ES2879964T3 - Composiciones y métodos para realizar ensayos de detección de metilación - Google Patents

Abstract

Un método para caracterizar sangre o un producto sanguíneo, que comprende: a) proporcionar una muestra de sangre o de un producto sanguíneo, preferiblemente una muestra de plasma, procedente de un sujeto; b) ensayar dicha muestra para detectar la presencia de ADN específico de células de un tejido, preferiblemente ADN específico de células epiteliales, en el que la presencia de dicho ADN específico de células de un tejido es indicativa de la presencia de células del tejido en dicha muestra de sangre o de producto sanguíneo, comprendiendo dicho método: i) tratar un ADN procedente de dicha muestra de sangre o de producto sanguíneo con un reactivo de bisulfito para producir ADN ZDHHC1 convertido con bisulfito; ii) amplificar una región de dicho ADN ZDHHC1 convertido con bisulfito usando una pareja de cebadores complementarios con SEQ ID NO:27 o su complemento; en el que la amplificación de dicha región es indicativa de la presencia de ADN específico de células de un tejido en la muestra de sangre o de un producto sanguíneo,

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para realizar ensayos de detección de metilación

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. n.° de serie 62/091.069, presentada el 12 de diciembre, 2014.

Campo de la invención

En la presente se proporciona una tecnología relacionada con composiciones y métodos para detectar ADN específico de células epiteliales en sangre o en productos sanguíneos procedentes de un sujeto, en la que la presencia y la cantidad de ADN de células epiteliales en la sangre o en el producto sanguíneo es indicativa de la presencia o la magnitud de una afección médica en el sujeto. La tecnología también se refiere al uso de ADN específicos de células de tejidos, por ejemplo, ADN específico de células epiteliales, como controles internos para ensayos de metilación en muestras, tales como muestras de heces o de tejidos, procedentes de un sujeto.

Antecedentes

El ADN metilado se ha estudiado como una clase potencial de biomarcador en los tejidos de la mayoría de los tipos de tumores. En muchos casos, las ADN metiltransferasas añaden un grupo metilo al ADN en sitios de islas de citosina-fosfato-guanina (CpG) como control epigenético de la expresión génica. En un mecanismo atractivo desde el punto de vista biológico, se cree que los acontecimientos de metilación adquirida en regiones de promotores de genes supresores de tumor silencian la expresión, contribuyendo con ello a la oncogénesis. La metilación del ADN puede ser una herramienta de diagnóstico más estable desde el punto de vista químico y biológico que la expresión de ARN o de proteínas (Laird (2010), "Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis", Nat. Rev. Genet. 11:191 -203). Además, en otros cánceres, tales como el cáncer de colon esporádico, los marcadores de metilación ofrecen una especificidad excelente y son más sensibles y ampliamente informativos que las mutaciones del ADN individuales (Zou et al. (2007), "Highly methylated genes in colorectal neoplasia: implications for screening", Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 16:2686-96). Siri Strand et al. ("Prognostic DNA Methylation Markers for Prostate Cancer", International Journal of Molecular Sciences, vol. 15, n.° 9, 18.09.2014) describen un conjunto de genes marcadores de la metilación que incluye ZDHHC1.

Los ácidos nucleicos procedentes de muestras de pacientes, por ejemplo, muestras de sangre, heces y tejidos, que se analizan para la presencia de mutaciones y/o para el estado de metilación asociado con una enfermedad o el riesgo de padecer una enfermedad generalmente atraviesan un número de etapas del proceso durante el análisis. Estas etapas pueden comprender, por ejemplo, filtración, precipitación, captura, lavado, elución y/o modificación química. Para el análisis de ADN para determinar el estado de metilación, por ejemplo, el porcentaje de metilación de un ADN de ensayo, el procesamiento generalmente comprende un tratamiento con bisulfito para convertir bases de dC no metiladas en restos dU, haciendo que sean más fácilmente distinguibles de los restos metil-C que están protegidos frente a la conversión con bisulfito.

La cuantificación precisa de un ADN de ensayo (por ejemplo, la determinación del porcentaje de metilación, la presencia y cantidad de ADN que porta una mutación, etc.) generalmente requiere una normalización a un ácido nucleico control, por ejemplo, un gen invariante endógeno que tiene características conocidas (por ejemplo, una secuencia conocida, un número de copias por célula conocido). Los controles de normalización para variaciones entre muestras que pueden producirse, por ejemplo, en el procesamiento de la muestra, la eficacia del ensayo, etc., permiten una comparación de datos precisa entre muestras.

Se ha usado un ADN marcador específico de cáncer en sangre o en productos sanguíneos, que está presente en complejos o células del cáncer circulantes o como un ADN circulante separado de células, para caracterizar tumores sólidos, por ejemplo, carcinomas de mama, en sujetos. Sin embargo, la utilidad de analizar sangre para marcadores de cáncer concretos se limita a la evaluación de tumores originarios concretos o tipos de cánceres que ya han sido caracterizados para esos marcadores, y la detección de marcadores concretos en la sangre de un sujeto puede tener un uso limitado para la detección de otras afecciones o cánceres.

Resumen

En la presente se proporciona una tecnología relacionada con la caracterización de muestras, por ejemplo, muestras de sangre, muestras de heces, etc., para detectar la presencia o la ausencia y/o cantidades de diferentes especies de ácidos nucleicos que pueden estar asociados, por ejemplo, con un estado de salud de un sujeto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la tecnología se relaciona con detectar y medir ADN asociado con un tejido concreto en un tipo de muestra que generalmente no contiene ADN de este tejido. En realizaciones preferidas, la tecnología se dirige a detectar y/o medir células epiteliales y/o ADN específico de células epiteliales en sangre o en muestras de productos sanguíneos.

En algunas realizaciones, la tecnología proporciona un método para controlar un estado de enfermedad en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas, por ejemplo, de obtener una primera muestra de un producto sanguíneo de un sujeto en un primer momento; iniciar un protocolo de tratamiento, en el que el protocolo de tratamiento comprende una intervención terapéutica; obtener una segunda muestra de un producto sanguíneo del sujeto en un segundo momento, en el que el segundo momento es después de iniciar dicho protocolo de tratamiento; y ensayar la primera muestra de producto sanguíneo y la segunda muestra de producto sanguíneo para detectar una cantidad de un ADN específico de células epiteliales, en el que una diferencia en la cantidad de ADN específico de células epiteliales entre la primera muestra de producto sanguíneo y la segunda muestra de producto sanguíneo es indicativa de un cambio en el estado de enfermedad en dicho sujeto. La tecnología no está limitada con respecto a cuándo se ensayan la primera y la segunda muestra de producto sanguíneo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la primera muestra de producto sanguíneo se ensaya antes de iniciar el protocolo de tratamiento, mientras que, en otras realizaciones, la primera muestra de producto sanguíneo se ensaya durante el protocolo de tratamiento, o después del protocolo de tratamiento, por ejemplo, al mismo tiempo que la segunda muestra de producto sanguíneo. En realizaciones preferidas, el método comprende generar un registro, por ejemplo, un registro de un paciente, tal como un registro médico electrónico o una copia impresa, en el que el registro indica un resultado del ensayo, por ejemplo, indica un valor (por ejemplo, una cantidad, o un cambio en la cantidad de ADN específico de células epiteliales en muestras comparativas), o un resultado de diagnóstico que se basa en un valor.

Los métodos no se limitan a ningún protocolo de tratamiento concreto. En algunas realizaciones, el protocolo de tratamiento puede no comprender ninguna intervención activa, por ejemplo, puede ser cuestión de mantener bajo observación a un sujeto. En realizaciones preferidas, el protocolo de tratamiento comprende uno o más de cirugía, terapia con fármacos, quimioterapia, inmunoterapia, terapia nutricional, terapia de radiación, terapia de temperatura y terapia física.

Una diferencia en la cantidad de ADN específico de células epiteliales entre la primera muestra de producto sanguíneo y la segunda muestra de producto sanguíneo es indicativa, por ejemplo, de la recurrencia, la progresión o la regresión del estado de enfermedad en dicho sujeto. En algunas realizaciones, no se usa un protocolo de tratamiento después de recoger la primera muestra, y una diferencia en la cantidad de ADN específico de células epiteliales entre la primera muestra de producto sanguíneo y la segunda muestra de producto sanguíneo es indicativa de una aparición inicial de un estado de enfermedad en el sujeto. En algunas realizaciones, el estado de enfermedad indicado por la presencia de ADN específico de células epiteliales en una muestra de sangre o de un producto sanguíneo es un cáncer, por ejemplo, un cáncer metastásico.

En algunas realizaciones preferidas, el ADN específico de células epiteliales comprende un ADN que está metilado en las células epiteliales y no está metilado en las células sanguíneas. En estas realizaciones, un método preferido comprende tratar el ADN procedente de una o más muestras de un producto sanguíneo con un reactivo de bisulfito para crear ADN específico de células epiteliales convertido. En realizaciones preferidas, el ADN específico de células epiteliales comprende ADN ZDHHC1, y en realizaciones particularmente preferidas, el ADN comprende al menos una porción de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:26.

El método no se limita a ninguna forma concreta de muestra de sangre o de producto sanguíneo. En ciertas realizaciones preferidas, el producto sanguíneo es plasma.

Los métodos no se limitan a ningún medio concreto para ensayar las muestras. En ciertas realizaciones preferidas, el ensayo comprende usar la reacción en cadena de la polimerasa, la secuenciación de ácidos nucleicos, la espectrometría de masas, nucleasas específicas de metilación, la separación basada en la masa, o la captura de ADN diana. En realizaciones particularmente preferidas, el ensayo comprende usar un ensayo de endonucleasa flap. En algunas realizaciones, la tecnología proporciona composiciones relacionadas con el análisis de una o más muestras procedentes de un sujeto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende una hebra de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:33 y/o una hebra de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:27. En algunas realizaciones, la composición comprende además un oligonucleótido de sonda de detección, en el que el oligonucleótido de sonda de detección comprende una región que es complementaria con una porción de dicha hebra de ADN. En realizaciones preferidas, el oligonucleótido de sonda de detección comprende una región que es complementaria con una porción de SEQ ID NO:27 y/o con una porción de SEQ ID NO:33. En realizaciones particularmente preferidas, el oligonucleótido de sonda de detección comprende una molécula indicadora. La molécula indicadora no se limita a ningún resto detectable concreto. En realizaciones preferidas, la molécula indicadora comprende un fluoróforo. En algunas realizaciones, la sonda de detección comprende una secuencia flap.

En ciertas realizaciones preferidas, la composición comprende además uno o más de un oligonucleótido de módulo de FRET, una endonucleasa flap, por ejemplo, una endonucleasa FEN-1 y/o una ADN polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa termoestable. En realizaciones preferidas, la ADN polimerasa es una ADN polimerasa bacteriana. En algunas realizaciones, la tecnología proporciona una mezcla de reacción, por ejemplo, para un ensayo de detección, que comprende cualquier combinación de las composiciones descritas anteriormente.

En algunas realizaciones, la tecnología se relaciona con realizar ensayos de metilación. En particular, en algunas realizaciones, la tecnología se relaciona con controles internos para ensayos de metilación.

En algunas realizaciones, la tecnología proporciona un método para caracterizar una muestra de sangre o de un producto sanguíneo procedente de un sujeto que comprende ensayar dicha muestra para detectar la presencia de ADN específico de células de un tejido, en el que la presencia del ADN específico de células de un tejido es indicativa de la presencia de células del tejido o de ADN procedente de células del tejido en la muestra de sangre o de producto sanguíneo. El ADN de células de un tejido puede estar presente dentro de las células del tejido en la sangre o dentro de otros complejos (por ejemplo, nucleosomas, episomas, complejos inmunitarios, micropartículas, etc.) o puede estar en forma de ADN circulante separado de células (ADNcsc). En algunas realizaciones, el ADN específico de células de un tejido es ADN específico de células epiteliales. En ciertas realizaciones preferidas, la muestra de un producto sanguíneo es una muestra de plasma.

En algunas realizaciones particularmente preferidas, el ADN específico de células de un tejido es ADN específico de células epiteliales que está metilado en las células epiteliales y no está metilado en las células sanguíneas, y la aplicación de la tecnología preferiblemente comprende tratar el ADN de la muestra con un reactivo de bisulfito para crear ADN específico de células de un tejido convertido. En realizaciones particularmente preferidas, el ADN específico de células epiteliales comprende ADN ZDHHC1, según se describe en la presente a continuación.

El método para analizar el ADN específico de células de un tejido no se limita a ningún método de análisis de ADN concreto. En algunas realizaciones, el ensayo comprende usar la reacción en cadena de la polimerasa, la secuenciación de ácidos nucleicos, la espectrometría de masas, nucleasas específicas de metilación, la separación basada en la masa y/o la captura de ADN diana. En realizaciones preferidas, el ensayo comprende un ensayo de endonucleasa flap. En algunas realizaciones preferidas, el ensayo es un ensayo de endonucleasa flap, por ejemplo, un ensayo QUARTS.

En algunas realizaciones, la tecnología proporciona ADN de referencia que pueden usarse para determinar el aporte de ADN humano total en una muestra, como un medio para determinar la cantidad relativa de un ácido nucleico de ensayo, por ejemplo, el porcentaje de metilación de un gen marcador de cáncer, en la muestra. En ciertas realizaciones preferidas, la tecnología proporciona ADN de referencia que tienen características de metilación similares a los ADN marcadores con los que se van a comparar, de modo que los ADN de referencia pueden exponerse a las mismas etapas preparativas que los ADN marcadores y se comportarán como ADN marcadores. En algunas realizaciones, la tecnología proporciona ADN control o marcadores que son específicos de células de un tejido, por ejemplo, células epiteliales. En realizaciones concretas, la tecnología proporciona ADN marcadores que están muy metilados, por ejemplo, en células de un tejido, por ejemplo, en células epiteliales de cáncer y normales, pero que no están metilados en la sangre, por ejemplo, en los linfocitos. Estos ADN marcadores tienen numerosas aplicaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, estos marcadores pueden usarse como ADN control o de referencia para cuantificar ADN derivado de un tejido en muestras que también pueden contener células sanguíneas, tales como linfocitos, que podrían producir una señal de fondo en la detección de otros ADN control, por ejemplo, p-actina. Estos marcadores específicos de células de un tejido también pueden aplicarse a la detección de células de un tejido en muestras en las que las células del tejido o el ADN del tejido están normalmente ausentes, por ejemplo, en la sangre, en la que la presencia de células del tejido o de ADN del tejido puede indicar la presencia de una enfermedad, por ejemplo, metástasis en el cáncer.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, la tecnología proporciona métodos para realizar un ensayo de detección de ácidos nucleicos cuantitativo, que comprende ensayar una muestra procedente de un sujeto para determinar una cantidad de al menos un gen marcador; ensayar la misma muestra para determinar una cantidad de ADN ZDHHC1 y comparar la cantidad de dicho al menos un gen marcador con la cantidad del ADN ZDHHC1 en la muestra para determinar la cantidad de dicho al menos un gen marcador con relación a la cantidad de ADN ZDHHC1 en dicha muestra. En algunas realizaciones, pueden emplearse controles externos, por ejemplo, patrones de calibración, para determinar la cuantificación absoluta de los genes marcadores y/o el ADN ZDHHC1.

En algunas realizaciones, la tecnología comprende tratar un ADN de la muestra con un reactivo de bisulfito para crear ADN ZDHHC1 convertido y al menos un gen marcador convertido, de modo que el ensayo para determinar una cantidad de un gen marcador y el ADN ZDHHC1 comprende ensayar una cantidad de un gen marcador convertido y ADN ZDHHC1 convertido.

Los métodos para ensayar los ácidos nucleicos mencionados anteriormente no se limitan a ningún método concreto. En algunas realizaciones, el ensayo comprende usar una o más de la reacción en cadena de la polimerasa, la secuenciación de ácidos nucleicos, la espectrometría de masas, nucleasas específicas de metilación, la separación basada en la masa, o la captura de ADN diana. En algunas realizaciones preferidas, el ensayo del ADN marcador y el ensayo del ADN ZDHHC1 se realizan en una única reacción. En realizaciones particularmente preferidas, el ensayo es un ensayo de endonucleasa flap, por ejemplo, un ensayo QUARTS.

En algunas realizaciones, la cantidad de un gen marcador convertido con relación a la cantidad de ADN ZDHHC1 convertido es indicativa de un estado de metilación del marcador, por ejemplo, en una muestra de ensayo, y el estado de metilación comprende una metilación mayor o menor del gen marcador con relación al estado de metilación normal del gen marcador. En ciertas realizaciones preferidas, un mayor porcentaje de metilación es indicativo de un estado de enfermedad.

Otras realizaciones proporcionan un método para detectar células de un tejido en la sangre o en un producto sanguíneo, que comprende: detectar la presencia de ZDHHC1 metilado en una muestra de sangre o de un producto sanguíneo procedente de un sujeto, en el que la presencia de ZDHHC1 metilado es indicativa de la presencia de células del tejido, por ejemplo, células epiteliales, en la sangre. En algunas realizaciones, la presencia de células de un tejido en la muestra es indicativa de un cáncer metastásico en el sujeto. En algunas realizaciones, el producto sanguíneo es plasma. En algunas realizaciones, el ensayo comprende usar la reacción en cadena de la polimerasa, la secuenciación de ácidos nucleicos, la espectrometría de masas, nucleasas específicas de metilación, la separación basada en la masa, o la captura de dianas. En algunas realizaciones, el ensayo es un ensayo de endonucleasa flap, por ejemplo, un ensayo QUARTS. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer colorrectal. Otras realizaciones proporcionan un método para detectar un cáncer metastásico en una muestra de sangre o de un producto sanguíneo procedente de un sujeto, que comprende: detectar la presencia de ZDHHC1 metilado en una muestra de sangre o de un producto sanguíneo procedente de un sujeto, en el que la presencia de ZDHHC1 metilado es indicativa de la presencia de un cáncer metastásico en el sujeto. Otras realizaciones proporcionan un kit, que comprende: a) al menos un oligonucleótido, en el que al menos una porción del oligonucleótido se hibrida específicamente con ZDHHC1; y b) bisulfito. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se selecciona de uno o más, por ejemplo, de un oligonucleótido de captura, una pareja de cebadores de ácido nucleico, una sonda de ácido nucleico, o un oligonucleótido INVADER. En algunas realizaciones, el kit comprende además uno o más ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con uno o más genes diana. En algunas realizaciones, el kit comprende además un soporte sólido (por ejemplo, una esfera magnética). En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende uno o más reactivos de captura (por ejemplo, oligonucleótidos complementarios con ZDHHC1 y/u otros genes diana).

Otras realizaciones proporcionan una composición, que comprende: un complejo de un ácido nucleico ZDHHC1 y al menos un oligonucleótido, en la que al menos una porción del oligonucleótido se hibrida con el ácido nucleico ZDHHC1. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden además una o más mezclas de reacción adicionales que comprenden un complejo de un ácido nucleico diana y uno o más oligonucleótidos que se hibridan específicamente con uno o más genes diana.

Otras realizaciones proporcionan un método para seleccionar un neoplasma en una muestra obtenida de un sujeto, comprendiendo dicho método: a) ensayar una muestra procedente de un sujeto para determinar una cantidad de al menos un gen marcador metilado seleccionado del grupo que consiste en vimentina, septina 9, NDRG4, y BMP3, en una muestra obtenida de un sujeto; ensayar la muestra para determinar una cantidad de ADN ZDHHC1 y comparar la cantidad de dicho al menos un gen marcador metilado con la cantidad del ADN ZDHHC1 en la muestra para determinar un estado de metilación para dicho al menos un gen marcador en la muestra. En algunas realizaciones, dicho al menos un marcador es al menos dos, tres, cuatro o todos los marcadores. En algunas realizaciones, el ensayo comprende además la etapa de identificar una puntuación de mutación de KRAS en la muestra. En algunas realizaciones, la medición de la puntuación de mutación de K-ras se mide mediante una PCR específica de alelo cuantitativa. En algunas realizaciones, el ensayo comprende detectar los estados de metilación de ZDHHC1, BMP3, NDRG4, e identificar una puntuación de mutación de KRAS en la muestra. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de determinar la presencia de hemoglobina en la muestra. En algunas realizaciones, el paciente padece enfermedad inflamatoria intestinal. En ciertas realizaciones preferidas, la muestra de una muestra de heces, una muestra de tejido, una muestra de jugo pancreático, una muestra de fluido de quiste pancreático, una muestra de sangre o una muestra de orina. Un neoplasma puede comprender, por ejemplo, un neoplasma de páncreas, un neoplasma colorrectal, un neoplasma de conducto biliar, un neoplasma de estómago, un neoplasma de esófago o un adenoma.

Algunas realizaciones proporcionan un kit, que comprende: a) al menos un oligonucleótido, en el que al menos una porción del oligonucleótido se hibrida específicamente con ZDHHC1; y b) al menos un oligonucleótido adicional, en el que al menos una porción del oligonucleótido se hibrida específicamente con un marcador seleccionado de vimentina, septina 9, NDRG4, y BMP3. En algunas realizaciones, el kit comprende al menos dos oligonucleótidos adicionales. En algunas realizaciones, el kit comprende además bisulfito. En algunas realizaciones, el kit comprende además al menos un oligonucleótido, en el que al menos una porción del oligonucleótido se hibrida específicamente con KRAS. En algunas realizaciones, el kit comprende además reactivos para detectar la presencia de hemoglobina en una muestra de heces.

Ciertas realizaciones proporcionan una composición, que comprende: a) un complejo de un ácido nucleico ZDHHC1 y al menos un oligonucleótido, en la que al menos una porción del oligonucleótido se hibrida con el ácido nucleico ZDHHC1; y b) un complejo de un ácido nucleico diana seleccionado del grupo que consiste en vimentina, septina 9, NDRG4, y BMP, y uno o más oligonucleótidos que se hibridan específicamente con el ácido nucleico diana.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente tecnología se entenderán mejor considerando los siguientes dibujos:

Las figuras 1A-2E proporcionan gráficas que comparan la presencia de p-actina (BTACT) y el gen metilado ZDHHC1 en ADN convertido con bisulfito procedente de muestras de heces, sangre, líneas celulares y tejidos.

Las figuras 2A-2C proporcionan gráficas que comparan el porcentaje de metilación del gen marcador NDRG4, determinado mediante comparación con los genes control BTACT o ZDHHC1, medido en muestras de heces (2A), líneas celulares (2B) y muestras de tejido de cáncer colorrectal (2C).

Las figuras 3A-3C proporcionan gráficas que comparan el porcentaje de metilación del gen marcador BMP3, determinado mediante comparación con los genes control BTACT o ZDHHC1, en muestras de heces (3A), líneas celulares (3B) y muestras de tejido de cáncer colorrectal (3C).

Las figuras 4A-4E proporcionan una tabla que muestra la detección de los niveles del marcador ZDHHC1 en muestra de plasma procedentes de sujetos que padecen los cánceres indicados y de sujetos normales.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la presente tecnología, a continuación, se definen una serie de términos y expresiones. Otras definiciones se ofrecerán a lo largo de la descripción detallada.

Tal como se emplean en la presente, "un/una" o "el/la" pueden significar uno o más de uno. Por ejemplo, "un" artefacto puede significar un artefacto o una pluralidad de artefactos.

Tal como se emplean en la presente, los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a cualquier animal, tal como un perro, un gato, ganado y, en particular, un mamífero, preferiblemente un ser humano. En algunos casos, el sujeto también es un "usuario" (y, por tanto, el usuario también es el sujeto o paciente).

Tal como se emplean en la presente, los términos "muestra" y "espécimen" se emplean indistintamente y en el sentido más amplio. En un sentido, una muestra pretende incluir un espécimen o cultivo obtenido de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas pueden obtenerse de animales (incluyendo seres humanos) e incluyen fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen productos sanguíneos, tales como plasma, suero, heces, orina y similares. Las muestras ambientales incluyen material ambiental, tal como materia superficial, tierra, barro, lodo, biopelículas, agua, cristales y muestras industriales. Sin embargo, no debe considerarse que estas muestras limiten los tipos de muestra aplicables a la presente invención. Tal como se emplea en la presente, una "muestra remota", tal como se usa en algunos contextos, se refiere a una muestra recogida indirectamente de un sitio que no es la célula, tejido u órgano fuente de la muestra. Por ejemplo, cuando se evalúa un material de muestra originado del páncreas en una muestra de heces (por ejemplo, no de una muestra tomada directamente de un páncreas), la muestra es una muestra remota.

El término "diana", cuando se usa en referencia al método de captura, detección o análisis de un ácido nucleico, en general se refiere a un ácido nucleico que tiene una característica, por ejemplo, una secuencia concreta de nucleótidos que se va a detectar o a analizar, por ejemplo, en una muestra sospechosa de contener el ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, una diana es un ácido nucleico que tiene una secuencia concreta para la cual resultaría deseable determinar un estado de metilación. Cuando se usa en referencia a la reacción en cadena de la polimerasa, "diana" se refiere en general a la región del ácido nucleico limitada por los cebadores usados para la reacción en cadena de la polimerasa. Por tanto, se busca seleccionar a la "diana" de otras secuencias de ácido nucleico que puedan estar presentes en una muestra. Un "segmento" se define como una región de un ácido nucleico dentro de la secuencia diana. La expresión "molde de muestra" se refiere a un ácido nucleico que se origina de una muestra que se analiza para la presencia de una diana.

Tal como se emplea en la presente, el término "locus" se refiere a una posición concreta, por ejemplo, de una mutación, polimorfismo, o un resto C en un dinucleótido CpG, dentro de una región o segmento definido de un ácido nucleico, tal como un gen o cualquier otra secuencia caracterizada en un cromosoma o molécula de ARN. Un locus no se limita a ningún tamaño o longitud concretos, y puede referirse a una porción de un cromosoma, un gen, un elemento genético funcional o un único nucleótido o par de bases. Tal como se emplea en referencia a sitios de CpG que pueden estar metilados, un locus se refiere al resto C en el dinucleótido CpG.

Tal como se emplea en la presente, un "reactivo de captura" se refiere a cualquier agente que es capaz de unirse a un analito (por ejemplo, una diana). Preferiblemente, un "reactivo de captura" se refiere a cualquier agente que es capaz de unirse específicamente a un analito, por ejemplo, que tiene una afinidad de unión mayor y/o especificidad por el analito frente a cualquier otro resto. Cualquier resto, tal como una célula, un orgánulo celular, una molécula inorgánica, una molécula orgánica y una de sus mezclas o complejos, puede usarse como reactivo de captura, si cumple con el requisito de afinidad de unión y/o especificidad por el analito. Los reactivos de captura pueden ser péptidos, proteínas, por ejemplo, anticuerpos o receptores, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, vitaminas, oligosacáridos, carbohidratos, lípidos, moléculas pequeñas o uno de sus complejos. Los reactivos de captura que comprenden ácidos nucleicos, por ejemplo, oligonucleótidos, pueden capturar un ácido nucleico diana mediante hibridación específica de secuencia (por ejemplo, a través de la formación de pares de bases de Watson-Crick convencionales), o a través de otras interacciones de unión. Cuando un oligonucleótido de captura se hibrida con un ácido nucleico diana, la hibridación puede implicar una porción del oligonucleótido, o la secuencia completa del oligonucleótido, y el oligonucleótido puede unirse a una porción o a la secuencia del ácido nucleico diana completa.

El término "amplificar" o "amplificación", en el contexto de los ácidos nucleicos, se refiere a la producción de múltiples copias de un polinucleótido, o una porción del polinucleótido, generalmente comenzando a partir de una pequeña cantidad del polinucleótido (por ejemplo, una única molécula de polinucleótido), y los productos de la amplificación o amplicones son en general detectables. La amplificación de polinucleótidos incluye una diversidad de procesos químicos y enzimáticos. La generación de múltiples copias de ADN a partir de una o unas pocas copias de una molécula de ADN diana o molde durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una reacción en cadena de la ligasa (LCR; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.494.810) son formas de amplificación. Otros tipos de amplificación incluyen, pero no se limitan a PCR específica de alelo (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.639.611), PCR de ensamblaje (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.965.408), amplificación dependiente de helicasa (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.662.594), PCR de comienzo en caliente (véanse, por ejemplo, las patentes de Ee . UU. n.os 5.773.258 y 5.338.671), PCR específica de intersecuencia, PCR inversa (véase, por ejemplo, Triglia, et al. (1988), Nucleic Acids Res., 16:81-86), PCR mediada por acoplamiento (véase, por ejemplo, Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997); la patente de e E. UU. n.° 5.508.169), PCR específica de metilación (véase, por ejemplo, Herman, et al. (1996), PNAS, 93(13), 9821-9826), PCR de minicebadores, amplificación de sondas dependiente del acoplamiento de múltiplex (véase, por ejemplo, Schouten, et al. (2002), Nucleic Acids Research, 30(12):e57), PCR de múltiplex (véase, por ejemplo, Chamberlain, et al. (1988), Nucleic Acids Research, 16(23), 11141-11156; Ballabio, et al. (1990), Human Genetics, 84(6), 571-573; Hayden, et al. (2008), BMC Genetics, 980), PCR anidada, PCR de extensión por solapamiento (véase, por ejemplo, Higuchi, et al. (1988), Nucleic Acids Research, 16(15), 7351-7367), PCR en tiempo real (véase, por ejemplo, Higuchi, et al. (1992), Biotechnology, 10:413-417; Higuchi, et al. (1993), Biotechnology, 11:1026-1030), ^pC^r por transcripción inversa (véase, por ejemplo, Bustin, S.A. (2000), J. Molecular Endocrinology, 25:169-193), PCR en fase sólida, PCR térmicamente asimétrica y entrelazada, y PCR Touchdown (véase, por ejemplo, Don, et al., Nucleic Acids Research (1991), 19(14), 4008; Roux, K. (1994), Biotechniques, 16(5), 812-814; Hecker, et al. (1996), Biotechniques, 20(3), 478-485). La amplificación de polinucleótidos también se puede llevar a cabo usando PCR digital (véase, por ejemplo, Kalinina, et al., Nucleic Acids Research, 25, 1999-2004 (1997); Vogelstein y Kinzler, Proc. Natl. Acad. Sci. uSa , 96, 9236-41 (1999); publicación de patente internacional n.° WO05023091A2; publicación de patente de EE. UU. n.° 20070202525).

La expresión "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") se refiere al método de K.B. Mullis, patentes de EE. UU. n.os 4.683.195, 4.683.202, y 4.965.188, que describen un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico u otro ADN o ARN, sin clonación ni purificación. Este proceso para amplificar la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores oligonucleotídicos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclado térmico en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios con sus respectivas hebras de la secuencia diana bicatenaria. Para llevar a cabo la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y después los cebadores se asocian con sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Después de la asociación, los cebadores se extienden con una polimerasa para formar una nueva pareja de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, asociación de cebadores y extensión con polimerasa pueden repetirse muchas veces (es decir, la desnaturalización, la asociación y la extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se ve determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y, por tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto de repetición del proceso, el método se denomina "reacción en cadena de la polimerasa" ("polymerase chain reaction", "PCR"). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que son "amplificados por PCR" y que son "productos de PCR" o "amplicones". Los expertos en la técnica entenderán que el término "PCR" incluye muchas variantes del método originariamente descrito usando, por ejemplo, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR de transcripción inversa (RT-PCR), PCR de un solo cebador y cebada arbitrariamente, etc.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "ensayo de detección de ácidos nucleicos" se refiere a cualquier método para determinar la composición de nucleótidos de un ácido nucleico de interés. Un ensayo de detección de ácidos nucleicos incluye, pero no se limita a métodos de secuenciación de ADN, métodos de hibridación de sondas, ensayos de ruptura específica de estructura (por ejemplo, el ensayo INVADER (Hologic, Inc.), y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n os 5.846.717, 5.985.557, 5.994.069, 6.001.567, 6.090.543, y 6.872.816; Lyamichev et al., Nat. Biotech., 17:292 (1999); Hall et al., PNAS, USA, 97:8272 (2000); y documento US 2009/0253142); métodos de ruptura por desapareamiento de enzimas (por ejemplo, Variagenics, patentes de EE. UU. n.os 6.110.684, 5.958.692, 5.851.770); reacción en cadena de la polimerasa (PCR), descrita anteriormente; métodos de hibridación ramificada (por ejemplo, Chiron, patentes de EE. UU. n.os 5.849.481,5.710.264, 5.124.246, y 5.624.802); replicación de círculo rodante (por ejemplo, patentes de EE. UU. n.os 6.210.884, 6.183.960 y 6.235.502); NASBA (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 5.409.81 8); tecnología de balizas moleculares (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 6.150.097); tecnología de E-sensor (Motorola, patentes de EE. UU. n.os 6.248.229, 6.221.583, 6.013.170, y 6.063.573); tecnología de ciclación de sondas (por ejemplo, patentes de EE. UU. n.os 5.403.711, 5.011.769, y 5.660.988); métodos de amplificación de señales de Dade Behring (por ejemplo, patentes de EE. UU. n.os 6.121.001, 6.110.677, 5.914.230, 5.882.867, y 5.792.614); reacción en cadena de la ligasa (por ejemplo, Baranay, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 189-193 (1991)); y métodos de hibridación de sándwich (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 5.288.609).

En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana se amplifica (por ejemplo, mediante PCR), y el ácido nucleico amplificado se detecta simultáneamente usando un ensayo de ruptura invasiva. Los ensayos configurados para realizar un ensayo de detección (por ejemplo, un ensayo de ruptura invasiva) en combinación con un ensayo de amplificación se describen en la publicación de patente de EE. UU. US 20090253142 A1. Otras configuraciones de amplificación más detección de ruptura invasiva, denominados el método QuARTS, se describen en las patentes de EE. UU. n.os 8.361.720; 8.715.937; 8.916.344; y 9.127.318. La expresión "estructura de ruptura invasiva", tal como se emplea en la presente, se refiere a una estructura de ruptura que comprende i) un ácido nucleico diana, ii) un ácido nucleico cadena arriba (por ejemplo, un oligonucleótido invasivo o "INVADER"), y iii) un ácido nucleico cadena abajo (por ejemplo, una sonda), en la que los ácidos nucleicos cadena arriba y cadena abajo se asocian a regiones contiguas del ácido nucleico diana, y en la que se forma un solapamiento entre la porción 3' del ácido nucleico cadena arriba y el dúplex formado entre el ácido nucleico cadena abajo y el ácido nucleico diana. Se produce un solapamiento cuando una o más bases de los ácidos nucleicos cadena arriba y cadena abajo ocupan la misma posición con respecto a una base del ácido nucleico diana, tanto si la base o bases solapantes del ácido nucleico cadena arriba son complementarias con el ácido nucleico diana como si no lo son, y tanto si esas bases son bases naturales como si son no naturales. En algunas realizaciones, la porción 3' del ácido nucleico cadena arriba que se solapa con el dúplex cadena abajo es un resto químico que no es una base, tal como una estructura de anillo aromático, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.090.543. En algunas realizaciones, uno o más de los ácidos nucleicos pueden estar unidos entre sí, por ejemplo, a través de un enlace covalente, tal como un tallo-bucle de ácido nucleico, o a través de un enlace químico que no aparece en los ácidos nucleicos (por ejemplo, una cadena de múltiples carbonos). Tal como se emplea en la presente, la expresión "ensayo de endonucleasa flap" incluye los ensayos de ruptura invasiva "INVADER" y los ensayos QuARTS, según se describió anteriormente.

Tal como se emplean en la presente, los términos "complementario" o "complementariedad" usados en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) se refieren a polinucleótidos relacionados mediante las reglas del apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "5'-A-G-T-3'" es complementaria con la secuencia "3'-T-C-A-5'". La complementariedad puede ser "parcial", en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se aparean según las reglas del apareamiento de bases, o puede existir una complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las hebras de los ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y la potencia de hibridación entre hebras de ácidos nucleicos. Esto tiene una importancia particular en las reacciones de amplificación, así como en los métodos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.

Tal como se emplea en la presente, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, tanto si aparece en la naturaleza como si se encuentra en un digerido de restricción purificado o si se ha producido de modo sintético, que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión por cebadores que es complementario con una hebra de ácido nucleico (por ejemplo, en presencia de nucleótidos y un agente inductor, tal como un biocatalizador (por ejemplo, una ADN polimerasa o similar). El cebador generalmente es monocatenario para alcanzar la máxima eficacia en la amplificación, pero, como alternativa, puede ser parcial o completamente bicatenario. La porción del cebador que se hibrida con un ácido nucleico molde es suficientemente larga para cebar la síntesis de los productos de la extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, que incluyen la temperatura, la fuente del cebador y el uso del método. Los cebadores pueden comprender detectores, marcadores, restos de captura, etc.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier molécula que contiene un ácido nucleico, que incluye, pero no se limita a ADN o ARN. La expresión incluye secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases de ADN y ARN conocidos que incluyen, pero no se limitan a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiuracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6-diaminopurina.

Tal como se emplea en la presente, el término "nucleobase" es sinónimo con otros términos y expresiones usados en la técnica que incluyen "nucleótido", "desoxinucleótido", "resto nucleótido", "resto desoxinucleótido", "nucleótido trifosfato (NTP)" o "desoxinucleótido trifosfato (dNTP)".

Un "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye al menos dos unidades monoméricas de ácido nucleico (por ejemplo, nucleótidos), generalmente más de tres unidades monoméricas, y más generalmente más de diez unidades monoméricas. El tamaño exacto de un oligonucleótido en general depende de diversos factores, que incluyen la función final o el uso del oligonucleótido. Para ilustrar más a fondo, los oligonucleótidos generalmente tienen una longitud menor que 200 restos (por ejemplo, entre 15 y 100), aunque, tal como se emplea en la presente, el término también pretende incluir cadenas polinucleotídicas más largas. Los oligonucleótidos a menudo se denominan según su longitud. Por ejemplo, un oligonucleótido de 24 restos se denomina un "24-mero". Generalmente, los monómeros de nucleósidos se unen a través de enlaces fosfodiéster, o sus análogos, que incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, y similares, incluyendo los contraiones asociados, por ejemplo, H+, NH4+, Na+, y similares, si dichos contraiones están presentes. Además, los oligonucleótidos generalmente son monocatenarios. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier método adecuado que incluye, pero no se limita al aislamiento de una secuencia existente o natural, la replicación o amplificación de ADN, la transcripción inversa, la clonación y la digestión de restricción de secuencias apropiadas, o la síntesis química directa mediante un método, tal como el método de fosfotriéster de Narang et al. (1979), Meth Enzymol., 68:90-99; el método de fosfodiéster de Brown et al. (1979), Meth Enzymol., 68:109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981), Tetrahedron Lett., 22:1859-1862; el método de triéster de Matteucci et al. (1981), J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191; métodos de síntesis automáticos; o el método del soporte sólido de la patente de EE. UU. n.° 4.458.066, titulada "Proceso para preparar polinucleótidos", expedida el 3 de julio, 1984, de Caruthers et al., u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Una "secuencia" de un biopolímero se refiere al orden y la identidad de las unidades monoméricas (por ejemplo, nucleótidos, aminoácidos, etc.) en el biopolímero. La secuencia (por ejemplo, la secuencia de bases) de un ácido nucleico generalmente se lee en la dirección 5' a 3'.

Tal como se emplea en la presente, el término "gen" se refiere a una secuencia de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que comprende las secuencias codificadoras necesarias para la producción de un polipéptido, un precursor o un ARN (por ejemplo, ARN no codificadores, tales como ARN ribosómico, ARN de transferencia, ARN espliceosómico, microARN). Un polipéptido o un ARN no codificador puede ser codificado por una secuencia codificadora de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificadora, con la condición de que se conserve la actividad o las propiedades funcionales deseadas (por ejemplo, la actividad enzimática, la unión de ligandos, la transducción de señales, la inmunogenicidad, etc.) del polipéptido de longitud completa o el fragmento del polipéptido. El término también incluye la región codificadora de un gen estructural y las secuencias localizadas adyacentes a la región codificadora en ambos extremos 5' y 3' hasta una distancia de aproximadamente 1 kb o más en cualquiera de los extremos, de modo que el gen se corresponde con la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias localizadas 5' de la región codificadora y presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas 5'. Las secuencias localizadas 3' o cadena abajo de la región codificadora y presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas 3'. El término "gen" incluye las formas de ADNc y genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificadora interrumpida por secuencias no codificadoras denominadas "intrones" o "regiones intermedias" o "secuencias intermedias". Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear (por ejemplo, ARNnh); los intrones pueden contener elementos reguladores (por ejemplo, potenciadores). Los intrones se retiran o "se cortan" del transcrito nuclear o primario; por tanto, los intrones están ausentes en el transcrito del ARN mensajero (ARNm). El ARNm actúa durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.

Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias localizadas en ambos extremos 5' y 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan secuencias o regiones "flanqueantes" (estas secuencias flanqueantes se localizan 5' o 3' con respecto a las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La región flanqueante 5' puede contener secuencias reguladoras, tales como promotores y potenciadores, que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región flanqueante 3' puede contener secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, la ruptura postraduccional y la poliadenilación.

La expresión "de tipo salvaje", cuando se emplea en referencia a un gen, se refiere a un gen que tiene las características de un gen aislado de una fuente natural. La expresión "de tipo salvaje", cuando se emplea en referencia a un producto de un gen, se refiere a un producto de un gen que tiene las características de un producto de un gen aislado de una fuente natural. El término "natural" cuando se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o de polinucleótido que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada de modo deliberado por la mano de una persona en el laboratorio es natural. Un gen de tipo salvaje a menudo es el gen o alelo que se observa más frecuentemente en una población y, por tanto, se denomina arbitrariamente la forma "normal" o "de tipo salvaje" del gen. Por contraste, el término "modificado" o "mutante", cuando se emplea en referencia a un gen o a un producto de un gen, se refiere, respectivamente, a un gen o a un producto de un gen que muestra modificaciones en la secuencia y/o en propiedades funcionales (por ejemplo, características alteradas) cuando se compara con el gen o producto de un gen de tipo salvaje. Se advierte que los mutantes naturales pueden aislarse; estos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas cuando se comparan con el gen o producto de un gen de tipo salvaje.

El término "alelo" se refiere a una variación de un gen; las variaciones incluyen, pero no se limitan a variantes y mutantes, loci polimórficos, y mutaciones de loci polimórficos de un solo nucleótido, de desplazamiento de marco, y de corte y empalme. Un alelo puede aparecer en la naturaleza en una población o puede surgir durante la vida de cualquier individuo concreto de la población.

Por tanto, los términos "variante" y "mutante", cuando se usan en referencia a una secuencia de nucleótidos, se refieren a una secuencia de ácido nucleico que se diferencia en uno o más nucleótidos de otra secuencia de nucleótidos normalmente relacionada con ella. Una "variación" es una diferencia entre dos secuencias de nucleótidos diferentes; generalmente, una secuencia es una secuencia de referencia.

La expresión "soporte sólido", tal como se emplea en la presente, incluye todos los materiales sobre los cuales puede inmovilizarse una diana (por ejemplo, ADN). Puede usarse materiales naturales o sintéticos, que pueden estar químicamente modificados o no, como soporte sólido, en particular polímeros, tales como poli(cloruro de vinilo), polietileno, poliestirenos, poliacrilato o poliamida, o copolímeros basados en monómeros aromáticos de vinilo, ésteres de ácidos carboxílicos insaturados, cloruro de vinilideno, dienos o compuestos que contienen funciones nitrilo (acrilonitrilo); polímeros de cloruro de vinilo y de propileno, polímeros de cloruro de vinilo y acetato de vinilo; copolímeros basados en estireno o derivados sustituidos del estireno; fibras sintéticas, tales como nailon; materiales inorgánicos, tales como sílice, vidrio, cerámica o cuarzo; látices, partículas magnéticas; derivados de metales. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a una placa de microtitulación, una lámina, un cono, un tubo, un pocillo, esferas (por ejemplo, esferas magnéticas), partículas o similares, o un soporte plano, tal como una oblea de sílice o silicio.

Tal como se emplean en la presente, las expresiones "partículas magnéticas" y "esferas magnéticas" se usan indistintamente y se refieren a partículas o esferas que responden a un campo magnético. Generalmente, las partículas magnéticas comprenden materiales que no tienen un campo magnético, pero que forman un dipolo magnético cuando se exponen a un campo magnético, por ejemplo, materiales capaces de ser magnetizados en presencia de un campo magnético, pero que ellos mismos no son magnéticos en ausencia de dicho campo. El término "magnético", cuando se usa en este contexto, incluye materiales que son materiales paramagnéticos o superparamagnéticos. El término "magnético", tal como se emplea en la presente, también incluye materiales temporalmente magnéticos, tales como materiales ferromagnéticos o ferrimagnéticos con bajas temperaturas de Curie, con la condición de que dichos materiales temporalmente magnéticos sean paramagnéticos en el intervalo de temperatura en el que se usan las partículas magnéticas de sílice que contienen dichos materiales según los presentes métodos para aislar materiales biológicos. El término "miscible", tal como se emplea en referencia a partículas o esferas, se refiere a partículas que están en forma libre, es decir, que no están inmovilizadas, por ejemplo, en una columna, sino que pueden añadirse a una muestra y distribuirse en el fluido de la muestra mediante una acción de mezclado (por ejemplo, agitación en vórtice, mezclado, agitación, pipeteado repetido, etc.).

El término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos), tanto si es natural como si está un digerido de restricción purificado o se ha producido de modo sintético, recombinante o mediante amplificación con PCR, que es capaz de hibridarse con otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas son útiles en la detección, la identificación y el aislamiento de secuencias de genes concretas (por ejemplo, una "sonda de captura"). Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invención pueda estar marcada, en algunas realizaciones, con cualquier "molécula indicadora", de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección que incluye, pero no se limita a sistemas de enzimas (por ejemplo, ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzimas), fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invención se limite a ningún marcador o sistema de detección concreto.

Tal como se emplea en la presente, "metilación" se refiere a la metilación de la citosina en las posiciones C5 o N4 de la citosina, la posición N6 de la adenina, u otros tipos de metilación de un ácido nucleico. El ADN amplificado in vitro habitualmente no está metilado, porque los métodos de amplificación de ADN in vitro típicos no conservan el patrón de metilación del molde de amplificación. Sin embargo, "ADN no metilado" o "ADN metilado" también pueden indicar un ADN amplificado cuyo molde original no estaba metilado o estaba metilado, respectivamente.

Por consiguiente, tal como se emplea en la presente, un "nucleótido metilado" o una "base de nucleótido metilada" se refiere a la presencia de un resto metilo en una base de nucleótido, en el que el resto metilo no está presente en una base de nucleótido típica reconocida. Por ejemplo, la citosina no contiene un resto metilo en su anillo de pirimidina, pero la 5-metilcitosina sí contiene un resto metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina. Por tanto, la citosina no es un nucleótido metilado y la 5-metilcitosina sí es un nucleótido metilado. En otro ejemplo, la timina contiene un resto metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina; sin embargo, para los objetivos de la presente, la timina no se considera un nucleótido metilado cuando está presente en el ADN, puesto que la timina es una base de nucleótido típica del ADN.

Tal como se emplea en la presente, una "molécula de ácido nucleico metilada" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene uno o más nucleótidos metilados.

Tal como se emplea en la presente, un "estado de metilación" y un "perfil de metilación" de una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia o ausencia de una o más bases de nucleótidos metiladas en la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una citosina metilada se considera metilada (por ejemplo, el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico es metilado). Una molécula de ácido nucleico que no contiene ningún nucleótido metilado se considera no metilada.

El estado de metilación de una secuencia de ácido nucleico concreta (por ejemplo, un marcador de gen o una región del ADN, como se describe en la presente) puede indicar el estado de metilación de cada base en la secuencia o puede indicar el estado de metilación de un subconjunto de las bases (por ejemplo, de una o más citosinas) dentro de la secuencia, o puede indicar cierta información con respecto a la densidad de metilación regional dentro de la secuencia proporcionando o no información precisa de las localizaciones en que aparecen las metilaciones dentro de la secuencia.

El estado de metilación de un locus de nucleótido en una molécula de ácido nucleico se refiere a la presencia o ausencia de un nucleótido metilado en un locus concreto en la molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, el estado de metilación de una citosina en el 7° nucleótido en una molécula de ácido nucleico es metilado cuando el nucleótido presente en el 7° nucleótido en la molécula de ácido nucleico es 5-metilcitosina. De modo similar, el estado de metilación de una citosina en el 7° nucleótido en una molécula de ácido nucleico no es metilado cuando el nucleótido presente en el 7° nucleótido en la molécula de ácido nucleico es citosina (y no 5-metilcitosina).

El estado de metilación puede representarse o indicarse opcionalmente mediante un "valor de metilación" (por ejemplo, que representa una frecuencia, fracción, proporción, porcentaje, etc., de metilación). Un valor de metilación puede generarse, por ejemplo, cuantificando la cantidad de ácido nucleico intacto presente después de una digestión de restricción con una enzima de restricción dependiente de la metilación o comparando los perfiles de amplificación después de una reacción con bisulfito o comparando secuencias de ácido nucleico tratadas con bisulfito y no tratadas. Por consiguiente, un valor, por ejemplo, un valor de metilación, representa un estado de metilación y, por tanto, puede usarse como indicador cuantitativo del estado de metilación a través de múltiples copias de un locus. Esto tiene un uso concreto cuando resulta deseable comparar el estado de metilación de una secuencia en una muestra con un umbral o valor de referencia.

Tal como se emplea en la presente, la "frecuencia de metilación" o "porcentaje (%) de metilación" se refiere al número de casos en los que una molécula o un locus está metilado con relación al número de casos en que la molécula o el locus no está metilado.

Así, el estado de metilación describe el estado de metilación de un ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia genómica). Además, el estado de metilación se refiere a las características de un segmento de ácido nucleico en un locus genómico concreto pertinente para la metilación. Estas características incluyen, pero no se limitan a si cualquiera de los restos citosina (C) dentro de esta secuencia de ADN está metilado, la localización del resto o restos C metilados, la frecuencia o porcentaje de C metilada a lo largo de una región concreta de un ácido nucleico, y las diferencias alélicas en la metilación debidas, por ejemplo, a la diferencia en el origen de los alelos. Las expresiones "estado de metilación" y "perfil de metilación" también se refieren a la concentración relativa, la concentración absoluta, o el patrón de C metilada o C no metilada a lo largo de cualquier región concreta de un ácido nucleico en una muestra biológica. Por ejemplo, si el resto o restos citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico están metilados, esto se puede denominarse "hipermetilado" o que tiene "mayor metilación", mientras que si el resto o restos citosina (C) dentro de una secuencia de ADN no están metilados, esto puede denominarse "hipometilado" o que tiene "menor metilación". De forma similar, si el resto o restos citosina (C) dentro de una secuencia de ácido nucleico están metilados, en comparación con otra secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, procedente de una región diferente o procedente de un individuo diferente, etc.), esa secuencia se considera hipermetilada o que tiene mayor metilación comparada con la otra secuencia de ácido nucleico. Como alternativa, si el resto o restos citosina (C) dentro de una secuencia de ADN no están metilados, en comparación con otra secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, procedente de una región diferente o procedente de un individuo diferente, etc.), esa secuencia se considera hipometilada o que tiene menor metilación comparada con la otra secuencia de ácido nucleico. Además, la expresión "patrón de metilación", tal como se emplea en la presente, se refiere a los sitios colectivos de nucleótidos metilados y no metilados a lo largo de una región de un ácido nucleico. Dos ácidos nucleicos pueden tener la misma o similar frecuencia de metilación o porcentaje de metilación, pero tener diferentes patrones de metilación cuando el número de nucleótidos metilados y no metilado es el mismo o similar a lo largo de la región, pero las localizaciones de los nucleótidos metilados y no metilados son diferentes. Se dice que las secuencias están "diferencialmente metiladas" o que tienen una "diferencia en la metilación" o que tienen un "estado de metilación diferente" cuando se diferencia en el grado (por ejemplo, una tiene mayor o menor metilación en relación con la otra), frecuencia o patrón de metilación. La expresión "metilación diferencial" se refiere a una diferencia en el nivel o patrón de metilación del ácido nucleico en una muestra positiva a un cáncer, en comparación con el nivel o patrón de metilación del ácido nucleico en una muestra negativa a un cáncer. También puede referirse a la diferencia en los niveles o patrones entre pacientes que presentan recurrencia de un cáncer después de una cirugía frente a pacientes que no presentan recurrencia. La metilación diferencial y los niveles o patrones específicos de metilación del ADN son biomarcadores de prognóstico y predictivos, por ejemplo, después de que se hayan definido las características predictivas o de corte correctas.

La frecuencia del estado de metilación puede usarse para describir una población de individuos o una muestra procedente de un único individuo. Por ejemplo, un locus de nucleótido que tenga una frecuencia de estado de metilación de 50 % está metilado en 50 % de los casos y no está metilado en 50 % de los casos. Esta frecuencia puede usarse, por ejemplo, para describir el grado en el cual un locus de nucleótido o una región de un ácido nucleico está metilado en una población de individuos o una colección de ácidos nucleicos. Por tanto, cuando la metilación en una primera población o agrupación de moléculas de ácidos nucleicos es diferente de la metilación en una segunda población o agrupación de moléculas de ácidos nucleicos, la frecuencia del estado de metilación de la primera población o agrupación será diferente de la frecuencia del estado de metilación de la segunda población o agrupación. Esta frecuencia también puede usarse, por ejemplo, para describir el grado en el cual un locus de nucleótido o una región de un ácido nucleico está metilado en un único individuo. Por ejemplo, esta frecuencia puede usarse para describir el grado en el cual un grupo de células procedentes de una muestra de tejido están metiladas o no metiladas en un locus de nucleótido o región de un ácido nucleico.

La expresión "muy metilado" se refiere a ácidos nucleicos en los que un locus concreto (por ejemplo, un dinucleótido CpG o un conjunto de dinucleótidos CpG o región rica en CpG) está metilado en un tipo de muestra o tipo de tejido concretos a una tasa que es mensurablemente mayor que la observada para el locus comparable en el mismo ADN en otro tipo de muestra o tejido. "Muy metilado" puede referirse a un único resto C concreto o a una tasa promedio de metilación a lo largo de múltiples C en una región, como una fracción de las copias de ese locus en la muestra que se está ensayando. Sin limitar la expresión a ningún nivel concreto de metilación, en algunas realizaciones, un locus muy metilado puede estar >10 % metilado, preferiblemente >20 % a 40 %, más preferiblemente >50 % a 75 %, aún más preferiblemente entre 75 % y 100 %.

Tal como se emplea en la presente, un "locus de nucleótido" se refiere a la localización de un nucleótido en una molécula de ácido nucleico. Un locus de nucleótido de un nucleótido metilado se refiere a la localización de un nucleótido metilado en una molécula de ácido nucleico.

Generalmente, la metilación del ADN humano aparece en una secuencia de dinucleótido que incluye una guanina y citosina adyacente, en la que la citosina está localizada 5' de la guanina (también denominadas secuencias de dinucleótidos CpG). La mayoría de las citosinas dentro de los dinucleótidos CpG están metiladas en el genoma humano, aunque algunas permanecen sin metilar en regiones genómicas ricas en dinucleótidos CpG específicas, conocidas como islas de CpG (véase, por ejemplo, Antequera et al. (1990), Cell, 62:503-514).

Tal como se emplea en la presente, una "isla de CpG" se refiere a una región rica en G:C de ADN genómico que contiene un mayor número de dinucleótidos CpG con relación al ADN genómico total. Una isla de CpG puede tener una longitud de al menos 100, 200 o más pares de bases, en la que el contenido en G:C de la región es al menos 50 % y la proporción de la frecuencia de CpG observada frente a la frecuencia esperada es 0,6; en algunos casos, una isla de CpG puede tener una longitud de al menos 500 pares de bases, en la que el contenido en G:C de la región es al menos 55 % y la proporción de la frecuencia de CpG observada frente a la frecuencia esperada es 0,65. La frecuencia de CpG observada frente a la frecuencia esperada puede calcularse según el método proporcionado en Gardiner-Garden et al. (1987), J. Mol. Biol., 196:261-281. Por ejemplo, la frecuencia de CpG observada frente a la frecuencia esperada puede calcularse según la fórmula R = (A x B)/(C x D), en la que R es la proporción de la frecuencia de CpG observada frente a la frecuencia esperada, A es el número de dinucleótidos CpG en una secuencia analizada, B es el número total de nucleótidos en la secuencia analizada, C es el número total de nucleótidos C en la secuencia analizada, y D es el número total de nucleótidos G en la secuencia analizada. El estado de metilación generalmente se determina en islas de CpG, por ejemplo, en regiones de promotores. Sin embargo, se apreciará que otras secuencias en el genoma humano son propensas a la metilación del ADN, tales como CpA y CpT (véase, Ramsahoye (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:5237-5242; Salmon y Kaye (1970), Biochim. Biophys. Acta, 204:340-351; Grafstrom (1985), Nucleic Acids Res., 13:2827-2842; Nyce (1986), Nucleic Acids Res., 14, 4353-4367; Woodcock (1987), Biochem. Biophys. Res. Commun., 145: 888-894).

Tal como se emplea en la presente, la expresión "célula de tejido" se refiere a cualquier célula de tejido en un cuerpo, por ejemplo, un cuerpo humano o animal, que incluye, por ejemplo, células de epitelio, músculo, nervio y hueso. Las células de tejidos no incluyen células sanguíneas. Tal como se emplea en la presente, la sangre normalmente comprende plasma, glóbulos rojos, glóbulos blancos (que incluyen leucocitos y linfocitos) y plaquetas. Los leucocitos incluyen neutrófilos, monocitos, eosinófilos y basófilos, y los linfocitos incluyen células T, células B y célula asesinas naturales.

Un "ADN control específico de células de un tejido" y un "ADN específico de células de un tejido" se refieren a un ADN que detectable en presencia del tejido o en ADN separado de células procedente del tejido, y es mínimamente detectable o indetectable en sangre o en un componente normal de la sangre (por ejemplo, plasma, glóbulos blancos, etc., como se listó anteriormente). Tal como se emplea en la presente, un ADN que está metilado solo en un tejido y no está metilado de modo similar en sangre (o viceversa) puede ser un ADN específico de células de un tejido con respecto al estado de metilación, incluso si la secuencia primaria del ADN es la misma en ambos tipos de células. Un "ADN control específico de epitelio" se refiere a un ADN control específico de tejido que detecta ADN que se encuentra en células epiteliales.

Tal como se emplea en la presente, un reactivo que modifica un nucleótido de la molécula de ácido nucleico como una función del estado de metilación de la molécula de ácido nucleico, o un reactivo específico de metilación, se refiere a un compuesto o una composición u otro agente que pueden cambiar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de tal manera que refleja el estado de metilación de la molécula de ácido nucleico. Los métodos para tratar una molécula de ácido nucleico con dicho reactivo pueden incluir poner en contacto la molécula de ácido nucleico con el reactivo, acoplado con etapas adicionales, si se desea, para lograr el cambio deseado de la secuencia de nucleótidos. Este cambio en la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico puede producir una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido metilado se modifica a un nucleótido diferente. Este cambio en la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico puede producir una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido no metilado se modifica a un nucleótido diferente. Este cambio en la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico puede producir una molécula de ácido nucleico en la que cada uno de un nucleótido seleccionado no está metilado (por ejemplo, cada citosina no metilada) se modifica a un nucleótido diferente. El uso de dicho reactivo para cambiar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico puede producir una molécula de ácido nucleico en la que cada nucleótido que es un nucleótido metilado (por ejemplo, cada citosina metilada) se modifica a un nucleótido diferente. Tal como se emplea en la presente, el uso de un reactivo que modifica un nucleótido seleccionado se refiere a un reactivo que modifica un nucleótido de los cuatro nucleótidos que aparecen generalmente en una molécula de ácido nucleico (C, G, T y A para el ADN, y C, G, U y A para el ARN), de modo que el reactivo modifica dicho un nucleótido sin modificar los otros tres nucleótidos. En un ejemplo de realización, dicho reactivo modifica un nucleótido seleccionado no metilado para producir un nucleótido diferente. En otro ejemplo de realización, dicho reactivo puede desaminar nucleótidos de citosina no metilados. Un ejemplo de reactivo es el bisulfito.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende, en algunas realizaciones, bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno, o sus combinaciones, para distinguir entre citidinas metiladas y no metiladas, por ejemplo, en secuencias de dinucleótidos CpG.

La expresión "ensayo de metilación" se refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de un ácido nucleico.

La expresión "MS AP-PCR" ("Methylation-Sensitive Arbitrarily-Primed Polymerase Chain Reaction", reacción en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente y sensible a la metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la técnica que permite un barrido global del genoma usando cebadores ricos en CG para centrarse en las regiones que, con más probabilidad, contienen dinucleótidos CpG, y es descrita por Gonzalgo et al. (1997), Cancer Research, 57:594-599.

El término "MethyLight™" se refiere a la técnica de PCR en tiempo real basada en la fluorescencia reconocida en la técnica descrita por Eads et al. (1999), Cancer Res., 59:2302-2306.

El término "HeavyMethyl™" se refiere a un ensayo en el que sondas de bloqueo específicas de metilación (también denominadas en la presente bloqueantes) que cubren posiciones de CpG entre las sondas de amplificación, o que son cubiertas por estas últimas, permiten una amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

La expresión "ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™" se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en el que el ensayo MethyLight™ se combina con sondas de bloqueo específicas de metilación que cubren posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación.

El término "Ms-SNuPE" ("Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension", extensión con cebadores de nucleótido único sensible a la metilación) se refiere al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo y Jones (1997), Nucleic Acids Res., 25:2529-2531.

El término "MSP" ("Methylation-specific PCR", PCR específica de metilación) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Herman et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9821-9826, y por la patente de EE. UU. n.° 5.786.146.

El término "COBRA" ("Combined Bisulfite Restriction Analysis", análisis de restricción de bisulfito combinado) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Xiong y Laird (1997), Nucleic Acids Res., 25:2532-2534.

El término "MCA" ("Methylated CpG Island Amplification", amplificación de islas de CpG metiladas) se refiere al ensayo de metilación descrito por Toyota et al. (1999), Cancer Res., 59:2307-12, y en el documento WO 00/26401A1.

Tal como se emplea en la presente, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de transporte para transportar materiales. En el contexto de los ensayos de reacción y sistemas de purificación de ácidos nucleicos, estos sistemas de transporte incluyen sistemas que permiten la conservación, el traslado o el transporte de reactivos y dispositivos (por ejemplo, adsorbantes de inhibidores, partículas, desnaturalizantes, oligonucleótidos, filtros de centrifugación, etc., en los recipientes apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, instrucciones escritas para realizar un procedimiento, etc.) desde un emplazamiento a otro. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más envases (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte pertinentes. Tal como se emplea en la presente, la expresión "kit fragmentado" se refiere a un sistema de transporte que comprende dos o más recipientes separados que contienen cada uno una subporción de los componentes totales del kit. Los recipientes pueden transportarse al receptor previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer recipiente puede contener materiales para la recogida de muestras y un tampón, mientras que un segundo recipiente contiene oligonucleótidos de captura y un desnaturalizante. La expresión "kit fragmentado" pretende incluir kits que contienen los reactivos específicos de analito ("analyte specific reagents", ASR) regulados según la sección 520(e) del Acta Federal de Alimentos, Fármacos y Cosméticos, pero no se limitan a estos. En efecto, cualquier sistema de transporte que comprenda dos o más recipientes separados que contienen cada uno una subporción de los componentes totales del kit se incluyen en la expresión "fragmented kit". Por contraste, un "kit combinado" se refiere a un sistema de transporte que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un único recipiente (por ejemplo, en una sola caja que aloja cada uno de los componentes deseados). El término "kit" incluye los kits fragmentados y combinados.

El término "sistema", tal como se emplea en la presente, se refiere a una colección de artículos para su uso para un objetivo concreto. En algunas realizaciones, los artículos comprenden instrucciones para su uso, como una información suministrada, por ejemplo, sobre un artículo, en papel o en un medio grabable (por ejemplo, disquete, CD, memoria USB, etc.). En algunas realizaciones, las instrucciones dirigen al usuario a una localización en línea, por ejemplo, un sitio web.

Tal como se emplea en la presente, el término "información" se refiere a cualquier colección de hechos o datos. Con referencia a la información almacenada o procesada usando uno o más sistemas de ordenador, que incluyen, pero no se limitan a internets, el término se refiere a cualquier dato almacenado en cualquier formato (por ejemplo, análogo, digital, óptico, etc.). Tal como se emplea en la presente, la expresión "información relacionada con un sujeto" se refiere a hechos o datos relativos a un sujeto (por ejemplo, un ser humano, una planta o un animal). La expresión "información genómica" se refiere a una información relativa a un genoma que incluye, pero no se limita a secuencias de ácido nucleico, genes, porcentaje de metilación, frecuencias de alelos, niveles de expresión de ARN, expresión de proteínas, fenotipos que se correlacionan con genotipos, etc. La "información de la frecuencia de alelos" se refiere a hechos o datos relativos a las frecuencias de alelos que incluyen, pero no se limitan a identidades de alelos, correlaciones estadísticas entre la presencia de un alelo y una característica de un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), la presencia o ausencia de un alelo en un individuo o población, el porcentaje de probabilidad de que un alelo esté presente en un individuo que tiene una o más características concretas, etc.

Descripción detallada

En la presente se proporciona una tecnología relacionada con realizar ensayos para la detección y la cuantificación de ADN, por ejemplo, ADN metilado. En particular, la tecnología se refiere a controles internos para dichos ensayos de metilación.

Las realizaciones de la presente descripción proporcionan un marcador denominado "ZDHHC1" para su uso como un marcador de metilación y control interno. Los experimentos realizados durante el desarrollo de las realizaciones de la descripción demostraron que no se encuentra, o se encuentra muy poco, ZDHHC1 metilado en muestras de sangre normales (por ejemplo, obtenidas de individuos sin enfermedad). Por contraste con los ADN de control interno usados habitualmente (por ejemplo, p-actina), ZDHHC1 produce una señal de fondo muy baja, por ejemplo, de la sangre presente en una muestra de tejido o heces. Durante el desarrollo de la presente tecnología, se descubrió que reemplazando el control interno ACTB por ZDHHC1 en un ejemplo de ensayo de metilación (por ejemplo, un ensayo de endonucleasa flap, tal como un ensayo QUARTS) se aumenta la sensibilidad y la especificidad del ensayo.

Otros experimentos demostraron que ZDHHC1 actúa como marcador que puede emplearse para detectar células de tejido epitelial en sangre (por ejemplo, como marcador para el cáncer metastásico). En la presente se describen ejemplos de realizaciones.

Aunque la presente descripción se refiere a ciertas realizaciones ilustradas, debe entenderse que estas realizaciones se presentan como ejemplo y no como limitación.

I. Marcadores específicos de células de un tejido

En los ensayos que detectan y cuantifican ADN rico en CpG metilado que se ha sometido a una conversión con bisulfito, también es típico detectar un gen control presente en la misma muestra, y el gen control verifica el aporte de ADN en el ensayo independientemente de la fuente (por ejemplo, cáncer, normal, heces, tejido). Este gen control se usa, por ejemplo, para normalizar los datos de número de copias de ADN obtenidos en ensayos a través de diferentes muestras, para mostrar de forma precisa unos niveles mayores o menores de marcadores asociados a enfermedad entre una muestra y otra.

Para que un gen normalizante de un ensayo de metilación actúe mejor, debe cumplir con varios criterios. Un gen normalizante ideal, por ejemplo: 1) debería estar igualmente presente en tejido normal y enfermo; 2) debería tener aproximadamente el mismo contenido en GC que el marcador o marcadores/gen o genes de ensayo que se están ensayando (por ejemplo, marcadores de ADN en los que la hipermetilación es un indicador de un estado de enfermedad); 3) debería reaccionar de la misma manera que los marcadores/genes de ensayo a tratamientos de muestras antes de la cuantificación (pre-PCR), tales como la conversión con bisulfito; y 4) debería tener una eficacia de amplificación por PCR que sea similar a la de los marcadores/genes de ensayo que se están ensayando.

El gen de p-actina, un gen que se emplea generalmente como gen normalizante para la detección de ADN marcadores metilados, no tiene el mismo contenido en GC y metilación de CpG que los marcadores de metilación asociados con enfermedades, tales como el cáncer y el adenoma (por ejemplo, vimentina, septina 9, NDRG4, BMP3), por tanto, no se comporta como dichos ADN marcadores en una conversión con bisulfito pre-PCR o en la amplificación con PCR. En el desarrollo de la presente tecnología, se ha descubierto que el uso de un gen normalizante que cumple los criterios analizados anteriormente, en lugar de ACTB, mejora la sensibilidad y la especificidad del ensayo. En el desarrollo de la presente tecnología, también se ha descubierto que el uso de un gen marcador que está muy metilado en tejido normal y enfermo, pero que no está metilado en sangre, proporciona un marcador que es específico de células de un tejido, por ejemplo, células epiteliales, y que tiene una presencia baja en sangre. El uso de dichos ADN control reduce la señal de fondo procedente de cualquier sangre presente en la muestra (por ejemplo, una muestra de heces o de tejido), y también puede emplearse para detectar la presencia anómala de dichas células del tejido en la sangre, como puede suceder, por ejemplo, durante la metástasis desde un tumor.

Los experimentos descritos en la presente identifican genes (por ejemplo, ZDHHC1) que están muy metilados en tejido normal y de cáncer. Estos genes no están muy metilados en sangre, y el grado en que están metilados en sangre no cambia según el estado de enfermedad, excepto como se describe en el ejemplo 6, en asociación con un cáncer metastásico. Esto permite un cálculo mejor y más preciso de la metilación que refleja solo un tejido, y es independiente del contenido de sangre de una muestra. Los genes descritos en la presente se usan para normalizar los niveles de marcadores a través de pacientes y muestras.

Se identificaron a ZDHHC1, ZFAND3, ZMYM4, ODZ2, y TRIO como candidatos a marcadores de metilación. La selección de los genes normalizantes que tienen baja metilación en la capa leucocítica permite una detección más sensible de la metilación de marcadores de interés (por ejemplo, el denominador empleado para la señal normalizante es bajo y, por tanto, el porcentaje de metilación del marcado de interés aumenta y se hace más fácil de distinguir).

Los genes normalizantes descritos en la presente están muy metilados en tejidos (de cáncer y normales) y no están muy metilados en sangre, y proporcionan varias ventajas frente a los marcadores existentes:

1- El contenido en GC y la metilación de CpG y la reactividad al bisulfito son más similares al marcador o marcadores de ADN que se están estudiando.

2- Muestran una eficacia de amplificación por PCR que es más similar a la del ADN marcador que se está midiendo.

3- El bajo estado de metilación en la capa leucocítica permite una mayor detección del porcentaje de metilación de marcadores de interés en sangre o en presencia de sangre.

II. Ensayos de detección de la metilación

Los marcadores descritos en la presente (por ejemplo, ZDHHC1 en concreto) pueden usarse en una diversidad de ensayos de detección de metilación como reactivos de normalización e indicadores de estados de enfermedad. El método usado con más frecuencia para analizar un ácido nuclei

basa en el método de bisulfito descrito por Frommer, et al., para la detección de 5-metilcitosinas en el ADN (Frommer et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1827-31), o sus variaciones. El método de bisulfito para cartografiar 5-metilcitosinas se basa en la observación de que la citosina, pero no la 5-metilcitosina, reacciona con el ion sulfito de hidrógeno (también denominado bisulfito). La reacción habitualmente se realiza según las siguientes etapas: en primer lugar, la citosina reacciona con el sulfito de hidrógeno para formar una citosina sulfonatada. Después, la desaminación espontánea del intermedio de reacción sulfonatado produce un uracilo sulfonatado. Por último, el uracilo sulfonatado se desulfonata bajo condiciones alcalinas para formar uracilo. La detección es posible porque el uracilo aparea sus bases con la adenina (comportándose así como la timina), mientras que la 5-metilcitosina aparea sus bases con la guanina (comportándose así como la citosina). Esto permite la discriminación de las citosinas metiladas de las citosinas no metiladas, por ejemplo, mediante secuenciación genómica con bisulfito (Grigg G., y Clark S., Bioessays (1994), 16:431-436; Grigg G., dNa Seq. (1996). 6:189-98), PCR específica de metilación (MSP) como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.786.146, o usando un ensayo que comprende la ruptura de sondas específica de secuencia, por ejemplo, un ensayo de endonucleasa flap QuARTS (véase, por ejemplo, Zou et al. (2010), "Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology", Clin. Chem., 56:A199; la patente de EE. UU. 8.361.720, y las solicitudes de patente de EE. UU. n.os de serie 12/946.745; 12/946.752, y 61/705.603).

Algunas tecnologías convencionales están relacionadas con métodos que comprenden introducir el ADN que se va a analizar en una matriz de agarosa, evitando con ello la difusión y la renaturalización del ADN (el bisulfito solo reacciona con ADN monocatenario), y reemplazando las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A., et al. (1996), "A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis", Nucleic Acids Res., 24:5064-6). Por tanto, es posible analizar células individuales para el estado de metilación, lo cual ilustra la utilidad y la sensibilidad del método. Se proporciona una visión global de los métodos convencionales para detectar 5-metilcitosina en Rein, T., et al. (1998), Nucleic Acids Res., 26:2255.

La técnica del bisulfito generalmente implica amplificar fragmentos cortos y específicos de un ácido nucleico conocido después de un tratamiento con bisulfito, y después ensayando el producto mediante secuenciación (Olek y Walter (1997), Nat. Genet., 17:275-6) o mediante una reacción de extensión con cebadores (Gonzalgo y Jones (1997), Nucleic Acids Res., 25:2529-31; documento WO 95/00669; patente de EE. UU. n.° 6.251.594) para analizar las posiciones de citosina individuales. Algunos métodos emplean una digestión enzimática (Xiong y Laird (1997), Nucleic Acids Res., 25:2532-4). En la técnica también se ha descrito la detección mediante hibridación (Olek et al., documento WO 99/28498). Además, se ha descrito el uso de la técnica del bisulfito para la detección de la metilación con respecto a genes individuales (Grigg y Clark (1994), Bioessays, 16:431-6; Zeschnigk et al. (1997), Hum. Mol. Genet., 6:387-95; Feil et al. (1994), Nucleic Acids Res., 22:695; Martin et al. (1995), Gene, 157:261-4; documento WO 9746705; documento ^w O 9515373).

Pueden usarse diversos procedimientos de ensayo de metilación junto con el tratamiento con bisulfito según la presente tecnología. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG (por ejemplo, islas de CpG) dentro de una secuencia de un ácido nucleico. Estos ensayos implican, entre otras técnicas, la secuenciación del ácido nucleico tratado con bisulfito, PCR (para la amplificación específica de secuencia), análisis de la transferencia Southern, y el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.

Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de los patrones de metilación y las distribuciones de 5-metilcitosina usando un tratamiento con bisulfito (Frommer et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1827-1831). Además, puede usarse una digestión con enzimas de restricción de los productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito para la evaluación del estado de metilación, por ejemplo, según se describe en Sadri y Hornsby (1997), Nucl. Acids Res., 24:5058-5059, o como se realiza en el método conocido como COBRA (análisis de restricción de bisulfito combinado) (Xiong y Laird (1997), Nucleic Acids Res., 25:2532-2534).

El análisis COBRA™ es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación del ADN en loci específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-2534, 1997). Brevemente, se usa una digestión con enzimas de restricción para revelar las diferencias de secuencia dependientes de la metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias en la secuencia dependientes de la metilación se introducen primero en el ADN genómico mediante un tratamiento con bisulfito convencional según el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1827-1831, 1992). Después se realiza una amplificación con PCR del ADN convertido con bisulfito usando cebadores específicos para las islas de CpG de interés, seguido de una digestión con endonucleasa de restricción, una electroforesis en gel, y una detección usando sondas de hibridación marcadas específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original son representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y no digerido de una manera linealmente cuantitativa a lo largo de un amplio espectro de niveles de metilación del ADN. Además, esta técnica puede aplicarse de modo fiable al ADN obtenido a partir de muestras de tejido sumergidas en parafina microdiseccionadas.

Los reactivos típicos (por ejemplo, los que pueden encontrarse en un kit basado en COBRA™ típico) para el análisis COBRA™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para loci específicos (por ejemplo, genes, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc., específicos); enzima de restricción y un tampón adecuado; oligonucleótido de hibridación con el gen; oligonucleótido de hibridación control; kit para el marcaje con quinasa para la sonda oligonucleotídica; y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; kits o reactivos de recuperación del ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación del ADN.

Se emplean ensayos, tales como "MethyLight™" (una técnica de PCR en tiempo real basada en la fluorescencia) (Eads et al., Cancer Res., 59:2302-2306, 1999), reacciones Ms-SNuPE™ (extensión con cebadores de nucleótido único sensible a la metilación) (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-2531, 1997), PCR específica de metilación ("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9821-9826, 1996; patente de EE. UU. n.° 5.786.146), y amplificación de islas de CpG metiladas ("MCA"; Toyota et al., Cancer Res., 59:2307-12, 1999), por sí solos o en combinación con uno o más de estos métodos.

La técnica del ensayo "HeavyMethyl™" es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación basada en la amplificación específica de metilación del ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de metilación ("bloqueantes") que cubren posiciones de CpG entre las sondas de amplificación, o que son cubiertas por estas últimas, permiten una amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico. La expresión "ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™" se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en el que el ensayo MethyLight™ se combina con sondas de bloqueo específicas de metilación que cubren posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMethyl™ también puede usarse en combinación con cebadores de la amplificación específicos de metilación. Los reactivos típicos (por ejemplo, los que pueden encontrarse en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis HeavyMethyl™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para loci específicos (por ejemplo, genes, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc., específicos); oligonucleótidos bloqueantes; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y polimerasa Taq.

La MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar el estado de metilación de casi cualquier grupo de sitios de CpG dentro de una isla de CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9821-9826, 1996; patente de EE. UU. n.° 5.786.146). Brevemente, el ADN se modifica con bisulfito de sodio, que convierte las citosinas no metiladas, pero no las citosinas metiladas, en uracilo, y los productos posteriormente se amplifican con cebadores específicos del ADN metilado frente al no metilado. La MSP solo requiere cantidades pequeñas de ADN, es sensible a 0,1 % de alelos metilados de un locus concreto de una isla de CpG, y puede aplicarse a ADN extraído de muestras sumergidas en parafina. Los reactivos típicos (por ejemplo, los que pueden encontrarse en un kit basado en MSP típico) para el análisis MSP pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR metilados y no metilados para loci específicos (por ejemplo, genes, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc., específicos); tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y sondas específicas.

El ensayo MethyLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alta capacidad de procesamiento que utiliza la PCR en tiempo real basada en la fluorescencia (por ejemplo, TaqMan®) que no requiere más manipulaciones después de la etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res., 59:2302-2306, 1999). Brevemente, el proceso de MethyLight™ comienza con una mezcla mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción con bisulfito de sodio, en una agrupación mixta de diferencias de secuencia dependientes de la metilación según procedimientos convencionales (el proceso con bisulfito convierte los restos citosina no metilados en uracilo). Después se realiza una PCR basada en fluorescencia en una reacción "sesgada", por ejemplo, con cebadores de PCR que se solapan con dinucleótidos CpG conocidos. La discriminación de las secuencias se produce al nivel del proceso de amplificación y al nivel del proceso de detección de fluorescencia.

El ensayo MethyLight™ se usa como un ensayo cuantitativo para patrones de metilación en un ácido nucleico, por ejemplo, una muestra de ADN genómico, en el que la discriminación de las secuencias se produce al nivel de la hibridación de sondas. En una versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de metilación en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un sitio de metilación putativo concreto. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN aportado mediante una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se solapan con ningún dinucleótido CpG. Como alternativa, se logra un ensayo cualitativo para la metilación genómica sondando la agrupación de PCR sesgada con oligonucleótidos control que no cubren sitios de metilación conocidos (por ejemplo, una versión basada en la fluorescencia de las técnicas de HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren sitios de metilación potenciales.

El proceso MethyLight™ se usa con cualquier sonda adecuada (por ejemplo, una sonda de "TaqMan®", una sonda de Lightcycler®, etc.). Por ejemplo, en algunas aplicaciones, un ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a uno de dos conjuntos de reacciones PCR usando sondas de TaqMan®, por ejemplo, con cebadores de MSP y/o oligonucleótidos bloqueantes de HeavyMethyl y una sonda de TaqMan®. La sonda de TaqMan® está marcada de modo dual con moléculas "indicadoras" y "extintoras" fluorescentes, y está diseñada para ser específica para una región con un contenido relativamente alto en GC, de modo que se funde en el ciclo de la PCR a una temperatura aproximadamente 10 °C más alta que los cebadores directo o inverso. Esto permite que la sonda de TaqMan® permanezca totalmente hibridada durante la etapa de asociación/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, finalmente alcanzará a la sonda de TaqMan® asociada. Entonces, la actividad endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará la sonda de TaqMan® digiriéndola para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal, ahora no extinguida, usando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.

Los reactivos típicos (por ejemplo, los que pueden encontrarse en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis MethyLight™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para loci específicos (por ejemplo, genes, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc., específicos); sondas de TaqMan® o Lightcycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y polimerasa Taq.

El ensayo QM™ ("quantitative methylation", metilación cuantitativa) es un ensayo cuantitativo alternativo para patrones de metilación en muestras de ADN genómico, en el que la discriminación de las secuencias se produce al nivel de la hibridación de sondas. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un sitio de metilación putativo concreto. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN aportado mediante una reacción en la que ni los cebadores ni la sonda se solapan con ningún dinucleótido CpG. Como alternativa, se logra un ensayo cualitativo para la metilación genómica sondando la agrupación de PCR sesgada con oligonucleótidos control que no cubren los sitios de metilación conocidos (una versión basada en la fluorescencia de las técnicas de HeavyMethyl™ y MSP) o con oligonucleótidos que cubren los sitios de metilación potenciales.

El proceso QM™ puede usarse con cualquier sonda adecuada, por ejemplo, sondas de "TaqMan®", sondas de Lightcycler®, en el proceso de amplificación. Por ejemplo, un ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito de sodio y se somete a cebadores no sesgados y la sonda de TaqMan®. La sonda de TaqMan® está marcada de modo dual con moléculas "indicadoras" y "extintoras" fluorescentes, y está diseñada para ser específica para una región con un contenido relativamente alto en GC, de modo que se funde en el ciclo de la PCR a una temperatura aproximadamente 10 °C más alta que los cebadores directo o inverso. Esto permite que la sonda de TaqMan® permanezca totalmente hibridada durante la etapa de asociación/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, finalmente alcanzará a la sonda de TaqMan® asociada. Entonces, la actividad endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará la sonda de TaqMan® digiriéndola para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal, ahora no extinguida, usando un sistema de detección fluorescente en tiempo real. Los reactivos típicos (por ejemplo, los que pueden encontrarse en un kit basado en QM™ típico) para el análisis QM™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para loci específicos (por ejemplo, genes, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc., específicos); sondas de TaqMan® o Lightcycler®; tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; y polimerasa Taq.

La técnica Ms-SNuPE™ es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios de CpG específicos basado en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido de una extensión con cebadores de nucleótido único (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-2531, 1997). Brevemente, un ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo, dejando la 5-metilcitosina sin cambios. Después se realiza la amplificación de la secuencia diana deseada usando cebadores de PCR específicos para el ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se usa como molde para un análisis de la metilación en el sitio de CpG de interés. Pueden analizarse pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, secciones de patología microdiseccionadas) y se evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en los sitios de CpG.

Los reactivos típicos (por ejemplo, los que pueden encontrarse en un kit basado en Ms-SNuPE™ típico) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para loci específicos (por ejemplo, genes, marcadores, regiones de genes, regiones de marcadores, secuencia de ADN tratada con bisulfito, isla de CpG, etc., específicos); tampones de PCR optimizados y desoxinucleótidos; kit de extracción en gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE™ para loci específicos; tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; kits o reactivos de recuperación del ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación del ADN.

La secuenciación con bisulfito de representación reducida ("Reduced Representation Bisulfite Sequencing", RRBS) comienza con un tratamiento con bisulfito para convertir todas las citosinas no metiladas en uracilo, seguido de una digestión con enzimas de restricción (por ejemplo, con una enzima que reconoce un sitio que incluye una secuencia CG, tal como MspI) y de la secuenciación completa de los fragmentos después de acoplar a un ligando adaptador. La elección de la enzima de restricción enriquece los fragmentos para las regiones densas en CpG, reduciendo el número de secuencias redundantes que pueden calcografiarse en múltiples posiciones de genes durante el análisis. Así, la RRBS reduce la complejidad de la muestra de ácido nucleico seleccionando un subconjunto (por ejemplo, mediante selección de tamaño usando una electroforesis en gel preparativa) de fragmentos de restricción para la secuenciación. En oposición a la secuenciación con bisulfito del genoma completo, cada fragmento producido por la digestión con enzimas de restricción contiene información sobre la metilación del ADN para al menos un dinucleótido CpG. Así, la RRBS enriquece a la muestra en promotores, islas de CpG y otras características genómicas con una alta frecuencia de sitios de corte de enzimas de restricción en estas regiones y, por tanto, proporciona un ensayo para evaluar el estado de metilación de uno o más loci genómicos.

Un protocolo típico para la RRBS comprende las etapas de digerir una muestra de ácido nucleico con una enzima de restricción, tal como MspI, rellenar los extremos colgantes y colas de A, acoplar adaptadores, realizar una conversión con bisulfito y una PCR. Véase, por ejemplo, Hongcang Gu, et al. (2005), "Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution", Nat. Methods, 7:133-6; Meissner et al. (2005), "Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis", Nucleic Acids Res., 33:5868-77.

En algunas realizaciones, se usa un ensayo de amplificación de señal y diana en tiempo real específico de alelo cuantitativo ("quantitative allele-specific real-time target and signal amplification", QuARTS) para evaluar el estado de metilación. En cada ensayo QuARTS se producen tres reacciones secuencialmente, que incluyen una amplificación (reacción 1) y una ruptura de sonda diana (reacción 2) en la reacción primaria; y una ruptura FRET y generación de una señal fluorescente (reacción 3) en la reacción secundaria. Cuando un ácido nucleico diana se amplifica con cebadores específicos, una sonda de detección específica con una secuencia flap se une de manera laxa al amplicón. La presencia del oligonucleótido invasivo específico en el sitio de unión a la diana provoca que una 5' nucleasa, por ejemplo, una endonucleasa FEN-1, libere la secuencia flap cortando entre la sonda de detección y la secuencia flap. La secuencia flap es complementaria con una porción no de horquilla de un correspondiente módulo de FRET. Por consiguiente, la secuencia flap actúa como un oligonucleótido invasivo sobre el módulo de FRET y realiza una ruptura entre el fluoróforo del módulo de FRET y un extintor, lo cual produce una señal fluorescente. La reacción de ruptura puede cortar múltiples sondas por diana y, por tanto, liberar múltiples fluoróforos por flap, proporcionando una amplificación exponencial de la señal. QuARTS puede detectar múltiples dianas en un único pocillo de reacción usando módulos de FRET con diferentes tintes. Véase, por ejemplo, Zou et al. (2010), "Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology", Clin. Chem., 56:A199).

La expresión "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno, o sus combinaciones, útil como se describe en la presente para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas Los métodos de dicho tratamiento son conocidos en la técnica (por ejemplo, documento PCT/EP2004/011715 y documento WO 2013/116375). En algunas realizaciones, el tratamiento con bisulfito se realiza en presencia de disolventes desnaturalizantes, tales como, pero sin limitarse a n-alquilenglicol o dietilenglicol dimetil éter (DME), o en presencia de dioxano o derivados del dioxano. En algunas realizaciones, los disolventes desnaturalizantes se usan en concentraciones de entre 1 % y 35 % (en v/v). En algunas realizaciones, la reacción del bisulfito se realiza en presencia de captadores, tales como, pero sin limitarse a derivados de cromano, por ejemplo, ácido 6-hidroxi-2,5,7,8,-tetrametilcroman-2-carboxílico o trihidroxibenzona ácida y sus derivados, por ejemplo, ácido gálico (véase el documento PCT/EP2004/011715). En ciertas realizaciones preferidas, la reacción de bisulfito comprende un tratamiento con sulfito de hidrógeno y amonio, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2013/116375.

En algunas realizaciones, el ADN tratado con bisulfito se purifica antes de la cuantificación. Esto puede realizarse por medios conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a ultrafiltración, por ejemplo, mediante columnas Microcon™ (fabricadas por Millipore™). La purificación se realiza según el protocolo del fabricante modificado (véase, por ejemplo, el documento PCT/EP2004/01175). En algunas realizaciones, el ADN tratado con bisulfito se une a un soporte sólido, por ejemplo, una esfera magnética, y la desulfonación y el lavado se producen mientras el ADN está unido al soporte. Se proporcionan ejemplos de dichas realizaciones, por ejemplo, en el documento WO 2013/116375. En ciertas realizaciones preferidas, el ADN unido al soporte está listo para un ensayo de metilación inmediatamente después de la desulfonación y el lavado sobre el soporte. En algunas realizaciones, el ADN desulfonatado se eluye del soporte antes del ensayo.

En algunas realizaciones, los fragmentos del ADN tratado se amplifican usando conjuntos de oligonucleótidos cebadores según la presente invención (por ejemplo, véase la tabla 2) y una enzima de amplificación. La amplificación de varios segmentos de ADN puede realizarse simultáneamente en un solo recipiente de reacción. Generalmente, la amplificación se realiza usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En otra realización del método, se detecta el estado de metilación de posiciones de CpG dentro o cerca de un marcador usando oligonucleótidos cebadores específicos de metilación. Esta técnica (MSP) se ha descrito en la patente de EE. UU. n.° 6.265.171 de Herman. El uso de cebadores específicos del estado de metilación para la amplificación de un ADN tratado con bisulfito permite la diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Las parejas de cebadores de MSP contienen al menos un cebador que se hibrida con un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Los cebadores de MSP específicos para ADN no metilado contienen una "T" en la posición de la posición C en el CpG.

Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación pueden portar un marcador detectable de modo directo o indirecto. En algunas realizaciones, los marcadores son marcadores fluorescentes, radionúclidos, o fragmentos de moléculas desprendibles que tienen una masa típica que puede detectarse en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcadores son marcadores de masa, en algunas realizaciones se proporcionan amplicones marcados que tienen una única carga neta positiva o negativa, lo cual permite una mejor detectabilidad en el espectrómetro de masas. La detección puede realizarse y visualizares, por ejemplo, por medio de una espectrometría de masas de desorción/ionización mediante láser asistida por matriz ("matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry", MALDI) o usando una espectrometría de masas de nebulización de electrones ("electron spray mass spectrometry", ESI).

Los métodos para aislar un ADN adecuado para estas tecnologías de ensayo son conocidos en la técnica. En particular, algunas realizaciones comprenden el aislamiento de ácidos nucleicos, como se describe en la solicitud de patente de EE. UU. n.° de serie 13/470.251 ("Isolation of Nucleic Acids", publicada como documento US 2012/0288868)

En algunas realizaciones, los marcadores descritos en la presente pueden usarse en ensayos QUARTS realizados sobre muestras de heces. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para producir muestras de ADN y, en particular, métodos para producir muestras de ADN que comprende ácidos nucleicos de baja abundancia y muy purificados en un volumen pequeño (por ejemplo, menos de 100, menos de 60 microlitros) y que están sustancial y/o eficazmente exentos de sustancias que inhiben los ensayos usados para ensayar las muestras de ADN (por ejemplo, PCR, INVADER, ensayos QuARTS, etc.). Estas muestras de ADN pueden emplearse en ensayos de diagnóstico que detectan cualitativamente la presencia o que miden cuantitativamente la actividad, la expresión o la cantidad de un gen, un variante de gen (por ejemplo, un alelo), o una modificación de un gen (por ejemplo, metilación) presente en una muestra tomada de un paciente. Por ejemplo, algunos cánceres se correlacionan con la presencia de alelos mutantes concretos o estados de metilación concretos y, por tanto, la detección y/o la cuantificación de dichos alelos mutantes o estados de metilación tiene un valor predictivo en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer.

Muchos marcadores genéticos valiosos están presentes en cantidades extremadamente bajas en muestras, y muchos de los acontecimientos que producen dichos marcadores son poco frecuentes. En consecuencia, incluso los métodos de detección sensibles, tales como la PCR, requieren una gran cantidad de ADN para proporcionar una cantidad suficiente de una diana de baja abundancia para alcanzar o superar el umbral de detección del ensayo. Además, la presencia de cantidades, que incluso pueden ser bajas, de sustancias inhibidoras compromete la precisión de estos ensayos dirigidos a detectar dichas cantidades bajas de una diana. Por consiguiente, en la presente se proporcionan métodos que proporcionan la gestión necesaria del volumen y la concentración para producir dichas muestras de ADN.

Algunas muestras biológicas, tales como muestras de heces, contienen una amplia diversidad de compuestos diferentes que son inhibidores para la PCR. Por tanto, los procedimientos de extracción de ADN incluyen métodos para retirar y/o inactivar los inhibidores de la PCR. Así, en algunas realizaciones, el procesamiento y la preparación de las muestras y, en particular, pero no exclusivamente, los métodos, sistemas y kits para retirar los inhibidores del ensayo de las muestras que comprenden ácidos nucleicos, se describen en el ejemplo 1.

En algunas realizaciones, la muestra comprende sangre, suero, plasma, secreciones gástricas, jugo pancreático, una muestra de biopsia gastrointestinal, células microdiseccionadas procedentes de una biopsia gastrointestinal, células gastrointestinales desprendidas hacia el lumen gastrointestinal y/o células gastrointestinales recuperadas de heces. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. Estas muestras pueden surgir del tracto gastrointestinal superior, del tracto gastrointestinal inferior, o comprender células, tejidos y/o secreciones del tracto gastrointestinal superior y el tracto gastrointestinal inferior. La muestra puede incluir células, secreciones o tejidos procedentes del hígado, conductos biliares, páncreas, estómago, colon, recto, esófago, intestino delgado, apéndice, duodeno, pólipos, vesícula biliar, ano y/o peritoneo. En algunas realizaciones, la muestra comprende fluido celular, fluido de ascitis, orina, heces, fluido pancreático, fluido obtenido durante una endoscopia, sangre, mucosidad o saliva. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de heces.

Estas muestras pueden obtenerse mediante una serie de medios conocidos en la técnica, tal como será evidente para los expertos en la técnica. Por ejemplo, las muestras de orina y fecales pueden obtenerse con facilidad, mientras que las muestras de sangre, fluido de ascitis, suero o fluido pancreático pueden obtenerse por vía parenteral usando una aguja y una jeringa, por ejemplo. Pueden obtenerse muestras sin células o sustancialmente sin células sometiendo la muestra a diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a centrifugación y filtración. Aunque en general que se prefieren no usar técnicas invasivas para obtener la muestra, estas pueden ser preferibles para obtener muestras, tales como homogeneizados de tejido, secciones de tejido y especímenes de biopsia. La tecnología no se limita a los métodos usados para preparar las muestras y proporcionar un ácido nucleico para ensayar. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un ADN se aísla de una muestra de heces o de sangre o de una muestra de plasma usando la captura directa de genes, por ejemplo, como se detalla en las patentes de EE. UU. n.os 8.808.990 y 9.169.511, y en el documento WO 2012/155072, o mediante un método relacionado.

El análisis de los marcadores puede realizarse por separado o de modo simultáneo con otros marcadores dentro de una única muestra de ensayo. Por ejemplo, pueden combinarse varios marcadores en un ensayo para el procesamiento eficaz de múltiples muestras y para proporcionar potencialmente una mayor precisión de diagnóstico y/o prognóstico. Además, los expertos en la técnica reconocerán el valor de ensayar múltiples muestras (por ejemplo, en momentos sucesivos) procedentes del mismo sujeto. Estos ensayos de muestras en serie pueden permitir la identificación de cambios en los estados de metilación de marcadores a lo largo del tiempo. Los cambios en el estado de metilación, así como la ausencia de cambios en el estado de metilación, pueden proporcionar información útil acerca del estado de enfermedad que incluye, pero no se limita a identificar el tiempo aproximado desde la aparición del acontecimiento, la presencia y la cantidad de tejido salvable, la idoneidad de las terapias de fármacos, la eficacia de diversas terapias, y la identificación del resultado del sujeto, que incluye el riesgo de futuros acontecimientos.

El análisis de los biomarcadores puede realizarse en una diversidad de formatos físicos. Por ejemplo, el uso de placas de microtitulación o la automatización puede emplearse para facilitar el procesamiento de un gran número de muestras de ensayo. Como alternativa, pueden desarrollarse formatos de muestras individuales para facilitar un tratamiento y diagnóstico inmediato de una manera puntual, en escenarios de transporte ambulatorio o salas de urgencia.

Se contempla que las realizaciones de la tecnología se proporcionen en forma de un kit. Los kits comprenden realizaciones de las composiciones, los dispositivos, los aparatos, etc., descritos en la presente, e instrucciones para el uso del kit. Estas instrucciones describen métodos apropiados para preparar un analito a partir de una muestra, por ejemplo, para recoger una muestra y preparar un ácido nucleico a partir de la muestra. Los componentes individuales del kit se envasan en recipientes y envases adecuados (por ejemplo, viales, cajas, paquetes de blísteres, ampollas, tarros, botellas, tubos y similares), y los componentes se envasan juntos en un recipiente apropiado (por ejemplo, una caja o cajas) para un almacenamiento, transporte y/o uso por el usuario del kit convenientes. Se entiende que los componentes líquidos (por ejemplo, un tampón) pueden proporcionarse en una forma liofilizada para ser reconstituida por el usuario. Los kits pueden incluir un control o referencia para evaluar, validar y/o asegurar la actuación del kit. Por ejemplo, un kit para ensayar la cantidad de un ácido nucleico presente en una muestra puede incluir un control que comprende una concentración conocida del mismo ácido nucleico o de otro ácido nucleico para la comparación y, en algunas realizaciones, un reactivo de detección (por ejemplo, un cebador) específico para el ácido nucleico control. Los kits son apropiados para su uso en un escenario clínico y, en algunas realizaciones, para su uso en el hogar del usuario. Los componentes de un kit, en algunas realizaciones, proporcionan las funcionalidades de un sistema para preparar una disolución de ácido nucleico a partir de una muestra. En algunas realizaciones, ciertos componentes del sistema son proporcionados por el usuario.

III. Otras aplicaciones

En algunas realizaciones, los ensayos de diagnóstico identifican la presencia de una enfermedad o afección en un individuo. En algunas realizaciones, la enfermedad es un cáncer (por ejemplo, cáncer del sistema gastrointestinal). La presente descripción no se limita a marcadores concretos. En algunas realizaciones, se utilizan marcadores cuya metilación aberrante se asocia con un neoplasma gastrointestinal (por ejemplo, uno o más de vimentina, septina 9, NDRG4; véase también la solicitud de patente provisional n.° 62/091.053, presentada el 12 de diciembre, 2014). En algunas realizaciones, el ensayo comprende además la detección de genes KRAS mutados (véase, por ejemplo, el ejemplo 1). En algunas realizaciones, los ensayos comprenden además la detección de hemoglobina en muestras de heces (véase, por ejemplo, el ejemplo 1).

En algunas realizaciones, la tecnología se relaciona con un método para tratar un paciente (por ejemplo, un paciente con cáncer gastrointestinal, con cáncer gastrointestinal de estadio temprano, o que puede desarrollar cáncer gastrointestinal), comprendiendo dicho método determinar el estado de metilación de uno o más marcadores, según se proporciona en la presente, y administrar un tratamiento al paciente basándose en los resultados de la determinación del estado de metilación. El tratamiento puede ser la administración de un compuesto farmacéutico, una vacuna, realizar una cirugía, formar imágenes del paciente, realizar otro ensayo. Preferiblemente, dicho uso es en un método de selección clínica, un método de evaluación de la prognosis, un método para controlar los resultados de una terapia, un método para identificar pacientes que respondan con más probabilidad a un tratamiento terapéutico concreto, un método para formar imágenes de un paciente o sujeto, y un método para la selección y desarrollo de fármacos.

En algunas realizaciones de la tecnología, se proporciona un método para diagnosticar un cáncer gastrointestinal en un sujeto. Los términos "diagnosticar" y "diagnóstico", tal como se emplean en la presente, se refieren a métodos mediante los cuales los expertos en la técnica pueden calcular, e incluso determinar, si un sujeto padece o no una enfermedad o trastorno concreto o si puede desarrollar una enfermedad o trastorno concreto en el futuro. Los expertos en la técnica a menudo realizan un diagnóstico basándose en uno o más indicadores de diagnóstico, tales como, por ejemplo, un biomarcador (por ejemplo, los descritos en la presente), cuyo estado de metilación es indicativo de la presencia, la gravedad o la ausencia de una afección.

Junto con el diagnóstico, la prognosis clínica del cáncer se relaciona con determinar la agresividad del cáncer y la probabilidad de recurrencia de un tumor para planear la terapia más eficaz. Si puede realizarse una prognosis más precisa o incluso si puede evaluarse un riesgo potencial para desarrollar el cáncer, puede elegirse la terapia apropiada y, en algunos casos, una terapia menos grave para el paciente. La evaluación (por ejemplo, la determinación del estado de metilación) de biomarcadores del cáncer es útil para separar sujetos con una buena prognosis y/o un riesgo bajo de desarrollar cáncer que no necesitarán terapia o necesitarán una terapia limitada, de los que sea más probable que desarrollen cáncer o sufran una recurrencia del cáncer que pueden beneficiarse de tratamientos más intensivos.

Así, "realizar un diagnóstico" o "diagnosticar", tal como se emplean en la presente, incluyen además determinar un riesgo de desarrollar cáncer o determinar una prognosis, que puede proporcionar información para predecir un resultado clínico (con o sin tratamiento médico), seleccionar un tratamiento apropiado (o si un tratamiento será eficaz), o controlar un tratamiento actual y potencialmente cambiar el tratamiento, basándose en la medición de los biomarcadores de diagnóstico (por ejemplo, los descritos en la presente) descritos en la presente. Además, en algunas realizaciones del contenido descrito en la presente, pueden realizarse múltiples determinaciones de los biomarcadores a lo largo del tiempo para facilitar el diagnóstico y/o la prognosis. Puede usarse un cambio temporal en el biomarcador para predecir un resultado clínico, controlar la progresión de un cáncer gastrointestinal y/o controlar la eficacia de terapias apropiadas dirigidas contra el cáncer. En una de estas realizaciones, por ejemplo, se podría esperar observar un cambio en el estado de metilación de uno o más biomarcadores descritos en la presente (y, potencialmente, uno o más biomarcadores adicionales, si se controlan) en una muestra biológica a lo largo del tiempo durante el curso de una terapia eficaz.

El contenido descrito en la presente también proporciona, en algunas realizaciones, un método para determinar si se inicia o se continúa la profilaxis o el tratamiento de un cáncer en un sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende proporcionar una serie de muestras biológicas procedentes del sujeto a lo largo de un periodo de tiempo; analizar la serie de muestras biológicas para determinar un estado de metilación de al menos un biomarcador descrito en la presente en cada una de las muestras biológicas; y comparar cualquier cambio mensurable en los estados de metilación de uno o más de los biomarcadores en cada una de las muestras biológicas. Cualquier cambio en los estados de metilación de los biomarcadores a lo largo del periodo de tiempo puede usarse para predecir el riesgo de desarrollar cáncer, predecir un resultado clínico, determinar si se inicia o se continúa la profilaxis o la terapia del cáncer, y si una terapia actual está tratando con eficacia el cáncer. Por ejemplo, puede seleccionarse un primer momento antes del inicio de un tratamiento y puede seleccionarse un segundo momento cierto tiempo después del inicio del tratamiento. Pueden medirse los estados de metilación en cada una de las muestras tomadas de los diferentes momentos y observar las diferencias cualitativas y/o cuantitativas. Un cambio en los estados de metilación de los niveles de biomarcadores de las diferentes muestras puede correlacionarse con el riesgo de cáncer gastrointestinal, con la prognosis, con la determinación de la eficacia del tratamiento y/o con la progresión del cáncer en el sujeto.

En realizaciones preferidas, los métodos y las composiciones de la invención son para el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad en un estadio temprano, por ejemplo, antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad. En algunas realizaciones, los métodos y las composiciones de la invención son para el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad en un estadio clínico.

Tal como se ha mencionado, en algunas realizaciones, pueden realizarse múltiples determinaciones de uno o más biomarcadores de diagnóstico o prognóstico, y puede usarse un cambio temporal en el marcador para determinar un diagnóstico o prognóstico. Por ejemplo, puede determinarse un marcador de diagnóstico en un momento inicial y de nuevo en un segundo momento. En estas realizaciones, un aumento en el marcador desde el momento inicial al segundo momento puede ser diagnóstico de un tipo concreto o gravedad de un cáncer, o una prognosis concreta. De modo similar, una disminución en el marcador desde el momento inicial al segundo momento puede ser indicativa de un tipo concreto o gravedad de un cáncer, o una prognosis concreta. Además, el grado de cambio de uno o más marcadores puede relacionarse con la gravedad del cáncer y futuros acontecimientos adversos. Los expertos en la técnica comprenderán que, aunque en ciertas realizaciones pueden realizarse mediciones comparativas del mismo biomarcador en múltiples momentos, también se puede medir un biomarcador concreto en un momento y un segundo biomarcador en un segundo momento, y la comparación de estos marcadores puede proporcionar información de diagnóstico.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "determinar la prognosis" se refiere a métodos mediante los cuales los expertos en la técnica pueden predecir el desarrollo o el resultado de una afección en un sujeto. El término "prognosis " no se refiere a la capacidad para predecir el desarrollo o el resultado de una afección con una precisión del 100 %, o incluso si un desarrollo o resultado concreto se vaya producir con más o menos probabilidad y de modo predecible, basándose en el estado de metilación de un biomarcador. Por el contrario, los expertos en la técnica comprenderán que el término "prognosis" se refiere a una mayor probabilidad de que se produzca cierto desarrollo o resultado; es decir, que es más probable que se produzca un desarrollo o resultado en un sujeto que presenta cierta afección, cuando se compara con individuos que no presentan la afección. Por ejemplo, en individuos que no presentan la afección (por ejemplo, que tienen un estado de metilación normal de uno o más genes diana), la probabilidad de un resultado concreto (por ejemplo, que padezca un cáncer gastrointestinal) puede ser muy baja.

En algunas realizaciones, un análisis estadístico asocia un indicador de prognóstico con una predisposición a un resultado adverso. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un estado de metilación diferente del que aparece en una muestra control normal obtenida de un paciente que no padece cáncer puede señalar que es más probable que un sujeto padezca un cáncer que los sujetos con un nivel que es más similar al estado de metilación en la muestra control, según se determina mediante un nivel de significancia estadística. Además, un cambio en el estado de metilación desde un nivel de línea de base (por ejemplo, "normal") puede reflejar la prognosis de un sujeto, y el grado de cambio en el estado de metilación puede relacionarse con la gravedad de acontecimientos adversos. A menudo, la significancia estadística se determina comparando dos o más poblaciones y determinando un intervalo de confianza y/o un valor de p. Véase, por ejemplo, Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York, 1983. Los ejemplos de intervalos de confianza del contenido de la presente son 90 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % y 99,99 %, mientras que los ejemplos de valores de p son 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 y 0,0001.

En otras realizaciones, puede establecerse un grado umbral de cambio en el estado de metilación de un biomarcador de prognóstico o de diagnóstico, y el grado de cambio en el estado de metilación del biomarcador en una muestra biológica simplemente se compara con el grado umbral de cambio en el estado de metilación. Un cambio umbral preferido en el estado de metilación para biomarcadores proporcionados en la presente es de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 100 %, y aproximadamente 150 %. En otras realizaciones, puede establecerse un "nomograma", mediante el cual un estado de metilación de un indicador de prognóstico o de diagnóstico (biomarcador o combinación de biomarcadores) se relaciona directamente con una disposición asociada hacia un resultado concreto. Los expertos en la técnica están familiarizados con el uso de estos nomogramas para relacionar dos valores numéricos con la comprensión de que la incertidumbre en esta medición es la misma que la incertidumbre en la concentración de marcador, ya que las mediciones de muestras individuales están referenciadas, no son promedios poblacionales.

En algunas realizaciones, una muestra control se analiza al mismo tiempo que la muestra biológica, de modo que los resultados obtenidos de la muestra biológica pueden compararse con los resultados obtenidos de la muestra control. Además, se contempla que puedan proporcionarse curvas patrón, con las que pueden compararse los resultados de ensayo de la muestra biológica. Estas curvas patrón presentan los estados de metilación de un biomarcador como una función de las unidades del ensayo, por ejemplo, intensidad de la señal fluorescente, si se usa un marcador fluorescente. Usando muestras tomadas de múltiples donantes, pueden proporcionarse curvas patrón para controlar los estados de metilación de dichos uno o más biomarcadores en tejido normal, así como los niveles "en riesgo" de dichos uno o más biomarcadores en tejido obtenido de donantes con metaplasia o de donantes con cáncer gastrointestinal. En ciertas realizaciones del método, se identifica que un sujeto tiene metaplasia tras haber identificado un estado de metilación aberrante de uno o más marcadores proporcionados en la presente en una muestra biológica obtenida del sujeto. En otras realizaciones del método, la detección de un estado de metilación aberrante de uno o más de dichos biomarcadores en una muestra biológica obtenida del sujeto da como resultado que el sujeto se identifica como que padece cáncer.

En algunas realizaciones, el sujeto se diagnostica con cáncer gastrointestinal si, cuando se compara con un estado de metilación control, existe una diferencia mensurable en el estado de metilación de al menos un biomarcador en la muestra. A la inversa, cuando no se identifica un cambio en el estado de metilación en la muestra biológica, el sujeto puede identificarse como que no padece cáncer gastrointestinal, no está en riesgo de padecer el cáncer o tiene un riesgo bajo para el cáncer. A este respecto, los sujetos que padecen el cáncer, o que están en riesgo de padecerlo, pueden diferenciarse de los sujetos que tienen un riesgo bajo o sustancialmente no tienen riesgo de padecer cáncer. Los sujetos que están en riesgo de desarrollar un cáncer gastrointestinal pueden colocarse en un programa de selección más intensivo y/o regular, que incluye vigilancia endoscópica. Por otra parte, los sujetos que tienen un riesgo bajo o sustancialmente no tienen riesgo pueden evitar ser sometidos a una endoscopia, hasta el momento en que una selección futura, por ejemplo, una selección realizada según la presente tecnología, indique que ha aparecido un riesgo de cáncer gastrointestinal en estos sujetos.

Tal como se mencionó anteriormente, dependiendo de la realización del método de la presente tecnología, la detección de un cambio en el estado de metilación de dichos uno o más biomarcadores puede ser una determinación cualitativa o puede ser una determinación cuantitativa. Así, la etapa de diagnosticar un sujeto como que tiene un cáncer gastrointestinal, o que está en riesgo de desarrollarlo, indica que se realizan ciertas mediciones umbral, por ejemplo, el estado de metilación de dichos uno o más biomarcadores en la muestra biológica, que varían de un estado de metilación control predeterminado. En algunas realizaciones del método, el estado de metilación control es cualquier estado de metilación detectable del biomarcador. En otras realizaciones del método en las que se ensaya una muestra control al mismo tiempo que la muestra biológica, el estado de metilación predeterminado es el estado de metilación en la muestra control. En otras realizaciones del método, el estado de metilación predeterminado se basa en una curva patrón y/o se identifica mediante una curva patrón. En otras realizaciones del método, el estado de metilación predeterminado es un estado o intervalo de estado específico. Así, el estado de metilación predeterminado puede elegirse dentro de límites aceptables que serán evidentes para los expertos en la técnica, basándose en parte en la realización del método que se está practicando y de la especificidad deseada, etc.

Además, con respecto a los métodos de diagnóstico, un sujeto preferido es un sujeto vertebrado. Un vertebrado preferido es un animal de sangre caliente; un vertebrado de sangre caliente preferido es un mamífero. Un mamífero preferido es, lo más preferiblemente, un ser humano. Tal como se emplea en la presente, el término "sujeto" incluye sujetos humanos y animales. Así, en la presente se proporcionan usos terapéuticos veterinarios. Así, la presente tecnología proporciona el diagnóstico de mamíferos, tales como seres humanos, así como mamíferos de importancia por estar en peligro, tales como los tigres siberianos; de importancia económica, tales como animales criados en granjas para el consumo humano; y/o animales de importancia social para los seres humanos, tales como los animales que se tienen como mascotas o en los zoos. Los ejemplos de dichos animales incluyen, pero no se limitan a: carnívoros, tales como perros y gatos; cerdos, que incluyen puercos y jabalíes salvajes; rumiantes y/o ungulados, tales como ganado vacuno, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes y camellos; pinnípedos, y caballos. Además, se proporciona el diagnóstico y tratamiento de ganado que incluye, pero no se limita a cerdos domesticados, rumiantes, ungulados, caballos (incluyendo caballos de carreras) y similares. El contenido descrito en la presente también incluye un sistema para diagnosticar un cáncer gastrointestinal en un sujeto. El sistema puede proporcionarse, por ejemplo, como un kit comercial que puede usarse para seleccionar un riesgo de cáncer gastrointestinal o diagnosticar un cáncer gastrointestinal en un sujeto del cual se ha recogido una muestra biológica. Un ejemplo de sistema proporcionado según la presente tecnología incluye evaluar el estado de metilación de un marcador descrito en la presente.

A lo largo de los últimos años, se ha hecho evidente que pueden detectarse células epiteliales circulantes, que representan células de tumor metastásico, en la sangre de muchos pacientes con cáncer. La formación de perfiles moleculares de células poco frecuentes es importante en estudios biológicos y clínicos. Las aplicaciones varían desde la caracterización de las células epiteliales circulantes (CEpC) en la sangre periférica de pacientes con cáncer para la prognosis de enfermedades y el tratamiento personalizado (véase, por ejemplo, Cristofanilli M., et al. (2004), N. Engl. J. Med., 351:781-791; Hayes D.F., et al. (2006), Clin. Cancer Res., 12:4218-4224; Budd G.T., et al. (2006), Clin. Cancer Res., 12:6403-6409; Moreno J.G., et al. (2005), Urology, 65:713-718; Pantel et al. (2008), Nat. Rev., 8:329-340; y Cohen S.J., et al. (2008), J. Clin. Oncol., 26:3213-3221).

Los experimentos realizados durante el desarrollo de las realizaciones de la descripción identificaron el resultado inesperado de que la presencia de ZDHHC1 metilado en sangre o plasma se correlaciona con la presencia de células epiteliales en la sangre de pacientes con cáncer metastásico. Por consiguiente, las realizaciones de la presente descripción proporcionan composiciones y métodos para detectar la presencia de un cáncer metastásico en un sujeto mediante la identificación de la presencia de ZDHHC1 metilado en plasma o sangre completa. La presencia de ZDHHC1 metilado se identifica usando cualquier método adecuado (por ejemplo, los descritos en la presente).

Ejemplos experimentales

Ejemplo 1: Métodos para el aislamiento de ADN y ensayo QUARTS

A continuación, se proporciona un ejemplo de un método para el aislamiento de ADN antes del análisis y un ejemplo de un ensayo QUARTS, tales como pueden emplearse según las realizaciones de la tecnología. En este ejemplo se describe la aplicación de la tecnología QuARTS a ADN procedente de muestras de heces y de diversos tejidos, pero la tecnología se aplica con facilidad a otras muestras de ácidos nucleicos, por ejemplo, como se muestra en otros ejemplos.

Recolección de ADN diana a partir de muestras de heces

Se recolectaron heces completas en cubos de plástico. Se añadió un tampón de conservación, por ejemplo, EDTA 150 mM, Tris-Cl 500 mM y NaCl 10 mM (pH 9,0) a las heces, por ejemplo, a aproximadamente 4 ml por gramo de heces, y las heces tamponadas se pueden usar directamente o archivarse a -80 °C.

Ejemplo de procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos diana a partir de muestras de heces:

1. Una muestra de heces se homogeneiza, por ejemplo, con un tampón, para formar un homogeneizado de heces. El homogeneizado se trata para separar los sólidos residuales del fluido, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración, para producir un "sobrenadante de heces".

2. El sobrenadante de heces se trata para eliminar los inhibidores del ensayo (por ejemplo, con polivinilpolipirrolidona, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 8.993.341), para producir un "sobrenadante aclarado".

3. Se mezclan 10 mililitros del sobrenadante aclarado (que representan un equivalente de aproximadamente 4 gramos de heces) con tiocianato de guanidina (GTC) hasta una concentración final de 2,4 M;

4. La mezcla después se calienta en un baño de agua a 90 °C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN (y las proteínas) presentes en las heces.

5. Se añaden a la muestra partículas paramagnéticas que contienen oligonucleótidos unidos covalentemente (acoplados) complementarios con la secuencia o secuencias diana de interés ("sondas de captura específicas de diana"). La muestra después se incuba (por ejemplo, a temperatura ambiente, aproximadamente 22-25 °C) durante una hora para permitir la hibridación del ADN diana a las sondas de captura sobre las partículas magnéticas.

6. La mezcla del sobrenadante aclarado, GTC y partículas se expone a un campo magnético para separar las partículas (que ahora contienen el ADN diana hibridado con las sondas de captura) de la mezcla de sobrenadante de heces/GTC, que se traslada a un nuevo tubo. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. n.° de serie 13/089.116.

El ciclo de desnaturalización/hibridación/separación (etapas 4-6) puede repetirse, por ejemplo, al menos cuatro o más veces para extraer en serie diferentes ADN diana de la misma muestra de sobrenadante de heces.

ADN de tejido FFPE

Se aísla un ADN procedente de un tejido fijado en formol y sumergido en parafina ("formalin-fixed, paraffinembedded", FFPE) usando el kit de ADN de tejido FFPE QlAamp (Qiagen Sciences, Germantown, MD).

Aislamiento de ADN a partir de células y plasma

Para líneas celulares, el ADN genómico puede aislarse a partir de un medio acondicionado de células usando, por ejemplo, el kit de ADNcsc de plasma Maxwell® RSC (Promega Corp., Madison, Wl). Siguiendo el protocolo del kit, se usa 1 mL de medio acondicionado de células ("cell conditioned media", CCM) en lugar de plasma, y se procesa según el procedimiento del kit.

Un ejemplo de procedimiento para aislar ADN de una muestra de 4 mL de plasma es el siguiente:

• A una muestra de 4 mL de plasma se le añaden 300 pL de proteinasa K (20 mg/mL) y se mezcla.

Se añaden 3 mL de 1 mq/mL de ADN Fish a la mezcla de plasma-proteinasa K.

Se añaden 2 mL de tampón de lisis de plasma al plasma.

El tampón de lisis de plasma es:

- Tiocianato de guanidina 4,3 M

- IGEPAL CA-630 al 10 % (octilfenoxipoli(etilenoxi)etanol, ramificado)

(5,3 g de IGEPAL CA-630 combinados con 45 mL de tiocianato de guanidina 4,8 M)

Se incuban las mezclas a 55 °C durante 1 hora con agitación a 500 rpm.

Se añaden 3 mL de tampón de lisis de plasma y se mezcla.

Se añaden 200 ^mL de esferas de unión a sílice magnéticas [16 Mg de esferas/ML] y se vuelve a mezclar. Se añaden 2 mL de isopropanol al 100 % y se mezcla.

Se incuba a 30 °C durante 30 minutos con agitación a 500 rpm.

Se coloca el tubo o los tubos sobre un imán y se deja que las esferas hagan la recolección. Se aspira y se desecha el sobrenadante.

Se añaden 750 ^mL de GuHCl-EtOH al recipiente que contiene las esferas de unión y se mezcla. El tampón de lavado de GuHCl-EtOH es:

- GuHCl 3 M

- EtOH al 57 %

Se agita a 400 rpm durante 1 minuto.

Se trasladan las muestras a una placa de pocillos profundos o a tubos de microcentrífuga de 2 mL.

Se colocan los tubos sobre un imán y se deja que las esferas hagan la recolección durante 10 minutos. Se aspira y se desecha el sobrenadante.

Se añaden 1000 mL de tampón de lavado (Tris HCl 10 mM, EtOH al 80 %) a las esferas, y se incuba a 30 °C durante 3 minutos con agitación.

Se colocan los tubos sobre un imán y se deja que las esferas hagan la recolección. Se aspira y se desecha el sobrenadante.

Se añaden 500 mL de tampón de lavado a las esferas, y se incuba a 30 °C durante 3 minutos con agitación. Se colocan los tubos sobre un imán y se deja que las esferas hagan la recolección. Se aspira y se desecha el sobrenadante.

Se añaden 250 mL de tampón de lavado y se incuba a 30 °C durante 3 minutos con agitación.

Se colocan los tubos sobre un imán y se deja que las esferas hagan la recolección. Se aspira y se desecha el tampón remanente.

Se añaden 250 mL de tampón y se incuba a 30 °C durante 3 minutos con agitación.

Se colocan los tubos sobre un imán y se deja que las esferas hagan la recolección. Se aspira y se desecha el tampón remanente.

Se secan las esferas a 70 °C durante 15 minutos, con agitación.

Se añaden 125 mL de tampón de elución (Tris HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM) a las esferas, y se incuba a 65 °C durante 25 minutos con agitación.

Se colocan los tubos sobre un imán y se deja que las esferas hagan la recolección durante 10 minutos.

• Se aspira y se traslada el sobrenadante que contiene el ADN a un nuevo recipiente o tubo.

Ensayo QuARTS

La tecnología QuARTS combina un proceso de amplificación de ADN diana basado en la polimerasa con un proceso de amplificación de señal basado en una ruptura invasiva. La tecnología se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 8.361.720; la patente de EE. UU. n.° 8.715.937; la patente de EE. UU. n.° 8.916.344; y la solicitud de patente de EE. UU. n.° de serie 4/036.649. La señal de fluorescencia generada por la reacción QuARTS se controla de una manera similar a la PCR en tiempo real y esto permite la cuantificación de la cantidad de un ácido nucleico diana en una muestra.

Un ejemplo de reacción QuARTS generalmente comprende aproximadamente 400-600 nmol/l (por ejemplo, 500 nmol/l) de cada cebador y sonda de detección, aproximadamente 100 nmol/l del oligonucleótido invasivo, aproximadamente 600-700 nmol/l de cada módulo de FRET (FAM, por ejemplo, tal como lo suministra en el mercado Hologic, Inc.; HEX, por ejemplo, tal como lo suministra en el mercado BioSearch Technologies, IDT; y Quasar 670, por ejemplo, tal como lo suministra en el mercado BioSearch Technologies), 6,675 ng/pl de endonucleasa FEN-1 (por ejemplo, Cleavase® 2.0, Hologic, Inc.), 1 unidad de ADN polimerasa Taq en un volumen de reacción de 30 pl (por ejemplo, ADN polimerasa GoTaq®, Promega Corp., Madison, WI), 10 mmol/l de ácido 3-(nmorfolino)propansulfónico (MOPS), 7,5 mmol/l de MgCl², y 250 pmol/l de cada dNTP. Un ejemplo de las condiciones de ciclado de QuARTS consiste en una incubación inicial a 95 °C durante 3 minutos, seguido de 10 ciclos de 95 °C durante 20 segundos, 67 °C durante 30 segundos, y 70 °C durante 30 segundos. Después de completar los 10 ciclos, generalmente se realizan 37 ciclos más a 95 °C durante 20 segundos, 53 °C durante 1 minuto, 70 °C durante 30 segundo, y 40 °C durante 30 segundos. En algunas aplicaciones, el análisis del ciclo de cuantificación (C^q) proporciona una medición del número inicial de hebras de ADN diana (por ejemplo, número de copias) en la muestra.

Para el ensayo del ADN de heces, las sondas de captura se usan en general como se describió anteriormente para capturar fragmentos de ácido nucleico diana a partir de los sobrenadantes aclarados, como se analizó anteriormente. A continuación, se muestran ejemplos de sondas de captura, y estas generalmente comprenden un enlace modificado de amino de seis carbonos-5' (Integrated DNA Technology, Coralville, IA):

Para NDRG4:

Para KRAS:

/5AmMC6/GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3’ (SEQ ID N O : 3) y

El ADN capturado para el ensayo de la metilación se trata con bisulfito usando, por ejemplo, el kit de metilación de ADN EZ-96 (Zymo Research, Irvine CA) o usando sulfito de hidrógeno y amonio como se describe en el documento WO 2013/116375. La muestra convertida generalmente se eluye en 50 microlitros de Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0, con 20 nanogramos por microlitro de ARNt (Sigma); se ensayan 10 microlitros de ADN tratado con bisulfito con el método QuARTS en volúmenes de reacción de 30 microlitros en una placa de PCR de 96 pocillos. Las placas de PCR se ciclan en un LightCycler 480 (Roche).

El ensayo QuARTS puede dirigirse a marcadores individuales o a combinaciones multiplexadas de marcadores, y generalmente comprende además oligonucleótidos para la detección de un ácido nucleico de referencia, por ejemplo, p-actina, o los marcadores analizados en las realizaciones de la invención, a continuación. En esta realización, para cada diana que aparece a continuación, los cebadores y la sonda (Integrated DNA Technology, Coralville, IA) son los siguientes:

Para NDRG4:

Cebador 5'-CGG TTT TCG TTC GTT TTT TCG-3' (SEQ ID NO:5)

Cebador 5'-GTA ACT TCC GCC TTC TAC GC-3' (SEQ ID NO:6)

Sonda 5'-CGC CGA GGG TTC GTT TAT CG/3'C6/ (SEQ ID NO:7)

Para BMP3:

Cebador 5'-GTT TAA TTT TCG GTT TCG TCG TC-3' (SEQ ID NO:8)

Cebador 5'-CTC CCG ACG TCG CTA CG-3' (SEQ ID NO:9)

Sonda 5'-CGC CGA GGC GGT TTT TTG CG/3'C6/ (SEQ ID NO:10)

Para la ^-actina tratada con bisulfito:

Cebador 5'-TTT GTT TTT TTG ATT AGG TGT TTA AGA-3' (SEQ ID NO:52)

Cebador 5'-CAC CAA CCT CAT AAC CTT ATC-3' (SEQ ID NO:59)

Sonda 5'-CCA CGG ACG ATA GTG TTG TGG/3'C6/ (SEQ ID NO:60)

Cada ensayo, por ejemplo, en una placa de ensayo, incluye muestras de ADN tratadas con bisulfito, muestras de curva patrón, controles positivo y negativo. Las curvas patrón pueden generarse usando hebras diana cortadas a partir de plásmidos modificados, por ejemplo, de 300 a 1000 hebras. Se usa ADN metilado universal CpGenome tratado con bisulfito (Millipore, Billerica, MA) y ADN genómico humano (Merck, Alemania) con controles positivo y negativo. El número de hebras del ADN se determina comparando el C^p del gen diana con la curva patrón para el ensayo pertinente. Se determina el porcentaje de metilación para cada marcador dividiendo el número de hebras del gen metilado entre el número de hebras del ADN control (por ejemplo, p-actina, o los candidatos a marcadores de control proporcionados en la presente) y multiplicando por 100.

Mutaciones de KRAS

Se usan ensayos QuARTS para evaluar siete mutaciones en los codones 12/13 del gen KRAS. Cada ensayo de mutación se diseña como un ensayo uniplex. Las sondas y los cebadores directos específicos de mutación de KRAS son:

Para la mutación G12S:

Cebador 5'-CTT GTG GTA GTT GGA GCA A-3' (SEQ ID NO:11)

Sonda 5'-GCG CGT CCA GTG GCG TAG GC/3'C6/ (SEQ ID NO:12)

Para la mutación G12C:

Cebador 5'-AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT T-3 '(SEQ ID NO:13)

Sonda 5'-GCG CGT CCT GTG GCG TAG GC/3'C6/ (SEQ ID NO:14);

Para la mutación G12R:

Cebador 5'-TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT C-3' (SEQ ID NO:15)

Sonda 5 '-GCG CGT CCC GTG GCG TAG GC/3'C6/ (SEQ ID NO:16);

Para la mutación G12D:

Cebador 5'-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TCA-3'(SEQ ID NO:17)

Sonda 5'-GCG CGT CCA TGG CGT AGG CA/3'C6/ (SEQ ID NO:18);

Para la mutación G12V:

Cebador 5'-ACT TGT GGT AGT TGG AGC TCT-3' (SEQ ID NO:19)

Sonda 5'-GCG CGT CCT TGG CGT AGG CA/3'C6/ (SEQ ID NO:20);

Para la mutación G12A:

Cebador 5'-AAC TTG TGG TAG TTG GAG ATG C-3' (SEQ ID NO:21)

Sonda 5'-GCG CGT CCC TGG CGT AGG CA/3'C6/ (SEQ ID NO:22);

Para la mutación G13D:

Cebador 5'-GGT AGT TGG AGC TGG TCA-3' (SEQ ID NO:23)

Sonda 5'-GCG CGT CCA CGT AGG CAA GA/3'C6/ (SEQ ID NO:24)

Para todos los mutantes de KRAS, el cebador inverso usado es:

5'-CTA TTG TTG GAT CAT ATT CGT C-3' (SEQ ID NO:25)

Las condiciones de ciclado de QuARTS y las concentraciones de reactivo para KRAS son las mismas que en los ensayos de metilación. Cada placa contiene patrones fabricados con plásmidos modificados, controles positivo y negativo, y blancos de agua, y se ensaya en un LightCycler 480 (Roche) o ABI 7500 (Thermo Scientific). El número de hebras del ADN se determina comparando el Cp o CT del gen diana con la curva patrón para ese ensayo. La concentración de cada marcador de mutación en 50 microlitros de KRAS se calcula basándose en el factor de dilución de 500 veces y una eficacia de amplificación de 1,95. Este valor se divide entre la concentración de p-actina o el ZDHH en el ensayo de metilación y después se multiplica por 100 para determinar el porcentaje de mutación. En los ensayos analizados a continuación, "BTACT" se refiere a la caracterización de la p-actina en el ensayo de metilación, y "ACT" o "ACTB" se refieren a la caracterización de la p-actina en el ensayo de mutación.

Ejemplo 2: Identificación y ensayo de candidatos a genes control

Tal como se analizó anteriormente, en ciertas realizaciones, se seleccionan genes control de la tecnología según el estado de metilación. En una primera etapa, se seleccionan genes que están muy metilados en células de tejido epitelial normales y de cáncer, como candidatos a genes control. Como segunda etapa, los genes candidatos seleccionados se seleccionan para identificar genes en los que la forma metilada del gen está mínimamente presente en la sangre y en fracciones de la sangre. En realizaciones preferidas, los genes candidatos pueden analizarse aún más para seleccionar genes que tengan un contenido en GC y un contenido en metilación de CpG similar a uno o más genes marcadores que se van a analizar, de modo que los comportamientos de reactividad al bisulfito y amplificación por PCR sean similares al del gen o genes marcadores que se van a analizar.

Se identificaron a ZDHHC1, ZFAND3, ZMYM4, ODZ2 y TRIO como genes metilados que quizá serían adecuados para su uso como controles.

Estos marcadores candidatos tienen los siguientes loci (referenciados al ensamblaje GRCh37/hg19):

Huella de ZDHHC1: Cr 16, 67428559-67428628

Huella de ZMYM4: Cr 1,35877002-35877078

Huella de ZFAND3: Cr 6, 37841985-37842061

Huella de ODZ2: Cr 5, 167285650-167285775

Huella de TRIO: Cr 5, 14461291-14461417

Se seleccionaron los genes ZDHHC1, ZFAND3 y ZMYM4 para su posterior análisis, y se ensayaron usando la tecnología QuARTS para comparar la metilación de los genes en las muestras normales y de cáncer y para evaluar la presencia de los marcadores en la sangre (por ejemplo, en suero). Los oligonucleótidos usados en los ensayos se muestran esquemáticamente a continuación. La expresión "de tipo salvaje" se emplea para indicar la secuencia de los genes en ausencia de conversión con bisulfito, que no se ve afectada por el estado de metilación.

ZDHHC1 - dedo de cinc, contiene tipo DHHC, 1

Secuencia diana sin tratar:

5 '-GGGGCCGGGGCCGACAGCCCACGCTGGCGCGGCAGGCGCGTGCGCCCGCCGTTTTCGTGAGCCCGAGCAG-3 '(SEQ ID NO: 26)

Secuencia diana tratada con bisulfito:

5 '-GGGGUCGGGGUCGAUAGUUUACGUTGGCGCGGUAGGCGCGTGCGUUCGUCGTTTTCGTGAGUUCGAGUAG-

3 '

(SEQ ID NO: 33)

Secuencia diana replicada, tratada con bisulfito:

5 '-GGGGTCGGGGTCGATAGTTTACGTTGGCGCGGTAGGCGCGTGCGTTCGTCGTTTTCGTGAGTTCGAGTAG-

3 ' (SEQ ID NO: 27)

Diseño de ensayo QuARTS 1:

Diseño de ensayo QuARTS 2 (v3):

(SEQ ID NO: 31)

GCACGCAAGCAG-B r a zo 3 - 5 '

(SEQ ID NO: 27) : : : : : : : : : : : :

GGGGTCGGGGTCGATAGTTTACGTTGGCGCGGTAGGCGCGTGCGTTCGTCGTTTTCGTGAGTTCGAGTAG

« GCAAAAGCACTCAAGCT CA

(SEQ ID NO: 32)

Oligonucleótidos del ensayo QuARTS (todos se muestran de 5' a 3'):

ZFAND3 - dedo de cinc, tipo AN 1, dominio 3

Secuencia diana sin tratar:

5 ' -T C T C T G T G T A C T A A T T T C C C T T T T T G G C C G G A C G T G G T G G C T C A C G C C T G T A A T C C C A G C A C T T T G G G A G G C C A A A G -3 ' (SEQ ID NO: 37)

Secuencia diana tratada con bisulfito:

5 '-TTTTTGTGTATTAATTTTTTTTTTTGGTCGGACGTGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGTTAAAG-3 (SEQ ID NO: 38)

Diseño de ensayo QuARTS:

Oligonucleótidos del ensayo QuARTS (todos se muestran de 5' a 3'):

ZMYM4 - dedo de cinc, tipo MYM, 4

Secuencia diana sin tratar:

5 CCATCTATAGAAAAATGGATTAGGGCCGGGCACAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGG

^{c a - 3 '} (SEQ ID NO: 44)

Secuencia diana tratada con bisulfito:

5 TTATTTATAGAAAAATGGATTAGGGTCGGGTATAGTGGTTTACGTTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGTCGAGG

^{t a - 3 '} (SEQ ID NO: 45)

Diseño de ensayo QuARTS:

(SEQ ID NO: 46)

3 '-C A C C A A A T G C A A -B razo-3-5 '

. . . .. .. . .. . . (SEQ ID NO: 45)

TTATTTATAGAAAAATGGATTAGGGTCGGGTATAGTGGTTTACGTTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGTCGAGG

TA

Oligonucleótidos del ensayo QuARTS (todos se muestran de 5' a 3'):

Quasar 670 A3 módulo de FRET:

5' d Q670-TCT(I-BHQ2)AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACTCCGCGTC-C63'

(SEQ ID NO: 51)

[FP = cebador directo; RP = cebador inverso; 3' C6 = 3' hexano; 5amm6 = 5' amino; CP = sonda de captura; Q670 = tinte Quasar® 670; BHQ2 = extintor de agujero negro 2]

Usando las combinaciones de oligonucleótidos descritas anteriormente, se realiza un análisis de la metilación de los marcadores de cáncer NDRG4 y BMP3 en una diversidad de tipos de muestras diferentes (sangre, plasma, y dos líneas celulares de cáncer colorrectal humano, HT29 y HT116) usando p-actina (BTACT) para la normalización, o usando uno de los candidatos a genes control (ZDHHC1, ZMYM y ZFAND) para la normalización. Los ensayos se realizaron por duplicado como se describe en el ejemplo 1. La tabla 1 muestra los promedios de las replicaciones: Tabla 1

A partir de estos datos pueden observarse que los tres marcadores candidatos, al igual que BTACT, muestran una fuerte señal positiva en las líneas celulares de cáncer HT29 y HT116. Sin embargo, tanto ZFAND3 como ZMYM4v2, al igual que BTACT, muestran una señal significativa en muestras de sangre, como la que puede producir un fondo no deseable en muestras que contienen una cantidad de sangre presente, por ejemplo, muestras de tejidos o de heces.

Este ejemplo demuestra que ZDHHC1 tiene una señal de fondo más baja en sangre y plasma, y que puede detectarse con facilidad en líneas de células epiteliales. Se seleccionó ZDHHC1 para su posterior análisis.

Ejemplo 3: Comparación de p-actina y ZDHHC1 para ensayos de marcadores de cáncer normalizantes

Se ensayó el marcador ZDHHC1 en paralelo con BTACT para comparar estos ADN como controles para determinar el porcentaje de metilación de los genes marcadores NDRG4 y BMP3. Se caracterizó el ADN aislado a partir de muestras de tejido sumergidas en parafina y fijadas con formol, normalizándose las señales del ensayo a la p-actina o ZDHHC1. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 3.

Estos datos demuestran que el porcentaje de metilación de los marcadores NDRG4 y BMP3 con relación a ZDHHC1 es comparable al porcentaje de metilación de los mismos marcadores con relación a la p-actina, lo cual demuestra que puede usarse ZDHHC1 en lugar de la p-actina para la normalización.

Tabla 3

Tal como se muestra en la tabla 3, la comparación de los valores del porcentaje de metilación determinados usando ZDHHC1 y usando BTACT demuestra que estos controles son equivalentes en actuación en estas muestras de tejido, y que puede usarse ZDHHC1 en lugar de BTACT para medir la metilación de los genes marcadores de cáncer.

Ejemplo 4: ADN ZDHHC1 y de p-actina en muestras de tejidos normal y de cáncer

Este ejemplo describe una comparación del número de hebras de ZDHHC1 y de p-actina en una toma de muestras extendida de diferentes muestras de tejidos cancerosos y normales. Se ensayó ADN procedente de tipos de tejidos normales y anómalos, que incluyen conducto biliar, colon, esófago, cabeza, pulmón, páncreas, intestino delgado y estómago.

Se caracterizó ADN aislado a partir de muestras de tejido sumergidas en parafina y fijadas con formol, y la mediana de las señales del ensayo para la p-actina (ACTB) y ZDHHC1 se muestran en la siguiente tabla 4.

Tabla 4

Estos datos confirman que el control de ZDHHC1 metilado se detecta en todos los tipos de tejidos ensayados y en tipos de tejidos normales y no normales (por ejemplo, adenoma, carcinoma, metaplasia). Los resultados demuestran una metilación de ZDHHC1 equivalente en tejidos de cáncer y normales.

Ejemplo 5: Efecto de ZDHHC1 para ensayos de marcadores de cáncer normalizantes en muestras complejas Se realizaron otros experimentos sobre el uso de ZDHHC1 como marcador normalizante en ensayos para detectar cáncer en muestras más complejas, por ejemplo, heces, sangre, etc., y en muestras de tejido de cáncer colorrectal y normales. La tabla 5A muestra las hebras detectadas del marcador de metilación NDRG4 y para ambos ADN control, y muestra el porcentaje de metilación de NDRG4 determinado usando cada ADN control. Los datos para el marcador BMP3 detectado en las mismas reacciones de ensayo se muestran en la tabla 5B.

Tabla 5A

Tabla 5B

Estos datos demuestran que la presencia de ADN control ZDHHC1 metilado es fundamentalmente uniforme en muestras de heces procedentes de sujetos normales y positivos a cáncer colorrectal, y confirman que el marcador está sustancialmente ausente en muestras de sangre. Estos datos también confirman que la presencia de ADN ZDHHC1 es fundamentalmente equivalente al ADN de p-actina en muestras que no contienen sangre (por ejemplo, líneas celulares).

Ejemplo 6: ZDHHC1 en muestras de plasma de sujetos con cáncer metastásico

Este ejemplo describe la detección de ZDHHC1 en muestras de plasma de pacientes con cáncer metastásico. Se usaron muestras de uno a dos mililitros de plasma de sujetos normal, de pacientes con adenoma avanzado (AA) y con adenocarcinoma (ACA) en los ensayos QUARTS. Las muestras de plasma procedentes de los sujetos con cáncer de colon y de los sujetos normales se procesaron usando el kit de ácidos nucleicos circulantes Qiagen. Los volúmenes de partida del plasma variaron de 0,75-2,0 ml. El ADN se convirtió con bisulfito y se ensayó con ZDHHC1 y las mezclas de oligos BTACT. Los resultados demuestran que los niveles de hebras de ZDHHC1 fueron altos en la muestra de cáncer de estadio IV con metástasis hepática.

Todas las muestras, excepto una, no presentaron hebras del marcador ZDHHC1. Esa única muestra que muestra un gran número de hebras del marcador ZDHHC1 en plasma es una metástasis de estadio IV. Estos datos apoyan el uso de ZDHHC1 para detectar células epiteliales en sangre/plasma como marcador general para la metástasis. Los resultados se resumen en la tabla 6:

Tabla 6

*incluye una muestra no caracterizada según el estadio.

En otro estudio de dos muestras de AA, ocho muestras de ACA, de las cuales dos fueron clasificadas como estadio IV con metástasis observada, y 34 muestras normales, se detectó una del estadio IV, que muestra una proporción significativamente elevada de ZDHHC1/BTACT (41 %) y una que parecía tener una proporción normal de ZDHHC1/BTACT (4,3 %). Ninguna de las demás muestras mostró una proporción elevada de ZDHHC1/BTACT. Ejemplo 7; ZDHHC1 en muestras de plasma de sujetos con cáncer

Se midieron los niveles en plasma de ZDHHC1 en otro conjunto de muestras de pacientes que comprendía 57 muestras de pacientes con cáncer y 52 muestras normales, como se detalla en las figuras 4A-4E. Se extrajo ADN de 4 ml de plasma y se convirtió con bisulfito. El ADN de ZDHHC1 se preamplificó durante 10 ciclos, después se detectó usando un ensayo de flap QuARTS como se describió en el ejemplo 1, usando los cebadores y las sondas descritas en el ejemplo 2. Los resultados se muestran en la tabla de la figura 4A- 4E, y el promedio de los datos para cada tipo de muestra es el siguiente:

Muestra Diagnóstico Copias de ZDHHC1

Plasma Colonoscopia normal Prom. de copias = 11

Plasma Cáncer páncr. Prom. de copias = 1.041

Plasma Cáncer de intestino delgado Prom. de copias = 12.001 (1 muestra) Plasma Cáncer de pulmón Prom. de copias = 300

Plasma Cáncer colorrectal Prom. de copias = 459

Ejemplo 8: Detección de ZDHHC1 para controlar el estado y/o progresión de la enfermedad

Se pueden analizar muestras de pacientes, por ejemplo, muestras de productos sanguíneos, tales como muestras de plasma, para detectar la presencia de células epiteliales o de ADN de células epiteliales como un medio para controlar un estado de enfermedad, por ejemplo, la aparición, la progresión, la respuesta a la terapia, la postcirugía, la remisión, la recurrencia, etc. En algunas realizaciones, se toman muestras de un paciente en múltiples momentos, y se mide la cantidad de ADN ZDHHC1 presente (libre o en células circulantes o en complejos) en cada momento, y se comparan las cantidades de ADN ZDHHC1 en las muestras tomadas en los diferentes momentos para evaluar los cambios en el estado de enfermedad.

En un primer momento, se toma una muestra de sangre de un paciente y se prepara una muestra de plasma.

En un segundo momento, se toma una segunda muestra de sangre de un paciente y se prepara una segunda muestra de plasma.

Se ensaya la muestra de sangre completa para ADN ZDHHC1 o la muestra se procesa aún más para producir una fracción de plasma.

Cada muestra de plasma se ensaya para la presencia y la cantidad de ADN ZDHHC1, por ejemplo, usando los métodos descritos en los anteriores ejemplos 1 y 6. Se contempla que, en algunas realizaciones, la primera muestra no se ensaye inmediatamente (por ejemplo, la sangre o el plasma, o el ADN aislado a partir de estos, se conserva para un ensayo posterior), y la primera y la segunda muestra se ensayan al mismo tiempo. En otras realizaciones, la primera muestra de plasma se ensaya antes de la recolección de la segunda muestra de sangre, y los resultados se almacenan para su comparación posterior.

La tecnología no se limita a un acontecimiento o curso de acción concretos que se produzcan entre el primer y el segundo momento. Por ejemplo, el primer momento puede ser un momento en que no exista sospecha de enfermedad, por ejemplo, el primer ensayo puede realizarse para establecer una línea de base en previsión de controlar al sujeto para una futura aparición de la enfermedad. Como alternativa, el primer momento puede ser un momento en que una afección o enfermedad pueda estar presente en el sujeto, pero el estado de enfermedad es un estado que se prefiere controlar a lo largo de una intervención terapéutica activa como un curso de acción, por ejemplo, el estado de enfermedad puede controlarse para detectar cambios, tales como metástasis. En otras situaciones, puede administrarse una terapia activa, por ejemplo, cirugía, terapia con fármacos, etc., al sujeto entre los dos momentos, y la medición del ADN de células epiteliales en la sangre puede usarse para controlar la eficacia de la terapia.

Diversas modificaciones y variaciones de las composiciones, métodos y usos de la tecnología descritos serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y del espíritu de la tecnología tal como se ha descrito.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1 Un método para caracterizar sangre o un producto sanguíneo, que comprende:

   a) proporcionar una muestra de sangre o de un producto sanguíneo, preferiblemente una muestra de plasma, procedente de un sujeto;

   b) ensayar dicha muestra para detectar la presencia de ADN específico de células de un tejido, preferiblemente ADN específico de células epiteliales,

   en el que la presencia de dicho ADN específico de células de un tejido es indicativa de la presencia de células del tejido en dicha muestra de sangre o de producto sanguíneo,

   comprendiendo dicho método:

   i) tratar un ADN procedente de dicha muestra de sangre o de producto sanguíneo con un reactivo de bisulfito para producir ADN ZDHHC1 convertido con bisulfito;

   ii) amplificar una región de dicho ADN ZDHHC1 convertido con bisulfito usando una pareja de cebadores complementarios con SEQ ID NO:27 o su complemento;

   en el que la amplificación de dicha región es indicativa de la presencia de ADN específico de células de un tejido en la muestra de sangre o de un producto sanguíneo,
2. 2. - El método de la reivindicación 1, en el que dicho ADN específico de células epiteliales comprende un ADN que está metilado en las células epiteliales y no está metilado en las células sanguíneas.
3. 3. - El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el ADN específico de tejido se trata con dicho reactivo de bisulfito para crear ADN específico de células de un tejido convertido.
4. 4. - El método de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha pareja de cebadores se selecciona de cebadores que tienen secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:29, 30 y 32.
5. 5. - Un método para controlar un estado de enfermedad en un sujeto, preferiblemente cáncer en el sujeto, más preferiblemente cáncer metastásico en el sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de:

   a) obtener una primera muestra de un producto sanguíneo, preferiblemente una muestra de plasma, procedente del sujeto en un primer momento;

   b) obtener una segunda muestra de un producto sanguíneo procedente del sujeto en un segundo momento; y c) ensayar dicha primera muestra de producto sanguíneo y dicha segunda muestra de producto sanguíneo para determinar una cantidad de un ADN específico de células epiteliales que comprende ADN ZDHHC1, preferiblemente ADN específico de células epiteliales que está metilado en células epiteliales y no está metilado en células sanguíneas, más preferiblemente ADN que comprende ADN ZDHHC1, comprendiendo dicho ensayo:

   i) tratar dicho ADN procedente de dicha muestra de sangre o de producto sanguíneo con un reactivo de bisulfito para producir ADN ZDHHC1 convertido con bisulfito;

   ii) amplificar una región de dicho ADN ZDHHC1 convertido con bisulfito usando una pareja de cebadores complementarios con SEQ ID NO:27 o su complemento;

   en el que una diferencia en la cantidad de ADN específico de células epiteliales entre dicha primera muestra de producto sanguíneo y dicha segunda muestra de producto sanguíneo es indicativa de un cambio en el estado de enfermedad de dicho sujeto.
6. 6. - El método de la reivindicación 5, en el que una diferencia en la cantidad de ADN específico de células epiteliales entre dicha primera muestra de producto sanguíneo y dicha segunda muestra de producto sanguíneo es indicativa de la recurrencia, la progresión o la regresión del estado de enfermedad en dicho sujeto.
7. 7. - El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que dicha pareja de cebadores se selecciona de cebadores que tienen secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:29, 30 y 32.
8. 8. - Un kit, que comprende:

   a) al menos un oligonucleótido, en el que al menos una porción de dicho oligonucleótido se hibrida específicamente con ADN ZDHHC1 convertido con bisulfito,

   en el que dicho al menos un oligonucleótido comprende una pareja de cebadores complementarios con SEQ ID NO:27 o su complemento;

   b) opcionalmente, uno o más ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con uno o más genes diana o marcadores; y

   c) un reactivo de bisulfito.
9. 9. - El kit de la reivindicación 8, que comprende además uno o más de:

   - un soporte sólido, preferiblemente una esfera magnética;

   - uno o más reactivos de captura, preferiblemente oligonucleótidos complementarios con ADN ZDHHC1 o dichos uno o más genes diana.
10. 10. - El kit de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que dicha pareja de cebadores se selecciona de cebadores que tienen secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:29, 30 y 32.
11. 11. - Una composición, que comprende:

    i) un complejo de un ácido nucleico ZDHHC1, preferiblemente un ácido nucleico ZDHHC1 convertido con bisulfito, y ii) al menos un oligonucleótido, en el que al menos una porción de dicho oligonucleótido se hibrida con dicho ácido nucleico ZDHHC1,

    en la que dicho al menos un oligonucleótido comprende una pareja de cebadores complementarios con SEQ ID NO:27 o su complemento.
12. 12. - La composición de la reivindicación 11, en la que dicha pareja de cebadores se selecciona de cebadores que tienen secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:29, 30 y 32.
13. 13. - La composición de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que dicha composición comprende además una o más mezclas de reacción que comprenden un complejo de un ácido nucleico diana y uno o más oligonucleótidos que se hibridan específicamente con dicho ácido nucleico diana.
14. 14. - Una composición, que comprende:

    i) una hebra de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:27,

    ii) una pareja de cebadores complementarios con SEQ ID NO:27 o su complemento, en la que preferiblemente dicha pareja de cebadores se selecciona de cebadores que tienen secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:29, 30 y 32; y que preferiblemente comprende además:

    iii) un oligonucleótido de sonda de detección que comprende una región que es complementaria con una porción de dicha hebra de ADN.
15. 15. - La composición de la reivindicación 14, que comprende además uno o más de un módulo de FRET, una endonucleasa FEN-1, y una ADN polimerasa termoestable.