ES2885550T3 - Fragmentos de periostina y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, o variantes del mismo, donde dicha variante tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de esas secuencias por una o más deleciones o sustituciones conservadoras y donde la secuencia de esas variantes es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos original.

Description

DESCRIPCIÓN

Fragmentos de periostina y uso de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de los marcadores biológicos y en particular a los marcadores biológicos de enfermedades metabólicas óseas como la osteoporosis. En particular, la invención se refiere a procedimientos útiles para el tratamiento y diagnóstico de pacientes con riesgo de osteoporosis y el seguimiento de la progresión del tratamiento de los mismos.

Antecedentes de la invención

El periostio cubre los huesos largos y juega un papel importante en el control del diámetro y la resistencia ósea; sin embargo, aún no se han desarrollado procedimientos no invasivos de evaluación del metabolismo perióstico (Contie et al., 2010, Calcif. Tissue Int., 87(4): 341-50; Garnero, 2014, Bone, 66: 46-55). La periostina (POSTN) es una proteína de ácido gamma-carboxiglutámico matricelular de 90 KDa expresada preferentemente en el periostio y las células madre mesenquimatosas óseas, pero también en tejidos ricos en colágeno sometidos a tensión mecánica, como ligamentos periodontales, válvulas cardíacas, tendones y piel (Contie et al., 2010, supra; Merle et al., 2012, Osteoporos. Int., 23: 1199-212). La periostina, inicialmente conocida también como factor 2 específico de osteoblastos, es una proteína de 811 aminoácidos que comprende un péptido señal secretor N-terminal, seguido de un dominio rico en cisteína Emilina (EMI), cuatro repeticiones homólogas internas llamadas Fasciclina-1 (FAS-1) y un dominio variable e hidrófilo C-terminal (Merle et al., 2012, supra). La periostina es un importante regulador de la actividad osteoblástica, la formación ósea y la regulación de la fuerza ósea al regular la reticulación del colágeno, en particular en los sitios corticales y también la actividad osteoclástica al aumentar la osteoprotegerina, pero no es específica del tejido óseo. POSTN existe en distintas formas debido al empalme alternativo (7 isoformas), gamma-carboxilación y dimerización, actualmente no se sabe si una de las isoformas podría ser específica solo para tejido óseo (Merle et al., 2012, supra). Se han obtenido algunos datos sobre la función de POSTN en el metabolismo óseo a partir del examen de ratones deficientes en POSTN (Bonnet et al., 2009, J. Biol. Chem., 284: 35939-50). Estos ratones desarrollan periodontitis y osteoporosis con menor densidad mineral ósea (BMD, del inglés bone mineral density), microarquitectura alterada y disminución de la resistencia ósea. Este estudio también ha demostrado que POSTN es un mediador importante de los efectos de los factores mecánicos y la hormona paratiroidea sobre la BMD cortical y la fuerza ósea al modular la vía de señalización wnt canónica con una regulación a la baja de la expresión de esclerostina (Bonnet et al., 2009, supra). POSTN se secreta por osteocitos, osteoblastos y en baja medida por osteoclastos y se ha propuesto que es un posible marcador óseo de parámetros de estructura cortical (Garnero, 2014, supra). Debido a que POSTN es una proteína secretada, se puede detectar, p. ej., en sangre periférica y, por tanto, se han desarrollado inmunoensayos POSTN para roedores (Contie et al. 2010, supra) y humanos (Anastasilakis et al. 2014, Horm. Metab. Res., 46: 145­ 9). Sin embargo, estos ensayos detectan los niveles de POSTN en suero independientemente de su origen o tipo de isoforma y, por lo tanto, no son específicos. Se han desarrollado varios anticuerpos dirigidos a distintos epítopos POSTN como se representa en la figura 1: anticuerpos policlonales contra POSTN humana (Uscn Life Science, Inc .; N.° de producto: SEH339Hu) se dirigen a la región de los aminoácidos 97-230 (FAS 1-1) y anticuerpos monoclonales contra POSTN humana y de ratón (Adipogen AG.; N.° de producto: BI-20433) se dirigen a la región de los aminoácidos 234-365 (FAS 1-2). Sin embargo, esos anticuerpos no reconocen una isoforma específica de POSTN ni un fragmento específico de tejido. Entre los marcadores bioquímicos identificados del metabolismo óseo, CTX (telopéptido C-terminal reticulado del colágeno tipo I) se usa como marcador de resorción ósea y P1NP (propéptido N-terminal de procolágeno tipo 1) se usa como marcador de remodelado óseo. Sin embargo, esos marcadores no son específicos de los compartimentos trabecular/cortical. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar marcadores y desarrollar ensayos dirigidos a la evaluación del metabolismo del hueso cortical que sean más específicos que la detección de los niveles totales de POSTN en suero. Además, actualmente no existen agentes anabólicos capaces de aumentar la formación de hueso trabecular, excepto la hormona paratiroidea (PTH, del inglés parathyroid hormone), que es conocida por tener efectos secundarios graves. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar herramientas para la monitorización de los compartimentos trabecular/cortical con vistas a la identificación de agentes anabólicos alternativos.

El documento US 2011/033516 se refiere a un ácido nucleico aislado y/o una partícula de virus que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína periostina o un fragmento biológicamente activo de la misma y/o un péptido aislado o una combinación de los mismos.

El documento WO 2008/021290 se refiere a un panel de diagnóstico que comprende una pluralidad de reactivos de detección en el que cada reactivo de detección es específico para una proteína específica de un órgano.

Garnero, 2014, bone 66: 46-55 revisa marcadores bioquímicos establecidos y nuevos marcadores biológicos del metabolismo óseo y analiza sus limitaciones.

Duong et al., 2016, CALCIFIED TISSUE INTERNATIONAL 98(4): 381-397 revisa una clase de medicamentos para tratar la osteoporosis que inhibe la CatK en los osteoclastos y el nuevo mecanismo o mecanismos de este objetivo en la regulación de la resorción y formación de hueso.

La catepsina K (CatK) es una enzima, específicamente una proteasa, que se define por su alta especificidad por las cininas y está implicada en el metabolismo óseo. Es una enzima lisosomal sintetizada como procatepsina K, que se activa en los lisosomas mediante un procedimiento que implica la escisión autocatalítica a pH bajo y a continuación se libera en las lagunas de resorción (Dodds et al., 2001, J. Bone Miner. Res., 16: 478-86). La catepsina K es una de las principales enzimas catalíticas expresadas y secretadas por los osteoclastos. Es fundamental en la resorción ósea mediada por osteoclastos, ya que desempeña un papel predominante en la degradación del colágeno óseo tipo I (Garnero, 2014, supra). En consecuencia, la vía metabólica de CatK se convirtió en un objetivo farmacológico en el tratamiento de la osteoporosis, p. ej., se han desarrollado inhibidores de CatK, como el odanacatib (Helali et al., 2013, Curr. Drug Targets, 14: 1591-600).

Independientemente, algo de CatK puede liberarse más en la circulación y, por lo tanto, se especuló que era un marcador biológico de la actividad de los osteoclastos. Se han desarrollado varios ensayos para la detección de CatK en sangre, aunque no está claro si detectan la proenzima, la forma activa o ambas (Garnero, 2014, supra). Mediante el uso de tales pruebas, se ha demostrado que la CatK sérica aumenta en pacientes con osteoporosis (Meier et al., 2006, Clin. Lab, 52: 1-10). Además, mediante el uso de un ensayo dirigido a detectar solo la forma activa de la CatK, no se pudo observar ningún cambio en el suero de los niveles de catepsina K activa en mujeres postmenopáusicas tratadas con terapia antirresortiva (Sun et al., 2013, Clin. Biochem., 46: 1606-6). Los inhibidores de la catepsina K se desarrollan actualmente para el tratamiento de la osteoporosis y otros trastornos esqueléticos asociados con una remodelación ósea excesiva (Odanacatib, Merck & Co., Inc.) pero los biomarcadores actualmente disponibles no ofrecen una herramienta adecuada para controlar los efectos de esos inhibidores en la actividad remodeladora en los compartimentos trabecular/cortical.

Por tanto, actualmente es de interés desarrollar ensayos que midan marcadores específicos de la actividad de la catepsina K en relación con la estructura cortical ósea con el fin de monitorizar el metabolismo fisiopatológico del hueso en pacientes con trastornos óseos o en riesgo de desarrollarlos y/o monitorizar el efecto de tratamientos de trastornos óseos metabólicos.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en el hallazgo inesperado de que POSTN es un sustrato para la degradación mediada por CatK que está restringida a los huesos, específicamente a la región cortical ósea. Por tanto, los productos de escisión dependientes de CatK (fragmentos de POSTN) podrían servir como biomarcadores de cambios metabólicos óseos relacionados con trastornos óseos como la osteoporosis.

En particular, se han identificado fragmentos de POSTN que son específicos del tejido óseo en contraposición a POSTN intacta. Más en particular, la invención se basa en el hallazgo de marcadores de la calidad ósea, en particular en términos de microestructura cortical y matriz ósea, marcadores que pueden usarse como indicadores predictivos fiables del riesgo de fractura en un sujeto. La presente invención está dirigida a un procedimiento de detección de fragmentos de POSTN de una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero y anticuerpos, ensayos y kits relacionados adecuados para el diagnóstico de pacientes con riesgo de desarrollar un trastorno óseo metabólico como la osteoporosis y monitorizar el efecto de un tratamiento de los mismos.

Un aspecto de la invención proporciona un fragmento de POSTN peptídica aislada o variantes de la misma. Otro aspecto de la invención se refiere a un fragmento de POSTN peptídica aislada o variantes de la misma, o una formulación de la misma según la invención para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno óseo metabólico como la osteoporosis.

Otro aspecto proporciona un procedimiento para producir fragmentos de POSTN o variantes de los mismos que comprende incubar POSTN con CatK.

Otro aspecto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un fragmento de POSTN o una variante del mismo como se describe en esta invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo específico para el fragmento de POSTN o una variante del mismo.

Otro aspecto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo tal y como se describe en esta invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende dicha molécula de ácido nucleico, y a una célula huésped que comprende dicho vector recombinante, respectivamente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para producir anticuerpos o fragmentos de los mismos como se describe a continuación que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos en condiciones suficientes para promover la expresión de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos.

El siguiente aspecto de la invención proporciona un procedimiento para detectar un fragmento de POSTN a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto mamífero;

(b) poner dicha muestra de fluido biológico en contacto con una matriz sólida a la que se une al menos un anticuerpo, en el que el contacto es en condiciones suficientes para unir un fragmento de POSTN de esta invención en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un anticuerpo mediante interacciones antígeno- anticuerpo y en las que dicho al menos un anticuerpo es específico para el fragmento de POSTN de la invención o cualquier variante del mismo;

(c) retirar la muestra de fluido biológico de la matriz sólida para retirar todos los fragmentos de POSTN no unidos de la invención de la superficie de dicha matriz sólida;

(d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida, donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene uno o más fragmentos de POSTN de la invención.

El siguiente aspecto de la invención proporciona un procedimiento para detectar un fragmento de POSTN a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto mamífero;

(b) poner dicha muestra de fluido biológico en contacto con al menos un anticuerpo, en el que el contacto es en condiciones suficientes para unir un fragmento de POSTN de esta invención en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un anticuerpo mediante interacciones antígeno-anticuerpo y en las que dicho al menos un anticuerpo es específico para el fragmento de POSTN de la invención o cualquier variante del mismo;

(c) poner en contacto la muestra obtenida en la etapa b) con una matriz sólida a la que se une al menos un fragmento de POSTN de la invención, donde el contacto se realiza en condiciones suficientes para unir un anticuerpo específico para el fragmento de POSTN de la invención presente en dicha muestra a dicho al menos un fragmento de POSTN de la invención a través de interacciones antígeno-anticuerpo;

(d) lavar la matriz sólida para retirar todos los anticuerpos no unidos de la superficie de dicha matriz sólida; (e) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida, donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene uno o más fragmentos de POSTN de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar un fragmento de POSTN a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto mamífero;

(b) proporcionar un soporte sólido que tiene unido al mismo al menos un fragmento de POSTN de la invención; (c) poner dicho soporte sólido en contacto con dicha muestra de fluido biológico;

(d) poner dicho soporte sólido en contacto con al menos un anticuerpo específico para el fragmento de POSTN de la invención o cualquier variante del mismo, donde el contacto se realiza en condiciones suficientes para unir un fragmento de POSTN de la invención presente en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un anticuerpo a través de interacciones antígeno-anticuerpo;

(e) lavar la matriz sólida para retirar todos los anticuerpos no unidos de la superficie de dicha matriz sólida; (f) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida, donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene uno o más fragmentos de POSTN de la invención.

En otro aspecto, se puede preparar un inmunoensayo para la detección de un fragmento de POSTN de la invención que comprende al menos un anticuerpo según la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para detectar un fragmento de POSTN de la invención en una muestra de fluido biológico, donde el kit comprende al menos un anticuerpo según la invención o una variante del mismo.

Según otro aspecto, los fragmentos de POSTN de la invención pueden ser útiles en un procedimiento de monitorización de los efectos de un tratamiento de trastornos metabólicos óseos, donde dicho procedimiento comprende la detección de un fragmento de POSTN de la invención en una muestra de fluido biológico de un sujeto en tratamiento.

Según otro aspecto, los fragmentos de POSTN de la invención pueden ser útiles en un procedimiento de diagnóstico de sujetos con riesgo de desarrollar un trastorno óseo metabólico tal como osteoporosis, donde dicho procedimiento comprende la detección de un fragmento de POSTN de la invención.

Según otro aspecto, los fragmentos de POSTN de la invención pueden usarse en un procedimiento indirecto de evaluación del volumen y la porosidad del hueso cortical que comprende la detección de un fragmento de POSTN de la invención.

Descripción de las figuras

La figura 1 es una representación esquemática de la secuencia de aminoácidos de POSTN con sus distintos dominios:

el dominio EMI, los cuatro dominios FAS y la región variable C terminal (C-Term). Los números indican posiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de POSTN madura. La señal del péptido en el N terminal se indica como escindida. Ab1: anticuerpos comerciales contra POSTN humana (USCN) dirigidos a 97-230 (FAS 1-1), Ab2: anticuerpos comerciales contra POSTN humana y de ratón (Adipogen AG) dirigidos a 234-365 (FAS 1-2).

La figura 2 muestra el gel SDS-PAGE de POSTN humana digerido con CatK (A-B). A : Digestión que dura 1 h, 2 h, 3 h o toda la noche con una relación POSTN/CatK constante de 50:1 como se describe en el Ejemplo 1. Se indica el peso molecular (MW, del inglés molecular weight) en kDa de péptidos. B: Digestión de una cantidad constante de POSTN durante 4 h, a 37°, con una cantidad creciente de CatK; se indican las relaciones POSTN/CatK que varían entre 1000:1 y 11:1. A-B: Los fragmentos de POSTN se visualizaron mediante tinción con plata; la banda dominante de alrededor de 90 kDa corresponde a POSTN.

La figura 3 muestra veintiún fragmentos de POSTN distintos separados en un único análisis LC-MS/MS como se describe en el Ejemplo 2. A : Las secuencias de los fragmentos de POSTN identificados se indican en la señal correspondiente. Se indica el % relativo de absorbancia. B: Medición LC-MS/MS de los dos principales fragmentos de POSTN de escisión de CatK obtenidos con una relación POSTN/CatK que varía entre 250:1 y 5:1. 1- Péptido 1 (SEQ

ID NO: 2), 2- Péptido 2 (SEQ ID NO: 3), 3- Péptido 3 (SEQ ID NO: 4), 4- Péptido 4 (SEQ ID NO: 5), 5- Péptido 5 (SEQ

ID NO: 6), 6-Péptido 6 (SEQ ID NO: 7), 7- Péptido 7 (SEQ ID NO: 8), 8- Péptido 8 (SEQ ID NO: 9), 9-Péptido 9 (SEQ

ID NO: 10), 10- Péptido 10 (SEQ ID NO: 11), 11- Péptido 11 (SEQ ID NO: 12), 12- Péptido 12 (SEQ ID NO: 13), 1 Péptido 13 (SEQ ID NO: 14), 14- Péptido 14 (SEQ ID NO: 15), 15- Péptido 15 (SEQ ID NO: 16), 16- Péptido 16 (SEQ

ID NO: 17), 17- Péptido 17 (SEQ ID NO: 18), 18- Péptido 18 (SEQ ID NO: 22), 19- Péptido 19 (SEQ ID NO: 23), 2 Péptido 20 (SEQ ID NO: 24), 21- Péptido 21 (SEQ ID NO: 25).

La figura 4 muestra la evolución temporal de la aparición de los fragmentos de POSTN entre 15 min y 2 h durante la digestión de POSTN dependiente de CatK como se describe en el Ejemplo 3, a una relación POSTN/CatK de 50:1. A :

el área punteada se muestra en el panel B. Fragmentos de POSTN indicados como en la figura 3.

La figura 5 muestra una descripción general de los sitios de fragmentos de POSTN de escisión de CatK en POSTN humana (A) y su abundancia medida mediante LC-MS/MS (B).

La figura 6 muestra la inmunotinción de osteocitos y el sistema lacuno-canalicular de hueso de ratón detectado en presencia de anti-SEQ ID NO: 2 como se describe en el Ejemplo 6. control; B: en presencia de anti-SEQ ID NO: 2 anticuerpos en 1/200000; C: en presencia de anti-SEQ ID NO: 2 anticuerpos en 1/10000.

La figura 7 muestra la curva estándar de ELISA (OD a 450 nm frente a la concentración de péptido 1 [c] en ng/ml) como se describe en el Ejemplo 7.

La figura 8 muestra la lectura de la prueba ELISA (OD a 450 nm frente a la concentración de péptido [c] en ng/ml) descrita en el Ejemplo 7 para el péptido 1 (rombo), péptido de control de SEQ ID NO: 20 (cuadrado), péptido de control de SEQ ID NO: 21 (triángulo) y POSTN (SEQ ID NO: 1, cruz).

La figura 9 representa los niveles séricos del péptido 1 [c1 ] frente a los niveles séricos de sPOSTN [c2] (ng/ml) medidos en el Ejemplo 8.

La figura 10 muestra la zona Ct. tibial y la distribución de la rigidez del tercil bajo, medio y alto de sPOSTN (A, B) y la relación entre péptido 1 y sPOSTN (C, D) como se describe en el Ejemplo 9.

La figura 11 representa los niveles séricos del péptido 1 [c1] frente a los niveles séricos de sPOSTN [c2] en ng/ml medidos con los kits comerciales 1 (A , n = 324) o 2 (B, n = 176) como se describe en el Ejemplo 11.

La figura 12 muestra la comparación de curvas ROC para A: BMD del cuello femoral (a Uc = 0,555; gris) frente a la

BMD del cuello femoral y péptido 1 (AUC = 0,692; negro) p = 0,005; B: FRAX (AUC = 0,667; gris) frente a FRAX y péptido 1 (AUC = 0,730; negro) como se describe en el Ejemplo 12.

Descripción detallada

Por «polipéptido» se entiende un péptido, un oligopéptido, un oligómero o una proteína que comprende al menos dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico normal o modificado, tal como en el caso de los péptidos isostéricos, por ejemplo. Un polipéptido puede estar compuesto por aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos definidos por el código genético. Un polipéptido puede estar compuesto igualmente por aminoácidos modificados por procesos naturales, tales como procesos de maduración postraduccionales o por procesos químicos, que se conocen bien por un experto en la técnica. Dichas modificaciones están completamente detalladas en la bibliografía. Estas modificaciones pueden aparecer en cualquier parte del polipéptido: en el esqueleto peptídico, en la cadena lateral o incluso en los extremos carboxi o amino terminales. Por ejemplo, se entiende que las modificaciones de polipéptidos incluyen fosforilaciones, glicolización, isomerización, gamma carboxilación, dimerización. Dichas modificaciones se detallan completamente en la bibliografía (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2a Ed., T.E. Creighton, Nueva York; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva

York; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646 y Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62).

El término «periostina», abreviado «POSTN», también conocido como factor 2 específico de osteoblastos, es una

proteína matricelular polipeptídica del ácido gammacarboxiglutámico expresada preferentemente en el periostio y en las células madre mesenquimatosas óseas. POSTN también se puede expresar en tejidos ricos en colágeno sometidos a tensión mecánica, como ligamentos periodontales, válvulas cardíacas y tendones. POSTN es una proteína de 811 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que comprende un péptido señal secretor N-terminal, seguido de un dominio rico en cisteína Emilina (EMI), cuatro repeticiones homólogas internas denominadas dominios Fasciclina-1 (FAS-1) y un dominio hidrófilo C-terminal y un dominio variable. La POSTN humana recombinante (Horiuchi et al., 1999, J Bone Miner Res 14: 1239) comprende un péptido señal secretor N-terminal (residuos 1-21 de SEQ ID NO: 1) que no está presente en la forma madura de POSTN, dominio EMI (residuos 40-94 de SEQ ID NO: 1), 4 de los dominios FAS-1 (respectivamente residuos 97-230, 234-365, 368-492 y 496-628 de SEQ ID NO: 1) y dominio variable C-terminal (residuos 628-836 de SEQ ID NO: 1), figura 1. El término «fragmento de periostina» o «fragmento de POSTN» se refiere a un fragmento de POSTN polipeptídica según la invención obtenido después de la degradación ósea dependiente de CatK.

El término «catepsina K», abreviado «CatK», como se denomina en esta invención, significa una enzima de referencia EC:3.4.22.38, específicamente una proteasa, que se define por su alta especificidad por las cininas y está implicada en la resorción ósea. CatK cataboliza elastina, colágeno y gelatina y le permite descomponer huesos y cartílagos. CatK se expresa alta y selectivamente por los osteoclastos y es fundamental en la resorción ósea mediada por osteoclastos. Se proporciona una secuencia de ejemplo de CatK humana como SEQ ID NO: 19.

El término «aislado/a» se usa para indicar que la molécula está exenta de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, como un producto de la purificación. Se entiende por «polinucleótido aislado» o «polipéptido aislado» un polipéptido tal como un fragmento de POSTN que se aísla del cuerpo humano o se produce de otro modo mediante un procedimiento técnico.

El término «variante» como se hace referencia en esta invención, significa un polipéptido sustancialmente homólogo a la secuencia peptídica original, pero que tiene al menos una secuencia de aminoácidos distinta de la secuencia original debido a una o más deleciones, o sustituciones conservadoras y donde la secuencia de aminoácidos variante es al menos en un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a las secuencias aminoacídicas originales, como se describe anteriormente. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede determinar mediante inspección visual y/o cálculo matemático, o más fácilmente comparando la información de las secuencias usando un programa informático conocido utilizado para la comparación de secuencias tal como el paquete Clustal versión 1.83. Una variante puede comprender una secuencia que tiene al menos un aminoácido sustituido conservativamente, lo que significa que un residuo de aminoácido dado se reemplaza por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. En general, las sustituciones para uno o más aminoácidos presentes en el polipéptido original deben hacerse de manera conservadora. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Se conocen bien otras sustituciones conservadoras de este tipo, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares (Kyte, et al., 1982, J. MoI. Biol., 157: 105-131). Por ejemplo, una «sustitución conservadora de aminoácidos» puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácidos nativo con un residuo no nativo de tal manera que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácidos en esa posición. Los expertos en la materia pueden determinar las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservadoras o no conservadoras) en el momento en que se deseen dichas sustituciones. En la Tabla 1, a continuación, se presentan sustituciones de aminoácidos ejemplares:

Tabla 1

La expresión «muestra de fluido biológico» se refiere a una muestra clínica de fluido para pruebas que se toma de un fluido corporal de un mamífero tal como saliva, médula ósea, sangre, líquido pleural, sudor y orina. Por ejemplo, una muestra de fluido biológico es una muestra de suero/plasma de un sujeto humano.

La expresión «muestra de control» se refiere a una muestra de control positivo o de control negativo. Una muestra de control negativo incluye una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto que es de la misma especie o una homóloga al sujeto que se va a someter a ensayo para la determinación de fragmentos de POSTN y se sabe que tiene un estado biológico normal, p. ej., sin fragmentos de POSTN detectables o una solución que no contiene fragmentos de POSTN que son inmunorreactivos con al menos un anticuerpo según la invención. Una muestra de control negativo incluye una muestra tomada de un sujeto de control. Una muestra de control positivo incluye una muestra de fluido corporal tomada de un sujeto que es de la misma especie o una homóloga al sujeto que se va a someter a ensayo para la determinación de fragmentos de POSTN y se sabe que tiene fragmentos de POSTN según la invención o una solución que contiene fragmentos de POSTN que son inmunorreactivos con al menos un anticuerpo según la invención.

El término «anticuerpo» como se menciona en el presente documento designa un polipéptido que se une a un antígeno. Esto incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno. El término «anticuerpo» se usa en su sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos adicionales modificados por ingeniería genética, siempre que se conserven las propiedades características de la invención, en particular, la capacidad de unión al antígeno diana, más específicamente al epítopo del fragmento de POSTN como el reconocido por los anticuerpos de la invención. Los ejemplos de anticuerpos y fragmentos de los mismos incluyen un fragmento de dominio variable («Fv», que consiste en los dominios VH y VL de un solo brazo de un anticuerpo), fragmento Fab (fragmento monovalente que consiste en los dominios VH, VL, CH1 y CL), Fragmento Fab2 (bivalente), fragmento Fab3 (trivalente), fragmento Fab' (Fab con región bisagra), fragmento F(ab')2 (fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra), fragmento Fd (que consiste en los dominios VH y CH1), rIgG (IgG reducida o media IgG), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio (dAb), anticuerpos monovalentes, anticuerpos divalentes o multivalentes que comprenden un fragmento de más de un anticuerpo, fragmento variable monocatenario (ScFv), bis-scFv (biespecífico), y derivados de anticuerpos tales como fragmentos Fv estabilizados con disulfuro, péptidos que comprenden CDR, así como fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores (Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23(9): 1126-1136). Un anticuerpo se refiere a una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). En los mamíferos, la cadena pesada puede ser alfa (a), delta (5), épsilon (e), gamma (y) o mu (p), que define la clase de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. En los mamíferos, la cadena ligera puede ser lambda (A) o kappa (k). En los mamíferos, dependiendo de la clase de anticuerpo, la región constante de cadena pesada comprende tres dominios de inmunoglobulina, CH1, CH2 y CH3 (para IgA, IgD, IgG) o cuatro dominios de inmunoglobulina, CH1, CH2, CH3 y CH4 (para IgE e IgM). La región constante de cadena ligera comprende un dominio de inmunoglobulina, CL. Un anticuerpo puede tener la estructura de una IgA, IgG, IgE, IgD e IgM, así como cualquier subtipo de la misma. Los anticuerpos pueden ser de cualquier fuente, incluyendo, en particular, primates (primates humanos y no humanos) y fuentes primatizadas. En particular, la fuente puede incluir animales que no sean primates, en particular conejos, ratones, ratas, donde los anticuerpos pueden obtenerse mediante tecnología de presentación en fagos.

El término «anticuerpo monoclonal», como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. El modificador «monoclonal» indica el carácter del anticuerpo según se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo por algún procedimiento particular.

El término «anticuerpo quimérico» generalmente se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable de una fuente o especie y al menos una porción de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, que se prepara usualmente mediante técnicas de ADN recombinante. Un ejemplo típico de anticuerpos quiméricos incluye aquellos que comprenden una región variable de ratón y una región constante humana.

El término «anticuerpo humanizado» designa anticuerpos de una especie no humana que tiene una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de dicha especie no humana y una región marco de una molécula de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender además uno o más residuos marco derivados de la especie no humana de la que se derivaron las CDR.

El término «anticuerpo humano» o «anticuerpo completamente humano» se refiere a anticuerpos en los que las regiones variables y las regiones constantes de las cadenas tanto pesada como ligera son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a las secuencias de origen humano, pero no necesariamente del mismo anticuerpo.

El término «anticuerpo aislado» se refiere a un anticuerpo que se ha separado de un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo aislado se ha purificado a más del 95 % o 99 % de pureza según lo determinado por los procedimientos en la técnica (véase, por ejemplo, Flatman et al., 2007, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 848: 79-87) incluyendo procedimientos electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa (cromatografía líquida de alto rendimiento).

Los términos «polinucleótido» o «molécula de ácido nucleico» se refieren a un polímero que comprende nucleótidos. Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico incluyen ADN, ARN, ácido nucleico bloqueado (LNA), ADN complementario (ADNc).

El término «epítopo» incluye cualquier determinante antigénico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo o fragmento de unión a antígenos del mismo. Un epítopo es una región de un antígeno que está unido por un anticuerpo. Algunos epítopos comprenden secciones discontinuas de la secuencia de aminoácidos del antígeno, donde los aminoácidos no contiguos se colocan cerca unos de otros por la configuración espacial del antígeno («epítopos conformacionales») o comprenden una sección de aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del antígeno («epítopos lineales»).

Como se usa en el presente documento, el término «unir» o «unión» de un anticuerpo a un antígeno diana significa una interacción o asociación al menos temporal de dicho anticuerpo con, o a, dicho antígeno diana (tal como fragmentos de POSTN) o con, o a, fragmentos de dicho antígeno diana que comprende un epítopo reconocido por dicho anticuerpo.

Los términos «se une selectivamente», «se une específicamente», «específico para», cuando se aplican a un anticuerpo, indican que el anticuerpo reconoce y/o se une preferentemente al polipéptido o epítopo diana, es decir, con una afinidad más alta que cualquier otro antígeno o epítopo, es decir, la unión al polipéptido diana puede discriminarse de la unión no específica a otros antígenos. La afinidad de unión de un anticuerpo puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard et al., 1949, Ann. N.Y. Acad. 1949. 51, 660-672).

Como se usa en esta invención, «afinidad de unión» por lo general se refiere a la constante de asociación aparente o «Ka». La Ka es el recíproco de la constante de disociación «Kd». La afinidad de unión se puede determinar mediante una variedad de procedimientos que incluyen diálisis en equilibrio, unión en equilibrio, filtración en gel, ELISA, resonancia de plasmón superficial o espectroscopia (p. ej., mediante un ensayo de fluorescencia). Las condiciones ejemplares para evaluar la afinidad de unión están en tampón TRIS (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM a pH 7,5). Estas técnicas se pueden usar para medir las concentraciones de proteína de unión libre y unida en función de la concentración de proteína de unión (o diana). La concentración de proteína de unión unida ([Bound]) está relacionada con la concentración de proteína de unión libre ([Free]) y la concentración de sitios de unión para la proteína de unión en la diana donde (N) es el número de sitios de unión por molécula diana mediante la siguiente ecuación: [Bound]=N x ([Free])/((1/Ka) [Free]). La comparación de afinidad entre dos anticuerpos puede establecerse sin determinar realmente el valor de Ka para cada anticuerpo, pero basándose en una medición cuantitativa de la afinidad (por ejemplo, por análisis ELISA o FACS) que es proporcional a la Ka, o una medición cualitativa de afinidad o una inferencia de afinidad (por ejemplo, en un ensayo funcional o en un ensayo in vitro o in vivo).

El término «matriz sólida» incluye todos los soportes en fase sólida adecuados para llevar a cabo un inmunoensayo o un procedimiento según la invención. Esto incluye perlas, micropartículas, nanopartículas, tubos, tejidos o placas, películas, portaobjetos, pocillos, construidos de, o revestidos con, vidrio, poliestireno, polipropileno, nitrocelulosa, cuarzo, cerámica, dextrano u otros materiales. Por ejemplo, la matriz sólida está en forma de pocillos de microtitulación, tal como una placa de microtitulación de 96 pocillos o una placa de microtitulación de 386 pocillos. La matriz sólida se puede recubrir con un agente de acoplamiento como avidina y estreptavidina.

La expresión «kit» comprende al menos un anticuerpo según la invención, o una variante del mismo o una combinación de mismo, como se describe en esta memoria, que se va a acoplar, o ya está acoplado, a una matriz sólida y opcionalmente material instructivo.

Como se usa en esta invención, una «enfermedad o trastorno metabólico de los huesos» se refiere a cualquier enfermedad o trastorno provocado por anomalías de minerales tales como calcio, fósforo, magnesio, vitamina D, función de la hormona paratiroidea (PTH) o mutaciones genéticas raras. Los ejemplos de enfermedad o trastorno metabólico de los huesos incluyen, entre otros, osteoporosis, osteomalacia (adultos), raquitismo (niños), osteítis fibrosa quística, enfermedad ósea de Paget, disfunción de la osteoclastogénesis, osteopetrosis y displasias óseas esclerosantes, osteodistrofia renal, displasia fibrosa, enfermedades óseas inducidas por cáncer, enfermedades de hiperparatiroidismo primario, osteoporosis idiopática juvenil y enfermedad de van Buchem.

Como se usa en esta invención, «osteoporosis» se refiere a una enfermedad en la que la disminución de la resistencia ósea aumenta el riesgo de fractura de un hueso. Ocurre debido al desequilibrio entre la resorción y la formación ósea. Se caracteriza además por una pérdida de densidad mineral ósea y alteraciones en la calidad del hueso (microestructura y propiedades del material) que conducen a fracturas por fragilidad.

El término «disfunción de la osteoclastogénesis», como se usa en esta invención, se refiere a cualquier afección relacionada con un aumento del recambio óseo o la resorción ósea de una causa secundaria como Paget, pérdida ósea resultante de inmovilización, metástasis ósea osteolítica, tumores óseos, pérdida ósea inducida por glucocorticoides, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo y diabetes.

El término «sujeto», como se emplea en esta memoria, se refiere a mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos contemplados en la presente invención incluyen humanos, primates, animales domésticos tales como perros, gatos, ganado bovino, ganado ovino, cerdos, caballos, roedores de laboratorio y similares.

El término «paciente» se refiere a un sujeto con una enfermedad o trastorno óseo metabólico, tal como osteoporosis.

El término «paciente/sujeto con riesgo de osteoporosis» se refiere a un sujeto con riesgo de desarrollar osteoporosis como se confirma, p. ej., mediante biomarcadores químicos o midiendo la densidad mineral ósea.

Como se usa en esta invención, «tratamiento» y «tratar» y similares generalmente significan obtener un efecto farmacológico y fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir o prevenir parcialmente una enfermedad, síntoma o afección de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad, afección, síntoma o efecto adverso atribuido a la enfermedad. El término «tratamiento» como se usa en esta invención cubre cualquier tratamiento de una enfermedad ósea metabólica o trastorno en un mamífero, en particular un ser humano, e incluye cualquier uso de cualquier fármaco que se dirija a las funciones de los osteoclastos u osteoblastos, incluidos los fármacos que se dirigen a la ruta metabólica de CatK, p. ej., inhibidores de CatK o fármacos dirigidos a la esclerostina. En particular, el tratamiento de una enfermedad o trastorno metabólico óseo en un mamífero, en particular un ser humano, puede incluir la administración de fragmentos peptídicos de POSTN.

El término «eficacia» de un tratamiento o procedimiento según la invención puede medirse basándose en cambios en el transcurso de la enfermedad o afección en respuesta a un uso o un procedimiento según la invención. Por ejemplo, la eficacia de un tratamiento o procedimiento según la invención se puede medir por su impacto en los signos o síntomas de una enfermedad. Se logra una respuesta cuando el paciente experimenta alivio parcial o total, o reducción de los síntomas no deseados de la enfermedad.

El término «cantidad eficaz» como se usa en esta invención se refiere a una cantidad de al menos un fragmento peptídico de POSTN, o una formulación farmacéutica del mismo, que provoca una reducción detectable de los síntomas de la enfermedad en un sujeto al que se le está administrando dicho fragmento peptídico de POSTN, estos síntomas pueden incluir, por ejemplo, aumento de la densidad ósea.

Fragmentos de POSTN

Según un aspecto, los fragmentos peptídicos de POSTN de la invención se pueden obtener después de la degradación dependiente de CatK de POSTN, en particular después de la degradación dependiente de CatK de POSTN humana, en particular POSTN recombinante humana. Según un aspecto, los fragmentos de POSTN de la invención se obtienen mediante un procedimiento in vitro de degradación dependiente de CatK.

Un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

En una realización particular, se proporciona un péptido aislado que consta de entre 6 y 20 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

En una realización particular, se proporciona un péptido aislado con un peso molecular que varía entre aproximadamente 600 y aproximadamente 2400 Da, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

En una realización particular, se proporciona un péptido aislado que consta de entre 6 y 20 aminoácidos con un peso molecular que varía entre aproximadamente 600 y aproximadamente 2400 Da, que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

En una realización adicional, se proporciona un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: Se Q ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 o variantes del mismo.

En una realización adicional, se proporciona un péptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

En una realización adicional, se proporciona un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: s Eq ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

En una realización adicional, se proporciona un péptido aislado que tiene al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad u homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. Según un aspecto de la invención, se proporciona un péptido aislado que tiene al menos un 8 % de identidad u homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

En otra realización adicional, se proporciona un péptido aislado según la invención que tiene una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 2 o una variante del mismo.

En otra realización adicional, se proporciona un péptido aislado según la invención que tiene una secuencia de aminoácidos, en la que al menos un aminoácido se añade o se elimina en el extremo C-terminal.

En otra realización adicional, se proporciona un péptido aislado según la invención que tiene una secuencia de aminoácidos, en la que al menos dos aminoácidos se añaden o se eliminan en el extremo C-terminal.

Procedimientos de producción de fragmentos de POSTN

Los procedimientos químicos de síntesis, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida, se pueden usar para sintetizar los polipéptidos según la invención. La purificación de esos péptidos se puede llevar a cabo por medio de cualquier técnica conocida en la técnica de la purificación de proteínas/péptidos. Las técnicas ejemplares incluyen la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y procedimientos de inmunoafinidad.

Según una realización, la invención proporciona un procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención que comprende incubar POSTN con CatK, en particular CatK humana, tal como CatK recombinante humana.

Según una realización, la invención proporciona un procedimiento para producir fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención que comprende incubar POSTN con CatK, donde POSTN y CatK están presentes en una proporción que varía entre aproximadamente 100:1 y aproximadamente 22:1, donde el procedimiento de incubación se realiza a una temperatura entre aproximadamente 19° y aproximadamente 38°, donde el tiempo de reacción es de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 h, y donde dicha reacción se realiza a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6.

Se entiende que tanto POSTN como CatK pueden ser sintéticas o derivadas de cualquier especie, en una realización preferida POSTN y CatK son POSTN y CatK humanas.

Según una realización, la invención proporciona un procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención que comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK de SEQ ID NO: 19.

Según otra realización, el procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK en una relación que varía entre aproximadamente 100:1 y aproximadamente 22:1.

El procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK en una proporción de 50:1.

El procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK a una temperatura entre aproximadamente 19 y aproximadamente 38 °C.

El procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK a una temperatura entre aproximadamente 35 y aproximadamente 38 °C.

El procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK a una temperatura de aproximadamente 37 °C.

Según una realización adicional, el procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 24 h.

Según una realización adicional, el procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK desde aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 5 h.

Según una realización adicional, el procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 60 minutos.

Según una realización adicional, el procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 30 minutos.

Según una realización adicional, el procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK a un pH de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6.

Según una realización adicional, el procedimiento de producción de fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención comprende incubar POSTN recombinante humana con CatK a un pH de aproximadamente 5,5.

Anticuerpos de unión de fragmentos de POSTN

En una realización de la invención se proporcionan anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos específicos para fragmentos de POSTN según la invención.

En una realización de la invención se proporcionan anticuerpos aislados específicos para fragmentos de POSTN de la invención.

En una realización alternativa de la invención se proporcionan anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos para fragmentos de POSTN de la invención, en particular fragmentos de POSTN humanas como se describe aquí.

En una realización alternativa de la invención se proporcionan anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, específicos para fragmentos de POSTN, en particular fragmentos de POSTN humanas, caracterizados además por su unión a un epítopo en fragmentos de POSTN, como se describe a continuación.

La proteína a la que se unen los anticuerpos según la invención o fragmentos de los mismos, a los fragmentos de POSTN de la invención de cualquier especie.

Los anticuerpos según la presente invención generalmente muestran una alta especificidad por fragmentos de POSTN humana de la invención.

En una realización adicional, se proporcionan anticuerpos aislados específicos para un péptido de entre 6 y 20 aminoácidos que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

En una realización particular, los anticuerpos según la invención, o fragmentos de los mismos, se unen preferentemente a los fragmentos de POSTN de la invención y muestran una unión débil, o virtualmente nula (es decir, insignificante o no detectable) a la POSTN completa.

Se entiende que cualquier variante de un anticuerpo según la invención, o fragmento del mismo, que se describe aquí, puede unirse a los fragmentos de POSTN de la invención. En una realización particular, dicha variante puede mostrar la misma o incluso mayor afinidad de unión por los fragmentos de POSTN de la invención, en comparación con el anticuerpo o fragmento parental del que deriva dicha variante.

Los anticuerpos según la invención pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y otros anticuerpos manipulados siempre que se conserven las propiedades características de la invención, en particular la capacidad de unirse al antígeno diana, más específicamente a los fragmentos de POSTN de la invención.

En una realización particular de la invención, los anticuerpos específicos para fragmentos de POSTN según la invención, o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a fragmentos de POSTN, son anticuerpos monoclonales.

En una realización particular de la invención, los anticuerpos específicos para fragmentos de POSTN según la invención, o fragmentos de los mismos, se unen específicamente a un fragmento de POSTN que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

En una realización particular de la invención, los anticuerpos específicos para fragmentos de POSTN según la invención, o fragmentos de los mismos, se unen específicamente a un fragmento de POSTN que consta de entre 6 y 20 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en : SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

En una realización particular de la invención, los anticuerpos específicos para fragmentos de POSTN según la invención, o fragmentos de los mismos, se unen específicamente a un fragmento de POSTN con un peso molecular que varía entre aproximadamente 600 y aproximadamente 2400 Da, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo formado por: SEQ ID NO: 2, Se Q ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

En una realización particular de la invención, los anticuerpos específicos para fragmentos de POSTN según la invención, o fragmentos de los mismos, se unen específicamente a un fragmento de POSTN que consta de entre 6 y 20 aminoácidos con un peso molecular que varía entre aproximadamente 600 y aproximadamente 2400 Da, que comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

En una realización preferida de la invención, los anticuerpos específicos para fragmentos de POSTN según la invención, o fragmentos de los mismos, se unen específicamente a péptidos que consisten o comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

En una realización más preferida de la invención, los anticuerpos específicos para el fragmento de POSTN según la invención, o fragmentos del mismo, se unen específicamente a un péptido de una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 2.

Los anticuerpos se pueden producir mediante técnicas estándar en el campo, incluida la recuperación de anticuerpos policlonales del suero de animales de laboratorio o de granja, o huevos de pollo que han sido inyectados con el antígeno de interés, la recuperación de anticuerpos monoclonales producidos mediante la fusión de células del bazo secretoras de anticuerpos de ratones, ratas o conejos inmunizados con células de mieloma inmortal para crear líneas celulares de hibridoma monoclonal que expresen el anticuerpo específico en el sobrenadante del cultivo celular. Alternativamente, se pueden producir anticuerpos recombinantes en diversas células hospedadoras, incluidas células de mamífero, células vegetales, bacterias, levaduras, que se hayan diseñado para expresar dichos anticuerpos.

En una realización particular de la invención, los anticuerpos específicos para fragmentos de POSTN según la invención, o fragmentos de los mismos, se producen inyectando fragmentos de POSTN sintéticos a conejos y recolectando suero del mismo en intervalos definidos.

En una realización particular de la invención, los anticuerpos específicos para fragmentos de POSTN según la invención, o fragmentos de los mismos, se producen mediante tecnología de visualización de fases después de la inmunización de camélidos.

En otro aspecto de la invención, los fragmentos de POSTN o variantes de los mismos pueden usarse como inmunógeno para generar anticuerpos según la invención.

Los inmunógenos para generar anticuerpos según la invención comprenden un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

Los inmunógenos para generar anticuerpos según la invención comprenden un péptido que consta de entre 6 y 20 aminoácidos, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consta de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

Los inmunógenos para generar anticuerpos según la invención comprenden un péptido con un peso molecular que varía entre aproximadamente 600 y aproximadamente 2400 Da, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

Los inmunógenos para generar anticuerpos según la invención comprenden un péptido que consta de entre 6 y 20 aminoácidos con un peso molecular que varía entre aproximadamente 600 y aproximadamente 2400 Da, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o variantes del mismo.

Según un aspecto particular, un inmunógeno para generar anticuerpos según la invención es un péptido de entre 6 y 20 aminoácidos o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Preferentemente, el inmunógeno para generar anticuerpos según la invención es un péptido de una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 o variantes del mismo.

En otro aspecto de la invención, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos según la invención se conjugan opcionalmente con una molécula accesoria, y después también se denominan en esta invención «anticuerpos conjugados» o «fragmentos de anticuerpos conjugados».

La molécula accesoria puede conjugarse con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo directamente o a través de un espaciador de longitud adecuada, por ejemplo, como se describe en Kellogg et al., 2011, Bioconjug Chem, 22: 717­ 27).

En una realización, particularmente adaptada para fines de diagnóstico, la molécula accesoria puede ser, por ejemplo, un agente de acoplamiento como la biotina, un grupo marcador que incluye radioisótopos (por ejemplo, 3H, 14C, 32P, 35S, 1251), etiquetas cromogénicas, por ejemplo, enzimas que se pueden usar para convertir un sustrato en un compuesto coloreado detectable (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa) o un compuesto fluorescente (por ejemplo, una proteína verde fluorescente, proteína roja fluorescente), etiquetas espectroscópicas (por ejemplo, etiquetas fluorescentes tal como fluoresceína y sus derivados como FITC, rojo de Texas, colorantes de cianina, fotociano, rodamina, o etiquetas que presentan un color visible), etiquetas luminiscentes incluyendo luciferinas, etiquetas de afinidad que pueden ser desarrolladas por un compuesto adicional específico para la etiqueta y que permiten una fácil detección y cuantificación, o cualquier otra etiqueta utilizada en ELISA estándar. Según otra realización, se proporciona un uso de los anticuerpos según la invención para el revestimiento de una matriz sólida para realizar un inmunoensayo.

Ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención

Según una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un péptido o variantes del mismo según la invención.

Según una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica fragmentos de POSTN o variantes de los mismos según la invención.

El ácido nucleico aislado según la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN natural o un ADN, ARN o LNA recombinante o sintético, o una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico según la invención, ya sea en solitario o en combinación.

Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención

Según otra realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la invención.

En una realización particular, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la invención.

Vectores y células huésped para la producción y purificación de los polipéptidos de la invención

En una realización, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico según la invención, en el que el vector opcionalmente comprende una secuencia de control de expresión, que permite la expresión en células huésped procariotas o eucariotas del polipéptido codificado, unidas operativamente a dicha molécula de ácido nucleico.

Se pueden usar numerosos sistemas de expresión, incluyendo, sin limitación, cromosomas, episomas y virus derivados. Más en particular, los vectores recombinantes utilizados pueden derivarse de plásmidos bacterianos, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos de cromosomas de levadura, virus tales como baculovirus, virus del papiloma tal como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela del zorro, virus de la pseudorrabia, retrovirus. Estos vectores recombinantes pueden derivarse igualmente de derivados de cósmidos o fagémidos.

La secuencia de ácido nucleico se puede insertar en el vector de expresión recombinante por procedimientos bien conocidos por un experto en la técnica, tales como, por ejemplo, los que se describen en MOLECULAR CLONING: A LABORATORY Ma NuAL, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001.

El vector recombinante puede incluir secuencias de nucleótidos que permitan, controlen o regulen la expresión y la transcripción de un polinucleótido de la invención, así como la traducción de un polipéptido de la invención, donde estas secuencias se seleccionan según las células hospedadoras que se utilicen.

Por lo tanto, por ejemplo, se puede integrar una señal de secreción apropiada en el vector recombinante para que el polipéptido, codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención, se dirija hacia el lumen del retículo endoplásmico, hacia el espacio periplásmico, en la membrana o hacia el entorno extracelular. La elección de una señal de secreción apropiada puede facilitar la posterior purificación de proteínas.

En una realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende un vector recombinante según la invención.

La introducción del vector recombinante en una célula huésped puede realizarse según procedimientos que se conocen bien por un experto en la técnica, tales como los descritos en BASIC METHODS IN MOLECULAR BIo Lo GY, Davis et al., 2a ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, y MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, supra, tal como transfección por fosfato de calcio, transfección por DEAE dextrano, transfección, microinyección, transfección por lípidos catiónicos, electroporación, transducción o infección.

La célula huésped puede ser, por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli o Streptomyces, células de hongos tal como Aspergillus, y levaduras tales como Saccharomyces, células de insectos, células de ovario de hámster chino (CHO), línea celular de ratón C127, línea celular BHK de células de hámster sirio, células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293). En una realización particular, la célula huésped es una célula CHO o una célula HEK 293.

Las células huésped pueden usarse, por ejemplo, para expresar un polipéptido de la invención. Después de la purificación por procedimientos estándar, el polipéptido de la invención puede usarse en un procedimiento descrito posteriormente en esta invención.

Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo puede concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como una matriz de filtración en gel. Como alternativa, se puede emplear un intercambio aniónico y/o una resina de afinidad. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Como alternativa, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios RP-HPLC hidrófobos para purificar adicionalmente los anticuerpos o fragmentos de los mismos. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, se conocen bien y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano puede aislarse mediante la alteración inicial de las células huésped, la centrifugación, la extracción de los gránulos celulares si se trata de un polipéptido insoluble, o del líquido sobrenadante si se trata de un polipéptido soluble, seguida de una o más etapas de concentración, desalado, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Las células microbianas pueden interrumpirse por cualquier procedimiento conveniente, incluido el ciclo de congelación-descongelación, sonicación, interrupción mecánica, o el uso de agentes de lisis celular.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir células capaces de expresar un polipéptido según la invención, que comprende células genéticamente modificadas con un vector o un ácido nucleico según la invención.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir péptidos según la invención que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleica que codifica dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos en condiciones suficientes para promover la expresión de dichos polipéptidos. Los péptidos según la invención se recuperan a continuación del medio de cultivo o extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir anticuerpos o fragmentos de los mismos según la invención que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleica que codifica dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos en condiciones suficientes para promover la expresión de dichos polipéptidos. El anticuerpo o fragmento del mismo según la invención se recupera a continuación del medio de cultivo o extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como sabe el experto en la técnica, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán según factores tales como el tipo de células huésped empleadas y si la proteína recombinante se secreta o no en el medio de cultivo como se ha descrito anteriormente.

Composiciones

La invención proporciona agentes farmacéuticos o terapéuticos como composiciones y procedimientos para tratar a un paciente, preferentemente un paciente mamífero, y lo más preferentemente un paciente humano que padece un trastorno médico, y en particular un trastorno óseo metabólico. Alternativamente, la invención proporciona procedimientos para prevenir un trastorno médico y, en particular, un trastorno óseo metabólico.

En una realización, se proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de (i) péptido según

la invención o fragmento del mismo, (ii) un ácido nucleico según la invención, (iii) un vector según la invención, y/o (iv) una célula huésped según la invención y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener uno o más péptidos de la invención o fragmentos del mismo en cualquier forma descrita en esta invención.

Las composiciones de esta invención pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales farmacéuticamente aceptables, tales como alumbre, estabilizantes, agentes antimicrobianos, tampones, agentes colorantes, agentes saporíferos, adyuvantes y similares.

Los compuestos de la invención, junto con un adyuvante, vehículo, diluyente o excipiente empleado convencionalmente, pueden colocarse en forma de composiciones farmacéuticas y dosis unitarias de los mismos, y en dicha forma pueden emplearse como sólidos, tales como comprimidos o cápsulas cargadas, formas liofilizadas, o líquidos tales como soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires o cápsulas cargadas con los mismos, todo para su uso oral, o en forma de soluciones inyectables estériles para uso parenteral (incluso subcutáneo). Dichas composiciones farmacéuticas y formas de dosificación unitarias de las mismas comprenden ingredientes en proporciones convencionales, con o sin compuestos o principios activos adicionales, y dichas formas de dosificación unitarias pueden contener cualquier cantidad eficaz adecuada del principio activo proporcional al intervalo de dosis diaria prevista que se va a emplear.

Las composiciones de esta invención pueden ser formulaciones líquidas incluyendo, entre otras, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes y elixires. Las formas líquidas adecuadas para administración vía oral pueden incluir un vehículo acuoso o no acuoso adecuado con tampones, agentes de suspensión y dispersantes, colorantes, saporíferos, y similares. Las composiciones también pueden formularse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes. Los agentes de suspensión incluyen, pero sin limitación, jarabe de sorbitol, metil celulosa, jarabe de glucosa/azúcar, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetil celulosa, gel de estearato de aluminio y grasas comestibles hidrogenadas. Los agentes emulsionantes incluyen, pero sin limitación, lecitina, monooleato de sorbitán y goma arábiga. Los vehículos no acuosos incluyen, pero sin limitación, aceites comestibles, aceite de almendras, aceite de coco fraccionado, ésteres oleicos, propilenglicol y alcohol etílico. Los conservantes incluyen, pero sin limitación, phidroxibenzoato de metilo o propilo y ácido sórbico. Otros materiales, así como técnicas de procesamiento y similares, se exponen en la Parte 5 de Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 22a Edición, 2012, Pharmaceutical Press and the University of the Sciences, Philadelphia College of Pharmacy.

Las composiciones sólidas de esta invención pueden estar en forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional. Por ejemplo, los comprimidos y cápsulas para administración por vía oral pueden contener excipientes convencionales, incluyendo, pero sin limitación, agentes de unión, cargas, lubricantes, disgregantes y agentes humectantes. Los agentes de unión incluyen, entre otros, jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucílago de almidón y polivinilpirrolidona. Las cargas incluyen, pero sin limitación, lactosa, azúcar, celulosa microcristalina, almidón de maíz, fosfato de calcio y sorbitol. Los lubricantes incluyen, pero sin limitación, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, polietilenglicol y sílice. Los disgregantes incluyen, entre otros, almidón de patata y glicolato de almidón sódico. Los agentes humectantes incluyen, pero sin limitación, laurilsulfato sódico. Los comprimidos pueden estar recubiertos según los procedimientos bien conocidos en la técnica.

Las composiciones inyectables se basan típicamente en una solución salina estéril inyectable o una solución salina tamponada con fosfato, u otros vehículos inyectables conocidos en la técnica.

Las composiciones de esta invención también se pueden formular como formulaciones transdérmicas que comprenden vehículos acuosos o no acuosos incluyendo, pero sin limitación, cremas, ungüentos, lociones, pastas, yeso medicinal, parche o membrana.

Las composiciones de esta invención también se pueden formular para administración parenteral incluyendo, pero sin limitación, mediante inyección o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden estar en forma de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación incluyendo, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes y dispersantes. La composición también se puede proporcionar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado incluyendo, pero sin limitación, agua estéril apirógena. Las composiciones de esta invención también se pueden formular como una preparación de liberación lenta, que se puede administrar por implante o mediante inyección intramuscular. Las composiciones se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (como una emulsión en un aceite aceptable, por ejemplo) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles (como una sal moderadamente soluble, por ejemplo).

Los compuestos de esta invención también se pueden administrar en formas de liberación sostenida o de sistemas de administración de fármacos de liberación sostenida. Se puede encontrar también una descripción de materiales de liberación prolongada representativos en Remington's Pharmaceutical Sciences.

Las formulaciones inyectables son en particular apropiadas para administrar las composiciones según la invención. En otra realización, la invención proporciona una composición de formación de imágenes o composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo específico para al menos un péptido de la invención o una variante del mismo como se describe aquí.

En otra realización, la invención proporciona una composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para un péptido de la invención o una variante del mismo como se describe aquí para la detección de un péptido de la invención o variantes del mismo.

En una realización, la composición de diagnóstico según la invención comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para un péptido de la invención o una variante del mismo como se describe aquí conjugado con un resto seleccionado de entre el grupo que consiste en un radioisótopo, una biotina, una avidina, una estrepavidina, un cromóforo, un fluoróforo, un resto quimioluminiscente, un hapteno y una enzima.

La composición de formación de imágenes o composición de diagnóstico según la invención es útil para detectar niveles elevados de un péptido de la invención o una variante del mismo asociado con enfermedades metabólicas óseas.

Combinación

Según la invención, los péptidos o variantes de los mismos según la invención pueden administrarse solos o junto con un coagente útil en la prevención y/o tratamiento de un trastorno metabólico óseo, por ejemplo, fármacos inmunomoduladores que incluyen biológicos, moléculas pequeñas y vacunas.

Los péptidos de la invención o una variante de los mismos se pueden administrar a un individuo antes, de forma simultánea o secuencial con otros regímenes terapéuticos o coagentes útiles en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad ósea metabólica. Los péptidos de la invención o una variante de los mismos según la invención que se administran simultáneamente con dichos coagentes pueden administrarse en la misma o distintas composiciones y por la misma o distintas vías de administración.

Modo de administración

Las composiciones de esta invención pueden administrarse de cualquier manera incluyendo, pero sin limitación, por vía oral, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosa, tópica, por inhalación, por administración bucal o intranasal, o intravejiga, o combinaciones de las mismas. La administración parenteral incluye, pero sin limitación, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratecal e intraarticular. Las composiciones de esta invención también se pueden administrar en forma de un implante, que permite la liberación lenta de las composiciones, así como una infusión i.v. controlada lentamente.

En una realización particular, los péptidos de la invención o una variante de los mismos según la invención se administran de manera sistémica o local.

En una realización particular, un péptido de la invención o una variante del mismo según la invención se administra por vía subcutánea o intravenosa.

La dosis administrada, como dosis únicas o múltiples, a un individuo variará dependiendo de una diversidad de factores, incluyendo las propiedades farmacocinéticas, las condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), la magnitud de los síntomas, tratamientos simultáneos, frecuencia de tratamiento, y el efecto deseado.

Procedimientos según la invención

En otro aspecto, la invención proporciona una preparación de inmunoensayo que comprende al menos un anticuerpo según la invención.

Según un aspecto particular, una preparación de inmunoensayo según la invención puede usarse en un procedimiento para la detección de fragmentos de POSTN, tal como un procedimiento para medir la detección de fragmentos de POSTN contenidos en una muestra.

Ejemplos de un procedimiento que utiliza una reacción antígeno-anticuerpo en la detección de fragmentos de POSTN contenidos en una muestra incluyen inmunoensayos enzimáticos (ELISA y EIA), fluoroinmunoensayos (FIA), radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos de luminiscencia (LIA), técnicas de anticuerpos enzimáticos, técnicas de anticuerpos de fluorescencia, inmunocromatografías, inmunonefelometrías, nefelometrías de látex, ensayos de aglutinación de látex, ensayos de aglutinación de eritrocitos, ensayos de aglutinación de partículas, el procedimiento descrito, por ejemplo, en la patente japonesa abierta al público n.° H09-229936 o la patente japonesa abierta al público n.° H10 -132819 utilizando un portador que tiene una superficie sobre la cual se inmoviliza una sustancia que se une específicamente a una sustancia a medir (analito) para cubrir la superficie y utilizando partículas sobre la que se inmoviliza una sustancia que se une específicamente a la sustancia a medir (analito), y el ensayo de sorción de ligandos ligados a enzimas (ELSA) descrito por Dahlbeack et al., 1998, Thromb. Haemost., 79, 767-772; WO 98/23963).

Según una realización, la invención proporciona un procedimiento para detectar un fragmento de POSTN a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto mamífero;

(b) poner dicha muestra de fluido biológico en contacto con una matriz sólida a la que se une al menos un anticuerpo, en el que el contacto es en condiciones suficientes para unir un fragmento de POSTN presente en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un anticuerpo mediante interacciones antígeno-anticuerpo y en las que el dicho al menos un anticuerpo es específico para el fragmento de POSTN o cualquier variante del mismo; (c) retirar la muestra de fluido biológico de la matriz sólida para retirar todos los fragmentos de POSTN no unidos de la superficie de dicha matriz sólida;

(d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida, donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene uno o más fragmentos de POSTN.

Según una realización, la invención proporciona un procedimiento para detectar un fragmento de POSTN a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto mamífero;

(b) poner dicha muestra de fluido biológico en contacto con al menos un anticuerpo, en el que el contacto es en condiciones suficientes para unir un fragmento de POSTN de esta invención en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un anticuerpo mediante interacciones antígeno- anticuerpo y en las que dicho al menos un anticuerpo es específico para el fragmento de POSTN de la invención o cualquier variante del mismo;

(c) poner en contacto la muestra obtenida en la etapa b) con una matriz sólida a la que se une al menos un fragmento de POSTN de la invención, donde el contacto se realiza en condiciones suficientes para unir un anticuerpo específico para el fragmento de POSTN de la invención presente en dicha muestra a dicho al menos un fragmento de POSTn de la invención a través de interacciones antígeno-anticuerpo;

(d) lavar la matriz sólida para retirar todos los anticuerpos no unidos de la superficie de dicha matriz sólida; (e) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida, donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene uno o más fragmentos de POSTN de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar un fragmento de POSTN a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto mamífero;

(b) proporcionar un soporte sólido que tiene unido al mismo al menos un fragmento de POSTN de la invención; (c) poner dicho soporte sólido en contacto con dicha muestra de fluido biológico;

(d) poner dicho soporte sólido en contacto con al menos un anticuerpo específico para el fragmento de POSTN de la invención o cualquier variante del mismo, donde el contacto se realiza en condiciones suficientes para unir un fragmento de POSTN de la invención presente en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un anticuerpo a través de interacciones antígeno-anticuerpo;

(e) lavar la matriz sólida para retirar todos los anticuerpos no unidos de la superficie de dicha matriz sólida; (f) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida, donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene uno o más fragmentos de POSTN de la invención.

Según una realización, se puede obtener un soporte sólido que tiene unido al menos un fragmento de POSTN de la invención revistiendo una placa de microtitulación con al menos un fragmento de POSTN de la invención o modificando una superficie de una placa de microtitulación para conjugar covalentemente al menos un fragmento de POSTN de la invención. Por ejemplo, los péptidos biotinilados de la invención pueden incubarse en microplacas prerrevestidas con estreptavidina según procedimientos estándar.

Según una realización, la detección de la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a la matriz sólida se puede lograr con un anticuerpo secundario. Según una realización, un procedimiento para detectar un fragmento de POSTN según la invención es indicativo de un trastorno óseo metabólico en dicho sujeto.

Según una realización, un procedimiento para detectar un fragmento de POSTN según la invención es indicativo del efecto del tratamiento de un trastorno óseo metabólico en dicho sujeto.

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho al menos un anticuerpo es específico para un péptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, en el que dicho al menos un anticuerpo es específico para un péptido que consta de entre 6 y 20 aminoácidos, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho al menos un anticuerpo es específico para un péptido con un peso molecular que varía entre aproximadamente 600 y aproximadamente 2400 Da, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho al menos un anticuerpo es específico para un péptido que consta de entre 6 y 20 aminoácidos con un peso molecular que varía entre aproximadamente 600 y aproximadamente 2400 Da, que comprende una o que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho al menos un anticuerpo es específico para un péptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho al menos un anticuerpo es específico para un péptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Según otra realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicha muestra de fluido biológico se pone en contacto con dicha matriz sólida en la etapa b), donde una combinación de péptidos o de variantes de los mismos según la invención se une a dicha matriz sólida.

Según otra realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde una cantidad conocida de anticuerpo de captura se une a dicha matriz sólida en la etapa b).

Según otra realización adicional, se proporciona un procedimiento para detectar fragmentos de POSTN de una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero, donde dicha muestra de fluido biológico se pone en contacto con dicha matriz sólida en la etapa b), donde una combinación de anticuerpos o de variantes de los mismos se une a dicha matriz sólida y donde la combinación comprende: a) un anticuerpo específico para un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una variante de los mismos; y b) al menos un anticuerpo específico para un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o una variante del mismo.

Según otra realización adicional, se proporciona un procedimiento para detectar fragmentos de POSTN de una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero, donde dicha muestra de fluido biológico se pone en contacto con dicha matriz sólida en la etapa b), donde una combinación de anticuerpos o de variantes de los mismos se une a dicha matriz sólida y donde la combinación comprende: a) un anticuerpo específico para un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y b) al menos un anticuerpo específico para un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

Según otra realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde el procedimiento comprende además una etapa de comparar la señal obtenida en la etapa de detección d) con la misma señal obtenida para al menos una muestra de control, donde la señal obtenida para dicha al menos una muestra de control se recoge previamente, simultáneamente o después de la etapa d) para dicha muestra de fluido biológico.

La detección de los fragmentos de POSTN capturados/unidos en la etapa d) mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica para detectar anticuerpos o proteínas capturados sobre superficies tal como técnicas de detección óptica (p. ej., ELISA), detección de variaciones de masa (p. ej., resonancia de plasmones superficiales, espectrometría de masas), detección eléctrica (p. ej., espectroscopía de impedancia, electroquímica). Los resultados del ensayo pueden ser cualitativos o cuantitativos. La cantidad de fragmentos de POSTN asociados con anticuerpos se puede comparar con controles positivos y negativos. Los controles se analizan típicamente de manera simultánea a la muestra que se va a analizar. Un control positivo puede ser un suero o una disolución que contenga un fragmento de POSTN que sea inmunorreactivo con al menos un anticuerpo según la invención. Un control positivo puede ser un suero o una solución que no contiene ningún fragmento de POSTN que sea inmunorreactivo con al menos un anticuerpo según la invención. Para la cuantificación, se puede generar y/o usar una curva de calibración que usa cantidades conocidas de fragmentos de POSTN contra al menos un anticuerpo según la invención. La comparación con muestras de fluido biológico sano normal se puede conseguir con procedimientos diferentes. Según una realización, se puede llevar a cabo incluyendo una reacción de control con una muestra de sangre de un sujeto sano. Según otra realización, se puede llevar a cabo empleando un valor para la concentración de fragmentos de POSTN endógenos para una muestra de fluido biológico típica de un sujeto sano. Típicamente, la comparación del nivel de fragmentos de POSTN endógenos presentes en una muestra en investigación se puede realizar con respecto a un valor determinado en cada procedimiento de prueba o con respecto a un valor predeterminado. El valor predeterminado se puede determinar para el procedimiento de prueba en general o, alternativamente, el valor puede ser válido solo para un cierto lote de reactivos de prueba. Por ejemplo, el valor de referencia puede ser válido solo para un periodo de calibración definido y se puede redefinir tras la calibración del procedimiento de prueba.

Según otra realización adicional, útil en un procedimiento de monitorización de los efectos de un tratamiento de sujetos con osteoporosis que comprende la detección de fragmentos de POSTN.

Según otra realización adicional, los fragmentos de POSTN de la invención pueden ser útiles en un procedimiento de monitorización de la progresión del tratamiento de pacientes con osteoporosis que comprende la detección de fragmentos de POSTN.

Según otra realización adicional, los fragmentos de POSTN de la invención pueden ser útiles en un procedimiento de diagnóstico de pacientes con riesgo de osteoporosis que comprende la detección de fragmentos de POSTN.

Según otra realización adicional, los fragmentos de POSTN de la invención pueden ser útiles en un procedimiento de diagnóstico de sujetos con un trastorno óseo metabólico que comprende la detección de fragmentos de POSTN.

Según otra realización adicional, los fragmentos de POSTN de la invención pueden ser útiles en un procedimiento de monitorización de los efectos de un tratamiento de un sujeto con un trastorno óseo metabólico que comprende la detección de fragmentos de POSTN.

Según una realización adicional, se proporcionan procedimientos según la invención donde un trastorno óseo metabólico es la osteoporosis.

Según una realización adicional, se proporciona un procedimiento según la invención, donde dicho procedimiento es un procedimiento ex vivo.

Kit y procedimiento de uso del mismo

Según un aspecto, la invención se refiere a un kit para llevar a cabo un procedimiento según la invención.

Según un aspecto, la invención proporciona un kit para detectar la formación de fragmentos proteolíticos CatK de POSTN en el compartimento cortical óseo.

Según un aspecto adicional, la invención proporciona un kit que comprende (1) un soporte sólido que tiene unido al mismo al menos un fragmento de POSTN de la invención; y opcionalmente: (2) al menos un anticuerpo según la invención específico para dicho al menos un fragmento de POSTN; (3) al menos un fragmento de POSTn no unido de la invención para que sirva como control positivo; (4) al menos un agente de detección para detectar el complejo que se forma entre dicho al menos un fragmento de POSTN de la invención presente en una muestra biológica y dicho al menos un anticuerpo según la invención específico para dicho al menos un fragmento de POSTN.

Según un aspecto particular, la invención proporciona un kit ELISA, más en particular un kit ELISA competitivo.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende al menos un anticuerpo según la invención o una variante del mismo.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un kit para detectar un fragmento de POSTN de la invención en una muestra de fluido biológico, donde el kit comprende al menos un anticuerpo según la invención o una variante del mismo.

El kit según la invención comprende al menos un anticuerpo según la invención, una variante del mismo o una combinación del mismo para acoplarlo, o ya acoplado, a una matriz sólida como soporte en fase sólida como se denomina en esta memoria. Se pueden usar diversas matrices sólidas, que incluyen, pero no se limitan a, vidrio, poliestireno, polipropileno, nitrocelulosa, cuarzo, cerámica, dextrano u otros materiales. Las formas adecuadas de la matriz sólida incluyen perlas, micropartículas, nanopartículas, tubos, tejidos o placas, películas, portaobjetos, pocillos construidos de, o revestidos con, estos materiales. Típicamente, la matriz sólida comprende pocillos de microtitulación, tal como una placa de microtitulación de 96 pocillos.

Un anticuerpo de la invención puede inmovilizarse sobre un portador en fase sólida mediante adsorción y/o unión mediante un procedimiento conocido tal como adsorción física, unión química o ambos.

Según otra realización adicional, se proporciona el uso de un kit de la invención para la detección de un trastorno óseo metabólico en un sujeto o para controlar el curso de un tratamiento de dicho trastorno en un sujeto.

Según otra realización adicional, se proporciona un uso de un kit de la invención para detectar un fragmento de POSTN en una muestra de fluido biológico.

El procedimiento, el kit y los usos según la invención pueden ser adecuados con fines de cribado, así como con fines de diagnóstico, y se pueden utilizar en el diagnóstico principal, así como en el seguimiento del curso de la enfermedad durante o después del tratamiento.

Según un aspecto particular, la detección de uno o más fragmentos de POSTN según la invención, en particular un fragmento que comprende o consiste en una secuencia de un péptido según SEQ ID NO: 2 es un biomarcador de la calidad ósea y es indicativo de riesgo de fractura en un sujeto. La detección de tal(es) fragmento(s) por anticuerpos específicos para el(los) fragmento(s) es en particular útil en un procedimiento o un uso según la invención.

Los ejemplos que ilustran la invención no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera.

EJEMPLOS

Ahx (ácido 2-aminohexanoico), AUC (área bajo la curva), BSA (albúmina sérica bovina), BMD (densidad mineral ósea), BMI (índice de masa corporal), BV/TV (volumen óseo sobre volumen total), CatK (Catepsina K), IC (intervalo de confianza), Ct. (hueso cortical), Ct.Th (espesor de Ct), CTX (telopéptido C-terminal reticulado de colágeno tipo I), CV (coeficiente de variabilidad), DXA (absorciometría de rayos X de energía dual), Ec (superficie endocortical), FRAX (herramienta de evaluación del riesgo de fractura), HRP (peroxidasa de rábano picante), KLH (hemocianina de lapa californiana), LC-MS/MS (cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem), MI (momento de inercia), MW (peso molecular), OD (densidad óptica), P1NP (propéptido N-terminal de procolágeno tipo 1), POSTN (periostina), Ps (superficie del periostio), ROC (curva característica de funcionamiento del receptor), RT (temperatura ambiente), SD (desviación estándar), SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio), sPOSTN (POSTN en suero), STD (estándar), Tb. (hueso trabecular), TRIS (Tris(hidroximetil) aminometano), TBS (solución salina tamponada con Tris), vBMD (densidad mineral ósea volumétrica).

Ejemplo 1: Digestión con CatK de POSTN humana

Para identificar los fragmentos de POSTN humanas resultantes de la digestión dependiente de CatK que duró 1 h, 2 h, 3 h o toda la noche, se utilizó electroforesis en gel de poliacrilamida en una muestra de proteína POSTN mezclada con un detergente aniónico (dodecilsulfato de sodio) (SDS-PAGE).

Digestión CatK, LC-MS/MS dirigida y SDS-PAGE teñida con plata. Se incubó POSTN humana recombinante (1. 1 mM) con CatK humana de SEQ ID NO: 19 (2,24 mM) a 37 °C. Los tiempos y las relaciones POSTN/CatK se indican para cada protocolo a continuación. Se añadió el inhibidor E64 (250 mM) para detener la digestión al final de la incubación. A continuación, los digeridos se analizaron mediante electroforesis SDS-Page. Se escindieron varias bandas de fragmentos de POSTN del gel SDS-Page y se digirieron con tripsina. A continuación, los péptidos trípticos se concentraron y separaron por cromatografía de fase inversa en una columna PepMap100, C18, 5 mm, 100 A, 300 mm x 25 mm de Dionex (ThermoScientific) usando un gradiente de acetonitrilo al entre el 5 % y el 40 %, ácido fórmico al 0,1 % en 60 min a 300 nl/min. Además, para maximizar la cobertura de la secuencia, el análisis se realizó en 2 espectrómetros de masas, espectrómetro de masas LTQ Velos (ThermoScientific) y espectrómetro de masas Qstar XL (Applied Biosystems).

Se observaron aproximadamente 105 de los fragmentos de POSTN únicos después de la digestión con CatK de POSTN que duró 3 h. Los fragmentos de POSTN observados después de la digestión con CatK correspondían al 62 % de la secuencia POSTN. Varios fragmentos de POSTN se caracterizaron por secuencias superpuestas que indican un tipo no específico de escisión por la enzima CatK. Se detectaron dos bandas de proteínas de fragmentos de POSTN de aproximadamente entre 35 kDa y 7 kDa (figura 2A). Las bandas no se observaron en el control negativo donde no se añadió enzima a POSTN (figura 2A). La digestión de una cantidad constante de POSTN con una cantidad creciente de CatK indica que la proporción de abundancia de los fragmentos de POSTN aumentó con la cantidad creciente de enzima, saturando a una proporción menor que POSTN/CatK de 11:1 (figura 2B).

Estos datos muestran que la POSTN humana es un sustrato de la digestión enzimática dependiente de CatK que genera una gran cantidad de varios péptidos que pueden servir como marcadores de la actividad de CatK en el periostio.

Ejemplo 2: identificación de fragmentos de POSTN

Se separaron e identificaron varios fragmentos de POSTN dependientes de CatK con el uso de cromatografía líquida dirigida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Digestión con CatK, LC-MS/MS dirigida y SDS-PAGE teñida con plata como se describe en el Ejemplo 1. Se separaron veintiún fragmentos de POSTN distintos en un único análisis LC-MS/MS (figura 3A) que incluía los péptidos 1-17 que se analizaron más a continuación y el péptido 18 (SEQ ID NO: 22), péptido 19 (SEQ ID NO: 23), péptido 20 (SEQ ID NO: 24) y péptido 21 (SEQ ID NO: 25). Los fragmentos de POSTN digeridos con CatK más abundantes de SEQ ID NO: 2 y s Eq ID NO: 6 obtenidos en una relación POSTN/CatK que variaba entre 250:1 y 5:1 se midieron con LC-MS/MS. La ausencia de un fragmento de POSTN digerido incompleto (ID SEQ NO.: 6) sirvió como una indicación de digestión de POSTN completa a una relación POSTN/CatK de 5:1 (figura 3B).

Estos datos muestran que la digestión in vitro óptima de POSTN humana aparece en una relación POSTN/CatK dentro de un intervalo entre 100:1 y 22:1. Los fragmentos de POSTN digeridos con CatK más abundantes son de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6.

Ejemplo 3: Evolución temporal de la digestión de POSTN dependiente de CatK

Se evaluó la evolución temporal de la aparición de 17 fragmentos de POSTN dependientes de CatK obtenidos con una relación POSTN/CatK de 50:1, separados e identificados con el uso de LC-MS/MS.

Digestión con CatK, LC-MS/MS dirigida y SDS-PAGE teñida con plata como se describe en el Ejemplo 1. Se controló la aparición de 17 fragmentos de POSTN distintos durante la digestión de POSTN dependiente de CatK entre 15 min y 2 h, con una relación POSTN/CatK de 50:1 (figura 4). El fragmento más antiguo es de SEQ ID NO: 2 que aparece en los primeros 15 minutos desde el inicio de la reacción, seguido de fragmentos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3, SEQ iD NO: 4, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 5. La mayor parte de la digestión de POSTN finaliza en los 60 minutos posteriores al inicio de la reacción.

A continuación, esos 17 fragmentos de POSTN se clasificaron en función de su abundancia medida en el análisis LC-MS/MS, así como la velocidad de su generación (figura 5). Las secuencias de los fragmentos de POSTN observados sugieren que los aminoácidos K, T, E, R y L son sitios de escisión preferidos para la POSTN digerida con CatK en el orden de preferencia siguiente: K>T>E>R>L.

Los fragmentos de POSTN digeridos con CatK más abundantes y de aparición más rápida son de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5. Por lo tanto, estos son fragmentos de POSTN preferidos que podrían ser útiles para marcar la actividad de CatK en el hueso.

Ejemplo 4: Producción de anticuerpos antifragmentos de POSTN

Los anticuerpos se generan mediante protocolos de inmunización convencionales. Específicamente, los péptidos de la invención se acoplan a una molécula portadora, que incluyen pero no se limitan a hemocianina de lapa californiana y albúmina de suero bovino (BSA).

Los fragmentos de péptidos, una vez acoplados, se inyectan en conejos durante 55 días. El suero de los animales se recoge y se purifica mediante procedimientos de inmunoafinidad contra los fragmentos de POSTN.

Inmunización. Se inmunizaron dos conejos (H8308 y H8325) mediante inyección del péptido sintético que comprende el péptido amidado de SEQ ID NO: 2, cisteína (C; para permitir una conjugación en el extremo N-terminal) y ácido 2-aminohexanoico (Ahx, espaciador hidrofóbico que permite una mejor exposición de la secuencia específica), y denominado C-Ahx-GSLQPIIK-NH2, que se acopló adicionalmente con hemocianina de lapa californiana (KLH).

Purificación y caracterización de anticuerpos. Los anticuerpos se aislaron del suero de los animales por inmunoafinidad usando un gel acoplado con la secuencia del péptido 1. El título de antisuero inmunopurificado se evaluó mediante la unión directa al péptido de SEQ ID NO: 2 acoplado a albúmina de suero bovino (BSA), denominada BSA-GSLQPIIK. El título del antisuero obtenido se evaluó en aproximadamente 106, lo que respalda el aislamiento de un anticuerpo policlonal específico para el fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2. Debido a la alta homología de secuencia entre POSTN humana y POSTN de otras especies, esos anticuerpos pueden reaccionar con fragmentos de POSTN de ratón, rata, macaco cangrejero, perro y gato.

Ejemplo 5: Presencia de fragmentos de POSTN digeridos con CatK en hueso cortical de ratón

La presencia de fragmentos de POSTN digeridos con CatK de SEQ ID NO: 2 se evaluaron en hueso de ratón usando los anticuerpos preparados según el Ejemplo 4.

Análisis inmunohistoquímico. Las tibias derecha e izquierda se extirparon del ratón y posteriormente se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante la noche a 4 °C. A continuación, se descalcificaron en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 19 % y formalina tamponada con fosfato al 4 % durante 3 semanas. A continuación, las tibias se deshidrataron en una serie ascendente de etanol, se aclararon en Propar (Anatech LTD, Battle Creek, MI) y se incrustaron en bloques de parafina. Se cortaron secciones de 8 pm de espesor de los bloques al nivel del eje medio de la tibia utilizando un micrótomo RM2155 (Leica, Alemania) y se montaron en portaobjetos Superfrost Plus (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Las secciones se secaron al aire durante la noche a temperatura ambiente. Antes de la tinción, las secciones se incubaron en un horno (Hybaib, MGW Biotech) a 60 °C durante 1 h, se desparafinaron en xileno y se rehidrataron en una serie descendente de etanol. Los portaobjetos desparafinizados se pretrataron en peróxido de hidrógeno al 3 % en metanol para desactivar la peroxidasa endógena y se enjuagaron con agua del grifo seguido de bloqueo no específico de avidina/biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) según las instrucciones del fabricante. Todas las incubaciones se llevaron a cabo en una cámara humidificada. El bloqueo de proteínas adicional se logró con Protein Block-Serum Free (DAKO, Carpinteria, CA). Usando el kit Vectastain Elite ABC (Rabbit IgG) (Vector Laboratories, Burlingame, CA), los portaobjetos se incubaron en suero de cabra normal al 1,5 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario (anticuerpo contra el fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 como se obtuvo en el Ejemplo 4) se diluyó en Antibody Diluent (DAKO, Carpinteria, CA) hasta obtener una concentración final de 1/200000 y 1/10000 y se incubó a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, los portaobjetos se enjuagaron en Wash Buffer (DAKO, Carpinteria, CA) durante 15 min en un agitador por movimiento basculante a temperatura ambiente y se incubaron en anticuerpo secundario anticonejo de cabra biotinilado (Vectastain Kit) diluido 1:1000 durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de otro enjuague en Wash Buffer durante 15 min en un agitador por movimiento basculante a temperatura ambiente. El reactivo ABC del Vector Kit se preparó según las instrucciones del fabricante a una dilución de 1:250 y los portaobjetos se incubaron en él durante 30 min a temperatura ambiente y se enjuagaron, como antes, en DAKO® Wash Buffer. Todas las etapas de incubación se realizaron a temperatura ambiente y todas las etapas de enjuague emplearon el DAKO® Wash Buffer a temperatura ambiente en un agitador por movimiento basculante. A continuación, los portaobjetos se incubaron en estreptavidinaperoxidasa de rábano picante (HRP) diluida a 1:100 durante 30 min y se lavaron durante 15 min. Los portaobjetos se desarrollaron en una disolución de trabajo de 3,3'-diaminobencidina (DAB Substrate Kit for Peroxidase Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) preparada según las instrucciones del fabricante durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de un enjuague final en agua desionizada, los portaobjetos se montaron en Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI). Para el control negativo, la incubación del anticuerpo primario ha sido reemplazada por TRIS 0,1 M. Las imágenes digitales se obtuvieron utilizando un microscopio con una cámara AxioCam MRc5 controlada por el software Axiovision AC (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemania).

La presencia de fragmentos de POSTN digeridos con CatK de SEQ ID NO: 2 se detectó en la superficie del periostio (Ps) del ratón de la región ósea cortical, específicamente en los osteocitos y el sistema lacuno-canalicular así como en la matriz ósea con el uso de anticuerpos anti-SEQ ID NO: 2 usados a la concentración de 1/10000, pero no a la concentración de 1/200000 (figura 6).

Este análisis confirmó que los anticuerpos de la invención son capaces de detectar la presencia de fragmentos de POSTN digeridos con CatK de SEQ ID NO: 2 en osteocitos de ratón y sistema lacuno-canalicular de la región ósea cortical y que estos fragmentos son específicos para esta región ósea.

Ejemplo 6: Ensayo ELISA para un fragmento de POSTN digerido con CatK

Se desarrolló un ensayo ELISA para analizar fragmentos peptídicos de POSTN digeridos con CatK de la invención. Primero, los péptidos biotinilados se preparan conjugando un péptido de la invención para ensayar con biotina. Esos péptidos POSTN biotinilados (p. ej., 100 ml) se incuban en placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina (durante 2 h, a temperatura ambiente, en tampón de recubrimiento) para recubrir las placas con un péptido. Después de lavar el exceso de péptido POSTN utilizado como calibrador (3-5 veces con disolución de bloqueo BSA-Tween en tampón TBS), se añade la muestra que se va a analizar (solución estándar del péptido POSTN no modificado que se va a analizar, o una muestra de tampón utilizada como disolución de control o una muestra de suero) a cada pocillo. También se añaden anticuerpos primarios antipéptido POSTN preparados como se describe en el Ejemplo 4 y específicos para el fragmento de péptido POSTN a ensayar. Por ejemplo, se añade 50 ml de estándar (péptido POSTN sintético a analizar) en distintas concentraciones de 0, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 ng/ml o muestra de suero y 50 ml de anticuerpo primario H8308/H8325 en tampón de ensayo y se incuba durante la noche a 4 °C. Después de la incubación, las placas se lavan (p. ej., 3-5 veces con BSA - solución de bloqueo Tween al 0,05 % en tampón TBS) y se pipetea una disolución de anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa (anticuerpo secundario) en cada pocillo (p. ej., 100 ml de anticuerpo anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido a 1/8000 en tampón TRIS-BSA e incubado durante 1 hora a temperatura ambiente). Después de la incubación y el lavado (p. ej., 3-5 veces con BSA - disolución de bloqueo Tween al 0,05 % en tampón TBS), se añade disolución indicadora de sustrato H2O2/tetrametilbencidina (TMB) (p. ej., 100 ml de sustrato TMB durante 30 min) para revelar el anticuerpo secundario de unión. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, la reacción colorimétrica se detiene mediante la adición de 100 ml de H2SO42 M y se mide la densidad óptica a 405 nm corregida por la absorbancia a 650 nm.

En dicho ensayo ELISA competitivo, el fragmento de POSTN peptídico contenido en la muestra (péptido sintético libre usado como estándar o el fragmento de péptido natural comprendido en una muestra de suero) compite con el péptido sintético biotinilado recubierto en la placa de microtitulación por la unión al anticuerpo primario. Después de la incubación de una muestra de prueba con anticuerpos primarios, el exceso de anticuerpos primarios no unidos se elimina mediante lavado y el anticuerpo secundario revela la cantidad de anticuerpo primario que queda en la placa después de una reacción colorimétrica. La señal de densidad óptica en este caso es inversamente proporcional a la concentración del péptido presente en la muestra.

La especificidad del anticuerpo utilizado en el ELISA se prueba mediante experimentos de competición con fragmentos de POSTN generados por catepsina K recombinante, péptidos sintéticos de la invención, POSTn recombinante intacta y los péptidos de la invención donde uno o dos aminoácidos se insertan o eliminan en el extremo C-terminal. Esta información se usa para controlar que el ensayo reconozca solo el sitio de escisión de catepsina K identificado en POSTN.

Se utilizan varias concentraciones de péptido biotinilado, anticuerpos primarios y secundarios para optimizar la relación señal/ruido. Se utilizan distintos tampones y condiciones de incubación (tiempo, temperatura) para optimizar la relación señal/ruido.

La prueba de suero humano se realiza para probar los péptidos de la invención de secuencias seleccionadas de entre el grupo de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID n O: 3, Se Q ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. Para garantizar que el ELISA proporcione datos precisos y reproducibles, se realizan los controles siguientes:

1. Variabilidad intra e interensayo en 3 grupos distintos de muestras de suero con distintas concentraciones de péptidos endógenos de la invención.

2. Linealidad usando diluciones en serie de 3 grupos de muestras de suero.

3. La recuperación de distintas concentraciones de péptidos sintéticos de la invención añadida a 3 grupos de suero humano.

4. Estabilidad de las muestras de suero a temperatura ambiente, 4 °C y después entre 1 y 4 ciclos de congelacióndescongelación.

Ejemplo 7: Ensayo ELISA para un fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2

Es de interés la detección de la presencia del péptido 1 que se identificó como el producto principal de la degradación final de POSTN recombinante humana por Cat-K humana (Ejemplos 2 y 3). Por tanto, se desarrolló un ELISA de inmunoensayo para la determinación cuantitativa de la presencia del péptido 1 en muestras de sangre humana como se describe en el Ejemplo 6 y como se detalla a continuación.

Preparación de la muestra. Se recolectaron muestras de sangre humana venosa utilizando tubos de extracción de sangre estandarizados para suero (BD VACUTAINER SST2, advance ref: 367955). La sangre se recogió entre las 8 y las 10 de la mañana. Los sujetos estuvieron en ayunas antes de la extracción de sangre durante al menos 8 horas o durante la noche. Poco después, se lleva a cabo la separación del suero mediante centrifugación, p. ej., 10 min a 3000 x g, preferentemente a 4 °C (2-8 °C) y las muestras de suero obtenidas se miden inmediatamente después. Para un almacenamiento más prolongado, las muestras alícuotas se almacenaron a -80 °C en un microtubo de 2 ml con tapón de polipropileno (Sarstedt). Las muestras no se congelaron-descongelaron más de 2 veces. Las muestras lipémicas o hemolizadas pueden dar resultados erróneos y no se utilizaron. Las muestras de suero se mezclaron bien antes del ensayo (Vortex 10 seg).

Protocolo ELISA. Los pocillos de microtitulación se lavaron 3 veces con 300 ml de tampón de lavado diluido (PBS BSA al 0,5 %, Gibco, señalización celular). Después del lavado final, se eliminó el tampón de lavado restante golpeando fuertemente la placa contra una toalla de papel. Los péptidos sintéticos biotinilados resultantes de la biotinilación del péptido 1 (100 ml a 2,5 ng/ml en Tris BSA, tampón de recubrimiento) se incubaron en placas de microtitulación prerrevestidas con estreptavidina (96 pocillos) durante 1 hora, bien tapadas, a temperatura ambiente (TA) (p. ej., 18­ 26 °C) con agitación suave. Después de la incubación, la solución se eliminó por aspiración y los pocillos se lavaron 4 x con 300 ml de tampón de lavado diluido, después del lavado final, el tampón de lavado restante se eliminó golpeando fuertemente la placa contra una toalla de papel. Se añadieron a los pocillos 50 ml de solución estándar (STD) de péptido 1 (ver más adelante) o disolución de control (CTRL) o muestra (p. ej., suero). A continuación, 50 ml de un anticuerpo primario policlonal contra el fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 (obtenido en el Ejemplo 4) diluido a 1/25000 en tampón de ensayo (TRIS 10 mM, CaCl2 10 mM, BSA al 0,5 %, respectivamente Sigma, MERCK, Bioconcept Cell Signaling Technology) y las placas se cubrieron e incubaron durante 19 -20 h a 4 °C (2-8 °C) con agitación suave.

La solución madre estándar (STD) de péptido 1 a 9,3 mg/ml se diluyó con tampón de ensayo para obtener las siguientes soluciones estándar individuales STD 5, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 960 ng/ml, STD 0 referido a tampón de ensayo. Después de la incubación, la solución se eliminó y los pocillos se lavaron 5 x con 300 ml de tampón de lavado diluido, después del lavado final, el tampón de lavado restante se eliminó golpeando fuertemente la placa contra una toalla de papel. A continuación, se añadieron al pocilio 100 ml de un anticuerpo anti-conejo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (peroxydase conjugated affinipure goat anti-rabbit IGG (H+L), Jackson- lab) a una concentración de 1/150000, las placas se taparon herméticamente y se incubaron durante 1 h a RT con agitación suave. Después de la incubación, la solución se eliminó por aspiración y los pocillos se lavaron 4 x con 300 ml de tampón de lavado diluido. A continuación se agregaron 100 ml de una disolución de TMB (H2O2/tetrametilbencidina) (sustrato cromogénico para HRP, Sigma T040) a los pocillos y se incubaron en una habitación oscura entre 20-30 min (p. ej., 25 min) a RT con agitación suave hasta que la reacción colorimétrica se detuvo al añadir 50 ml de disolución de parada (H2SO4) a una concentración de 0,2 M. Inmediatamente después de la finalización de las reacciones se midió la densidad óptica (OD) de todos los pocillos en un lector de placas a una longitud de onda de 450 nm. Se construyó la curva a partir de los valores de Od del STD y a continuación se dedujo la concentración de la muestra de la curva estándar así obtenida (figura 7). El ensayo se evaluó con el algoritmo 4PL con varios procedimientos de ajuste de curvas.

Sensibilidad analítica

Se utilizó la concentración correspondiente a OD (STD 0)-3SD (desviación estándar) del estándar 0 calculada a partir de 15 mediciones repetidas de s Td 0.

La especificidad del ensayo ELISA se analizó llevando a cabo el protocolo descrito anteriormente utilizando una solución de muestra que además contenía el péptido 1 o un péptido de control 1 de SEQ ID NO: 20 (péptido 1 modificado que lleva una treonina C-terminal) u otro péptido 2 de control de SEQ ID NO: 21 (fragmento del péptido 1 al que le falta la lisina C-terminal), o POSTN intacta (SEQ ID NO: 1) a concentraciones de 60 y 120 ng/ml. La muestra con tampón solo se usó como control y los valores de OD se midieron en función de la concentración en el péptido diana de SEQ ID NO: 2. En otro segundo conjunto de experimentos, se realizó un ensayo ELISA en una muestra con POSTN humana recombinante intacta, o en una muestra en la que POSTN humana recombinante se digirió mediante CatK recombinante durante 4 horas con una relación molar de 1/10. Un tampón usado para la reacción de digestión se usó como control negativo.

Reproducibilidad analítica

La variabilidad intraensayo se evaluó en 4 muestras de suero de distintas concentraciones de péptidos ejecutadas 10­ 12 veces en el mismo ensayo. La variabilidad interensayo se evaluó en 3 muestras de suero que se analizaron 4-10 veces en distintos ensayos. El coeficiente de variabilidad (CV) se calculó dividiendo la SD de las medidas por el valor medio de cada muestra. En general, son aceptables los % CV intraensayo e interensayo de menos de 15.

Linealidad del ensayo

Se diluyeron en serie 2 muestras de suero con altas concentraciones de péptido 1 endógeno en el tampón de ensayo.

A continuación, se calculó el % de recuperación medio dividiendo la concentración medida por el valor esperado teniendo en cuenta el factor de dilución. Las recuperaciones que oscilan entre el 80 y el 120 % se consideran aceptables para dicha tecnología ELISA.

La curva estándar obtenida para el péptido 1 es consistente con las curvas estándar proporcionadas por los protocolos de control de calidad (QC) de liberación final (valores de OD de 1,40 o superiores obtenidos para el estándar cero). El límite inferior analítico de detección (LLOD) para este ensayo ELISA se estimó en 9,1 ng/ml. Se estimó usando la concentración del péptido diana correspondiente al valor de OD del estándar 0 - 3 SD. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) se estimó en 12 ng/ml. El LLOq es la concentración del péptido diana en muestras de suero que se puede medir con un % CV por debajo del 20 %.

La especificidad de este ensayo ELISA fue respaldada ya que no detectó el péptido de control SEQ ID NO: 20, péptido de control de SEQ ID NO: 21 ni POSTN intacta de SEQ ID NO: 1 a las concentraciones evaluadas y solo fue sensible al péptido 1 (figura 8). En el segundo conjunto de experimentos, la POSTN humana recombinante intacta (concentración de 0,04 mg/ml) no se detectó mediante ELISA, pero, por el contrario, en una muestra en la que la POSTN intacta fue digerida por CatK, se detectó fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 a una concentración de 29 ng/ml. El CV intraensayo fue inferior al 12,5 % y el CV interensayo para la muestra de suero por encima del LLOQ (es decir, 12 ng/ml) fue inferior a 14 (Tabla 2).

Tabla 2

Tabla 3

Estos datos apoyan que el ensayo ELISA competitivo según la invención puede detectar de forma fiable y específica el péptido 1 en muestras de suero humano.

Ejemplo 8: Presencia de fragmento de POSTN digerida con CatK de SEQ ID NO: 2 en una población de sujetos jubilados

La presencia del péptido 1 se midió con un ensayo ELISA de la invención como se describe en el Ejemplo 7. Se recogió el suero de 195 sujetos elegidos al azar de la Cohorte de Jubilados de Ginebra (GERICO) que comprende más de 1000 sujetos (3/4 mujeres) de la población general con una edad media de 65,0 ± 1,40 años para 160 mujeres y 35 hombres y se recogió y ensayó.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando MedCalc Statistical Software versión 13.1.2 (MedCalc Software bvba, Ostende, Bélgica). Todos los datos se informaron como medias ± SD. La distribución normal se evaluó mediante la prueba de d'Agostino-Pearson. Para tener en cuenta que no todas las variables tenían una distribución normal, las diferencias se evaluaron mediante una prueba U de Mann-Whitney. Se realizó un ANOVA unidireccional con los terciles de los niveles séricos del fragmento de periostina (péptido 1) empleados como factor. Las correlaciones de la microestructura ósea y los niveles séricos del péptido 1 con los parámetros óseos se analizaron mediante análisis de regresión lineal simple y multivariante. P <0,05 se consideró el nivel de significación estadística para el coeficiente de regresión (o valores de p).

La concentración media medida del péptido 1 en el suero de esos sujetos fue de 38,8 ng/ml con el valor más bajo y más alto respectivamente de 10,9 y 170,3 ng/ml como se muestra en la Tabla 4 a continuación. El valor de la concentración de péptidos difirió significativamente entre hombres y mujeres y no se correlaciona con la edad. La Tabla 5 muestra la distribución de las concentraciones de péptido 1 entre la población de sujetos.

Tabla 4

Tabla 5

La cantidad del péptido en el suero analizado no se asoció con la POSTN total (figura 9) ni con la POSTN medida por los anticuerpos p Os TN de USCN o Biomedica (figura 12).

Esos datos apoyan que un ensayo ELISA de la invención es capaz de detectar el fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 en sueros de población general con sensibilidad a la población de género, lo que es indicativo de una posible sensibilidad al estado de la calidad ósea.

Ejemplo 9: Fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 como marcador específico del compartimento óseo cortical

Se midieron varios marcadores óseos y características de la estructura ósea en los pacientes seleccionados en la población de pacientes del Ejemplo 8 como sigue:

CTX (telopéptido C-terminal reticulado de colágeno tipo I) y P1NP (propéptido N-terminal de procolágeno tipo 1) se utilizaron como marcadores de la resorción ósea y de la formación ósea, respectivamente, se midieron en un instrumental Cobas-6000 utilizando reactivos Elecsys (Roche diagnostics). El nivel sérico de POSTN (sPOSTN) se midió mediante un ensayo ELISA (SEH339Hu, USCN, China).

La densidad mineral ósea (BMD) del cuello femoral se determinó mediante absorciometría de rayos X de energía dual (DXA) utilizando un instrumental Hologic QDR Discovery. Se realizaron mediciones de tomografía computarizada cuantitativa periférica de alta resolución utilizando un instrumental XtremeCT (Scanco Medical AG, Basserdorf Switzerland). La exploración del antebrazo no dominante inmovilizado y la tibia distal se realizó como se describió anteriormente (Durosier et al., 2013, J Clin Endocrinol Metab, 98(9): 3873-83). En poco tiempo, se adquirió una pila de 110 cortes de tomografía computarizada (TC) sobre una longitud de 9 mm con un tamaño de vóxel isotrópico de 82 mm, comenzando proximalmente en 9,5 y 22,5 mm desde una línea de referencia del margen articular para el radio distal y la tibia distal, respectivamente. La reproducibilidad evaluada con el reposicionamiento fue 0,6-1,0 % y 2,8­ 4,9 % para las variables de densidad y microestructuras trabeculares (Tb.) y corticales (Ct.), respectivamente. Los parámetros de microestructura Tb. y Ct. (volumen óseo sobre volumen total (BV/TV), área Tb. o Ct. (Tb./Ct.Ar), espesor Tb. o Ct. (Ct.Th), momento de inercia (MI) y porosidad se evaluaron como se describió anteriormente (Chevalley et al., 2013, Bone, 55(2): 377-83).

Se llevaron a cabo análisis transversales (Tabla 6) para determinar si este péptido podría ser un marcador independiente y específico del compartimento óseo cortical.

Las correlaciones del péptido 1 y sPOSTN con los parámetros óseos se analizaron como se describe en el Ejemplo 8. Todos los datos se informaron como medias /- SD. Para tener en cuenta que no todas las variables tenían una distribución normal, las diferencias se evaluaron mediante una prueba de d'Agostino-Pearson. El ajuste CTX de los niveles medidos del péptido 1 se realizó por covarianza para demostrar que la asociación de la periostina con la estructura ósea es independiente de los marcadores clásicos de recambio óseo como CTX.

Tabla 6

sPOSTN se correlacionó positivamente con el área cortical, Ct. vBMD y parámetros de análisis de elementos finos (MI polar total, carga fallida y rigidez) y no se asoció con BMD o marcadores de recambio óseo (CTX, P1NP) (Tabla 6) que son marcadores conocidos de parámetros óseos, pero no específicos para el hueso cortical. El péptido 1 se asoció negativamente con los parámetros corticales (Ct. área tibia, Ct. VBMD, MI polar total) y los parámetros no trabeculares (Tb. VBMD), lo que confirma la asociación de la periostina con el compartimento cortical. La relación entre péptido 1 y sPOSTN, es decir, un índice de la periostina digerida se correlacionó negativamente con el área cortical, Ct. vBMD, M, carga fallida y rigidez y MI polar total. Estas asociaciones negativas siguen siendo significativas después del ajuste por CTX, lo que indica que la medición del péptido 1 proporciona información adicional que los marcadores de remodelación ósea (Tabla 6). Además, los sujetos con alta fertilidad de sPOSTN tienen un área cortical alta y rigidez, mientras que la relación entre péptido 1 y sPOSTN de alta fertilidad tiene un área cortical y rigidez significativamente más bajas (figura 10).

Juntos, los datos anteriores indican que el fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 es un marcador específico del compartimento óseo cortical que proporciona información adicional a los marcadores bioquímicos conocidos del recambio óseo (CTX, P1NP).

Ejemplo 10: Fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 como marcador específico del compartimento óseo cortical (análisis prospectivo)

Se llevó a cabo un análisis prospectivo de los marcadores y parámetros óseos, así como los niveles séricos del péptido 1 y POSTN, en 137 sujetos elegidos al azar de la población de GERICO como se describió anteriormente. En este estudio, se realizaron mediciones de la microestructura ósea (DXA, HRpQCT) 3 años después de la evaluación de los marcadores óseos para determinar si los marcadores óseos son predictivos de la estructura ósea. La BMD y la regresión de la microarquitectura del hueso tibial se recogen en la Tabla 7 según se monitorizó con el Péptido 1, sPOSTN y la relación entre Péptido 1 y sPOSTN.

Tabla 7

sPOSTN se correlacionó positivamente con BV/TV, Ct. área y CtTh de tibia y radio y no se asoció con BMD (Tabla 7). El péptido 1 se asoció negativamente con los parámetros corticales (Ct. área, CtTh). La relación entre péptido 1 y sPOSTN se correlacionó negativamente con Ct. área y CtTh de tibia y radio, lo que confirma que el fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 es un marcador específico de hueso cortical. A continuación, se realiza el mismo análisis 6 años después de la evaluación inicial de los marcadores óseos en la cohorte de 1000 sujetos.

Ejemplo 11: La asociación de fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 con compartimento óseo cortical se mantiene después del ajuste para POSTN (análisis prospectivo)

Los marcadores óseos y los parámetros de estructura ósea se analizan junto con los niveles séricos de péptido 1 y POSTN medidos con kits disponibles comercialmente (con dos kits disponibles comercialmente: Kit ELISA para periostina, Uscn Life Science, Inc. (Producto n.°: SEH339Hu) (Kit 1) y Kit ELISA para periostina, Biomedica Immunoassays (Cat. No.: BI-20433) (Kit 2) en 165 sujetos elegidos al azar de la población GERICO como se describe anteriormente. Los niveles medidos de péptido 1 se ajustaron mediante análisis de regresión múltiple con el nivel de POSTN detectado con el kit 1 o el kit 2. La BMD y la regresión de la microarquitectura ósea con péptido 1 y péptido 1 ajustado (adj.) a los niveles de POSTN medidos por el kit 1 o 2 se describen en la Tabla 8.

Tabla 8

Péptido 1 (SEQ ID NO: 2) se asoció negativamente con los parámetros corticales (Ct. área tibia, CtTh tibia/radio) y al menos para Ct. área tibia esta asociación permaneció negativa después del ajuste del nivel de péptido 1 al nivel de POSTN medida por dos kits distintos. Para CtTh tibia/radio, la asociación negativa para el péptido 1 permaneció después del ajuste del nivel del péptido 1 al nivel de POSTN medido por el kit 1. Además, después del ajuste del nivel de péptido 1 al nivel de POSTN medido por el kit 1, la asociación negativa del péptido 1 para Ct. radio se vuelve estadísticamente significativa.

La cantidad de péptido 1 en los sueros analizados no se asoció con la POSTN total medida por el kit 1 o 2 (figura 11).

Este resultado confirma que los anticuerpos desarrollados utilizados para la detección del fragmento de POSTN digerido con CatK de la invención en un suero no detectan las mismas moléculas que los anticuerpos comerciales y, por tanto, son específicos. Además, el fragmento de POSTN digerido con CatK de la invención puede servir como marcador específico del compartimento de hueso cortical.

Ejemplo 12: La asociación de fragmento de POSTN digerido con CatK de SEQ ID NO: 2 con fractura incidente (análisis prospectivo)

Se llevó a cabo un análisis de los marcadores y parámetros óseos, así como los niveles séricos del péptido 1 y POSTN, en sujetos con fractura incidente y controles emparejados.

En este estudio, dentro de la cohorte GERICO de 759 mujeres posmenopáusicas a las que se les realizó un seguimiento de hasta 6 años, se registraron 54 fracturas incidentes con traumatismo bajo y medio (fractura osteoporótica; grupo «fractura») (excluidas las fracturas vertebrales, de dedos de los pies, de dedos y de cráneo) y se compararon con sujetos emparejados por edad e índice de masa corporal (BMI) seleccionados al azar de entre GERICO (n=198, grupo «sin fractura»). Se llevó a cabo un análisis de marcadores y parámetros óseos, así como de niveles séricos de péptido 1 y POSTN, como se describe en el Ejemplo 9. La POSTn se midió con el kit ELISA para periostin, Uscn Life Science, Inc. (producto n.°: SEH339Hu). Con el fin de cuantificar cuán fuertemente se asociaron los niveles de péptido 1 con la presencia o ausencia de fractura, se calculó la razón de probabilidades basada en 1 SD del péptido 1. La regresión de riesgo instantáneo proporcional del modelo de Cox y el área bajo la curva (AUC) de la curva de la característica operativa del receptor (ROC) se realizó como modelo estadístico de supervivencia utilizando MedCalc Statistical Software versión 13.1.2. Los modelos de supervivencia relacionan el tiempo que pasa antes de que ocurra algún acontecimiento, aquí el riesgo de fractura, con una o más covariables que pueden estar asociadas con esa cantidad de tiempo.

La herramienta de evaluación del riesgo de fractura (FRAX) desarrollada por la Organización Mundial de la Salud (www.shef.ac.uk/FRAX/) y los datos específicos de cada país (Lippuner et al., 2010, Osteoporosis I nt. 21: 381-9) se utilizaron para evaluar el riesgo de fractura de los sujetos utilizando factores de riesgo clínicos como la edad, el BMI y los antecedentes de fractura con inclusión de la BMD del cuello femoral.

Las características de la cohorte se recogen en la Tabla 9 y muestran que el grupo de fractura tenía valores más bajos de BMD, parámetros de microestructura Tb. y Ct. en la tibia y el radio (BV/TV, Ct. área, Ct.Th). El nivel de péptido 1 fue significativamente mayor en el grupo de fractura que en el grupo de control (+53 %, p<0,001), mientras que los marcadores de recambio óseo clásicos (CTX, P1NP) y la POSTN total no fueron significativamente distintos entre los dos grupos.

Tabla 9

La regresión de riesgo instantáneo proporcional de Cox se obtuvo como se recoge en la Tabla 10 y mostró una asociación positiva del péptido 1 y la fractura incidente con un cociente de riesgo instantáneo de 1,58 [1,24-2,01], lo que indica que con un aumento de una desviación estándar de 1 del péptido 1, aumenta el riesgo de fractura en un 58 % (Tabla 10 A). Además, con los terciles más altos del péptido 1, el riesgo de fractura aumentó aún más con un cociente de riesgo instantáneo de 4,74 [2,16-10,40]. Las predicciones de fractura por péptido 1 siguieron siendo significativas después del ajuste por BMD del cuello, Ct. área radio, BV/TV radio o marcador CTX (Tabla 10 B-E).

Tabla 10

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, o variantes del mismo, donde dicha variante tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de esas secuencias por una o más deleciones o sustituciones conservadoras y donde la secuencia de esas variantes es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos original.

2. Un péptido según la reivindicación 1 que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, Se Q ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, o una variante del mismo, donde la secuencia de esas variantes es al menos en un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos original.

3. Un péptido aislado según las reivindicaciones 1 o 2 que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 2.

4. Un procedimiento para detectar un fragmento de POSTN en una muestra de fluido biológico de un sujeto mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto mamífero;

(b) poner dicha muestra de fluido biológico en contacto con una matriz sólida a la que se une al menos un anticuerpo, donde dicho al menos un anticuerpo es específico para un péptido o cualquier variante del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y donde el contacto se realiza en condiciones suficientes para unir un fragmento de POSTN presente en dicha muestra de fluido biológico a dicho al menos un anticuerpo a través de interacciones antígeno-anticuerpo;

(c) retirar la muestra de fluido biológico de la matriz sólida para retirar cualquier material no unido de la superficie de dicha matriz sólida;

(d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo unido a dicha matriz sólida, donde la presencia de dicho complejo es indicativa de que la muestra de fluido biológico contiene uno o más fragmentos de POSTN que comprenden una secuencia de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, donde dicho al menos un anticuerpo es específico para un péptido según la reivindicación 3.

6. Un procedimiento según las reivindicaciones 4 o 5, donde una combinación de anticuerpos o de variantes de los mismos se une a dicha matriz sólida y donde la combinación comprende: a) un anticuerpo específico para un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y b) al menos un anticuerpo específico para un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, o una variante del mismo, donde dicha variante tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de esas secuencias por una o más deleciones o sustituciones conservadoras y donde la secuencia de esas variantes es al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos original.

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde dicho al menos un anticuerpo es específico para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, donde la presencia de uno o más fragmentos de POSTN que comprenden una secuencia de un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 es indicativa de un trastorno óseo metabólico o un riesgo de fractura.

9. Uso de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 para la detección o monitorización de la progresión de un trastorno óseo metabólico o un riesgo de fractura.

10. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo específico para un péptido o variante del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 10.

13. Un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12.

14. Una célula huésped que comprende un vector recombinante según la reivindicación 12.

15. Un procedimiento para producir anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 11, que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos según la reivindicación 12, en condiciones suficientes para promover la expresión de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos.

16. Un kit para detectar un fragmento de POSTN en una muestra de fluido biológico, donde el kit comprende al menos un anticuerpo según la reivindicación 11 o al menos un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.