ES2892403T3 - Curación de heridas e ingeniería de tejidos - Google Patents

Abstract

Un armazón de cicatrización de heridas compuesto por un armazón de colágeno y glucosaminoglicano coinjertado con una población de células madre, en donde la población de células madre se caracteriza por: a) al menos el 80 % de la población de células madre son células madre ABCB5+; b) la población de células madre son células madre oculares ABCB5+, en donde la población celular está libre de células no oculares o (c) siendo una población de células madre ABCB5+ aisladas de un tejido de un sujeto, en donde las células madre ABCB5+ han sido separadas de otras células en el sujeto usando un anticuerpo específico para ABCB5.

Description

DESCRIPCIÓN

Curación de heridas e ingeniería de tejidos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la curación de heridas y la ingeniería de tejidos, que implican células madre positivas para ABCB5 en armazones de colágeno glucosaminoglicano.

Antecedentes de la invención

La medicina regenerativa implica la reparación, regeneración, mantenimiento y reemplazo de tejidos y órganos utilizando materiales exógenos, tales como armazones. Los armazones se pueden sembrar con células, tales como células primarias o células madre, y varios factores para estimular el crecimiento de los tejidos. Sin embargo, sigue habiendo una serie de retos en el diseño de material apropiado para la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos.

Más de un millón de nuevas heridas crónicas se desarrollan en Estados Unidos cada año con costes de tratamiento estimados que alcanzan los miles de millones de dólares. Las heridas se pueden conceptualizar como defectos en la cubierta protectora de un órgano o sistema de órganos individual. Sin esta barrera fisiológica, el tejido normalmente protegido por la cubierta está sujeto a la pérdida de compartimentación biológica. Cuando el tejido ya no está compartimentado fisiológicamente, está sujeto a pérdida de líquido, invasión por microorganismos, desequilibrios electrolíticos y, en algunos casos, disfunción metabólica. Los líquidos perdidos por tejido no compartimentado incluyen, entre otros: sangre, plasma, linfa, contenido entérico, bilis, líquido cefalorraquídeo, moco. Estas pérdidas de líquido provocan la desecación del tejido subyacente y permiten la invasión de microorganismos, que conduce a una posible infección y, en muchos casos, a pérdida progresiva de tejido. Por ejemplo, la incapacidad de curar una herida cutánea crónica en la extremidad inferior puede llevar a la amputación de una parte o de la totalidad de la extremidad afectada. Existen varias etiologías para tales heridas crónicas en la piel de las extremidades inferiores, incluyendo traumatismo mecánico, quemaduras, radiación, insuficiencia arterial, estasis venosa, infección crónica, neuropatía y enfermedades sistémicas, tales como diabetes. Los métodos actuales para mejorar la cicatrización de heridas enfatizan el drenaje efectivo, prevención de infecciones, reducción de la inflamación y minimización de la pérdida de tejidos y líquidos.

Las heridas cutáneas crónicas plantean problemas de salud importantes para los pacientes con diversas afecciones médicas, tales como diabetes, quemaduras, traumatismo, tal como traumatismo sostenido durante la guerra, lesión de la médula espinal e insuficiencia vascular. Algunos de estos pacientes tienen riesgo de desarrollar heridas crónicas como consecuencia de la inmovilidad y úlceras de decúbito, así como úlceras crónicas que no cicatrizan debido a diabetes o enfermedad vascular periférica. La respuesta predeterminada a las lesiones en la piel humana posnatal es impulsada por la necesidad de un cierre rápido de la herida y está destinada a dar como resultado la formación de una cicatriz. Si bien las cicatrices son suficientes para restaurar la función de barrera cutánea, a menudo alteran otras funciones normales al reemplazar estructuras cutáneas esenciales con tejido conjuntivo. En la vida fetal, un entorno más protegido en el que la piel en desarrollo se baña en líquido amniótico estéril, el tegumento humano es completamente capaz de regenerarse sin cicatrices, es decir, cicatrización regenerativa de heridas. El conocimiento actual de la plasticidad inherente de las células madre adultas sugiere que este fenómeno puede replicarse posnatalmente. El documento de Formigli L et al (2012), Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, vol.7, nr. 2, pp. 125-134 describe la siembra de un armazón de glucosaminoglicano de colágeno con células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea humana (hMSC).

Sumario de la invención

La invención es tal como se define en las reivindicaciones.

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que las células madre que expresan ABCB5 muestran plasticidad de diferenciación y mejoran aún más la cicatrización de heridas y/o la regeneración de tejidos cuando se emplean solas o en el contexto de armazones biodegradables.

En algunos aspectos, la invención es un armazón de cicatrización de heridas compuesto por un armazón de colágeno glucosaminoglicano coinjertado con una población de células madre, donde al menos el 80 % de la población de células madre son células madre ABCB5+.

Un armazón de cicatrización de heridas compuesto por un armazón de colágeno glucosaminoglicano coinjertado con una población de células madre oculares ABCB5+, en el que la población celular está libre de células no oculares se proporciona en otros aspectos de la invención.

Un armazón de cicatrización de heridas compuesto por un armazón de colágeno glucosaminoglicano coinjertado con una población de células madre ABCB5+ aisladas de un tejido de un sujeto, en el que las células madre ABCB5+ se han separado de otras células en el sujeto usando un anticuerpo específico para ABCB5 se proporciona en otros aspectos.

Las células madre ABCB5+ pueden ser células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+. En algunas realizaciones, al menos el 85 % o el 90 % de la población de células madre son células madre ABCB5+.

En algunas realizaciones, el armazón es una matriz porosa de colágeno reticulado y glucosaminoglicano. El colágeno puede ser, por ejemplo, colágeno de tendón bovino. En algunas realizaciones, el glucosaminoglucano se selecciona del grupo que consiste en condroitín-6-sulfato, condroitín-4-sulfato, heparina, sulfato de heparina, sulfato de queratina, dermatán sulfato y combinaciones de los mismos.

El armazón puede incluir una capa semipermeable tal como polisiloxano (silicona). En otras realizaciones, el armazón es un armazón de malla. Opcionalmente, el armazón puede tener una forma para su inserción en un tejido.

En algunas realizaciones, el armazón es una matriz de heridas de dos capas en malla INTEGRA®.

El armazón puede tener un tamaño de poro variable. Por ejemplo, el armazón puede tener un tamaño de poro de aproximadamente 10-500 o aproximadamente 50-350 o aproximadamente 70-200 micrómetros.

El armazón puede incluir al menos una molécula bioactiva eficaz para mejorar la cicatrización de heridas. Por ejemplo, la molécula bioactiva puede ser un miembro seleccionado del grupo que consiste en factores de crecimiento, agentes antiinflamatorios, agentes cicatrizantes de heridas, agentes anticicatrices, agentes antimicrobianos, péptidos de adhesión celular, células moduladoras de la generación de tejidos, ácidos nucleicos, análogos de ácido nucleico, proteínas, péptidos, aminoácidos, cerámicos y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el armazón tiene un tamaño de 5 cm x 5 cm (25 cm2) ( 2 pulgadas x 2 pulgadas), 10 cm x 12,7 cm (125 cm2) (4 pulgadas x 5 pulgadas), 10 cm x 25 cm (250 cm2) (4 pulgadas x 10 pulgadas) o 20 cm x 25 cm (500 cm2) (8 x 10 pulgadas).

En otros aspectos de la invención se proporciona un armazón de cicatrización de heridas según la invención para su uso en la estimulación de la cicatrización de heridas, en el que una herida se pone en contacto con el armazón de cicatrización de heridas con el fin de estimular la cicatrización. En algunas realizaciones, el contacto comprende aplicar la composición a un sitio de hemorragia para controlar la hemorragia.

En algunas realizaciones, la herida es una quemadura o una úlcera diabética.

En algunas realizaciones, se usa una terapia de presión negativa para heridas con el armazón.

En otras realizaciones, el método puede implicar asegurar posteriormente la herida con una cubierta médicamente aceptable para tratar la herida.

La herida puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: herida de espesor parcial y total, úlceras de decúbito, úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlceras vasculares crónicas, heridas tunelizadas/socavadas, heridas quirúrgicas, heridas por traumatismos y heridas supurantes.

También se desvela un método para la ingeniería de tejidos, sembrando un armazón de glucosaminoglicano de colágeno con células madre ABCB5+ y manteniendo el armazón en condiciones tales que se forme tejido. En algunos aspectos de la divulgación, el método de ingeniería de tejidos es un método para la regeneración de tejidos y el armazón se mantiene en condiciones tales que el tejido se regenera. En otros aspectos más de la divulgación, el método de regeneración de tejidos es un método para tratar la piel envejecida.

En otros aspectos de la divulgación se proporciona un método para la ingeniería de tejidos sembrando un armazón de tejido biológico con células madre ABCB5+ y manteniendo el armazón en condiciones tales que se forme tejido.

El armazón de tejido biológico puede ser, por ejemplo, un aloinjerto o autoinjerto, un tejido xenogénico y/o tejido descelularizado.

Otras ventajas y características novedosas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias realizaciones no limitantes de la invención cuando se consideran junto con las figuras adjuntas.

La presente invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de componentes establecidos en la descripción siguiente o ilustrados en los dibujos. La invención tiene capacidad para otras realizaciones y para ponerse en práctica o realizarse de diversos modos. Asimismo, la fraseología y la terminología utilizadas en el presente documento son para fines descriptivos. El uso de "que incluye/n", "que comprende/n", o "que tiene/n", "que contiene/n" "que implica/n", y variaciones de los mismos en el presente documento, pretende abarcar los elementos enumerados a continuación en el presente documento y equivalentes de los mismos, así como elementos adicionales.

Breve descripción de los dibujos

No se pretende que los dibujos adjuntos estén dibujados a escala. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que se ilustra en diversas figuras se representa por el mismo número. Por motivos de claridad, no todos los componentes pueden marcarse en cada dibujo. En los dibujos:

Figura 1. Potencial de diferenciación multipotencial de células ABCB5+. Tinción de inmunofluorescencia (tres filas superiores) de células cutáneas humanas ABCB5+ (panel izquierdo) o ABCB5-(panel derecho) para la expresión de espectrina (ensayo de miogénesis), CD31 (ensayo de angiogénesis) y TUJ1 (ensayo de neurogénesis), antes y después de la diferenciación. Los núcleos se visualizan con DAPI. Dos filas inferiores: Tinción con rojo aceite (ensayo de adipogénesis) y rojo alizarina (ensayo de osteogénesis) de ABCB5+ (panel izquierdo) o ABCB5-(panel derecho) de células de piel humana antes y después de la diferenciación. Análisis agregado de la intensidad de píxeles para cada marcador (en ensayos de miogénesis, angiogénesis y neurogénesis) o porcentaje de células teñidas positivamente (en ensayos de adipogénesis y osteogénesis), en muestras por duplicado (n = 3) se muestran en los diagramas de barras de la derecha. *, P < 0,05.

Figura 2. Esquema del locus del gen ABCB5 murino y topología de proteínas. El gen Abcb5 murino contiene 28 exones y abarca 102 kb de ADN genómico en el locus 12qF2. Codifica una proteína 1255 AA con 11 hélices transmembrana y 5 bucles extracelulares. El exón 23 codifica AA 911-957, que forma un bucle extracelular que contiene el epítopo de unión del anticuerpo anti-ABCB53C2-1D12.

Figura 3. Análisis de ratones Abcb5 SV (paneles superiores) y Abcb5 KO (paneles inferiores). La tinción H&E muestra adelgazamiento de la dermis con grasa subcutánea reducida y musculatura lisa desorganizada en animales KO (mismo aumento para muestras SV y KO). La IHQ y la citometría de flujo muestran una pérdida completa de la expresión de la proteína Abcb5 en ratones deficientes en Abcb5null/deficientes. Los estudios de salida de rodamina-123 identifican una población de células retenedoras de colorante de novo en ratones deficientes en Abcb5/deficientes (puerta R1, panel inferior derecho), coherente con la pérdida de una función característica de Abcb5, salida de rodamina-123 1.

Figura 4A-4C. Regulación de la inactividad de las células madre por ABCB5. Análisis de citometría de flujo de dos colores representativos de células cutáneas murinas de ratones Abcb5 SV (B) y Abcb5 KO (C) marcados con BrdU in vivo y de controles Abcb5 SV sin marcar (A). Las células se tiñen conjuntamente con anticuerpo anti-BrdU FITC y 7-AAD. Las células positivas para Brdu en la fase G0 del ciclo celular se muestran en la puerta R1. Las células negativas para BrdU en las fases S/G2/M del ciclo celular se representan en la puerta R2.

Figura 5A-5B. Expresión diferencial de genes implicados en la regulación del ciclo celular entre ratones Abcb5 KO Ratones Abcb5 SV. (A) Una lista de genes regulados por disminución en ratones Abcb5 KO frente a Abcb5 SV como se determinó en el análisis PCR en tiempo real. (B) Los genes representados en este caso están regulados por disminución en ratones Abcb5 KO. Las líneas con flechas muestran interacciones génicas conocidas. Las relaciones génicas con vías canónicas, tales como señalización de p53, regulación del punto de control G1/S, ciclinas y regulación del ciclo celular, y vías de señalización del calcio, se indican con líneas sin flechas. Las relaciones e interacciones génicas se basan en el análisis Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity, CA).

Figura 6A-6C. Análisis comparativos de cicatrización de heridas de ratones Abcb5 KO y Abcb5 SV. (A ) Fotografías digitales representativas del día 0 y del día 7 de heridas cutáneas de espesor completo generadas en ratones Abcb5 SV (panel superior) y Abcb5 KO (panel inferior). (B) Tinción H&E representativa de las secciones transversales de la herida central, la piel circundante y el tejido muscular subyacente recogido en el día experimental 7 de ratones Abcb5 SV (panel superior) y Abcb5 KO (panel inferior). (C) Análisis cuantitativos del cierre de la herida (panel superior) y el espesor del estroma inflamatorio (panel inferior) de heridas Abcb5 KO y Abcb5 SV.

Figura 7A-7C. Análisis comparativos de la expresión de CD31 en ratones Abcb5 KO y Abcb5 SV. (A) y (B), Tinción representativa de H&E y CD31 de secciones transversales de la herida central, la piel circundante y el tejido muscular subyacente recogido en el día experimental 7 de ratones Abcb5 SV (panel superior) y Abcb5 KO (panel inferior). (C) Análisis cuantitativos del espesor de la capa vascular CD31+ (panel superior) y el espesor de la capa avascular CD31-(panel inferior) en heridas Abcb5 KO y Abcb5 SV.

Figura 8. Análisis comparativos de la formación de vasos en ratones Abcb5 KO y Abcb5 SV. Tinción CD31 representativa de capas vasculares de cortes transversales de heridas centrales de tejidos recolectados el día 7 del experimento de ratones Abcb5 SV (panel izquierdo) y Abcb5 KO (panel derecho).

Figura 9A-9B. Expresión diferencial de genes implicados en la angiogénesis en heridas de ratón Abcb5 KO frente a SV. (A) Niveles de expresión génica determinados por análisis de PCR en tiempo real. (B) Se muestran y marcan citocinas proangiogénicas reguladas por disminución en heridas de Abcb5 KO. Las flechas indican efecto proangiogénico. Un receptor transmembrana antiangiogénico, Bail, que se sobreexpresa en heridas de Abcb5 KO. La barra en la parte inferior indica efecto antiangiogénico. Las relaciones génicas se basan en el análisis Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity, CA).

Figura 10A-10D. Efecto de las células ABCB5+ sobre la cicatrización de heridas en ratones NSG. (A) Análisis cuantitativos del espesor del estroma inflamatorio de las heridas infligidas en cuatro grupos experimentales. (B) Tinción H&E representativa de secciones transversales de heridas recolectadas el día 14 del experimento. (C) Detección de células humanas inyectadas en matrices INTEGRA® por p2M específico de seres humanos 14 días después del trasplante. Las flechas negras apuntan a grupos de células humanas p2M+ y células humanas p2M+ individuales. (D) Análisis de RT-PCR de secciones de heridas murinas para la expresión de GAPDH específica de ser humano, p2-microglobulina y p-actina murinas utilizadas como control de carga.

Figura 11A-11C. Modelo de xenoinjerto humano a ratón que muestra un injerto de piel humana establecido en el dorso del ratón 8 semanas después del injerto (A). En (B) se muestra la histopatología correspondiente que demuestra la anastomosis cutánea humano-murina. La herida del xenoinjerto humano (C) permite la detección inmunohistoquímica de células dérmicas específicas y elementos de la matriz extracelular en los puntos de tiempo 0, 2, 4 y 7 días después de la herida (de arriba a abajo).

Figura 12. Papel de ABCB5 en la cicatrización de heridas regenerativas humanas. Se pueden determinar estudios comparativos que examinen los perfiles inmunohistoquímicos de las respuestas de cicatrización como consecuencia de la formación de cicatrices y la regeneración inducida por armazón INTEGRA® (cicatriz frente a armazón) (obsérvese la realineación llamativa de los miofibroblastos que expresan actina y la expresión notablemente mejorada de las células dérmicas ABCB5+ en la herida que lleva el armazón).

Descripción detallada

La invención es tal como se define en las reivindicaciones.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los armazones de colágeno glucosaminoglicano sembrados con células madre positivas ABCB5 demuestran propiedades mejoradas de cicatrización de heridas y de ingeniería de tejidos. Se ha demostrado que las construcciones de la invención poseen una actividad regenerativa única que conduce a la síntesis de tejidos. La síntesis mejorada de tejidos es útil en la reparación y generación de tejidos y en la reparación y cicatrización de heridas.

Las células útiles según la invención son células madre positivas para ABCB5. ABCB5 es un marcador nuevo e importante para el aislamiento de poblaciones de células madre multipotenciales a partir de tejido humano normal. "Células madre ABCB5(+)", como se utiliza en el presente documento, se refiere a células que tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en células maduras de múltiples linajes de células adultas. Estas células se caracterizan por la expresión de ABCB5 en la superficie celular. En algunas realizaciones de la invención, Las células madre ABCB5(+) son células madre dérmicas u oculares.

"Células madre mesenquimatosas dérmicas positivas para ABCB5", como se usa en el presente documento, se refiere a células de la piel que tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en células maduras de múltiples linajes de células adultas tales como hueso, grasa y cartílago. Estas células se caracterizan por la expresión de ABCB5 en la superficie celular. En cultivo, las células madre mesenquimatosas pueden ser guiadas para diferenciarse en hueso, grasa, cartílago o células musculares utilizando medios específicos. (Hirschi KK y Goodell MA. Gene Ther. 2002; 9: 648-652. Pittenger MF, et al., Science. 1999; 284: 143-147. Schwartz RE, et al., J Clin Invest. 2002; 109: 1291-1302. Hirschi K y Goodell M. Differentiation. 2001; 68: 186-192.)

Las células madre mesenquimatosas dérmicas positivas para ABCB5 se pueden obtener de la piel. La piel puede obtenerse de cualquier sujeto que tenga piel, pero en algunas realizaciones es, preferentemente, piel humana. La piel puede obtenerse de un sujeto de cualquier edad, pero en algunas realizaciones es, preferentemente, piel de adulto, en lugar de piel de un adolescente o un bebé.

En otras realizaciones de la invención, las células madre ABCB5(+) son células madre de la retina. Las células madre ABCB5(+) pueden obtenerse del (por ejemplo, aislarse de o derivar de) epitelio del limbo basal del ojo o del epitelio pigmentario de la retina (RPE). En algunas realizaciones, las células madre ABCB5(+) se obtienen del ojo humano. Otros tipos de células madre ABCB5(+) tal como, por ejemplo, las obtenidas de la córnea central pueden usarse en diversos aspectos y realizaciones de la invención.

Las células madre ABCB5(+) pueden aislarse. Una "célula madre ABCB5(+) aislada", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula que se ha extraído de un organismo en el que se encontraba de manera original, o un descendiente de dicha célula. Una célula aislada también se refiere a una célula que se coloca en condiciones distintas del entorno natural. Posteriormente, dicha célula puede introducirse en un segundo organismo o reintroducirse en el organismo del que se aisló (o la célula o población de células de la que descendió). Dicha una célula, una vez manipulada de acuerdo con los métodos de la invención todavía se considera que es una célula aislada. El término "aislada" no excluye el uso posterior de la célula a partir de entonces en combinaciones o mezclas con otras células o en un entorno in vivo.

Las células madre ABCB5(+) pueden obtenerse de un sujeto aislando una muestra de tejido, incluso en las células de la piel, tales como células dérmicas y células oculares del epitelio del limbo basal o RPE y purificando, después, las células madre ABCB5(+). Será evidente para los expertos en la materia que una muestra puede enriquecerse en células madre ABCB5+ de varias formas. Por ejemplo, las células madre se pueden seleccionar para usar anticuerpos u otras moléculas de unión que se unen a las moléculas de la superficie celular ABCB5 en las células. Las células madre pueden obtenerse directamente de un donante o recuperarse del almacenamiento con crioconservadores. Las células madre pueden, por ejemplo, aislarse utilizando anticuerpos contra ABCB5 y mantenerse en cultivo utilizando metodología convencional o congelarse, por ejemplo, en nitrógeno líquido, para su uso posterior.

Específicamente, se pueden aislar poblaciones de células dérmicas ABCB5+ puras con fenotipo molecular de células madre mesenquimatosas a partir de muestras quirúrgicas de piel humana sana utilizando, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (AcMo) contra ABCB5 establecido, sensible y específico. Las células madre dérmicas ABCB5+ aisladas tienen una capacidad de diferenciación multipotencial, de modo que se diferencian en linajes celulares de las tres capas germinales, es decir, ectodermo, mesodermo y endodermo.

La presente invención contempla cualquier método adecuado para emplear moléculas de unión a ABCB5 tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, fragmentos F(ab')2, Fab, Fd, Fv o Fv monocatenarios para separar las células madre ABCB5(+) de una población mixta de células. En consecuencia, los métodos incluyen un método para producir una población de células madre ABCB5(+) que comprende las etapas de proporcionar una suspensión celular de células; poner en contacto la suspensión celular con un anticuerpo monoclonal, o una combinación de anticuerpos monoclonales, que reconoce o reconocen un epítopo, incluyendo ABCB5, en las células ABCB5(+); y separar y recuperar de la suspensión celular las células unidas por los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden unirse a una fase sólida y utilizarse para capturar células madreABCB5+. Las células unidas se pueden separar después de la fase sólida mediante métodos conocidos dependiendo de la naturaleza del anticuerpo y de la fase sólida.

"Anticuerpo monoclonal", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una única población clonal de inmunoglobulinas que se unen al mismo epítopo de un antígeno. Los sistemas basados en monoclonales apropiados para preparar poblaciones de células de la invención incluyen columnas de perlas magnéticas/partículas paramagnéticas que utilizan anticuerpos para la selección positiva o negativa; separación basada en afinidad por biotina o estreptavidina; y clasificación por citometría de flujo de alta velocidad de LSC teñidas con inmunofluorescencia mezcladas en una suspensión de otras células. Por consiguiente, los métodos de la presente invención incluyen el aislamiento de una población de células y la potenciación usando anticuerpos monoclonales producidos contra el antígeno de superficie ABCB5 (por ejemplo, anticuerpos monoclonales que se unen selectivamente a ABCB5). En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo disponibles en el mercado que se unen de manera selectiva a ABCB5 pueden usarse en los métodos divulgados en el presente documento. Se considera que dichos anticuerpos se unen de manera selectiva a ABCB5 si se unen o son capaces de unirse a ABCB5 con una afinidad mayor que la afinidad con la que los anticuerpos monoclonales pueden unirse a otros antígenos (es decir, antígenos diferentes a ABCB5). Tal unión puede medirse o determinarse mediante ensayos estándar de interacción proteína-proteína (por ejemplo, ensayos de anticuerpo-antígeno o ligando-receptor) tales como, por ejemplo, ensayos competitivos, ensayos de saturación o inmunoensayos convencionales que incluyen, sin limitación, enzimoinmunoanálisis de adsorción, radioinmunoensayos y ensayos de unión con radioinmunofiltro.

Las células madre ABCB5(+) se pueden preparar como preparaciones sustancialmente puras. La expresión "sustancialmente pura", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una preparación que está sustancialmente libre de células diferentes a las células madre ABCB5(+). Por ejemplo, una preparación sustancialmente pura de células madre ABCB5(+) puede constituir una preparación en la que al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % del total de células presentes en una preparación son células madre ABCB5(+).

Las composiciones de la invención comprenden un sustrato tal como, por ejemplo, un material biocompatible que favorezca la cicatrización de heridas, incluyendo armazones biodegradables. Se pueden añadir células madre ABCB5(+) al sustrato o armazón para formar, por ejemplo, tejido o injertos de tejido para trasplante. El armazón es una red muy porosa compuesta por colágeno y glucosaminoglicano, es decir, una matriz o armazón de colágeno glucosaminoglicano. Los ejemplos de armazones de colágeno glucosaminoglucano incluyen los enumerados en las patentes de Estados Unidos números 4.060.081,4.280.954 y 4.505.266. Otros materiales útiles en los armazones de colágeno glucosaminoglicano incluyen, pero sin limitaciones, condroitín 6-sulfato, condroitín-4-sulfato, heparina, sulfato de heparina, queratán sulfato, dermatán sulfato, quitina y quitosano. Los armazones de colágeno glucosaminoglicano sirven como estructura de soporte o armazón a la que los vasos sanguíneos y las células de tejido circundantes migran desde dentro de una cavidad de tejido, un proceso denominado "infiltración". La infiltración es responsable de crear un nuevo tejido, que reemplaza el armazón a medida que se biodegrada.

En algunas realizaciones, el armazón es INTEGRA®. INTEGRA® es un sustituto de la piel dérmica acelular aprobado por la FDA compuesto por matriz extracelular (colágeno y GAG). Se ha utilizado en el tratamiento de defectos tisulares anchos o heridas que no cicatrizan, como úlceras venosas en las piernas.

"Composiciones", en el presente documento, puede hacer referencia a preparaciones de células aisladas o armazones, incluyendo armazones de tejido y armazones artificiales. Las composiciones de la invención están enriquecidas con células madre ABCB5(+) aisladas. Se considera que una composición está enriquecida con células madre ABCB5(+) aisladas si las células madre ABCB5(+) son el subtipo celular predominante presente en la preparación. Por ejemplo, una composición enriquecida con células madre ABCB5(+) es una composición en la que al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de las células de la composición son células madre ABCB5(+). En algunas realizaciones, una composición enriquecida con células madre ABCB5(+) aisladas es una en la que menos del 50 %, menos del 45 %, menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 % de las células de la composición son células ABCB5(-). En algunas realizaciones, las células de una composición son solamente células dérmicas. Por ejemplo, el armazón se siembra con células de modo que todas las células sean células dérmicas ABCB5+. Es decir, en algunas realizaciones, una composición puede no contener células no dérmicas. En algunas realizaciones, las células no incluyen queratinocitos y/o células epidérmicas. En algunas realizaciones, las células de una composición son solamente células oculares. Es decir, en algunas realizaciones, una composición no puede contener células no oculares. En algunas realizaciones, una composición puede no contener células oculares ABCB5(-).

Los armazones de la presente invención se pueden formatear en diversas formas, tal como una sola hoja, o como una hoja laminada que contiene múltiples capas u hojas de colágeno. En determinadas realizaciones, los armazones comprenden 2-15 hojas. Estas hojas se pueden mantener unidas mediante puntos o suturas.

En una realización particular, el polímero comprende además una molécula bioactiva, por ejemplo, una molécula pequeña o un péptido además de las células madre. La molécula bioactiva puede incorporarse de forma no covalente al polímero, por ejemplo, como una suspensión, encapsulada como partículas, micropartículas o coloides, o como una mezcla de los mismos. La molécula bioactiva también se puede incorporar covalentemente al polímero, utilizando cualquier química adecuada para la unión de la molécula bioactiva al polímero. La molécula bioactiva puede ser cualquier molécula terapéuticamente deseable, tal como un factor de crecimiento, un antimicrobiano, un analgésico, un hemostático, un agente proangiogénico o un agente antiangiogénico. En realizaciones ilustrativas, el polímero comprende uno o más de FGF2, NGF, doxiciclina, amoxicilina y poli-L-lisina.

En otra realización particular, los armazones tienen una anchura de al menos 10 cm. Por ejemplo, el armazón puede tener una anchura de al menos 10 cm y una longitud de al menos 10 cm. En consecuencia, ciertos armazones pueden tener una superficie superior a 100 cm2, por ejemplo, 4002. Los armazones de la invención pueden tener una resistencia biaxial de al menos 80 N o más.

Los armazones de tejido de la invención se pueden usar en múltiples aplicaciones, que incluyen, entre otras, cubrir un déficit de tejido o una herida, reforzar tejidos, tales como tejidos blandos y generación o regeneración de órganos/tejidos. En consecuencia, en otro aspecto, la invención presenta un método para inducir la reparación de un tejido dañado, que comprende poner en contacto el tejido dañado con un armazón de la invención. La invención presenta además un método para estimular la regeneración de tejidos blandos, que comprende poner en contacto el tejido blando con un armazón de la invención. Cuando un armazón se coloca en contacto con un tejido, el armazón puede aumentar la proliferación de células ubicadas cerca del armazón. De manera adicional, el armazón puede estimular la vascularización dentro de un tejido al que se adhiere. En consecuencia, en otro aspecto, la invención proporciona un método para estimular la proliferación de células en un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con un armazón de modo que se estimule la proliferación celular. La invención proporciona además un método para inducir la vascularización de un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con un armazón de manera que se produzca vascularización dentro del tejido.

El armazón puede tener la forma necesaria para rellenar un defecto tisular. En la mayoría de los casos, esto se puede lograr recortando las fibras de polímero con unas tijeras o un cuchillo; como alternativa, el armazón se puede moldear a partir de una solución de polímero formada por calentamiento o disolución en un disolvente volátil.

Las células madre mesenquimatosas se siembran en el armazón mediante la aplicación de una suspensión celular al armazón. Esto se puede lograr empapando el armazón en un recipiente de cultivo celular o mediante inyección u otra aplicación directa de las células al armazón.

El armazón sembrado con células se implanta en el sitio del defecto utilizando técnicas quirúrgicas estándar. El armazón se puede sembrar y cultivar in vitro antes de la implantación, sembrarse e implantarse inmediatamente, o implantarse y luego sembrarse con células. En una realización, las células se siembran sobre y dentro del armazón y se cultivan in vitro durante aproximadamente dieciséis horas y dos semanas, aunque puede ser más tiempo. La densidad celular en el momento de la siembra o la implantación variará según las circunstancias. Por ejemplo, la densidad celular puede ser de aproximadamente 25.000 células/mm3. El experto en la materia conocerá la densidad celular apropiada.

Como se usa en el presente documento, un sujeto puede ser un mamífero tal como, por ejemplo, un ser humano, primate no humano, vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato o roedor. Las células madre ABCB5(+) humanas y los sujetos humanos son realizaciones particularmente importantes.

En algunas realizaciones, las células madre ABCB5(+) aisladas (por ejemplo, como una composición en forma de una preparación o injerto de células madre ABCB5(+) liberada en un injerto implantado) se pueden administrar a un sujeto más de una vez. Por consiguiente, en algunas realizaciones, a un sujeto se le pueden administrar múltiples dosis o injertos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de células madre ABCB5(+) aisladas en el transcurso de varias semanas, meses o años. En algunas realizaciones, las células madre se administran nuevamente 3 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 18 meses, 21 meses o 24 meses después de la primera aplicación. El número de aplicaciones y la frecuencia de aplicación pueden depender, por ejemplo, del grado de regeneración celular logrado después de la primera administración/trasplante de células madre. Un profesional médico (por ejemplo, cirujano o médico) puede determinar el número y la frecuencia de las aplicaciones de células madre.

Las composiciones de la invención (armazón sembrado con células madre ABCXB5+) son útiles en la cicatrización de heridas. La mayoría de las heridas en la piel y otros sistemas de órganos se caracterizan por una pérdida de células y matriz de tejido conjuntivo de la capa exterior protectora, así como de las capas y tejidos subyacentes. En el caso de heridas en la piel, la epidermis es la capa externa que se pierde. La epidermis recubre la dermis, así como estructuras más profundas tales como la grasa, el músculo y el hueso. El cierre de heridas grandes en la piel y otros sistemas de órganos generalmente requiere la producción de miles de millones de células, nutrición a través de una red vascular y fuerza mecánica de proteínas y glucosaminoglicanos presentes en una matriz extracelular (MEC) naciente.

El término "herida", para los fines del presente documento, se refiere en términos generales a una lesión en un órgano o sistema de órganos. En el caso de la piel, la lesión puede ser en la epidermis, la dermis y el tejido subcutáneo. Las heridas en la piel pueden clasificarse en uno de cuatro grados dependiendo de la profundidad de la herida: i) Grado I: heridas limitadas al epitelio; ii) Grado II: heridas que se extienden hacia la dermis; iii) Grado III: heridas que se extienden hacia el tejido subcutáneo; y iv) Grado IV (o heridas de espesor completo): heridas en las que los huesos están expuestos (por ejemplo, un punto de presión ósea como el trocánter mayor o el sacro). La expresión "herida de espesor parcial" se refiere a heridas que abarcan los Grados I-III; ejemplos de heridas de espesor parcial incluyen heridas por quemaduras, úlceras de decúbito, úlceras por estasis venosa y úlceras diabéticas. La expresión "herida profunda" incluye heridas tanto de grado III como de grado IV. Los métodos de la invención son útiles para tratar todos los grados de heridas, incluyendo heridas crónicas y agudas. La expresión "herida crónica" se refiere a una herida que no ha sanado en 30 días.

La expresión "estimular la cicatrización de heridas", para los fines del presente documento, se refiere a permitir la reconstitución de la barrera fisiológica normal de un órgano o sistema de órganos. En el caso de heridas en la piel, estimular la cicatrización de heridas puede incluir la inducción de la formación de tejido de granulación y/o la inducción de la contracción de la herida y/o la inducción de revascularización y/o la inducción de epitelización (es decir, la generación de nuevas células en el epitelio). En algunas realizaciones, las células ABCB5+ pueden funcionar al menos en parte por la secreción de mediadores, tales como, por ejemplo, VEGF.

Los tipos de heridas que se tratarán mediante los métodos de la invención incluyen varios tipos de heridas, que incluyen, pero sin limitaciones: heridas quirúrgicas; heridas traumáticas; heridas por lesiones por radiación; heridas por necrólisis epidérmica tóxica; heridas infecciosas; heridas neoplásicas; heridas de espesor completo; heridas de espesor parcial; y heridas por quemaduras, así como heridas derivadas de varios tipos de úlceras, tales como úlceras cutáneas, úlceras corneales, úlceras obstructivas arteriales, úlceras de decúbito inducidas por presión y úlceras diabéticas, úlceras por quemaduras, úlceras por lesiones, úlceras por radiación, úlceras inducidas por fármacos, úlceras postoperatorias, úlceras inflamatorias, úlceras del tracto gastrointestinal, úlceras simples y otros tipos de úlceras angiopáticas y úlceras crónicas (intratables).

Los métodos de diversas realizaciones de la invención pueden ser particularmente útiles para tratar heridas complejas o heridas difíciles de curar. Muchos factores pueden afectar negativamente al proceso de cicatrización de heridas, incluyendo infección, tejido irradiado, enfermedad sistémica, medicaciones, la edad del paciente, la salud del paciente y el estado nutricional del sujeto. De manera adicional, cualquier proceso que impida la circulación sanguínea periférica, tal como arteriosclerosis, presión prolongada, enfermedad de las venas varicosas y estasis venosa, puede afectar negativamente al suministro de oxígeno, nutrientes, señales químicas y tipos de células apropiados para mediar en la curación en un sujeto lesionado, perjudicará a la cicatrización de heridas. Los factores que inhiben la cicatrización de heridas incluyen la desecación de la herida, medicación, tal como quimioterapia o esteroides, y mala salud y/o nutrición del paciente. Ciertas lesiones de espesor parcial y completo, tales como quemaduras, injertos de piel y varios tipos de úlceras, resisten la reparación y producen dolor e incomodidad significativos para el sujeto.

El estado físico general del paciente también es importante para la cicatrización de heridas. A medida que aumenta la edad, la capacidad de reparar el tejido lesionado disminuye a medida que la piel se vuelve más delgada y la cantidad de fibroblastos y la cantidad total de colágeno de la piel disminuyen. Estados patológicos tales como alcoholismo, anemia, diabetes, desnutrición, shock y uremia conducen a un suministro deficiente de oxígeno y nutrientes al sitio de la herida, inhibiendo así el proceso de cicatrización. Asimismo, las enfermedades que conducen a monocitopenia pueden afectar significativamente a la cicatrización de heridas.

Los medicamentos que se utilizan para tratar los trastornos pueden alterar la cicatrización de las heridas. La quimioterapia, utilizada para eliminar las células en división en pacientes con cáncer, también suprime la capacidad de dicho paciente para curar heridas, que también depende del crecimiento de nuevas células. Los esteroides afectan de forma negativa a las tres fases de la reparación de heridas, inhibiendo la respuesta inflamatoria inicial, ralentizando la producción de nuevo epitelio y tejido vascular, y debilitando la matriz de colágeno en el tejido cicatricial.

La infección bacteriana de la herida es una causa local común de cicatrización prolongada de heridas. La piel humana suele estar colonizada por varios microorganismos, incluyendo Candida albicans, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus y algunas cepas de Streptococcus. Por consiguiente, cualquier herida que exponga los tejidos subyacentes al medio ambiente se infecta con al menos flora microbiana residente. Las heridas bien cuidadas y en tejido muy vascularizado resisten la infección, mientras que las que están en tejido isquémico son mucho más susceptibles a la infección.

En algunas realizaciones, el sujeto puede tener una herida en la piel. En otras realizaciones, el sujeto puede tener una afección ocular, tal como una herida ocular (por ejemplo, células oculares muertas, dañadas o infectadas) en, por ejemplo, el epitelio corneal. Por consiguiente, el epitelio corneal puede estar herido en un sujeto que tiene una afección ocular de acuerdo con la invención.

En algunas realizaciones, el armazón de la invención puede combinarse con un dispositivo para ejercer presión sobre una herida. Las células dentro de la herida pueden someterse a una tensión controlada utilizando dispositivos que inducen mecánicamente tensión o compresión de manera constante o dependiente del tiempo, según sea necesario. Aplicar fuerzas localizadas controladas en la superficie de la herida se puede usar un dispositivo que tenga varios microcanales conectados de manera fluida a microestructuras, tales como microcámaras por ejemplo, dentro de una matriz que se puede colocar sobre la superficie de una herida. La presión de vacío (o presión positiva) aplicada a cada microcámara se controla a través de los microcanales. La expresión "presión de vacío", para los fines del presente documento, se refiere a una presión en una cámara o material de interés que es menor en magnitud que la de una cámara, material, tejido o atmósfera de referencia. La expresión "presión positiva", para los fines del presente documento, se refiere a una presión en una cámara o material de interés que es mayor en magnitud que la de una cámara, material, tejido o atmósfera de referencia. El término "presión", para los fines del presente documento, pretende abarcar tanto la presión de vacío como la presión positiva. El armazón de la invención se puede aplicar a la herida antes, después o de forma intermitente con un dispositivo para aplicar presión.

La cicatrización de heridas implica la formación de coágulos de fibrina, reclutamiento de células inflamatorias, reepitelización y formación y remodelación de la matriz. Inmediatamente después de una lesión tisular, la rotura de los vasos sanguíneos conduce a la extravasación de sangre y la agregación plaquetaria y la coagulación de la sangre concomitantes, lo que da como resultado la formación de coágulos de fibrina. Las plaquetas activadas atrapadas dentro del coágulo de fibrina se desgranulan y liberan diversas citocinas y hormonas de crecimiento. Estas citocinas y hormonas de crecimiento ayudan a reclutar células inflamatorias en el sitio de la lesión, para estimular la angiogénesis e iniciar los movimientos tisulares asociados con la reepitelización y la contracción del tejido conjuntivo.

Los neutrófilos y los monocitos se reclutan en el sitio de la lesión mediante una serie de señales quimiotácticas que incluyen los factores de crecimiento y las citocinas liberadas por las plaquetas desgranulantes, péptidos de formil metionilo escindidos de proteínas bacterianas y los subproductos de la proteólisis de fibrina y otras proteínas de la matriz. La infiltración de neutrófilos cesa después de unos días, pero los macrófagos continúan acumulándose mediante el reclutamiento continuo de monocitos en el sitio de la herida. Los macrófagos activados liberan factores de crecimiento y citocinas, amplificando así las señales anteriores de las plaquetas desgranulantes. Se pueden aplicar factores exógenos a la herida para ayudar en estos procesos.

Por consiguiente, las realizaciones de la invención también incluyen métodos que implican la inclusión de factores solubles con células ABCB5+. Después de la colocación del dispositivo en la herida, los factores solubles agregados al dispositivo (por ejemplo, factores de crecimiento como el factor de crecimiento epidérmico, citocinas, PGDF, factor de crecimiento de tipo insulina, TGF-beta, citocina factor de crecimiento de queratinocitos, TNF, quimiocinas, péptidos quimiotácticos, inhibidores tisulares de metaloproteinasas, etc.) pasan al tejido.

Se ha observado que varios factores de crecimiento recombinantes pueden acelerar al proceso de cicatrización de heridas, tanto en heridas tanto agudas como crónicas, en modelos animales. Estos factores derivados recombinantes incluyen el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y los factores de crecimiento transformadores a y p (TGF-a y TGF-p). De manera adicional, otros factores de crecimiento recombinantes, incluidos insulina, factores de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I e IGF-II, respectivamente), interferones (IFN), interleucinas (IL), KGF (factor de crecimiento de queratinocitos), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF) y factor de células madre (SCF), pueden estimular la activación, proliferación y/o estimulación de tipos de células implicadas en el proceso de cicatrización de heridas.

Los factores solubles pueden ser proteínas o pueden expresarse en células. Proteína, péptido o polipéptido se refiere a un polímero de aminoácidos y estos términos se usan de forma indistinta. El polímero puede incluir aminoácidos naturales o no naturales. La proteína o polipéptido se puede producir in vitro o in vivo de forma natural, recombinante, sintética o por otros medios. La proteína o polipéptido puede tener modificaciones postraduccionales o puede haber sido modificado químicamente para incluir fosforilación, glicosilación, famesilación, acetilación, metilación, oxidación de tioles, etc.

Otro uso de las composiciones de la invención es la regeneración de tejidos. La cicatrización de heridas se puede lograr mediante la reparación de tejidos o la regeneración de tejidos. En comparación con la reparación, que generalmente da como resultado la formación de una cicatriz, la regeneración de tejidos proporciona una restauración morfológica y funcional completa de las estructuras normales. La regeneración espontánea de tejido no ocurre en la vida posnatal; sin embargo, se puede ayudar al menos parcialmente de matrices biológicas exógenas, tales como los armazones, clínicamente conocidos como INTEGRA® (Integra LifeSciences, Plainsboro, N. J.), que han sido aprobados por la Food and Drug Administration de Estados Unidos para su uso en pacientes con quemaduras masivas y para el tratamiento de defectos reconstructivos y heridas crónicas. La piel regenerada es mecánicamente competente, está totalmente vascularizada y sensible al tacto y al calor o al frío6, pero carece de apéndices cutáneos cruciales, por ejemplo, folículos pilosos y glándulas sudoríparas5.

El trasplante de injertos que contienen células madre positivas para ABCB5, pero no injertos dérmicos deficientes en ABCB5, mejorará aún más la cicatrización regenerativa de heridas inducida por INTEGRA® y mejorará potencialmente la formación de apéndices cutáneos en virtud de una mayor disponibilidad local de poblaciones de células madre multipotenciales asociadas a respuestas regenerativas. Se prevé que las mejoras significativas de la respuesta de cicatrización de heridas irán acompañadas de una regeneración simultánea de la dermis y la epidermis y una disminución de la formación de cicatrices.

En este aspecto de la invención, los armazones sembrados con células positivas para ABCB5 se utilizan para generar tejido por inducción de la diferenciación. Las células madre mesenquimatosas aisladas y purificadas pueden cultivarse en un estado indiferenciado mediante expansión mitótica en un medio específico. Estas células pueden luego recolectarse y activarse para diferenciarse en hueso, cartílago y varios otros tipos de tejido conjuntivo por una serie de factores, incluyendo estímulos mecánicos, celulares y bioquímicos. Las células madre mesenquimatosas humanas poseen el potencial de diferenciarse en células como osteoblastos y condrocitos, que producen una amplia variedad de células de tejido mesenquimatoso, así como tendón, ligamento y dermis, y este potencial se retiene después del aislamiento y para varias expansiones de población en cultivo. Por consiguiente, al poder aislar, purificar, multiplicar en gran medida y luego activar las células madre mesenquimatosas para diferenciarlas en los tipos específicos de células mesenquimatosas deseadas, tales como tejidos esqueléticos y conectivos, tales como huesos, cartílago, tendón, ligamento, músculo y adiposo, existe un proceso para tratar trastornos esqueléticos y del tejido conjuntivo. El término tejido conjuntivo se usa en el presente documento para incluir los tejidos del cuerpo que sostienen los elementos especializados, e incluye hueso, cartílago, ligamento, tendón, estroma, músculo y tejido adiposo.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para reparar daños en el tejido conjuntivo. El método comprende las etapas de aplicar los armazones a un área de daño en el tejido conjuntivo en condiciones adecuadas para diferenciar las células madre en el tipo de tejido conjuntivo necesario para la reparación.

La expresión "defectos del tejido conjuntivo" se refiere a defectos que incluyen cualquier daño o irregularidad en comparación con el tejido conjuntivo normal que puede ocurrir debido a un traumatismo, enfermedad, edad, defecto congénito, intervención quirúrgica, etc. Los defectos del tejido conjuntivo también se refieren a áreas no dañadas en las que únicamente se desea la formación de hueso, por ejemplo, para aumento estético.

Los armazones también son útiles en el tratamiento de hepatopatías. Las hepatopatías incluyen enfermedades tales como la hepatitis que dañan el tejido hepático. De forma más general, los armazones de la presente invención pueden usarse para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones hepáticas que incluyen, aunque sin limitaciones: enfermedad de hígado alcohólico, hepatitis (A, B, C, D, etc.), lesiones focales del hígado, carcinoma hepatocelular primario, lesiones quísticas grandes del hígado, hiperplasia nodular focal, enfermedad hepática granulomatosa, granulomas hepáticos, hemocromatosis, tales como hemocromatosis hereditaria, síndromes de sobrecarga de hierro, hígado graso agudo, hiperémesis gravídica, enfermedad hepática intercurrente durante el embarazo, colestasis intrahepática, insuficiencia hepática, insuficiencia hepática fulminante, ictericia o hiperbilirrubinemia asintomática, lesión en los hepatocitos, síndrome de Crigler-Najjar, enfermedad de Wilson, deficiencia de alfa-1-antitripsina, síndrome de Gilbert, hiperbilirrubinemia, esteatohepatitis no alcohólica, porfirias, hipertensión portal no cirrótica, hipertensión portal no cirrótica, fibrosis portal, esquistosomiasis, cirrosis biliar primaria, síndrome de Budd-Chiari, enfermedad venooclusiva hepática después de un trasplante de médula ósea, etc.

En algunas realizaciones, la invención se refiere al tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, con los armazones de la invención. En algunos casos, la invención contempla el tratamiento de sujetos que tienen una enfermedad neurodegenerativa o una lesión de las células nerviosas que puede conducir a neurodegeneración. Las células neuronales se clasifican predominantemente en función de sus conexiones sinápticas locales/regionales (por ejemplo, Interneuronas de circuitos locales frente a neuronas de proyección de largo alcance) y conjuntos de receptores y sistemas de segundos mensajeros asociados. Las células neuronales incluyen tanto neuronas del sistema nervioso central (SNC) como neuronas del sistema nervioso periférico (SNP). Hay muchos tipos diferentes de células neuronales. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, neuronas sensoriales y simpáticas, neuronas colinérgicas, neuronas del ganglio de la raíz dorsal, neuronas propioceptivas (en el núcleo mesencefálico del trigémino), neuronas del ganglio ciliar (en el sistema nervioso parasimpático), etc. Un experto normal en la técnica podrá identificar fácilmente las células neuronales y distinguirlas de las células no neuronales, tales como células gliales, utilizando normalmente características morfológicas celulares, expresión de marcadores específicos de células, secreción de ciertas moléculas, etc. "Trastorno neurodegenerativo" o "enfermedad neurodegenerativa" se define en el presente documento como un trastorno en el que se produce una pérdida progresiva de neuronas en el sistema nervioso periférico o en el sistema nervioso central. Estos trastornos incluyen daño neuronal relacionado con lesiones, tales como lesiones de la médula espinal y lesiones en la cabeza.

La mayoría de las enfermedades neurodegenerativas crónicas se caracterizan por su aparición durante la edad adulta media y conducen a una rápida degeneración de subconjuntos específicos de neuronas dentro del sistema neural, dando como resultado en última instancia una muerte prematura. Las composiciones que comprenden células madre mesenquimatosas dérmicas se pueden administrar a un sujeto para tratar una enfermedad neurodegenerativa en monoterapia o en combinación con la administración de otros compuestos terapéuticos para el tratamiento o la prevención de estos trastornos o enfermedades.

Se ha descrito la utilidad de las células madre adultas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Se ha demostrado que las células madre mesenquimatosas pueden transformarse en células similares a neuronas en ratones que han sufrido accidentes cerebrovasculares. Journal of Cell Transplantation Vol. 12, pág. 201-213, 2003. De manera adicional, las células madre derivadas de la médula ósea se convirtieron en células neurales que son prometedoras para el tratamiento de pacientes con enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y lesiones de la médula espinal.

Los métodos de la invención también son útiles en el tratamiento de trastornos asociados con nefropatías. Se ha demostrado que las células madre mesenquimatosas inyectadas previamente en los riñones dan como resultado una mejora casi inmediata de la función renal y la renovación celular. Resnick, Mayer, Stem Cells Brings Fast Direct Improvement, Without Differentiation, in Acute Renal Failure, EurekAlert!, August 15, 2005. Por consiguiente, los armazones de la invención se pueden administrar a un sujeto que padece una nefropatía de forma individual en combinación con otros tratamientos o procedimientos, tales como diálisis, para mejorar la función renal y la renovación celular.

Otras enfermedades que pueden tratarse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen enfermedades de la córnea y el pulmón. Las terapias basadas en la administración de células madre mesenquimatosas en estos tejidos han demostrado resultados positivos. Por ejemplo, se han utilizado células madre mesenquimatosas humanas para reconstruir córneas dañadas. Ma Y et al, Stem Cells, August 18, 2005. Además, se ha descubierto que células madre derivadas de la médula ósea son importantes para la reparación pulmonar y la protección contra lesiones pulmonares. Rojas, Mauricio, et al., American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, Vol. 33, pág. 145-152, May 12, 2005. Por tanto, las células madre mesenquimatosas dérmicas de la invención también pueden usarse en la reparación de tejido corneal o tejido pulmonar.

Las células madre ABCB5(+) pueden ser autólogas para el sujeto (obtenidas del mismo sujeto) o no autólogas, tal como las células que son alogénicas o singénicas para el sujeto. Como alternativa, las células madre ABCB5(+) pueden obtenerse de una fuente que sea xenogénica para el sujeto.

Alogénico se refiere a células que son genéticamente diferentes, aunque pertenecen a o se obtienen de la misma especie que el sujeto. Por consiguiente, una célula madre ABCB5(+) alogénica es una célula madre obtenida de un ser humano que no es el receptor previsto de las células madre. Singénica se refiere a células que son genéticamente idénticas o estrechamente relacionadas e inmunitariamente compatibles con el sujeto (es decir, de individuos o tejidos que tienen genotipos idénticos). Xenogénica se refiere a células derivadas u obtenidas de un organismo de una especie diferente a la del sujeto.

Las células madre ABCB5(+) de acuerdo con la invención pueden expandirse ex vivo o in vitro antes de la aplicación al armazón o in vivo después de la administración. Por consiguiente, en algunos casos, la expresión de ABCB5 proporciona una base para identificar, aislar, clonar, propagar y expandir células madre ABCB5(+) in vitro. Se puede usar cualquier método adecuado de emplear agentes, por ejemplo, péptidos aislados, por ejemplo, anticuerpos, que se unen a ABCB5 para separar las células madre ABCB5(+) de otras células. Las células madre ABCB5(+) aisladas se pueden mantener en un entorno de cultivo apropiado utilizando, por ejemplo, una combinación de medios, suplementos y reactivos. Opcionalmente, se pueden usar poblaciones de células alimentadoras o medios acondicionados obtenidos de poblaciones de células alimentadoras para expandir las poblaciones de células madre ABCB5(+).

Adhesión, factores de adhesión y matriz que pueden usarse para la expansión de células madre de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación, E-cadherina, colágeno, fibronectina, superfibronectina, proteoglicano de sulfato de heparina, ICAM-I, laminina, osteopontina, proteoglicano, E-selectina, L-selectina, VCAM y vitronectina.

Bioactivos y suplementos que pueden usarse para la expansión de células madre de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación, enzimas (por ejemplo, catepsina G, Flt-3/Fc), proteínas y péptidos (por ejemplo, activina A, albúmina, angiogenina, angiopoyetina, péptido inhibidor de BAX, heregulina beta-1, SMAC/Diablo), vitaminas, hormonas y varias otras sustancias (por ejemplo, ácido L-ascórbico, dexametasona, EGF, receptor de EGF, líquido embrionario (bovino), ligando flt3, progesterona, ácido retinoico, acetato de retinilo, trombopoyetina y TPO), anticuerpos, quimiocinas, citocinas, factores de crecimiento y receptores.

Reactivos de cultivo que pueden usarse para la expansión de células madre de acuerdo con la invención incluyen, sin limitación, antibióticos (por ejemplo, cicloheximida, etopósido, gentamicina, mitomicina, penicilina-estreptomicina), medios clásicos (por ejemplo, medio de Claycomb, medio Eagle modificado de Dulbecco, medio de Dulbecco modificado de Iscove, medio esencial mínimo), medio de congelación celular DMSO, medio de Claycomb sin L-glutamina, medio Stemline® (Sigma-Aldrich, EE. UU.).

Las composiciones de la presente invención pueden comprender células madre o una preparación aislada de células madre, las células madre caracterizadas por la expresión de ABCB5 en su superficie celular coinjertadas con un armazón de glucosaminoglicanos. Una composición puede comprender una preparación enriquecida con células madre ABCB5(+) aisladas o puede comprender una población sustancialmente pura de células madre ABCB5(+). Se pretende que las composiciones abarquen armazones, analizados en el presente documento.

Las composiciones, en algunas realizaciones, pueden comprender bioactivos y suplementos adicionales para promover la regeneración y diferenciación celular. Dichos bioactivos y suplementos que pueden usarse de acuerdo con la invención se han descrito anteriormente e incluyen, sin limitación, diversas enzimas, proteínas y péptidos, vitaminas, anticuerpos, quimiocinas, citocinas, factores de crecimiento y receptores. En algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender un inmunosupresor y/o un agente contra la vasculogénesis. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición puede comprender ciclosporina (por ejemplo, CyA), que puede usarse para prevenir y/o tratar rechazos de injertos. En algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender bevacizumab (por ejemplo, AVASTIN®). Puede usarse el uso de un agente contra la vasculogénesis, en algunos casos, para prevenir la formación de vasos sanguíneos, que con frecuencia se produce después del trasplante y puede conducir al rechazo del injerto. En algunas realizaciones, no se administra un inmunosupresor y/o un agente contra la vasculogénesis como componente de una composición o armazón, sino que se administra de forma independiente antes o después de la administración de células madre ABCB5(+).

Las células ABCB5+ pueden modificarse por ingeniería genética o recombinante. Recombinante puede hacer referencia a organismos, células, ácidos nucleicos y proteínas. Las células y organismos recombinantes son células y organismos que contienen ADN recombinante. El ADN recombinante se refiere a una secuencia de ácido nucleico que normalmente no se encuentra en la naturaleza. Por lo general, este término se refiere a dos o más piezas de ADN empalmadas para formar un producto no natural. La proteína recombinante es una proteína producida a partir de ADN recombinante (es decir, un ácido nucleico que difiere del que se produce en la naturaleza). Al producir una proteína recombinante, las secuencias reguladoras del gen que codifica la proteína suelen ser diferentes de las que se encuentran en el gen natural. El gen también puede haberse colocado en un organismo que normalmente no posee el gen para producir esa proteína en el organismo deseado.

La inserción de genes deseados u otras construcciones de ácido nucleico en células sembradas en el armazón se puede lograr usando técnicas de ingeniería genética y recombinante de rutina, por ejemplo, como se describe en Ausubel et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas pueden modificarse para expresar proteínas que también son útiles en las indicaciones terapéuticas, como se describe con más detalle en el presente documento. Por ejemplo, las células pueden incluir un ácido nucleico que produce al menos un factor bioactivo que además induce o acelera la diferenciación de las células madre mesenquimatosas en un linaje diferenciado y/o las células pueden incluir un ácido nucleico que produce un mediador secretado. En el caso de que se esté formando hueso, el factor bioactivo puede ser un miembro de la superfamilia TGF-beta que comprende varios factores de crecimiento tisular, particularmente proteínas morfogenéticas óseas, tal como al menos una seleccionada del grupo que consiste en BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6 y BMP-7. En otros casos, el mediador secretado puede ser VEGF.

Pueden emplearse diversas técnicas para introducir ácidos nucleicos en las células. Tales técnicas incluyen transfección de precipitados de ácido nucleico-CaPO⁴, transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, transfección con un retrovirus que incluye el ácido nucleico de interés, transfección mediada por liposomas, y similares. Para ciertos usos, se prefiere dirigir el ácido nucleico a células concretas. En dichos casos, un vehículo utilizado para administrar un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula (por ejemplo, un retrovirus u otro virus; un liposoma) puede tener una molécula de direccionamiento unida al mismo. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie en la célula diana o un ligando para un receptor en la célula diana puede unirse o incorporarse dentro del vehículo de liberación de ácido nucleico. Por ejemplo, cuando se emplean liposomas para administrar los ácidos nucleicos de la invención, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie asociada con la endocitosis se pueden incorporar en la formulación de liposomas para dirigir y/o para facilitar la captación.

Un método para introducir material genético exógeno en las células madre mesenquimatosas dérmicas es transducir las células usando retrovirus de replicación deficiente. Los retrovirus de replicación deficiente son capaces de dirigir la síntesis de todas las proteínas del virión, pero son incapaces de producir partículas infecciosas. En consecuencia, estos vectores retrovirales alterados genéticamente tienen utilidad general para la transducción de genes de alta eficiencia en células cultivadas. Los retrovirus se han utilizado ampliamente para transferir material genético a las células. Los protocolos estándar para producir retrovirus de replicación deficiente (incluidas las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, la transfección de una línea celular de empaquetamiento con plásmido, la producción de retrovirus recombinantes por la línea celular empaquetadora, la recolección de partículas víricas de medios de cultivo de tejidos e infección de las células diana con partículas víricas) se proporcionan en la técnica.

La principal ventaja de usar retrovirus es que los virus insertan de manera eficiente una única copia del gen que codifica el agente terapéutico en el genoma de la célula huésped, permitiendo así que el material genético exógeno se transmita a la progenie de la célula cuando se divide. De manera adicional, se ha informado que las secuencias promotoras de genes en la región LTR mejoran la expresión de una secuencia codificante insertada en diversos tipos de células. Las principales desventajas de usar un vector de expresión de retrovirus son (1) mutagénesis insercional, es decir, la inserción del gen terapéutico en una posición indeseable en el genoma de la célula diana que, por ejemplo, conduce a un crecimiento celular no regulado y (2) la necesidad de proliferación de células diana para que el gen terapéutico transportado por el vector se integre en el genoma diana. A pesar de estas aparentes limitaciones, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico a través de un retrovirus puede ser eficaz si la eficacia de la transducción es alta y/o el número de células diana disponibles para la transducción es alto.

Otro candidato vírico más útil como vector de expresión para la transformación de células madre mesenquimatosas dérmicas es el adenovirus, un virus de ADN bicatenario. Como el retrovirus, el genoma del adenovirus es adaptable para su uso como vector de expresión para la transducción de genes, es decir, eliminando la información genética que controla la producción del propio virus. Dado que el adenovirus funciona normalmente de forma extracromosómica, el adenovirus recombinante no tiene el problema teórico de la mutagénesis insercional. Por otro lado, la transformación adenoviral de una célula madre mesenquimatosa dérmica diana puede no resultar en una transducción estable. Sin embargo, más recientemente, se ha informado de que ciertas secuencias adenovirales confieren especificidad de integración intracromosómica a secuencias portadoras y, por tanto, dan como resultado una transducción estable del material genético exógeno.

Por consiguiente, como será evidente para un experto en la materia, existen disponible diversos vectores adecuados para transferir material genético exógeno a células madre mesenquimatosas dérmicas. La selección de un vector apropiado para administrar un agente terapéutico para una condición en particular susceptible de terapia de reemplazo génico y la optimización de las condiciones para la inserción del vector de expresión seleccionado en la célula están dentro del alcance de un experto en la técnica sin la necesidad de una experimentación indebida.

Por consiguiente, la presente invención hace posible manipular genéticamente células madre mesenquimatosas dérmicas de tal manera que produzcan polipéptidos, hormonas y proteínas que normalmente no se producen en las células madre humanas en cantidades biológicamente significativas o en pequeñas cantidades, pero en situaciones en las que la sobreproducción daría lugar a un beneficio terapéutico. A continuación, estos productos se secretarían en el torrente sanguíneo u otras áreas del cuerpo, tal como el sistema nervioso central. Las células madre humanas formadas de esta manera e incrustadas en un armazón pueden servir como un sistema continuo de administración de fármacos para reemplazar los regímenes actuales, que requieren administración periódica (mediante ingestión, inyección, infusión de depósito, etc.) de la sustancia necesaria. La presente invención tiene aplicabilidad para proporcionar hormonas, enzimas y fármacos a los seres humanos, que necesiten tales sustancias. Es particularmente valioso para proporcionar dichas sustancias, tales como hormonas (por ejemplo, hormona paratiroidea, insulina), que se necesitan en dosis sostenidas durante períodos de tiempo prolongados y están asociados con el tejido que se está reparando.

Las células madre ABCB5(+) pueden aislarse para producir células madre multipotenciales o pluripotenciales (por ejemplo, células madre pluripotenciales inducidas (iPSC)), a partir de los cuales pueden desarrollarse otras células y/o tejidos. Por consiguiente, en algunos aspectos de la divulgación se proporcionan métodos para reprogramar directamente, o inducir, células madre ABCB5(+) para que se conviertan en células madre multipotenciales o pluripotenciales antes o después de que las células se siembren en el armazón. El término "reprogramación" como se utiliza en el presente documento, se refiere a un proceso que invierte el potencial de desarrollo de una célula o población de células (por ejemplo, una célula madre ABCB5(+)). Por consiguiente, la reprogramación se refiere al proceso de conducir una célula a un estado con mayor potencial de desarrollo, es decir, hacia atrás a un estado menos diferenciado. La célula que se va a reprogramar puede diferenciarse parcial o terminalmente antes de la reprogramación. En algunos aspectos de la divulgación, la reprogramación comprende una reversión parcial del estado de diferenciación, es decir, un aumento en el potencial de desarrollo de una célula, al de una célula que tiene un estado multipotencial o pluripotencial. La reprogramación también comprende la reversión parcial del estado de diferenciación de una célula a un estado que hace que la célula sea más susceptible a la reprogramación completa hacia un estado multipotencial o pluripotencial cuando se somete a manipulaciones adicionales.

Se pueden generar células madre multipotenciales o pluripotenciales a partir de células madre ABCB5(+) (denominadas en el presente documento "células ABCB5(+) reprogramadas") utilizando varios factores de reprogramación. Las células resultantes, que tienen un mayor potencial de desarrollo que las células madre ABCB5(+), pueden convertirse después en la fuente de células madre para manipulaciones adicionales. Un "factor de reprogramación" como se usa en el presente documento, se refiere a un factor de alteración del potencial de desarrollo, cuya expresión contribuye a la reprogramación de una célula, por ejemplo, una célula madre ABCB5(+), hacia un estado menos diferenciado o indiferenciado, por ejemplo, hacia una célula de un estado pluripotente o un estado parcialmente pluripotente. Factores de reprogramación incluyen OCT4, SOX2, KLF 4 y c-MYC (también conocidos como los "factores de Yamanaka"). Otros factores de reprogramación incluyen, sin limitación, SOX 1, SOX 3, SOX15, SOX 18, NANOG, KLF1, KLF 2, KLF 5, NR5A2, LIN28, 1-MYC, n-MYC, REM2, TBX3, TERT y LIN28. Puede usarse cualquier combinación de dos o más de los factores de transcripción anteriores para reprogramar células madre ABCB5(+) aisladas. Métodos de reprogramación de células a estado multipotencial o pluripotencial se describen por Stadtfeld y Hochedlinger.

Las células diferenciadas también pueden producirse e incorporarse al armazón a partir de células ABCB5(+) reprogramadas. Los métodos pueden comprender expresar en las células ABCB5(+) reprogramadas uno o más factores de diferenciación necesarios para estimular la diferenciación en un tipo de célula más madura, diferenciada, tal como, por ejemplo, una célula sanguínea, plaqueta, célula estromal, célula ósea, miocito, célula de la piel, célula adiposa o célula neural. Como se usa en el presente documento, la expresión "factor de diferenciación" se refiere a un factor de alteración del potencial de desarrollo, tal como una proteína o una molécula pequeña, que induce a una célula a diferenciarse a un tipo celular deseado, por ejemplo, un factor de diferenciación reduce el potencial de desarrollo de una célula. La diferenciación a un tipo de célula específico puede implicar la expresión simultánea y/o sucesiva de más de un factor de diferenciación. Los métodos pueden comprender además hacer crecer las células ABCB5(+) reprogramadas en condiciones para promover la diferenciación para formar una célula diferenciada.

Una "célula madre" como se usa en el presente documento es una célula indiferenciada o parcialmente diferenciada que tiene la capacidad de autorrenovarse y tiene el potencial de desarrollo para diferenciarse en múltiples tipos celulares. Una "célula pluripotente" es una célula con potencial de desarrollo, en diferentes condiciones, para diferenciarse en tipos celulares característicos de las tres capas de células germinales, es decir, endodermo (por ejemplo, tejido intestinal), mesodermo (incluida la sangre, músculos y vasos) y ectodermo (tal como piel y nervios). Una célula "multipotente" es una célula que tiene el potencial de desarrollo para diferenciarse en células de una o más capas germinales, pero no en las tres. Estas células incluyen, por ejemplo, células madre adultas, tal como, por ejemplo, células madre hematopoyéticas y células madre neurales. Una célula "totipotente" es una célula que tiene el potencial de desarrollo para diferenciarse en todas las células diferenciadas de un organismo, incluidos los tejidos extraembrionarios. Las células madre pueden tener una propensión a un fenotipo diferenciado; sin embargo, estas células pueden inducirse a revertir y volver a expresar el fenotipo de células madre. Este proceso se conoce como "desdiferenciación" o "reprogramación".

Las células madre ACB5(+), las células ABCB5(+) reprogramadas y las células diferenciadas de la divulgación pueden manipularse en condiciones habituales para estos tipos celulares. El tratamiento de las células se puede realizar antes 0 después de que las células se incorporen en el armazón e in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las células pueden estar presentes en el organismo o en un medio de cultivo. Las manipulaciones se pueden realizar en condiciones de alto o bajo contenido de oxígeno.

Un "medio de cultivo" contiene nutrientes que mantienen la viabilidad celular y apoyan la proliferación. Un medio de cultivo habitual incluye: sales, tampones, aminoácidos, glucosa u otros azúcares, antibióticos, suero o reemplazo de suero y/u otros componentes tales como factores de crecimiento peptídicos. En la técnica se conocen medios de cultivo celular para su uso en la obtención y mantenimiento de células totipotenciales, multipotenciales y pluripotenciales. El medio de cultivo también puede incluir factores de crecimiento específicos de las células, tal como la angiogenina, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor IA de proteína morfogénica ósea, receptor IB de proteína morfogénica ósea, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor neutrófico ciliar, receptor alfa del factor neutrófico ciliar, factor quimiotáctico de neutrófilos 1 inducido por citocinas, neutrófilos inducidos por citocinas, factor quimiotáctico 2-alfa, factor quimiotáctico de neutrófilos 2-beta inducido por citocinas, factor de crecimiento de células beta-endoteliales, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, atrayente de neutrófilos derivado de células epiteliales, factor de crecimiento de fibroblastos 4, factor de crecimiento de fibroblastos 5, factor de crecimiento de fibroblastos 6, factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de crecimiento de fibroblastos 8, factor de crecimiento de fibroblastos b, factor de crecimiento de fibroblastos c, factor de crecimiento de fibroblastos 9, factor de crecimiento de fibroblastos 10, factor de crecimiento de fibroblastos ácido, factor de crecimiento de fibroblastos básico, receptor alfa-1 del factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales, receptor alfa-2 del factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales, proteína relacionada con el crecimiento, proteína alfa relacionada con el crecimiento, proteína beta relacionada con el crecimiento, proteína gamma relacionada con el crecimiento, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento similar a la insulina I, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento similar a la insulina II, proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de la leucemia, receptor alfa del factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor de crecimiento placentario, factor 2 de crecimiento placentario, factor de crecimiento de células endoteliales derivadas de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas a A, factor de crecimiento derivado de plaquetas AB, cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante del crecimiento de células pre-B, factor de células madre, receptor del factor de células madre, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento transformante beta, factor de crecimiento transformante beta-1, factor de crecimiento transformante beta-1-2, factor de crecimiento transformante beta-2, factor de crecimiento transformante beta-3, factor de crecimiento transformante beta-5, factor de crecimiento transformante latente beta-1, proteína I de unión al factor de crecimiento transformante beta, proteína II de unión al factor de crecimiento transformante beta, proteína III de unión al factor de crecimiento transformante beta, receptor del factor de necrosis tumoral de tipo I, receptor del factor de necrosis tumoral de tipo II, receptor activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, factor de crecimiento endotelial vascular y proteínas quiméricas y fragmentos biológica o inmunitariamente activos de los mismos.

El estado de diferenciación de la célula se puede evaluar utilizando cualquier método conocido en la técnica para realizar tales evaluaciones. Por ejemplo, el estado de diferenciación de una célula tratada de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento puede compararse con una célula no tratada o con células tratadas con ADN utilizando vectores víricos para suministrar ADN dando como resultado la expresión de los mismos factores de reprogramación o diferenciación.

La dosis de las células madre puede definirse por el número de células incluidas en el armazón y varía dentro de amplios límites y por supuesto, se ajustará a las necesidades individuales de cada caso en particular. El número de células utilizadas dependerá del peso y el estado del receptor y de otras variables conocidas por los expertos en la técnica.

La presente divulgación también proporciona cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente en kits, incluyendo, opcionalmente, instrucciones para el uso de la composición para el tratamiento de una afección descrita en el presente documento. Es decir, el kit puede incluir una descripción del uso de la composición para participar en cualquier mecanismo biológico o químico desvelado en el presente documento. Los kits pueden incluir además una descripción de la actividad de la afección en el tratamiento de la patología, frente a los síntomas de la afección. Es decir, el kit puede incluir una descripción del uso de las composiciones como se analiza en el presente documento. El kit también puede incluir instrucciones para el uso de una combinación de células y armazón para el tratamiento de las enfermedades. También se pueden proporcionar instrucciones para administrar la composición mediante cualquier técnica adecuada. Los kits también pueden ser uno o más reactivos asociados con el aislamiento y purificación de las células madre mesenquimatosas dérmicas, es decir, anticuerpos frente ABCB5 e instrucciones para aislar y/o purificar las células.

Los kits descritos en el presente documento también pueden contener uno o más recipientes, que pueden contener la composición y otros ingredientes como se ha descrito previamente. Los kits también pueden contener instrucciones para mezclar, diluir y/o administrar las composiciones de la invención en algunos casos. Los kits también pueden incluir otros recipientes con uno o más disolventes, tensioactivos, conservantes y/o diluyentes (por ejemplo, solución salina normal (NaCl a 0,9 %) o dextrosa al 5 %) así como recipientes para mezclar, diluir o administrar los componentes en una muestra o en un sujeto que necesite dicho tratamiento.

Las composiciones del kit se pueden proporcionar en cualquier forma adecuada, por ejemplo, como soluciones líquidas o como polvos secos. Cuando la composición proporcionada sea un polvo seco, la composición puede reconstituirse mediante la adición de un disolvente adecuado, que también se puede proporcionar. En realizaciones en las que se utilizan formas líquidas de la composición, la forma líquida puede estar concentrada o lista para usar.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que de ninguna manera debe interpretarse como una limitación adicional de la invención, que se define en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1: Plasticidad de diferenciación multipotencial de células madre dérmicas ABCB5+ in vitro e in vivo.

Anteriormente se ha demostrado que ABCB5 identifica una población de células madre mesenquimatosas en la dermis humana, donde confiere hiperpolarización de la membrana y determina como regulador del potencial de membrana la propensión de los progenitores de la piel a sufrir diferenciación. Estudios adicionales han revelado que ABCB5 confiere resistencia a los medicamentos y marca subconjuntos de células madre cancerosas (CSC) con una plasticidad de diferenciación específica en melanomas humanos, donde también se correlaciona con la progresión clínica de la enfermedad.

Los inventores han demostrado que las células cutáneas ABCB5+ residen en la dermis reticular y son distintas de los fibroblastos maduros vecinos, las células endoteliales CD31+ y las células protuberantes CD34+. ABCB5 se expresa en un 2,5-5 % de todas las células en una muestra de piel humana. Las células ABCB5+ coexpresaron los marcadores de células madre mesenquimatosas CD29 (en el 99,48 ± 0,5 % de las células), CD44 (99,09 ± 0,9 %), CD49e (92,61 ± 4,0 %), CD90 (100 %) y CD166 (58,29 ± 19,7 %), así como el marcador de células madre CD133 (6,29 ± 5,1 %), pero fueron negativas para marcadores de diferenciación como el marcador de linaje endotelial CD31, el marcador de linaje hematopoyético CD45 y el marcador de fibroblasto inactivo CD34. De forma importante, solo subpoblaciones distintas de células que se tiñen positivamente para los marcadores de MSC indicados (CD29, CD44, CD49e, CD90 y CD166) mostraron tinción positiva para ABCB5, mientras que grandes proporciones de células que expresan estos antígenos resultaron negativas para ABCB5, lo que demuestra que las células ABCB5+ representan una nueva subpoblación única de células madre mesenquimatosas.

Los inventores evaluaron la plasticidad de diferenciación multipotencial de las células madre dérmicas ABCB5+ frente a las células ABCB5- in vitro e in vivo, con el fin de investigar si ABCB5 representa un marcador más específico para las células madre mesenquimatosas multipotenciales que los antígenos de MSC actualmente disponibles.

Los inventores examinaron el potencial de diferenciación de células ABCB5+ aisladas por selección positiva de suspensiones de células cutáneas disociadas obtenidas de voluntarios humanos sanos y lo compararon con el potencial de diferenciación de fibroblastos dérmicos ABCB5-(Figura 1). Se cultivaron células ABCB5+ o ABCB5- en medios inductores de linaje neurogénico, angiogénico miogénico, osteogénico o adipogénico, y su plasticidad de diferenciación se evaluó midiendo la inducción de ARN y la expresión de proteínas de marcadores específicos de linaje (es decir, espectrina - miogénesis, CD31 - angiogénesis, TUJ1 - neurogénesis, rojo aceite - adipogénesis y rojo alizarina - osteogénesis), así como cambios morfológicos característicos del linaje (Figura 1). Solo las células dérmicas ABCB5+, pero no ABCB5-, fueron capaces de dar lugar a los tres linajes embrionarios (es decir, linaje ectodérmico (neurogénesis), mesodérmico (miogénesis) y endodérmico (angiogénesis)) (Figura 1).

Para diseccionar aún más la plasticidad de diferenciación de las MSC dérmicas ABCB5+ humanas y determinar su capacidad independiente de nicho para la diferenciación multipotencial in vivo, los inventores examinaron el potencial miorregenerativo in vivo de células humanas derivadas de piel ABCB5+ frente a ABCB5 en un modelo de lesión muscular aguda. Se inyectaron células de la piel ABCB5+ y ABCB5- en los músculos tibial anterior (TA) lesionados con cardiotoxina de ratones NOD/SCID/IL2Ry -/- (NSG) gravemente inmunodeprimidos. Se obtuvo tinción de inmunofluorescencia representativa de músculos murinos inyectados con células ABCB5+ y ABCB5- humanas con microglobulina p2 específica para humanos, A-sarcoglicano y espectrina. Los núcleos se visualizan con DAPI. Los músculos inyectados y los músculos de control no inyectados se recolectaron 2 semanas después del trasplante y se examinaron para determinar la expresión de microglobulina p2 específica para humanos (p2M), que identifica todas las células de origen humano, y espectrina específica para humanos (SPTBN1) y delta-sarcoglicano (SGCD), que son expresadas específicamente por miocitos humanos diferenciados pero no murinos. Si bien la inmunotinción reveló la presencia de células humanas p2M+ en los músculos inyectados con células ABCB5+ y ABCB5-, indicativo de trasplante e injerto con éxito, sólo los músculos TA inyectados con células ABCB5+ contenían miocitos diferenciados SPTBN1+ y SGCD+. Los análisis de PCR en tiempo real de los músculos de control no inyectados e inyectados demostraron la expresión de transcripciones p2M específicas para humanos en músculos inyectados con células ABCB5+ y ABCB5-, pero no en los controles no inyectados, y la expresión de los transcritos de SPTBN1 y SGCD específicos de humanos se demostró sólo en músculos inyectados con células ABCB5+. Por consiguiente, ABCB5 representa un marcador altamente específico para células madre mesenquimatosas dérmicas humanas multipotenciales, con una función marcadora discriminatoria sustancialmente mejorada sobre los antígenos de MSC actualmente disponibles. Estos hallazgos destacan la capacidad de las MSC dérmicas ABCB5+ como una nueva fuente regeneración tisular basada en células madre.

Ejemplo 2: Fenotipo de deficiencia de células madre de ratones defectivos en Abcb5.

Con el fin de analizar más a fondo el papel de ABCB5 en el desarrollo y la función de las células madre, los inventores crearon el primer ratón defectivo en abcb5 (KO) condicionado. Hasta hace poco, la función de la proteína ABCB5 se estudió ampliamente en Homo sapiens. El gen ABCB5 humano codifica una proteína de 812 aminoácidos (AA) con cinco hélices transmembrana flanqueadas por dominios de unión a ATP tanto extracelulares como intracelulares1. Los estudios anteriores de los inventores revelaron que uno de sus clones de anticuerpos monoclonales anti-ABCB5, 3D2-1D12, que está dirigido a un bucle extracelular que contiene los restos de aminoácidos 493-508 de la proteína ABCB5 humana, inhibe la salida del colorante Rhodamine-123 mediada por ABCB5, la polarización de la membrana y el transporte de doxorrubicina125, lo que demuestra la importancia funcional crítica de esta región de bucle extracelular de la molécula. Asimismo, los inventores han clonado previamente el homólogo de ratón ABCB5 correspondiente, Abcb5 murino23. Se apuntó a una parte homóloga de la molécula murina para interrumpir la función de Abcb5 en ratones. Utilizando el motor de búsqueda UCSC Blat identificaron que la región genómica de ratón que codifica el dominio de la proteína Abcb5 homóloga al epítopo de unión a AcMo 3C2-1D12 ABCB5 está codificada por el exón 23. Basándose en este hallazgo, se diseñó una construcción KO condicionada en la que se insertaron dos sitios loxP para flanquear el exón murino 23 (Figura 2).

Para determinar el resultado de una pérdida completa de la función, el exón 23 del gen Abcb5 se eliminó utilizando el transgén EIIa-Cre, que expresa Cre recombinasa en un embrión de ratón en la etapa de cigoto4849. La deleción de la región genómica entre los sitios loxP se confirmó mediante PCR de ADN genómico. Se entrecruzaron ratones heterocigotos Abcb5deficientes/SV para producir mutantes homocigotos deficientes en Abcb5/deficientes, y se confirmó la pérdida de expresión y función de Abcb5 en mutantes deficientes en Abcb5/deficientes mediante análisis de citometría de flujo y ensayos de salida de rodamina-1231 (Figura 3).

La inactividad relativa es una de las características distintivas atribuidas a varias poblaciones de células madre de mamíferos50. Las células madre de la piel se identificaron por primera vez como células de ciclo lento utilizando los denominados enfoques experimentales de marcaje de ADN de "pulso y seguimiento" desarrollados por Bickenbach51, Morris52 y Cotsarelis50 Estos enfoques se basan en la incorporación de un análogo de timidina marcado, uridina, en el ADN nuclear durante la fase de replicación (fase S) del ciclo celular. En primer lugar, durante el marcaje del ADN o la fase de "pulso", las células o los animales están expuestos a la uridina marcada radiactivamente o químicamente (por ejemplo, bromodesoxiuridina, BrdU), que luego se incorpora al ADN nuclear durante cada división celular. La exposición a uridina marcada (por ejemplo, BrdU) se retira durante la fase de "seguimiento", con la consiguiente pérdida del marcador al dividirse con frecuencia las células, en el transcurso de aproximadamente 48 a 72 horas. Sin embargo, las células de ciclo lento son capaces de retener el marcador de ADN durante períodos de tiempo prolongados; por ejemplo, las células madre del área del promontorio del folículo piloso de ratón pueden retener uridina marcada radiactivamente durante al menos 4 semanas50 y, por lo tanto, se denominan "células retenedoras del marcador"

Para determinar si ABCB5 identifica una población de células retenedoras de marcador en reposo en la piel de los mamíferos, coherente con el fenotipo de células madre demostrado, y si se requiere una función ABCB5 intacta para el mantenimiento de la inactividad de las células madre, los inventores realizaron experimentos de marcaje de BrdU in vivo en ratones Abcb5 SV y Abcb5 KO. Brdu es un derivado de uridina no radiactivo, que puede detectarse utilizando anticuerpos anti-BrdU marcados con fluorescencia. Los ratones fueron sometidos a un "pulso" de 9 días de dosis sistémicas diarias (i.v.) Administración de BrdU diseñada para marcar células de división lenta, seguido de una fase de "seguimiento" sin BrdU de 4 semanas tras el cese del tratamiento con BrdU. A continuación, se comparó el porcentaje de células que retienen BrdU en suspensiones de células de la piel de espesor completo disociadas entre ratones Abcb5 SV y Abcb5 KO, utilizando tinción con anticuerpos anti-BrdU y citometría de flujo. Las células se tiñeron conjuntamente con el colorante 7-amino-actinomicina D (7-Aa D), que se une al ADN total, para la enumeración y caracterización de las células con respecto a su posición en el ciclo celular (Figura 4). Los análisis de citometría de flujo revelaron que después de un "seguimiento" de 4 semanas, todos los positivos para Brdu (es decir, células que retienen el marcador) en ratones Abcb5 SV se encontraban en la fase G0 (Figura 4B, puerta R1), y que esta población se redujo en un 74 % en ratones Abcb5 KO (Figura 4C, puerta R1). De manera adicional, las suspensiones de células de la piel de espesor completo derivadas de ratones Abcb5 KO exhibieron un 67 % más de células negativas para BrdU proliferantes en la fase S/G2/M en comparación con las derivadas de ratones Abcb5 SV (Figura 4B y 4C, puerta R2), lo que indica que la anulación de la función ABCB5 normal induce la proliferación celular de células ABCB5+ normalmente inactivas.

De acuerdo con esta observación, los análisis de PCR en tiempo real de 84 genes celulares implicados en la regulación del ciclo celular (SABiosciences, número de catálogo PAMM-020), revelaron una regulación por disminución significativa en ratones Abcb5 KO de 22 moléculas implicadas en varias vías canónicas del ciclo celular, incluidas señalización de p53, regulación del punto de control G1/S, ciclinas y regulación del ciclo celular, y vías de señalización de calcio (Figura 5), incluyendo, miembros de la familia p53 (p53 y p63) y de la familia cKip (p21 y p27), que controlan el punto de control del ciclo celular G0/G1 y la quiescencia celular.

Estos resultados indican que ABCB5 regula la progresión del ciclo celular y es necesario para el mantenimiento de la inactividad de las células madre. La anulación de la función ABCB5 conduce a la represión de reguladores negativos críticos de la progresión del ciclo celular G0/G1 y a una mayor proliferación celular. La retirada del ciclo celular es un requisito previo para la diferenciación normal y la incapacidad para hacerlo puede explicar un deterioro de la cicatrización normal de heridas en ratones Abcb5 KO que se describe a continuación. Los datos respaldan aún más la idoneidad de ABCB5 como un marcador funcionalmente relevante para el aislamiento de células madre de la piel de mamíferos.

Ejemplo 3: Deterioro de la cicatrización de heridas en ratones defectivos para Abcb5.

La cicatrización de heridas es un fenómeno complejo, que progresa a través de cuatro fases secuenciales: hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación con formación de cicatrices53. Los inventores investigaron si se requiere una función ABCB5 intacta para la cicatrización normal de heridas, utilizando ratones Abcb5 SV y Abcb5 KO. Se generaron heridas cutáneas de espesor completo mediante la eliminación de 1 cm2 de piel y panículo y posteriormente se observaron los ratones durante 7 días durante la fase proliferativa temprana de la cicatrización de la herida. Las heridas se fotografiaron inmediatamente después del procedimiento quirúrgico y en el momento de la recolección de tejido (día 7). Las fotografías digitales capturadas al final del experimento se analizaron cuantitativamente en comparación con las fotografías iniciales correspondientes por 2 observadores independientes ciegos para el estado genético del ratón.

El cierre de la herida se calculó como un porcentaje de la herida original, en función de las mediciones obtenidas por análisis planimétricos como se ha descrito anteriormente54, utilizando el paquete de software Image J (NIH, Bethesda, MD). Los datos se compararon utilizando pruebas t para datos no apareados con la corrección de Welch para tener en cuenta las varianzas desiguales. Los ratones Abcb5 KO (n = 15) demostraron un cierre de la herida significativamente retrasado en comparación con los ratones Abcb5 SV (n = 19) (63,64 ± 7,6 % frente a 87,33 ± 3,4 %, media ± SEM, P = 0,01) (Figura 6). De manera adicional, el espesor del estroma inflamatorio se midió en ambos grupos en secciones escaneadas teñidas con H&E el día 7 utilizando el software Aperio Image Scope (Vista, CA), con heridas Abcb5 KO que demuestran un aumento significativo del espesor del estroma inflamatorio en comparación con las heridas Abcb5 SV (820,2 ± 65,6 pm frente a 590,0 ± 38,8 pm, media ± SEM, P = 0,003) (Figura 6).

La neovascularización es una de las características distintivas de las primeras etapas de la regeneración de heridas y es fundamental para el control de la proliferación excesiva de miofibroblastos inducida por hipoxia, que se cree que contribuye a la formación de cicatrices queloides (revisado en 55). Estudios anteriores han demostrado que, si bien la angiogénesis de la herida se logra principalmente mediante el brote de nuevos vasos a partir de vasos preexistentes, algunos de los vasos recién formados pueden tener su origen en células progenitoras de la médula ósea56. La contribución de otras poblaciones de células madre residentes a la angiogénesis de la herida no está clara. Según las observaciones previas de los inventores del papel crítico de las células ABCB5+ en la vasculogénesis del melanoma humano28, plantearon la hipótesis de que la función de ABCB5 intacta también podría ser esencial para una angiogénesis eficaz en la piel herida. Para probar esta hipótesis en estudios preliminares adicionales generados desde la última iteración de esta propuesta, la formación de vasos en heridas en la piel murinas generadas como se ha descrito anteriormente se analizó comparando la expresión del marcador endotelial CD31 en ratones Abcb5 KO y Abcb5 SV el día 7 después de la herida en el contexto del espesor de los estratos (capas) vascularizados frente avascularizados dentro del lecho de la herida. .Se midieron los espesores de la capa vascular CD31 positiva y avascular CD31 negativa en ambos grupos en secciones escaneadas teñidas con CD31 el día 7 utilizando el software Aperio Image Scope (Vista, CA), con heridas Abcb5 KO que demuestran una disminución significativa del espesor de la capa vascular(278,5 ± 51,45 pm frente a 469,2 ± 40,30 pm, media ± SEM, P = 0,0069) y aumentó significativamente el espesor de la capa avascular (626,2 ± 41,18 pm frente a 324,5 ± 28,55 pm, media ± SEM, P <0,0001) en comparación con las heridas Abcb5 SV (Figura 7).

A diferencia de los animales de tipo silvestre, cuando los vasos proliferantes positivos para CD31 formaron canales de ramificación alargados de forma variable con lúmenes bien formados, áreas similares de animales ABCB5 KO estaban focalmente o relativamente desprovistas de estructuras positivas para CD31, o estaban compuestas de perfiles de vasos pequeños ocasionales mezclados con grupos pequeños o solitarios de células positivas para CD31. Estas últimas células positivas para CD31 parecían reflejar la incapacidad de diferenciarse en túbulos capaces de la brotación angiogénica necesaria para formar la red arborizante de vasos maduros necesarios para una respuesta de curación eficaz y productiva (Figura 8).

De acuerdo con esta observación, los análisis de PCR en tiempo real de 84 genes implicados en la angiogénesis (SABiosciences, número de catálogo PAMM-024Z), revelaron una regulación por disminución significativa en las heridas Abcb5 KO de las citocinas proangiogénicas, es decir, Csf3, CxCl2, Il1b, Ifng, Lep y Mdk y regulación por aumento de una molécula antiangiogénica conocida, el receptor de fosfatidilserina Bail (Figura 9), que proporciona una explicación inicial del patrón angiogénico anormal y altamente inhibido observado en las heridas Abcb5 Ko .

Estos resultados demuestran una cicatrización de heridas deteriorada en ratones Abcb5 KO caracterizados por un cierre retardado de la herida, aumento del espesor del estroma inflamatorio y angiogénesis aberrante, apoyando aún más un papel funcional crítico de ABCB5 y, por lo tanto, de las células madre mesenquimatosas ABCB5+, en la cicatrización normal de heridas cutáneas.

Ejemplo 4: Efecto de las MSC dérmicas ABCB5+ sobre la cicatrización de heridas regenerativa en ratones NSG.

Los inventores investigaron el efecto de las MSC dérmicas ABCB5+ humanas sobre la cicatrización de heridas en ratones NSG tratados con INTEGRA® utilizando los siguientes cuatro grupos de tratamiento: (1) ningún tratamiento; (2) INTEGRA® solamente; (3) INTEGRA® inyectado con 1x106 MSC dérmicas ABCB5+ y (4) iNt EGRA® inyectado con 1x106 células dérmicas positivas para ABCB5 (Figura 10B). Se generaron heridas cutáneas de espesor completo en todos los animales retirando 1 cm2 de piel y panículo como se describe en la Figura 6. Cada herida de los grupos 2, 3 y 4 fue inmediatamente trasplantada con injerto INTEGRA® de 1 cm2, seguido de inyección de intra-INTEGRA® de 1x106 células ABCB5+ (grupo 3) o 1x106 células ABCB5- (grupo 4). No se inyectaron células en el grupo experimental 2. El grupo 1 sirvió como control experimental sin tratamiento. Al día 14 después del procedimiento, se recolectaron los tejidos de la herida, compuestos por INTEGRA®, la piel circundante y el tejido muscular subyacente. El espesor del estroma inflamatorio se midió en todos los grupos en secciones de la herida escaneadas teñidas con H&E el día 14 utilizando el software Aperio Image Scope (Vista, CA). Los análisis cuantitativos revelaron que los ratones tratados con INTEGRA® y MSC dérmicas ABCB5+ humanas mostraron una disminución significativa del espesor del estroma inflamatorio en comparación con los ratones tratados con INTEGRA® y células dérmicas ABCB5-(608,0 ± 46,7 pm frente a 855,4 ± 69,8 pm, media ± SEM, P = 0,009), ratones tratados con INTEGRA® solo (874,7 ± 43,3 pm, P = 0,0001), o ratones no tratados (1014 ± 49,4 pm, P < 0,0001). No se observaron diferencias entre los ratones tratados con INTEGRA® solo y los ratones tratados con INTEGRA® y células dérmicas ABCB5-. El tratamiento con INTEGRA® solo redujo modestamente el espesor del estroma inflamatorio en comparación con las heridas no tratadas (Figura 10A). Para garantizar la viabilidad de la población de células humanas inyectadas, además, se examinaron los injertos para determinar la expresión de p2-microglobulina específica para humanos (p2M), un identificador de todas las células de origen humano. La inmunotinción reveló la presencia de grupos de células humanas p2M+ así como células humanas p2M+ individuales (Figura 10C) en injertos INTEGRA® inyectados con células. Los análisis de PCR en tiempo real de injertos INTEGRA® inyectados con células dérmicas humanas ABCB5+ o ABCB5-también demostraron la expresión de transcritos GAPDH y p2M específicas para humanos, que no han sido detectables, como cabía esperar, en controles no inyectados tratados con INTEGRA® solamente (Figura 10D). Por consiguiente, a pesar del injerto con éxito y la persistencia de MSC dérmicas ABCB5+ viables o células dérmicas ABCB5- viables después de la inyección en matrices INTEGRA® trasplantables, solo trasplante de MSC dérmicas ABCB5+, pero no células dérmicas humanas ABCB5- redujeron aún más el espesor del estroma inflamatorio en ratones n Sg heridos, proporcionando una prueba de principio inicial para la utilidad terapéutica específica de esta nueva población de MSC para mejorar aún más la cicatrización regenerativa de heridas.

Ejemplo 5: Modelo de ratón humanizado

Si bien los modelos de ratón se emplean ampliamente para el estudio de enfermedades humanas, existen diferencias sustanciales en el proceso de cicatrización de heridas entre especies humanas y no humanas31. Por esta razón, se utilizó un modelo alternativo en el que se trasplantan injertos de piel humana de espesor completo en ratones inmunodeficientes32 En este modelo, los injertos de piel se parecen mucho a la piel humana histológicamente y mantienen su fenotipo humano durante al menos 3 meses. Las muestras de piel de adulto normal descartadas extraídas durante la cirugía plástica se utilizaron para injertos de piel humana en ratones NSG inmunodeficientes de 8 semanas de edad (Figura 11A, B). La herida del xenoinjerto de piel humana dio como resultado un patrón de cicatrización de herida humana normal como se muestra en la Figura 11C.

De manera adicional, los efectos del trasplante de armazón INTEGRA® sobre la cicatrización regenerativa de heridas en pacientes humanos se examinaron en biopsias obtenidas de heridas no injertadas (Figura 12, paneles superiores) o de heridas de pacientes humanos trasplantados con injertos de armazón INTEGRA® (Figura 12, paneles inferiores). Los análisis comparativos revelaron perfiles inmunohistoquímicos de respuestas de cicatrización como consecuencia de la formación de cicatrices (sin INTEGRA®, Figura 12, paneles superiores) o regeneración inducida por el armazón, caracterizado por el realineamiento de miofibroblastos que expresan actina y una expresión notablemente mejorada de células dérmicas ABCB5+ en heridas que llevan el armazón (INTEGRA®, Figura 12, paneles inferiores).

Estos resultados muestran que el injerto de armazón INTEGRA® y la movilización resultante de MSC dérmicas ABCB5+ inducen preferentemente la cicatrización regenerativa de heridas en contraposición a la cicatrización de heridas a través de la formación de cicatrices. Por consiguiente, las MSC dérmicas ABCB5+ humanas mejoran de forma significativa y selectiva la cicatrización regenerativa de heridas mediada por INTEGRA® (Figura 10) y demuestra la eficacia terapéutica del coinjerto de MSC dérmicas ABCB5+ humanas/INTEGRA® en los experimentos de cicatrización de heridas cutáneas humanas más relevantes desde el punto de vista traslacional.

Se requieren células madre mesenquimatosas dérmicas para proporcionar un equilibrio mediante el cual las respuestas de cicatrización normales se produzcan de manera ordenada, lo que da como resultado el cierre gradual de la herida y la formación de cicatrices fisiológicas. Los inventores prevén que la función alterada de las células madre dérmicas en ratones Abcb5 KO conducirá a respuestas anormales de cicatrización de heridas, que puede ser una cicatrización insuficiente o una cicatrización excesiva. La cicatrización deficiente podría manifestarse como pérdida de tejido subcutáneo como se observa en la úlcera de decúbito o fallo de reepitelización como se observa en la úlcera venosa o como combinación de necrosis-infección como se observa en la úlcera diabética. Histológicamente, la cicatrización deficiente de las heridas podría caracterizarse por una infiltración neutrofílica excesiva y un aumento de la secreción de MMP-9 colagenasa que conduce a la destrucción del colágeno3. Al contrario, las cicatrices hipertróficas se caracterizan por un aumento de la deposición de colágeno debido a una respuesta inflamatoria amplificada con la sobreproducción resultante de factores de crecimiento, incluido TGF-p58.

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Habiendo descrito así varios aspectos de al menos una realización de la presente invención, se aprecia que los expertos en la técnica idearán fácilmente diversas alteraciones, modificaciones y mejoras. En consecuencia, la descripción anterior y los dibujos son solamente a modo ilustrativo.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un armazón de cicatrización de heridas compuesto por un armazón de colágeno y glucosaminoglicano coinjertado con una población de células madre, en donde la población de células madre se caracteriza por:

a) al menos el 80 % de la población de células madre son células madre ABCB5+;

b) la población de células madre son células madre oculares ABCB5+, en donde la población celular está libre de células no oculares o

(c) siendo una población de células madre ABCB5+ aisladas de un tejido de un sujeto, en donde las células madre ABCB5+ han sido separadas de otras células en el sujeto usando un anticuerpo específico para ABCB5.

2. El armazón de la reivindicación 1, en el que al menos el 85 % o el 90 % de la población de células madre son células madre ABCB5+.

3. El armazón de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el armazón es una matriz porosa de colágeno reticulado y glucosaminoglicano y en donde opcionalmente el colágeno es colágeno de tendón bovino.

4. El armazón de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el armazón incluye una capa semipermeable que es opcionalmente polisiloxano (silicona).

5. El armazón de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el armazón es un armazón de malla.

6. El armazón de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el armazón tiene un tamaño de poro de aproximadamente 10-500 micrómetros, 50-350 micrómetros o 70-200 micrómetros.

7. El armazón de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además al menos una molécula bioactiva eficaz para mejorar la cicatrización de heridas.

8. Un armazón de cicatrización de heridas de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en la estimulación de la cicatrización de heridas, en donde una herida se pone en contacto con el armazón de cicatrización de heridas con el fin de estimular la cicatrización.

9. El armazón de cicatrización de heridas para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la herida es una quemadura o una úlcera diabética.

10. El armazón de cicatrización de heridas para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde con el armazón se usa terapia de presión negativa para heridas.

11. Un armazón de cicatrización de heridas para su uso en la estimulación de la cicatrización de heridas, en donde una herida se pone en contacto con el armazón de cicatrización de heridas, en donde el armazón comprende un armazón de colágeno glucosaminoglicano coinjertado con una población de células madre ABCB5+ aisladas del ojo, en donde la población celular está libre de células no oculares y, en donde la herida es una herida ocular.