ES2869459T3 - Moléculas con unión a receptor de fc de neonato alterada que tiene propiedades terapéuticas y de diagnóstico potenciadas - Google Patents

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Abstract

Una IgG1 humana modificada que comprende una región Fc que comprende sustituciones de aminoácidos en dos o más de las posiciones 432 a 437, numeradas de acuerdo con el índice de numeración EU de Kabat, con respecto a una región Fc de tipo silvestre humana; en donde (i) las posiciones 432 y 437 se sustituyen cada una por cisteína; (ii) la posición 433 es histidina o se sustituye por arginina, prolina, treonina, lisina, serina, alanina, metionina o asparagina; (iii) la posición 434 es asparagina o se sustituye por arginina, triptófano, histidina, fenilalanina, tirosina, serina, metionina o treonina; (iv) la posición 435 es histidina o se sustituye por histidina; y (v) la posición 436 es tirosina o fenilalanina o se sustituye por leucina, arginina, isoleucina, lisina, metionina, valina, histidina, serina o treonina; y en donde la IgG1 humana modificada tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG1 que tiene la región Fc de tipo silvestre humana.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas con unión a receptor de fc de neonato alterada que tiene propiedades terapéuticas y de diagnóstico potenciadas
ANTECEDENTES
El uso de inmunoglobulinas como agentes terapéuticos ha aumentado drásticamente en años recientes y se ha expandido a áreas diferentes de tratamientos médicos. Dichos usos incluyen el tratamiento de la agammaglobulinemia y la hipogammaglobulinemia, como agentes inmunosupresores para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y enfermedades de injerto contra hospedador (GVH, por sus siglas en inglés), el tratamiento de neoplasias malignas linfoides e inmunoterapias pasivas para el tratamiento de diversas enfermedades sistémicas e infecciosas. Además, las inmunoglobulinas son útiles como herramientas de diagnóstico in vivo, por ejemplo, en procedimientos de formación de imágenes de diagnóstico.
La eficacia de las inmunoterapias y los productos inmunodiagnósticos puede verse afectada por la persistencia de las inmunoglobulinas en la circulación. Por ejemplo, la velocidad de aclaramiento de inmunoglobulina afecta directamente a la cantidad y la frecuencia de dosificación de la inmunoglobulina. El aclaramiento rápido puede requerir un aumento de la dosificación y de la frecuencia de dosificación, lo que a su vez puede provocar efectos adversos en el paciente y también aumentar los costes médicos. Por otro lado, en determinados otros procedimientos diagnósticos y terapéuticos, puede ser deseable el aclaramiento rápido de la inmunoglobulina.
La IgG es la clase de inmunoglobulina más frecuente en seres humanos y otros mamíferos y se utiliza en diversos tipos de inmunoterapias y procedimientos de diagnóstico. El mecanismo del catabolismo de IgG en la circulación se ha dilucidado mediante estudios relacionados con la transferencia de inmunidad pasiva de la madre al feto/neonato a través de la placenta o el saco vitelino o a través del calostro (transferencia materno-fetal de IgG a través de transcitosis) en roedores (Brambell, Lancet, ii:1087-1093, 1966; Rodewald, J. Cell Biol., 71: 666-670, 1976; Morris et al., En: Antigen Absorption by the Gut, págs. 3-22, 1978, University Park Press, Baltimore; Jones et al., J. Clin. Invest., 51: 2916-2927, 1972).
Un receptor de Fc de alta afinidad, el receptor de Fc neonatal (FcRn), se ha implicado en este mecanismo de transferencia. El receptor FcRn se ha aislado de los bordes en cepillo del epitelio duodenal de ratas lactantes (Rodewald et al., J. Cell Biol., 99: 154s-164s, 1984; Simister et al., Eur. J. Immunol., 15: 733-738, 1985) y el gen correspondiente se ha clonado (Simister et al., Nature, 337: 184, 1989 y Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., LIV, 571-580, 1989). Las clonaciones posteriores de genes que codifican el FcRn de ratones (Ahouse et al., J. Immunol., 151: 6076-6088, 1993) y seres humanos (Story et al., J. Exp. Med., 180: 2377-2381, 1994) demuestran una homología alta de estas secuencias con el FcRn de rata, lo que sugiere un mecanismo similar de transmisión materno-fetal de IgG que implica el FcRn en estas especies.
Mientras tanto, el grupo de Brambell también propuso un mecanismo para el catabolismo de IgG (Brambell et al., Nature, 203: 1352-1355, 1964; Brambell, Lancet, ii: 1087-1093, 1966). Propusieron que una proporción de moléculas de IgG en la circulación se unen a determinados receptores celulares (es decir, FcRn), que son saturables, por lo que las IgG están protegidas de la degradación y en última instancia se reciclan en la circulación; por otro lado, las IgG que no se unen a los receptores se degradan. El mecanismo propuesto era coherente con el catabolismo de IgG observado en pacientes hipergammaglobulinémicos o hipogammaglobulinémicos. Además, basándose en sus estudios, así como en otros (véase, por ejemplo, Spiegelberg et al., J. Exp. Med., 121: 323-338, 1965; Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63: 78-85, 1969), Brambell también sugirió que los mecanismos implicados en la transferencia materno-fetal de IgG y el catabolismo de IgG pueden ser los mismos o, al menos, estar muy relacionados (Brambell, Lancet, ii: 1087-1093, 1966). De hecho, más tarde se publicó que una mutación en el fragmento bisagra-Fc provocaba cambios concomitantes en el catabolismo, la transferencia materno-fetal, la transcitosis neonatal y, en particular, la unión a FcRn (Ghetie et al., Immunology Today, 18(12): 592-598, 1997). Se ha demostrado que el FcRn facilita tanto la transferencia de IgG materna al neonato a través de la placenta como la homeostasis de los niveles de IgG y albúmina en adultos (Ghetie et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26, 690-696; Israel et al. (1996) Immunology 89, 573-578; Ghetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766; Roopenian et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7, 715-725.
Estas observaciones sugirieron que porciones del dominio constante de IgG controlan el metabolismo de la IgG, incluyendo la velocidad de degradación de IgG sérica mediante interacciones con el FcRn. De hecho, el aumento de la afinidad de unión por FcRn aumentó la semivida sérica de la molécula (Kim et al., Eur. J. Immunol., 24: 2429-2434, 1994; Popov et al., Mol. Immunol., 33: 493-502, 1996; Ghetie et al., Eur. J. Immunol., 26: 690-696, 1996; Junghans et al., Proc. Acad. Sci. USA, 93: 5512-5516, 1996; Israel et al., Immunol., 89: 573-578, 1996).
Desde entonces, se ha descubierto que la interacción entre el Fc de IgG y el receptor de Fc neonatal (FcRn) es fundamental para la homeostasis de la IgG, dando como resultado una semivida sérica larga de las IgG circulantes. Una vez que los anticuerpos son endocitados, el receptor FcRn protege al anticuerpo de la degradación lisogénica mediante la unión de alta afinidad al anticuerpo en el endosoma ácido (pH 6,0) y la posterior liberación del anticuerpo en la superficie celular neutra de nuevo a la circulación.
Diversos experimentos de mutagénesis específica de sitio en la región Fc de IgG de ratón han conducido a la identificación de determinados restos de aminoácidos implicados en la interacción entre la IgG y el FcRn (Kim et al., Eur. J. Immunol., 24: 2429-2434, 1994; Medesan et al., Eur. J. Immunol., 26: 2533, 1996; Medesan et al., J. Immunol., 158: 2211-2217, 1997). Estos estudios y estudios de comparación de secuencias descubrieron que la isoleucina en la posición 253, la histidina en la posición 310 y la histidina en la posición 435 (de acuerdo con la numeración de Kabat, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., 1991 Pub. de NIH N.° 91-3242) están muy conservadas en las IgG humanas y de roedores, lo que sugiere su importancia en la unión IgG-FcRn. El mecanismo neutralizante responsable del reciclaje de IgG es altamente dependiente del pH y es facilitado en particular por la histidina 310 y 435 en el Fc de una IgG a pH ~ 6. La cadena lateral imidazol de la histidina con un pKa de ~6-6,5, tiene una carga neutra neta a pH 7,4, pero gana carga positiva en entornos de pH más bajo. Por tanto, tanto la afinidad de unión como la dependencia del pH de la interacción Fc/FcRn son reguladores importantes de la función farmacocinética in vivo.
Adicionalmente, diversas publicaciones describen métodos para obtener moléculas fisiológicamente activas cuyas semividas se modifican mediante la introducción de un polipéptido de unión a FcRn en las moléculas (documento WO 97/43316; Patente de los EE.UU. N.° 5.869.046; Patente de los EE.UU. N.° 5.747.035; documento WO 96/32478; documento WO 91/14438) o mediante la fusión de las moléculas con anticuerpos cuyas afinidades de unión a FcRn se conservan, pero las afinidades por otros receptores de Fc se han reducido considerablemente (documento WO 99/43713) o fusionando con dominios de unión a FcRn de anticuerpos (documento WO 00/09560; Patente de los EE.UU. N.° 4.703.039).
Los investigadores han identificado mutaciones en el dominio constante de IgG que afectan a la unión de la IgG a FcRn y/o alteran la semivida in vivo de la IgG. Por ejemplo, el documento WO 93/22332 (de Ward et al.) desvela diversas IgG de ratón recombinantes cuyas semividas in vivo se reducen debido a mutaciones en el dominio constante de IgG. La modulación de moléculas de IgG mediante la sustitución, adición o supresión de aminoácidos para aumentar o reducir la afinidad por FcRn también se desvela en el documento WO 98/23289. Recientemente, se ha alterado el Fc de IgG para obtener moléculas que produzcan una mayor persistencia sérica in vivo a través de unión potenciada a FcRn (Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunol. 169, 5171-5180; Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 23514-23524; Datta-Mannan et al. (2007) Drug Metab. Dispos. 35, 86-94; Deng et al. (2010) Drug Metab. Dispos. 38, 600-605; Hinton et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 6213-6216; Hinton et al. (2006) J. Immunol. 176, 346-356; Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182, 7663-7671); Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28, 157-159). Las IgG que tienen semividas in vivo extendidas como resultado de la modificación de un dominio constante de IgG también se describen en las Pat. de los EE.UU. N.° 7.083.784, 7.670.600, 7.704.497, 8.012.476, 8.323.962, 8.475.792 y el documento WO2002/060919 (Dall'Acqua et al.).
SUMARIO
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Se refiere a una IgG1 humana modificada que comprende una región Fc que comprende sustituciones de aminoácidos en dos o más de las posiciones 432 a 437, numeradas de acuerdo con el índice de numeración EU de Kabat, en donde la IgG1 humana modificada tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG1 que tiene la región Fc humana de tipo silvestre.
Terminología
Los anticuerpos e inmunoglobulinas nativos son por lo general glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, y las cadenas pesadas están unidas entre sí, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como CL). Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (VH) y una región constante de la cadena pesada (CH) que consiste en tres dominios, CH1, CH2 y CH3. CH1 y CH2, de la cadena pesada, están separados entre sí por la denominada región bisagra. La región bisagra normalmente comprende uno o más restos de cisteína, que pueden formar puentes disulfuro con los restos de cisteína de la región bisagra de la otra cadena pesada de la molécula de anticuerpo. Los anticuerpos tienen un dominio variable que comprende los sitios de unión específicos de antígeno y un dominio constante que está implicado en funciones efectoras.
La expresión "región Fc", en ocasiones denominada "Fc" o "dominio Fc", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la porción de una molécula de IgG que se correlaciona con un fragmento cristalizable obtenido por digestión con papaína de una molécula de IgG. La región Fc consiste en la mitad C-terminal de las dos cadenas pesadas de una molécula de IgG que están unidas por enlaces disulfuro. No tiene ninguna actividad de unión a antígeno, pero contiene el resto hidrato de carbono y los sitios de unión para los receptores del complemento y de Fc, incluyendo el receptor FcRn (véase a continuación). La región Fc contiene todo el segundo dominio constante c H2 (restos 231-340 de IgG1 humana, de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat) (por ejemplo, SEQ ID NO: 1; Fig. 1C) y el tercer dominio constante CH3 (restos 341-447) (por ejemplo, SEQ ID NO: 2; Fig. 1D).
Las expresiones "región bisagra-Fc", "región Fc-bisagra", "dominio bisagra-Fc" o "dominio Fc-bisagra", como se utilizan en el presente documento se utilizan indistintamente y se refieren a una región de una molécula de IgG que consiste en la región Fc (restos 231-447) y una región bisagra (restos 216-230; por ejemplo, SEQ ID NO: 3) que se extiende desde el extremo N de la región Fc. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de la región bisagra-Fc de la IgG1 humana es la SEQ ID NO: 4 (Fig. 1B-Fig. 1D).
La expresión "dominio constante" se refiere a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada con respecto a la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión a antígeno. El dominio constante de la cadena pesada contiene los dominios CH1, CH2 y c H3 y el dominio constante de la cadena ligera contiene el dominio CL.
Una "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un primer polipéptido unido a un segundo polipéptido con el que no está unido de forma natural en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos que codifica una región Fc o al menos una porción de una región Fc (por ejemplo, la porción de la región Fc que confiere unión a FcRn) y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido no inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio de unión a ligando de un receptor o un dominio de unión a receptor de un ligando. Los polipéptidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se reúnen en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero se colocan en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Una proteína de fusión puede crearse, por ejemplo, mediante síntesis química, o creando y traduciendo un polinucleótido en el que las regiones peptídicas estén codificadas en la relación deseada.
"Unido", "fusionado" o "fusión" se utilizan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos o más elementos o componentes, por cualquier medio, incluyendo la conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en fase" o "unida operativamente" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos (ORF) para formar un ORF continuo más largo, de una manera que mantiene el marco de lectura correcto de los ORF originales. Por lo tanto, la proteína de fusión recombinante resultante es una única proteína que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos no suelen estar así unidos en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se hace por lo tanto continuo a través de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar física o espacialmente separados, por ejemplo, por una secuencia enlazadora en fase.
La expresión "receptor FcRn" o "FcRn", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un receptor de Fc ("n" indica neonatal) que se sabe que está implicado en la transferencia de IgG maternas a un feto a través de la placenta humana o de primates, o del saco vitelino (conejos) y a un neonato desde el calostro a través del intestino delgado. También se sabe que el FcRn está implicado en el mantenimiento de los niveles constantes de IgG sérica mediante la unión de las moléculas de IgG y el reciclaje de las mismas en el suero. La unión del FcRn a moléculas de IgG1, IgG2 e IgG4 de origen natural es estrictamente dependiente del pH, con una unión óptima a pH 6. La IgG3 tiene una variación conocida en la posición 435 (es decir, la IgG humana tiene R435 en lugar de H435 que se encuentra en las IgG1, IgG2 e IgG4 humanas), que puede dar como resultado una unión reducida a pH 6. El FcRn comprende un heterodímero de dos polipéptidos, cuyos pesos moleculares son aproximadamente 50 kD y 15 kD, respectivamente. Los dominios extracelulares del polipéptido de 50 kD están relacionados con las cadenas a del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y se demostró que el polipéptido de 15 kD es la p2-microglobulina no polimórfica (p2-m). Además de en la placenta y el intestino neonatal, el FcRn también se expresa en diversos tejidos de distintas especies, así como en diversos tipos de líneas celulares endoteliales. También se expresa en el endotelio vascular, la vasculatura muscular y los sinusoides hepáticos adultos humanos, y se sugiere que las células endoteliales pueden ser las más responsables del mantenimiento de los niveles de IgG sérica en seres humanos y ratones. Las secuencias de aminoácidos del FcRn humano y del FcRn murino se indican mediante la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, respectivamente. También se incluyen homólogos de estas secuencias que tienen actividad FcRn.
Un "fragmento de unión a FcRn" de un dominio constante de IgG, como se utiliza esta expresión en el presente documento, se refiere a un fragmento de un dominio constante de IgG que se une al receptor FcRn. Un fragmento de unión a FcRn de un dominio constante de IgG puede incluir la región Fc, o la región bisagra-Fc; por tanto, puede incluir porciones de la región CH2-CH3 de la cadena pesada o la región bisagra-CH2-CH3 que están implicadas en la unión a FcRn (véase Roopenian et al., Nature Rev. Immunol. 7: 715-725 (2007).
"KD", como se utiliza este término en el presente documento (en ocasiones también denominado Kd, Kd o Kd) es la constante de disociación de equilibrio de una interacción de unión entre dos moléculas, tales como una IgG y un FcRn. La KD puede calcularse a partir de constantes de velocidad observadas para asociación (kasoc) y disociación (kdisoc), de manera que la KD es igual a la relación de kdisoc/kasoc.
La expresión "semivida in vivo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una semivida biológica de un tipo particular de molécula de IgG o sus fragmentos que contienen sitios de unión a FcRn en la circulación de un animal dado y está representada por el tiempo necesario para que la mitad de la cantidad administrada en el animal se aclare de la circulación y/u otros tejidos del animal. Cuando se construye una curva de aclaramiento de una IgG dada en función del tiempo, la curva por lo general es bifásica con una fase a rápida que representa un equilibrio de las moléculas de IgG inyectadas entre el espacio intra y extravascular y que está, en parte, determinada por el tamaño de las moléculas, y una fase p más larga que representa el catabolismo de las moléculas de IgG en el espacio intravascular. La expresión "semivida in vivo" corresponde prácticamente a la semivida de las moléculas de IgG en la fase p.
Un anticuerpo o una proteína de fusión "aislados" o "purificados" están sustancialmente libres de material celular o de otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que deriva la proteína, o sustancialmente libres de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. La expresión "sustancialmente libres de material celular" incluye las preparaciones de un anticuerpo o una proteína de fusión en las que el anticuerpo o la proteína de fusión están separados de los componentes celulares de las células de las que se han aislado o producido de forma recombinante. Por tanto, un anticuerpo o una proteína de fusión que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de anticuerpo o proteína de fusión que tienen menos de aproximadamente el 30 %, el 20 %, el 10 % o el 5 % (en peso seco) de proteína contaminante. En un caso, cuando el anticuerpo o la proteína de fusión se producen de forma recombinante, también pueden estar sustancialmente libres de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 %, el 10 % o el 5 % del volumen de la preparación de proteína. En otro caso, cuando el anticuerpo o la proteína de fusión se producen por síntesis química, pueden estar sustancialmente libres de precursores químicos u otras sustancias químicas, es decir, están separados de precursores químicos u otras sustancias químicas que están implicados en la síntesis de la proteína. En consecuencia, dichas preparaciones del anticuerpo o la proteína de fusión tienen menos de aproximadamente el 30 %, el 20 %, el 10 %, el 5 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo de interés. En un caso de la presente invención, los anticuerpos se aíslan o se purifican. Opcionalmente, las proteínas de fusión se aíslan o se purifican.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es aquella que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural de la molécula de ácido nucleico. Por otro lado, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Una molécula de ácido nucleico "aislada" no incluye moléculas de ADNc dentro de una biblioteca de ADNc. En un caso de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos se aíslan o se purifican. Opcionalmente, se aíslan o purifican las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión.
La expresión "célula hospedadora", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la célula objeto particular transfectada con una molécula de ácido nucleico o infectada con fagémidos o bacteriófagos y a la progenie o progenie potencial de una célula de este tipo. La progenie de una célula de este tipo puede no ser idéntica a la célula parental transfectada con la molécula de ácido nucleico debido a mutaciones o influencias ambientales que pueden producirse en generaciones sucesivas o a la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula hospedadora.
Los restos de aminoácidos de los dominios constantes y variables de la IgG a los que se hace referencia en el presente documento se numeran de acuerdo con el índice de numeración EU de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., 1991 Pub. de NIH N.° 91-3242), e incluyen los restos correspondientes en otros dominios constantes de IgG, según se determina por alineación de secuencia. Las Fig. 1A-D muestran el dominio constante de la cadena pesada de la IgG1 humana, así como restos correspondientes en otros dominios constantes de IgG. Los nombres de los aminoácidos a los que se hace referencia en el presente documento se abrevian con símbolos de tres letras o de una letra.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con el fin de realizar una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para realizar una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Después, se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente de la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartida por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas solapadas/número total de posiciones x 100 %). En un caso, las dos secuencias tienen la misma longitud.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias también puede lograrse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877. Se incorpora un algoritmo de este tipo en los programas Nb LAST y XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403. Las búsquedas de nucleótidos por BLAST pueden realizarse con los parámetros del programa de nucleótidos NBLAST establecidos, por ejemplo, para la puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las búsquedas de proteínas por BLAST pueden realizarse con los parámetros del programa XBLAST establecidos, por ejemplo, para la puntuación -50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de la presente invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389­ 3402. Como alternativa, puede utilizarse PSI-BLAST para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, de XBLAST y NBLAST) (véase, por ejemplo, http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4: 11-17. Se incorpora un algoritmo de este tipo en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede utilizarse una tabla de restos ponderados PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse utilizando técnicas similares a las descritas anteriormente, permitiendo huecos o no. En el cálculo del porcentaje de identidad, normalmente solo se cuentan los apareamientos exactos.
El término "aproximadamente", cuando se utiliza en el presente documento con respecto a un valor numérico, puede incluir un intervalo de valores de /- 20 %, /- 10 % o /-5 %.
Ha de comprenderse que la presente invención no se limita a composiciones o etapas de proceso específicas, ya que éstas pueden variar. Ha de observarse que, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A a 1D muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 56-59) y la numeración para las regiones constantes de la cadena pesada de IgG (IgG1 (SEQ ID NO: 56), IgG2 (SEQ ID NO: 57), IgG3 (SEQ ID NO: 58) e IgG4 (SEQ ID NO: 59)) numeradas de acuerdo con el índice EU como se establece en Kabat. El "índice EU como se establece en Kabat" se refiere a la numeración de restos del anticuerpo humano IgG1 EU como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., 1991 Pub. de NIH N.° 91-3242. La Figura 1A-B muestra las secuencias de aminoácidos y la numeración para las regiones CH1 y bisagra. La Figura 1C muestra las secuencias de aminoácidos y la numeración para la región CH2. La Figura 1D muestra la secuencia de aminoácidos y la numeración para la región CH3. Los restos que difieren entre IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4 están sombreados, y los sitios de variación alélica conocida se indican con un asterisco (*). La Figura iE muestra una secuencia de aminoácidos de la subunidad grande p51 del receptor de Fc neonatal humano (FcRn) (SEQ ID NO: 5) que forma un complejo con la beta-2-microglobulina (también conocida como p14). La Figura IF muestra una secuencia representativa de aminoácidos de beta-2-microglobulina humana (SEQ Id NO: 6). Debido a las variaciones alélicas conocidas, pueden existir ligeras diferencias entre las secuencias presentadas y las secuencias de la técnica anterior.
La Figura 2A muestra un espacio bidimensional definido por la afinidad de unión (valores de KD) del fragmento Fc de IgG a FcRn humano (hFcRn) a pH 6,0 (eje x) y a pH 7,4 (eje y). El plano está dividido en cuadrantes que pueden asociarse a propiedades farmacocinéticas variables. La Figura 2B muestra un gráfico de dispersión que muestra la unión a hFcRn para variantes de anti-CD20 seleccionadas a pH 6,0 y 7,4. La Figura 2C muestra un gráfico de dispersión del recuadro de la Figura 2B que muestra la unión a hFcRn para variantes de anti-CD20 seleccionadas.
La Figura 3 muestra el análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la IgG HB20.3 y de diversas variantes de Fc. Todos los anticuerpos presentan una temperatura de despliegue de Fab de ~73 °C. E1HB20.3 ( línea discontinua de color negro ) tiene una Tf de Ch3 de 83,3 °C; la transición de desnaturalización para Ch2 de HB20.3 (normalmente ~69 °C) está probablemente enterrada dentro de la transición de Fab. YTE (línea de color gris oscuro ) tiene una Tf de Ch3 de 83,3 °C y una de Ch2 de 65,1 °C. N3-YTE ( línea de color negro ) y CwtC-YTE ( línea discontinua de color gris claro ) presentan transiciones Ch2 y Ch3 similares, con la Tf de Ch3 a 87,1 °C para ambas variantes y la transición de Ch2 reducida a 62,7 °C para N3-YTE y 62,3 °C para CwtC-YTE (wt es "tipo silvestre" por sus siglas en inglés). SerN3-YTE ( línea de color gris claro ) tuvo la transición de Ch2 más baja de los anticuerpos que se muestran a 58,7 °C, con su transición de Ch3 enmascarada por el despliegue de Fab a 73 °C.
La Figura 4 muestra el análisis de secuencia para las bibliotecas CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) y ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) como representaciones gráficas de la incidencia relativa de un aminoácido que se produce en una posición particular en la posición representada a través de todas las secuencias estudiadas. Cuanto más grande es la letra, más frecuentemente se encuentra ese aminoácido en esa posición a través de las secuencias examinadas. Se muestran representaciones SequenceLogo (Crooks et al., 2004 Genome Res. 14: 1188-1190; Schneider y Stephens, 1990 Nucleic Acids Res. 18: 6097-6100) de los aminoácidos 432-437 para 52 clones de fagos aislados después de 4 rondas de selección de fagos para la biblioteca CXXXXCE (Fig. 4A) y para 6 clones que se considera que han mejorado la dependencia del pH a través de ELISA de fagos (Fig. 4B). Se muestran representaciones SequenceLogo de los aminoácidos 432-437 (SEQ ID NO: 23) para 68 clones de fagos aislados después de 4 rondas de selección de fagos para la biblioteca ZXXHXZ (Fig. 4C).
La Figura 5 muestra datos de ELISA de fagos para las bibliotecas CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) y ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14). Se muestran datos representativos de ELISA de fagos que comparan la unión de hFcRn a pH 7,4 y pH 6,0, así como secuencias de variantes de la biblioteca CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) que no se agrupan con N3E-YTE (Fig. 5A). También se muestran resultados representativos de ELISA de fagos para clones individuales aislados después de la ronda 4 de selección para la biblioteca ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) (Fig. 5B). Los clones de fagos que presentan una unión dependiente del pH en una región preferida están rodeados por un círculo. Algunos de estos clones se convirtieron en IgG de longitud completa y se volvieron a evaluar para determinar la unión a FcRn.
La Figura 6 muestra el análisis farmacocinético (PK) de variantes de Motavizumab en ratones transgénicos hFcRn. Se muestran niveles de IgG para versiones de tipo silvestre (-), YTE (■), Y31-YTE (▼) y N3E-YTE (▲) de Motavizumab en ratones hFcRn (Fig. 6A). Se representan gráficamente velocidades de aclaramiento de todas las variantes de anticuerpos sometidas a ensayo en la Tabla 2 frente a su afinidad de unión a hFcRn a pH 6,0 (Fig. 6B).
La Figura 7 muestra los resultados de inmunogenicidad (ensayo de proliferación de linfocitos T) utilizando PBMC de 202 donantes. Los donantes se eligieron para reflejar la diversidad de HLA caucásica y representar más de una docena de alotipos de HLA-DRB1. Como antígenos se utilizaron Motavizumab (wt), Motavizumab N3, Tampón (PBS) y Hemocianina de lapa californiana (KLH, una proteína inmunógena conocida). Los antígenos se administraron a las PBMC y se dejaron incubar 14 días. La proliferación de linfocitos T se midió mediante FACs. Los datos se publican como índice de estimulación (IE). Se muestra una tabla que muestra el IE y la significación de los cuatro grupos sometidos a ensayo (Fig. 7A). Puede observarse el IE de donantes individuales (Fig. 7B).
La Figura 8 representa la destrucción opsonofagocítica de Pseudomonas aeruginosa. (cepa PA01:lux que contiene el gen de la luciferasa) por células polimorfonucleares derivadas del paciente. Cam004 wt (círculos de color negro) facilitó eficazmente la OPK (destrucción opsonofagocítica por sus siglas en inglés), mientras que Cam004 YTE tuvo una OPK reducida (triángulos de color negro). Cam440 N3 (cuadrados de color gris) tiene una OPK similar a la de la Cam004 parental. También se muestra un anticuerpo inespecífico como control negativo (R347; triángulos de color gris).
La Figura 9 representa los resultados de un ensayo de tensión de estabilidad de un mes de duración con un anticuerpo de variante de N3 (Motavizumab N3) a 50 mg/ml incubado a 4 °C (cuadrados de color negro), 25 °C (diamantes de color negro) o 40 °C (triángulos de color negro) durante un mes.
La Figura 10 es una representación esquemática de aclaramiento antigénico con un anticuerpo que presenta una unión a antígeno dependiente de pH. La pinocitosis clásica (Fig. 9A) se compara con la posible endocitosis utilizando un anticuerpo que presenta una alta afinidad por FcRn a 7,4 así como a pH 6,0 (Fig. 9B).
DESCRIPCIÓN DE LOS ASPECTOS GENERALES DE LA DIVULGACIÓN
Más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas, la presente divulgación también proporciona un marco de trabajo más genérico para proporcionar polipéptidos y otras moléculas que incluyen al menos una porción de un dominio constante de inmunoglobulina que se une a un receptor de Fc de neonato (FcRn), por ejemplo, una región Fc o región bisagra-Fc, que contiene una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, una o más sustituciones, inserciones y/o supresiones) con respecto a una región Fc de inmunoglobulina de tipo silvestre. Las una o más modificaciones de aminoácidos cambian la afinidad del dominio constante de la inmunoglobulina, la región Fc o el fragmento de unión a FcRn, por FcRn y alteran la semivida sérica de los polipéptidos u otras moléculas.
Por ejemplo, los anticuerpos terapéuticos, los anticuerpos de diagnóstico y los productos biológicos fusionados con Fc aprovechan el reciclaje mediado por FcRn para conseguir semividas en suero que pueden ser similares o diferentes a las de la IgG endógena, dependiendo de las propiedades deseadas. Mediante la dotación a agentes biológicos terapéuticos y de diagnóstico de propiedades farmacocinéticas mejoradas, la presente divulgación proporciona oportunidades de dosificaciones más deseables, una frecuencia reducida de administración o un aclaramiento mejorado, manteniendo al mismo tiempo la eficacia.
La presente divulgación proporciona moléculas, particularmente proteínas, más particularmente, inmunoglobulinas cuyas semividas in vivo se ven alteradas (aumentadas o reducidas) por la presencia de un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana), que tienen modificaciones de uno o más de los restos de aminoácidos en al menos el dominio CH3. Las modificaciones pueden incluir sustituciones, inserciones, supresiones de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas. Debe comprenderse que todas las referencias a los restos de aminoácidos de los dominios constante y variables de la IgG que aparecen en el presente documento se numeran de acuerdo con el índice de numeración EU de Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., 1991 Pub. de NIH N.° 91-3242), e incluyen los restos correspondientes en otros dominios constantes de IgG, según se determina por alineación de secuencia.
Más particularmente, la divulgación proporciona moléculas, particularmente proteínas, más particularmente, inmunoglobulinas cuyas semividas in vivo se ven alteradas (aumentadas o reducidas) por la presencia de un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana), que tienen modificaciones de uno o más de entre los restos de aminoácidos 432, 433, 434, 435, 436, o 437, y/o que tienen una inserción de un solo aminoácido entre los aminoácidos 437 y 438, cuya inserción se denomina en el presente documento 437*, en la región de bucle His435 del dominio CH3, cuyas sustituciones y/o inserciones de aminoácidos alteran (aumentan o reducen) la afinidad de unión del dominio constante de IgG o del fragmento de unión a FcRn del mismo para el FcRn a un pH particular (por ejemplo, pH 6,0 o pH 7,4). Dichas modificaciones, incluyendo las inserciones entre los restos 437 y 438, se denominarán en general modificaciones dentro de la región de bucle His435, es decir en los restos de aminoácidos 432-437. En determinados casos, estas modificaciones pueden excluir el resto 435, de manera que el dominio constante de IgG modificada, o la porción de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), contiene His435 que se encuentra en las IgG1, IgG2 e IgG4 humanas de tipo silvestre. En determinados casos, por ejemplo, la modificación de la región de bucle His435 análoga en la IgG3 humana, que en la molécula de tipo silvestre incluye la arginina en la posición (R435) en lugar de la histidina (H435) que se encuentra en IgG1, IgG2 e IgG4 y, además, es un sitio de variación alélica conocida (véase la Fig. 1D, recuadros sombreados y asteriscos), estas modificaciones incluyen la sustitución de un resto 435 no histidina de tipo silvestre por una histidina, para obtener H435. En un caso, el dominio constante de IgG modificada, o la porción de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), es un dominio constante de IgG humana o humanizada o una porción de unión a FcRn del mismo, aunque puede ser murino. El dominio constante de IgG humana o humanizada puede ser un dominio constante de un dominio IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, o cualquier subtipo del mismo.
En un caso, la divulgación aborda la importancia farmacéutica de aumentar las semividas in vivo de las inmunoglobulinas y otras moléculas bioactivas. Para este fin, la divulgación proporciona IgG y otras moléculas que contienen un dominio constante de IgG modificada o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana) que confieren una semivida aumentada in vivo a inmunoglobulinas y otras moléculas bioactivas. En este caso, la presente divulgación se refiere a una IgG u otra molécula (por ejemplo, una proteína, pero puede ser un agente no proteínico) que tiene una semivida in vivo aumentada en virtud de la presencia de un dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana) en donde el dominio constante de IgG, o el fragmento del mismo, se modifica (por ejemplo, por sustitución, supresión o inserción de aminoácidos) para cambiar (aumentar o reducir) la afinidad de unión del dominio constante de IgG o el fragmento de unión a FcRn por FcRn a un pH particular (por ejemplo, pH 6,0 o pH 7,4). En un caso, el dominio constante de IgG, o el fragmento de unión a FcRn del mismo, se modifica para aumentar la afinidad de unión por FcRn a pH 6,0 con respecto a la afinidad de unión a FcRn a pH 7,4. Las semividas in vivo de las IgG modificadas de la divulgación pueden evaluarse convenientemente en un modelo de ratón transgénico humano o en un modelo de primate de macaco de la Indica, como se describe con más detalle en los ejemplos a continuación.
En otro caso, la divulgación aborda la importancia farmacéutica de acortar las semividas in vivo de inmunoglobulinas y otras moléculas bioactivas unidas covalentemente a un dominio constante de IgG, o a un fragmento del mismo que se une a FcRn (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc). Para este fin, la divulgación proporciona IgG y otras moléculas que contienen un dominio constante de IgG modificada o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana) que confieren una semivida in vivo reducida a inmunoglobulinas y otras moléculas bioactivas unidas covalentemente a un dominio constante de IgG, o un fragmento del mismo que se une a FcRn. En este caso, la presente divulgación se refiere a una IgG u otra molécula (por ejemplo, una proteína o un agente no proteínico) unida covalentemente a un dominio constante de IgG, o a un fragmento del mismo que se une a FcRn (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana), que tiene una semivida in vivo reducida en virtud de la presencia de un dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo, en donde el dominio constante de IgG, o un fragmento del mismo, se modifica (por ejemplo, por sustitución, supresión o inserción de aminoácidos) para alterar la afinidad de unión del dominio constante de IgG, o un fragmento del mismo, por FcRn, a uno o más pH; por ejemplo, pero no a modo de limitación, manteniendo o aumentando la afinidad de unión por FcRn, a pH 6,0 y aumentando simultáneamente la afinidad de unión por FcRn a pH 7,4.
La mayoría de las IgG modificadas de la divulgación, ya sea que presenten semividas in vivo aumentadas o reducidas comparadas entre sí o con sus homólogas no modificadas o de tipo silvestre, contienen un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo, que presenta una mayor afinidad de unión hacia FcRn a pH 6,0 que el dominio constante de IgG de tipo silvestre.
Más generalmente, un experto en la materia comprenderá que las variantes de Fc de la divulgación, ya sea que presenten semividas in vivo aumentadas o reducidas comparadas entre sí o con sus homólogas no modificadas o de tipo silvestre, pueden tener propiedades de unión a FcRn alteradas. Los ejemplos de propiedades de unión incluyen, pero sin limitación, la especificidad de unión, la constante de disociación de equilibrio (KD), las velocidades de disociación y asociación (Kasoc y Kdisoc, respectivamente), la afinidad de unión y/o la avidez. Es bien sabido en la técnica que la constante de disociación de equilibrio (KD) se define como kdisoc/kasoc. Se comprende que una interacción de mayor afinidad tendrá una KD menor y, por el contrario, que una interacción de menor afinidad tendrá una KD mayor. Sin embargo, en algunos casos, el valor de kasoc o kdisoc puede ser más relevante que el valor de la KD.
Aunque las relaciones entre la afinidad de unión de IgG por FcRn, la dependencia del pH de dicha afinidad de unión y la semivida in vivo son complejas, se ha descubierto que, para aquellos dominios constantes de IgG que presentan una afinidad de unión alta a FcRn a pH 6,0 (por ejemplo, KD de menos de aproximadamente 500 nM), a medida que aumenta la afinidad de unión por FcRn a pH 7,4 (generalmente reflejando una menor dependencia del pH de la unión a FcRn), por ejemplo, si la KD a pH 7,4 cae por debajo de aproximadamente 1 |jM en el intervalo nanomolar, el resultado puede ser, en algunos casos, una semivida in vivo más corta para la IgG modificada (véase, por ejemplo, el cuadrante III de la Fig. 2A y 5B, que se analiza con más detalle a continuación).
Por el contrario, una afinidad de unión reducida por FcRn a pH 7,4 (por ejemplo, KD a pH 7,4 por encima de aproximadamente 1 j M) junto con una afinidad de unión alta a pH 6,0 (por ejemplo, KD de menos de aproximadamente 500 nM), que generalmente reflejan una mayor dependencia del pH de la unión a FcRn, pueden en algunos casos dar como resultado una semivida in vivo más larga (véase, por ejemplo, el cuadrante I de la Fig. 2A y 5B, que se analiza con más detalle a continuación).
En algunos casos, las IgG modificadas y otras moléculas de la divulgación contienen un dominio constante de IgG modificada o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), que presenta una KD de unión a FcRn a pH 6,0 de menos de 100 nM, menos de 200 nM, menos de 300 nM, menos de 400 nM, menos de 500 nM o menos de 1000 nM. Las IgG modificadas de la divulgación pueden caracterizarse, por ejemplo, por valores de KD para la unión a FcRn a pH 6,0 de 10 nM a 500 nM, 50 nM a 500 nM. En algunos casos, la IgG modificada de la divulgación presenta una potenciación de al menos 10 veces, una potenciación de al menos 20 veces o una potenciación de al menos 50 veces de la afinidad de unión por FcRn a pH 6,0 en comparación con un dominio constante de IgG de tipo silvestre o un fragmento de unión a FcRn del mismo.
Adicionalmente o como alternativa, una IgG modificada puede presentar una afinidad de unión por FcRn a pH 7,4 que está entre 10 nM y 50 j M. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se observa que puede existir un umbral: a pH 7,4, una KD de aproximadamente 1 j M o superior (por ejemplo, una KD de 1 j M, 5 j M 10 j M, 20 j M, 30 j M, 40 j M, 50 j M, o superior; es decir, afinidades de unión en el intervalo micromolar o milimolar que evidencian una menor afinidad de unión por FcRn) puede asociarse a una IgG modificada u otra molécula que tenga una semivida potenciada (aclaramiento más lento), mientras que una KD de menos de 1 j M a pH 7,4 (por ejemplo, una KD de 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM, 800 nM hasta aproximadamente 1000 nM; es decir, afinidades de unión en el intervalo nanomolar, que evidencian una mayor afinidad de unión por FcRn) puede asociarse a una IgG modificada u otra molécula que tenga una semivida acortada (aclaramiento más rápido). Una semivida aumentada para la IgG modificada u otra molécula se asocia generalmente, pero no siempre, a una unión dependiente del pH a FcRn caracterizada por una KD de 50 nM a 400 nM o 500 nM para la unión a pH 6, y una KD de más de 1 j M a pH 7,4.
La Fig. 2A muestra un plano de coordenadas definido por los valores de KD para la unión de IgG a FcRn a pH 6,0 (eje x) y pH 7,4 (eje y). Se muestran cuatro cuadrantes, pero debe comprenderse que los cuadrantes pueden solaparse entre sí, puesto que la relación entre la dependencia del pH de la unión a FcRn y diversas propiedades farmacocinéticas, tales como la semivida y el aclaramiento sérico, son complejas.
Las IgG que pertenecen al cuadrante I muestran una afinidad de unión alta por FcRn a pH 6,0 (superior a la del tipo silvestre) y una afinidad de unión relativamente baja a pH 7,4. El resultado es, en general, una mayor dependencia del pH de la unión a FcRn, que puede asociarse a semividas in vivo más largas para estas IgG. La Fig. 2B muestra IgG mutantes de ejemplo que pertenecen al cuadrante I. Uno de estos mutantes se denomina en el presente documento "YTE". YTE tiene un dominio constante de IgG que tiene mutaciones en el dominio CH2 (es decir, M252Y/S254T/T256E). El mutante YTE tiene una afinidad de unión potenciada a FcRn a pH 6,0 y una afinidad de unión relativamente baja a 7,4, y presenta un aumento de 3-4 veces en la semivida y el aclaramiento in vivo, en comparación con un dominio constante de IgG de tipo silvestre. Esta mutación está entre las mejor identificadas para extender la semivida de IgG y se describe con más detalle en la Pat. de los EE.UU. N.° 7.083.784, expedida el 1 de agosto de 2006, y la Publicación Pc T WO 2002/060919, publicada el 8 de agosto de 2002. Por tanto, las IgG modificadas de la divulgación que pertenecen al cuadrante I se denominan en ocasiones en el presente documento "de tipo YTE" o que tienen propiedades "de tipo YTE". Las IgG modificadas de ejemplo de la divulgación con propiedades "de tipo YTE", cuyas estructuras se describen en la Tabla I, se muestran en el cuadrante I de las Fig. 2B y 2 C e incluyen, pero sin limitación, N3, Y31, Y12, YC37-YTE, YC56-YTE, Y3-YTE, Y31-YTE, Y12-YTE, Y83-YTE, Y37-YTE e Y9-YTE.
Las IgG modificadas que pertenecen al cuadrante II presentan una afinidad de unión a FcRn a pH 6,0 que no es tan alta como la de la YTE (es decir, que es más similar a la afinidad de unión de la IgG de tipo silvestre), y una afinidad de unión a pH 7,4 que tampoco es muy alta. La IgG de tipo silvestre es una IgG de ejemplo en el cuadrante II. YC59-YTE (Tabla I) también pertenece al cuadrante II y se espera que tenga propiedades de tipo silvestre.
El cuadrante III incluye IgG modificadas que presentan una afinidad de unión a FcRn que no solo es alta a pH 6,0, sino que también es significativamente superior a los niveles de tipo silvestre a pH 7,4. Para estas moléculas, se observa generalmente una menor dependencia del pH en sus afinidades de unión por FcRn. La afinidad de unión alta a pH 7,4 puede manifestarse en semividas de IgG in vivo cortas y velocidades de aclaramiento rápidas. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que estas propiedades farmacocinéticas pueden ser el resultado de una unión más estrecha de la inmunoglobulina a su receptor en la superficie celular, lo que a su vez puede inhibir la liberación de la IgG en el suero o el tejido, perdiendo de este modo el beneficio del reciclaje mediado por FcRn, y también puede impedir que la IgG endógena utilice el FcRn para el reciclaje, produciendo de forma global una reducción de los niveles de IgG en la circulación. Se espera que las IgG modificadas con semividas acortadas, así como las que tienen propiedades similares a los abdeg (anticuerpos que potencian la degradación de IgG, por sus siglas en inglés) (Vaccaro et al., Nature Biotechnol., 2005, 10(23): 1283-1288) pertenezcan probablemente al cuadrante III. Los abdeg, con afinidad de unión potenciada por FcRn tanto a pH 6,0 como a pH 7,4, son potencialmente útiles como fármacos autoinmunitarios, dada su capacidad para reducir los niveles de IgG endógena (Vaccaro et al., Nature Biotechnol., 2005, 10(23): 1283-1288). Las IgG modificadas con afinidad de unión potenciada por FcRn tanto a pH 6,0 como a 7,4 también pueden ser útiles para barrer rápidamente los antígenos solubles del suero y el tejido. Los ejemplos de IgG modificadas que pertenecen al cuadrante III y que pueden presentar propiedades abdeg incluyen N3-YTE y N3E-YTE (Tabla 1). Las IgG modificadas Y54-YTE, SerN3-YTE e Y8-YTE también presentan una unión aumentada a FcRn a pH 7,4 y se sitúan en el cuadrante III del gráfico de la Fig. 2B.
Las IgG modificadas que pertenecen al cuadrante IV pueden no reciclarse eficientemente, puesto que la unión a FcRn dentro del endosoma ácido puede estar comprometida. Por otra parte, la afinidad de unión alta por FcRn a pH 7,4 puede impedir su liberación en suero o tejido.
Además de las modificaciones dentro de la región de bucle His435, restos 432-437, el dominio constante de IgG modificada, o el fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), puede incluir una o más modificaciones en otros sitios del dominio constante de IgG, o del fragmento de unión a FcRn del mismo. En otras palabras, las mutaciones en la región His 435 descritas en el presente documento pueden incorporarse o superponerse sobre un dominio constante de IgG o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), o a otras moléculas que ya se han modificado por ingeniería para que tengan otras características deseables relacionadas con la estabilidad, la especificidad, la afinidad de unión, y similares. Por ejemplo, el dominio constante, o un fragmento del mismo, puede modificarse además por sustitución de uno o más de entre los restos de aminoácidos 251-256, 285-290, 308-314, 385-389 y 428-431 que aumentan la afinidad del dominio constante o del fragmento de unión a FcRn del mismo por FcRn, como se describe en la Pat. de los EE.UU. N.° 7.083.784, expedida el 1 de agosto de 2006, y la Publicación PCT WO 2002/060919, publicada el 8 de agosto de 2002. La una o más modificaciones adicionales pueden incluir sustituciones, inserciones, supresiones de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas. Las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, modificaciones en uno o más restos expuestos a la superficie, y la modificación puede ser una sustitución por un resto de carga, polaridad o hidrofobia similares al resto que se sustituye.
La estructura del dominio constante de IgG (o un fragmento de unión a FcRn del mismo, por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc) fuera de la región de bucle His435 puede denominarse en el presente documento la "estructura base" o "fondo" de la molécula de IgG, y estos dos términos se utilizan indistintamente. La divulgación contempla, por tanto, IgG modificadas con mutaciones en la región de bucle His435 incorporadas en una estructura base de IgG de tipo silvestre o en una estructura base de IgG mutante. Puede utilizarse cualquier estructura base de IgG mutante; en el presente documento se describen estructuras base de IgG mutante de ejemplo pero no limitantes. "YTE", como se describe con más detalle a continuación, es un ejemplo de estructura base de IgG mutante.
Un caso de la inmunoglobulina u otra molécula bioactiva de la divulgación contiene un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana), que tiene modificaciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 251,252, 254, 255 y 256, en el dominio CH2; más específicamente, que tiene sustituciones en una o más de estas posiciones. En casos específicos, el resto 251 se sustituye por leucina o arginina, el resto 252 se sustituye por tirosina, fenilalanina, serina, triptófano o treonina, el resto 254 se sustituye por treonina o serina, el resto 255 se sustituye por leucina, glicina, isoleucina o arginina, y/o el resto 256 se sustituye por serina, arginina, glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, alanina, asparagina o treonina. En un caso más específico, el resto 251 se sustituye por leucina, el resto 252 se sustituye por tirosina, el resto 254 se sustituye por treonina o serina, y/o el resto 255 se sustituye por arginina. En otro caso específico más, el resto 252 se sustituye por fenilalanina y/o el resto 256 se sustituye por ácido aspártico. En un caso específico, el resto 251 se sustituye por leucina, el resto 252 se sustituye por tirosina, el resto 254 se sustituye por treonina o serina, y/o el resto 255 se sustituye por arginina. En otro caso específico, el resto 252 se sustituye por tirosina, el resto 254 se sustituye por treonina y el resto 256 se sustituye por ácido glutámico (M252Y/S254T/T256E, denominado en el presente documento "YTE"). Muchas de las regiones constantes de IgG modificadas, o fragmentos de unión a FcRn de las mismas descritas en el presente documento, incluyen una estructura base "YTE". Puede utilizarse cualquier combinación de estas sustituciones en la estructura base.
Algunos casos de la inmunoglobulina u otra molécula bioactiva de la divulgación contienen un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana), que tiene modificaciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 308, 309, 311, 312 y 314, más específicamente, que tiene sustituciones en una o más de las posiciones 308, 309, 311, 312 y 314 por treonina, prolina, serina, ácido aspártico y leucina, respectivamente. En un caso, los restos en una o más de las posiciones 308, 309 y 311 se sustituyen por isoleucina, prolina y ácido glutámico, respectivamente. En un caso, los restos en una o más de las posiciones 308, 309, 311, 312 y 314 se sustituyen por treonina, prolina, serina, ácido aspártico y leucina, respectivamente. Puede utilizarse cualquier combinación de estas sustituciones en la estructura base.
Algunos casos de la inmunoglobulina u otras moléculas bioactivas de la divulgación contienen un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana), que tiene modificaciones de aminoácidos en una o más posiciones 385, 386, 387 y 389, más específicamente, que tiene sustituciones en una o más de estas posiciones. En casos específicos, el resto 385 se sustituye por arginina, ácido aspártico, serina, treonina, histidina, lisina o alanina, el resto 386 se sustituye por treonina, prolina, ácido aspártico, serina, lisina, arginina, isoleucina o metionina, el resto 387 se sustituye por arginina, histidina, serina, treonina, alanina o prolina y/o el resto 389 se sustituye por prolina o serina. En casos más específicos, los restos en una o más posiciones 385, 386, 387 y 389 se sustituyen por arginina, treonina, arginina y prolina, respectivamente. En otro caso específico más, los restos en una o más posiciones 385, 386 y 389 se sustituyen por ácido aspártico, prolina y serina, respectivamente. Puede utilizarse cualquier combinación de estos sustitutos en la estructura base.
Algunos casos de la inmunoglobulina u otras moléculas bioactivas de la divulgación contienen un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o región bisagra-Fc) (por ejemplo, de una IgG humana, por ejemplo, IgG1 humana), que tiene modificaciones de aminoácidos en la posición 428. En casos específicos, el resto 428 se sustituye por metionina, treonina, leucina, fenilalanina o serina. En un caso, el resto 428 se sustituye por metionina.
Las moléculas de la divulgación contienen, por tanto, al menos una modificación de restos de aminoácidos en la región de bucle His435, es decir, los restos 432, 433, 434, 435, 436 o 437, y/o una inserción de aminoácidos entre los aminoácidos 437 y 438, y opcionalmente también puede incluir cualquier combinación de las sustituciones descritas anteriormente, incluyendo, pero sin limitación, sustituciones en uno o más de los restos 251,252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389 y/o 428.
En la divulgación se incluyen composiciones farmacéuticas y métodos de profilaxis y terapia que utilizan inmunoglobulinas modificadas, proteínas y otras moléculas bioactivas de la divulgación que tienen semividas extendidas. También se incluyen métodos de diagnóstico que utilizan inmunoglobulinas modificadas, proteínas y otras moléculas bioactivas de la divulgación que tienen semividas extendidas.
Mutaciones asociadas a semividas in vivo alteradas
La divulgación se refiere a modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o supresiones) en el dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o región bisagra-Fc), que se han descubierto que aumentan la afinidad del dominio constante de IgG, o un fragmento del mismo, por FcRn a pH 6, y que opcionalmente alteran la afinidad de la IgG o un fragmento de la misma por FcRn a pH 7,4, alterando de este modo la dependencia del pH de la afinidad de unión del dominio constante de IgG, o un fragmento del mismo (por ejemplo, una región Fc o región bisagra-Fc) por FcRn. Además, estas modificaciones pueden aumentar o reducir la semivida in vivo de la molécula.
La divulgación se basa en la identificación de modificaciones de aminoácidos en la región de bucle His 435 del dominio CH3 del fragmento Fc de IgG humana (SEQ ID NO: 7 u 8), que afectan a la afinidad de unión de la IgG modificada, o un fragmento de la misma, a FcRn a uno o más pH. Estas modificaciones pueden dar como resultado una alteración en la dependencia del pH de la unión de IgG, o un fragmento de la misma, a FcRn. En algunos casos, las modificaciones de aminoácidos en la región de bucle His435 pueden dar lugar a una mayor afinidad de unión del dominio constante de IgG, o del fragmento de unión a FcRn del mismo, por FcRn a pH 6, a pH 7,4, o a ambos pH 6,0 y 7,4, que la que presenta el dominio constante de IgG de tipo silvestre. Adicionalmente o como alternativa, las modificaciones pueden afectar a la semivida in vivo de la molécula.
La región de bucle His435 incluye los restos de aminoácidos 432, 433, 434, 435, 436 y 437. La secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la región de bucle His435 (restos 432 a 437) del dominio CH3 del fragmento Fc de IgG1, IgG2 e IgG4 humanas es Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr (SEQ iD NO: 8) y de IgG3 humana es Leu-His-Asn-Arg-Phe-Thr (SEQ ID NO: 7). En algunos casos, las una o más modificaciones aminoácidos se realizan en, o cerca de, uno o más de los restos 432, 433, 434, 435, 436 y 437 en un dominio constante de IgG humana, o en el dominio de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), o restos análogos del mismo, como se determina por alineación de secuencia de aminoácidos, en otras IgG. Dichas mutaciones incluyen sustituciones de aminoácidos, así como deleciones e inserciones. Un sitio ilustrativo para una inserción de aminoácido es entre los restos 437 y 438, cuya posición añadida se denomina en el presente documento 437*.
En un caso del dominio constante de IgG modificada, o del fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o región bisagra-Fc), el resto 435 se mantiene como una histidina (His435) (como en las IgG1, IgG2 e IgG4 humanas de tipo silvestre) o muta a una histidina (tal como en la IgG3, que contiene de forma nativa R435 y, por tanto, muta a R435H)), mientras que se sustituye al menos uno de los restos 432, 433, 434, 436 o 437, y/o se realiza una inserción en la posición 437*. En un caso, ni el resto 435 (His435) ni el resto 433 (His 433) están mutados (excepto porque, para la IgG3 humana, el resto 435 tiene la mutación R435H, de manera que sea His435), mientras que al menos uno de los restos 432, 434, 436 o 437 está sustituido, y/o se realiza una inserción en la posición 437*. En un caso, el dominio de unión a FcRn tiene una sustitución en 1, 2, 3, 4 o los 5 restos 432, 433, 434, 436, 437, y/o tiene una inserción en la posición 437* en la región de bucle His435. En otro caso, el dominio de unión a FcRn tiene una sustitución en tres o más de las posiciones 432, 433, 434, 435, 436 o 437. En otro caso, el dominio de unión a FcRn tiene una sustitución en cuatro o más de las posiciones 432, 433, 434, 435, 436 o 437.
En un caso, al menos una de las posiciones 432 y 437 se sustituye por cisteína, y los restos 433, 434, 435 y 436 están cada uno independientemente sustituido o sin sustituir. En determinados casos, los restos 432 y 437 están los dos sustituidos por cisteínas, y los restos 433, 434, 435 y 436 están cada uno independientemente sustituido o sin sustituir.
En un caso, al menos una de las posiciones 432 y 437 se sustituye por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e histidina, y los restos 433, 434, 435 y 436 están cada uno independientemente sustituido o sin sustituir. En determinados casos, ambas posiciones 432 y 437 se sustituyen por un aminoácido seleccionado independientemente del grupo que consiste en glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e histidina, y los restos 433, 434, 435 y 436 están cada uno independientemente sustituido o sin sustituir.
En un caso, un dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), contiene al menos tres mutaciones en la región de bucle His435, y tiene una histidina en la posición 435 (la histidina en la posición 435 puede ser un resto de tipo silvestre o una mutación). La divulgación abarca cualquiera de las diversas permutaciones de tres o más mutaciones (sin incluir una mutación en 435, si está presente), incluyendo sin limitación las mutaciones en los si uientes sitios:
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En un caso del dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), la región de bucle His435 del dominio CH3 del fragmento Fc tiene la secuencia de aminoácidos CXXXXC (restos 432-437; SEQ ID NO: 9) o CXXXXCE (restos 432 a 437* en donde 437* es una inserción; SEQ ID NO: 10). En la Tabla 1 (Ejemplo 1) se muestran secuencias de aminoácidos del bucle His435 de ejemplo para diversos mutantes de IgG HB20.3 generados a partir de una biblioteca CXXXXCE (SEQ ID NO: 10). También se muestran datos de unión de las diversas IgG HB20.3 mutantes a FcRn humano. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los dos restos de cisteína pueden ejercer un efecto estabilizador en la región de bucle, posiblemente formando un disulfuro de cistina. La distancia prevista entre las dos cisteínas es de aproximadamente 6,7A, que está dentro del intervalo (4,6-7A) compatible con la formación de una cistina. En determinados casos basados en el motivo de bucle His435 CXXXXC (SEQ ID NO: 9), las modificaciones de aminoácidos para un dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), son sustituciones en una o más de las posiciones 432-437, estando ambas posiciones 432 y 437 sustituidas por cisteína. La posición 435 es histidina. La posición 433 puede sustituirse por arginina, prolina, treonina, lisina, serina, alanina, metionina o asparagina; en un caso, la posición 433 es histidina. La posición 434 puede sustituirse por arginina, triptófano, histidina, fenilalanina, tirosina, serina, metionina o treonina. La posición 436 puede sustituirse por leucina, arginina, isoleucina, lisina, metionina, valina, histidina, serina o treonina. Opcionalmente, la región de bucle His435 mutada contiene una inserción de ácido glutámico en la posición 437*. En un caso, las posiciones 432 y 437 son cisteína, la posición 433 es arginina, prolina, treonina, lisina o histidina, la posición 434 es arginina, triptófano, histidina, fenilalanina o tirosina, la posición 435 es histidina y la posición 436 es leucina, arginina, isoleucina, lisina, metionina, valina o histidina (véase, por ejemplo, la Fig. 4A). En un caso, la región de bucle His435 es CXRHXC (SEQ ID NO: 11), donde la posición 433 es arginina, histidina, asparagina, prolina o serina, y la posición 436 es arginina, isoleucina, metionina o serina (véase, por ejemplo, la Fig. 4B). En un caso, la región de bucle His435 es CRRHXC (SEQ ID NO: 12) en donde la posición 436 se sustituye por leucina, arginina, isoleucina, lisina, metionina, valina, histidina, serina o treonina; por ejemplo, puede sustituirse por leucina, isoleucina, serina o treonina. En un caso, la región de bucle His435 es CXRHRC (SEQ ID NO: 13) en donde la posición 433 es arginina, prolina, treonina, lisina, serina, alanina, metionina o asparagina. Opcionalmente, en cualquiera de estos casos, la región de bucle His435 mutada contiene una inserción de ácido glutámico en la posición 437*.
En otro caso del dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), la región de bucle His435 del dominio CH3 del fragmento Fc tiene la secuencia de aminoácidos ZXXHXZ, en donde "Z" es glutamina, ácido glutámico, histidina o ácido aspártico (restos 432-437; SEQ ID NO: 14). En este caso, el aminoácido identificado por "Z" en la posición 432 puede ser el mismo que el aminoácido identificado por "Z" en la posición 437, o puede ser diferente. La Tabla 1 se refiere a esta biblioteca de mutantes como que está basada en la secuencia de aminoácidos ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14).
Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se postula que la introducción de restos con carga (por ejemplo, ácido glutámico, ácido aspártico, histidina) en la región de bucle de His435, particularmente en las posiciones 432 y/o 437 (los restos Z en el motivo ZXXHXZ; SEQ ID NO: 14), puede alterar el reciclaje dependiente del pH de la IgG dentro de una célula. En un caso, al menos una de las posiciones 432 o 437 se sustituye por un resto con carga negativa, lo que puede facilitar la formación de un puente salino entre una histidina en la posición 435 y el resto con carga negativa en la posición 432 y/o 437. En un caso, uno de los restos 432 y 437 se sustituye por un resto con carga negativa y el otro se sustituye por un resto con carga positiva que puede facilitar la formación de un enlace salino entre el resto 432 y el resto 437. En un caso, al menos una de las posiciones 432 o 437 se sustituye por un resto cargado; por ejemplo, la posición 432 puede sustituirse por un resto cargado, tal como ácido glutámico o histidina, y la posición 437 puede sustituirse por glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico o histidina. En un caso, la posición 432 se sustituye por un ácido glutámico y la posición 437 se sustituye por una glutamina. Adicionalmente o como alternativa, la posición 433 se sustituye por arginina, alanina, lisina, treonina, leucina, serina, prolina o glutamina; en otro caso, la posición 433 es una histidina. Adicionalmente o como alternativa, la posición 434 se sustituye por tirosina, fenilalanina, histidina, serina o triptófano. Adicionalmente o como alternativa, la posición 436 se sustituye por una arginina, histidina, asparagina, lisina, leucina, metionina, treonina o valina. En determinados casos, la posición 432 se sustituye por ácido glutámico o histidina, la posición 433 se sustituye por arginina, alanina, lisina, treonina o leucina; la posición 434 se sustituye por fenilalanina o tirosina, la posición 436 se sustituye por arginina, histidina, asparagina o lisina, y la posición 437 se sustituye por glutamina o ácido glutámico (véase, por ejemplo, la Fig. 4C). En un caso, las posiciones 433 y/o 436 se sustituyen por un aminoácido con carga positiva. Adicionalmente o como alternativa, la posición 434 se sustituye por un aminoácido hidrófobo.
En un caso, la región de bucle His435 mutada del dominio CH3 del fragmento Fc tiene una secuencia de consenso de: E(R/A)(W/S/F)HRQ (SEQ ID NO: 15). Aunque se postuló que la introducción de un puente salino entre las posiciones 432 y 437 (en comparación con la cistina en estas posiciones) podría aumentar la flexibilidad del bucle His435 y conducir a una mayor dependencia del pH (junto con una semivida in vivo más larga), se descubrió sorprendentemente que la sustitución por glutamina en la posición 437, en lugar de la sustitución por un aminoácido cargado, produjo las ganancias más uniformes en la dependencia del pH de la unión del dominio constante de IgG modificada, o del fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), a FcRn.
La Tabla 1 muestra una serie de secuencias de aminoácidos mutadas de ejemplo dentro de la región de bucle His435 de la región Fc de IgG1. Estos dominios constantes de IgG modificada se evaluaron en una IgG anti-CD20, conocida como Hb20.3 (Tabla 1). Algunos de estos dominios constantes de IgG modificada se evaluaron además en una IgG motavizumab (NuMax) (Tablas 2 y 3), y las propiedades farmacocinéticas se evaluaron en ratones y/o macacos de la India como se describe con más detalle en los Ejemplos.
Un caso de una IgG modificada de la divulgación se denomina en el presente documento "N3E-YTE", que contiene la secuencia Cys-Ser-Trp-His-Leu-Cys-Glu (CSWHLCE; SEQ ID NO: 16) en las posiciones 432-437* (siendo Glu una inserción en la posición 437*, que está entre las posiciones 437 y 478), incorporada en una estructura base de dominio constante de IgG1 "YTE" (IgG1 con Tyr252, Thr254 y Glu256). La histidina en la posición 435 es el único resto de tipo silvestre de IgG1 en la región de bucle His435 en N3E-YTE. Tanto la IgG1 de tipo silvestre como "YTE" (documento Us 7.083.784, emitido el 1 de agosto de 2006; Publicación PCT WO 2002/060919, publicada el 8 de agosto de 2002) presentan una afinidad de unión relativamente baja por FcRn a pH 7,4, teniendo YTE una afinidad de unión por FcRn significativamente superior a la del tipo silvestre a pH 6,0 y una semivida in vivo más larga (pertenece, por tanto, al cuadrante I del gráfico de la Fig. 2B). Por otro lado, N3E-YTE, que se encuentra en el cuadrante III del gráfico de la Fig.
2B, presenta una afinidad de unión alta por FcRn a ambos pH 6,0 y pH 7,4 (teniendo generalmente una menor dependencia del pH), y presenta una semivida in vivo corta en un modelo de ratón de FcRn humano. Por tanto, N3E-YTE puede ser adecuado para su uso en IgG destinadas para su uso en la eliminación o neutralización de antígenos tóxicos, terapias autoinmunitarias o aplicaciones de formación de imágenes biológicas. N3-YTE, que es idéntico a N3E-YTE excepto porque no incluye el ácido glutámico extra en la posición 437*, tiene propiedades farmacocinéticas similares a N3E-YTE y se encuentra análogamente en el cuadrante III en el plano de coordenadas que se muestra en la Fig. 2B. Las IgG modificadas de la divulgación que, como N3E-YTE y N3-YTE, se caracterizan por una afinidad de unión alta por FcRn a ambos pH 6,0 y pH 7,4 (generalmente, las que tienen una menor dependencia del pH), y semividas in vivo cortas, pueden presentar opcionalmente propiedades farmacocinéticas similares a las de abdeg; pueden poseer la capacidad de promover la degradación de IgG endógenas, mejorando de este modo determinadas enfermedades autoinmunitarias caracterizadas por anticuerpos destructivos.
Además de ser útiles para aplicaciones que requieren una semivida in vivo corta, N3E-YTE y N3-YTE también sirven como una plataforma conveniente para el desarrollo de otros dominios constantes de IgG que conservan una afinidad de unión alta por FcRn a pH 6,0 pero presentan niveles inferiores de afinidad de unión a pH 7,4 y semividas in vivo extendidas.
Por tanto, en algunos casos del dominio constante de IgG modificada, o del fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), la región de bucle His435 es similar a la de N3E-YTE o N3-YTE, excepto porque la posición 434 puede sustituirse por un resto hidrófobo diferente. Los ejemplos de secuencias His435 que pueden incorporarse en la estructura base de y Te incluyen Cys-Ser-Phe-His-Leu-Cys (CSFHLC; SEQ ID NO: 17), Cys-Ser-Ile-His-Leu-Cys (CSIHLC; SEQ ID NO: 18), Cys-Ser-Leu-His-Leu-Cys-Glu (CSLHlC; SEQ ID NO: 19), con o sin la inserción de ácido glutámico en la posición 437*. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se ha observado que un resto hidrófobo en una o ambas posiciones 434 y 436 puede conducir a una reducción de la sensibilidad al pH, lo que a su vez puede reducir la semivida in vivo.
Otro caso del dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), se denomina en el presente documento "N3", que contiene la secuencia Cys-Ser-Trp-His-Leu-Cys (CSWHLC; SEQ ID NO: 20) en las posiciones 432-437 (sin inserción entre las posiciones 437 y 438), incorporada en una estructura base del dominio constante de IgG1 de tipo silvestre, en lugar de la estructura base YTE de N3E-YTE. Sorprendentemente, la eliminación de la estructura base de YTE mutante restauró la dependencia del pH de la unión a FcRn, principalmente disminuyendo la afinidad de unión de esta molécula a FcRn a pH 7,4, en comparación con N3E-YTE y N3-YTE. N3 presenta una semivida in vivo significativamente más larga y velocidades de aclaramiento lentas, comparables a las observadas para YTE.
Sin embargo, la extensión de la semivida no es el único resultado clínicamente relevante de la modulación de la interacción Fc-FcRn; también puede ser importante conservar o potenciar, o en otras ocasiones inhibir, otras actividades biológicas tales como la función efectora, dependiendo de la aplicación terapéutica prevista. El mutante YTE presenta una función efectora reducida (ADCC y destrucción opsonofagocítica) debido a una unión ligeramente reducida al receptor de Fcy (Fc gamma). Una molécula con una farmacocinética similar a la de YTE, pero con una función efectora potenciada, puede ser útil para determinadas aplicaciones terapéuticas. Sorprendente y ventajosamente, N3 presenta propiedades biológicas adicionales (en comparación con YTE) de gran interés, además del aumento observado de la semivida sérica. Por ejemplo, N3 sigue siendo totalmente capaz de unirse a ligandos de Fc tales como FcYRIIa y C1q. Potencialmente, N3 puede presentar una función efectora incluso mejor que la de la IgG1 de tipo silvestre. N3 presenta además actividad de destrucción opsonofagocítica (OPK) completa y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Más generalmente, N3 parece presentar propiedades farmacológicas que son similares o mejores con respecto a la IgG de tipo silvestre en experimentos realizados en ratones HuFcRn y macacos de la India, presentando al mismo tiempo una semivida in vivo sustancialmente más larga (véase el Ejemplo I). Por tanto, N3 puede ser una alternativa útil a YTE en contextos clínicos en los que se desea una función efectora normal, tal como en anticuerpos monoclonales antibacterianos que dependen de la destrucción opsonofagocítica para ser eficaces.
Varios otros casos del dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), incorporan un motivo CXXHXC (SEQ ID NO: 21) en la región de bucle His435 en los restos 432-437 de IgG1, o un motivo Cx XhXCE (SEQ ID NO: 22) en los restos 432-437*, motivos que caracterizan N3E-YTE y N3-YTE, respectivamente. Estos casos generalmente presentan una mayor dependencia del pH de la afinidad de unión por FcRn, y/o semividas in vivo más largas que N3E-YTE y N3-YTE, y normalmente pertenecen al cuadrante I en el gráfico que se muestra en la Fig. 2B. La dependencia aumentada del pH se manifiesta generalmente por una afinidad de unión reducida por FcRn a pH 7,4 (es decir, una KDpH7 mayor para la unión a FcRn) y una afinidad de unión mayor por FcRn a pH 6,0 (es decir, una KDpH6 menor para la unión a FcRn). Como se ha señalado anteriormente, la región de bucle His435 en N3E-YTE (Cys-Ser-Trp-His-Leu-Cys-Glu; SEQ ID NO: 16) tiene sustituciones hidrófobas en los restos 434 (Trp) y 436 (Leu). En algunos casos que presentan una mayor dependencia del pH, al menos uno de los restos 433, 434 y 436 se sustituye por un resto con carga positiva. En la Tabla 1 se muestran IgG modificadas de ejemplo (por ejemplo, IgG1) que tienen un motivo CXXHXCE (s Eq ID NO: 22) en los restos 432 a 437*, sustituido por un resto con carga positiva en al menos una de las posiciones 433, 434 y 436 y que incorporan una estructura base de YTE, e incluyen casos referidos en el presente documento como YC33-y Te , y C83-YTE, YC37-YTE, YC56-YTE e YC59-YTE. Un motivo para la región de bucle His435 en las posiciones 432-437 es CXRHRC (SEQ ID NO: 13), que al igual que todos los motivos descritos en el presente documento puede incorporarse en una estructura base de tipo silvestre, una estructura base de YTE o cualquier otro dominio constante de IgG mutante o un fragmento de unión a FcRn del mismo.
Otros casos de ejemplo del dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), incorporan el motivo ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) y carecen del resto de cistina que caracteriza al motivo CXXXXC(E) (SEQ ID NO: 9/10). Uno caso de este tipo (por ejemplo, una IgG1) que se muestra en la Tabla 1 se denomina en el presente documento Y31-YTE. Y31-YTE tiene un bucle His435 modificado en las posiciones 432-437 que tiene la secuencia Glu-Arg-Phe-His-Arg-Gln (ERFHRQ; SEQ ID NO: 25) y tiene una semivida extendida en comparación con la IgG1 de tipo silvestre. Otros casos que se muestran en la Tabla 1 que presentan una dependencia del pH aumentada incluyen Y3-YTE e Y12-YTE, caracterizados por bucles His435 modificados en las posiciones 432-437 de Glu-Arg-Tyr-His-Thr-Gln (ERYHTQ; SEQ ID NO: 26) y Glu-Ala-Trp-His-Arg-Gln (EAWHRQ; SEQ ID NO: 27), respectivamente. Otros casos que se muestran en la Tabla 1 con una dependencia del pH aumentada incluyen Y37-YTE, Y9-YTE e Y83-YTE, caracterizados por bucles His435 modificados en las posiciones 432-437 de His-Arg-Phe-His-Leu-Gln (HRFHLQ; SEQ ID NO: 28), Glu-Ala-Phe-His-Arg-Glu (EAFHRE; SEQ ID NO: 29) y Glu-Pro-Tyr-His-Arg-Glu (EPYHRE; SEQ ID NO:37), respectivamente.
Como se describe en detalle en los Ejemplos, a continuación, algunos de los dominios constantes de IgG modificada que se evaluaron en la IgG anti-CD20 (HB20.3) se sometieron a ensayo además en motavizumab, para evaluar la unión a FcRn en el contexto de un dominio variable diferente. Los dominios constantes de IgG modificada presentes en determinados mutantes basados en la estructura base del dominio constante de IgG YTE, es decir, N3E-YTE, Y3-YTE, Y12-YTE, Y31-YTE, así como determinados mutantes basados en la estructura base del dominio constante de IgG1 de tipo silvestre, es decir, N3, Y12 e Y31, se sometieron a ensayo en motavizumab. Se comprobó que la afinidad de unión del dominio constante de IgG hacia FcRn a pH 6,0 de unión era en gran medida la misma que en la IgG anti-CD20. El efecto de la estructura base de "YTE" también se sometió a ensayo en el motavizumab. Las propiedades farmacocinéticas de Mota-Y12-YTE y Mota-Y31-YTE se compararon con las de Mota-Y12-WT y Mota Y31-WT, respectivamente (el motavizumab aporta el dominio variable). Se observó una afinidad de unión potenciada hacia FcRn a pH 6,0 y una dependencia del pH de la afinidad de unión, lo que sugiere que tanto YTE como la región de bucle H435 afectan a la dependencia del pH de la unión a FcRn. También se evaluaron las velocidades de aclaramiento sérico en un modelo de ratón utilizando motavizumab. La mayoría de las IgG evaluadas se aclararon del suero con relativa lentitud, lo que sugiere un reciclaje potenciado a través de la unión a FcRn. Sin embargo, la IgG que tenía la mutación N3E-YTE, que tiene una dependencia del pH más reducida en su afinidad de unión por FcRn, se eliminó rápidamente del suero. Para muchas aplicaciones terapéuticas, un aclaramiento sérico reducido (más lento) es beneficioso, sin embargo, para algunas aplicaciones terapéuticas y muchas aplicaciones de diagnóstico, se prefiere un aclaramiento más rápido, como se describe con más detalle en otra parte del presente documento. Estos datos sugieren que la afinidad de unión del dominio constante de IgG por FcRn a pH 7,4 puede ser un determinante importante en las semividas séricas y las velocidades de aclaramiento para las IgG. La unión estrecha a FcRn a pH 7,4 (por ejemplo, KD de 25 nM) para N3E-YTE se asoció a velocidades de aclaramiento sérico rápidas. Sin embargo, a medida que la KD a pH 7,4 disminuía por debajo de 1 uM a pH 7,4, la IgG comenzaba a presentar una semivida potenciada y velocidades de aclaramiento más lentas.
Las modificaciones de aminoácidos pueden realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica y muchos de estos métodos son bien conocidos y rutinarios para el experto. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, las sustituciones, supresiones e inserciones de aminoácidos pueden realizarse utilizando cualquier técnica bien conocida basada en PCR. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse mediante mutagénesis dirigida al sitio (véase, por ejemplo, Zoller y Smith, Nucl. Acids Res. 10: 6487-6500, 1982; Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 488, 1985). Los mutantes que dan lugar como resultado una afinidad aumentada por FcRn y una semivida in vivo aumentada pueden cribarse fácilmente utilizando ensayos bien conocidos y rutinarios, tales como los descritos en el presente documento. Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en uno o más restos del dominio constante de IgG o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), y los dominios constantes mutados o los fragmentos pueden expresarse en las superficies de bacteriófagos, que después se criban para determinar la afinidad de unión a FcRn aumentada.
Una vez generado, un dominio constante de IgG mutado, o un fragmento del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), puede utilizarse en la construcción de una IgG (por ejemplo, mediante fusión con las porciones variables de un anticuerpo de interés) o una molécula de fusión de Fc (por ejemplo, mediante fusión/conjugación de un resto heterólogo). Una molécula de fusión de Fc o IgG modificada de la divulgación puede generarse mediante métodos bien conocidos por un experto en la materia. Brevemente, dichos métodos incluyen, pero sin limitación, combinar una región variable con la especificidad deseada (por ejemplo, una región variable aislada de una biblioteca de expresión o presentación en fagos o derivada de un anticuerpo humano o no humano) con una región constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn de la misma (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc) que tiene una semivida alterada como se proporciona en el presente documento. Como alternativa, un experto en la materia puede generar una molécula de fusión de Fc o IgG modificada de la divulgación sustituyendo al menos un resto de aminoácido en la región Fc de un anticuerpo o molécula de fusión de Fc.
Además de afectar a la semivida, las modificaciones de aminoácidos descritas en el presente documento pueden alterar (es decir, aumentar o reducir) la biodisponibilidad (por ejemplo, el transporte a las superficies mucosas, u otros tejidos diana) de las moléculas, en particular, altera (es decir, aumenta o reduce) el transporte (o la concentración o la semivida) de la molécula a las superficies mucosas (por ejemplo, de los pulmones) u otras porciones de un tejido diana. En algunos casos, las modificaciones de aminoácidos alteran (por ejemplo, aumentan o reducen) el transporte o la concentración o la semivida de la molécula a los pulmones. En algunos casos, las modificaciones de aminoácidos alteran (por ejemplo, aumentan o reducen) el transporte (o la concentración o la semivida) de la molécula al corazón, páncreas, hígado, riñón, vejiga, estómago, intestino grueso o delgado, tracto respiratorio, ganglios linfáticos, tejido nervioso (tejido nervioso central y/o periférico), músculo, epidermis, hueso, cartílago, articulaciones, vasos sanguíneos, médula ósea, próstata, ovario, útero, tumor o tejido canceroso, etc.
En algunos casos, las modificaciones de aminoácidos no suprimen, o no alteran, una o más funciones efectoras inmunitarias o de unión a receptores del dominio constante, por ejemplo, pero sin limitarse a la fijación del complemento, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o la unión a uno o más receptores de Fc gamma tales como FcyRI, FcyRII y FcyRIII. Las IgG modificadas y otras moléculas de la divulgación pueden evaluarse para determinar a su función efectora utilizando métodos bien conocidos y rutinarios en la técnica.
En algunos casos, el fragmento de unión a FcRn modificado del dominio constante no contiene secuencias que medien en las funciones efectoras inmunitarias o en la unión a otros receptores. Dichos fragmentos pueden ser particularmente útiles para la conjugación con una molécula no IgG o no inmunoglobulina para aumentar la semivida in vivo de la misma. En algunos casos, las funciones efectoras se alteran selectivamente (por ejemplo, para reducir o aumentar las funciones efectoras).
Más generalmente, la divulgación proporciona IgG modificadas muy adecuadas para diversos fines diagnósticos y terapéuticos. La divulgación proporciona IgG modificadas que presentan niveles variables de dependencia del pH de su unión a FcRn. Los diferentes niveles de dependencia del pH pueden dar como resultado diferentes propiedades farmacocinéticas o pueden correlacionarse con ellas, lo que a su vez produce IgG modificadas que son más adecuadas para algunos fines que para otros.
Por ejemplo, algunas de las IgG modificadas descritas en el presente documento presentan una afinidad de unión alta a FcRn a pH 6,0 junto con un nivel alto de dependencia del pH en su unión a FcRn, y un aumento observado de la semivida in vivo. Las IgG modificadas de este aspecto de la divulgación tienen utilidad, por ejemplo, cuando se emplean como agentes terapéuticos en aplicaciones en donde es deseable una semivida in vivo más larga. Opcionalmente, la IgG modificada presenta asimismo otras propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como la capacidad retenida o potenciada para interactuar con Fc-ligandos, tales como los receptores de Fcy y C1q, una sólida actividad de destrucción opsonofagocítica (OPK) y la capacidad de mediar en funciones efectoras de Fc (por ejemplo, CDC, ADCC).
Por el contrario, algunas de las IgG modificadas descritas en el presente documento presentan una afinidad de unión alta a FcRn a pH 6,0 junto con un nivel inferior de dependencia del pH en su unión a FcRn (normalmente como resultado de una afinidad potenciada por FcRn a pH 7,4), y una disminución observada de la semivida in vivo. Las IgG modificadas de este aspecto de la divulgación tienen utilidad, por ejemplo, cuando se emplean como agentes terapéuticos en aplicaciones en donde es deseable una semivida in vivo más corta, tal como en el tratamiento de determinadas afecciones autoinmunitarias. También pueden ser adecuadas para aplicaciones de diagnóstico, tal como cuando se utilizan como agente de formación de imágenes biológicas, donde se desea un aclaramiento rápido de los fluidos corporales o del tejido.
Otro aspecto de la divulgación se dirige a mejorar la eficacia de las IgG terapéuticas y de diagnóstico que se han modificado por ingeniería para la unión dependiente del pH a su antígeno. Pueden utilizarse anticuerpos para inactivar dianas o antígenos mediante la unión a los mismos con gran afinidad. Después, el complejo anticuerpo-antígeno se aclara de la circulación. El aclaramiento mediado por anticuerpos puede mejorarse mediante la ingeniería en la unión a antígeno dependiente del pH, de manera que el antígeno se una más estrechamente a un pH más alto (pH 7,4) y menos estrechamente a un pH más bajo (pH 6), permitiendo que el antígeno se libere y se degrade en el entorno ácido del endosoma.
La ingeniería en la dependencia del pH de la unión del dominio constante de IgG a FcRn puede ser ventajosa para las inmunoglobulinas que presentan de forma natural, o que se han modificado por ingeniería para presentar, dependencia del pH para la unión a antígeno. Las inmunoglobulinas que se han modificado por ingeniería para aclarar más rápidamente los antígenos del suero o del tejido por medio de alteraciones en la dependencia del pH de la unión al antígeno al sitio de unión del antígeno de la inmunoglobulina, pueden mejorarse adicionalmente incorporando un dominio constante de IgG modificada de unión por pH, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc) (por ejemplo, el Fc modificado por ingeniería de unión por pH que se muestra en el cuadrante I de la Figura 2A y B). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se sugiere que una IgG modificada que presenta una unión a antígeno dependiente del pH a la región variable, donde la unión a antígeno a pH ácido (por ejemplo, 6) se reduce significativamente con respecto a la unión a pH neutro (por ejemplo, 7,4), y un Fc modificado por ingeniería de unión por pH, donde la afinidad de unión por FcRn tanto a pH 7,4 como a pH 6,0 aumenta con respecto a la IgG1 de tipo silvestre, podría aclarar el antígeno más rápidamente y de manera más persistente en comparación con una IgG1 de tipo silvestre. La unión a Fc y FcRn mejorada al pH neutro potencia la presencia del anticuerpo en la superficie celular y da como resultado que el antígeno se una a la IgG en la superficie celular. Por tanto, el anticuerpo arrastra más eficazmente a los antígenos hacia el endosoma; (Fig. 9B), donde la afinidad de unión por el antígeno disminuye, dando como resultado una liberación y degradación más rápidas. La unión de alta afinidad de Fc a FcRn a pH ácido conduce al reciclaje de la IgG sin antígeno de vuelta a la superficie celular o al suero para unirse y aclarar más antígeno. Esta estrategia combina la unión IgG-antígeno dependiente del pH (región variable) con el dominio constante de IgG modificada por ingeniería de unión por pH a FcRn. Un ejemplo de una IgG modificada de este aspecto de la divulgación es una IgG que se ha modificado por ingeniería para la unión dependiente del pH de su antígeno, así como que se ha modificado por ingeniería para incluir la N3-YTE o el dominio constante de IgG n 3e -YTE (Tabla 1).
Las moléculas de inmunoglobulina modificadas de la divulgación incluyen moléculas de IgG que contienen de forma natural un dominio de unión a FcRn, así como otras inmunoglobulinas no IgG (por ejemplo, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) o fragmentos de inmunoglobulinas que se han modificado por ingeniería para que contengan un fragmento de unión a FcRn (es decir, proteínas de fusión que comprenden inmunoglobulina no IgG o un fragmento de la misma y un dominio de unión a FcRn, tal como una región Fc o una región Fc bisagra). En ambos casos, el dominio de unión a FcRn tiene una o más modificaciones de aminoácidos que aumentan la afinidad del fragmento de dominio constante por FcRn a pH 6,0 y, opcionalmente, afectan (aumentan o reducen) la dependencia del pH de la unión a FcRn.
Los dominios constantes de IgG modificada de la divulgación se sometieron a ensayo en diversas inmunoglobulinas, tales como IgG anti-CD20 Hb20.3 y motavizumab, como se describe con más detalle en los Ejemplos. Un experto en la materia reconocerá que el dominio constante de IgG modificada, o el fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), de la divulgación puede por tanto incorporarse fácilmente a cualquier inmunoglobulina u otra molécula para proporcionar a la inmunoglobulina modificada u otra molécula propiedades farmacocinéticas potenciadas.
Las inmunoglobulinas modificadas incluyen cualquier molécula de inmunoglobulina que se una (preferentemente, de forma inmunoespecífica, es decir, que compita con la unión inespecífica, como se determina mediante inmunoensayos bien conocidos en la técnica para someter a ensayo la unión específica antígeno-anticuerpo) a un antígeno y que contenga un fragmento de unión a FcRn. Dichos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, multiespecíficos, humanos, humanizados, quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 , Fv unidos por disulfuro y fragmentos que contienen un dominio VL o VH o incluso una región determinante de la complementariedad (CDR) que se une específicamente a un antígeno, en determinados casos, modificados por ingeniería para contener o fusionarse con un dominio de unión a FcRn.
Las moléculas de IgG de la divulgación, y los fragmentos de unión a FcRn de las mismas, son en determinados casos, la subclase IgG1 de IgG, pero también pueden ser cualquier otra subclase de IgG de animales dados. Por ejemplo, en los seres humanos, la clase IgG incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En los casos de la divulgación basados en la IgG3 humana, debe tenerse en cuenta que la secuencia de aminoácidos de la región de bucle His435 (posiciones 432-437) de la IgG3 humana no está totalmente conservada con respecto a la IgG1, IgG2 e IgG4 humanas, teniendo restos no conservados en las posiciones 435 y 436 de arginina (R) y fenilalanina (F), respectivamente (LHNRFT; SEQ ID NO: 7, Fig. 1D) y, además, se sabe que presenta una variación alélica en las posiciones 435 y 436 (Fig. 1D, asteriscos). En vista de las variaciones conocidas, un experto en la materia reconocerá que puede ser ventajoso sustituir la histidina en la posición 435 (R435H) y/o la tirosina en la posición 436 (F436Y) en el dominio CH3 de IgG3 en las moléculas de la divulgación.
Las inmunoglobulinas (y otras proteínas utilizadas en el presente documento) pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. Los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, humanos, de roedores (por ejemplo, de ratones y ratas), de burros, de ovejas, de conejos, de cabras, de cobayas, de camellos, de caballos o de pollos. Como se utiliza en el presente documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe a continuación, y, por ejemplo, en la Patente de los e E.UU. N.° 5.939.598 de Kucherlapati et al.
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido o pueden ser específicos para epítopos heterólogos, tales como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol., 147: 60-69, 1991; las Patentes de los EE.UU. N.° 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553, 1992.
Los anticuerpos de la divulgación incluyen derivados que se modifican de otra manera, es decir, por unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de manera que la unión covalente no impida que el anticuerpo se una al antígeno y/o genere una respuesta anti-idiotípica. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede realizarse mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitación, la escisión química específica, la acetilación, la formilación, la síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica incluyendo el uso de hibridoma, tecnologías recombinantes y de presentación de fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma, incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed.
1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, págs. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986); Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987). La expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no el método por el cual se produce.
En la técnica se conocen bien y son rutinarios métodos para producir y cribar anticuerpos específicos usando tecnología de hibridoma. En un ejemplo no limitante, los ratones pueden ser inmunizados con un antígeno de interés o una célula que exprese un antígeno de este tipo. Una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero del ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. Después, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada. Los hibridomas se seleccionan y clonan por dilución limitante. Después, los clones de hibridoma se someten a ensayo mediante métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno. El líquido ascítico, que generalmente contiene niveles altos de anticuerpos, puede generarse inoculando por vía intraperitoneal a los ratones clones de hibridoma positivos.
Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como la papaína (para producir fragmentos Fab) o la pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la cadena ligera completa y la región variable, la región CH1 y la región bisagra de la cadena pesada.
Por ejemplo, también pueden generarse anticuerpos utilizando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación de fagos, los dominios de anticuerpo funcional se muestran en la superficie de las partículas de fagos que llevan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. En un caso particular, dichos fagos pueden utilizarse para presentar dominios de unión a antígeno, tales como Fab y Fv o Fv estabilizados por enlace disulfuro, expresados a partir de un repertorio o biblioteca combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). Los fagos que expresan un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, utilizando antígeno marcado o antígeno capturado o unido a una superficie sólida o perla. Los fagos utilizados en estos métodos son normalmente fagos filamentosos, incluyendo fd y M13. Los dominios de unión a antígeno se expresan como una proteína fusionada de forma recombinante a la proteína del gen III o del gen VIII del fago. Como alternativa, la porción de unión a FcRn modificada de las inmunoglobulinas de la presente divulgación puede expresarse también en un sistema de presentación en fagos.
En la técnica se conocen bien y son rutinarios métodos para producir anticuerpos monoclonales utilizando bibliotecas de fagos de anticuerpos. Véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); y Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991). Además de los kits disponibles en el mercado para generar bibliotecas de presentación en fagos (por ejemplo, el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes de Pharmacia, N.° de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación en fagos SURFZAP™ de Stratagene, N.° de catálogo 240612), pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos para su uso en la generación y el cribado de bibliotecas de presentación de anticuerpos, por ejemplo, en las Patentes de los EE.UU. N.° 6.248.516; US 6.545.142; 6.291.158; 6.291.1591; 6.291.160; 6.291.161; 6.680.192; 5.969.108; 6.172.197; 6.806.079; 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.593.081; 6.582.915; 7.195.866. Otros ejemplos de métodos de presentación en fagos que pueden utilizarse para fabricar las inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas, de la presente divulgación incluyen los desvelados en Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods, 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene, 187: 9-18, 1997; Burton et al, Advances in Immunology, 57: 191-280, 1994; la solicitud PCT N.° PCT/GB91/01134; las publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las Patentes de los EE.UU. N.° 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpos de fago pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento deseado, y expresarse en cualquier hospedador deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los desvelados en la Publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869, 1992; y Sawai et al., AJRI, 34: 26-34, 1995; y Better et al., Science, 240: 1041-1043, 1988. Los ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para producir Fv y anticuerpos monocatenarios incluyen los descritos en las Patentes de los EE.UU. N.° 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu et al., PNAS, 90: 7995-7999, 1993; y Skerra et al., Science, 240: 1038-1040, 1988.
Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y los ensayos de detección in vitro, puede ser útil usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes especies animales, tales como los anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante derivada de una inmunoglobulina humana. En la técnica se conocen métodos para producir anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison, Science, 229: 1202, 1985; Oi et al., BioTechniques, 4: 214 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202, 1989; las Patentes de los EE.UU. 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de especies no humanas que se unen al antígeno deseado que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones marco conservadas de una molécula de inmunoglobulina humana. Con frecuencia, los restos armazón en las regiones marco conservadas humanas se sustituirán por el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferentemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones del armazón se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de las CDR y los restos de armazón para identificar los restos de armazón importantes para la unión a antígeno y la comparación de secuencias para identificar los restos de armazón inusuales en posiciones particulares. Véanse, por ejemplo, Queen et al., Patente de los EE.UU. N.° 5.585.089; Riechmann et al., Nature, 332: 323, 1988. Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica incluyendo, por ejemplo, el injerto de CDR (documento EP 239.400; Publicación PCT WO 91/09967; Patentes de los EE.UU. N.° 5.225.539; 5.530.101 y 5.585.089), el recubrimiento o acondicionamiento (documento EP 592.106; documento EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5): 489-498, 1991; Studnicka et al, Protein Engineering, 7(6): 805-814, 1994; Roguska et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91: 969-973, 1994) y el intercambio de cadenas (Patente de los EE.UU. N.° 5.565.332). La humanización puede realizarse siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., citado anteriormente; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Específicamente, los anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo enfoques de injerto de CDR (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 6.548.640), revestimiento o acondicionamiento (Patente de los EE.UU. N.° 5.639.641 y 6.797.492; Studnicka et al, Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91: 969-973 (1994)), estrategias de intercambio de cadenas (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 5.565.332; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 8910-8915), estrategias de modelado molecular (Patente de los EE.UU. N.° 5.639.641), y similares. Estos enfoques generales pueden combinarse con técnicas convencionales de mutagénesis y síntesis recombinante para producir anticuerpos humanizados monoméricos con las propiedades deseadas.
Los anticuerpos totalmente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden fabricarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de presentación en fagos descritos anteriormente, utilizando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véanse las Patentes de los EE.UU. N.° 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741.
Los anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Para una visión general de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol., 13: 65-93, 1995. Para un análisis detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; la Patente europea N.° 0598 877; las Patentes de los EE.UU. N.° 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Véase también Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); las Pat. de los EE.UU. N.° 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); la Pat. de los EE.UU. N.° 5.545.807; y el documento WO 97/17852. Se ha descrito el uso de cepas de ratones XENOMOUSE® para la producción de anticuerpos humanos. Véanse Méndez et al. Nature Genetics 15: 146­ 156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998). Las cepas XENOMOUSE® están disponibles en Amgen, Inc. (Fremont, California). La producción de las cepas de ratones XENOMOUSE® y los anticuerpos producidos en esos ratones se analizan adicionalmente en las Patentes de los EE.UU. N.° 6.673.986; 7.049.426; 6.833.268; 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181, 6.657.103; 6.713.610 y 5.939.598; y las Publicaciones de los EE.UU. N.° 2004/0010810; 2003/0229905; 2004/0093622; 2005/0054055; 2005/0076395; y 2006/0040363. En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque "minilocus". Este enfoque se describe en las Pat. de los EE.UU. N.° 5.545.807; 5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; 5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.877.397; 5.874.299; 6.255.458; 5.591.669; 6.023.010; 5.612.205; 5.721.367; 5.789.215; 5.643.763; y 5.981.175. Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que se han introducido trozos grandes de cromosomas, o cromosomas enteros, mediante fusión de microcélulas. Véase la Patente N.° 6.632.976. Adicionalmente, se han generado ratones KM™, que son el resultado del cruce de ratones Tc de Kirin con ratones minilocus (Humab) de Medarex. Estos ratones poseen el transcromosoma de IgH humana de los ratones Kirin y el transgén de la cadena kappa de los ratones Genpharm (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4: 91-102). Los anticuerpos humanos también pueden obtenerse mediante métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen, pero sin limitación, la presentación en fagos (Medlmmune (anteriormente CAT), Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed), la presentación en ribosomas (Medlmmune (anteriormente CAT)), la presentación en levadura, y similares. La tecnología de presentación en fagos (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 5.969.108) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios génicos de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. La presentación en fagos puede realizarse en diversos formatos, revisados en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Pueden utilizarse varias fuentes de segmentos génicos V para la presentación en fagos. Véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993); y las Pat. de los EE.UU. N.° 5.565.332 y 5.573.905. Como se ha analizado anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B activadas in vitro (véanse las Pat. de los EE.UU. N.° 5.567.610 y 5.229.275). Además, pueden contratarse empresas tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA), Medarex (NJ) y Genpharm (San José, CA) para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando una tecnología similar a la descrita anteriormente.
Pueden generarse anticuerpos totalmente humanos que reconocen un epítopo seleccionado mediante una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque se utiliza un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo totalmente humano que reconozca el mismo epítopo. (Jespers et al., Bio/Technology, 12: 899-903, 1988).
En casos particulares, los anticuerpos modificados tienen usos terapéuticos y/o profilácticos in vivo. Los ejemplos de anticuerpos terapéuticos y profilácticos que pueden modificarse de este modo incluyen, pero sin limitación, SYNAGIS® (Medlmmune, MD), que es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-virus respiratorio sincitial (VRS) para el tratamiento de pacientes con infección por VRS; HERCEPTIN® (Trastuzumab) (Genentech, CA), que es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER2 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico; REMICADE® (infliximab) (Centocor, PA) que es un anticuerpo monoclonal quimérico anti-TNFa para el tratamiento de pacientes con la enfermedad de Crone; REOPRO® (abciximab) (Centocor) que es un anticuerpo anti-receptor de glicoproteína 11b/111a en las plaquetas para la prevención de la formación de coágulos; ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suiza) que es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD25 inmunosupresor para la prevención del rechazo agudo del aloinjerto renal. Otros ejemplos son un F(ab')2 humanizado anti-CD18 (Genentech); CDP860, que es un F(ab')2 humanizado anti-CD18 (Celltech, Reino Unido); PRO542, que es un anticuerpo anti-gp120 de VIH fusionado con CD4 (Progenics/Genzyme Transgenics); Ostavir, que es un anticuerpo humano contra el virus de la hepatitis B (Protein Design Lab/Novartis); PROTOVIR™, que es un anticuerpo IgG1 humanizado anti-CMV (Protein Design Lab/Novartis); MAK-195 (SEGARD), que es un F(ab')2 murino anti-TNF-a (Knoll Pharma/BASF); IC14, que es un anticuerpo anti-CD 14 (ICOS Pharm); un anticuerpo IgG1 humanizado anti-VEGF (Genentech); OVAREX™ que es un anticuerpo murino anti-CA 125 (Altarex); PANOREX™ que es un anticuerpo IgG2a murino anti-17-IA de superficie celular (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2, que es un anticuerpo IgG murino anti-idiotipo (epítopo GD3) (ImClone System); IMC-C225, que es un anticuerpo IgG quimérico anti-EGFR (ImClone System); VITAXIN™, que es un anticuerpo humanizado anti-integrina aVp3 (Applied Molecular Evolution/MedImmune); Campath 1H/LDP-03 que es un anticuerpo IgG1 humanizado anti CD52 (Leukosite); Smart M195 que es un anticuerpo humanizado anti-CD33 IgG (Protein Design Lab/Kanebo); RITUXAN™ que es un anticuerpo IgG1 quimérico anti-CD20 (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); LYMPHOCIDE™ que es un anticuerpo IgG humanizado anti-CD22 (Immunomedics); Smart ID10 que es un anticuerpo humanizado anti-HLA (Protein Design Lab); ONCOLYM™ (Lym-1) es un anticuerpo murino anti-HLA marcado radiactivamente (Techniclone); ABX-IL8 es un anticuerpo humano anti-IL8 (Abgenix); anti-CD 11a es un anticuerpo IgG1 humanizado (Genetech/Xoma); ICM3 es un anticuerpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 es un anticuerpo primatizado anti-CD80 (IDEC Pharm/Mitsubishi); ZEVALIN™ es un anticuerpo murino anti-CD20 radiomarcado (IDEC/Schering AG); IDEC-131 es un anticuerpo humanizado anti-CD40L (IDEC/Eisai); IDEC-151 es un anticuerpo primatizado anti-CD4 (Id Ec ); IDEC-152 es un anticuerpo primatizado anti-CD23 (IDEC/Seikagaku); SMART anti-CD3 es un IgG humanizado anti-CD3 (Protein Design Lab); 5G1.1 es un anticuerpo humanizado anti-factor 5 del complemento (C5) (Alexion Pharm); D2E7 es un anticuerpo humanizado anti-TNF-a (CAT/BASF); CDP870 es un fragmento Fab humanizado anti-TNF-a (Celltech); IDEC-151 es un anticuerpo primatizado anti-CD4 IgG1 (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 es un anticuerpo IgG humano anti-CD4 (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 es un anticuerpo IgG4 humanizado anti-TNF-a (Celltech); LDP-02 es un anticuerpo humanizado anti-a4p7 (LeukoSite/Genentech); OrthoClone OKT4A es un anticuerpo IgG humanizado anti-CD4 (Ortho Biotech); ANTOVA™ es un anticuerpo IgG humanizado anti-CD40L (Biogen); ANTEGREN™ es un anticuerpo IgG humanizado anti-VLA-4 (Elan); MDX-33 es un anticuerpo humano anti-CD64 (FcyR) (Medarex/Centeon); SCH55700 es un anticuerpo IgG4 humanizado anti-IL-5 (Celltech/Schering); SB-240563 y SB-240683 son anticuerpos humanizados anti-IL-5 e IL-4, respectivamente, (SmithKline Beecham); rhuMab-E25 es un anticuerpo IgG1 humanizado anti-IgE (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems); IDEC-152 es un anticuerpo primatizado anti-CD23 (IDEC Pharm); ABX-CBL es un anticuerpo IgM murino anti CD-147 (Abgenix); BTI-322 es un anticuerpo IgG de rata anti-CD2 (Medimmune/Bio Transplant); Orthoclone/OKT3 es un anticuerpo IgG2a murino anti-CD3 (ortho Biotech); SIMULECT™ es un anticuerpo IgG1 quimérico anti-CD25 (Novartis Pharm); LDP-01 es un anticuerpo IgG humanizado anti-p2-integrina (LeukoSite); Anti-LFA-1 es un F(ab')2 murino anti CD18 (Pasteur-Merieux/Immunotech); CAT-152 es un anticuerpo humano anti-TGF-p2 (Cambridge Ab Tech); vitaxin un anticuerpo anti-avp3; y Corsevin M es un anticuerpo quimérico anti-Factor VII (Centocor).
Las IgG modificadas de la presente divulgación también pueden incluir IgG cuyos sitios bioactivos, tales como los sitios de unión a antígenos, los sitios de unión Fc-receptor o los sitios de unión al complemento, se modifican mediante ingeniería genética para aumentar o reducir dichas actividades en comparación con el tipo silvestre.
La presente divulgación también proporciona proteínas de fusión que comprenden una molécula bioactiva y un dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), que tiene una o más modificaciones (es decir, sustituciones, supresiones o inserciones) en o cerca de restos de aminoácidos en la región His435 (restos 432-437) como se identifica en el presente documento. La molécula bioactiva puede fusionarse de forma recombinante o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con el dominio constante de IgG modificada o con el fragmento de unión a FcRn del mismo. Opcionalmente, el dominio constante de IgG modificada o el fragmento de unión a FcRn del mismo puede contener una modificación adicional, tal como modificaciones en el dominio CH2 en uno o más de entre los restos de aminoácidos 251-256, 285­ 290, y/o los restos de aminoácidos 308-314, y/o modificaciones en el dominio CH3 en uno o más de los restos de aminoácidos 385-389 y/o 428-431. La fusión de una molécula bioactiva con un dominio constante o un fragmento del mismo con una o más de dichas modificaciones aumenta la semivida in vivo de la molécula bioactiva.
La presente divulgación también proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de IgG modificada de la divulgación o un fragmento de unión a FcRn del mismo (por ejemplo, una región Fc o una región bisagra-Fc), así como vectores que comprenden dichos polinucleótidos. En determinados casos, el polinucleótido codifica una inmunoglobulina, por ejemplo, una IgG, que incluye un dominio constante de IgG modificada o un fragmento de unión a FcRn del mismo. En casos alternativos, el polinucleótido codifica una proteína de fusión que comprende una molécula bioactiva y un dominio constante de IgG modificada, o un fragmento de unión a FcRn del mismo.
Además, la divulgación incluye polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación estrictas o menos estrictas con polinucleótidos que codifican IgG modificadas y proteínas de fusión de la presente divulgación.
La secuencia de nucleótidos de las IgG modificadas y los polinucleótidos que codifican las mismas pueden obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo el método general de secuenciación del ADN, tal como el método de terminación de la cadena didesoxi (secuenciación Sanger) y el cebado de oligonucleótidos en combinación con PCR, respectivamente.
Identificación de mutaciones
Las modificaciones de aminoácidos en la región His435 del dominio constante de IgG como se describen en el presente documento pueden introducirse utilizando cualquier técnica conocida por los expertos en la materia. El dominio constante o el fragmento del mismo que tenga una o más modificaciones en los restos de aminoácidos 432-437 (o en otros emplazamientos del dominio constante de IgG, o del fragmento de unión a FcRn del mismo) puede cribarse mediante, por ejemplo, un ensayo de unión para identificar el dominio constante o el fragmento del mismo con afinidad aumentada por el receptor FcRn (como se describe con más detalle a continuación). Aquellas modificaciones en el dominio bisagra-Fc o en los fragmentos del mismo que aumenten la afinidad del dominio constante o del fragmento del mismo por el receptor FcRn pueden introducirse en los anticuerpos para aumentar las semividas in vivo de dichos anticuerpos. Además, aquellas modificaciones en el dominio constante o en el fragmento del mismo que aumentan la afinidad del dominio constante o del fragmento del mismo por FcRn pueden fusionarse con moléculas bioactivas para aumentar las semividas in vivo de dichas moléculas bioactivas y, opcionalmente, alterar (por ejemplo, aumentar o disminuir) la biodisponibilidad de la molécula, por ejemplo, para aumentar o disminuir el transporte a las superficies mucosas (u otro tejido diana) (por ejemplo, los pulmones).
Mutagénesis
La mutagénesis puede realizarse de acuerdo con cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, la síntesis de un oligonucleótido que tiene una o más modificaciones dentro de la secuencia del dominio constante de un anticuerpo o un fragmento del mismo (por ejemplo, el dominio CH2 o CH3) que ha de modificarse. La mutagénesis específica de sitio permite la producción de mutantes mediante el uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebadores de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable a ambos lados de la unión de supresión que se atraviesa. Un cebador de ejemplo tiene de aproximadamente 17 a aproximadamente 75 nucleótidos o más de longitud, con aproximadamente 10 a aproximadamente 25 o más restos a ambos lados de la unión de la secuencia que se altera. Para generar una biblioteca de mutantes puede utilizarse varios de dichos cebadores que introducen diversas mutaciones diferentes en una o más posiciones. La técnica de mutagénesis específica de sitio es bien conocida en la técnica, como se ejemplifica en diversas publicaciones (véase, por ejemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol., 154: 367-82, 1987). En general, la mutagénesis dirigida al sitio se realiza obteniendo en primer lugar un vector monocatenario o fundiendo dos cadenas de un vector bicatenario que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado. Se prepara un cebador oligonucleotídico que porta la secuencia mutada deseada, generalmente de forma sintética. Después, este cebador se hibrida con el vector monocatenario y se somete a enzimas de polimerización del ADN, tal como la ADN polimerasa T7, para completar la síntesis de la cadena que porta la mutación. Por tanto, se forma un heterodúplex en donde una cadena codifica la secuencia original no mutada y la segunda porta la mutación deseada. Este vector heterodúplex después se utiliza para transformar o transfectar células apropiadas, tales como células de E. coli, y se seleccionan los clones que incluyen vectores recombinantes que portan la disposición de la secuencia mutada. Como se apreciará, la técnica normalmente emplea un vector fágico que existe tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos están disponibles en el mercado y su uso es generalmente bien conocido por los expertos en la materia. También se emplean plásmidos bicatenarios rutinariamente en la mutagénesis dirigida al sitio, que elimina la etapa de transferir el gen de interés de un plásmido a un fago.
Como alternativa, el uso de PCR™ con enzimas termoestables disponibles en el mercado tales como la ADN polimerasa Taq, puede utilizarse para incorporar un cebador oligonucleotídico mutagénico en un fragmento de ADN amplificado que después puede clonarse en un vector de clonación o expresión apropiado. Véase, por ejemplo, Tomic et al., Nucleic Acids Res., 18(6): 1656, 1987, y Upender et al., Biotechniques, 18(1): 29-30, 32, 1995, para consultar procedimientos de mutagénesis mediada por PCR™. También puede utilizarse la PCR™ que emplea una ligasa termoestable además de una polimerasa termoestable para incorporar un oligonucleótido mutagénico fosforilado en un fragmento de ADN amplificado que puede clonarse después en un vector de clonación o de expresión apropiado (véase, por ejemplo, Michael, Biotechniques, 16(3): 410-2, 1994).
Pueden utilizarse otros métodos conocidos por los expertos en la materia para producir variantes de secuencia del dominio Fc de un anticuerpo o de un fragmento del mismo. Por ejemplo, pueden tratarse vectores recombinantes que codifican la secuencia de aminoácidos del dominio constante de un anticuerpo o un fragmento del mismo con agentes mutagénicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia.
Selección
Los vectores, en particular, los fagos, que expresan dominios constantes o fragmentos de los mismos que tienen una o más modificaciones en los restos de aminoácidos 432-437 u otros emplazamientos, pueden cribarse para identificar dominios constantes o fragmentos de los mismos que tengan una afinidad aumentada por FcRn para seleccionar los ligantes de mayor afinidad de una población de fagos. Los inmunoensayos que pueden utilizarse para analizar la unión del dominio constante o un fragmento del mismo que tiene una o más modificaciones en los restos de aminoácidos 432­ 437 u otros emplazamientos a FcRn incluyen, pero sin limitación, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sándwich" e inmunoensayos fluorescentes. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). A continuación en el presente documento se describen brevemente inmunoensayos de ejemplo (pero no se pretende que sea a modo de limitación). También puede utilizarse el análisis cinético BIAcore para determinar las velocidades de asociación y disociación de la unión de un dominio constante o de un fragmento del mismo que tenga una o más modificaciones en los restos de aminoácidos 432-437 o en otros emplazamientos a FcRn. El análisis cinético BIAcore comprende el análisis de la unión y la disociación de un dominio constante o de un fragmento del mismo que tenga una o más modificaciones en los restos de aminoácidos 432-437 u otros emplazamientos de chips con FcRn inmovilizado en su superficie.
Secuenciación
Puede utilizarse cualquiera de diversas reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente la secuencia de nucleótidos que codifica los dominios constantes o fragmentos de los mismos que tienen una o más modificaciones en los restos de aminoácidos 432-437 u otros emplazamientos. Los ejemplos de reacciones de secuenciación incluyen los basados en técnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 560, 1977) o Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463, 1977). También se contempla la posibilidad de utilizar cualquiera de diversos procedimientos de secuenciación automatizados (Bio/Techniques, 19:448, 1995), incluyendo la secuenciación por espectrometría de masas (véase, por ejemplo, la Publicación PCT N.° WO 94/16101, Cohen et al., Adv. Chromatogr., 36: 127-162, 1996, y Griffin et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 38: 147-159, 1993).
Métodos recombinantes para producir anticuerpos
Los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o mediante técnicas de expresión recombinante.
La secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo puede obtenerse a partir de cualquier información disponible para los expertos en la materia (es decir, de Genbank, de la bibliografía o mediante clonación rutinaria). Si no se dispone de un clon que contenga un ácido nucleico que codifique un anticuerpo particular o un fragmento de unión a epítopo del mismo, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo o del fragmento de unión a epítopo del mismo, puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico que codifique la inmunoglobulina o puede obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, por ejemplo, poli ARN A+, aislado de cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables con los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación utilizando una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia genética particular identifique, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse después en vectores de clonación replicables utilizando cualquier método bien conocido en la técnica.
Una vez determinada la secuencia nucleotídica del anticuerpo, la secuencia nucleotídica del anticuerpo puede manipularse utilizando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias nucleotídicas, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; y Ausubel et al, ed., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar anticuerpos que tengan una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo, introduciendo sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos en las regiones del dominio de unión a epítopo de los anticuerpos, por ejemplo, en las regiones bisagra-Fc de los anticuerpos que están implicados en la interacción con FcRn. Pueden generarse anticuerpos que tengan una o más modificaciones en los restos de aminoácidos 432-437 u otros emplazamientos.
La expresión recombinante de un anticuerpo requiere la construcción de un vector de expresión que contenga una secuencia de nucleótidos que codifique el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido una secuencia de nucleótidos que codifique una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una porción del mismo (opcionalmente, pero no necesariamente, que contenga la región variable de la cadena pesada o ligera), el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Por tanto, en el presente documento se describen métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo. Para construir vectores de expresión que contengan secuencias codificantes de anticuerpos y señales de control transcripcional y traduccional apropiadas, pueden utilizarse métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo. La divulgación, por tanto, proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo con una o más modificaciones en los restos de aminoácidos implicados en la interacción con FcRn (véase, por ejemplo, la Publicación PCT WO 86/05807; la Publicación PCT WO 89/01036; y la Patente de los EE.UU. N.° 5.122.464). La secuencia nucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada, la región variable de la cadena ligera, tanto la región variable de la cadena pesada como la de la cadena ligera, un fragmento de unión a epítopo de la región variable de la cadena pesada y/o de la cadena ligera, o una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo puede clonarse en un vector de este tipo para su expresión.
El vector de expresión se transfiere a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales y las células transfectadas después se cultivan mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo que tenga una afinidad aumentada por FcRn y una semivida in vivo aumentada. Por tanto, la divulgación incluye células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo, un dominio constante o un fragmento de unión a FcRn del mismo que tiene una o más modificaciones en los restos de aminoácidos 432-437 u otros emplazamientos, opcionalmente unido operativamente a un promotor heterólogo.
Pueden utilizarse diversos sistemas de vectores de expresión del hospedador para expresar las moléculas de anticuerpo de la divulgación. Dichos sistemas de expresión del hospedador representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, pueden expresar una molécula de anticuerpo de la divulgación in situ. Estos incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. co liy B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriófagos recombinantes, ADN plasmídico o vectores de expresión de ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces y Pichia) transformada con vectores de expresión en levadura recombinante que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; y sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3 y NSO) que albergan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, promotor de adenovirus tardío; el promotor del virus vaccinia de 7,5K). Para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante se utilizan células bacterianas, tal como Escherichia coli, y células eucariotas, que son muy adecuadas para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante completa. Por ejemplo, las células de mamífero tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el principal elemento promotor génico temprano intermedio del citomegalovirus humano son un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., Gene, 45: 101, 1986, y Cockett et al., Bio/Technology, 8: 2, 1990).
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se ha de producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO, 12:1791, 1983), en el que la secuencia de codificación del anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en fase con la región codificante de lacZ, de manera que se produce una proteína de fusión; y vectores pIN (Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res., 13: 3101­ 3109, 1985 y Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem., 24: 5503-5509, 1989).
En un sistema de insectos, se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en las células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y ponerse bajo el control de un promotor del AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina).
En las células hospedadoras de mamíferos, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus para expresar una molécula de anticuerpo de la divulgación. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante de anticuerpos de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico después puede insertarse en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en hospedadores infectados (por ejemplo, véase Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 355-359, 1984). Las señales de inicio específicas también pueden ser necesarias para la traducción eficaz de secuencias codificantes de anticuerpos insertadas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de inicio pueden tener diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (véase, por ejemplo, Bitter et al., Methods in Enzymol., 153: 516-544, 1987).
Además, puede elegirse una cepa de células hospedadoras que module la expresión de las secuencias de anticuerpos, o que modifique y procese el anticuerpo de la manera específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteínicos pueden ser importantes para la función del anticuerpo. Las diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccionales de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del anticuerpo expresado. Con este fin, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado de la transcripción primaria, glicosilación y fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero sin limitación CHO, VERY, Bh K, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138 y, en particular, células de mieloma tales como células NS0, y líneas celulares relacionadas, véase, por ejemplo, Morrison et al., Patente de los EE.UU. N.° 5.807.715.
Para la producción de anticuerpos recombinantes a largo plazo y de alto rendimiento, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería líneas celulares que expresen de forma estable la molécula de anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes víricos de replicación, las células hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de introducir el ADN extraño, puede permitirse que las células modificadas por ingeniería crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede utilizarse ventajosamente para modificar por ingeniería líneas celulares que expresen la molécula de anticuerpo. Dichas líneas celulares modificadas por ingeniería pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de composiciones que interactúen directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Pueden utilizarse varios sistemas de selección, incluyendo, pero sin limitación, pueden emplearse los genes de timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler et al, Cell, 11: 223, 1977), la hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 202, 1992) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell, 22: 8-17, 1980) en células tk', hgprt- o aprt, respectivamente. Además, la resistencia a los antimetabolitos puede utilizarse como base de la selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA, 77: 357, 1980 y O'Hare et al., Proc. Acad. Sci. USA, 78: 1527, 1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072, 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu y Wu, Biotherapy, 3: 87-95, 1991; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 573-596, 1993; Mulligan, Science, 260: 926-932, 1993; y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem., 62: 191-217, 1993; y May, TIB TECH, 11(5): 155-215, 1993); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene, 30: 147, 1984). Pueden aplicarse rutinariamente métodos habitualmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (ed.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (ed.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY; y Colberre-Garapin et al, J. Mol. Biol., 150: 1, 1981.
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante la amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, 1987, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. Academic Press, Nueva York). Cuando un marcador en el sistema del vector que expresa anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada se asocia al gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., Mol., Cell. Biol., 3: 257, 1983).
La célula hospedadora puede contransfectarse con dos vectores de expresión de la divulgación, codificando el primer vector un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permitan la expresión por igual de polipéptidos de la cadena pesada y de la cadena ligera o marcadores seleccionables diferentes para garantizar el mantenimiento de ambos plásmidos. Como alternativa, puede utilizarse un único vector que codifique, y sea capaz de expresar, polipéptidos de la cadena tanto pesada como ligera. En dichas situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature, 322: 52, 1986; y Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 2197, 1980). Las secuencias de codificación para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo de la divulgación por expresión recombinante, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la purificación por Proteína A, y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente divulgación o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.
Conjugados de anticuerpo
La presente divulgación abarca anticuerpos fusionados de forma recombinante o conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con polipéptidos heterólogos (es decir, un polipéptido no relacionado; o una porción del mismo, por ejemplo, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos del polipéptido) para generar proteínas de fusión. La fusión no tiene que ser necesariamente directa, sino que puede producirse mediante secuencias enlazadoras. También pueden utilizarse anticuerpos fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT N.° WO 93/21232; el documento EP 439.095; Naramura et al., Immunol. Lett., 39: 91-99, 1994; la Patente de los EE.UU. 5.474.981; Gillies et al., PNAS, 89: 1428-1432, 1992; y Fell et al., J. Immunol., 146: 2446-2452, 1991.
Los anticuerpos pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como el marcador proporcionado en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), pero sin limitación, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 821­ 824, 1989, por ejemplo, la hexahistidina facilita la purificación de la proteína de fusión. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, pero sin limitación, el marcador "HA" de hemaglutinina, que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., Cell, 37: 767 1984) y el marcador "flag" (Knappik et al., Biotechniques, 17(4): 754-761, 1994).
La presente divulgación también abarca anticuerpos conjugados con un agente de diagnóstico o terapéutico o cualquier otra molécula para la que se desee aumentar la semivida in vivo. Los anticuerpos pueden utilizarse para el diagnóstico, por ejemplo, para controlar el desarrollo o la progresión de una enfermedad, un trastorno o una infección como parte de un procedimiento de ensayos clínicas para, por ejemplo, determinar la eficacia de una pauta de tratamiento dada. La detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones y iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse a o conjugarse con el anticuerpo directamente o indirectamente, a través de un intermedio (tal como, pero sin limitación, un enlazador conocido en la técnica) utilizando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como productos diagnósticos de acuerdo con la presente divulgación. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la p-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen la estreptavidina/biotina y la avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen la umbeliferona, la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la diclorotriazinilamina fluoresceína, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen la luciferasa, la luciferina y la aecuorina; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 1251,131I, 111In o 99mTc.
Un anticuerpo puede conjugarse con un resto terapéutico, tal como una citotoxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida), un agente terapéutico o un elemento radiactivo (por ejemplo, emisores alfa, emisores gamma, etc.). Las citotoxinas o agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células.
Además, un anticuerpo puede conjugarse con un agente terapéutico o resto de fármaco que modifique una respuesta biológica dada. No debe interpretarse que los agentes terapéuticos o restos de fármaco estén limitados a los agentes quimioterápicos clásicos. Por ejemplo, el resto del fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada.
Las técnicas para conjugar dichos restos terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas; véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, págs. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2° Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, págs. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (ed.), 1985, págs. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.),1985, págs. 303-16, Academic Press; y Thorpe et al., Immunol. Recombinant expression vector, 62: 119-58, 1982.
Un anticuerpo o un fragmento del mismo, con o sin un resto terapéutico conjugado a él, administrado solo o en combinación con uno o más factores citotóxicos y/o citocinas puede utilizarse como producto terapéutico.
Como alternativa, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como se describe por Segal en la Patente de los EE.UU. N.° 4.676.980.
Los anticuerpos también pueden fijarse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para los inmunoensayos o la purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, pero sin limitación, el vidrio, la celulosa, la poliacrilamida, el nailon, el poliestireno, el cloruro de polivinilo o el polipropileno.
Ensayos in vitro e in vivo para determinar la semivida de dominios constantes de IgG modificada o fragmentos de unión a FcRn de los mismos
La capacidad de las IgG modificadas y de otras moléculas que comprenden un dominio constante de IgG modificada o un fragmento de unión a FcRn del mismo para unirse a FcRn puede caracterizarse mediante diversos ensayos in vitro, incluyendo los ejemplificados en los ejemplos proporcionados en el presente documento. Las publicaciones PCT WO 97/34631 de Ward y WO 02/060919 de Dall'Acqua et al. también desvelan diversos métodos en detalle.
Por ejemplo, para comparar la capacidad de la IgG modificada o los fragmentos de la misma para unirse a FcRn con la de la IgG de tipo silvestre, la IgG modificada o fragmentos de la misma y la IgG de tipo silvestre pueden radiomarcarse y hacerse reaccionar con células que expresan FcRn in vitro. Después, puede contarse y compararse la radiactividad de las fracciones unidas a las células. Las células que expresan FcRn que han de utilizarse para este ensayo pueden ser, por ejemplo, líneas celulares endoteliales, incluyendo las células endoteliales capilares pulmonares de ratón (B10, D2.PCE) derivadas de pulmones de ratones B10.DBA/2 y células endoteliales transformadas con SV40 (SVEC) (Kim et al., J. Immunol., 40: 457-465, 1994) derivadas de ratones C3H/HeJ. Sin embargo, también pueden utilizarse otros tipos de células, tales como los bordes en cepillo intestinales aislados de ratones lactantes de 10 a 14 días de edad, que expresan un número suficiente de FcRn. Como alternativa, también pueden utilizarse células de mamífero que expresen FcRn recombinante de una especie de elección. Después de contar la radiactividad de la fracción unida de IgG modificada o de la de tipo silvestre, las moléculas unidas pueden extraerse después con el detergente, y puede calcularse y compararse el porcentaje de liberación por unidad de número de células.
La afinidad de las IgG modificadas o los fragmentos de las mismas por FcRn puede medirse por resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando, por ejemplo, un BIAcore 2000 (BIAcore Inc.) como se ha descrito anteriormente (Popov et al., Mol. Immunol., 33: 493-502, 1996; Karlsson et al., J. Immunol. Methods, 145: 229-240, 1991). En este método, las moléculas de FcRn se acoplan a un chip sensor BIAcore (por ejemplo, el chip CM5 de Pharmacia) y la unión de la IgG modificada al FcRn inmovilizado se mide a un determinado caudal para obtener sensorgramas utilizando el software BIA evaluation 2.1, basándose en los cuales pueden calcularse las velocidades de entrada y salida de la IgG modificada, los dominios constantes o fragmentos de los mismos, a FcRn.
Las afinidades relativas de las IgG modificadas o los fragmentos de las mismas y de las IgG de tipo silvestre por FcRn también pueden medirse mediante un sencillo de unión por competencia simple. Se añade IgG modificada no marcada o IgG de tipo silvestre en diferentes cantidades a los pocillos de una placa de 96 pocillos en la que se inmoviliza FcRn. Después, se añade a cada pocillo una cantidad constante de IgG de tipo silvestre radiomarcada. El porcentaje de radiactividad de la fracción unida se traza frente a la cantidad de IgG modificada no marcada o de IgG de tipo silvestre y la afinidad relativa de la IgG modificada o los fragmentos de la misma puede calcularse a partir de la pendiente de la curva.
Además, pueden medirse también las afinidades de las IgG modificadas o los fragmentos de las mismas y de las IgG de tipo silvestre por FcRn mediante un estudio de saturación y el análisis de Scatchard.
La transferencia de IgG modificada o de fragmentos de la misma a través de la célula por FcRn puede medirse mediante un ensayo de transferencia in vitro utilizando IgG radiomarcada o fragmentos de la misma y células que expresan FcRn y comparando la radiactividad de un lado de la monocapa celular con la del otro lado. Como alternativa, dicha transferencia puede medirse in vivo alimentando ratones lactantes de 10 a 14 días de edad con IgG modificada radiomarcada y contando periódicamente la radiactividad en las muestras de sangre, lo que indica la transferencia de la IgG a través del intestino a la circulación (o cualquier otro tejido diana, por ejemplo, los pulmones). Para someter a ensayo la inhibición dependiente de la dosis de la transferencia de IgG a través del intestino, se administra a los ratones una mezcla de IgG radiomarcada y no marcada en una determinada relación y puede medirse periódicamente la radiactividad del plasma (Kim et al., Eur. J. Immunol., 24: 2429-2434, 1994).
La semivida de la IgG modificada o los fragmentos de la misma puede medirse mediante estudios farmacocinéticos de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento (véase la sección Ejemplos). Opcionalmente o de forma alternativa pueden realizarse estudios farmacocinéticos como los descritos por Kim et al. (Eur. J. Immunol. 24: 542, 1994). De acuerdo con este método, la IgG modificada radiomarcada o los fragmentos de la misma se inyectan por vía intravenosa en ratones y se mide su concentración plasmática periódicamente en función del tiempo, por ejemplo, entre 3 minutos y 72 horas después de la inyección. La curva de aclaramiento obtenida de este modo debe ser bifásica, es decir, de fase a y fase p. Para la determinación de la semivida in vivo de las IgG modificadas o los fragmentos de las mismas, se calcula la velocidad de aclaramiento en fase p y se compara con la de la IgG de tipo silvestre.
EJEMPLOS
La presente divulgación se ilustra mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo I.
Modulación de la dependencia del pH de la interacción Fc/FcRn en anticuerpos de semivida potenciada
La interacción entre el Fc de IgG y el receptor de Fc neonatal (FcRn) es fundamental para la homeostasis de IgG, y facilita la semivida sérica larga de las IgG. El FcRn y la IgG se unen de manera altamente dependiente del pH, lo que es crucial para el reciclaje de IgG. El dominio Fc de la IgG ha sido objeto de numerosos estudios mutacionales destinados a alterar la afinidad IgG/FcRn. Estos estudios han producido variantes con características farmacocinéticas (PK) dispares in vivo, que varían desde semividas muy extendidas hasta un aclaramiento extremadamente rápido. En el presente estudio, los inventores aislaron una variante de Fc (N3E-YTE), que alberga la mutación YTE (Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunol. 169, 5171-5180) con una potenciación de la afinidad de >50 veces a pH 6,0 en comparación con YTE y de >200 veces en comparación con la IgG de tipo silvestre. Esta variante también tiene una unión muy potenciada a pH 7,4 y presenta un aclaramiento extremadamente rápido en un modelo de ratón transgénico de FcRn humano. Usando N3E-YTE como punto de partida, los inventores generaron bibliotecas de fagos adicionales diseñadas para potenciar la dependencia del pH, pero manteniendo una unión a pH 6,0 aumentada. Mediante el uso de un ELISA de fagos para evaluar la dependencia del pH, los inventores pudieron aislar variantes con afinidades de pH 6,0 superiores a las de YTE sola con semividas in vivo potenciadas tanto en un modelo de ratón FcRn transgénico humano como en macacos de la India. El trabajo de los inventores sugiere un umbral de afinidad pronunciado para la unión a FcRn que conduce a un aclaramiento extremadamente rápido a afinidades muy altas, y cambia precipitadamente a un aclaramiento bajo/semividas potenciadas a afinidades ligeramente más bajas.
Introducción
Los enfoques actuales para optimizar los parámetros PK mediante la alteración de la unión a FcRn aprovechan el modelo generalmente aceptado de la homeostasis de IgG mediada por FcRn (Ghetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739­ 766; Roopenian et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7, 715-725), lo que indica que las moléculas de IgG (internalizadas a través de la pinocitosis en fase fluida) se unen a FcRn en el endosoma ácido (pH 6,0) protegiéndolas de la degradación en el lisosoma. La IgG rescatada por FcRn en el endosoma después se devuelve a la circulación y se libera en las superficies celulares a pH neutro, manteniendo el nivel alto de IgG sérica. Una de las principales estrategias empleadas para mejorar la persistencia sérica de los anticuerpos terapéuticos es la ingeniería de variantes de Fc con afinidad potenciada por FcRn a pH ácido (Strohl (2009) Curr. Opin. Biotechnol. 20, 685-691). Este enfoque ha tenido algunos éxitos notables, ya que algunas variantes aisladas presentan mejoras de la semivida in vivo >3 veces superiores que las de los anticuerpos de tipo silvestre (Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 23514-23524; Deng et al. (2010) Drug Metab. Dispos. 38, 600-605; Hinton et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 6213-6216; Hinton et al. (2006) J. Immunol. 176, 346­ 356; Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182, 7663-7671; Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28, 157-159; Yeung et al. (2010) Cancer Res. 70, 3269-3277).
Una propiedad que se considera importante para las moléculas de IgG de semivida potenciada es el mantenimiento de la dependencia del pH. La unión mejorada a pH 6,0 a FcRn manteniendo al mismo tiempo una cantidad mínima de unión a pH 7,4, se considera esencial para obtener parámetros PK mejorados (Presta (2008) Current Opinion in Immunology 20, 460-470). Los estudios sobre la unión de IgG y FcRn demostraron que el mecanismo de reciclaje dependiente del pH se ve facilitado por los puentes salinos His-Glu o His-Asp entre el Fc de IgG y el FcRn formados a un pH ~ 6 (Kim et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29, 2819-2825; Martin et al. (2001) Mol. Cell 7, 867-877). La cadena lateral imidazol de la histidina (con un pKa de ~6-6,5), tiene una carga neutra neta a pH 7,4, pero gana carga positiva en entornos de pH más bajo. La especie de histidina cargada positivamente y protonada puede formar un puente salino con los restos con carga negativa en la superficie de FcRn, y es esta interacción la que se cree que facilita la unión endosómica y el rescate. En el Fc de IgG humana, His310 e His435 forman puentes salinos con cadenas laterales ácidas en FcRn y son parte integral de la unión dependiente del pH (Kim et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29, 2819-2825). Las tres regiones principales del Fc de IgG que interactúan con FcRn son el bucle His435 situado en CH3, el bucle His310 situado en CH2 y el bucle M252-T256 en CH2 (Martin et al. (2001) Mol. Cell 7, 867-877). Estas regiones en la unión CH2-CH3 con frecuencia son una diana para obtener variantes con propiedades farmacocinéticas (PK) alteradas. Aunque se han generado múltiples variantes con una semivida in vivo potenciada a través de esta estrategia (Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 23514-23524; Deng et al. (2010) Drug Metab. Dispos. 38, 600-605; Hinton et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 6213-6216; Hinton et al. (2006) J. Immunol. 176, 346-356; Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182, 7663-7671; Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28, 157­ 159; Yeung et al. (2010) Cancer Res. 70, 3269-3277: Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18, 1759-1769), las propiedades de unión a FcRn aparentemente mejoradas in vitro no siempre producen una potenciación farmacocinética in vivo (Datta-Mannan et al. (2007) Drug Metab. Dispos. 35, 86-94; Datta-Mannan et al. (2007) J. Biol. Chem. 282, 1709-1717). Adicionalmente, en ratones, se ha observado poca correlación entre la afinidad por FcRn y la semivida (Gurbaxani et al. (2006) Mol. Immunol. 43, 1462-1473). Además, las IgG con unión a FcRn aumentada tanto a pH 6,0 como a 7,4 en realidad pueden presentar una semivida sérica más corta que las de tipo silvestre, y potenciar la degradación endógena de IgG (Abdegs) (Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1283-1288). Estos ejemplos ilustran la compleja relación entre la afinidad por FcRn, la dependencia del pH y el aclaramiento in vivo. Aunque en general se comprende que potenciar la unión a pH 6,0 manteniendo la dependencia del pH puede conducir a moléculas de semivida potenciada, y que potenciar la unión a pH 6,0 sin dependencia del pH puede conducir a abdeg, se desconocen los umbrales de afinidad y los parámetros que rigen qué resultado se conseguirá con una variante particular.
Para comprender mejor el mecanismo de dependencia de la unión del pH y la relación entre la afinidad de unión a FcRn a pH 6,0 y la semivida sérica de IgG, los inventores se dirigieron al bucle His 435, mediante mutagénesis en una estructura base de Fc que contenía las mutaciones YTE (M252Y/S254T/T256E) (Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunol. 169, 5171­ 5180; Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 23514-23524; Oganesyan et al. (2009) Mol. Immunol. 46, 1750-1755). El cribado de la biblioteca inicial de fagos produjo una variante de Fc (N3E-YTE) con una afinidad ultra alta por FcRn, pero con poca dependencia del pH. Las IgG que portan las mutaciones presentaron una semivida reducida en un modelo de ratón de FcRn humano (Roopenian et al. (2003) J. Immunol. 170, 3528-3533) de forma análoga a las mutaciones Abdeg (Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1283-1288). Usando este mutante como punto de partida, los inventores diseñaron bibliotecas adicionales para identificar nuevas variantes con una unión mejorada a FcRn y una dependencia mantenida del pH. Las variantes identificadas a partir de estas bibliotecas se construyeron como IgG y se evaluaron para determinar la unión a FcRn y los parámetros farmacocinéticos. Se caracterizaron variantes con una afinidad por FcRn 3­ 4 veces superior frente a YTE y se descubrió que tenían mejores PK potenciadas. Los datos también sugieren un umbral de unión aparente a pH 7,4 para los ligantes de FcRn de alta afinidad, donde una menor unión en este umbral puede producir una persistencia en suero potenciada, pero una unión más estrecha, produce moléculas con un aclaramiento extremadamente rápido.
Materiales y procedimientos experimentales
Reactivos e ilustraciones
Todos los productos químicos eran de calidad analítica. Las enzimas de restricción y las enzimas modificadoras del ADN se adquirieron en New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Los oligonucleótidos se adquirieron en Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA). Todas las variantes de HB20.3 (anti-CD20) y motavizumab (proteína F anti-RSV) (Wu at al. (2007) J. Mol. Biol. 368, 652-665) se generaron en Medlmmune. Se expresó y purificó FcRn humano recombinante como se describió anteriormente (Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunol. 169, 5171-5180). Los anticuerpos se numeran de acuerdo con la convención de numeración EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., 1991 Pub. de NIH N.° 91-3242). Las figuras de Sequence Logo (Schneider et al. (1990) Nucleic Acids Research 18, 6097-6100) se generaron utilizando Weblogo (weblogo.berkeley.edu; Crooks et al. (2004) Genome Research 14, 1188-1190).
Construcción de bibliotecas de fagos
El ADN que codificaba Fc de IgG1 (incluyendo las mutaciones YTE en CH2) partiendo de E216 (numeración de Kabat) hasta el extremo C de Fc se clonó como una fusión g3 en un vector fagémido. La inserción inicial de la biblioteca se construyó en la región de bucle His 435 introduciendo codones NNS en las posiciones 432, 433, 434, 436, 437 y la inserción aleatoria de 1 aminoácido después de 437. Para generar el inserto de la biblioteca se empleó un cebador inverso que contenía codones NNS en estas posiciones.
La biblioteca se generó mediante PCR solapada (mezcla HiFi platinum PCR de Invitrogen), y se electroporó en células TG1 de E. coli (Stratagene) en un campo de 2,5 kV utilizando una resistencia de 200 ohmios. Las células se recuperaron en 10 ml de medio SOC durante 30 minutos a 37 °C a 250 rpm y después se colocaron en bandejas Q con agar 2xYT que contenía carbenicilina y glucosa al 2 %. Al día siguiente, se recogieron las colonias raspándolas en medio 2xYT que contenía carbenicilina 100 ug/ml y glucosa al 2 %. Las células se cultivaron hasta que la DO fue de aproximadamente 0,5-1. Se introdujeron aproximadamente 1011 fagos auxiliares M13KO7 (Invitrogen) y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C sin agitación y 30 minutos con agitación. Posteriormente, las células se centrifugaron y se resuspendieron en 50 ml de 2YT/carb/kanamicina (50 ug/ml)/IPTG 0,5 mM y se incubaron a 30 °C a 250 rpm durante 12-16 horas. Al final de la incubación, los fagos se precipitaron con PEG 6000 y se resuspendieron en 3 ml de tampón MES 20 mM pH 6,0. La biblioteca CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) se construyó utilizando N3E-YTE como molde para la generación de la biblioteca. Se diseñó un cebador degenerado aleatorizando las posiciones 433, 434, 435 y 436 con el codón NNS. Para la biblioteca ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14), se usó la IgG1 Fc-YTE como molde para la construcción de la biblioteca. Se diseñó un cebador degenerado para mantener una histidina fija en la posición 435 aleatorizando al mismo tiempo las posiciones 433, 434 y 436 con NNS. En las posiciones 432 y 437 se usó el codón degenerado STE para incorporar bien histidina, ácido glutámico, ácido aspártico o glutamina en estas posiciones.
Selección de la biblioteca inicial de IgG YTE/Fc
Se usó un enfoque de selección basado en ELISA con FcRn biotinilado como diana. Brevemente, se aplicaron como recubrimiento 2 ug/ml de FcRn humano biotinilado y FcRn de ratón biotinilado en 8 pocillos (respectivamente) de una inmunoplaca de neutravidina Maxisorp (Pierce) de 96 pocillos y se almacenaron durante la noche a 4 °C. Después, la placa se bloqueó con leche al 3 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con tampón MES 20 mM (pH 6) antes de añadir los fagos. Se añadieron a cada pocillo 100 ml de fago (6x1012 UFF) en tampón MES 20 mM, pH 6,0 con Tween 20 al 0,05 % y leche al 3 %. La placa se incubó 2 horas a 37 °C. Los pocillos se lavaron 20 veces con tampón MES 20 mM, pH 6,0 con Tween 20 al 0,05 % y NaCl 0,3 M. Los fagos unidos se eluyeron con 100 ml de PBS de pH 7,4 durante 30 minutos a 37 °C. Los fagos eluidos se utilizaron para reinfectar el cultivo de células TG1 de crecimiento exponencial. La infección se permitió a 37 °C durante 30 minutos. Después, las células infectadas se cultivaron en placas de 2YT/carbenicilina/glucosa. Al día siguiente, las células se rasparon de las placas y se infectaron con el fago auxiliar M13KO7 una vez más para la siguiente ronda. Se realizaron selecciones sobre el FcRn de ratón y humano en paralelo durante un total de 4 rondas. Las bibliotecas CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) y ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) se cribaron de manera similar (durante 4 rondas cada una), excepto porque se empleó una etapa adicional de agotamiento a pH 7,4 después de cada ronda. Después de la elución a pH 7,4, los fagos se incubaron durante una hora más en placas recubiertas con FcRn biotinilado a pH 7,4 y se recogieron los fagos no unidos.
ELISA de fagos dependiente de pH
Las placas se recubrieron con FcRn humano 2 mg/ml a 4 °C durante la noche. Después, las placas se lavaron tres veces con tampón de fosfato de sodio 100 mM y se bloquearon con leche al 3 % en tampón de fosfato de sodio de pH6 o pH7,4 a temperatura ambiente durante 1 hora. Se retiró el tampón de bloqueo y se añadieron 109 fagos en tampón de fosfato de sodio de pH 6,0 o 7,4 a los pocillos respectivos y se incubaron a TA. Después de una hora, las placas se lavaron 3 veces con tampón de fosfato de sodio de pH6 o pH 7,4 (+tween al 0,2 %). Después se añadió HRP anti-M13 (1:5000 TA 30 min) y se lavó 3 veces antes de la detección con sustrato TMB.
Análisis por calorimetría diferencial de barrido
Los experimentos de DSC se realizaron utilizando un microcalorímetro de barrido Microcal VP-DSC (Microcal). Todas las soluciones y muestras utilizadas para la DSC se filtraron utilizando un filtro de 0,22 |jm antes de cargarlas en el calorímetro. Los anticuerpos utilizados para los estudios de DSC fueron > 98 % monoméricos según lo determinado por la SEC analítica. Antes del análisis por DSC, todas las muestras se dializaron minuciosamente en tampón de referencia (PBS) para los experimentos de DSC posteriores. Se obtuvieron mediciones de referencia (tampón frente a tampón) para restarlas de la medición de la muestra. Las muestras dializadas (a una concentración de 1 mg/ml) se añadieron al pocillo de la muestra y las mediciones de DSC se realizaron a una velocidad de barrido de 1 °C/min. El análisis y la desconvolución de los datos se realizaron utilizando el software Origin™ DSC proporcionado por Microcal. El análisis de desconvolución se realizó utilizando un modelo que no es de dos estados y los mejores ajustes se obtuvieron utilizando 100 ciclos de iteración.
Mediciones de Resonancia de Plasmón superficial (SPR)
La interacción del FcRn humano soluble con variantes de anticuerpos inmovilizados se controló mediante resonancia de plasmón superficial con un ProteOn™ XPR36 (Bio-Rad, Hércules, Ca ) (Bravman et al. (2006) Analytical Biochemistry 358, 281-288). Los anticuerpos se acoplaron en primer lugar a un chip sensor de GLC utilizando un kit de acoplamiento de aminas ProteOn™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El exceso de ésteres reactivos se bloqueó con una inyección de 6 minutos de etanolamina 1 M. Los anticuerpos se inmovilizaron a una densidad superficial entre >5000 UI para las mediciones de equilibrio y <200 UI para los experimentos de unión cinética. El FcRn humano se usó a concentraciones que variaron de 0,45 nM a 3 jM a un caudal de 25 jl/m in para las mediciones en estado estacionario y de 75 jl/m in para las mediciones cinéticas. Siempre se dejó un canal sin modificar para proporcionar una superficie de referencia en blanco. Las diluciones y los experimentos de unión se realizaron a 25 °C en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 6,0 o pH 7,4, que contenía Tween 20 al 0,05 %. Los datos de unión en estado estacionario se recogieron durante 10 minutos. Las superficies de los anticuerpos se regeneraron con una inyección de 15 segundos de HCl 5 mM. También se permitió que el FcRn humano fluyera sobre el canal de referencia que sirvió como blanco para restarlo de los canales recubiertos con anticuerpo. Las afinidades de unión se determinaron utilizando el software ProteOn™ Manager (BioRad). Las constantes de disociación (KdS) se determinaron ajustando las isotermas de unión correspondientes para los datos en estado estacionario o ajustando la cinética de asociación y disociación empleando un de Langmuir 1:1 o un modelo de transferencia de masa de Langmuir 1:1.
Ratones transgénicos HFcRn y análisis farmacocinéticos
Los ratones transgénicos HFcRn utilizados en este estudio son el cruce F1 de ratones B6.129X1-Fcgrttm1Dcr/DcrJ deficientes en mFcRn y la línea transgénica de ADNc de hFcRn B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ (Roopenian et al. (2003) J. Immunol. 170, 3528-3533; Chaudhury et al. (2003) The Journal of Experimental Medicine 197, 315-322). La expresión de hFcRn en estos animales ha sido validada por transcripción inversa (RT)-PCR, transferencia western y ensayos funcionales in vivo (Chaudhury et al. (2003) The Journal of Experimental Medicine 197, 315-322).
A los ratones HFcRn emparejados por sexo (de 6 a 16 semanas de edad) se les administró una dosis IV en bolo de 2,5 mg/kg de anticuerpo el día 0. Se usaron ocho ratones hFcRn Tg por anticuerpo, con 4 ratones (grupo A o grupo B) desangrados en puntos temporales alternativos. Se obtuvieron muestras de sangre del plexo retro-orbital utilizando pipetas capilares en diferentes puntos temporales a lo largo del estudio de 3 semanas. Se usó un ELISA cuantitativo para controlar las concentraciones séricas de los anticuerpos. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con 2 |jg ml-1 de fragmento específico anti-f(ab)2 humano de cabra AffiPure (Jackson Immunoresearch). Las placas se bloquearon con BSA al 3 % en PBS durante una hora y después se incubaron con muestras de suero apropiadamente diluidas (1:200 para los primeros puntos temporales y 1:50 o 1:100 para los últimos puntos temporales). Para la detección del anticuerpo se usó un anticuerpo de cabra anti-Fd humano específico conjugado con HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.) (dilución 1:10000). La absorbancia a 405 nm se midió después del revelado con sustrato TMB (KPL Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se generaron curvas patrón (a partir de 10 ug/ml) para cada variante de anticuerpo diluida en suero de ratón pre-sangrado 1:100 (tomado el día -3). Las porciones lineales de las curvas patrón generadas en Prizm (GraphPad Software, Inc.) se utilizaron después para cuantificar la IgG humana en las muestras de suero.
Análisis farmacocinéticos en macaco de la India
Se aleatorizaron dieciséis hembras de macaco de la India y se asignaron a uno de los 3 grupos del estudio. Cada animal recibió una dosis intravenosa (i.v.) de Motavizumab, Motavizumab-YTE, Motavizumab-N3 o Motavizumab Y31-YTE a 10 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre antes de la dosis el día 0, a las 1, 4 y 12 horas después de la dosis) y los días 2, 3, 4, 8, 15, 22, 29, 43, 57, 71 y 85 después de la dosis. Las concentraciones séricas de anticuerpos Motavizumab se determinaron usando el ELISA anti-Motavizumab descrito anteriormente (Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 23514-23524) con una curva patrón generada por separado para cada variante sometida a ensayo. Para cada infusión i.v., se ajustó un modelo no compartimental para los datos de concentración sérica de cada animal utilizando SAS 8.0 (SAS Institute, Cary, NC). Después, se calcularon las estadísticas descriptivas de varios parámetros farmacocinéticos.
Resultados
Identificación de variantes Fc de unión mejorada a partir de una biblioteca de variantes YTE
Los resultados anteriores han demostrado que las mutaciones de aminoácidos realizadas en la región Fc de la IgG que mejoran la unión a FcRn a pH 6,0, tal como YTE, pueden aumentar en gran medida la semivida del anticuerpo en suero en animales de experimentación, incluyendo el macaco de la India (Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 23514­ 23524; Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28, 157-159). Sin embargo, la combinación de YTE con mutaciones adicionales en el bucle H435 (H433K/N434F) que potencian la unión a FcRn tanto a pH ácido como neutro dio como resultado moléculas Abdeg con una semivida sérica gravemente reducida (Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1283­ 1288; Montoyo et al. (2009) Proc. Acad. Sci. U. S. A. 106, 2788-2793). Las mutaciones Yt E mantienen una unión baja a FcRn a pH 7,4, al igual que la IgG de tipo silvestre (Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunol. 169, 5171-5180), mientras que los Abdeg tienen una unión a FcRn aumentada tanto a pH ácido como neutro. Para identificar variantes novedosas de unión a FcRn de alta afinidad, los inventores de dirigieron a aminoácidos de uno de los sitios clave de unión a FcRn que contiene histidina 435 en la región Fc de una IgG, y construyeron una biblioteca de variantes que contenían secuencias aleatorias entre los aminoácidos 432-437 de CH3 dejando la histidina 435 sin modificar. Además, se insertó un codón de aminoácido aleatorio adicional después de la posición 437, (437*) para determinar si los contactos de unión a FcRn adicionales en el fragmento Fc que porta mutaciones YTE resultarían beneficiosos. Después, la biblioteca de variantes de Fc se presentó sobre la superficie del fago M13 y se seleccionaron las variantes de unión a FcRn contra la proteína FcRn humana recombinante aplicada como recubrimiento en pocillos de ELISA en tampón de pH 6,0. El análisis de la secuencia de los resultados de la selección reveló un único grupo de variantes que contenían cisteínas en las posiciones 432 y 437. Una variante, N3E-YTE (Tabla 1) y sus derivados se convirtieron en fondo de IgG HB20.3 anti-CD20. El análisis de unión por SPR mostró que una IgG que portaba la variante de doble cisteína, por ejemplo, N3E-YTE, mejoraba la unión a FcRn en más de 50 veces con respecto a la variante YTE a pH 6,0 (Tabla 1). Sin embargo, la unión a pH 7,4 de la variante a FcRn también aumentó de forma significativa, dando como resultado una escasa dependencia de la unión del pH.
Tabla 1. Unión de FcRn humano a diversas IgG HB20.3, incluyendo las variantes de la biblioteca CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) y ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14)
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Además, diseccionaron la mutación N3E-YTE para comprender qué mutaciones contribuían a la unión a FcRn. La eliminación del resto de inserción de ácido glutámico 437* (N3-YTE) tuvo un impacto modesto sobre la unión a pH 6,0 y pH 7,4, lo que sugiere que la variación de la secuencia de 432-437 es suficiente para conferir la mayoría de las mejoras de unión observadas. Para evaluar el papel de las cisteínas en 432 y 437, se reemplazaron por serinas (SerN3-YTE). La variante resultante mostró una reducción de la unión a FcRn tanto a pH 6,0 como a pH 7,4, lo que sugiere que puede formarse un disulfuro entre las cisteínas y contribuir positivamente a la unión. Se generó una variante adicional (CwtC-YTE) con restos de tipo silvestre entre L432C, T437C para determinar qué papel tenían las cisteínas por sí solas en la unión a FcRn. Esta construcción se unió a FcRn ligeramente menos que la construcción YTE parental, lo que indica que las mutaciones de cisteína, por sí solas, no confieren una unión potenciada. La observación de los inventores de que la dependencia de la unión del pH de YTE puede verse alterada por mutaciones en el bucle H435 coincide con estudios anteriores (Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunol. 169, 5171-5180; Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1283-1288) y respalda el papel de H435 y su bucle en la unión dependiente del pH de Fc a FcRn. Además de eliminar por separado la inserción de ácido glutámico (N3-YTE) y las mutaciones YTE (N3E) de N3E-YTE, los inventores también generaron una construcción con ambas eliminadas (N3). N3 tenía una dependencia del pH mejorada en comparación con N3E-YTE (Tabla 1).
L432C, T437C estabilizan el dominio C h 3
Las distancias Ca y la orientación de las cadenas laterales de L432 y T437 en las estructuras de rayos X de Fc parecen ser compatibles con la formación de enlaces disulfuro tras la mutación a cisteínas. Usando la estructura cristalina de YTE-Fc (Oganesyan et al. (2009) Mol. Immunol. 46, 1750-1755) los inventores determinaron que las distancias Ca entre L432 y T437 son de 6,7 A. Esta distancia está dentro del intervalo de distancia Ca observado (~4,6-7Á) para las cistinas que se ha publicado a partir del análisis de múltiples estructuras cristalinas (Petersen et al. (1999) Protein Engineering 12, 535-548). Como los efectos estabilizadores de la formación de enlaces disulfuro dentro de las proteínas son bien conocidos, los inventores realizaron una calorimetría diferencial de barrido (DSC) para examinar si el dominio Ch3 se estabiliza en variantes que contienen L432C/ T437C (Figura 3). El perfil de DSC de HB20.3 consiste en una Tf de Ch3 de 83,3 °C con los dominios Fab y CH2 desplegados como un pico a 73 °C. YTE HB20.3, tiene un desdoblamiento Fab y Ch3 casi idéntico al del tipo silvestre, pero con una Tf de Ch2 ligeramente inferior a 65,1 °C. CwtC-YTE (L432C/ T437C con la mutación YTE) tiene una Tf de Ch3 a 87,1 °C, casi 4 °C más alta que Ch3 de tipo silvestre. Curiosamente, aunque el Ch3 se estabiliza en gran medida, la Tf de Ch2 se reduce ~3 °C en comparación con YTE-HB20.3. La comparación de N3-YTE y SerN3-YTE (construcciones que difieren en tener cisteínas o serinas en 432 y 437) ilustra adicionalmente el profundo efecto de estabilización provocado por L432C/ T437C. La Tf más baja de SerN3-YTE es de 58,7 °C, con una Tf de Ch3 muy por debajo de 80 °C, mientras que el perfil de DSC de N3-YTE casi coincide con el de CwtC-YTE, con una Tf de Ch3 elevada de 87,1 °C.
Modificación por ingeniería y selección de variantes de YTE dependientes de la unión por pH
Los inventores diseñaron nuevas bibliotecas en el bucle His435 con el objetivo de producir variantes con una unión reducida a pH 7,4, manteniendo al mismo tiempo una afinidad de unión alta a pH 6,0. También modificaron sus condiciones de selección de fagos para permitir una selección más estricta del ligante de FcRn dependiente de pH y de alta afinidad en la selección. Los inventores generaron una biblioteca basada en N3E-YTE mediante la aleatorización de las secuencias intermedias entre Cys432 y Cys437 incluyendo H435 (Biblioteca CXXXXCE (SEQ ID NO: 10)). Para desalentar la unión a pH neutro, se introdujo una etapa de agotamiento de pH 7,4 después de la etapa de elución de pH 6,0. Los fagos no unidos después se utilizaron para infectar bacterias para su amplificación y caracterización. También se desarrolló un ELISA de fagos para caracterizar la unión de clones después de la selección dependiente del pH. En este ensayo, se utilizaron fagos clonales para unirse a los pocillos recubiertos con FcRn en condiciones de pH 6,0 y 7,4. La unión a pH 6,0 y la relación de unión entre pH 6,0 y 7,4 se compararon con los fagos que albergan N3E-YTE e YTE parentales. Los clones de fagos seleccionados después de 4 rondas de selección se cribaron para determinar la dependencia de la unión del pH en el ELISA. Aunque casi todos mostraron la unión alta esperada a FcRn, similar o mejor que el control YTE a pH 6,0 en el ensayo, varios clones mostraron una unión significativamente reducida a pH 7,4, o una relación de unión más alta de pH 6,0 a 7,4, lo que indica una dependencia de la unión del pH mejorada frente a N3E-YTE. El análisis de secuencia de más de 56 clones aislados después de 4 rondas de selección mostró que His435 estaba altamente enriquecido (Figura 4A). La mayoría de los clones de la ronda 5 contenían H435, lo que confirma el papel clave de la histidina en esta posición en la unión a FcRn. El análisis de secuencia muestra que estos clones también contenían restos con carga positiva en 433, 434 o 436. Un subgrupo de clones de la ronda 4 con relaciones de unión a pH 6/7,4 mejoradas a través de ELISA de fagos estaba incluso más enriquecido para restos con carga positiva adyacentes a 435 (Figura 4B).
Se diseñó una biblioteca adicional para reemplazar los restos de cisteína en las posiciones 432 y 437 por restos con carga, incluyendo la histidina. Como es probable que Cys432 y Cys437 formen enlaces disulfuro en N3E-YTE, los inventores razonaron que el reemplazo de la restricción rígida del bucle de cisteína en N3E-YTE por los aminoácidos cargados en las posiciones de cisteína puede introducir cambios dependientes del pH en la posición del bucle que podrían ser beneficiosos para la unión a FcRn dependiente del pH. Para someter a ensayo la hipótesis, los inventores diseñaron una biblioteca reemplazando Cys432 y Cys437 por ácido glutámico (E), ácido aspártico (D) histidina (H) y aminoácidos aleatorios en la posición 433, 434 y 436, dejando al mismo tiempo H435 sin cambios (biblioteca ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14)). En este esquema, "Z" puede ser ácido glutámico, ácido aspártico, histidina o glutamina. Se introdujeron ácido glutámico (E), ácido aspártico (D) o histidina (H) en 432 y 437 para permitir la posible formación de un puente salino dependiente del pH entre el ácido glutámico o el ácido aspártico y la histidina o la introducción de restos con carga negativa que pueden ser sensibles a los cambios electrostáticos locales. También se codificó glutamina (Q) en estas posiciones 432 y 437 debido al uso de oligonucleótidos degenerados en la clonación. La biblioteca ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) se sometió a 4 rondas de selección con la etapa adicional de agotamiento de la unión a pH 7,4 después de cada elución de selección. Se secuenciaron los clones de fagos individuales después de las 4 rondas de barrido y se sometieron a una pantalla de unión en el ELISA de fagos, como se describe para la selección y el cribado de la biblioteca CXXXXCE (SEQ Id NO: 10). A diferencia de los resultados de la biblioteca CXXXXCE (Se Q ID NO: 10), la mayoría de los clones seleccionados de la biblioteca ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) presentaron una dependencia de la unión del pH mejorada en comparación con N3E-YTE, demostrada por la relación alta de unión a pH 6,0 frente a pH 7,4 en el ELISA de fagos. Además, se reveló un patrón de secuencia en los clones identificados como dependientes de pH mediante ELISA de fagos (Figura 4C). La dependencia del pH se confirmó posteriormente mediante el análisis por SPR cuando se convirtió en IgG (Tabla 1). Los resultados mostraron que los aminoácidos con carga positiva, (generalmente arginina), son preferibles en la posición 433 y 436; y los aminoácidos hidrófobos, tirosina o fenilalanina, son preferibles en la posición 434 en los clones que adquirieron unión dependiente del pH a FcRn de afinidad alta. Curiosamente, los clones de unión dependientes del pH de esta biblioteca estaban altamente enriquecidos para el ácido glutámico (E) y la glutamina (Q) codificados en la posición 432 y 437, respectivamente. Los resultados indicaron que la modificación por ingeniería del potencial de carga superficial cerca de H435 es eficaz para identificar variantes de Fc de unión a FcRn dependiente del pH y afinidad alta. La adaptación de una superficie de carga equilibrada cerca de H435 parece beneficiosa para la unión a FcRn, a pesar de la falta de restos de histidina en estas posiciones que pueden ser susceptibles de cambios dependientes del pH.
Caracterización de la unión por SPR de variantes de unión a FcRn como IgG.
Se seleccionó un panel de variantes de las bibliotecas CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) y ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) que mostraron dependencia de la unión del pH en los cribados de fagos y se expresaron como IgG1 (HB20.3, anti-CD20) para caracterizaciones adicionales. Se usó la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) para medir la unión de los mAb purificados a FcRn humano tanto a pH 6,0 como a pH 7,4. La Tabla 1 resume las secuencias y los resultados de unión de los mAb seleccionados. La unión a pH 7,4 de todas las variantes sometidas a ensayo derivadas de la biblioteca CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) o ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) mostró la unión a FcRn reducida esperada en comparación con N3E-YTE, y con muchos niveles de unión similares a IgG YTE (aproximadamente 5 |j M). Las variantes de CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) que mostraron dependencia del pH en el ELISA de fagos mantuvieron la unión dependiente del pH como IgG, sin embargo, estas variantes no presentaron una afinidad mejorada en comparación con YTE a pH 6. Muchas variantes de ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) mostraron mejoras significativas en la afinidad a pH 6,0 frente a YTE, a la vez que mantenían la unión dependiente del pH. Múltiples variantes, por ejemplo, Y3-YTE, Y12-YTE e Y31-YTE, mostraron una afinidad de unión a FcRn entre 3 y 9 veces superior a la de YTE a pH 6,0, mientras que la unión a pH 7,4 sigue siendo similar o más débil que la de referencia. Estos resultados confirman la eficacia de la biblioteca y de la estrategia de selección utilizada para seleccionar e identificar los clones.
La afinidad de unión a pH 6,0 y 7,4 de los clones de CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) y ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14), así como de las variantes N3E-YTE y sus derivados, se agruparon en cuadrantes (Figura 5A, 5B, 5C). El cuadrante I contiene variantes con una unión alta a pH 6,0 y una unión baja a pH 7,4 que probablemente presenten propiedades "de tipo YTE". El cuadrante II contiene clones con una unión baja a pH 6,0 y a pH 7,4 que probablemente presenten propiedades de "tipo silvestre". El cuadrante III contiene anticuerpos con una unión alta a pH 6,0 y 7,4 que probablemente presenten propiedades "de tipo Abdeg". El cuadrante IV contiene ligantes de pH 7,4 alto y pH 6,0 bajo, ninguno de los cuales se aisló en estos estudios.
Unión a FcRn en un fondo de IgG adicional: Motavizumab
Un pequeño número de clones que presentaban propiedades de unión a FcRn deseables en el fondo de IgG1 anti-CD20 se trasladó a un fondo de IgG1 adicional, motavizumab (Wu at al. (2007) J. Mol. Biol. 368, 652-665), para confirmar las características de unión a FcRn de los clones en el contexto de diferentes dominios variables. Como los estudios anteriores han demostrado que los dominios variables pueden contribuir a la variabilidad de la unión a FcRn en fondos de Fc wt (Suzuki et al. (2010) J. Immunol. 184, 1968-1976; Wang et al. (2011) Drug Metab. Dispos. 39, 1469-1477; Datta-Mannan et al. (2012) Drug Metab. Dispos. 40, 1545-1555), los inventores querían confirmar que las propiedades de unión a FcRn de sus variantes eran transferibles. Se generaron clones de la biblioteca ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) Y12-YTE, Y31-YTE e Y3-YTE como IgG con dominios variables de Motavizumab. La unión a pH 6,0 de estos clones, así como la de YTE y N3E-YTE, son coherentes con las del fondo anti-CD20 (Tabla 2). Curiosamente, la unión a pH 7,4 varía cuando los clones se desplazan a diferentes dominios variables de anticuerpos, con una unión aumentada (Y31-YTE) o reducida (YTE). Adicionalmente, para Y12-YTE e Y31-YTE, también se generaron clones en el fondo de Fc de Mota de tipo silvestre (que carece de YTE), por ejemplo, Y12 e Y31. Estas construcciones se generaron para mostrar la contribución de las mutaciones del bucle H435 por sí solas a la unión a FcRn. Y12 e Y31 mantuvieron una unión potenciada a FcRn a pH 6,0 y dependencia del pH (unión baja a pH 7,4). Estos datos indican que YTE y las mutaciones de H435 tales como Y12 e Y31 tienen un efecto aditivo sobre la unión dependiente del pH. N3 con una KD de pH 6,0 de 89 nM y una KD de pH 7,4 de 1630 nM tuvo una unión similar en el fondo de motavizumab que en el fondo de anti-CD20.
Tabla 2A. Unión de FcRn a diversas I G de Motavizumab
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Tabla 2B. Unión del efector a diversas I G de Motavizumab
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Tabla 2C. DSC datos farmacocinéticos de ratón trans énico de hFcRn
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Aclaramiento sérico en un modelo de ratón transgénico de FcRn humano
A continuación, los inventores examinaron el aclaramiento sérico de diversas variantes de unión a FcRn sensibles al pH utilizando los ratones transgénicos de FcRn humano (Roopenian et al. (2003) J. Immunol. 170, 3528-3533; Chaudhury et al. (2003) The Journal of Experimental Medicine 197, 315-322). En los estudios de PK, los ratones hFcRn Tg recibieron una dosis IV en bolo de 2,5 mg/kg en el tiempo cero, y la sangre se extrajo en diferentes puntos temporales que variaron desde 30 minutos hasta 21 días después de la inyección del anticuerpo. La concentración de anticuerpos humanos en el suero del ratón se cuantificó mediante ELISA.
La tabla 2 resume los resultados de PK, la Tf por DSC más baja, así como la secuencia y las propiedades de unión de Motavizumab y sus variantes de Fc. Se presentan los perfiles de concentración sérica-tiempo de los anticuerpos seleccionados (Figura 6A). Como se esperaba, la mutación YTE redujo el aclaramiento sérico en aproximadamente 2,4 veces en comparación con el Motavizumab. YTE confiere sistemáticamente velocidades bajas de aclaramiento de anticuerpos en el modelo de ratones hFcRn Tg, lo que sugiere que esta variante satisface las condiciones necesarias y suficientes para un reciclaje potenciado a través de la unión a FcRn. N3E-YTE, la variante con afinidad de unión alta a pH 6,0 pero que carece de dependencia del pH de la unión, mostró un aclaramiento sérico extremadamente rápido de 373 ml/día/kg, aproximadamente seis veces más rápido que Motavizumab, reiterando la importancia de la unión dependiente del pH en el reciclaje de anticuerpos mediado por FcRn. El clon Y31-YTE también muestra una reducción del aclaramiento de aproximadamente 2,4 veces en comparación con Motavizumab, a la par que YTE. N3, con un aclaramiento de 25,2 ml/día*kg también estuvo a la par con YTE para la extensión de la semivida. Curiosamente, todas las variantes modificadas por ingeniería de unión por pH (excepto N3E-YTE) sometidas a ensayo, con o sin YTE, redujeron significativamente el aclaramiento sérico en comparación con Motavizumab de tipo silvestre, validando el enfoque para identificar nuevas variantes con una farmacocinética potenciada (Figura 6B). Las variantes con parámetros de PK mejorados tenían afinidades a pH 6,0 que variaban de ~4 a 40 veces más estrechas en comparación con Motavizumab. Curiosamente, una afinidad por el pH 7,4 de 25 nM produjo velocidades de aclaramiento extremadamente escasas (N3E-YTE), mientras que las variantes con afinidad de unión a pH 7,4 de ~1 |jM seguían presentando una semivida potenciada.
También se evaluó la unión a FcyR y C1q de las variantes de motavizumab. Curiosamente, la mayoría de las variantes, con la excepción de N3, tuvieron una unión reducida a determinados FcyR en comparación con motavizumab. Estos cambios en la unión variaron desde una unión menor (< 2 veces) hasta una unión totalmente obliterada a varios receptores (tal como en el caso de Y12-YTE). Curiosamente, incluso la mutación YTE por sí sola provocó una disminución de la unión en FcyRIII, FcYRIIa y FcyRMb, lo que sugiere que algunas funciones efectoras pueden estar disminuidas en el fondo de YTE, pero no en el fondo de N3.
Farmacocinética de N3 e Y31-YTE en macacos de la India
Después, se comparó una variante novedosa de Fc que presentaba un aclaramiento bajo en ratones hFcRn, Y31-YTE, con YTE y Motavizumab de tipo silvestre en macacos de la India. Cuatro animales de cada grupo recibieron una única inyección en bolo de Motavizumab o de variantes de Motavizumab-Fc; se tomaron muestras de suero durante los 85 días siguientes. De acuerdo con un estudio anterior (Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 23514-23524), YTE-Motavizumab tenía propiedades farmacocinéticas mejoradas con respecto a Motavizumab de tipo silvestre. Y31-YTE también presentó propiedades farmacocinéticas mejoradas frente a motavizumab (Tabla 3). Tres animales del grupo de Y31-YTE presentaron descensos bruscos de las concentraciones séricas de Y31-YTE entre los períodos de tiempo de 500 y 1000 horas, lo que probablemente indica que los anticuerpos contra el fármaco estaban aclarando el Y31-YTE-motavizumab. No se observaron descensos similares en el grupo de tipo silvestre y en el de YTE durante este período.
Tabla 3. Datos farmacocinéticos de macacos de la India
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Evaluación de la inmunogenicidad de N3
Para evaluar si la mutación N3 introducía epítopos inmunógenos de linfocitos T, se compararon N3-motavizumab y motavizumab en experimentos de proliferación de linfocitos T ex vivo. En estos experimentos se utilizaron PBMC de más de 200 donantes que representaban una amplia gama de haplotipos de HLA. Las PBMC se incubaron con motavizumab, N3-motavizumab, tampón solo o la proteína KLH inmunógena. Se midió la proliferación de linfocitos T y los resultados se cuantifican como un índice de estimulación (IE) que compara la proliferación de linfocitos T de las PBMC del donante con el control de solo tampón (IE=1). La proteína KLH tuvo un aumento significativo del IE, mientras que tanto motavizumab como N3-motavizumab, no (Figura 7A, 7B). Estos datos sugieren que la mutación N3 tiene una baja inmunogenicidad cuando se mide de esta manera.
Destrucción opsonofagocítica de las variantes de N3 en comparación con las variantes de YTE.
Los datos de unión al receptor Fcy con N3 e YTE sugirieron que N3 conserva la unión al receptor Fcy parental mientras que YTE tiene una unión a FcyR reducida (Tabla 2). Para evaluar si la diferente afinidad de unión a FcyR de estas variantes podría conducir a diferentes funciones efectoras in vitro, los inventores generaron las variantes YTE y N3 del anticuerpo anti-psl de Pseudomonas Cam004 (DiGiandomenico (2012) J. Exp. Med. 209 (7): 1273-87). Estas construcciones se sometieron a ensayo en un ensayo de destrucción opsonofagocítica utilizando células polimorfonucleares derivadas de pacientes como efectores, y una cepa de Pseudomonas que expresa luciferasa (PAO1:lux) como anticuerpo diana. Los resultados muestran que N3 mostró una OPK similar a la del anticuerpo parental Cam004, mientras que YTE tuvo una OPK reducida (Figura 8).
Estabilidad de las variantes de N3.
Se realizaron estudios de estabilidad acelerada con N3 Motavizumab en una formulación líquida (50 mg/ml en tampón de PBS pH 7,2). La formulación de anticuerpos se incubó a 4 °C, 25 °C o 40 °C durante un mes. En puntos temporales semanales, se tomaron alícuotas y se analizaron por HPSEC para determinar el contenido monomérico así como cualquier fragmentación o agregación. Los datos de la Figura 9 representan la pérdida de monómeros en función del tiempo y muestran que la variante de N3 es bastante estable, con una pérdida del 1,2 % por mes a 40 °C y solo un 0,3 % por mes a 25 °C. Estos datos indican que las mutaciones de N3 no afectan a la estabilidad de la región Fc.
Análisis
La región Fc de IgG es un terreno fértil para mutaciones que pueden alterar la potencia y la eficacia de los anticuerpos terapéuticos. Un gran número de estudios diferentes han identificado variantes de Fc con una semivida in vivo o funciones efectoras alteradas (Strohl (2009) Curr. Opin. Biotechnol. 20, 685-691; Presta (2008) Current Opinion in Immunology 20, 460-470; Lazar et al. (2006) Proc. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4005-4010). Los posibles beneficios de los anticuerpos con parámetros farmacocinéticos extendidos incluyen una mejor adaptación para ajustarse a ventanas terapéuticas específicas, lo que podría dar como resultado la reducción de la frecuencia de dosificación, manteniendo o incluso mejorando la eficacia (Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28, 157-159). En el extremo opuesto se encuentran las variantes de Fc con semividas reducidas. Estos anticuerpos pueden ser útiles para fines de formación de imágenes, tales como la formación de imágenes por tomografía de emisión de positrones (PET), en la que son deseables velocidades de aclaramiento rápidas para obtener imágenes claras y reducir la toxicidad (Kenanova et al. (2010) Engineering of the Fc Region for Improved PK (FcRn Interaction). págs. 411-430; Olafsen et al. (2006) Nature Protocols 1, 2048-2060). Los abdeg son una tercera clase de variantes de Fc con una unión a FcRn alterada (Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1283-1288). La capacidad de los Abdeg para reducir los niveles endógenos de IgG podría utilizarse para mejorar determinadas enfermedades autoinmunitarias caracterizadas por autoanticuerpos destructivos (Killock (2011) Nat Rev Rheumatol 7, 496-496; Patel et al. (2011) J. Immunol. 187, 1015-1022; Challa et al. (2013) mAbs 5, 655-659 Epub). Para comprender mejor los parámetros que separan los resultados farmacocinéticos in vivo dispares que surgen de la modificación por ingeniería de la interacción Fc-FcRn, los inventores usaron la presentación en fagos de Fc para seleccionar ligantes de afinidad alta.
El primer intento de los inventores de seleccionar variantes de unión a FcRn de alta afinidad en el fondo de YTE dio como resultado N3E-YTE que se unió >50 veces más estrechamente a FcRn que la variante de YTE ya potenciada por afinidad a pH 6. La mutación de inserción de ácido glutámico después de la posición 437 sí contribuyó al aumento de la afinidad, como lo demuestra la disminución de 6 veces en la unión tras su eliminación (Tabla 1). Además de los restos de inserción e hidrófobos en las posiciones 434 y 436, N3E-YTE contiene dos cisteínas en las posiciones 432 y 437. La posición de las cisteínas en la base del bucle His 435, la proximidad y las direcciones de sus cadenas laterales y el efecto estabilizador de estas mutaciones conducen a los inventores a creer que forman un enlace disulfuro entre sí. Posteriormente, los inventores lo confirmaron mediante cartografiado de péptidos. La calorimetría diferencial de barrido confirma el efecto estabilizador de L432C y T437C sobre CH3, a expensas de un ligero efecto desestabilizador de CH2 (Figura 3). Estos datos indican que ambas cisteínas son probablemente importantes para la estabilidad del bucle y que las secuencias intermedias confieren la mayor parte del aumento de afinidad y de la pérdida de sensibilidad al pH. La escasa dependencia del pH observada con N3E-YTE no era inesperada. Se ha publicado que N434W por sí solo ha aumentado la unión a FcRn tanto a pH 6,0 como a 7,4 (Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182, 7663-7671). Además, el mutante MST-HN (M252Y, S254T, T256E, H433K, N434F), que combina la mutación YTE con dos mutantes adicionales del bucle H435, también presenta una dependencia reducida del pH que da como resultado un abdeg (Dall'Acqua et al. (2002) J. Immunol. 169, 5171-5180; Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1283-1288.
Estos datos iniciales impulsaron la creación de 2 bibliotecas adicionales, CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) y ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14). Después, estas bibliotecas se seleccionaron con una etapa de agotamiento de pH 7,4 para eliminar los ligantes insensibles al pH, y los clones aislados se evaluaron mediante ELISA de fagos (Figuras 5A y 5B). La biblioteca ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) produjo los ligantes dependientes del pH de afinidad más alta a través de ELISA de los fagos, lo que sugiere que la reducción de las restricciones provocadas por las cisteínas 432 y 437 en la biblioteca CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) puede haber sido beneficiosa para reintroducir la dependencia del pH. Cabe destacar que la biblioteca CXXXXCE (SEQ ID NO: 10) también contenía la inserción de ácido glutámico después del resto 437 (de la que carecía ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14)) y esto también podría explicar algunos de los perfiles de unión dispares de las variantes identificadas a partir de estas bibliotecas. Curiosamente, las mutaciones identificadas de la biblioteca ZXXHXZ (SEQ ID NO: 14) que mantuvieron una afinidad mayor que YTE sola con la unión sensible al pH consistieron en restos con carga en las posiciones 433, 436 o ambas, con un resto hidrófobo en 434 (Tabla 1). El aumento de las cargas positivas puede contribuir a la dependencia del pH de estas variantes.
Se demostró que la variante de N3 tiene una farmacocinética similar a la de YTE en ratones HuFcRn y macacos de la India, y adicionalmente, a diferencia de YTE, conserva la unión a Fcy y C1q de forma similar a la IgG de tipo silvestre. Por otro lado, de nuevo a diferencia de YTE, se descubrió que N3 tenía una actividad OPK equivalente a la de la IgG parental en el sistema PA01 lux de Pseudomonas (Figura 8). Además, la variante de N3 no afecta a la estabilidad de la región Fc tras el almacenamiento. En consecuencia, se espera que N3 tenga utilidad, por ejemplo, como una IgG modificada para su uso en aplicaciones de aclaramiento mediado por anticuerpos que se dirigen a un agente infeccioso, donde es deseable una semivida más larga y una función efectora robusta.
Los datos de los inventores sugieren que es probable que haya un nivel de umbral para la extensión de la semivida mediada por FcRn (Figura 6B) y que profundizar más allá de este umbral no producirá mejoras adicionales en la PK. De hecho, el aumento de la afinidad por FcRn más allá de este umbral dará como resultado moléculas como N3E-YTE o MST-HN que presentan semividas más cortas que las del tipo silvestre (Montoyo et al. (2009) Proc. Acad. Sci. U. S. A.
106, 2788-2793) y pueden alterar el reciclaje normal de las IgG (Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1283-1288). Inesperadamente, los inventores descubrieron que las variantes con una unión a pH 7,4 tan baja como de 1 uM seguían manteniendo una semivida in vivo potenciada a la par que la de la YTE sola (Tabla 2). N3E-YTE con una Kd de pH 7,4 de 24 nM presentó un aclaramiento extremadamente rápido. Los inventores proponen que por debajo de este umbral de ~1 uM parece haber un punto crítico para determinar si las variantes con unión potenciada a pH 6,0 se convierten en PK potenciada o de tipo Abdeg presentando un aclaramiento más rápido que el tipo silvestre.
Las variantes con la semivida más larga en ratones HuFcRn, N3 e Y31-YTE, tuvieron un aclaramiento casi 3 veces mejor que el Motavizumab de tipo silvestre y una semivida ~5 veces más larga. Estas variantes se encuentran entre las principales variantes mejoradas en PK descritas (Presta (2008) Current Opinion in Immunology 20, 460-470). La potenciación de aproximadamente 3-5 veces en la semivida o las velocidades de aclaramiento en comparación con el anticuerpo parental son las mejoras más altas publicadas conseguidas mediante la alteración de la unión a FcRn (Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281,23514-23524; Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28, 157-159). Los datos farmacocinéticos en macacos de la India también mostraron mejoras para Y31-YTE y N3 frente a Motavizumab de tipo silvestre. A la luz de los datos de los inventores y de otros, es difícil imaginar que haya espacio para una mejora significativa más allá de una potenciación PK de 3-4 veces simplemente alterando aún más la unión a FcRn. Los inventores prevén que podrían conseguirse semividas in vivo aún más largas para moléculas que contienen Fc mediante la combinación de mutaciones de unión a FcRn con tecnologías de extensión de la semivida independientes de FcRn, tal como la modificación por ingeniería de pI (Dahiyat et al. (2012) Pub. de Pat. de los EE.UU. 20120028304 publicada el 2 de febrero de 2012), PEGilación (Jevsevar et al. (2010) Biotechnol. J. 5, 113-128), PASilación (Schlapschy et al. (2013) Protein Eng. Des. Sel. 26, 489-501), unión a antígenos dependiente del pH (para reducir los efectos de los sumideros de antígenos) (Igawa et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28, 1203-1207; Igawa et al. (2011) Protein Eng. Des. Sel. 23, 385-392).
Ejemplo II.
Formato de anticuerpos para estrategias terapéuticas que dependen del aclaramiento mediado por anticuerpos con unión a antígenos dependiente del pH
Se han modificado por ingeniería anticuerpos para la unión de su antígeno dependiente del pH. El anticuerpo modificado por ingeniería se une al antígeno en la circulación (pH 7,4) para mediar en el aclaramiento, pero lo libera en el endosoma de clasificación (pH 6), permitiendo de este modo el reciclaje del anticuerpo a través de FcRn mientras que el antígeno que queda atrás es degradado en el endosoma.
En el presente documento se describen formatos de anticuerpos con afinidad alta por FcRn tanto a pH 7,4 como a 6,0. Un ejemplo es el N3E-YTE, descrito en el Ejemplo I, que presenta una semivida más corta que los anticuerpos comparables de tipo silvestre. Una posible explicación para la semivida más corta de N3E-YTE y otros similares puede ser que estos anticuerpos permanezcan unidos a FcRn en la superficie celular y, por consiguiente, no se detecten en las muestras de suero. Si se ciclan dentro de los endosomas en complejo con FcRn, se espera que este formato sea mucho más eficiente para el aclaramiento de antígenos (véase la Figura 10).
Por tanto, se prevé un aclaramiento más eficiente mediado por anticuerpos. Un formato de anticuerpo con afinidad alta por FcRn tanto a pH fisiológico (pH 7,4) como a pH bajo (pH 6) puede unirse a FcRn tanto en los compartimentos endosómicos como en la superficie celular. Como resultado, se uniría a los antígenos en la superficie de la célula y mediaría activamente en la internalización dentro de los endosomas, lo que sería mucho más eficiente para el aclaramiento de antígenos. Además, la endocitosis impulsada por anticuerpos es un mecanismo que puede respaldar el muestreo del contenido sérico del sistema inmunitario (Kuo TT et al, J Clin Immunol (2010) 30: 777-789). Por tanto, debería ser posible aumentar la eficacia incrementando la afinidad por FcRn a pH fisiológico, como se describe en el presente documento.
La eficacia de dichos anticuerpos puede someterse a ensayo in vivo. Un sistema modelo con relevancia clínica es PCSK-9. Se conoce un anticuerpo anti-PCSK-9 con unión dependiente del pH (Chaparro-Riggers et al., 2012, JBC 287: 11090­ 11097). La región variable de un anticuerpo anti-PCSK-9 que está modificado por ingeniería para la unión dependiente del pH a su antígeno puede ser modificarse por ingeniería en cualquiera de las estructuras base del anticuerpo que pertenecen a los cuadrantes I y III que tienen unión alterada a FcRn. En algunos casos, pueden preferirse las estructuras que pertenecen al cuadrante III. La generación de dichos anticuerpos puede lograrse utilizando los procedimientos descritos en el presente documento, lo que permite una comparación lado a lado con anti-PCSK-9 de tipo silvestre. La velocidad de aclaramiento de PCSK9 exógeno en diversos puntos temporales puede medirse fácilmente. Puede utilizarse

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una IgG1 humana modificada que comprende una región Fc que comprende sustituciones de aminoácidos en dos o más de las posiciones 432 a 437, numeradas de acuerdo con el índice de numeración EU de Kabat, con respecto a una región Fc de tipo silvestre humana; en donde
(i) las posiciones 432 y 437 se sustituyen cada una por cisteína;
(ii) la posición 433 es histidina o se sustituye por arginina, prolina, treonina, lisina, serina, alanina, metionina o asparagina; (iii) la posición 434 es asparagina o se sustituye por arginina, triptófano, histidina, fenilalanina, tirosina, serina, metionina o treonina;
(iv) la posición 435 es histidina o se sustituye por histidina; y
(v) la posición 436 es tirosina o fenilalanina o se sustituye por leucina, arginina, isoleucina, lisina, metionina, valina, histidina, serina o treonina; y
en donde la IgG1 humana modificada tiene una semivida aumentada en comparación con la semivida de una IgG1 que tiene la región Fc de tipo silvestre humana.
2. La IgG1 humana modificada de la reivindicación 1, que comprende además una inserción de aminoácido después de la posición 437.
3. La IgG1 humana modificada de la reivindicación 2, en donde la inserción de aminoácido es ácido glutámico.
4. La IgG1 humana modificada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la afinidad de unión de la IgG1 humana modificada por FcRn a pH 6,0 es superior a la afinidad de unión de la IgG1 que tiene la región Fc de tipo silvestre humana por FcRn a pH 6.
5. La IgG1 humana modificada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la afinidad de unión de la IgG1 humana modificada por FcRn a pH 7,4 es superior a la afinidad de unión de la IgG1 que tiene la región Fc de tipo silvestre humana por FcRn a pH 7,4.
6. La IgG1 humana modificada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IgG1 humana modificada presenta una dependencia del pH aumentada de la afinidad de unión por FcRn en comparación con la IgG1 que tiene la región Fc de tipo silvestre humana.
7. La IgG1 humana modificada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IgG1 humana modificada tiene sustituciones de aminoácidos en tres, cuatro, cinco o seis de las posiciones 432, 433, 434, 435, 436 o 437.
8. La IgG1 humana modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 432 a 437 de CXRHXC (SEQ ID NO: 11), donde la posición 433 es histidina o se sustituye por arginina, asparagina, prolina o serina, y la posición 436 se sustituye por arginina, leucina, isoleucina, metionina o serina.
9. La IgG1 humana modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 432 a 437 de CRRHXC (SEQ ID NO: 12) en donde la posición 436 se sustituye por leucina, arginina, isoleucina, lisina, metionina, valina, histidina, serina o treonina.
10. La IgG1 humana modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 432 a 437 de CXRHRC (SEQ ID NO: 13) en donde la posición 433 es arginina, prolina, treonina, lisina, serina, alanina, metionina o asparagina.
11. La IgG1 humana modificada de cualquier reivindicación anterior que comprende además una sustitución por tirosina en la posición 252, una sustitución por treonina 254 y una sustitución por ácido glutámico en la posición 256.
12. La IgG1 humana modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende la secuencia de aminoácidos en las posiciones 432 a 437 seleccionada del grupo que consiste en N3 definido por la SEQ ID NO 20, o N3E definido por la SEQ ID NO: 16.
13. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la IgG1 modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13.
15. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13.
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