ES2894362T3

ES2894362T3 - Un proceso para mejorar la bioactividad de los extractos de ashwagandha

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Publication number: ES2894362T3
Application number: ES16857057T
Authority: ES
Inventors: Benny Antony
Original assignee: Arjuna Natural Pvt Ltd
Current assignee: Arjuna Natural Pvt Ltd
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2016-10-18
Publication date: 2022-02-14
Anticipated expiration: 2036-10-18
Also published as: EP3364990B1; CA3002624A1; ZA201802900B; AU2020201462B2; US20190160132A1; US20210113646A1; US10251927B2; EP3364990A1; WO2017068600A1; AU2018260852A1; AU2020280997A1; US11638738B2; US20170326195A1; AU2016341452B2; EP3364990A4; AU2016341452A1; AU2018260852B2; US10166266B2; AU2020201462A1; US20180280463A1

Abstract

Composición con recubrimiento entérico de un extracto de Withania somnifera, donde el extracto de Withania somnifera es extracto de raíz de Withania somnifera que comprende al menos aproximadamente un 35 % de glicósidos de witanólidos y al menos aproximadamente un 10 % de saponinas; o extracto de raíz de Withania somnifera que comprende al menos aproximadamente un 80 % de glicósidos de witanólidos y al menos aproximadamente un 15 % de saponinas.

Description

DESCRIPCIÓN

Un proceso para mejorar la bioactividad de los extractos de ashwagandha

CAMPO

[0001] En la presente memoria, se describen métodos para mejorar la bioactividad del extracto de ashwagandha. Se divulgan composiciones de extracto de ashwagandha enriquecidas con glicósidos de witanólidos y saponinas después de eliminar los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos. También se describen procesos para la fabricación de extractos de ashwagandha enriquecidos con glicósidos de witanólidos, saponinas y para la eliminación de alcaloides, agliconas de witanólidos y oligosacáridos. También se describe un proceso de extracción de ashwagandha y de enriquecimiento principalmente con glicósidos de witanólidos para obtener un porcentaje de glicósidos de witanólidos en un rango de 0,5 % y superior y de saponinas en un rango de 0,1 y superior. Los glicósidos de witanólidos incluyen los witanósidos I a VII y los sitoindósidos I a X. También se describen métodos de extracción de extracto de ashwagandha enriquecido en glicósidos de witanólidos y saponinas, pero con alcaloides inferiores al 0,1 %, agliconas de witanólidos inferiores al 0,1 % y oligosacáridos inferiores al 0,1 %.

[0002] Algunos modos de realización proporcionan una composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico para proteger los glicósidos de witanólidos de la hidrólisis en condiciones ácidas, evitando la conversión de los glicósidos de witanólidos en agliconas y la entrega de glicósido de witanólido en un pH neutro/alcalino en el tracto gastrointestinal (TGI). Algunos modos de realización dan a conocer una composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entéri

glicósidos de witanólidos en agliconas de witanólidos en un ambiente ácido.

[0003] Los extractos de ashwagandha con recubrimiento entérico mostraron actividad contra el estrés, actividad inmunomoduladora, actividad antidiabética y actividad antiinflamatoria incluso en dosis menores en comparación con los extractos de ashwagandha sin recubrimiento entérico. Se describen métodos para aumentar la biodisponibilidad y la bioactividad de los glicósidos de witanólidos tras la administración de composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico en una dosis menor que los extractos de ashwagandha sin recubrimiento entérico. Se describen formas farmacéuticas de la composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico.

[0004] Se describe un método para aumentar la resistencia tras la administración del extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico en combinación con extracto de amaranto en una dosis menor.

ANTECEDENTES

[0005] La Withania somnífera, una planta medicinal india popular también conocida como ashwagandha, ginseng indio y alquequenje pertenece a la familia Solanaceae. Durante más de 3000 años, ha sido una hierba importante en el sistema médico ayurveda e indígena.

[0006] Es un subarbusto erguido, grisáceo, con flores amarillas o verdosas poco llamativas, seguidas de pequeñas bayas esféricas de color rojo anaranjado que contienen semillas amarillas en forma de riñón. Suele alcanzar una altura de entre tres y cinco pies (91,44 cm y 152,4 cm) y crece principalmente en terrenos baldíos, pero se cultiva ampliamente como planta entera; mayoritariamente, la raíz y la hoja se utilizan con fines medicinales. Los frutos de diversas de sus especies son comestibles y algunos se utilizan en la medicina tradicional.

[0007] El nombre de especie somnífera significa "que induce al sueño" en latín. El nombre común proviene del sánscrito ashvagandha, es decir, ashwa de caballo y gandha de olor, de ahí la idea común de que el nombre significa "que huele a caballo". La especie está ampliamente distribuida en los estados indios noroccidentales de Guyarat, Madhya Pradesh, Maharashtra, Rajastán, Uttar Pradesh y las llanuras del Punjab, extendiéndose hasta las regiones montañosas de Himachal Pradesh y Jammu. También se cultiva en partes de Madhya Pradesh y Rajastán. Al noroeste de la India, su hábitat se extiende hasta las provincias paquistaníes de Sind y Baluchistán, y hasta Afganistán. Al sureste de la India, se encuentra en Sri Lanka. En China, se dice que crece en las provincias occidentales de Gansu y Yunnan.

[0008] La ashwagandha es una de las hierbas rasayana del Ayurveda; una de las hierbas que supuestamente promueve la juventud y la longevidad y alivia el sufrimiento. Se cree que es especialmente rejuvenecedora para los hombres: para fortalecer la médula ósea, los músculos y el semen, y para dotar al usuario de facilidad intelectual, además de larga vida y vitalidad juvenil. Sin embargo, también se cree que es bastante útil para los ancianos, ya que les proporciona energía y alivia el dolor, la inflamación y la debilidad nerviosa.

[0009] Las raíces de esta planta se han utilizado como adaptógeno y para tratar la artritis, el asma, la dispepsia, la hipertensión, el reumatismo y la sífilis. Las primeras investigaciones farmacológicas de Withania somnífera han revelado sus actividades antiinflamatorias, antioxidantes, inmunomoduladoras y de inhibición de la proliferación de células tumorales.

[0010] Las hojas se utilizan para expulsar las lombrices y se combinan con aceite de ricino caliente (Ricinis communis, Euphorbiaceae) en carbuncos, inflamaciones e hinchazones. Los masái utilizan el jugo de las hojas para la conjuntivitis. Las bayas frescas magulladas se utilizan para la tiña. Los frutos o las semillas se utilizan para coagular la leche. Las semillas también se utilizan como masticatorio. En Lesoto se utiliza una infusión de la corteza internamente para el asma y externamente para las escaras. Los brotes tiernos se consumen como verdura en la India.

[0011] La raíz seca y la planta entera se utilizan en los sistemas de medicina tradicional de Ayurveda, Siddha, Sowa-Rigpa (Amchi) y Unani, así como en la medicina popular india. Los materiales que se comercializan se obtienen tanto de fuentes cultivadas como de recolección silvestre, principalmente en la India.

[0012] En los países en los que se reconoce y practica oficialmente el sistema de medicina ayurveda (por ejemplo, India, Bangladesh, Bután, Malasia, Nepal y Sri Lanka), la raíz seca en polvo de ashwagandha se utiliza, como componente de preparaciones, para el tratamiento de trastornos inflamatorios, tisis (cualquier enfermedad de desgaste o atrófica, debilidad, enfermedades debidas a vata dosha) e impotencia masculina.

[0013] En los países en los que se reconoce y practica oficialmente el sistema de medicina unani (por ejemplo, Bangladesh, India, Malasia, Pakistán y Sri Lanka), la raíz madura seca, denominada asgand, se utiliza como componente de formulaciones medicinales para tratar la leucorrea, la espermatorrea, la disminución de la viscosidad del semen, la debilidad sexual, el lumbago y la artritis.

[0014] En la medicina Siddha -un sistema dravídico de medicina originario del estado de Tamil Nadu, en el sureste de la India, que ahora también se practica en los estados vecinos de Karnataka, Kerala y Andhra Pradesh, así como en partes de Malasia, Singapur y Sri Lanka- la raíz seca (purificada antes de su uso), denominada amukkara, se utiliza como componente de formulaciones indicadas para el tratamiento de afecciones como la oligospermia, el dolor lancinante, la pérdida de fuerza corporal, la anemia, las convulsiones/ataques, los trastornos del humor, el eczema, el edema/inflamación y la tuberculosis.

[0015] Dhuley et al descubrieron que el extracto de raíz de ashwagandha prevenía el aumento de la LPO inducida experimentalmente en conejos y ratones. La witaferina A y el sitoindósido VIII-X muestran actividades antiartríticas, antiinflamatorias, antioxidantes e inmunomoduladoras bastante potentes; también aumentan los niveles de SOD, CAT, GPX en el cerebro y la lactona esteroidea W.A (Bhattacharya et al, 1997). La administración de ashwagandha rasayana redujo significativamente la formación de nódulos tumorales en el pulmón y también redujo la leucopenia inducida por animales experimentales tratados con ciclofosfamida, lo que indica su utilidad en la terapia del cáncer (Menon L,1997 y Davis L, 1998). La withania aumenta el recuento de glóbulos blancos y reduce la leucopenia. También aumentó la celularidad de la médula ósea y normalizó la proporción de eritrocitos hormacromáticos y eritrocitos policromáticos (Davis L,1998). Un extracto metanólico y etanólico al 80 % de Withania somnífera mostró una actividad antiinflamatoria significativa en el edema de la pata inducido por carragenina (Hindawial MKIH et al, 1989).

[0016] Los principales componentes de la aswagandha son los alcaloides y las lactonas esteroideas. Entre los diversos alcaloides, la witanina es el principal constituyente. Los otros alcaloides son la somniferina, la somnina, la somniferinina, la witananina, la pseudowitanina, la tropina, la pseudotropina, el 3agloiloxitropano, la colina, la cuscohigrina, la isopelletierina, la anaferina y la anahidrina. De la raíz se han aislado dos acil esteril glucósidos, a saber, el sitoindósido VII y el sitoindósido VIII. Las hojas contienen lactonas esteroidales, que se denominan comúnmente witanólidos. Los witanólidos tienen un núcleo esteroideo C28 con una cadena lateral C9, con anillos de lactona de seis miembros. La witaferina A, una lactona esteroidea, es el witanólido más importante aislado del extracto de las hojas y las raíces secas de Withania somnifera.

[0017] En 2012, Qamar et al. informaron de los componentes fitoquímicos y farmacológicos activos de Withania somnifera. Se informa de que las raíces contienen alcaloides, aminoácidos, esteroides, aceite volátil, almidón, azúcares reductores, glucósidos, hentriacontano, dulcitol, witaniol, un ácido y un compuesto neutro. Se ha informado de la presencia de muchos alcaloides bioquímicamente heterogéneos en las raíces. Los alcaloides básicos incluyen la cuscohigrina, la anahigrina, la tropina, la pseudotropina, la anaferina, la isopelletierina, la witananina, la witananinina, la pseudowitanina, la somnina, la somniferina y la somniferinina. Los alcaloides neutros incluyen el 3-tropiltigloato y un alcaloide no identificado. Otros alcaloides incluyen la witanina, la witasomnina y la visamina. Se ha informado que las hojas de la planta (quimiotipo indio) contienen 12 witanólidos, 5 alcaloides no identificados, muchos aminoácidos libres, ácido clorogénico, glucósidos, glucosa, taninos condensados y flavonoides (Khare, 2007). El tallo de la planta contiene taninos condensados y flavonoides. La corteza contiene una serie de aminoácidos libres (Anónimo, 1982).

[0018] Patel et al. (2009) extrajeron polvo de raíz de W. somnifera con etilacetato y desarrollaron un perfil de huellas dactilares y análisis de witaferina A en muestras de raíz joven y vieja. Chatterjee et al. (2010) estudiaron la huella metabólica de los extactos de hojas y raíces de W. somnifera mediante una extracción exhaustiva en serie utilizando hexano, metanol al 90 %, metanol al 70 %, cloroformo y butanol. Rao et al. (2012) utilizaron metanol para extraer witanólidos de las raíces de W. somnifera y el extracto se sometió a HPLC para su detección. Singh et al. (2011) realizaron una TLC para identificar los diferentes constituyentes presentes en diferentes extractos de raíces de aswagandha. Diferentes sistemas de disolventes como acetonitrilo: agua (75:25) y tolueno: acetato de etilo: ácido acético (65:33:2).

[0019] El método HPTLC ha sido desarrollado por Sharma et al. (2007) para la estimación de witaferina A y witanólido A en diferentes partes de la planta como la hoja, la raíz, el tallo y el fruto de dos morfotipos de W. somnifera.

[0020] Ghosal et al, publicación de patente estadounidense 2004/0166184, revela la composición de withania somnífera de las raíces y las hojas que contiene un 8-25 % de glicósidos de witanólidos y sitoindósidos, alrededor de un 25-75 % de oligosacáridos y menos de un 2 % de witanferina A(aglicona) libre. Ghosal et al US 6153198 divulga una composición de extracto de Withania Somnífera de alta pureza procedente de la raíz de ashwagandha que contiene al menos un 3 % de glicósido de witanólido y sitoindósido, al menos un 3 % de oligosacáridos y menos de un 0,5 % de witaferina A citotóxica (agliconas) en forma de polvo estable de alta pureza para producir un efecto de cognición mejorado para el uso y para aumentar la facilidad de aprendizaje. La patente estadounidense 7108870, Sangwan et al, informó de un proceso mejorado de aislamiento analítico y cuantitativo de la witaferina A de Withnia Somnífera. La publicación de patente US 20140087009, McNeary et al, divulga una composición que incluye combinaciones de pglucano y Withania Somnifera para aumentar la actividad inmunológica de ciertas citoquinas objetivo ad fagocitosis y reducir el cortisol o la corticosterona. Sumithradevi et al informaron de un método sencillo para purificar el witanólido A de las raíces de Withania somnifera. Uddin et al informaron del perfil fitoquímico y farmacológico de Withania somnifera. El documento WO2012160569, Jayesh Panalal et al divulga un proceso para la extracción de witanósido IV y V de las raíces de ashwagandha y su composición.

SUMARIO

[0021] Visto desde un primer aspecto, la invención proporciona una composición con recubrimiento entérico de un extracto de Withania somnifera, donde el extracto de Withania somnifera es un extracto de raíz de Withania somnifera que comprende al menos aproximadamente un 35 % de glicósidos de witanólidos y al menos aproximadamente un 10 % de saponinas; o un extracto de raíz de Withania somnifera que comprende al menos aproximadamente un 80 % de glicósidos de witanólidos y al menos aproximadamente un 15 % de saponinas.

[0022] Visto desde un segundo aspecto, la invención proporciona un extracto de Withania somnifera que comprende entre aproximadamente un 35 % y un 80 % de glicósidos de witanólidos.

[0023] Visto desde un tercer aspecto, la invención proporciona un extracto de Withania somnifera, que está en forma de una composición con recubrimiento entérico según el primer aspecto, para su uso en un método de mejora de la biodisponibilidad de los glicósidos de witanólidos.

[0024] Visto desde un cuarto aspecto, la invención proporciona un extracto de Withania somnifera, que está en forma de una composición con recubrimiento entérico según el primer aspecto, para su uso en un método de mejora de la bioactividad del extracto de Withania somnifera.

[0025] Visto desde un quinto aspecto, la invención proporciona un extracto de Withania somnifera como se define según el primer o segundo aspecto para su uso en un método de tratamiento.

[0026] Visto desde un sexto aspecto, la invención proporciona un extracto de Withania somnifera como se define según el primer o el segundo aspecto para su uso en un método de tratamiento, que se selecciona del grupo que consiste en mejorar la actividad inmunomoduladora, mejorar la actividad antiinflamatoria, mejorar la actividad contra el estrés, tratar la diabetes, donde la actividad inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste en un aumento de las células de la médula ósea, un aumento del número de células a-esterasa positivas, un aumento del valor del título de anticuerpos IgG e IgM, un aumento del número de células productoras de anticuerpos, y donde la mejora de la actividad contra el estrés es un aumento del tiempo de tolerancia al estrés por anoxia.

[0027] Visto desde un séptimo aspecto, la invención proporciona el uso de un extracto de Withania somnifera como se define según el primer o el segundo aspecto en la mejora de la actividad contra el estrés, donde la mejora de la actividad contra el estrés es una mejora del tiempo de resistencia a la natación.

[0028] En el presente documento se describe un método para mejorar la bioactividad de los extractos de ashwagandha. La divulgación proporciona una composición estable obtenida a partir del extracto de ashwagandha. La divulgación proporciona un extracto de ashwagandha enriquecido con glicósidos de witanólidos y saponinas del que se disminuyen o eliminan los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos. La divulgación proporciona un extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico en formas de dosificación adecuadas para obtener una composición estable. La divulgación proporciona métodos para producir el extracto de ashwagandha. La divulgación proporciona métodos para producir el extracto de ashwagandha enriquecido con contenido de glicósidos de witanólidos, contenido de saponina, después de la eliminación de alcaloides, agliconas de witanólidos y oligosacáridos. El extracto de ashwagandha de acuerdo con el segundo aspecto puede prepararse a partir de la raíz, los tallos, las hojas y la planta entera de ashwagandha. La divulgación proporciona un método para aumentar la bioactividad de los glicósidos de witanólidos después de administrar la composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico, incluso con un nivel de dosis más bajo. La divulgación proporciona además una composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico que tiene actividad contra el estrés, actividad inmunomoduladora, actividad antidiabética, actividad antiinflamatoria, etc., incluso con un nivel de dosis más bajo.

[0029] La divulgación proporciona un extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico en combinación con extracto de amaranto para mejorar la resistencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0030]

La figura 1 muestra un método de preparación del extracto de diclorometano de la raíz de ashwagandha tratada con amoníaco.

La figura 2 muestra un método de preparación de un extracto de metanol al 60 % de la raíz de ashwagandha tratada con amoníaco.

La figura 3 muestra un método de preparación de un extracto de metanol al 50 % de la raíz de ashwagandha.

La figura 4 muestra un método de preparación de un extracto purificado de metanol al 50 % de la raíz de ashwagandha tratada con amoníaco.

La figura 5 muestra un método de preparación de la columna purificada con metanol eluido al 50 % de la raíz de ashwagandha tratada con amoníaco.

La figura 6 proporciona un método de preparación de extracto de cloroformo de extracto de metanol al 60 % de la raíz de ashwagandha.

La figura 7 proporciona un método de preparación de un extracto de etanol al 20 % de la raíz de ashwagandha tratada con amoníaco.

La figura 8 proporciona un método de preparación de un extracto de agua purificada de amaranto.

La figura 9 proporciona un método de preparación de una combinación de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico y extracto de amaranto purificado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0031] Aunque se sabe que los extractos de ashwagandha tienen propiedades beneficiosas, durante nuestros estudios descubrimos que los alcaloides y la fracción enriquecida con componentes alcaloides tenían efectos tóxicos en los animales. La fracción sin alcaloides no mostraba toxicidad, pero conservaba los efectos beneficiosos de la ashwagandha y resultaba ser superior al extracto completo. Los compuestos identificados en el extracto de raíz de ashwagandha que presentaban toxicidad incluían compuestos alcaloides, witaferina A, witanina y agliconas de witanólidos. Eliminamos los componentes tóxicos de la ashwagandha mediante un novedoso proceso de extracción y purificación. Al mismo tiempo, se enriqueció el porcentaje de componentes activos como los glicósidos de witanólidos y las saponinas en el extracto mediante el novedoso proceso de extracción y purificación.

[0032] Se estudió la actividad de diferentes extractos o polvos de ashwagandha en diferentes pH. Los glicósidos de witanólidos sufren hidrólisis en un pH ácido y se convierten en agliconas de witanólidos. Las agliconas de witanólidos tienen efectos tóxicos. Esta conversión se producirá en el entorno ácido del estómago tras la ingesta oral de extracto de ashwagandha normal. Un recubrimiento entérico puede evitará el contacto de los glicósidos de witanólidos con el pH ácido del estómago y liberar el contenido en zonas con pH neutro o ligeramente alcalino en el tracto gastrointestinal desde donde se absorbe.

[0033] Un extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico liberará los activos (glicósidos de witanólidos) en el intestino delgado sin liberarlos en el estómago, evitando así la hidrólisis a agliconas y mejorando la absorción y la biodisponibilidad oral de glicósido de witanólido en el organismo.

[0034] Se describen métodos para mejorar la bioactividad del extracto de ashwagandha. Se proporciona una composición altamente estable de extracto de ashwagandha enriquecida con glicósidos de witanólidos y saponinas tras la eliminación de alcaloides, agliconas de witanólidos y oligosacáridos. La divulgación también proporciona procesos para la fabricación de extractos enriquecidos de ashwagandha tras la eliminación de alcaloides y oligosacáridos. La divulgación también se refiere a extractos de ashwagandha con recubrimiento entérico. Los extractos están enriquecidos con glicósidos de witanólidos y saponinas tras la eliminación de alcaloides, agliconas de witanólidos y oligosacáridos.

[0035] Se proporciona una composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico. Un recubrimiento entérico protege a los glicósidos de witanólidos de la hidrólisis en condiciones ácidas, lo que impide la conversión de los glicósidos de witanólidos en agliconas y el suministro de glicósido de witanólido en un pH neutro/alcalino en el tracto gastrointestinal (GIT, por sus siglas en inglés). Algunos modos de realización dan a conocer una composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entéri

con un nivel de dosis más bajo al evitar la conversión de los glicósidos de witanólidos en agliconas de witanólidos en un ambiente ácido. Se ha determinado que la composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico tiene actividad contra el estrés, actividad inmunomoduladora, actividad antidiabética, actividad antiinflamatoria, mejora de la calidad del sueño, etc. Se proporcionan métodos para aumentar la biodisponibilidad y la bioactividad de los glicósidos de witanólidos después de administrar la composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico. Se proporciona un método para mejorar la resistencia después de administrar el extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico en combinación con el extracto de amaranto.

[0036] La divulgación proporciona un método para mejorar la bioactividad del extracto de ashwagandha. La divulgación proporciona una composición estable de ashwagandha preparada mediante un método único de extracción. Los procesos divulgados proporcionan un extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico enriquecido con glicósidos de witanólidos que incluyen los witanósidos I a VII y los sitoindósidos I a X después de la eliminación de los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos.

[0037] La divulgación se refiere a una composición de extracto de raíz de ashwagandha. La composición se enriquece con contenido de glicósidos de witanólidos (witanósidos I a VII, sitoindósidos I a X) después de eliminar los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos.

[0038] El extracto de raíz de ashwagandha se analiza mediante HPLC y se ha descubierto que contiene glicósidos de witanólidos (witanósido I a VII), sitoindósidos (sitoindósidos I a X) y su presencia se confirma mediante análisis de LCMS. El extracto de ashwagandha contiene saponinas y se analiza mediante el método UV.

[0039] La divulgación proporciona polvo de ashwagandha, polvo y/o extracto de ashwagandha y formulación. La divulgación también proporciona polvo con recubrimiento entérico o gránulos de extracto de ashwagandha en polvo. El extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico resultó tener actividad contra el estrés, actividad inmunomoduladora, actividad antidiabética, actividad antiinflamatoria, mejora de la calidad del sueño, etc. El extracto de ashwagandha sin recubrimiento también resultó tener actividad contra el estrés, actividad inmunomoduladora, actividad antidiabética, actividad antiinflamatoria, mejora de la calidad del sueño, etc.

[0040] En algunos modos de realización, el extracto de ashwagandha se mezcla con un segundo extracto. El segundo extracto se selecciona del grupo que consiste en el extracto de amla, el extracto de cúrcuma, el extracto de semilla de uva, el extracto de té verde, el extracto de granada, el extracto de amaranto, el extracto de costus, el extracto de cacao, el extracto de raíz de coco, el extracto de romero, el extracto de hoja de menta, el anís estrellado, el extracto de albahaca dulce, el extracto de canela/extracto de clavo, el extracto de jengibre, el extracto de semilla de comino, el extracto de pimienta negra, el extracto de alholva, o combinaciones de los mismos.

[0041] Se ha determinado que el extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico mezclado con un segundo extacto tiene actividad contra el estrés, actividad inmunomoduladora, actividad antidiabética, actividad antiinflamatoria, mejora la calidad del sueño, etc.

[0042] En algunos modos de realización, el extracto de ashwagandha puede ser fortificado mediante la adición de extracto de amaranto. Algunos modos de realización proporcionan una combinación de extracto de ashwagandha y extracto de amaranto para mejorar la resistencia. Algunos modos de realización proporcionan una combinación de extracto de ashwagandha y extracto de amaranto para mejorar la resistencia, donde la proporción de extracto de ashwagandha y extracto de amaranto es 1:1. En algunos modos de realización, la proporción de peso de extracto de ashwagandha y de extracto de amaranto es 3:1. En otro modo de realización, la proporción de extracto de ashwagandha y de extracto de amaranto es 1:3.

[0043] Algunos modos de realización proporcionan un extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico en combinación con extracto de amaranto en proporciones diferentes. En algunos modos de realización, la proporción de peso de extracto de ashwagandha recubierto y de extracto de amaranto es 3:1. En algunos modos de realización, la proporción de peso de extracto de ashwagandha y de extracto de amaranto es 1:1. En otro modo de realización, la proporción de extracto de ashwagandha recubierto y de extracto de amaranto es 1:3.

[0044] La divulgación proporciona métodos para producir el extracto de amaranto. El extracto de amaranto de acuerdo con el segundo aspecto puede prepararse a partir de las hojas frescas o secas y el tallo del amaranto.

[0045] En algunos modos de realización del extracto de amaranto, el amaranto se selecciona del grupo que consiste en Amaranthus caudatus, Amaranthus cruentus, Amaranthus tricolor, Amaranthus blitum, Amaranthus viridis, Amaranthus dubis o combinaciones de los mismos.

[0046] En algunos modos de realización del extracto de amaranto, los nitratos oscilan entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 3 %. En algunos modos de realización del extracto, los nitratos oscilan entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 10 %. En algunos modos de realización del extracto, los nitratos oscilan entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 20 %. En algunos modos de realización del extracto, los nitratos oscilan entre aproximadamente el 3 % y aproximadamente el 20 %. En algunos modos de realización del extracto, los nitratos oscilan entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 80 %.

[0047] En algunos modos de realización, las verduras ricas en nitratos incluyen zumo, extracto, polvo y similares de amaranto, col, espinacas, remolacha, alcachofa, espárrago, haba, berenjena, albahaca sagrada, gymnema sylvestre, ajo, cebolla, gingko, judía verde, té verde, baya de espino, algas, champiñón, guisante, pimiento, patata, calabaza de verano, batata, salvia, tomate, tribulus, sandía, brócoli, zanahoria, coliflor, pepino, calabaza, achicoria, eneldo, nabo, col de Milán, apionabo, col china, escarola, hinojo, colinabo, puerro, perejil, apio, berro, perifollo, lechuga, rúcula y similares.

[0048] En otro modo de realización, la sal de nitrito se selecciona del grupo que consiste en nitrito de sodio, nitrito de potasio, nitrito de magnesio, nitrito de calcio y sus mezclas. En un modo de realización particular, la sal de nitrito se selecciona del grupo que consiste en nitrito de sodio, nitrito de potasio y mezclas de los mismos.

[0049] Según algunos modos de realización, el extracto de ashwagandha puede obtenerse de la planta entera de ashwagandha o de la raíz fresca o de la raíz, el tallo o las hojas secas de ashwagandha o de sus combinaciones.

[0050] Un extracto regular de ashwagandha contiene una composición de witaferina A, witanólidos, alcaloides, aminoácidos, esteroides, glicósidos, taninos condensados, flavonoides y oligosacáridos. Los componentes alcaloides y witaferina A (witanólidos o agliconas de witanólidos) resultan ser tóxicos. Por lo tanto, purificamos el extracto por fraccionamiento para eliminar los componentes tóxicos. Este proceso de extracción único da como resultado un extracto de ashwagandha enriquecido con componentes activos como los glicósidos de witanólidos y las saponinas, donde los glicósidos de witanólidos incluyen los witanósidos I-VII y los sitoindósidos I a X.

[0051] Durante nuestros estudios, descubrimos que los alcaloides y la fracción enriquecida con componentes alcaloides tenían efectos tóxicos en los animales. Los animales alimentados con la fracción rica en alcaloides presentan una disminución de los movimientos espontáneos, una respuesta lenta a los estímulos y una disminución del tono muscular. Los animales alimentados con extracto de raíz de ashwagandha purificado libre de alcaloides con un 80 % de glicósidos de witanólidos, y con extracto de raíz de ashwagandha purificado libre de alcaloides con un 80 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento entérico, no presentan síntomas tóxicos.

[0052] Los animales alimentados con extracto de raíz de ashwagandha con un mínimo del 5 % de glicósidos de witanólidos o con una fracción rica en alcaloides muestran pérdida de apetito, mientras que los animales alimentados con extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides con un 80 % de glicósidos de witanólidos y con extracto de raíz de ashwagandha purificado con recubrimiento entérico con un 80 % de glicósidos de witanólidos muestran un apetito normal. En nuestro estudio podemos observar que algunos animales alimentados con extracto de raíz de ashwagandha con un mínimo de un 5 % de glicósidos de witanólidos y fracción rica en alcaloides murieron debido a convulsiones clónicas y depresión respiratoria.

[0053] Algunos modos de realización proporcionan una composición obtenida del extracto de ashwagandha a partir de raíces de ashwagandha. En algunos modos de realización del extracto de ashwagandha o de las composiciones de ashwagandha con recubrimiento entérico, los glicósidos de witanólidos oscilan en torno al 40 %. En algunos modos de realización del extracto de ashwagandha o de las composiciones de ashwagandha con recubrimiento entérico, los glicósidos de witanólidos oscilan en torno al 50%. En algunos modos de realización del extracto de ashwagandha o de las composiciones de ashwagandha con recubrimiento entérico, los glicósidos de witanólidos oscilan en torno al 80 %. En algunos modos de realización del extracto de ashwagandha o de las composiciones de ashwagandha con recubrimiento entérico, los glicósidos de witanólidos son de al menos un 80 %. En algunos modos de realización, las saponinas oscilan entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 2 %. En algunos modos de realización, las saponinas oscilan entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 10 %. En algunos modos de realización, las saponinas oscilan entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 30 %. En algunos modos de realización, los alcaloides oscilan entre aproximadamente el 0,001 % y aproximadamente el 0,05 %. En algunos modos de realización, los alcaloides oscilan entre aproximadamente el 0,001 % y aproximadamente el 0,1%. En algunos modos de realización, las agliconas de witanólidos oscilan entre aproximadamente el 0,001 % y aproximadamente el 0,05 %. En algunos modos de realización, las agliconas de witanólidos oscilan entre aproximadamente el 0,001 % y aproximadamente el 0,1 %. En algunos modos de realización, los oligosacáridos oscilan entre aproximadamente el 0,001 % y aproximadamente el 0,05 %. En algunos modos de realización, los oligosacáridos oscilan entre aproximadamente el 0,001 % y aproximadamente el 0,1%.

[0054] Algunos modos de realización proporcionan una composición que comprende un extracto de raíz de Withania somnífera. El extracto de raíz de Withania somnífera tiene al menos un 35 % de glicósidos de witanólidos y un 10 % de saponinas. El extracto también tiene aproximadamente un 0,4 % de alcaloides. Las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos eran indetectables en el extracto mediante el método HPLC. Los glicósidos de witanólidos incluían los sitoindósidos I a X, los witanósidos I a VII y los witánmidos.

[0055] Algunos modos de realización proporcionan una composición de un extracto de raíz de Withania somnífera. El extracto tiene al menos un 80 % de glicósidos de witanólidos. El extracto tiene aproximadamente un 15 % de saponinas. El extracto tiene aproximadamente un 0,001 % de alcaloides. Las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos eran indetectables en el extracto mediante el método HPLC. Los glicósidos de witanólido incluían los sitoindósidos I a X, los witanósidos I a VII y los witánmidos.

[0056] Algunos modos de realización proporcionan una composición con recubrimiento entérico de un extracto de Withania somnifera. El extracto de Withania somnifera incluye glicósidos de witanólidos. La composición con recubrimiento entérico tiene un material de recubrimiento entérico. El material de recubrimiento entérico puede ser poli(ácido metacrílico-co-metilmetacrilato), ésteres de ácido aleurético, acetato ftalato de celulosa, trimelitato de acetato de celulosa, ftalato de acetato de polivinilo, hidroxipropilmetilcelulosa ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato de acetaldehído dimetilcelulosa, quitosano, zeína, ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos, fibras vegetales, o una combinación de etilcelulosa modificada y alginato de sodio. En algunos modos de realización de la composición con recubrimiento entérico, el extracto de Withania somnífera tiene al menos un 80 % de glicósidos de witanólidos.

[0057] En algunos modos de realización, el extracto de Withania somnífera en la composición con recubrimiento entérico tiene alrededor de un 10 % de saponinas; alrededor de un 0,4 % de alcaloides; y, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos fueron indetectables mediante el método HPLC. En algunos modos de realización, el extracto de Withania somnífera en la composición con recubrimiento entérico tiene alrededor de un 15 % de saponinas; alrededor de un 0,001 % de alcaloides. En algunos modos de realización, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos fueron indetectables mediante el método HPLC. En algunos modos de realización, los glicósidos de witanólidos incluían los sitoindósidos I a X, los witanósidos I a VII y los witánmidos.

[0058] Algunos modos de realización proporcionan una composición que tiene una combinación de un extracto de amaranto y un extracto con recubrimiento entérico de Withania somnífera. Algunos modos de realización de la combinación de extracto de amaranto y extracto con recubrimiento entérico de Withania somnifera proporcionan una resistencia mejorada.

[0059] También se describe en el presente documento un método para preparar un extracto de Withania somnifera. El método incluye la limpieza de las raíces de Withania somnifera, seguida del tratamiento de las raíces frescas limpiadas de Withania somnifera con amoníaco. A continuación, se extraen las raíces frescas limpiadas con dicloruro de metileno para obtener un filtrado y un residuo. El residuo se lava con agua para obtener un lavado con un pH que oscila entre 6 y 7 aproximadamente. El residuo lavado se seca a una temperatura de entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 100 °C para obtener un residuo seco. El residuo seco se pulveriza para obtener un extracto de raíces de Withania somnifera. El extracto de raíces de Withania somnifera es un polvo. A veces, el método incluye, además, la preparación de gránulos del polvo seguido de la pulverización de los gránulos con un material de recubrimiento entérico para obtener una composición con recubrimiento entérico. El extracto de raíz de Withania somnifera tiene al menos aproximadamente un 3 % de glicósidos de witanólidos y al menos un 1 % de saponinas.

[0060] También se describe en el presente documento un método para preparar un extracto de Withania somnifera. El método incluye la limpieza de las raíces de Withania somnifera, seguida del tratamiento de las raíces frescas limpiadas de Withania somnifera con amoníaco. A continuación, se extraen las raíces frescas limpiadas con dicloruro de metileno para obtener un filtrado y un residuo. El residuo se lava con agua para obtener un lavado con un pH que oscila entre 6 y 7 aproximadamente. El residuo lavado se seca a una temperatura de entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 100 °C para obtener un residuo seco. El residuo seco se pulveriza para obtener un extracto de raíces de Withania somnifera. El extracto de raíces de Withania somnifera es un polvo. Algunos modos de realización del método incluyen además la extracción del polvo con metanol a entre unos 60 °C y unos 70 °C para obtener un sobrenadante y un residuo. A continuación, concentrar el sobrenadante para obtener un concentrado. A continuación, secar el concentrado para obtener un extracto de metanol seco en forma de polvo. A veces, el método incluye, además, la preparación de gránulos del polvo seguido de la pulverización de los gránulos con un material de recubrimiento entérico para obtener una composición con recubrimiento entérico.

[0061] También se describe en el presente documento un método para preparar un extracto de Withania somnifera. El método incluye la limpieza de las raíces de Withania somnifera, seguida del tratamiento de las raíces frescas limpiadas de Withania somnifera con amoníaco. A continuación, se extraen las raíces frescas limpiadas con dicloruro de metileno para obtener un filtrado y un residuo. El residuo se lava con agua para obtener un lavado con un pH que oscila entre 6 y 7 aproximadamente. El residuo lavado se seca a una temperatura de entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 100 °C para obtener un residuo seco. El residuo seco se pulveriza para obtener un extracto de raíces de Withania somnifera. El extracto de raíces de Withania somnifera es un polvo. En ocasiones, el método incluye, además la extracción del polvo con metanol a entre unos 60 °C y unos 70 °C para obtener un sobrenadante y un residuo. A continuación, concentrar el sobrenadante para obtener un concentrado. A continuación, secar el concentrado para obtener un extracto de metanol seco en forma de polvo. El método incluye además disolver el extracto de metanol seco en agua y clarificar el producto resultante para obtener un sobrenadante y un residuo. A continuación, cargar el sobrenadante en una columna de adsorción. A continuación, eluir la columna de adsorción con agua y luego con metanol al 50 %. A continuación, concentrar y secar el eluido de metanol al 50 % para obtener un extracto seco de metanol de raíces de Withania somnifera. El extracto de metanol seco es un polvo. La columna de adsorción puede ser de sílice, SP700, HP20, HP2MGL, SA10A, WA10, CRB03, CRB05, CR20, XAD 7HP, FP66, SK1B o SP825L. A veces, el método incluye, además, la preparación de gránulos del polvo seguido de la pulverización de los gránulos con un material de recubrimiento entérico para obtener una composición con recubrimiento entérico. El extracto de raíz de Withania somnifera tiene al menos aproximadamente un 35 % de glicósidos de witanólido y al menos un 10 % de saponinas. Algunos modos de realización proporcionan un extracto de raíces de Withania somnifera con recubrimiento entérico, en el que el extracto de raíz de Withania somnifera tiene al menos aproximadamente un 35 % de glicósidos de witanólidos y al menos aproximadamente un 10 % de saponinas.

[0062] También se describe en el presente documento un método para preparar un extracto de Withania somnifera. El método incluye la limpieza de las raíces de Withania somnifera, seguida del tratamiento de las raíces frescas limpiadas de Withania somnifera con amoníaco. A continuación, se extraen las raíces frescas limpiadas con dicloruro de metileno para obtener un filtrado y un residuo. El residuo se lava con agua para obtener un lavado con un pH que oscila entre 6 y 7 aproximadamente. El residuo lavado se seca a una temperatura de entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 100 °C para obtener un residuo seco. El residuo seco se pulveriza para obtener un extracto de raíces de Withania somnífera. El extracto de raíces de Withania somnífera es un polvo.

[0063] En ocasiones, el método incluye, además, la extracción del polvo con metanol a entre unos 60 °C y unos 70 °C para obtener un sobrenadante y un residuo. A continuación, concentrar el sobrenadante para obtener un concentrado. A continuación, secar el concentrado para obtener un extracto de metanol seco en forma de polvo. El método incluye además disolver el extracto de metanol seco en agua y clarificar el producto resultante para obtener un sobrenadante y un residuo. A continuación, cargar el sobrenadante en una columna de adsorción. A continuación, eluir la columna de adsorción con agua y luego con metanol al 50 %. A continuación, concentrar y secar el eluido de metanol al 50 % para obtener un extracto seco de metanol de raíces de Withania somnífera. El extracto de metanol seco es un polvo. La columna de adsorción puede ser de sílice, SP700, HP20, HP2MGL, SA10A, WA10, CRB03, CRB05, CR20, XAD 7HP, FP66, SK1B o SP825L. El método incluye además la disolución del polvo del extracto de metanol seco en agua, seguida de una centrifugación para obtener un sobrenadante y un residuo. A continuación, se carga el sobrenadante en una columna de adsorción. La columna de adsorción puede ser de sílice, SP700, HP20, HP2MGL, SA10A, WA10, CRB03, CRB05, CR20, XAD 7HP, FP66, SK1B y SP825L. A continuación, la columna de adsorción se eluye con metanol al 10 % y luego con metanol al 50 % para obtener un eluido de metanol al 50 %. El eluido de metanol al 50 % se disuelve en metanol, y a continuación se concentra el producto disuelto. A continuación, se añade acetona al producto concentrado para obtener un precipitado. El precipitado se filtra y se seca para obtener un polvo del extracto de raíces de Withania somnifera. A veces, el método incluye, además, la preparación de gránulos del polvo seguido de la pulverización de los gránulos con un material de recubrimiento entérico para obtener una composición con recubrimiento entérico. El extracto de raíz de Withania somnifera tiene al menos aproximadamente un 80 % de glicósidos de witanólidos y al menos aproximadamente un 15 % de saponinas. Algunos modos de realización proporcionan un extracto de raíces de Withania somnifera con recubrimiento entérico, en el que el extracto de raíz de Withania somnifera tiene al menos aproximadamente un 80 % de glicósidos de witanólidos y al menos aproximadamente un 15 % de saponinas.

[0064] También se describe en el presente documento un método para preparar un extracto de Withania somnifera. El método incluye la limpieza de las raíces de Withania somnifera, seguida del tratamiento de las raíces frescas limpiadas de Withania somnifera con amoníaco. A continuación, se extraen las raíces frescas limpiadas con dicloruro de metileno para obtener un filtrado y un residuo. El residuo se lava con agua para obtener un lavado con un pH que oscila entre 6 y 7 aproximadamente. El residuo lavado se seca a una temperatura de entre aproximadamente 90 °C y aproximadamente 100 °C para obtener un residuo seco. El residuo seco se pulveriza para obtener un extracto de raíces de Withania somnifera. El extracto de raíces de Withania somnifera es un polvo. El método incluye además la extracción del polvo con metanol al 20 % a entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 80 °C para obtener un sobrenadante y un residuo. A continuación, concentrar el sobrenadante para obtener un extracto de etanol concentrado. A continuación, secar el extracto de etanol concentrado para obtener un polvo de extracto seco de etanol de raíces de Withania somnifera. A veces, el método incluye, además, la preparación de gránulos del polvo seguido de la pulverización de los gránulos con un material de recubrimiento entérico para obtener una composición con recubrimiento entérico.

[0065] También se describe en el presente documento un método para mejorar la bioactividad de un extracto de Withania somnifera mediante la administración de una composición con recubrimiento entérico del extracto de Withania somnifera. El método para mejorar la biodisponibilidad de los glicósidos de witanólidos de un extracto de Withania somnifera conlleva la administración de una composición con recubrimiento entérico del extracto de Withania somnifera de acuerdo con el primer aspecto de la invención. También se describe en el presente documento un método de administración de un extracto de Withania somnifera en un medio que tiene un pH que oscila entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9 mediante la administración de una composición con recubrimiento entérico del extracto de Withania somnifera. El extracto de Withania somnifera se libera de la composición con recubrimiento entérico del extracto de Withania somnifera cuando el pH del medio oscila entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9. También se describe en el presente documento un método de tratamiento mediante la administración de un extracto de Withania somnifera como se define de acuerdo con el primer o el segundo aspecto. Las afecciones tratadas incluyen la mejora de la actividad inmunomoduladora, la mejora de la actividad antiinflamatoria, la mejora de la actividad contra el estrés y el tratamiento de la diabetes. La actividad inmunomoduladora incluye un aumento de las células de la médula ósea, un aumento del número de células a-esterasa positivas, un aumento del valor del título de anticuerpos IgG e IgM, un aumento del número de células productoras de anticuerpos. La mejora de la actividad contra el estrés se observa como un mayor tiempo de tolerancia al estrés por anoxia y un mayor tiempo de resistencia a la natación. También se describe en el presente documento un método de tratamiento mediante la administración de un extracto de Withania somnifera con recubrimiento entérico. Las condiciones del método de tratamiento incluyen la mejora de la actividad inmunomoduladora, la mejora de la actividad antiinflamatoria, la mejora de la actividad contra el estrés y el tratamiento de la diabetes. La mejora de la actividad inmunomoduladora incluye un aumento de las células de la médula ósea, un aumento del número de células a-esterasa positivas, un aumento del valor del título de anticuerpos IgG e IgM, un aumento del número de células productoras de anticuerpos. La mejora de la actividad contra el estrés incluye un mayor tiempo de tolerancia al estrés por anoxia y un mayor tiempo de resistencia a la natación. También se describe aquí una forma de dosificación del extracto de Withania somnífera que incluye cápsulas, comprimidos, minicomprimidos, gránulos, sobres, polvos, pastas, infusiones, ampollas, soluciones, suspensiones, emulsiones, píldoras o cremas. También se describe en el presente documento una forma de dosificación de extracto con recubrimiento entérico de Withania somnífera. La forma de dosificación de la composición con recubrimiento entérico incluye cápsulas, comprimidos, minicomprimidos, gránulos, sobres, polvos, pastas, infusiones, ampollas, soluciones, suspensiones, emulsiones, píldoras o cremas. Una dosis del extracto de Withania somnífera en la forma de dosificación de las composiciones de entre aproximadamente 200 mg y aproximadamente 2000 mg. Una dosis del extracto de Withania somnifera con recubrimiento entérico en la forma de dosificación de las composiciones de entre aproximadamente 200 mg y aproximadamente 2000 mg.

[0066] Se estudió la actividad de diferentes extractos/polvos de ashwagandha en diferentes pH. La administración oral de polvo de raíz de ashwagandha (200 mg/kg) a pH 1, 2, 3 y 5 después de la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 245, 245, 230 y 220 segundos respectivamente. La administración de polvos de raíz de ashwagandha (200 mg/kg) a pH 7 y 7,4 tras la inyección de reserpina fue ligeramente eficaz y el tiempo de inmovilidad fue de 205 segundos. Del mismo modo, la administración de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos (60 mg/kg) a pH 1, 2, 3 y 5 después de la inyección de reserpina fue ligeramente eficaz y el tiempo de inmovilidad fue de 235, 230, 210 y 189 segundos respectivamente. En cambio, la administración de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos (60 mg/kg) a pH 7 y 7,4 después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 152 y 150 segundos respectivamente. La administración de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos (20 mg/kg) a pH 1, 2, 3 y 5 después de la inyección de reserpina fue eficaz y el tiempo de inmovilidad fue de 220, 220, 202 y 180 segundos respectivamente. Del mismo modo, la administración de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos (20 mg/kg) a pH 7 y 7,4 después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad fue de aproximadamente 145 y 139 segundos respectivamente. En caso de administrar extractos con un contenido muy alto de glicósidos de witanólidos (80 %) (20 mg/kg) a pH 1, 2, 3 y 5 después de la inyección de reserpina es eficaz y el tiempo de inmovilidad fue de aproximadamente 212, 211, 194 y 165 segundos respectivamente. Mientras, la administración de extracto de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos (20 mg/kg) a pH 7 y 7,4 después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad fue de aproximadamente 110 y 105 segundos respectivamente. En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg (Grupo XVII), el tiempo de inmovilidad fue de sólo 122 segundos, casi similar al de los animales de control normales. La actividad del extracto de ashwagandha sometido a un tampón ácido mostró una actividad menor en comparación con el extracto sometido a un tampón neutro o básico. El extracto en pH neutro o básico muestra una mayor actividad.

[0067] Del estudio anterior se desprende que en el pH ácido el componente activo de la ashwagandha (glicósidos de witanólidos) sufre una hidrólisis y se convierte en agliconas de witanólidos. Las agliconas de witanólidos tienen efectos tóxicos. Con el fin de proteger el extracto de ashwagadha en medio ácido, se aplican diferentes tipos de recubrimiento al extracto de ashwagandha y se estudia su actividad. La administración oral de polvo de raíz de ashwagandha con recubrimiento HPC normal (200 mg/kg) tras la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad fue de 245 segundos. La administración de polvo de raíz de ashwagandha con recubrimiento entérico (200 mg/kg) tras la inyección de reserpina fue más eficaz que el recubrimiento HPC y el tiempo de inmovilidad fue de 205 segundos. La administración de polvo de raíz de ashwagandha con recubrimiento de liberación retardada (200 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue menos eficaz que el recubrimiento entérico y el tiempo de inmovilidad se registró en 220 segundos.

[0068] Del mismo modo, la administración oral de gránulos de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento HPC normal (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 215 segundos. La administración de gránulos de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento entérico (60 mg/kg) tras la inyección de reserpina fue más eficaz que el recubrimiento HPC y el tiempo de inmovilidad fue de 141 segundos. La administración de gránulos de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento de liberación retardada (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue menos eficaz que el recubrimiento entérico y el tiempo de inmovilidad se registró en 186 segundos.

[0069] La administración oral de gránulos de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento HPC normal (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina es ligeramente eficaz y el tiempo de inmovilidad se registra en 192 segundos (Grupo IX). La administración de gránulos de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento entérico (20 mg/kg) tras la inyección de reserpina fue más eficaz que el recubrimiento HPC y el tiempo de inmovilidad se registra en 138 segundos. La administración de gránulos de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento de liberación retardada (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina es menos eficaz que el recubrimiento entérico y el tiempo de inmovilidad se registra en 162 segundos.

[0070] La administración oral de gránulos de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento HPC normal (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina es eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 173 segundos. La administración de gránulos de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento entérico (20 mg/kg) tras la inyección de reserpina es más eficaz que el recubrimiento HPC y el tiempo de inmovilidad se registra en 109 segundos. La administración de gránulos de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento de liberación retardada (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina es menos eficaz que el recubrimiento entérico y el tiempo de inmovilidad se registra en 132 segundos. En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg, el tiempo de inmovilidad es de 120 segundos, casi similar al de los animales de control normales.

[0071] Del estudio anterior del extracto de ashwagandha con diferentes tipos de recubrimiento se desprende que el extracto con recubrimiento entérico es más estable en medio ácido. Por lo tanto, en nuestro siguiente estudio encontramos la actividad del extracto de ashwagandha con diferentes porcentajes de recubrimiento entérico (0,5 % a 15 %). La administración oral de polvo de raíz de ashwagandha con un recubrimiento entérico del 0,5 %, 1 % y 3 % (200 mg/kg) después de la inyección de reserpina no es muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registra en 245, 235 y 223 segundos respectivamente. La administración de polvo de raíz de ashwagandha con un recubrimiento entérico del 5 y el 7 % (200 mg/kg) después de la inyección de reserpina es más eficaz que los porcentajes más bajos de recubrimientos y el tiempo de inmovilidad se registra en 216 y 207 segundos respectivamente. La administración de polvo de raíz de ashwagandha con un recubrimiento entérico del 10, 12 y 15 % (200 mg/kg) después de la inyección de reserpina es más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registra en 201, 200 y 200 segundos respectivamente. En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg, el tiempo de inmovilidad fue de 120 segundos, que es similar al de los animales de control normales.

[0072] La administración oral de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con un 0,5 %, 1 % y 3 % de recubrimiento entérico (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina no es muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registra en 225, 220 y 206 segundos respectivamente. La administración de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con un 5 y 7 % de recubrimiento entérico (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina es más eficaz que los porcentajes más bajos de recubrimiento y el tiempo de inmovilidad se registra en 195 y 180 segundos respectivamente. La administración de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con un 10, 12 y 15 % de recubrimiento entérico (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina es más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registra en 160, 142 y 140 segundos respectivamente. En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg, el tiempo de inmovilidad es de 120 segundos, casi similar al de los animales de control normales.

[0072] La administración oral de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con un 0,5 %, 1 % y 3 % de recubrimiento entérico (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina no es muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registra en 200, 188 y 180 segundos respectivamente. La administración de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con un 5 y 7 % de recubrimiento entérico (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina es más eficaz que los porcentajes más bajos de recubrimiento y el tiempo de inmovilidad se registra en 171 y 160 segundos respectivamente. La administración de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con un 10, 12 y 15 % de recubrimiento entérico (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina es más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registra en 153, 139 y 136 segundos respectivamente. En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg, el tiempo de inmovilidad es de 120 segundos, casi similar al de los animales de control normales.

[0072] La administración oral de extracto de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con un 0,5 %, 1 % y 3 % de recubrimiento entérico (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina no es muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registra en 195, 183 y 173 segundos respectivamente. La administración de extracto de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con un 5 y 7 % de recubrimiento entérico (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina es más eficaz que los porcentajes más bajos de recubrimiento y el tiempo de inmovilidad se registra en 160 y 145 segundos respectivamente. La administración de extracto de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con un 10, 12 y 15 % de recubrimiento entérico (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina es más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registra en 122, 111 y 109 segundos respectivamente. En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg, el tiempo de inmovilidad fue de 120 segundos, que es similar al de los animales de control normales.

[0075] Algunos modos de realización proporcionan una composición obtenida a partir del extracto de ashwagandha, encapsulando la composición mediante un recubrimiento entérico polimérico. El recubrimiento entérico protege el contenido de una cápsula en el entorno altamente ácido del estómago. "Entérico" indica intestino delgado; por lo tanto, los recubrimientos entéricos evitan la liberación del medicamento antes de que llegue al intestino delgado. La mayoría de los recubrimientos entéricos funcionan presentando una superficie recubierta que es estable en el pH altamente ácido que se encuentra en el estómago, pero que se descompone rápidamente en un pH menos ácido (relativamente más básico). El material de recubrimiento entérico polimérico incluye el poli (ácido metacrílico-co-metil metacrilato) también conocido como Eudragit, goma laca (ésteres de ácido aleurético), CAP (acetato ftalato de celulosa), CAT (trimelitato de acetato de celulosa), PVAP (ftalato de acetato de poli[vinilo]), HPMCP (ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa), acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato de acetaldehído-dimetilcelulosa, quitosano, zeína, ácidos grasos, ceras, plásticos, fibras vegetales y combinación de etilcelulosa modificada y alginato sódico (Nutrateric) y sus combinaciones en cualquier proporción posible.

[0076] El extracto de raíz de ashwagandha y el extracto de raíz de ashwagandha purificado pueden estar recubiertos de material de recubrimiento entérico o no entérico.

[0077] El extracto de raíz de ashwagandha o el extracto de raíz de ashwagandha purificado se carga en la cubeta del extractor de lecho fluidizado (FBE). Se hace pasar aire caliente y filtrado hasta 90 °C a gran velocidad desde el fondo de la cubeta del FBE a través del material de alimentación (extracto de raíz de ashwagandha o extracto de raíz purificado) y el material de alimentación se fluidifica.

[0078] Mientras tanto, cualquier material de recubrimiento entérico o no entérico se disuelve en un disolvente adecuado. La solución de recubrimiento se pulveriza en el material fluidizado mediante un dispositivo de pulverización acoplado al FBE. A través del proceso de recubrimiento del lecho fluidizado, las partículas fluidizadas son pulverizadas continuamente con la solución de recubrimiento, depositando capas (películas) de material en la superficie de las partículas, y obteniendo un espesor de capa uniforme.

[0079] El estudio de actividad muestra que tras la administración de extracto de raíz de ashwagandha con un mínimo de un 6 % de glicósidos de witanólidos en dosis de 100 mg/kg y 20 mg/kg, el extracto de raíz de ashwagandha con un mínimo de un 6 % de glicósidos de witanólidos recubierto de pectina tras la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró por encima de 240 segundos. El extracto de ashwagandha con un 6 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit después de la inyección de reserpina, el tiempo de inmovilidad se registró en 195 segundos. Cuando los animales fueron tratados con extracto de raíz de ashwagandha que contenía un mínimo de un 1 % de glicósidos de witanólidos, no es eficaz y el tiempo de inmovilidad es de 242 segundos. Cuando los animales fueron tratados con extracto de raíz de ashwagandha que contenía un mínimo de un 20 % de glicósidos de witanólidos en dosis de 100 y 20 mg/kg, el tiempo de inmovilidad fue de 235 y 239 segundos respectivamente. Pero el extracto de raíz de ashwagandha con un 20 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit en una dosis de 20 mg/kg, el tiempo de inmovilidad se redujo a 190 segundos. El tiempo de inmovilidad es de 175 y 210 segundos cuando los animales son tratados con extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósidos de witanólidos en dosis de 100 y 20 mg/kg. Cuando los animales fueron tratados con extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósidos de witanólidos recubierto de pectina, HPMC y PVA en dosis de 20 mg/kg, el tiempo de inmovilidad es de 205, 207 y 204 segundos respectivamente, lo que indica una eficacia muy baja de tales recubrimientos no entéricos. A pesar de los recubrimientos no entéricos, cuando los animales fueron tratados con extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos recubierto de materiales entéricos, goma laca, CAP o Eudragit en una dosis de 20 mg/kg, el tiempo de inmovilidad se reduce a 162, 164 y 160 segundos respectivamente, lo que indica la eficacia del recubrimiento entérico. Los animales tratados con extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido en dosis de 100 y 20 mg/kg mostraron un tiempo de inmovilidad de 166 y 192 segundos respectivamente. Cuando se trata a los animales con un extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de pectina, el tiempo de inmovilidad es de 189 segundos, mientras que cuando el mismo extracto está recubierto de Eudragit, el tiempo de inmovilidad se reduce a sólo 122 segundos, lo que demuestra la eficacia del recubrimiento entérico.

[0080] Un extracto de ashwagandha sin recubrimiento entérico liberará los activos (glicósidos de witanólidos y sitoindósidos) en el estómago. En el entorno ácido del estómago, los glicósidos de witanólidos se convertirán en agliconas de witanólidos, que son tóxicas.

[0081] Sin embargo, un extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico liberará los activos (glicósidos de witanólidos y sitoindósidos) en el intestino delgado sin liberar los activos en el estómago. Los recubrimientos entéricos del extracto impiden la liberación de los activos antes de que lleguen al intestino delgado.

[0082] Se estudia la conversión de los glicósidos de witanólidos en la fracción aglicona y en el azúcar en un fluido gástrico simulado. Se ha comprobado que, a los 15 minutos en medio ácido, los glicósidos de witanólidos en comprimido sin ningún recubrimiento que contiene extracto de raíz de ashwagandha purificado se convierten en agliconas de witanólidos (33,8 %), pero sólo se forma un 1,2 % de agliconas de witanólidos tras la administración del comprimido con recubrimiento entérico de extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides. A las 2 horas se forma un 74,8 % de agliconas de witanólidos en el medio ácido tras la administración de un comprimido sin ningún recubrimiento que contiene extracto de raíz de ashwagandha. Tras la administración de un comprimido con recubrimiento entérico de extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides, sólo se forma un 4,8 por ciento de agliconas de witanólidos en el medio ácido.

[0083] Una composición de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico aumenta la biodisponibilidad de los glicósidos de witanólidos. Tras la administración de extracto de ashwagandha con un 6 % de glicósidos de witanólidos o de extracto de raíz de ashwagandha con un 6 % de glicósidos de witanólidos recubierto de pectina, no se detectan glicósidos de witanólidos en el plasma. En los animales alimentados con extracto de raíz de ashwagandha con un 6 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit a 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido fue de 15,2 ng/ml. Los glicósidos de witanólidos no se detectan en el plasma de los animales alimentados con extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos en dosis de 100 y 20 mg/kg, mientras que el extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit a 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido se encuentra en 10,2 ng/ml. Los animales alimentados con extracto de ashwagandha con un mínimo de un 20 % de glicósidos de witanólidos a 100 y 20 mg/Kg mostraron un nivel de glicósido de witanólido en plasma de 1,9 y 0,3 ng/ml respectivamente. Los animales alimentados con extracto de ashwagandha con un mínimo de un 1 % y 20 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit a 20 mg/kg mostraron un nivel de glicósido de witanólido en plasma de 1,6 y 4,2 ng/ml, lo que demuestra la eficacia del recubrimiento entérico para preservar los glicósidos de witanólidos de la hidrólisis en el estómago. En los animales alimentados con extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido en dosis de 100 y 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido en el plasma es de 60,3 y 12,4 ng/ml respectivamente. Los animales alimentados con extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido recubierto de pectina, HPMC o PVA en dosis de 20 mg/kg mostraron un nivel plasmático de glicósidos de witanólidos de 13,8, 12,9 y 13,2 ng/ml respectivamente. Cuando el mismo extracto, es decir, el extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido, se recubre con materiales entéricos como goma laca, CAP o Eudragit, el nivel plasmático de los glicósidos de witanólidos aumenta a 100,3, 101,9 y 102,3 ng/ml respectivamente, lo que indica la eficacia del recubrimiento entérico. Cuando los animales son alimentados con extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido en dosis de 100 y 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido en plasma es de 85,2 y 18,5 ng/ml respectivamente. Cuando el mismo extracto (extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido) se recubre de pectina y se administra en una dosis de sólo 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido es de sólo 17,3 ng/ml, lo que demuestra la ineficacia del recubrimiento no entérico. En cambio, cuando los animales son alimentados con extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit en una dosis de 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido en plasma es de 149,8 ng/ml, lo que demuestra la naturaleza protectora del recubrimiento entérico.

[0084] El extracto de ashwagandha puede administrarse en forma de minicomprimido. Los minicomprimidos pueden prepararse mezclando el extracto de ashwagandha con aglutinante y lubricante. La mezcla se introduce en una máquina de comprimir con troqueles y punzones de 3 mm para obtener los minicomprimidos de 3 mm de diámetro con 9 kg/cm2 de dureza. El aglutinante y el lubricante utilizados son celulosa microcristalina y esterato de magnesio.

[0085] Los minicomprimidos pueden recubrirse con un material de recubrimiento de un 5-20 %. Los minicomprimidos pueden introducirse en una cápsula para facilitar su administración.

[0086] El material adsorbente utilizado para purificar el extracto de raíz de ashwagandha puede ser sílice, SP700, HP20, HP2MGL, SA10A, WA10, CRB03, CRB05, CR20, XAD 7HP, FP66, SK1B, SP825L.

[0087] La divulgación proporciona diferentes extractos de ashwagandha extraídos mediante el uso de disolventes como el agua, el metanol, el etanol, el cloroformo, el dicloruro de metileno, el dicloruro de etileno, el isopropanol, el n-butanol, el acetato de metilo, el acetato de etilo, el acetato de propilo, el acetato de n-butilo, la acetona y sus combinaciones.

[0088] Los alcoholes de bajo peso molecular que pueden utilizarse en la preparación del extracto son el metanol, el etanol, el isopropanol, el n-butanol y sus combinaciones. Los ésteres que pueden utilizarse para la preparación del extracto incluyen el acetato de metilo, el acetato de etilo, el acetato de propilo, el acetato de n-butilo y sus combinaciones. Los alcanos que pueden utilizarse para la preparación del extracto incluyen el pentano, el hexano, el heptano, el isooctano y sus combinaciones.

[0089] En algunos modos de realización, se proporciona una forma de dosificación de la composición de extracto de ashwagandha para la administración oral en formas de dosificación adecuadas como cápsulas, comprimidos, minicomprimidos, gránulos, sobres, polvos, pastas, infusiones, inyecciones, ampollas, soluciones, suspensiones, emulsiones, píldoras, crema, etc.

[0090] La divulgación proporciona una composición de extracto de ashwagandha/polvo de ashwagandha con recubrimiento entérico en formas de dosificación adecuadas como cápsulas, comprimidos, minicomprimidos, gránulos, sobres, polvos, pasta, infusiones, ampollas, píldoras, crema, etc.

[0091] Estos sistemas de administración pueden requerir excipientes seleccionados del grupo que consiste en un desintegrante, diluyentes, aglutinantes, rellenos, un portador, adsorbentes, emulsionantes, lubricantes, agentes estabilizadores, antiadherentes, galidantes, antioxidantes y mezclas de los mismos.

[0092] Además, se da a conocer una forma de dosificación de un extracto de ashwagandha para administrar en una dosis que va de unos 200 mg a unos 2000 mg a un sujeto humano.

[0093] La divulgación proporciona un extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico enriquecido con glicósidos de witanólidos, saponinas y en el que los alcaloides, las agliconas de witanólidos y oligosacáridos fueron eliminados del extracto. El extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico tiene actividad contra el estrés, actividad inmunomoduladora, actividad antidiabética, actividad antiinflamatoria, etc. La composición del extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico se utiliza para mejorar la calidad del sueño, la capacidad aeróbica máxima (VO2 máx.), la relación de intercambio respiratorio (RER), la tasa de esfuerzo percibido (RPE), la frecuencia cardíaca (HR), la potencia media absoluta y relativa, el tiempo total para alcanzar el agotamiento máximo, el producto tasa-presión (RPP), la relación de intercambio respiratorio (pCO2/pO2), la intensidad del ejercicio, el rendimiento y la resistencia, el gasto cardíaco.

[0094] La divulgación también proporciona un polvo crudo de ashwagandha con recubrimiento entérico. Un polvo crudo de ashwagandha con recubrimiento entérico muestra actividad contra el estrés, actividad inmunomoduladora, antidiabética, actividad antiinflamatoria, utilizada para mejorar la calidad del sueño, etc.

[0095] La inflamación es una respuesta biológica compleja de los tejidos vasculares y las células inmunitarias a los estímulos nocivos, como los patógenos, las células dañadas o los irritantes. Se caracteriza por cinco signos: enrojecimiento, aumento del calor, hinchazón, dolor y/o pérdida de función. La inflamación puede clasificarse como aguda o crónica. La inflamación aguda es la respuesta inicial del organismo a los estímulos nocivos y se produce por el aumento del movimiento de plasma y leucocitos (especialmente granulocitos) desde la sangre hacia los tejidos lesionados. Una cascada de acontecimientos bioquímicos propaga y madura la respuesta inflamatoria, implicando al sistema vascular local, al sistema inmunitario y a diversas células del tejido lesionado. La inflamación prolongada, conocida como inflamación crónica, conduce a un cambio progresivo en el tipo de células presentes en el lugar de la inflamación y se caracteriza por la destrucción y la curación simultáneas del tejido del proceso inflamatorio. En la actualidad, la mayoría de los medicamentos ampliamente utilizados como agentes antiinflamatorios son antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que tienen, como mecanismo de acción, una acción inhibidora sobre las ciclooxigenasas (COX) que intervienen en la biosíntesis de los prostanoides. Sin embargo, dado que la actividad de síntesis de prostanoides está presente en varios tejidos del organismo vivo y rige la homeostasis del mismo, cuando se administran AINE se inducen diversos efectos secundarios. Una prueba de inflamación es la medición de la proteína C reactiva (PCR). Algunos clínicos abogan por incluirla de forma rutinaria. La prueba de la PCR detecta cualquier inflamación, sin importar dónde se encuentre. Una rodilla desollada, la gripe, la artritis y las infecciones son causas comunes de elevación de la PCR. La actividad antiinflamatoria de los extractos/fármacos puede evaluarse en animales pequeños como ratas y ratones. Un modelo clásico es el modelo de edema de la pata inducido por carragenina en ratas. La carragenina es un irritante y produce inflamación en la pata de las ratas tras inyectar un pequeño volumen en la región subplantar. El volumen de la pata aumenta a los 30 minutos de la inyección de carragenina, lo que puede medirse con un pletismómetro. El volumen de la pata debe medirse en varios momentos después de la administración de carragenina y del fármaco de prueba y debe compararse con el control.

[0096] La actividad antiinflamatoria del extracto de raíz de ashwagandha con recubrimiento entérico y enriquecido con glicósidos de witanólidos y saponinas, en el que se eliminaron del extracto los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos, mostró un mayor porcentaje de inhibición de la inflamación. Un mayor valor de porcentaje de inhibición indica una mayor actividad antiinflamatoria. El extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit también resulta eficaz para reducir la inflamación en la pata de la rata.

[0097] El estrés es simplemente una reacción a un estímulo que perturba el equilibrio físico o mental. Se considera que es cualquier condición que provoca una perturbación de la homeostasis del organismo. A los pocos segundos de un acontecimiento estresante agudo, las terminaciones nerviosas liberan norepinefrina en preparación para una respuesta rápida, y las glándulas suprarrenales liberan epinefrina y norepinefrina en el torrente sanguíneo, lo que da lugar a la conocida respuesta de lucha o huida. A los pocos minutos de un acontecimiento estresante (y posiblemente durante varias horas), se produce una interacción mucho más compleja entre los sistemas nervioso y endocrino y otras formas de comunicación interna, lo que da lugar a una intrincada respuesta de adaptación al estrés. Durante este tiempo, las glándulas suprarrenales liberan cortisol adicional en la circulación.

[0098] Diversas otras glándulas endocrinas son fundamentales para la respuesta al estrés. El hipotálamo, la "glándula maestra" del cerebro, responde al estrés liberando el factor liberador de corticotropina (CRF). Esta hormona indica a la glándula pituitaria que libere la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), que estimula a las glándulas suprarrenales para que liberen cortisol. Con el aumento de las hormonas del estrés, se pone en marcha un complejo mecanismo de controles de retroalimentación que acaba por indicar al hipotálamo que deje de producir CRF. Una amplia gama de acontecimientos o condiciones se considera fisiológicamente estresante porque las glándulas suprarrenales son estimuladas para liberar hormonas del estrés. Estos sucesos incluyen la restricción calórica, la cirugía, la privación del sueño, el ejercicio excesivo y diversos estados mentales, todo lo cual puede dar lugar a un aumento de las hormonas del estrés cortisol y catecolaminas.

[0099] El estrés ejerce una influencia perturbadora sobre la liberación circadiana normal de cortisol. Mediante un estudio realizado con cadetes militares sometidos a un curso de entrenamiento de cinco días de intenso ejercicio físico y privación de comida y sueño se descubrió que los niveles de cortisol subían y el rendimiento se deterioraba debido a la naturaleza estresante del entrenamiento. Los investigadores también descubrieron que "el ritmo circadiano se extinguió". Incluso después de 4-5 días de descanso, los ritmos circadianos no se habían normalizado por completo. Esta y otras investigaciones demuestran que las consecuencias fisiológicas y psicológicas del estrés agudo y crónico pueden persistir mucho después de que haya cesado el evento estresante.

[0100] El estrés es un factor que influye en muchas enfermedades, desde los dolores de cabeza hasta las enfermedades cardíacas, pasando por las deficiencias inmunológicas y los problemas digestivos. Un factor importante que contribuye al deterioro de la salud inducido por el estrés parece ser el aumento de la producción de hormonas del estrés y la consiguiente disminución de la función inmunitaria. Las investigaciones indican que un ataque de estrés agudo de cualquier tipo provocará una disminución temporal del funcionamiento del sistema inmunitario, mientras que el estrés crónico provocará una disminución continua de la inmunidad.

[0101] Hay pruebas abrumadoras que demuestran que prácticamente cualquier tipo de estrés tiene un efecto perjudicial sobre la capacidad de mantener niveles óptimos de actividad citotóxica de las células asesinas naturales (NK). Un estrés vital grave puede asociarse a una reducción de hasta el 50 por ciento de la actividad de las células NK. Dado que la actividad de las células NK desempeña un papel vital en la vigilancia del sistema inmunitario contra los virus y las células cancerosas, una disminución sostenida de este aspecto del rendimiento inmunitario puede tener graves consecuencias.

[0102] Un alto grado de estrés predijo una menor capacidad de las células NK para destruir las células cancerosas y predijo significativamente una peor respuesta a las intervenciones destinadas a mejorar la actividad de las células NK. El estrés crónico que precede a un acontecimiento estresante agudo puede afectar significativamente a la actividad de las células NK. El estrés crónico puede dar lugar a una mayor sensación de malestar subjetivo, a niveles máximos más altos de epinefrina, a una reducción inmediata más pronunciada de la actividad de las células NK y a una disminución prolongada de la actividad de las células NK en los individuos.

[0103] La capacidad de producir IgA secretora (sIgA) también parece estar influida por el estrés. La sIgA puede ser el aspecto más importante de la inmunidad humoral en las secreciones mucosas del sistema digestivo, la boca, los pulmones, el tracto urinario y otras cavidades corporales, y cualquier disminución de sus niveles puede reducir la resistencia a los patógenos microbianos. Los niveles más altos de la hormona catecolamina del estrés, la epinefrina, se asocian significativamente con concentraciones más bajas de sIgA. Los problemas cotidianos, la falta de sentido del humor y las emociones negativas pueden disminuir los niveles de sIgA.

[0104] El estrés tiene una influencia significativa en el equilibrio de la microflora intestinal. En un estudio se observó que la composición de la flora no se veía afectada de forma significativa por cambios drásticos en la dieta, pero se observaron cambios estadísticamente significativos en las proporciones de algunas especies en individuos en condiciones de estrés por ira o miedo.

[0105] La actividad contra el estrés de un extracto de raíz de ashwagandha purificado con recubrimiento entérico y enriquecido con glicósidos de witanólidos y saponinas, en el que se eliminaron del extracto los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos, mostró un mayor tiempo de tolerancia al estrés por anoxia. Un mayor tiempo de tolerancia al estrés por anoxia indica una mayor actividad contra el estrés. El tiempo de tolerancia al estrés por anoxia mejoró en el grupo tras la administración del extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de Eudragit.

[0106] El extracto de raíz de ashwagandha purificado con recubrimiento entérico y enriquecido con glicósidos de witanólidos y saponinas mostró una mejora significativa del tiempo de resistencia a la natación. Se eliminaron los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos del extracto de raíz de ashwagandha purificado y enriquecido con glicósidos de witanólidos y saponinas. También se encontró una mejora en el tiempo de resistencia en la natación en los grupos después de administrar el extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido (50 mg/kg) y el extracto de raíz de ashwagandha recubierto de un 3,5 % de glicósido de witanólido (50 mg/kg). La fracción rica en alcaloides del extracto de raíz de ashwagandha tiene muy poco efecto en el aumento del tiempo de natación.

[0107] El extracto de raíz de ashwagandha purificado con recubrimiento entérico, enriquecido con glicósidos de witanólidos y saponinas, y del que se eliminaron los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos, mostró un aumento significativo de las células de la médula ósea en comparación con los animales de control. Además, el número de células a-esterasa positivas también aumentó significativamente en los grupos tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con recubrimiento entérico. El extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido y el extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit mostraron un aumento de las células de la médula ósea en comparación con los animales de control. El extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido con y sin recubrimiento también mostró un aumento en el número de células aesterasa positivas en comparación con los controles.

[0108] El valor máximo del título de anticuerpos se observó en los grupos tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con recubrimiento entérico. El extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit también mostró un alto valor de título de anticuerpos. El número máximo de células formadoras de placas (PFC) se encuentra después de administrar el extracto de raíz de ashwagandha con recubrimiento entérico enriquecido con glicósidos de witanólidos. Los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos se eliminaron del extracto de raíz de ashwagandha purificado y enriquecido con glicósidos de witanólidos. El extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos también mostró un aumento del número de células formadoras de placas (PFC).

[0109] La actividad antidiabética del extracto de raíz de ashwagandha enriquecido con glicósidos de witanólidos y saponinas con o sin recubrimiento, en el que se eliminaron del extracto los alcaloides, las agliconas de witanólidos y los oligosacáridos, en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina muestra que el extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico tiene más actividad antidiabética en dosis más bajas en comparación con el extracto de ashwagandha sin recubrimiento. El tratamiento con extracto de ashwagandha con un mínimo de un 1 % de glicósidos de witanólidos en una dosis de 100 mg/kg redujo la FBG de 423 a 302 mg/dl, mientras que el mismo extracto tras el recubrimiento con Eudragit redujo la FBG de 428 a 300 mg/dl. El extracto de raíz de ashwagandha con un 5 % de glicósidos de witanólidos a 100 mg/kg redujo la FBG de 425 a 224 mg/dl, mientras que el producto recubierto redujo el nivel de 423 a 222 mg/dl. El extracto de ashwagandha con un mínimo de un 3,5 % de glicósidos de witanólidos a 100 mg/kg y su producto recubierto en una dosis de 20 mg/kg redujeron la FBG de 425 a 163 y de 426 a 162 mg/dl respectivamente. El extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido administrado a 100 mg/kg redujo el nivel de FBG de 424 a 120 mg/dl, mientras que el extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit administrado a 20 mg/kg durante 28 días redujo la FBG de 424 a 119 mg/dl. El extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido a 100 mg/kg y su producto recubierto a 20 mg/kg son los más eficaces y redujeron el nivel de FBG de 426 a 73 y de 425 a 72 mg/dl respectivamente.

[0110] Se estudió la actividad antidiabética de los extractos de ashwagandha recubiertos en diferentes dosis en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina. El extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit en dosis diarias de 1, 5, 10, 20 y 40 mg/kg durante 28 días redujo el nivel de FBG a 301, 250, 202, 164 y 145 mg/dl respectivamente. El extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit fue el más eficaz para reducir los niveles de FBG en ratas. Este producto en dosis diarias de 1, 5, 10, 20 y 40 mg/kg redujo el nivel de FBG a 250, 200, 160, 120 y 80 mg/dl respectivamente.

[0111] Se proporciona un método para mejorar la resistencia después de administrar el extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico en combinación con el extracto de amaranto. Tras la alimentación con extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de Eudragit a 20 mg/kg aumentó la resistencia a la natación y el tiempo de inmovilidad se redujo a 77,33 segundos. El tiempo de inmovilidad en ratas alimentadas con extracto de amaranto con un 9 % de contenido de nitrato a 50 mg/kg se registró en 66,67 segundos. La alimentación de ratas con una combinación 1:1 de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit y extracto de amaranto con un 9 % de contenido de nitrato es más eficaz y redujo el tiempo de inmovilidad a 52,67 segundos.

[0112] El extracto de ashwagandha se ha probado en sujetos humanos y se ha descubierto que es útil para los trastornos del sueño, la mejora de la resistencia, el rejuvenecimiento en la vejez y los efectos inmunomoduladores, como se describe en los siguientes estudios.

Estudio contra la infertilidad:

[0113] Se realizó un estudio multicéntrico, aleatorizado, de grupos paralelos, doble ciego y controlado con placebo en 60 adultos sanos estresados que sufrían de infertilidad durante 60 días.

[0114] Se incluyó en el estudio a varones voluntarios con síntomas de ansiedad (puntuación total de referencia de 17 o más en la Escala de Calificación de la Ansiedad de Hamilton), baja concentración de esperma (recuento de espermatozoides; espermatozoides/ml) < 15 millones/ml; menor motilidad total de los espermatozoides. El extracto de ashwagandha en una dosis de 250 mg/día en 30 días mejoró el volumen de semen, mejoró la motilidad de los espermatozoides con una motilidad progresiva de los espermatozoides, aumentó el número total de espermatozoides por eyaculación, mejoró la morfología de los espermatozoides, mejoró la viabilidad de los espermatozoides, aumentó los niveles séricos de testosterona total y libre, redujo la ansiedad medida por la puntuación HAM-A y aumentó el número de embarazos espontáneos.

Estudio inmunomodulador:

[0115] Se realizó un ensayo controlado aleatorio doble ciego sobre los efectos inmunomoduladores del extracto de ashwagandha (Withania somnífera) en 24 voluntarios adultos sanos voluntarios en una dosis de 250 mg/día durante 60 días. Se observó un aumento significativo de las citocinas Th1 y Th2 después de 30 días de administración del extracto de ashwagandha, así como un aumento significativo de las células T auxiliares y de las células NK.

Estudio sobre la testosterona:

[0116] Se realizó un ensayo aleatorio de doble ciego controlado con placebo para evaluar el efecto del extracto de ashwagandha 250 mg/día durante 60 días en la función física, sexual, vitalidad y niveles de testosterona en adultos sanos. Los voluntarios tenían niveles de testosterona en suero con una media inferior a 275 ng por decilitro. También declararon tener una disminución de la libido y una puntuación de 20 o menos en el dominio de deseo sexual (rango, 0 a 33, donde las puntuaciones más altas indican mayor deseo) de la entrevista de Derogatis relativa al funcionamiento sexual en hombres-II (DISF-M-II). También informaron de dificultades para caminar o subir escaleras, informaron de una baja vitalidad y una puntuación inferior a 40 en la escala de fatiga de la evaluación funcional de la terapia de enfermedades crónicas (FACIT) (rango, 0 a 52, con puntuaciones más altas que indican menos fatiga). Los voluntarios que tomaron el extracto de ashwagandha mostraron una mejora en la función sexual, que se muestra como una mejora de la puntuación total en el cuestionario psicosexual diario (PDQ-Q4); una mejora en la función física mostrada por un aumento del porcentaje de hombres que aumentaron al menos 50 m la distancia recorrida en la prueba de caminata de 6 minutos (6-MWT); la mejora de la función vital mostró un aumento del porcentaje de hombres con un incremento de al menos 4 puntos en la puntuación de la escala de fatiga de la evaluación funcional de la terapia de enfermedades crónicas (FACIT); mejora del dominio de la función eréctil (rango de 0 a 30, donde las puntuaciones más altas indican una mejor función) del Índice Internacional de Función Eréctil (IIEF); mejora de la puntuación en el dominio de deseo sexual del DISF;

[0117] Aumento del cambio en los niveles séricos de testosterona y testosterona libre en los 30 días de tratamiento. Estudio contra la ansiedad:

[0118] Se realizó un estudio aleatorio, doble ciego y controlado con placebo para evaluar la eficacia, seguridad, tolerabilidad y acciones farmacológicas de un extracto de ashwagandha (withania somnífera) en voluntarios adultos sanos y estresados. A 60 sujetos sanos con una puntuación total entre 6 y 17 en la Escala de Calificación de Ansiedad de Hamilton se les administraron 250 mg/día de extracto de ashwagandha durante 60 días. Se observó una mejora significativa en la puntuación total de la Escala de Calificación de la Ansiedad de Hamilton (HAM-A), una mejora en la puntuación total y en las puntuaciones de subescala de la Escala de Depresión, Ansiedad y Estrés (DASS-21), una reducción de los niveles de cortisol y DHEA en sangre y una mejora en los niveles de testosterona en 30 días.

[0119] Varios métodos para la preparación del extracto enriquecido con contenido de glicósidos de witanólidos y sin contenido de alcaloide preparado mediante la extracción de la raíz de ashwagandha son los siguientes:

La figura 1 describe un método de preparación del polvo de raíz de ashwagandha después del tratamiento con amoníaco y la extracción con MDC. La raíz fresca de ashwagandha se trata con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 (2 % de amoníaco: raíz) durante 4 horas. La raíz de ashwagandha tratada con amoníaco se extrae con dicloruro de metileno (diclorometano) a una temperatura de 70-80 °C en un extractor Soxhlet durante 10 horas para formar el residuo y el filtrado. El filtrado y el residuo se separan. El residuo se lava con agua hasta que el pH sea neutro. A continuación, se seca el residuo en una estufa de vacío a 90-100 °C. Tras el secado, el residuo (raíz de ashwagandha) se pulveriza para formar un polvo de raíz de ashwagandha.

[0120] El filtrado se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) a una temperatura de 40-50 °C para formar el extracto concentrado de diclorometano (MDC). El extracto concentrado de MDC se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para formar polvo de "extracto de diclorometano" de ashwagandha.

[0121] La figura 2 describe un método de preparación del 60 % de extracto de metanol de la raíz de ahawagandha tras el tratamiento con amoníaco y la extracción con MDC. La raíz fresca de ashwagandha se trata con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 (2 % de amoníaco: raíz) durante 4 horas. La raíz de ashwagandha tratada con amoníaco se extrae con dicloruro de metileno (diclorometano) a una temperatura de 70-80 °C en un extractor Soxhlet durante 10 horas para formar el residuo y el filtrado. El filtrado y el residuo se separan. El residuo se lava con agua hasta que el pH sea neutro. A continuación, se seca el residuo en una estufa de vacío a 90-100 °C. Tras el secado, el residuo (raíz de ashwagandha) se pulveriza para formar un polvo de raíz de ashwagandha.

[0122] El polvo de la raíz de ashwagandha se extrae con metanol al 60 % durante una hora. Se separan la raíz y la parte de metanol (sobrenadante) obtenida. El sobrenadante se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de un 60 % de extracto de metanol de ashwagandha.

[0123] La figura 3 describe un método de preparación de un 50 % de extracto de metanol de extracto de raíz de ashwagandha. La raíz de ashwagandha se extrae con metanol al 50 % durante una hora. Se separan la raíz y la parte de metanol (sobrenadante) obtenida. El sobrenadante se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha.

[0124] El polvo del extracto de ashwagandha al 50 % de metanol se disuelve en una cantidad mínima de metanol. La parte de metanol disuelta se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. Se añade acetona gota a gota al extracto de metanol concentrado hasta que la precipitación es completa. A continuación, se filtra el precipitado y se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener el polvo del extracto de ashwagandha.

[0125] La figura 6 describe un método de preparación del extracto insoluble en cloroformo del 60 % de extracto de metanol de extracto de raíz de ashwagandha. Las raíces de ashwagandha se extraen con metanol al 60 % durante una hora. Se separan la raíz y la parte de metanol (sobrenadante) obtenida. El sobrenadante se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol.

[0126] El polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol se somete a reflujo con cloroformo a la temperatura de ebullición (70-80 °C) del cloroformo durante media hora. Se separan el residuo (insoluble en cloroformo) y el sobrenadante (soluble en cloroformo). El residuo se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de cloroformo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol.

[0127] La figura 4 describe un método de preparación del extracto de metanol purificado del extracto de raíz de ashwagandha después del tratamiento con amoníaco y la extracción con MDC. La raíz fresca de ashwagandha se trata con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 (2 % de amoníaco: raíz) durante 4 horas. La raíz de ashwagandha tratada con amoníaco se extrae con dicloruro de metileno (diclorometano) a una temperatura de 70-80 °C en un extractor Soxhlet durante 10 horas para formar el residuo y el filtrado. El filtrado y el residuo se separan. El residuo (raíz de ashwagandha) se lava con agua hasta que el pH sea neutro. A continuación, se seca el residuo (raíz de ashwagandha) en una estufa de vacío a 90-100 °C. Tras el secado, el residuo (raíz de ashwagandha) se pulveriza para formar un polvo de raíz de ashwagandha. (muestra 1).

[0128] El polvo de las raíces de ashwagandha (muestra 1) se extrae con metanol al 60 % durante una hora. Se separan el residuo y los sobrenadantes obtenidos. El sobrenadante se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol. (muestra 2)

[0129] La muestra 2 se disuelve en agua y se clarifica. El sobrenadante obtenido tras la clarificación se carga en una columna de resina HP20. La columna se eluye inicialmente con agua y luego con metanol al 50 %. La fracción de metanol al 50 % se recoge y se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. La fracción de metanol concentrado se introduce en un extractor de vacío y se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de metanol al 50 % (muestra 3) de ashwagandha.

[0130] La figura 5 describe un método de preparación del extracto de metanol purificado al 60 % del extracto de raíz de ashwagandha tras el tratamiento con amoníaco y la extracción con MDC. La raíz fresca de ashwagandha se trata con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 (2 % de amoníaco: raíz) durante 4 horas. La raíz de ashwagandha tratada con amoníaco se extrae con dicloruro de metileno (diclorometano) a una temperatura de 70-80 °C en un extractor Soxhlet durante 10 horas para formar el residuo y el filtrado. El filtrado y el residuo se separan. El residuo (raíz de ashwagandha) se lava con agua hasta que el pH sea neutro. A continuación, se seca el residuo (raíz de ashwagandha) en una estufa de vacío a 90-100 °C. Tras el secado, el residuo (raíz de ashwagandha) se pulveriza para formar un polvo de raíz de ashwagandha. (muestra 1)

[0131] El polvo de las raíces de ashwagandha (muestra 1) se extrae con metanol al 60 % durante una hora. Se separan el residuo y los sobrenadantes obtenidos. El sobrenadante se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol. (muestra 2)

[0132] La muestra 2 se disuelve en agua y se clarifica. El sobrenadante obtenido tras la clarificación se carga en una columna de resina HP20. La columna se eluye inicialmente con agua y luego con metanol al 50 %. La fracción de metanol al 50 % se recoge y se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. La fracción de metanol concentrado se introduce en un extractor de vacío y se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de metanol al 50 % (muestra 3) de ashwagandha.

[0133] La muestra 3 se disuelve en agua y se centrifuga a 10000 rpm durante 10 minutos para formar el sobrenadante y el residuo. El sobrenadante se carga en la columna C18. Tras hacer pasar el sobrenadante por la columna preacondicionada, se eluye la columna con metanol al 10 %, metanol al 50 % y metanol al 100 %. Se recogieron todas las partes de metanol. Cada parte recogida se concentra por separado en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto concentrado de cada parte. El concentrado de cada parte se introduce en un extractor de vacío y se seca por separado bajo vacío a más de 500 mm de mercurio para formar polvo de eluido de metanol purificado al 10 %, eluido de metanol al 50 % (muestra 4) y eluido de metanol al 100 % de raíz de ashwagandha.

[0134] La muestra 4 se disolvió en una cantidad mínima de metanol. La muestra 4 disuelta en metanol se concentró en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado de la muestra 4. Se añade acetona gota a gota al extracto de metanol concentrado de la muestra 4 hasta que la precipitación es completa. A continuación, se filtra el precipitado y se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener el polvo de extracto de ashwagandha (muestra 5).

[0135] A veces, se proporciona extracto de cloroformo de ashwagandha. Otros modos de realización proporcionan un extracto de metanol al 100 %, un extracto de metanol al 80 % y un extracto de cloroformo-metanol de ashwagandha.

[0136] A veces, la raíz de ashwagandha se extrae con un 100 % de metanol durante una hora. Se separan la raíz y la parte de metanol (sobrenadante) obtenida. El sobrenadante se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 100 % de metanol.

[0137] La figura 7 describe un método de preparación del 20 % de extracto de etanol de la raíz de ahawagandha tras el tratamiento con amoníaco y la extracción con MDC. La raíz fresca de ashwagandha se trata con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 (2 % de amoníaco: raíz) durante 4 horas. La raíz de ashwagandha tratada con amoníaco se extrae con dicloruro de metileno (diclorometano) a una temperatura de 70-80 °C en un extractor Soxhlet durante 10 horas para formar el residuo y el filtrado. El filtrado y el residuo se separan. El residuo se lava con agua hasta que el pH sea neutro. A continuación, se seca el residuo en una estufa de vacío a 90-100 °C. Tras el secado, el residuo (raíz de ashwagandha) se pulveriza para formar un polvo de raíz de ashwagandha.

[0138] El polvo de la raíz de ashwagandha se extrae con etanol al 20 % durante una hora. La parte de etanol (sobrenadante) obtenida se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de etanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se filtra para formar un filtrado. Al filtrado se le añade un 35 % de maltodextrina y se seca por pulverización para obtener polvo de extracto de ashwagandha al 20 % de etanol.

[0139] A veces, se limpian las raíces frescas de ashwagandha. Las raíces limpias se secan y se pulverizan para obtener polvo de raíz de ashwagandha.

[0140] La figura 8 describe un método de preparación de extracto de amaranto purificado. Las hojas frescas y el tallo del amaranto se limpian, se trituran y se extraen durante aproximadamente 1 hora utilizando agua en un extractor con condensador de reflujo para obtener el residuo y el sobrenadante. El residuo y el sobrenadante se separan drenando el sobrenadante del fondo del extractor a través de la tela filtrante. El sobrenadante resultante se concentra en un evaporador de película fina agitado (ATFE) a una temperatura de 85 °C para formar extracto concentrado. El extracto de agua concentrado se hace pasar por una columna de carbón para obtener un filtrado. El filtrado se concentra y se clarifica para formar un sobrenadante y un residuo. El sobrenadante se seca al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto acuoso purificado de amaranto fresco.

[0141] La figura 9 describe un método de preparación de combinación de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico y extracto de amaranto. El extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico y el extracto de amaranto se mezclan en una proporción de 1:1 utilizando una batidora de doble cono.

[0142] A veces, el extracto o el polvo de ashwagandha con diferentes pH se prepara añadiendo polvo/extracto de ashwagandha a diferentes tampones (pH 1, 2, 3, 5, 7 y 7,4) en una proporción de 1:20 de polvo/extracto de ashwagandha:tampón. La solución extracto-tampón se mantiene en un baño de agua a 37 °C durante 2 horas. La solución se neutraliza añadiendo una solución de base o de ácido. La solución neutralizada se concentra y se seca.

[0143] A continuación se explican, a modo de ejemplos, detalles de algunos de los ensayos/experimentos realizados y sus resultados. En los ejemplos que siguen, los ejemplos 1-3, 6, 19-24 y 28 no son ejemplos de la invención, pero son útiles para su comprensión.

Ejemplo 1

[0144] Se recogieron raíces frescas de ashwagandha (100 kg). Se limpiaron las raíces de ashwagandha. Las raíces limpias se trataron con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 disolvente:raíces de ashwagandha durante 4 horas. Las raíces de ashwagandha tratadas con amoníaco se introdujeron en el extractor Soxhlet y se extrajeron con diclorometano o dicloruro de metileno (MDC) (300 L). La extracción se llevó a cabo durante 10 horas a una temperatura de unos 70 °C. Una vez finalizada la extracción, el sobrenadante y el residuo se separaron por filtración. El residuo (raíces de ashwagandha) después de la extracción con MDC se lavó con agua hasta que el pH se volvió neutro. A continuación, se secó la raíz en una estufa de vacío a 90-100 °C. Después del secado, las raíces de ashwagandha se pulverizaron para formar un polvo de raíces de ashwagandha (muestra 1) (Rendimiento 88 %).

[0145] El sobrenadante se concentró en un evaporador de película fina agitado (ATFE) a una temperatura de 70 °C para formar el extracto concentrado de MDC. El extracto concentrado de MDC se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de MDC de ashwagandha después del tratamiento con amoníaco (muestra 2) (Rendimiento 0,6 %).

[0146] Véase también la preparación del extracto en la figura 1.

[0147] El contenido de alcaloides en el polvo de raíz de ashwagandha después del tratamiento con amoníaco (muestra 1) resultó ser del 0,6 % mediante el método gravimétrico. El contenido de witanólido en el polvo de raíz de ashwagandha después del tratamiento con amoníaco (muestra 1) era de aproximadamente un 0,7 % mediante el método HPLC. El contenido de glicósido de witanólido en el polvo de raíz de ashwagandha después del tratamiento con amoníaco (muestra 1) era de aproximadamente un 4 % mediante el método HPLC. El contenido de saponina en el polvo de raíz de ashwagandha tras el tratamiento con amoníaco (muestra 1) era de aproximadamente un 1 % mediante el método UV. El contenido de alcaloides en el polvo de extracto de MDC de raíz de ashwagandha tratada con amoníaco (muestra 2) era de aproximadamente el 60 % mediante el método gravimétrico.

Ejemplo 2

[0148] Se recogieron raíces frescas de ashwagandha (100 kg). Se limpiaron las raíces de ashwagandha. Las raíces limpias se trataron con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 disolvente:raíces de ashwagandha durante 4 horas. Las raíces de ashwagandha tratadas con amoníaco se introdujeron en el extractor Soxhlet y se extrajeron con diclorometano o dicloruro de metileno (MDC) (300 L). La extracción se llevó a cabo durante 10 horas a una temperatura de unos 70 °C. Una vez finalizada la extracción, el sobrenadante y el residuo se separaron por filtración. El residuo (raíces de ashwagandha) después de la extracción con MDC se lavó con agua hasta que el pH se volvió neutro. A continuación, se secó la raíz en una estufa de vacío a 90-100 °C. Después del secado, las raíces de ashwagandha se pulverizaron para formar un polvo de raíces de ashwagandha (muestra 1) (88 %).

[0149] Se extrajeron 88 kg de polvo de raíces de ashwagandha (muestra 1) con metanol al 60 %. La muestra 1 se sometió a reflujo con metanol al 60 % (300 L) a la temperatura de ebullición (60-70 °C) del metanol durante una hora para obtener un segundo residuo y un segundo sobrenadante. El segundo residuo se volvió a extraer dos veces más con una cantidad de metanol tres veces mayor en cada ocasión. Se separaron el residuo y los sobrenadantes. Todos los sobrenadantes fueron agrupados y concentrados en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol. El rendimiento fue de aproximadamente un 10 % (muestra 2).

[0150] Véase también la preparación del extracto en la figura 2.

[0151] El contenido de glicósido de witanólido en el polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 6 % mediante HPLC. El contenido de saponina en el polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 1,5 % mediante el método UV. El contenido de alcaloides en el polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 0,1 % mediante el método gravimétrico. El contenido de agliconas de witanólidos en el polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 0,2 % mediante HPLC. El contenido de oligosacáridos en el polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 5 % mediante HPLC.

Ejemplo 3

[0152] Se recogieron raíces de ashwagandha (100 kg). Se limpiaron las raíces de ashwagandha. Las raíces limpias se extrajeron con metanol al 50 %. Las raíces se sometieron a reflujo con metanol al 50 % a la temperatura de ebullición (60-70 °C) del metanol durante una hora para obtener un primer residuo y un primer sobrenadante. El primer residuo se volvió a extraer dos veces más con una cantidad de metanol cuatro veces mayor en cada ocasión. Se separaron el residuo y los sobrenadantes. Todos los sobrenadantes fueron agrupados y concentrados en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 50 % de metanol. (rendimiento 22 %) (muestra 1).

[0153] El polvo de extracto de ashwagandha al 50 % de metanol se disolvió en una cantidad mínima de metanol. La parte de metanol disuelta se concentró en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. Se añadió acetona gota a gota al extracto de metanol concentrado hasta que la precipitación fue completa. A continuación, se filtró el precipitado y se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de ashwagandha (rendimiento de alrededor de un 3 %) (muestra 2).

[0154] Véase también la preparación del extracto en la figura 3.

[0155] El contenido de glicósido de witanólido en polvo de extracto de ashwagandha al 50 % de metanol (muestra 2) era de un 20 % mediante HPLC. El contenido de saponina en el polvo de extracto de ashwagandha al 50 % de metanol (muestra 2) era de un 3,5 % mediante el método UV. El contenido de alcaloides en el polvo de extracto de ashwagandha al 50 % de metanol (muestra 2) era de un 1,2 % mediante el método gravimétrico. El contenido de agliconas de witanólidos en el polvo de extracto de ashwagandha al 50 % de metanol (muestra 2) era de aproximadamente un 1 % mediante el método HPLC.

Ejemplo 4

[0156] Se recogieron raíces de ashwagandha (100 kg). Se limpiaron las raíces de ashwagandha. Las raíces limpias se trataron con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 disolvente:raíces de ashwagandha durante 4 horas. Las raíces de ashwagandha tratadas con amoníaco se introdujeron en el extractor Soxhlet y se extrajeron con diclorometano o dicloruro de metileno (MDC) (300 L). La extracción se llevó a cabo durante 10 horas a una temperatura de unos 70 °C. Una vez finalizada la extracción, el primer sobrenadante y el primer residuo (raíces de ashwagandha) formados se separaron por filtración. El primer residuo (raíces de ashwagandha después de la extracción con MDC) se lavó con agua hasta que el pH se volvió neutro. A continuación, se secó el primer residuo (raíz de ashwagandha) en una estufa de vacío a 90-100 °C. Tras el secado, el primer residuo (raíces de ashwagandha) se pulverizó para formar un polvo de raíces de ashwagandha (rendimiento 88 %) tras el tratamiento con amoníaco (muestra 1).

[0157] Se extrajeron 88 kg de polvo de raíces de ashwagandha (muestra 1) con metanol al 60 %. La muestra 1 se sometió a reflujo con metanol al 60 % (300 L) a la temperatura de ebullición (60-70 °C) del metanol durante una hora para obtener un segundo residuo y un segundo sobrenadante. El segundo residuo se volvió a extraer dos veces más con una cantidad de metanol tres veces mayor en cada ocasión. Se separaron el residuo y los sobrenadantes. Todos los sobrenadantes fueron agrupados y concentrados en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol. (rendimiento 10 %) (muestra 2).

[0158] Se disolvieron 10 kg de la muestra 2 en agua y se clarificaron para formar el sobrenadante y el residuo. El sobrenadante se cargó en una columna de resina HP20. Después de hacer pasar el sobrenadante por la columna, la columna se eluyó inicialmente con agua, seguida de metanol al 50 %. Se recogió el eluido de metanol al 50 %. La fracción de metanol al 50 % se concentró en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar el extracto de metanol concentrado. La fracción concentrada se introdujo en un extractor de vacío y se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de metanol al 50 % (muestra 3) (rendimiento 8 %) de ashwagandha. El polvo de la fracción al 50 % de metanol de ashwagandha contiene glicósidos de witanólidos (35 %).

[0159] Véase también la preparación del extracto en la figura 4.

[0160] El contenido de glicósido de witanólido en el polvo de ashwagandha al 50 % de eluido de metanol después del tratamiento en columna (muestra 3) era de un 35 % mediante HPLC. El contenido de saponina en el polvo de ashwagandha al 50 % de eluido de metanol después del tratamiento en columna (muestra 3) era de un 10 % mediante el método UV. El contenido de alcaloides en el polvo de ashwagandha al 50 % de eluido de metanol después del tratamiento en columna (muestra 3) resultó ser de un 0,04 % mediante el método gravimétrico. El contenido de aglicona de witanólido en el polvo de ashwagandha al 50 % de eluido de metanol después del tratamiento en columna (muestra 3) no fue detectable mediante HPLC. Los oligosacáridos en el polvo de ashwagandha al 50 % de eluido de metanol después del tratamiento en columna (muestra 3) no fueron detectables.

Ejemplo 5

[0161] Se recogieron raíces de ashwagandha (100 kg). Se limpiaron las raíces de ashwagandha. Las raíces limpias se trataron con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 disolvente:raíces de ashwagandha durante 4 horas. Las raíces de ashwagandha tratadas con amoníaco se introdujeron en el extractor Soxhlet y se extrajeron con diclorometano o dicloruro de metileno (MDC) (300 L). La extracción se llevó a cabo durante 10 horas a una temperatura de unos 70 °C. Una vez finalizada la extracción, el primer sobrenadante y el primer residuo se separaron mediante filtración. El primer residuo (raíces de ashwagandha después de la extracción con MDC) se lavó con agua hasta que el pH se volvió neutro. A continuación, se secó el primer residuo (raíces de ashwagandha) en una estufa de vacío a 90 100 °C. Tras el secado, el primer residuo (raíces de ashwagandha) se pulverizó para formar un polvo de raíces de ashwagandha (rendimiento 88 %) tras el tratamiento con amoníaco (muestra 1).

[0162] Se extrajeron 88 kg de polvo de raíces de ashwagandha (muestra 1) con metanol al 60 %. La muestra 1 se sometió a reflujo con metanol al 60 % (300 L) a la temperatura de ebullición (60-70 °C) del metanol durante una hora para obtener un segundo residuo y un segundo sobrenadante. El segundo residuo se volvió a extraer dos veces más con una cantidad de metanol tres veces mayor en cada ocasión. Se separaron el residuo y los sobrenadantes. Todos los sobrenadantes fueron agrupados y concentrados en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol. (rendimiento 10 %) (muestra 2).

[0163] Se disolvieron 10 kg de la muestra 2 en agua y se clarificaron para formar el sobrenadante y el residuo. El sobrenadante se cargó en una columna de resina HP20. Después de hacer pasar el sobrenadante por la columna, la columna se eluyó inicialmente con agua, seguida de metanol al 50 %. Se recogió el eluido de metanol al 50 %. El eluido de metanol al 50 % se concentró en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar el extracto de metanol concentrado. La fracción concentrada se introdujo en un extractor de vacío y se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de metanol al 50 % (muestra 3) (rendimiento 8 %) de ashwagandha. El polvo de la fracción al 50 % de metanol de ashwagandha contiene glicósidos de witanólidos (35 %).

[0164] El polvo de la fracción al 50 % de metanol (muestra 3) se disolvió en agua y se centrifugó a 10000 rpm durante 10 minutos para formar el sobrenadante y el residuo. El sobrenadante se cargó en la columna C18. Antes de hacerlo pasar por la columna, la columna se acondicionó con metanol al 10 %. Tras hacer pasar el sobrenadante por la columna preacondicionada, se eluyó la columna con metanol al 10 %, metanol al 50 % y metanol al 100 %. Se recogieron todas las partes de metanol. Cada parte recogida se concentró por separado en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar extracto concentrado de cada parte. El concentrado de cada parte se introdujo en un extractor de vacío y se secó por separado al vacío a más de 500 mm de mercurio para formar polvo de eluido de metanol al 10 % purificado (rendimiento 7 %), eluido de metanol al 50 % (3,5 %) (muestra 4) y eluido de metanol al 100 % (rendimiento 1,5 %) de raíz de ashwagandha.

[0165] El polvo de la fracción de ashwagandha al 50 % de metanol contiene glicósidos de witanólidos (50 %), alcaloides (0,01 %) y agliconas de witanólidos (0,03 %).

[0166] El polvo de eluido de metanol al 50 % de raíz de ashwagandha (muestra 4) se disolvió en una cantidad mínima de metanol. La muestra 4 disuelta en metanol se concentró en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado de la muestra 4. Se añadió acetona gota a gota al extracto de metanol concentrado de la muestra 4 hasta que la precipitación fue completa. A continuación, se filtró el precipitado y se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de ashwagandha (muestra 5) (rendimiento 1,8 %).

[0167] Véase también la preparación del extracto en la figura 5.

[0168] El contenido de glicósido de witanólido en el polvo de extracto de ashwagandha purificado en columna (muestra 5) resultó ser de un 80 % mediante HPLC. El contenido de saponina en el polvo de extracto de ashwagandha purificado en columna (muestra 5) resultó ser de un 15 % mediante el método UV. El contenido de alcaloides en el polvo de extracto de ashwagandha purificado en columna (muestra 5) resultó ser de un 0,001 % mediante el método gravimétrico. El contenido de aglicona de witanólido en el polvo de extracto de ashwagandha purificado en columna (muestra 5) no fue detectado mediante HPLC. No se detectó el contenido de oligosacáridos en el polvo de extracto de ashwagandha purificado en columna (muestra 5).

Análisis mediante HPLC y LCMS de los glicósidos de witanólidos y de las agliconas de witanólidos

[0169] El extracto de ashwagandha (muestra 5) se analizó mediante HPLC y se descubrió que contenía glicósidos de witanólidos (witanósidos I a VII), sitoindósidos (sitoindósidos I a X) y witanamidas, y su presencia se confirmó mediante análisis de LCMS.

[0170] El análisis mediante HPLC del extracto de ashwagandha detecta los witanósidos I a VII (glicósidos de witanólidos), los sitoindósidos I a X y las witanamidas, así como una cantidad insignificante de agliconas de witanólidos (witaferina A, 12-deoxi-witastramonolido, witanólido A) a 227 nm.

[0171] El extracto de ashwagandha fue sometido a un análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS) y la presencia de componentes activos como los witanósidos I a VII, los sitoindósidos I a X y las witanamidas fue confirmada por los datos de LCMS obtenidos. A partir de los datos de LCMS también podemos confirmar la presencia de una cantidad insignificante de componentes inactivos como agliconas de witanólidos en el extracto de ashwagandha.

Hidrólisis ácida

[0172] El extracto de ashwagandha (muestra 5) se sometió a hidrólisis ácida. Se disolvieron 2,5 kg de la muestra 5 en ácido clorhídrico IN mediante agitación continua durante 4 horas. A continuación, se transfirió la mezcla a un embudo de separación y se extrajo con cloroformo. Se separaron las dos capas. Se eliminó la capa de ácido y se recogió la capa de cloroformo. La capa de cloroformo se lavó de nuevo con agua en un embudo de separación hasta que el pH se volvió neutro. La capa de cloroformo se recogió y se filtró a través de un papel de filtro que contenía sulfato de sodio. La capa de cloroformo filtrada se concentró y se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de ashwagandha (muestra 6) (rendimiento 1,5 %).

[0173] El extracto después de la hidrólisis se analizó mediante HPLC. En el cromatograma de HPLC a 227 nm el pico principal obtenido representa la parte aglicona inactiva. Sólo un pequeño porcentaje de la parte glicosídica activa estaba presente. Tras la hidrólisis del extracto de ashwagandha, los glicósidos de witanólidos presentes en el extracto se convirtieron en agliconas y se confirmó mediante LCMS. El extracto de ashwagandha, después de la hidrólisis, se sometió a un análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS) y la presencia de componentes inactivos como witaferina A, 12-deoxi-witastramonolido, witanolida A (masa molecular 471,54; 471; 471,64 respectivamente) se confirmó mediante LCMS. Así, se confirmó de nuevo la presencia de glicósidos de witanólidos, sitoindósidos y witanamidas en el extracto que se convirtió en parte aglicona tras la hidrólisis.

Ejemplo 6

[0174] Se recogieron raíces de ashwagandha (100 kg). Se limpiaron las raíces de ashwagandha. Las raíces limpias se extrajeron con metanol al 60 %. Las raíces se sometieron a reflujo con metanol al 60 % a la temperatura de ebullición (60-70 °C) del metanol durante una hora para obtener un primer residuo y un primer sobrenadante. El primer residuo se volvió a extraer dos veces más con una cantidad de metanol cuatro veces mayor en cada ocasión. Se separaron el residuo y los sobrenadantes. Todos los sobrenadantes fueron agrupados y concentrados en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol. (muestra 1) (rendimiento 18 %).

[0175] 18 kg de la muestra 1 se sometieron a reflujo con cloroformo a la temperatura de ebullición (70-80 °C) del cloroformo durante media hora para obtener el segundo residuo y el segundo sobrenadante. A continuación, el segundo residuo se extrajo dos veces más con una cantidad de cloroformo cuatro veces mayor en cada ocasión. Se separaron el residuo y los sobrenadantes. El residuo se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto de cloroformo de extracto de metanol de ashwagandha (muestra 2) (rendimiento 16 %).

[0176] Véase también la preparación del extracto en la figura 6.

[0177] El contenido de witanólido en el polvo de extracto de cloroformo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol (muestra 2) resultó ser de un 0,7 % mediante el método HPLC. El contenido de alcaloides en el polvo de extracto de cloroformo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol (muestra 2) resultó ser de un 1,5 % mediante el método gravimétrico. El contenido de glicósido de witanólido en el polvo de extracto de cloroformo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol (muestra 2) resultó ser de un 5 % mediante el método HPLC. El contenido de saponina en el polvo de extracto de cloroformo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol (muestra 2) resultó ser de un 1,6 % mediante el método UV. El contenido de oligosacáridos en el polvo del extracto de cloroformo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol (muestra 2) resultó ser de un 20 % mediante el método HPLC.

Ejemplo 7

Análisis de oligosacáridos, glicósidos de witanólidos y agliconas en diferentes extractos de ashwagandha [0178] Se analizaron diferentes extractos de ashwagandha para detectar la presencia de oligosacáridos, glicósidos y agliconas de witanólidos.

[0179] Los extractos de ashwagandha analizados fueron los siguientes:

1. Extracto de raíz de ashwagandha al 60 % de metanol preparado según el ejemplo 6;

2. Polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol tratado con amoníaco, preparado según el ejemplo 2; 3. Polvo de la fracción de metanol al 50 % de ashwagandha después de pasar por la columna de resina HP20 preparado según el ejemplo 4;

4. Polvo de extracto de ashwagandha purificado en columna, preparado según el ejemplo 5.

Análisis mediante HPTLC de los oligosacáridos y de los glicósidos y agliconas de witanólidos

[0180] Todos los extractos mencionados se analizaron mediante HPTLC para determinar la presencia de activos en el extracto correspondiente.

[0181] La HPTLC se llevó a cabo en placas de TLC previamente recubiertas. Se aplicó una solución estándar de glicowitanólidos (sitoindósidos IV y V), agliconas de witanólidos (witaferina A, 12-deoxi-witastramonolido, witanólido A) y oligosacáridos (sacarosa y maltosa) junto con extractos de raíces de ashwagandha. Las placas se revelaron utilizando n-butanol-ácido acético-agua 4:1:2 (v/v/v) como fase móvil. La evaluación densitométrica de las placas se realizó a A = 225 nm.

[0182] Tras el análisis de diferentes extractos de ashwagandha, el polvo de la fracción de metanol al 50 % de ashwagandha después de pasar por la columna de resina HP20 preparado según el ejemplo 4 y el polvo del extracto de ashwagandha purificado en columna preparado según el ejemplo 5 mostraron la presencia de glicósidos de witanólidos (Rf 0,43-0,78). Sin embargo, no se observó ninguna mancha para la presencia de agliconas de witanólidos y oligosacáridos. No obstante, en el polvo del extracto de ashwagandha al 60 % de metanol tratado con amoníaco, preparado según el ejemplo 2, el patrón de HPTLC mostró la presencia de oligosacáridos (Rf 0,24-0,38). En el patrón de HPTLC del extracto de ashwagandha al 60 % de metanol, la intensidad de la mancha entre Rf 0,24-0,38 corresponde a los oligosacáridos y las otras dos manchas corresponden a los glicósidos de witanólidos (Rf 0,43-0,78) y a las agliconas de witanólidos (Rf 0,82- 0,94).

Análisis mediante HPLC de los oligosacáridos y de los glicósidos y agliconas de witanólidos

[0183] Los oligosacáridos se determinaron utilizando el sistema HPLC de Waters con un detector RI y el software Empower con una columna de análisis de hidratos de carbono [Waters] de 300 x 3,9 mm; se utilizó acetonitrilo: agua-80:20 (v/v) como fase móvil; el tiempo de ejecución fue de 10 minutos y la velocidad de flujo fue de 2 ml/min en modo isocrático.

[0184] Los glicósidos de witanólidos/agliconas de witanólidos se analizaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en una columna RP C18 (250X4,6 mm Shimadzu Co., Japón.) utilizando ortofosfato de dihidrógeno de potasio anhidro 0,01 M y acetonitrilo como fase móvil y detección UV a 227 nm. La velocidad de flujo del eluyente era de 1 ml/min.

[0185] El análisis mediante HPLC de extracto de raíz de ashwagandha al 60 % de metanol mostró aproximadamente un 5 % de glicósidos de witanólidos, un 0,7 % de agliconas de witanólidos y un 20 % de oligosacáridos. El polvo de extracto de ashwagandha al 60 % de metanol tratado con amoníaco contenía aproximadamente un 6 % de glicósidos de witanólidos, aproximadamente un 0,2 % de agliconas de witanólidos y aproximadamente un 5 % de oligosacáridos. La proporción en peso de los glicósidos de witanólidos y las agliconas de witanólidos era de 30:1 y la proporción en peso de los glicósidos de witanólidos y los oligosacáridos era de 6:5. No se detectaron oligosacáridos en los extractos enriquecidos de ashwagandha preparados según el ejemplo 4 (aproximadamente un 35 % de glicósidos de witanólidos). No se detectaron oligosacáridos en los extractos enriquecidos de ashwagandha preparados según el ejemplo 5 (aproximadamente un 80 % de glicósidos de witanólidos).

Ejemplo 8

Método de preparación de extracto con recubrimiento entérico

[0186] Se cargó una cantidad específica de extracto de raíz de ashwagandha purificado/otros extractos de raíz de ashwagandha en el recipiente del extractor de lecho fluidizado (pam glatt pharma technologies). El recipiente tiene una malla fina de acero inoxidable en el fondo. El aire utilizado para el secar/fluidizar se filtró sucesivamente a través de filtros HEPA (atrapador de partículas de alta eficiencia) (grado EU 13, 0,3 micras, 99,997 % de eficiencia).

[0187] El aire caliente y filtrado hasta 90 °C se hizo pasar a gran velocidad desde el fondo del recipiente del FBE a través del material de alimentación (extracto de raíz de ashwagandha purificado/extracto de raíz de ashwagandha) y el material de alimentación se fluidificó.

[0188] Mientras tanto, el material de recubrimiento entérico/no entérico se disolvió en una cantidad específica de disolventes que depende de la naturaleza del material de recubrimiento entérico/no entérico. La solución de recubrimiento entérico/no entérico se pulverizó en el material fluidizado utilizando un dispositivo de pulverización acoplado al FBE (velocidad de pulverización 2 L en 1 h, rango de rpm de la bomba 10-12). A través del proceso de recubrimiento del lecho fluidizado, las partículas fluidizadas son pulverizadas continuamente con la solución de recubrimiento, depositando capas (películas) de material en la superficie de las partículas, y obteniendo una capa uniforme con un determinado espesor.

Ejemplo 9

[0189] Los comprimidos se prepararon en una punzonadora automática de comprimidos de 16 estaciones. Los comprimidos se recubrieron con el método de recubrimiento en bombo. En resumen, se introdujeron 5 kg de comprimidos en el bombo y se hicieron girar a 20 rpm. El material de recubrimiento se pulverizó sobre los comprimidos mediante una pistola de pulverización en forma de dispersión acuosa al 30 %. Simultáneamente, se puso en marcha un soplador caliente (110 grados) para el secado rápido de los comprimidos. Los comprimidos se recubrieron hasta obtener un aumento de peso del 5-6 %. Después del recubrimiento, los comprimidos se mantuvieron en una corriente de aire caliente durante 15 minutos para garantizar el secado completo.

Ejemplo 10

Método de análisis de los glicósidos de witanólidos y de las agliconas de witanólidos

[0190] Se pesaron con precisión 125 mg de extracto de ashwagandha y se transfirieron a un matraz estándar de 25 ml y se completaron con una solución de 25 ml con metanol. Se filtró a través de un filtro de membrana de 0,2 ^m antes de la inyección. El estándar se preparó pesando exactamente 5 mg de estándar [estándares de Chromadex] y se transfirió a un matraz aforado de 5 ml y se completó una solución de 5 ml con metanol. De esto, se pipetean 200 ^l en un matraz aforado de 10 ml (20 ppm) y se completa con una solución de 10 ml con metanol. Se filtra a través de un filtro de membrana de 0,2 ^m antes de la inyección.

[0191] Los glicósidos de witanólidos/agliconas de witanólidos se analizaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en una columna RP C18 (250X4,6mm Shimadzu Co., Japón) utilizando ortofosfato de dihidrógeno de potasio anhidro 0,01 M (el pH se ajustó a 2,58 utilizando una solución de ácido ortofosfórico al 10 %) y acetonitrilo como fase móvil y detección UV a 227 nm. La velocidad de flujo del eluyente era de 1 ml/min.

[0192] Mediante la comparación del área del estándar y de la muestra, se calculó el porcentaje de glicósidos de witanólidos/agliconas de witanólidos mediante la fórmula:

% de glicósidos de witanólidos/ agliconas de witanólidos =

Área de muestra X cantidad de std X Pureza de std

Área de Std X peso de la muestra

Ejemplo 11

Método de análisis de los alcaloides

[0193] Se vertieron 3 g de extracto seco de ashwagandha (W1) en el matraz cónico. Se añadieron 5 ml de amoníaco al extracto en el matraz cónico y se agitó durante 15 minutos. A continuación, se añadió al matraz una mezcla de 75 ml de éter y 25 ml de alcohol. Esta solución se agitó continuamente durante 1 hora. La solución se filtró en el separador a través de papel de filtro. El residuo se lavó del matraz cónico con una mezcla de 75 ml de éter y 25 ml de alcohol. La solución total se extrajo con 25 ml de ácido sulfúrico diluido en un embudo de separación. Se separaron las dos capas. Se eliminó la capa de éter y se recogió la capa acuosa ácida. La capa acuosa ácida se lavó con 25 ml de dicloruro de metileno (MDC) en un embudo de separación. Se separaron las dos capas y se recogió la capa acuosa ácida y se ajustó a medio alcalino con amoníaco. Esta solución acuosa se extrajo con 25 ml de cloroformo en un embudo de separación. Se separaron las dos capas formadas. Se recogió la capa de cloroformo y se añadieron de nuevo 25 ml de cloroformo a la capa acuosa. Este proceso se repitió dos veces más y se recogieron todas las capas de cloroformo. La parte de cloroformo se lavó con agua en un embudo de separación. Tras la separación de las dos capas, se recogió la capa de cloroformo y se filtró en un vaso de precipitados pesado (W2). Se evaporó hasta la sequedad y luego se pesó el vaso de precipitados con la muestra seca (W3).

Cálculo:

% de alcaloide = (W3-W2) X 100

W1

(Véase, Anónimo. (1996). Indian Pharmacopoeia, Vol. II, Government of India, Ministry of Health and Family Welfare, Nueva Delhi, A-81-83, 95, 736.)

Ejemplo 12

Estudio de disolución

[0194] El patrón de liberación del fármaco en estudio se analizó en fluido gástrico simulado (pH 1,2) y en fluido intestinal simulado de (pH 6,8) mediante un aparato de disolución in vitro USP (LABINDIA DS 8000). El medio de disolución (fluido gástrico simulado sin enzimas, pH 1,2), sin aire disuelto, se introdujo en el recipiente del aparato de disolución. Se montó el aparato y se calentó el medio de disolución a entre 36,5° y 37,5°. El comprimido con recubrimiento entérico que contenía extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides se hundió en el fondo de un recipiente antes de la rotación de la paleta. En otro recipiente, el comprimido de extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides y sin recubrimiento entérico se hundió en el fondo del recipiente antes de la rotación de la paleta. Se utilizó un dispositivo adecuado, como un alambre de hélice de vidrio, para mantener horizontales en el fondo del recipiente los comprimidos que, de otro modo, flotarían.

[0195] Tras dos horas de funcionamiento, se recogió una alícuota del líquido de dos recipientes y se cambió el medio de disolución por fluido intestinal simulado con pH 6,8 y se repitió el proceso anterior. Se recogieron muestras a las 3, 4 y 5 horas.

[0196] Las muestras de dos recipientes en cada punto de tiempo se transfirieron a un extractor líquido-líquido y se extrajeron con una mezcla de cloroformo y metanol (80:20). Se separaron las fases ácida y de cloroformo-metanol. Se recogió la fase de cloroformo-metanol y la fase ácida se extrajo de nuevo con cloroformo-metanol dos veces más. Todas las fases de cloroformo-metanol se juntaron y se extrajeron con agua. Se separaron las fases acuosa y de cloroformometanol y se recogió la fase de cloroformo-metanol. La fase de cloroformo-metanol se concentró y se secó para formar polvo de extracto de cloroformo-metanol.

El extracto de cloroformo-metanol se disuelve en metanol y se analiza mediante HPLC.

[0197] Se observó que en las primeras 2 horas sólo se liberó el 20 por ciento del fármaco tras la administración del comprimido con recubrimiento entérico de extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides. Sin embargo, después de 2 horas se liberó el 40 por ciento del fármaco y los resultados a las 4 y 5 horas mostraron la liberación completa del comprimido con recubrimiento entérico de extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides. Ejemplo 13

Estudio de eficacia de diferentes extractos de ashwagandha

[0198] Se dividieron 44 ratas en once grupos con 4 ratas en cada grupo. Los animales fueron entrenados para la prueba de natación (15 minutos) como sesión previa a la prueba y, a continuación, se les sometió a ayuno durante la noche. A los animales en ayunas, se les inyectó reserpina (6 mg/kg) por vía intraperitoneal para deprimir a los animales. Tras 1 hora de la inyección de reserpina, las muestras de prueba/estándar se administraron por vía oral según la dosis designada. Después de 1 hora de la muestra de prueba/estándar, las ratas fueron sometidas a una prueba de natación forzada y se registró la duración de la inmovilidad en la sesión de prueba de 5 minutos.

Tabla 2: Efecto de diferentes extractos de ashwa andha sobre el tiem o de inmovilidad en ratas.

[0199] Como se muestra en la tabla 2, el tiempo de inmovilidad de los animales normales de control fue de 120 segundos. Cuando se inyectó reserpina por vía intraperitoneal, los animales se deprimieron y el tiempo de inmovilidad

aumentó a 210 segundos (Grupo II). La administración oral de extracto de raíz de ashwagandha con un mínimo de un

5 % de witanólidos (100 mg/kg) tras la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en

200 segundos (Grupo III). Del mismo modo, las ratas tratadas con extracto de ashwagandha con un mínimo de un

2,5 %, 1,8 %, 1,1 % y 0,7 % de witanólidos (100 mg/kg) tampoco fueron eficaces y el tiempo de inmovilidad se registró

cerca de los 200 segundos (Grupo IV a Grupo VII). Cuando los animales fueron tratados con extracto de ashwagandha

con un 20 %, 35 % y 80 % de glicósidos de witanólidos (100 mg/kg), el tiempo de inmovilidad se redujo

significativamente a 180, 145 y 135 segundos respectivamente (Grupo VIII a Grupo X). En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg (Grupo XI), el tiempo de inmovilidad fue de sólo 122 segundos, lo que es casi similar al de los animales de control normales.

Ejemplo 14

Efecto de diferentes extractos de ashwagandha con recubrimiento entérico y no entérico sobre el tiempo de inmovilidad en ratas

[0200] 92 ratas fueron divididas en veintitrés grupos. Cada grupo tenía 4 ratas. Los animales fueron entrenados para la prueba de natación (15 minutos) como sesión previa a la prueba y, a continuación, se les sometió a ayuno durante la noche. A los animales en ayunas, se les inyectó reserpina (6 mg/kg) por vía intraperitoneal para deprimir a los animales. Tras 1 hora de la inyección de reserpina, las muestras de prueba/estándar se administraron por vía oral según la dosis designada. Después de 1 hora de la muestra de prueba/estándar, las ratas fueron sometidas a una prueba de natación forzada y se registró la duración de la inmovilidad en la sesión de prueba de 5 minutos.

Tabla 2: Efecto de extractos de ashwagandha purificados con recubrimiento entérico y no entérico sobre el tiem o de inmovilidad en ratas

[0201] Como se muestra en la tabla 2, el tiempo de inmovilidad de los animales normales de control fue de 120 segundos. Cuando se inyectó reserpina por vía intraperitoneal, los animales se deprimieron y el tiempo de inmovilidad aumentó a 250 segundos (Grupo II). La administración oral de extracto de ashwagandha con un 6 % de glicósidos de witanólidos en dosis de 100 mg/kg y 20 mg/kg y de extracto de ashwagandha con un 6 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de pectina después de la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró por encima de 240 segundos (Grupo III-V). No obstante, en el grupo VI, el extracto de ashwagandha con un 6 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de Eudragit después de la inyección de reserpina, el tiempo de inmovilidad se registró en 195 segundos. Cuando los animales fueron tratados con extracto de ashwagandha que contenía un mínimo de un 1 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de Eudragit en una dosis de 20 mg/kg, no fue eficaz y el tiempo de inmovilidad fue de 242 segundos (Grupo VII). Cuando los animales fueron tratados con extracto de raíz de ashwagandha que contenía un mínimo de un 20 % de glicósidos de witanólidos en una dosis de 100 mg/Kg, el tiempo de inmovilidad fue de 235 segundos (Grupo VIII) y el extracto de raíz de ashwagandha que contenía un mínimo de un 20 % de glicósidos de witanólidos en una dosis de 20 mg/Kg, el tiempo de inmovilidad fue de 239 segundos (Grupo IX). En cambio, el extracto de raíz de ashwagandha con un 20 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de Eudragit en una dosis de 20 mg/kg, el tiempo de inmovilidad se redujo a 190 segundos (Grupo X). El tiempo de inmovilidad resultó ser de 175 y 210 segundos cuando los animales fueron tratados con extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósidos de witanólidos en dosis de 100 mg/kg (Grupo IX) y dosis de 20 mg/kg (Grupo XII) respectivamente. Cuando los animales fueron tratados con extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de pectina, HPMC y PVA en dosis de 20 mg/kg, el tiempo de inmovilidad fue de 205, 207 y 204 segundos respectivamente, lo que indica una eficacia muy baja de tales recubrimientos no entéricos (Grupo XIII-XV). A pesar de los recubrimientos no entéricos, cuando los animales fueron tratados con extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de materiales entéricos, goma laca, CAP o Eudragit en una dosis de 20 mg/kg, el tiempo de inmovilidad se redujo a 162, 164 y 160 segundos respectivamente (Grupo XVI- XVIII), lo que indica la eficacia del recubrimiento entérico. Los animales tratados con extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido en una dosis de 100 mg/kg y 20 mg/kg mostraron un tiempo de inmovilidad de 166 segundos (Grupo XIX) y 192 segundos (Grupo XX) respectivamente. Cuando se trató a los animales con un extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de pectina, el tiempo de inmovilidad fue de 189 segundos, mientras que cuando el mismo extracto estaba recubierto de Eudragit, el tiempo de inmovilidad se redujo a sólo 122 segundos, lo que demuestra la eficacia del recubrimiento entérico (Grupo XXI- XXII). En el caso del estándar de fluoxetina (Grupo XXIII), el tiempo de inmovilidad fue de sólo 122 segundos, lo que es casi similar al de los animales de control normales.

Ejemplo 15

Estudio de biodisponibilidad utilizando diferentes extractos de ashwagandha con recubrimiento entérico y no entérico

[0202] Para el estudio se utilizaron conejos blancos NZ que pesaban entre 2 y 2,5 kg de ambos sexos. Los conejos se alojaron individualmente en jaulas de acero inoxidable y se mantuvieron en una sala bien ventilada en condiciones normales y uniformes, como un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad y a 25 ± 2 °C. Se les dio agua y alimento ad libitum. Los animales se dividieron en veinticuatro grupos. Cada grupo tenía 3 animales. Todos los animales fueron sometidos a un ayuno de 12 horas antes de la administración de las muestras de prueba. Los animales se dividieron como se indica en la tabla 1.

[0203] Los animales pudieron acceder libremente al agua potable. Los extractos se prepararon en Tween 80 al 1 % y se administraron por vía oral. Después de 2 horas y 30 minutos, se recogieron 2 ml de sangre de cada conejo a través de la vena auricular marginal en tubos Vacutainer recubiertos de EDTA. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos y el plasma se separó cuidadosamente. Las muestras de plasma se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. La concentración de glicósidos de witanólidos se analizó mediante HPLC.

Tabla 2: Estudio de biodisponibilidad utilizando diferentes extractos de ashwagandha con recubrimiento entérico no entérico

[0204] Como se muestra en la tabla 2, no se detectaron glicósidos de witanólidos en el plasma de los animales alimentados con vehículo, extracto de ashwagandha con un mínimo de un 6 % de glicósidos de witanólidos o extracto de raíz de ashwagandha con un mínimo de un 6 % de glicósidos de witanólidos recubierto de pectina (Grupo I-IV). Cuando los animales fueron alimentados con extracto de raíz de ashwagandha con un mínimo de un 6 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de Eudragit a 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido fue de 15,2 ng/ml (Grupo V). Los glicósidos de witanólidos no se detectan en el plasma de los animales alimentados con extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido en dosis de 100 y 20 mg/kg (Grupo XXII-XXIII), mientras que el extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de Eudragit a 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido fue de 10,2 ng/ml (Grupo XXIV). Los animales alimentados con extracto de ashwagandha con un mínimo de un 20 % de glicósidos de witanólidos a 100 y 20 mg/Kg mostraron un nivel de glicósidos de witanólidos en plasma de 1,9 y 0,3 ng/ml respectivamente. Los animales alimentados con extracto de ashwagandha con un mínimo de un 1 % y 20 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit a 20 mg/kg mostraron un nivel de glicósido de witanólido en plasma de 1,6 y 4,2 ng/ml, lo que demuestra la eficacia del recubrimiento entérico para preservar los glicósidos de witanólidos de la hidrólisis en el estómago (Grupo VI y IX). Cuando los animales fueron alimentados con extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido en dosis de 100 y 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido en el plasma fue de 60,3 y 12,3 ng/ml (Grupo X-XI). Los animales alimentados con extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido recubierto de pectina, HPMC o PVA a dosis de 20 mg/kg mostraron un nivel plasmático de glicósidos de witanólidos de 13,8, 12,9 y 13,2 ng/ml respectivamente (Grupo XII- XIV). Cuando el mismo extracto, es decir, el extracto de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido, se recubrió con materiales entéricos como goma laca, CAP o Eudragit, el nivel plasmático de los glicósidos de witanólidos aumentó a 100,3, 101,9 y 102,3 ng/ml respectivamente, lo que indica la eficacia del recubrimiento entérico (XV- XVII). Cuando los animales fueron alimentados con extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido en dosis de 100 y 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido en plasma fue de 85,2 y 18,5 ng/ml respectivamente (Grupo XVIII-XIX). Cuando el mismo extracto (extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido) se recubrió de pectina y se administró en una dosis de sólo 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido fue de sólo 17,3 ng/ml, lo que demuestra la ineficacia del recubrimiento no entérico (Grupo XX). En cambio, cuando los animales fueron alimentados con extracto de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de eudragit en una dosis de 20 mg/kg, el nivel de glicósido de witanólido en plasma fue de 149,8 ng/ml, lo que demuestra la naturaleza protectora del recubrimiento entérico (Grupo XXI).

Ejemplo 16

Estudios de eficacia de extractos de ashwagandha

1. Actividad contra el estrés

a. Prueba de tolerancia al estrés por anoxia

[0205] Se seleccionaron ratas albinas Wistar de ambos sexos que pesaban entre 150 y 220 g y se dividieron en 11 grupos de seis cada uno y se les administró el siguiente tratamiento tras una semana de aclimatación:

[0206] Los animales fueron tratados como se indica más arriba durante las 3 semanas. Al final de la 1a, 2a y 3a semana, es decir, el 7°, 14° y 21° día, 1 hora después de inducirse el estrés de tratamiento colocando a cada animal individualmente en un recipiente hermético de 1 litro de capacidad para registrar el tiempo de tolerancia a la anoxia. Se tomó como tiempo de anoxia la duración de la entrada del animal en el recipiente hermético y la aparición de la primera convulsión.

Tabla 2: Efecto de extractos de ashwa andha en el tiem o de toleranca al estrés or anoxia en ratas

[0207] Los resultados obtenidos en la prueba de tolerancia al estrés por anoxia se expresaron como media de seis ratas (tabla 2). El tiempo de tolerancia al estrés por anoxia aumentó significativamente en los días 7, 14 y 21 en los grupos tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósidos de witanólidos (50 mg/kg), extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit (50 mg/kg) y Diazepam (2 mg/kg). El tiempo de tolerancia al estrés por anoxia aumentó en los días 7, 14 y 21 en el extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos (50 mg/kg), extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubiertos de Eudragit (50 mg/kg). También se observó un aumento del tiempo de tolerancia a la anoxia después de la segunda y tercera semana del grupo tratado con extracto de raíz de ashwagandha con un 5 % de glicósidos de witanólidos (50 mg/kg), pero no se obtuvieron resultados estadísticamente significativos en el séptimo día. El polvo crudo de ashwagandha y el polvo crudo de ashwagandha con recubrimiento entérico mostraron un ligero aumento del tiempo de tolerancia a la anoxia (100 mg/kg). Sin embargo, el efecto de la fracción rica en alcaloides del extracto de raíz de ashwagandha (50 mg/kg) sobre el tiempo de tolerancia no fue estadísticamente significativo al final de la primera, segunda y tercera semana de tratamiento.

b. Prueba de resistencia a la natación

[0208] Se seleccionaron ratones suizos de ambos sexos que pesaban entre 20 y 25 g y se dividieron en nueve grupos de seis cada uno y se les administró el siguiente tratamiento tras una semana de aclimatación:

T l : r i n r n r i x rim n l

[0209] Los extractos se administraron a los ratones una vez al día durante 7 días. Al octavo día se sometió a los ratones a un estrés de natación manteniéndolos en un tanque de propileno de dimensiones (37X37X30 cm), lleno de agua hasta una altura de 25 cm. Se permitió a las ratas nadar hasta el agotamiento total y el punto final se tomó cuando el animal comenzó a ahogarse. Se calculó el tiempo medio de natación de cada grupo.

Tabla 4: Efecto de los extractos de ashwa andha sobre la resistencia a la natación en ratones

[0210] El tiempo de resistencia en la natación aumentó significativamente el octavo día en los grupos tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido (50 mg/kg), extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit (50 mg/kg) y Diazepam (2 mg/kg), en comparación con el grupo de control. El tiempo de natación también mejoró en el grupo de extracto de raíz de ashwagandha con un 5 % de glicósidos de witanólidos (100 mg/kg), pero fue menor que en los grupos de extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósidos de witanólidos o extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit. El tiempo de resistencia en la natación aumentó en el grupo de extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido (50 mg/kg) y en el grupo de extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit (50 mg/kg) en comparación con el grupo de control. La fracción rica en alcaloides del extracto de raíz de ashwagandha tuvo muy poco efecto en el aumento del tiempo de natación.

2. Actividad inmunomoduladora

a. Efecto de los extractos de Withania somnífera sobre la celularidad de la médula ósea y las células a-esterasa positivas.

[0211] Se dividieron cuarenta y dos ratones Balb/c (20-25 gm) en ocho grupos con 6 ratones en cada grupo. Se administró el siguiente tratamiento durante 7 días:

T l : r i n r r i x rim n l

[0212] Los animales fueron sacrificados tras la última dosis de tratamiento farmacológico y se recogió la médula ósea del fémur en un medio que contenía un 2 % de suero fetal de ternera. El número de células de la médula ósea se determinó utilizando un hemocitómetro y se expresó a modo de células vivas totales/fémur. Se realizó un frotis de las células de la médula ósea de la preparación anterior en portaobjetos de vidrio limpios y se tiñó con clorhidrato de pararosanilina y se contratiñó con hematoxilina para determinar las células a-esterasa positivas no específicas.

Tabla 6: Efecto de los extractos de ashwagandha sobre la celularidad de la médula ósea y la actividad de aesterasa

[0213] El efecto de la administración de extractos de ashwagandha sobre la celularidad de la médula ósea y las células a-esterasa positivas se indica en la tabla 6. Tanto los grupos tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido como con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit mostraron un aumento significativo de las células de la médula ósea en comparación con los animales de control. El extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido y el extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit mostraron un aumento de las células de la médula ósea en comparación con los animales de control. Los animales tratados con extracto de raíz de ashwagandha con un 5 % de glicósidos de witanólidos también mostraron un aumento de las células de la médula ósea, pero fue menor en comparación con los grupos tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido y con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit. Hubo un aumento muy ligero de las células de la médula ósea en los animales tratados con la fracción rica en alcaloides del extracto de raíz de ashwagandha. Además, el número de células a-esterasa positivas también aumentó significativamente en los grupos tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido y con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit, en comparación con los controles. El extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido con y sin recubrimiento mostró un aumento en el número de células a-esterasa positivas en comparación con los controles.

b. Efecto de los extractos de ashwagandha sobre el título de anticuerpos circulantes.

[0214] Treinta y seis ratones Balb/c fueron inmunizados con SRBC (0,1 ml, i.p.) y divididos en ocho grupos y tratados de la siguiente manera durante 10 días:

T l 7: r i n r n r i x rim n l

[0215] Se recogió sangre de la vena caudal antes de la administración del antígeno y después de la última dosis de extractos. El suero se separó y se inactivó por calor a 56 °C durante 30 minutos. Se calculó el título de anticuerpos utilizando el SRBC como antígeno. Para ello, el suero se diluyó en serie con PBS en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadieron volúmenes iguales de SRBC (Ag) tripsnizados al 1 %, se mezclaron suavemente y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 h, y se registraron los títulos de aglutinación.

Tabla 8: Efecto de los extractos de ashwa andha sobre el título de anticuer os circulantes

[0216] El efecto de la administración de extractos de Withania somnífera sobre el título de anticuerpos se indica en la tabla 8. El valor máximo de título de anticuerpos de 750 se observó con el extracto purificado de raíz de ashwagandha con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit. El extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit mostró el valor de título de anticuerpos de 550. El valor máximo del título de los animales de control fue de 45 solamente. Todos los demás extractos también aumentaron el valor del título, pero éste fue menor que el de los animales tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit.

c. Efecto de los extractos de ashwagandha sobre las células productoras de anticuerpos.

[0217] El número de células formadoras de placas del bazo se determinó mediante el ensayo de placas. Treinta y seis ratones Balb/c fueron divididos en ocho grupos y tratados de la siguiente manera durante 7 días:

[0218] El 7° día los ratones fueron inmunizados con SRBC (2,5*108). Los animales fueron sacrificados al cabo de 4 días; los bazos se procesaron en una suspensión celular única y el número de células se ajustó a 8*10® células/ml. Se mezclaron cincuenta microlitros de suspensión celular de bazo y 50 ml de Ag (SRBC 7 %) con 0,5 ml de agarosa fundida al 0,5 % mantenida a 45 °C y se extendieron en portaobjetos. Tras solidificar la agarosa, los geles se incubaron en presencia de complemento (suero de conejo a 37 °C durante 1 h). El número de placas se contó utilizando un contador de colonias.

[0219] Se comprobó que la administración de extracto de ashwagandha aumentó significativamente el número de células productoras de anticuerpos en el bazo. El número máximo de células formadoras de placas (PFC) se encontró en los animales tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit. El extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos también mostró un mayor número de células formadoras de placas (PFC). Todos los demás extractos también aumentaron el número de células formadoras de placas, pero éste fue menor que el de los animales tratados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit.

3. Actividad antiinflamatoria

[0220] La actividad antiinflamatoria de los extractos de ashwagandha se evaluó mediante el modelo de edema de la pata inducido por carragenina en ratas. Se dividieron cuarenta y cinco ratas wistar en nueve grupos (n = 5). El siguiente tratamiento se les administró a las ratas en dosis única:

[0221] Tras 30 minutos de extractos, se inyectaron 0,1 ml de carragenina (1 % en solución salina normal) en la pata trasera derecha de cada rata. El volumen de la pata se midió pletismográficamente a las 0, 0,5, 1, 2, 3, 4 y 5 horas después de la exposición. Se calculó el porcentaje de inhibición del edema para cada grupo con respecto al grupo de animales de control que recibió el vehículo.

[0222] El porcentaje de inhibición máximo se mostró a las 3 horas de la inyección de carragenina. El porcentaje de inhibición máximo de la inflamación se observó en los animales alimentados con indometacina. Entre los grupos tratados con extractos, el extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit resultó ser el más eficaz para reducir la inflamación en la pata de la rata. El extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit también resultó eficaz para reducir la inflamación en la pata de la rata.

Ejemplo 17

Estudio de toxicidad en ratas

[0223] Para este estudio se utilizaron veinticuatro ratas albinas (14 machos y 14 hembras) de 200-250 g de peso. Las ratas se dividieron aleatoriamente en seis grupos con dos machos y dos hembras en cada grupo. Los animales fueron aclimatados durante 7 días antes de comenzar a alimentarlos con el extracto. La agrupación de los animales fue la siguiente (tabla 1):

Tabla 1: A ru ación de animales en estudio de toxicidad

[0224] Las muestras de prueba se administraron por vía oral en una dosis de 1000 mg/kg de peso corporal diariamente con la ayuda de una cánula unida a una jeringa. Asimismo, un grupo de dos ratas macho y dos hembras fueron tratadas con el vehículo, es decir, con Tween 80 al 1 %, y fueron designadas como grupo de control. Los animales fueron observados durante un período total de 14 días. Se registró el peso corporal de las ratas, el consumo de alimentos, la respiración, la temperatura rectal, el comportamiento general y la mortalidad/incapacidad grave.

Resultados

[0225] El extracto de raíz de ashwagandha con un 5 % de glicósidos de witanólidos, el extracto de raíz de ashwagandha con un 5 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit, así como la fracción rica en alcaloides del extracto de raíz de ashwagandha tuvieron efectos tóxicos en las ratas. Los animales eran más dóciles y se dejaban manipular libremente. Entre todos los grupos, los animales alimentados con la fracción rica en alcaloides presentaron una disminución de los movimientos espontáneos, una respuesta lenta a los estímulos y una disminución del tono muscular. La capacidad de mantener el reflejo de enderezamiento estaba presente. En cambio, no hubo síntomas tóxicos en las ratas alimentadas con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido, extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit y grupo de control.

[0226] También se observó pérdida de apetito en las ratas alimentadas con extracto de raíz de ashwagandha con un 5 % de glicósidos de witanólidos o con una fracción rica en alcaloides, mientras que los animales alimentados con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósidos de witanólidos, extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido después de la hidrólisis y extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit mostraron un apetito normal, comparable al de los animales de control. Se registraron los pesos corporales individuales en el día 1, el día 7 y el día 14 del estudio. El aumento del peso corporal de los animales tratados con extracto de raíz de ashwagandha con un 5 % de glicósidos de witanólidos y fracción rica en alcaloides fue muy inferior, mientras que el aumento de peso corporal del grupo tratado con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido y con extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit fue comparable al aumento de peso de los animales de control. Una rata (hembra) del grupo de extracto de raíz de ashwagandha y tres ratas (dos hembras y un macho) del grupo de la fracción rica en alcaloides murieron debido a convulsiones clónicas y depresión respiratoria.

Tabla 2: Datos de consumo de alimento

Tabla 3: Peso cor oral de las ratas

Tabla 4: Parámetros conductuales clínicos

Ejemplo 18

[0227] Se estudió la conversión de los glicósidos de witanólidos en la fracción aglicona y en el azúcar en fluido gástrico simulado (pH 1,2) mediante un aparato de disolución in vitro USP (LABINDIA DS 8000). El medio de disolución (fluido gástrico simulado sin enzimas, pH 1,2), sin aire disuelto, se introdujo en el recipiente del aparato de disolución. Se montó el aparato y se calentó el medio de disolución a entre 36,5° y 37,5°. El comprimido con recubrimiento entérico (preparado según el ejemplo 9) que contenía extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides (muestra 5 preparada según el ejemplo 5) se hundió en el fondo de un recipiente antes de la rotación de la paleta. En otro recipiente, la tableta sin recubrimiento entérico que contenía el extracto de raíz de ashwagandha purificado (muestra 5 preparada según el ejemplo 5) se hundió en el fondo del recipiente antes de la rotación de la paleta. Se utilizó un dispositivo adecuado, como un alambre de hélice de vidrio, para mantener horizontal en el fondo del recipiente el comprimido que, de otro modo, flotaría.

[0228] Se recogió una alícuota del líquido en dos recipientes a los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos. Las muestras se transfirieron a un extractor líquido-líquido y se extrajeron con una mezcla de cloroformo y metanol (80:20). Se separaron las fases ácida y de cloroformo-metanol. Se recogió la fase de cloroformo-metanol y la fase ácida se extrajo de nuevo con cloroformo-metanol dos veces más. Todas las fases de cloroformo-metanol se juntaron y se extrajeron con agua. Se separaron las fases acuosa y de cloroformo-metanol y se recogió la fase de cloroformo-metanol. La fase de cloroformometanol se concentró y se secó para formar el polvo de extracto de cloroformo-metanol. El extracto de cloroformometanol se disuelve en metanol y se analiza mediante HPLC.

[0229] Se descubrió que a los 15 minutos en medio ácido los glicósidos de witanólidos en el comprimido de extracto de raíz de ashwagandha purificado sin recubrimiento entérico se convirtieron en agliconas de witanólidos (33,8 %), pero sólo se formó un 1,2 % de agliconas de witanólidos tras la administración del comprimido con recubrimiento entérico de extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides. A las 2 horas se formó un 74,8 % de agliconas de witanólidos en el medio ácido tras la administración de un comprimido de extracto de raíz de ashwagandha purificado sin recubrimiento entérico. Tras la administración de un comprimido con recubrimiento entérico de extracto de raíz de ashwagandha purificado sin alcaloides, sólo se formó un 4,8 % de agliconas de witanólidos en el medio ácido. Los glicósidos de witanólidos sufren hidrólisis en el pH ácido y se convierten en agliconas de witanólidos, que son tóxicas. El recubrimiento entérico impidió la hidrólisis del compuesto activo como el glicósido de witanólido a agliconas en el extracto de raíz de ashwagandha en el entorno ácido.

Ejemplo 19

Método de elaboración de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido

[0230] Se recogieron raíces de ashwagandha (100 kg). Se limpiaron las raíces de ashwagandha. Las raíces limpias se trataron con una solución de amoníaco al 2 % en una proporción de 1:2 disolvente:raíces de ashwagandha durante 4 horas. Las raíces de ashwagandha tratadas con amoníaco se introdujeron en el extractor Soxhlet y se extrajeron con diclorometano o dicloruro de metileno (MDC) (300 L). La extracción se llevó a cabo durante 10 horas a una temperatura de unos 70 °C. Una vez finalizada la extracción, el sobrenadante y el residuo se separaron por filtración. El residuo (raíces de ashwagandha) después de la extracción con MDC se lavó con agua hasta que el pH se volvió neutro. A continuación, se secó la raíz en una estufa de vacío a 90-100 °C. Después del secado, las raíces de ashwagandha se pulverizaron para formar un polvo de raíces de ashwagandha (muestra 1) (88 %).

[0231] Se extrajeron 88 kg de polvo de raíces de ashwagandha (muestra 1) con metanol al 20 %. La muestra 1 se sometió a reflujo con metanol al 20 % (300 L) a la temperatura de ebullición (75-80 °C) del etanol durante una hora para obtener un segundo residuo y un segundo sobrenadante. El segundo residuo se volvió a extraer dos veces más con una cantidad de etanol tres veces mayor en cada ocasión. Se separaron el residuo y los sobrenadantes. Todos los sobrenadantes fueron agrupados y concentrados en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de etanol concentrado. El extracto de etanol concentrado se filtró para obtener filtrado y un tercer residuo. Se añadió un 35 % de maltodextrina al filtrado y se secó por pulverización para obtener polvo de extracto de ashwagandha al 20 % de etanol. El rendimiento fue de aproximadamente un 18 % (muestra 2).

[0232] Véase también la preparación del extracto en la figura 7.

[0233] El contenido de glicósido de witanólido en el polvo de extracto de ashwagandha al 20 % de etanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 3,5 % mediante HPLC. El contenido de saponina en el polvo de extracto de ashwagandha al 20 % de etanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 2,5 % mediante el método UV. El contenido de alcaloides en el polvo de extracto de ashwagandha al 20 % de metanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 0,06 % mediante el método gravimétrico. El contenido de agliconas de witanólidos en el polvo de extracto de ashwagandha al 20 % de etanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 0,15 % mediante HPLC. El contenido de oligosacáridos en el polvo de extracto de ashwagandha al 20 % de etanol tratado con amoníaco era de aproximadamente un 3 % mediante HPLC.

Ejemplo 20

Método de elaboración de gránulos de extracto de raíz ashwagandha con recubrimiento entérico con un 3,5 % de glicósido de witanólido

[0234] Se hizo pasar 1 kg de polvo de extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido por la máquina compactadora de rodillos. Los copos obtenidos en la compactadora de rodillos se hicieron pasar por una máquina granuladora oscilante equipada con un tamiz de 16 mallas para obtener gránulos de extracto de raíz de ashwagandha.

[0235] Los gránulos de extracto de raíz de ashwagandha se cargaron en el recipiente del extractor de lecho fluidizado (pam glatt pharma technologies). El recipiente tiene una malla fina de acero inoxidable en el fondo. El aire utilizado para secar/fluidizar se filtró sucesivamente a través de filtros HEPA (atrapador de partículas de alta eficiencia) (grado EU 13, 0,3 micras, 99,997 % de eficiencia).

[0236] El aire caliente y filtrado hasta 90 °C se hizo pasar a gran velocidad desde el fondo del recipiente del FBE a través del material de alimentación (extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido) y el material de alimentación se fluidificó.

[0237] Mientras tanto, se disolvieron 100 g de material de recubrimiento (ácido poli metacrílico-co-metilmetacrilato (Eudragit) en 900 ml de agua. La solución de recubrimiento se pulverizó en el material fluidizado utilizando un dispositivo de pulverización acoplado al FBE (velocidad de pulverización 0,5 L en 1 h, rango de rpm de bomba 10-12). Mediante el proceso de recubrimiento del lecho fluidizado, las partículas fluidizadas se pulverizan continuamente con la solución de recubrimiento, depositando capas (películas) de material en la superficie de las partículas, y produciendo una capa uniforme, con un aumento de peso del 4 % y un espesor de 6 mg/cm2

Ejemplo 21

Método de elaboración de minicomprimido de extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido

[0238] Se mezclaron 5 kg de polvo de extracto ashwagandha al 20 % de etanol con un 19 % de celulosa microcristalina (MCC) y un 1 % de estearato de magnesio. Así, la carga del extracto original fue del 80 %. Esta mezcla se introdujo en una máquina de comprimir con troqueles y punzones de 3 mm para obtener minicomprimidos de 3 mm de diámetro con una dureza de 9 kg/cm2.

Ejemplo 22

Método de elaboración de minicomprimido con recubrimiento entérico de extracto de raíz de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido

[0239] Los minicomprimidos preparados según el ejemplo 21 se recubrieron mediante el método de recubrimiento en bombo. En resumen, se introdujeron 4 kg de minicomprimidos de 3 mm de diámetro en el bombo y se hicieron girar a 20 rpm. Se pulverizó material de recubrimiento (polímero de recubrimiento entérico de la marca EUDRAGUARD de Evonik) sobre los comprimidos mediante una pistola de pulverización como dispersión acuosa al 30 %. Simultáneamente, se puso en marcha un soplador caliente (110 grados) para el secado rápido de los comprimidos. Los comprimidos se recubrieron hasta obtener un aumento de peso del 12 %. Después del recubrimiento, los comprimidos se mantuvieron en una corriente de aire caliente durante 15 minutos para garantizar el secado completo.

Ejemplo 23

[0240] Se recogieron raíces de ashwagandha (100 kg). Se limpiaron las raíces de ashwagandha. Las raíces limpias se extrajeron con metanol al 100 %. Las raíces se sometieron a reflujo con metanol al 100 % a la temperatura de ebullición (60-70 °C) del metanol durante una hora para obtener un primer residuo y un primer sobrenadante. El primer residuo se volvió a extraer dos veces más con una cantidad de metanol cuatro veces mayor en cada ocasión. Se separaron el residuo y los sobrenadantes. Todos los sobrenadantes fueron agrupados y concentrados en un evaporador de película fina agitado (ATFE) para formar un extracto de metanol concentrado. El extracto de metanol concentrado se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener un polvo de extracto de ashwagandha al 100 % de metanol (rendimiento 6 %).

El contenido de glicósido de witanólido en el polvo de extracto de ashwagandha al 100 % de metanol era de un 1 % mediante HPLC.

Ejemplo 24

Método de preparación de polvo de raíz de ashwagandha

[0241] Se recogieron raíces frescas de ashwagandha (100 kg). Se limpiaron las raíces de ashwagandha. Las raíces limpias se secaron. Las raíces secas se pulverizaron para obtener polvo de raíz de ashwagandha (rendimiento 70 %).

[0242] El contenido de glicósido de witanólido en el polvo de ashwagandha fue de un 0,6 % mediante HPLC.

Ejemplo 25

Método de análisis de saponinas mediante el método espectrofotométrico

[0243] Se pesaron 50 mg de extracto de ashwagandha en un matraz aforado de 50 ml y se completó el volumen añadiendo agua. El estándar se preparó pesando con precisión 5 mg de estándar [protodioscina estándar de 97,2 % de pureza de Chromadex] y se transfirió a un matraz aforado de 5 ml y se completó con agua hasta obtener una solución de 5 ml. Se pipeteó 1 ml de muestra y 1 ml de estándar en dos tubos de ensayo separados. Se añadió 1 ml de reactivo de anisaldehído a cada tubo y se mezcló bien. La mezcla se mantuvo durante 10 minutos. Se añadieron 4 ml de reactivo de ácido sulfúrico al 70 % a cada tubo y se mezclaron. Los tubos se mantuvieron en un baño de agua con una temperatura constante de 60 °C. Después de 10 minutos, los tubos se enfriaron y se tomó la absorbancia a 435 nm. Las saponinas se determinaron mediante la fórmula siguiente:

Saponina total =

Absorbancia de muestra x concentración de estándar x pureza de estándar

Absorbancia de estándar x concentración de muestra

Ejemplo 26

Método de preparación de diferente polvo/extracto de ashwagandha en diferente pH

[0244] Se añadió polvo/extracto de ashwagandha a diferentes tampones (pH 1, 2, 3, 5, 7 y 7,4) en una proporción de 1:20 de polvo/extracto de ashwagandha:tampón. La solución extracto-tampón se mantuvo en un baño de agua a 37 °C durante 2 horas. La solución se neutralizó añadiendo una solución de base o de ácido. La solución neutralizada se concentró y se secó.

Ejemplo 27

Método de elaboración de extracto de amaranto con nitrato al 9 %

[0245] Se recogió amaranto fresco (100 kg). Se limpiaron y trituraron las hojas y el tallo del amaranto fresco. Se añadió agua en una cantidad diez veces superior a la cantidad de material triturado de amaranto para formar una mezcla. La extracción se realizó utilizando un extractor con un condensador de reflujo. En el fondo del extractor se colocó una tela filtrante de polipropileno (100 micras). La mezcla se sometió a reflujo durante una hora para obtener un primer residuo y un sobrenadante. El residuo y los sobrenadantes se separaron drenando el sobrenadante del fondo del extractor a través de la tela filtrante de polipropileno utilizando una bomba centrífuga. Tras la primera extracción, el primer residuo se volvió a extraer con una cantidad de agua diez veces superior para obtener el segundo residuo y el sobrenadante. El segundo residuo se extrajo de nuevo con una cantidad de agua diez veces mayor para obtener un tercer residuo y un sobrenadante. Todos los sobrenadantes se juntaron y se concentraron en un evaporador de película fina agitado (ATFE) a una temperatura de 85 °C para formar el extracto acuoso concentrado (rendimiento 3 %).

[0246] El extracto acuoso concentrado se hizo pasar por una columna de carbono para obtener un filtrado. El filtrado se concentró y se clarificó para formar un sobrenadante y un residuo. El sobrenadante se secó al vacío a más de 500 mm de mercurio para obtener polvo de extracto acuoso purificado de amaranto fresco (rendimiento 2,5 kg).

[0247] El contenido de nitrato en el extracto acuoso de amaranto fresco por cromatografía iónica resultó ser del 9 %. Ejemplo 28

Método de elaboración de la combinación de extracto de raíz de ashwagandha con recubrimiento entérico con un 3,5 % de glicósido de witanólido y extracto de amaranto con un 9 % de nitrato

[0248] Se mezclaron 2,5 kg de extracto de ashwagandha con recubrimiento entérico, preparado según el ejemplo 20, y 2,5 kg de extracto de amaranto, preparado según el ejemplo 25, en una proporción de 1:1, utilizando un mezclador de doble cono (acero inoxidable SS-316, capacidad de 2000 litros, fabricante: Zebra Pharma, Mumbai).

Ejemplo 29

Estudio de eficacia de diferentes extractos de ashwagandha en gránulos y en polvo tratados con diferentes pH [0249] Se dividieron 108 ratas en 27 grupos que comprendían 4 ratas en cada grupo. Los animales fueron entrenados para la prueba de natación (15 minutos) como sesión previa a la prueba y, a continuación, se les sometió a ayuno durante la noche. A los animales en ayunas, se les inyectó reserpina (6 mg/kg) por vía intraperitoneal para deprimirlos. Tras 1 hora de la inyección de reserpina, las muestras de prueba tratadas con diferentes pH/estándar se administraron por vía oral según la dosis designada. Después de 1 hora de la muestra de prueba/estándar, las ratas fueron sometidas a una prueba de natación forzada y se registró la duración de la inmovilidad en la sesión de prueba de 5 minutos. En esta prueba, un mayor tiempo de inmovilidad indica que el animal está más deprimido o estresado.

Tabla 1: Efecto de diferentes gránulos de polvo/extractos de ashwagandha en diferentes pH sobre el tiempo de inmovilidad en ratas

[0250] Como se muestra en la tabla 1, el tiempo de inmovilidad de los animales normales de control era de 120 segundos. Cuando se inyectó reserpina por vía intraperitoneal, los animales se deprimieron y el tiempo de inmovilidad aumentó a 250 segundos (Grupo II). La administración oral de polvos de raíz de ashwagandha (200 mg/kg) a pH 1, 2, 3 y 5 después de la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 245, 245, 230 y 220 segundos respectivamente (Grupo III a VI). La administración de polvos de raíz de ashwagandha (200 mg/kg) a pH 7 y 7.4 tras la inyección de reserpina fue ligeramente eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 205 segundos (Grupo VII a VIII). Del mismo modo, la administración de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos (60 mg/kg) a pH 1, 2, 3 y 5 después de la inyección de reserpina fue ligeramente eficaz (mejor que la de polvo de raíz de ashwagandha) y el tiempo de inmovilidad fue de 235, 230, 210 y 189 segundos respectivamente (Grupo IX a XII). En cambio, la administración de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos (60 mg/kg) a pH 7 y 7.4 después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 152 y 150 segundos respectivamente (Grupo XIII a XIV).

[0251] La administración de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos (20 mg/kg) a pH 1, 2, 3 y 5 después de la inyección de reserpina fue eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 220, 220, 202 y 180 segundos respectivamente (Grupo XV a XVIII). En cambio, la administración de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos (20 mg/kg) a pH 7 y 7,4 después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 145 y 139 segundos respectivamente (Grupo XIX a XX).

[0252] En caso de administrar extractos con un contenido muy alto de glicósidos de witanólidos (80 %) (20 mg/kg) a pH 1, 2, 3 y 5 después de la inyección de reserpina fue eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 212, 211, 194 y 165 segundos respectivamente (Grupo XXI a XIV). En cambio, la administración de extracto de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos (20 mg/kg) a pH 7 y 7,4 después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 110 y 105 segundos respectivamente (Grupo XV a XVI). En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg (Grupo XVII), el tiempo de inmovilidad fue de sólo 122 segundos, lo que es casi similar al de los animales de control normales.

Ejemplo 30

Estudio de eficacia de diferentes gránulos de extractos de ashwagandha con recubrimiento normal (película), entérico y de liberación retardada

[0253] Se dividieron 60 ratas en 15 grupos que comprendían 4 ratas en cada grupo. Los animales fueron entrenados para la prueba de natación (15 minutos) como sesión previa a la prueba y, a continuación, se les sometió a ayuno durante la noche. A los animales en ayunas, se les inyectó reserpina (6 mg/kg) por vía intraperitoneal para deprimir a los animales. Inmediatamente después de la inyección de reserpina, las muestras de prueba con recubrimiento/estándar normal (hidroxipropilcelulosa; HPC), entérico (Eudragit) y de liberación retardada (alto porcentaje de Eudragit) se administraron por vía oral en las dosis designadas. Después de 2 horas de la muestra de prueba/estándar, las ratas fueron sometidas a una prueba de natación forzada y se registró la duración de la inmovilidad en la sesión de prueba de 5 minutos. En esta prueba, un mayor tiempo de inmovilidad indica que el animal está más deprimido o estresado.

Tabla 1: Efecto de diferentes polvos/gránulos de ashwagandha con recubrimiento normal/entérico/de liberación ________ __________________ retardada sobre el tiempo de inmovilidad en ratas_____ ____

Grupos Tratamiento Tie

inm

seg

[0254] Como se muestra en la tabla 1, el tiempo de inmovilidad de los animales normales de control era de 120 segundos. Cuando se inyectó reserpina por vía intraperitoneal, los animales se deprimieron y el tiempo de inmovilidad aumentó a 250 segundos (Grupo II). La administración oral de polvo de raíz de ashwagandha con recubrimiento HPC normal (200 mg/kg) tras la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 245 segundos (Grupo III). La administración de polvo de raíz de ashwagandha con recubrimiento entérico (200 mg/kg) tras la inyección de reserpina fue más eficaz que el recubrimiento HPC y el tiempo de inmovilidad se registró en 205 segundos (Grupo IV). La administración de polvo de raíz de ashwagandha con recubrimiento de liberación retardada (200 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue menos eficaz que el recubrimiento entérico y el tiempo de inmovilidad se registró en 220 segundos (Grupo V).

[0255] Del mismo modo, la administración oral de gránulos de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento HPC normal (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 215 segundos (Grupo VI). La administración de gránulos de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento entérico (60 mg/kg) tras la inyección de reserpina fue más eficaz que el recubrimiento HPC y el tiempo de inmovilidad fue de 141 segundos (Grupo VII). La administración de gránulos de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento de liberación retardada (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue menos eficaz que el recubrimiento entérico y el tiempo de inmovilidad se registró en 186 segundos (Grupo VIII).

[0256] La administración oral de gránulos de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento HPC normal (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue ligeramente eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 192 segundos (Grupo IX). La administración de gránulos de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento entérico (20 mg/kg) tras la inyección de reserpina fue más eficaz que el recubrimiento HPC y el tiempo de inmovilidad se registró en 138 segundos (Grupo X). La administración de gránulos de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento de liberación retardada (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue menos eficaz que el recubrimiento entérico y el tiempo de inmovilidad se registró en 162 segundos ^(GrupoX ⁱ).

[0257] La administración oral de gránulos de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento HPC normal (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 173 segundos (Grupo XII). La administración de gránulos de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento entérico (20 mg/kg) tras la inyección de reserpina fue más eficaz que el recubrimiento HPC y el tiempo de inmovilidad se registró en 109 segundos (Grupo XIII). La administración de gránulos de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con recubrimiento de liberación retardada (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue menos eficaz que el recubrimiento entérico y el tiempo de inmovilidad se registró en 132 segundos (Grupo XIV). En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg (Grupo XVII), el tiempo de inmovilidad fue de 120 segundos, lo que es casi similar al de los animales de control normales.

Ejemplo 31

Estudio de eficacia de diferentes gránulos de extractos de ashwagandha con diferentes porcentajes de recubrimiento entérico

[0258] Se dividieron 44 ratas en 11 grupos que comprendían 4 ratas en cada grupo. Los animales fueron entrenados para la prueba de natación (15 minutos) como sesión previa a la prueba y, a continuación, se les sometió a ayuno durante la noche. A los animales en ayunas, se les inyectó reserpina (6 mg/kg) por vía intraperitoneal para deprimir a los animales. Inmediatamente después de la inyección de reserpina, las muestras de prueba (polvo de raíz de ashwagandha) con diferentes porcentajes de recubrimiento entérico/estándar se administraron por vía oral según la dosis designada. Después de 2 horas de la muestra de prueba/estándar, las ratas fueron sometidas a una prueba de natación forzada y se registró la duración de la inmovilidad en la sesión de prueba de 5 minutos. En esta prueba, un mayor tiempo de inmovilidad indica que el animal está más deprimido o estresado.

[0259] La prueba se repitió con diferentes porcentajes de extracto de ashwagandha recubierto que contenía un 3,5 % de glicósidos de witanólidos y diferentes porcentajes de extracto de ashwagandha recubierto que contenía un 35 % y un 80 % de glicósidos de witanólidos.

Tabla 1: Efecto del polvo de ashwagandha con diferentes porcentajes de recubrimiento entérico sobre el tiempo de inmovilidad en ratas

[0260] Como se muestra en la tabla 1, el tiempo de inmovilidad de los animales normales de control fue de 120 segundos. Cuando se inyectó reserpina por vía intraperitoneal, los animales se deprimieron y el tiempo de inmovilidad aumentó a 250 segundos (Grupo II). La administración oral de polvo de raíz de ashwagandha con un recubrimiento entérico del 0,5 %, 1 % y 3 % (200 mg/kg) después de la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 245, 235 y 223 segundos respectivamente (Grupo III a V). La administración de polvo de raíz de ashwagandha con un recubrimiento entérico del 5 y el 7 % (200 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue más eficaz que los porcentajes más bajos de recubrimientos y el tiempo de inmovilidad se registró en 216 y 207 segundos respectivamente (Grupo VI a VII). La administración de polvo de raíz de ashwagandha con un recubrimiento entérico del 10, 12 y 15 % (200 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 201, 200 y 200 segundos respectivamente (Grupo VIII a X). En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg (Grupo XI), el tiempo de inmovilidad fue de 120 segundos, lo que es casi similar al de los animales de control normales.

Tabla 2: Efecto del extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósido de witanólido con diferentes porcentajes ________ ___________ de recubrimiento entérico sobre el tiempo de inmovilidad en ratas___________________ Grupos Tratamiento Tiempo de

inmovilidad en segundos

Grupo I Control normal (recibió sólo vehículo; 1 % Tween 80 v/v p.o.).

120 Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p.) vehículo (1 % Tween 80 v/v p.o.). 250 II

Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p) extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos 225 III de witanólidos (muestra 2 preparada según el ejemplo 19) con un 0,5 % de recubrimiento entérico (dosis 60 mg/kg p.o). Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p) extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos 220 IV de witanólidos (muestra 2 preparada según el ejemplo 19) con un 1 % de recubrimiento entérico (dosis 60 mg/kg p.o). Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p) extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos 206 V de witanólidos (muestra 2 preparada según el ejemplo 19) con un 3 % de recubrimiento entérico (dosis 60 mg/kg p.o). Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p) extracto de ashwagandha co 195 VI de witanólidos (muestra 2 preparada según el ejemplo recubrimiento entérico (dosis 60 mg/kg p.o). Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p) extracto de ashwagandha co 180 VII de witanólidos (muestra 2 preparada según el ejemplo recubrimiento entérico (dosis 60 mg/kg p.o). Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p) extracto de ashwagandha co 160 VIII de witanólidos con un 10 % de recubrimiento entérico ( Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p) extracto de ashwagandha co 142 IX de witanólidos (muestra 2 preparada según el ejemplo recubrimiento entérico (dosis 60 mg/kg p.o). Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p) extracto de ashwagandha co 140 X de witanólidos (muestra 2 preparada según el ejemplo recubrimiento entérico (dosis 60 mg/kg p.o). Grupo Reserpina (6 mg/kg i.p.) fluoxetina (10 mg/kg p.o.).

120

[0261] Como se muestra en la tabla 2, el tiempo de inmovilidad de los animales normales de control fue de 120 segundos. Cuando se inyectó reserpina por vía intraperitoneal, los animales se deprimieron y el tiempo de inmovilidad aumentó a 250 segundos (Grupo II). La administración oral de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con un recubrimiento entérico del 0,5 %, 1 % y 3 % (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 225, 220 y 206 segundos respectivamente (Grupo III a V). La administración de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con un recubrimiento entérico del 5 y el 7 % (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue más eficaz que los porcentajes más bajos de recubrimientos y el tiempo de inmovilidad se registró en 195 y 180 segundos respectivamente (Grupo VI a VII). La administración de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos con un recubrimiento entérico del 10, 12 y 15 % (60 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 160, 142 y 140 segundos respectivamente (Grupo VIII a X). En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg (Grupo XI), el tiempo de inmovilidad fue de 120 segundos, lo que es casi similar al de los animales de control normales.

Tabla 3: Efecto del extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósido de witanólido con diferentes porcentajes de recubrimiento entérico sobre el tiem o de inmovilidad en ratas

[0262] Como se muestra en la tabla 3, el tiempo de inmovilidad de los animales normales de control fue de 120 segundos. Cuando se inyectó reserpina por vía intraperitoneal, los animales se deprimieron y el tiempo de inmovilidad aumentó a 250 segundos (Grupo II). La administración oral de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con un recubrimiento entérico del 0,5 %, 1 % y 3 % (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 200, 188 y 180 segundos respectivamente (Grupo III a V). La administración de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con un recubrimiento entérico del 5 y el 7 % (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue más eficaz que los porcentajes más bajos de recubrimientos y el tiempo de inmovilidad se registró en 171 y 160 segundos respectivamente (Grupo VI a VII). La administración de extracto de ashwagandha con un 35 % de glicósidos de witanólidos con un recubrimiento entérico del 10, 12 y 15 % (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 153, 139 y 136 segundos respectivamente (Grupo VIII a X). En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg (Grupo XI), el tiempo de inmovilidad fue de 120 segundos, lo que es casi similar al de los animales de control normales.

Tabla 4: Efecto del extracto de ashwagandha con un 80% de glicósido de witanólido con diferentes porcentajes de recubrimiento entérico sobre el tiem o de inmovilidad en ratas

[0263] Como se muestra en la tabla 4, el tiempo de inmovilidad de los animales normales de control fue de 120 segundos. Cuando se inyectó reserpina por vía intraperitoneal, los animales se deprimieron y el tiempo de inmovilidad aumentó a 250 segundos (Grupo II). La administración oral de extracto de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con un recubrimiento entérico del 0,5 %, 1 % y 3 % (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina no fue muy eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 195, 183 y 173 segundos respectivamente (Grupo III a V). La administración de extracto de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con un recubrimiento entérico del 5 y el 7 % (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue más eficaz que los porcentajes más bajos de recubrimientos y el tiempo de inmovilidad se registró en 160 y 145 segundos respectivamente (Grupo VI a VII). La administración de extracto de ashwagandha con un 80 % de glicósidos de witanólidos con un recubrimiento entérico del 10, 12 y 15 % (20 mg/kg) después de la inyección de reserpina fue más eficaz y el tiempo de inmovilidad se registró en 122, 111 y 109 segundos respectivamente (Grupo VIII a X). En el caso del estándar de fluoxetina a 10 mg/kg (Grupo XI), el tiempo de inmovilidad fue de 120 segundos, lo que es casi similar al de los animales de control normales.

Ejemplo 32

Actividad antidiabética del extracto de ashwagandha en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina [0264] Se evaluó la actividad antidiabética de distintos extractos de ashwagandha con y sin recubrimiento en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina (STZ). Se mantuvieron varias ratas albinas wistar macho/hembra según las directrices estándar: alojadas en jaulas de polipropileno, bajo ciclos de luz y oscuridad artificiales de 12 horas a una temperatura de 24 ± 2 °C, con una dieta estándar de pellets y agua ad libitum. Los animales se aclimataron a las condiciones de un recinto para animales durante una semana antes de comenzar el experimento.

[0265] Se indujo la diabetes inyectando por vía intraperitoneal estreptozotocina 35 mg/kg disuelta en tampón citrato 0,1 M de pH 4,5. Cinco días después de la inducción de la diabetes (día 1 del estudio), se sometió a ayuno a los animales durante 12 horas y se estimó el nivel de glucosa en sangre en ayunas (FBG, por sus siglas en inglés) para diagnosticar las ratas diabéticas. Los animales con FBG superior a 200 mg/dl se consideraron diabéticos. Los animales diabéticos se dividieron aleatoriamente en 13 grupos de seis animales cada uno. También se incluyó un grupo normal que comprendía seis ratas normales.

[0266] La siguiente tabla 1 muestra el programa de tratamiento administrado a los respectivos grupos de animales durante 28 días.

T l 1: Pr r m r mi n

[0267] El nivel de glucosa en sangre en ayunas y el peso corporal de las ratas se midieron inicialmente y luego en el día 7, el día 14, el día 21 y el día 28 del estudio.

Tabla 2: Nivel de glucosa en sangre en ayunas (FBG) de ratas diabéticas tratadas con extracto de ashwagandha.

[0268] La diabetes se indujo con éxito en las ratas tras la inyección de STZ. La FBG de las ratas del Grupo I (control con vehículo) se mantuvo normal hasta el final del estudio. La FBG del grupo de control sin tratar (Grupo II) se mantuvo elevada (por encima de 400 mg/dl) durante los 28 días del estudio. El fármaco estándar glibenclamida (Grupo III) fue eficaz en la reducción del nivel de FBG y se redujo de 422 a 124 mg/dl en 28 días de tratamiento. El tratamiento con extracto de ashwagandha con un mínimo de un 1 % de glicósidos de witanólidos en una dosis de 100 mg/kg (Grupo IV) redujo la FBG de 423 a 302 mg/dl, mientras que el mismo extracto después de recubrirlo con Eudragit (Grupo V) redujo la FBG de 428 a 300 mg/dl. El extracto de raíz de ashwagandha con un 5 % de glicósidos de witanólidos (Grupo VI) a 100 mg/kg redujo la FBG de 425 a 224 mg/dl mientras que el producto recubierto (Grupo VII) redujo el nivel de 423 a 222 mg/dl. El extracto de ashwagandha con un mínimo de un 3,5 % de glicósidos de witanólidos (Grupo VIII) a 100 mg/kg y su producto recubierto (Grupo IX) en una dosis de 20 mg/kg redujeron la FBG de 425 a 163 y de 426 a 162 mg/dl respectivamente. El extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido (Grupo X) administrado a 100 mg/kg redujo el nivel de FBG de 424 a 120 mg/dl, mientras que el extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit (Grupo XI) administrado a 20 mg/kg durante 28 días redujo la FBG de 424 a 119 mg/dl. El extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 80 % de glicósido de witanólido (Grupo XII) a 100 mg/kg y su producto recubierto (Grupo XIII) a 20 mg/kg fueron los más eficaces y redujeron el nivel de FBG de 426 a 73 y de 425 a 72 mg/dl respectivamente.

Ejemplo 33

Actividad antidiabética de los extractos de ashwagandha recubiertos en diferentes dosis en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina.

[0269] Se evaluó la actividad antidiabética de diferentes extractos de ashwagandha con recubrimiento en diferentes dosis en ratas experimentales. Se mantuvieron varias ratas albinas wistar macho/hembra según las directrices estándar: alojadas en jaulas de polipropileno, bajo ciclos de luz y oscuridad artificiales de 12 horas a una temperatura de 24 ± 2 °C, con una dieta estándar de pellets y agua ad libitum. Los animales se aclimataron a las condiciones de un recinto para animales durante una semana antes de comenzar el experimento.

[0270] Se indujo la diabetes inyectando por vía intraperitoneal estreptozotocina 35 mg/kg disuelta en tampón citrato 0,1 M de pH 4,5. Cinco días después de la inducción de la diabetes (día 1 del estudio), se sometió a ayuno a los animales durante 12 horas y se estimó el nivel de glucosa en sangre en ayunas (FBG, por sus siglas en inglés) para diagnosticar las ratas diabéticas. Los animales con FBG superior a 200 mg/dl se consideraron diabéticos. Los animales diabéticos se dividieron aleatoriamente en 13 grupos de 4 animales cada uno.

[0271] La siguiente tabla muestra el programa de tratamiento administrado a los respectivos grupos de animales durante 28 días.

T l 1: Pr r m r mi n

[0272] El nivel de glucosa en sangre en ayunas y el peso corporal de las ratas se midieron inicialmente y luego en el día 7, el día 14, el día 21 y el día 28 del estudio.

Tabla 2: Nivel de glucosa en sangre en ayunas (FBG) de ratas diabéticas tratadas con extracto de ashwagandha en distintas dosis

[0273] La FBG de las ratas del Grupo I (control con vehículo) se mantuvo normal hasta el final del estudio. La FBG del grupo de control sin tratar (Grupo II) se mantuvo elevada (por encima de 400 mg/dl) durante los 28 días del estudio. El fármaco estándar glibenclamida (Grupo III) fue muy eficaz en la reducción del nivel de FBG y se redujo de 423 a 125 mg/dl en 28 días de tratamiento. El extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit (Grupo IV a VIII) en dosis diarias de 1, 5, 10, 20 y 40 mg/kg durante 28 días redujo el nivel de FBG a 301, 250, 202, 164 y 145 mg/dl respectivamente. El extracto de raíz de ashwagandha purificado con un 35 % de glicósido de witanólido recubierto de Eudragit fue el más eficaz para reducir los niveles de FBG en ratas. Este producto en dosis diarias de 1, 5, 10, 20 y 40 mg/kg (Grupo IX a XIII) redujo el nivel de FBG a 250, 200, 160, 120 y 80 mg/dl respectivamente.

Ejemplo 34

Estudio de resistencia

[0274] Se utilizó la prueba de natación forzada (FST) en ratas para evaluar la resistencia a la natación. La prueba incluía dos exposiciones a un depósito de agua (altura, 40 cm; diámetro, 22 cm, que contenía 25 cm de agua a 25 °C) separadas por 24 horas. La primera exposición duró 10 minutos (entrenamiento) y la segunda, que sirvió de sesión de prueba, duró 5 minutos. Cada animal hizo vigorosos intentos de salir del baño de agua durante los primeros minutos y después se rindió a las condiciones experimentales y asumió una postura típica de inmovilidad (que se define como cuando no se observa ninguna actividad adicional que no sea la necesaria para mantener la cabeza por encima del agua) con intentos ocasionales de escape. Se registró la duración total de la inmovilidad.

[0275] Se dividieron 24 ratas macho en 4 grupos que comprendían 6 ratas en cada grupo. El experimento se realizó según el procedimiento anterior y se registró el tiempo de inmovilidad.

[0276] En el grupo de control (Grupo I), el tiempo medio de inmovilidad de las ratas en una sesión de prueba de 5 minutos fue de 118,67 segundos, mientras que después de alimentarlas con extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit (Grupo II) a 20 mg/kg aumentó la resistencia a la natación y el tiempo de inmovilidad se redujo a 77,33 segundos. El tiempo de inmovilidad de las ratas alimentadas con extracto de amaranto con un 9 % de contenido de nitrato (Grupo III) a 50 mg/kg se registró en 66,67 segundos. La alimentación de las ratas con una combinación de extracto de ashwagandha con un 3,5 % de glicósidos de witanólidos recubierto de Eudragit y extracto de amaranto con un 9 % de contenido de nitrato fue más eficaz y redujo el tiempo de inmovilidad a 52,67 segundos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición con recubrimiento entérico de un extracto de Withania somnífera, donde el extracto de Withania somnífera es extracto de raíz de Withania somnífera que comprende al menos aproximadamente un 35 % de glicósidos de witanólidos y al menos aproximadamente un 10 % de saponinas; o extracto de raíz de Withania somnífera que comprende al menos aproximadamente un 80 % de glicósidos de witanólidos y al menos aproximadamente un 15 % de saponinas.

2. Composición con recubrimiento entérico de acuerdo con la reivindicación 1, donde el extracto de Withania somnifera se obtiene de raíz fresca, raíz seca de Withania somnifera o combinaciones de las mismas.

3. Composición con recubrimiento entérico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el extracto de Withania somnifera comprende alcaloides en una proporción inferior a aproximadamente 0,1 %, agliconas de witanólidos en una proporción inferior a aproximadamente 0,1 % y oligosacáridos en una proporción inferior a aproximadamente 0,1 %.

4. Composición con recubrimiento entérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el extracto de Withania somnifera se mezcla con un segundo extracto, donde el segundo extracto se selecciona del grupo que consiste en el extracto de amla, el extracto de cúrcuma, el extracto de semilla de uva, el extracto de té verde, el extracto de granada, el extracto de amaranto, el extracto de costus, el extracto de cacao, el extracto de raíz de coco, el extracto de romero, el extracto de hoja de menta, el anís estrellado, el extracto de albahaca dulce, el extracto de canela/extracto de clavo, el extracto de jengibre, el extracto de semilla de comino, el extracto de pimienta negra, el extracto de alholva, y combinaciones de los mismos.

5. Composición con recubrimiento entérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1a 3 en combinación con un extracto de amaranto.

6. Composición con recubrimiento entérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la composición con recubrimiento entérico comprende un material de recubrimiento entérico, donde el material de recubrimiento entérico se selecciona del grupo que consiste en poli(ácido metacrílico-co-metilmetacrilato), ésteres de ácido aleurético, acetato ftalato de celulosa, trimelitato de acetato de celulosa, ftalato de acetato de polivinilo, hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato de acetaldehído dimetilcelulosa, quitosano, zeína, ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos, fibras vegetales, y una combinación de etilcelulosa modificada y alginato de sodio.

7. Extracto de Withania somnifera que comprende entre aproximadamente un 35 % y aproximadamente un 80 % de glicósidos de witanólidos.

8. Uso de una composición con recubrimiento entérico según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para mejorar la biodisponibilidad de los glicósidos de witanólidos.

9. Uso de una composición con recubrimiento entérico según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para mejorar la bioactividad del extracto de Withania somnifera.

10. Extracto de Withania somnifera según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1a 3 y 7 para su uso en un método de tratamiento.

11. Extracto de Withania somnifera según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1a 3 y 7 para su uso en un método de tratamiento, que se selecciona del grupo que consiste en mejorar la actividad inmunomoduladora, mejorar la actividad antiinflamatoria, mejorar la actividad contra el estrés, tratar la diabetes, donde la actividad inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste en un aumento de las células de la médula ósea, un aumento del número de células a-esterasa positivas, un aumento del valor del título de anticuerpos IgG e IgM, un aumento del número de células productoras de anticuerpos, y donde la mejora de la actividad contra el estrés es un aumento del tiempo de tolerancia al estrés por anoxia.

12. Extracto de Withania somnifera para el uso de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, donde el extracto se encuentra en forma de una composición con recubrimiento entérico según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Uso de un extracto de Withania somnifera según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 7 en la mejora de la actividad contra el estrés, donde la mejora en la actividad contra el estrés es una mejora del tiempo de resistencia a la natación.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, donde el extracto se encuentra en forma de una composición con recubrimiento entérico según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.