ES2871125T3 - Inyección de corpúsculo polar - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para la obtención de células madre, caracterizado por que el procedimiento comprende: - extraer un corpúsculo polar de un primer ovocito, - inyectar el corpúsculo polar en un segundo ovocito que se encuentra en un estado capaz de ser fecundado, que no es el primer ovocito, y - cultivar el segundo ovocito hasta la formación de un blastocisto.

Description

DESCRIPCIÓN
Inyección de corpúsculo polar
Campo técnico
La presente invención se refiere en general al campo de la obtención de células madre y, en particular, a un procedimiento para la inyección de un corpúsculo polar en un ovocito.
Antecedentes
Las células madre tienen la capacidad de producir mediante diferenciación un amplio espectro de distintos tipos celulares. Debido a esta capacidad de diferenciación, existe un interés en la obtención y el uso de células madre desde un punto de vista médico, por ejemplo, para reemplazar tejido enfermo o lesionado.
Distintos procedimientos para la obtención de células madre han planteado preocupaciones éticas, en particular con respecto al uso de embriones.
Planteamiento del objetivo
En este contexto, es un objetivo de la invención proporcionar procedimientos para la obtención de células madre sin el uso de embriones o células madre embrionarias.
Breve descripción
Este objetivo se consigue mediante un procedimiento y células madre de acuerdo con las reivindicaciones independientes de la patente. Las reivindicaciones dependientes describen formas de realización preferidas.
Un procedimiento de acuerdo con la invención comprende extraer un corpúsculo polar de un primer ovocito e inyectar el corpúsculo polar en un segundo ovocito que se encuentra en un estado capaz de ser fecundado.
Por la expresión "corpúsculo polar" se abarcará en particular en este caso el denominado corpúsculo polar secundario, que se forma con una dotación cromosómica haploide durante la segunda división meiótica, meiosis II. En el caso de que no se extraiga de acuerdo con la invención un corpúsculo polar de este tipo, sino que permanezca por el momento en el ovocito, entonces puede generalmente ser expulsado en el contexto de la meiosis II.
En este caso, por el término "ovocito" se abarcará, además del óvulo maduro capaz de ser fecundado, al menos el ovocito que se encuentra en el contexto de la ovogénesis en la maduración.
Por la expresión "estado capaz de ser fecundado" se entenderá en particular que el ovocito (a) ha madurado hasta el estado del óvulo y (b) aún no ha sido fecundado; además, este ovocito ya ha expulsado sus corpúsculos polares. Por el contrario, la fecundación de un ovocito lleva a que, en general, puede ser adecuado poner en marcha el proceso de desarrollo de un organismo, por ejemplo, de un ser humano. El procedimiento de acuerdo con la invención no usa ni materia prima ni productos intermedios que serían adecuados para poner en marcha el proceso de desarrollo de un organismo. En particular, el procedimiento no usa ovocitos fecundados. Tampoco se usan ni células germinales masculinas ni cromosomas ni material genético de origen masculino. Mediante la inyección del corpúsculo polar en el segundo ovocito, por ejemplo, puede generarse una disomía unimaternal de todos los cromosomas que, según los conocimientos actuales, no puede desarrollarse para formar un organismo viable.
En particular, está previsto que la extracción del corpúsculo polar y la inyección del corpúsculo polar se lleven a cabo in vitro. En tales formas de realización, el primer ovocito puede haber sido extraído de un primer individuo. El segundo ovocito puede haber sido extraído del primer individuo o de un segundo individuo. La extracción del primer ovocito de un primer individuo y la extracción del segundo ovocito del primer individuo o de un segundo individuo pueden abarcarse por formas de realización del procedimiento de acuerdo con la invención.
En general, los ovocitos pueden haber sido extraídos de cualquier organismo. En algunas formas de realización, el primer ovocito y el segundo ovocito pueden ser en cada caso ovocitos humanos.
En el caso del primer ovocito y del segundo ovocito se trata de dos ovocitos independientes.
En general, la extracción de un corpúsculo polar del primer ovocito puede comprender al menos fijar el primer ovocito, abrir el primer ovocito y/o aspirar el corpúsculo polar del primer ovocito.
En general, la inyección del corpúsculo polar puede tener lugar por vía intracitoplásmica. Por la expresión "inyección intracitoplásmica" se designará una inyección en el interior del citoplasma. El corpúsculo polar se acerca a los cromosomas del segundo ovocito mediante inyección intracitoplásmica.
Como alternativa o adicionalmente, la inyección del corpúsculo polar puede comprender (i) la colocación del corpúsculo polar entre la zona pelúcida del segundo ovocito y el citoplasma del segundo ovocito, así como (ii) la fusión de las membranas, por ejemplo por medio de electrofusión. Preferentemente, al menos antes de la fusión de las membranas, se retiró un corpúsculo polar expulsado por el segundo ovocito. Como resultado de la electrofusión, el contenido del corpúsculo polar inyectado, en particular los cromosomas contenidos, puede llegar al citoplasma y, por lo tanto, a las proximidades de los cromosomas del segundo ovocito.
En general, el procedimiento puede comprender adicionalmente lisar, es decir provocar una lisis, del corpúsculo polar. El lisado del corpúsculo polar puede tener lugar en particular entre su extracción e inyección. En este caso, en lugar del corpúsculo polar intacto se inyecta el corpúsculo polar lisado. Con "corpúsculo polar lisado" se designará en adelante al menos el lisado del corpúsculo polar. El corpúsculo polar lisado comprende en particular los cromosomas del corpúsculo polar extraído. Para la inyección del corpúsculo polar lisado se puede usar en general una pipeta de inyección con un diámetro pequeño, incluso si no fuera posible la inyección del corpúsculo polar extraído en el estado intacto en algunos ejemplos de realización con la pipeta de inyección con un diámetro pequeño. En formas de realización preferidas, el lisado del corpúsculo polar puede tener lugar de manera osmótica. Para ello, el corpúsculo polar se puede colocar en una solución hipoosmolar. La solución hipoosmolar puede encontrarse, por ejemplo, por debajo de un sello de aceite. Mediante osmosis, el corpúsculo polar se puede llevar a "explotar", es decir, a la lisis. Mediante absorción de la solución hipoosmolar en la pipeta de inyección, el corpúsculo polar lisado también puede recogerse en la pipeta de inyección.
En general, el procedimiento puede comprender adicionalmente cultivar el segundo ovocito hasta la formación de un blastocisto y aislar al menos una célula madre del blastocito. La al menos una célula madre se puede aislar preferentemente a partir de una masa celular interior del blastocisto. Por ejemplo, el aislamiento de la al menos una célula madre a partir de un blastocisto se muestra en el documento de patente DE 102004062 184 B4. En general, en el caso de la al menos una célula madre aislada puede tratarse de una célula madre embrionaria.
SAYAKA WAKAYAMA ET AL: "Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies", STEM CELLS, ALPHAMED PRESS, DAYTON, OH, US, vol. 25, n.° 4, 1 de abril de 2007 (01/04/2007), páginas 986-993 describe la obtención de células madre pluripotentes de blastómeros y corpúsculos polares (figura 1). Los corpúsculos polares se extraen de un primer ovocito y se inyectan en un ovocito enucleado. El ovocito reconstruido se activa de modo que el 2° corpúsculo polar permanezca en la célula. Las células obtenidas se cultivan hasta el estadio de blastocisto, de modo que a partir de las mismas se pueden obtener células madre. Los documentos WO 2004/003182, US 2003/129745 y WO 2008/033469 describen procedimientos adicionales para la obtención de células madre a partir de ovocitos.
Breve descripción de los dibujos
En la siguiente descripción de ejemplos de realización de la invención, se hace referencia a los dibujos adjuntos, que muestran:
La figura 1 una representación esquemática de un primer ovocito antes de la extracción del corpúsculo polar,
La figura 2 una representación esquemática de un primer ovocito durante la extracción del corpúsculo polar,
La figura 3 una representación esquemática de un segundo ovocito poco antes de la inyección de un corpúsculo polar,
La figura 4 una representación esquemática de un segundo ovocito después de la inyección de un corpúsculo polar,
La figura 5 muestra una representación esquemática de un segundo ovocito que ha madurado hasta blastocisto durante la extracción de una célula madre.
La figura 6 una representación esquemática de otra forma de realización de un segundo ovocito durante la inyección de un corpúsculo polar.
Descripción detallada
La figura 1 muestra una representación esquemática de un primer ovocito 12 antes de la extracción del corpúsculo polar 10. El primer ovocito 12 está fijado con la ayuda de una pipeta de sujeción 16. En el presente caso, la pipeta de sujeción 16 se ha llevado desde el lado izquierdo en la representación hasta el primer ovocito 12 y el primer ovocito se ha girado hasta que el corpúsculo polar 10 se encuentra en el lado derecho en la representación del primer ovocito 12. El primer ovocito comprende, entre otras cosas, una membrana plasmática 14 que también encierra el corpúsculo polar 10.
La figura 2 muestra una representación esquemática de un primer ovocito 12 durante la extracción del corpúsculo polar 10. En particular, puede tratarse del primer ovocito 12 representado en la figura 1. La membrana plasmática 14 del primer ovocito 12 presenta una abertura 14b que se produjo, por ejemplo, con ayuda de un láser. La abertura 14b se encuentra en las proximidades del corpúsculo polar 10 que se va a extraer. A través de la abertura 14b se puede introducir una pipeta de biopsia 18. La pipeta de biopsia 18 representada se encuentra inmediatamente antes de la introducción en la abertura 14b. La pipeta de biopsia 18 sirve para aspirar el corpúsculo polar y así extraerlo del primer ovocito 12. Una vez retirado, el corpúsculo polar se puede almacenar en el medio de cultivo hasta que se vuelva a usar.
La figura 3 muestra una representación esquemática de un segundo ovocito 22 poco antes de la inyección de un corpúsculo polar 10. El corpúsculo polar 10 puede haber sido extraído, por ejemplo, de un primer ovocito 12, tal como se representa en la figura 1 y/o figura 2. El segundo ovocito 22 comprende, entre otras cosas, un citoplasma 24. El corpúsculo polar expulsado por el segundo ovocito 22 en el transcurso de su maduración se identifica con el número de referencia 20. En el presente caso, este se encuentra preferentemente en el borde superior ("a las 12 en punto") o en el borde inferior ("a las 6 en punto") en la representación para evitar dañar el huso del segundo ovocito mediante una pipeta de inyección. Sin embargo, la presencia de este corpúsculo polar expulsado no es obligatoria. Así, en algunos ejemplos de realización, el corpúsculo polar se puede inyectar en el mismo ovocito del que se extrajo. En estos casos, el mismo ovocito no presenta ningún corpúsculo polar después de la extracción de su corpúsculo polar.
El segundo ovocito está fijado con la ayuda de una pipeta de sujeción 26. En el presente caso, el ovocito está fijado en el lado izquierdo de la representación. La inyección del corpúsculo polar 10 puede tener lugar, por ejemplo, desde el lado derecho en la representación. El corpúsculo polar 10 se encuentra ya en una pipeta de inyección 28. Puede, por ejemplo, haber sido extraído de un medio de cultivo en el que se almacenó después de haber sido extraído de un primer ovocito. La pipeta de inyección 28 sirve para romper la membrana plasmática del segundo ovocito 22 y para sobresalir al interior del citoplasma 24. A continuación, el corpúsculo polar 10 puede depositarse en el citoplasma 24 con la ayuda de la pipeta de inyección 28.
La figura 4 muestra una representación esquemática de un segundo ovocito 22 después de la inyección intracitoplásmica de un corpúsculo polar 10. El segundo ovocito está fijado con la ayuda de una pipeta de sujeción 26. El corpúsculo polar 10 se encuentra en el interior del citoplasma 24. El segundo ovocito 22 y el corpúsculo polar 10 presentan respectivamente una dotación cromosómica haploide (no representada). Mediante la fusión de estas dos dotaciones cromosómicas se genera una dotación cromosómica diploide. Ambas dotaciones cromosómicas son de origen materno, no está presente una dotación cromosómica paterna. Por lo tanto, no tiene lugar ninguna fusión de cromosomas maternos y paternos. En caso de que tanto el primer ovocito como el segundo ovocito se extraigan de un primer individuo, en el caso de la célula diploide se trata de una disomía unimaternal.
La figura 5 muestra una representación esquemática de un blastocisto 32. El blastocisto 32 representado ha madurado a partir de un segundo ovocito después de que un corpúsculo polar extraído de un primer ovocito se haya inyectado en el segundo ovocito. El blastocisto 32 está fijado con la ayuda de una pipeta de sujeción 26. El blastocisto 32 comprende, entre otras cosas, una masa celular interna 34. Con la ayuda de una pipeta 38, se puede extraer y aislar al menos una célula madre 36 de la masa celular interna 34. A continuación, la al menos una célula madre aislada puede estimularse para su diferenciación, por ejemplo, para generar tejido con fines médicos.
La figura 6 muestra una representación esquemática de otra forma de realización de un segundo ovocito 22 durante la inyección de un corpúsculo polar 10. El segundo ovocito 22 comprende un citoplasma 24 y una zona pelúcida 40. En el ejemplo de realización representa, el corpúsculo polar se deposita entre la zona pelúcida 40 del segundo ovocito 22 y el citoplasma 24 del segundo ovocito 22 por medio de una pipeta de inyección 28.
A continuación, la membrana que rodea el citoplasma 24 y la membrana que rodea el corpúsculo polar 10 pueden excitarse para su fusión. Esto sucede preferentemente mediante electrofusión. Como resultado de la electrofusión, el contenido del corpúsculo polar 10 inyectado, en particular los cromosomas contenidos (no representados), llega al citoplasma 24 del segundo ovocito 22. En el presente ejemplo de realización, a diferencia del ejemplo de realización representado en la figura 3, se retiró previamente un corpúsculo polar expulsado del segundo ovocito 22 y se colocó el corpúsculo polar 10 en su posición.
Ejemplos
Un primer óvulo humano en el estadio de ovocito se fija bajo un microscopio binocular con la ayuda de una pipeta de sujeción (cánula de succión con diámetro exterior de aproximadamente 100 pm, diámetro interior aproximadamente 20 pm). La fijación sucede de tal manera que el corpúsculo polar del primer ovocito humano se encuentra a la derecha, a las 3 en punto en la vista superior. Con la ayuda de un láser (por ejemplo, láser infrarrojo, en particular a 1,48 pm), se genera una abertura en la zona pelúcida en este punto. El corpúsculo polar se aspira con la ayuda de una pipeta de biopsia (diámetro exterior aproximadamente 15 pm, diámetro interior aproximadamente 13 pm). El corpúsculo polar se coloca en una gota de cultivo en la misma placa de cultivo.
Un segundo ovocito humano, que se encuentra en la etapa de óvulo maduro, se fija bajo el microscopio binocular con la ayuda de una pipeta de sujeción. Con la ayuda de una pipeta de inyección, se aspira el corpúsculo polar, se rompe la membrana plasmática y el corpúsculo polar se deposita profundamente en el citoplasma del segundo ovocito humano. Se retira la pipeta de inyección. El cultivo del segundo ovocito humano tiene lugar de acuerdo con los protocolos tal como se conocen por el experto en la materia del campo de la fecundación in vitro o la inyección de espermatozoides intracitoplásmica (ICSI).
Tras el cultivo del segundo ovocito humano hasta el estado de blastocisto, tiene lugar el aislamiento de una célula madre del blastocito de acuerdo con el procedimiento divulgado en el documento de patente DE 102004062 184 B4.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la obtención de células madre,
caracterizado por que
el procedimiento comprende:
- extraer un corpúsculo polar de un primer ovocito,
- inyectar el corpúsculo polar en un segundo ovocito que se encuentra en un estado capaz de ser fecundado, que no es el primer ovocito, y
- cultivar el segundo ovocito hasta la formación de un blastocisto.
2. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer ovocito y el segundo ovocito son en cada caso ovocitos humanos.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente:
- aislar al menos una célula madre a partir del blastocisto.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la extracción de un corpúsculo polar comprende al menos una de las siguientes etapas: fijar el primer ovocito, abrir el primer ovocito, aspirar el corpúsculo polar a partir del primer ovocito.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la inyección del corpúsculo polar tiene lugar por vía intracitoplásmica.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento comprende adicionalmente un lisado, en particular un lisado osmótico, del corpúsculo polar.
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