 121 0C. La fermentación se llevó a cabo en un fermentador de 50 litros de laboratorio (Shanghai Baoxing, china) con un volumen de trabajo de 30 litros. El cultivo se llevó a cabo durante 24-36 h a 37 0C con agitación a 200-600 rpm y aireación a 0,4-1 litro min-1 litro-1. El oxígeno disuelto (DO) se controló al 25 % - 60 %. Se recogieron muestras en puntos temporales distintos para su análisis (t = 2-4 h). Las muestras se recogieron por centrifugación para el análisis de SDS-PAGE y determinación de la concentración de proteína total. La 10266apr-W4 se ha expresado con éxito con una banda de 30 kDa en SDS-PAGE (Figura 19). La concentración total de proteínas llegó a 4,91 g/l a las 24 h de cultivo (Tabla 5).
Tabla 5. Producción de 10266aprE-W4 en un termentador de 50 l con medio SC3
Figure imgf000037_0001
5.3 Fermentación en un termentador de 500 l
Se seleccionó un único clon de la placa de LB y se inoculó en 10 ml de medio LB. Las cepas recombinantes se cultivaron a 37 °C durante la noche. A continuación se utilizaron 3 ml de este precultivo para inocular 120 ml de medio LB en un matraz de 500 ml y se cultivó a 37 °C y 200 rpm. Después de 8-10 h de cultivo con la DO600 en 9-12, el cultivo de siembra de 80 ml se inoculó en un fermentador de 2,0 l con medio de fermentación SC1. Después de 6-8 h de cultivo con la DO600 en 12-16, se inoculó 1,0 l de cultivo de siembra en un fermentador de 50 l con 25 l de medio de fermentación SC1. Después de 7-9 h de cultivo con la DO600 en 25-27, se inocularon 20 l de cultivo de siembra en un fermentador de 300 l de medio de fermentación SC3. El pH medio se ajustó a 7,5 añadiendo 1 mol/l de solución de NaOH antes de la esterilización. La fermentación se llevó a cabo en un fermentador de laboratorio 500 litros (Shanghai Baoxing, china) con un volumen de trabajo de 300 l. El cultivo se llevó a cabo durante 24-36 h a 37 0C con agitación a 200-300 rpm y aireación a 0,4-1 litro min-1 litro-1. El oxígeno disuelto (DO) se controló al 20 % - 50 %. Se recogieron muestras en puntos temporales distintos para su análisis (t = 2-4 h). Las muestras se recogieron por centrifugación para el análisis de SDS-PAGE y determinación de la concentración de proteína total. La 10266apr-W4 se ha expresado con éxito con una banda de 30 kDa en SDS-PAGE (Figura 20). La concentración total de proteínas llegó a 3,89 g/l a las 22 h de cultivo (Tabla 6).
Tabla 6. Producción de 10266aprE-W4 en un termentador de 50 l con medio SC3
Tiempo (h) DO600 Proteína Total (g/l)
20 74,2 3,78
22 78,2 3,89
25 83,6 3,51
6. Purificación de proteína exenta de Phe
El proceso de purificación se realizó del siguiente modo: (1) Recoger el caldo de cultivo; (2) Recoger el filtrado utilizando el sistema de filtración de flujo tangencial con membrana cerámica de 0,1 pm o 0 ,2 pm y a continuación añadir la cantidad adecuada de agua pura para lavar el fluido concentrado. El fluido lavado se filtró con el mismo método, se recogió el filtrado y se combinó con el filtrado anterior; (3) Ajustar el pH del filtrado a 1,6 ± 0,15 con HCI 6 M, a continuación se deja reposar 2-4 horas a temperatura ambiente; (4) Desechar el sobrenadante, y bombear la suspensión sólida restante al tanque de almacenamiento del sistema de flujo tangencial con filtración por membrana cerámica de 50-100 nm, y a continuación la suspensión sólida se concentra a una décima parte del volumen inicial; (5) Utilizar el sistema de flujo tangencial con membrana cerámica de 50 nm para llevar su pH a 3,5-6 con agua pura y concentrar aproximadamente a un octavo o una décima parte del volumen inicial; (6 ) Secar este concentrado en un secador por pulverización centrífuga; (7) Envasar asépticamente los productos terminados.
Referencias del Ejemplo 2
[1] Gang-Ping Xue, Jennifer S. Johnson, Brian P. Dalrymple. High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis, Journal of Microbiological Methods, 1999, 34(3):183-191.
[2] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72:248-254.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Una proteína recombinante exenta de Phe, en donde la proteína se selecciona de secuencias que tienen al menos 85 % de identidad de secuencia con la Id de sec. n.°: 12 y en donde toda la Phe ha sido sustituida por un LNAA seleccionado de Tyr, Trp, Thr, Ile, Leu, Val, Met o His.
  2. 2. La proteína recombinante exenta de Phe según la reivindicación 1, en donde la proteína se selecciona de secuencias que tienen al menos 95 % de identidad de secuencia con la Id de sec. n.° 12 y en donde toda la Phe se ha sustituido por un LNAA seleccionado de Tyr, Trp, Thr, Ile, Leu, Val, Met o His.
  3. 3. La proteína recombinante exenta de Phe según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con las Id de sec. n.° 28-29 o la Id de sec. n.° 76.
  4. 4. La proteína recombinante exenta de Phe según la reivindicación 3 que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con las Id de sec. n.° 28-30 o la Id de sec. n.° 76.
  5. 5. Una proteína recombinante exenta de Phe que tiene 100 % de identidad de secuencia con las Id de sec.
    n.° 28-30 o la Id de sec. n.° 76.
  6. 6. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5.
  7. 7. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
  8. 8. El vector según la reivindicación 7, en donde el vector se selecciona del grupo que consiste en la Id de sec. n.° 15 (pHT01), Id de sec. n.° 16 (pHT43), Id de sec. n.° 17 (pHT100), Id de sec. n.° 18 (pHT223), Id de sec. n.° 19 (pHT250), Id de sec. n.° 20 (pHT431), Id de sec. n.° 21 (pHT432) e Id de sec. n.° 22 (pHT433).
  9. 9. Un microorganismo recombinante que comprende el vector de la reivindicación 7 u 8, en donde el microorganismo recombinante es B. licheniformis.
  10. 10. El microorganismo recombinante según la reivindicación 9, que es B. licheniformis CICC10266.
  11. 11. Un alimento medicinal que comprende una proteína recombinante exenta de Phe como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
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