ES2876930T3

ES2876930T3 - Métodos y composiciones para tratar enfermedades y afecciones hepáticas

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Publication number: ES2876930T3
Application number: ES16785555T
Authority: ES
Inventors: Chantar María Martinez; Juan Anguita
Original assignee: Asociacion Centro De Investig Cooperativa En Biociencias Cic Biogune; Centro de Investigacion Cooperativa en Biociencias
Current assignee: Asociacion Centro De Investig Cooperativa En Biociencias Cic Biogune; Centro de Investigacion Cooperativa en Biociencias
Priority date: 2015-08-20
Filing date: 2016-08-20
Publication date: 2021-11-15
Anticipated expiration: 2036-08-20
Also published as: KR20180039162A; WO2017029556A1; AU2016308694A1; CN108026528A; EP3337900A1; EP3337900B1; US20180245080A1; JP2018523696A; CA2995079A1; US10457941B2

Abstract

Una composición que comprende un compuesto inhibidor de microARN que inhibe al menos uno de miARN-873- 5p y miARN-518d-5p para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección hepática en un sujeto, en la que que cuando se administra al sujeto el compuesto inhibidor de microARN que inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p disminuye la actividad de microARN y aumenta la actividad de la enzima glicina N- metiltransferasa (GNMT) en al menos una célula del sujeto, y en la que el el compuesto inhibidor de microARN comprende una o más de una molécula de ARN, un compuesto de esponja de miARN y una molécula inhibidora antisentido.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para tratar enfermedades y afecciones hepáticas

La invención se refiere, en parte, a composiciones para su uso en métodos de tratamiento de enfermedades y afecciones que afectan al hígado.

Antecedentes

La hepatología es un campo en continua evolución: la epidemiología de la enfermedad hepática crónica está cambiando a una velocidad extremadamente alta, con la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) asumiendo una posición anteriormente ocupada por la hepatitis viral y exponiendo la enfermedad cardiovascular como una causa creciente de mortalidad relacionada con el síndrome metabolismo. La NAFLD es un término clínicopatológico que abarca un amplio rango de condiciones patológicas que van desde la acumulación de grasa (hígado graso) a diversos grados de inflamación y fibrosis, esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y finalmente a la cirrosis criptogénica y sus secuelas clínicas (hepatocelular carcinoma, descompensación hepática). Michelotti et al. han resumido las correlaciones entre el cáncer de hígado y la cirrosis relacionada con NAFLD, y el papel del síndrome metabólico en el desarrollo de cáncer de hígado de diversas etiologías, incluida la cirrosis mediada por e1HCV. (Michelotti, G., Machado, M. & Diehl, A. NAFLD, NASH and liver cancer. Nat Rev Gastroentero1Hepatol 10, 656-665 (2013) La investigación y la intervención han impactado dramáticamente la hepatitis y las enfermedades cardiovasculares, pero sigue siendo insuficiente comprensión de los mecanismos implicados en la progresión de NAFLD a cirrosis y cáncer.

Sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones 1 a 8.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende un compuesto inhibidor de microARN que inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad hepática o condición en un sujeto, como se define en la reivindicación 1. El compuesto inhibidor de microARN que inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p disminuye una actividad de microARN en al menos una célula del sujeto. En determinadas realizaciones, la disminución de la actividad de microARN incluye la disminución del nivel o la función de microARN. El compuesto inhibidor de microARN que inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p disminuye la actividad de microARN y aumenta la actividad de la enzima glicina N-metiltransferasa (GNMT) en al menos una célula del sujeto. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección hepática es una o más de un cáncer de hígado, un cáncer metastásico en el hígado, una afección hepática precancerosa, carcinoma hepatocelular, cirrosis, una afección hepática postcáncer, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), acumulación de grasa (hígado graso), inflamación hepática, fibrosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis criptogénica y sus secuelas clínicas (carcinoma hepatocelular, descompensación hepática), esteatohepatitis y quimiorresistencia. En determinadas realizaciones, el tratamiento de la enfermedad o afección hepática incluye aumentar la actividad de GNMT en al menos una célula del sujeto, en comparación con un nivel de control de la actividad de GNMT. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor de microARN se administra en una composición farmacéutica y, opcionalmente, la composición farmacéutica incluye adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, el compuesto inhibidor de microARN también incluye uno o más de un marcador detectable y un agente de direccionamiento. En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento es un agente de direccionamiento del hígado. El compuesto inhibidor de microARN incluye uno o más de una molécula de ARN, un compuesto de esponja de miARN, una molécula inhibidora antisentido y una molécula de miARN variante. En determinadas realizaciones, el compuesto inhibidor de microARN incluye una molécula inhibidora de microARN en horquilla. El compuesto inhibidor de microARN inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p. En determinadas realizaciones, la enfermedad o afección hepática no es cáncer. En determinadas realizaciones, la composición se utiliza en un método de tratamiento que también incluye administrar al sujeto una o más terapias adicionales para el tratamiento de un cáncer de hígado, un cáncer metastásico en el hígado, una enfermedad hepática precancerosa, carcinoma hepatocelular, cirrosis, una enfermedad hepática postcáncer, fibrosis hepática, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), acumulación de grasa (hígado graso), inflamación del hígado, fibrosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis criptogénica, carcinoma hepatocelular, descompensación hepática, esteatohepatitis o quimiorresistencia. En algunas realizaciones, una o más terapias adicionales se administran al sujeto en uno o más momentos antes, coincidiendo con y después de la administración del compuesto inhibidor de miARN al sujeto. En algunas realizaciones, una o más terapias adicionales se seleccionan independientemente de una terapia de radiación, una terapia quirúrgica, una quimioterapia, una terapia direccionada a moléculas, una terapia citostática y una terapia citotóxica. En determinadas realizaciones, la administración del compuesto inhibidor de miARN y una o más terapias adicionales da como resultado un efecto de tratamiento sinérgico sobre la enfermedad o afección hepática en el sujeto. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor de miARN es un compuesto inhibidor de miARN exógeno. En algunas realizaciones, un medio de administración para el compuesto inhibidor de miARN incluye uno o más de administración oral, administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intrahepática, administración nasal, administración tópica, administración transdérmica, administración de implantes y administración de infusión. En determinadas realizaciones, una formulación de administración para el compuesto inhibidor de miARN incluye una o más de una formulación de liberación lenta, una nanopartícula, una micropartícula, un hidrogel, un vehículo absorbible, una formulación implantable y una matriz biodegradable. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor de miARN administrado reduce la desdiferenciación de al menos una célula en el sujeto. En algunas realizaciones, la al menos una célula es una célula del hígado. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En determinadas realizaciones, el sujeto es un humano.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos in vitro o ex vivo para aumentar la actividad de la enzima GNMT en una célula, como se define en la reivindicación 6. Los métodos incluyen poner en contacto la célula con un compuesto inhibidor de miARN que inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de la enzima GNMT en la célula y en donde el aumento de la actividad de la enzima GNMT reduce la hipermetilación del ADN en la célula. En determinadas realizaciones, aumentar la actividad de la enzima GNMT incluye aumentar el nivel o la función de la enzima GNMT en la célula. La célula es una célula in vitro o ex vivo. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende un compuesto inhibidor de microARN para su uso en un método de tratamiento que comprende aumentar la actividad de la enzima GNMT en una célula, como se define en la reivindicación 5. En ciertas realizaciones, la célula es un vivo en un sujeto y el contacto incluye la administración del compuesto inhibidor de miARN al sujeto. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor de miARN se administra en una composición farmacéutica y, opcionalmente, la composición farmacéutica incluye adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor de microARN también incluye uno o más de un marcador detectable y un agente de direccionamiento, en donde opcionalmente el agente de direccionamiento es un agente de direccionamiento del hígado. El compuesto inhibidor de microARN incluye uno o más de una molécula de ARN, un compuesto de esponja de miARN y un compuesto inhibidor antisentido. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor de microARN incluye una molécula inhibidora de microARN en horquilla. El compuesto inhibidor de microARN inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p. En determinadas realizaciones, la célula es una célula del hígado. En algunas realizaciones, la célula es una o más de una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer metastásico, una célula de hígado precancerosa, una célula de hígado cirrótica, una célula de hígado poscancerígena, una célula de hígado fibrótica, un hepatocito, una célula inflamatoria de cáncer de hígado y una célula hepática quimiorresistente. En algunas realizaciones, la célula no es una célula cancerosa. En determinadas realizaciones, el método también incluye poner en contacto la célula con una o más terapias adicionales para el tratamiento de un cáncer de hígado, un cáncer metastásico, una enfermedad hepática precancerosa, carcinoma hepatocelular, cirrosis, una enfermedad hepática postcáncer, enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), acumulación de grasa (hígado graso), inflamación del hígado, fibrosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis criptogénica y sus secuelas clínicas como carcinoma hepatocelular, descompensación hepática, esteatohepatitis o quimiorresistencia. En algunas realizaciones, la célula se pone en contacto con una o más terapias adicionales en uno o más momentos antes, coincidiendo con y después de que la célula entre en contacto con el compuesto inhibidor de miARN. En algunas realizaciones, una o más terapias adicionales se seleccionan independientemente de radioterapia, cirugía, quimioterapia, terapia de cáncer direccionada molecular, terapia citostática y terapia citotóxica. En determinadas realizaciones, el contacto con el compuesto inhibidor de miARN y una o más terapias adicionales da como resultado un efecto sinérgico del compuesto inhibidor de miARN y/o una o más terapias adicionales en la célula. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor de miARN es un compuesto inhibidor de miARN exógeno. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor de miARN reduce la desdiferenciación de la célula en contacto. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En determinadas realizaciones, el sujeto es un humano.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos ex vivo o in vitro para identificar un compuesto modulador de miARN que altera la actividad de uno o ambos miARN-873-5p y miARN-518d-5p en una célula, como se define en la reivindicación 8. Los métodos incluyen, (a) poner en contacto una célula con un compuesto modulador de miARN candidato; (b) determinar la cantidad de actividad de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en la célula; en donde determinar la cantidad de actividad de uno o ambos miARN-873-5p y miARN-518d-5p en la célula comprende comparar la actividad de la enzima GNMT en la célula en contacto con la actividad de GNMT en una célula de control que no está en contacto con el compuesto modulador de miARN candidato; y (c) comparar la cantidad de actividad determinada para uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p con una cantidad de control de actividad de miARN-873-5p y miARN-518d-5p, respectivamente, en donde un aumento en la actividad de la enzima GNMT en la célula en contacto frente a la célula de control identifica al modulador de miARN candidato como un compuesto inhibidor de miARN y en donde una disminución en la actividad de la enzima GNMT en la célula en contacto frente a la célula de control identifica al modulador de miARN candidato como un compuesto potenciador de miARN. La célula es una célula in vitro o una célula ex vivo. En algunas realizaciones, la célula en contacto es una célula del hígado. En determinadas realizaciones, la célula en contacto es una o más de una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer metastásico, una célula de hígado precancerosa, una célula de hígado cirrótica, una célula de hígado poscancerígena, una célula de hígado fibrótica, un hepatocito, una célula inflamatoria de cáncer de hígado, una célula hepática quimiorresistente y una célula normal. En algunas realizaciones, el método también incluye administrar el compuesto inhibidor de miARN identificado a un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad o afección hepática. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En determinadas realizaciones, el sujeto es un humano.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO: 1 Secuencia de Homo sapiens para MIR-873-5p conocida como: hsa-miR-873-5p: gcaggaacuugugagucuccu, que tiene Número de acceso miRBasa: MIMAT0004953.

SEQ ID NO: 2 Secuencia de

Mus musculus para MIR-873-5p conocida como: mmu-miR-873 gcaggaacuugugagucuccu.

SEQ ID NO: 3 Secuencia de Rattus novergicus para MIR-873-5p conocida como: rno-miR-873-5p: gcaggaacuugugagucuccu.

SEQ ID NO: 4 Secuencia de

Populus trichocarpa para MIR-873-5p conocida como: ptr-miR-873: gcaggaacuugugagucuccu.

SEQ ID NO: 5 Secuencia de Bos taurus para MIR-873-5p conocida como: bta-miR-873: gcaggaacuugugagucuccu.

SEQ ID NO: 6 Secuencia de

Equus caballus para MIR-873-5p conocida como: eca-miR-873: gcaggaacuugugagucuccu.

SEQ ID NO: 7 Secuencia de

Pongo pygmaeus para MIR-873-5p conocida como: ppy-miR-873: gcaggaacuugugagucuccu.

SEQ ID NO: 8 Secuencia de Homo sapiens para MIR-518d-5p conocida como: hsa-miARN-518d-5p: cucuagagggaagcacuuucug, que tiene Número de acceso miRBasa: MIMAT0005456.

SEQ ID NO: 9 Secuencia de Homo Sapiens para MIR-526a conocida

como hsa-miR-526a: cucuagagggaagcacuuucug.

SEQ ID NO: 10 Secuencia de Homo Sapiens para MIR-520c-5p conocida como hsa-miR-520c-5p: cucuagagggaagcacuuucug.

SEQ ID NO: 11 Secuencia de Populus trichocarpa para MIR-526a conocida como ptr-miR-526a: cucuagagggaagcacuuucug.

SEQ ID NO: 12 Secuencia de Gorilla gorilla para MIR-518d-5p conocida como ggo-miARN-518d-5p: cucuagagggaagcacuuucug.

SEQ ID NO: 13 Secuencia de Gorilla gorilla para MIR-520C conocida como: ggo-miR-520cd: cucuagagggaagcacuuucug.

SEQ ID NO: 14 Secuencia de Gorilla gorilla para MIR-526a conocida

como ggo-miR-526a: cucuagagggaagcacuuucug.

SEQ ID NO: 15 Secuencia de Pongo pygmaeus para MIR-518g-5p conocida como ppy-miARN-518g-5p: cucuagagggaagcacuuucug.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A-F muestra gráficos de resultados que indican que miR-873-5p se dirige a la expresión de GNMT en el hígado. La Figura 1A muestra dos gráficos de resultados de un estudio de correlación entre los niveles de expresión de miR-873-5p y GNMT en tumores de hígado (gráfico de la izquierda) y en una cohorte de pacientes cirróticos (gráfico de la derecha). La Figura 1B muestra los resultados del análisis de qPCR de GNMT (gráfico de la izquierda) y miR-873-5p (gráfico de la derecha) en hígado de ratones adultos y postnatales de 1 día. La Figura 1C muestra los resultados del análisis de qPCR de GNMT (gráfico de la izquierda) y miR-873-5p en hepatocitos en cultivo en diferentes puntos de tiempo. La Figura ID muestra los resultados del análisis de qPCR de GNMT (gráfico de la izquierda) y miR-873-5p en diferentes puntos de tiempo de BDL. La Figura IE muestra los resultados del análisis de qPCR de GNMT (gráfico de la izquierda) y miR-873-5p bajo tratamiento con ácido desoxicólico de hepatocitos primarios. La Figura IF muestra los resultados del ensayo indicador de luciferasa de la expresión de GNMT en hepatocitos después de la sobreexpresión de miR-873-5p (gráfico de la izquierda) y en células de cáncer de hígado BCLC3 (gráfico de la derecha) después de la inhibición de miR-873-5p. El análisis estadístico representó: p <0.05 *;

p <0.01 **; p <0.001 ***.

La Figura 2A-D proporciona gráficos de resultados que demuestran que la inhibición de miR-873-5p evita la desdiferenciación de los hepatocitos. Los gráficos muestran los resultados del análisis realizado en la expresión de

ARNm de los genes indicados por qPCR en control y hepatocitos inhibidos por miR-873-5p en cultivo en diferentes puntos de tiempo de desdiferenciación. La Figura 2A muestra los resultados de GNMT. La Figura 2B muestra los resultados para HNF4a (izquierda), albúmina (centro) y HK4 (derecha). La Figura 2C muestra los resultados de

PKM2 (izquierda), AFP (centro) y HGF (derecha). La figura 2D muestra los resultados de CYP2E1 (izquierda), CYP3A11 (centro) y CYP2B10 (derecha). El análisis estadístico representó: p <0.05 *; p <0.01 **; p <0.001 ***. # compara 24 h con 48 h (miR-Ctrl). Las barras negras representan tratado con miR-Ctl y las barras blancas representan tratado con miR-873-5p-inh.

La Figura 3A-F muestra gráficos, transferencias e imágenes fotomicrográficas de los resultados que demuestran que la inhibición de miR-873-5p después de la ligadura de los conductos biliares en ratones retrocedió el fenotipo fibrótico. La Figura 3A es un gráfico y una transferencia de Western que muestra la expresión de GNMT medida por los niveles de ARNm y proteínas. La Figura 3B muestra un análisis de apoptosis mediado por la escisión de PARp . La Figura 3C es una curva de Kaplan Meier que representa la supervivencia en ratones bajo miR-Ctrl y ratones inhibidos por miR-873-5p después de BDL. La Figura 3D muestra los resultados del análisis de los niveles de actividad de Caspasa 3 (C3) en ratones inhibidos con miR-Ctrl y miR-873-5p a los 7 días de BDL. La Figura 3E muestra los resultados del análisis de los niveles de transaminasas (ALT y AST) en ratones inhibidos con miR-Ctrl y miR-873-5p a los 7 días de BDL. La Figura 3F muestra imágenes fotomicrográficas de tinción con Sirius Red, F4/80, aSMA y CK19 en secciones de hígado de ratones inhibidos con miR-Ctrl y miR-873-5p a los 7 días de BDL, y proporciona gráficos correspondientes de cambios en el control versus BDL inhibido por miR -873-5p. (Los valores son la media ± SEM. * P <0.05, ** P <0.01, [Control versus 873-Inh]).

La Figura 4A-C muestra gráficos de resultados que demuestran la atenuación del daño hepático en ratones inhibidos por miR-873-5p después de BDL. Las Figuras 4A-C muestran los resultados del análisis de los genes indicados por qPCR en ratones control e inhibidos por miR-873-5p. La Figura 4A muestra los resultados para TGFp (izquierda) y MMP9 (derecha). La Figura 4B muestra los resultados para FXR, HNF1a, Abcg5 y Abcg8HGF (de izquierda a derecha). La Figura 4C muestra los resultados para iNOS (izquierda), SAA1 (centro) y CXCL1 (derecha), fila superior y TNFa (izquierda) e IL-6 (derecha), fila inferior. (Los valores son la media ± SEM. * P <0.05, ** P <0.01, [Control versus 873-5p-Inh]). Las barras negras representan NO BDL, las barras blancas representan miR-Ctrl BDL y las barras grises representan miR-837-5p-inh BDL.

La Figura 5A-D muestra gráficos de resultados que demuestran que la inhibición de miR-873-5p en hepatocitos primarios reduce la respuesta apoptótica a los ácidos biliares. La Figura 5A es un gráfico de la actividad de Caspasa 3 (C3) en hepatocitos control e inhibidos por miR-873-5p antes y después de 2 h de tratamiento con DCA (100 |^jM). Las Figuras 5B-D proporcionan gráficos de resultados del análisis de expresión de ARNm de los genes indicados por qPCR en hepatocitos de control e inhibidos de miR-873-5p en diferentes puntos de tiempo del tratamiento con DCA. La Figura 5B muestra los resultados para GNMT, Bcl-2, HNF1a y HNF4a (de izquierda a derecha). La Figura 5C muestra los resultados de FXR, SHP, BSEP, Abcg5 y Abcg8 (fila superior, de izquierda a derecha) y MRP1, MRP2, MRP3, MRP4 y MRP5 (fila inferior, de izquierda a derecha). La Figura 5D muestra los resultados de mdrl, mdr2 y mdr3 (de izquierda a derecha). El análisis estadístico representó: p <0.05 *; p <0.01 **; p <0.001 *** (Control (ctl) versus 873-5p-Inh). Las barras negras representan miR-Ctl y las barras blancas representan el tratamiento con miR-837-5p-inh.

La Figura 6A-C proporciona información relacionada con la expresión de miR-873-5p y miARN-518d-5p en el hígado. La Figura 6A es una tabla de resultados de análisis de expresión de miARN indicados en muestras de hígado tumoral en comparación con hígado sano. La Figura 6B es un gráfico que muestra los resultados de un estudio de correlación entre los niveles de expresión de miARN-518d-5p y GNMT en tumores hepáticos. La Figura 6C es un dibujo esquemático que muestra el sitio de unión putativo de miR-873-5p en un fragmento GNMT 3'UTR. La Figura 7A-B muestra gráficos que demuestran una falta de efecto de inhibición de miR-873-5p en ausencia de GNMT. La Figura 7A proporciona gráficos de los resultados del análisis de la expresión de ARNm de genes indicados por qPCR en control y hepatocitos Gnmt-KO inhibidos por miR-873-5p en cultivo en diferentes puntos de tiempo de desdiferenciación, mostrando resultados para HNH4a, Matla, Albúmina y HK4 (de izquierda a derecha). La Figura 7B es un gráfico que muestra el ensayo de actividad de Caspasa 3 en hepatocitos de control e inhibidos por miR-873-5p derivados de ratones Gnmt-KO después de 1 h y 2 h de tratamiento con DCA (100 ^jM). El análisis estadístico representó: p <0.05 *; p <0.01 **; # se compara con 0h DCA miR-Ctrl.

La Figura 8 es un diagrama esquemático que ilustra la inhibición de miR-873-5p que bloquea la desdiferenciación del hígado y la expresión de la fibrosis direccionada a GNMT. El esquema representa el efecto del miARN-873-5p en el hígado sobre la regulación de la expresión de GNMT, afectando la desdiferenciación hepática y el fenotipo fibrótico. A la izquierda, se muestra el efecto de inhibir miR-873-5p recuperando la expresión de GNMT.

La Figura 9A-D proporciona gráficos que muestran la expresión de miR-873-5p en NAFLD. La Figura 9A muestra la expresión de g NmT en el hígado de pacientes sanos (control), esteatóticos y con NASH. La Figura 9B muestra la expresión de miR-873-5p en el hígado de pacientes sanos (control), esteatóticos y con NASH. La Figura 9C muestra la correlación entre GNMT y la expresión de miR-873-5p en el hígado de pacientes sanos y con NASH. La Figura 9D muestra el nivel de miR-873-5p en el suero de pacientes sanos y con NAFLD/NASH.

La Figura 10A-C proporciona gráficos que muestran la expresión de miR-873-5p en modelos de ratones NAFLD. Las Figuras 10A-C muestra resultados de ratones alimentados con dieta normal (Chow) en comparación con ratones alimentados con una dieta deficiente en metionina y colina (MCDD) en la Figura10A, ratones alimentados con dieta alta en grasas (HFD) en la Figura10B y ratones alimentados con dieta de colesterol alto (HC) en la Figura 10C. Cada sujeto de ratón fue alimentado con la dieta indicada durante un período de cuatro semanas, y luego se determinaron los niveles de ARNm de miR-873-5p y GNMT.

La Figura 11A-G proporciona un diagrama esquemático, imágenes fotomicrográficas y gráficos que demuestran que la inhibición del miR-873-5p en MCDD contrarresta la NAFLD. Los ratones de los estudios se alimentaron con MCDD durante cuatro semanas y se inyectó en la cola anti-miR-873-5p durante 3 semanas. La Figura 11A muestra un diagrama esquemático de la inyección de ratón. Las Figura 11B-C muestran los resultados del análisis histológico que incluyen hematoxilina y eosina (H&E), Sudán III, Sirius red, F4/80, SMA y GNMT en el hígado de ratones tratados con anti-miR o de control normal (ctrl). La Figura 11D-F proporciona tres gráficos que muestran los niveles séricos de transaminasas hepáticas (figura 11D), triglicéridos (figura 11E) y cuerpos cetónicos (Figura 11F). La Figura 11G proporciona un gráfico que muestra los ácidos grasos libres hepáticos, los triglicéridos y el colesterol de ratones alimentados con dieta estándar (Chow) y MCD y tratados o no con anti-miR-873-5p. La dieta MCD también se hace referencia aquí de manera intercambiable como MCDD y DDMC.

Descripción detallada

Se ha identificado ahora que miARN-873-5p y miARN-518d-5p impactan ambos en la enfermedad hepática (ejemplos no limitantes de los cuales incluyen: NAFLD, NASH, inflamación del hígado, hígado graso, descompensación del hígado, fibrosis hepática, cirrosis, etc.), y el desarrollo y tratamiento del cáncer de hígado mediante la regulación de la expresión de GNMT. También se ha descubierto que niveles altos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p están asociados con niveles bajos de GNMT en modelos animales de enfermedad hepática, y también están presentes en sujetos que tienen ciertas enfermedades o afecciones hepáticas. La invención, en algunos aspectos, incluye la actividad inhibidora de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p como tratamiento de afecciones pro-oncogénicas hepáticas (LPOC), tales como NAFLD, cirrosis, así como carcinoma hepatocelular (HCC) y otras enfermedades y afecciones hepáticas. En ciertos aspectos de la invención, la inhibición de una actividad de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p puede aumentar la quimioprotección en LPOC y reducir la quimiorresistencia antitumoral en enfermedades asociadas con la actividad de miARN-873-5p y miARN- 518d-5p. En ciertos aspectos de la invención, se proporcionan composiciones para su uso en métodos de tratamiento que incluyen la reducción direccionada de los niveles de actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p como tratamiento para NAFLD, cirrosis, HCC, afecciones pro-oncogénicas hepáticas, y otras enfermedades y afecciones del hígado.

Los microARN (también denominados en el presente documento miARN) son pequeñas moléculas de ARN endógeno que actúan para dirigir el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) a secuencias diana en moléculas de ARNm. Los miARN cargados con RISC se unen de una manera específica de secuencia a sus ARNm diana y reprimen los ARNm diana a través de medios tales como la inhibición de la traducción y la desestabilización del a Rn . Las secuencias de microARN establecidas en el presente documento como SEQ ID NO: 1-15 incluyen: Secuencia de Homo sapiens para MIR-873-5p también denominada como: hsa-miR-873-5p, que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de Mus musculus para MIR -873-5p también denominada como: mmu-miR-873a-5p, la secuencia de Rattus novergicus para MIR-873-5p también denominada como: rno-miR-873-5p, la secuencia de Populus trichocarpa para MIR-873-5p también denominada como: ptr-miR-873, la secuencia de Bos taurus para MIR-873-5p también denominada como: bta-miR-873, la secuencia de Equus caballus para MIR-873-5p también denominada como: eca-miR -873, y la secuencia de Pongo pygmaeus para MIR-873-5p también denominada como: ppy-miR-873. También se proporciona la secuencia de Homo sapiens para MIR-518d-5p también denominada como: hsa-miARN-518d-5p y tiene una secuencia idéntica a la de MIR-526a también denominaada como hsa-miR-526a, la secuencia de Homo sapiens para MIR-520c-5p también denominada como hsa-miR-520c-5p, la secuencia de Populus trichocarpa para MIR-526a también denominada como ptr-miR-526a, la secuencia Gorilla gorilla para MIR-518d-5p también denominada como ggo-miARN-518d-5p, la secuencia Gorilla gorilla para MIR-520C también denominada como: ggo-miR-520cd, la secuencia Gorilla gorilla para MIR-526a también denominada como ggo-miR-526a, y la secuencia Pongo pygmaeus para MIR-518g-5p también denominada ppy-miARN-518g-5p.

Como se usa en el presente documento, la inhibición de la actividad de microARN significa la represión del ARNm diana del microARN y la reducción de la proteína transcrita a partir del ARNm diana. Como se usa en este documento, la mejora de la actividad de microARN significa la intensificación del efecto del ARNm diana del microARN y el aumento de la cantidad de proteína que se transcribe a partir del ARNm diana. Ahora se ha determinado que la actividad de los microARN: miARN-873-5p y miARN-518d-5p en células y sujetos se correlaciona con la presencia o ausencia de enfermedades y afecciones, que incluyen pero no se limitan a enfermedades y afecciones hepáticas. Un nivel más alto de actividad de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en una o más de una célula, tejido u órgano aumenta la probabilidad de una enfermedad o afección hepática en la célula, tejido u órgano, respectivamente. Un nivel reducido de actividad de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en una o más de una célula, tejido u órgano disminuye la probabilidad de una enfermedad o afección hepática en la célula, tejido u órgano, respectivamente.

También se ha identificado ahora que el aumento de la actividad de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en una célula puede resultar en la desdiferenciación de la célula y puede resultar en la adquisición de más características "fetales" por parte del célula.

Actividad de miARN-873-5p, miARN-518d-5p y GNMT.

La presente divulgación se refiere generalmente a modular una o más de la actividad de miARN-873-5p, miARN-518d-5p y GNMT en una célula, tejido y/o sujeto. Como se usa en el presente documento, el término "modulación" significa cambiar un nivel de actividad de miARN-873-5p, miARN-518d-5p y/o GNMT (por ejemplo, nivel y/o función) en una célula. En algunas realizaciones, cambiar la actividad de miARN-873-5p, miARN-518d-5p y/o GNMT incluye cambiar un nivel de uno o más de miARN-873-5p, miARN-518d-5p y GNMT en una célula o tejido. Por lo tanto, la disminución de la actividad de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en una célula puede incluir disminuir el nivel (por ejemplo, cantidad) de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en la célula.

Algunas realizaciones de la invención incluyen composiciones para su uso en métodos de tratamiento que implican la administración de uno o más de un compuesto inhibidor de miARN-873-5p y un compuesto inhibidor de miARN-518d-5p a una célula, tejido o sujeto en una cantidad eficaz para disminuir una o más de la actividad de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en la célula, tejido o sujeto, como tratamiento para la enfermedad o afección hepática. Una enfermedad o afección hepática tal como cáncer de hígado, cáncer metastásico en el hígado, afección precancerosa del hígado, carcinoma hepatocelular, cirrosis, afección hepática postcáncer, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), hígado graso, inflamación del hígado, fibrosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis criptogénica, carcinoma hepatocelular, descompensación del hígado, esteatohepatitis y quimiorresistencia pueden tratarse en una célula o tejido que contacta la célula o tejido con uno o ambos de un inhibidor de miARN-873-5p compuesto y un compuesto inhibidor de miARN-518d-5p disminuyendo así la actividad de miARN-873-5p y miARN-518d-5p, respectivamente, en la célula o tejido, tratando así la enfermedad o afección hepática en la célula o tejido.

Una enfermedad o afección hepática tal como cáncer de hígado, un cáncer metastásico en el hígado, una afección hepática pro-oncogénica, una afección hepática precancerosa, carcinoma hepatocelular, cirrosis, una afección hepática postcáncer, enfermedad del hígado graso no alcohólico. (NAFLD), hígado graso, inflamación del hígado, fibrosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis criptogénica, carcinoma hepatocelular, descompensación hepática, esteatohepatitis y quimiorresistencia pueden tratarse en un sujeto mediante la administración de uno o más de un compuesto inhibidor de miARN-873-5p y un compuesto inhibidor de miARN-518d-5p al sujeto en una cantidad eficaz para disminuir la actividad de miARN-873-5p y miARN-518d-5p, respectivamente, en el sujeto, para tratar la enfermedad hepática o condición en el sujeto.

En algunas realizaciones, las composiciones para su uso en los métodos de tratamiento de la invención incluyen la disminución de la actividad de uno o más de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en una célula, tejido o sujeto, por ejemplo, administrando un compuesto inhibidor de microARN en la célula, tejido o sujeto, para tratar una enfermedad o afección hepática. Para tratar una enfermedad o afección hepática en un sujeto, una o más células pueden ponerse en contacto con un compuesto inhibidor de microARN, tal como un compuesto inhibidor de miARN-873-5p o un compuesto inhibidor de miARN-518d-5p, lo que da como resultado un nivel disminuido de actividad de al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en la célula. Si la célula que va a ponerse en contacto con el compuesto inhibidor de microARN está en un sujeto, el compuesto inhibidor de microARN se puede administrar al sujeto.

Compuestos inhibidores de microARN y compuestos potenciadores

Los compuestos inhibidores de microARN útiles en composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención son compuestos inhibidores de miARN-873-5p y compuestos inhibidores de miARN-518d-5p.

La presente divulgación se refiere generalmente a modular la actividad de microARN. Como se señaló anteriormente, en un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto modulador de miARN que altera la actividad de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en una célula, como se define en la reivindicación 8.

En algunos casos, modular es "inhibir" la actividad de microARN y, en otros casos, modular es "potenciar" la actividad de microARN, por lo que los términos compuesto "inhibidor de microARN" y compuesto "potenciador de microARN" pueden denominarse en este documento mediante el término colectivo Compuesto "modulador de microARN". Un experto en la técnica reconocerá que, como se usa en este documento, términos tales como más alto, más bajo, disminuido, inhibido, reducido, aumentado y potenciado pueden representar niveles o valores relativos en comparación con los niveles o valores de control.

Métodos para reducir la actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p

La invención, en parte, incluye composiciones para su uso en métodos de tratamiento que implican reducir la actividad (por ejemplo, niveles y/o función) de uno o más de los microARN miARN-873-5p y miARN-518d-5p para tratar un enfermedad o afección hepática en una célula, tejido, órgano y/o sujeto. Las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención pueden usarse para tratar a un sujeto que tiene, o corre el riesgo de tener, una enfermedad o afección hepática que puede caracterizarse y/o asociarse con una actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p en una o más de una célula, tejido o sujeto que aumenta la probabilidad de una enfermedad o afección hepática en la célula, tejido o sujeto, respectivamente. Ciertos aspectos de la invención proporcionan métodos y composiciones in vitro o ex vivo para su uso en métodos de tratamiento que pueden usarse para inhibir la actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p en una célula, lo que aumenta la actividad de la enzima glicina N- metiltransferasa (GNMT) en la célula.

En algunas realizaciones, las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención incluyen poner en contacto una célula con un compuesto inhibidor de miARN en una cantidad que sea eficaz para aumentar la actividad de la enzima GNMT en la célula. En algunas realizaciones, las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención incluyen poner en contacto una célula con un compuesto inhibidor de miARN en una cantidad que sea eficaz para reducir la hipermetilación del ADN en la célula para tratar enfermedades o afecciones hepáticas en células, tejidos, órganos y sujetos. La invención, en parte, también se refiere a disminuir/inhibir la actividad de miARN-873-5p y miARN-518d-5p desde un nivel de actividad inicial en una o más células en un sujeto a un nivel más bajo de actividad que es eficaz para reducir o eliminar los síntomas de y para tratar una enfermedad o afección hepática en el sujeto.

En ciertas realizaciones de la invención, la inhibición de la actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p incluye reducir la función de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p en una célula, tejido y/o sujeto. La reducción de la función de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p puede resultar de una disminución en la cantidad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p y/o de una disminución en la actividad del miARN-873 -5p y/o molécula de miARN-518d-5p en una célula, tejido o sujeto. Se entenderá que en algunas realizaciones, la invención puede reducir la actividad de un miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p sin alterar la cantidad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p en una célula o tejido. Un ejemplo no limitante de una composición para su uso en un método de tratamiento de acuerdo con la invención, para reducir la actividad de un miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p, incluye poner en contacto el miARN-873-5p o miARN -518d-5p con un inhibidor de microARN que se une a miARN-873-5p o miARN-518d-5p e inhibe la actividad del miARN-873-5p o miARN-518d-5p, respectivamente. Se entenderá que en algunas realizaciones, la invención reduce la cantidad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p en una célula o tejido, reduciendo así la actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p en la célula, tejido o sujeto. Las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención pueden incluir la administración de uno o más compuestos inhibidores de microARN a una célula, tejido o sujeto para reducir la actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p, para reducir una cantidad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p, y/o para reducir tanto la cantidad como la actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p en la célula, tejido y/o sujeto.

Las moléculas y compuestos que inhiben una actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p se denominan en el presente documento compuestos inhibidores de microARN. Un compuesto inhibidor de microARN disminuye la capacidad de un miARN diana para actuar sobre el ARNm diana del miARN. Como se usa en este documento, el término "miARN diana" significa el miARN cuya actividad va a ser reducida por el compuesto inhibidor de miARN. En ciertos aspectos de la invención, el microARN diana es miARN-873-5p. En algunos aspectos de la invención, el microARN diana es miARN-518d-5p.

La reducción de la actividad de un miARN diana mediante la administración de un compuesto inhibidor de microARN puede resultar de la inhibición directa o indirecta de la actividad de su microARN diana. Como se usa en este documento, el término "inhibición directa" significa inhibición de la actividad de microARN que resulta de la unión de un compuesto inhibidor de microARN a su microARN diana. En algunas realizaciones de la invención, la inhibición directa de microARN reduce o elimina la unión del microARN diana a su ARNm diana, inhibiendo así la actividad del microARN diana. En ciertas realizaciones de la invención, la inhibición directa de microARN puede no prevenir la unión de un microARN a su ARNm diana, pero puede interferir con la interacción entre el microARN y su ARNm diana, inhibiendo así la actividad del microARN. Como se usa en este documento, el término "inhibición indirecta de microARN" significa inhibición de la actividad de microARN que resulta de la unión de un compuesto inhibidor de microARN a un ARNm diana de microARN. En algunas realizaciones de la invención, la inhibición indirecta de microARN da como resultado una reducción o eliminación de la unión del microARN a su ARNm diana, inhibiendo así la actividad del microARN. En ciertas realizaciones de la invención, la inhibición indirecta de microARN puede no prevenir la unión de un microARN a su ARNm diana, pero puede interferir con la interacción entre el microARN y su ARNm diana, inhibiendo así la actividad del microARN. Los métodos generales para preparar y usar compuestos inhibidores de microARN (tanto directos como indirectos) se describen en publicaciones tales como: Patente US No.

8,288,356; Patente US No. 8,906,871; Patente US No. 8,247,543; Publicación de solicitud de Patente US No. US 2013-0171242; Patente US No. 9,096,850; y Robertson, B. et al., Silence 2010, 1:10 (doi:10.1186/1758-907X-1-10); Baigude, H. and Rana, T.M. 2014, Nanomedicine (Lond) 9:2545; Esau, C.C. 2008, Methods 44:55; and Zhao, J.J. et al., 2015 Cancer Res. Publicación electrónica antes de la impresión.

Se pueden usar numerosos tipos de compuestos inhibidores de microARN en aspectos de la invención, como se define en las reivindicaciones. Por lo tanto, estas pueden ser moléculas de ARN, tales como antagomir y blockmir, moléculas de esponja de miARN o moléculas inhibidoras antisentido.

Un ejemplo no limitante de un compuesto inhibidor de microARN que reduce la actividad de miARN-873-5p es miRIDIAN microARN Inhibidor de horquilla miARN-873-5p (Dharmacon, Lafayette, CO), que es un que es un oligonucleótido de ARN potenciado químicamente monocatenario, que se une a y secuestra la hebra de microARN madura complementaria miARN-873-5p. Un ejemplo no limitante de un compuesto inhibidor de microARN que reduce la actividad de miARN-518d-5p es miRIDIAN microARN Inhibidor de horquilla miARN-518d-5p (Dharmacon, Lafayette, CO), que es un oligonucleótido de ARN monocatenario potenciado químicamente que se une a y secuestra la hebra de microARN madura complementaria miARN-518d-5p. Otras secuencias que se unen a y reducen la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p incluyen oligonucleótidos de ARN que comprenden una secuencia complementaria a la secuencia de miARN-873-5p o miARN-518d-5p, respectivamente. En algunos aspectos, se usa un compuesto inhibidor para inhibir otro miARN divulgado en el presente documento, por ejemplo, MIR-526a, MIR-520c-5p, MIR-520C y MIR-518g-5p.

Los tipos adicionales de moléculas que pueden usarse en la invención para inhibir la actividad de microARN incluyen, pero no se limitan a, antagomir, blockmirs y esponjas de microARN.

Los antagomir son oligonucleótidos químicamente modificados que se unen específicamente a un microARN diana de interés e inhiben la actividad de la diana celular del microARN. En ciertos aspectos de la invención, uno o más de un antagomir que se une e inhibe miARN-873-5p y un antagomir que se une a e inhibe miARN-518d-5p pueden administrarse a una célula para tratar una enfermedad o afección hepática en la célula, y/o puede administrarse a un sujeto para tratar una enfermedad o afección hepática en el sujeto. Los métodos para preparar y administrar antagomirs son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Krützfeldt, J. et al., (2005) Nature 438 (7068): 685-9; Checa M.P. (2006) N. Engl. J. Med. 354 (11): 1194-5; Tay, F.C. et al., 2015, Adv Drug Deliv Rev. 81: 117; Ebert, M.S. y Sharp, P.A. 2010, ARN 16: 2043; y Velu C.X. 2014, J. Clin Invest 124: 222.

Los blockmirs están diseñados de tal manera que incluyen una secuencia complementaria a una secuencia de ARNm diana que sirve como sitio de unión para microARN. Los blockmir se unen al ARNm y, por lo tanto, inhiben la actividad del microARN al bloquear estéricamente el microARN para que no se una al mismo sitio en el ARNm diana, lo que evita la degradación del ARNm diana a través del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Los métodos para preparar y administrar blockmirs son conocidos en la técnica, véanse, por ejemplo, la Patente U.S. N° 8,691965; Stenvang et al. Silence 2012, 3:1; and Young, J.A. 2013, Blood 122:2911.

Los ARN esponja son pequeños ARN sintéticos que se unen a múltiples microARN que tienen la misma secuencia en su "región semilla". Ejemplos no limitantes de compuestos de esponja de miARN son transgenes altamente expresados que comprenden múltiples sitios diana de miARN y, por lo tanto, pueden unirse y secuestrar miARN. La "esponja" de microARN administrada (por ejemplo, administrada a una célula o expresada en ella) puede dar como resultado una pérdida continua de función de miARN en la célula. Los ARN esponja útiles en algunas realizaciones de los métodos de la invención comprenden secuencias de ARN que proporcionan sitios de unión complementarios a miARN-873-5p o miARN-518d-5p, y cuando se expresan o se administran a una célula, los ARN esponja funcionan dentro de la célula para inhiben la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p, respectivamente. Los sitios de unión de la esponja de microARN pueden ser complementarios y específicos de la región semilla de miARN de miARN-873-5p o miARN-518d-5p. En ciertos aspectos de la invención, la región semilla de miARN-873-5p pueden ser los nucleótidos 2-8 de la secuencia de miARN-873-5p. En ciertos aspectos de la invención, la región semilla de miARN-518d-5p pueden ser los nucleótidos 2-8 de la secuencia de miARN-518d-5p. El diseño y uso de ARN de esponja es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Ebert, M., et al. Nature Methods 4, 721 - 726 (2007) y Ebert, M. & P. Sharp, RNA. 2010 Nov; 16 (11): 2043-2050.

Pueden usarse moléculas inhibidoras antisentido en aspectos de la invención para reducir la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p y para aumentar la actividad de GNMT. Ejemplos no limitantes de moléculas inhibidoras antisentido son: anti-miARN y oligonucleótidos antisentido químicamente modificados que secuestran miARN maduros y, por tanto, compiten con los mRNA diana celulares. La competencia reduce el nivel de unión del miARN con su ARNm diana celular y así inhibe la actividad del miARN. Los compuestos y métodos de inhibición antisentido son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo: A.G. Torres et al., RNA (2011), 17: 933-943; y Torres A.G.2011, Artif DNA PNA XNA 2:71.

Células, sujetos y controles

La invención, que proporciona composiciones para su uso en métodos de tratamiento y métodos in vitro o ex vivo, puede usarse junto con células, tejidos, órganos y/o sujetos. En algunos aspectos de la invención, un sujeto es un humano o un mamífero vertebrado que incluye, entre otros, un perro, un gato, un caballo, una vaca, una cabra, un ratón, una rata y un primate, por ejemplo, un mono. Por tanto, la invención puede usarse para tratar enfermedades o afecciones en sujetos humanos y no humanos. En algunos aspectos de la invención, un sujeto puede ser un animal de granja, un animal de zoológico, un animal domesticado o un animal no domesticado y los métodos de la invención pueden usarse en regímenes de prevención y tratamiento veterinarios. En algunas realizaciones de la invención, el sujeto es un humano y los métodos de la invención pueden usarse en regímenes de prevención y tratamiento en humanos.

Ejemplos no limitantes de sujetos a los que se puede aplicar la presente invención son sujetos quienes han sido diagnosticados, sospechosos de tener, o en riesgo de tener, una enfermedad o afección hepática. Los métodos de la invención pueden aplicarse a un sujeto que, en el momento del tratamiento, ha sido diagnosticado que tiene una enfermedad o afección hepática, o un sujeto que se considera que tiene riesgo de tener o desarrollar una enfermedad o afección hepática. En algunos aspectos de la invención, una enfermedad o afección hepática es una enfermedad o afección hepática aguda, y en ciertos aspectos de la invención, una enfermedad o afección hepática es una enfermedad o afección hepática crónica.

Las células a las que se pueden aplicar las composiciones para su uso en los métodos de tratamiento de la invención incluyen células que son células in vivo; los métodos in vitro o ex vivo de la invención pueden aplicarse a células in vitro o ex vivo. Las células pueden estar en un sujeto, en cultivo y/o en suspensión, o en cualquier otro estado adecuado. Una célula a la que se puede aplicar la invención puede ser una célula de hígado u otro tipo de célula de vertebrado, incluidas células de mamífero humanas y no humanas. En ciertos aspectos de la invención, una célula a la que se puede aplicar la invención es una célula normal sana que no es una célula de cáncer de hígado. En determinadas realizaciones de la invención, una célula a la que se pueden aplicar las composiciones para su uso en los métodos de tratamiento de acuerdo con la invención es una o más de una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer metastásico, una célula de hígado precancerosa, una célula de hígado cirrótico, una célula hepática poscancerígena, una célula hepática fibrótica, un hepatocito, una célula cancerosa inflamatoria del hígado y una célula hepática quimiorresistente. En determinadas realizaciones de la invención, una célula que se pone en contacto con un modulador de microARN es una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer metastásico, una célula de hígado precancerosa, una célula de hígado cirrótico, una célula hepática poscancerígena, una célula hepática fibrótica, un hepatocito, una célula cancerosa inflamatoria del hígado y una célula hepática quimiorresistente. En ciertos aspectos de la invención, una célula de control es una célula normal, pero se entenderá que una célula que tiene una enfermedad o afección (por ejemplo, pero no se limita a una enfermedad o afección hepática) también puede servir como una célula de control en circunstancias particulares, por ejemplo, para comparar los resultados de una célula tratada que tiene una enfermedad o afección con una célula no tratada que tiene la enfermedad o afección, etc.

Se puede determinar un nivel de actividad de GNMT, miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p y comparar con el nivel de control de actividad de GNMT, miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p, respectivamente, de acuerdo con los métodos de la invención. Un control puede ser un valor predeterminado, que puede adoptar diversas formas. Puede ser un valor de corte único, tal como una mediana o una media. Puede establecerse con base en grupos comparativos, tales como en grupos que tienen niveles normales de actividad de GNMT, miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p y grupos que tienen niveles reducidos de GNMT, miARN-873-5p y/o actividad de miARN-518d-5p. Otro ejemplo de grupos comparativos pueden ser los grupos que tienen uno o más síntomas o un diagnóstico de una enfermedad o afección hepática y los grupos que no tienen uno o más síntomas o un diagnóstico de la enfermedad o afección hepática. Típicamente, un control puede basarse en individuos normales aparentemente sanos en un grupo de edad apropiado o en células aparentemente sanas. Se entenderá que los controles pueden ser, además de valores predeterminados, muestras de materiales probados en paralelo con los materiales experimentales. Ejemplos incluyen muestras de poblaciones de control o muestras de control generadas a través de la fabricación para ser probadas en paralelo con las muestras experimentales.

Los valores de una o más de la actividad de GNMT, miARN-873-5p y miARN-518d-5p determinados para un sujeto pueden servir como valores de control para determinaciones posteriores de la actividad de GNMT, miARN-873-5p y miARN-518d-5p, respectivamente, en ese mismo sujeto, lo que permite evaluar los cambios de una actividad de GNMT "basal", miARN-873-5p y miARN-518d-5p en un sujeto. Por lo tanto, un nivel de actividad inicial de GNMT, miARN-873-5p y miARN-518d-5p puede estar presente y/o determinado en un sujeto, célula o tejido y la invención puede usarse para disminuir el nivel de miARN-873- 5p, y miARN-518d-5p y aumentan el nivel de actividad GNMT en el sujeto, sirviendo el nivel inicial como nivel de control para ese sujeto. Usando compuestos inhibidores de microARN como se define en las reivindicaciones, el nivel de actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p en una célula y/o sujeto puede reducirse en al menos 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en comparación con el nivel inicial como tratamiento para una enfermedad o afección hepática en la célula y/o sujeto, respectivamente, o en comparación con un nivel de control sin contacto en una célula y/o sujeto, respectivamente. Usando compuestos inhibidores de microARN como se define en las reivindicaciones, el nivel de actividad GNMT en una célula y/o sujeto puede incrementarse en al menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 250%, 500%, 1000%, 5000% o más en comparación con el nivel inicial como tratamiento para una enfermedad o afección hepática en la célula y/o sujeto, respectivamente, o en comparación con un nivel de control sin contacto en una célula y/o sujeto, respectivamente.

Tratamiento

Las enfermedades y afecciones hepáticas son ejemplos de enfermedades y afecciones que pueden tratarse usando la invención para inhibir la actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p y aumentar la GNMT. Las enfermedades y afecciones hepáticas que pueden tratarse con inhibidores de microARN incluyen, pero no se limitan a: un cáncer de hígado, un cáncer metastásico en el hígado, una afección precancerosa del hígado, carcinoma hepatocelular, cirrosis, una afección hepática postcáncer, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), hígado graso, inflamación del hígado, fibrosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis criptogénica, carcinoma hepatocelullar, hígado descompensado, esteatohepatitis y quimiorresistencia. En algunas realizaciones, la invención puede usarse para reducir la quimiorresistencia y reducir el crecimiento y la recurrencia de tumores en un sujeto. La administración de un compuesto inhibidor de microARN puede ser útil para reducir la quimiorresistencia en un sujeto que está siendo tratado por cáncer y puede aumentar la probabilidad de una terapia exitosa del cáncer con un resultado terapéutico más positivo para el sujeto, que el que estaría presente en ausencia del método de tratamiento de la invención. Por tanto, la administración de un inhibidor de microARN como se define en las reivindicaciones puede reducir la quimiorresistencia en un sujeto que está siendo tratado con un agente quimioterapéutico o que será tratado con un agente quimioterapéutico.

En ciertos aspectos de la invención, a un sujeto se le puede administrar un compuesto inhibidor de microARN en un momento que es uno o más antes o después del diagnóstico de una enfermedad o afección hepática. En algunos aspectos de la invención, un sujeto corre el riesgo de tener o desarrollar una enfermedad o afección hepática. Un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad o afección hepática es aquel que tiene una mayor probabilidad de desarrollar la enfermedad o afección hepática, en comparación con un riesgo de control de desarrollar la enfermedad o afección hepática. En algunas realizaciones de la invención, un nivel de riesgo puede ser estadísticamente significativo en comparación con un nivel de riesgo de control. Un sujeto en riesgo puede incluir, por ejemplo, un sujeto que es, será, un sujeto que tiene una enfermedad preexistente y/o una anomalía genética que hace que el sujeto sea más susceptible a una enfermedad o afección hepática que un sujeto de control sin la enfermedad preexistente o anomalía genética; un sujeto que tiene antecedentes médicos familiares y/o personales de una enfermedad o afección hepática; y un sujeto que ha sido tratado previamente por la enfermedad o afección hepática. Se entenderá que una enfermedad preexistente y/o una anomalía genética que hace que el sujeto sea más susceptible a una enfermedad o afección hepática, puede ser una enfermedad o anomalía genética que, cuando está presente, se ha identificado previamente que tiene una relación correlativa con una mayor probabilidad de desarrollar una enfermedad o afección hepática.

Como se usa en este documento, los términos "trato", "tratado" o "tratar" cuando se usan con respecto a una enfermedad o afección hepática pueden referirse a un tratamiento profiláctico que disminuye la probabilidad de que un sujeto desarrolle la enfermedad o afección hepática, y también puede referirse a un tratamiento después de que el sujeto haya desarrollado la enfermedad o afección hepática para eliminar o reducir el nivel de la enfermedad o afección hepática, evitar que la enfermedad o afección hepática se vuelva más avanzada (por ejemplo, más grave), y/o ralentizar la progresión de la enfermedad o afección hepática en un sujeto en comparación con el sujeto en ausencia de la terapia para reducir la actividad en el sujeto de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p y aumentar el nivel de actividad GNMT en el sujeto.

Suministro/administración de compuestos moduladores de microARN

Los compuestos inhibidores de microARN como se definen en las reivindicaciones pueden administrarse a un sujeto en una cantidad y manera eficaz para reducir la actividad de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p, y para aumentar la actividad de la enzima GNMT en el sujeto para tratar una enfermedad o afección hepática. Las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención, en algunas realizaciones, incluyen la administración de uno o más compuestos inhibidores de microARN a un sujeto que necesita tal tratamiento para reducir una enfermedad o afección hepática en el sujeto. Los compuestos inhibidores de microARN como se definen en las reivindicaciones pueden administrarse para reducir la actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p en una más de células in vitro, ex vivo e in vivo.

En algunas realizaciones de la invención, la actividad de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p puede reducirse introduciendo genéticamente un compuesto inhibidor de micro-ARN en una célula. Pueden usarse agentes y métodos de selección para ayudar en la administración de un compuesto inhibidor de microARN a un tipo celular, subtipo celular, órgano, región espacial específicos dentro de un sujeto y/o región subcelular dentro de una célula. En las realizaciones de la invención también se pueden usar métodos conocidos en la técnica, tales como el direccionamiento genético, para controlar la cantidad de un compuesto modulador de microARN en una célula y/o sujeto. Algunas realizaciones de la invención pueden incluir un reactivo para la expresión direccionada genéticamente de un compuesto modulador de microARN.

Se puede administrar un compuesto modulador de microARN en composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención individualmente o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Un compuesto inhibidor de microARN administrado a un sujeto o célula para tratar una enfermedad o afección hepática puede actuar de manera sinérgica con uno o más de otros agentes o actividades terapéuticas y aumentar la eficacia de uno o más agentes o actividades terapéuticas y/o para aumentar la eficacia del compuesto inhibidor de microARN en el tratamiento de la enfermedad o afección hepática.

Las composiciones para su uso en los métodos de tratamiento de acuerdo con la invención, que incluyen la administración de un compuesto inhibidor de microARN, se pueden usar antes del inicio de una enfermedad o afección hepática y/o cuando la enfermedad o afección hepática está presente, incluyendo en una etapa inicial, intermedia y tardía de la enfermedad o afección hepática y en todo momento antes y después de cualquiera de estas etapas. La invención también puede ser para tratar sujetos que han sido tratados previamente por una enfermedad o afección hepática con uno o más medicamentos que no tuvieron éxito, tuvieron un éxito mínimo y/o ya no tienen éxito en el tratamiento de la enfermedad o afección hepática en el sujeto.

Se entenderá que se pueden identificar y usar compuestos inhibidores de microARN adicionales en métodos de tratamiento de las composiciones para su uso en el tratamiento de acuerdo con la invención. Por ejemplo, los compuestos candidatos pueden probarse por su capacidad para disminuir la actividad de uno o ambos de miARN873-5p y miARN-518d-5p, su capacidad para aumentar la actividad de la enzima GNMT y su capacidad para tratar una enfermedad hepática o condición usando ensayos y métodos presentados en este documento.

Componentes de los compuestos moduladores de microARN

Un compuesto modulador de microARN útil en la invención, específicamente un compuesto inhibidor de microARN como se define en las reivindicaciones, puede administrarse solo o en conjugación con uno o más elementos tales como agentes de direccionamiento, agentes de marcaje, agentes de suministro de cruce de membranas., etiqueta de secuencia, etc. Así, en algunas realizaciones de la invención, el compuesto inhibidor de microARN consiste en una molécula inhibidora de microARN y en ciertas otras realizaciones de la invención el compuesto inhibidor de microARN comprende una molécula inhibidora de microARN y uno o más elementos adicionales.

Los agentes de dirección pueden incluir agentes que dirijan un compuesto modulador de microARN hacia y/o dentro de una célula que se va a tratar, tal como una célula hepática u otro tipo de célula. Un compuesto de direccionamiento de selección dependerá de la naturaleza de la enfermedad o afección hepática y del tipo de célula a la que es direccionada. En un ejemplo no limitante, en algunas realizaciones puede ser deseable direccionar un compuesto modulador de microARN hacia y/o dentro de una célula hepática. Se entenderá que en algunas realizaciones un compuesto modulador de microARN incluye una molécula moduladora de microARN sin ningún elemento adicional adjunto. Por ejemplo, se puede administrar un modulador de microARN a una célula y/o sujeto en forma "desnuda", lo que significa que no hay moléculas de administración, marcadores, etc. unidos al compuesto modulador de microARN. Alternativamente, se puede administrar un modulador de microARN a una célula y/o sujeto mediante un medio de transfección.

En los casos en los que un compuesto modulador de microARN se une a, o en una composición con, uno o más: agentes portadores de células o tejidos, agentes de direccionamiento, agentes de marcaje, agentes de suministro, etc., un experto en la técnica estará al tanto de y capaz de seleccionar y utilizar agentes adecuados para su uso a este respecto. Un agente portador puede comprender, por ejemplo, uno o más de un nanoportador, una nanopartícula, un portador que penetra en las células, un polímero, un dendrímero, un bioconjugado, un portador basado en lípidos u otro agente portador adecuado. En la técnica se describen medios y procedimientos de administración y direccionamiento adicionales que pueden usarse. Véase, por ejemplo, Torres A.G.2011, Artif DNA PNAXNA Jul-Dec: 2 (3): 71-8, Chen, Z., et al., (2012) Expert Opin Drug Deliv. Junio; 9 (6): 649-56, Li, F. y J.Y. Wang (2009) Opinión de expertos Drug Deliv. May; 6 (5): 531-41, y Poelstra, K. et al., (2012) J. Control Release 20 de julio; 161 (2): 188-97.

Se pueden usar agentes de marcaje para determinar la ubicación del compuesto modulador de microARN en células y tejidos y también se pueden usar para evaluar la ubicación de células, tejidos u órganos de los compuestos de tratamiento que se han administrado. Los procedimientos para unir y utilizar agentes de marcado, tales como marcadores enzimáticos, tintes, radiomarcadores, etc., son bien conocidos en la técnica.

Cantidades efectivas

Las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención, en algunos aspectos, comprenden administrar uno o más compuestos inhibidores de microARN a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar una enfermedad o afección hepática. Una "cantidad eficaz" usada en términos de tratamiento de una enfermedad o afección hepática es una cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de microARN podría ser la cantidad necesaria para (i) ralentizar o detener la progresión de la enfermedad o afección; o (ii) revertir, reducir o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad o afección hepática. En algunos aspectos de la invención, una cantidad eficaz es aquella cantidad de un compuesto inhibidor de microARN que cuando se administra a un sujeto que necesita un tratamiento de una enfermedad o afección hepática, da como resultado una respuesta terapéutica que previene y/o trata la enfermedad o condición hepática. De acuerdo con algunos aspectos de la invención, una cantidad eficaz es aquella cantidad de un compuesto inhibidor de microARN que cuando se combina o coadministra con otro tratamiento terapéutico para una enfermedad o afección hepática, da como resultado una respuesta terapéutica que previene y/o trata la enfermedad. enfermedad o afección hepática. En algunas realizaciones de la invención, un efecto biológico de tratar a un sujeto con un compuesto inhibidor de microARN puede ser la mejora o la eliminación absoluta de los síntomas resultantes de la enfermedad o afección hepática. En algunas realizaciones de la invención, un efecto biológico es la anulación completa de la enfermedad o afección hepática, como se evidencia, por ejemplo, mediante una prueba de diagnóstico que indica que el sujeto está libre de la enfermedad o afección hepática.

Típcamente, se determinará una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de microARN para disminuir la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p, y para aumentar la actividad de la enzima GNMT a un nivel para tratar una enfermedad o afección hepática en ensayos clínicos, estableciendo una dosis eficaz para una población de prueba versus una población de control en un estudio ciego. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz será la que dé como resultado una respuesta deseada, por ejemplo, una cantidad que disminuya una enfermedad o afección hepática en células, tejidos y/o sujetos con la enfermedad o afección hepática. Por lo tanto, una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de microARN para tratar una enfermedad o afección hepática que puede tratarse reduciendo la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p puede ser la cantidad que cuando se administra disminuye la cantidad de miARN- 873-5p o miARN-518d-5p en el sujeto en una cantidad que es menor que la cantidad que estaría presente en la célula, tejido y/o sujeto sin la administración del compuesto inhibidor de microARN. De manera similar, una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de microARN para tratar una enfermedad o afección hepática que se puede tratar aumentando la actividad de la enzima GNMT, puede ser la cantidad que cuando se administra aumenta la cantidad de actividad de la enzima GNMT en el sujeto a una cantidad que es mayor que la cantidad que estaría presente en la célula, tejido y/o sujeto sin la administración del compuesto inhibidor de microARN. En ciertos aspectos de la invención, el nivel de actividad de miARN-873-5p, actividad de miARN-518d-5p o actividad de la enzima GNMT presentes en una célula, tejido y/o sujeto que no ha sido puesto en contacto con o administrado con un compuesto inhibidor de microARN se denomina cantidad de "control". En el caso de tratar una enfermedad o afección hepática, la respuesta deseada puede ser reducir o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad o afección hepática en la célula, tejido y/o sujeto. La reducción o eliminación puede ser temporal o permanente. Se entenderá que el estado de una enfermedad o afección hepática se puede controlar usando métodos para determinar la actividad de miARN-873-5p, actividad de miARN-518d-5p y/o actividad de la enzima GNMT, evaluación de síntomas, pruebas clínicas, etc. En algunos aspectos de la invención, una respuesta deseada al tratamiento de la enfermedad o afección hepática también puede retrasar la aparición o incluso prevenir la aparición de la enfermedad o afección hepática.

También se puede determinar una cantidad eficaz de un compuesto que disminuye la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p y aumenta la actividad de la enzima GNMT evaluando los efectos fisiológicos de la administración de un compuesto inhibidor de microARN en una célula o sujeto, tal como una disminución de una enfermedad o afección hepática después de la administración. Pueden usarse ensayos y/o monitorización sintomática de un sujeto para determinar la eficacia de un compuesto inhibidor de microARN como se define en las reivindicaciones y para determinar la presencia o ausencia de una respuesta a un tratamiento. Un ejemplo, aunque no pretende ser limitante, es el uso de una prueba conocida en la técnica de la función hepática para determinar el estado de una enfermedad o afección hepática en un sujeto antes y después del tratamiento del sujeto con un compuesto inhibidor de microARN. Se entenderá que la cantidad de un compuesto inhibidor de microARN que se administra a un sujeto puede modificarse basándose, al menos en parte, en tales determinaciones del estado de enfermedad y/o afección. La cantidad de un tratamiento se puede variar, por ejemplo, aumentando o disminuyendo la cantidad de un compuesto inhibidor de microARN, cambiando la composición del compuesto inhibidor de microARN que se administra, cambiando la vía de administración, cambiando el momento de la dosificación y así sucesivamente. La cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de microARN variará con la afección particular que se esté tratando, la edad y la condición física del sujeto que se esté tratando; la gravedad de la afección, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hubiera), la vía específica de administración y factores adicionales dentro del conocimiento y la experiencia del médico. Por ejemplo, una cantidad eficaz puede depender del nivel deseado de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p y/o actividad de la enzima GNMT que sea eficaz para tratar la enfermedad o afección hepática. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente una cantidad eficaz de un inhibidor de microARN particular para su uso en la invención sin necesidad de una experimentación indebida. En combinación con las enseñanzas proporcionadas en este documento, seleccionando entre diversos compuestos inhibidores de microARN y factores de ponderación tales como potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, gravedad de los efectos secundarios adversos y modo preferido de administración, un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico eficaz puede planificarse que sea eficaz para tratar al sujeto particular.

Composiciones farmacéuticas moduladoras de microARN y dosificación

Un compuesto modulador de microARN que se administra de acuerdo con la invención también se denomina en el presente documento "compuesto farmacéutico". La dosificación de un compuesto farmacéutico puede ser ajustada por un por un proveedor de atención médica individual o veterinario, particularmente en el caso de cualquier complicación. Una cantidad terapéuticamente eficaz varía típicamente de 0.01 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, o de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más dosis de administraciones diarias, durante uno o más días. La cantidad absoluta dependerá de una variedad de factores que incluyen un tratamiento concurrente, el número de dosis y los parámetros del sujeto individual, que incluyen la edad, la condición física, el tamaño y el peso. Estos son factores bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden abordar con sólo una experimentación de rutina. En algunas realizaciones, se puede usar una dosis máxima, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con el criterio médico sólido.

Las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención pueden incluir en algunas realizaciones la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dosis de un compuesto inhibidor de microARN. En algunos casos, un compuesto farmacéutico (por ejemplo, un compuesto inhibidor de microARN, un compuesto potenciador de microARN, un compuesto inhibidor de miARN-873-5p o un compuesto inhibidor de miARN-518d-5p, etc.) puede administrarse a un sujeto al menos diariamente, cada dos días, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente, etc. Las dosis se pueden administrar una vez al día o más de una vez al día, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más veces en un período de 24 horas.

Las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención, en algunos aspectos, incluyen la administración de un compuesto farmacéutico solo, en combinación con uno o más de otros compuestos inhibidores de microARN, y/o en combinación con otras terapias o tratamientos farmacológicos. actividades o regímenes que se administran a sujetos con una enfermedad o afección hepática. Los compuestos farmacéuticos se pueden administrar en composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas utilizadas en la invención pueden ser estériles y contener una cantidad de un compuesto inhibidor de microARN que reducirá la actividad de un miARN-873-5p o un miARN-518d-5p a un nivel suficiente para producir la respuesta deseada en una unidad de peso o volumen adecuado para la administración a un sujeto. Una dosis administrada a un sujeto de una composición farmacéutica que incluye un compuesto inhibidor de microARN para reducir la actividad de un miARN-873-5p o miARN-518d-5p puede seleccionarse de acuerdo con diferentes parámetros, en particular de acuerdo con el modo de administración utilizado y el estado del sujeto. Otros factores incluyen el período de tratamiento deseado. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente a las dosis iniciales aplicadas, pueden emplearse dosis más altas (o dosis efectivamente más altas por una vía de administración diferente, más localizada) en la medida que lo permita la tolerancia del paciente.

Métodos de administración

Hay disponible una variedad de vías de administración para un compuesto modulador de microARN (por ejemplo, un compuesto inhibidor de microARN o un compuesto potenciador de microARN) para su uso en las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención. El modo de administración particular seleccionado dependerá, al menos en parte, de la afección particular que se esté tratando y la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. En términos generales, se puede usar cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, es decir, cualquier modo que produzca niveles efectivos de tratamiento de una enfermedad o afección hepática sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. En algunas realizaciones de la invención, se puede administrar un compuesto modulador de microARN por vía oral, enteral, mucosa, percutánea y/o parenteral. El término "parenteral" incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal e intraesternal. Otras rutas incluyen, pero no se limitan a, nasal (por ejemplo, a través de un tubo gastro-nasal), dérmica, vaginal, rectal y sublingual. Las vías de administración de la invención pueden incluir intratecal, intraventricular o intracraneal. En algunas realizaciones de la invención, un compuesto modulador de microARN puede colocarse dentro de una matriz de liberación lenta y administrarse colocando la matriz en el sujeto. En algunos aspectos de la invención, se puede administrar un compuesto modulador de microARN a una célula del sujeto usando nanopartículas recubiertas con un agente de administración que se direcciona a una célula u orgánulo específico. Se conocen en la técnica diversos medios, métodos y agentes de administración. Ejemplos no limitantes de métodos de administración y agentes de administración se proporcionan adicionalmente en otra parte de este documento. En algunos aspectos de la invención, el término "suministrar" en referencia a un modulador de microARN puede significar la administración a una célula o sujeto de una o más secuencias de compuestos inhibidores de microARN "desnudos" y en ciertos aspectos de la invención "suministrar" significa administración a una célula o sujeto a través de medios de transfección. La administración de un compuesto modulador de microARN usando un medio de transfección puede incluir la administración de un vector a una célula y/o sujeto.

Se pueden administrar uno o más compuestos moduladores de microARN en formulaciones, que se pueden administrar en soluciones farmacéuticamente aceptables, que pueden contener habitualmente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes reguladores, conservantes, vehículos compatibles, adyuvantes y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos. En algunas realizaciones de la invención, se puede formular un compuesto modulador de microARN con otro agente terapéutico para la administración simultánea. Se puede administrar un compuesto modulador de microARN en una composición farmacéutica. En general, una composición farmacéutica comprende un compuesto modulador de microARN y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica. Como se usa en este documento, un vehículo farmacéuticamente aceptable significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos, por ejemplo, la capacidad del compuesto inhibidor de microARN, etc., para tratar la enfermedad hepática o afección. En la técnica se conocen y pueden utilizarse numerosos métodos para administrar y liberar compuestos moduladores de microARN para su uso terapéutico.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, agentes de relleno, sales, reguladores, estabilizadores, solubilizantes y otros materiales que son bien conocidos en la técnica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares se describen en la patente U.S. 5,211,657 y otros son conocidos por los expertos en la técnica. Tales preparaciones pueden contener de forma rutinaria sal, agentes reguladores, conservantes, vehículos compatibles y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero las sales no farmacéuticamente aceptables pueden usarse convenientemente para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Tales sales farmacológica y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, las preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Además, se pueden preparar sales farmacéuticamente aceptables tales como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio.

Algunas realizaciones de composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención incluyen la administración de uno o más compuestos moduladores de microARN directamente a un tejido. En algunas realizaciones, el tejido al que se administra el compuesto es un tejido en el que la enfermedad o afección hepática está presente o es probable que surja, un ejemplo no limitante de la cual es el hígado. La administración directa de tejidos se puede lograr mediante inyección directa u otros medios. Muchos compuestos administrados por vía oral se desplazan naturalmente hacia y a través del hígado y algunas realizaciones de los métodos de tratamiento de la invención incluyen la administración oral de uno o más compuestos inhibidores de microARN a un sujeto. Los compuestos inhibidores de microARN, solos o junto con otros agentes terapéuticos, pueden administrarse una vez, o alternativamente pueden administrarse en una pluralidad de administraciones. Si se administran múltiples veces, los compuestos inhibidores de microARN se pueden administrar por diferentes vías. Por ejemplo, aunque no se pretende que sea limitante, se puede realizar una primera (o varias primeras) administraciones mediante administración oral y una o más administraciones adicionales pueden ser administraciones orales y/o sistémicas.

Para realizaciones de la invención en las que es deseable administrar un compuesto inhibidor de microARN sistémicamente, el compuesto inhibidor de microARN puede formularse para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con o sin un conservante añadido. Las formulaciones de compuestos moduladores de microARN (también denominadas composiciones farmacéuticas) pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluidos medios salinos y regulados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tal como los basados en la dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Las dosis más bajas resultarán de otras formas de administración, tales como la administración intravenosa. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente a las dosis iniciales aplicadas, pueden emplearse dosis más altas (o dosis efectivamente más altas por una vía de administración diferente, más localizada) en la medida que lo permita la tolerancia del paciente. Pueden usarse múltiples dosis por día según sea necesario para lograr niveles sistémicos o locales apropiados de uno o más compuestos inhibidores de microARN y para lograr una reducción apropiada en la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p.

En aún otras realizaciones, las composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención incluyen el uso de un vehículo de administración tal como micropartículas, nanopartículas o implantes biocompatibles adecuados para su implantación en un receptor, por ejemplo, un sujeto. En la publicación PCT No. WO 95/24929 se describen implantes bioerosionables ejemplares que pueden ser útiles de acuerdo con este método, que describe una matriz polimérica biodegradable biocompatible para contener una macromolécula biológica. Tales medios de administración son bien conocidos en la técnica y pueden usarse para lograr la liberación sostenida de un compuesto modulador de microARN en un sujeto, y pueden seleccionarse para que no se degrade, sino que se libere por difusión durante un período de tiempo prolongado.

Pueden usarse matrices poliméricas tanto biodegradables como no biodegradables en composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención para administrar uno o más compuestos moduladores de microARN a un sujeto. En algunas realizaciones, una matriz puede ser biodegradable. Los polímeros de matriz pueden ser polímeros naturales o sintéticos. Se puede seleccionar un polímero basándose en el período de tiempo durante el cual se desea la liberación, generalmente en el orden de unas pocas horas a un año o más. Típicamente, se puede utilizar la liberación durante un período que varía entre unas pocas horas y tres a doce meses. El polímero está opcionalmente en forma de un hidrogel que puede absorber hasta aproximadamente el 90% de su peso en agua y, además, opcionalmente está reticulado con iones multivalentes u otros polímeros.

En general, los compuestos moduladores de microARN pueden administrarse usando el implante bioerosionable por medio de difusión, o por degradación de la matriz polimérica. Los polímeros sintéticos de ejemplo para tal uso son bien conocidos en la técnica. Pueden usarse polímeros biodegradables y polímeros no biodegradables para el suministro de compuestos moduladores de microARN usando métodos conocidos en la técnica. También se pueden usar polímeros bioadhesivos tales como hidrogeles bioerosionables (véase HS Sawhney, CP Pathak and JA Hubell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587, para administrar compuestos inhibidores de microARN para el tratamiento de una enfermedad o afección hepática. Los sistemas de administración adecuados adicionales pueden incluir sistemas de administración de liberación prolongada, liberación retardada o liberación sostenida. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de un compuesto modulador de microARN, aumentando la conveniencia para el sujeto y el profesional de la atención médica. Hay muchos tipos de sistemas de suministro de liberación disponibles y conocidos por aquellos con experiencia en la técnica (Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 5,075,109; 4,452,775; 4,675,189; 5,736,152; 3,854,480; 5,133,974; y 5,407,686. Además, se pueden utilizar sistemas de suministro de hardware basados en bombas, algunos de los cuales están adaptados para implantación.

El uso de un implante de liberación sostenida a largo plazo puede ser adecuado para el tratamiento profiláctico de sujetos y para sujetos con riesgo de desarrollar una enfermedad o afección hepática recurrente. Liberación a largo plazo, como se usa en este documento, significa que el implante está construido y dispuesto para administrar un nivel terapéutico de un compuesto inhibidor de microARN durante al menos hasta 10 días, 20 días, 30 días, 60 días, 90 días o más. Los implantes de liberación sostenida a largo plazo son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen algunos de los sistemas de liberación descritos anteriormente.

Las formulaciones terapéuticas de compuestos moduladores de microARN se pueden preparar para el almacenamiento mezclando la molécula o compuesto que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables [Remington's Pharmaceutical Sciences 21a edición, (2006)], en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen reguladores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecil dimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG).

Evaluación de los efectos moduladores y la eficacia del tratamiento

La evaluación de la eficacia de compuestos moduladores de microARN candidatos para disminuir la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p en una célula o tejido también se puede realizar usando ensayos en células de cultivo, por ejemplo, como ensayos de cribado para evaluar los compuestos moduladores de microARN candidatos por su capacidad para disminuir la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p. Los compuestos inhibidores de microARN que reducen la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p en una célula, tejido o sujeto pueden usarse en el tratamiento de una enfermedad o afección hepática.

Los ensayos adecuados pueden incluir medios para determinar la actividad de microARN, por ejemplo, la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p en células, tejidos y sujetos. Los niveles de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p pueden determinarse de varias formas. En algunas realizaciones, se puede medir un nivel de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p en relación con un nivel de control de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p, respectivamente, en una célula, tejido, o sujeto. Una posible medición de un nivel de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p es una medición de un nivel absoluto de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p. Esto podría expresarse, por ejemplo, en un nivel de actividad de miARN-873-5p o miARN-5l8d-5p por unidad de células o tejido. Otra medida de un nivel de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p es una medida de un cambio en el nivel y/o actividad de la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p a lo largo del tiempo y/o un cambio en el nivel y/o actividad de la enzima GNMT en células y tejidos relevantes a lo largo del tiempo. Esto puede expresarse en una cantidad absoluta o puede expresarse en términos de un aumento o disminución porcentual a lo largo del tiempo. Los ensayos de actividad para miARN-873-5p o miARN-518d-5p también pueden usarse para evaluar la eficacia de un compuesto inhibidor de miARN-873-5p, inhibidor de miARN-518d-5p, potenciador de miARN-873-5p o potenciador de miARN-518d-5p. Además, en ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a polipéptidos que aumentan o disminuyen de una manera que se correlaciona con la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p puede usarse para evaluar la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p después del contacto (por ejemplo, tratamiento) con un compuesto modulador de microARN.

En algunas realizaciones, una disminución en la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p en una célula o tejido, puede ser una disminución de al menos 0.2%, 0.5%, 1.0%, 2.0%, 3.0%., 4.0%, 5.0%, 7.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% incluyendo todos los valores en este rango. Una disminución en la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p después del contacto con un compuesto inhibidor de microARN puede indicar la eficacia del compuesto inhibidor de microARN para tratar una enfermedad o afección hepática en un sujeto.

Como apreciarán los expertos en la técnica, la evaluación de una composición para su uso en un método de tratamiento de acuerdo con la invención también puede basarse en una evaluación de los síntomas o puntos finales clínicos de una enfermedad o afección hepática y tales evaluaciones pueden usarse junto con composiciones para su uso en métodos de tratamiento de acuerdo con la invención para evaluar el estado de una enfermedad o afección hepática y/o la eficacia de un tratamiento de una enfermedad o afección hepática.

Kits

Se describen, pero no se reivindican, kits que comprenden uno o más compuestos moduladores de microARN seleccionados de un compuesto inhibidor de miARN-873-5p y un compuesto inhibidor de miARN-518d-5p, e instrucciones para su uso en los métodos de la invención. Los kits pueden incluir uno o más compuestos moduladores de microARN que pueden usarse para tratar una enfermedad o afección hepática. Se pueden preparar kits que contienen compuestos moduladores de microARN para su uso en los métodos de tratamiento de la invención. Los componentes de los kits se pueden empacar bien sea en medio acuoso o en forma liofilizada. Un kit puede comprender un portador que está compartimentado para recibir en un confinamiento estrecho en el mismo uno o más medios contenedores o una serie de medios contenedores tales como tubos de ensayo, viales, matraces, botellas, jeringas o similares. Un primer medio contenedor o una serie de medios contenedores pueden contener uno o más compuestos tales como un compuesto modulador de microARN. Un segundo medio contenedor o una serie de medios contenedores puede contener un agente de direccionamiento, un agente de etiquetado, un agente de administración, etc., que puede incluirse como una porción de un compuesto modulador de microARN que se administrará en una realización de un método de tratamiento de la invención.

Un kit también puede incluir instrucciones. Las instrucciones típicamente estarán en forma escrita y proporcionarán una guía para llevar a cabo un tratamiento incluido en el kit y para tomar una determinación basada en ese tratamiento.

Métodos para identificar compuestos candidatos

La invención reivindicada incluye un método, como se define en la reivindicación 8, para identificar compuestos candidatos que pueden usarse como moduladores de microARN para aumentar o disminuir la actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p en células, tejidos y/o sujetos. El método incluye poner en contacto un compuesto candidato con células y determinar una cantidad de actividad de miARN-873-5p y/o miARN-518d-5p antes y después del contacto de las células con el compuesto candidato. Una disminución en la cantidad de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p en comparación con un control adecuado es indicativa de un compuesto capaz de disminuir el nivel de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p y un aumento en la cantidad de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p en comparación con un control adecuado es indicativa de un compuesto capaz de aumentar el nivel de actividad de miARN-873-5p o miARN-518d-5p.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar casos específicos de la práctica de la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Material y métodos

Muestras humanas

Se obtuvieron ADN y ARN de hígado de pacientes con HCC (descritos en la Tabla 1) de la colección de tejidos BCLC (Hospital Clínic, Barcelona, España) y 2 hígados sanos proporcionados por el Banco de Tumores del Instituto de Oncología de Asturias.

Tabla 1 Información del paciente con CHC.

Cuarenta y siete pacientes con cirrosis hepática y HCC con función hepática conservada y que correspondían bien sea al estadio BCLC A (n = 34) y B (n = 13) fueron proporcionados por la Dra. Erica Villa (Universidad de Modena y Reggio Emilia, Modena, Italia). Se proporciona más información en Villa E., et al, Gut. Mayo de 2016; 65 (5): 861-9, Publicación electrónica del 9 de febrero de 2015. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes incluidos en el estudio, de acuerdo con los principios éticos consagrados en la Declaración de Helsinki.

Animales

En el estudio se utilizaron ratones macho (C57BL6) de tres meses de edad, de tipo silvestre GNMT (WT) y con eliminación de Gnmt (KO). Los procedimientos con animales fueron aprobados siguiendo las pautas de CIC bioGUNE Animal Facility con certificado AAALAC.

Líneas celulares

La línea celular de hepatoma humano BCLC3 fue previamente caracterizada y proporcionada por el Dr. Jordi Bruix y Dra. Loreto Boix (Grupo BCLC Hospital Clínico, Barcelona, España). Las células se mantuvieron en DMEM-F12 con FBS al 10%.

Aislamiento y cultivo de hepatocitos primarios

Se aislaron hepatocitos primarios de ratones macho WT Gnmt-KO mediante perfusión de colagenasa como se describe en Embade, N. et al., Hepatol, Baltimore, MD 2012; 55: 1237-1248. Las células adheridas se mantuvieron en MEM con suero bovino fetal (FBS) al 10%.

Silenciamiento in vitro

Se transfectaron hepatocitos primarios WT y Gnmt-KO con miRIDIAN microARN Hairpin Inhibitor/Mimic hsa-miR-873-5p (Dharmacon, Lafayette, CO) usando reactivo de transfección DharmaFECT (Dharmacon) siguiendo el procedimiento de los fabricantes. Los controles se transfectaron con un ARNip no relacionado (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La transfección mímica se confirmó mediante miARN específico qPCR, mientras que la transfección del inhibidor se confirmó mediante la modulación de su ARNm diana GNMt mediante qPCR y transferencia Western. Inhibición in vivo de hsa-miR-873.

Se inyectaron por vía intravenosa ratones WT machos de tres meses en la vena de la cola con el inhibidor de horquilla de microARN miRIDIAN hsa-miR-873-5p (2.5 |^jM) o ARNip de control no relacionado cada dos días desde el tercer día después de BDL hasta el séptimo día usando jetPEI (Polyplus Transfection, Illkirch, Francia), siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, se sacrificaron los animales y se extrajeron los hígados y se congelaron en nitrógeno líquido o se fijaron con formalina para el análisis posterior.

Inmunohistoquímica

Las muestras de hígado embebidas en parafina se seccionaron, desparafinaron e hidrataron. La inmunohistoquímica se realizó como se describe en Barbier-Torres, L., et al., Oncotarget 2015; 6: 2509-2523.

Tratamientos farmacológicos

Los hepatocitos primarios cultivados durante la noche en MEM (0% FBS) se trataron con ácido desoxicólico (DCA) 100 |jM durante los tiempos indicados.

PCR cuantitativa en tiempo real de microARN

Se realizó una RT-PCR específica para cada uno de los miARN analizados siguiendo el procedimiento del kit de transcripción reversa TaqMan® MicroARN. Se usaron 10-50 ng de ARN para la reacción. La PCR cuantitativa se realizó con el kit TaqMan Universal PCR Master Mix No AmpErase u Ng (Life Technologies, Carlsbad, CA) y cebadores específicos para cada miARN siguiendo el procedimiento del fabricante. En todos los casos, cada miARN analizado se normalizó con el miARN snRNA U6.

Medición de la apoptosis

El ensayo de actividad de la caspasa 3 se realizó como se describe en Embade N., et al., Hepatol. Baltim. Md (2012); 55: 1237-1248.

Ensayo informador de luciferasa

Se adquirieron secuencias de ADNc de GNMT murino y humano de Source biosciences (clon de ADNc MGC: 13738 IMAGEN: 4210236 y clon de ADNc MGC: 45044 IMAGEN: 5229272 respectivamente). Sus secuencias 3'UTR se subclonaron en el vector pmirGLO (Promega, Sunnyvale, CA) obteniendo el pmirGLO-GNMT-3'UTR. Se transfectaron hepatocitos y células BCLC3 con pmirGLO o pmirGLO-GNMT-3'UTRvector junto con miRIDIAN microARN Hairpin Inhibitor/Mimic hsa-miR-873-5p o siARN no relacionado usando DharmaFECT Duo Transfection Reagent (Dharmacon) en MEM o DMEM- F12, respectivamente. Las actividades de luciferasas de luciérnaga y Renilla en lisados celulares se determinaron con un sistema de ensayo de luciferasa dual (Promega). Los datos normalizados se calcularon como la proporción de actividades luciferasa de luciérnaga/Renilla.

Medición de SAMe

La S-adenosilmetionina (SAMe) y la S-adenosilhomocisteína (SAH) hepáticas se determinaron mediante LC/MS utilizando un sistema Waters ACQUITY-UPLC acoplado a un espectrómetro de masas Waters Micromass LCT Premier equipado con una fuente de ionización Lockspray como se describe en Martínez- López N., et al., Gastroenterología (2012); 143: 787-798e13.

Medición global de metilación del ADN. Cuantificación de 5mC por espectrometría de masas

Se realizaron análisis globales de metilación (5mC) e hidroximetilación (5hmC) del ADN siguiendo el método descrito en Le, T. et al., Anal. Biochem. (2011); 412: 203-209.

Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± SEM. La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de Student o la prueba de Welch siempre que se encontraron varianzas desiguales, donde se indique. Se consideró significativo un valor de p <0.05.

Resultados

Identificación de los miARN que se dirigen a la expresión de GNMT.

Para identificar los miARN que podrían controlar la expresión de GNMT se utilizaron tres enfoques independientes e insesgados: TargetScanHuman, MicroCosm y microARN. Del amplio espectro de todos los miARN coincidentes de la base de datos recuperados del análisis, se seleccionaron aquellos con puntuaciones más altas que aparecen inducidas en el panel de miARN en las células BCLC de hepatoma humano (Figura 6A). Se encontró que tanto miARN-873-5p como miARN-518d-5p se inducían en la mayoría de esas células de hepatoma versus hígado normal sano (Figura 6A). Además, se evaluó la expresión de estos miARN y los niveles de GNMT en una cohorte seleccionada de muestras tumorales de pacientes con HCC (las características de los pacientes se describen en la Tabla 1). Se encontró una correlación estadística significativa entre los tumores hepáticos con baja expresión de GNMT y alto miR-873-5p (Figura 1A panel izquierdo), mientras que en el caso de miARN-518d-5p no se identificó asociación (Figura 6B). Además, la comparación de tejido cirrótico emparejado con su tejido no cirrótico identificó una diferencia importante en los niveles de expresión de miR-873-5p y una correlación negativa significativa entre los niveles de expresión de miR-873-5p y GNMT (Figura 1A panel derecho).

Aunque GNMT se expresa principalmente en hígado adulto, en el órgano postnatal la expresión es mínima. Los resultados experimentales indicaron que el aumento de los niveles de GNMT en hepatocitos bien diferenciados se acompañó de una reducción de los niveles de miR-873-5p (Figura 1B). Por el contrario, durante la desdiferenciación de hepatocitos primarios en cultivo, se observó una disminución en la expresión de GNMT que se correlacionó notablemente con un aumento de los niveles de miR-873-5p (Figura 1C).

La asociación entre los niveles de miR-873-5p y GNMT se investigó adicionalmente en modelos de ratón con daño hepático, tales como fibrosis hepática inducida por ligadura de conductos biliares (BDL). Bajo estas circunstancias, la expresión de ARNm de GNMT se redujo después de 1, 3 y 7 días de asociación de BDL con un marcado aumento de la expresión de miR-873-5p (Figura 1D). La fibrosis hepática inducida por BDL es una consecuencia directa de la acumulación de ácidos biliares en el hígado y el tratamiento de los hepatocitos primarios con el ácido biliar, ácido desoxicólico (DCA), resultó en la observación de una subregulación de la expresión de GNMT acompañada de una elevación de los niveles de miR-873-5p (Figura IE). En conjunto, estos hallazgos sugieren que una alteración en la expresión del miR-873-5p está estrechamente asociada con cambios en los niveles de GNMT hepáticos tanto en la diferenciación hepática como en la lesión hepática, lo que respalda su papel en la regulación de la expresión de GNMT.

GNMT 3'UTR contiene un sitio de unión para el miR-873-5p.

Para investigar cómo miR-873-5p regulaba la expresión de GNMT, la 3'UTR de GNMT se fusionó con un gen indicador de luciferasa y se clonó en el vector pmirGLO (pmirGLO-GNMT-3'UTR). La Figura 6C muestra el sitio de unión putativo para el miR-873-5p en el 3'UTR de GNMT. La actividad de luciferasa reveló que en los hepatocitos primarios de ratón de tipo silvestre, la transfección con el miR-873-5p mímico produjo aproximadamente una disminución del 50% de la actividad informadora del 3'UTR GNMT en comparación con los transfectados con miARN de control (Figura IF, panel izquierdo). Por otro lado, la respuesta de la actividad de luciferasa impulsada por pmirGLO-GNMT-3'UTR en células BCLC3 (caracterizadas por altos niveles de hsa-miR-873-5p) reveló una reducción de esta actividad informadora incluso a niveles basales que fue neutralizado después de silenciar miR-873-5p por un inhibidor específico (Figura IF, panel derecho). En general, estos resultados respaldaron el papel de miR-873-5p como actor clave en la regulación de la expresión de GNMT.

La inhibición de miR-873-5p mantiene diferenciados los hepatocitos primarios.

La GNMT es un marcador de diferenciación hepática (véase Aliva, M.A., et al., J. Hepatol. 2000; 33: 907-914). Para evaluar si los cambios en la expresión de miR-873-5p contrarrestaron la desdiferenciación que experimentan los hepatocitos primarios en cultivo, se inhibió miR-873-5p con su inhibidor específico. Los resultados indicaron que los niveles de GNMT se redujeron gradualmente con un mayor tiempo de cultivo. Además, la ablación de miR-873-5p aumentó la expresión de GNMT tanto a nivel de ARNm como de proteína durante el proceso de desdiferenciación (Figura 2A-D). Significativamente, los marcadores de diferenciación fundamentales como el factor nuclear de hepatocitos 4a (HNF4a) y los genes relacionados con el hígado diferenciado normal tal como la albúmina y la hexoquinasa 4 (HK4) se estabilizaron parcialmente después de bloquear el miR-873-5p (Figura 2B). Asimismo, se redujo la expresión de genes y proteínas relacionados con un fenotipo desdiferenciado como la isoforma piruvato quinasa M2 (PKM2), alfa-fetoproteína (AFP) (Figura 2C) y glutaminasa 1 (GLS1) (datos no mostrados). Se encontró un sistema de desintoxicación de genes del citocromo P450 (CYP) bien conservado en hepatocitos primarios después de la inhibición de miR-873-5p (Figura 2D). Los resultados respaldaron el hallazgo de que mantener los niveles de miR-873-5p bajo una subregulación controlada tuvo un impacto significativo en el fenotipo hepático. De manera notable, también se identificó que el aumento en la expresión de GNMT tras la anulación de hsa-miR-873-5p en hepatocitos primarios en cultivo elevó los niveles del factor mitogénico factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que indujo la activación de S6K, la fosforilación de S6 (Thr389) y la elevación de 4EBP1 (Th37/46) como se describió anteriormente. (Véase Yen, C.-H., et al., Mol. Med. 2011: 18; 286-296).

Notablemente, la inhibición de miR-873-5p en hepatocitos primarios derivados de los ratones Gnmt-KO no logró contrarrestar la pérdida del fenotipo hepático, lo que destaca además la especificidad de miR-873-5p en la expresión de GNMT durante la desdiferenciación hepática. (Figura 7A). Sin embargo, es importante señalar que miR-873-5p no está regulado en la desdiferenciación en los hepatocitos Gnmt-KO.

La inhibición de miR-873-5p atenúa el daño hepático después de la ligadura de los conductos biliares.

Para evaluar si los cambios en miR-873-5p y GNMT juegan un papel importante en la lesión hepática, los niveles de miR-873-5p fueron modulados por inyección i.v. con el inhibidor específico de este miARN en el modelo de ratón con fibrosis inducida por BDL comenzando tres días después de la cirugía, cuando se produce una respuesta inflamatoria y una alteración de la homeostasis de los ácidos biliares en el hígado. Se encontró que la inhibición de miR-873-5p en roedores BDL restauró la expresión de ARNm y proteína de GNMT a valores normales (Figura 3A, panel superior e inferior). La inhibición específica de miR-873-5p aumentó drásticamente el porcentaje de supervivencia de los ratones después de BDL, hasta un 100%, en comparación con un porcentaje de supervivencia inferior al 40% en los ratones tratados con miR-control (Figura 3C). Este efecto se acompañó de una reducción significativa en la actividad de la caspasa 3, en la escisión de PARP como lectura de la actividad apoptótica y finalmente en los niveles de ALT y AST (Figura 3A-E). Además, la tinción de marcadores inflamatorios como F4/80 y las evidencias de indicadores fibrogénicos como Sirius Red, actina alfa lisa (a-SMA) y citoqueratina 19 (CK19) fueron menores en ratones inhibidos por miR-873-5p en comparación con el control miR (Figura 3F).

Además, se detectó una reducción en la expresión del factor de crecimiento transformante de citoquinas profibrogénicas beta (TGF-p) así como en la expresión de metaloproteinasa 9 (MMP9) en los hígados con inactivación acompañada de una reducción en la actividad de JNK y Smad2/3 (Figura 4A). Se mostró una respuesta intensa en la reprogramación del metabolismo de los ácidos biliares en los hígados inhibidos por miR-873-5p (Figura 4B), con la expresión restaurada del factor nuclear de hepatocitos 1 a (HNF1a) y del receptor farnesoide X (FXR) e indujo el transporte activo de los ácidos biliares a través de la sobrerregulación de ABCG5 y ABCG8.

Además, también se detectó una reducción en la respuesta inflamatoria después de BDL tras la inhibición de miR-873-5p. Este resultado se demostró por una disminución en la expresión inducible de óxido nítrico sintasa (iNOS), en los niveles de receptor de quimioquinas directamente implicados en la respuesta inmune, el Ligando 1 del motivo CXC (CXCL1) y en el gen de respuesta de fase aguda amiloide sérico A1 (SAA1).) (Figura 4C). Además, una reducción en las señales proinflamatorias interleucina-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) anuló la ^{respuesta mediada por la activación de STAT3 después de}bDl en aquellos hígados donde GNMT permaneció sobrerregulado (Figura 4C).

En general, los datos apoyan la conclusión de que la inhibición de miR-873-5p contrarresta la reducción de GNMT durante el daño hepático, atenuando el fenotipo profibrogénico y proinflamatorio asociado a la ausencia de este gen supresor de tumores.

La ausencia de miR-873-5p modula la respuesta apoptótica en hepatocitos primarios mediada por ácidos biliares. Los ácidos biliares están profundamente implicados en la patogénesis de la lesión inducida por BDL así como en la fibrosis y cirrosis clínica. Basado en la subregulación de GNMT como resultado de niveles elevados de miR-873-5p después del tratamiento con DCA (Figura IF), se analizó el efecto de inhibición de este miARN. Los resultados indicaron que el bloqueo de miR-873-5p dio como resultado una reducción de la respuesta apoptótica mediada por la actividad de la caspasa 3 en los hepatocitos primarios, de una manera consistente con el aumento correspondiente en los niveles de GNMT (Figura 5A). No se observó ningún impacto en la actividad de la apoptosis después de la inhibición de miR-873-5p en los hepatocitos Gnmt-KO, destacando la especificidad del efecto de miR-873-5p en la expresión de GNMT, y no se observaron cambios significativos en la expresión de miR-873-5p en hepatocitos Gnmt-KO después del tratamiento con DCA. La resistencia a los estímulos apoptóticos mediados por DCA después de la ablación de miR-873-5p en hepatocitos de tipo silvestre se vinculó a un aumento significativo del supresor apoptótico Bcl-2 (Figura 5B). Además, se identificó una regulación adecuada del perfil génico asociado con el metabolismo de los ácidos biliares para preservar la homeostasis hepática en ausencia de miR-873-5p. Se ha informado previamente que el mecanismo central por el cual los ácidos biliares reprimen los niveles clave del factor de transcripción HNF1a, es a través de la subregulación de HNF4a (véase Jung, D. & Kullak-Ublick GA, Hepatol. Baltim. Md 2003; 37: 622-631). Además, la ablación del miR-873-5p 24 horas antes mantuvo HNF1a y HNF4a elevados en presencia de DCA (Figura 5B). El aumento de los genes FXR, bomba de exportación de sales biliares (BSEP) y pequeño heterodímero socio (SHP) y la cantidad de transportadores de casete de unión de ATP (ABC) MRP1, MRp2, MRP3, MRP4 y MRP5 y ABCG5 asociados con niveles estables de GNMT sugirieron un efecto menos tóxico de DCA (Figura 5C). Además, la inhibición de miR-873-5p indujo la expresión de los marcadores hepáticos adultos MDR1, MDR2 y MDR3 de genes de resistencia a múltiples fármacos (MDR) (Figura 5D). Finalmente, los resultados de la transferencia Western indicaron que la activación de JNK resultante disminuyó notablemente cuando la expresión de GNMT permaneció estable y la fosforilación de c-jun, que parecía tener un papel protector en la señalización de DCA, aumentó en ausencia de miR-873-5p.

Mecanismo epigenómico mediado por la inhibición de miR-873-5p-GNMT hepático dependiente.

La GNMT es un regulador esencial del flujo de transmetilación total, lo que implica a esta enzima como un controlador epigenético. Además, se encontró que la GNMT estaba alterada en el proceso de diferenciación de los hepatocitos. Puesto que tales genes y proteínas directamente relacionados con el contenido de SAMe y reacciones de metilación (donde GNMT juega un papel fundamental) como la metionina adenosiltransferasa (MAT) I/III, la primera enzima responsable de la síntesis de SAMe, MTA fosforilasa (MTAP), involucrada en la vía de salvación de metionina hacia SAMe regenerativa, y el gen S-adenosilhomocisteína hidrolasa (SAHH), que cataliza la hidrólisis reversible de S-adenosilhomocisteína (AdoHcy) a adenosina ( Ado) y L-homocisteína (Hcy) se indujeron después de la inhibición de miR-873-5p. Además, la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) que cataliza la conversión de 5,10-metilentetrahidrofolato en 5-metiltetrahidrofolato, un cosustrato para la remetilación de homocisteína a metionina, fue claramente inducida después de la inhibición de miR-873-5p. Por tanto, la inhibición de miR-873-5p mantuvo el estado epigenético del hepatocito diferenciado. De hecho, la inactivación de miR-873-5p mitigó significativamente el aumento de la relación SAMe/SAH, el índice de capacidad de metilación celular durante la desdiferenciación de hepatocitos (Tabla 2A).

Tabla 2A. Contenido hepático de SAMe y SAH en hepatocitos en cultivo.

Asimismo, la inhibición de miR-873-5p en ratón BDL evitó el aumento en el nivel de SAMe y la relación SAMe/SAH (Tabla 2B).

Tabla 2B. Contenido hepático total de SAMe y SAH en ratones BDL

Se ha descrito que la metilación del ADN (CpG) tiene un papel en las alteraciones globales del epigenoma que impulsa la transformación profibrogénica en el hígado (véase Mann, D.A., Hepatol. Baltim. Md 2014; 60: 1418-1425). En los experimentos descritos en el presente documento, se encontró que la inactivavión de miR-873-5p durante BDL y el aumento de la expresión de GNMT impedían el aumento de la tasa de metilación del ADN global (CpG). Los resultados indicaron que la inhibición de miR-873-5p post-BDL indujo los niveles de inhibidores del supresor de la señalización de citoquinas 3 (SOCS3) y del miembro de la familia del dominio de asociación Ras (RalGDS/AF-6) (RASSF1A) de la vía STAT y RAS en el hígado con la correspondiente inhabilitación de la fosforilación STAT3 y c-Raf (Ser259). Estos resultados estuvieron de acuerdo con el efecto represivo descrito previamente para SOCS3 y RASSF1A después de un silenciamiento crónico de GNMT por hipermetilación de sus correspondientes promotores (véase Martinez-Chantar ML et al., Hepatol. Baltim. Md 2008; 47: 1191-1199) y asociado con el grado anormal de proliferación y transformación maligna del hígado.

Reforzando esta idea, el receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma (PPARy), un inhibidor clave en la transdiferenciación de miofibroblastos y, por lo tanto, asociado al fenotipo de células estrelladas hepáticas inactivas, se reexpresó bajo la inhibición de miR-873-5p post-BDL. La histona lisina metiltransferasa, potenciador del homólogo 2 de zeste (EZH2), modula la represión de la expresión de PPARy (véase Mann J. et al., Gastroenterology 2010; 138: 704-714, 714.e1-4). Ahora se ha identificado que la inhibición de miR-873-5p a través de la sobrerregulación de GNMT redujo drásticamente los niveles altamente representativos del centro profibrogénico EZH2 después de BDL, tanto a niveles de ARNm como de proteínas, ejerciendo así un control fundamental en la red epigenética subyacente a este proceso profibrogénico, apoyando así una conclusión de que la pronta recuperación de la expresión dependiente de GNMT-miR-873-5p hepática podría conducir a una regulación epigenética de genes específicos.

Ejemplo 2

Material y métodos

Muestras humanas:

El ARN de una cohorte de pacientes con cirrosis hepática fue proporcionado por el Dr. Javier Crespo (Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. Santander) (n = 42) y Ramiro Jover (Universidad de Valencia) (n = 30). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes incluidos en el estudio, de acuerdo con los principios éticos consagrados en la Declaración de Helsinki.

Métodos de SUDAN III:

Las muestras congeladas embebidas en OCT se seccionaron (8-12 |jm de espesor), se aclararon con isopropanol al 60%, luego se tiñeron con una solución de Sudan III recién preparada (0, 5% en isopropanol Sudan III Panreac Ref: 251731.1606 filtrado con un filtro de 0.2 mm) durante una hora y finalmente se aclara de nuevo con isopropanol al 60%. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina Mayer (Sigma Ref: MHS32-1L) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se montaron en medio de montaje acuoso para la cuantificación de lípidos.

Métodos de H&E:

Las muestras de hígado embebidas en parafina se seccionaron (5 jm de espesor), se desparafinaron con un sustituto de xileno (Histoclear, National Diagnostics Ref: HS-202) y se hidrataron a través de soluciones de alcohol graduado en agua destilada. Las secciones se tiñeron 5 minutos con hematoxilina de Harry (Sigma Ref: HHS128-4L) y 15 minutos con Eosina acuosa (Sigma Ref: HT110232-1L). Las muestras se deshidrataron a través de soluciones graduadas de alcohol y se aclararon con Histoclear durante 10 minutos. Finalmente, las secciones se montaron en medio de montaje DPX (Sigma 06522-500ml).

Métodos de Sirius Red:

Se seccionaron muestras de hígado embebidas en parafina (5 jm de espesor), se desparafinaron con un sustituto de xileno (Histoclear, National Diagnostics Ref: HS-202) y se hidrataron a través de soluciones de alcohol graduado en agua destilada. Las secciones se tiñeron con verde rápido FCF al 0.01% en ácido pícrico saturado durante 15 minutos y se colocaron inmediatamente en verde rápido ^fC^fal 0.04%/Sirius Red al 0.1% en ácido pícrico saturado durante 15 minutos. Las secciones se deshidrataron directamente en alcohol al 100% durante 30 segundos y se aclararon con Histoclear durante 10 minutos. Finalmente, las secciones se montaron en medio de montaje DPX (Sigma 06522-500ml).

Inmunofluorescencia de actina de músculo liso a

Las secciones desparafinadas y rehidratadas se sometieron a recuperación de antígeno con regulador de citrato de sodio 10 mM pH 6.0 en un módulo de enlace PT (DAKO Dinamarca, Agilent Technologies, Glostrup, Dinamarca) a 97 °C durante 20 minutos sin la opción de hervir habilitada, luego se bloquearon con fragmento Fab anti-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) (1 hora, TA, 1:10), seguido de 10 minutos de incubación con peróxido de hidrógeno al 3% para bloquear la actividad de peroxidasa endógena. Luego, las secciones se bloquearon con suero de cabra normal al 5% en PBS durante 30 minutos y se incubaron con anticuerpo primario Cy3-SMA (1: 200) (Sigma Ref: C6198) 1 h a TA. Los portaobjetos se tiñeron por contraste con DAPI y se montaron con medio de montaje de fluorescencia DAKO (DAKO Ref: S3023).

Inmunohistoquímica F4/80:

Las secciones desparafinadas y rehidratadas se sometieron a recuperación de antígeno con proteinasa K durante 15 minutos a TA. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con una incubación de 10 minutos con peróxido de hidrógeno al 3%, luego las secciones se bloquearon con suero de cabra normal al 5% en PBS durante 30 minutos y se incubaron con anticuerpo primario F4/80 (1:50, 1h a 37 ° C Bio -rad Ref: MCA497BB) (Bio-rad, Hercules, CA) seguido de 30 minutos con reactivo anti-Rat Immpress (Vector Ref: MP-7404) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). La detección colorimétrica se completó con el sustrato violeta Vector Vip (Vector Ref: sk-4600). Los portaobjetos se contratiñeron con Mayer Hematoxilina (Sigma Ref: MHS32-1L) y finalmente las muestras se deshidrataron a través de soluciones graduadas de alcohol, se aclararon con Histoclear y se montaron en medio de montaje DPX (Sigma 06522-500 ml).

Glicina N-metiltransferasa (GNMT) (inmunohistoquímica):

Las secciones rehidratadas se bloquearon con el fragmento Fab anti-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch) (1 hora, RT, 1:10) y, luego, se tiñeron con anticuerpo primario monoclonal anti-GNMT de ratón (1: 400), seguido por el sistema Envision de anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con peroxidasa (DAKO) a temperatura ambiente durante 3 horas, teñido con el sustrato de peroxidasa 3,3 3-diamino-bencidina cromógeno (DAKO) y contrateñido con hematoxilina.

Administración intravenosa (i.v.) de anti-miR-873-5p:

Se sintetizó anti-miR-873-5p para estudios in vivo (Dharmacon). El anti-Mir-875-5p usado se adquirió de Dharmacon (hsa-miR-873-5p). Estos inhibidores de horquilla son oligonucleótidos de ARN monocatenario diseñados con un patrón de modificación patentado para potenciar la funcionalidad y direccionar la siguiente secuencia en miR-873: gcaggaacuugugagucuccu (SEQ ID NO: 1 para humanos) (número de acceso de miRBase: MIMAT0004953). Estas secuencias se unen y secuestran la hebra de microARN madura complementaria, véase también el Ejemplo 1). Se usó Invivofectamine 3.0 (Life Technology) como un sistema de administración para obtener una alta eficiencia de administración in vivo de anti-miARN en los hepatocitos. Siguiendo la recomendación del fabricante, se utilizó 1.7 mg/kg en combinación con invivofectamina 3.0. La preparación de anti-miARN con Invivofectamine se realizó según lo recomendado por el fabricante. A los ratones se les administró dos veces por semana anti-miARN/invivofectamina en 150 |jl.

Métodos qPCR:

Se trataron 2 jg del ARN obtenido con DNasa I (Invitrogen) y se sintetizó ADNc con M-MLV (Invitrogen) en presencia de cebadores aleatorios y RNaseOUT (Invitrogen). El ADNc resultante se diluyó 1/20 en agua libre de ARNasa (Sigma-Aldrich) y se usaron 5 microlitros para la reacción de PCR. Las PCR se realizaron utilizando BioRad iCycler iQ5 Thermalcycler, con iQ SYBR Green Super Mix (Bio Rad) y cebadores específicos, en un volumen de reacción total de 20 jl, y todas las reacciones se realizaron por triplicado. Se optimizaron las condiciones de PCR para estos cebadores y se utilizaron 40 ciclos con una temperatura de fusión de 60 °C y 30 segundos de cada etapa. Los cebadores se diseñaron utilizando el software Primer 3 y fueron sintetizados por Sigma-Aldrich. Después de verificar la especificidad de los productos de PCR con la curva de fusión, los valores de Ct se extrapolaron a una curva estándar realizada simultáneamente con las muestras y los datos se normalizaron luego a la expresión de un gen de mantenimiento (GAPDH).

PCR cuantitativa en tiempo real de microARN

Se realizó una RT-PCR específica para miR-873-5p siguiendo el procedimiento del kit de transcripción inversa TaqMan® MicroRNA. Se usaron 10-50 ng de ARN para la reacción. La qPCR se realizó con el kit TaqMan Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG (Life Technologies) y cebadores específicos para miR-873-5p siguiendo el procedimiento del fabricante. miR-873-5p se normalizó con el ARNnn U6.

Animales

En el estudio se utilizaron ratones C57BL/6 macho de tres meses de edad. Los procedimientos con animales fueron aprobados siguiendo las pautas de CIC bioGUNE Animal Facility con certificado AAALAC. Los ratones fueron alimentados con dieta de mantenimiento estándar, dieta deficiente en metionina y colina (MCDD), dieta alta en grasas (HFD) o dieta alta en colesterol (HCD).

Método de muestreo de sangre y manipulación de muestras.

Se obtuvieron muestras de sangre submandibular incidiendo la vena submandibular derecha de ratones no anestesiados con una lanceta estéril de 4 mm (MediPoint, Mineola, NY). Se recogieron muestras de sangre retroorbital del plexo retroorbital derecho de ratones anestesiados. La anestesia se indujo colocando a cada ratón en una cámara de inhalación con isoflurano al 4% (IsoFlo, Abbott Laboratories, Berkshire, Reino Unido) regulado con un vaporizador calibrado. Las muestras de sangre se depositaron en tubos de gel separador de suero (Microtainer, Becton-Dickinson, Franklin Park, NJ) y se centrifugaron (9.300 xg, 15 min, 4 °C) para la separación del suero.

Parámetros de química clínica.

Se realizó un panel de bioquímicas séricas que incluyó aspartato aminotransferasa (AST-GOT), alanina aminotransferasa (ALT-GPT), triglicéridos, glucosa, colesterol, proteína y albúmina. Las muestras se analizaron utilizando un analizador Selectra Junior Spinlab 100 (Vital Scientific, Dieren, Netherland) de acuerdo con el protocolo sugerido por los fabricantes. Los controles calibrados se procesaron antes de cada uso y estaban dentro de los rangos establecidos antes de analizar las muestras.

Cuantificación de lípidos totales

Se homogeneizaron hígados (300 mg) y se extrajeron los lípidos como describen Bligh, E.G. y W.J. Dyer (1959) Can J Biochem Physiol. Ago; 37 (8): 911-7. Los TG se cuantificaron utilizando un kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante (A. Menarini Diagnostics, Italia). El suero se extrajo de la sangre y los cuerpos cetónicos se cuantificaron usando un kit disponible comercialmente de Wako chemical GmbH (Richmond, VA) usando las instrucciones del fabricante. Los kits utilizados para la cuantificación de cuerpos cetónicos fueron los siguientes, que consta de dos componentes y un kit calibrador): Autokit T-KB R1 Set ref 415-73301, Autokit T-KB R2 Set Ref 413-73601; y el calibrador corporal de cetonas 300 Ref 412-73791.

Resultados

Expresión de miR-873-5p en NAFLD.

La expresión de GNMT y el metabolismo de SAMe está marcadamente alterada en pacientes con esteatosis y esteatohepatitis. Usando qPCR, se midió la expresión de GNMT y miR-873-5p en muestras de hígado de pacientes de control sanos y pacientes con NAFLD, revelando una disminución de GNM^tacompañada de un aumento de los niveles de miR-873-5p (Figura 9A-B). Además, se ha identificado una correlación inversa significativa entre los niveles de GNMT-miR-873 (Figura 9C). Finalmente, se encontró que los niveles de miR-873-5p estaban aumentados en muestras de suero de pacientes que padecían NAFLD en comparación con pacientes de control sanos (Figura 9D).

Expresión de miR-873-5p en modelos de ratones NAFLD.

Con el fin de estudiar el papel de la regulación de GNMT/miR-873 en el desarrollo del hígado graso, se midieron los niveles de expresión de GNMT y miR-873-5p en diferentes modelos de ratones NAFLD. Los ratones fueron alimentados con dieta de mantenimiento estándar, dieta deficiente en metionina y colina (MCDD, Figura 10A), dieta alta en grasas (HFD, Figura 10B) o dieta alta en colesterol (HCD Figura 10C). En todas las dietas estudiadas se observó una correlación inversa entre GNMT y la expresión de miR-873-5p, lo que indica un papel de miR-873-5p en el desarrollo de NAFLD.

La inhibición del miR-873-5p en MCDD contrarresta el desarrollo de NAFLD.

Para estudiar el papel de miR-873-5p en NAFLD, los ratones fueron alimentados con dieta MCD durante 4 semanas y miR-873-5p se inhibió con anti-miR-873-5p específico mediante inyección en la vena de la cola dos veces por semana durante 3 semanas. La caracterización final por inmunohistoquímica (IHC) de ratones inhibidos por miR-873 después de la dieta MCD muestra cantidades más bajas de contenido de lípidos hepáticos (Sudan Red), así como una disminución de los marcadores proinflamatorios y profibrogénicos (F4/80, Sirius Red y aSMA). Estos resultados se acompañaron de un aumento de los niveles de GNMt en comparación con los ratones de control con dieta MCD (Figura 11A-C). Además, los análisis de suero recogido de ratones con dieta MCD mostraron una disminución de los niveles de transaminasas hepáticas (GOT, GPT) en ratones tratados con anti-miR-873-5p, lo que indica un hígado menos lesionado. Otros marcadores séricos revelaron una disminución de los triglicéridos junto con un aumento de los cuerpos cetónicos (Figura 11D-F), lo que indica una reducción de la exportación de triglicéridos del hígado a la sangre y un aumento de la oxidación de ácidos grasos en el hígado con el consiguiente aumento de cuerpos cetónicos en sangre. Finalmente, se analizó el contenido total de lípidos de estos hígados. En este caso, el estudio mostró que la inhibición de miR-873 media una reducción significativa de diferentes lípidos en el hígado al final de la dieta MCD, mostrando menor contenido de ácidos grasos libres, triglicéridos y colesterol (Figura 11G).

Discusión

El síndrome metabólico es un grupo de factores clínicos: diabetes, obesidad abdominal, colesterol alto y presión arterial alta. Se estima que alrededor del 20-25 por ciento de la población adulta mundial tiene el síndrome metabólico y tienen el doble de probabilidades de morir y tres veces más probabilidades de sufrir un ataque cardíaco o un derrame cerebral en comparación con las personas sin el síndrome. Además, las personas con síndrome metabólico tienen un riesgo cinco veces mayor de desarrollar diabetes tipo 2. Cada año, 3.2 millones de personas en todo el mundo mueren por complicaciones asociadas con la diabetes. Además, la obesidad se ha convertido en una epidemia mundial. Por primera vez en la historia de la humanidad, el número de personas con sobrepeso rivaliza con el de personas con bajo peso. A nivel mundial, hay más de mil millones de adultos con sobrepeso y alrededor de 300 millones de obesos clínicos. La obesidad es responsable del 2 al 8% de los costes sanitarios y del 10 al 13% de las muertes en diferentes partes de la UE. La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la enfermedad hepática más común, ya que se estima que su prevalencia es del 20-30% en la población general de los países occidentales. Se ha demostrado que la NAFLD está fuertemente asociada a las características del síndrome metabólico. La resistencia a la insulina es un factor patogénico clave tanto en la NAFLD como en el síndrome metabólico. Los datos disponibles de estudios clínicos, experimentales y epidemiológicos indican que NAFLD puede ser la manifestación hepática del síndrome metabólico.

La glicina N-metiltransferasa (GNMT) es un regulador esencial del flujo de transmetilación total en el hígado de mamífero. Los patrones de metilación del ADN distintos son característicos del desarrollo hepático, la desdiferenciación hepática y la progresión de la enfermedad hepática, entre ellos NAFLD, fibrosis, cirrosis y cáncer de hígado, procesos en los que los niveles de GNMT disminuyen dramáticamente por mecanismos aún poco conocidos [Avila MA, et al., (2000) J. Hepatol. 33: 907-9141].

Los microARN (miARN) son una clase emergente de ARN pequeños no codificantes altamente conservados que regulan la expresión génica tanto por silenciamiento del ARN como a nivel postranscripcional [Filipowicy w., Et al., (2005) Curr. Opin Struct. Biol. 15: 331-341]. Los miARN regulan procesos biológicos esenciales que incluyen la diferenciación y el metabolismo, así como respuestas celulares como proliferación, apoptosis y tumorigénesis [Meltzer, P.S. (2005) Nature 435: 745-74]. En el hígado, la firma de miARN se ha relacionado con la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), la cirrosis y el cáncer de hígado [Croce, C.M. (2008) N. Engl. J. Med 358: 502 511].

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un compuesto inhibidor de microARN que inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección hepática en un sujeto, en la que que cuando se administra al sujeto el compuesto inhibidor de microARN que inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p disminuye la actividad de microARN y aumenta la actividad de la enzima glicina N-metiltransferasa (GNMT) en al menos una célula del sujeto, y en la que el el compuesto inhibidor de microARN comprende una o más de una molécula de ARN, un compuesto de esponja de miARN y una molécula inhibidora antisentido.

2. La composición para su uso en el tratamiento de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la enfermedad o afección hepática es una o más de un cáncer de hígado, un cáncer metastásico en el hígado, una afección precancerosa del hígado, carcinoma hepatocelular, cirrosis, una afección hepática postcáncer, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), acumulación de grasa (hígado graso), inflamación del hígado, fibrosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis criptogénica, carcinoma hepatocelullar, hígado descompensado, esteatohepatitis y quimiorresistencia.

3. La composición para su uso en el tratamiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que el tratamiento de la enfermedad o afección hepática comprende aumentar una actividad de GNMT en al menos una célula en el sujeto, en comparación con un nivel de control de la actividad de GNMT.

4. La composición para su uso en el tratamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además administrar al sujeto una o más terapias adicionales para el tratamiento de un cáncer de hígado, un cáncer metastásico en el hígado, una afección hepática precancerosa, carcinoma hepatocelular, cirrosis, una afección hepática postcáncer, fibrosis hepática, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis criptogénica, carcinoma hepatocelular, esteatohepatitis por descompensación hepática o quimiorresistencia.

5. Una composición que comprende un compuesto inhibidor de microARN para su uso en un método de tratamiento que comprende aumentar la actividad de la enzima GNMT en una célula, en la que el compuesto inhibidor de microARN comprende una o más de una molécula de ARN, un compuesto de esponja de miARN y una molécula inhibidora antisentido e inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p, y el aumento de la actividad de la enzima GNMT reduce la hipermetilación del ADN en la célula.

6. Un método in vitro o ex vivo para aumentar la actividad de la enzima GNMT en una célula, comprendiendo el método poner en contacto la célula con un compuesto inhibidor de miARN en una cantidad eficaz para aumentar la actividad de la enzima GNMT en la célula y en el que el compuesto inhibidor de microARN comprende uno o más de una molécula de ARN, un compuesto de esponja de miARN y una molécula inhibidora antisentido e inhibe al menos uno de miARN-873-5p y miARN-518d-5p, y el aumento de la actividad de la enzima GNMT reduce la hipermetilación del ADN en la célula.

7. La composición para su uso en el tratamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o el método in vitro o ex vivo de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el compuesto inhibidor de microARN:

(a) comprende además uno o más de un marcador detectable y un agente de direccionamiento; y/o

(b) reduce la desdiferenciación de la célula en contacto.

8. Un método in vitro o ex vivo para identificar un compuesto modulador de miARN que altera la actividad de uno o ambos miARN-873-5p y miARN-518d-5p en una célula, comprendiendo el método

(a) poner en contacto una célula con un compuesto modulador de miARN candidato;

(b) determinar la cantidad de actividad de uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p en la célula; en el que determinar la cantidad de actividad de uno o ambos miARN-873-5p y miARN-518d-5p en la célula comprende comparar la actividad de la enzima GNMT en la célula en contacto con la actividad de GNMT en una célula de control que no está en contacto con el compuesto modulador de miARN candidato; y

(c) comparar la cantidad de actividad determinada para uno o ambos de miARN-873-5p y miARN-518d-5p con una cantidad de control de actividad de miARN-873-5p y miARN-518d-5p, respectivamente, un aumento en la actividad de la enzima GNMT en la célula en contacto versus la célula de control identifica al modulador de miARN candidato como un compuesto inhibidor de miARN y en el que una disminución en la actividad de la enzima GNMT en la célula en contacto versus la célula de control identifica al modulador de miARN candidato como un compuesto potenciador de miARN.