ES2877566T3 - Una formulación de lubricante de carbamoiletil katira y un proceso para la preparación de la misma - Google Patents

Abstract

Una formulación de lubricante de carbamoiletil katira que comprende goma katira en el rango del 5 % p/v al 10 % p/v carbamoiletil en el rango del 5 % p/v al 10 % p/v y aditivos.

Description

DESCRIPCIÓN

Una formulación de lubricante de carbamoiletil katira y un proceso para la preparación de la misma

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una formulación de lubricante de carbamoiletil katira. Particularmente, la presente invención se refiere a un proceso para la preparación de la formulación de lubricante de carbamoiletil katira. La presente invención también se refiere al proceso asistido por microondas para la preparación de dicha formulación. Más particularmente, la presente invención se refiere a la formulación de lubricante de carbamoiletil katira que tiene actividad antibacteriana útil para formulaciones basadas en lubricantes oculares, tratamiento del síndrome de la enfermedad del ojo seco, etc.

Antecedentes de la invención

La expectativa de la goma natural es mayor, ya que los polímeros sintéticos tienen determinadas desventajas como alto coste, toxicidad, contaminación medioambiental durante la síntesis, no renovables e incumplimientos con los pacientes etc. Por tanto, las gomas naturales se usan ampliamente para formas de dosificación convencionales y nuevas ya que son químicamente inertes, no tóxicas, biodegradables, no costosas y fácilmente disponibles y estas gomas naturales se modifican de diferentes maneras para obtener materiales mejores para los sistemas de administración de fármacos y, por tanto, pueden compararse con excipientes sintéticos disponibles. En la industria alimentaria, se usan diversas clases de gomas naturales y se consideran seguras para el consumo humano. Las gomas tienen una variedad de aplicaciones en la farmacia (Prajapati, V. D., Jani, G. K., Moradiya, N. G., y Randeria, N. P. (2013). Pharmaceutical applications of various natural gums, mucilages and their modified forms. Carbohydrate polymers, 92(2), 1685-1699.). Las gomas naturales se han estudiado para su aplicación en diferentes formas de dosificación farmacéuticas como sistema controlado matricial, agentes de recubrimiento de película, películas bucales, microesferas, nanopartículas, formulaciones líquidas viscosas como disoluciones, suspensiones, implantes oftálmicos y se ha demostrado su aplicabilidad y eficacia. Estas también se han utilizado como potenciadores de la viscosidad, estabilizantes, disgregantes, solubilizantes, emulsionantes, agentes de suspensión, agentes gelificantes y bioadhesivos, aglutinantes en diversas formas de dosificación (Guo, J. H., Skinner, G. W., Harcum, W. W., y Bamum, P. E. (1998). Pharmaceutical applications of naturally occurring water-soluble polymers. Pharmaceutical science & technology today, 1 (6), 254-261.). Las gomas exudadas son polisacáridos producidos por las plantas como resultado del estrés, incluyendo daño físico y ataque fúngico. La goma arábiga (Acacia senegal), goma de tragacanto (Aatragalus gummifer), goma Karaya (Sterculia urens), goma Ghatti (Anogesissus latifolia) y goma Katira (C. religiosum) se han usado por los seres humanos durante miles de años en diversas aplicaciones alimentarias y farmacéuticas (Verbeken, D., Dierckx, S., y Dewettinck, K. (2003). Exudate gums: occurrence, production, and applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 63(1), 10-21.). Las gomas naturales se han modificado para superar determinados inconvenientes como tasa incontrolada de hidratación, espesamiento, caída en la viscosidad durante el almacenamiento, solubilidad y contaminación microbiana. Están disponibles diversos métodos para modificar el estado de las interacciones moleculares entre polímeros (Rana, V., Rai, P., Tiwary, A. K., Singh, R. S., Kennedy, J. F., y Knill, C. J. (2011). Modified gums: Approaches and applications in drug delivery. Carbohydrate Polymers, 83(3), 1031 -1047.). Métodos físicos: las interacciones moleculares entre polímeros pueden conseguirse mediante la exposición a calor, vapor saturado, tecnología de microondas y radiaciones. Métodos químicos: los polímeros se tratan con compuestos químicos como aldehídos, epiclorohidrina, bórax o glutaraldehído.

El síndrome del ojo seco u ojo seco (también conocido como Queratoconjuntivitis seca) ocurre cuando hay un problema con la película lagrimal que normalmente mantiene el ojo húmedo y lubricado. Es evidente a partir de su nombre que la Queratoconjuntivitis seca es una inflamación secante: querato (corneal) conjuntivitis (inflamación de la conjuntiva) seca (del latín sicco, que significa "secar") (Vibhute, S., Kawtikwar, P., Kshirsagar, S., y Sakarkar, D. (2010). Formulation and evaluation of tear substitutes. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 2, 17-20.). Es una enfermedad multifactorial y está acompañada de una osmolaridad incrementada de la película lagrimal e inflamación de la superficie ocular. Los síntomas del ojo seco varían entre pacientes, y lo más comúnmente incluyen picor, sensación de arenilla, quemazón, y sensibilidad a la luz brillante, sensación de cuerpo extraño, irritación, dolor, visión borrosa, e intolerancia a las lentes de contacto. Los ojos secos pueden afectar a cualquier persona, pero son más comunes al incrementarse la edad (Brewitt, H., y Sistani, F. (2001). Dry eye disease: the scale of the problem. Survey of ophthalmology, 45, S199-S202.). Un ojo seco afecta aproximadamente al 7 % de las personas en la cincuentena, y aproximadamente al 15 % de las personas en la setentena. Las mujeres se ven más afectadas que los hombres (Lee, A. J., Lee, J., Saw, S. M., Gazzard, G., Koh, D., Widjaja, D., y Tan, D. T. H. (2002). Prevalence and risk factors associated with dry eye symptoms: a population based study in Indonesia. British Journal of Ophthalmology, 86(12), 1347-1351.). La elección de la terapia para la enfermedad del ojo seco puede determinarse por la gravedad de la afección. Los casos leves de ojo seco, en los que no hay signos de daño en la conjuntiva o la córnea, pueden gestionarse con éxito con lágrimas artificiales aplicadas hasta cuatro veces al día. En los casos moderados de ojo seco, el examen revelará daño leve en la córnea, tal como queratopatía punteada superficial (SPK) limitada a determinadas zonas. En estos casos, se requerirá un tratamiento más frecuente, p. ej., el uso de lágrimas artificiales sin conservantes hasta 12 veces al día y una pomada lubricante sin conservantes por la noche. El ojo seco grave puede caracterizarse por la queratinización de la conjuntiva y un daño corneal de moderado a grave, incluyendo SPK, filamentos, defectos epiteliales, y subsecuentemente un mayor riesgo de infecciones secundarias. Además de la instilación frecuente de lágrimas artificiales sin conservantes y pomada lubricante por la noche, los casos graves de ojo seco requerirán otras estrategias de tratamiento, tales como terapias de conservación de lágrimas (Calonge, M. (2001). The treatment of dry eye. Survey of ophthalmology, 45, S227-S239.).

US 2005/250681 A1 describe composiciones y métodos para tratar enfermedades y trastornos oculares. Las composiciones pueden contener al menos un antibiótico que puede administrarse por vía tópica por inyección, sistémicamente, o por otros medios apropiados. Los métodos de administración implican proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación que contiene al menos un antibiótico a la sección apropiada del ojo.

Vikas Rana etal. (Modified gums: Approaches and applications in drug delivery, Carbohydrate Polymers, Volumen 83, No. 3, 2011, Páginas 1031 -1047) discute la modificación de gomas a través de la derivatización de grupos funcionales, injerto con polímeros, reticulación con iones etc. con el fin de hacer que las gomas sean adecuadas para la administración de fármacos.

La goma katira es una goma exudada, polisacárido producido por plantas como resultado del estrés, incluyendo daño físico y ataque fúngico. La goma es secretada por Cochlospermum religiosum (un árbol leñoso blando, caduco, de tamaño pequeño o medio). La goma katira usada en la presente invención se adquirió en almacén Kiryana "Monu Di Hatti", Badala Rode, Kharar, Factura No. 521, con fecha del 7 de enero, 2013. La goma katira es pálida y semitransparente, insoluble en agua, pero se hincha en una masa transparente pastosa con agua. La goma es dulce, termogénica, anodina, sedante y efectiva en la tos, disentería, diarrea, gonorrea, sífilis, tracoma y antipiojos.

Se encontró que el heteropolisacárido aislado de la goma (Katira) consiste en D-galactosa, ácido D-galactrourónico y L-ramnosa en una relación molar 2:1:3 (Ojha, A. K., Maiti, D., Chandra, K., Mondal, S., Roy, D. D. S. K., Ghosh, K., e Islam, S. S. (2008). Structural assignment of a heteropolysaccharide isolated from the gum of Cochlospermum religiosum (Katira gum). Carbohydrate research, 343(7), 1222-1231).

Se sintetizó una goma katira injertada con polisacárido por injerto de acrilamida en la goma katira en presencia de una concentración variada de nitrato de amonio cérrico (CAN) como iniciador. Se encontró que esta goma modificada era útil como un excipiente para el direccionamiento de fármacos al colon (Bharaniraja, B., Jayaram Kumar, K., Prasad, C. M., y Sen, A. K. (2011). Modified katira gum for colon targeted drug delivery. Journal of Applied Polymer Science, 119(5), 2644-2651; Bharaniraja, B., Kumar, K. J., Prasad, C. M., y Sen, A. K. (2011). Different approaches of katira gum formulations for colon targeting. International journal of biological macromolecules, 49(3), 305-310). La síntesis de goma katira injertada con acrilamida requiere una etapa de calentamiento a 60 °C durante un máximo de 5 h en un baño de agua. Por tanto, el método propuesto en la invención está asistido por microondas y requiere 15-20 minutes para completar el proceso de la reacción. Por tanto, se considera que el proceso propuesto tiene una alta aceptación industrial. Una síntesis verde de nanopartículas de oro usando una disolución acuosa de un heteropolisacárido, extraído de la goma katira y que se encontró que era útil como un catalizador heterogéneo eficiente en la reducción de 4-nitrofenol a 4-aminofenol (Maity, S., Sen, I. K., e Islam, S. S. (2012). Green synthesis of gold nanoparticles using gum polysaccharide of Cochlospermum religiosum (katira gum) and study of catalytic activity. Physica E: Lowdimensional Systems and Nanostructures, 45, 130-134). Por lo tanto, el método implica la reducción catalítica de la goma katira empleando un calentamiento directo a 70 °C durante 6 h para preparar nanopartículas de oro. Sin embargo, la presente invención proporciona un método asistido por microondas y requiere menos tiempo para completar la reacción. La goma katira se ha usado con éxito como un agente gelificante en medios de cultivo tisular para la formación de brotes y enraizamiento in vitro en Syzygium cuminiiy embriogénesis somática en Albizzia lebbeck (Jain, N., y Babbar, S. B. (2002). Gum katira-a cheap gelling agent for plant tissue culture media. Plant cell, tissue and organ culture, 71(3), 223-229).

En una investigación diferente, se encontró que los extractos metanólicos de hojas y flores de Cochlospermum ereligiosum linn. mostraban actividad antibacteriana frente a ochos cepas de especies bacterianas, concretamente, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum, Bacillus cereus y Micrococcus sp. (Bai, J. A., Rai, R. V., y Samaga, P. V. (2011). Evaluation of the antimicrobial activity of three medicinal plants of South India. Malaysian Journal of Microbiology, 7(1), 14-18). Cochlospermum religiosum se denomina comúnmente árbol de taza de mantequilla, árbol de algodón de seda amarilla, árbol de algodón de seda dorada, y es nativo de la India, Myanmar y Tailandia. Las flores de este árbol se usan para ofrecimientos religiosos. Los sinónimos de esta planta son Bombax gossypium, Cochlospermum gossypium, Maximilianea gossypium. Cochlospermum religiosum es un árbol leñoso blando, caduco, de tamaño pequeño o medio. El árbol rinde una goma que exuda de la corteza fibrosa, surcada profundamente, que se conoce como goma Katira (Prajapathi, N. D., Purohit, S. S., Sharma, A. K., y Kumar, T. (2003). A Handbook of medicinal plants: A complete source book. Sección II, Publicado por Agrobios (India), Jodhpur, 27). Cochlospermum religiosum (L.) se usa ampliamente en medicinas ayurvédicas y otros usos. Cada parte de esta planta se usa en medicina. También se usa por su actividad antiinflamatoria en el fármaco Siddha 'Kalnar Parpam'. La goma katira se usa como un agente gelificante barato para el cultivo de tejidos de plantas y tiene una aplicación amplia en las industrias farmacéutica y alimentaria. La goma katira es pálida y semitransparente, insoluble en agua, pero se hincha en una masa transparente pastosa con agua. Esta goma ha adquirido una gran importancia en los últimos años y se ha exportado anualmente de la India para su uso en la pasta de cigarros y en la industria de helados (Ojha, A. K., Maiti, D., Chandra, K., Mondal, S., Roy, D. D. S. K., Ghosh, K., e Islam, S. S. (2008). Structural assignment of a heteropolysaccharide isolated from the gum of Cochlospermum religiosum (Katira gum). Carbohydrate research, 343(7), 1222-1231).

Se ha informado que la carboximetilación, así como la carbamoiletilación, de la goma Cassia mejora la solubilidad en agua fría, mejora la viscosidad e incrementa la resistencia microbiana en comparación con la goma nativa (Sharma, B. R., Kumar, V., y Soni, P. L. (2003). Carbamoylethylation of Cassia tora gum. Carbohydrate polymers, 54(2), 143­ 147; Soni, P. L., y Sharma, P. (2000). Cassia tora gum as viscosifier and fluid loss control agent. Solicitud de Patente India, (680)). Por lo tanto, Rai et al (Rai, P. R., Tiwary, A. K., y Rana, V. (2012). Superior disintegrating properties of calcium cross-linked Cassia fistula gum derivatives for fast disolver tablets. Carbohydrate Polymers, 87(2), 1098-1104) intentaron incorporar sales de calcio o sodio de goma de C. fistula carboximetilada o carbamoiletilada como un superdisgregante en el desarrollo de formulaciones de FDT. Por tanto, la presente invención se refiere al método para convertir una goma katira insoluble en agua, con baja capacidad de esparcimiento y altamente hinchable en una carbamoiletil katira soluble en agua, altamente hinchable, altamente esparcible.

Las microondas comprenden radiación electromagnética en el rango de frecuencia de 300 MHz a 300 GHz. Con la exposición a microondas, las partículas cargadas o polares tienden a alinearse ellas mismas con el componente de campo eléctrico de las microondas que revierte rápidamente su dirección, p. ej., a la velocidad de 2,4 x 109/s a una frecuencia de microondas de 2,45 GHz. Como las partículas polares o cargadas en un medio de reacción no pueden alinearse ellas mismas tan rápido como cambia la dirección del campo eléctrico de las microondas, se crea una fricción para calentar el medio (Galema, S. A. (1997). Microondas chemistry. Chem. Soc. Rev., 26(3), 233-238). Este calor generado podría utilizarse para proporcionar la energía de activación para la reacción. Además, en el proceso de calentamiento con microondas, las altas temperaturas conseguidas y la capacidad de trabajar bajo condiciones de alta presión durante tiempos relativamente cortos, hace que las reacciones sean más rápidas que bajo las condiciones térmicas convencionales, y limitan la aparición de reacciones secundaras más lentas. Por tanto, habitualmente se obtienen mayores rendimientos. (Kappe, C. O. (2004). Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angewandte Chemie Edición Internacional, 43(46), 6250-6284). Por tanto, la presente invención utilizó un método asistido por microondas alternativo para preparar carbamoiletil katira a partir de goma katira.

El tratamiento del ojo seco plantea un desafío sustancial al médico. Los objetivos principales en el tratamiento en pacientes con la enfermedad del ojo seco son mejorar el confort y la calidad de vida del paciente, y hacer que la superficie ocular y la película lagrimal vuelvan al estado homeostático normal. Los síntomas pueden eliminarse raramente, pero frecuentemente pueden mejorarse. Los lubricantes oculares se usan para incrementar la humedad en la superficie ocular (Pinho Tavares, F. D., Fernandes, R. S., Bernardes, T. F., Bonfioli, A. A., y Carneiro Soares, E. J. (2010, mayo). Dry eye disease. In Seminars in ophthalmology (Vol. 25, No. 3, p. 84-93). Londres, Reino Unido: Informa UK Ltd).

Se encontró que el extracto obtenido de hojas y flores de Cochlospermum religiosum linn contenía alcaloides, esteroides, glicósidos, saponinas, flavonoides, taninos y fenoles. Sin embargo, no existen informes disponibles para ninguna actividad antibacteriana de la goma katira. Globalmente, la presente invención implica un proceso para la preparación de una disolución de lubricante ocular de carbamoiletil Katira empleando asistencia con microondas. La técnica incluye el uso de microondas que proporcionan la energía de activación de la reacción mucho más rápido que el calentamiento en un baño de agua. Además, la distribución no uniforme de la velocidad de calentamiento en un baño de agua da lugar algunas veces a la ruptura del enlace a-(1-4) presente en los polisacáridos. Por tanto, el proceso asistido por microondas para la síntesis de la disolución de lubricante ocular de carbamoiletil Katira es rápido, seguro y aceptable industrialmente.

Objetivos de la invención

El objetivo principal de la presente invención es proporcionar una formulación de lubricante de carbamoiletil katira.

El otro objetivo de la presente invención es proporcionar un proceso para la preparación de la formulación de lubricante de carbamoiletil katira.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un proceso asistido por microondas para la preparación de la formulación de lubricante de carbamoiletil katira.

Otro objeto más es proporcionar la formulación de lubricante de carbamoiletil katira efectiva para el remedio de la enfermedad del ojo seco.

Otro objeto más es proporcionar la formulación de lubricante de carbamoiletil katira efectiva frente a la enfermedad del ojo seco en comparación con Refreash tears (NaCMC al 0,5 % p/v) e Hiperomelosa (HPMC al 0,3 % p/v) disponibles en el mercado.

Otro objetivo de la presente invención se refiere a la formulación de lubricante de carbamoiletil katira que tiene actividad antibacteriana útil para formulaciones basadas en lubricante ocular, tratamiento del síndrome de la enfermedad del ojo seco, etc.

Resumen de la invención

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una formulación de lubricante de carbamoiletil katira que comprende goma katira en el rango del 5 % p/v al 10 % p/v carbamoiletil en el rango del 5 % p/v al 10 % p/v y aditivos.

En una realización, dicha goma katira se obtiene de Cochlospermum religiosum.

En una realización, dichos aditivos se seleccionan del grupo que consiste en un tensioactivo, emulsionante, y combinaciones de los mismos, en una emulsión basada en agua.

En una realización preferida, dicha formulación muestra actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus. En otra realización preferida, dicha formulación es para su uso en el tratamiento de la enfermedad del ojo seco. En una realización adicional, un proceso para la preparación de la formulación de lubricante de carbamoiletil katira en donde dicho proceso comprende las siguientes etapas:

a) empapar la goma katira en agua durante un periodo de tiempo de 14 a 20 h para obtener un gel homogeneizado; b) agitar el gel homogeneizado obtenido en la etapa (a) durante 30 a 45 minutos seguido de la adición de 25 ml de una disolución de hidróxido de sodio del 28 % p/v al 44 % p/v enfriada en hielo con agitación y agitación adicional durante 30 min después de la adición de hidróxido de sodio enfriado en hielo para obtener una mezcla de reacción básica;

c) añadir del 11 % p/v al 18 % p/v de acrilamida a la mezcla de reacción básica obtenida en la etapa (b) con agitación constante durante 1 h para obtener una mezcla de reacción;

d) irradiar la mezcla de reacción obtenida en la etapa (c) en un reactor de microondas a 450 watios durante un periodo de tiempo de 0,5 a 1 min seguido de un ciclo de enfriamiento durante un periodo de tiempo de 1 a 2 min a una temperatura de 4 °C a 10 °C en un baño de hielo;

e) repetir la etapa (d) de 3 a 7 veces seguido de neutralización con ácido acético glacial diluido para obtener una mezcla de reacción neutralizada;

f) precipitar la mezcla de reacción neutralizada obtenida en la etapa (e) con disolventes seguido de lavado con disolvente de precipitación para obtener un precipitado de carbamoiletil katira;

g) filtrar y secar los precipitados de carbamoiletil katira obtenidos en la etapa (f) para obtener carbamoiletil katira; h) disolver del 2,5 % al 10 % p/v de carbamoiletil katira obtenida en la etapa (g) en agua estéril para inyección tibia seguido de filtración a través de un sistema de filtración de 0,22 g para obtener una formulación de lubricante de carbamoiletil katira;

i) esterilizar la formulación de lubricante de carbamoiletil katira obtenida en la etapa (h) a una temperatura en el rango de 121 °C a 118 °C durante un periodo de tiempo de 20 a 40 minutos para obtener una formulación de lubricante esterilizada.

En otra realización más, la relación de ácido acético glacial y agua es 1:1 para la neutralización de la reacción. En otra realización preferida adicional, el secado de la carbamoiletil katira se lleva a cabo usando liofilización a una temperatura en el rango de -80 °C durante un periodo de tiempo de 72 a 96 h o secado en horno a una temperatura seleccionada en el rango de 45 a 55 °C durante un periodo de tiempo seleccionado en el rango de 3,5 a 4,5 días o 60 °C durante un periodo de tiempo seleccionado en el rango de 1,5 a 2,5 días para obtener la formulación de carbamoiletil katira.

En la presente memoria también se describe un proceso para la preparación de carbamoiletil katira, una nueva disolución de lubricante ocular en el tratamiento farmacéutico y nutraceútico, en general, y para el tratamiento de la enfermedad del ojo seco.

En otra realización más, la carbamoiletil katira se prepara a partir de una goma katira pura obtenida de Cochlospermum religiosum.

En otra realización adicional, se obtiene una disolución de lubricante ocular de carbamoiletil katira por el proceso como se ha mencionado.

En otra realización adicional, una disolución estéril donde la disolución estéril es útil como lubricante ocular efectivo para el remedio de la enfermedad del ojo seco.

Otra realización más, una disolución estéril tiene actividad de lubricante ocular a una concentración mayor del 2,5 % p/v.

Otra realización más, se prepara la formulación para la administración ocular que tiene del 2,5 %-10 % p/v de disolución de lubricante ocular de carbamoiletil katira.

Descripción breve de las figuras

La Fig. 1 Ilustra la síntesis y ventaja de la goma de carbamoiletil katira

La Fig. 2 Ilustra una imagen de microscopía electrónica de barrido de goma katira y goma de carbamoiletil katira

La Fig. 3 Ilustra un gráfico de la viscosidad frente al tiempo para (a) una disolución de goma de carbamoiletil katira no esterilizada (al 3 % p/v); (b) una disolución de goma de carbamoiletil katira esterilizada (al 3 % p/v) a una velocidad de cizallamiento constante (40 s-1)

La Fig. 4 Ilustra la correlación de la viscosidad frente al tiempo para (a) una disolución de goma de carbamoiletil katira no esterilizada (al 5 % p/v); (b) una disolución de goma de carbamoiletil katira esterilizada (al 5 % p/v) a una velocidad de cizallamiento constante (40 s-1)

La Fig. 5 Ilustra la actividad antioxidante de DPPH de la disolución de goma de carbamoiletil katira/carboximetil katira (a) actividad secuestrante de radicales libres de DPPH; (b) actividad secuestrante de peróxido de hidrógeno

La Fig.6 Ilustra la medición de la secreción de lágrimas en ojos de conejos empleando el ensayo de Schirmer Fig. 7 Tabla 14 Resultados del ensayo de Draize

Fig. 8 Tabla 16 Resultados del modelo animal de ojo seco

Tabla 1 Efecto de la concentración de hidróxido de sodio en carbamoiletil katira

Tabla 2 Diseño factorial completo 32 para la síntesis de goma de carbamoiletil katira

Tabla 3 Resultados de MALDI-TOF de goma de carbamoiletil katira

Tabla 4 Resultados de la descripción reológica evaluada usando retroextrusión

Tabla 5 Resultados de la actividad bacteriostática de la goma de carbamoiletil/carboxietil katira frente a Staphylococcus aureus usando un método de disolución seriada en medio líquido

Tabla 6 Resultados de la actividad bactericida de la goma de carbamoiletil/carboxietil katira frente a Staphylococcus aureus usando un método de punto final o punto de extinción

Tabla 7 Diversas formulaciones de lubricante ocular de goma de carbamoiletil/carboxietil katira

Tabla 8 Propiedades físicas de diferentes disoluciones de lubricantes oculares

Tabla 9 Efecto de la concentración de la disolución de lubricante ocular en el tamaño de las gotas Tabla 10 Efecto de la tensión superficial en el tamaño de las gotas dispensadas de una botella gotero de plástico

Tabla 11 El efecto en el tamaño de gota medio de la disolución de lubricante ocular de goma de carbamoiletil/carboxietil katira cuando se dispensa a un ángulo de 45° y 90°

Tabla 12 Resultados de la actividad antimicrobiana in-vitro de una disolución de lubricante ocular Tabla 13 Resultados del estudio de estabilidad de las formulaciones

Tabla 15 Resultados del ensayo de schirmer para la secreción lagrimal

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo lubricante ocular a partir de una carbamoiletil katira y a su ventaja como un potencial lubricante ocular antibacteriano para la enfermedad del ojo seco. La etapa inicial de la presente invención se refiere a la carbamoiletilación de la goma katira, comprende goma katira, acrilamida (prop-2-enamida; CH²=CH-CONH² ; como reactante), sistema de calentamiento como microondas operado a diferentes condiciones, etapa de precipitación que se lleva a cabo con diferentes disolventes (acetona, metanol, etanol, acetona:etanol), fase de secado en horno a diferentes condiciones (45 °C durante 3,5 días, 60 °C durante 2,5 días, 65 °C durante 38 h o 70 °C durante 28 h). La presente invención se refiere a una composición de lubricante ocular que trata la enfermedad del ojo seco.

Los parámetros de la reacción, que influyen en el proceso de carbamoiletilación, son el sistema de disolvente, composición del disolvente, concentración de hidróxido de sodio y concentración de acrilamida, tiempo de la reacción y temperatura de la reacción.

La carbamoiletilación se realizó empleando la técnica de microondas, además técnicas convencionales que no proporcionan la carbamoiletilación de la goma katira insoluble en agua.

La presente invención incluye etapas de reacción como:

Katira O H NaOH -----------► Katira-ONa

Tratamiento

con microondas

Katira-ONa Acrilamida (CHi-CH-CONH;)----------* Katíra-O CH2-CH2-CONH:

La presente invención detalló el proceso de carbamoiletilación variando los parámetros del proceso tales como la concentración de hidróxido de sodio, la concentración de acrilamida, radiación con microondas, tiempo de radiación con microondas, sistema del disolvente de precipitación y fase de secado. Se examinó el efecto de la variación de la concentración de hidróxido de sodio de la radiación con microondas (450 watios durante 5 ciclos, cada ciclo 0,5 min/ciclo seguido de 2 min de ciclo de enfriamiento) en el grado de sustitución. El grado de sustitución (DS) del polímero es el número promedio de grupo de sustitución (-O-CH²-CH²-COONa) unido por unidad básica.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos, que incluyen realizaciones preferidas, servirán para ilustrar la práctica de esta invención, entendiéndose que los particulares mostrados son como ejemplo y para el propósito de una discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la invención.

Ejemplo-1: cribado de la concentración de álcali para obtener un rendimiento máximo de carbamoiletil katira

La goma katira (1 gm) se empapó en 100 mL de agua hasta que la goma se hinchó completamente. La disolución de goma homogeneizada se agitó durante 30 min con la adición lenta de 25 ml de disolución de hidróxido de sodio al 28 % p/v, 36 % p/v o 44 % p/v enfriada en hielo (Tabla 1). Separadamente, se mezcló acrilamida al 18 % p/v (con respecto al volumen total de la mezcla de reacción) con disolución de goma katira alcalina con agitación constante durante 1 h. La mezcla preparada se sometió a microondas (7 ciclos, 450 W) durante 0,5 min de ciclo cliente seguido de 1 min de ciclo de enfriamiento. Esta disolución se mantuvo toda la noche para completar la reacción y por neutralización con ácido acético glacial diluido (1:1:: ácido acético glacial:agua). La mezcla de reacción neutralizada se precipitó con acetona seguido de lavado con el disolvente de precipitación respectivo. Los precipitados de carbamoiletil katira se filtraron y secaron usando liofilización a una temperatura en el rango de -80 °C durante un periodo de tiempo de 72 a 96 h. Por tanto, se seleccionó la concentración de hidróxido de sodio del 36 % p/v.

Tabla 1 Efecto de la concentración de hidróxido de sodio en la carboximetil katira

Ejemplo-2

La goma katira (1 gm) se empapó en 100 mL de agua hasta que la goma se hinchó completamente. La disolución de goma homogeneizada se agitó durante 30 min con la adición lenta de 25 ml de disolución de hidróxido de sodio al 36 % p/v enfriada en hielo (Tabla 1). Separadamente, se mezcló acrilamida al 18 % p/v (con respecto al volumen total de la mezcla de reacción) con disolución de goma katira alcalina con agitación constante durante 1 h. La mezcla preparada se sometió a microondas (3-7 ciclos, 450 W) durante 0,5 min/ciclo seguido de 1-2 min de ciclo de enfriamiento. Esta disolución se mantuvo toda la noche para completar la reacción y por neutralización con ácido acético glacial diluido (1:1:: ácido acético glacial:agua). La mezcla de reacción neutralizada se precipitó con acetona seguido de lavado con el disolvente de precipitación respectivo. Los precipitados de carbamoiletil katira se filtraron y secaron usando liofilización a una temperatura en el rango de -80 °C durante un periodo de tiempo de 72 a 96 h.

El proceso para la síntesis de carboximetil katira se llevó a cabo según un diseño factorial completo de tres niveles, dos factores (32) (Gohel, M., Patel, M., Amin, A., Agrawal, R., Dave, R., y Bariya, N. (2004). Formulation design and optimization of mouth dissolve tablets of nimesulide using vacuum drying technique. AAPs PharmSciTech, 5(3), 10­ 15). El X¹ fue la cantidad de acrilamida añadida y X² fue el número de ciclos. Durante los estudios preliminares, se observó que se requiere la concentración óptima de hidróxido de sodio, es decir, 25 ml del 36 % p/v para completar la reacción. Con esta concentración de hidróxido de sodio, el % de contenido de nitrógeno disminuye. Por lo tanto, la composición de hidróxido de sodio se fijó a 25 ml del 36 % p/v. Se encontró que la cantidad de acrilamida y el número de ciclos de calentamiento durante el tratamiento con microondas mostraban un efecto significativo en el grado de sustitución (en términos de % de contenido de nitrógeno) y en el % de rendimiento de carbamiletil katira.

Por tanto, se tomaron ambos factores para optimizar la síntesis de carbamoiletil katira. Los resultados se mostraron en la Tabla 2. Las ecuaciones generadas mediante regresión lineal múltiple son:

Yi = 0.26+0.053Xi+0.026X2 ; (R2 = 0.9317)

Y2= 92.21+2.78X^j+1.OOX²+O.25X^jX2+ 0.53X!2+0.38X22 ; (R2 = 0.9824)

Las ecuaciones mostraron una correlación directa de Y¹ (grado de sustitución) e Y² (rendimiento) en X¹ y X². Además, el incremento de la cantidad de monómero (X¹) y no. de ciclos durante el tratamiento con microondas (X²) incrementó el rendimiento y el grado de sustitución. Se encontró que el rendimiento y grado de sustitución máximo se obtenía al 18 % p/v (con respecto al volumen total de la mezcla de reacción) de monómero y 7 ciclos de tratamiento con microondas

(450 W, 0,5 min/ciclo), es decir, la síntesis S⁹. Por lo tanto, se sintetizó más carbamoiletil katira con el método de S⁹ para obtener un rendimiento del 97,5 %.

Tabla 2 Diseño factorial completo 32 para la síntesis de carbamoiletil katira

Ejemplo-3: determinación del grado de sustitución (D.S.)

Se calculó el grado de sustitución de la goma de carbamoiletil katira usando el % de contenido de nitrógeno de la goma de carbamoiletil katira. El % del contenido de N se determinó por un analizador elemental. El DS se midió usando la siguiente fórmula:

p g = 162 X %N

1400 -( 71 X %¿V)

Ejemplo-4: caracterización de la carbamoiletil katira

A. Los espectros de FTIR de la goma Katira secada o muestras de Carbamoiletil Katira derivatizada se registraron en un espectrofotómetro ATR-FTIR (Bruker, alfa E, Alemania). El polvo seco se usó para el análisis espectral. Los espectros de FTIR se escanearon en el rango de longitud de onda de 400-4.000 cm-1.

B. Las mediciones de DSC se realizaron en muestras en polvo de goma Katira o goma de Carbamoiletil Katira empleando un calorímetro de barrido diferencial (812E, Mettler Toledo, Suiza) en el rango de 40 a 350 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min.

C. Los datos de difracción de rayos X de polvo se adquirieron con un Difractómetro Analítico (XPERT PRO, PANalyticals, Almelo, Países Bajos) equipado con un detector contador de centelleo y un haz divergente. Se usó un monocromador de Johansson para producir una radiación pura de Cu k[a]1 (1,5406 A°; 45 kV; 40 mA; rango 10°-80° 20). Las muestras se aplastaron hasta un polvo fino y se presionaron en un soporte de muestras. Los datos de difracción de rayos X se recogieron a una temperatura de 25 °C y se escanearon con un tamaño de etapa de 0,017020 y un tiempo de escaneo de 20 seg en cada etapa.

D. Los espectros de 1H RMN se registraron en un espectrómetro de RMN BRUKER ADVANCE II 400 a 25 °C en D²O. La muestra purificada se puso en una sonda de muestra y se obtuvo el espectro de resonancia. Los desplazamientos químicos se reportaron en ppm en relación a un estándar interno de D²O.

E. Las características morfológicas de la goma katira y Carbamoiletil Katira se estudiaron con un microscopio electrónico de barrido (JSM-6510, Jeol, Tokio, Japón). La muestra secada se montón en un porta muestra metálico y se pulverizó con oro con el fin de hacer que la muestra sea conductora y se tomaron las imágenes a un voltaje acelerante de 10KV y a un aumento variado.

F. El peso molecular de la carbamoiletil katira se determinó por Espectroscopía de Masa MALDI TOF. Se mezcló la disolución de carbamoiletil katira (al 1 % p/v, 2 pl) con 2 pl de la disolución de matriz (10 mg/ml de ácido 2,5-dihidroxibenzoico en TFA:CH3CN::1,75:0,75; v/v) y se aplicó un total de 2 pl de esta disolución a un portaobjetos de muestra de acero inoxidable y se secó en vacío. Los espectros de masas MALDI-TOF de la carbamoiletil katira se registraron en modo de reflectrón usando un espectrómetro de masa MALDI-TOF TOF/TOF ultraflex (Bruker Daltonics) equipado con extracción iónica retrasada. Los espectros de múltiples disparos de láser (100) (láser de N²) se resumieron usando un voltaje de reflectrón de 25 kV.

Los espectros de FTIR de la goma Katira mostraron picos anchos en el rango de 3.000-3.500 cm-1 que podrían deberse a la vibración extendida del enlace de hidrógeno (O-H). Los picos característicos a 1.720 cm-1 y 1.596 cm-1 se deben a la extensión del grupo carbonilo de la goma katira. La modificación de esta goma a Carbamoiletil Katira mostró picos característicos a 1.673 cm-1, 1.555 cm-1, 1.405 cm-1 y 1.013 cm-1 indicados por la unión química del monómero con la goma pura. El pico observado a 1.555 cm-1 se debe a la banda amida I de la extensión de carbonilo y a 1.405 cm-1 se debe a la banda amida II de curvatura de N-H. El pico observado a 1.013 cm-1 se debe a la vibración extendida de C-O-C del grupo éter. Gupta et al., (Gupta, S., Sharma, P., y Soni, P. L. (2005). Chemical modification of Cassia occidentalis seed gum: carbamoylethylation. Carbohydrate polymers, 59(4), 501-506) observaron un pico similar para esta derivatización.

El termograma de DCS de la goma katira mostró dos transiciones endotérmicas a 45,786 °C (AH=0,422 J/g) y 87,18 °C (AH=146,962 J/g) y una transición exotérmica a 256,962 °C (AH=-6,544 J/g). Sin embargo, la Carbamoiletil Katira derivatizada mostró dos transiciones endotérmicas a 97,644 °C (AH=161,262 J/g) y 233,63 °C (AH=32,461 J/g) y una transición exotérmica a 265,033 °C (AH=-49,802 J/g).

Las difracciones de rayos X de polvo de la goma Katira y Carbamoiletil Katira mostraron un patrón regular de difracción de rayos X de la goma de katira que refleja la naturaleza amorfa de la goma pura. Sin embargo, el patrón de difracción de rayos X de la goma de Carbamoiletil Katira mostró picos a 20 de 16,96°, 20,6°, 22,55°, 25,18°, 29,72°, 30,82°, 36,6° lo que indica la naturaleza cristalina de la goma de Carbamoiletil Katira.

En los espectros de 1H RMN de la goma Katira, el valor del desplazamiento químico a 51-3 ppm pertenece a átomos de hidrógeno secundarios de la cadena lateral unidos al anillo de galactopiranosa en la unidad de polisacárido. Los espectros de 1H RMN de la goma de Carbamoiletil Katira mostraron múltiples divisiones de la región de pico sin de 5 1-3 ppm, lo que sugiere un incremento en el número de átomos de hidrógeno secundarios y un valor del desplazamiento químico a 5-7 ppm indicado por átomos de hidrógeno unidos a los grupos acilamino y carboxilo. Se observaron valores del desplazamiento químico similares para esta derivatización por Ren etal., (Ren, J. L., Peng, F., y Sun, R. C. (2008). Preparation of hemicellulosic derivatives with bifunctional groups in different media. Journal of agricultural and food chemistry, 56(23), 11209-11216).

Las imágenes de SEM sugirieron partículas de forma irregular de la goma katira que tienen una superficie rugosa. Sin embargo, las imágenes de SEM de la goma de Carbamoiletil Katira mostraron cristales de goma de Carbamoiletil Katira (Figura 2). Por tanto, los resultados estuvieron de acuerdo con los estudios de los espectros de XRD. De los espectros de masa MALDI-TOF de Carbamoiletil Katira, se ha observado que el peso molecular de la goma de Carbamoiletil Katira es aproximadamente 1.466 g/mol. El patrón de fragmentación de la molécula de goma de Carbamoiletil Katira con su valor de m/z respectivo se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3 Resultados de MALDI-TOF de la goma de carbamoiletil katira

Galp- galactopiranosa, Rhap- rhamnopiranosa, M- monómero de acrilamida unido

Ejemplo-5

La carbamoiletil katira se analizó para determinar diferentes características del polvo como densidades aparentes y de compactación, relación de Hausner, índice de compresibilidad, ángulo de reposo, capacidad de hinchamiento y radio de poro efectivo (Refp). Se encontró que la densidad aparente, densidad de compactación, relación de Hausner, índice de Carrs, ángulo de reposo, capacidad de hinchamiento y radio de poro efectivo (Refp) eran 1,18±0,03 g/ml, 1,21±0,03 g/ml, 1,02±0,13, 2,47±0,14, 25,98±0,57, 215±0,12 y 0,0259±0,33 mm, respectivamente, según se menciona en USP30 NF25.

Ejemplo-6: estabilidad de la disolución de goma de carbamoiletil katira después de autoclavar empleando ftir-atr

La estabilidad de la disolución de goma para su resistencia a la temperatura de autoclave se examinó usando análisis espectral FTIR-ATR. La disolución de goma de carbamoiletil katira esterilizada (al 1 -10 % p/v) se sometió a FTIR-ATR y los espectros obtenidos se compararon con la disolución de goma de carbamoiletil katira no esterilizada (al 1-10 % p/v).

Los espectros de FTIR-ATR de la disolución de goma no esterilizada al 1 % p/v mostraron picos a 1.216,46 cm-1, 1.413,53 cm-1, 1.551,70 cm-1, 1.644,42 cm-1, 1.795,36 cm-1 y 3.236,68 cm-1. Se observaron picos similares con una magnitud aumentada en los espectros de FTIR-ATR de disoluciones de goma al 5 % p/v y 10 % p/v. Los espectros de FTIR-ATR de disoluciones de goma de carbamoiletil katira esterilizadas al 1 %, 5 %, y 10 % p/v mostraron los picos característicos prominentes similares a 1.515,73 cm-1, 1.546,42 cm-1 y 1.461,93 cm-1, lo que indica que la disolución de goma era estable incluso después del autoclavado.

Ejemplo-7: análisis de viscosidad

Las disoluciones de goma de carbamoiletil katira de diferentes concentraciones se analizaron para determinar la viscosidad usando un viscosímetro de tipo exterior hueco (cup) e interior macizo (bob) (Modelo CLTD80/QC Anton Paar Rheolab QC) con husillo CC27. La muestra (19 ml) se empaquetó en el muestreador (cup) y después el husillo se bajó en el muestreador. Antes del inicio de la medición, la temperatura se mantuvo a 25 °C. Las viscosidades aparentes en centipoises se midieron sobre una velocidad de cizallamiento constante (40 s-1). El análisis de la viscosidad de las disoluciones de goma de carbamoiletil katira (al 3 % p/v y al 5 % p/v) antes y después de la esterilización se hicieron con un viscosímetro de tipo exterior hueco (cup) e interior macizo (bob) (Modelo CLTD80/QC Anton paar Rheolab QC).

Los gráficos de viscosidad frente a tiempo generados a diferentes concentraciones se mostraron en las Figuras 3 a 4. Los resultados sugirieron un comportamiento tixotrópico de la disolución de carbamoiletil katira no esterilizada al 3 % p/v y

5 % p/v. Sin embargo, la disolución de carbamoiletil katira esterilizada al 3 % p/v mostró un comportamiento reopéxico, mientras que la disolución de carbamoiletil katira al 5 % p/v mantuvo un comportamiento tixotrópico incluso después de la esterilización.

De hecho, se ha mostrado experimentalmente que una disolución oftálmica, con el fin de tener un tiempo de residencia prolongado en la superficie corneal mientras, que, al mismo tiempo, se tolere bien por el paciente, no debe tener una viscosidad constante la de los como fluidos newtonianos, sino que debe comportarse como un comportamiento tixotrópico no newtoniano, es decir, debe mostrar una disminución de la viscosidad con una velocidad de cizallamiento creciente. Solo este tipo de reología puede ofrecer una alta viscosidad en la película lagrimal precorneal en reposo, de manera que en ausencia de cualquier estrés, la película se adhiere a la superficie corneal sin caerse y, al mismo tiempo, puede proporcionar una baja viscosidad en la película lagrimal durante un movimiento de parpadeo, cuando la película está sometida a un estrés de cizallamiento, de manera que la disolución oftálmica se tolera bien y se distribuye por el parpadeo en la superficie corneal completa sin estar desplazada masivamente debido a la fricción hacia el borde del párpado inferior como se muestra por la disolución oftálmica basada en polisacárido de semilla de tamarindo (Saettone, M. F., Burgalassi, S., Giannaccini, B., Boldrini, E., Bianchini, P., y Luciani, G. (2000). Patente de EE. UU. No. 6.056.950. Washington, DC: Oficina de Patentes y Marcas de EE. UU.).

Ejemplo-8: análisis de la textura

Se realizaron retroextrusión (BE) y ensayo mecánico de penetración de cono para investigar los descriptores del comportamiento reológico de la disolución de goma de carbamoiletil katira. Ambos experimentos se realizaron usando un analizador de textura TA XT Plus (Stable Micro Systems Ltd., Godalming, Reino Unido).

Los resultados obtenidos a partir de los análisis de textura de diferentes concentraciones de disolución de goma de carbamoiletil katira empleando un anillo de retroextrusión se muestran en la Tabla 4. La firmeza, consistencia, cohesividad e índice de viscosidad de la disolución de goma de carbamoiletil katira se incrementaron con un incremento de la concentración de carbamoiletil katira. Los resultados mostraron una mayor firmeza y consistencia de las concentraciones al 5 % y 10 % p/v no esterilizadas. La región negativa del gráfico representa el trabajo de cohesión e índice de viscosidad. Cuanto mayor es el valor, más resistencia para tomar la muestra. Por tanto, esto es un reflejo de la viscosidad de la muestra. Se encontró que el trabajo máximo de cohesión e índice de viscosidad era para las concentraciones al 5 % y 10 % p/v. Sin embargo, se observó una diferencia no significativa (p>0,05) cuando los predictores reológicos se compararon con muestras estériles a muestras no esterilizadas. Por tanto, la goma de carbamoiletil katira es estable y adecuada para su uso en sistemas de administración incluso después de la esterilización.

Tabla 4 de descripción reológica evaluada usando un anillo de retroextrusión

CEKG = goma katira carbamoiletilada, u=no esterilizada, s= esterilizada

Ejemplo-9: evaluación in-vitro de la actividad antimicrobiana de la disolución de goma de carbamoiletil katira/carboximetil katira frente a staphylococcus aureus

La actividad antimicrobiana in vitro de la goma de carbamoiletil katira/carboximetil katira se examinó frente a Staphylococcus aureus. Los derivados de goma de carbamoiletil katira/carboximetil katira se ensayaron para determinar la actividad bacteriostática y bactericida.

Preparación de un cultivo de 24 h de Staphylococcus aureus

Las cepas bacterianas puras (Staphylococcus aureus) se obtuvieron del Departamento de Biotecnología, Universidad de Punjabi, Patiala. Para la preparación del cultivo de 24 h, se preparó un caldo de nutrientes estéril mezclando una cantidad definida de peptona (al 5 % p/v), extracto de levadura (al 2 % p/v), extracto de buey (al 1 % p/v) y cloruro de sodio (al 5 % p/v) en agua destilada, el pH se ajustó a 7,2 según la Farmacopea India (2010) y se sometió a autoclave a 15 psi durante 30 minutos. El caldo estéril se inoculó con Staphylococcus aureus en condiciones asépticas y se incubó durante 24 h a 37 °C para obtener un cultivo de 24 h.

Actividad bacteriostática

La actividad bacteriostática de carbamoiletil katira/carboximetil katira se determinó por métodos de dilución seriada en medio sólido y dilución seriada en medio líquido (Benthley"s "Textbook of Pharmaceutics", EA Rawlins (Editor). Londres: Casella nsCollier Macmilan Publishers Limited: 516).

Método de dilución seriada en medio líquido

Se prepararon diversos tubos de ensayo conteniendo cada uno 5 ml de disolución de goma (al 1-10 % p/v), caldo de cultivo de 24 h de S. aureus (0,5 ml), cultivo de caldo de nutrientes esterilizado (5 ml). Además de las muestras de ensayo, también se prepararon los blancos respectivos. Para el ensayo, cada tubo de ensayo que contenía la disolución de goma se inoculó con 0,5 ml de caldo de cultivo de S. aureus, después se transfirió 1 ml de la disolución de goma inoculada a los tubos de ensayo que contenían 5 ml de cultivo de caldo de nutrientes después de un intervalo de tiempo de 4 h, 12 h y 24 h y estos tubos de ensayo se incubaron durante 24 h a 37 °C. Se examinó el crecimiento midiendo la absorbancia de la muestra a 540 nm frente a un banco que contenía cultivo de caldo de nutrientes (5 ml) y 1 ml de la disolución de goma respectiva (sin inóculo). El efecto de la inhibición microbiana se calculó como sigue;

% de Efecto de inhibición

100

donde, Ac = Absorbancia del control, As = Absorbancia de la muestra

Método de dilución seriada en medio sólido

Se preparó una disolución madre de medio agar de sal de manitol disolviendo 38 g de medio en un litro de agua destilada tibia en un matraz cónico. El medio de cultivo preparado y las placas petri se esterilizaron separadamente a 15 psi durante 30 minutos. También se prepararon disoluciones de goma de concentraciones (al 1-10 %). Se añadieron 5 ml de disolución de goma (cada concentración) a 15 ml de medio base de agar de sal de manitol esterilizado y se vertieron en las placas petri (90 mmx15 mm) hasta que solidificó en condiciones asépticas. Se extendió sobre el medio una suspensión de un cultivo de toda la noche de S. aureus. Las placas se incubaron (37 °C; 24 h) y se observaron para detectar un crecimiento visible.

Actividad bactericida

La actividad bactericida de carbamoiletil katira/carboximetil katira se estimó por el método de punto final o punto de extinción (Benthley"s "Textbook of Pharmaceutics", EA Rawlins (Editor). Londres: Casella nsCollier Macmilan Publishers Limited: 518-523). Se emplearon dos tipos de método de extinción: (a) en el que el tiempo de extinción es fijo, se estima la concentración de agente bactericida necesaria para matar en el tiempo específico (b) en el que la concentración de bactericida es fija, se estima el tiempo de extinción. Se prepararon diversos tubos de ensayo conteniendo cada uno

2,5 ml de disolución de goma (al 1-10 % p/v), caldo de cultivo de 24 h de S. aureus y se prepararon muestras de ensayo con los blancos respectivos. Además de las muestras de ensayo, también se prepararon los blancos respectivos. Los tubos de ensayo que contenían disolución de goma se inocularon con 2,5 ml de caldo de cultivo de S. aureus . Se examinó el crecimiento midiendo la absorbancia de la muestra a 540 nm frente a un banco que contenía la disolución de goma respectiva (sin inóculo) después de una incubación de 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h y 3 h. El efecto bactericida se calculó como sigue;

% de Efecto bactericida -

x 100

AC

donde, Ac = Absorbancia del control, As = Absorbancia de la muestra

El tiempo de extinción fue el tiempo del último crecimiento en el que se obtuvo por primera vez el 100 % del efecto bactericida a la concentración fijada de goma de carbamoiletil katira/carboximetil katira. La concentración inhibidora mínima (MIC) es la concentración de carbamoiletil katira/carboximetil katira en el tiempo de extinción menor. El tiempo de muerte medio para la goma de carbamoiletil katira/carboximetil se calculó por:

I Tiempo de extinción

MDT = -------------------------------------

No. de tiempo de extinción

Tabla 5 Resultados de la actividad bacteriostática de la goma de carbamoiletil/carboxietil katira frente a Staphylococcus aureus usando el método de la dilución seriada en medio líquido

Abs= absorbancia, % IE= porcentaje de inhibición, CEKG = goma de katira carbamoiletilada, CMKG = goma de katira carboximetilada

La actividad antimicrobiana in vitro de la goma de carbamoiletil katira/carboximetil katira se examinó frente a Staphylococcus aureus. La actividad bacteriostática de carbamoiletil katira/carboximetil katira se determinó por los métodos de dilución seriada en medio sólido y dilución seriada en medio líquido. La actividad bactericida de carbamoiletil katira/carboximetil katira se estimó por el método de punto final o tiempo de extinción. La magnitud de la absorbancia obtenida fue el indicador del crecimiento de las bacterias. La depresión en la magnitud de la absorbancia con el tiempo reveló una disminución del crecimiento de Staphylococcus aureus, independientemente de la concentración de carbamoiletil katira/carboximetil katira añadida al medio del caldo (Tabla 5). Esto sugirió que ambos derivados presentan actividad bacteriostática. Sin embargo, se encontró que la intensidad del efecto aumentaba cuando se usaba la disolución de carbamoiletil katira del 5 % p/v al 10 % p/v. Para confirmar adicionalmente la actividad bacteriostática, también se usó una dilución seriada en medio sólido. Se encontró que la CFU disminuía con un incremento de la concentración de carbamoiletil katira/carboximetil katira. Se encontró que la CFU era cero cuando se añadía carbamoiletil katira/carboximetil katira al 5 % p/v en medio de agar. A partir de los resultados, podría concebirse que la carbamoiletil katira mostraba una actividad bacteriostática aumentada respecto a DP-I. Por tanto, los descubrimientos aseguran que la carbamoiletil katira al 5 % p/v

Tabla 6 Resultados de la actividad bactericida de la goma carbamoiletil/carboxietil katira frente a Staphylococcus aureus usando el método de punto final o punto de extinción

Abs= absorbancia. % IE= efecto bactericida

Z Tiempo de extinción

Tiempo de muerte medio para CEK.G = ------------------------------- 3U 3 ÍI

No. de tiempo de extinción 30m inTiem po de muerte medio para 2

_r, _ ZTiempo de extinción

C M K G = - N-o--.- d-e--- ti-e-m---p-o-- d--e-- e-x--ti-n--c-i-ó-n-

y DP-I al 5 % p/v fueron agentes bacteriostáticos efectivos. La actividad bactericida de carbamoiletil katira/carboximetil katira se determinó usando el método de punto final o tiempo de extinción. Los datos obtenidos se resumen en la Tabla 6. Se encontró que la carbamoiletil katira y la carboximetil katira mostraban una concentración inhibidora mínima (MIC) del 5 % p/v ya que no se observó crecimiento. Se encontró que el tiempo para conseguir la concentración inhibidora mínima (MIC) era 45 minutos (tiempo de extinción), lo que sugiere que la carbamoiletil katira y la carboximetil katira tenían una actividad bactericida igualmente efectiva. Por lo tanto, se prepararon formulaciones de carbamoiletil katira (al 5 % p/v) y carboximetil katira (al 5 % p/v) para el tratamiento efectivo de infecciones bacterianas causadas por Staphylococcus aureus.

Ejemplo-10: actividad antioxidante

A. Ensayo de secuestro de radicales DPPH

El efecto secuestrante de radicales DPPH de carbamoiletil katira/carboximetil katira se determinó por el método reportado por (Xiong, X., Li, M., Xie, J., Jin, Q., Xue, B., y Sun, T. (2013). Antioxidant activity of xanthan oligosaccharides prepared by different degradation methods. Carbohydrate polymers, 92(2), 1166-1171). Brevemente, se incubaron 2,0 ml de disolución etanólica de DPPH (0,1 mmoles/l) con disolución de goma de carbamoiletil katira/carboximetil katira a diferentes concentraciones (0,1-10,0 mg/ml, 2,0 ml). La mezcla de reacción se mezcló con un agitador vórtex, se incubó (30 min a 30 °C) y se leyó la absorbancia de la disolución resultante a 517 nm frente a un blanco. El efecto secuestrante de radicales DPPH se midió como:

1-absorbancia de la disolución de muestra (517 nm) % de Efecto secuestrante ---------------------------------------------------------------------------- x i 00 absorbencia de la disolución control (517 nm)

B. Ensayo de secuestro de peróxido de hidrógeno

La actividad de carbamoiletil katira/carboximetil katira para secuestrar H²O² se determinó según el método de (Xiong, X., Li, M., Xie, J., Jin, Q., Xue, B., y Sun, T. (2013). Antioxidant activity of xanthan oligosaccharides prepared by different degradation methods. Carbohydrate polymers, 92(2), 1166-1171). Se preparó una disolución de H²O² (40 mM) en disolución tampón de Na2HPO4-NaH2PO4 (pH = 7,40, 0,2 moles/l). La concentración de H²O² se determinó espectrofotométricamente a partir de la absorción a 230 nm. Se añadieron diferentes concentraciones de muestras (0,1-10,0 mg/ml) en agua destilada a una disolución de H²O² (0,6 ml, 40 mM). Se determinó la absorbancia de H²O² a 230 nm después de 10 min frente a una disolución de blanco que contenía tampón fosfato sin H²O². La actividad de todas las muestras para secuestrar H²O² se calculó usando:

1-absorbancia de la disolución de muestra (230 nm) % de Efecto secuestrante = ------------------------------------------------------------------------- x 100 absorbancia de la disolución control (230 nm)

El radical DPPH es uno de los compuestos que posee un radical libre de protón con una absorción característica, que disminuye significativamente con la exposición a secuestrantes de radicales protones. Además, está aceptado que el secuestro de radicales DPPH por antioxidantes se debe a su capacidad para donar hidrógeno. En este experimento, el color morado de la mezcla de reacción cambia a amarillo y su absorbancia a 517 nm disminuye en presencia de muestras antioxidantes. Los resultados de la actividad secuestrante de los radicales libres DPPH y la actividad secuestrante de peróxido de hidrógeno de la disolución de goma de carbamoiletil katira/carboximetil katira se muestra en las Figuras 5. Se encontró que la actividad secuestrante de los radicales libres DPPH se incrementaba con un incremento en la concentración de carbamoiletil katira/carboximetil katira. A partir de la figura 5, se encontró que el valor de CI⁵⁰ para carbamoiletil katira y carboximetil katira era aproximadamente 3 mg/ml y 3,2 mg/ml, respectivamente. Por tanto, la derivatización de la goma no afectó la actividad antioxidante. Además, podría concebirse que la actividad antioxidante estaba relacionada con el núcleo de la goma y no con la unión de grupos a través de la derivatización. Esto sugirió que la derivatización de la goma incrementa la solubilidad y la actividad antioxidante. Esto dos factores conjuntamente influyen en la actividad antimicrobiana.

Ejemplo-11: fabricación y evaluación de formulaciones de lubricante ocular usando carbamoiletil katira/carboximetil katira

Se prepararon disoluciones oculares de diferentes concentraciones (al 2,5 %-10 %) de carbamoiletil katira/carboximetil katira en agua estéril para inyección (Tabla 7). El pH de las disoluciones oculares se ajustó a 7,4 y la isotonicidad se ajustó usando el método de equivalente de cloruro de sodio. Las disoluciones oculares preparadas se utilizaron para llenar botellas previamente limpiadas, esterilizables después de filtrarlas a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 mm y esterilizarlas en un autoclave (15 psi, 30 min.).

Todas las formulaciones se evalúan para determinar la apariencia, gravedad específica, viscosidad y tensión superficial. Se usó cloruro de sodio para conseguir formulaciones isotónicas.

Tabla 7 Diversas formulaciones de gotas oculares de goma de Carbamoil etil Katira/carboximetil katira

Las formulaciones de lubricante ocular desarrolladas se esterilizaron en autoclave (121 °C; 15 psi; 20 min) después de transferirlas a contenedores de gotas oculares de polipropileno que tenían un tamaño de poro variable de orificio para dispensar gotas oculares. Las formulaciones de lubricante ocular obtenidas después de autoclavar se ensayaron para determinar la gravedad específica, viscosidad y tensión superficial. Los resultados de la evaluación física de las formulaciones de lubricante ocular se muestran en la Tabla 8. Todas las formulaciones E1 a E8 eran transparentes y sin ninguna materia particulada visible

Tabla 8 Propiedades físicas de diferentes disoluciones de lubricante ocular

Ejemplo-12: determinación del tamaño de gota de las formulaciones de lubricante ocular

El tamaño de gota de las formulaciones de gotas oculares se caracterizó por su peso. Se llenaron botellas gotero de plástico flexible disponibles comercialmente con 10 ml de formulaciones de gotas oculares y se equiparon con dos diferentes puntas de gotero Punta A y Punta B que tenían un diámetro de orificio de 0,45 mm y 0,70 mm, respectivamente. Los diámetros de los orificios de las puntas se determinaron usando un microscopio compuesto que tenía una pieza ocular platina. La botella se fijó en la posición vertical (ángulo de 90°) o a un ángulo de 45° y la botella se comprimió hasta que se suministró una gota. La gota se pesó inmediatamente en una balanza analítica. Para cada disolución, se dispensaron tres series de 10 gotas y se calcularon el peso medio y la desviación estándar de las tres series (Van Santvliet, L., y Ludwig, A. (1999). Influence of the physico-chemical properties of ophthalmic viscolysers on the weight of gotas dispensed from a flexible dropper bottle. European journal of pharmaceutical sciences, 7(4), 339-345).

Determinantes farmacéuticos y de pacientes del tamaño de gota ocular

Selección del contenedor de las gotas oculares

Una disolución oftálmica acuosa instilada como una gota en el saco conjuntival inferior, permanece como la forma de dosificación preferida para una mediación ocular (Lang, J. C. (1995). "Ocular drug delivery conventional ocular formulations." Advanced Drug Delivery Reviews 16(1), 39-43). Estas disoluciones se formulan para la administración de múltiples dosis o de una única dosis en una amplia variedad de botellas gotero de vidrio y plástico. Se asumió que el tamaño de gota promedio de la disolución oftálmica era 50-70 gl (Shell, J. W. (1982). "Pharmacokinetics of topically applied ophthalmic drugs. "Survey of Ophthalmology 26(4), 207-21.; Urtti, A. y L. Salminen (1993). "Minimizing systemic absorption of topically administered ophthalmic drugs." Survey of Ophthalmology 37(6), 435-456). Sin embargo, Lederer et al., (Lederer, C. M., Jr. y R. E. Harold (1986). "Drop size of commercial glaucoma medications." American Journal of Ophthalmology 101(6), 691-694) estimaron que el tamaño de gota promedio de muchas medicaciones tópicas disponibles comercialmente era 39 gl con un rango de 25,1 a 56,4 gl. Además, los oftalmólogos que realizaron estudios para encontrar el número o gotas por dosis, coste por dosis y coste por medicamento de gotas oculares en botella reportaron volúmenes de gotas oculares que variaban de 26,4 gl hasta 69,4 gl (Sorensen, S. J. y S. R. Abel (1994). "Drop size of ocular carteolol hydrochloride." American Journal of Hospital Pharmacy: 51 (11), 1470­ 1473; Stewart, W. C., C. Sine, E. Cate, G. E. Minno y H. H. Hunt (1997). "Daily cost of beta adrenergic blocker therapy." Archives of Ophthalmology 115(7), 853-856). A partir de los puntos de vista de biodisponibilidad y toxicológicos, podrían administrarse incluso gotas con un volumen menor de 5 a 15 gl (Flach, A. (1994). "Systemic toxicity. Associated with topical ophthalmic medications." The Journal of the Florida Medical Association 81 (4), 256-260; Urtti, A. y L. Salminen (1993). "Minimizing systemic absorption of topically administered ophthalmic drugs." Survey of Ophthalmology 37(6), 435-456). El tamaño de las gotas administradas a partir de botellas gotero de plástico se ve influido por tres factores principales: el diseño y características de la punta del gotero y botella, las propiedades fisico­ químicas de la disolución que se va a dispensar y la manera en la que el paciente maneja la botella gotero. Por lo tanto, la selección del contenedor de las gotas oculares se hizo sobre la base de los tres factores principales anteriores.

El diseño y características de la punta y botella de gotero

Según las especificaciones proporcionadas por la Farmacopea Europea, el polietileno, que es un polietileno de baja densidad con o sin aditivos y el polipropileno son las botellas gotero de plástico requeridas. Sin embargo, la farmacopea de los Estados Unidos no especifica el tipo de plástico. Por lo tanto, en el presente estudio, se adquirieron botellas de polipropileno diseñadas para gotas oculares y disponibles en el mercado. Otra parte importante del contenedor es la punta de plástico para la dispensación de las gotas. La punta se introduce en el cuello de la botella. Están disponibles varios diseños de punta del gotero. El diseño más simple es una tobera con una pequeña abertura calibrada para el paso del líquido. Para evitar un chorro cuando la botella se aprieta, puede introducirse en el diseño de la punta un conducto central estrecho elongado. Esto asegura una dispensación gota a gota del líquido. El conducto tiene un orificio más ancho/externo, cuando la gota se forma y expele y una apretura interna estrecha. Esta última controla el flujo del líquido que entra en el conducto. Por lo tanto, para la formulación de gotas oculares se seleccionó la punta que tiene un canal cónico (canal cilíndrico estrecho recto) y el orificio exterior localizado en una superficie hemiesférica con un diámetro disponible.

Efecto de la concentración de la disolución ocular en el tamaño de las gotas

Se examinaron cuatro concentraciones diferentes de disolución ocular que contenían carbamoiletil katira (al 2,5 % p/v,

5 % p/v, 7,5 % p/v y 10 % p/v) y carboximetil katira (al 2,5 % p/v, 5 % p/v, 7,5 % p/v y 10 % p/v) para determinar su efecto en el tamaño de las gotas. Los resultados se resumieron en la Tabla 9. Se observó que el peso de las gotas se incrementaba significativamente con un incremento en la concentración de carbamoiletil katira/carboximetil katira. Se observó un resultado similar incluso cuando se incrementó el tamaño de la punta de 0,45 mm a 0,7 mm. Se reportó que el tamaño promedio de las gotas de la disolución oftálmica era 20-70 gl (USP 30 NF25). Por lo tanto, E¹, E² que contenían carbamoiletil katira (al 2,5 % p/v y 5 % p/v) y E⁵, E6 que contenían carboximetil katira (al 2,5 % p/v y 5 % p/v) podrían ser la mejor disolución oftálmica para cumplir con el estándar de USP. Las formulaciones comercializadas preparadas a partir de HPMC (al 0,3 % p/v) y NaCMC (al 0,5 % p/v) mostraron un tamaño de gotas en el rango de 20­ 70 gl lo que cumplía con el estándar de USP. De forma interesante, la cantidad de carbamoiletil katira/carboximetil katira atrapada en la gota ocular individual fue mayor en comparación con las formulaciones comercializadas. Por tanto, puede usarse carbamoiletil katira/carboximetil katira para el propósito doble, es decir, como gota ocular lubricante, así como antibacteriana.

Tabla 9: efecto de la concentración de la disolución de lubricante ocular en el tamaño de las gotas

Propiedades físicas y químicas de la disolución ocular

La tensión superficial y la viscosidad son los dos parámetros físicos importantes para una disolución oftálmica. La tensión superficial de la disolución oftálmica es una determinación importante del tamaño de las gotas. Se ha encontrado que la tensión superficial del fluido lagrimal es entre 44 mN/m a 50 mN/m y la disolución oftálmica debe tener una tensión superficial igual a la tensión superficial del fluido lagrimal (Desai, H. R. y P. D. Amin (2013). "Cationic submicron emulsion in ocular drug delivery -a review." International Journal of Pharma Sciences and Research 3(7), 5499-5511). Los resultados de tensión superficial de diferentes formulaciones de gotas oculares se muestran en la Tabla 10. Se encontró que la tensión superficial de E¹, E², E⁵ y E6 era equivalente a la tensión superficial del fluido lagrimal. Según la ley de Tate, cuanto menor es la tensión superficial de la disolución, menor es la gota dispensada (Van Santvliet, L., y Ludwig, A. (1999). Influence of the physico-chemical properties of ophthalmic viscolysers on the weight of drops dispensed from a flexible dropper bottle. European journal of pharmaceutical sciences, 7(4), 339-345). La linealidad de la correlación del tamaño de gota y la tensión superficial sugirió que las formulaciones de gotas oculares de carbamoiletil katira/carboximetil katira obedecían la ley de Tate (r2= 0,970/0,872, respectivamente).

Tabla 10: efecto de la tensión superficial en el tamaño de las gotas dispensadas de una botella gotero de plástico

Esto sugirió que la disolución de gotas oculares preparada con carbamoiletil katira (al 5 % p/v, 2,5 % p/v) o carboximetil katira (al 5 % p/v, 2,5 % p/v) podría ser una disolución ideal para la preparación de formulaciones de gotas oculares. Cuando se dispensan las gotas más pequeñas de una disolución de menor tensión superficial, es necesario ejercer menos fuerza en la botella y se observó un menor tiempo de dispensación. Esto también podría ser una ventaja práctica para las personas mayores que experimentan dificultades físicas al instilar su medicación. Van Santvliet et al., (Van Santvliet, L., y Ludwig, A. (1999). Influence of the physico-chemical properties of ophthalmic viscolysers on the weight of drops dispensed from a flexible dropper bottle. European journal of pharmaceutical sciences, 7(4), 339­ 345) estudiaron el comportamiento reológico, la viscoelasticidad y la tensión superficial de diversos viscolizadores en el peso de las gotas dispensadas de una botella gotero flexible disponible comercialmente. Los resultados sugirieron que hasta un valor de

25 mPa.s, la viscosidad y el comportamiento reológico de la disolución no tenían una influencia significativa en el peso de las gotas en condiciones que simulaban la manipulación por parte del paciente. Además, el incremento en la viscosidad de una disolución de gotas oculares da lugar a una disminución de los beneficios ya que la disolución crea tanto molestias, resistiendo el movimiento de los párpados durante el parpadeo como visión borrosa (Dudinski, O., Finnin, B. C., y Reed, B. L. (1983). Acceptability of thickened eye drops to human-subjects. Current Therapeutic Research-Clinical and Experimental, 33(2), 322-337). En general, las disoluciones oftálmicas viscosas que presentan movimiento de los párpados sobre el globo y, por lo tanto, son más confortables que la disolución Newtoniana (Ludwig, A. (2005). The use of mucoadhesive polymers in ocular drug delivery. Advanced drug delivery reviews, 57(11), 1595­ 1639). Se encontró que la viscosidad de todas las formulaciones de gotas oculares era menor de 25 mPa.s incluyendo las formulaciones comercializadas. Además, no hubo una diferencia significativa (P>0,05) en las viscosidades de carbamoiletil katira/carboximetil katira. Sin embargo, la viscosidad de las formulaciones comercializadas Hipromelosa (HPMC al 0,3 % p/v) y refresh tears (NaCMC al 0,5 % p/v) fue mayor que la de la carbamoiletil katira/carboximetil katira, pero menor de

25 mPa.s. Además, se encontró que el tamaño de las gotas de la disolución de gotas oculares se incrementaba con un incremento en la viscosidad de la formulación. La correlación lineal de la viscosidad con el tamaño de las gotas de la disolución de gotas oculares que contenía carbamoiletil katira/carboximetil katira no se vio afectada por un incremento en el tamaño del orificio. Se reportó que la viscosidad de NaCMC (al 1 % p/v) y HPMC (al 1 % p/v) era 19,8 mPa.s y

23,4 mPa.s, respectivamente (Van Santvliet, L., y Ludwig, A. (1999). Influence of the physico-chemical properties of ophthalmic viscolysers on the weight of drops dispensed from a flexible dropper bottle. European journal of pharmaceutical sciences, 7(4), 339-345). Sin embargo, la viscosidad de la carbamoiletil katira/carboximetil katira era menor de 25 mPa.s incluso cuando se usaron en una concentración del 10 % p/v. Por tanto, la carbamoiletil katira/carboximetil katira podría usarse de manera efectiva para el tratamiento de ojos secos y otras infecciones bacterianas en su nivel de MIC. Por lo tanto, las formulaciones de gotas oculares E¹ (carbamoiletil katira al 2,5 % p/v), E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v), E⁵ (carboximetil katira al 2,5 % p/v) y E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) se seleccionaron para un estudio adicional.

Efecto del ángulo/inclinación de la dispensación

Cuando se instila una gota ocular, el paciente tiene que sujetar el gotero a un ángulo de 90° por encima de su ojo, pro en la práctica, este ángulo varía de 90° a 30° (Van Santvliet, L., y Ludwig, A. (1999). Influence of the physico-chemical properties of ophthalmic viscolysers on the weight of drops dispensed from a flexible dropper bottle. European journal of pharmaceutical sciences, 7(4), 339-345). Para investigar la influencia del ángulo en el que se sujeta la botella gotero, se midió el peso de las gotas de las formulaciones de disolución de gotas oculares E¹-E⁸ con un aparato posicionado a un ángulo de 90° a 45°. Los resultados de estas mediciones se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11 El efecto en el tamaño medio de las gotas de una disolución de lubricante ocular de goma de carbamoiletil/carboxietil katira cuando se dispensa a un ángulo de 45° y 90°

Cuando se cambia el ángulo de dispensación de 90° a 45°, el peso medio de las gotas de la formulación comercializada, disolución de lubricante ocular de NaCMC (al 0,5 % p/v) y HPMC (al 0,3 % p/v) disminuyó en aproximadamente un 10 % (P < 0,001). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas para las formulaciones que contenían carbamoiletil katira/carboximetil katira.

Globalmente, los determinantes farmacéuticos y de paciente del tamaño de las gotas oculares sugirieron que las formulaciones de gotas oculares E¹ (carbamoiletil katira al 2,5 % p/v). E² (carbamoiletil katira 5 % p/v), E⁵ (carboximetil katira al 2,5 % p/v) y E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) podrían seleccionarse para un estudio adicional.

Ejemplo-13: actividad antimicrobiana in-vitro de las formulaciones de lubricante ocular

La actividad antimicrobiana in vitro de las formulaciones de gotas oculares de carbamoiletil katira (al 2,5 % p/v, 5 % p/v)/ carboximetil katira (al 2,5 % p/v, 5 % p/v) se examinó frente a Staphylococcus aureus usando un método de difusión en pocillos de agar según el método reportado en la Farmacopea India (2010).

Preparación de un cultivo de 24 h

Para la preparación de un cultivo de 24 h, se preparó caldo de nutrientes estéril mezclando volúmenes definidos de peptona (al 0,6 %), extracto de levadura (al 0,15 %) y dihidrógeno fosfato de dipotasio (al 0,36 %) en agua destilada, el pH se ajustó a 7,2 (I.P 2010) y se sometió a autoclave a 15 psi durante 30 minutos. El caldo estéril se inoculó con el Staphylococcus aureus en condiciones asépticas y se incubó durante 24 h a 37 °C para obtener un cultivo de 24 h.

Método de difusión en pocillos de agar para la determinación de la actividad antimicrobiana

Se disolvieron 23 gramos de medio sólido en un litro de agua destilada tibia en un matraz cónico. El medio de cultivo preparado y las placas petri se esterilizaron separadamente a 15 psi durante 30 minutos. Se añadió 1 ml de la suspensión microbiana de 24 h al medio de agar nutriente esterilizado a 40 °C y se vertió en las placas petri (90 mmx15 mm) hasta que solidificó en condiciones asépticas. Los pocillos se prepararon con la ayuda de un horadador estéril. Para cada placa petri, se crearon cuatro pocillos. Cada uno de los pocillos se llenó con 0,5 ml de las formulaciones de gotas oculares. Después de una incubación a 37 °C durante 24 h, se registraron las zonas de inhibición.

La actividad antimicrobiana in vitro de las formulaciones de gotas oculares E¹ (carbamoiletil katira al 2,5 % p/v), E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v), E⁵ (carboximetil katira al 2,5 % p/v) y E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) se examinó frente a Staphylococcus aureus por el método de difusión en pocillos de agar. Los resultados de la zona de inhibiciones se muestran en la Tabla 12. Los descubrimientos apuntaron hacia una actividad máxima de la formulación de gotas oculares E². La zona de inhibición de las diferentes formulaciones de gotas oculares sigue el orden E2>E6>E1>E5. Por tanto, E² y E6 se seleccionaron para un estudio adicional.

Tabla 12 Resultados de la actividad antimicrobiana in-vitro de las disoluciones de lubricante ocular

Ejemplo-14: ensayo de esterilidad

Un ensayo de esterilidad puede definirse como 'un ensayo que evalúa críticamente si un producto farmacéutico esterilizado carece de microorganismos contaminantes' según la Farmacopea India (2007), el ensayo de esterilidad de las formulaciones de gotas oculares se llevó a cabo usando el Método B (método de inoculación directa) en Caldo de Nutrientes (NB), Medio de Tioglicolato Fluido (FTG), Medio de Digerido de Caseína de Soja (SCD). Para evaluar la esterilidad de las formulaciones de gotas oculares, se cogieron 5 ml de la formulación de gotas oculares del contenedor de ensayo con una jeringa estéril de manera aséptica y se transfirieron a 5 ml del medio de cultivo. El 'medio inoculado' se incubó durante no menos de 14 días a: 30-35 °C para el 'Medio de Tioglicolato Fluido', 20-25 °C para el 'Medio de Digerido de Caseína de Soja' y 37 °C para el Medio de Caldo de Nutrientes y se observó el crecimiento de microorganismos. El ensayo de esterilidad de todas las formulaciones de gotas oculares se llevó a cabo según la Farmacopea India, (2010) empleando el método de dilución. Las formulaciones de gotas oculares de carbamoiletil katira/ carboximetil katira mostraron una propiedad antibacteriana. El ensayo antimicrobiano sugirió que la concentración del

1 % p/v de ambos carbamoiletil katira/ carboximetil katira fue inefectiva para actividad antibacteriana. Por lo tanto, todas las formulaciones de gotas oculares se diluyeron con agua estéril para inyección para alcanzar una concentración menor del 1 % p/v de carbamoiletil katira/ carboximetil katira y el ensayo de esterilidad se llevó a cabo en medios FTG, SCD y NB.

Los resultados del ensayo de esterilidad indicaron que todos los lotes de gotas oculares pasaron el ensayo según la Farmacopea India, 2007. Los resultados sugirieron que las formulaciones de gotas oculares carecen de microorganismos viables y no promueven el crecimiento de ningún crecimiento microbiano.

Ejemplo-15: Estudios de estabilidad

Las formulaciones estériles (E² y E6) se sometieron a estudios de estabilidad de las formulaciones y estudios de estabilidad microbiana. Para los estudios de estabilidad de las formulaciones, las formulaciones estériles se sometieron a estudios de estabilidad a una temperatura de 30 °C/HR del 65 % en una cámara de estabilidad durante dos meses según las directrices de ICH. Las formulaciones se evaluaron periódicamente para determinar su apariencia, presencia de materia particulada visible, pH, viscosidad, gravedad específica, tensión superficial y análisis por FTIR-ATR (para cualquier posibilidad de degradación).

Para los estudios de estabilidad microbiana, se tomaron dos gotas de la formulación de gotas oculares del contenedor después de abrir la cubierta de las botellas y exposición a un área o estéril durante 15 min. Estas dos gotas se pusieron en placas petri de agar esterilizadas en condiciones asépticas y se incubaron durante 24 h para detectar cualquier posibilidad de crecimiento. Este procedimiento se repitió tres veces en un día durante 30 días.

Los resultados del estudio de estabilidad de las formulaciones en la Tabla 13 sugieren la compatibilidad de los ingredientes de las formulaciones y, por tanto, pueden ofrecer una vida a temperatura ambiente de preparación satisfactoria. No hay una diferencia significativa en parámetros considerables durante el periodo del estudio. Los espectros de FTIR-ATR sugirieron la ausencia de degradación de las formulaciones de gotas oculares de carbamoiletil katira/ carboximetil katira.

Los resultados de los estudios de estabilidad microbiana sugirieron la ausencia de microbios cuando se expusieron a un área no estéril tres veces al día durante 30 días. Esto indicó que las gotas oculares preparadas no requerían ningún conservante que generalmente causa infecciones de ojo seco con el uso prolongado.

Tabla 13 Resultados del estudio de estabilidad de las formulaciones

Ejemplo-16: estudios de tolerancia ocular ex-vivo

Ensayo ocular en conejo de Draize

El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Ético Animal Institucional según el número 107/99/CPCSEA/2013-43. El Ensayo de Irritación ocular de Draize según la directriz de la OECD No 405(2) se realizó en conejos para evaluar el potencial de irritación de las formulaciones de gotas oculares. Se usaron conejos albinos de ambos sexos. Los animales se mantuvieron con una alimentación animal estándar y tuvieron acceso libre al agua. Los animales se mantuvieron en condiciones estándar. El ensayó se basó en la determinación de la presencia de cambios patofisiológicos oculares como opacidad corneal, congestión, hinchamiento del iris, hemorragia, destrucción del iris, quemosis, enrojecimiento de la conjuntiva (hiperemia), descarga de moco dando lugar al humedecimiento de los párpados y pelo etc. Para la evaluación de la formulación de gotas oculares, se instilaron 0,1 ml de la formulación de gotas oculares en el fondo de saco conjuntival del ojo del conejo. Los ojos se observaron a duraciones de 0, 12, 24, 48 y 72 horas para detectar cualquiera de los cambios patofisiológicos anteriores.

Ensayo del huevo de gallina - Método de ensayo de la membrana corioalantoica (HET-CAM)

La tolerancia ocular de las formulaciones de gotas oculares preparadas se evaluó empleando el ensayo del huevo de gallina en la membrana corioalantoica de huevos de pollo (ensayo HET-CAM). El estudio HET CAM es una técnica alternativa establecida al ensayo en ojos de conejo de Draize para valorar los efectos potenciales de irritación en el ojo. Este estudio estima los efectos de irritación tales como hemorragia, lisis y coagulación en el ojo causados en los 5 min posteriores a la aplicación de la formulación en la membrana corioalantoica (CAM) de huevos de pollo. Para este estudio, se usaron huevos leghorn blancos de 7 días que pesaban 60,0 5,0 g y estos huevos se adquirieron en la granja de crianza e incubadora Haryana y (Vill. ker kheri, Jind, Haryana). Los huevos seleccionados se incubaron durante 10 días. Con el extremo grande hacia arriba, en una bandeja rotatoria a 37,0±0,5 °C y una humedad relativa del 62,5±1,5 %. En el día 9, los huevos se pusieron en la parte inferior del incubador y la incubación continuó sin rotación. En el día 10, los huevos se examinaron al trasluz con una lámpara fuente de láser para asegurar su viabilidad. Los huevos no fertilizados o no viables se rechazaron. Se marcó el espacio de aire delimitado por la membrana interna en el extremo grande del huevo, después de lo cual se retiró la cáscara del huevo. La membrana interna, directamente en contacto con la CAM, se humedeció con una disolución de NaCl al 0,9 % y el huevo se puso de nuevo a una temperatura de 37 °C durante un máximo de 20 min. Después de la incubación, la disolución de NaCl se retiró con cuidado y la membrana interna se retiró mediante fórceps con el extremo curvado sin dañar ninguno de los vasos sanguíneos subyacentes. La CAM fue entonces visible y se examinó cuidadosamente para confirmar su integridad. Finalmente, la CAM se trató con una parte alícuota de 0,5 ml de las formulaciones de gotas oculares, cloruro de benzalconio al 10 % (como un cloruro positivo) y disolución salina (como un control negativo). La CAM se observó para determinar la aparición del efecto de irritación tal como hemorragia, lisis y coagulación durante 5 min y se puntuó. Los valores de tiempo obtenidos después de la observación de cada reacción se combinaron en una puntuación de irritación (IS) ocular in vitro generada mediante la siguiente ecuación (Yadav, S., Ahuja, M., Kumar, A., y Kaur, H. (2014). Gellan-thioglycolic acid conjugate: Synthesis, characterization and evaluation as mucoadhesive polymer. Carbohydrate polymers, 99, 601-607):

donde segH = tiempo de reacción en segundos para hemorragia, segL = tiempo de reacción en segundos para lisis, segC = tiempo de reacción en segundos para coagulación intra o extravascular si no se ha producido reacción durante 5 min, entonces ajustar segH, segL, segC= 301

Los resultados obtenidos durante el ensayo ocular en conejo de Draize se resumen en la Tabla 14. No se observaron cambios patofisiológicos después de 1 h, 4 h, 24 h, 48 h y 72 h de la instilación tópica de las formulaciones de gotas oculares E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v) y E6 (carboximetil katira al 5 % p/v), lo que indica que las formulaciones son seguras para uso ocular.

El ensayo HET-CAM mostró una puntuación de irritación máxima para la disolución de cloruro de benzalconio (al 10 % p/v). Por lo tanto, es un irritante severo que da lugar a hemorragia, coagulación en (segC=52). Sin embargo, se encontró que la puntuación de irritación para las formulaciones de gotas oculares E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v) y E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) era cero, indicada para un no irritante. Esto sugirió que las formulaciones de carbamoiletil katira/carboximetil katira eras seguras, no irritantes y no tóxicas.

Ejemplo-17: potencial de lubricación ocular

Desarrollo del modelo de ojo seco en conejos y medición de la producción de lágrimas

Este estudio se llevó a cabo según el modelo propuesto por (Xiong, C., Chen, D., Liu, J., Liu, B., Li, N., Zhou, Y., y Wang, Z. (2008). A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Investigative ophthalmology & visual science, 49(5), 1850-1856). Se usaron conejos para estudiar la evaluación de la lubricación ocular de las formulaciones. Se indujo ojo seco en los conejos mediante la administración de 2 gotas de disolución de cloruro de benzalconio (BAC) al 0,2 % dos veces al día durante tres días. Se encontró que tres días de instilación tópica era adecuado para inducir los síntomas inflamatorios y disminuir la producción de lágrimas para producir ojo seco moderado sin causar un daño permanente en el ojo del conejo. El modelo animal de ojo seco producido por el procedimiento anterior se asemejó al estado de ojo seco evaporativo en los seres humanos.

Se usó el ensayo de lágrimas de Schirmer I para medir la producción de lágrimas de los ojos de los conejos (tanto estado sano como de ojo seco). El ensayo comprendió poner una tira pequeña de papel de filtro Whatmann 41 cortada en las dimensiones; 35x5 mm después de la esterilización en el interior del saco conjuntival inferior después de hacer un agujero de 5 mm desde un extremo de la tira. Los ojos se cerraron durante 5 minutos. El segmento de 30 mm se dejó colgando sobre el párpado inferior. Después de 5 minutos, se retiró la tira y se midió la longitud humedecida. No se usó anestésico ya que la anestesia tópica tiende a disminuir los valores del ensayo y afecta a la reproducibilidad del ensayo de lágrimas de Schirmer. La inducción del ojo seco se confirmó por la disminución de los valores de producción de lágrimas y por la presencia de los síntomas de ojo seco como se observó con una cámara digital. Se fotografiaron los síntomas inflamatorios producidos.

Tratamiento con las formulaciones de gotas oculares preparadas en el modelo de ojo seco en conejos

Después de tres días de instilación tópica de BAC al 0,2 % en conejos, se inició el tratamiento de los conejos. La formulación se instiló dos veces al día. Después de instilar la formulación, se fotografiaron los cambios graduales en los diversos componentes de los síntomas inflamatorios como enrojecimiento de la conjuntiva (bulbar y tarsal) e iris, hiperemia conjuntival, descarga mucosal del ojo, humedecimiento de los párpados, pelos y regiones circundantes del ojo, lagrimeo y la facilidad de abrir los ojos de los conejos y se midió el incremento en los valores de producción de lágrimas. El tratamiento se continuó hasta que el ojo tratado se normalizó a un estado sano con la ausencia completa de síntomas inflamatorios y las lecturas de lágrimas se normalizaron a valores basales (es decir, los presentes en el ojo sano) Xiong, C., Chen, D., Liu, J., Liu, B., Li, N., Zhou, Y., y Wang, Z. (2008). A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Investigative ophthalmology & visual science, 49(5), 1850­ 1856).

El potencial de las formulaciones de gotas oculares E¹ (carbamoiletil katira al 2,5 % p/v). E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v), E⁵ (carboximetil katira al 2,5 % p/v) y E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) para el tratamiento de la enfermedad del ojo seco se evaluó adicionalmente usando el modelo de ojo seco inducido por cloruro de benzalconio al 0,2 % (Xiong, C., Chen, D., Liu, J., Liu, B., Li, N., Zhou, Y., y Wang, Z. (2008). A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Investigative ophthalmology & visual science, 49(5), 1850-1856). Se empleó el ensayo de Schirmer para cuantificar la producción de lágrimas. La tira (35x5 mm) fue para medir la cantidad de lágrimas producidas. La puntuación del ensayo de schirmer (reportada como mm de tira húmeda después de 3 min de inserción) obtenida antes y después del tratamiento con las formulaciones de gotas oculares E¹ (carbamoiletil katira al 2,5 % p/v), E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v), E⁵ (carboximetil katira al 2,5 % p/v) y E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) se muestran en la Tabla 15 y las imágenes tomadas en cada punto de tiempo de la medición se muestran en la Tabla 16. Se observó que la administración en los ojos de conejos de BAC (al 0,2 % p/v) produce síntomas de ojo seco como inflamación ocular, descarga mucosal e hinchamiento de los párpados y redujo significativamente la producción de lágrimas en 2 días (Figura 6). El tratamiento de los ojos secos con las formulaciones de gotas oculares E¹ (carbamoiletil katira al 2,5 % p/v), E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v), E⁵ (carboximetil katira al 2,5 % p/v) E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) o formulaciones comercializadas (Hipromelosa o Refresh tears) aumentó la producción de lágrimas. Las formulaciones de gotas oculares E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v) y E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) mostraron una curación rápida (en 3 días después de la infección) de la enfermedad del ojo seco en comparación con las formulaciones comercializadas. Sin embargo, las formulaciones de gotas oculares E¹ (carbamoiletil katira al 2,5 % p/v) o E⁵ (carboximetil katira al 2,5 % p/v) no mostraron una diferencia significativa en el aumento de lágrimas cuando se comparan con las formulaciones comercializadas. De forma interesante, todas las formulaciones con E¹ (carbamoiletil katira al 2,5 % p/v), E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v), E⁵ (carboximetil katira al 2,5 % p/v), E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) y las formulaciones comercializadas elevaron la producción de lágrimas al nivel normal después de 5 días (después de la infección), lo que sugiere el potencial lubricante ocular de carbamoiletil katira (al 2,5 % p/v- 5 % p/v) y carboximetil katira (al 2,5 % p/v- 5 % p/v). Globalmente, las formulaciones de gotas oculares E² (carbamoiletil katira al 5 % p/v) y E6 (carboximetil katira al 5 % p/v) podrían usarse como las mejores formulaciones de gotas oculares para el tratamiento de ojos secos.

Tabla 15 Resultados del ensayo de schirmer para secreción lagrimal

NaCMC= Carboximetil celulosa de sodio, HPMC=Hidroxipropil metil celulosa, BAC= Cloruro de benzalconio

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de lubricante de carbamoiletil katira que comprende goma katira en el rango del 5 % p/v al 10 % p/v carbamoiletil en el rango del 5 % p/v al 10 % p/v y aditivos.

2. La formulación de lubricante como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la goma katira se obtiene de Cochlospermum religiosum.

3. La formulación de lubricante como se reivindica en la reivindicación 1, en donde los aditivos se seleccionan del grupo que consiste en un tensioactivo, emulsionante, y combinaciones de los mismos, en una emulsión basada en agua.

4. La formulación de lubricante como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicha formulación muestra actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus.

5. La formulación de lubricante como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicha formulación es para su uso en el tratamiento de la enfermedad del ojo seco.

6. Un proceso para la preparación de una formulación de lubricante de carbamoiletil katira como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho proceso comprende las siguientes etapas:

a) empapar la goma katira en agua durante un periodo de tiempo de 14 a 20 h para obtener un gel homogeneizado;

b) agitar el gel homogeneizado obtenido en la etapa (a) durante 30 a 45 minutos seguido de la adición de 25 ml de disolución de hidróxido de sodio del 28 % p/v al 44 % p/v enfriada en hielo con agitación y agitación adicional durante 30 min después de la adición de hidróxido de sodio enfriado en hielo para obtener una mezcla de reacción básica;

c) añadir del 11 % p/v al 18 % p/v de acrilamida a la mezcla de reacción básica obtenida en la etapa (b) con agitación constante durante 1 h para obtener una mezcla de reacción;

d) irradiar la mezcla de reacción obtenida en la etapa (c) en un reactor de microondas a 450 watios durante un periodo de tiempo de 0,5 a 1 min seguido de un ciclo de enfriamiento durante un periodo de tiempo de 1 a 2 min a una temperatura de 4 °C a 10 °C en un baño de hielo;

e) repetir la etapa (d) de 3 a 7 veces seguido de neutralización con ácido acético glacial diluido para obtener una mezcla de reacción neutralizada;

f) precipitar la mezcla de reacción neutralizada obtenida en la etapa (e) con disolventes seguido de lavado con disolvente de precipitación para obtener un precipitado de carbamoiletil katira;

g) filtrar y secar los precipitados de carbamoiletil katira obtenidos en la etapa (f) para obtener carbamoiletil katira;

h) disolver del 2,5 % al 10 % p/v de carbamoiletil katira obtenida en la etapa (g) en agua estéril para inyección tibia seguido de filtración a través un sistema de filtración de 0,22 p;

i) esterilizar la formulación de lubricante de carbamoiletil katira obtenida en la etapa (h) a una temperatura en el rango de 121 °C a 118 °C durante un periodo de tiempo de 20 a 40 minutos para obtener una formulación de lubricante esterilizada.

7. El proceso como se reivindica en la reivindicación 6, en donde la relación de ácido acético glacial y agua en la etapa (e) es 1:1 para la neutralización de la reacción.

8. El proceso como se reivindica en la reivindicación 6(g), en donde el secado de la carbamoiletil katira en la etapa (g) se lleva a cabo usando liofilización a una temperatura en el rango de -80 °C durante un periodo de tiempo de 72 a 96 horas o secado en horno a una temperatura seleccionada en el rango de 45 a 55 °C durante un periodo de tiempo seleccionado en el rango de 3,5 a 4,5 días o 60 °C durante un periodo de tiempo seleccionado en el rango de 1,5 a 2,5 días para obtener la formulación de carbamoiletil katira.