ES2896012T3 - Sistema para suministro de componentes médicos a los pulmones - Google Patents

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Abstract

Un sistema de suministro para su uso en medicina que comprende una microburbuja llena de gas, una pluralidad de nanopartículas y al menos un componente médico asociado con una o más de las nanopartículas para el suministro del componente médico a un tejido diana que es un pulmón, tejido de un aparato respiratorio y/o un tejido cercano, en el que el sistema de suministro se administra en la circulación sanguínea, y el suministro de las nanopartículas y el componente médico al tejido diana es sin ultrasonido enfocado.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema para suministro de componentes médicos a los pulmones
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere en general a formulaciones farmacéuticas. En particular, la presente invención se refiere a un nuevo sistema de suministro para suministro de componentes médicos a los pulmones, con una alta carga de fármaco y su utilidad en los campos de la formulación farmacéutica, la administración de fármacos, la medicina y el diagnóstico.
Antecedentes
Los pulmones están localizados en el tórax y están construidos como un sistema de conductos que se dividen más de 20 veces y terminan en el tejido pulmonar. El tejido pulmonar está construido como un sistema de sacos (alvéolos) llenos de aire. Los alvéolos están rodeados de capilares. Cuando una persona inspira, el oxígeno pasa de los alvéolos a los capilares circundantes y hacia la circulación sanguínea. Al mismo tiempo, el dióxido de carbono pasa de la circulación sanguínea a los capilares y hacia los alvéolos. Por tanto, la función de los pulmones en el aparato respiratorio es extraer oxígeno de la atmósfera y transferirlo hacia la circulación sanguínea, y liberar dióxido de carbono de la circulación sanguínea hacia la atmósfera, en un proceso de intercambio de gases. Los pulmones son parte de un aparato complejo, que se expande y relaja miles de veces al día. Las vías respiratorias centrales están estabilizadas por tejido cartilaginoso y las vías respiratorias más distales contienen músculos lisos y tejido elástico.
Las neumopatías son algunas de las afecciones médicas más comunes del mundo. Las enfermedades localizadas en los pulmones pueden ser tanto discapacitantes como mortales y se pueden beneficiar del suministro de fármaco directamente al pulmón. El tabaquismo, las infecciones y la genética son responsables de la mayoría de las neumopatías. La neumopatía puede resultar de problemas en cualquier parte del aparato respiratorio.
Existen tres tipos principales de neumopatías; 1) enfermedades de las vías respiratorias que afectan a los conductos (bronquios), 2) enfermedades del tejido pulmonar que afectan a la estructura del tejido pulmonar y 3) enfermedades de la circulación pulmonar que afectan a los vasos sanguíneos de los pulmones.
Las neumopatías más comunes incluyen inflamaciones agudas tales como bronquitis (en las vías respiratorias) y neumonía (tejido pulmonar), inflamaciones crónicas tales como asma (en las vías respiratorias) y neumopatía fibrótica (tejido pulmonar), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, edema pulmonar, neumotórax, embolia pulmonar y cáncer de pulmón.
El cáncer de pulmón es el tipo de cáncer más letal y representó aproximadamente 1,59 millones de muertes en todo el mundo en 2012. En Noruega, aproximadamente un 20 % de las muertes relacionadas con el cáncer se provocan por el cáncer de pulmón. La mayoría de los cánceres de pulmón primarios son carcinomas, localizados principalmente en las vías respiratorias, y los dos tipos principales son el carcinoma de pulmón microcítico (CPM) y el carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM). Si bien es conocido que el CPM remite con quimioterapia y radioterapia, los tratamientos estándar para el CPNM incluyen cirugía, quimioterapia, radiación, láser y tratamiento fotodinámico. Las tasas de éxito de los diversos tratamientos dependen del tipo de cáncer, el estadio (grado de diseminación) y la salud global de la persona. Aunque ha mejorado en los últimos años, el pronóstico para los pacientes con cáncer de pulmón es todavía desfavorable.
La quimioterapia se puede definir como el tratamiento del cáncer con uno o más fármacos antineoplásicos citotóxicos (agentes quimioterápicos) como parte de un tratamiento estandarizado. El término engloba una variedad de fármacos, que se dividen en amplias categorías, tales como agentes alquilantes y antimetabolitos. Los agentes quimioterápicos tradicionales actúan destruyendo las células que se dividen rápidamente, una propiedad fundamental de la mayoría de las células cancerosas. Esto se logra alterando la mitosis (división celular) o la síntesis de ADN.
Los agentes quimioterápicos se administran más a menudo por vía parenteral. Con la quimioterapia parenteral tradicional, típicamente solo un 0,001-0,01 % de la dosis inyectada llega al tumor. Lamentablemente, muchos fármacos de quimioterapia actuales tienen una toxicidad excesiva para los tejidos sanos y una capacidad limitada para prevenir metástasis. Como la quimioterapia tradicional no tiene una eficacia suficientemente alta en comparación con los efectos secundarios graves, las dosificaciones se limitan a menudo a lo subóptimo, lo que dificulta mucho el tratamiento de los tumores en los pulmones.
El uso de la nanotecnología en medicina ofrece muchas posibilidades. Dos áreas en las que el uso de la nanotecnología ha comenzado a demostrar un valor particular son la administración de fármacos y la formación de imágenes moleculares. Las nanopartículas (NP) para el suministro de componentes médicos tienen el potencial de sortear muchas dificultades asociadas con los enfoques de suministro tradicionales, incluyendo los efectos secundarios adversos y la baja eficacia debido a la distribución biológica no específica. Como tal, se muestra que las NP como portadores de fármacos antineoplásicos ofrecen un gran potencial. Sin embargo, puesto que la absorción de NP en tumores a menudo es insuficiente y la distribución es heterogénea, los sistemas para potenciar el suministro de NP son de gran interés. Como se demostró por Afadzi et al. (1) y Eggen et al. (2) se muestra que el ultrasonido potencia el suministro de NP a tumores sólidos. También se ha propuesto que las microburbujas (MB) disponibles comercialmente se pueden utilizar con ultrasonido para potenciar la absorción de fármaco en los tejidos. Incluso, además, Eggen et al. (3) (J Control Release. 10 de agosto de 2014;187:39-49. doi: 10.1016) ha propuesto el uso de ultrasonido en conexión con MB estabilizadoras de NP. Sin embargo, toda esta técnica anterior utiliza ultrasonido para potenciar la absorción del componente médico y el ultrasonido tiene un efecto limitado en el tejido pulmonar debido a que el ultrasonido se refleja en la interfase aire-tejido y, de este modo, tiene una penetración tisular muy limitada en los pulmones.
En el documento US 9421194B2, se divulga un sistema de suministro de fármacos doble dirigido al pulmón que comprende una micropartícula de gel y nanopartículas. Este sistema depende de que la administración intravenosa de partículas de un tamaño particular queden atrapadas en los lechos capilares de los pulmones. Otro sistema se describe en Xu et al. (4), que describe una partícula de tamaño de un micrómetro discoidal que se puede cargar con tratamientos quimioterápicos. El documento US 2010/0074927 divulga una composición para el suministro dirigido de un agente antiproliferativo al sitio de un tumor. La composición comprende microburbujas llenas de gas como vehículo para el agente terapéutico.
Todavía existe una necesidad de sistemas de suministro alternativos y flexibles dirigidos específicamente a los pulmones para potenciar la cantidad de fármaco para alcanzar su patología diana en el tejido pulmonar, mitigando las desventajas encontradas en la técnica anterior. Preferentemente, dichos sistemas de suministro también limitarán la toxicidad hacia el tejido sano.
Sumario de la invención
Los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que el suministro de componentes médicos a los pulmones y al tejido pulmonar se puede lograr usando un sistema de suministro que comprende microburbujas (MB) llenas de gas, una pluralidad de nanopartículas (NP) y al menos un componente médico asociado con una o más de las NP.
El sistema de suministro no usa ultrasonido para ayudar a la liberación y absorción de NP en el tejido diana.
La presente invención proporciona un sistema de suministro, un procedimiento de preparación de un sistema de suministro, el uso del sistema de suministro en medicina y la composición que comprende el sistema de suministro.
Específicamente, la presente invención proporciona los siguientes aspectos:
En un primer aspecto, la invención proporciona un sistema de suministro para su uso en medicina que comprende una microburbuja llena de gas, una pluralidad de NP, en el que al menos una de las NP está cargada con al menos un componente médico, para el suministro del componente médico a un tejido diana que es un pulmón, un tejido de un aparato respiratorio y/o un tejido cercano, tal como un tejido en las proximidades del aparato respiratorio, tal como un tejido cartilaginoso, un tejido muscular liso y/o un tejido elástico en las proximidades de las vías respiratorias.
En un modo de realización preferente, el suministro de las nanopartículas y el componente médico al tejido diana se realiza sin usar ultrasonido, tal como ultrasonido enfocado.
En un modo de realización, el uso médico es para el diagnóstico o tratamiento de neumopatía.
En un modo de realización, la pluralidad de nanopartículas está asociada con la microburbuja llena de gas, tal como asociada a la superficie. Como se describe en el presente documento, la pluralidad de nanopartículas asociada con las microburbujas llenas de gas puede estabilizar las microburbujas.
En otro modo de realización, el sistema de suministro puede comprender además al menos una nanopartícula libre y al menos un componente médico asociado con la al menos una nanopartícula libre.
En otro modo de realización de la invención, al menos una de la pluralidad de nanopartículas se recubre con polietilenglicol (PEG).
Aún en otro modo de realización, al menos una de la pluralidad de nanopartículas comprende además al menos un agente dirigido.
En un modo de realización, el sistema de suministro comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro modo de realización describe un sistema de suministro en el que la microburbuja llena de gas comprende un gas seleccionado del grupo que consiste en: perfluorocarbono (PFC), aire, gases nobles, gases de fluoruro sulfúrico, tales como gas hexafluoruro de azufre (SFa), halógenos o componentes del aire, tales como nitrógeno (N2), oxígeno (O2), argón (Ar), dióxido de carbono (CO2), helio (He), neón (Ne) y metano (CH4).
En un modo de realización, el gas es PFC. En otro modo de realización, el gas es aire o componentes del aire. Aún en otro modo de realización, el gas es gas hexafluoruro de azufre (SF6). En otro modo de realización, el gas no es PFC.
En otro modo de realización, las microburbujas llenas de gas comprenden además un compuesto tensioactivo, tal como caseína o seroalbúmina.
Aún en otro modo de realización, el sistema de suministro comprende además un agente modificador. En un modo de realización preferente, el agente modificador es urea.
Un modo de realización del sistema de suministro es un sistema como se describe, en el que el diámetro medio de las microburbujas llenas de gas asociadas con las nanopartículas está en el intervalo de 0,5 a 30 pm.
En otro modo de realización del sistema de suministro de acuerdo con la invención, el componente médico se selecciona del grupo que consiste en: fármacos citotóxicos/citostáticos, antibióticos, agentes que disuelven la mucosidad (mucolíticos), fármacos antiinflamatorios, un fármaco terapéutico pulmonar, agentes respiratorios, fármacos inmunoterápicos, agentes modificadores de genes, quimiopotenciadores, agentes de diagnóstico, agentes de contraste.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un sistema de suministro que comprende una microburbuja llena de gas, una pluralidad de NP, en el que al menos una de las NP se carga con al menos un componente médico, para el suministro del componente médico a un pulmón y/o un tejido cercano, tal como tejido en las proximidades de un pulmón, tal como tejido cartilaginoso, tejido muscular liso y tejido elástico en las proximidades de las vías respiratorias, y en el que la pluralidad de nanopartículas son nanopartículas libres.
En un modo de realización de acuerdo con este aspecto, la pluralidad de nanopartículas se puede recubrir con polietilenglicol (PEG).
En otro modo de realización de este aspecto, al menos una de la pluralidad de nanopartículas comprende además al menos un agente dirigido.
El sistema de suministro de acuerdo con este aspecto puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro modo de realización de acuerdo con este aspecto, la microburbuja llena de gas comprende un gas seleccionado del grupo que consiste en: perfluorocarbono, aire, gases nobles, gases de fluoruro sulfúrico, tales como gas hexafluoruro de azufre (SFa), halógenos o componentes del aire, tales como nitrógeno (N2), oxígeno (O2), argón (Ar), dióxido de carbono (CO2), helio (He), neón (Ne) y metano (CH4).
En un modo de realización, el gas es PFC. En otro modo de realización, el gas es aire o componentes del aire. Aún en otro modo de realización, el gas es gas hexafluoruro de azufre (SFa). En otro modo de realización, el gas no es PFC.
Aún en otro modo de realización, la microburbuja llena de gas comprende además un compuesto tensioactivo, tal como caseína o seroalbúmina.
En un modo de realización particular, la microburbuja llena de gas es una microburbuja con nanopartículas asociadas en la superficie.
Aún en otro modo de realización, el sistema de suministro comprende además un agente modificador. En un modo de realización preferente, el agente modificador es urea.
En un modo de realización de la invención de acuerdo con este aspecto, el diámetro medio de las microburbujas llenas de gas asociadas con nanopartículas está en el intervalo de 0,5 a 30 pm.
En otro modo de realización, el componente médico se selecciona del grupo que consiste en: fármacos citotóxicos/citostáticos, antibióticos, agentes que disuelven la mucosidad (mucolíticos), fármacos antiinflamatorios, un fármaco terapéutico pulmonar, agentes respiratorios, quimiopotenciadores, agentes de diagnóstico, agentes de contraste.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar un sistema de suministro de fármacos de acuerdo con el primer y segundo aspecto de la invención, que comprende las etapas de:
a. Sintetizar las nanopartículas que se van a cargar con el componente médico.
b. Añadir nanopartículas a una solución que comprende una sustancia tensioactiva.
c. Añadir gas a la solución
d. Mezclar la solución para obtener microburbujas llenas de gas.
En un modo de realización de acuerdo con este aspecto, la solución en c) se mezcla de 2 segundos a 60 minutos, preferentemente de 1 a 10 minutos.
En otro modo de realización de este aspecto, la solución en c) se mezcla agitando a de 500 a 50000 rpm, preferentemente de 1000 a 30000 rpm.
Aún en otro modo de realización, la sustancia tensioactiva en b) es suero o proteína o lípido o tensioactivo.
En un cuarto aspecto de la invención, el sistema de suministro, de acuerdo con cualquiera del primer y segundo aspecto de la invención, es para su uso en medicina por suministro del componente médico a un pulmón y/o un aparato respiratorio y/o un tejido cercano, tal como tejido cartilaginoso, músculos lisos y tejido elástico de las vías respiratorias. Diferentes modos de realización de acuerdo con este aspecto describen el uso de la invención para el diagnóstico de una neumopatía o para el tratamiento de una neumopatía. En diferentes modos de realización, la neumopatía es cualquier enfermedad que afecte a los pulmones o al aparato respiratorio, tales como 1) enfermedades de vías respiratorias que afectan a los conductos (bronquios), 2) enfermedades de tejido pulmonar que afectan a la estructura del tejido pulmonar y 3) enfermedades de circulación pulmonar que afectan a los vasos sanguíneos de los pulmones. La neumopatía puede ser en diferentes modos de realización inflamaciones agudas tales como bronquitis (en las vías respiratorias) y neumonía (tejido pulmonar), inflamaciones crónicas tales como asma (en las vías respiratorias) y neumopatía fibrótica (tejido pulmonar), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, edema pulmonar, neumotórax, embolia pulmonar y cáncer de pulmón.
En un modo de realización, el sistema de suministro de acuerdo con los diferentes aspectos es para administración parental, tal como para inyecciones, administración intravenosa o intraarterial.
En un modo de realización particular, el sistema de suministro es para suministro dirigido a los pulmones.
También se describen procedimientos de tratamiento o diagnóstico de una neumopatía que comprenden administrar un sistema de suministro de acuerdo con las reivindicaciones 1-20 a un paciente que lo necesite.
Como se entenderá por el experto en la técnica, cada modo de realización y aspecto relacionados con el uso médico de la presente invención como se describe en el presente documento es igualmente aplicable para el procedimiento de tratamiento o diagnóstico de neumopatía en un paciente.
En un último aspecto, se proporciona una composición o solución que comprende el sistema de suministro de acuerdo con el primer y el segundo aspecto de la invención. La composición o solución puede ser una formulación farmacéutica que comprende excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: biodistribución de NP de PACA (control sin MB). 1-5: pulmón, hígado, bazo, riñón y corazón.
Figura 2: biodistribución de NP de PFC-MB 30 min después de la inyección. 1-5: pulmones, hígado, bazo, riñón, corazón.
Figura 3: biodistribución de NP de aire-MB 30 min después de las inyecciones. 1-5: pulmones, hígado, bazo, riñón, corazón.
Figura 4: pulmones de animales a los que se les inyectó; 1) NP de aire-MB, 2) NP, 3) NP de PFC-MB.
Figura 5. Biodistribución de NP lipídicas llenas de aire-MP 30 min después de la inyección. 1-4: pulmones, hígado, bazo, riñón.
Figura 6: biodistribución de NP de aire y PACA-MB después de 1 h (A) y 2 h (B). 1-3: pulmón, hígado, bazo.
Figura 7: pulmones de animales a los que se les inyectó A) NP de PFC-MB, B) NP de PFC y urea-MB C) NP de SFa-MB.
Definiciones
Como se usa en el presente documento, la frase "al menos uno" seguida de una lista de dos o más elementos, tal como "A, B o C", significa uno cualquiera individual de A, B o C, así como cualquier combinación de los mismos.
El término "microburbujas (MB)" se refiere a vesículas que se caracterizan en general por la presencia de una o más cubiertas, paredes o membranas que rodean un vacío interno que se llena con un gas o precursor del mismo. Tienen un diámetro típicamente en el intervalo de 1 a 10 pm, o más típicamente de 1 a 6 pm.
Como se usa en el presente documento, el término "nanopartículas (NP)" describe partículas de cualquier forma con dimensiones en el intervalo de 1 nm y 1000 nm, típicamente por debajo de 800 nm, más típicamente por debajo de 500, 400, 300 o 200 nm. En un modo de realización, las NP como se usa en el presente documento son típicamente de 70 a 200 nm. Típicamente, las NP son esféricas.
El término "asociado con" como se usa en el presente documento en relación con microburbujas y nanopartículas, pretende describir la interacción entre microburbujas y nanopartículas. Las interacciones pueden incluir enlaces químicos provocados por la fuerza de atracción electrostática entre átomos con cargas opuestas, o a través de compartir electrones como en los enlaces covalentes. Los enlaces químicos pueden ser tanto "enlaces fuertes" tales como enlaces covalentes o iónicos como "enlaces débiles" tales como diferentes fuerzas de van der Waals, interacción dipolo-dipolo, la fuerza de dispersión de London y/o enlace de hidrógeno.
El término "componente médico", como se usa en el presente documento, pretende incluir agentes tanto de diagnóstico como terapéuticos y teranóstica, una combinación de terapéutica y diagnóstico. Los ejemplos de agentes terapéuticos para el tratamiento de neumopatías son agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, beta-agonistas, corticosteroides, agentes quimioterápicos, quimiopotenciadores, etc. El término "diagnóstico" o "agente de diagnóstico" usado en el presente documento es cualquier resto químico que se puede usar para el diagnóstico o la formación de imágenes de un paciente. Los ejemplos de agentes de diagnóstico son agentes de formación de imágenes tales como tintes fluorescentes y formación de imágenes por resonancia magnética.
El suministro de fármaco dirigido es un procedimiento para suministrar medicamentos a un paciente de una manera que incremente la concentración del medicamento en algunas partes del cuerpo en relación con otras. Como se usa en el presente documento, "suministro dirigido" o "suministro que se dirige" se refiere al mecanismo por el que un sistema de suministro se transporta a su destino apropiado. La direccionalidad pasiva se basa en la longevidad del vehículo farmacéutico en la sangre y su acumulación en sitios patológicos con vasculatura afectada. En la direccionalidad pasiva, el éxito del fármaco está directamente relacionado con el tiempo de circulación. La direccionalidad activa se basa en la unión de restos dirigidos específicos a la superficie de vehículos farmacéuticos para reconocer y unir células patológicas. La direccionalidad activa de NP se puede usar en combinación con la direccionalidad pasiva para potenciar los efectos de la direccionalidad pasiva al hacer que la NP sea más específica para un sitio diana.
Como se usa en el presente documento, "resto(s) dirigido(s)" se refiere a cualquier resto adecuado que se dirige a o provoca que la partícula se localice en localizaciones específicas dentro de un sujeto. El resto dirigido puede ser un resto que contiene un grupo funcional que puede reaccionar con el extremo opuesto al extremo del grupo amino del polialquilenglicol de las NP. Los grupos funcionales adecuados son los que pueden formar un enlace covalente con un polialquilenglicol, tal como amino, hidroxi, acida, alquino y tio. La conjugación de un resto dirigido a un polialquilenglicol se puede realizar por cualquier procedimiento usado de forma rutinaria en la técnica, tal como química "clic". Se debe apreciar que se puede usar un único resto dirigido o una mezcla de diferentes restos dirigidos. Los ejemplos de restos dirigidos se seleccionan del grupo que consiste en un aminoácido, proteína, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, sacárido, carbohidrato, glucano, citocina, quimiocina, nucleótido, lectina, lípido, receptor, esteroide, neurotransmisor, marcador de superficie celular, antígeno de cáncer, antígeno de glucoproteína, aptámero o mezclas de los mismos. Los restos dirigidos en particular preferentes incluyen péptidos lineales y cíclicos.
Como se usa en el presente documento, "tejido diana" se refiere a un tejido o a un órgano sobre el que un componente médico ejerce su acción; en general, un tejido o un órgano que se beneficiará de recibir el componente médico. De acuerdo con la invención, el tejido diana es un pulmón, un tejido del aparato respiratorio y/o un tejido cercano, tal como un tejido en las proximidades del aparato respiratorio, tal como un tejido cartilaginoso, un tejido muscular liso y/o un tejido elástico en las proximidades de las vías respiratorias, a todos los que se pueden dirigir apropiadamente por la direccionalidad pasiva y/o bien activa del sistema de suministro.
"Compuesto tensioactivo" y "agente estabilizador" se usan de manera intercambiable y se refieren a compuestos tales como proteínas, polímeros, lípidos y/o tensioactivos. Los ejemplos de compuestos tensioactivos adecuados son polisorbato (Tween), albúmina, caseína y fosfolípidos. El compuesto tensioactivo se añade al sistema de suministro de la invención para estabilizar las microburbujas llenas de gas.
Como se usa en el presente documento, "agente modificador" se refiere a agentes que pueden modificar la superficie de las microburbujas, para promover además una asociación estable entre las microburbujas y las nanopartículas. Esto se puede lograr modificando la interacción entre los compuestos tensioactivos y las nanopartículas. El agente modificador puede formar complejos o retículas entre las MB y las NP y, por consiguiente, incrementar la estabilidad del sistema de suministro.
El término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en el presente documento indica que el sistema o composición es adecuado para su administración a un sujeto, incluyendo un paciente humano, para lograr los tratamientos descritos en el presente documento, sin efectos secundarios indebidamente perjudiciales en vista de la gravedad de la enfermedad y la necesidad del tratamiento.
Como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "que trata" y "tratamiento" se usan como sinónimos para referirse a cualquier acción que proporciona un beneficio a un paciente en riesgo de o aquejado por una enfermedad, incluyendo la mejora de la afección a través de la disminución, inhibición, supresión o eliminación de al menos un síntoma, retraso en la progresión de la enfermedad, prevención, retraso o inhibición de la probabilidad de aparición de la enfermedad, etc.
Descripción detallada
Las NP como portadores de componentes médicos son una solución prometedora para el tratamiento de enfermedades, ya que pueden proporcionar un tratamiento más local y dirigido. Sin embargo, las NP como portadores no están exentas de dificultades. Una de las principales dificultades del uso de NP es lograr concentraciones suficientemente altas de NP en el sitio diana. Como solución a este problema, los autores de la invención han descubierto que, administrando las NP con MB, se puede lograr una concentración mucho mayor de NP en el sitio diana que si se administran las NP por sí mismas. Una pluralidad de NP puede estar comprendida en un sistema de suministro con MB, junto con las MB en una solución o bien directamente asociadas con las MB. Al cargar además cada NP con un componente médico deseado, la cantidad de componentes médicos suministrados al sitio diana se potencia enormemente.
Otra dificultad con el uso de NP como portadores es que la mayoría de las NP libres en la circulación sanguínea a menudo terminan en el hígado y el bazo. Sin embargo, los autores de la invención han descubierto que esto también se puede abordar por un sistema de suministro que comprenda tanto NP como MB. Previamente, se ha usado un sistema de suministro que comprende NP y MB con ultrasonido enfocado para dirigirse a sitios específicos de la enfermedad. Estas MB están desarrolladas para garantizar un tiempo de circulación prolongado y una afinidad no específica de órgano. Sorprendentemente, los autores de la invención han descubierto ahora que un sistema de suministro que comprende NP y MB llenas de gas crea un sistema optimizado para suministro dirigido de fármacos a los pulmones, debido al descubrimiento de que las MB tienen tendencia a acumularse en los pulmones.
En consecuencia, el resultado de la presente invención es un sistema de suministro mejorado, donde se suministran a los pulmones componentes médicos para el diagnóstico y/o el tratamiento de enfermedades relacionadas con el aparato respiratorio. Una ventaja de la invención es que es independiente del ultrasonido usado previamente para dirigir los fármacos de suministro asociados con las mB.
En un primer aspecto, la invención es un sistema de suministro para su uso en medicina que comprende MB llenas de gas, una pluralidad de NP y uno o más componentes médicos para suministro dirigido a los pulmones y/o al tejido pertinente del aparato respiratorio.
Las MB aplicables en el sistema de acuerdo con la invención pueden ser cualquier microburbuja de contraste disponible comercialmente, tal como Albunex (GE Healthcare), Optison (GE Healthcare), Sonazoid (Ge Healthcare), Sonovue (Bracco) u otras MB de contraste habituales conocidas por el experto en la técnica. En un modo de realización de la invención, las MB comprendidas en el sistema de suministro son MB con una cubierta de NP asociadas a la superficie. Dichas MB se producen en una solución de NP, como se describe en el presente documento. Una ventaja de este modo de realización es el efecto estabilizador de las NP asociadas en la superficie de las MB.
En un modo de realización, las MB de acuerdo con la invención pueden ser MB llenas de gas, llenas con un gas o un precursor del mismo. En modos de realización preferentes, el gas comprende perfluorocarbonos o gases de fluoruro sulfúrico o halógenos o aire o cualquier gas conocido que es componente del aire, tal como, pero sin limitarse a, nitrógeno (N2), oxígeno (O2), argón (Ar), dióxido de carbono (CO2), helio (He), neón (Ne) y metano (CH4).
Sin estar ligado a ninguna teoría, la solubilidad del gas comprendido en las MB puede influir en la capacidad de las MB para circular en la sangre y la capacidad para acumularse en el aparato respiratorio. Por ejemplo, los estudios han demostrado que las MB que están llenas de gases PFC tienen un tiempo de circulación prolongado. Esto se puede deber a la baja solubilidad de los PFC en sangre.
En un modo de realización, el gas es PFC. En otro modo de realización, el gas no es PFC. En otro modo de realización, el gas es aire o cualquier gas conocido que es componente del aire. Aún en otro modo de realización, el gas es un gas fluoruro sulfúrico, preferentemente gas hexafluoruro de azufre (SFa).
Las MB disponibles comercialmente consisten en una suspensión de MB gaseosas estabilizadas por una cubierta de lípidos y/o proteínas y/u otros tensioactivos. En consecuencia, en un modo de realización de la invención, las MB se preparan opcionalmente con la adición de un compuesto tensioactivo. Los componentes tensioactivos pueden ser proteínas, polímeros, lípidos o tensioactivos. La función de dicho compuesto tensioactivo es estabilizar la microburbuja. Si el compuesto tensioactivo es una proteína, los modos de realización preferentes son albúmina o caseína. Si el compuesto tensioactivo es un lípido, un modo de realización preferente es un fosfolípido. Opcionalmente, las MB también pueden contener agentes estabilizadores y excipientes adicionales, tales como colesterol o polioxietileno-polioxipropileno. Con respecto a las MB de albúmina, estas MB se pueden derivar de seroalbúmina humana o bovina (HSA o BSA) o de otras fuentes de albúmina biocompatible adecuadas, incluyendo albúmina sintética o sintetizada.
El sistema de suministro de acuerdo con la invención comprende una pluralidad de NP. Las NP aplicables en el sistema de suministro pueden ser cualquier NP que pueda cargar un componente médico, tal como agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos. Las NP se usan como vehículos de suministro, en consecuencia, en el sistema de acuerdo con la invención son aplicables una variedad de sistemas de nanopartículas. Estos incluyen micelas poliméricas, polímeros, liposomas, lipoproteínas de baja densidad, NP lipídicas sólidas, dendrímeros, complejos poliméricos de fármacos hidrófilos, NP cerámicas y otras NP conocidas por el experto en la técnica. Las NP como se describe en Kumari et al., 2010 son aplicables en un sistema de acuerdo con la invención.
Opcionalmente, el sistema de suministro de acuerdo con la invención puede comprender además un agente modificador. La función del agente modificador es modificar la interacción entre los componentes del sistema de suministro. El agente modificador puede formar complejos o retículas entre las microburbujas y/o los compuestos tensioactivos y las nanopartículas y, por consiguiente, incrementar la estabilidad del sistema de suministro. En un modo de realización, el agente modificador introduce interacciones entre el compuesto tensioactivo y las nanopartículas. En un modo de realización particular, el agente modificador es urea. En un modo de realización preferente, el sistema de suministro comprende una proteína, preferentemente caseína, como compuesto tensioactivo y urea como agente modificador. La urea (H2N-CO-NH2) es conocida como desnaturalizante de proteínas. Es altamente polar y, por lo tanto, interfiere con los enlaces de hidrógeno implicados en el plegamiento de proteínas. La capacidad de la urea para formar enlaces de hidrógeno es bien conocida. Esto se ha atribuido al carácter positivo del átomo de hidrógeno enlazado covalentemente al átomo de nitrógeno fuertemente electronegativo del grupo amino de la molécula de urea. La urea también puede formar un complejo con grupos ácidos en la superficie de la NP y modificar la hidrofilia de las NP.
En un modo de realización de la invención, en el que el sistema de suministro comprende un compuesto tensioactivo que es una proteína y un agente modificador que es urea, se potencia la cantidad de compuesto médico suministrado al tejido diana. Al introducir interacciones más fuertes entre los compuestos tensioactivos y las NP, la urea dará como resultado MB más estables. En consecuencia, la función de la urea es modificar la hidrofobia y/o la hidrofilia de las MB y/o las NP comprendidas en el sistema de suministro. Como se entenderá por un experto en la técnica, son aplicables diferentes agentes modificadores. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que la modificación de las MB, el compuesto tensioactivo y/o las NP potenciará la estabilidad de la asociación entre las MB y las NP en el sistema de suministro. A medida que se potencia la asociación entre una MB y las NP, el número de NP que llegan al tejido pulmonar diana será mayor, posibilitando de este modo que una mayor cantidad de componente médico alcance el tejido diana. Esto se ha demostrado en el ejemplo 4 (véase la figura 7).
En un modo de realización, las NP como se describe en el presente documento pueden ser NP poliméricas que comprenden polímeros biodegradables tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y poli(cianoacrilato de alquilo)(PACA). Los PACA son conocidos por el experto en la técnica y pueden ser como se describe en el documento WO2014/191502 A1, tanto con como sin restos dirigidos.
Los PACA se introdujeron por primera vez en el campo médico como pegamento quirúrgico, pero se han estudiado ampliamente como material para vehículos de suministro de fármaco. Las NP de PACA se pueden preparar fácilmente por polimerización in situ de monómeros de cianoacrilato de alquilo que encapsulan una amplia gama de fármacos con alta capacidad de carga. Como los monómeros son hidrófobos, los PACA son especialmente adecuados para encapsular fármacos lipófilos, mejorando de este modo el suministro de fármacos poco solubles en sangre. La flexibilidad del sistema de nanopartículas de PACA permite un buen control y diseño de las propiedades de uso final. El tamaño y la tasa de degradación se pueden regular y la superficie funcionalizar, lo que permite tanto tiempos de circulación prolongados como suministro dirigido.
En un modo de realización, el procedimiento de preparación de NP de PACA incluye personalizar la superficie de NP introduciendo polímeros hidrófilos e incorporando componentes médicos, tales como fármacos y agentes de contraste para diversas modalidades de formación de imágenes. En consecuencia, este modo de realización del sistema de suministro constituye un sistema altamente versátil y flexible, lo que permite el suministro de diferentes componentes médicos a los pulmones, por ejemplo, el aparato respiratorio y el tejido contiguo.
En otro modo de realización de la invención, al menos una de las NP es una NP basada en lípidos. Las NP basadas en lípidos aplicables en el sistema de acuerdo con la invención pueden ser portadores lipídicos nanoestructurados (NLC), tales como compuestas por, por ejemplo, ácido esteárico y palmitato de isopropilo. Dichas NP basadas en lípidos ofrecen flexibilidad con respecto al núcleo lipídico (sólido y líquido) así como a los ligandos estabilizadores. Esto posibilita la adaptación a entornos fisicoquímicos específicos y compatibilidad con fármacos. Las partículas se pueden cubrir con polímeros hidrófilos haciéndolas dispersables en agua y no agregadas en tampón y medios biológicos. Además, la superficie de la partícula se puede opcionalmente funcionalizar además con restos dirigidos, tales como con ligandos u otras moléculas de interés. Esto ofrece la posibilidad de una direccionalidad activa a células específicas.
Aún en otro modo de realización, las NP se recubren con polietilenglicol (PEG). Recubrir las NP con PEG es un enfoque común para evitar la eliminación por el sistema inmunológico.
Otro rasgo característico importante de las NP es la posibilidad de incorporar agentes de formación de imágenes tales como tintes fluorescentes y agentes de contraste para la formación de imágenes por resonancia magnética (RM) o la tomografía de emisión positrónica/tomografía de emisión monofotónica (PET/SPECT), logrando una combinación de terapéutica y diagnóstico, la denominada "teranóstica".
En un modo de realización de la invención, el sistema de suministro comprende MB llenas de gas y una pluralidad de NP, en el que la pluralidad de NP está asociada con las MB llenas de gas. De acuerdo con este modo de realización, la pluralidad de NP puede estar asociada a la superficie de la MB. Opcionalmente, el sistema de suministro de acuerdo con este modo de realización comprende además NP libres, que pueden ser o no ser iguales a las NP que están asociadas a la superficie de las MB. Las NP pueden ser cualquier Np, opcionalmente además funcionalizadas en la superficie, tal como PEGiladas y/o dirigidas o funcionalizadas con cualquier otro tensioactivo conocido por el experto en la técnica, tal como se menciona en Gamucci et al. (5)
Sin estar ligado a ninguna teoría, la asociación entre las NP y las MB puede ser el resultado de la formación de las denominadas emulsiones de Pickering. Es conocido que las partículas sólidas con hidrofobia intermedia se pueden adsorber fuertemente en la interfase entre fluidos inmiscibles tales como aceite-agua, posibilitando la formación de emulsiones de Pickering, es decir, emulsiones estabilizadas por partículas sólidas de tamaño nanométrico o micrométrico. De la misma manera, se pueden usar partículas sólidas para estabilizar las interfases gas-agua. Sin embargo, pocos materiales poseen inherentemente el equilibrio suficiente de hidrofobia e hidrofilia esencial para la acción estabilizadora de partículas. De acuerdo con dicho modo de realización, el sistema de suministro de la invención comprende NP que se pueden usar para estabilizar la interfase gas-agua por autoensamblaje en la superficie de la MB. El resultado son MB muy estables. Se ha demostrado que dichas MB estabilizadas con NP tienen una vida útil prolongada.
En un modo de realización particular, las NP son NP poliméricas, tales como las NP de PACA, que se pueden usar para estabilizar las MB por autoensamblaje sobre la superficie de la MB. Esto dará como resultado Mb con una cubierta estabilizadora particular de NP. El diámetro medio de las MB llenas de gas asociadas con las NP está en el intervalo de 0,5 a 30 pm, tal como de 1 a 10 pm.
En otro modo de realización de la invención, la pluralidad de NP comprendidas en el sistema de suministro son NP libres. Una ventaja observada del sistema de suministro de acuerdo con la invención son las concentraciones potenciadas de fármacos que se pueden suministrar al sitio diana. Esto se puede atribuir al número de NP llenas de fármaco asociadas en la superficie de las MB. Sin embargo, tras la inyección en la sangre, un número adicional de NP libres también seguirá a las MB hasta el sitio diana en los pulmones. En consecuencia, un modo de realización de la invención es un sistema de suministro que comprende una MB llena de gas, una pluralidad de NP y al menos un componente médico asociado con una o más de las NP para su suministro a los pulmones, en el que la pluralidad de NP son NP libres. Las NP pueden ser cualquier NP, opcionalmente además funcionalizada en la superficie, tal como PEGilada y/o dirigida. El sistema de suministro de acuerdo con este modo de realización puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. La MB llena de gas de acuerdo con este modo de realización puede ser cualquier MB, tal como MB llenas de gas disponibles comercialmente conocidas por el experto en la técnica, o una MB llena de gas estabilizada además por una cubierta de las NP en la superficie. La pluralidad de NP libres pueden ser o no las mismas NP que las que estabilizan la superficie de las MB. En consecuencia, el sistema de suministro puede comprender varias NP diferentes, asociadas en la superficie a las MB llenas de gas y/o bien comprendidas como NP libres. En un modo de realización particular, el sistema de suministro de la invención comprende MB llenas de gas con una pluralidad de NP asociadas a la superficie y una pluralidad adicional de NP libres. Las NP libres adicionales contribuyen a una concentración además potenciada de componente médico que llega al sitio diana. De acuerdo con este modo de realización de la invención, la concentración incrementada de componente médico se puede atribuir al elevado número de NP asociadas en la superficie de las MB, así como a las NP libres adicionales, que seguirán a las MB llenas de gas hasta los pulmones.
El componente médico comprendido en el sistema de suministro de la invención se puede seleccionar del grupo que consiste en: fármacos citotóxicos/citostáticos, antibióticos, agentes que disuelven la mucosidad (mucolíticos), fármacos antiinflamatorios, un fármaco terapéutico pulmonar, agentes respiratorios, fármacos inmunoterápicos, agentes modificadores de genes, quimiopotenciadores y agentes de diagnóstico, tales como agentes de contraste. En un modo de realización particular, el componente médico es cabazitaxel.
Como se demuestra en los ejemplos, las MB llenas de gas y la pluralidad de NP se acumulan en los pulmones. En consecuencia, el sistema de suministro funciona como un sistema de suministro dirigido de forma altamente pasiva para el suministro de componentes médicos al tejido diana en el aparato respiratorio y/o el tejido cercano. Las NP se pueden dirigir activamente a enfermedades específicas en el tejido diana. Esto se puede lograr por la incorporación de restos dirigidos en las NP. Un sistema de suministro de este tipo posibilitará, por ejemplo, una absorción potenciada de las NP por patógenos específicos que provocan enfermedades en los pulmones y el aparato respiratorio, así como por tejido patológico específico, tal como por ejemplo, tejido canceroso con receptores particulares.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento para preparar un sistema de suministro como se describe. En un modo de realización, el procedimiento comprende la etapa de:
a. Añadir MB prefabricadas y NP prefabricadas cargadas con un componente médico a una solución,
b. Mezclar la solución,
En otro modo de realización, el procedimiento comprende la etapa de:
a. Sintetizar las NP, cargadas con un componente médico.
b. Añadir las NP a una solución que comprende una sustancia tensoactiva.
c. Añadir gas a la solución.
d. Mezclar la solución para obtener MB llenas de gas.
Como se describe en el presente documento, las NP en la etapa a) pueden ser cualquier NP conocida por el experto en la técnica adecuada para cargarse con un componente médico. Las NP como se describe en Kumari et al. (6) se pueden sintetizar como se describe y usar en el procedimiento de acuerdo con la invención.
En un modo de realización, el procedimiento comprende mezclar la solución agitándola de 2 segundos a 60 minutos. En un modo de realización preferente, la solución se agita durante 1-10 minutos. Se pueden utilizar diferentes procedimientos para mezclar la solución conocidos por el experto en la técnica, tales como ultrasonidos, agitación mecánica, microfluídica, agitación, etc.
El procedimiento de obtención de MB asociadas a NP se describe en el presente documento (véase el ejemplo 1). El procedimiento como se describe es simple, económico, no requiere disolventes orgánicos y es factible de aumentar a escala. En un modo de realización, las NP asociadas con las MB se obtienen añadiendo gas a una solución que comprende NP de PACA y mezclándolo para obtener MB llenas de gas. A diferencia de otros sistemas de suministro, una plataforma basada en MB y NP de PACA, que se optimiza usando una síntesis de una etapa, permite introducir todas las funcionalidades de manera controlada y sencilla.
El sistema de suministro se puede usar tanto para diagnosticar neumopatías como en tratamiento. La ventaja del sistema es que se dirige específicamente a los pulmones y al tejido cercano.
La invención se basa en el descubrimiento de que cuando las MB llenas de gas y las NP se administran en la circulación sanguínea, se acumulan en los pulmones. Por tanto, el sistema de suministro se dirige pasivamente a los pulmones y al tejido en las proximidades de los pulmones. En consecuencia, el sistema de suministro descrito es para administración en la circulación sanguínea, tal como administración parental por inyección, administración intravenosa o intraarterial.
En un modo de realización, el sistema de suministro de fármacos de la invención es para su uso en medicina por administración del sistema de suministro en la circulación sanguínea y suministro dirigido del componente médico a un pulmón y/o al aparato respiratorio y/o tejido cartilaginoso, músculos lisos y tejido elástico de las vías respiratorias, sin aplicar ultrasonido.
En estudios previos se ha demostrado que el ultrasonido es necesario para ayudar al suministro de suficiente componente médico a un tejido diana, tal como tumores de mama sólidos, para lograr un efecto terapéutico (Snipstad et al., 2017). El mecanismo propuesto es que el ultrasonido enfocado (FUS) creará cavitación inercial, provocando que las microburbujas se agrupen. Esto da lugar a la formación de ondas de choque y corrientes en chorro en la vasculatura, que pueden crear poros tanto temporales como permanentes en la pared capilar y en las membranas celulares, permitiendo por tanto que las NP llenas de fármaco se distribuyan en los tumores.
Sin embargo, debido a que el ultrasonido se refleja en la interfase aire-tejido, las fuerzas que se crean por el ultrasonido tendrán una penetración tisular muy limitada en los pulmones. En consecuencia, la aplicación de FUS no podrá provocar que las microburbujas se agrupen en el tejido pulmonar. Las limitaciones de la sonoporación y la capacidad alterada de las ondas de US para penetrar en los pulmones debido a la influencia del aire dentro de los pulmones, han limitado, por tanto, la aplicabilidad de los sistemas de suministro de MB-NP en el tejido pulmonar.
A diferencia de esta suposición, los autores de la invención han descubierto que el suministro de NP llenas de fármaco a los pulmones y al tejido del aparato respiratorio es posible por administración del sistema de suministro de la invención, sin aplicar ultrasonido. Sin estar ligado a ninguna teoría, se plantea la hipótesis de que esto se debe a la combinación de las MB llenas de gas y las NP en el sistema de suministro de fármacos propuesto, y a la capacidad de las MB de acumularse en el tejido del aparato respiratorio como una forma de direccionalidad pasiva. Como resultará obvio para el experto en la técnica, el sistema de suministro como se describe en la presente solicitud puede estar comprendido en una composición que comprende además excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones farmacéuticas pueden ser adecuadas para su administración a un sujeto.
"Administrar" cuando se usa junto con un medio terapéutico o de diagnóstico para administrar un tratamiento o diagnóstico por vía sistémica o local, como directamente en o sobre un tejido diana, o para administrar un tratamiento a un paciente con lo que el tratamiento tiene un impacto positivo en el tejido al que está dirigido. "Administrar" una composición se puede lograr por inyección o por otros procedimientos solos o en combinación con otras técnicas conocidas.
Sin estar limitado a ninguna teoría, la hipótesis es que el suministro del componente médico se potencia por varios factores. Un factor es el tamaño del sistema de suministro; el tamaño posibilita el atrapamiento del sistema en los lechos capilares de los alvéolos, haciendo, por tanto, que el suministro de componentes médicos al tejido pulmonar sea en particular eficaz. Otro factor es la incorporación de gas en las MB, que se cree que influyen en la acumulación en los pulmones. Como tal, las MB con las NP asociadas no están dirigidas a la enfermedad, pero pueden proporcionar un beneficio para diferentes enfermedades y ser un sistema de suministro genérico para agentes de diagnóstico y terapéuticos a los pulmones y al tejido cercano. En un modo de realización del sistema de suministro de fármacos como se describe en el presente documento, las NP llenas de componente médico están asociadas con las MB, tal como asociadas en la superficie de la microburbuja. En otro modo de realización, el sistema de suministro de fármacos también comprende las NP que no están asociadas con las MB, por ejemplo, el sistema comprende adicionalmente NP libres. Estas NP libres también pueden estar llenas de componentes médicos. Como tal, pueden potenciar además la carga de fármaco y, por consiguiente, la capacidad del sistema de suministro de fármacos.
Como se describe en el presente documento, el sistema de suministro de la invención es para su uso en medicina, específicamente para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades en los pulmones, el aparato respiratorio o en tejido en estrecha proximidad con los pulmones. Dicho tejido puede incluir tejido cartilaginoso, tejido muscular liso y tejido elástico en las proximidades de las vías respiratorias.
Los ejemplos de enfermedades pueden ser neumopatías asociadas con inflamación, tales como fibrosis quística y enfermedades pulmonares obstructivas crónicas, tuberculosis y cáncer de pulmón.
Los ejemplos demuestran grandes acumulaciones de NP llenas con un componente médico en pulmones sanos en ratones. Dicha concentración incrementada de NP (y por tanto del componente médico) en los pulmones puede dar lugar a un diagnóstico y tratamiento significativamente mejorados de diversas neumopatías. Los efectos del tratamiento se han demostrado en un estudio piloto con animales y demuestran la capacidad del sistema de suministro para reducir la metástasis en los pulmones en un modelo con ratones y cáncer de pulmón.
Se ha de entender que el modo de realización descrito en los ejemplos se ha de considerar solo como un ejemplo no limitante de la invención y que se puede modificar de muchas maneras dentro del alcance de las reivindicaciones de la patente.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NP Y MB ASOCIADA A NP.
Producción y caracterización de nanopartículas cargadas con tinte:
Se prepararon NP recubiertas con PEG y cargadas con tinte de polímero o bien lípido por el procedimiento de miniemulsión como sigue:
NP poliméricas (PACA): se preparó una fase oleosa que consistía en 2,25 g de cianoacrilato de n-butilo (monómero de BCA, Henkel Loctite, Irlanda), 0,1 ml de una mezcla de Miglyol 810N (coestabilizador, aceite inactivo, Cremer, Alemania) con DIR (tinte del infrarrojo cercano, Marker Gene, EE. UU.) añadido a una concentración de 25 mg/ml mezclando a fondo en un vial de vidrio mantenido en hielo. A continuación, se añadió una fase acuosa que consistía en 0,125 g de Brij L23 (estabilizador de PEG, Sigma) y 0,125 Kolliphor HS15 (iniciador de PEG, Sigma) en 11,5 ml de HCl 0,1 M a la fase oleosa y se mezclaron durante 30 segundos en un vial de vidrio colocado en hielo usando un agitador magnético. La emulsión de aceite en agua se sometió a ultrasonidos (homogeneizador ultrasónico digital Branson 450 CE, 60 % de amplitud) de inmediato durante 3 minutos (intervalos de 6x30 s con pausas de 10 s) en hielo. La solución se mantuvo en rotación (15 rpm) a temperatura ambiente durante la noche antes de ajustar el pH a 5 y la polimerización continuó durante 5 horas adicionales a temperatura ambiente mientras se giraba (15 rpm). Se dializó la dispersión (membrana de diálisis Spectra/Por MWCO 100000 Da) extensivamente contra HCl 1 mM (pH 3) a temperatura ambiente para retirar el PEG sin reaccionar. Se reemplazó el dializado 3 veces. Se almacenaron las partículas en la solución ácida a 4 °C protegidas de la luz.
NP lipídicas: se precalentó una fase lipídica que consistía en 0,8 g de ácido esteárico, 0,2 g de palmitato de isopropilo y 0,1 ml de una mezcla de Miglyol 810N (coestabilizador, aceite inactivo, Cremer, Alemania) con DIR (tinte del infrarrojo cercano, Marker Gene, EE. UU.) añadido hasta 80 °C hasta que se fundió. Se preparó una fase acuosa que consistía en 0,06 g de lecitina 80H, 0,24 g de QDP Ultra Andina y 20 ml de agua destilada y se precalentó a 90 °C. La fase lipídica y acuosa se mezclaron y se sometió a ultrasonidos en un baño de agua (90 °C) durante 3 minutos (homogeneizador ultrasónico digital Branson 450 CE, 60 % de amplitud) antes de enfriar con agua. Se almacenaron las partículas a 4 °C protegidas de la luz.
Se usó Zetasizer (dispersión dinámica de luz, Malvern) para determinar el diámetro hidrodinámico, la distribución del diámetro hidrodinámico y el potencial zeta de las NP. Las mediciones se realizaron a 25 °C en tampón fosfato 0,01 M, pH 7. Se determinó el contenido de peso seco de la solución final (concentración de NP) secando la muestra a 50° durante la noche. El procedimiento de dispersión dinámica de luz mostró un tamaño de NP de 158 y 186 nm (promedio z) para las NP de PACA y lipídicas, respectivamente, con una carga ligeramente negativa. El índice de polidispersidad fue de 0,11 (NP de PACA) y 0,17 (NP lipídicas).
Producción y caracterización de NP cargadas con cabazitaxel:
Se prepararon NP de poli(cianoacrilato de alquilo) recubiertas con PEG y cargadas con cabazitaxel por el procedimiento de miniemulsión como sigue: Se preparó una fase oleosa que contenía 1,50 g de cianoacrilato de 2-etil-butilo (monómero), 0,03 g de Miglyol 812 (coestabilizador, aceite inactivo, Cremer, Alemania) y 0,18 g de cabazitaxel (fármaco citotóxico, BioChemPartner, Shanghái) mezclando a fondo en un vial de vidrio. Se preparó una fase acuosa que contenía 0,09 g de Brij L23 (estabilizador de PEG, Sigma) y 0,09 g de Kolliphor HS15 (iniciador de PEG, Sigma), disueltos en 12 ml de HCl 0,1 M. Se preparó una emulsión de aceite en agua mezclando el aceite y la fase acuosa y sometiendo la mezcla a ultrasonidos (homogeneizador ultrasónico digital Branson 450) de inmediato en hielo durante 2 minutos (intervalos de 4x30 s, 60 % de amplitud) seguido de otros 3 minutos (intervalos de 6x30 s, 30 % de amplitud). Después de los ultrasonidos, se giró la solución a 15 rpm durante la noche a temperatura ambiente antes de ajustar el pH a 5 usando NaOH 0,1 M. La polimerización continuó durante 5 horas a temperatura ambiente mientras se giraba (15 rpm). Se dializó la dispersión extensamente contra HCl 1 mM (pH 3) a temperatura ambiente para retirar el PEG sin reaccionar (membrana de diálisis, MWCO 100.000 Da). Se reemplazó el dializado 3 veces. Se almacenaron las partículas en la solución ácida a 4 °C. El procedimiento mencionado anteriormente dio como resultado dispersiones de NP cargadas con fármaco, PEGiladas, con concentraciones de 75 mg de NP/ml después de la diálisis. Cuando se almacenó en condiciones ácidas, la dispersión de partículas se mantuvo estable durante varios meses, sin que se observara agregación.
Se usó Zetasizer (dispersión dinámica de luz, Malvern) para determinar el diámetro hidrodinámico, la distribución del diámetro hidrodinámico y el potencial zeta. Las mediciones se realizaron a 25 °C en tampón fosfato 0,01 M, pH 7. Se determinó el contenido de peso seco de la solución final (concentración de NP) secando la muestra a 50° durante la noche. Para calcular la cantidad de fármaco encapsulado, se extrajo el contenido de fármaco de las partículas y se cuantificó la cantidad extraída de cabazitaxel usando el procedimiento CL-EM/EM.
El procedimiento de dispersión dinámica de luz mostró un tamaño de NP de 142 nm (promedio z) para las NP cargadas con fármaco con un índice de polidispersidad de 0,18. El potencial zeta medido fue de -1 mV. La eficacia de carga de fármaco determinada fue de un 72 % y la carga útil de fármaco fue de un 10,7 % (% en peso de cabazitaxel/peso de NP).
Producción y caracterización de MB estabilizadas con NP:
Se produjeron las MB llenas de gas asociadas con las NP de PACA como sigue:
Se preparó una solución que contenía caseína al 2 % en peso (pH 7,4) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 |jm. Se mezclaron las NP PEGiladas cargadas con tinte o cargadas con cabazitaxel con la solución de caseína y agua destilada hasta una concentración final de 0,5 % en peso de caseína y de 1 % en peso de NP, con un volumen total de 4 ml. Se colocó la mezcla en un lote de ultrasonidos durante 10 minutos (a temperatura ambiente) antes de saturar la solución con gas, aire o bien perfluoropropano (PFC, Apollo Scientific, Reino Unido) durante aproximadamente 10 segundos. Se selló el vial parcialmente con parafilm. A continuación, se aplicó de inmediato Ultraturrax (25.000 rpm) durante 2 minutos para producir MB estabilizadas con NP llenas de gas. Se selló el vial de inmediato en una atmósfera llena de gas usando un tapón de goma.
Se determinó el tamaño y la concentración promedio de las MB estabilizadas con NP resultantes a partir de imágenes de microscopia óptica usando un objetivo de contraste de fase 20x y una cámara de recuento (hemocitómetro). Se contaron las MB y se calculó el tamaño analizando las imágenes usando el analizador de imágenes ImageJ.
Las MB estabilizadas con NP resultantes tenían un tamaño promedio de 2,3 |jm y una concentración de 5,62E+08 MB/ml como se midió por microscopía óptica y análisis de imágenes.
Se usó microscopia de fluorescencia (usando el mismo tipo de NP que encapsulan solo un tinte fluorescente en lugar de fármaco) y microscopia electrónica (fig. 3) para confirmar que las NP están asociadas con las MB formando una (mono)capa estabilizadora. Cuando se almacenaron a 4 °C, las MB fueron estables durante hasta varios meses. EJEMPLO 2: BIODISTRIBUCIÓN Y ACUMULACIÓN PULMONAR DE DIFERENTES MB ESTABILIZADAS CON NP EN RATONES
En este estudio, se evaluó el potencial de las MB asociadas con las NP para el suministro de fármacos específicos dirigidos a los pulmones en ratones sanos. Los resultados muestran que se pueden lograr altas concentraciones locales con MB llenas de gas estabilizadas por NP.
Procedimientos
El estudio se diseñó con un animal en cada grupo. Se formaron las NP marcadas con un tinte fluorescente del infrarrojo cercano de acuerdo con el procedimiento como se describe en el ejemplo 1 y se usaron. Usando un generador de imágenes del animal completo, estas NP se pueden localizar en el interior de animales pequeños.
Los estudios en animales se aprobaron por la autoridad alimentaria noruega (Mattilsynet). Todos los experimentos fueron paliativos en el sentido de que los animales recibieron anestesia, se usaron para los experimentos y se sacrificaron antes de despertar. Durante el almacenamiento en el animalario, se supervisó el bienestar de los animales por los ingenieros en el animalario y tuvieron acceso libre a la comida y el agua.
Experimentos con animales:
1. Se seleccionó de forma aleatoria un animal, se pesó y se le administró una inyección subcutánea de fentanilo/medetomidina/midazolam/agua (2:1:2:5) que proporciona anestesia completa en minutos y dura 2-3 horas.
2. Se colocó un catéter en la vena de la cola, lo que permitió inyecciones intravenosas.
3. Se inyectaron 100 ul de las burbujas deseadas (aprox. 10e8 burbujas/ml) como inyección intravenosa rápida (tiempo de inyección ~5 segundos).
4. Los animales se dejaron dormir durante el tiempo deseado antes de sacrificarse por luxación cervical.
5. A continuación, se recogieron los pulmones, el hígado, el riñón y el bazo y se colocaron uno al lado del otro (véase la sección de resultados) en la tapa de una placa de Petri.
6. Se obtuvieron imágenes de fluorescencia de los órganos usando un generador de imágenes completamente animal (Pearl).
Resultados
Nanopartículas:
Para realizar los experimentos con animales, se necesitaban NP marcadas en el infrarrojo cercano. En la tabla 1 se muestran las características físicas de las NP usadas además para producir las MB.
Tabla 1: características de las NP de los dos lotes de NP usados en los estudios con animales
Material Tamaño (promedio z) PDI Potencial zeta Carga
Lípido
Figure imgf000013_0001
186 nm
Figure imgf000013_0002
0,17
Figure imgf000013_0003
DiR
Polímero (PACA) 158 nm 0,11 -3,4 DiR
Microburbujas con NP de PACA:
En la figura 1, se muestra la fluorescencia de los órganos que acumulan NP después de la inyección de 100 ul de NP de PACA (sin MB). Se puede observar una acumulación de manchas en el pulmón, pero la concentración es baja en comparación con el hígado y el bazo.
Después del control que contenía solo NP, se sometió a prueba el sistema de suministro que comprende NP (PACA) asociadas con el sistema de MB, en el que las MB contenían gas PFC (figura 2).
Como se puede observar en la figura 2, se acumularon pequeñas cantidades de las NP-MB en los pulmones, y esto se repitió en múltiples animales con resultados similares.
Se ha observado previamente que las burbujas con PFC tienen una vida media de circulación significativamente más larga que las MB con aire, en consecuencia, los autores de la invención querían someter a prueba a continuación las NP-MB llenas con aire. La biodistribución de las NP-MB de aire se muestra en la figura 3 y demuestra que un mayor número de NP cargadas con DiR se acumulan en los pulmones.
Para comparar los resultados directamente, los pulmones de los tres animales se colocaron en la misma placa de Petri y se obtuvieron imágenes (figura 4). Como se puede ver en la figura 4, los pulmones de los ratones a los que se les inyectó NP-MB de PFC (3) contenían más DiR que los pulmones de los ratones a los que se les inyectó las NP solas sin las MB (2). Además, los pulmones de ratones a los que se les inyectó las NP-MB de aire (1) acumularon una gran cantidad de NP cargadas con DiR.
MB con NP lipídicas:
También se produjeron MB con NP lipídicas y se sometieron a prueba con la biodistribución resultante mostrada en la figura 5. Como se puede ver, también estos pulmones contenían NP cargadas con DiR.
Finalmente se sometió a prueba la estabilidad de la acumulación pulmonar, es decir, si las NP permanecerían en los pulmones a lo largo del tiempo o se redistribuirían a otros órganos. Debido a que la solicitud a la Autoridad Noruega de Seguridad Alimentaria para obtener permiso para llevar a cabo experimentos con animales (la solicitud FOTS) solo describía experimentos de corta duración, el período de tiempo más largo permitido para realizar fue de 2 horas. Se examinó la biodistribución en dos animales 1 h (figura 6A) y 2 h (figura 6B) después de la inyección. A partir de las cifras, hay algunos indicios de que hay una ligera redistribución de las NP-MB con el tiempo, pero esto se puede deber a la variación entre individuos tanto por la biología como también por la manipulación y la calidad de la muestra, como es de esperar. Sin embargo, 2 h después de la inyección, los pulmones son todavía el órgano que ha acumulado la mayoría de las NP.
Conclusión
Como se puede ver a partir de la comparación de la figura 4, la inyección de MB llena de gas (tanto PFC como aire) con las NP de PACA dio como resultado una acumulación mejorada de las NP en los pulmones en comparación con la inyección de las NP solas. En particular, los resultados muestran que la plataforma de NP-MB que consiste en las NP de PACA y las MB de aire se acumula en gran medida en los pulmones de ratones sanos y que este efecto da una alta concentración local durante al menos 2 h (figura 6). La figura 5 revela que también m B llenas de aire con NP lipídicas se acumulan hasta cierto punto en los pulmones.
Una alta concentración local de las NP en los pulmones puede tener un potencial enorme como sistema de suministro de fármacos para tratar neumopatías, tales como por ejemplo cáncer de pulmón y trastornos respiratorios.
EJEMPLO 3: ESTUDIO DE ACTIVIDAD ANTITUMORAL (TRATAMIENTO) EN RATONES
Se realizó un estudio piloto de tratamiento para investigar el potencial del sistema de suministro en el tratamiento de cáncer de pulmón.
Procedimientos
Animales:
Se usaron ratones hembra C57BL/6J (C57Bl/6JRj). Los animales se mantuvieron en estado de salud SPF de acuerdo con las pautas de FELASA. El alojamiento de animales y los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las regulaciones europeas y la guía NRC para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se autorizó el animalario por las autoridades francesas (Acuerdo n.° B 21231 011 EA). Todos los procedimientos que usan animales se sometieron al Comité para el Cuidado y Uso de animales de Oncodesign (Oncomet) acordado por las autoridades francesas (acuerdo CNREEA n.° 91).
Inducción de tumores B16-F10 en animales:
Se inyectaron 105 células tumorales B16-F10 en 200 pl de medio RPMI 1640 por vía i.v. en la vena inferior de los ratones. El día de la inyección de células tumorales se consideró como día 0 (D0).
Estudio de tratamiento:
El tratamiento se inició el día 2 (D2). El grupo 1 (G1, control) recibió tres inyecciones i.v. de solución salina cada 2 días. El grupo 2 (G2) recibió dos inyecciones i.v. de MB estabilizadas con NP en aire que contenían cabazitaxel (preparadas como se describe en el ejemplo 1) a 10 mg de cabazitaxel/kg cada 2 días.
Se sacrificaron todos los ratones el día catorce (D14). De inmediato después de la eutanasia, se extrajeron y pesaron los pulmones. Se evaluó macroscópicamente el nivel de invasión pulmonar contando el número de metástasis. Resultados
Como se puede ver en el resultado enumerado en la tabla 2, el grupo de control experimentó más invasión de metástasis. Los pulmones en este grupo estaban completamente cubiertos por metástasis y el número era demasiado grande para contarse. En comparación, los ratones tratados con las NP-MB cargadas con cabazitaxel tenían un porcentaje de invasión de metástasis de un 20 y un 30 % y un recuento de metástasis de 86 y 112, respectivamente. Tabla 2:
Figure imgf000015_0001
Conclusión
Este fue un estudio piloto con solo cantidades limitadas de animales. Sin embargo, los resultados muestran una clara tendencia entre los dos grupos de animales, con menos metástasis y % de invasión de metástasis en el grupo tratado con el sistema de suministro de fármacos de acuerdo con la invención en comparación con el control, demostrando la capacidad de la invención para disminuir la metástasis de cáncer de pulmón en ratones.
EJEMPLO 4: ACUMULACIÓN PULMONAR DE DIFERENTES MB ESTABILIZADAS CON NP EN RATONES En este estudio, se evaluó además el potencial de diferentes MB llenas de gas estabilizadas por las NP para el suministro de fármacos específicos dirigidos a los pulmones en ratones sanos. Los resultados muestran que se pueden lograr altas concentraciones locales con MB llenas de gas estabilizadas por NP.
Procedimientos
El estudio se diseñó con un animal en cada grupo. Se formaron las NP marcadas con un tinte fluorescente del infrarrojo cercano de acuerdo con el procedimiento como se describe en el ejemplo 1 y se usaron. Usando un generador de imágenes del animal completo, estas NP se pueden localizar en el interior de animales pequeños.
Los estudios en animales se aprobaron por la autoridad alimentaria noruega (Mattilsynet). Todos los experimentos fueron paliativos en el sentido de que los animales recibieron anestesia, se usaron para los experimentos y se sacrificaron antes de despertar.
Producción de MB estabilizadas con NP:
Se produjeron las MB llenas de gas asociadas con las NP de PACA como sigue:
Se preparó una solución que contenía caseína al 2 % en peso (pH 7,4) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0. 22.|jm. Las NP PEGiladas cargadas con tinte se mezclaron con la solución de caseína y agua destilada hasta una concentración final de 0,5 % en peso de caseína y 1 % en peso de NP, con un volumen total de 4 ml. Se colocó la mezcla en un lote de ultrasonidos durante 10 minutos (a temperatura ambiente) antes de saturar la solución con gas, SF6 o bien perfluoropropano (PFC, Apollo Scientific, Reino Unido) durante aproximadamente 10 segundos. Se selló el vial parcialmente con parafilm. A continuación, se aplicó de inmediato Ultraturrax (25.000 rpm) durante 2 minutos para producir MB estabilizadas con NP llenas de gas. En un lote, se añadió urea como agente modificador para promover además la asociación entre microburbujas y nanopartículas. En este caso, se añadió gota a gota urea (2 % p/v, pH 5) a la solución durante Ultraturrax hasta una concentración final de 0,5 % p/v de urea. Se selló el vial de inmediato en una atmósfera llena de gas usando un tapón de goma.
El experimento con animales se realizó como se describe en el ejemplo 2, a cada animal se le inyectó por vía intravenosa cualquiera de:
A) MB llena de PFC estabilizada por NP de PEBCA (PFC-MBNP, GB-505, BC-26 con PFC).
b) MB llena de PFC con urea estabilizada por NP de PEBCA (PFC-urea-MBNP, GB-507, BC26 con urea, PFC). C) MB llena de SF6 estabilizada por NP de PEBCA (GB-509 (SF6-MBNP, BC-26 con SF6).
La concentración de las NP en todos los lotes ascendió al 1,17 %.
Resultados:
Los resultados de la acumulación de fármaco modelo (DiR) en los pulmones de los animales se pueden ver en la figura 7. Las imágenes se obtienen 30 min después de las inyecciones y las intensidades de fluorescencia demuestran la biodistribución de NP llenas de fármaco en los pulmones de todos los animales.
La figura 7A muestra los pulmones del animal al que se le inyectó PFC-MBNP ordinaria. La intensidad de fluorescencia en los pulmones demuestra que las PFC-MBNP se han acumulado y la absorción de las NP con el fármaco modelo. La figura 7B muestra los pulmones del animal al que se le inyectó PFC-urea-MBNP. En comparación con la figura 7A, la intensidad de fluorescencia demuestra que la urea como agente modificador tiene un efecto positivo sobre la absorción de NP en los pulmones. La mancha más oscura en el medio demuestra la intensidad de fluorescencia más alta (por encima de 5,58E-2, las manchas más oscuras corresponden a manchas rojas en las fotos originales).
La figura 7C muestra los pulmones del animal al que se le inyectó SF6-MBNP. En comparación con tanto la figura 7A como 7B, la intensidad de fluorescencia demuestra que la acumulación de fármacos es incluso mayor en los pulmones del animal al que se le inyectó las MBNP con SF6. Las áreas más claras a la izquierda y a la derecha (flechas blancas) en las imágenes corresponden a una intensidad de fluorescencia entre 3,00E-2 y 5,00E-2 (amarillo en las imágenes originales), mientras que los puntos más oscuros (flechas negras) en la parte derecha demuestran la intensidad de fluorescencia más alta (por encima de 5,58E-2=puntos rojos en las imágenes originales).
Conclusión
Los resultados demuestran que la inyección de MB llena de gas (tanto PFC como SF6) con las NP de PACA dio como resultado una acumulación de NP en los pulmones de ratones sanos. La adición de agentes modificadores tal como urea, que mejora la asociación entre las Mb y las NP, puede influir en el grado de absorción de NP en el tejido diana. Referencias
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3. Eggen S, Fagerland SM, Morch Y, Hansen R, Sovik K, Berg S, Furu H, Bohn AD, Lilledahl MB, Angelsen A, Angelsen B, Davies CD. Ultrasound-enhanced drug delivery in prostate cancer xenografts by nanoparticles stabilizing microbubbles. J Controlled Release. 2014;187:39-49.
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5. Gamucci O, Bertero A, Gagliardi M, Bardi G. Biomedical Nanoparticles: OverView of Their Surface Immune-Compatibility. Coatings. 2014;4:139-59.
6. Kumari A, Yadav SK, Yadav SC. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2010;75:1-18.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema de suministro para su uso en medicina que comprende una microburbuja llena de gas, una pluralidad de nanopartículas y al menos un componente médico asociado con una o más de las nanopartículas para el suministro del componente médico a un tejido diana que es un pulmón, tejido de un aparato respiratorio y/o un tejido cercano, en el que el sistema de suministro se administra en la circulación sanguínea, y el suministro de las nanopartículas y el componente médico al tejido diana es sin ultrasonido enfocado.
2. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la pluralidad de nanopartículas está asociada con la microburbuja llena de gas, tal como asociada a la superficie.
3. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además nanopartículas libres y al menos un componente médico asociado con las nanopartículas libres.
4. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la pluralidad de nanopartículas son nanopartículas libres.
5. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la pluralidad de nanopartículas está recubierta con polietilenglicol (PEG).
6. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una de la pluralidad de nanopartículas comprende además al menos un agente dirigido.
7. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la microburbuja llena de gas comprende un gas seleccionado del grupo que consiste en: perfluorocarbono, aire, gases nobles, gases de fluoruro sulfúrico, halógenos o componentes del aire, tales como nitrógeno (N2), oxígeno (O2), argón (Ar), dióxido de carbono (CO2), helio (He), neón (Ne) y metano (CH4).
9. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la microburbuja llena de gas comprende además un compuesto tensioactivo y/o un agente modificador.
10. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la microburbuja llena de gas es una microburbuja con nanopartículas asociadas en la superficie.
11. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el diámetro medio de las microburbujas llenas de gas con nanopartículas asociadas está en el intervalo de 0,5 a 30 pm.
12. El sistema de suministro para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el componente médico se selecciona del grupo que consiste en: fármacos citotóxicos/citostáticos, antibióticos, agentes que disuelven la mucosidad (mucolíticos), fármacos antiinflamatorios, un fármaco terapéutico pulmonar, agentes respiratorios, fármacos inmunoterápicos, agentes modificadores de genes, quimiopotenciadores, agentes de diagnóstico, agentes de contraste.
13. Un procedimiento para preparar un sistema de suministro de fármacos para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que comprende las etapas de:
a. Sintetizar las nanopartículas que se van a cargar con el componente médico.
b. Añadir nanopartículas a una solución que comprende un compuesto tensioactivo y/o un agente modificador. c. Añadir gas a la solución
d. Mezclar la solución para obtener microburbujas llenas de gas.
14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la solución en c) se mezcla de 2 segundos a 60 minutos, preferentemente de 1 a 10 minutos.
15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14,
en el que la solución en c) se mezcla agitando a de 500 a 50000 rpm, preferentemente de 1000 a 30000 rpm; y/o en el que la sustancia tensioactiva es suero o proteína o lípido o tensioactivo.
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