ES2880835T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer y biomarcador para el cribado de fármacos - Google Patents

Composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer y biomarcador para el cribado de fármacos Download PDF

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Abstract

Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer, que comprende Sorafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y 3-(3,5-dibromo-4-hidroxi-bencilidén)-5-yodo-1,3-dihidro-indol- 2-ona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer y biomarcador para el cribado de fármacos Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer, que comprende Sorafenib y GW5074. La invención da a conocer, además, un compuesto para disociar un complejo de proteínas que consiste en c-Raf y DAPK. Adicionalmente, la invención proporciona además un método para el cribado de un fármaco candidato mediante la utilización de un biomarcador.
Descripción de la técnica anterior
La activación de los protooncogenes o la deficiencia de genes supresores tumorales con frecuencia conduce al desarrollo de células de cáncer. Ras es un protooncogén y la activación de la proteína Ras normalmente resulta inducida por las receptor-tirosina quinasas (TKI, por sus siglas en inglés) en la membrana celular. La proteína Ras activada se une a RAF y seguidamente transmite la señal corriente abajo, activando la ruta de MAPK que, a su vez, regula el crecimiento celular y la diferenciación celular. La proteína Grb-sos activada que aparece por la unión de un factor de crecimiento a su receptor en la membrana celular conduce a la fosforilación de la proteína Ras-GDP corriente abajo, y Ras-GTP resultante se une a continuación al extremo N-terminal de la proteína Raf y activa Rat, que regula a continuación la activación de ERK mediante la fosforilación de MEK. Seguidamente, la e Rk activada entra en el núcleo celular e induce la proliferación de las células de cáncer. Por lo tanto, se han generado incontables fármacos diseñados específicamente contra dichos protooncogenes, tales como los inhibidores de tirosina quinasa (TKI, por sus siglas en inglés), para posteriormente encontrar que muchos pacientes de cáncer desarrollan resistencia farmacológica durante el tratamiento. En consecuencia, una terapia de combinación con diana específicamente en la ruta de transducción de señales de la tirosina quinasa se ha convertido en un método de tratamiento habitual.
La angiogénesis y la proliferación celular desempeñan funciones esenciales en el crecimiento tumoral. En el tumor, al liberarse enormes cantidades de factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) a partir de las células de cáncer, la unión de VEGF-A al receptor 2 del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGFR-2) sobre la superficie de las células endoteliales de un tumor activa la ruta de transducción de señales de Raf/proteína quinasa activada por mitógeno (MEK)/quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), que a su vez induce la angiogénesis de las células endoteliales. Simultáneamente, la ruta Ras-ERK también potencia la proliferación de las células de cáncer. Además, se ha mostrado la pérdida de regulación de la ruta Ras-Raf-ERK en varias líneas de células tumorales. De esta manera, VEGF y Raf podrían ser las mejores dianas para la inhibición del crecimiento tumoral.
El Sorafenib (Nexavar*, BAY 43-9006, Bayer HealthCare Pharmaceuticals) es un inhibidor multiquinasa oral utilizado comúnmente para el tratamiento de diversos cánceres. El Sorafenib puede inhibir proteínas tales como Raf, receptor de VEGF, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), KIT y tirosina quinasa 3 similar a fms (FLT-3). Varios estudios han indicado que el Sorafenib inhibe el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la ruta de señalización de Raf en diferentes células de cáncer, suprimiendo simultáneamente la proliferación de células endoteliales que circundan a las células de cáncer mediante la inhibición de VEGF, así como rutas de señalización de PDGF y posteriormente induce la muerte de las células de cáncer. El diseño y resultados experimentales de dichos fármacos son ideales. Sin embargo, tras años de aplicaciones clínicas, desafortunadamente se ha encontrado que, aunque el tamaño tumoral en los primeros estadios del tratamiento, se reduce eficientemente con Sorafenib, dichos fármacos no sólo no consiguen erradicar el tumor por completo, sino que además pueden causar graves efectos secundarios. Además, las células de cáncer tratadas han desarrollado resistencia farmacológica tras el tratamiento a largo plazo. Adicionalmente, en los últimos años determinados estudios han mostrado que la inhibición de la ruta de señalización de Raf en las células de cáncer conduce a una inhibición reducida del Sorafenib debido a regulaciones alternativas por diferentes moléculas en las células de cáncer. Más importante, hay pruebas que indican adicionalmente que los efectos de inhibición del Sorafenib sobre las células de cáncer podrían no estar regulados por la ruta de Raf. Por lo tanto, las deficiencias anteriormente mencionadas necesitan mejorarse adicionalmente.
Descripción resumida de la invención
Aunque el Sorafenib podría reducir eficazmente el tamaño tumoral en un estadio temprano, no puede erradicar el tumor; además, con frecuencia provoca efectos secundarios graves, y a medida que se incrementa el periodo de tratamiento, las células de cáncer con frecuencia se vuelven resistentes. En vista de lo anteriormente expuesto, el Sorafenib no es un compuesto ideal para la utilización en el tratamiento tumoral y existe una necesidad en la técnica relacionada de provisión de un compuesto mejorado para la utilización en el tratamiento del cáncer. En vista de lo anterior, la presente invención se refiere a las invenciones siguientes: (1) una nueva composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer, que comprende Sorafenib y GW5074, (2) un compuesto para la utilización en el tratamiento del cáncer que causa la disociación de c-Raf y DAPK, que conduce a necrosis celular, de esta manera eficazmente eliminando células, y (e) un método para cribar un fármaco candidato mediante la utilización de una proteína DAPK que presenta la secuencia SEC ID n° 2 como biomarcador, en el que el residuo aminoácido serina 308 (Ser308) de la proteína DAPK está fosforilado.
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer, que comprende Sorafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y 3-(3,5-dibromo-4-hidroxibencilidén)-5-yodo-1,3-dihidro-indol-2-ona (GW5074) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Según realizaciones de la presente invención, los compuestos de la composición se administran separadamente, concurrentemente o secuencialmente.
Según realizaciones de la presente invención, el cáncer es carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, carcinoma cervical, cáncer oral, glioma, carcinoma de células uroteliales, o melanoma. Según realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable para dicho compuesto o compuestos. Los vehículos anteriormente indicados pueden ser excipientes, diluyentes, espesantes, agentes de carga, ligantes, desintegrantes, lubricantes, agentes aceitosos o no aceitosos, tensioactivos, agentes de suspensión, agentes gelificantes, adyuvantes, conservantes, antioxidantes, estabilizadores y agentes colorantes.
Según realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica se administra por vía oral, inmersión, inyección, aplicación tópica o administración de parche.
Según la composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer de la presente invención, GW5074 altera la conformación de la proteína c-Raf que presenta la secuencia SEC ID n° 1 tras la unión a la misma, incrementando de esta manera la afinidad de unión del Sorafenib para la proteína c-Raf de manera que se disocia c-Raf respecto del complejo de proteínas c-Raf/DAPK.
La presente invención proporciona además un compuesto que comprende Sorafenib y 3-(3,5-dibromo-4-hidroxibencilidén)-5-yodo-1,3-dihidro-indol-2-ona (GW5074) para la disociación de un complejo de proteínas, en el que dicho complejo de proteínas consiste en c-Raf (SEC ID n° 1) y DAPK (SEC ID n° 2).
En otro aspecto, la invención da a conocer un método para el cribado de un fármaco candidato que utiliza un biomarcador; en el que el método comprende proporcionar un espécimen, detectar un nivel de fosforilación del biomarcador en el espécimen antes de la administración del fármaco, y detectar una tasa de inhibición del crecimiento celular del fármaco de ensayo del espécimen tras la administración del fármaco, en el que, en el caso de que el nivel de fosforilación se correlacione positivamente con la tasa de inhibición del crecimiento celular, el fármaco es un candidato farmacológico adecuado, en el que el biomarcador es una proteína DAPK que presenta la secuencia SEC ID n° 2, en el que el residuo aminoácido serina 308 (Ser308) de la proteína DAPK está fosforilado.
Según realizaciones de la presente invención, el espécimen es ascites, sangre, orina, heces, esputo, células mucosales, líquido gástrico, bilis o tejidos de cáncer desprendidos recogidos después de una cirugía.
Según realizaciones de la presente invención, el fármaco candidato comprende Sorafenib y GW5074.
En un aspecto, la presente invención da a conocer la utilización de un biomarcador para el cribado farmacológico, en el que el biomarcador es una proteína DAPK que presenta la secuencia SEC ID n° 2, en el que el residuo aminoácido serina 308 (Ser308) de la proteína DAPK está fosforilado.
Según la presente invención, el fármaco candidato comprende Sorafenib y GW5074.
Según la presente invención, la utilización de un biomarcador en el cribado de una fármaco candidato incluye además detectar un nivel de fosforilación del biomarcador del espécimen antes de la administración del fármaco, y detectar la tasa de inhibición del crecimiento celular después de la administración del fármaco, en el que en el caso de que el nivel de fosforilación se correlacione positivamente con la tasa de inhibición del crecimiento celular, el fármaco es un candidato farmacológico adecuado.
Por lo tanto, la presente exposición propone una nueva composición farmacéutica para la utilización en terapia de combinación para el tratamiento del cáncer, en el que el Sorafenib, un fármaco antiangiogénico, se combina con GW5074, un inhibidor de c-Raf. Ninguno de dichos dos compuestos, al administrarlo por sí solo a una dosis baja (Sorafenib a 5 j M o GW5074 a 10 j M) muestra efectos de inhibición del crecimiento. Sin embargo, la combinación de dichos dos fármacos, que no son citotóxicos por sí solos, consigue un efecto citotóxico, reduciendo de esta manera el efecto secundario causado por Sorafenib a su dosis eficaz, inhibiendo eficazmente el crecimiento de las células de cáncer. La nueva composición para la utilización en la terapia de combinación para el tratamiento del cáncer propuesto por la presente invención descubre un nuevo mecanismo molecular, en el que dichos dos fármacos destruyen el complejo de proteínas de c-Raf y DAPK mediante la unión a c-Raf, que a su vez conduce a la apoptosis celular y puede utilizarse como nueva diana para el futuro diseño de fármacos. Los estudios realizados por el presente inventor establecen que la composición para la utilización en terapia de combinación para el tratamiento del cáncer resulta más eficaz en células de cáncer con c-Raf s338 altamente fosforilado y resulta menos eficaz en las células de cáncer humano con menor expresión de DAPK o DAPK-s308 menos fosforilado.
El fármaco para disociar las proteínas c-Raf y DAPK o el fármaco cribado por el presente método es la combinación de Sorafenib y GW5074.
La expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se utiliza en la presente memoria para referirse a cualquier sustancia fisiológicamente inerte o farmacológicamente inactiva conocida por el experto en la materia que resulta física o químicamente compatible con Sorafenib o con GW5074. Entre los excipientes farmacéuticamente aceptables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, polímeros, resinas, plastificadores, agentes de carga, lubricantes, diluyentes, ligantes, desintegrantes, solventes, cosolventes, tensioactivos, conservantes, edulcorantes, agentes saborizantes, tintes o pigmentos de grado farmacéutico y agentes de viscosidad.
En la presente solicitud, la expresión "composición farmacéutica" es una composición sólida o líquida cuya forma, concentración y grado de pureza resultan adecuados para la administración en un paciente (tal como un paciente humano o animal) y puede inducir cambios fisiológicos después de su administración. Una composición farmacéutica es típicamente estéril y/o no pirogénica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "combinación" describe materiales que combinan dos o más compuestos y/o fármacos (también denominados ingredientes en la presente solicitud). El término "combinado" y "combinación" presentan el mismo significado.
La combinación de dos o más compuestos/fármacos en una composición puede ser física o no física. Entre los ejemplos de una composición de compuestos/fármacos que se unen físicamente se incluyen composiciones (p.ej., una única mezcla) que contienen dos o más compuestos/fármacos mezclados (p.ej., en la misma dosis individual), una composición que contiene dos o más compuestos/fármacos química/físicamente unidos (p.ej., mediante entrecruzamiento, aglomeración molecular o unión a una fracción de vehículo común), una composición que contiene dos o más compuestos /fármacos que se coempaquetan química o físicamente (p.ej., formulados en un medio líquido, partículas (p.ej., partículas micrométricas o nanopartículas) o materiales sobre o dentro de gotas de emulsión, kits farmacéuticos, paquetes farmacéuticos o paquetes de paciente, en el que dos o más compuestos/fármacos están coenvasados o co-representados (p.ej., un lote de unidades de dosis).
Entre los ejemplos de una composición de compuestos/fármacos en una combinación no física se incluyen: un material (p.ej. una mezcla no de un componente) que contiene por lo menos uno de los dos o más compuestos/fármacos más las instrucciones que indican que la combinación física de los dos o más compuestos/fármacos se forma mediante la combinación reciente de por lo menos uno o más compuestos físicos; un material (p.ej., una mezcla no de un componente) que contiene por lo menos uno de los dos o más compuestos/fármacos más instrucciones que indican una terapia de combinación que utiliza dos o más compuestos/fármacos; un material que contiene por lo menos uno de los dos o más compuestos/fármacos más instrucciones para la administración en una población de pacientes, en la que la población de pacientes ha sido tratada (o en la que se está administrando) el otro (otros) fármaco de entre los dos o más compuestos/fármacos, y un material que comprende por lo menos uno de los dos o más compuestos/fármacos cuya cantidad o forma está formulada especialmente para la utilización en la composición con el otro (otros) de entre los dos o más compuestos/fármacos.
En dicha solicitud, la expresión "terapia de combinación" se utiliza en la presente memoria para referirse a una terapia que utiliza la composición que contiene dos o más compuestos/fármacos (tal como se ha definido anteriormente). De esta manera, en la presente invención, "terapia de combinación", "combinación", así como "composición" de compuestos/fármacos, se utilizan para referirse a compuestos/fármacos administrados como parte del tratamiento completo. En consecuencia, la posología de cada uno de los dos o más compuestos/fármacos puede ser diferente, lo que sugiere que cada uno puede administrarse simultáneamente o en tiempos diferentes. Resulta importante entender que los compuestos/fármacos de dicha composición pueden administrarse en orden (p.ej., antes o después) o concurrentemente (p.ej., simultáneamente) y pueden formularse en la misma mezcla farmacéutica (juntos) o en diferentes mezclas (por separado). Además, la administración simultánea en la misma mezcla se proporciona en forma de una única mezcla, y la administración simultánea en diferentes mezclas no se proporciona en forma de una única mezcla. Además, la posología de cada uno de los dos o más compuestos/fármacos en una terapia de combinación también puede variar según los modos de administración.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la inhibición del crecimiento de las células ACHN a las 24 horas del tratamiento de una dosis de inhibidores de c-Raf (Sorafenib, GW5074, L779450 o PLX4720).
La figura 2 muestra la inhibición del crecimiento de las células ACHN a las 48 horas del tratamiento de una dosis de inhibidores de c-Raf (Sorafenib, GW5074, L779450 o PLX4720).
La figura 3 muestra la inhibición del crecimiento de las células ACHN a las 72 horas del tratamiento de una dosis de inhibidores de c-Raf (Sorafenib, GW5074, L779450 o PLX4720).
La figura 4 muestra la inhibición del crecimiento de las células ACHN a las 24, 48 y 72 horas de la terapia de combinación de diversos inhibidores de c-Raf (Sor: Sorafenib, GW: GW5074, L77: L779450, PLX: PLX4720). La figura 5 muestra los volúmenes tumorales xenoinjertados medidos cada 3 días durante 21 días después de los tratamientos de Sorafenib y GW5074 administrados individualmente o en combinación.
La figura 6 muestra las señales de fotones recogidas de ratones inmunodeficientes xenoinjertados ortotópicamente con células Luc-ACHN-LL tras los tratamientos con diversos fármacos. Con el fin de calcular el número de tumores distribuidos en todo el cuerpo, se midió el total de fotones emitidos por el cuerpo entero de cada ratón, además de cuantificarse con el software de imágenes en vivo Xenogen*. La flecha indica el tiempo de administración inicial de fármaco.
La figura 7 muestra el nivel de la apoptosis o necrosis de células ACHN a las 24 horas después de los tratamientos de DMSO (grupo de control), Sorafenib 5 pM y GW5074 10 pM o la terapia de combinación.
La figura 8 muestra el nivel de fosforilación de pDAPKS308 y la expresión de la proteína DAPK de las células ACHN a las 24 horas después de los tratamientos de DMSO (grupo de control), Sorafenib 5 pM y GW5074 10 pM o la terapia de combinación mediante inmunotransferencia.
La figura 9 muestra los resultados de inmunoprecipitación de DAPK endógeno de células ACHN a las 24 horas después de los tratamientos de DMSO (grupo de control), Sorafenib 5 pM y GW5074 10 pM o la terapia de combinación, seguido de la inmunotransferencia para teñir otras proteínas relevantes mediante la utilización de anticuerpos específicos.
La figura 10 muestra los resultados de inmunoprecipitación de c-Raf endógeno de células ACHN a las 24 horas después de los tratamientos de DMSO (grupo de control), Sorafenib 5 pM y GW5074 10 pM o la terapia de combinación, seguido de la inmunotransferencia para teñir otras proteínas relevantes mediante la utilización de anticuerpos específicos.
La figura 11 muestra la inhibición del crecimiento de células ACHN tras la terapia de combinación en presencia o en ausencia de inhibidor de PP2A:cantaridina (C.A.) o ácido ocadaico (O.A.).
La figura 12 muestra la inhibición del crecimiento de las células ACHN que expresan establemente c-Raf de tipo salvaje o mutante a las 24 horas de iniciar la terapia de combinación. (*p < 0,05, **p < 0,01 en la comparación con c-Raf de tipo salvaje).
La figura 13 es un perfil de expresión de proteínas de las células ACHN que expresan c-Raf etiquetada con Flag o los mutantes indicados a las 24 horas del tratamiento de DMSO (control) o de la terapia de combinación. Se inmunoprecipitó Flag-c-Raf a partir de lisados celulares, seguido de inmunotransferencia para los anticuerpos indicados.
La figura 14 muestra la inhibición del crecimiento de células ACH, 786-O y Rcc-Sut-002 transfectadas con ARNip aleatorizado (Scr), ARNip1 de DAPK (siDAPK-a) o ARNip2 de DAPK (siDAPK-b) tras la terapia de combinación (panel superior). Se examinó la expresión de DAPK y a-catenina de los lisados celulares mediante inmunotransferencia.
La figura 15 muestra la inhibición del crecimiento de células HeLa que expresan DAP etiquetado con V5 y los mutantes indicados a las 24 horas de iniciar la terapia de combinación.
La figura 16 muestra la inhibición del crecimiento de células MDA-MB231 que expresan DAP etiquetado con V5 y los mutantes indicados a las 24 horas de iniciar la terapia de combinación.
La figura 17 muestra la inhibición del crecimiento de diversas células de cáncer o células normales a las 24 horas de los tratamientos de Sorafenib 5 pM.
La figura 18 muestra la inhibición del crecimiento de diversas células de cáncer o células normales a las 24 horas de los tratamientos de GW5074 10 pM.
La figura 19 muestra la inhibición del crecimiento de diversas células de cáncer o células normales a las 24 horas de la terapia de combinación de Sorafenib 5 pM y GW5074 10 pM.
La figura 20 muestra el nivel de fosforilación de pDAPKS308 del grupo ACHN en comparación con el grupo de control; se detectó la expresión de pDAPKS308 y DAPK mediante inmunotransferencia.
La figura 21 es un gráfico de regresión que muestra la correlación entre la expresión de pDAPKS308 y la inhibición del crecimiento de las células; R2 = 0,4551, R = 0,6746, p = 0,00001.
La figura 22 muestra el nivel de expresión de pDAPKS308 y DAPK en tumores (pT) o en tejidos normales (pN) del mismo paciente, mediante inmunotransferencia.
La figura 23 muestra la intensidad relativa de pDAPKS308 tras la normalización respecto a la expresión de GAPDH. La figura 24 es el análisis inmunohistoquímico (IHQ) de la expresión de pDAPKS308 de tejidos humanos normales y de carcinoma renal. Magnificación original: x40 (panel superior), x100 (panel inferior); las barras de escala son de 100 pM.
La figura 25 muestra la expresión de pDAPKS308 de tejidos normales humanos y de cáncer renal después de la cuantificación utilizando micromatrices; normales, así como diferentes grados (G).
La figura 26 muestra la expresión de pDAPKS308 de tejidos normales humanos y de cáncer renal después de la cuantificación utilizando micromatrices; diferentes estadios (T), así como metástasis de células de cáncer (meta.). La figura 27 es una fotografía simulada por ordenador que muestra la conformación de la c-Raf quinasa después de la interacción con Sorafenib y GW5074; el verde representa GW5074 y el magenta representa Sorafenib.
Descripción detallada de la forma de realización preferente
A continuación, la presente invención se describe más específicamente en referencia a los ejemplos siguientes, que se proporcionan con fines demostrativos y no limitativos.
Ejemplo 1. Terapia de combinación de Sorafenib y GW5074: ensayos celulares.
Se cultivaron células de carcinoma renal humano (ACHN) en medio MEM (medio esencial mínimo) de Eagle con FBS (suero de feto bovino, por sus siglas en inglés) al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%. La sulforrodamina B (SRB) es una proteína negativa con un grupo ácido sulfónico y se une a aminoácidos básicos de proteínas intracelulares bajo condiciones ácidas débiles. La proteína SRB se extrajo de las células utilizando solución alcalina débil y después se sometió a medición de la absorbancia. La cantidad de proteínas intracelulares, que es un indicador de supervivencia celular, puede calcularse a partir de la cantidad de SRB. Se trataron células ACHN o A498 individualmente con Sorafenib 2,5 jiM, Sorafenib 5 jiM, Sorafenib 10 jiM, GW5074, L779450 o PLX4720 durante 48 y 72 horas, seguido de un ensayo de SRB para evaluar la supervivencia celular. Alternativamente, se pretrataron las células ACHN con GW5074 10 jiM, L779450 10 jiM o PLX4720 10 jiM durante 30 minutos antes del tratamiento con Sorafenib 5 jiM durante 24, 48 y 72 horas adicionales, seguido de ensayo de SRB para evaluar la inhibición del crecimiento.
Basándose en estos resultados, la combinación de inhibidores de c-Raf que comprendían Sorafenib y GW5074 no mostró inhibición del crecimiento de las células tras el tratamiento de una sola dosis baja durante 24 horas (Sorafenib 5 jiM o GW5074 10 jiM) (figuras 1 a 3, medias±S.D., n=4). Sin embargo, la combinación de dichos dos fármacos no sólo indujo la citotoxicidad que no se observó en el tratamiento individual con cualquiera de los fármacos originalmente, sino que redujo con éxito los efectos secundarios causados por la dosis eficaz de Sorafenib e inhibió el crecimiento de las células de cáncer, sugiriendo un efecto sinérgico (figura 4, medias±S.D., **P<0,01, n=4).
Ejemplo 2. Terapia de combinación de Sorafenib y GW5074: xenoinjertos.
Se xenoinjertaron ratones macho inmunodeficientes de seis semanas de edad (BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl) de peso promedio de 20 gramos, con 1x107 células ACHN en el flanco derecho mediante inyección intraperitoneal (i.p.). Los ratones se mantuvieron en un medio libre de patógenos específico (SPF, por sus siglas en inglés). Se midió el tamaño de los tumores mediante la utilización de un calibrador digital dos veces a la semana y se calcularon los volúmenes tumorales mediante la ecuación de longitud * anchura * altura 0,5. La administración de fármaco que incluía 5 mg/kg de Sorafenib mediante sonda esofágica e inyección subcutánea de 10 mg/kg de GW5074 una vez al día durante tres semanas se inició una vez el volumen tumoral era >100 mm3 y el tamaño del tumor se midió cada tres días. Se incluyó un total de cuatro grupos en el experimento: un grupo de control que recibió únicamente vehículo (DMSO) y grupos de ensayo en los que se administraron 5 mg/kg de Sorafenib, 25 mg/kg de GW5074 o la terapia de combinación de 5 mg/kg de Sorafenib y 25 mg/kg de GW5074, respectivamente, con 8 ratones en cada grupo.
Los resultados se muestran en la figura 5. El tratamiento de Sorafenib 5 jiM o GW5074 10 jiM por sí solos no mostró ningún efecto de inhibición. En contraste, la terapia de combinación de Sorafenib 5 jiM y GW5074 10 jiM mostró una inhibición del crecimiento significativa de las células ACHN (prueba t, medias±SD, **P<0,01, n-8).
Ejemplo 3. Terapia de combinación de Sorafenib y GW5074: el modelo ortotópico.
Con el fin de simular el fenómeno clínico, los presentes inventores establecieron un modelo animal espontáneo ortotópico para estudiar la metástasis del carcinoma renal. En primer lugar, se transfectaron células ACHn con el gen de luciferasa y los transfectantes Luc-ACHN resultantes (transfectantes estables que expresaban la luciferasa) con niveles de expresión diferentes a continuación se seleccionaron para el cultivo in vivo en ratones mediante inyección subcutánea. En ratones de seis semanas de edad y afeitados se inyectaron por vía subcutánea 1x107 células Luc-ACHN en 0,1 ml de PBS. Dos meses después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se recogieron sus riñones, hígados, ganglios linfáticos regionales, así como otros órganos, para evaluar las células tumorales que eran potencialmente metastásicas, lo que se confirmó mediante tinción de hematoxilina-eosina (H+E). Las líneas de células tumorales que eran altamente metastásicas se diseccionaron en 1 ml de PBS en trozos pequeños asépticamente y después se cultivaron en medio MEM que contenía FBS (suero de feto bovino) al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% después de la centrifugación. Unos cuantos días después, las líneas celulares monoclonales se trataron en primer lugar con tripsina para disociar las células y después se cultivaron in vitro. Las células obtenidas de los tejidos tumorales hepáticos se denominaron ACHN-L. El potencial metastásico de diversas líneas celulares monoclonales recogidas de diferentes órganos se analizó adicionalmente mediante xenoinjertación de dichas células tumorales en los riñones izquierdos de los ratones. Los ratones xenoinjertados fueron sacrificados y examinados 8 semanas después de la inyección de las células tumorales. El crecimiento tumoral observado en cada órgano se investigó mediante examen visual y procedimientos histológicos. Las células metastásicas encontradas en el hígado se diseccionaron en trozos pequeños asépticamente y se cultivaron in vitro. Las células obtenidas de los tejidos tumorales hepáticos se denominaron células ACHN-L (inyección subcutánea) y las células recogidas de las lesiones metastásicas después de la inyección de las células ACHN-L en los riñones izquierdos se denominaron células ACHN-LL. El mismo procedimiento utilizando xenoinjerto ortotópico de célula ACHN-LL y células metastásicas hepáticas se repitió dos veces para seleccionar los tumores altamente metastásicos. Se seleccionó la línea celular de cáncer (Luc-ACHN-LL), que era altamente metastásica y causaba una mortalidad elevada. En ratones macho inmunodeficientes se inyectaron 3x105 células Luc-ACHN-LL en 50 jil de PBS en la cápsula renal derecha. Se examinó la actividad de luciferasa in vivo cada día durante hasta tres semanas a fin de garantizar que no se observaban fugas de células de cáncer en los riñones inmediatamente después de la inyección y para monitorizar la metástasis de dichas células de cáncer. Dos a cinco minutos antes de utilizar el sistema IVIS Xenogene, se inyectaron 75 mg/kg de D-luciferina (Xenogen) en PBS en el seno retroorbital de cada ratón. Dos semanas después de la inyección de las células Luc-ACHN-LL, se utilizó el sistema IVIS Xenogene para monitorizar la transferencia de imágenes fluorescentes biológicas y para calcular las intensidades de las señales de fotones (fotones/cm2/estereorradianes). Se incluyó un total de cinco grupos en el estudio: un grupo de control que recibió únicamente vehículo y cuatro grupos de ensayo que recibieron, respectivamente, 10 mg/kg de Sorafenib, 25 mg/kg de GW5074, una terapia de combinación de 10 mg/kg de Sorafenib y 25 mg/kg de GW5074 (los animales se alimentaron con Sor 30 min después de la inyección i.p. de GW), o 60 mg/kg de Sorafenib.
Tal como se muestra en los resultados, los ratones del grupo de control, del grupo de 10 mg/kg de Sorafenib y del grupo de 25 mg/kg de GW5074 murieron 5, 8 y 5 semanas después de la inyección de células de cáncer, respectivamente. De manera similar, también se observó pérdida de peso en el grupo de ensayo de dosis alta que recibió 60 mg/kg de Sorafenib, seguido de muerte en 10 semanas. Inesperadamente, únicamente los ratones en el grupo que recibió terapia de combinación de dosis baja, de 10 mg/kg de Sorafenib y 25 mg de GW5074, mostró la inhibición tanto de los tamaños tumorales como de la metástasis de los tumores, así como un periodo de supervivencia prolongado en comparación con los otros grupos. La figura 6 muestra las imágenes de IVIS y la cuantificación de la intensidad de los fotones, medias±SD, **P<0,01, n=4. Además, los pesos corporales, así como la energía de los ratones que recibieron la terapia de combinación fueron similares a los observados en ratones normales. Las células tumorales recogidas de ratones que habían recibido la terapia de combinación también mostraron una profunda necrosis tumoral en comparación con otros grupos.
En resumen, la terapia de combinación de Sorafenib y GW5074 en dosis baja resulta eficaz para la inhibición del crecimiento de las células de cáncer in vitro. Además, más importante, la eficacia de la terapia de combinación puede examinarse in vivo en la condición que simula la metástasis clínica de las células de cáncer.
Ejemplo 4:
La terapia de combinación de Sorafenib y GW5074 indujo necrosis celular mediante desfosforilación de DAPK asociada a muerte en la serina 308, seguido de la disociación del protooncogén c-Raf. Las células se cultivaron tal como se indica en el Ejemplo 1, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI, por sus siglas en inglés) durante 15 minutos. La presencia de anexina V fluorescente, así como yoduro de propidio (PI) se detectó mediante citometría de flujo a fin de determinar si la muerte celular estaba causada por apoptosis o necrosis. La expresión de c-Raf y DAPK, así como el nivel de fosforilación de DAPK, se examinaron mediante transferencia Western e inmunoprecipitación utilizando anticuerpos. Se incluyeron anticuerpos anti-DAPK o IgG de conejo no inmune (IP: inmunoglobulina) a modo de controles negativos, y se midió la supervivencia celular mediante ensayo de SRB, tal como se muestra en el Ejemplo 1. En el presente experimento, se trataron células ACHN por separado con DMSO (como grupo de control), Sorafenib 5 j M, GW5074 10 j M o la terapia de combinación de Sorafenib 5 j M y GW5074 10 j M durante 24 horas.
Los resultados indicaron que la tasa media de necrosis celular de las células ACHN tratadas con DMSO, la monoterapia de Sorafenib 5 j M y la monoterapia de GW5074 10 j M era de 0,37, 0,77 y 1,35%, respectivamente. Sin embargo, las células que recibieron la terapia de combinación mostraron un incremento significativo de la necrosis, hasta 53,95% (figura 7, prueba t, medias±SD, ***P<0,001, n=4). Sólo se observó una reducción significativa del número de grupos fosfatos de S308 debido a la desfosforilación de pDAPKS308 por PP2A en células tumorales, en células tratadas con la terapia de combinación (figura 8). Los resultados de la inmunoprecipitación sugieren además que c-Raf y DAPK, así como PP2A, formaron un complejo. La terapia de combinación redujo las interacciones entre PP2A, DAPK y c-Raf, que posteriormente redujeron pDAPS308 (figuras 9 y 10). En el grupo de ensayo que recibió la terapia de combinación, diversas concentraciones de inhibidores de PP2A (ácido cantaridínico, C.A. y ácido ocadaico, O.A.) resultaron eficaces en la inhibición de la desfosforilación de pDAPKS308 y el crecimiento de las células ACHN únicamente al proporcionarlas 30 minutos antes de la administración de los fármacos de combinación (figura 11, * P <0,05, ** P <0,01, n=4).
A continuación, los efectos de la terapia de combinación sobre la eficacia de pc-RafS338. Se observó que la reducción de pDAPKS308 era más significativa en el caso de que las células ACHN se transfectasen con c-Raf33380 (simulación de la fosforilación de S338). Además, c-Raf0338* (simulación de desfosforilación de S338) no sólo debilitó la desfosforilación de DAPK S308, sino que también redujo la inhibición del crecimiento de las células ACHN bajo la terapia de combinación (figura 12, * P <0,05, ** P <0,01, n=3). Además, los resultados de inmunoprecipitación sugieren que c-Raf33380 (simulación de la fosforilación de S338) aparentemente pierde su interacción con PP2A en comparación con c-RafWT (tipo salvaje) y c-RafS338A (simulación de desfosforilación de S338) (figura 13). Por lo tanto, la terapia de combinación no sólo incrementa pc-RafS338, sino que además facilita la desfosforilación de pDAPK®308 por PP2A y potencia la necrosis celular.
El ejemplo anteriormente mencionado revela que la terapia de combinación de Sorafenib y GW5074 induce la necrosis celular mediante la desfosforilación de la serina 308 de la proteína quinasa (DAPK) asociada a muerte, seguido de la disociación del protooncogén c-Raf. El desensamblaje de c-Raf y DAPK también puede utilizarse como la diana para el diseño de futuros fármacos, ya que la disociación de c-Raf respecto de DAPK en las células conduce al inicio del proceso de necrosis celular, que elimina las células eficazmente.
Ejemplo 5. Métodos de cribado de fármacos utilizando biomarcadores in vitro.
Los estudios anteriores muestran que la desfosforilación de DAPK en la serina 308 puede utilizarse como un biomarcador predictivo de los efectos anticáncer de fármacos sobre las células de cáncer. Los métodos para el cultivo celular, así como la detección para el examen de la inhibición del crecimiento, se describen en el Ejemplo 1. Las líneas celulares ACHN, 786-O y Rcc-Sut- 002 (células de cáncer resistentes a fármaco) se trataron con ARNip de DAPK tipo a y tipo b (siDAPK-a, cadena de sentido: 5'-CAAGAAACGUUAGCAAAUGUU-3' [SEC ID n° 3] y cadena antisentido: 5'-CAUUUGCUAACGUUUCUUGUU-3' [SEC ID n° 4]; siDAPK-b, cadena de sentido: 5'-GGUCAAGGAUCCAAAGAAGUU-3' [SEC ID n° 5] y cadena antisentido: 5'-CUUCUUUGGAUCCUUGACCUU-3' [SEC ID n° 6]). Se analizó cada línea celular mediante siDAPK-a, siDAPK-b y un control (Scr). Se examinó la inhibición del crecimiento de las células tras la terapia de combinación de Sorafenib 5 pM y GW5074 10 pM durante 24 horas. Por otra parte, las células HeLa y las células MDA-MB-231 se transfectaron con el vector vacío de control (vector), WT (tipo salvaje), DAPKS308D, Da PKS308A o DAPKK42A (proteína quinasa inactivada) y se examinó la inhibición del crecimiento de las células transfectadas después de la terapia de combinación de Sorafenib 5 pM y GW5074 10 pM durante 24 horas.
Los resultados indican que la proteína DAPK resulta indispensable para la citotoxicidad inducida por la terapia de combinación de Sorafenib y GW5074. En las células ACHN, 786-O y RCC-SUT-002, la inhibición del crecimiento que resulta de dos ARNip capaces de inhibir la expresión de DAPK se redujo en aproximadamente 60% (figura 14). Además, la fosforilación de DAPK en S308 estaba altamente asociada a la citotoxicidad inducida por la terapia de combinación. La sobreexpresión de DAPKwt y DAPKS308D en células HeLa que habitualmente expresan niveles más elevados de pDAPKS308 incrementó notablemente la citotoxicidad tras recibir la terapia de combinación, mientras que la muerte celular no resultó potenciada en DAPKK42A (DAP quinasa inactivada) y DAPKS308A (simulación de la no fosforilación de S308) después de la terapia de combinación. Se encontró que solo DAPKS308D incrementaba la inhibición del crecimiento en células de cáncer mamario MDA-MB-231 que habitualmente expresan niveles más bajos de pDAPKS308 después de recibir la terapia de combinación. El resto, incluyendo DAPKwt, DAPKS308A y DAPKK42A, no mostraron ningún incremento de la inhibición del crecimiento (figuras 15 y 16, medias±SD, **p < 0,01, n=3). Según los resultados, no es la proteína DAPK misma, sino la fosforilación de S308 de DAPK que desempeña un papel crucial en la inducción de la citotoxicidad al tratarse con la terapia de combinación de Sorafenib y GW5074. Lo anterior se debe a que la desfosforilación de S308 no resulta eficaz bajo la terapia de combinación ni siquiera con un nivel de expresión más elevado de DAPK. El efecto de citotoxicidad inducido por la terapia de combinación debe operar a través de DAPK activado. Por lo tanto, la terapia de combinación de Sorafenib y GW5074 solo resulta eficaz en presencia de pDAPKS308 en las células de cáncer.
La fosforilación de la proteína c-Raf puede utilizarse como un biomarcador para predecir el efecto anticáncer de los fármacos sobre las células de cáncer. La reducción de pDAPKS308 era más evidente en las células ACHN transfectadas con c-Raf33380 (simulación de la fosforilación de S388). No solo c-RafS338A (que simula la desfosforilación de S388) reduce la desfosforilación de S308 de DAPK, sino que además reduce la inhibición del crecimiento de las células ACHN bajo la terapia de combinación (figura 12, * P <0,05, ** P <0,01, n=3). De esta manera, la fosforilación de S338 de c-Raf resulta beneficiosa para la terapia de combinación debido a los mejores efectos del tratamiento, y S338D de c-Raf (que simula la fosforilación de S388) presenta un mejor efecto que S338a de c-Raf (que simula la desfosforilación de S388).
Además, se examinó el número de células de cáncer, además del número de células normales. Se encontró que la terapia de combinación causaba solo una citotoxicidad limitada en las células anteriormente indicadas debido a la baja fosforilación de S308 de DAPK en fibroblastos normales y en células epiteliales. Sin embargo, la inhibición del crecimiento causada por la terapia de combinación entre diversas células tumorales se correlaciona positivamente con el nivel de fosforilación de S308 de DAPK (figuras 17, 18, 19, 20 y 21, medias±SD, **p < 0,01, n=3). Se investigó adicionalmente si la terapia de combinación presentaba un efecto de inhibición sobre las células de cáncer resistentes a fármacos utilizando células de cáncer resistentes a Sorafenib obtenidas de casos clínicos (RCC-Sut-001, RCC-Sut-002, RCC-Sor-001) y modelos animales (786-OT4, ACHN-T2R). Todas las células de cáncer resistentes a fármaco que presentaban s 308 de DAPK altamente fosforilado resultaron significativamente inhibidas bajo la terapia de combinación. Además, las líneas celulares de cáncer HT29 y A2058, ambas resistentes a inhibidores de Raf, también mostraron un nivel elevado de fosforilación de S308 de DAPK, y la terapia de combinación mostró una inhibición significativa, así como un efecto sinérgico (figuras 17, 18, 19 y 20, y la Tabla, a continuación). Además, debido a que la fosforilación de S308 en DAPK en las células normales es relativamente baja, la inhibición del crecimiento de las células de cáncer inducida por la terapia de combinación de Sorafenib y GW5074, por lo tanto, es selectiva y no causa toxicidad en células normales.
Figure imgf000008_0001
continuación
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En vista de los datos proporcionados en la Tabla 1, anteriormente, se encontró c-Raf y DAPK en el citoplasma y en las mitocondrias, y la terapia de combinación condujo a la relocalización de DAPK entre citoplasma y mitocondrias, junto con la desfosforilación de pDAPKS308 por PP2A. La DAPK desfosforilada redujo su interacción con c-Raf en el citoplasma. Además, solo puede inducirse la traslocación de DAPKS308D de las mitocondrias al citoplasma de las MDA-MB-231 bajo la terapia de combinación. Lo anterior resulta en la producción de especies de oxígeno reactivo (EOR) y el bajo nivel de fosforilación de pDAPKS308 Sin embargo, la reducción tanto de c-Raf como de la fosforilación de su S338 inducidos por la terapia de combinación en el citoplasma y las mitocondrias se encontró solo en células de cáncer con pDAPKS308 altamente fosforilado y no en células de cáncer con un nivel bajo de pDAPKS308
Ejemplo 6:
Las muestras de tumor y las muestras de tejido normal recogidas de 20 pacientes con carcinomas de células renales se investigaron adicionalmente. Basándose en los resultados de transferencia Western, 16 de 20 muestras mostraron un nivel elevado de fosforilación de DAPK en S308 en células de cáncer en comparación con las muestras de tejido normal (figuras 22 y 23 (pDAPKS308/GAPDH, medias± S.D., **p <0,005)). El análisis inmunohistoquímico (IHQ) también demostró que la fosforilación en S308 de DAPK era más elevada en 181 muestras de carcinoma renal humano en comparación con los tejidos renales normales (figura 24). Por otra parte, la fosforilación en S308 de DAPK no mostró diferencias significativas entre diferentes grados (G) o estadios (T) del cáncer mediante la utilización de micromatrices de tejidos (TMA, por sus siglas en inglés) y el análisis semicuantitativo. Los resultados sugieren que pDAPKS308 es no sólo un factor que determina el pronóstico, sino también un biomarcador predictivo de la terapia de combinación como tratamiento de los cánceres renales.
Según los resultados, a continuación se llevó a cabo un experimento de simulación por ordenador para evaluar las estructuras cristalinas de diversos inhibidores de c-Raf unidos a c-Raf. Se esperaba la producción de energía máxima con la unión de inhibidores a la región estructural de la c-Raf quinasa al unirse la combinación de GW5074 y Sorafenib a c-Raf (-182 kcal/mol, Tabla, a continuación). GW5074 en el extremo frontal se une a c-Raf y produce un bolsillo hidrofóbico más profundo para la unión a través de Ile355, Val363, Ala373, Leu406, Trp423 y Phe47. Bajo las circunstancias, más regiones en el bolsillo hidrofóbico resultarán ocupadas por GW5074 y el Sorafenib (tal como se muestra en la figura 27).

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer, que comprende Sorafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y 3-(3,5-dibromo-4-hidroxi-bencilidén)-5-yodo-1,3-dihidro-indol-2-ona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 1, en la que el Sorafenib y 3-(3,5-dibromo-4-hidroxi-bencilidén)-5-yodo-1,3-dihidro-indol-2-ona se administran por separado, concurrentemente o secuencialmente.
  3. 3. Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 1, en la que el cáncer es carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, carcinoma cervical, cáncer oral, glioma, carcinoma de células uroteliales, o melanoma.
  4. 4. Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 1, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  5. 5. Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 4, en la que el vehículo se selecciona del grupo que consiste en excipientes, diluyentes, espesantes, agentes de carga, ligantes, desintegrantes, lubricantes, agentes aceitosos o no aceitosos, tensioactivos, agentes de suspensión, agentes gelificantes, adyuvantes, conservantes, antioxidantes, conservantes y agentes colorantes.
  6. 6. Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 1, en la que la composición farmacéutica se administra mediante administración oral, inmersión, inyección, aplicaciones tópicas o administración de un parche.
  7. 7. Composición farmacéutica para la utilización en el tratamiento del cáncer según la reivindicación 1, en la que la 3-(3,5-dibromo-4-hidroxi-bencilidén)-5-yodo-1,3-dihidro-indol-2-ona altera la conformación de la proteína c-Raf que presenta la secuencia SEC ID n° 1 tras la unión a la misma, incrementando de esta manera la afinidad de unión del Sorafenib para la proteína c-Raf de manera que se disocia c-Raf respecto del complejo de proteínas c-Raf/DAPK.
  8. 8. Combinación de compuestos para la utilización en el tratamiento del cáncer, en la que la combinación comprende Sorafenib y 3-(3,5-dibromo-4-hidroxi-bencilidén)-5-yodo-1,3-dihidro-indol-2-ona, y en la que la combinación de compuestos disocia un complejo de proteínas en las células, en la que el complejo de proteínas es un complejo de proteínas c-Raf/DAPK, en el que la proteína c-Raf presenta la secuencia SEC ID n° 1 y la proteína DAPK presenta la secuencia SEC ID n° 2.
  9. 9. Método para el cribado de un fármaco candidato mediante la utilización de un biomarcador, que comprende las etapas de proporcionar un espécimen, detectar el nivel de fosforilación del biomarcador en el espécimen antes de la administración de un fármaco de ensayo y detectar una tasa de inhibición del crecimiento celular del fármaco de ensayo en el espécimen, y en el que el nivel de fosforilación del biomarcador se correlaciona positivamente con la tasa de inhibición del crecimiento celular, determinar que el fármaco de ensayo es el fármaco candidato, en el que
    el biomarcador es una proteína DAPK que presenta la secuencia SEC ID n° 2, en el que el residuo aminoácido serina 308 (Ser308) de la proteína DApK está fosforilado.
  10. 10. Método según la reivindicación 9, en el que el espécimen es ascites, sangre, orina, heces, esputo, células mucosales, líquido gástrico, bilis o tejidos de cáncer desprendidos que se recogen después de una cirugía.
  11. 11. Método según la reivindicación 9, en el que el fármaco candidato comprende Sorafenib y 3-(3,5-dibromo-4-hidroxi-bencilidén)-5-yodo-1,3-dihidro-indol-2-ona.
  12. 12. Utilización de un biomarcador en el cribado de un fármaco candidato, en el que el biomarcador es una proteína DAPK que presenta la secuencia SEC ID n° 2, en la que el residuo aminoácido serina 308 (Ser308) de la proteína DAPK está fosforilado.
  13. 13. Utilización según la reivindicación 12, en el que el fármaco candidato comprende Sorafenib y 3-(3,5-dibromo-4-hidroxi-bencilidén)-5-yodo-1,3-dihidro-indol-2-ona.
  14. 14. Utilización según la reivindicación 12, que comprende además la detección del nivel de fosforilación del biomarcador antes de la administración de un fármaco de ensayo y detectar una tasa de inhibición del crecimiento celular del fármaco de ensayo, y en el que el nivel de fosforilación del biomarcador se correlaciona positivamente con la tasa de inhibición del crecimiento celular, determinando que el fármaco de ensayo es el fármaco candidato.
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