ES2894075T3 - Composiciones de vacunas divalentes y el uso de las mismas para el tratamiento de tumores - Google Patents
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Abstract
Se describen composiciones vacunales que combinan en igual proporción los dominios extracelulares de los receptores de factores de crecimiento Her1 y Her2 o fragmentos de estos y adicionalmente proteoliposomas de muy pequeña talla derivado de proteínas de la membrana externa de
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones de vacunas divalentes y el uso de las mismas para el tratamiento de tumores
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a biotecnología e inmunología aplicadas a la salud humana. En particular, se refiere a una formulación de vacuna para el tratamiento de tumores malignos.
Antecedentes de la invención
Los receptores Her1 y Her2 son glicoproteínas transmembrana con actividad tirosina quinasa que pertenecen a una familia de receptores conocida como la familia ErbB (Normanno N, et al (2005) Curr Drug Targets 6, (3): 243-257). Her1 se sobreexpresa en tumores de pulmón, mama, cabeza y cuello, colorrectal, páncreas, vejiga, ovario, glioblastomas (TM Brand, et al, (2011) Cancer Biol Ther 11 (9): 777-792); (Zhau HY et al, (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93, (26): 15152-15157; Liu XH, et al, (1993) J Clin Endocrinol Metab 77 (6): 1472-1478; Neal DE, et al, (1985) Lancet 1 (8425): 366-368; Gullick WJ, et al, Cancer Res 46 (1): 285-292; Salomon DS, et al, (1995) Crit Rev Oncol Hematol 19 (3): 183-232). La sobreexpresión de Her1 se asocia con un mal pronóstico en tumores de cabeza y cuello y cáncer de pulmón, con un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad (Turkeri LN et al, (1998) Urology 51 (4): 645 649; Chow Nh , et al, (1997) Anticancer Res 17 (2B): 1293-1296) y con menor supervivencia de pacientes con cáncer de ovario, colon, vejiga, tiroides y cabeza y cuello (Grandis et al, (1998) J Cell Biochemr 69 (1):55-62).
Adicionalmente, los niveles de expresión de Her1 se correlacionan con la resistencia a las terapias convencionales (Holbro T, et al, (2003) Exp Cell Res 284 (1): 99-110). Además, se ha encontrado una expresión aberrante del receptor Her2 en comparación con la expresión en tejidos normales en tumores gástricos de mama, ovario y (Tai W et al, (2010) J Control Release 146 (3): 264-275). Además, se ha observado desregulación de este receptor en la transformación maligna del tracto respiratorio (Andrade Filho et al., 2010) y es un mecanismo de resistencia tumoral a las terapias anti-Her1 (Brand et al, (2011) Cancer Biol Ther 11 (9): 777-792). La sobreexpresión de Her2 en tumores de mama se ha correlacionado con una supervivencia general más baja y una supervivencia libre de recaídas.
Muchos de los tumores mencionados anteriormente coexpresan altos niveles de Her1 y Her2, y la sobreexpresión de ambos receptores se asocia con una disminución de la supervivencia del paciente (Wiseman SM, et al, (2005) Cancer. May 1;103(9): 1770-7). Las pacientes con tumores de mama positivos para Her2 tienen un alto riesgo de mortalidad asociado a la enfermedad, y además, la coexpresión de Her1 y Her2 en estos tumores aumenta significativamente este riesgo, lo que indica que la expresión de Her1 en estos carcinomas tiene un efecto sinérgico sobre expresión de Her2 (Suo Z et al, (2002) J Pathol 196 (1): 17-25). Se ha demostrado experimentalmente que existe una interacción sinérgica entre estos receptores en la transformación celular maligna (Kokai Y et al, (1989) Cell 58 (2): 287-292). Otros ejemplos de tumores en los que se ha encontrado la coexpresión de Her1 y Her2 son cánceres de cerebro, ovario, cabeza y cuello, pulmón, esófago y colon (Emanuel SL et al, (2008) Mol Pharmacol 73 (2): 338-348; Ako E et al, (2007). Oncol Rep 17 (4): 887-893; Venkateswarlu S et al, (2002) Oncogene 21 (1): 78-86).
Está bien documentado en la bibliografía el papel fisiológico de la expresión aberrante y coexpresión de los receptores Her1 y Her2 en tumores. Estos receptores, mediante la formación de dímeros y heterodímeros (Pinkas-Kramarski R et al, (1996) EMBO J 15 (10): 2452-2467), regulan procedimientos importantes en la biología tumoral, tal como la proliferación sostenida, la angiogénesis, la inhibición de la apoptosis, reprogramación metabólica y capacidad invasiva y metastásica (Hanahan D et al (2011) Cell 144 (5): 646-674).
Ambos receptores Her1 y Her2 tienen una estructura similar que consta de un dominio extracelular (ECD), un dominio transmembrana único y un dominio intracelular con actividad tirosina quinasa. ECD de Her1 (ECD-Her1) y ECD de Her2 (ECD-Her2) tienen un peso molecular de 105 y 110 kDa respectivamente, y pueden tener una conformación diferente en el espacio que la del resto de la molécula. Los ECD comprenden cuatro subdominios denominados I, II, III y IV. Los subdominios I y III son las regiones que forman el sitio de unión al ligando y contienen sitios potenciales de glicosilación. El subdominio II es la región crítica para la dimerización entre receptores, y se denomina "brazo de dimerización" (Garrett TP et al, (2002) Cell 110 (6): 763-773; Ferguson KM et al, (2003) Mol Cell 11 (2): 507-517).
Se han descrito siete ligandos de Her1, entre ellos los más relevantes para la formación de tumores son el factor de crecimiento epidérmico (EGF), que promueve la proliferación de células epidérmicas que expresan el receptor, el factor de crecimiento transformador (TGF) y anfiregulina (Normanno et al, (2005) Curr Drug Targets 6 (3): 243-257). El ECD-Her1 está en equilibrio dinámico y tiene múltiples conformaciones que incluyen conformaciones "cerradas" y conformaciones donde el subdominio II está en un estado más flexible. La unión del ligando desplaza el equilibrio hacia una conformación "extendida" o activa, un estado conformacional que es competente para la dimerización (Ferguson KM, (2008) Annu Rev Biophys. 37:353-373).
Sin embargo, no se ha encontrado ningún ligando específico para Her2. La señalización a través de este receptor no requiere factores de crecimiento, ya que el receptor tiene una conformación activa o "extendida" de forma constitutiva que expone su subdominio de dimerización (Cho HS et al, (2003) Nature 421 (6924): 756-760). Por esta razón, el receptor Her2 es el socio de dimerización preferido para todos los demás miembros de la familia ErbB, incluido Her1
(Franklin MC et al, (2004) Cáncer Cell 5 (4): 317-328). La heterodimerización con Her2 contribuye a una disminución en el grado de endocitosis de Her1 y un aumento del reciclaje a la membrana de los receptores que forman el heterodímero (Lenferink A E et al, (1998) EMBO J 17 (12): 3385-3397).
Como describen Baselga J et al, (2009) Nat Rev Cancer 9 (7): 463-475), la dimerización inducida por ligando permite la autofosforilación y transfosforilación de residuos de tirosina de la región citoplásmica de los receptores. Los residuos de fosfotirosina generados inician múltiples vías de señalización intracelular. Una de las vías de señalización iniciadas es la de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), en cuya cascada de activación participan las proteínas quinasas reguladas extracelulares Erk1 y Erk2. Inducen la expresión de factores de transcripción que aumentan la transcripción de genes implicados en la proliferación celular, tal como la ciclina D1 que promueve la progresión del ciclo celular a la fase G1/S. Las combinaciones heterodiméricas son los complejos de señalización más potentes y tienen control directo del ciclo celular (Pinkas-Kramarski R et al, (1996) EMBO J 15 (10): 2452-2467).
Estas dianas tumorales se han validado ampliamente en estudios clínicos. Se ha evaluado el efecto clínico del tratamiento con inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) de estos receptores, tales como gefitinib y lapatinib (Ciardiello F et al, (2000) Clin Cancer Res 6 (5): 2053-2063; Kondo N et al, (2010) Oncol Rep 23 (4): 957-963). También hay informes de ensayos clínicos que usan anticuerpos monoclonales (MAb) contra las dianas mencionadas anteriormente, tal como cetuximab (Jean GW et al, (2008) Pharmacotherapy 8(6):742-54) y nimotuzumab (Ramos TC, et al, (2006) Cancer Biol Ther 5 (4): 375-379), que son específicos para el ECD de Her1, y trastuzumab, que reconoce el ECD de Her2 (Clifford A, (2007) N Engl J Med; 357:39-51). A pesar del potente efecto antitumoral de algunas de estas terapias, tales como cetuximab, se han descrito mecanismos moleculares de resistencia, entre ellos el aumento de los niveles de expresión de otro receptor de la familia, por ejemplo Her2 (Brand TM et al, (2011) Cancer Biol Ther 11 (9): 777-792). Por otro lado, se ha encontrado una mejor respuesta a pertuzumab anti-Her1 murino MAb en carcinomas de mama y pulmón que expresan heterodímeros Her2 con otros miembros de la familia ErbB (Agus DB et al, (2005) J Clin Oncol 23 (11): 2534-2543). Esto apoya la idea de que la inhibición de la heterodimerización es una estrategia atractiva para la terapia contra el cáncer.
Adicionalmente, la terapia activa con vacuna contra el cáncer ha surgido como una nueva opción terapéutica cuyo objetivo es activar la respuesta del sistema inmunológico en pacientes con tumores que expresan Her1 y Her2. Este tipo de terapia, sin embargo, es un desafío, ya que implica la estimulación del sistema inmunológico deprimido por el efecto supresor del tumor, lo que ha hecho necesario que las formulaciones de vacunas utilicen adyuvantes para ayudar a generar una respuesta eficaz. Tal es el caso del adyuvante de proteoliposomas de muy pequeño tamaño (VSSP) derivado de las proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis, que es capaz de activar las células dendríticas (DC) y polarizar la respuesta inmune hacia el patrón de respuesta T-Helper tipo 1 (Th1) como se describe en la patente W o 02/45746 publicada el 13.12.2002.
Los receptores Her1 y Her2 han sido dianas de diferentes candidatos a vacunas evaluados en estudios preclínicos y clínicos. En el diseño de vacunas en base a Her2, se han utilizado vacunas de DC (Czerniecki BJ et al, (2007) Cancer Res 67 (4): 1842-1852), péptidos de Her2 y ECD-Her2. (Ladjemi MZ et al, (2010) Cancer Immunol Immunother 59 (9): 1295-1312). En estudios clínicos de fase II con pacientes con cáncer de mama, se evaluó la inmunización activa con el péptido p369-377 (péptido E75) derivado del ECD de Her2 y presentado por MHC-I, usando el factor estimulante de colonias granulocitos-macrófagos (GM-CSF) como adyuvante. Esta vacuna es capaz de generar linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos in vivo contra células que sobreexpresan Her2 y actualmente se encuentra en estudios clínicos de fase II (Knutson KL et al, (2002) Clin Cancer Res 8 (5): 1014-1018; Patil R et al, (2010) J Am Coll Surg 210 (2): 140-147). Además, se ha diseñado una vacuna terapéutica en base a el ECD de Her2 y adyuvada con GM-CSF, la vacuna es capaz de retardar el crecimiento de carcinomas que expresan Her2 y prolongar la supervivencia de los animales inmunizados (Helguera et al, (2006) Vaccine 16;24(3):304-16).
Las composiciones de vacuna que estimulan o aumentan la respuesta de anticuerpos contra gangliósidos y comprenden un inmunógeno y un adyuvante inmunológico se describen en la solicitud de patente EP-A-661061 y la patente US-A-6149921. Los inmunógenos descritos son VSSP formados por la asociación de los gangliósidos GM3 N-acetilados (N-AcGM3) y N-GlicolilGM3 (N-GcGM3), con el complejo proteico de la membrana externa (OMPC) de la bacteria Neisseria meningitidis. Los inmunógenos N-AcGM3/VSSP y N-GcGM3/VSSP son de muy pequeño tamaño, prácticamente invisibles al microscopio electrónico, solubles en agua y con alta flotabilidad.
La patente WO-A-02145746 describe composiciones de vacuna que contienen: (A) uno o más antígenos poco inmunogénicos; (B) VSSP con gangliósidos incorporados, principalmente N-AcGM3/VSSP y N-GcGM3/VSSP; y (C) opcionalmente uno o más adyuvantes. En particular se describe una vacuna cuyo ingrediente activo es el ECD-Her1 y que usa VSSP y Montanide ISA51 VG como adyuvantes. Los estudios preclínicos con esta vacuna demostraron su efecto antitumoral in vitro e in vivo (Ramirez BS, et al, (2006) Int J Cancer 119 (9): 2190-2199; Ramirez BS, et al (2008) Vaccine 26 (38): 4918-4926).
Aunque se han obtenido resultados con terapias monovalentes, no han sido suficientemente eficaces porque dado que las terapias no pueden eliminar completamente la masa tumoral e incluso cuando el tumor disminuye de tamaño, eventualmente regresa después de la aparición de variantes resistentes. Esto sugiere que las perturbaciones específicas no pueden anular sistemas biológicos complejos tales como los tumores. La explicación de esto podría ser que las variantes resistentes generadas por monoterapias dirigidas a miembros de la familia ErbB, aumentan los
niveles de expresión de otros miembros de la familia (Brand TM, et al, (2011) Cáncer Biol Ther 11 (9): 777-792) permitiendo que los tumores escapen del ataque del sistema inmunológico. Debido a esto, una perturbación múltiple en la biología del tumor a través de la inactivación de más de un receptor ErbB podría resultar en una mayor eficacia.
La solicitud de patente WO-A-02145746 también reivindica una composición que comprende los receptores del factor de crecimiento Her-1, Her-2 y PDGF-R o cualquiera de sus variantes que contienen el dominio extracelular con o sin la región transmembrana. Sin embargo, ni esta solicitud ni ningún otro documento de la técnica enseña cómo combinar los dos receptores, particularmente los ECD de los receptores Her1 y Her2 para producir una vacuna bivalente eficaz para inducir la producción de anticuerpos en el individuo vacunado.
Los autores de la presente invención han descubierto que cuando los ECD de Her1 y Her2 y VSSP-GM3 se mezclan en la misma proporción se obtiene una composición de vacuna capaz de inducir la producción de títulos de anticuerpos que inhiben la fosforilación de Her1 y Her2 y estos anticuerpos tienen un efecto antiproliferativo sobre las células tumorales. Los inventores también encontraron que la proporción en la que se combinan los ECD de Her1 y Her2 es crítica para obtener la respuesta inmune deseada, es decir, que ninguna combinación de los ECD de los receptores Her1 y Her2 desencadena esta respuesta inmune. El objeto de la presente invención son nuevas composiciones de vacunas con la misma proporción de ECD de receptores Her1 y Her2 y VSSPs-GM3 para administración subcutánea.
Un objeto adicional de la presente divulgación es la vacuna para su uso mencionada anteriormente, para su uso en un método para tratar pacientes que padecen una enfermedad causada por tumores que expresan los receptores de los factores de crecimiento Her1 y Her2 que comprende la administración subcutánea de dicha vacuna.
Un objeto adicional de la presente divulgación que no forma parte de la invención son las composiciones de vacuna con la misma proporción de ECD de los receptores Her1 y Her2 y VSSP-GM3 y un adyuvante adicional que puede ser aceitoso o no aceitoso.
Descripción detallada de la invención:
La presente invención proporciona una composición de vacuna para su uso según la reivindicación 1.
La presente divulgación se refiere a una composición de vacuna que comprende los ECD de los receptores Her1 y Her2 o fragmentos de los mismos usados para inducir una respuesta inmune contra tumores malignos que expresan los receptores Her1 y Her2. Esta composición de vacuna comprende además proteoliposomas de tamaño muy pequeño purificados a partir de proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis y el GM3 (VSSP-GM3). En una realización particular, la composición de la presente invención comprende además un adyuvante farmacéuticamente apropiado. Estos adyuvantes farmacéuticamente apropiados incluyen Alúmina.
Sorprendentemente, los inventores de la presente invención encontraron que la proporción en la que se combinan los ECD de los receptores es relevante en la inducción de la respuesta inmune contra los tumores malignos que expresan los receptores Her1 y Her2. La composición de vacuna bivalente descrita en este documento comprende los ECD de los receptores Her1 y Her2 en la misma proporción. La mezcla de ambos principios activos que son los ECD de los receptores Her1 y Her2 en otras proporciones no tiene el efecto deseado sobre el sistema inmunológico. En una realización no cubierta por la invención reivindicada, la composición comprende los ECD de los receptores Her1 y Her2 en un intervalo de concentración de aproximadamente 100 a aproximadamente 800 ug/dosis. Más particularmente, la composición comprende 800 ug/dosis de los ECD de los receptores Her1 y Her2 o fragmentos de los mismos y además comprende 1.2 mg/dosis de VSSP-GM3, administrados por vía subcutánea en una solución acuosa.
En otra realización no cubierta por la invención reivindicada, la composición comprende estas dosis de 800 ug/dosis de cada uno de los ECD de los receptores Her1 y Her2 o fragmentos de los mismos y 1.2 mg/dosis de VSSP-GM3 que se puede mezclar con un adyuvante que puede ser Montanide ISA 51 o Alúmina
Otra realización no cubierta por la invención reivindicada se refiere a una composición de vacuna que comprende los ECD de los receptores Her1 y Her2 o fragmentos de los mismos para ser usados en la inducción de una respuesta inmune como un método para el tratamiento de tumores malignos que expresan los receptores Her1 y Her2. Dicho método comprende la administración subcutánea de al menos una dosis de los ECD de los receptores Her1 y Her2 o fragmentos de los mismos en un intervalo de dosis desde aproximadamente 100 a aproximadamente 800 ug/dosis y adicionalmente de 200 ug/dosis a aproximadamente 1.2 mg/dosis de VSSPs-GM3. La administración puede ser por inyección subcutánea cada dos semanas para completar un total de 5 dosis y luego se administrará una dosis de mantenimiento durante 1 año.
Los ECD de los receptores Her1 y Her2 o fragmentos de los mismos se obtienen mediante síntesis de proteínas o técnicas de ingeniería genética.
Breve descripción de las figuras:
La figura 1 muestra la cinética de Abs IgG en ratones BALB/c (n = 5) inmunizados por vía subcutánea cuatro veces cada 14 días y 30 días después de la última inmunización con 100 |ig de ECD-Her1 y 100 |ig de ECD-Her2 en 200 |ig
de VSSP. Se realizaron extracciones de sangre los días 7, 21, 35, 56, 87 y 102 para medir los títulos de Abs de IgG en los sueros inmunes usando un ensayo ELISA. La cinética de Abs IgG se expresa como el Log (1/medio de título+1) para cada día de extracción, cuando se recubrió con ECD-Her1 (a) y ECD-Her2 (b). La respuesta de Abs de ratones individuales (n = 5) se muestra en la figura, la respuesta es específica para ECD-HER1 (c) y ECD-Her2 (d) y se midió trazando el logaritmo recíproco del título de Abs más 1, en el día 87 del protocolo de inmunización. Letras diferentes indican significancia estadística según lo probado por ANOVA de dos vías (factor de grupo de tratamiento), usando la corrección de la prueba de Bonferroni (p <0.05).
La figura 2 muestra el reconocimiento de las líneas de células tumorales MDAMB468 y MCF7/HER2 por sueros inmunes inducidos por la vacuna bivalente Her1+Her2 y las vacunas monovalentes Her1 y Her2, usando citometría de flujo. Las líneas celulares tumorales humanas mencionadas anteriormente se incubaron con los sueros inmunes (n = 5) o con una mezcla de sueros preinmunes diluidos 1:200, en el día 35 del protocolo de inmunización, así como los controles de la expresión de receptores: MAbs nimotuzumab y trastuzumab, a una concentración de 10 |ig/ml. Posteriormente, las células se marcaron con PAb IgG anti- de ratón de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína. Las células marcadas se visualizaron mediante citometría de flujo. El porcentaje de células reconocidas por los sueros y los MAb se determinó usando el software Flow Jo versión 5.7.2. Letras diferentes indican significancia estadística según lo probado por ANOVA de dos vías (factor de grupo de tratamiento), usando la corrección de la prueba de Bonferroni (p <0.05).
La figura 3 muestra el reconocimiento de la línea celular tumoral H292 por sueros inmunes inducidos por la vacuna bivalente Her1+Her2 y las vacunas monovalentes Her1 y Her2, usando citometría de flujo. Las células tumorales humanas se incubaron el día 35 del protocolo de inmunización con sueros inmunes (n = 5) o con una mezcla de sueros preinmunes diluidos 1:300, así como los controles de expresión de los receptores: MAbs nimotuzumab y trastuzumab en concentración de 10 |ig/ml. Posteriormente, las células se marcaron con IgG anti-ratón PAbs de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína. Las células marcadas se visualizaron mediante citometría de flujo. El porcentaje de células reconocidas por los sueros y MAb se determinó usando el software Flow Jo versión 5.7.2. Letras diferentes indican significancia estadística según lo probado por ANOVA bidireccional (factor de grupo de tratamiento), usando la corrección de la prueba de Bonferroni (p <0.05).
La figura 4 muestra la inhibición de la fosforilación de Her1 y Her2 provocada por los sueros inmunes inducidos por la administración de la vacuna bivalente Her1+Her2. Las células h 292 se incubaron en una mezcla de cinco sueros inmunes inducidos por la vacuna bivalente Her1+Her2 y las vacunas monovalentes Her1 y Her2. Los niveles de fosforilación de Her1 y Her2 después de la estimulación con EGF y con los diferentes tratamientos se determinaron mediante Western blot. Las células no tratadas se usaron como control negativo y el tratamiento con una mezcla de sueros preinmunes (PI) como control negativo de especificidad. Se usó TKI AG1478 como control positivo para la inhibición. Las imágenes muestran los niveles de P-Her1 (a) y P-Her2 (b) obtenidos con diferentes tratamientos. Los gráficos de barras muestran el análisis densitométrico de las imágenes de un experimento representativo elegido entre los dos experimentos realizados.
La figura 5 muestra el efecto antiproliferativo de los Abs inducido por la vacuna bivalente Her1+Her2 en la línea tumoral H292. Las células H292 se incubaron durante 48 horas en una mezcla de cinco sueros inmunes, diluidos 1:20, el día 87 del protocolo de inmunización. La mezcla de sueros PI se utilizó como control negativo en el experimento. La viabilidad celular se determinó mediante el método colorimétrico MTT, determinando la diferencia de densidad óptica (OD) restando la OD a 540 al valor de la OD a 620 nm. El porcentaje de viabilidad máximo se encontró al restar la diferencia de absorbancia de la incubación con suero PI. Las barras representan la media de triplicados de tres experimentos para cada tratamiento. Letras diferentes indican significancia estadística según la prueba de Dunnett T3 para a vs b, p < 0.01 para a vs c, p < 0.001.
La figura 6 muestra los títulos de Abs que reconocen ECD-Her1 y ECD-Her2 inducidos por formulaciones de vacuna bivalente Her1+Her2 que contienen cantidades iguales o no iguales de cada receptor. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 5) por vía subcutánea cuatro veces cada 14 días con: Grupo 1, 100 |ig de ECD-Her1 y 100 |ig de ECD-Her2; Grupo 2, 100 |ig de ECD-Her1 y 200 |ig de ECD-Her2; Grupo 3, 100 |ig de ECD-Her1 y 300 |ig de ECD-Her2; Grupo 4, 200 |ig de ECD-Her1 y 100 |ig de ECD-Her2; Grupo 5, 300 |ig de ECD-Her1 y 100 |ig de ECD-Her2. Todas las formulaciones contenían 200 |ig de VSSP. La determinación de los títulos de anticuerpos específicos ECD-Her1 y ECD-Her2 se realizó en el suero mediante un ensayo ELISA, a partir de una extracción de sangre tomada el día 56. La cinética de Abs IgG se expresa como el medio de log recíproco más uno para cada día de extracción, cuando se recubrió con ECD-Her1 (a) y ECDHer2 (b). La respuesta Abs de IgG de ratones individuales (n = 5) se determinó trazando el inverso de los títulos de anticuerpos.
No se observaron diferencias estadísticas probadas por ANOVA bidireccional (factor de grupo de tratamiento), usando la corrección de la prueba de Bonferroni (p <0.05).
Ejemplos:
Ejemplo 1: títulos de anticuerpos específicos producidos contra ECD-Her1 y DEC-Her2 inducidos por vacuna bivalente Her1+Her2
Se inmunizaron ratones Balb/c por vía subcutánea con una formulación de vacuna bivalente que contenía 100 |ig de ECD-Her1 y 100 |ig de ECD-Her2. Un segundo grupo de ratones se inmunizó con una formulación de vacuna monovalente que contenía 100 |ig de ECD-Her1, y un tercer grupo se inmunizó con una formulación de vacuna monovalente que contenía 100 |ig de ECD-Her2. Las tres formulaciones de vacunas mencionadas contenían 200 |ig de adyuvante VSSP. Las inmunizaciones se realizaron los días 0, 14, 28, 42 y 72, y se extrajo sangre para procesar el suero en los días -2, 21, 56, 87 y 102. Los títulos de anticuerpos específicos contra los e Cd de Her1 y Her2 en el suero se determinaron mediante el método ELISA.
Los ratones inmunizados con la vacuna bivalente Her1+Her2 produjeron anticuerpos de isotipo IgG específicos contra el ECD-Her1 y ECD-Her2. Los títulos de anticuerpos inducidos contra cada uno de estos receptores no difirieron de los inducidos por las respectivas vacunas monovalentes. En el caso de la respuesta de anticuerpos frente a ECD-Her1, tanto los títulos inducidos por la vacuna bivalente Her1+Her2 como la vacuna monovalente alcanzaron valores de 1/10.000. La respuesta frente a ECD-Her2 inducida tanto por la vacuna bivalente como por la monovalente alcanzó valores de títulos de anticuerpos de 1/200.000 (Figura 1).
Este resultado muestra que mezclar los dos receptores en una única formulación de vacuna no afecta la inmunogenicidad de cada uno de ellos individualmente, lo que valida el uso potencial de esta formulación de vacuna.
Ejemplo 2: Reconocimiento de las líneas tumorales Her1+/Her2-, Her1VHer2+ por sueros inducidos por la vacuna bivalente Her1+Her2
Los sueros de ratones inmunizados con la vacuna bivalente Her1+Her2 y las vacunas monovalentes Her1 y Her2, diluidos 1/200 se incubaron con 105 células de diferentes líneas celulares tumorales: MDA-MB468 (ATCC, HTB-132), derivadas de adenocarcinoma de mama y MCF7/Her2, generada a partir de la transfección de la línea celular MCF7 (ATCC HTB-22) con Her2 de longitud completa. Los sueros PI se usaron como controles de especificidad negativos. El Mab nimotuzumab, que reconoce Her1, y el anticuerpo monoclonal Herceptin, que reconoce Her2, se usaron como controles positivos.
Los sueros generados por la vacuna bivalente reconocieron el mismo porcentaje de células MDA-MB468 que los sueros generados por la vacuna monovalente Her1. Adicionalmente, los sueros generados por la vacuna bivalente reconocieron el mismo porcentaje de células MCF7/Her2 que los sueros generados por la vacuna monovalente Her2 según la prueba T3 de Dunnett (p> 0.05) (Figura 2). La intensidad de reconocimiento de estos receptores también fue muy similar (Tabla 1).
Esto demuestra que los anticuerpos inducidos por la formulación bivalente que contiene los receptores Her1 y Her2 truncados no afectan el reconocimiento de los receptores Her1 y Her2 de longitud completa en la membrana de las células tumorales. También muestra que la calidad de este reconocimiento no se ve afectada cuando los anticuerpos contra Her1 y Her2 se generan a partir de una formulación en base a ambos receptores, ya que el reconocimiento fue el mismo que se obtuvo con los sueros de las vacunas monovalentes tanto en número de células reconocidas y la intensidad del reconocimiento.
Tabla 1: Promedio de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células MDAMB468 y MCF7/HER2 reconocidas por los sueros inmunes generados por los tratamientos.
Ejemplo 3: Reconocimiento de la línea tumoral Her1+/Her2+ por sueros inducidos por la vacuna bivalente Her1+Her2
Se incubaron sueros de ratones inmunizados con la vacuna bivalente Her1+Her2 y vacunas monovalentes Her1 y Her2, diluidas 1/300 con la línea de células tumorales H292 (ATCC CRL-1848), derivada de carcinoma de células escamosas de pulmón. Los sueros preinmunes se usaron como controles de especificidad negativos. Se usaron MAb nimotuzumab y MAb Herceptin como controles positivos.
El porcentaje de células H292 reconocidas fue estadísticamente mayor en los sueros generados por la vacuna bivalente, en comparación con el reconocimiento de los sueros generados por las vacunas monovalentes Her1 y Her2, según prueba Dunnett T3 (p <0.05) (Figura 3). Esto demuestra que los anticuerpos policlonales inducidos por la formulación bivalente tienen un umbral más alto de reconocimiento de células tumorales debido a su capacidad para
reconocer simultáneamente ambos receptores, Herí y Her2, en la membrana de las células. Esto sugiere que la vacuna bivalente tiene un mayor potencial con respecto a las vacunas monovalentes, en términos de efecto biológico sobre las células tumorales h 292, determinado por el número de receptores reconocidos. Tal es el caso de la inhibición de la activación de los receptores de la familia Her, que están implicados en la proliferación de tumores.
Ejemplo 4: Inhibición de la activación de los receptores HER1 y HER2 por la vacuna bivalente Her1+Her2
Se incubaron sueros de ratones inmunizados con la vacuna bivalente Her1+Her2 y las vacunas monovalentes Her1 y Her2, diluidas 1/100 con células de la línea celular tumoral H292. Las células se estimularon con 100 ng/mL de EGF durante 10 min y luego se lisaron. El efecto de los sueros inmunes sobre la inhibición de la fosforilación de EGFR se determinó mediante un ensayo de transferencia Western, usando anticuerpos específicos para la detección de EGFR fosforilado y EGFR total. En este ensayo se usó inhibidor de tirosina quinasa AG1478 a 10 |iM como control positivo de la inhibición de la fosforilación, y se usó suero PI como control negativo de especificidad.
Los sueros generados por la vacuna bivalente inhibieron la activación de los receptores Her1 y Her2, medida en términos de fosforilación, en mayor medida que los sueros de las vacunas monovalentes Her1 y Her2. Las películas a partir de la transferencia de Western se sometieron a análisis densitométrico. Los datos del análisis densitométrico arrojaron que la disminución en la fosforilación de Her1 provocada por los sueros inmunes inducidos por la vacuna bivalente Her1+Her2 con respecto al suero PI fue 11.2 veces. Cuando se realizó el mismo análisis a los sueros inducidos por la vacuna monovalente Her1, la disminución de la fosforilación de Her1 fue 1.7 veces. En el caso de los sueros del grupo de la vacuna monovalente Her2, la disminución fue de 2.2 veces. En el caso de Her2, la disminución de la fosforilación de Her2 inducida por sueros de ratones inmunizados con la vacuna bivalente Her1+Her2 con respecto al suero PI fue de 8.7 veces. Cuando se realizó el mismo análisis a los sueros inducidos por la vacuna monovalente Her1, la disminución de la fosforilación de Her2 fue de 1.7 veces y para los sueros del grupo de la vacuna monovalente Her2 la disminución fue de 3.5 veces (Figura 4).
Esto demuestra la superioridad de la vacuna bivalente con respecto a las vacunas monovalentes. La vacuna bivalente no solo podría inhibir directamente la fosforilación de los receptores Her1 o Her2, que forman homodímeros (Her1/Her1 y Her2/Her2) a través de anticuerpos que bloquean la unión del ligando y contra el brazo de dimerización, sino que también podría ser más eficiente. que las vacunas monovalentes en la reducción de la activación de los receptores que forman parte de un heterodímero Her1/Her2.
Ejemplo 5: Efecto antiproliferativo de los sueros inducido por la vacuna bivalente Her1+Her2 en la línea tumoral Her1+/Her2+
Las células H292 se incubaron durante 48 h con sueros de ratones inmunizados con la vacuna bivalente Her1+Her2 y las vacunas monovalentes Her1 y Her2, diluidas 1:20. Pasado este tiempo, se eliminó el sobrenadante del cultivo y se agregó el reactivo MTT a una concentración de 1 mg/mL. Después de 4 horas de incubación, se eliminó el sobrenadante y se agregaron 100 |iL de dimetilsulfóxido para disolver los cristales de formazan; se midió la absorbancia determinando la diferencia de OD restando la OD a 540 al valor de OD a 620 nm con un lector de ELISA. Las células viables se evaluaron determinando la diferencia de absorbancia entre 540 nm y 620 nm. La diferencia de absorbancia obtenida en el suero PI se tomó como porcentaje máximo de viabilidad.
Las células tumorales tratadas con los sueros inducidos por la vacuna bivalente Her1+Her2 tenían menos viabilidad que las células tumorales incubadas con el suero inducido por las vacunas monovalentes, según la prueba estadística T3 de Dunnett (p < 0.05 (Figura 5). Esto demuestra que la administración de la vacuna bivalente indujo un mayor efecto antitumoral en las células, en términos de efectos antiproliferativos, que las vacunas monovalentes que expresan los receptores Her1 y Her2. Esto sugiere su potencial para ser un agente terapéutico eficaz contra los tumores epiteliales que expresan ambos receptores.
Ejemplo 6: Las dosis no equivalentes de ECD-Her1 y ECD-Her2 disminuyen la capacidad de los anticuerpos generados para reconocer H125/Her1+/Her2+
Se inmunizaron ratones Balb/c por vía subcutánea con una formulación de vacuna bivalente que contenía combinaciones no equivalentes de ECD-Her1 y ECD-Her2. El grupo 1 se inmunizó con 100 |ig de ECD-Her1 y 100 |ig de ECDHer2; grupo 2 con 100 |ig de ECD-Her1 y 200 |ig de ECD-Her2; grupo 3 con 100 |ig de ECD-Her1 y 300 |ig de ECDHer2; grupo 4 con 200 |ig de ECD-Her1 y 100 |ig de ECD-Her2; grupo 5 con 300 |ig de ECD-Her1 y 100 |ig de ECDHer2. Todas las formulaciones de vacunas adyuvantes mencionadas contenían 200 |ig de VSSP. Las inmunizaciones se administraron los días 0, 14 y 28 mediante inyecciones subcutáneas y se extrajo sangre para procesar el suero el día 42. Los títulos de anticuerpos específicos contra los ECD de Her1 y Her2 se determinaron usando el método ELISA y la capacidad de los sueros mencionados anteriormente para reconocer la línea celular tumoral H125, que expresa Her1 y Her2, se evaluó mediante FACS (Figura 6).
El porcentaje de células tumorales reconocidas por los sueros inmunes fue del 100 % para todos los grupos evaluados, lo que se explica por la capacidad de las variantes de formulación evaluadas para inducir títulos de anticuerpos contra Her1 y Her2. Sin embargo, la calidad del reconocimiento, medida en términos
de intensidad de fluorescencia media (MFI) fue mayor para el grupo 1, en el que se combinaron dosis equivalentes de ambos receptores (Tabla 2).
Tabla 2: Reconocimiento de la línea celular tumoral H125 por los sueros inmunes inducidos por formulaciones de vacunas bivalentes Her1+Her2 que contienen dosis equivalentes y no equivalentes de cada receptor.
Claims (6)
1. Una composición de vacuna que comprende los ECD de los receptores Herí y Her2, o fragmentos inmunogénicos de los mismos, en la misma proporción y en un intervalo de concentración desde aproximadamente 100 a aproximadamente 800 |ig/dosis, y proteoliposomas de tamaño muy pequeño derivados de proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis y GM3 (VSSP-GM3), para su uso en la inducción de una respuesta inmune contra tumores malignos que expresan los receptores Herí y Her2; en la que la composición es para administración subcutánea.
2. La composición de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en la que dicha composición comprende además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
3. La composición de vacuna para su uso según la reivindicación 2, en la que el adyuvante farmacéuticamente aceptable es Montanide ISA 51.
4. La composición de vacuna para su uso según la reivindicación 2, en la que el adyuvante farmacéuticamente aceptable es Alúmina.
5. La composición de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en la que la composición es para administración subcutánea cada dos semanas para completar un total de 5 dosis y posteriormente mensualmente como dosis de mantenimiento durante al menos un año.
6. La composición de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en la que la respuesta inmune contra tumores malignos que expresan los receptores Her1 y Her2 es una respuesta inmune que inhibe la proliferación de dichos tumores.
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2019
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