ES2879322T3

ES2879322T3 - Cepa de Pseudomonas putida

Info

Publication number: ES2879322T3
Application number: ES18716220T
Authority: ES
Inventors: Sanchez José Manuel Lara; Castillo Carolina Fernandez
Original assignee: Futureco Bioscience SA
Current assignee: Futureco Bioscience SA
Priority date: 2017-04-06
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2021-11-22
Anticipated expiration: 2038-04-04
Also published as: US20200178541A1; WO2018185139A1; MA49037A; EP3607048A1; US11332709B2; EP3385370A1; EP3607048B1; MA49037B1; JP2020515273A; JP7049689B2

Abstract

Una cepa de Pseudomonas putida depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de registro CECT8538, o una mutante de la misma, en donde dicha cepa mutante se obtiene usando la CECT8538 de Pseudomonas putida y mantiene las siguientes características de la cepa de partida: - actividad antagonista de la cepa de partida contra Erwinia carotovora subsp atroseptica, Botrytis aclada, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum coccodes, Fusarium oxysporum y Alternaria porri; y; - habilidad de colonizar o sobrevivir en una parte aérea o en las raíces de una planta.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepa de Pseudomonas putida

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de los productos fitosanitarios, específicamente a una nueva cepa de Pseudomonas putida y a su uso en el control biológico de enfermedades fúngicas y bacterianas en cultivos de interés agrícola.

Técnica anterior

Actualmente, el control de las enfermedades infecciosas de las plantas ha centrado su atención en minimizar el impacto conocido que tienen los fungicidas y bactericidas sobre la salud del consumidor y el medio ambiente. Por esa razón, se observa un cambio hacia un uso racional de este tipo de productos y una aplicación de métodos que sean menos tóxicos.

Aunque se considera que los antibióticos son los productos fitosanitarios con mayor eficacia en el control de enfermedades bacterianas en las plantas, su uso prolongado favorece la generación de cepas resistentes, lo que compromete su eficacia. Asimismo, la resistencia a los antibióticos generada en estas cepas se puede transferir a otras bacterias, incluidos los patógenos humanos. Este hecho explica la prohibición de su uso en la agricultura en muchos países, incluida la Unión Europea. Una alternativa a los antibióticos son los antimicrobianos de amplio espectro, como los compuestos a base de cobre, pero en este caso tienen una eficacia limitada y un impacto ambiental adverso debido a su toxicidad y acumulación en el medio ambiente.

En el estado actual de la técnica, se han descrito cepas de bacterias no patógenas transmitidas por el suelo con habilidad de antagonizar fitopatógenos fúngicos y bacterianos, como una alternativa a los plaquicidas químicos. Sin embargo, estas cepas bacterianas tienen algunos inconvenientes. Ejemplos de ello son la producción de metabolitos secundarios tóxicos y la falta de una idoneidad ecológica adecuada para la colonización de plantas; o cierta inestabilidad con el paso del tiempo, lo que dificulta la formulación de estas cepas en composiciones de periodo de validez prolongado.

Además de lo anterior, en algunos casos se ha indicado que estas cepas bacterianas tienen dificultades para colonizar y sobrevivir eficazmente en los órganos del hospedador infectado, lo que requiere la aplicación de altas concentraciones o formulaciones complejas para obtener un efecto significativo del control de las enfermedades. Es más, el hecho de que participen organismos vivos significa que, aunque tienen ventajas sobre otros plaguicidas sintéticos, las condiciones ambientales y del hospedador afectan a su actividad biológica, haciendo que su efectividad sea generalmente variable y significativamente más baja que la de los productos químicos de referencia. Asimismo, en los últimos años, para impedir la aparición de resistencias en cepas patógenas para seres humanos o animales, las bacterias productoras de antibióticos utilizadas como ACB (agentes de control biológico) se han reducido En el estado de la técnica se conocen varias cepas de Pseudomonas putida, útiles como agente de control biológico (por ejemplo, de los documentos WO 2013/150422, EP 1241247 y WO 99/05257).

En vista de lo anterior, a pesar de los trabajos realizados, sigue existiendo la necesidad de cepas bacterianas que superen total o parcialmente las limitaciones mostradas por las cepas ya conocidas en el estado de la técnica en el control de la fitopatología (enfermedades de las plantas).

Sumario de la invención

Los inventores han aislado una nueva cepa de la especie Pseudomonas putida, aislada en Gavá (Barcelona, noreste de España), que se caracteriza por tener un amplio espectro de actividad, controlando así varios patógenos fúngicos y bacterianos, en una amplia gama de pH del suelo.

Como se ilustra a continuación, la cepa de la invención se caracteriza por mostrar una actividad antagonista contra cepas fúngicas de Botrytis aclada, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum coccodes, Fusarium oxysporum, Alternaria porri, y contra la cepa bacteriana de Erwinia carotovora subsp. atroseptica (FIG. 2 y Tablas 4 y 5). Los presentes inventores también han descubierto que la cepa de la invención es capaz de inhibir las infecciones causadas por Erwinia carotovora subsp. atroseptica en plantas en condiciones de cultivo (Tabla 4).

La cepa de la invención presenta actividades de leucina arilamidasa y fosfatasa alcalina, ambas con un impacto beneficioso sobre el crecimiento, desarrollo y reproducción de las plantas. La leucina arilamidasa libera aminoácidos de compuestos poliméricos de elevada masa molecular proporcionando una fuente de nitrógeno orgánico disuelto que es un nutriente esencial para la planta. Asimismo, la actividad de fosfatasa alcalina juega un papel importante en la solubilización de los fosfatos unidos, poniéndolos a disposición de las plantas y también ayudando a su crecimiento y desarrollo.

En cuanto a la actividad de control biológico de la cepa de la invención, como se comentó anteriormente, tiene la capacidad de antagonizar diferentes agentes fitopatógenos. En este contexto, como se ilustra en la Tabla 5, la cepa de la invención puede antagonizar más eficazmente el crecimiento del hongo Botrytis aclada que otras cepas de P. putida, teniendo un efecto superior y duradero. Por tanto, a partir de los datos que se indican a continuación, también se puede llegar a la conclusión de que la efectividad de la cepa de la invención puede permitir su uso en concentraciones más bajas para alcanzar la actividad de control biológico. Esto puede dar lugar a ventajas en la formulación de diferentes composiciones que comprenden la cepa de la invención, así como una reducción de costes relacionados con su producción industrial.

La actividad antagonista de la cepa de la invención puede deberse en parte a la expresión de enzima esterasa (C4) (Tabla 3), que se ha relacionado con la capacidad de control biológico debido a su actividad desintoxicante de algunas fitotoxinas microbianas, inhibiendo la entrada de hongos en las células vegetales y/o suscitando las respuestas de defensa de las plantas.

A pesar de la alta capacidad antagonista de la cepa de la invención, se ha descubierto sorprendentemente que la cepa de la invención no expresa ni sintetiza los compuestos antimicrobianos pirrolnitrina, 2,4-diacetilfloroglucinol (2,4-DAPG), pioluteorina y piocianina como se describe en los ejemplos 4 A y B. Estos metabolitos son conocidos por ser los compuestos antimicrobianos más comunes producidos por Pseudomonas spp. y están implicados en la aparición de resistencia en cepas patógenas para seres humanos o animales. Por tanto, la falta de expresión de estos metabolitos por la cepa de la invención la confiere un perfil más seguro.

Es más, la cepa de la invención tiene la habilidad de colonizar y sobrevivir en suelos con pH entre 4 y 10 (Tabla 2). El intervalo de pH de los suelos, puede variar desde ultra ácido, que son suelos que tienen un pH inferior a 3,5, a suelos muy fuertemente alcalinos, que tienen pH superiores a 9. El crecimiento de las plantas depende de la disponibilidad de micronutrientes y macronutrientes. El pH del suelo tiene un claro impacto en la disponibilidad de nutrientes. Esta es la razón por la que hay algunas especies que pueden crecer en algunos suelos y otras que no dependiendo de sus requisitos de crecimiento. Por otro lado, los expertos en la técnica reconocen bien que las condiciones ambientales, tales como el pH, pueden afectar negativamente a la viabilidad/actividad de un microorganismo particular. Los inventores han descubierto sorprendentemente que la cepa de la invención puede sobrevivir a valores de pH muy extremos, entre 4 y 10. Es decir, la eficacia de la cepa de la invención no se ve afectada negativamente por el pH del suelo, lo cual es una valiosa ventaja adicional porque significa que la cepa de la invención puede ejercer su función en cualquier tipo de cultivo de plantas.

En conjunto, los datos aquí proporcionados permiten llegar a la conclusión de que la cepa de la invención es una cepa segura y versátil que puede ejercer de manera eficaz su acción como plaguicida independientemente de la naturaleza del suelo, a diferencia de otras cepas de P. putida.

Por tanto, la presente invención proporciona, en un primer aspecto, una cepa de Pseudomonas putida depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de registro CECT8538, o una mutante de la misma, en donde dicha cepa mutante se obtiene usando la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida y también conserva las siguientes características de la cepa de partida: (a) actividad antagonista de la cepa de partida contra Erwinia carotovora subsp atroseptica, Botrytis aclada, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum coccodes, Fusarium oxysporum y Alternaría porri y (b) habilidad de colonizar o sobrevivir en una parte aérea o en las raíces de una planta.

La cepa de Pseudomonas putida de la invención, aislada de suelo en Gavá (Barcelona, noreste de España), fue depositada por el solicitante, según el Tratado de Budapest, el 21 de enero de 2014 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), ubicada en la Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia, España. La cepa recibió el número de registro CECT8538 después de considerarla como una cepa viable.

Por tanto, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso de la cepa CECT8538 de P. putida o una mutante de la misma como se define en el primer aspecto de la invención, como un plaguicida.

En cuanto a su uso como un plaguicida en plantas, es importante obtener grandes cantidades de células viables de la cepa. Como se muestra en el Ejemplo 5, una vez concentrada y liofilizada, la composición muestra> 90 % de viabilidad celular, que se mantiene conserva el almacenamiento.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un proceso para obtener una suspensión celular viable procedente de la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida o de una mutante de la misma como se define en el primer aspecto de la invención, comprendiendo el proceso: (i) inocular la cepa en un medio de cultivo, (ii) someter el medio de cultivo inoculado de la etapa (i) a condiciones adecuadas para el crecimiento de la cepa, y (iii) someter opcionalmente el medio resultante de la etapa (ii) a una etapa de concentración.

En un cuarto aspecto, la divulgación proporciona un extracto acelular procedente de la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida o de una mutante de la misma como se define en el primer aspecto de la invención, pudiendo obtenerse dicho extracto mediante un proceso que comprende: (i) inocular la cepa en un medio de cultivo adecuado; (ii) someter el medio de cultivo inoculado a condiciones de crecimiento adecuadas; (iii) separar las células del medio de cultivo de la etapa (ii); (iv) recoger el extracto acelular; y (v) opcionalmente someter el extracto acelular a una etapa de concentración.

Como alternativa, una vez inoculada la cepa y sometiéndola a condiciones de crecimiento adecuadas, el producto de inoculación resultante puede someterse a una etapa de inactivación del microorganismo.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un producto de inoculación que comprende la cepa de la invención inactivada.

El producto de inoculación del quinto aspecto de la invención puede ejercer el efecto antagonista debido a la secreción, durante la etapa de crecimiento, de los metabolitos responsables de ese efecto.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida o una mutante de la misma como se define en el primer aspecto de la invención, o un producto de inoculación como se define en el quinto aspecto, y uno o más compuestos agrícolamente aceptables.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona el uso de la cepa de la invención o una mutante de la misma como se define en el primer aspecto de la invención, o el producto de inoculación como se define en el quinto aspecto de la invención, o una composición como se define en el sexto aspecto de la invención como un plaguicida.

Por último, en un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para controlar una infección causada por un patógeno bacteriano o fúngico en una planta, que comprende administrar a la planta, la cepa de la invención o una mutante de la misma como se define en el primer aspecto, el producto de inoculación como se define en el quinto aspecto o la composición como se define en el sexto aspecto.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1. La cepa CECT8538 tiene capacidad de enjambre a 28 °C. Imágenes representativas de P. putida CECT8538 incubada con M9 o BM2 a 28 °C (derecha) o a 37 °C (izquierda) durante 30 h.

FIG 2. La cepa CECT8538 tiene actividad antifúngica. Imágenes representativas de hongos fitopatógenos que crecen en APD que contiene dos dosis de P. putida CECT8538 en comparación con APD solo como control. A: B. aclada CECT 2851, B: R. solani DSMZ 63010, C: P. ultimum CECT 20902, D: S. sclerotiorum CECT 2822, E: S. esclerotiorum cepa H24, F: C. coccodes cepa H827, G: F. oxysporum cepa H828 y H: A. porri cepa H830.

FIG 3. Cinética del crecimiento fúngico de Botryis aclada expuesta o no a las cepas de P. putida indicadas. El gráfico muestra el % de inhibición del crecimiento de B. aclada creciendo en APD (control; rombos), APD inoculado con CECT8538 (cuadrados), APD inoculado con CECT324 (triángulos) y APD inoculado con DSM6125 (cruces) a los 3, 7 y 10 días después de la inoculación.

Descripción detallada de la invención

Todos los términos que se utilizan en la presente solicitud, a menos que se indique otra cosa, se entenderán en su significado habitual como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas de determinados términos y expresiones que se utilizan en la presente solicitud, son como se exponen a continuación y se pretende que se apliquen de manera uniforme a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones a menos que una definición expuesta expresamente de otro modo proporcione una definición más amplia.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una cepa de Pseudomonas putida depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de registro CECT8538, o a una cepa mutante de la misma.

Por el término "mutante" se entiende una bacteria que se obtiene usando, como material de partida, la cepa CECT8538 de P. putida de la invención, y que conserva las propiedades de dicha cepa depositada, con respecto a su actividad antagónica y a la habilidad de colonizar o sobrevivir en una parte de una planta.

La actividad antagonista contra diferentes fitopatógenos se puede analizar a través de diferentes métodos. Estos métodos se basan comúnmente en el análisis de la capacidad de crecimiento de los patógenos en contacto con el principio activo o el ACB, o en la evaluación de la gravedad de la enfermedad causada por la infección del patógeno después de la exposición al principio activo o al ACB. Algunos protocolos habituales para valorar esta actividad son, entre otros, la técnica de los alimentos envenenados y el análisis de la gravedad de la podredumbre blanda bacteriana. Resumiendo, la técnica de los alimentos envenenados consiste en la generación de una placa de agar, patata y dextrosa, que contiene el agente de control biológico, en la exposición de esta placa a un cultivo de micelio previamente preparado de las cepas patógenas, y en la evaluación del crecimiento de las cepas patógenas a lo largo del tiempo. En el caso del análisis de la gravedad de la podredumbre blanda bacteriana, el protocolo consta de las siguientes etapas: (i) desinfección y siembra de semillas; (ii) permitir el crecimiento de las plántulas durante 4 semanas; (iii) exponer la planta resultante a la cepa patógena; (iv) incubar la planta con el agente de control biológico; y (v) evaluar la gravedad de la enfermedad después de una incubación adicional durante 4 semanas. Más adelante, en los Ejemplos 6 A-C, se muestra la capacidad de la cepa de la invención para antagonizar diferentes agentes fitopatógenos. La FIG.

2 y las Tablas 4 y 5 ilustran que la cepa de la invención no solo puede antagonizar diferentes cepas de hongos de manera más eficaz que otras cepas de P. putida, sino que también es eficaz contra el crecimiento de bacterias, tales como Erwinia carotovora subsp. atroseptica en condiciones de cultivo. La capacidad de colonización es necesaria para que un ACB realice correctamente su función. Esta capacidad se puede estudiar usando varias técnicas que comprenden el ensayo de enjambre, o ensayos funcionales tales como la evaluación de la actividad antagonista en condiciones similares a las de un cultivo. Para evaluar la movilidad de enjambre, las cepas bacterianas se siembran en placas en medios específicos (M9 o BM2) y se incuban durante la noche a una temperatura deseada. Después de la incubación, se analiza el movimiento multicelular de la superficie por las bacterias. Asimismo, relacionado con la capacidad de colonizar, hay otras capacidades también implicadas en la adaptación a diferentes condiciones ambientales, tales como las tolerancias de pH y temperatura. En este contexto, la cepa de la invención muestra la habilidad de colonizar diferentes sustratos a 26 °C (FIG 1), así como la habilidad de actuar contra una infección bacteriana cuando se aplica a la planta infectada (Tabla 4), pudiendo sobrevivir en un amplio intervalo de pH, de 4 a 10 (Tabla 2).

Un "mutante" de CECT8538 de P. putida, también se entiende como una "variante" de CECT8538 de P. putida. Los expertos en la técnica entenderán que los mutantes que conservan las características y ventajas relevantes descritas en el presente documento se pueden obtener habitualmente, por ejemplo, por mutagénesis espontánea o mutación dirigida, usando la cepa de la invención como material de partida. En la técnica se conocen métodos para obtener mutantes de una cepa bacteriana específica. Un ejemplo se puede encontrar en Sambrook, J. y Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Capítulo 13, "Mutagenesis", Cold Spring Harbor, 3a ed, 2001.

De ahora en adelante, cuando en la presente invención se hace referencia a la expresión "cepa de la invención", esta abarca la cepa CECT8538 de P. putida y sus mutantes.

La planta puede ser un tubérculo, como patatas, o un árbol, en particular, un árbol frutal, como un peral, tomate, coliflor o pimiento, entre otras.

Por tanto, en el presente documento, las expresiones "control de plagas" y "control biológico de plagas", se usan indistintamente y se refieren al control integrado de plagas.

En vista de lo anterior, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de la cepa CECT8538 de P. putida o de una mutante de la misma, como un plaguicida en plantas.

En la presente invención, el término "plaguicida" se entiende por su significado habitual en el campo de la agronomía como un producto destinado a destruir, repeler, regular o interrumpir el crecimiento de organismos vivos que se consideran plagas. Claramente, debido a la naturaleza de la cepa CECT8538 de P. putida o mutante de la misma, en el presente documento se entiende que "plaguicida " es un plaguicida biológico o ecológico (orgánico), denominado también bioplaguicida. En el alcance de la presente invención, el término "plaguicida" tendría el mismo significado que el término "fitosanitario".

En la presente invención, la expresión "control de la enfermedad" significa que previene, reduce, cura o erradica la enfermedad.

En una realización del segundo aspecto de la invención, la cepa se usa para prevenir infecciones causadas por bacterias u hongos en las plantas.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un proceso para obtener una suspensión celular viable procedente de la cepa de la invención que comprende: (i) inocular la cepa de la invención en un medio de cultivo adecuado, (ii) someter el medio de cultivo inoculado de la etapa (i) a condiciones apropiadas para el crecimiento de la cepa, y (iii) someter opcionalmente el medio resultante de la etapa (ii) a una etapa de concentración.

La expresión "procedente de la cepa de la invención" significa que la suspensión se obtiene a partir de la cepa objeto de la presente invención.

La cepa de la invención puede inocularse en el medio de cultivo a una concentración final comprendida entre el 5 y el 7 % v/v. Preferentemente, el cultivo inoculado se encuentra en una fase de crecimiento exponencial. El crecimiento celular se ralentizará al alcanzar, preferentemente, una concentración celular comprendida entre 1,0x109 y 1,0x1010 UFC/ml. Los medios de cultivo adecuados para el crecimiento de la cepa de la invención son medios sintéticos, tales como LB (del inglés lysogenic broth, caldo lisogénico) y PM (saline production médium, medio de producción salino), o medios de origen vegetal tales como melaza (por ejemplo, de caña de azúcar, remolacha y otros). Las condiciones adecuadas para el crecimiento de la cepa son temperaturas comprendidas entre 25 y 35 °C, un pH comprendido entre 6 y 8 y una concentración de oxígeno comprendida entre 50 y 100 %. El crecimiento de la cepa de la invención se produce mediante agitación. En el Ejemplo 5 se refleja un ejemplo del método detallado para obtener células de la cepa de la invención.

En otra realización del proceso para la obtención de la suspensión, las células se separan del medio para obtener una suspensión concentrada. Las técnicas de separación adecuadas incluyen centrifugación o filtración del cultivo. Al realizar la centrifugación del cultivo, por ejemplo, a un mínimo de 5000 rpm, las células se obtienen en el sedimento, que se resuspende en parte del medio de cultivo o en un medio tamponado adecuado, de modo que la concentración de la cepa sea de aproximadamente 1x1011 UFC/ml.

Una vez obtenida la suspensión, ésta puede someterse a una etapa de deshidratación. La deshidratación se puede realizar mediante un proceso de liofilización. Como alternativa, la suspensión se puede deshidratar mediante secado en lecho fluidizado. Otra opción es deshidratar la suspensión mediante secado por pulverización o secado en un horno al vacío. En este sentido, otra característica ventajosa de la cepa de la invención es que presenta una alta resistencia a los procesos de deshidratación, que son habituales en la obtención de microorganismos a escala industrial. Para mejorar la viabilidad celular, se puede añadir un ingrediente protector osmótico inerte a la suspensión antes de llevar a cabo el proceso de deshidratación.

En otra realización del tercer aspecto de la invención, el proceso comprende resuspender las células resultantes de la etapa de separación en un tampón adecuado para producir una suspensión concentrada de células.

En un cuarto aspecto, la divulgación proporciona un extracto acelular procedente de la cepa CECT8538 de P. putida o de una mutante de la misma, como se define en el primer aspecto de la invención, pudiendo obtenerse dicho extracto mediante un proceso que comprende: (i) inocular la cepa en un medio de cultivo adecuado; (ii) someter el medio de cultivo inoculado a condiciones de crecimiento adecuadas; (iii) separar las células del medio de cultivo de la etapa (ii); (iv) recoger el extracto acelular; y (v) opcionalmente someter el extracto acelular a una etapa de concentración. El medio acelular obtenido mediante los procesos de separación descritos anteriormente, podría usarse y/o introducirse en una formulación apropiada directamente o someterse a una etapa de concentración para alcanzar una composición más adecuada. Por tanto, en una realización del cuarto aspecto, la divulgación se refiere a diferentes protocolos para concentrar el extracto acelular que se puede usar, tales como deshidratación, filtración, ultrafiltración, centrifugación, ultracentrifugación, precipitación o cromatografía.

En otro aspecto de la invención, la invención proporciona en un quinto aspecto un producto de inoculación que comprende la cepa de la invención.

Por "producto de inoculación" se entiende un producto obtenido después de inocular la cepa en un medio de cultivo adecuado, sometiendo el medio de cultivo inoculado a condiciones de crecimiento adecuadas.

En una realización del quinto aspecto de la invención, el producto de inoculación está en forma concentrada. En otra realización, el producto de inoculación está en forma concentrada seca. Las técnicas para concentrar y secar el producto de inoculación son habituales y se han proporcionado anteriormente.

En otra realización del quinto aspecto de la invención, el producto de inoculación comprende la cepa de la invención inactivada.

Por "producto de inoculación que comprende la cepa de la invención inactivada" se refiere a un producto obtenido después de inocular la cepa en un medio de cultivo adecuado, someter el medio de cultivo inoculado a condiciones de crecimiento adecuadas y después, inactivar la cepa. El término "inactivado" significa que el microorganismo no puede formar colonias. En una realización, los microorganismos inactivados tienen la membrana celular intacta o rota. En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende la cepa como se define en el primer aspecto de la invención, o un producto de inoculación como se define en el quinto aspecto, y uno o más compuestos agrícolamente aceptables. Con miras a un uso práctico en el control de plagas, los agentes plaguicidas se formulan normalmente en composiciones que también incluyen aditivos adecuados para su uso agrícola. Las composiciones de la invención pueden ser sólidas (incluyendo, por ejemplo, concentrado de bacterias deshidratadas) o líquidas (incluyendo suspensiones concentradas de bacterias).

"Compuestos agrícolamente aceptables" se refiere a aquellos compuestos y/o materiales, que son adecuados para su uso en agricultura. En general, dichos compuestos no deberían ser tóxicos para los seres humanos y, preferentemente, deberían ser respetuosos con el medio ambiente.

En una realización particular del sexto aspecto de la invención, las composiciones plaguicidas de la invención pueden contener compuestos para mejorar la adherencia de las cepas en las plantas a tratar, así como compuestos fitofortificantes, nutrientes, agentes humectantes, estabilizantes, protectores osmóticos, antioxidantes, protectores solares, compuestos tamponantes o combinaciones de los mismos.

En otra realización del sexto aspecto de la invención, son ejemplos de productos de adhesión la gelatina, el almidón, las pectinas, los alginatos y varios tipos de gomas tales como el xantano. Muchos de estos compuestos también son agentes humectantes. En el caso de los protectores solares, pueden usarse emulsiones de cera, rojo Congo y carbonato de calcio. Los fitofortificantes son compuestos que pueden facilitar que los cultivos desarrollen fortaleza o tolerancia contra patógenos o condiciones ambientales adversas, por ejemplo, análogos del ácido jasmónico y algunos estimulantes de las defensas de las plantas tales como harpinas, quitosanos y laminarinas. Asimismo, son ejemplos de protectores osmóticos la trehalosa, las betaínas y los aminoácidos. Por último, el ácido ascórbico y el glutatión se incluyen entre los antioxidantes.

En una realización adicional del sexto aspecto de la invención, la composición comprende al menos un agente plaguicida adicional, dicho plaguicida adicional no afecta negativamente a la actividad de la cepa CECT8538. En otra realización del sexto aspecto de la invención, el agente plaguicida adicional se selecciona del grupo que consiste en una cepa bacteriana eficaz para controlar una infección bacteriana o fúngica, un fungicida, un bactericida, un herbicida, un insecticida o un nematicida.

Las composiciones del sexto aspecto de la invención se pueden preparar mediante protocolos habituales, tal como mezclando los diferentes ingredientes.

En un séptimo aspecto, la invención se dirige al uso de la cepa de la invención como se define en el primer aspecto de la invención, o al producto de inoculación como se define en el quinto aspecto de la invención, o a las composiciones como se definen en el sexto aspecto de la invención, como un plaguicida en plantas.

En otra realización del séptimo aspecto de la invención, la invención se refiere al uso de las composiciones del sexto aspecto para controlar enfermedades causadas por patógenos fúngicos o bacterianos en las plantas.

En otro aspecto, la invención proporciona un método que comprende administrar la cepa de la invención o sus mutantes, como se define en el primer aspecto, o el producto de inoculación definido en el quinto aspecto, o las composiciones definidas en el sexto aspecto, a la parte afectada de la planta y/o la semilla, o al sustrato o suelo que se usa para el cultivo de dicha planta, para prevenir, curar, reducir o erradicar una enfermedad causada por una infección bacteriana o fúngica.

A lo largo de la descripción y en las reivindicaciones, la palabra "comprende" y variaciones de la misma, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Es más, la palabra "comprende" abarca el caso de "consiste en". Objetos, ventajas y características adicionales de la invención serán obvias para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse poniendo en práctica la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Aislamiento e identificación de la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida

Para obtener los aislados, se recogieron muestras de suelo de la región de España Todas las muestras procedían de campos y entornos naturales de clima mediterráneo. Las muestras se procesaron mediante métodos microbiológicos convencionales (Mora et al., "Antimicrobial peptide genes in Bacillus strains from plant environments", International Microbiology, 2011, vol. 14, págs. 213-223) y las bacterias del género Pseudomonas se aislaron en medio NA a 28 °C durante 24 h, formando una colección de 2.400 aislados. La cepa CECT8538 se identificó inicialmente mediante secuenciación de ADNr 16S. El ADNr 16S se amplificó usando el cebador directo bacteriano 8f, con la secuencia SEQ ID NO: 1 (cebador directo 8f: AGTTTGATCCT^gG^cTCAG) y el cebador universal complementario inverso 1492r, con SEQ ID NO: 2 (cebador inverso 1492r: ACGGTTACCTTGTTACGACTT), usando PCR de colonias (con la punta de una pipeta estéril, se recogió una sola colonia de un cultivo sólido en NA; la punta se sumergió en 50 pl de agua estéril, se hirvió durante 10 min a 98 °C y puso inmediatamente en hielo hasta su uso como molde de PCR) con una ADN polimerasa de alta fidelidad (Biotaq, Bioline, Londres, RU) siguiendo las instrucciones del fabricante. El amplicón de SEQ ID NO: 3 (correspondiente a la subunidad 16S de ADNr de la cepa CECT8538 de la invención) se purificó y se secuenció usando el cebador 8f. A continuación, la secuencia se sometió a una búsqueda de homología BLASTn contra toda la base de datos de nucleótidos del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica). Basándose en la secuencia de nucleótidos del ADNr 16S, el aislado bacteriano se identificó inicialmente como una cepa de Pseudomonas sp. estrechamente relacionada con el denominado "complejo de P. putida" (P. putida/plecoglossicida/taiwanensis).

Para una identificación más precisa de la cepa bacteriana, las secuencias de nucleótidos de rpoD y gyrB, que, según los informes, son más discriminatorias dentro de este género, se recuperaron de la secuencia hologenómica (WGS, whole-genome sequencing) indiscriminada y se analizaron como en el caso de 16S, excepto que la base de datos diana se limitó a entradas de Pseudomonas spp. (taxid: 286). Las secuencias de nucleótidos de rpoD (SEQ ID: 4) y gyrB (SEQ ID: 5) muestran que la cepa CECT8538 es una cepa de P. putida perteneciente a la biovariedad A o C. A diferencia de la biovariedad C, las cepas de P. putida de la biovariedad A no pueden crecer a 4 °C. Dado que la cepa CECT8538 no pudo crecer a 4 °C, se concluyó que era una cepa de P. putida de la biovariedad A.

Para obtener amplia información sobre la cepa de la invención, incluyendo una clasificación precisa, se realizó un experimento de secuenciación hologenómica (de todo el genoma). Para esto, se obtuvo ADN de un cultivo líquido de CECT8538 y se secuenció usando la tecnología Illumina (HiSeq2500) en una biblioteca de ADN Nextera® (Illumina, Cambridge, RU) siguiendo las especificaciones del fabricante. Los datos generados se analizaron en Sequentia Biotech (Barcelona, España) aplicando un flujo de trabajo patentado, RECONSTRUCTOR, que genera una secuencia hologenómica (WGS) indiscriminada usando un enfoque combinado de novo y de ensamblaje asistido por referencias. Para el ensamblaje asistido por referencias, como referencia se usó P. putida KT2440 (n.° de registro NC_002947.4; DSM6125).

La secuencia WGS se anotó usando RAST (Rapid Annotations using Subsystems Technology). Para la exploración de operones de ARNr se usó la herramienta informática WebMGA (http://weizhong-lab.ucsd.edu/metagenomicanalysis/). Para la identificación de los ARNt se usó ARAGORN v1.2.36. El oriC y las secuencias relacionadas se identificaron usando Ori-Finder y la base de datos DoriC. Las islas genómicas se identificaron usando IslandViewer 3. El ensamblaje de la secuencia del genoma de CECT8538 produjo 186 armazones, que contenían 6315656 nucleótidos, construidos a partir de cóntigos sin ningún acierto BLAST (límite del valor de e 0,01) o con los mejores aciertos BLAST en Pseudomonas spp. De los 186 armazones, el primero (denominado en el presente documento "el cromosoma") incluye 5860165 bases, es decir, el 92,8 % de todas las bases secuenciadas. El contenido global de GC, del genoma de CECT8538, es del 61,7%. IslandViewer predice 12 islas genómicas (IsG) en el cromosoma, coincidiendo algunas de ellas con regiones de GC distorsionadas, de las cuales al menos 5 llevan secuencias relacionadas con profagos. Una de estas IsG abarca aproximadamente 700 kbp e incluye más de 600 CDS.

Solo un fragmento de una copia de ADNr 5S se ensambla en el cromosoma de CECT8538. Las secuencias completas de 16S y 23S, adyacentes a un fragmento del 5S, están codificadas en uno de los armazones más grandes (excluido el cromosoma). Asimismo, otros armazones contienen o bien un fragmento o la secuencia de 5S completa cada uno. Muy probablemente, RECONSTRUCTOR alinea las copias de ADNr entre sí considerando que son lecturas superpuestas. La WGS de CECT8538 incluye secuencias que codifican 67 ARNt. De estas, 57 están codificadas en el cromosoma e incluyen los ARNt para 22 aminoácidos, incluyendo seC (selenocisteína) y un ARNt ambiguo (para seC o Val). La secuencia oriC del genoma de CECT8538 comprende 573 nucleótidos, flanqueados por los genes rpmH y dnaA, y comprende 4 cajas de dnaA y dos secuencias adicionales con 1 y 2 sitios no emparejados, respectivamente.

La herramienta de anotación RAST predijo 5892 CDS codificadas en 5595813 nucleótidos (es decir, las regiones codificantes cubren el 88,6 % del genoma), variando la longitud de CDS de 60 a 14394 nucleótidos, con longitudes medias y medianas de CDS de 950 y 819 nucleótidos, respectivamente, y con una longitud de N50 CDS de 1197 nucleótidos. De todas las CDS, el 50 % se clasificaron como proteínas hipotéticas.

Asimismo, Sequentia Biotech realizó un análisis de validación de variantes para descifrar polimorfismos mononucleotídicos (SNP, single nucleotide polymorphisms), pequeñas inserciones o deleciones (INDE^l) y grandes variantes estructurales (VE) en CECT8538 en comparación con el genoma de referencia (KT2440; DSM6125). Después de filtrar por calidad de variante y profundidad de genotipo, CECT8538 muestra 112931 SNP y 867 INDEL (332 pequeñas deleciones y 535 pequeñas inserciones) en comparación con KT2440. Asimismo, de todas las lecturas de CECT8538 obtenidas en el experimento, el 22,3 % no se mapeó en el genoma de KT2440. Estas lecturas se ensamblaron de novo y de los armazones ensamblados se predijeron 512 ORF (forma siglada de open reading frame, marco abierto de lectura), incluyendo 402 proteínas completas. El algoritmo megablast, con la configuración predeterminada, no mostró una alineación significativa con ninguna secuencia de nucleótidos en la base de datos del NCBI para más de 200 de estos ORF, lo que indica que la cepa CECT8538 no solo es diferente a la KT2440, sino también de otras cepas.

Ejemplo 2. Caracterización de las propiedades fisicoquímicas de la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida Para los ensayos de caracterización, la cepa de la invención se sembró en placas con medios de agar nutritivo comercial (NA, Scharlab), M9 (casaminoácidos al 0,5 %, MgSO42 mM, CaCh 0,1 mM complementado con glucosa al 0,4 % y solidificado con agar al 0,5 %) o BM2 (tampón de fosfato de potasio 62 mM, pH = 7, MgSO42 mM, FeSO4 10 ^|jM, casaminoácidos al 0,5 % [p/vol], complementado con glucosa al 0,4 % y solidificado con agar al 0,5 %). Las placas se prepararon después de la esterilización de los medios y, una vez que éstos se enfriaron lo suficiente, se vertió en las placas y se dejó hasta que se volviesen semisólidos. Para la evaluación del perfil de temperatura, la cepa de la invención se sembró en placas de NA a una concentración de 108 (UFC ml-1), y se incubó a diferentes temperaturas (es decir, 4 °C, 26 °C, 37 °C y 42 °C) durante 5 días. Se descubrió que las temperaturas de 26 °C y 37 °C eran óptimas para el crecimiento de la cepa CECT8538 aislada mientras que no crecía a 4 °C y 42 °C después de 24 h de incubación (véase la Tabla 1). Como se ha descrito anteriormente, basándose en las secuencias de nucleótidos de rpoD y gyrB, CECT8538 se agrupó como P. putida biovariedad A o C. A diferencia de la biovariedad C, la habilidad de las cepas de P. putida de la biovariedad A para crecer a 4 °C, es relativamente rara, lo que confirma que la cepa de la invención pertenece a la biovariedad A.

La sensibilidad a los antibióticos se determinó incorporando 15 |jg/ml de ácido nalidíxico, 50 |jg/ml de cloranfenicol, 50 jg/ml de sulfato de estreptomicina, 50 jg/ml de oxitetraciclina o 50 jg/ml de nitrofurantoína en medio NA. También se determinó la habilidad para crecer en NA que contiene 5 % de NaCl. En todas las condiciones, las placas se incubaron durante 48 horas a 26 °C. P. putida CECT8538 fue resistente a 15 jg/ml de ácido nalidíxico y a 50 jg/ml de cloranfenicol. Sin embargo, la cepa de la invención no pudo crecer en NA que contenía 50 jg/ml de sulfato de estreptomicina, 50 jg/ml de oxitetraciclina o NaCl al 5 %. El antibiótico nitrofurantoína mostró un ligero efecto sobre el crecimiento bacteriano a 50 jg/ml (véase la Tabla 1).

Para caracterizar además la cepa de la invención, las actividades enzimáticas se analizaron con un kit API ZYM según los procedimientos descritos por el fabricante (BioMerieux, Lyon Francia). La cepa de la invención presentó las actividades enzimáticas de esterasa (C⁴), leucina arilamidasa y fosfatasa alcalina.

Tabla 1. Características fisicoquímicas de P putida CECT8538

Característica Resultado ^a

Crecimiento a diferentes

temperaturas:

4 °C -26 °C

37 °C

42 °C -Crecimiento en NA NaCl al 5 % -Resistencia a antibióticos:

Ácido nalidíxico (15 jg/ml)

Cloramfenicol (50 jg/ml)

Sulfato de estreptomicina (50 jg/ml) -Oxitetraciclina (50 jg/ml) -Nitrofurantoína (50 jg/ml) d

API ZYM:

Fosfatasa alcalina

Esterasa (C⁴)

Esterasa lipasa (C^e) -Lipasa (C¹⁴) -Leucina arilamidasa

Valina arilamidasa -Cistina arilamidasa -Tripsina -a-Quimotripsina -Fosfatasa ácida -Naftol-AS-Bl- fosfohidrolasa

a-Galactosidasa -P-Galactosidasa -API ZYM: -p-Glucuronidasa -a-Glucosidasa -p-Glucosidasa -N-Acetil-p-glucosamidasa -a-Manosidasa -a-Fucosidasa -^a(-) negativo; (+) positivo, (d) débilmente positivo

La capacidad de colonización es una característica crucial para que los agentes de control biológico compitan adecuadamente en el entorno de la rizosfera. Para probar esta capacidad de la cepa de la invención, se evaluó su movilidad de enjambre bacteriano. El enjambre es un movimiento multicelular especializado que facilita la colonización coordinada de superficies por bacterias. Resumiendo, se inoculó un precultivo de la cepa de la invención en placas que contenían medio M9 o BM2, y se incubó durante 30 h a 28 °C o a 37 °C (Figura 1). Como se muestra en la Figura 1, la cepa de la invención tiene una alta capacidad de enjambre a 28 °C, pero no a 37 °C. Esto indica que la cepa de la invención es metabólicamente activa a 28 °C, que es la temperatura media del suelo, y que no lo es a 37 °C, que es la temperatura óptima de colonización de los microorganismos patógenos humanos.

Ejemplo 3. Análisis comparativo de la capacidad de crecimiento celular a diferentes pH

Para comparar la habilidad de sobrevivir a diferentes pH dentro de diferentes cepas de P. putida, la cepa de la invención, CECT8538, y las cepas de referencia de P. putida CECT324 y DSM6125 (KT2440), se cultivaron previamente en un agitador a 28 °C y a 120 rpm durante la noche. Estos precultivos se sembraron en placas de Petri NA con los pH ajustados deseados (véase la tabla 2) y se incubaron durante 24 h a 28 °C. El ajuste del pH se realizó después de la esterilización del medio NA, justo antes de verter el medio en las placas. La Tabla 2 muestra los resultados observados después de 24 h de incubación. La cepa CECT8538 fue la cepa que pudo sobrevivir en un intervalo de pH más amplio en comparación con las otras cepas de P. putida, confirmando la alta capacidad de adaptación de la cepa de la invención al medio ambiente.

Tabla 2. Análisis de la ca acidad de crecimiento celular de CECT8583 a diferentes pH.

Ejemplo 4. Análisis de producción antimicrobiana por la cepa de la invención.

Ejemplo 4A. Análisis mediante HPLC en busca de pruebas de producción de metabolitos por P. putida CECT8538.

Los metabolitos antimicrobianos más comunes producidos por Pseudomonas spp. son pirrolnitrina, 2,4-DAPG, pioluteorina y fenazinas, que desempeñan un importante papel en el control biológico. Durante la fase de crecimiento logarítmica tardía o estacionaria, Pseudomonas spp. puede sintetizar estos metabolitos.

Para evaluar la producción de metabolitos de la cepa CECT8538 de P. putida, la cepa de la invención se sometió a un proceso de fermentación para crecer. Los cultivos a gran escala se realizaron en un biorreactor industrial F3-100 (modelo F3-industrial, Bionet) con un volumen de trabajo de 100 litros, usando medio de cultivo LB, una temperatura ajustada a 28 °C ± 1 °C, aireación de 8 l/min, oxígeno disuelto a > 50 % y agitado a 200-400 rpm. El cultivo se inoculó al 5 % v/v con un precultivo desarrollado durante 24 horas en un biorreactor de laboratorio F1-5 (modelo F1 -lab, Bionet) con los mismos parámetros del biorreactor industrial.

Durante la fermentación, todos los parámetros (es decir, temperatura, pH, presión de oxígeno, agitación, velocidad del flujo de aire, nivel de espuma y densidad óptica) se controlaron y se midieron. Una vez finalizada la fermentación, las células se recogieron por centrifugación (Hitachi CR22N), el sobrenadante del cultivo se almacenó a 4 °C y las células se liofilizaron (Heto Power Dry LL 3000) para conservar la viabilidad de la biomasa.

Las posibles fracciones metabólicas se analizaron mediante HPLC (sistema eAlliance, Waters). Los cromatogramas se realizaron usando una columna de fase inversa XBridge C18 (5 pm 4,6x150 mm, Waters) eluida (1 ml min’1) con un gradiente lineal de 0-80% de acetonitrilo en agua durante 15 min. Ambos disolventes contenían ácido trifluoroacético (TFA) al 0,05 %. Los metabolitos se detectaron mediante espectroscopia UV con un detector de matriz de fotodiodos [para la pirrolnitrina, A = 247 nm y tiempo de retención (tr) = 14,6 min; para el 2,4-DAPG, A = 278 nm y tr = 12,6 min; para la pioluteorina, A = 308 nm y tr = 10,6 min; para la piocianina, A = 278 nm y tr = 5,5 min].

Los cromatogramas de HPLC de las diferentes muestras de la cepa de la invención, se compararon con el cromatograma obtenido de los metabolitos estándar pirrolnitrina, 2,4-DAPG, pioluteorina y piocianina. Los cuatro picos correspondientes de cada metabolito no estaban en los cromatogramas obtenidos de la cepa de la invención.

Ejemplo 4B. Análisis genómico para determinar la habilidad de la cepa de la invención para sintetizar los metabolitos pirrolnitrina, 2,4-DAPG, pioluteorina y piocianina

Se realizó un estudio genómico complementario para determinar si la cepa CECT8538 comprendía la maquinaria genética para sintetizar estos metabolitos en otras condiciones particulares de crecimiento/almacenamiento.

En primer lugar, se recuperaron las rutas biosintéticas principales de cada metabolito en Pseudomonas spp. de la base de datos del NCBI. En la WGS (secuencia hologenómica) de CECT8538 se buscaron los homólogos de las enzimas biosintéticas pirrolnitrina, 2,4-DAPG, pioluteorina y piocianina, y se realizaron alineaciones entre proteínas usando BLASTp. Usando una puntuación en bits como parámetro divisorio y aplicando un umbral de 40, se obtuvo una base de datos que consistía en la traducción informática de los genes previstos del genoma de CECT8538 (5892 genes que codifican proteínas).

Las enzimas biosintéticas de pirrolnitrina están codificadas por genes ubicados en el operón prn, que incluye prna (que codifica una triptófano halogenasa), prnB (que codifica una monodecloroaminopirrolnitrina sintasa), prnC (que codifica una halogenasa) y prnD (que codifica una aminopirrolnitrina oxigenasa). La cepa CECT8538 de P. putida tiene sólo un homólogo de prna procedente del operón prn, lo que sugiere que la cepa CECT8538 no es capaz de sintetizar pirrolnitrina (Tabla 3).

La ruta biosintética principal del 2,4-DAPG está codificada por genes en el locus phl, que incluye phlA (que codifica una p-cetoacil-ACP sintasa III), phlB (que codifica una supuesta enzima de unión a ácido nucleico), phlC (que codifica una enzima de condensación) y phlD (que codifica una policétido sintasa de tipo III; PKS). Algunas proteínas PhID en Pseudomonas spp. mostraron un homólogo en CECT8538, pero en la cepa de la invención no se encontraron homólogos de phIA, PhIB o PhIC (Tabla 3). Por tanto, se deduce que CECT8538 no puede sintetizar 2,4-DAPG.

Los genes biosintéticos de la pioluteorina, en P. fluorescens Pf-5, están agrupados en el grupo génico plt. Este grupo incluye 10 genes, aunque solo 7 constituyen la ruta biosintética principal de la pioluteorina: pltF (que codifica una acil-CoA sintasa), pltE (que codifica una acil-CoA deshidrogenasa), pltA y pltM (ambos codificantes de halogenasas), pltB (PKS), pltC (PKS) y pltG (tioesterasa). De estas 7 proteínas biosintéticas de la pioluteorina, PltF tenía un homólogo en CECT8538; solo en algunas especies/cepas PltA, PltB, PltC, PltE y PltM, mostraron homología con una proteína de CECT8538; y ninguna PltG tenía un homólogo en la cepa de la invención. La PltG de tioesterasa es probablemente responsable de la terminación del ensamblaje de policétidos, por tanto, la ausencia de pltG sugiere que CECT8538 no puede sintetizar pioluteorina.

Las fenazinas, tales como el ácido fenazin-1-carboxílico (PCA) y la piocianina, son factores de virulencia en P. aeruginosa. Ambos estimulan una respuesta inflamatoria neutrofílica y regulan positivamente quimiocinas (IL-8) y moléculas de adhesión (ICAM-1) a través de mecanismos dependientes de oxidantes. La biosíntesis de la piocianina se realiza mediante la acción combinada de la ruta biosintética principal de la fenazina que conduce al PCA y de reacciones biosintéticas específicas de la piocianina que permiten la conversión del PCA en piocianina. Estos dos conjuntos de reacciones son catalizados por enzimas codificadas en dos operones respectivos. Cinco genes del grupo génico phz -phzB/A (que codifica la cetoesteroide isomerasa; phzA que es una copia no funcional de phzB), phzD (que codifica la isocorismatasa), phzE (similar a la antranilato sintasa), phzF (que codifica una trans-2,3-dihidro-3-hidroxiantranilato isomerasa) y phzG (que codifica una oxidasa dependiente de flavina)- son estrictamente necesarios para la biosíntesis del PCA, el precursor de la piocianina. Asimismo, la acción de phzM y phzS, que codifican el PCA metiltransferasa y una hidroxilasa dependiente de flavina, respectivamente, también son estrictamente necesarios para la biosíntesis de la piocianina.

En la base de datos del NCBI hay miles de secuencias de PhzF de Pseudomonas spp., de las cuales, 27 corresponden a P. putida. CECT8538 tiene una copia de PhzF homóloga a la de otras cepas de P. putida (Tabla 3), y la traducción informática de los genes previstos de la secuencia genómica de CECT8538 predice la presencia de una copia de phzF en esta cepa. Con respecto a los accesos de PhzA, PhzB y PhzD, las búsquedas se limitaron a accesos correspondientes a P. putida y a los correspondientes a genes de referencia en Pseudomonas spp. (todos pertenecen a P. aeruginosa). El acceso correspondiente a P. putida NJ-10 PhzD mostró un homólogo en CECT8538, y lo mismo se observó con proteínas PhzD de P. aeruginosa PAO1. Por otro lado, PhzA y PhzB no mostraron homólogos en CECT8538, ni las secuencias de P. putida FDAARGOS, ni las de PAG. aeruginosa PAO1.

No se encontraron homólogos de PhzE, PhzG, PhzM y PhzS en la base de datos del NCBI de ninguna cepa de P. putida. Sin embargo, CECT8538 mostró un homólogo de proteína previsto a PAO1 PhzE de P. aeruginosa y dos proteínas de CECT8538 mostraron homología a 3 accesos encontrados para PhzG en Pseudomonas spp. Además, mientras que ninguno de los dos genes phzM de referencia de Pseudomonas spp. (ambos pertenecientes a P. aeruginosa) tenía un homólogo en CECT8538, el gen de referencia phzS (también de P. aeruginosa) tenía un homólogo en la cepa de la invención. Debido a la ausencia de PhzB, una cetoesteroide isomerasa esencial para la biosíntesis del PCA precursor de piocianina y a la ausencia de PhzM, una metiltransferasa necesaria para la biosíntesis de la piocianina, se deduce que CECT8538 no es capaz de sintetizar la piocianina.

Todos estos datos confirman lo que reveló el análisis mediante HPLC e indican que la cepa de la invención no es capaz de producir algunos metabolitos antimicrobianos debido a la ausencia de genes específicos necesarios para su síntesis. La incapacidad de producir estas toxinas, que puede explicar los problemas de resistencia a los antibióticos en patógenos humanos, confiere a la cepa de la invención un perfil adecuado para su uso en el tratamiento de plantas destinadas al consumo humano.

Tabla 3. Homólogos de enzimas biosintéticas pirrolnitrina, 2,4-DAPG, pioluteorina y piocianina Metabolito Proteína biosintética Homólogos3 Conclusión

pirrolnitrina PrnA 23/23 Sí

PrnB 0/17 NO

PrnC 0/280 NO

PrnD 0/14 NO

(continuación)

Metabolito Proteína biosintética Homólogosa Conclusión

2,4-DAPG PhlA 0/14 NO

PhlB 0/25 NO

PhlC 0/250 NO

PhlD 7/128 ?

Pioluteorina PltA 1/3 ?

PltB 2/3 ?

PltC 2/3 ? PltE 1/2 ?

PltF 2/2 Sí

PltG 0/2 NO PltM 1/3 ?

Piocianinab PhzB/A 0/4 NO

PhzD 1/1 (2/2) Sí

PhzE NE (2/2) Sí

PhzF 23/27 (ND) Sí

PhzG NE (2/3) ?

PhzM NE (0/2) NO

PhzS NE (1/1) Sí

a Los números indican el número de secuencias con un homólogo en CECT8538 frente al número de búsquedas de secuencias de Pseudomonas spp.

b Para la piocianina, los números indican el número de secuencias con un homólogo en CECT8538 frente al número de búsquedas de secuencias de P. putida. Entre paréntesis, se muestra el número de secuencias con un homólogo en CECT8538 frente al número de genes de referencia de Pseudomonas spp.

cNE: No encontrado

Ejemplo 5. Producción a escala industrial de una composición de la invención.

Para la producción a escala industrial de composiciones con la cepa de la invención, se pueden usar las condiciones óptimas de fermentación descritas a continuación, usando un biorreactor del tipo F3-100 en medio líquido, aunque también se pueden usar técnicas basadas en la fermentación en medios sólidos, siendo todos ellos métodos estándar usados en la microbiología industrial.

Para determinar las condiciones óptimas, se usó un biorreactor F1-F5 con medio 10LLB a 28 °C, pH 7,0, ascenso de pO2 >50 % y agitación a 200-400 rpm. Se inoculó un cultivo exponencial de P. putida CECT8538 al 5 % v/v y se controlaron los parámetros operativos del biorreactor, finalizando el crecimiento en fase estacionaria en 12 h y obteniéndose concentraciones celulares de 2,0x109 UFC/ml. A continuación, el cultivo se centrifugó en una centrífuga Hitachi CR22N a 5000 rpm y las células se recogieron asépticamente. Al final de esta etapa, la biomasa se concentró resuspendiéndola en 500 ml de tampón, obteniendo aproximadamente 1 litro de concentrado de 2,0x1010 UFC/ml. Posteriormente, al concentrado se le añadió un ingrediente protector osmótico inerte (1 l) y se deshidrató en un liofilizador Heto Power Dry LL 3000 en condiciones estándar durante 72 h, obteniendo aproximadamente 100 g de peso seco (material activo al 50 %), con una concentración de 1,0x1011 UFC/g p.s. En dichas condiciones, se obtiene un producto con una viabilidad celular cercana al 90 %, estable, fácil de almacenar y manipular, que a dosis operativas de 5x10* 57 *1052UFC/ml, permite la preparación de aproximadamente 200 l de un producto listo para aplicar sobre las plantas de cultivo a proteger.

Posteriormente, el material se envasó en bolsas selladas al vacío y se conservó a 4 °C, lo que mantiene su periodo de validez durante más de un año.

Ejemplo 6. Actividad de control biológico de la cepa CECT8538

Ejemplo 6A. Evaluación de la actividad de la cepa de la invención contra Erwinia carotova subsp. atroseptica en cultivo de patata

La actividad biobactericida se evaluó mediante un método de análisis interno (MA 10 "Determinación de la actividad biocida o bioestática in vivo", Futureco Bioscience).

Se establecieron tres bioensayos independientes con tubérculos de patata para valorar la actividad antagonista del ACB, la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida, contra Erwinia carotovora subsp. atroseptica (cepa DSM 30184, colección alemana DSMZ, aislada de una planta de patata) el agente causante de la enfermedad bacteriana conocida como "podredumbre blanda bacteriana". Para estos análisis, se seleccionó la variedad de patata "Kennebec" por ser una de las variedades de cultivo más habituales en España. Se evaluaron tres composiciones diferentes formuladas como Principio Activo de Calidad Técnica (PACT; consistente en material liofilizado compuesto por 50 % p/p de células viables y 50 % p/p de sacarosa), formulación en polvo humectable (PH; compuesto por 10 % p/p de PAC^t, 2 % p/p de sílice precipitada (CAS 1343-98-2), 3 % p/p de carboximetil celulosa (CAS 9004-32-4), 2 % p/p de ácido naftaleno y alquil naftaleno sulfónico, sal de sodio (CAS 68425-94-5), 0,5 % p/p de ácido 2R)-3-(2-hidroxi-3-metoxifenil)-2-[2-metoxi-4-(3-sulfopropil)fenoxi] propano-1-sulfónico (CAS 105859-97-0) y 82,5 % p/p de bentonita (tipo montmorillonita, CAS 1302-78-9)) y formulación dispersable en aceite (DA; compuesta por 10% p/p de PACT, 1 % p/p de sílice precipitada (CAS 1343-98-2), 20 % p/p de trimetilnonil polietilenglicol (CAS 60828-78-6) y 69 % p/p de aceite de linaza refinado (CAS 68649-95-6)).

Se desinfectaron aproximadamente 2x2 cm de tubérculos de patata con brotes (lejía comercial al 1,2 %, 5 minutos y después 3 baños con agua destilada), se sembraron y se cultivaron durante cuatro-cinco semanas en sustrato de turba:vermiculita (1:1; v/v) en condiciones de cámara de crecimiento (Fitoclima 20000, ARALAB; 18-20 °C; HR al 60-70%, 13 h:11 h día:noche; 270-300 PAR). Después de cuatro-cinco semanas, las plántulas se transfirieron a una maceta de 1 l con sustrato de suelo:turba:perlita (2:1:0,5; v/v). Se llevó a cabo en diseño de bloques al azar que consistía en 3 repeticiones por tratamiento, con 4 plantas por repetición (12 plantas por tratamiento). Las sustancias de prueba (PACT, PH o DA) se aplicaron tres veces a lo largo de cada bioensayo. La primera aplicación de prueba (A) se realizó 24 h después del trasplante (6 días antes de la exposición al patógeno) añadiendo sobre el sustrato 20 ml que contenían diferentes concentraciones de las sustancias de prueba (véase la Tabla 4). La inoculación con el patógeno se realizó 7 días después del trasplante añadiendo 20 ml de una suspensión bacteriana patógena (2x109 UFC/ml; 4x107 UFC/planta) de un precultivo de 24 h por planta. Se realizaron dos aplicaciones más (B y C) con la cepa de la invención, una y dos semanas después de la primera, a razón de 20 ml por planta (B= 7DDA; C=14 DDA; DAA significa "días después del tratamiento A". En los 3 bioensayos, se incluyó un control infectado con el patógeno pero no tratado con la cepa de la invención.

Las plantas se mantuvieron en condiciones de cámara de crecimiento (Fitoclima 20000, ARALAB) durante 4 semanas (20 °C (día), 18 °C (noche); HR al 60-70 %; 13 h:11 h día:noche; 270-300 PAR) y se regaron todos los días. Veintidós días después del trasplante a las macetas de 1 l, las plantas se clasificaron con respecto a la gravedad de la enfermedad de la podredumbre blanda bacteriana (porcentaje de PBB como lesión vascular necrótica). La eficacia se evaluó midiendo el porcentaje de tallo dañado como podredumbre parda en relación con la longitud total del tallo 7 días después de la última aplicación (7 DDC, días después del tratamiento C).

El porcentaje de eficacia se calculó usando la fórmula de Abbot:

% de eficacia = 100 -(T URNxTl0R0)

TR = porcentaje de tallo dañado en la parcela tratada

UNTR = porcentaje de tallo dañado en la parcela no tratada

Tabla 4. Eficacia contra Erwinia carotova subsp. atroseptica en plantas de patata vc Kennebec en condiciones controladas

Como se muestra en la tabla, la cepa de la invención tiene la capacidad de colonizar cultivos de patata y actuar como un agente de control biológico contra las bacterias Erwinia carotovora subsp. atroseptica. Estos datos muestran que la cepa de la invención tiene la capacidad de colonizar una planta infectada y antagonizar las enfermedades causadas en ella por una infección bacteriana.

Ejemplo 6B. Actividad antifúngica in vitro de la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida

Para valorar la capacidad de control biológico de la cepa de la invención, se analizó in vitro su capacidad fitopatógena contra hongos usando la técnica de los alimentos envenenados. Para la evaluación, se seleccionaron 8 hongos, 4 cepas adquiridas de una colección de microorganismos (Botrytis aclada CECT 2851, Rhizoctonia solani DSMZ 63010, Pythium ultimum CECT 20902 y Sclerotinia sclerotiorum CECT 2822) y 4 cepas de la colección de cultivos de Futureco Bioscience aisladas de plantas infectadas (cepa H24 de Sclerotinia sclerotiorum aislada de lechuga, cepa H827 de Colletotrichum coccodes aislada de patata, cepa H828 de Fusarium oxysporum aislada de tomate y cepa H830 de Alternaría porri aislada de cebolla).

Como se ha mencionado anteriormente, las pruebas de inhibición fúngica se realizaron contra los fitopatógenos indicados con la técnica de los alimentos envenenados. Resumiendo, la bacteria se cultivó durante la noche en medio LB a 28 °C y 200 rpm. De este cultivo estacionario, una solución del agente de control biológico, CECT8538, se

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de Pseudomonas putida depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de registro CECT8538, o una mutante de la misma, en donde dicha cepa mutante se obtiene usando la CECT8538 de Pseudomonas putida y mantiene las siguientes características de la cepa de partida:

- actividad antagonista de la cepa de partida contra Erwinia carotovora subsp atroseptica, Botrytis aclada, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum coccodes, Fusarium oxysporum y Alternaría porri; y;

- habilidad de colonizar o sobrevivir en una parte aérea o en las raíces de una planta.

2. Uso de la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida o de una mutante de la misma como se define en la reivindicación 1, como pesticida en plantas.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, para controlar una enfermedad causada por una bacteria o un hongo en una planta.

4. Un procedimiento para obtener una suspensión celular viable derivada de la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida o de una mutante de la misma como se define en la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento: (i) inocular la cepa en un medio de cultivo, (ii) someter el medio de cultivo inoculado de la etapa (i) a condiciones adecuadas para el crecimiento de la cepa, y (iii) someter opcionalmente el medio resultante de la etapa (ii) a una etapa de concentración

5. Un producto de inoculación que comprende la cepa definida en la reivindicación 1.

6. Una composición que comprende la cepa CECT8538 de Pseudomonas putida o una mutante de la misma como se define en la reivindicación 1, o un producto de inoculación como se define en la reivindicación 5, y uno o más compuestos agrícolamente aceptables.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el uno o más compuestos agrícolamente aceptables se seleccionan del grupo que consiste en nutrientes, agentes humectantes, compuestos que mejoran la adherencia, compuestos tamponantes, estabilizantes, antioxidantes, protectores osmóticos, filtros solares y fortificantes para plantas.

8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, que comprende al menos un pesticida adicional.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el pesticida adicional se selecciona del grupo que consiste en una cepa bacteriana con actividad antifúngica y/o antibacteriana, un fungicida, un bactericida, un herbicida, un insecticida o un nematicida.

10. Uso de la cepa como se define en la reivindicación 1, o el producto de inoculación como se define en la reivindicación 5, o la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, como pesticida en una planta.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, para el control de patógenos fúngicos y bacterianos en una planta.

12. Un método para controlar una infección causada por un patógeno bacteriano o fúngico en una planta, que comprende aplicar la cepa o una mutante de la misma como se define en la reivindicación 1, o el producto de inoculación como se define en la reivindicación 5, o la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, a la parte afectada de la planta y/o a la semilla o al sustrato o al suelo usado para cultivar dicha planta.