ES2882916T3 - Inmunoterapia resistente a medicamentos para tratamiento de un cáncer - Google Patents

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Abstract

Una composición para uso en la reducción del cáncer en un paciente que necesita tratamiento, en la que la composición comprende células asesinas naturales (NK) en las que más del 50% de las células NK han sido modificadas genéticamente para expresar un polipéptido que confiere resistencia a un agente quimioterapéutico.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoterapia resistente a medicamentos para tratamiento de un cáncer
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional Estadounidense Núm. 61/257.136, presentada el 2 de noviembre de 2009.
DECLARACIÓN SOBRE PATROCINIO FEDERAL
INVESTIGACIÓN O DESARROLLO
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la subvención NIH No. HL 087969-01A1 otorgada por los Institutos Nacionales de Salud del Gobierno de los Estados Unidos. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención
CAMPO TÉCNICO
La presente divulgación se refiere en general a procedimientos para combinar quimioterapia e inmunoterapia para el tratamiento de un cáncer. Los procedimientos también se refieren a la generación de una línea de células inmunes citotóxicas resistentes a los fármacos y a su uso en combinación con fármacos citotóxicos.
ANTECEDENTES
Aunque se han realizado progresos extraordinarios en los campos de la detección del cáncer y la biología de las células tumorales, el tratamiento del cáncer en fase avanzada y metastásico sigue siendo un reto importante. Los agentes quimioterapéuticos citotóxicos siguen siendo uno de los tratamientos anticancerígenos más utilizados y empleados con éxito. Sin embargo, no son uniformemente eficaces, y la introducción de estos agentes con terapias novedosas, tal como las inmunoterapias, es problemática. Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos pueden ser perjudiciales para el establecimiento de células inmunocompetentes antitumorales robustas debido a los perfiles de toxicidad no específicos de los agentes. Las terapias basadas en pequeñas moléculas dirigidas a las vías de proliferación celular también pueden dificultar el establecimiento de la inmunidad antitumoral. Sin embargo, si los regímenes de quimioterapia que son transitoriamente eficaces pueden combinarse con nuevas terapias de células inmunocompetentes, puede lograrse una mejora significativa en la terapia antineoplásica.
Se han identificado diversos genes resistentes a fármacos que pueden utilizarse potencialmente para conferir resistencia a los fármacos a las células diana, y los avances en las técnicas de terapia génica han permitido probar la viabilidad del uso de estos genes en estudios de terapia génica de resistencia a los fármacos (Sugimoto et al., (2003) J. Gene Med. 5: 366-376 Spencer et al., (1996) Blood 87: 2579-2587 Takebe et al., (2001) Mol. Ther. 3: 88­ 96 Kushman et al., (2007) Carcinogenesis. 28: 207-214 Nivens et al., (2004) Cancer Chemother. Pharmacol. 53: 107­ 115; Bardenheuer et al., (2005) Leukemia 19: 2281-2288 Zielske et al., (2003) J. Clin. Invest. 112: 1561-1570). Por ejemplo, se utilizó una estrategia de ARNhc para disminuir los niveles de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT), que confiere resistencia a la 6-tioquina (Porter & DeGregori (2008) Gene Ther. 112: 4466-4474). Además, el gen MGMT resistente a los fármacos que codifica la alquil guanina transferasa humana (hAGT) es una proteína de reparación del ADN que confiere resistencia a los efectos citotóxicos de los agentes alquilantes, tal como las nitrosoureas y la temozolomida (TMZ). La 6-bencilguanina (6-BG) es un inhibidor de AGT que potencia la toxicidad de la nitrosourea y se coadministra con TMZ para potenciar los efectos citotóxicos de este agente. Varias formas mutantes de MGMT que codifican variantes de AGT son muy resistentes a la inactivación por 6-BG, pero conservan su capacidad de reparar daños en el ADN (Maze et al., (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 290: 1467-1474). Se ha demostrado que la terapia génica resistente a los fármacos basada en P140KMGMT confiere quimioprotección a las células de ratón, caninas, de macacos rhesus y humanas, específicamente a las células hematopoyéticas (Zielske et al., (2003) J. Clin. Invest. 112: 1561-1570 Pollok et al., (2003) Hum. Gene Ther. 14: 1703-1714 Gerull et al., (2007) Hum. Gene Ther. 18: 451-456 Neff et al., (2005) Blood 105: 997-1002; Larochelle et al., (2009) J. Clin. Invest. 119: 1952-1963 Sawai et al., (2001) Mol. Ther. 3: 78-87).
El glioblastoma multiforme (GBM) es el tipo de tumor cerebral primario más común y más agresivo en los seres humanos, que afecta a las células gliales y representa el 52% de todos los casos de tumores cerebrales parenquimatosos y el 20% de todos los tumores intracraneales. A pesar de ser la forma más prevalente de tumor cerebral primario, los GBM sólo se presentan en 2-3 casos por cada 100.000 personas en Europa y Norteamérica. El nombre estándar de este tumor cerebral es "glioblastoma"; presenta dos variantes: glioblastoma de células gigantes y gliosarcoma. Los glioblastomas son también un importante tumor cerebral del canino, y se está investigando para utilizarlo como modelo para desarrollar tratamientos en humanos.
El glioblastoma tiene uno de los peores pronósticos entre los cánceres. El tratamiento puede incluir quimioterapia, radioterapia y cirugía, sola o en combinación, pero el resultado sigue siendo normalmente desfavorable para el paciente. Por ejemplo, la mediana de supervivencia con la radioterapia y quimioterapia estándar con temozolomida es de sólo 15 meses. La mediana de supervivencia sin tratamiento es de aproximadamente cuatro meses y medio. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad urgente de procedimientos que mejoren, sustituyan o complementen los procedimientos actuales de tratamiento de dichos cánceres y, en particular, de aquellos que presentan respuestas transitorias a la quimioterapia. La inmunoterapia ofrece un procedimiento complementario de este tipo si se puede eludir la citotoxicidad del quimioagente.
SUMARIO
El establecimiento de la inmunidad antitumoral mediada por células inmunocompetentes suele verse mitigado por los efectos mielosupresores durante la quimioterapia. La presente divulgación proporciona procedimientos para proteger estas células inmunitarias de las toxicidades inducidas por los fármacos, permitiendo así la administración combinada de inmuno y quimioterapia, un tratamiento anticanceroso denominado "inmunoterapia resistente a fármacos". Utilizando un sistema lentiviral basado en VIS, el elemento genético que confiere resistencia a los fármacos puede administrarse en líneas celulares inmunocompetentes. Las células inmunocompetentes modificadas genéticamente desarrollaron una resistencia significativa a un agente citotóxico quimioterapéutico específico en comparación con las células no modificadas, y no afectaron a su capacidad de eliminar las células cancerosas diana en presencia o ausencia de un agente quimioterapéutico. La ingeniería de las células inmunocompetentes para resistir los desafíos de la quimioterapia puede mejorar la eliminación de las células tumorales cuando se aplica la quimioterapia junto con la inmunoterapia celular.
Un aspecto de la presente invención, por lo tanto, abarca una composición para uso en la reducción del cáncer en un paciente que necesita tratamiento, en el que la composición comprende células asesinas naturales (NK) en el que más de aproximadamente el 50% de las células NK expresan un polipéptido que confiere resistencia a un agente de quimioterapia.
En ciertas realizaciones de la invención, el cáncer es un glioblastoma.
En ciertas realizaciones de la invención, la composición se coadministra al paciente con el agente de quimioterapia.
En ciertas realizaciones de la invención, la composición y el agente de quimioterapia se coadministran al paciente secuencialmente.
En ciertas realizaciones de la invención, la composición se administra al paciente directamente al cáncer o a un vaso sanguíneo proximal y que deriva en el cáncer.
Un aspecto de la presente invención abarca un procedimiento de obtención de una población de células NK aisladas modificadas genéticamente para que sean resistentes a un agente terapéutico que comprende las etapas de: cultivar una población de células n K aisladas de un individuo humano o animal, aumentando así la población de las células; transfectar de forma estable la población de células NK con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga unida de forma operable a un promotor, en el que la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica un polipéptido que confiere a la célula resistencia al agente terapéutico.
En ciertas realizaciones de la invención, el agente terapéutico es trimetotrexato o metotrexato, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica la dihidrofolato reductasa, o uno de sus derivados.
En ciertas realizaciones de la invención, el agente terapéutico es la temozolomida, o uno de sus derivados terapéuticos, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica la O6-metilguanina-ADN-metiltransferasa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Muchos aspectos de la divulgación pueden comprenderse mejor con referencia a los siguientes dibujos.
La Fig. 1 compara de forma esquemática un protocolo para combinar inmunoterapia y quimioterapia en el tratamiento de un cáncer, en el que las células inmunitarias son sensibles (arriba) y resistentes (abajo) al agente quimioterapéutico. En el esquema no resistente, una respuesta antitumoral es proporcionada por citoquinas como IL-2, IL-12, GM-CSF y similares.
Las Figs. 2A y 2B son gráficos que muestran que las células y§ matan a las líneas celulares de glioblastoma en una forma de respuesta a la dosis (Fig. 2A), y la viabilidad de las células de glioblastoma disminuye con cantidades crecientes de células y§ (Fig. 2B).
La Fig. 2C muestra una serie de imágenes digitales en las que se aprecia la eliminación de células de glioblastoma.
La Fig. 3 muestra un gráfico de barras que ilustra la citotoxicidad de las células y§T aisladas contra varios aislamientos de células de glioblastoma cultivadas, incluyendo: células glioblastomales primarias cultivadas (GBM 1 y GBM 2) y líneas celulares cultivadas D54MG, U251MG y U373.
La Fig. 4 muestra un par de gráficos de barras que ilustran que las células implicadas en la respuesta inmunitaria adaptativa son sensibles a los actuales regímenes de tratamiento del glioblastoma (izquierda). Las células y§ son igualmente sensibles (derecha).
La Fig. 5 es un gráfico que muestra la expresión de los antígenos de estrés de la superficie celular MICA/B inducida por el agente quimioterapéutico Temozolamida (TMZ).
La Fig. 6 es un gráfico que muestra que la expresión de los antígenos de estrés de la superficie celular MICA/B inducida por el agente quimioterapéutico Temozolamida (TMZ) es transitoria.
La Fig. 7 muestra una serie de imágenes digitales del desarrollo de glioblastomas en ratones inyectados con solución salina (arriba) y con células T y§ (abajo).
La Fig. 8 es un gráfico que muestra la densidad de imágenes en ratones de 1 a 3 semanas después de la inducción del tumor y del tratamiento con solución salina (círculos negros) o con células T y§ (círculos abiertos).
La Fig. 9 es un gráfico que muestra el aumento de la supervivencia de los ratones con glioblastomas inducidos tras el tratamiento con células T y§ (círculos abiertos).
La Fig. 10 compara de forma esquemática un protocolo para combinar la inmunoterapia con células T y§ y la quimioterapia en el tratamiento de un cáncer, en la que las células inmunes y§ son sensibles (arriba) y resistentes (abajo) al agente quimioterapéutico.
La Fig. 11 es un gráfico que ilustra que la transducción de fibroblastos con una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica MGMT confiere resistencia al compuesto BCNU (bis-cloronitrosourea; CARMUSTINE™), un compuesto de a-cloro-nitrosourea relacionado con el gas mostaza que se utiliza como agente alquilante en quimioterapia, en particular para el tratamiento de glioblastomas.
La Fig. 12 muestra esquemáticamente la región de un lentivirus que incluye dos repeticiones terminales largas (LTR) y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una proteína verde fluorescente (GFP) o la variante P104K de MGMT.
La Fig. 13 es una serie de fotografías digitales que ilustran la transducción de células y§T con construcciones SIV-GFP o SIV-MGMT. Los paneles superiores muestran una alta eficiencia de transducción utilizando una construcción que codifica GFP. Según lo esperado, no se observa fluorescencia con MGMT (panel inferior).
La Fig. 14 es un gráfico que muestra que la administración de un agente quimioterapéutico a un régimen anticanceroso, que también requiere la expansión de células T, disminuye la eficacia del tratamiento basado en células. Esta disminución es muy pronunciada cuando los ratones han sido sometidos a un procedimiento de trasplante de médula ósea, que es un procedimiento común para los pacientes que se someten a tratamiento para varios tipos de cáncer.
La Fig. 15 muestra de forma esquemática un protocolo experimental para tratar un cáncer con células inmunes resistentes a los fármacos. En este protocolo, se cosechó médula ósea de ratones y se transduce con un vector lentivirus recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica la variante L22YDHFR. Las células transducidas se trasplantaron a ratones receptores irradiados. Al cabo de 4 semanas se trasplantaron células de sarcoma AG104. Dos semanas después, los ratones recibirían una inmunoterapia compuesta por anticuerpos anti-CD137 seguida de quimioterapia (TMTX).
La Fig. 16 muestra un par de gráficos que ilustran el efecto del tratamiento de quimioterapia (TMTX) solo o de la inmunoterapia sola (estimulación de los linfocitos citotóxicos con anticuerpos anti-CD137). En cada caso se siguió el esquema de protocolo que se muestra en la Fig. 15.
La Fig. 17 muestra un gráfico que ilustra la reducción rápida y prolongada del tamaño del tumor AG104 con la combinación de inmunoterapia y quimioterapia en la que el sistema inmunitario de los ratones portadores de tumores se hizo resistente al TMTx mediante la transducción con L22YDHFR.
La Fig. 18 muestra un gráfico de supervivencia de ratones portadores de DHFR trasplantados con células de sarcoma AG104 y tratados con TMTx y/o inmunoterapia anti-CD137.
La Fig. 19 muestra un gráfico de supervivencia de los ratones que recibieron esplenocitos aislados de ratones portadores de tumores y curados con DHFR y que luego fueron desafiados con células de sarcoma AG104.
La Fig. 20A y la Fig. 20B muestran datos que sugieren que las células T y§ modificadas genéticamente mataron tanto a las células GBM wt como a las resistentes a la TMZ en presencia del agente. Las células T Y5 no modificadas no son activas en presencia de TMZ. Em son células T y§ modificadas genéticamente. E son células T y§ no modificadas. T es SB19 TMZ resistente.
La Fig. 21 muestra datos que sugieren que la modificación genética de las células T y§ confiere resistencia a la TMZ. Las células T y§ fueron transducidas (MOI = 20) con SIV-MGMT-DHFR en el día 8 de expansión y la viabilidad celular se midió en el día 14. La viabilidad se evaluó mediante la captación de yoduro ToPro.
La Fig. 22 muestra datos que sugieren que las células T y§ modificadas genéticamente conservan sus citotoxicidades hacia las células del GBM. E son células T y§ de tipo salvaje; Em son células T y§ modificadas genéticamente T son líneas celulares SB19 (GBM); (ensayo de citotoxicidad de cuatro horas).
La Fig. 23 muestra un modelo molecular de DHFR y las localizaciones de los sitios de variantes. También se muestra un gráfico que muestra la eficacia de las variantes para conferir resistencia al fármaco a las células transfectadas y que expresan los polipéptidos variantes.
Las Figs. 24A-24D son una serie de gráficos que ilustran la determinación de las eficiencias de transducción para células diana inmunocompetentes y experimentales.
La Fig. 24A ilustra los esquemas de las construcciones vectoriales de SIV que codifican para eGFP (arriba) y P140KMGMT (abajo).
La Fig. 24B es una imagen de un análisis de citometría de flujo de células NK-92 transducidas con lentivirus SIV-eGFP.
La Fig. 24C es una imagen de un análisis de citometría de flujo de células TALL-104 transducidas con lentivirus SIV-eGFP.
La Fig. 24D es una imagen de un análisis de citometría de flujo de células K562 transducidas con lentivirus SIV-eGFP.
La Fig. 25A es una serie de gráficos que muestran los análisis de las curvas de supervivencia de las células NK-92 modificadas por P140KMGMT (círculos abiertos) y las no modificadas (círculos cerrados) (panel izquierdo), las células TALL-104 (panel central) y las células K562 (panel derecho) tras el tratamiento con 6-BG/TMZ. Las células fueron tratadas con 25 pM de 6-BG y concentraciones crecientes de TMZ. Cuarenta y ocho horas después, se midió la viabilidad de las células mediante el procedimiento del azul de tripán. Cada punto de datos en todos los gráficos representa la media de valores por triplicado.
La Fig. 25B es un par de gráficos que muestran las actividades citotóxicas de las células inmunitarias efectoras NK-92 (panel de la izquierda) y de las células TALL-104 (panel de la derecha) contra las células diana K562 en diferentes proporciones de células efectoras:diana (E:T). Se mezclaron diferentes concentraciones de células modificadas con P140KMGMT (círculos abiertos), células modificadas con el gen después de la selección con 25 pM 6-BG/ 200 pM TMZ (triángulo invertido), o células no modificadas (círculos cerrados) con una concentración fija de las células diana y se realizaron ensayos de liberación de LDH después de 4 horas. Cada punto de datos en todos los gráficos representa la media de valores por triplicado.
La Fig. 26 es un par de gráficos que muestran la lisis mediada por células efectoras inmunes no diseñadas de las células K562 diana. Las células efectoras no modificadas (E) y las células K562 diana no modificadas (T) o modificadas genéticamente (Tm) fueron tratadas con 25 pM 6-BG/ 200 pM TMZ durante la noche. A continuación, las células efectoras no modificadas (E) se mezclaron con células K562 diana no modificadas (T) o modificadas genéticamente (Tm) en una proporción E:T de 10:1. A continuación se midieron las actividades citotóxicas de las células efectoras. El panel A representa la lisis mediada por células NK-92; el panel B representa la lisis mediada por células TALL-104.
Las Figs. 27A-27D son una serie de gráficos que ilustran la lisis mediada por células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente de las células K562 diana en presencia de 6-Bg /TMZ. Las células efectoras no modificadas (E) y modificadas genéticamente (Em), y las células diana no modificadas (T) o modificadas genéticamente (Tm) fueron tratadas con 25 pM 6-BG/ 200 pM TMZ durante la noche. Las células efectoras no modificadas o modificadas se incubaron con células diana modificadas genéticamente en una proporción E:T de 10:1, y se midieron las actividades citotóxicas de las células efectoras. Se mezclaron diferentes combinaciones de células efectoras no modificadas o modificadas genéticamente con células diana no modificadas o modificadas genéticamente en una proporción E:T de 10:1. Se determinó la citotoxicidad de las células efectoras.
La Fig. 28 muestra las secuencias de nucleótidos que codifican la MGMT y la DHFR optimizadas en codones para su expresión en células de mamífero.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Antes de que la presente divulgación se describa con mayor detalle, debe comprenderse que esta divulgación no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que éstas pueden, por supuesto, variar. También debe comprenderse que la terminología empleada en la presente memoria tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente divulgación estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior (a menos que el contexto dicte claramente lo contrario), entre el límite superior y el inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo declarado, está incluido en la divulgación. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños pueden incluirse de forma independiente en los intervalos más pequeños y también se engloban dentro de la divulgación, sin perjuicio de cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo declarado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en la divulgación.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria también puede utilizarse en la práctica o en las pruebas de la presente divulgación, ahora se describen los procedimientos y materiales preferentes.
La cita de cualquier publicación es para su divulgación anterior a la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que la presente divulgación no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de la divulgación anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas reales de publicación, que deben ser confirmadas de forma independiente.
Como será aparente para los expertos en la técnica tras leer esta divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en la presente memoria tiene componentes y características discretas que pueden ser fácilmente separadas o combinadas con las características de cualquiera de las otras realizaciones sin apartarse del alcance de la presente divulgación. Cualquier procedimiento recitado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos recitados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
Las realizaciones de la presente divulgación emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas de química, química orgánica sintética, bioquímica, biología, biología molecular, imagen molecular y similares, que están dentro de las habilidades de la técnica. Estas técnicas se explican ampliamente en la literatura.
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa de cómo realizar los procedimientos y utilizar las composiciones y los compuestos que se describen y reivindican en la presente memoria. Se ha procurado garantizar la exactitud de las cifras (por ejemplo, las cantidades, la temperatura, etc.), pero deben considerarse algunos errores y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura es en °C y la presión es la atmosférica o una cercana. La temperatura y la presión estándar se definen como 20 °C y 1 atmósfera.
Antes de que se describan en detalle las realizaciones de la presente divulgación, debe comprenderse que, a menos que se indique lo contrario, la presente divulgación no se limita a materiales particulares, reactivos, materiales de reacción, procesos de fabricación o similares, ya que éstos pueden variar. También debe comprenderse que la terminología empleada en la presente memoria tiene por objeto describir únicamente determinadas realizaciones y no pretende ser limitativa. También es posible en la presente divulgación que las etapas se ejecuten en una secuencia diferente cuando esto sea lógicamente posible.
Cabe señalar que, tal y como se utiliza en la especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un soporte" incluye una pluralidad de soportes. En esta especificación y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán con el siguiente significado, a menos que sea evidente una intención contraria.
Definiciones
Al describir y reivindicar el tópico desvelado, se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones establecidas a continuación.
Por "administración" se entiende la introducción de un compuesto, materiales biológicos que incluyen una población celular, o una de sus combinaciones, de la presente divulgación en un individuo humano o animal. La vía de administración preferente de los compuestos es la intravenosa. Sin embargo, puede utilizarse cualquier vía de administración, tal como oral, tópica, subcutánea, peritoneal, intraarterial, inhalación, vaginal, rectal, nasal, introducción en el líquido cefalorraquídeo o instilación en compartimentos corporales. También se contempla la inyección directa en un sitio de tejido diana, tal como un tumor sólido.
Los términos "agente terapéutico", "agente quimioterapéutico" o "fármaco", tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a un compuesto o a uno de sus derivados que puede interactuar con una célula cancerosa, reduciendo así el estado proliferativo de la célula y/o matándola. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, ifosamida), antagonistas metabólicos (por ejemplo, metotrexato (MTX), 5-fluorouracilo o sus derivados), antibióticos antitumorales (por ejemplo, mitomicina, adriamicina), agentes antitumorales derivados de plantas (por ejemplo, vincristina, vindesina, Taxol), cisplatino, carboplatino, etopósido y similares. Dichos agentes pueden incluir además, pero sin limitación, los agentes anticancerígenos TRIMETHOTRIXATE™ (TMTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-Nitrobencil)-6-tioinosina (NBMPR), 6-bencilguanidina (6-Bg ), bis-cloronitrosourea (BCNU) y CAMPTOTHECIN™, o un derivado terapéutico de cualquiera de estos.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la cantidad del compuesto que se administra que aliviará en cierta medida uno o más de los síntomas de una enfermedad, una condición o un trastorno que se está tratando. En referencia al cáncer o a las patologías relacionadas con la división celular no regulada, una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad que tiene el efecto de (1 ) reducir el tamaño de un tumor, (2 ) inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto, preferentemente detener) la división celular aberrante, por ejemplo la división de las células cancerosas, (3) prevenir o reducir la metástasis de las células cancerosas, y/o, (4) aliviar hasta cierto punto (o, preferentemente, eliminar) uno o más síntomas asociados a una patología relacionada o causada en parte por la división celular no regulada o aberrante, incluyendo, por ejemplo, el cáncer, o la angiogénesis.
Los términos "tratar" o "tratamiento" de una enfermedad (o una afección o un trastorno), tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a la prevención de la enfermedad en un animal que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que todavía no experimenta o muestra síntomas de la misma (tratamiento profiláctico), a la inhibición de la enfermedad (ralentizando o deteniendo su desarrollo), al alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluyendo el tratamiento paliativo), y al alivio de la enfermedad (causando la regresión de la enfermedad). En lo que respecta al cáncer, estos términos también significan que la esperanza de vida de un individuo afectado por un cáncer puede aumentar o que uno o varios de los síntomas de la enfermedad se reducirán.
Los términos "individuo" y "paciente", tal y como se utilizan en la presente memoria, incluyen a los seres humanos, los mamíferos (por ejemplo, gatos, perros, caballos, etc.), células vivas, y otros organismos vivos. Un organismo vivo puede ser tan simple como, por ejemplo, una sola célula eucariota o tan complejo como un mamífero. Los huéspedes típicos a los que se pueden administrar las realizaciones de la presente divulgación son los mamíferos, en particular los primates, especialmente los seres humanos. Para las aplicaciones veterinarias, será adecuada una amplia variedad de sujetos, por ejemplo, ganado tal como vacuno, ovejas, cabras, vacas, cerdos y similares; aves de corral tal como pollos, patos, gansos, pavos y similares; y animales domésticos, en particular mascotas tal como perros y gatos. Para aplicaciones de diagnóstico o de investigación, una amplia variedad de mamíferos serán sujetos adecuados, incluyendo roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsters), conejos, primates y cerdos, tal como cerdos endogámicos y similares. En algunas realizaciones, un sistema incluye una muestra y un individuo. El término "huésped vivo" se refiere a los huéspedes u organismos mencionados anteriormente que están vivos y no están muertos. El término "huésped vivo" se refiere a todo el huésped u organismo y no sólo a una parte extirpada (por ejemplo, un hígado u otro órgano) del huésped vivo.
El término "células T y8 (células T gamma delta)", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un pequeño subconjunto de células T que pueden unirse específicamente a un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. La mayoría de las células T tienen un TCR compuesto por dos cadenas de glicoproteínas llamadas cadenas a- y p-TCR. En cambio, en las células T y8, el TCR está formado por una cadena y y una cadena 8. Este grupo de células T suele ser mucho menos común que las células T ap, pero se encuentran en su mayor abundancia en la mucosa intestinal, dentro de una población de linfocitos conocida como linfocitos intraepiteliales (IEL).
Las moléculas antigénicas que activan las células T y8 son todavía muy desconocidas. Sin embargo, las células T y8 son peculiares en el sentido de que no parecen requerir el procesamiento del antígeno y la presentación del MHC de los epítopos peptídicos, aunque algunas reconocen las moléculas MHC de clase IB. Además, se presume que las células T y8 tienen un papel destacado en el reconocimiento de los antígenos lipídicos, y que responden a los antígenos relacionados con el estrés, tal como MIC-A y MIC-B.
El término "cáncer", tal y como se utiliza en la presente memoria, tendrá su significado ordinario, como término general para las enfermedades en las que las células anormales se dividen sin control. En particular, y en el contexto de las realizaciones de la presente divulgación, el cáncer se refiere al cáncer relacionado con la angiogénesis. Las células cancerosas pueden invadir los tejidos cercanos y propagarse a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Hay varios tipos principales de cáncer, por ejemplo, el carcinoma es un cáncer que comienza en la piel o en los tejidos que revisten o recubren los órganos internos. El sarcoma es un cáncer que comienza en los huesos, cartílagos, grasas, músculos, vasos sanguíneos u otro tejido conectivo o de soporte. La leucemia es un cáncer que se inicia en el tejido hematopoyético, tal como la médula ósea, y provoca la producción de un gran número de células sanguíneas anormales que entran en el torrente sanguíneo. El linfoma es un cáncer que comienza en las células del sistema inmunitario.
Cuando las células normales pierden su capacidad de comportarse como una unidad específica, controlada y coordinada, se forma un tumor. Por lo general, un tumor sólido es una masa anormal de tejido que no suele contener quistes ni áreas líquidas (algunos tumores cerebrales sí tienen quistes y áreas necróticas centrales llenas de líquido).
Un mismo tumor puede incluso tener diferentes poblaciones de células en su interior, con diferentes procesos que se han estropeado. Los tumores sólidos pueden ser benignos (no cancerosos) o malignos (cancerosos). Los diferentes tipos de tumores sólidos reciben el nombre del tipo de células que los forman. Algunos ejemplos de tumores sólidos son sarcomas, carcinomas y linfomas. Las leucemias (cánceres de la sangre) no suelen formar tumores sólidos.
Los cánceres representativos incluyen, pero sin limitación, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, la leucemia, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer gástrico, glioma de tronco cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, glioblastoma, ependimoma, tumores de la familia del sarcoma de Ewing, tumor de células germinales, cáncer extracraneal, enfermedad de Hodgkin, leucemia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, cáncer de hígado, meduloblastoma, neuroblastoma, tumores cerebrales en general, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno óseo, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcomas de tejidos blandos en general, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineales, glioma de la vía visual e hipotalámico, tumor de Wilms, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda del adulto, linfoma no Hodgkin del adulto, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cáncer de esófago, leucemia de células pilosas, cáncer de riñón, mieloma múltiple, cáncer oral, cáncer de páncreas, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, entre otros.
Un tumor puede clasificarse como maligno o benigno. En ambos casos, se produce una agregación y proliferación anormal de células. En el caso de un tumor maligno, estas células se comportan de forma más agresiva, adquiriendo propiedades de mayor invasión. En última instancia, las células tumorales pueden incluso adquirir la capacidad de desprenderse del entorno microscópico en el que se originaron, extenderse a otra área del cuerpo (con un entorno muy diferente, que normalmente no favorece su crecimiento) y continuar su rápido crecimiento y división en esta nueva ubicación. Esto se llama metástasis. Una vez que las células malignas han hecho metástasis, conseguir una cura es más difícil. Los tumores benignos tienen menos tendencia a invadir y son menos propensos a hacer metástasis.
Los tumores cerebrales se extienden ampliamente dentro del cerebro pero no suelen hacer metástasis fuera de éste. Los gliomas son muy invasivos dentro del cerebro, incluso atravesando los hemisferios. Sin embargo, se dividen de forma incontrolada. Dependiendo de su localización, pueden ser tan peligrosos para la vida como las lesiones malignas. Un ejemplo de esto sería un tumor benigno en el cerebro, que puede crecer y ocupar espacio dentro del cráneo, provocando un aumento de la presión en el cerebro.
El término "reducción de un cáncer", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una reducción del tamaño o del volumen de una masa tumoral, a una disminución del número de tumores con metástasis en un individuo, a una disminución del estado proliferativo (el grado de multiplicación de las células cancerosas) de las células cancerosas, y similares.
Los términos "aislado" y población aislada de células", tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a una célula o a una pluralidad de células extraídas del tejido o del estado en el que se encuentran en un individuo. Los términos pueden incluir además células que han sido separadas de acuerdo con parámetros tales como, pero no limitados a, marcadores de la superficie celular, un marcador reportero tal como un tinte o etiqueta,
El término "expresado" o "expresión", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la transcripción de un gen para dar una molécula de ácido nucleico de ARN al menos complementaria en parte a una región de una de las dos cadenas de ácido nucleico del gen. El término "expresado" o "expresión", tal y como se utiliza en la presente memoria, también se refiere a la traducción de dicha molécula de ácido nucleico de ARN para dar una proteína, un polipéptido o una de sus porciones o fragmentos.
El término "promotor", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la secuencia de ADN que determina el sitio de inicio de la transcripción de una ARN polimerasa. Un "elemento promotor-proximal" puede ser una secuencia reguladora dentro de aproximadamente 200 pares de bases del sitio de inicio de la transcripción.
El término "célula recombinante" se refiere a una célula que tiene una nueva combinación de segmentos de ácido nucleico que no están unidos covalentemente entre sí en la naturaleza. Una nueva combinación de segmentos de ácido nucleico puede introducirse en un organismo utilizando una amplia gama de técnicas de manipulación de ácidos nucleicos disponibles para los expertos en la técnica. Una célula recombinante puede ser una única célula eucariota, o una única célula procariota, o una célula de mamífero. La célula recombinante puede albergar un vector que es extragenómico. Un vector de ácido nucleico extragenómico no se inserta en el genoma de la célula. Una célula recombinante puede albergar además un vector o una porción del mismo que sea intragenómico. El término "intragenómico" define una construcción de ácido nucleico incorporada dentro del genoma de la célula recombinante.
Los términos "ácido nucleico recombinante" y "ADN recombinante", tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a combinaciones de al menos dos secuencias de ácido nucleico que no se encuentran de forma natural en una célula eucariota o procariota. Las secuencias de ácido nucleico incluyen, pero sin limitación, vectores de ácido nucleico, elementos reguladores de la expresión génica, orígenes de replicación, secuencias génicas adecuadas que cuando se expresan confieren resistencia a los antibióticos, secuencias codificadoras de proteínas y similares. El término "polipéptido recombinante" incluye un polipéptido producido mediante técnicas de ADN recombinante que es distinto de un polipéptido natural, ya sea en su localización, pureza o estructura. Generalmente, dicho polipéptido recombinante está presente en una célula en una cantidad diferente a la que normalmente se observa en la naturaleza.
Los términos "operativamente" u "operativamente vinculado", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a la configuración de las secuencias de codificación y control para realizar la función deseada. Por lo tanto, las secuencias de control vinculadas de forma operativa a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante. Una secuencia codificadora está vinculada de forma operativa o bajo el control de regiones reguladoras de la transcripción en una célula cuando la ADN polimerasa se une a la secuencia promotora y transcribe la secuencia codificadora en ARNm que puede traducirse en la proteína codificada. No es necesario que las secuencias de control sean contiguas a la secuencia codificante, a condición de que funcionen para dirigir su expresión. Así, por ejemplo, puede haber secuencias intermedias no traducidas pero transcritas entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora puede seguir considerándose "operativamente unida" a la secuencia codificante.
Los términos "heterólogo" y "exógeno", en lo que respecta a las secuencias de ácido nucleico, tal como las secuencias codificantes y las secuencias de control, denotan secuencias que no están normalmente asociadas con una región de una construcción recombinante o con un locus cromosómico particular, y/o no están normalmente asociadas con una célula particular. Por lo tanto, una región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico es un segmento identificable de ácido nucleico dentro de otra molécula de ácido nucleico o unido a esta que no se encuentra asociado a la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una punta de construcción puede incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias que no se encuentran asociadas a la secuencia codificante en la naturaleza. Otro ejemplo de secuencia codificante heteróloga es una construcción en la que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). Del mismo modo, una célula huésped transformada con una construcción que no está normalmente presente en la célula huésped se consideraría heteróloga a efectos de esta invención.
En algunas realizaciones, el promotor se modifica mediante la adición o supresión de secuencias, o se sustituye por secuencias alternativas, incluyendo secuencias naturales y sintéticas, así como secuencias que pueden ser una combinación de secuencias sintéticas y naturales. Muchos promotores eucariotas contienen dos tipos de secuencias de reconocimiento: la caja TATA y los elementos promotores corriente arriba. El primero, situado corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción, participa en la dirección de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción en el sitio correcto, mientras que el segundo parece determinar la tasa de transcripción y se encuentra corriente arriba de la caja TATA. Los elementos potenciadores también pueden estimular la transcripción a partir de promotores vinculados, pero muchos funcionan exclusivamente en un tipo de célula particular. Muchos elementos potenciadores/promotores derivados de virus, por ejemplo el SV40, el virus del sarcoma de Rous (RSV) y los promotores del CMV, son activos en una amplia gama de tipos de células y se denominan "constitutivos" o "ubicuos" La secuencia de ácido nucleico insertada en el sitio de clonación puede tener cualquier marco de lectura abierto que codifique un polipéptido de interés, con la condición de que cuando la secuencia codificadora codifique un polipéptido de interés, debe carecer de sitios de empalme crípticos que puedan bloquear la producción de moléculas de ARNm apropiadas y/o producir moléculas de ARNm aberrantemente empalmadas o anormales.
La región de terminación que se emplea principalmente será una de conveniencia, ya que las regiones de terminación parecen ser relativamente intercambiables. La región de terminación puede ser nativa de la secuencia de ácido nucleico de interés, o puede derivarse de otra fuente.
El término "vector", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un polinucleótido compuesto por ADN o ARN monocatenario, bicatenario, circular o superenrollado. Un vector típico puede estar compuesto por los siguientes elementos unidos operativamente a distancias apropiadas para permitir la expresión funcional del gen: origen de replicación, promotor, potenciador, secuencia líder de ARNm en 5', sitio de unión ribosomal, casete de ácido nucleico, sitios de terminación y poliadenilación, y secuencias marcadoras seleccionables. Uno o varios de estos elementos pueden omitirse en aplicaciones específicas. El casete de ácido nucleico puede incluir un sitio de restricción para la inserción de la secuencia de ácido nucleico a expresar. En un vector funcional, el casete de ácido nucleico contiene la secuencia de ácido nucleico que debe expresarse, incluidos los sitios de iniciación y terminación de la traducción.
Se construye un vector de manera tal que la secuencia codificadora particular se ubique en el vector con las secuencias reguladoras adecuadas, siendo el posicionamiento y la orientación de la secuencia codificadora con respecto a las secuencias de control tal que la secuencia codificadora se transcriba bajo el "control" de las secuencias de control o reguladoras. La modificación de las secuencias que codifican la proteína particular de interés puede ser deseable para lograr este fin. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia para que pueda unirse a las secuencias de control con la orientación adecuada; o para mantener el marco de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificadora antes de su inserción en un vector. Alternativamente, la secuencia codificadora puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contenga las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado que esté en el marco de lectura con las secuencias de control y bajo su control regulador.
El término "vector basado en lentivirus", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un vector lentiviral diseñado para insertar de forma operativa una secuencia de polinucleótidos exógena en el genoma del huésped de forma específica. Los vectores de focalización basados en lentivirales pueden basarse en, pero sin limitación, por ejemplo, el VIH-1, el VIH-2, el virus de la inmunodeficiencia simia (VIS) o el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF). En una realización preferente, el vector de orientación basado en lentivirus es un vector de orientación basado en VIH. Este vector puede comprender toda o una parte de la secuencia polinucleotídica del VIH.
Los términos "transformación" y "transducción" denotan la introducción de un polinucleótido en una célula o células receptoras.
Discusión
Una limitación importante de los tratamientos de quimioterapia para el cáncer es la toxicidad inmunológica inducida por el fármaco. Esto da lugar, tras la administración del agente terapéutico, a la muerte de células inmunocompetentes y a la pérdida de un sistema inmunitario eficaz que, de otro modo, evitaría infecciones indeseables o proporcionaría una defensa contra las células cancerosas. Una estrategia para combatir los graves efectos tóxicos de la quimioterapia es la ingeniería genética de las células de la sangre o de la médula mediante la introducción de vectores retrovirales diseñados para expresar secuencias de ADNc que confieren resistencia a los fármacos. La introducción de genes resistentes a los fármacos en las células madre hematopoyéticas (HSC) da lugar a la expresión del transgén en todo el sistema hematopoyético del huésped, incluidas las células inmunocompetentes, tal como las células T y las células asesinas naturales, tras el trasplante de las células modificadas genéticamente en un paciente receptor, como describen McMillin et al., (2006) Human Gene Therapy 17:798-806. El paciente puede entonces desarrollar un sistema inmunitario activo mientras se somete al mismo tiempo a la quimioterapia. Sin embargo, en el caso de la expresión del transgén HSC, con el tiempo no todas las células T y las células asesinas naturales del sujeto expresan el gen resistente al fármaco. Por ejemplo, McMillin et al. (2005) desvela que menos del 50% de las células NK contenían un marcador expresivo 8 semanas después del trasplante. Véase la Figura 3 de McMillin et al.
Una estrategia alternativa es modificar genéticamente de forma selectiva las células inmunocompetentes citotóxicas que pueden dirigirse activamente a aquellas células cancerosas capaces de resistir la administración simultánea de un agente quimioterapéutico, eliminando así de forma efectiva la mayoría, si no todas, las células cancerosas del paciente.
En la presente memoria se describen composiciones aisladas que comprenden células asesinas naturales en las que más del 50% de las células asesinas naturales expresan un polipéptido que confiere resistencia a un agente quimioterapéutico. También se describen en la presente memoria composiciones aisladas que comprenden células T asesinas naturales en las que más del 50% de las células T asesinas naturales comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que confiere resistencia a un agente quimioterapéutico. También se describen en la presente memoria composiciones aisladas que consisten esencialmente en células T asesinas naturales que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que confiere resistencia a un agente quimioterapéutico. En ciertas realizaciones, el polipéptido que confiere resistencia a un agente quimioterápico es la O6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (Mg Mt ), una variante resistente a los fármacos de dihidrofolato reductasa (L22Y-DHFR), timidilato sintasa, proteína de resistencia a múltiples fármacos-1 (MDR1).
En la presente memoria se describen procedimientos para tratar a un individuo diagnosticado de cáncer que comprenden: administrar un agente quimioterapéutico al individuo y administrar una composición de células asesinas naturales resistentes a la quimioterapia al sujeto, en la que la composición de células asesinas naturales resistentes a la quimioterapia comprende células asesinas naturales modificadas genéticamente para expresar un polipéptido que confiere resistencia al agente quimioterapéutico.
La presente divulgación abarca procedimientos por los que las células inmunocompetentes son protegidas selectivamente de los efectos tóxicos de la quimioterapia, permitiendo así la coadministración de quimioterapia e inmunoterapia basada en células, por lo que se denomina inmunoterapia resistente a fármacos. Se ha demostrado la viabilidad del uso de inmunoterapia resistente a fármacos en el contexto de las células hematopoyéticas resistentes a los fármacos (Cesano et al., (1998) Anticancer Res. 18: 2289-2295). Células de médula ósea de ratón fueron modificadas genéticamente mediante la introducción mediada por retrovirus de un ADNc que codifica una forma mutante de DHFR, es decir, L22Y-DHFR que confiere resistencia a trimetrexato (TMTX). Fueron trasplantados ratones con células de médula ósea modificadas genéticamente que dieron lugar a la expresión del transgén en todos los linajes hematopoyéticos. A continuación, los ratones fueron tratados con el agente inmunoterapéutico anti-CD137, TMTX solo o una combinación de anti-CD137 y TMTX.
En ratones inoculados con células de sarcoma AG104, la quimioterapia con TMTX redujo la eficacia de un anticuerpo anti-CD 137 en ratones trasplantados con células no modificadas que eran sensibles al TMTX. Sin embargo, cuando los ratones estaban protegidos contra la toxicidad inducida por la quimioterapia mediante el trasplante de médula ósea que expresaba L22Y-DHFR, el tratamiento combinado de TMTX y anti-CD137 dio lugar a la erradicación completa de los tumores en el 100% de los animales. La presente divulgación proporciona pruebas de que las células inmunocompetentes humanas modificadas genéticamente pueden utilizarse en el contexto de la inmunoterapia de resistencia a fármacos, en lugar de modificar genéticamente todo el sistema hematopoyético. La capacidad de proporcionar a un paciente una población genéticamente modificada de células inmunocompetentes citotóxicas, y en particular si se administran localmente en el sitio de un tumor, permitiría la inmunoterapia junto con la quimioterapia sin tener que someterse necesariamente a un trasplante de médula ósea.
Las células NK-92 y TALL-104 son líneas celulares inmunitarias representativas, dado que ambos tipos celulares reconocen y eliminan una amplia gama de células malignas, incluidas las células K562 (Sawai et al., (2001) Mol. Ther.
3: 78-87 Tam et al., (1999) J. Hematother. 8: 281-290). La línea de células NK humanas altamente citotóxicas NK-92 es una línea de células asesinas naturales humanas dependientes de la interleucina-2 (IL-2) con características funcionales y fenotípicas de las células NK activadas (Gong et al., (1994) Leukemia 8: 652- 658). Las células NK-92 son efectores del sistema inmunitario innato, que desempeñan un papel importante en las respuestas del huésped contra los virus y las células tumorales. Debido a la alta citotoxicidad contra un amplio espectro de células tumorales primarias y establecidas a bajas proporciones efector:diana y contra la leucemia primaria en ratones SCID (Gong et al., (1994) Leukemia 8: 652- 658 Yan et al., (1998) Clin. Cancer Res. 4: 2859-2868 Tam et al., (1999) J. Hematother.
8: 281-290) las convierte en un candidato razonable como célula efectora inmunitaria resistente a fármacos (Yan et al., (1998) Clin. Cancer Res. 4: 2859-2868 Tam et al., (1999) J. Hematother. 8: 281-290). Las células TALL-104 son una línea de células T leucémicas dependientes de la interleucina 2 que tiene marcadores de superficie típicos de los que se encuentran tanto en los linfocitos T citotóxicos como en las células asesinas naturales. Las células TALL-104 lisan células tumorales de forma no restringida por el HLA (Tam et al., (1999) J. Hematother. 8: 281-290). La inmunoterapia adoptiva con TALL-104 ha inducido remisiones completas o parciales a largo plazo en animales portadores de tumores (Tam et al., (1999) J. Hematother. 8: 281-290 Geoerger et al., (2000) Neuro Oncol. 2: 103-113). Al igual que las células NK-92, se han utilizado las células TALL-104 como células inmunocompetentes para los estudios de prueba de concepto, dado que estas células pueden expandirse en cultivo indefinidamente para proporcionar una fuente ilimitada de células efectoras con actividad tumoricida estable.
Las células NK-92 y TALL-104 modificadas genéticamente por P140K-MGMT fueron resistentes a la TMZ y tuvieron actividades citotóxicas similares a las células no modificadas. Además, las células modificadas genéticamente mostraron actividades citolíticas similares a las células no transducidas tras la selección de fármacos. Por lo tanto, la modificación genética de estas células no afecta a su actividad citotóxica.
La inmunoterapia resistente a fármacos se evaluó en una serie de ensayos citotóxicos, en presencia y ausencia de un fármaco citotóxico. Dasqupta et al., (2010) Biochem. Biophys. Res. Com. 391:170-175. Es importante destacar que las células inmunocompetentes modificadas genéticamente mostraron una importante actividad citolítica hacia las células tumorales resistentes a fármacos en presencia de estos. Por el contrario, las células inmunocompetentes no modificadas fueron ineficaces en la eliminación del tumor cuando se administró el fármaco. En combinación, estos resultados demuestran que en presencia de un fármaco quimioterapéutico citotóxico, las células efectoras modificadas genéticamente permanecen activas, y se observó un mayor nivel de eliminación de las células cancerosas diana tras el tratamiento de las células efectoras modificadas genéticamente y las células diana no modificadas, en comparación con las células efectoras no modificadas y las células diana resistentes a fármacos. En consecuencia, las células inmunocompetentes resistentes a fármacos modificadas genéticamente pueden ser diseñadas para sobrevivir a los efectos citotóxicos de los agentes quimioterapéuticos y la eficacia de la eliminación del tumor aumenta significativamente durante un desafío de quimioterapia.
La presente divulgación proporciona datos de que las células efectoras inmunocompetentes resistentes a fármacos son efectores citotóxicos superiores durante un desafío de quimioterapia. Este es un hallazgo significativo que puede combinarse con las actuales inmunoterapias celulares y adoptivas. Se ha demostrado que la regresión de los tumores grandes y vascularizados se produce en pacientes con melanoma metastásico refractario. Sin embargo, para lograr la máxima eficacia, suele ser necesario un régimen de depleción linfática antes de la transferencia de células linfocíticas autólogas (Chinnasamy et al., (2004) Hum. Gene Ther. 8: 758-769).
La generación y expansión de linfocitos resistentes a fármacos (en lugar de todo el sistema hematopoyético) ex vivo puede permitir, en este contexto, la administración de una terapia basada en células inmunocompetentes simultáneamente con la quimioterapia, mejorando potencialmente la eliminación del tumor mientras se establece y mantiene la inmunidad antitumoral. En este escenario, los linfocitos no transducidos pueden agotarse mediante un tratamiento de quimioterapia selectiva, que podría aplicarse continuamente durante la administración de la inmunoterapia adoptiva. Entonces, la coadministración de quimio e inmunoterapias conduce a la eliminación del tumor a largo plazo.
Sin embargo, se ha demostrado que el crecimiento de las células de LMC en ratones trasplantados con médula ósea diseñada para conferir resistencia al MTX puede ser exacerbado por la administración de quimioterapia (Rosenberg & Dudley (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101: 14639-14645). Así, el tratamiento de quimioterapia en el contexto de la protección de la médula ósea completa modificada genéticamente puede inducir efectos secundarios tal como la supresión inmunitaria que permite a algunos cánceres sobrevivir a un desafío farmacológico. Sin embargo, en base a los resultados de la presente divulgación, en lugar de trasplantar células madre hematopoyéticas resistentes a los fármacos, una estrategia más eficaz implica el trasplante de linfocitos inmunocompetentes resistentes a fármacos.
Además, recientemente se ha demostrado que las líneas celulares de melanoma y glioma son sensibles a la combinación de TMZ y antifolatos (Sweeney et al., (2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 300: 1075-1084). Por lo tanto, en una realización de los procedimientos de la divulgación, la transferencia retroviral de vectores duales que coexpresan variantes resistentes a los fármacos de la DHFR, tal como, L22Y-DHFR, junto con P140K-MGMT aumentaría la eliminación de células tumorales al permitir una inmunoterapia citotóxica eficaz mientras se administra una combinación de agentes quimioterapéuticos. La expresión de mutantes de DHFR, por ejemplo, puede proporcionar resistencia a antifolatos tal como metotrexato y trimetrexato, mientras que la expresión de MGMT puede proporcionar resistencia a agentes metilantes monofuncionales tal como la dacarbazina y procarbazina, así como a agentes cloroetilantes bifuncionales tal como BCNU, ACNU o TMZ.
Por consiguiente, se realizó una serie de ensayos de citotoxicidad combinatoria con células efectoras y diana no modificadas y modificadas genéticamente. Para determinar los efectos de TMZ en las células no modificadas, se realizaron ensayos de citotoxicidad en los que se mezclaron células efectoras no modificadas con células diana modificadas genéticamente en ausencia o presencia de 200 pM de 6-BG/TMZ.
Se utilizaron células diana modificadas genéticamente para eliminar los efectos de la quimioterapia en las células diana (las células diana modificadas genéticamente eran resistentes a la TMZ en esta concentración de fármaco). Antes de iniciar estos estudios, se determinó la sensibilidad de las células K562 modificadas genéticamente a las células NK92 y Tall-104. Se realizó un ensayo de citotoxicidad de 4 horas en el que se incubaron células efectoras no modificadas (E) con células diana no modificadas (T) o con células diana modificadas genéticamente (Tm) en una proporción de efector a diana de 10:1, como se muestra en la Fig. 27, en ausencia de fármaco. Las citotoxicidades de las dos líneas celulares efectoras no modificadas (NK92 y TALL-104) hacia las células diana no modificadas o modificadas genéticamente fueron comparables (Pnk-92 = 0,8441, Ptall-014 = 0,6349). Por lo tanto, la modificación genética de las células diana no afectó a su lisis por parte de las células inmunocompetentes.
A continuación se realizaron ensayos citotóxicos utilizando células efectoras no modificadas y células diana modificadas genéticamente en presencia de TMZ. Se observó una disminución significativa de la lisis mediada por las células NK-92 y TALL-104 en comparación con las células diana modificadas genéticamente en ausencia de tratamiento farmacológico (véase la Fig. 27; Pnk-92 = 0,0003, Ptall-o-m = 0,0008). Por lo tanto, la eliminación de las células tumorales resistentes a fármacos por parte de las células inmunocompetentes no modificadas es muy limitada tras un desafío de quimioterapia.
Para comparar la eficacia de matanza de las células efectoras inmunitarias no modificadas y modificadas genéticamente durante los tratamientos farmacológicos, se realizaron ensayos de citotoxicidad en los que se incubaron células efectoras no modificadas o modificadas con P140KMGMT (Em) con células diana modificadas genéticamente (Tm) y 200 pM de 6-BG/TMZ.
En comparación con las células efectoras no modificadas, las células NK-92 modificadas genéticamente lisaron las células diana significativamente mejor tras ser tratadas con 6-BG/TMZ, como se muestra en la Fig. 28A (Pnk-92 = 0,0001). Por lo tanto, en presencia del fármaco, las células inmunocompetentes modificadas con P140KMGMT eran activas para eliminar las células tumorales. Sin embargo, en condiciones idénticas, las células TALL-104 modificadas genéticamente sólo presentaron un modesto aumento de la actividad citotóxica (Fig. 28B).
Para determinar la eficacia de las células tumorales resistentes a fármacos durante un desafío de quimioterapia cuando las células diana son sensibles al tratamiento farmacológico, se incubaron efectores modificados genéticamente, es decir, células P140KMGMT-NK-92 y P140KMGMT-TALL-104, con células diana no modificadas y sensibles a los fármacos y 200 pM de 6-BG/TMZ. A continuación, se compararon las citotoxicidades de estas células inmunocompetentes resistentes a fármacos con las citotoxicidades logradas utilizando células inmunocompetentes sensibles a fármacos, como se muestra en las Figs. 28C y 28D.
En comparación con la eliminación de las células diana modificadas genéticamente por las células efectoras no modificadas, hubo un aumento significativo de aproximadamente 4,5 veces y 2,5 veces en la eliminación de las células diana no modificadas por las células NK-92 y TALL-104 modificadas genéticamente, respectivamente (Pnk-92 = 0,0012, Ptall-oi4 = 0,0011). Estos datos demuestran que las células NK-92 y TALL-104 modificadas con P140KMGMT funcionan como potentes efectores en presencia de 6-BG/TMZ, y que las células inmunocompetentes resistentes al fármaco, cuando se utilizan simultáneamente con la quimioterapia, pueden potenciar significativamente la eliminación de las células diana.
Las realizaciones de la presente divulgación abarcan procedimientos para tratar cánceres, y en particular tumores cancerosos. Los procedimientos de la divulgación combinan el uso de agentes quimioterapéuticos que pueden matar o reducir la proliferación de las células cancerosas, con la inmunoterapia para eliminar eficazmente las células cancerosas que desarrollan resistencia a fármacos o que escapan al agente quimioterapéutico. Los procedimientos de la presente divulgación proporcionan para aislar células inmunes citotóxicas, incluyendo, pero sin limitación, células T y6 ya sea de un paciente a tratar o de otra fuente, como se describe, por ejemplo, por Lamb L.S. en la Patente de los EE.UU. con Núm. de Serie 7.078.034. Las células aisladas pueden entonces transfectarse con un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un polipéptido que confiere a la célula resistencia a un agente quimioterapéutico seleccionado. El paciente que necesita tratamiento para un cáncer, y en particular un tumor, puede entonces recibir una dosis, o dosis, de las células T transfectadas antes, después o con el agente quimioterapéutico. El agente en sí mismo, aunque pretende ser tóxico para las células cancerosas diana, y reduce la proliferación y viabilidad de las células, también puede inducir la formación en la superficie celular de las células cancerosas de proteínas relacionadas con el estrés. Las células T y§ transfectadas, por ejemplo, tienen la característica de ser capaces de reconocer y, por lo tanto, de dirigirse a dichos ligandos relacionados con el estrés, dirigiéndose así de forma específica o preferente a las células cancerosas.
La transducción de una población de células inmunitarias citotóxicas, tal como las células T y§, con un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido exógeno que confiere resistencia al agente quimioterapéutico puede garantizar que las células inmunitarias no se vean afectadas negativamente por el agente (fármaco). El resultado es que la quimioterapia y la inmunoterapia cooperan para reducir eficazmente la masa tumoral o eliminar las células cancerosas. Los datos aportados en la presente memoria indican que se puede conseguir un aumento del resultado de supervivencia de un animal tratado.
Se contempla que las células inmunitarias citotóxicas genéticamente modificadas, tal como las células T y§, pueden entregarse al tumor diana directamente mediante, por ejemplo, pero sin limitarse a, la inyección directa en la masa tumoral, la administración a un vaso sanguíneo que entra en la masa tumoral, o una de sus combinaciones. Por ejemplo, se contempla que las células pueden ser administradas a una masa glioblastomal en el cerebro de un paciente por implantación directa a través de una aguja canulada insertada en la masa tumoral.
Los procedimientos de la divulgación se comparan con otros procedimientos que combinan enfoques quimioterapéuticos e inmunológicos para tratar los cánceres. Por ejemplo, como se muestra en la Fig. 1, las citoquinas y otros factores que pueden estimular el sistema inmunitario, incluido el sistema innato, pueden administrarse a un paciente por vía sistémica, lo que da lugar a la expansión de muchas clases de células de todo el sistema inmunitario del paciente. Sin embargo, cuando se administra el agente quimioterapéutico, la toxicidad del agente puede reducir o destruir efectivamente las propias células del sistema inmunitario, eliminando así los beneficios potenciales de un sistema inmunitario ampliado.
Un protocolo alternativo, como se muestra en la Fig. 17, comprende aislar células de médula ósea de un individuo y transducir las células con un vector de ácido nucleico, tal como, pero sin limitación, un vector lentiviral, donde el vector comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un polipéptido que puede conferir resistencia al agente quimioterapéutico seleccionado para su uso en el tratamiento de un cáncer, como se muestra en la Fig. 13, por ejemplo. En un sistema experimental, como el que se muestra en la Fig. 17, las células de la médula transducidas pueden trasplantarse a un individuo receptor cuyo sistema inmunitario ha sido destruido por una radiación de alto nivel. Si estos sujetos reciben entonces una inoculación de células tumorales, desarrollarán un tumor, como se muestra en las Figs. 18 y 19, y se discute en McMillin et al., (2006) Hum. Gene Therapy 17: 798-806. Si el individuo recibe entonces el agente quimioterapéutico seleccionado o un inductor de células inmunitarias dirigidas al cáncer (en este caso mediante la administración de anticuerpos anti-CD137), entonces se observan reducciones en los tamaños de los tumores (en las Figs. 18 y 19, tumores de sarcoma AG104).
En algunos protocolos que combinan la inmunoterapia y la quimioterapia para tratar los cánceres en un paciente humano o animal, las citoquinas (IL-2, IL-12, GM-CSF y similares) pueden administrarse a un paciente para impulsar la formación de linfocitos citotóxicos. En otros procedimientos, se puede emplear un anticuerpo específico anti-CD137. El CD137 es un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF)/factor de crecimiento nervioso (NGF) y se expresa en los linfocitos T y B activados y en los monocitos; se ha descubierto que su ligando desempeña un papel importante en la regulación de las respuestas inmunitarias. Un anticuerpo monoclonal anti-CD137 puede unirse específicamente a las células inmunitarias que expresan CD137, tal como las células T activadas y las células dendríticas (CD) de ratón recién aisladas, estimulando así una respuesta inmunitaria, en particular de células T citotóxicas, contra las células tumorales.
También se ha observado que la reducción de los tumores puede ser transitoria cuando se utiliza un agente quimioterapéutico (Fig. 18), y la reducción inmunoterapéutica del tamaño del tumor también puede mostrar un rebote (Fig. 19). Por el contrario, si el agente quimioterapéutico y la inmunoterapia se administran en conjunto o secuencialmente al sujeto, se observa una reducción significativa y prolongada del tamaño del tumor (Fig. 20). También se aumenta la supervivencia del animal tratado. La transferencia de esplenocitos de un individuo tratado con éxito a un individuo inyectado con una población de células cancerosas dio lugar a un aumento de la supervivencia (Fig. 21), lo que demuestra la prolongación de las células específicas del cáncer tras su curación. Los experimentos, tal y como se resume en la Fig. 22, muestran que la aplicación de la transducción de un fármaco resistente a las células del sistema inmunitario permite la aplicación práctica de una combinación de quimioterapia e inmunoterapia para aumentar la supervivencia, y la destrucción de los tumores. Este procedimiento también se ha aplicado a la regresión de tumores muy grandes, como se muestra en la Fig. 23.
Si bien los protocolos de tratamiento para su uso contra los tumores cancerosos han tenido cierto éxito, como lo demuestran los datos presentados en las Figs. 15-23, el éxito de estos procedimientos con los tumores glioblastomales ha sido mínimo, con una supervivencia prolongada del paciente que no va más allá de unos 24 meses. En consecuencia, los procedimientos de la presente divulgación proporcionan una etapa de inmunoterapia alternativo que emplea células inmunitarias citotóxicas aisladas, y en particular la subpoblación de células T y§ que pueden reconocer, unirse a, y destruir específicamente las células cancerosas que producen el antígeno de estrés de superficie celular MICA/B. Las células T y§ comprenden sólo un 5% del total de células T circulantes y constituyen un poderoso componente del sistema de defensa innato. En los procedimientos de la divulgación, las células CD4-CD8- pueden aislarse de poblaciones de células T mediante procedimientos bien conocidos como FACS y cultivarse in vitro para ampliar el tamaño de la población.
En consecuencia, los procedimientos de la presente divulgación proporcionan células inmunitarias citotóxicas, tal como células T y6, que se modifican genéticamente para comprender un ácido nucleico heterólogo que, cuando se expresa en las células, les confiere resistencia al agente quimioterapéutico. Las células T modificadas son entonces capaces de sobrevivir durante el tiempo suficiente para destruir eficazmente la mayoría, si no todas, de las células cancerosas diana.
Ahora se ha demostrado que los animales injertados con células glioblastomales tienen un tiempo de supervivencia significativamente mayor cuando se les proporciona el tratamiento combinado de un agente quimioterapéutico y las células y6 T resistentes al agente modificadas genéticamente apropiadas, en comparación con los animales que han recibido sólo el agente.
La modificación genética de las células inmunitarias citotóxicas aisladas puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, pero sin pretensiones de limitación, las células T y§ aisladas pueden transfectarse con un vector lentiviral tal como VIS que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una variante de la proteína MGMT (por ejemplo, una variante P104K). La eficacia de la transducción puede demostrarse mediante la cotransfección de las células con un vector lentivirus que comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína informadora como, por ejemplo, la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) o similar. La transferencia de MGMT a las células les confiere resistencia a los agentes alquilantes del ADN, como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 7. Del mismo modo, utilizando un vector lentivirus recombinante del VIS, las células T y6 pueden ser transfectadas con MGMT, como se muestra en la Fig. 8.
Un aspecto de la presente divulgación, por lo tanto, abarca procedimientos para reducción de un cáncer en un paciente, que comprenden las etapas de: obtener una población de células inmunes citotóxicas aisladas, en el que las células inmunes citotóxicas aisladas han sido modificadas genéticamente para ser resistentes a un agente terapéutico; administrar a un paciente que lo necesita, una cantidad efectiva del agente terapéutico; y administrar al paciente la población de células inmunes citotóxicas aisladas genéticamente modificadas, con lo que las células inmunes citotóxicas se entregan al tumor, reduciendo así el cáncer en el paciente.
En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, las células inmunitarias citotóxicas aisladas pueden ser células T y5.
En realizaciones de este aspecto de la divulgación, las células inmunes citotóxicas aisladas pueden ser aisladas del paciente que tiene el cáncer.
En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, las células inmunitarias citotóxicas aisladas pueden ser aisladas de una fuente distinta del paciente que las necesita.
En realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico puede tener la característica de inducir una proteína de estrés en una célula cancerosa del paciente, en el que la proteína de estrés es reconocida por las células inmunes citotóxicas.
En realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico citotóxico caracterizado porque una célula desarrolla resistencia a dicho agente terapéutico cuando la célula recibe un ácido nucleico heterólogo, y en el que el ácido nucleico heterólogo se expresa en la célula.
En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico citotóxico seleccionado del grupo que consiste en: un agente alquilante, un antagonista metabólico, un antibiótico antitumoral y un agente antitumoral derivado de plantas.
En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico citotóxico seleccionado del grupo que consiste en: una ciclofosfamida, una ifosamida, un metotrexato, un nucleótido sustituido, un nucleósido sustituido, fluorouracilo, una mitomicina, adriamicina, vincristina, vindesina, Taxol, cisplatino, carboplatino y etopósido.
En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en: TRIMETHOTRIXATE™ (TMTX), metotrixato (MTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-Nitrobencil)-6-tioinosina (NBMPR), CAMPTOTHECIN™, 6-bencilguanidina, y un derivado terapéutico de cualquiera de estos.
En realizaciones de este aspecto de la divulgación, la etapa de obtener una población de células inmunes citotóxicas aisladas modificadas genéticamente para ser resistentes a un agente terapéutico puede comprender aislar de un individuo humano o animal una población de células inmunes citotóxicas; cultivar la población aislada de células inmunes citotóxicas, aumentando así la población de las células; transfectar de forma estable la población de células inmunes citotóxicas con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga unida de forma operable a un promotor, en el que la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica un polipéptido que confiere a la célula resistencia al agente terapéutico.
En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, la población de células inmunitarias citotóxicas transfectadas de forma estable puede mantenerse de forma viable.
En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico puede ser TRIMETHOTRIXATE™ o metotrexato, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica la dihidrofolato reductasa, o uno de sus derivados. En otras realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico puede ser TEMOZOLOMIDE™, o un derivado terapéutico del mismo, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga puede codificar la O6-metilguanina-ADN-metiltransferasa, o uno de sus derivados.
En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, las células inmunitarias citotóxicas aisladas modificadas genéticamente y el agente terapéutico pueden coadministrarse al paciente.
En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, las células inmunitarias citotóxicas genéticamente modificadas y el agente terapéutico pueden administrarse secuencialmente al paciente.
En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, las células inmunitarias citotóxicas genéticamente modificadas se administran al paciente directamente en el tumor o en un vaso sanguíneo proximal y que deriva en el tumor. En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, el tumor es un glioblastoma.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona sistemas para tratar un cáncer en un paciente que comprenden un agente terapéutico citotóxico que tiene las características de inhibir la supervivencia de una célula cancerosa, y una población aislada de células inmunes citotóxicas, en el que las células inmunes citotóxicas están genéticamente modificadas para ser resistentes al agente terapéutico.
En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, las células inmunitarias citotóxicas pueden ser células T y§. En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, la población de células inmunitarias citotóxicas puede comprender una secuencia de ácido nucleico heteróloga unida de forma operable a un promotor, donde la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica un polipéptido que cuando se expresa en una célula confiere resistencia al agente terapéutico a la célula.
En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico citotóxico seleccionado del grupo que consiste en: un agente alquilante, un antagonista metabólico, un antibiótico antitumoral y un agente antitumoral derivado de plantas.
En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: TRIMETHOTRIXATE™ (TMTX), metotrixato (MTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-Nitrobencil)-6-tioinosina (NBMPR), CAMPTOTHECIN™, 6-bencilguanidina, y un derivado terapéutico de cualquiera de estos. En ciertas realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico es TRIMETHOTRIXATE™ o metotrixato, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica la dihidrofolato reductasa, o uno de sus derivados. En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico es TEMOZOLOMIDE™, o uno de sus derivados terapéuticos, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica la O6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT), o uno de sus derivados.
Aún otro aspecto de la divulgación proporciona sistemas para tratar un glioblastoma en un paciente que comprende un agente terapéutico que tiene las características de inhibir la supervivencia de una célula cancerosa e inducir una proteína de estrés en la célula cancerosa, y una población aislada de células inmunes citotóxicas, en el que dichas células inmunes citotóxicas son células T y§, y en el que dichas células T y§ han sido modificadas genéticamente para ser resistentes al agente terapéutico.
En realizaciones de este aspecto de la divulgación, la población de células T y§ comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga unida de forma operable a un promotor, en el que la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica un polipéptido que cuando se expresa en una célula confiere resistencia al agente terapéutico a la célula. En las realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico citotóxico seleccionado del grupo que consiste en: un agente alquilante, un antagonista metabólico, un antibiótico antitumoral y un agente antitumoral derivado de plantas.
En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: TRIMETHOTRIXATE™ (TMTX), metotrixato (MTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-Nitrobencil)-6-tioinosina (NBMPR), CAMPTOTHECIN™, 6-bencilguanidina, y un derivado terapéutico de cualquiera de estos.
En algunas realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico es TRIMETHOTRIXATE™ o metotrixato, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica la dihidrofolato reductasa, o uno de sus derivados.
En otras realizaciones de este aspecto de la divulgación, el agente terapéutico es TEMOZOLOMIDE™, o un derivado terapéutico del mismo, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica la O6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (MGMT), o uno de sus derivados.
Cabe señalar que las relaciones, las concentraciones, las cantidades y otros datos numéricos pueden expresarse en la presente memoria en un formato de intervalo. Debe entenderse que dicho formato de intervalo se utiliza por conveniencia y brevedad, y por lo tanto, debe interpretarse de manera flexible para incluir no sólo los valores numéricos explícitamente recitados como los límites del intervalo, sino también para incluir todos los valores numéricos individuales o subintervalos abarcados dentro de ese intervalo como si cada valor numérico y subintervalo se recitara explícitamente. Para ilustrar, un intervalo de concentración de "aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5%" debe interpretarse de manera que incluya no sólo la concentración explícitamente recitada de aproximadamente 0,1 % en peso a aproximadamente 5 % en peso, sino que también incluya las concentraciones individuales (por ejemplo, 1%, 2%, 3% y 4%) y los subintervalos (por ejemplo, 0,5%, 1,1%, 2,2%, 3,3% y 4,4%) dentro del intervalo indicado. El término "aproximadamente" puede incluir ±1%, ±2%, ±3%, ±4%, ±5%, ±6%, ±7%, ±8%, ±9%, o ±10%, o más del valor o valores numéricos que se modifican. Además, el término "aproximadamente 'x' a 'y'" incluye "aproximadamente 'x' a 'y'".
Debe enfatizarse que las realizaciones descritas anteriormente de la presente divulgación son meramente ejemplos posibles de implementaciones, y se exponen simplemente para una clara comprensión de los principios de esta divulgación. Se pueden hacer muchas variaciones y modificaciones a las realizaciones descritas de la divulgación sin apartarse sustancialmente de los principios de la divulgación. Todas estas modificaciones y variaciones están incluidas en el ámbito de la presente divulgación y protegidas por las siguientes reivindicaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Generación y titulación de retrovirus recombinante: Los ADNc que codifican para el P140KMGMT humano y eGFP se amplificaron por PCR utilizando cebadores adecuados (tal como, por ejemplo, para: MGMT: Directo: AAACTGGAGCTGTCTGCTGTGAA, Inverso:
AAACTCTCCTGCTGGAACACTGGA; y DHFR: Directo:
CATGGGAATTGCAAGAATGGCGA, Inverso:
TGACCAGGTTCTGTTTCCCTTCCA)
y se insertan en el vector de expresión adecuado. Las secuencias, optimizadas en codones para su expresión en células de mamífero, que codifican MGMT y DHFR, se presentan en la Fig. 29. Se utilizó un sistema de cuatro plásmidos para generar VIS-lentivirus recombinante. La transducción transitoria se llevó a cabo en células productoras 293T utilizando procedimientos como los detallados anteriormente (Cesano et al., (1998) Anticancer Res. 18: 2289­ 2295). Los títulos de los virus que codifican eGFP y la P140KMGMT se determinaron por procedimientos de citometría de flujo y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, respectivamente (Cesano et al., (1998) Anticancer Res. 18: 2289-2295; McMillin et al., (2006) Hum. Gene Ther. 17: 798-806).
Ejemplo 2
Transducción lentiviral: Las transducciones de partículas lentivirales basadas en VIS se realizaron incubando las células con el virus en un medio complementado con polibreno (8 mg/ml; Specialty Media, Phillipsburg, NJ). Veinticuatro horas después de la transducción, el medio que contenía el virus se sustituyó por medio fresco y las células transducidas se cultivaron hasta alcanzar aproximadamente 70-90% de confluencia, momento en el que las células se utilizaron para las aplicaciones posteriores.
Eficiencias de transducción lentiviral de las células NK-92, TALL-104 y K562: Inicialmente se evaluó la eficiencia de transducción de las células NK-92, TALL-104 y K562 utilizando un lentivirus recombinante de VIS de inactivación automática, pseudotipado con la proteína de la envoltura de VSV-G, que codifica la eGFP, cuyas construcciones se muestran esquemáticamente en la Fig. 25A.
La expresión de eGFP en la construcción lentiviral reportera fue impulsada por el promotor del virus de células madre murinas. Para medir las eficiencias de transducción, todas las líneas celulares se inocularon con una MOI de 40 y la fluorescencia de GFP se analizó por citometría de flujo a las 72 horas de la transducción. La transducción de cada línea celular dio lugar a expresiones robustas de eGFP (visualizadas por microscopía de fluorescencia) que se cuantificaron en un 90%, 41% y 99% en las líneas celulares NK-92, TALL-104 y K562, respectivamente, como se muestra en las Figs. 25B-25D. Por lo tanto, se logran altas eficiencias de transducción para las líneas celulares NK-92 y K562, y la línea celular TALL-104 mostró una eficiencia de transducción moderada.
Ejemplo 3
Análisis de curva de supervivencia: Las células no modificadas y las modificadas con P104KMGMT se expusieron 2 horas a 6-BG (25 j M), seguidas de una exposición a concentraciones crecientes de TMZ durante 48 horas. A continuación, se accedió a la viabilidad de las células mediante un procedimiento estándar de exclusión del azul tripán. Todos los fármacos se prepararon en fresco el día del tratamiento farmacológico.
Para determinar la eficacia de la P140KMGMT resistente a fármaco, se incubaron células inmunocompetentes transducidas y no transducidas con 6-BG durante 2 horas. Se añadió TMZ a concentraciones crecientes, y las células se incubaron durante 48 horas. Se generaron curvas de supervivencia con respecto a las células no transducidas.
Las células NK-92, TALL-104 y K562 transducidas con P140KMGMT fueron resistentes a la combinación 6-BG/TMZ en comparación con las células de control no transducidas, como se muestra en la Fig. 26A). Dicha resistencia fue pronunciada hasta 200 j M de TMZ, momento en el que casi todas las células modificadas sobrevivieron a la prueba del fármaco.
Los grados de resistencia alcanzados por la modificación genética de cada una de las líneas celulares se midieron calculando el valor IC50 de TMZ. El IC50 de 6-BG/TMZ basado en una exposición de 48 horas fue de 360 ± 8 j M y 135 ± 4 j M, respectivamente, en las células NK-92 modificadas y no modificadas; 385 ± 5 j M y 120 ± 6 j M, respectivamente, en las células TALL-104 modificadas y no modificadas; y 550 ± 8 j M y 170 ±10 j M, respectivamente, en las células K562 modificadas y no modificadas. Por lo tanto, cada una de las líneas celulares mostró aproximadamente una resistencia triple a la TMZ en un ensayo de viabilidad de 48 horas. Se han alcanzado niveles de resistencia similares en células madre hematopoyéticas y en células K562, pero utilizando un ensayo de supervivencia de 7 a 10 días (Gangadharan et al., (2006) Blood. 107: 3859-3864). La selección del actual período de ensayo de 48 horas se basó en los ensayos citotóxicos de procesamiento posterior.
Ejemplo 4
Ensayo de citotoxicidad: Las células, cultivadas en presencia de 100 U/ml de IL-2 humana recombinante, se expusieron a 25 j M de 6-BG durante 2 horas, seguidas de la adición de 200 j MTMZ y se incubaron durante toda la noche. Para determinar la concentración de células efectoras que provocó la máxima destrucción de las células diana, se colocaron 4.000 células (T) en placas de 96 pocillos y se mezclaron con las células efectoras (E) (NK-92 o TALL-104) en proporciones E:T de 2,5:1, 5:1 y 10:1 (por triplicado), seguidas de una incubación de 4 horas. La cantidad liberada de LDH en el sobrenadante como resultado de la citolisis de las células diana se midió en un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Las citotoxicidades se expresaron como % de actividad citotóxica de las células efectoras de acuerdo con la siguiente fórmula:
citotoxicidad % =
(Liberación experimental - Liberación espontáneaefector}-Liberación Espontaneada
Figure imgf000017_0001
Liberación máximadiana - Liberación espontáneadiana
Para determinar la eficacia de las modificaciones genéticas sobre las citotoxicidades de las células efectoras, las células efectoras no modificadas/modificadas genéticamente (E/Em) y las células diana (T/Tm) fueron expuestas a 6-BG/TMZ durante 24 horas y se realizaron ensayos citotóxicos como se ha detallado anteriormente. Las variantes resistentes a fármacos de las líneas celulares NK-92 y TALL-104 median la eliminación eficaz de las células diana: Se ha informado de que las líneas celulares NK-92 y TALL-104 pueden lisar eficazmente la línea celular leucémica K562. En el presente ejemplo, se determinó si la modificación genética de estas líneas celulares efectoras inmunitarias daba lugar a un cambio en sus capacidades citotóxicas hacia la línea celular diana K562. En consecuencia, se mezclaron células efectoras modificadas y no modificadas con un número fijo de células diana en varias proporciones efectoras:diana de 2,5:1, 5:1 y 10:1. Se comparó la eficacia de eliminación de cada una de las células efectoras resistentes al fármaco con las células de control no modificadas en un ensayo de citotoxicidad de 4 horas. Cuando se comparan con las células no modificadas, tanto las células efectoras inmunes resistentes a los fármacos modificadas genéticamente, las células NK-92 y TALL-104 mostraron actividades citolíticas similares hacia la línea celular diana, como se muestra en la Fig. 2B, estableciendo así que las modificaciones genéticas impartidas a las líneas celulares transducidas NK-92 y TALL-104 no parecían afectar a las propiedades citotóxicas de las células. Retención de la eficacia citotóxica de las células inmunocompetentes modificadas genéticamente tras su expansión en presencia de 200yM de TMZ. Como se muestra en la Fig. 2B, las citotoxicidades de las líneas celulares efectoras modificadas genéticamente por el fármaco NK-92 y TALL1-04, fueron similares a las citotoxicidades de las células efectoras modificadas genéticamente no seleccionadas. Estos resultados muestran que las líneas celulares inmunocompetentes resistentes a los fármacos, tras la modificación con P140KMGMT, conservaron su capacidad de lisar eficazmente las células diana.
Ejemplo 5
Generación de líneas celulares efectoras y diana resistentes a fármacos mediante transducción lentiviral: La secuencia de ADNc P140KMGMT se insertó en el vector de expresión SIV sustituyendo la secuencia que codifica la eGFP (como se muestra en la Fig. 25A). Los títulos del virus, determinados utilizando células 293T como diana, fueron de 107­ 108 TU/ml. La transferencia de genes a las células efectoras y diana se cuantificó mediante amplificación por PCR en tiempo real utilizando ADN genómico aislado de células transducidas con el virus recombinante a una MOI de 40.
Los números de copias de P140KMGMT para las células NK-92, TALL-104 y K562 transducidas se determinaron como 3 ± 0,28, 1 ± 0,14 y 4 ± 0,41, respectivamente. También se midieron los niveles de ARNm de MGMT en las células K562 para confirmar que las células modificadas por el gen expresan mayores niveles de mensaje de MGMT. La expresión del ARNm de MGMT se detectó fácilmente en las células K562 transducidas, mientras que los niveles de expresión del ARNm de MGMT en las células K562 no transducidas estaban por debajo del intervalo lineal de detección. Estudios anteriores (Gangadharan et al., (2006) Blood. 107: 3859-3864) también informaron de niveles de proteína MGMT extremadamente bajos en las células K562 de tipo salvaje.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para uso en la reducción del cáncer en un paciente que necesita tratamiento, en la que la composición comprende células asesinas naturales (NK) en las que más del 50% de las células NK han sido modificadas genéticamente para expresar un polipéptido que confiere resistencia a un agente quimioterapéutico.
2. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el cáncer es un glioblastoma.
3. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la composición se coadministra al paciente con el agente de quimioterapia.
4. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición y el agente quimioterapéutico se coadministran al paciente en forma secuencial.
5. La composición para para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición se administra al paciente directamente sobre el cáncer o sobre un vaso sanguíneo próximo y que deriva en el cáncer.
6. Un procedimiento para obtener una población de células NK aisladas y modificadas genéticamente para que sean resistentes a un agente terapéutico, que comprende las etapas de:
cultivar una población de células NK aisladas de un individuo humano o animal, aumentando así la población de las células;
transfectar de forma estable la población de células NK con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga unida de forma operable a un promotor, en el que la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica un polipéptido que confiere a la célula resistencia al agente terapéutico.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el agente terapéutico es trimetotrexato o metotrexato, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica la dihidrofolato reductasa, o uno de sus derivados.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que el agente terapéutico es la temozolomida, o uno de sus derivados terapéuticamente activos, y la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica la O6-metilguanina-ADN-metiltransferasa.
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