ES2867900T3 - Anticuerpos y polipéptidos dirigidos contra CD127 - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD127, en particular a CD127 humano, que comprende: - una cadena ligera de anticuerpo que comprende o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; en particular SEQ ID NO: 12; y - un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO:

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos y polipéptidos dirigidos contra CD127
La invención se encuentra en el campo de los polipéptidos o anticuerpos útiles en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico dirigidas a CD 127, la cadena alfa del receptor de IL7, y proporciona en particular anticuerpos monoclonales humanizados contra CD127, particularmente CD127 humano, usos terapéuticos de los mismos y aplicaciones de diagnóstico.
Breve descripción de la invención
La cadena (o subunidad) alfa del receptor de la interleucina 7 (IL-7) se designa CD 127 o p90 IL-7R o IL-7Ralfa o IL-7Ra (a veces también se denomina lL-7Ra). En un aspecto particular, los anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, proporcionados en el presente documento están dirigidos contra la cadena alfa del receptor de IL-7 humana expresada en células humanas. En un aspecto particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento tienen propiedades antagonistas para la interacción IL-7-IL-7R, pueden presentar actividad citotóxica contra células CD 127 positivas pero no aumentan la maduración de células dendríticas (DC) inducida por TSLP. En particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento reconocen un epítopo de CD 127 humano que comprende secuencias del sitio 2b de CD127, en particular, el epítopo comprende secuencias de CD127 humanas del dominio D1 y del sitio 2b de CD 127, en particular, el epítopo comprende al menos una secuencia de D1 y al menos una secuencia del sitio 2b, preferentemente de la tercera hoja beta del sitio 2b de CD127. Como alternativa, o además, en un aspecto particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento no inducen la internalización de CD 127 y/o inhiben la internalización de CD127 inducida por IL7. En un aspecto particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento están humanizados y comprenden al menos el 80 % y preferentemente al menos el 84 %, o al menos el 85 % de restos humanos. En un aspecto particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento tienen un efecto rápido sobre las células T de memoria efectoras, un efecto duradero sobre las células T de memoria efectoras o, preferentemente, un efecto rápido y duradero sobre las células T efectoras de memoria. En un aspecto particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento permiten una producción eficiente. En un aspecto particular, los niveles de expresión de CD127, Pueden medirse IL-7 y/o TSLP para evaluar la probabilidad de respuesta, en particular usando los anticuerpos anti-CD 127 proporcionados en el presente documento. Además de los anticuerpos, se proporcionan en el presente documento, en particular como herramientas para la producción de anticuerpos y/o para usos similares a dichos anticuerpos, los polipéptidos, en particular dominios variables de cadena ligera de anticuerpo o cadenas ligeras de anticuerpo, fragmentos de unión a antígenos y moléculas miméticas de anticuerpos de dichos anticuerpos y polinucleótidos.
Los inventores han buscado obtener anticuerpos humanizados mejorados en comparación con los anticuerpos N13B2-h1, N13B2-h2 y N13B2-h3 desvelados en el documento WO 2015/189302. Aunque se sabe que algunos restos en las secuencias marco del dominio variable, incluyendo los restos en la zona Vernier, restos canónicos, restos en la interfaz VH/VL, etc., son fundamentales en la estructura de un anticuerpo y no deben mutarse para preservar la actividad bioquímica y biológica de un anticuerpo, los inventores han descubierto sorprendentemente que algunas mutaciones dentro de la secuencia marco del dominio variable de la cadena ligera de N13B2, incluyendo algunos de dichos restos críticos, permiten aumentar el contenido de restos humanos (más alto que N13B2-h3 y hasta el 86,3 %) y mejorar la producción (hasta 4 veces más alta que N13B2-h3) conservando todas las características funcionales.
Estas mutaciones consisten en 16 sustituciones de aminoácidos dentro de la secuencia marco del dominio variable de la cadena ligera de N13B2 y, en particular, adicionalmente en la sustitución del resto de valina en la posición 48 por un resto de leucina (V48L) y/o en la sustitución del resto de fenilalanina en la posición. 87 por un residuo de tirosina (F87Y). Estas posiciones, y cualquier posición de aminoácidos con cadenas de anticuerpos proporcionadas en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, se proporcionan usando la numeración de Kabat. En el presente documento se proporcionan los dominios variables de la cadena ligera de anticuerpos mejorados que consisten en las siguientes secuencias:
- SEQ ID NO: 9 (incluyendo dichas sustituciones de 16 aminoácidos - designándose dicho dominio variable de cadena ligera de anticuerpo en lo sucesivo en el presente documento N 13B2-hVL3);
- SEQ ID NO: 10 (incluyendo dichas sustituciones de 16 aminoácidos y adicionalmente con la mutación V48L -designándose dicho dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en lo sucesivo en el presente documento N13B2-hVL4);
- SEQ ID NO: 11 (incluyendo dichas sustituciones de 16 aminoácidos y adicionalmente con la mutación F87Y -designándose dicho dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en lo sucesivo en el presente documento N13B2-hVL5); y
- SEQ ID NO: 12 (incluyendo dichas sustituciones de 16 aminoácidos y adicionalmente con ambas mutaciones V48L y F87Y - designándose dicho dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en lo sucesivo en el presente documento N13B2-hVL6).
Por lo tanto, el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo designado en el presente documento N13B2-hVL3, comprende las CDR de N13B2-h3, dichas sustituciones de 16 aminoácidos y los restos originales de N13B2 en las posiciones críticas 48 y 87 (es decir, respectivamente, V y F) dentro de las secuencias marco humanas y tiene la secuencia de SEQ ID NO: 9. El dominio variable de cadena ligera del anticuerpo mejorado preferido proporcionado en el presente documento, designado N13B2-hVL6, que comprende además ambas mutaciones V48L y F87Y, consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 12.
El experto en la materia no habría esperado que dichas mutaciones, particularmente en tales posiciones en los marcos del dominio variable de la cadena ligera dejaría la afinidad del anticuerpo con CD 127 sin afectar: V48 es un resto canónico y F87 está ubicado en la interfaz VH/VL; la mutación de tales restos, como es conocido por el experto en la materia y se analiza en, por ejemplo, Clark, 2014, se espera que afecte a la afinidad y/o la estabilidad del anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el término resto "canónico" se refiere a un resto en una CDR o marco que define una estructura de CDR canónica particular como se define por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992). De acuerdo con Chothia et al., las porciones críticas de las CDR de muchos anticuerpos tienen conformaciones de la cadena principal peptídica casi idénticas a pesar de la gran diversidad a nivel de la secuencia de aminoácidos. Cada estructura canónica especifica principalmente un conjunto de ángulos de torsión de la columna vertebral del péptido para un segmento contiguo de restos de aminoácidos que forman un bucle. No era previsible que la introducción de las mutaciones descritas en ambas posiciones daría como resultado una mejora de la producción, conservando al mismo tiempo las características de unión y ventajosamente otras características funcionales de los anticuerpos.
En consecuencia, se proporciona en el presente documento un polipéptido útil en particular para la producción de tales anticuerpos, en particular un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo o una cadena ligera de anticuerpo, que consiste en una secuencia, en particular de hasta 250 aminoácidos, que comprende o que consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 11; o SeQ ID NO: 12 o un fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo del mismo como se define a continuación. La invención se refiere a anticuerpos o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, particularmente anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a CD127, particularmente al CD127 humano, y comprenden:
- una cadena ligera de anticuerpo que comprende o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID No : 11; SEQ ID NO: 12; en particular SEQ ID NO: 12; y
- un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7.
En una realización preferida, la invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se proporcionan en el presente documento, particularmente anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente al CD 127 humano, y comprenden:
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, particularmente SEQ ID NO: 12; y
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7.
En un aspecto particular, el anticuerpo proporcionado en el presente documento comprende una cadena ligera con un dominio variable como anteriormente y un dominio constante que consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 27 o 28, preferentemente SEQ ID NO: 27 y una cadena pesada con un dominio variable como anteriormente y un dominio constante que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 26.
También se proporciona en el presente documento un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de hasta 250 aminoácidos, en particular de hasta 217, de hasta 214, de hasta 211, más particularmente de hasta 200, de hasta 175, de hasta 150, de hasta 135, de hasta 120, de hasta 107 e incluso más particularmente de hasta 100, de hasta 90, de hasta 80, de hasta 74, de hasta 70, de hasta 60 aminoácidos, en donde dicha secuencia comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 9 (las CDR de N13B2-h3 dentro de secuencias marco humanas);
- SEQ ID NO: 10 (las CDR de N13B2-h3 dentro de secuencias marco humanas, incluyendo la mutación V48L); - SEQ ID NO: 11 (las CDR de N13B2-h3 dentro de secuencias marco humanas, incluyendo la mutación F87Y); - SEQ ID NO: 12 (las CDR de N13B2-h3 dentro de secuencias marco humanas, incluyendo las mutaciones V48L y F87Y); y
- un fragmento de unión a antígeno del mismo, particularmente dicho fragmento que comprende las tres CDR que consisten en las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, más particularmente un fragmento que comprende al menos 74 aminoácidos que consiste en los aminoácidos 24 a 97 de SEQ ID NO: 12.
También se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que codifican los polipéptidos proporcionados en el presente documento, en particular los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención. Dichos polinucleótidos codifican en particular polipéptidos que comprenden o consisten en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 a 12 y también codifican polipéptidos que comprenden o consisten en la secuencia SEQ ID NO: 7 y también puede codificar polipéptidos que comprenden o consisten en secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO 26 a 28. En particular, dichos polinucleótidos comprenden o consisten en la combinación de al menos dos secuencias (moléculas) de ácido nucleico aisladas, una primera molécula de ácido nucleico aislada que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15 a 18; en particular s Eq ID NO. 18; comprendiendo o consistiendo dicha combinación en una segunda molécula de ácido nucleico aislada que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 29 a 31, en particular SEQ ID NO. 13.
En particular, el polipéptido de acuerdo con la invención comprende un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo o una cadena ligera de anticuerpo, comprendiendo dicho polipéptido al menos el 84 % y más particularmente al menos el 85 % de restos humanos. Dicho polipéptido puede ser un fragmento de unión a antígeno y/o una molécula mimética de anticuerpo de un anticuerpo desvelado
en el presente documento.
También se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden dichos polipéptidos, en particular dominios variables de cadena ligera de anticuerpo o cadenas ligeras de anticuerpo, anticuerpos, fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo de los mismos, métodos de obtención de dichos anticuerpos, moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos y anticuerpos y usos de dichos polipéptidos, anticuerpos y composiciones.
En consecuencia, los polipéptidos, dominios variables de cadena ligera del anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, moléculas miméticas de anticuerpos y la composición proporcionada en el presente documento pueden estar destinadas y/o ser adecuadas para su uso con el fin de remediar una afección diagnosticada en un paciente humano que resulta de la patogénesis relacionada con la linfopoyesis, cuando las rutas de señalización de iL-7 contribuyen a dicha patogénesis, especialmente cuando un aumento en la maduración, más precisamente la regulación positiva de moléculas coestimuladoras, de células dendríticas es indeseable.
Descripción detallada de la invención
Bioquímica
CD127 es común al receptor de IL-7 (IL-7R) y al receptor de TSLP (TSLPR). El IL-7R está constituido por un heterodímero de CD127 y la cadena gamma común (yc) de los receptores de interleucina. La cadena gamma común yc se denomina en ocasiones en el presente documento y en la bibliografía como CD 132. IL-7R se une a la interleucina 7. El receptor de TSLP es un heterodímero de CD 127 y el factor 2 similar al receptor de citocinas (CRLF2). El receptor de TSLP está unido por TSLP. En la bibliografía, TSLPR se usa a veces para designar tanto la cadena CRLF2 del receptor como el complejo CD127/CRLF2. Para evitar confusiones, en lo que sigue, TSLPR suele designar el complejo.
CD127 (número de registro de Swiss Prot P16871) puede existir en cuatro isoformas. La isoforma canónica, también denominada H20 (Swiss Prot P16871. 1) es una proteína transmembrana de un solo paso y tiene 459 aminoácidos que consisten, desde el N- al C-terminal, en un péptido señal de 20 aminoácidos, un dominio extracelular de 219 aminoácidos, un dominio transmembrana de 25 aminoácidos y un dominio intracelular de 195 aminoácidos. Otras isoformas comparten la secuencia de todo (o la mayor parte) del dominio extracelular de H20 y muestran secuencias C-terminales variadas. Las isoformas 2 y 4 se secretan (Swiss Prot P16871 -4 y P16871 -3), mientras que la isoforma 3 (Swiss Prot P16871-2) también es una proteína transmembrana. Se informa que CD127 tiene la secuencia de SEQ ID SO: 21, y su dominio extracelular, cuando se retira el péptido señal, tiene la secuencia de SEQ ID NO: 22. A menos que se indique lo contrario, la numeración usada en el presente documento para los aminoácidos de CD127 es la numeración de SEQ ID NO: 22.
CD127 es un receptor de clase I de homología de receptores de citocinas (CRH I). Como es bien sabido en la técnica, el dominio extracelular de estos receptores consiste en dos dominios de fibronectina 3, denominados D1 y D2. La estructura cristalográfica precisa de CD127 se ha publicado y analizado en, por ejemplo, McElroy et al., 2009; McElroy et al., 2012 y Walsh, 2012 y, en particular, se ha desvelado como datos de estructura de proteínas en la base de datos del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB), con el número de registro 3UP1. Generalmente se considera que D1 está implicado en la unión con IL-7, mientras que D2 participa en la unión a la cadena yc (y también con IL-7). De manera importante, el sitio 2b del dominio D2 comprende tres hojas beta que incluyen las siguientes secuencias SEQ ID NO. 32 (FDLSVIYRE); SEQ ID NO: 33 (NDFVVTFNTS) y SEQ ID NO: 34 (TKLTLLQR). El sitio 2b del dominio D2 se incluye, por lo tanto, entre los aminoácidos 109 y 180 de SEQ ID NO: 22 (véase Walsh, 2012; Verstraete, K. et al., Nature Com 2017). El sitio 2b del dominio D2 también puede definirse estando incluido entre los aminoácidos 109 y 173 de SEQ ID NO. 22. El sitio 2b del dominio D2 también puede definirse estando incluido entre los aminoácidos 113 y 180 de SEQ ID NO. 22. El sitio 2b del dominio 2b también puede definirse estando incluido entre los aminoácidos 113 y 173 de SEQ ID NO. 22. Particularmente, el sitio 2b del dominio D2 comprende, en particular consiste esencialmente en, los aminoácidos 109 a 133 de SEQ ID NO: 22, en particular 109 a 127, en donde se localizan las dos primeras hojas beta; y los aminoácidos 166 a 180 de SEQ ID NO: 22, en donde se localiza la tercera hoja beta. Más particularmente, el sitio 2b consiste esencialmente en los aminoácidos 113 a 133, en particular 113 a 127, de SEQ ID NO: 22 y en los aminoácidos 166 a 180 de SEQ ID NO: 22. Más particularmente, el sitio 2b consiste esencialmente en los aminoácidos 109 a 133, en particular 109 a 127, de SEQ ID NO: 22 y en los aminoácidos 166 a 173 de SEQ ID NO: 22. Más particularmente, el sitio 2b consiste esencialmente en los aminoácidos 113 a 133, en particular 113 a 127, de SEQ ID No : 22 y en los aminoácidos 166 a 173 de SEQ ID NO: 22. El sitio 2b del dominio D2 es crítico para la interacción CD127-yc, en particular para permitir o aumentar la unión de CD 127 con yc en presencia de IL-7. En particular, las mutaciones en P112 y L115, que se han identificado en pacientes que padecen inmunodeficiencia combinada grave (SCID), se cree que desestabilizan el núcleo hidrófobo del dominio D2, lo que probablemente da como resultado su característica patogénica. Como se ha dicho anteriormente, el sitio 2b consiste esencialmente en los aminoácidos 109 a 180 de SEQ ID NO: 22, o consiste esencialmente en los aminoácidos 109 a 173 de SEQ ID NO. 22, o consiste esencialmente en los aminoácidos 113 a 180 de SEQ ID NO. 22, o consiste esencialmente en los aminoácidos 113 a 173 de SEQ ID NO. 22. El experto en la materia apreciará que las extremidades de un dominio tal pueden no necesariamente definirse de forma no ambigua con una precisión de base única y que puede entenderse que el sitio 2b comprende, en uno o ambos extremos de la secuencia o secuencias mencionadas, 1, 2 o 3 aminoácidos más o menos. Por lo tanto, cuando se hace referencia en el presente documento al sitio 2b de CD127, esto debe entenderse que se refiere a una secuencia de CD127 que comienza en la posición 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113 y termina en la posición 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 o 180 de SEQ ID NO: 22; en particular a una secuencia de este tipo que se cree o se muestra que constituye un sitio de unión esencial con la cadena yc de IL7-R, en particular en presencia de IL-7. Más particularmente, cuando se hace referencia en el presente documento al sitio 2b de CD127, esto debe entenderse que se refiere a una secuencia de CD127 que comienza en la posición 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113 y termina en la posición 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 o 133 de SEQ ID NO: 22, pero también a una secuencia de c D127 que comienza en la posición 162, 163, 164, 165 o 166 y termina en la posición 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 o 180 de SEQ ID NO: 22. Cabe señalar que las tres hojas beta como se definen en el presente documento pueden comprender secuencias de epítopos específicas para anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno de acuerdo con la invención. Los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno y los miméticos de unión a antígeno de acuerdo con la invención pueden unirse específicamente a SEQ ID NO: 32, SeQ ID NO: 33 y/o SEQ ID NO: 34. Adicionalmente, una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una porción de una hoja beta y algunos aminoácidos contiguos localizados en un extremo de cualquier hoja beta también puede ser una secuencia de epítopo específica para un anticuerpo de acuerdo con la invención. Como un ejemplo, la secuencia s Eq ID NO: 35 (TLLQRKLQPAAMYEI) comprende los últimos cinco aminoácidos de la tercera hoja beta y diez aminoácidos extra localizados fuera de la tercera hoja beta. Como otro ejemplo, la SEQ ID NO. 96 (RKLQPAAM) comprende un aminoácido localizado dentro de la tercera hoja beta y siete aminoácidos extra localizados fuera de la tercera hoja beta. En particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de unión a antígeno de acuerdo con la invención puede unirse específicamente a R173 de SEQ ID NO: 22. En particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de unión a antígeno de acuerdo con la invención puede unirse específicamente a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 96. En particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de unión a antígeno de acuerdo con la invención puede unirse específicamente a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No : 36 (LVEv Kc LNFR); SEQ ID NO: 37 (ICGALVEVKCLNFR) y SEQ ID NO: 38 (LVEVKCLNFRK). Alternativa o complementariamente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o mimético de unión a antígeno de acuerdo con la invención puede unirse específicamente a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39 (KKFLLIG); SEQ ID NO: 40 (KKFLLIGKSNI) y SEQ ID NO: 41 (FIETKKFLLIG). SEQ ID NO: 36 a SEQ ID NO: 41 se localizan dentro del dominio D1 de CD 127 y son secuencias de epítopos reconocidas por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o una molécula mimética de anticuerpo de acuerdo con la invención. En una realización alternativa o complementaria de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o una molécula mimética de anticuerpo de acuerdo con la invención puede unirse específicamente a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42 (CLNFR) y SEQ ID NO: 43 (FIETKKF). Estas dos secuencias son secuencias de epítopos localizadas dentro del dominio D1 de CD127. En una realización particular de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno de acuerdo con la invención puede unirse específicamente a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO. 96, en particular del grupo que consiste en SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 96; y al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, en particular del grupo que consiste en SEQ ID NO. 42 y SEQ ID NO. 43. En una realización preferida de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede unirse específicamente a SEQ ID NO 34 y al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 42 y SEQ ID NO 43, en particular a SEQ ID NO. 42 y SEQ ID NO. 43. En una realización preferida de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede unirse específicamente a SEQ ID NO: 35 y al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, en particular a SeQ ID NO. 42 y SEQ ID NO. 43. En una realización preferida de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede unirse específicamente a SEQ ID NO: 96 y al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, en particular a s Eq ID NO. 42 y SEQ ID NO. 43. En una realización preferida de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede unirse específicamente a ambas secuencias SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 96. En una realización preferida de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede unirse específicamente a ambas secuencias SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43. En una realización particular de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno de acuerdo con la invención puede reconocer específicamente al menos la tercera hoja beta del sitio 2b del dominio D2 de CD127. La tercera hoja beta se define preferentemente estando localizada entre los aminoácidos 166 y 173 de SEQ ID NO: 22, correspondiente a SEQ ID NO. 34 y más particularmente la tercera beta corresponde a SEQ ID NO. 34. En una realización más particular de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno de acuerdo con la invención puede reconocer específicamente al menos dos de las hojas beta localizadas dentro del sitio 2b del dominio D2 y, más particularmente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno de acuerdo con la invención puede reconocer específicamente las tres hojas beta localizadas dentro del sitio 2b del dominio D2 como se define anteriormente en el presente documento. En una realización más particular de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede reconocer específicamente al menos una hoja beta localizada dentro del sitio 2b del dominio D2, en particular la tercera hoja beta correspondiente a SEQ ID NO. 34 y se une a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43. En una realización preferida de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede reconocer específicamente al menos la tercera hoja beta correspondiente a SEQ ID NO: 34 y al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, en particular a SeQ ID NO. 42 y SEQ ID NO. 43. En una realización más particular de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede reconocer específicamente un péptido lineal o un epítopo lineal que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Alternativa o complementariamente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede reconocer específicamente un péptido conformacional o un epítopo conformacional que consiste en los aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO. 96. En una realización más particular, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o mimético de unión a antígeno puede reconocer específicamente un epítopo lineal o un péptido lineal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y un epítopo conformacional o un péptido conformacional de SEQ ID NO: 96.
Señalización de IL-7R. La unión de IL-7 a IL-7R desencadena la activación de varias rutas de señalización, incluyendo las Janus quinasas (JAK) -1 y -3, transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5) y fosfatidilinosol 3-quinasa (PI3-k). Se informa que las rutas STAT1 y STAT3 están activadas, aunque no parecen ser las rutas principales. La activación de la ruta STAT5 es necesaria para la inducción de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y la prevención de la entrada de la proteína proapoptótica Bax en la mitocondria y, por lo tanto, para la supervivencia de los precursores de células T en desarrollo tímico. La activación de la ruta PI3-k da como resultado la fosforilación y retención citoplásmica de la proteína proapoptótica Bad.
Señalización de TSLPR. La linfopoyetina del estroma tímico, (TSLP) es una citocina de células epiteliales que actúa en la linfopoyesis y, en particular, está implicado en la regulación del desarrollo de las células del sistema inmunológico, impactando dicha regulación en particular en la maduración de dichas células. La TSLP humana (número de registro de Genbank AF338732) es un factor que ejerce la polarización de las células dendríticas y promueve la proliferación y diferenciación de las células T y B. TSLP también suprime la generación de células T reg (Lei et al., 2011).
Se ha demostrado que las rutas de señalización inducidas por TSLP son diferentes, a nivel molecular, de las rutas inducidas por IL-7. En particular, mientras que la unión de TSLP a su receptor también activa Jak-1, no activa Jak-3 pero activa Jak-2. Estas diferencias son consistentes con la observación de que Jak-1 se asocia con CD127, compartido por ambos receptores mientras que Jak-2 se asocia con CRLF2 y Jak-3 con yc (Rochman et al., 2010). La activación de la ruta STAT5 también se informa para la señalización inducida por TSLP (Zhong et al., 2014). Un efecto importante de TSLP es conducir a la activación de células dendríticas, induciendo la sobreexpresión de moléculas coestimuladoras tales como CD80, promoviendo de esta manera respuestas inflamatorias mediadas por TH-2 (Reche et al., 2001).
Biología celular
"Células positivas para CD127" designa células que expresan CD127 en su superficie celular. En la mayoría de los casos, las células positivas para CD127 expresan CD127 en un complejo que forma las IL-7R (células positivas para IL-7R) y/o en un complejo que forma las TSLPR (células positivas para TSLPR). CD127 se expresa por diversas células, incluyendo ambas células T de memoria y vírgenes. CD 127 se expresa en particular por células T efectoras (Tef), incluyendo células T en reposo y de memoria y por células B inmaduras, pero especialmente no se expresa por las células T reguladoras naturales en reposo (Treg natural). CD 127 es esencial para promover la diferenciación de timocitos y la expansión clonal de linfocitos.
Varios estudios recientes subrayan la importancia de la ruta IL7-CD127 para la homeostasis de células T vírgenes, que muestran que los niveles de expresión de CD127 unido a membrana en células T CD4+ convencionales se correlacionan con frecuencias de células T de emigración tímica reciente (RTE)-CD4+ en individuos sanos y pacientes infectados por el VIH, así como en pacientes con EM (Albuquerque et al., 2007) (Broux et al., 2010). CD127 también es un componente del receptor TSLP. La secreción de TSLP por los corpúsculos de Hassall, estructuras compuestas por células epiteliales en la médula tímica, se ha demostrado que condiciona las células dendríticas mieloides (MDC) CD11c+ para inducir la diferenciación de timocitos en Treg (Watanabe et al., 2005a). En consecuencia, las señales del receptor de IL-7 son necesarias para el desarrollo de Treg como se muestra en ratones de inactivación génica para CD127 (Mazzucchelli et al., 2008). En (Haas et al., 2011), los autores mostraron una expresión reducida de CD127 en las células T convencionales y niveles plasmáticos de IL-7 regulados positivamente junto con una reducción de las frecuencias recientes de Treg de emigrantes tímicos y la función de Treg en EM, sin una clara influencia genética (Haas et al., 2011).
La disección de cómo la IL-7 regula el tráfico de la membrana del receptor afín es fundamental para comprender en profundidad el papel de la IL-7/IL-7R en la función de los linfocitos. Estudios anteriores han sugerido que la estimulación de las células T con IL-7 conduce a una modulación descendente de superficie de CD127 en 30 minutos, posiblemente debido a la internalización del receptor. En puntos de tiempo posteriores (2-6 horas), se demostró que la IL-7 induce la disminución de la transcripción de CD127. Sin embargo, la dinámica real de internalización de CD127 y la regulación de los mecanismos de tráfico por IL-7 aún no se han dilucidado (Henriques et al., 2010). También se sugirió que la señalización inducida por IL-7 depende de la internalización de CD127 y que la degradación posterior del receptor se basa en la actividad de JAK3 y está mediada tanto por proteasomas como por lisosomas.
Fisiopatología
Las células dendríticas expresan altos niveles de moléculas coestimuladoras después de la maduración, tales como CD80, que promueve respuestas inmunitarias mediadas por células T. También producen la citocina TARC (CCL17), que induce la quimiotaxis en las células T. Como tal, las células dendríticas maduras contribuyen a la fisiopatología de varias enfermedades inmunomediadas en las que intervienen las respuestas de las células T, como por ejemplo en asma, artritis reumatoide, colitis, esclerosis múltiple y uveítis. Las células dendríticas maduras también juegan un papel clave en el proceso de rechazo de las células, tejidos o aloinjertos de órganos. Por lo tanto, muchas estrategias terapéuticas tienen por objeto prevenir la maduración de las células dendríticas.
La presencia o ausencia de moléculas coestimuladoras en células presentadoras de antígeno (APC), tales como las células dendríticas influye significativamente en la naturaleza cualitativa y cuantitativa de una respuesta inmunitaria. La sobreexpresión de CD80 por las células dendríticas provoca la maduración de las DC y aumenta la activación de las células T de memoria (Bour-Jordan et al., 2011). Mecanicísticamente, la interacción de CD28 con CD80 ocupa el grupo central de la sinapsis inmunitaria y se colocaliza con el TCR acoplado, estabilizando de esta manera la sinapsis inmunitaria (Dustin y Shaw, 1999) (Grakoui et al., 1999). La interacción entre CD28 y CD80 realmente genera el espacio apropiado para que el TCR interactúe de manera eficiente con moléculas de HLA (Shaw y Dustin, 1997).
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria desmielinizante del sistema nervioso central (SNC). La aparición de placas desmielinizantes en el SNC de pacientes con EM se asocia a un infiltrado inflamatorio compuesto principalmente por macrófagos y linfocitos T. A nivel mecanicista, la EM se considera una enfermedad autoinmunitaria. La e M se considera típicamente una enfermedad mediada principalmente por células T CD4+. Los subconjuntos particulares de CD4+: Th1 y más recientemente Th17, estaban implicados en la fisiopatología de la enfermedad. En la actualidad, todavía es difícil asignar roles específicos a cada subpoblación Th1 y Th17. Adicionalmente, la inhibición del tráfico de leucocitos por antagonismo de la alfa4 (a 4)-integrina se ha validado ahora como un enfoque terapéutico para el tratamiento de enfermedades inflamatorias como la EM y la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y también para el tratamiento de la aterosclerosis (Zhi et al., 2014). a4p7 se expresa en un conjunto más restringido de leucocitos que incluyen macrófagos activados, subconjuntos de linfocitos, células NK, mastocitos y eosinófilos.
La IL-7 humana induce una fuerte expresión de las integrinas a4 y p7 in vitro en los linfocitos T humanos y aumenta drásticamente la frecuencia de los linfocitos T humanos que expresan a4, p7 y a4/p7 integrinas, que son necesarios para la localización y retención de los linfocitos T en tejidos no linfoides como tales el intestino, cerebro y piel (Denucci et al., 2009; Gorfu et al., 2009).
Las células T vírgenes son en parte responsables del rechazo agudo de órganos y tejidos trasplantados. Estas células pueden controlarse por los fármacos inmunosupresores actuales (inhibidores de la calcineurina) y por anticuerpos monoclonales que bloquean la coestimulación (anti-adhesión, inhibidores de CD80/86). Las células T de memoria también son responsables del rechazo del trasplante. Las células T de memoria se acumulan en el hombre debido a la historia inmunitaria adquirida, principalmente reacciones anteriores contra virus. Se ha demostrado que los aloantígenos pueden reactivar las células T de memoria como resultado de la "inmunidad heteróloga", que es la reacción cruzada de nuestras defensas antivíricas con aloantígenos (Adams et al., 2003). La inmunidad heteróloga representa una barrera potente para la inducción de tolerancia, ya que las células T de memoria, a diferencia de las células T vírgenes, están programadas para activarse rápidamente, con un requisito reducido de señales coestimuladoras. Las células T de memoria también pueden estar implicadas en el rechazo crónico. Además de su función en el trasplante de órganos y tejidos, las células T vírgenes y de memoria también son corresponsables de muchas enfermedades autoinmunitarias. Este es el caso de colitis ulcerosa (Shinohara et al., 2011), artritis reumatoide, psoriasis o enfermedad de injerto contra hospedador.
Las enfermedades inflamatorias del intestino (EII), tales como colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC), son trastornos gastrointestinales crónicos recidivantes caracterizados por inflamación intestinal crónica, respuestas inmunitarias desreguladas a la microbiota intestinal y disfunción de la barrera epitelial (Khor et al., 2011; Abraham y Cho, 2009). Las tasas de incidencia y prevalencia de la EII están aumentando en todo el mundo y estas enfermedades están asociadas a una morbilidad marcada y tienen un impacto importante en la calidad de vida y la capacidad para trabajar (Danese y Fiocchi, 2011; Baumgart y Sandbom, 2012). Los tratamientos convencionales actuales tienen como diana amortiguar la inflamación con el uso gradual de agentes antiinflamatorios, fármacos inmunosupresores y agentes biológicos dirigidos a citocinas inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Una característica clave de la EII es también el rápido reclutamiento y la persistencia prolongada de leucocitos en el sitio de la inflamación, que está permitida por la interacción de las integrinas con receptores afines expresados por las células endoteliales que permiten la adhesión y transmigración celular (Adams y Eksteen, 2006; Agace, 2006). Las terapias emergentes se dirigen a esta puerta de entrada al intestino con moléculas anti-adhesión, especialmente dirigidas a la ruta de las integrinas a4p7 específicas del intestino (Feagan et al., 2013; Sandbom et al., 2013)78 Sin embargo, estas terapias no mantienen la remisión en más de la mitad de los pacientes, produciéndose brotes recurrentes en una alta proporción de respondedores primarios. Las infecciones oportunistas también se desarrollan como consecuencia de la inmunosupresión general. Por lo tanto, una de las metas principales es proporcionar tratamientos novedosos para la EII e identificar los marcadores que determinan la cronicidad, la respuesta y la recidiva de la EII.
Adicionalmente, se ha demostrado que varias células malignas presentan IL-7R. Este es el caso del linfoma cutáneo de Sezary (60 % de ellos) o la leucemia linfoblástica aguda infantil en la que aproximadamente el 15 % de los casos desarrollan una mutación de ganancia de función en CD127, haciendo que estos tumores sean parcialmente dependientes de IL-7 (Shochat et al., 2011).
El agotamiento de los linfocitos T ha sido un enfoque inmunosupresor obvio para contrarrestar el rechazo del aloinjerto o combatir la autoinmunidad. Sin embargo, el agotamiento total de células T podría no ser favorable para la inducción de tolerancia inmunológica. Dirigirse a subpoblaciones de células T o células T activadas selectivamente, sin modificar las células Treg, podría constituir un enfoque pro-tolerogénico (Haudebourg et al., 2009). Por lo tanto CD127 podría considerarse una diana terapéutica potencialmente atractiva para los anticuerpos monoclonales (Mab) destinados a modular las respuestas inmunitarias, ya que tales anticuerpos monoclonales podrían tener el potencial de reducir los linfocitos efectores pero no los reguladores. En consecuencia, se ha asumido que podrían mostrar efectividad en el trasplante, la autoinmunidad (Michel et al., 2008) y las neoplasias malignas al antagonizar el acceso de IL-7 a IL-7-R y, por lo tanto, limitar la función y el crecimiento de las células T y B.
Una terapia con un anticuerpo monoclonal contra las células CD127+ que interfiera con la ruta de la IL-7 podría cumplir esa meta eliminando/neutralizando las células T vírgenes y de memoria y/o reduciendo su número mientras se conservan las células Treg o eliminando o reduciendo el número de células CD127-positivas malignas. Sin embargo, una terapia con un anticuerpo monoclonal contra las células CD127+ podría actuar como una espada de doble filo si conduce a la activación de las células dendríticas. De hecho, CD 127 también se expresa por células dendríticas en asociación con CRLF2, formando el receptor TSLP. En presencia de TSLP, las células dendríticas se activan y promueven respuestas inmunitarias mediadas por células T. Algunos anticuerpos monoclonales contra CD127, presumiblemente modificando la forma en que TSLP interactúa con el receptor de TSLP, tienen la propiedad de aumentar la maduración de las células dendríticas inducida por TSLP. Como consecuencia, una terapia con un anticuerpo monoclonal contra CD127 que no aumentaría la maduración de las células dendríticas inducida por TSLP presentaría una ventaja terapéutica. Presentaría el beneficio del bloqueo de IL7R sin el inconveniente de activar las células dendríticas en un entorno inflamado que contiene TSLP.
En una publicación (Racapé et al., 2009) los autores analizaron el interés del receptor alfa de IL-7 (IL7Ra) como potencial diana terapéutica en el trasplante. Habiendo revisado la expresión de IL-7Ra en diversas células T y células que responden a IL-7, los autores determinaron si dirigirse a las células T de memoria que expresan IL-7Ra podría prolongar la supervivencia del aloinjerto en ratones y concluyeron que dirigirse a IL-7 o IL-7Ra ahorraría ventajosamente las células Treg. Entre las perspectivas, los autores señalaron que la selección de IL-7 o IL-7Ra en el tratamiento terapéutico podría tener diferentes consecuencias sobre la supervivencia de las células que expresan CD 127 y podría provocar diferentes tipos de linfopenia. También se planteó desde un punto de vista conceptual la cuestión de los efectos de los anticuerpos que estarían dirigidos contra IL-7Ra dependiendo de si serían anticuerpos bloqueantes o neutralizantes o citotóxicos. Sin embargo, los autores no demostraron haber obtenido y ensayado tales anticuerpos y más bien expresaron la necesidad de realizar más estudios para evaluar la relevancia de la hipótesis.
En vista de los inconvenientes de los enfoques terapéuticos disponibles en enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario y otras enfermedades que implican a IL-7/IL-7Ra tales como diferentes tipos de cánceres, incluyendo algunos cánceres de mama, todavía se necesitan más candidatos a fármacos, especialmente para candidatos activos con respecto a dianas más selectivas con el fin de controlar, por ejemplo, la activación inmunitaria moduladora en pacientes humanos.
En este contexto, los anticuerpos monoclonales contra IL-7Ra que tienen propiedades antagonistas de IL-7Ra se han descrito en el documento WO2010/017468 y sus versiones humanizadas en el documento WO2011/094259 con vistas a tratar enfermedades autoinmunitarias como esclerosis múltiple. Se dice que los anticuerpos descritos son antagonistas de la unión de IL-7 a su receptor y activos contra la expansión y la supervivencia de células Th17 y Th1 que se dice que requieren la interacción de iL-7 con su receptor Cd 127. El efecto de estos anticuerpos sobre la maduración de las células inmunitarias, y particularmente de las células dendríticas, no ha sido considerado. Aparte, se dice que estos anticuerpos no inhiben la producción de TARC inducida por TSLP (p.107 del documento WO2011/094259). De manera similar, los anticuerpos anti-CD127 informados en el documento WO2011/104687 o en el documento WO2013/056984, que están contemplados para su uso en el tratamiento de diabetes, lupus, artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunitarias, no se han analizado con respecto a su posible efecto sobre la maduración de las células dendríticas y no se ha informado de su interacción con la señalización inducida por TSLP. Además, según lo publicado por Kern et al (Kern et al., 2013; Kern et al., 2015) y como se muestra en el presente documento, los anticuerpos anti-CD127 de la técnica anterior inducen la internalización del receptor. Dado que los anticuerpos antagonistas anti-CD 127 que también inducen la internalización de CD127 no controlan la hipersensibilidad cutánea de tipo IV, mientras que los anticuerpos antagonistas anti-CD127 que no inducen la internalización sí lo hacen, puede ser que el proceso de internalización active la ruta de señalización, mitigar el efecto antagonista de los anticuerpos. Por último, los anticuerpos de la técnica anterior reconocen un epítopo que no comprende ninguna secuencia del sitio 2b de CD127 (es decir, en particular de los aminoácidos 109-180 de SEQ ID NO: 22, o en particular de los aminoácidos 109-173 de SEQ ID NO. 22, o en particular de los aminoácidos 113-180 de la SEQ ID NO. 22, o en particular de los aminoácidos 113-173 de SEQ ID NO. 22); y no se ha demostrado que interrumpa la unión de CD127 con la cadena yc del IL7-R.
A pesar del interés reciente en el desarrollo de anticuerpos CD127, los esfuerzos se han concentrado de esta manera en la inhibición de la señalización de IL-7R inducida por IL7. Sin embargo, TSLP y TSLPR han estado implicados en una serie de patologías. Se ha demostrado que TSLP desempeña un papel en las enfermedades de la piel y los pulmones (He y Geha, 2010) y se asocia a diversas patologías incluyendo la enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias y la dermatitis atópica en humanos y ratones (Ying et al., 2008) (Jariwala et al., 2011). Además, se ha demostrado que el TSLP se asocia a la regulación de la inmunidad e inflamación intestinal (Taylor et al., 2009). Otras patologías que implican TSLP y TSLPR incluyen leucemia de células B pediátrica (van Bodegom et al., 2012), trastornos alérgicos específicos de pulmón y piel, enfermedades relacionadas con la autoinmunidad (Roan et al., 2012) y cáncer, incluyendo cáncer de mama (Olkhanud et al., 2011).
Los anticuerpos que no muestran el efecto de aumentar la maduración de las células dendríticas y/o que no inducen la internalización de CD127 y/o que inhiben la internalización inducida por IL7 se desvelaron en el documento WO 2015/189302. Dichos anticuerpos, denominados N13B2 (anticuerpo quimérico), N13B2-h1, N13B2-h2 y N13B2-h3 (N13B2 humanizado) en dicha solicitud y en lo sucesivo en el presente documento, tienen alta eficiencia, especialmente in vivo y, en particular, se demostró que tienen un efecto rápido sobre las células T de memoria efectoras, como se define en lo sucesivo en el presente documento. Sin embargo, dichos anticuerpos están humanizados en un grado limitado y su eficiencia de producción también es limitada. Por otra parte, no se ha informado de ningún efecto duradero de dichos anticuerpos sobre las células T de memoria efectoras.
La presente divulgación se refiere a herramientas para el diseño de novedosos anticuerpos adecuados como candidatos terapéuticos para la administración a pacientes con o en riesgo de una enfermedad que implica rutas de señalización de IL-7. De acuerdo con diversos enfoques proporcionados en el presente documento, tales herramientas mejoran la preparación de anticuerpos destinados a la administración a hospedadores humanos. Tales herramientas comprenden anticuerpos en particular humanizados, particularmente monoclonales, que comprenden todas las secuencias de CDR de N13B2-h3.
Tales polipéptidos (o polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos) se proporcionan en particular para la producción de anticuerpos (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) y/o como anticuerpos (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos), particularmente que se une específicamente a CD 127; dichos anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, comprenden un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7, o tienen dicha secuencia con mutaciones adicionales, en particular sustitución, deleción o inserción de cuatro restos, preferentemente tres o dos restos e incluso más preferentemente un resto, preferentemente en donde dichas mutaciones no están ni en las secuencias de CDR ni en las posiciones canónicas o Vernier de las secuencias marco.
Los anticuerpos proporcionados en el presente documento son preferentemente anticuerpos monoclonales, lo que significa que una composición de estos anticuerpos es homogénea, especialmente idéntica, en términos de especificidad de unión a antígenos y, en consecuencia, en términos de composición de región variable.
La invención proporciona anticuerpos que comparten las CDR del anticuerpo N13B2-h3 pero tienen una estructura de dominio variable de cadena ligera distinta. Los inventores han demostrado sorprendentemente que los anticuerpos que comprenden las mismas CDR del dominio variable de cadena ligera de N13B2-h3, es decir, las CDR con SEQ ID NO: 4 y 5 y 6 pero que comprenden una secuencia de dominio variable de cadena ligera diferente, es decir, de SEQ ID NO: 9; de SEQ ID NO: 10; de SEQ ID NO: 11 o de SEQ ID NO: 12; aunque extensamente humanizados, se producen altamente en comparación con N13B2-h3 (hasta 4 veces más), conservando todas las características funcionales.
La presente divulgación proporciona medios adecuados en este contexto, que comprende en particular anticuerpos monoclonales específicos contra IL-7Ra. En realizaciones particulares, dichos anticuerpos interfieren solo negativamente con la ruta de TSLP. En consecuencia, en realizaciones preferidas, dichos anticuerpos no aumentan la maduración de células dendríticas inducida por TSLP. Además o como alternativa, en realizaciones particulares, dichos anticuerpos no inducen la internalización de CD127 y/o inhiben la internalización de CD127 inducida por IL7. En realizaciones particulares, dichos anticuerpos combinan estas propiedades relacionadas con la internalización y/o maduración de d C con actividad antagonista hacia la señalización de IL-7/IL-7-R. En realizaciones particulares, dichos anticuerpos inhiben la expresión de integrinas a4, p7 y a4/p7 inducida por IL7 en células T, en particular in vivo. En realizaciones particulares, dichos anticuerpos ejercen una acción citotóxica contra células CD127+ diana que reducen físicamente su número (contracción de la subpoblación). Además o como alternativa, en realizaciones particulares dichos anticuerpos comprenden al menos el 80 %, preferentemente al menos el 84 % o más del 84 % e incluso más preferentemente al menos el 85 % de restos humanos como se define en lo sucesivo en el presente documento. Además o como alternativa, en realizaciones particulares dichos anticuerpos se producen al menos tan eficientemente como N13B2-h3, preferentemente al menos dos veces más eficientemente, como se define en lo sucesivo en el presente documento. Además o como alternativa, en realizaciones particulares dichos anticuerpos tienen un efecto rápido y/o duradero sobre las células T de memoria efectoras.
En particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento comprenden una cadena pesada variable (VH) que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:
VHCDR1 SEQ ID NO: 1;
VHCDR2 SEQ ID NO: 2;
VHCDR3 SEQ ID NO: 3,
la cadena VH que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7:
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAVSGFTLSDYYMAWIRQAPGKGLEWVSTISASGLRTYYPD
SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPLSAHYGFNYFDYWGQGTLVTVSS.
Dicha cadena pesada variable está, en particular, unida a la cadena pesada constante que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 26 para constituir una cadena pesada de anticuerpo completa.
En particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento comprenden una cadena VL que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, la secuencia de SEQ ID NO: 11 y la secuencia de SEQ ID NO: 12, en particular la secuencia de SEQ ID NO: 12:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYQGLAWYQQKPGKAPKLLLYSANTLHIGVPSRFSG SGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYYDYPLAFGGGTKVEIK. Dicha cadena ligera variable está, en particular, unida a la cadena ligera constante que consiste en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, en particular SEQ ID NO: 27, para constituir una cadena ligera de anticuerpo completa.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, se une específicamente a CD127, en particular a CD127 humano y comprende:
- una cadena ligera de anticuerpo que comprende o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID No : 11; SEQ ID NO: 12; en particular SEQ ID NO: 12; y
- un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7. En una realización más particular de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, se une específicamente a CD127 humano y comprende:
- un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo o una cadena ligera de anticuerpo de acuerdo con la invención, particularmente que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, en particular SEQ ID NO: 12; y
- un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7. Unión de CD127
De acuerdo con la invención, "unión" a la proteína IL-7Ra se refiere a una interacción de tipo antígeno-anticuerpo y abarca propiedades de "unión específica" de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos cuya unión específica significa que los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a la proteína IL-7Ra mientras no se unen o se unen con una afinidad significativamente más débil a otras proteínas (por ejemplo, la cadena y del receptor de citocinas común). La unión específica se define y/o se determina preferentemente en condiciones fisiológicas, especialmente en términos de pH y contenido de sal de la solución de prueba. La unión y la especificidad de unión pueden ensayarse de acuerdo con las pruebas descritas en los Ejemplos y, en particular, pueden ensayarse mediante biosensor, Blitz, Biacore, ELISA o análisis de Transferencia Western.
En realizaciones particulares, los anticuerpos proporcionados en el presente documento se dirigen y se unen a la cadena alfa de IL-7-R cuando forma un complejo en el receptor de TSLP (con CCRF2; Número de registro de Genbank AF338733; Reche et al., 2001). En realizaciones particulares, los anticuerpos proporcionados en el presente documento se unen a CD127 como una proteína aislada con una constante de afinidad (KD) igual o menor que 5E-9 M, como puede determinarse por análisis de biosensor, en particular por el método Blitz. En realizaciones particulares, las propiedades de unión de los anticuerpos se determinan o se definen usando un antígeno de CD127 humano que comprende las secuencias de ep1 (SEQ ID NO: 19) y/o ep2 (SEQ ID NO: 20). En realizaciones particulares, el antígeno comprende un fragmento de CD127 humano que comprende tanto ep1 como ep2 (es decir, el antígeno comprende las secuencias de ep1 y ep2 y las secuencias intercaladas de CD127 humano). En realizaciones particulares, los anticuerpos proporcionados en el presente documento tienen al menos la misma afinidad por dicho antígeno que el anticuerpo N13B2-h3 descrito en el documento WO 2015/189302, y/o como el anticuerpo N13B2-hVL6 desvelado en el presente documento (teniendo el VH tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7 y teniendo el VL la secuencia de SEQ ID NO: 12) y/o como el anticuerpo con el VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7 y el VL con la secuencia de SEQ ID NO: 10 o con la secuencia de SEQ ID n O: 11.
Los métodos para probar la unión de los anticuerpos a su diana, ya sea CD127 de larga duración, aislado o como TSLPR o IL7R, o un antígeno de los mismos como anteriormente, que comprende en particular el método Blitz, son conocidos por la persona experta y se ilustran en particular en la Figura 3, Ejemplo 3 y Ejemplo 4 en el presente documento y en la p. 14, Figuras 3, 4 y 6 y las respectivas leyendas, y Ejemplos 1, 2, 6, 7 del documento WO 2015/189302.
Ausencia de maduración de células dendríticas inducida por TSLP aumentada
Los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden unirse a CD127 en el receptor de TSLP (es decir, pueden unirse a CD127 cuando está en un complejo con CRLF2, formando el receptor TSLP). Por lo tanto, los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden interferir con la señalización inducida por TSLP y/o mediada por el receptor de TSLP. Preferentemente, los anticuerpos proporcionados en el presente documento no se sinergizan con TSLP para la maduración de las células inmunitarias, en particular células dendríticas. En otras palabras, los anticuerpos de la invención no aumentan la maduración de las células inmunitarias inducida por TSLP. Este efecto es particularmente deseado en la maduración de las células dendríticas. Los medios para medir tal efecto son conocidos por los expertos y se describen en particular en el documento WO 2015/189302 en las páginas 16-17 y en el Ejemplo 9 del mismo. En particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento no aumentan la expresión de CD40 en más del 50 % en comparación con la estimulación con TSLP solo (sin anticuerpo). Preferentemente, la expresión de CD40 no aumenta en más del 25 %, preferentemente en no más del 10 % e incluso más preferentemente en no más del 5 %. En realizaciones particularmente preferidas, la expresión de CD40 no aumenta o disminuye en las células estimuladas con TSLP y con dichos anticuerpos en comparación con las células estimuladas con TSLP solo.
Inhibición de la expresión de integrinas a4, p7 y a4/p7 inducida por IL7
En realizaciones particulares, los anticuerpos proporcionados en el presente documento inhiben la expresión de integrinas a4, p7 y a4/p7 inducida por IL7 in vitro. La expresión de integrinas a4, p7 y a4/p7 inducida por IL7, como se usa en el presente documento, designa cualquiera o ambos del aumento en el nivel de expresión de las integrinas a4 y p7 y el aumento en el número o proporción de linfocitos T que expresan integrinas a4, p7 y/o a4/p7. La inhibición puede ser parcial, es decir, el nivel de expresión de integrinas a4, p7 y a4/p7 en presencia de IL7 se aumenta por encima del nivel inicial (es decir, el nivel sin anticuerpos ni IL7) en presencia de anticuerpos, pero menos que en ausencia de anticuerpos; o la inhibición puede ser completa, es decir, el nivel de expresión de integrinas a4, p7 y a4/p7 en presencia de IL7 y del anticuerpo no es más alto que el nivel inicial.
En realizaciones particulares, los anticuerpos proporcionados en el presente documento inhiben la expresión de integrinas a4, p7 y/o a4/p7 in vitro, es decir, el nivel de expresión de integrinas a4, p7 y/o a4/p7 es menor en células tratadas con anticuerpos (y con y/o sin IL7) que en células no tratadas (es decir, sin anticuerpo o IL7). El grado de inhibición puede ser dependiente de la dosis. La inhibición de la expresión puede definirse, probarse y/o medirse más específicamente como se establece en el documento WO 2015/189302 en la p. 18, en particular el párrafo [58], y en el Ejemplo 16.
Inhibidores de la internalización de CD127
En una realización particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento inhiben la internalización de CD127 inducida por IL7. Por lo tanto, cuando se incuba con dichos anticuerpos, la presencia de IL7 no induce disminución en la expresión de CD127 en la superficie celular, o induce una disminución menos fuerte en la expresión de CD127 en la superficie celular que las células incubadas sin anticuerpos. En realizaciones particulares, cuando se incuba con dichos anticuerpos, el nivel de expresión de la superficie celular CD127 cuando las células se incuban a 37 °C durante 15 minutos con 5 ng/ml de IL7 es al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % del nivel de expresión de la superficie celular en células incubadas sin IL7. In vitro, la expresión de la superficie celular se mide preferentemente después de un tiempo limitado como se indicó anteriormente. Aparte, ya que la mayoría de los procesos de internalización celular se inhiben a baja temperatura, el efecto suele observarse mejor a temperatura fisiológica, en particular a 37 °C. Sin embargo, También se contempla incubar células a baja temperatura, en particular a 4 °C.
En una realización preferida, los anticuerpos proporcionados en el presente documento no inducen la internalización de CD 127. Por lo tanto, la expresión de la superficie celular de CD 127 en células incubadas en presencia de dichos anticuerpos no se reduce, o no se reduce significativamente, en relación con la expresión de la superficie celular en células incubadas en condiciones idénticas, pero en ausencia del anticuerpo. En realizaciones particulares, cuando se incuba a 37 °C durante 30 a 45 minutos en presencia de 50 ng/ml de anticuerpo, el nivel de expresión de la superficie celular CD127 es al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % de su nivel en células incubadas en ausencia del anticuerpo. Este efecto puede observarse en ausencia de IL7 (tanto en células tratadas como no tratadas con anticuerpos), en presencia de IL7 y/o ambos.
Las dos características relacionadas con la internalización de CD127 descritas anteriormente (es decir, la inhibición de la internalización inducida por IL7 o la no inducción de internalización) pueden definirse y/o probarse adicionalmente como se establece en el documento WO2015/189302 en particular en los párrafos [59]-[63] en las páginas 19-20 y en la Figura 16 y el Ejemplo 5.
Interrupción de CD127 - interacción de la cadena yc
De acuerdo con una realización particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden interrumpir la unión de CD127 a la cadena yc de IL7-R. Esto significa que, en condiciones (en particular condiciones químicas y físicas) donde CD127 y la cadena yc se unen en ausencia de anticuerpo y, en particular, en presencia de IL7, la presencia de dichos anticuerpos reduce significativamente dicha unión. En realizaciones particulares, en presencia de anticuerpo y de IL7, CD127 no se une a yc. En particular, en presencia del anticuerpo y de IL7, la cantidad de cadena yc encontrada asociada con (o unida a) CD127 es menos del 80 %, preferentemente menos del 50 %, incluso más preferentemente menos del 25 % o el 10 % de la cantidad unida en ausencia del anticuerpo (o en presencia de otro anticuerpo anti CD-127 tal como MD707-13) en condiciones de otra manera idénticas, en particular en presencia de IL7. Tal característica del anticuerpo puede evaluarse en particular mediante métodos de coinmunoprecipitación, bien conocidos por la persona experta en la prueba de la interacción de proteínas y se ilustra, por ejemplo, en el documento WO2015/189302 en el Ejemplo 21. En particular, las células pueden incubarse en presencia o ausencia del anticuerpo probado, después se solubilizan en condiciones que permitan la conservación de los complejos de proteínas, y el lisado resultante puede someterse a una inmunoprecipitación anti-CD 127 y la presencia de yc en el complejo inmunoprecipitado que contiene CD127 evaluarse por transferencia Western usando anticuerpos anti-Yc (a la inversa, la inmunoprecipitación puede realizarse usando anticuerpos anti-Yc y la presencia de CD127 evaluarse usando anticuerpos anti-CD127).
Antagonista hacia la interacción IL7-IL7-R
De acuerdo con una realización particular, una macromolécula, en particular un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la invención tiene además propiedades antagonistas de la interleucina 7 (IL7), antagonizando de esta manera el acceso, es decir, unión de IL7 a CD 127 en células CD 127 positivas.
"Propiedades antagonistas de la interacción IL7-IL7-R" significa que los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención, que se dirigen al IL7-Ralfa, tienen el efecto de prevenir la accesibilidad del receptor de IL7 expresado en las células CD127, especialmente células T efectoras humanas, en particular células T de memoria humanas, para su compañero de unión IL7, especialmente IL7 humana. Como resultado de antagonizar la unión de IL7, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos funcionales conducen a linfopenia al evitar la generación de células T tímicas dependientes de IL7.
Las propiedades antagonistas pueden ser, en particular, el antagonismo hacia la señalización de IL7-R inducida por IL7. Puede identificarse un antagonista de la señalización de IL7-R inducida por IL7 midiendo la inhibición de la fosforilación de STAT5 como se describe en los Ejemplos. La fosforilación de STAT5 inducida por IL7 es un marcador de activación de IL7-R y se espera que un anticuerpo que antagoniza la interacción IL7-IL7-R disminuya la fosforilación de STAT5 inducida por IL7.
En realizaciones particulares, la macromolécula de la invención es un antagonista de la señalización de IL7-R inducida por IL7. En una realización particular, la macromolécula de la invención inhibe la fosforilación de STAT5 inducida por IL7. En realizaciones preferidas, la inhibición de la fosforilación de STAT5 es superior al 50 % a concentraciones de anticuerpos tan bajas como 55 ng/ml y/o la inhibición de la fosforilación de STAT5 es superior al 80 % a concentraciones de anticuerpos tan bajas como 100 ng/ml. La inhibición de la fosforilación de STAT5 puede evaluarse mediante métodos conocidos por la persona experta y, en particular, mediante el método establecido en la sección de ejemplos, en particular en el Ejemplo 5 y/o en la página 21, párrafos [69] y [70] y Ejemplo 3 del documento WO2015/189302.
También es deseable que la macromolécula de la invención (en particular anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o molécula mimética de anticuerpo) inhiba la activación y/o no active o aumente la activación, de las rutas de señalización de PI3-k y/o ERK (quinasa regulada por señal extracelular) y en particular inhibe la fosforilación y/o no induce ni aumenta la fosforilación de PI3-k y/o ERK 1 y/o ERK 2. En particular, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o molécula mimética de anticuerpo proporcionada en el presente documento, y en particular dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o molécula mimética de anticuerpo que es un antagonista de la interacción IL-7 - IL-7R, no induce la activación de las rutas PI3-k y/o ERK (preferentemente de las rutas PI3-k y ERK) y en particular no induce la fosforilación de PI3-k y/o de ERK 1 y/o ERK 2, más particularmente no induce la fosforilación de PI3-k y de ERK 1 y de ERK 2. En particular, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o molécula mimética de anticuerpo proporcionada en el presente documento, y en particular un anticuerpo tal, fragmento de unión a antígeno del mismo o molécula mimética de anticuerpo que es un antagonista de la interacción IL-7 - IL-7R, inhibe la activación de las rutas PI3-k y/o ERK y en particular inhibe la fosforilación de PI3-k y/o de ERK 1 y/o ERK 2, más particularmente inhibe la fosforilación de PI3-k y de ERK 1 y de ERK 2. La activación de las rutas y/o fosforilación de dichas proteínas, puede ensayarse mediante métodos conocidos por la persona experta y, en particular, mediante transferencia Western como se ilustra en la Figura 7 y el Ejemplo 8.
Antagonista de la unión de TSLP
Dado que los anticuerpos proporcionados en el presente documento se unen a CD127 en el IL7-R, también pueden unir CD127 en el TSLPR y, particularmente por impedimento estérico y/o por competencia en sitios de unión comunes, pueden inhibir la unión de TSLP al TSLPr . En otras palabras, los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden presentar actividad antagonista para la unión de TSLP.
Inhibidor de la producción de TARC inducida por TSLP
En una realización particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento inhiben la producción de TARC inducida por TSLP de células CD127 positivas. Como se ha mencionado anteriormente, Las células dendríticas estimuladas por TSLP producen niveles elevados de TARC. Esto puede resultar de su unión a TSLPR y su acción potencial como antagonistas de la unión de TSLP. En una realización particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento no aumentan la maduración de las células dendríticas (determinándose la maduración, por ejemplo, como una expresión aumentada del marcador de superficie celular CD40 y/o CD80).
El nivel de producción de TARC inducida por TSLP puede ser menor en las células tratadas con TSLP junto con los anticuerpos anti-CD 127 proporcionados en el presente documento que en las células tratadas con TSLP solo. En otras palabras, los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden ser inhibidores de la producción de TARC inducida por TSLP. En una realización de la invención, los anticuerpos proporcionados en el presente documento disminuyen los niveles de producción de TARC. En una realización particular, el nivel de producción de TARC en células tratadas con TSLP y un anticuerpo proporcionado en el presente documento se reduce en más del 10 %, preferentemente más del 20 %, en comparación con el nivel en células tratadas con TSLP solo, a concentraciones de anticuerpos tan bajas como 1 pg/ml. La medición de la producción de TARC puede llevarse a cabo en células inmunitarias CD127-positivas, en particular células dendríticas, a partir de una muestra de sangre usando cualquier método convencional conocido por la persona experta y se ilustra, por ejemplo, en el documento WO2015/189302 en el Ejemplo 9.
Actividad citotóxica
En una realización particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento son citotóxicos contra células humanas, especialmente células T humanas que expresan CD127. Las células humanas que expresan CD127 como una cadena del receptor de IL7, que son la diana de dichos anticuerpos, son principalmente linfocitos T y, más precisamente, son subpoblaciones de linfocitos T efectores incluyendo células T vírgenes y de memoria pero no son células T reguladoras (Treg), especialmente Treg naturales no en reposo. Las células T de memoria se generan como resultado del cebado de antígenos y se definen principalmente por sus características funcionales, incluyendo la capacidad de experimentar una proliferación de recuerdo tras la reactivación y diferenciación en células efectoras secundarias y de memoria. De manera similar, el receptor de TSLP dirigido (como un complejo que incluye la cadena alfa de IL-7-R) regula la diferenciación de linfocito T colaborador, célula B y célula dendrítica.
En particular, los anticuerpos proporcionados en el presente documento, que tienen "actividad citotóxica contra las células T" o propiedades citotóxicas (anticuerpos citotóxicos) dan lugar al agotamiento de la población de células T efectoras al matar estas células y, en consecuencia, reducen el número de estas células cuando se administran. A la inversa, dichos anticuerpos no alteran la subpoblación de células T reguladoras o no la alteran en un grado significativo, permitiendo que las células Treg realicen su función. En este contexto, en una realización particular, la proporción de células T reguladoras (Treg) frente a células T efectoras (Tef) aumenta después de la administración de dichos anticuerpos. En particular, los anticuerpos proporcionados en este documento permiten elevar dicha proporción de aproximadamente un 10 % o más. En particular, el aumento de la relación de Treg frente a Tef es de aproximadamente el 20 %.
En particular, los anticuerpos citotóxicos muestran Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés). Como alternativa, los anticuerpos proporcionados en el presente documento no tienen propiedades ADCC. El potencial de ADCC del anticuerpo puede considerarse positivo cuando la citotoxicidad específica es, por ejemplo, superior al 10 %. Las propiedades de ADCC pueden evaluarse en un ensayo de ADCC como el ensayo descrito en el Ejemplo 10 de WO2015/189302. Cuando el anticuerpo es un anticuerpo de rata, las células efectoras usadas en el ensayo de ADCC son preferentemente células LAK (asesinas activadas por linfocinas) de rata. Cuando los anticuerpos se humanizan, el ensayo de ADCC puede realizarse en particular en células NK humanas.
Los anticuerpos de la invención que tienen propiedades tanto citotóxicas como antagonistas para las células CD127 positivas permiten efectos acumulativos de estas propiedades con respecto al agotamiento de las células T efectoras, especialmente de las células T de memoria, permitiendo de esta manera un agotamiento más fuerte (agotamiento de la reserva de células CD127+) y la reducción correspondiente en el número de células T diana.
Los párrafos anteriores, así como los Ejemplos, describen cómo probar las características funcionales deseadas relevantes de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Las siguientes secciones detallarán diversas características estructurales y posibles modificaciones de los anticuerpos. A la luz de estas orientaciones, el experto en la materia podrá obtener anticuerpos que tengan las siguientes características estructurales junto con las características funcionales deseadas, en particular partiendo del anticuerpo N13B2-hVL6 que tiene las características funcionales deseadas.
Cuando esté destinado a la administración a seres humanos, es deseable que los anticuerpos presenten una homología lo más fuerte posible con los anticuerpos humanos, como conoce la persona experta. El grado de identidad con un anticuerpo humano se mide como el % de restos humanos en la secuencia del anticuerpo, en particular en el marco del dominio variable de la cadena ligera o pesada del anticuerpo, es decir, el % de restos en la secuencia del anticuerpo, en particular en el marco del dominio variable de la cadena ligera o pesada del anticuerpo, que son idénticos en la misma posición funcional al resto en el anticuerpo humano más homólogo conocido, en particular en el marco del dominio variable de cadena ligera o pesada de anticuerpo humano más homólogo conocido. Esta característica se expresa generalmente en el presente documento, como en la bibliografía, como "el anticuerpo A (o la secuencia marco de su dominio variable) tiene un xx % de restos humanos", lo que significa que el anticuerpo A (o la secuencia marco de su dominio variable) tiene un xx % de restos que son idénticos en la misma posición funcional a los restos del anticuerpo humano más homólogo conocido (o la secuencia marco de su dominio variable). Dicho grado de identidad puede medirse por medios conocidos por la persona experta y, en particular, con la herramienta DomainGapAlign del International Immunogenetics Information System (IMGT) como se aclaró durante la sesión abierta del Grupo de Expertos en INN de la OMS (abril de 2015). Preferentemente, los anticuerpos proporcionados en el presente documento tienen más del 80 %, incluso más preferentemente al menos el 84 %, más del 84 % e incluso más preferentemente al menos el 85 % de identidad con un anticuerpo humano, en particular como se determina usando la herramienta DomainGapAlign. Dicho grado de identidad puede determinarse solo para el dominio variable de la cadena ligera o solo para la cadena ligera (en comparación con un dominio variable o cadena ligera de la cadena ligera de un anticuerpo humano) o para la cadena ligera y la cadena pesada tomadas juntas, por comparación de cada cadena con la cadena de anticuerpo humano correspondiente más homóloga, e informando el porcentaje acumulado de identidad. Particularmente, el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo o la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con la invención comprende al menos el 80 %, más particularmente el 84 % e incluso más particularmente al menos el 85 % de restos humanos. Los dominios variables de la cadena ligera del anticuerpo particular proporcionados en el presente documento tienen respectivamente el 84,2 % (SEQ ID NO: 9); el 85,3 % (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11) y el 86,3 % (SEQ ID NO: 12) restos humanos. El dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo preferido proporcionado en el presente documento (SEQ ID NO: 7) tiene el 90,8 % de restos humanos.
Un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo proporcionado en el presente documento puede comprender hasta 135 aminoácidos, preferentemente hasta 120 aminoácidos e incluso más preferentemente hasta 110 o 107 aminoácidos. Un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo proporcionado en el presente documento puede comprender al menos 80, preferentemente al menos 90 e incluso más preferentemente al menos 100 o 106 aminoácidos. Un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo proporcionado en el presente documento puede comprender de 80 a 135, preferentemente de 90 a 120 e incluso más preferentemente de 105 a 110 aminoácidos.
Una cadena ligera de anticuerpo proporcionada en el presente documento puede comprender hasta 250 aminoácidos, preferentemente hasta 230 aminoácidos e incluso más preferentemente hasta 214 o 211 aminoácidos. Una cadena ligera de anticuerpo proporcionada en el presente documento puede comprender al menos 150, preferentemente al menos 190 e incluso más preferentemente al menos 200 o 210 aminoácidos. Una cadena ligera de anticuerpo proporcionada en el presente documento puede comprender de 150 a 250, preferentemente de 190 a 230 e incluso más preferentemente de 210 a 220 aminoácidos.
También se proporcionan en el presente documento polipéptidos que son (i) fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, en particular, fragmentos de unión a antígeno que consisten en o comprenden un fragmento de las cadenas ligeras del anticuerpo o las regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo proporcionadas en el presente documento, un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo proporcionado en el presente documento y/o (ii) moléculas miméticas de anticuerpo de los anticuerpos proporcionados en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno es un polipéptido que se une específicamente a la proteína CD 127 como se define anteriormente en la sección correspondiente (párrafos [44] a [47]) y comprende al menos las tres CDR de N13B2-h3 (que consisten en las secuencias de SEQ ID NO: 4 a 6), preferentemente un fragmento de los dominios variables de cadena ligera proporcionados en el presente documento (con SEQ ID NO: 9 a 12) que comprende dichas secuencias de CDR. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender al menos 40, preferentemente al menos 50 e incluso más preferentemente al menos 70 o 74 aminoácidos. Un fragmento de unión a anticuerpo puede comprender como mucho 100, preferentemente como mucho 90 e incluso más preferentemente como mucho 80 o 74 aminoácidos. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender de 40 a 100, de 50 a 90 y preferentemente de 60 a 100 e incluso más preferentemente de 50 a 70 o de 60 a 80 aminoácidos. Un fragmento de unión a antígeno como se proporciona en el presente documento puede tener, en particular, cualquiera de las características funcionales adecuadas desveladas con respecto a los anticuerpos proporcionados en el presente documento, en particular, las características desveladas en los párrafos [47] a [62].
En consecuencia, un polipéptido aislado proporcionado en el presente documento puede consistir en una secuencia de hasta 250 aminoácidos, en particular de hasta 217, de hasta 214, de hasta 211, más particularmente de hasta 200, de hasta 175, de hasta 150, de hasta 135, de hasta 120, de hasta 107 e incluso más particularmente de hasta 100, de hasta 90, de hasta 80, de hasta 74, de hasta 70, de hasta 60 aminoácidos.
Una molécula mimética de anticuerpo es un polipéptido con propiedades similares a un anticuerpo, en particular con propiedades de unión similares a CD127. Los miméticos de anticuerpos pueden ser, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, afilinas, afímeros, anticalinas, monocuerpos, etc. Una molécula mimética de anticuerpo como se proporciona en el presente documento puede tener, en particular, cualquiera de las características funcionales adecuadas desveladas con respecto a los anticuerpos proporcionados en el presente documento, en particular, las características desveladas en los párrafos [47] a [62].
En particular, el anticuerpo de acuerdo con la invención es un anticuerpo humanizado, que comprende dominios constantes derivados de dominios constantes humanos. En particular, el dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo deriva de un dominio constante de la cadena ligera kappa humana y/o el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo deriva de una región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2, de IgG3 o IgG4 humanas, particularmente de una región constante de cadena pesada de IgG4 humana. "Derivado de" significa algunas mutaciones puntuales por sustituciones de aminoácidos tales como IgG4 (S228P) o IgG1 (E333A). Estas mutaciones bien conocidas por la persona experta en la materia, generalmente modifican algunas propiedades de la cadena parental. Por ejemplo, conducen a una menor inmunogenicidad en comparación con el anticuerpo parental o anulan la unión de FcyReceptor o evitan la dimerización del anticuerpo monómero o estabilizan la dimerización haciendo que los anticuerpos sean mejores para usos terapéuticos humanos. El anticuerpo de la invención derivado del dominio constante de cadena ligera y pesada parental comprende o consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 o en SEQ ID NO: 28 o un fragmento de las mismas, respectivamente. Más particularmente el dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 27. En particular, el dominio constante de cadena pesada de anticuerpo comprende o consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 26 o un fragmento de la misma. Más particularmente el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 26.
También se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de acuerdo con la invención, o un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento. Particularmente, dichas moléculas de ácido nucleico codifican el dominio variable de cadena ligera o la cadena ligera de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, en combinación con moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la cadena pesada de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, de acuerdo con cualquiera de las definiciones proporcionadas en el presente documento. En particular, se proporciona en el presente documento una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12. En particular, la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la invención comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18. Particularmente, dicha molécula de ácido nucleico aislada se proporciona en combinación con una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena pesada que comprende las tres CDR que consisten en las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 y que codifica un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7, más particularmente la molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 13. En una realización preferida, se proporciona una combinación de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo o consistiendo dicha combinación en una primera molécula de ácido nucleico aislada que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18; y una segunda molécula de ácido nucleico aislada que comprende o consiste en la secuencia de s Eq ID NO: 13. En otra realización preferida, se proporciona una combinación de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo o consistiendo dicha combinación en una primera molécula de ácido nucleico aislada que comprende o que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 18; y una segunda molécula de ácido nucleico aislada que comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 13.
En el presente documento también se proporcionan polinucleótidos que codifican la secuencia polipeptídica de una cadena ligera completa, que comprende tanto el dominio variable como el constante, es decir, en particular polinucleótidos que codifican una de las secuencias de SEQ ID NO: 9 a 12 y la secuencia de SEQ ID NO: 27 o 28, en particular polinucleótidos que comprenden o consisten en una de las secuencias SEQ ID NO: 15 a 18 concatenados con SEQ Id NO: 30 o SEQ ID NO: 31. Dichos polinucleótidos se proporcionan en particular en combinación con un polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica de una cadena pesada completa, que comprende tanto el dominio variable como el constante, es decir, en particular polinucleótidos que codifican SEQ ID NO: 7 y la secuencia de SEQ ID NO: 26, en particular polinucleótidos que comprenden o consisten en SEQ ID NO: 13 concatenados con SEQ ID NO: 29.
En particular, las moléculas de ácido nucleico aisladas proporcionadas en el presente documento pueden comprender ventajosamente, además de una secuencia que codifica una cadena ligera y opcionalmente una cadena pesada de un anticuerpo proporcionada en el presente documento, anteriormente a la secuencia que codifica dichas cadenas de anticuerpos, una secuencia que codifica un péptido señal que permite la secreción de dichas cadenas cuando se expresa en una célula de producción. También pueden comprender una o más secuencia o secuencias que codifican uno o más péptido o péptidos marcadores para detectar y/o facilitar la purificación de, dichas cadenas.
También se proporciona en el presente documento un vector para la clonación y/o para la expresión de una molécula de ácido nucleico proporcionado en el presente documento. En particular, dicho vector proporcionado es un plásmido adecuado para clonar y/o expresar en células de mamífero, que comprende secuencias de regulación para la transcripción y expresión. En consecuencia, se proporciona en el presente documento un vector que comprende un polinucleótido como se desvela anteriormente, en particular, un polinucleótido como se desvela en los párrafos [76] a [78].
Además, se proporcionan en el presente documento células o líneas celulares recombinadas con una molécula de ácido nucleico como anteriormente, en particular un vector, especialmente una célula o línea celular de mamífero o ave, en particular, como se detalla en la Figura 2. Por ejemplo, células de ovario de hámster chino, modificadas genéticamente para reducir la fucosilación global. De hecho, los anticuerpos que carecen de fucosilación del núcleo muestran una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) significativamente mejorada (von Horsten et al., 2010). Otro ejemplo es la línea celular EB66 que de forma natural tiene propiedades de fucosilación bajas (Olivier et al., 2010). Los anticuerpos también pueden producirse en células transfectadas transitoriamente con una molécula de ayuda nucleica como anteriormente, en particular un vector, en particular células COS, en particular como se detalla en el Ejemplo 2.
También se proporcionan en el presente documento métodos para la producción de un polipéptido proporcionado en el presente documento, en particular una cadena ligera de anticuerpo y/o un anticuerpo monoclonal, comprendiendo dichos métodos la etapa de expresar dicho polipéptido, cadena ligera de anticuerpo o anticuerpo monoclonal (o la cadena ligera y opcionalmente la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal) en células que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, en condiciones que permitan la recuperación de dicho polipéptido y la etapa de recuperación de dicho polipéptido. En particular, los anticuerpos o su fragmento se preparan en células que presentan bajas propiedades de fucosilación, tales como las células aviares EB66.
También se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un polipéptido (en particular, un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo o una cadena ligera de anticuerpo) y/o un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo del mismo y/o una molécula de ácido nucleico aislada como se define anteriormente y un vehículo farmacéutico. Opcionalmente, dicha composición farmacéutica puede comprender además un principio activo diferente. Dicha composición se proporciona en particular en una formulación adecuada para administración sistémica o para administración local. En particular, se proporcionan en el presente documento composiciones adecuadas para la administración local, en particular para inyección intramuscular o subcutánea, para inyección con un dispositivo tal como un autoinyector (o un bolígrafo inyector), para administración transdérmica, en particular usando un parche transdérmico, para administración transmucosa, en particular administración intranasal o rectal. En particular, se proporcionan en el presente documento composiciones adecuadas para la administración local al tracto gastrointestinal (GI), en particular a través de la administración oral, en particular para el tratamiento de enfermedades intestinales tales como enfermedad de Crohn o CU, en particular composiciones adecuadas para administración al colon. En particular, se proporcionan en el presente documento composiciones adecuadas para la administración sistémica, en particular para la administración parenteral o enteral, en particular para inyección intravenosa o administración oral. Como conoce la persona experta, la administración entérica puede ser una administración local en el tracto GI o una administración sistémica. Siempre que se proporcionen en el presente documento dichas composiciones farmacéuticas o sus usos, debe entenderse que también puede proporcionarse el vehículo de administración y sus usos, por ejemplo, cuando se proporciona explícitamente una composición farmacéutica inyectable, debe entenderse que la composición se proporciona como tal así como en un dispositivo o en combinación con un dispositivo que permite la administración y/o inyección de dicha composición ("dispositivo de administración"). Los ejemplos de dispositivos de administración incluyen pero no se limitan a autoinyectores, en particular jeringas multicámara y parches transdérmicos. En consecuencia, se proporcionan en el presente documento un dispositivo de suministro, en particular un autoinyector, una bomba o un parche transdérmico que comprende dicha composición, y usos de los mismos como se proporciona a continuación en relación con las composiciones farmacéuticas. También se proporciona en el presente documento un kit que comprende una composición farmacéutica y un dispositivo de suministro local, en particular un dispositivo de suministro subcutáneo, entérico u oral, en particular una jeringa precargada o un dispositivo sin aguja, que contiene dicha composición y/o adecuado para la administración de dicha composición, y usos del mismo como se proporciona a continuación en relación con las composiciones farmacéuticas. La composición farmacéutica se proporciona en cualquier forma adecuada para su administración, incluyendo como una solución, en particular una solución acuosa estéril, como una suspensión, como un sólido, en particular un sólido liofilizado, en particular para la adsorción en (o adsorbido sobre) un parche y/o para resuspensión y administración como una solución, como una píldora, comprimido u otra forma sólida adecuada para administración oral, en particular con liberación retardada o prolongada, como nanopartículas, por ejemplo, una composición que comprende nanopartículas con el polipéptido adsorbido sobre la superficie, o dentro de dichas nanopartículas, etc. La forma de la composición farmacéutica y, opcionalmente, la naturaleza del dispositivo de suministro pueden ser adecuadas para la administración del principio activo como se proporciona en el presente documento de forma sistémica o local, es decir, puede ser adecuado para que el principio activo alcance las células, tejidos, órganos marcados como diana, en un estado activo. Particularmente, la forma de la composición farmacéutica y, opcionalmente, la naturaleza del dispositivo de suministro pueden ser adecuadas para el suministro al tracto GI, en particular al colon. Se dice que la composición farmacéutica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable; sin embargo, las composiciones farmacéuticas también se proporcionan sin un vehículo para usos y fines similares, cuando un vehículo tal no se requiere para su uso farmacéutico, por ejemplo, si el producto se administra como un sólido liofilizado puro. En particular, la administración se realiza de acuerdo con cualquier medio adecuado como se describe en el presente documento para la liberación intestinal, especialmente para la liberación retardada intestinal.
También se proporciona en el presente documento una composición que comprende como un principio activo, un polipéptido (en particular un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo o cadena ligera de anticuerpo) y/o un anticuerpo (en particular anticuerpo monoclonal), fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo del mismo como se definió anteriormente, o una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en una formulación adecuada para controlar la supervivencia o expansión de células CD127 positivas humanas, en particular células efectoras CD127 positivas humanas, especialmente supervivencia o expansión de las células T de memoria CD127+, especialmente las células T de memoria que son tanto CD127+ como CD8+ o que son células tanto CD127+ como CD4+, cuando se administra a un paciente humano. En particular, dicha composición que comprende el anticuerpo (u otro agente como anteriormente) como principio activo está en una formulación adecuada para controlar la diferenciación y/o maduración de las células dendríticas cuando se administra a un paciente.
Los inventores han demostrado sorprendentemente que una sola inyección del anticuerpo proporcionado en el presente documento permite un efecto sostenido, y la respuesta inflamatoria todavía se reduce significativamente en los animales tratados con una sola inyección de los anticuerpos proporcionados hasta 14 meses, e incluso tanto como hasta 18 meses, después de dicha inyección única. La administración, y preferentemente una sola administración, del polipéptido, en particular la cadena ligera del anticuerpo y más particularmente el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo del mismo proporcionado en el presente documento, preferentemente tiene un efecto rápido y/o duradero sobre las células T de memoria efectoras. Se observa un efecto rápido preferentemente en una semana, y más preferentemente en 48 horas, e incluso más preferentemente en un día de la administración de dicho polipéptido, cadena de anticuerpo o anticuerpo. Se observa un efecto duradero preferentemente al menos 12 meses, y más preferentemente al menos 14 meses después de la administración más reciente (y, preferentemente, la única) de dicho polipéptido, cadena de anticuerpo o anticuerpo. Dicho efecto es, en particular, reversible (en particular, la respuesta de las células T puede restaurarse mediante una nueva vacunación). Un efecto tal es preferentemente específico de antígeno y/o respuesta y preferentemente no está asociado a una linfodepleción medible (es decir, el número global de linfocitos no se reduce en el sujeto, como se mide mediante métodos comunes). De lo contrario, tal efecto puede definirse como una deleción clonal de las células T de memoria, o como una deleción reversible, específica de antígeno de la memoria T inmunitaria. Puede evaluarse un efecto de dicha administración sobre las células T de memoria efectora comparando los niveles de células secretoras de IFN-y (medidos, por ejemplo, mediante ELISPOT) en respuesta a un antígeno, por ejemplo, tuberculina, en sujetos vacunados (en particular en babuinos) que después se trataron con el polipéptido, cadena de anticuerpo o anticuerpo monoclonal proporcionado en el presente documento, y en sujetos vacunados no tratados: se observa un efecto si el nivel medido de células T específicas de antígeno es significativamente menor (preferentemente al menos un 10 %, más preferentemente al menos un 40 % menor) en los sujetos tratados, en el momento relevante después del tratamiento. Dicho efecto también puede medirse evaluando de otro modo la respuesta inflamatoria a un antígeno dado, por ejemplo, una reacción inflamatoria local, en particular dérmica, en respuesta a un antígeno administrado localmente. Como alternativa, puede usarse un ensayo de tetrámero de MHC. La persona experta en la materia conoce métodos para probar dicho efecto y se ilustran en el presente documento, en particular, en el Ejemplo 6.
Además, los inventores han demostrado sorprendentemente que el anticuerpo proporcionado en el presente documento puede tener un efecto rápido, en particular sobre la activación de las células T, en particular sobre la liberación de citocinas por las células T, en particular en tejido inflamatorio. Dicho efecto se observa en particular en una semana, y preferentemente en 48 e incluso más preferentemente en 24 horas de la administración del anticuerpo, y en particular se observa como una reducción en la producción (o liberación) de IFNy. Tal efecto se observa en particular a nivel local, es decir, en el sitio de administración del anticuerpo o en el sitio de suministro. En particular, el anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene un efecto rápido, en particular un efecto local rápido, en particular sobre la liberación de citocinas por las células T, en particular tiene un efecto observado a las 24 horas de la administración. Cuando el anticuerpo se administra para el suministro local pero no directamente en el sitio de suministro previsto, el anticuerpo puede tener un efecto rápido como anteriormente en el sitio de administración, dentro de los mismos períodos de tiempo desde el suministro en lugar de desde la administración, que puede o puede no estar retardado de la administración como conoce la persona experta.
Una composición proporcionada en el presente documento puede comprender además un compuesto adicional que tenga un efecto inmunomodulador terapéutico, en particular en células implicadas en alergia o autoinmunidad. Para los fines ilustrativos, los inmunomoduladores ilustrativos de interés son otros anticuerpos monoclonales dirigidos a las células T, tales como anticuerpos anti-CD3, anti-ICOS o anti-CD28 o proteínas recombinantes o anticuerpos dirigidos a células accesorias tales como CTLA4Ig o anticuerpos anti-CD40.
El polipéptido, anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo de los mismos, molécula de ácido nucleico aislada, célula y/o composición proporcionada en el presente documento puede proporcionarse en un producto de combinación, que comprende productos adicionales, en particular, un agente con un efecto inmunomodulador terapéutico como anteriormente, en particular destinado a la administración simultánea, separada o secuencial. En el presente documento se proporciona un producto de combinación que comprende un polipéptido (en particular, un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo o cadena ligera de anticuerpo) y/o un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo del mismo, y/o una molécula de ácido nucleico aislada, vector, célula o línea celular y/o una composición farmacéutica como se define anteriormente y que opcionalmente comprende además:
- un agente con efecto inmunomodulador terapéutico, en particular destinado a la administración en combinación con, por ejemplo, el anticuerpo proporcionado en el presente documento, en particular en donde dicha administración es simultánea o separada en el tiempo y/o en donde dicha administración es por la misma vía o por una diferente; y/o
- un dispositivo para la administración del producto.
Un polipéptido, en particular una cadena ligera de anticuerpo y/o un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal y/o un fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo y/o un ácido nucleico, vector, célula o línea celular y/o una composición farmacéutica o una composición como se define anteriormente se proporcionan en particular para su uso en un paciente humano para tratar patologías o afecciones patológicas influenciadas por respuestas inmunitarias, especialmente por las respuestas de las células T de memoria. Tales afecciones o patologías comprenden aquellas inducidas por el rechazo del trasplante, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades alérgicas, enfermedades respiratorias, infecciones víricas crónicas, enfermedad inflamatoria crónica, en particular enfermedad inflamatoria intestinal crónica, linfoma, leucemia u otras enfermedades cancerosas incluyendo aquellas que resultan de tumores sólidos, cuando estas patologías están asociadas a células CD 127 positivas, así como con la ruta de señalización de IL-7, en particular donde debe evitarse un aumento en la maduración de las células dendríticas. En consecuencia, los inventores muestran que el uso de dichos agentes puede contemplarse para el tratamiento de trastornos cutáneos alérgicos particulares, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), en particular, enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU), síndrome de Sjogren primario, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica o esclerosis múltiple, diabetes tipo I o leucemia linfoblástica aguda (por ejemplo, T-ALL) o linfoma de Hodgkin, o cáncer de mama asociado a células CD127+, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas o para el tratamiento de un linfoma cutáneo de células T, tal como linfoma de Sézary, o para el tratamiento de la leucemia linfoblastoide aguda con mutación de ganancia de función de la ruta IL-7-R/TSLP o para el tratamiento del rechazo de trasplantes y/o de pacientes que necesitan trasplante y/o a punto de someterse a un trasplante y/o que se han sometido a un trasplante. El tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), en particular, enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU), síndrome de Sjogren primario, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica o esclerosis múltiple o diabetes de tipo I se contemplan en realizaciones preferidas. En particular, la invención se refiere al polipéptido, o el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo del mismo, o la molécula de ácido nucleico aislada, o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento, más particularmente para su uso en la prevención o el tratamiento del rechazo de trasplantes de órganos o tejidos o de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunitarias, particularmente artritis reumatoide, esclerosis sistémica, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, tiroiditis autoinmunitaria, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren primario y enfermedades inflamatorias, particularmente enfermedad inflamatoria del intestino (EII), más particularmente enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa y encefalomielitis y enfermedades alérgicas y enfermedades cancerosas y enfermedades relacionadas con trasplantes y enfermedades respiratorias, preferentemente por administración local.
En el presente documento se proporcionan usos del polipéptido, cadena ligera de anticuerpo o anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o molécula mimética de anticuerpo del mismo en el tratamiento de afecciones patológicas que implican la alteración de la respuesta inmunitaria en un paciente humano que conduce a un estado tolerogénico dominante o, por el contrario, falta de tolerancia donde sería necesario el control del nivel de la respuesta inmunitaria, así como la destrucción de células malignas CD127 positivas.
Por "tratamiento" o "tratamiento terapéutico", se entiende que las etapas de administración realizadas dan como resultado la mejora de la condición clínica de un animal o un paciente humano que lo necesita, que padece un trastorno o trastornos asociados a la ruta de la IL-7, es decir, que implican la activación o proliferación de células CD 127 positivas. Dicho tratamiento tiene por objeto mejorar el estado clínico del paciente animal o humano, eliminando o aliviando los síntomas asociados al trastorno o trastornos relacionados con la ruta de la IL-7, es decir, que implican la activación o proliferación de células CD127 positivas. Preferentemente, el tratamiento proporcionado en el presente documento permite restaurar la salud. Preferentemente, dicho tratamiento no tiene efectos negativos no deseados debido a una maduración aumentada de las células inmunitarias, en particular de células dendríticas.
En aspectos particulares del tratamiento de pacientes, se proporciona el polipéptido, anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula mimética de anticuerpo, polinucleótido, célula o línea celular o composición, destinados y/o adecuados para su uso para agotar las células CD127 positivas mientras se conservan las células CD127 negativas.
En aspectos particulares del tratamiento de pacientes, se proporciona el uso del polipéptido, anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula mimética de anticuerpo, polinucleótido, célula o línea celular o composición, destinados y/o adecuados para su uso para prevenir la diferenciación y/o expansión y/o maduración de células CD127 positivas, en particular diferenciación, expansión o maduración inducida por IL-7 y/o TSLP, mientras que tiene poco o ningún efecto directo sobre las células CD 127 negativas.
En aspectos particulares del tratamiento de pacientes, se proporciona el uso del polipéptido, anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula mimética de anticuerpo, polinucleótido, célula o línea celular o composición, destinados y/o adecuados para su uso para eliminar/neutralizar células T vírgenes y de memoria al interferir con la señalización inducida por IL-7, conservando las células Treg.
En aspectos particulares del tratamiento de pacientes, se proporciona el uso del polipéptido, anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula mimética de anticuerpo, polinucleótido, célula o línea celular o composición, destinado y/o adecuado para su uso para reducir subpoblaciones de linfocitos u otras poblaciones de células que expresan CD127 (incluyendo linfocitos T y B normales o patológicos, células NK, células dendríticas y otros tipos de células incluyendo las células epiteliales) como resultado de la acción citotóxica de los anticuerpos, posiblemente, pero no exclusivamente, a través de ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) y opcionalmente a través de CDC (citotoxicidad dependiente del complemento).
También se proporciona en el presente documento un polipéptido, en particular una cadena ligera de anticuerpo y/o un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula mimética de anticuerpo, polinucleótido, célula o línea celular, o composición como se define anteriormente, para su uso como principio activo en una combinación o régimen terapéutico adicional en un paciente que lo necesite. También se proporciona el uso de un polipéptido, en particular una cadena ligera de anticuerpo y/o un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula mimética de anticuerpo, polinucleótido, célula o línea celular, o composición como se definió anteriormente como un principio terapéuticamente activo en una combinación o en un régimen terapéutico complementario en un paciente que lo necesite.
En los aspectos anteriores, los usos contemplados también son aplicables a ácidos nucleicos, vectores, células, líneas celulares, composiciones y composiciones farmacéuticas proporcionadas anteriormente en el presente documento.
En el presente documento se proporcionan los medios y productos mencionados anteriormente y/o adecuados para su uso en patologías tales como aquellas inducidas por el rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades alérgicas, enfermedades respiratorias, infecciones víricas crónicas, enfermedad inflamatoria crónica, en particular enfermedad inflamatoria intestinal crónica, linfoma, leucemia u otras enfermedades cancerosas incluyendo aquellas que resultan de tumores sólidos, cuando estas patologías están asociadas a células CD127 positivas, así como con la ruta de señalización de IL-7, en particular donde debe evitarse un aumento en la maduración de las células dendríticas. En consecuencia, dichos medios y productos están especialmente destinados y/o son adecuados para el tratamiento de trastornos alérgicos de la piel particulares, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), en particular, enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU), o leucemia linfoblástica aguda (por ejemplo, T-ALL) o linfoma de Hodgkin, o cáncer de mama asociado a células CD127+, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas o para el tratamiento de un linfoma cutáneo de células T, tal como linfoma de Sézary, o para el tratamiento de la leucemia linfoblastoide aguda con mutación de ganancia de función de la ruta IL-7-R/TSLP o para el tratamiento del rechazo de trasplantes y/o de pacientes que necesitan trasplante y/o a punto de someterse a un trasplante y/o que se han sometido a un trasplante.
En particular, se proporciona en el presente documento el uso de un polipéptido, en particular una cadena ligera de anticuerpo y/o un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula mimética de anticuerpo, un ácido nucleico, célula, línea celular o composición en un paciente humano para el tratamiento de afecciones y/o patologías inducidas por el rechazo del trasplante, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades alérgicas, enfermedades respiratorias, infecciones víricas crónicas, enfermedad inflamatoria crónica, en particular enfermedad inflamatoria intestinal crónica, linfoma, leucemia u otras enfermedades cancerosas incluyendo aquellas que resultan de tumores sólidos, cuando estas patologías están asociadas a células CD127 positivas, así como con la ruta de señalización de IL7, en particular donde debe evitarse un aumento en la maduración de las células dendríticas. En consecuencia, dichos productos son particularmente para el tratamiento de trastornos cutáneos alérgicos particulares, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), en particular, enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU), o leucemia linfoblástica aguda (por ejemplo, T-ALL) o linfoma de Hodgkin, o cáncer de mama asociado a células CD127+, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas o para el tratamiento de un linfoma cutáneo de células T, tales como el linfoma de Sézary, o para el tratamiento de la leucemia linfoblastoide aguda con mutación de ganancia de función de la ruta IL7-R/TSLP o para el tratamiento del rechazo de trasplante y/o de pacientes que necesitan un trasplante y/o están a punto de someterse trasplante y/o que se han sometido a un trasplante de una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad alérgica o para el tratamiento de leucemia tal como leucemia linfoblástica aguda o para el tratamiento de linfoma, o para el tratamiento de una enfermedad cancerosa o para el tratamiento de una infección vírica crónica, o para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en particular EII, particularmente EC o CU, o para el tratamiento de enfermedades respiratorias, o para la prevención y/o tratamiento de síntomas relacionados con un trasplante.
En particular, en el presente documento se proporciona un método de tratamiento que comprende la administración de un polipéptido (en particular, un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo o una cadena ligera de anticuerpo) y/o un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula mimética de anticuerpo o una molécula de ácido nucleico aislada, célula y/o línea celular o una composición y/o composición farmacéutica como se define anteriormente en un paciente humano para el tratamiento de afecciones y/o patologías inducidas por rechazo de trasplante, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades alérgicas, enfermedades respiratorias, infecciones víricas crónicas, enfermedad inflamatoria crónica, en particular enfermedad inflamatoria intestinal crónica, linfoma, leucemia u otras enfermedades cancerosas incluyendo aquellas que resultan de tumores sólidos, cuando estas patologías están asociadas a células CD 127 positivas, así como con la ruta de señalización de IL-7, en particular donde debe evitarse un aumento en la maduración de las células dendríticas. En consecuencia, dichos métodos son particularmente para el tratamiento de trastornos cutáneos alérgicos particulares, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), en particular, enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU), o leucemia linfoblástica aguda (por ejemplo, T-ALL) o linfoma de Hodgkin, o cáncer de mama asociado a células CD127+, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas o para el tratamiento de un linfoma cutáneo de células T, tales como el linfoma de Sézary, o para el tratamiento de la leucemia linfoblastoide aguda con mutación de ganancia de función de la ruta IL7-R/TSLP o para el tratamiento del rechazo de trasplante y/o de pacientes que necesitan un trasplante y/o están a punto de someterse trasplante y/o que se han sometido a un trasplante de una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad alérgica o para el tratamiento de leucemia tal como leucemia linfoblástica aguda o para el tratamiento de linfoma, o para el tratamiento de una enfermedad cancerosa o para el tratamiento de una infección vírica crónica, o para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en particular EII, particularmente EC o CU, o para el tratamiento de enfermedades respiratorias, o para la prevención y/o tratamiento de síntomas relacionados con un trasplante.
Los inventores han demostrado además que en pacientes con CU, los niveles de ARNm de IL7, CD127 y/o TSLPR permiten predecir la respuesta a los tratamientos inmunosupresores convencionales: los respondedores (es decir, los pacientes que presentan una marcada reducción de los síntomas en respuesta al tratamiento) tienen niveles más bajos de IL-7 y CD127 y niveles más altos de TLSPR que los que no responden. En consecuencia, se proporcionan en el presente documento métodos in vivo para evaluar la probabilidad de respuesta a tratamientos inmunosupresores en pacientes, en particular pacientes humanos, que tienen colitis ulcerosa (CU) que comprende medir en una muestra obtenida de dicho paciente el nivel de ARNm o proteína de IL7, CD127 y/o TLSPR, y concluir que la probabilidad de respuesta aumenta en comparación con un grupo de referencia cuando el nivel medido de IL7 y/o CD127 es menor que el nivel promedio en dicho grupo y/o cuando el nivel medido de TSLPR es más alto que el nivel promedio en dicho grupo. La persona experta conoce los métodos para realizar las mediciones requeridas y pueden implicar el uso de un anticuerpo contra CD127, en particular para la medición de los niveles de expresión de proteína de CD127. El polipéptido, en particular, la cadena ligera del anticuerpo y/o el anticuerpo monoclonal proporcionado anteriormente en el presente documento se proporciona en particular para su uso en tales métodos y tales métodos se proporcionan en particular usando tal polipéptido, cadena ligera de anticuerpo y/o el anticuerpo monoclonal.
En particular, se desvela en el presente documento un método para seleccionar un compuesto del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo y una molécula mimética de anticuerpo, comprendiendo el método al menos una de las siguientes etapas:
i. probar la unión del compuesto a CD127, en particular a CD127 humano, en particular a una secuencia de epítopo del dominio D1 y/o del sitio 2b del dominio D2 de CD127. Una secuencia de epítopo del dominio D1 y/o del sitio 2b del dominio D2 puede ser cualquiera de las secuencias de epítopo descritas allí, particularmente como se describe en los párrafos [016], particularmente una secuencia de epítopo seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36 o SEQ ID NO. 96, y más particularmente SEQ ID NO 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 96. En una realización particular de la invención, la prueba de unión puede abarcar probar la unión del compuesto a una secuencia de epítopo seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 96 y probar la unión del compuesto a una secuencia de epítopo seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 42 y SEQ ID NO. 43. La capacidad de unión del compuesto puede probarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, en particular el método Blitz, conocidos por la persona experta e ilustrados en particular en la Figura 3, Ejemplo 3 y Ejemplo 4 en el presente documento y en la p. 14, Las Figuras 3, 4 y 6 y las leyendas respectivas, y los Ejemplos 1, 2, 6, 7 del documento WO 2015/189302 y/o mediante el método del ejemplo 10 desvelado en el presente documento; y/o
ii. probar la inhibición de la señalización de IL7-R inducida por IL-7, en particular la fosforilación de STAT5, en presencia del compuesto. La inhibición inducida por IL7 en presencia del compuesto puede ensayarse mediante el método desvelado en el ejemplo 8 y/o el ejemplo 11 en el presente documento; y/o
iii. ensayar la activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa en presencia del compuesto. La activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa en presencia del compuesto puede ensayarse de acuerdo con el método desvelado en el ejemplo 8 y/o el ejemplo 11 en el presente documento; y/o
iv. probar la activación de la ruta de señalización ERK en presencia del compuesto. La activación de la ruta de señalización de ERK quinasa en presencia del compuesto puede ensayarse de acuerdo con el método desvelado en el ejemplo 8 y/o el ejemplo 11 en el presente documento;
v. probar la capacidad de unión del compuesto a al menos una hoja beta del sitio 2b del dominio D2 de CD 127, en particular, al menos a la tercera hoja beta del sitio 2b, definido como los ácidos nucleicos de SEQ ID NO. 34 y/o al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 96. La capacidad de unión del compuesto puede probarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, en particular el método Blitz, conocidos por la persona experta e ilustrados en particular en la Figura 3, Ejemplo 3 y Ejemplo 4 en el presente documento y en la p. 14, las Figuras 3, 4 y 6 y las leyendas respectivas, y los Ejemplos 1, 2, 6, 7 del documento WO 2015/189302 y/o mediante el método del ejemplo 10 desvelado en el presente documento. El método puede comprender además una cualquiera de las siguientes etapas opcionales, o al menos una de las siguientes etapas opcionales:
vi. probar la unión de CD127, en particular CD127 humano, a la cadena común yc de receptores de citocinas en presencia del compuesto. La unión de CD127 a la cadena común yc de receptores de citocinas en presencia del compuesto puede evaluarse en particular mediante métodos de co-inmunoprecipitación, bien conocidos por la persona experta en la prueba de la interacción de proteínas y se ilustra, por ejemplo, en el documento WO2015/189302 en el Ejemplo 21. En particular, las células pueden incubarse en presencia o ausencia del compuesto probado, después se solubilizan en condiciones que permitan la conservación de los complejos de proteínas, y el lisado resultante puede someterse a una inmunoprecipitación anti-CD 127 y la presencia de yc en el complejo inmunoprecipitado que contiene CD127 evaluarse por transferencia Western usando anticuerpos antiyc (a la inversa, la inmunoprecipitación puede realizarse usando anticuerpos anti-yc y la presencia de CD 127 evaluarse usando anticuerpos anti-CD 127); y/o
vii. probar la internalización de CD127, en particular CD127 humana, y/o la internalización de CD127 inducida por IL7 en presencia del compuesto. La internalización de CD127, definida en el presente documento en los párrafos [51] a [53], puede definirse y/o probarse adicionalmente como se establece en el documento WO2015/189302 en particular en los párrafos [59]-[63] en las páginas 19-20 y en la Figura 16 y el ejemplo 5; y/o
viii. ensayar la maduración de células dendríticas inducida por TSLP en presencia del compuesto. La maduración de las células dendríticas inducida por TSLP se define en los párrafos [47] y [48] del presente documento. Los medios para medir tal efecto son conocidos por los expertos y se describen en particular en el documento WO 2015/189302 en las páginas 16-17 y en el Ejemplo 9 del mismo. En particular, los medios para medir tal efecto comprenden la medida de la expresión de CD40 entre células estimuladas con el compuesto y células estimuladas con TSLP solo (sin el compuesto).
En una realización particular del método, se selecciona el compuesto que se une específicamente a CD127, en particular CD127 humano, que es un antagonista de la señalización de IL7-R inducida por IL7, que no induce la activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa y/o la ruta de señalización ERK. En una realización más particular del método, se selecciona el compuesto que se une específicamente a CD127, en particular CD127 humano, que es un antagonista de la señalización de IL7-R inducida por IL7 y que no induce la activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa y no induce la activación de la ruta de señalización ERK.
En particular, se proporciona en el presente documento un método para producir un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, que se eleva contra CD127, posiblemente elevado a partir de una inmunización de un animal no humano, tales como ratas de la cepa LOU/C Igk1a (disponible en la Universidad de Lovaina, Bélgica). La inmunización puede llevarse a cabo usando un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 22 y, en particular, un fragmento de SEQ ID NO. 22 que comprende una secuencia de epítopo como se define en el presente documento y, en particular, SEQ ID NO. 35 y/o SEQ ID NO. 96, como un inmunógeno. El hibridoma puede obtenerse fusionando células mononucleares de bazo con el inmunocitoma de rata LOU IR983F. El hibridoma puede cribarse de acuerdo con la capacidad de los anticuerpos monoclonales secretados para unirse a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 96, en particular SEQ ID NO: 35 y/o SEQ ID NO: 96. Por lo tanto, la invención también abarca un compuesto inmunógeno, siendo dicho compuesto inmunógeno un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 22, en particular, un fragmento que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 96, en particular SEQ NO. 34, SEQ ID NO. 35 y SEQ ID NO. 96, más particularmente SEQ ID NO. 96. En una realización particular de la invención, el compuesto inmunógeno es un péptido lineal, en particular, un péptido lineal que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 96, más particularmente, un péptido lineal que comprende o consiste en, preferentemente que consiste en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Secuencias de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento
Panel A. Secuencia de la cadena pesada (VH). Las CDR están en caracteres en negrita.
Panel B. Secuencia de las cadenas ligeras (LH) humanizadas derivadas de N13B2. Las CDR están en caracteres en negrita. N13B2-VL3 comprende restos marco originales de N13B2-h3 en las posiciones 48 y 87 (subrayados); N13B2-VL4-V48L y N13B2-VL5-F87Y comprenden el resto marco humanizado correspondiente y N13B2-VL6-V48L-F87Y comprende ambos restos marco humanizados.
Figura 2. Producción de anticuerpos - transfección estable
Se realizaron tres lotes de producción diferentes para cada uno de los anticuerpos mencionados en células CHO-M de acuerdo con métodos comunes, usando medios libres de suero disponibles en el mercado, y los títulos obtenidos en experimentos típicos, medidos por un ensayo ELISA, se informan aquí. El eje horizontal representa el tiempo de cultivo, en días, mientras que el eje vertical representa los títulos de anticuerpos obtenidos, en pg/ml.
Figura 3. Unión a CD127
La unión de los anticuerpos indicados a CD127 recombinante se ensayó mediante ELISA de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 3. El eje horizontal representa la concentración de anticuerpos en ng/ml y el eje vertical representa la densidad óptica a 450 nm, en unidades arbitrarias.
Figura 4. Inhibición de la fosforilación de STAT5
La inhibición de la fosforilación de STAT5 por los anticuerpos indicados se ensayó mediante citofluorometría de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 5. El porcentaje de células CD3+ teñidas con anticuerpos pSTAT5 se informa en el panel A (eje horizontal: concentración de anticuerpo en ng/ml) y la intensidad de fluorescencia media (en unidades arbitrarias) de la señal pSTAT5 para células CD3+ se informa en el panel B.
Figura 5. Efecto sobre las células T de memoria
Panel A. Respuesta de DTH (área bajo la curva de las curvas de eritema) en babuinos después de la inyección de N13B2.
Se evaluó la hipersensibilidad de tipo retardado en respuesta a una prueba de tuberculina en babuinos vacunados, después de la administración de N13B2 (n=7 babuinos) o excipiente (n=4 babuinos), midiendo la reacción dérmica de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 6. El eje vertical representa el área bajo la curva de eritema, en unidades arbitrarias. Los valores se informan para las reacciones intradérmicas realizadas en los puntos de tiempo dados, indicados en días en el eje horizontal, antes o después de la administración de N13B2 o excipiente (administrado el día 0). "Post-BCG" corresponde a los resultados de la reacción dérmica realizada después de una nueva vacunación con BCG (nd = no determinado). El control de excipiente no se determinó en los días 150 y 180 y "post-BCG" (nd).
Panel B.
Respuesta de DTH (área bajo la curva de las curvas de eritema) en babuinos después de la inyección de N13B2 humanizado. Se evaluó la hipersensibilidad de tipo retardado en respuesta a una prueba de tuberculina en babuinos vacunados, después de la administración de N13B2 humanizado (AA892BB, 32257, V915GQ, 33874) o tampón, midiendo la reacción dérmica de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 6. El eje vertical representa el área bajo la curva de eritema, en unidades arbitrarias. Los valores se informan para las reacciones intradérmicas realizadas antes de la administración de N13B2 humanizado o tampón ("IDR1", primera barra de izquierda a derecha para cada babuino), 4 horas después de la administración de N13B2 humanizado o tampón ("IDR2", segunda barra desde la izquierda), uno, dos y tres meses ("IDR3-5", tercera a quinta barra desde la izquierda) y cuatro meses ("IDR6", sexta barra desde la izquierda, para V915GA solo) después de la administración de N13B2 humanizado o tampón y después de una nueva vacunación con BCG ("IDR7", última barra desde la izquierda).
Panel C.
ELISPOT de IFNy realizado en PBMC de sangre en babuinos vacunados con BCG provocados con tuberculina y tratados con N13B2 humanizado.
La frecuencia de células T específicas de AG después de la exposición a tuberculina se analizó en babuinos vacunados después de la administración de N13B2 humanizado (AA892BB, 32257, V915GQ, 33874) o tampón, por ensayo ELISPOT de IFNy de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 6. El eje vertical representa la frecuencia de puntos para 100.000 células. Los valores se informan para Elispot sin antígeno (sin Ag, barras de la izquierda) o con antígeno de tuberculina (barras de la derecha) realizado antes de la administración de N13B2 humanizado o tampón (primera barra desde la izquierda para cada grupo de barras), 4 días después de la administración de N13B2 humanizado o tampón ("IDR2"), uno, dos y tres meses ("IDR3-5") y cuatro meses ("IDR6", para V915GA solo) después de la administración de N13B2 humanizado o tampón y después de una nueva vacunación con BCG (última barra desde la izquierda, discontinua).
Figura 6. Expresión de IL-7, CD127 y TSLP en pacientes con EII
Los niveles de expresión de ARNm de IL-7, CD127 (forma soluble de IL-7Ra) y TSLP (de longitud completa) se midieron de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 7 en muestras de tejido de sujetos control sanos (control sin EII), muestras de biopsia de colon sanas y enfermas (inflamadas) de pacientes con colitis ulcerosa (CU) activa que no respondieron (o ya no respondieron más) al tratamiento antiinflamatorio y en muestras de pacientes con CU con enfermedad inactiva, es decir, que estaban curados o en remisión en ese momento de muestreo (Respondedores). El eje vertical representa las unidades de fluorescencia relativas. El valor se representa para cada muestra en un grupo dado, representando la barra horizontal los valores promedio para el grupo y las barras de error representan la desviación estándar. "*" denota un valor p <0,05; "**" un valor de p < 0,01; "****" un valor de p < 0,0001.
Figura 7. Inhibición de las rutas de señalización de CD127
El efecto de diversos anticuerpos anti-CD127 humanos sobre la activación de rutas de señalización se evaluó mediante transferencia Western como se detalla en el Ejemplo 8. La figura representa resultados representativos de 6 donantes diferentes. "No IL-7" corresponde a una muestra que no fue estimulada por IL-7. "C" corresponde a una muestra control, estimulada con IL-7 en ausencia de anticuerpo anti-CD 127. Las líneas horizontales a la izquierda de la transferencia representan la migración del marcador de peso molecular indicado. Las flechas a la derecha de la transferencia indican la migración de STAT5 tirosina-fosforilado, PI3-k p55 tirosina 199-fosforilada, Akt fosforilado, ERK 1/2 fosforilada y, como una referencia de carga, GAPDH.
Figura 8. Supresión de la liberación de citocinas de células T de biopsias de CU
Panel A. Producción de IFNy por muestras de biopsia de CU cultivadas ex vivo. Panel B. Producción de IFNy por muestras de biopsia de EC cultivadas ex vivo.
En ambos paneles, las muestras se obtuvieron y se trataron como se detalla en el Ejemplo 9. Cada símbolo representa una muestra de un paciente, se cultiva con IgG ("Ctrl Ab") o con anticuerpo anti-CD127 ("aIL-7Ra"). Los símbolos conectados son muestras emparejadas del mismo paciente. ** p <0,01 con la prueba de pares emparejados de Wilcoxon. La producción de IFNy se inhibió significativamente por mAb anti-IL7Ra. Se observaron resultados similares para las muestras de biopsia de EC.
Figura 9. MAb anti-IL-7Ra humana y señales agonistas
El efecto de diversos anticuerpos anti-CD127 humanos sobre la activación de STAT5, las rutas de señalización de PI3K y ERK se evaluó mediante transferencia Western como se detalla en el Ejemplo 11. La figura 9A muestra una de las siete células donantes diferentes en ausencia de IL7 humana recombinante exógena. El panel A. "medio" corresponde a una muestra sin ningún anticuerpo anti-CD127 humano. "No IL7" significa que las cuatro muestras no fueron estimuladas con IL-7. Se pretrataron tres muestras con 10 pg/ml de un mAb anti IL-7Ra (N13B2-hVL6 o MD707-13-G4 o 1A11-G1). Panel B. Cuantificación de pI3K y pERK corregida a la expresión de GAPDH y normalizada a condiciones control de medio (n=7 donantes diferentes). El eje vertical representa la expresión normalizada al control. El valor se representa para cada muestra en un solo grupo, representando la barra horizontal el valor promedio para el grupo y representando las barras de error la desviación estándar.
Figura 10. Efecto de mAb anti-IL7-Ra humana sobre la activación de la ruta de IL7
La cuantificación de la señal de fosfo-STAT5 se corrigió a la expresión de GADPH y se normalizó a las condiciones de control de medio. Las PBMC se pretrataron con 10 pg/ml de un mAb anti-IL7-Ra (N13B2-hVL6 o MD707-13-G4 o 1A11) y después se incubaron durante 10 min a 37 °C con 5 ng/ml de IL7 humana. Las cuantificaciones de la señal de fosfo-STAT5 se corrigieron a la expresión de GAPDH (n=7 donantes diferentes). La línea de puntos representa la condición con medio solo sin tratamiento. El valor se representa para cada muestra en un solo grupo, representando la barra horizontal el valor promedio para el grupo y representando las barras de error la desviación estándar. denota un valor de p <0,05 entre los grupos indicados.
Figura 11. Los mAb anti-IL7-Ra de doble agonista/antagonista inducen modificaciones transcripcionales Análisis de secuencias de ARN de PBMC humanas (n=7) incubadas durante 3,5 horas (1) con 5 ng/ml de IL7 humana, (2) sin IL7, (3,4,5) con 5 ng/ml de IL7 humana y diferentes mAb anti-IL7-Ra humana ((3): 10 pg/ml de N13B2-hVL6; (4): 10 pg/ml de MD707-13-Ig4; (5): 10 pg/ml 1A11).
Panel A. Mapa de calor de la expresión de los 93 genes expresados de manera más diferencial (Tasa de descubrimiento falso (FDR) 5 %, múltiplo de variación (FD) > 2) entre las condiciones de estimulación y control de IL7.
Panel B. Cuantificación del perfil mediano de los tres grupos inducidos por IL7 en condiciones estimulados con IL7, control y de mAb IL7 y anti-IL7-Ra humana.
Panel C. Diagrama de Venn del análisis de secuencias de ARN de PBMC humanas (n=7) incubadas sin IL-7 durante 3,5 horas con diferentes mAb anti-IL-7Ra humana (10 pg/ml de N13B2-hVL6, 10 pg/ml MD707-13-Ig4 n.° 1 o 10 pg/ml 1A11). Diagrama de Venn de los 481 genes expresados diferencialmente (FDR 5 %, FC > 1,5) comparando mAb anti-IL-7Ra humana y condiciones de control del medio. El tamaño del círculo es proporcional al número de genes de cada categoría.
Ejemplos
Ejemplo 1. Humanización de cadenas ligeras
La siguiente cadena pesada se usó en todos los experimentos informados en el presente documento, a menos que se indique lo contrario N13B2 humanizada_VH, secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 13):
CAGGTGCAGCTGGTCGAATCAGGGGGGGGACTGGTCAAACCCGGGGGCTCACTGCGTCTGTCATGTGCCG TCTCAGGCTTCACACTGAGCGACTACTATATGGCATGGATCCGACAGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTGG GTGTCTACTATTTCTGCCAGTGGCCTGAGGACCTACTATCCTGACAGTGTCAAGGGAAGGTTCACAATCTCAC GGGATAACGCTAAAAATTCCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAAGACACCGCTGTGTACTATT GCGCTCGCCCACTGTCCGCACACTATGGCTTCAATTACTTTGATTATTGGGGGCAGGGTACCCTGGTGACAG TCTCCAGC
N13B2 humanizada_VH, Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7): véase la Figura 1A
Las siguientes secuencias de nucleótidos optimizadas se usaron para la producción de cadenas ligeras de anticuerpos (cuyas secuencias de aminoácidos se proporcionan en la Figura 1B):
N13B2-h3 (SEQ ID NO:14):
GAGATCGTCATGACGCAGTCCCCCGCAACGCTCTCCGTCTCCCCGGGGGAACGCGCGACC
CTGTCGTGCAGGACCTCCGAGGACATCTACCAAGGCCTCGCGTGGTATCAGCAGAAGCCC
GGCCAGGCCCCGCGGCTGTTGATCTACTCCGCGAACACCTTGCACATCGGCATCCCGGCG
CGCTTCTCGGGGTCAGGGAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCGTCGCTCCAGAGC
GAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACGACTACCCCCTGGCGTTCGGGGGC
GGGACCAAGGTGGAGATCAAG
N13B2hVL3 (SEQ ID NO: 15):
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGGTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG GAAGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC GGCACCAAGGTCGAGATCAAG
N13B2hVL4 (SEQ ID NO: 16):
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG
ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG
GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGCTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC
CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG
GAAGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC
GGCACCAAGGTCGAGATCAAG
N13B2hVL5 (SEQ ID NO: 17):
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG
ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG
GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGGTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC
CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG
GAAGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC
GGCACCAAGGTCGAGATCAAG
N13B2hVL6 (SEQ ID NO: 18):
GACATTCAGATGACCCAGTCCCCCTCGAGCCTGAGTGCGAGTGTGGGCGACCGCGTGACG ATCACCTGCCGGACGTCCGAGGATATCTACCAGGGCCTCGCCTGGTACCAGCAGAAGCCG GGCAAGGCCCCCAAACTGCTGCTCTACAGCGCGAACACCCTCCACATCGGCGTCCCCAGC CGGTTCAGCGGCTCCGGCTCGGGAACGGACTACACCCTCACGATCTCGTCCCTGCAGCCG GAAGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTATTACGACTACCCGCTGGCGTTCGGTGGC GGCACCAAGGTCGAGATCAAG
Cada secuencia de VL se obtuvo mediante síntesis génica, se insertó en un vector de clonación (pUC57) con las extremidades BsiWI 5' y 3' y la adición de una secuencia Kozak (GCCACC) antes del ATG. Se usó un vector de expresión, el plásmido de expresión pFuseCLIg-hk (Invivogen), que contiene el dominio constante CLkappa de IgG1 humana.
Cada plásmido de clonación (VL-pUC57-Genscript) se digirió por la enzima de restricción BsiWI para extraer el inserto VL (400 pb). El inserto purificado se ligó en el plásmido de expresión pFuseCLIg-hk linealizado por digestión con BsiWI y se desfosforiló. Los clones positivos, que tienen fragmentos VL insertados en la orientación correcta antes de los dominios constantes humanos, se amplificaron y se purificaron por Midiprep-sin endotoxinas (Macherey-Nagel) para la etapa de transfección. La cadena pesada se clonó de manera similar, consistiendo el dominio constante en SEQ ID NO: 26.
Ejemplo 2. Producción de cadenas ligeras humanizadas
Para los anticuerpos anti-CD 127 humanizados probados, la transfección y selección de clones estables se realizaron de acuerdo con métodos convencionales. Se prepararon y probaron tres sobrenadantes para cada anticuerpo correspondientes a diferentes proporciones de transfección de la cadena pesada (HC) y cadenas ligeras (LC): 2:1, 1:1.3 y 1:2 HC:LC. Los títulos obtenidos se informan en la Figura 2, obtenidos tras la producción en células CHO sembradas a 300.000 células/ml; sin antibióticos, de acuerdo con los métodos convencionales: el título se ensayó mediante ELISA en anti-IgG humana (Fc) inmovilizada del anticuerpo correspondiente y la revelación se realizó con un mAb anti-kappa humano de ratón más anticuerpos de burro anti-ratón marcados con peroxidasa y se reveló por colorimetría a 450 nm usando sustrato TMB.
La producción de N13B2-h3 y N13B2-hVL6 también se ensayó en experimentos de transfección transitoria. Un día antes de la transfección, las células COS se sembraron a 100000 células/pocillo en una placa P12 con medio completo (DMEM SVF al 10 % (Hyclone) PS al 1 % Glu al 1 %) y se incubaron a 37 °C, al 5 % de CO2. El día de la transfección, se usaron células COS a una confluencia del 50 al 90 %. Se lavaron con PBS y se mantuvieron con 500 |jl en medio completo. Se mezclaron 0,6 |jg de variante de VH 0,4 |jg de variante de VL en 200 j l de medio OptiMEM y se añadió 1 j l de Reactivo Plus (Invitrogen) (incubación de 15 min a temperatura ambiente). Se añadieron 3,5 j l de lipofectamina LTX (Invitrogen) 100 j l a la mezcla y se incubaron 25 min a temperatura ambiente. La mezcla entera se depositó gota a gota sobre las células COS y se incubó 48 horas al 37 %, al 5 % de CO2. Después de 48 h, los sobrenadantes se recolectaron y se centrifugaron (1500 rpm 10 min 4 °C). Los sobrenadantes se cuantificaron con ELISA n°TH-MO-43. El ensayo de actividad se realizó con ELISA TH-MO-44.
Ejemplo 3. Unión a CD127 - Elisa
Para ELISA tipo sándwich, se recubrió un anticuerpo de burro anti-IgG humana (específico de Fc) a 1,2 jig/ml en una placa P96 y se añadieron anticuerpos purificados para medir la concentración en función del intervalo convencional. Tras la incubación y el lavado, se añadieron anticuerpos de cadena ligera anti-humana de ratón, específica de kappa, (Effimune, clon NaM76-5F3) más anti-ratón de burro marcados con peroxidasa (Jackson Immunoresearch, referencia 715-036-151) y se revelaron mediante métodos convencionales.
Para el ensayo ELISA de actividad, hCD127 recombinante (Sino Biologicals, Beijing, China; referencia 10975-H08H) se inmovilizó sobre plástico a 1 jg/m l y se añadieron diluciones de anticuerpo anti-CD 127 para medir la unión. Tras la incubación y el lavado, se añadieron anticuerpos de cadena ligera anti-humana de ratón (específica de kappa) más anti-ratón de burro marcados con peroxidasa y se revelaron por colorimetría a 450 nm usando sustrato TMB por métodos convencionales.
Se obtuvieron los siguientes valores de ED50 (concentración requerida para alcanzar el 50 % de la señal máxima):
Tabla 1. Valor de ED5 n n ml r l ni n D127 de los anticuerpos
Figure imgf000026_0002
La estabilidad de los anticuerpos se estudió incubando los anticuerpos durante 7, 14 o 30 días a 4 °C, 25 °C y 42 °C. La unión de los anticuerpos a CD127 todavía fue excelente incluso después de 30 días de incubación. Los valores de ED50 determinados por ELISA después de 30 días de incubación se informan en la tabla 2.
Tabla 2. Valor de ED50 (en ng/ml) para la unión a CD127 de los anticuerpos, después de 30 días de incubación a la m r r in i
Figure imgf000026_0001
Ejemplo 4. Unión a CD127 - Blitz
Este método se realizó con un Blitz (Forte Bio, C22-2 N.° 61010-1).
hCD127 recombinante (Sino Biologicals, Beijing, China; referencia 10975-H08H)/proteína recombinante (Sino Biological Cat: 11612-H08H) se inmovilizó a 50 jg/m l mediante un fragmento Fc en un biosensor de Fc (AHC) anti-IgG humana (Forte Bio, 18-5063) durante 30 segundos. Después, se añadieron anticuerpos anti-CD 127 a 20 jg/m l (concentración de saturación) durante un período de asociación de 120 segundos, seguido de un período de disociación del anticuerpo anti-CD 127 en tampón cinético durante 120 segundos. El análisis de datos se realizó con el software Blitz pro 1.2, que calculó la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd) y determinó la constante de afinidad KD (ka/kd). Los resultados se informan en la Tabla 3.
Tabla 3. Análisis de afinidad por Blitz de anticuerpos anti-CD127 en proteína recombinante CD127 humana
Figure imgf000027_0001
Ejemplo 5. Inhibición de la fosforilación de STAT5
Para probar la inhibición de IL7R en un ensayo funcional, el anticuerpo se incubó con PBMC humanas durante 30 min a 37 °C, antes de estimular con IL7 (AbD Serotec, ref PHP046) a 0,1 ng/ml durante 15 min a 37 °C. La reacción se detuvo a 4 °C y se lavó con tampón Perm Wash antes de la fijación con el kit Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience, ref 554722) durante 15 min a 4 °C. Las células se lavaron y se tiñeron con anti-CD3 marcado con FITC (BD Bioscience, ref. 557694) durante 30 min a 4 °C. Después, las células se permeabilizaron en incubación Perm Buffer III (BD Bioscience, ref. 558050) durante 30 min a 4 °C. Después de lavar con PBS BSA al 1 % Azida al 0,1 %, las células se tiñeron con anticuerpo anti-pStat5 marcado con Alexa-647 (BD Bioscience, ref. 612599) durante 30 min a temperatura ambiente. Las muestras se analizaron en un citofluorómetro BD CantoII. hPBMC-CD3+ con fosforilación inducida por IL7 de pStat5, mientras que, sin IL7, no tenemos fosforilación. Los resultados se informan en la Figura 4 y la tabla a continuación, que muestra ED50, es decir, la concentración del anticuerpo indicado para alcanzar el 50 % de la señal en este ensayo.
Ta l 4 Inhi i i n f f ril i n TAT r n i r n i- D127
Figure imgf000027_0002
Este experimento confirmó que la modificación de la línea germinal y la modificación de restos estructurales por aminoácidos humanizados no cambiaron la actividad biológica del anticuerpo anti-CD 127. Todas las variantes probadas (N13B2-h3, N13B2-hVL3, N13B2-hVL4, N13B2-hVL5, N13B2-hVL6) podrían inhibir la fosforilación de Stat5 después de la estimulación de IL7 en hPBMC, como lotes de referencia previamente producidos de N13B2. Centrándose en N13B2-hVL6 (el más humanizado y el más optimizado), los presentes inventores se dieron cuenta de que era capaz de mantener su actividad biológica al inhibir la fosforilación de Stat5, en la misma medida que la referencia N13B2-h3. Por otra parte, esta variante fue muy estable después de 14 días de incubación a 42 °C, a 25 °C o 4 °C, no indujo la formación de agregados y mantuvo su actividad de unión.
Ejemplo 6. Efecto sobre las células T de memoria
Modelo de hipersensibilidad de tipo retardado inducida por tuberculina
Los babuinos se inmunizaron por vía intradérmica dos veces con una vacuna de bacilo de Calmette-Guerin (0,1 ml; 2­ 8 105 UFC; Sanofi Pasteur m Sd , Lyon, Francia) en la región superior de la pierna, 4 y 2 semanas antes de la prueba cutánea de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). Las reacciones intradérmicas (IDR) se realizaron con inyecciones intradérmicas de 2000 o 1000 UI de derivado proteico purificado de tuberculina (PPD; Symbiotics Corporation, San Diego, CA). Se usó solución salina (0,1 ml) como un control negativo. Las respuestas dérmicas en los sitios de inyección se midieron usando un calibre cuadrado por al menos dos observadores y se consideraron positivas cuando tenían > 4 mm de diámetro. Se realizó una segunda IDR después de un período de lavado de tres semanas y los animales recibieron una inyección intravenosa de 10 mg/kg de N13B2 (n = 7) o 10 mg/kg (V915GA, AA892BB, 32257, 33874) (n = 4) de N13B2 humanizado o equivalente de excipiente en volumen (n = 4). Se realizaron IDR adicionales cada mes después de la inyección. Después de un período de lavado, algunos babuinos (previamente tratados con N13B2) se inmunizaron de nuevo por vía intradérmica dos veces con un BCG seguido de un nuevo IDR. La media de la lectura se registró y se trazó para cada punto de tiempo. Para comparar múltiples condiciones experimentales, las respuestas de eritema se cuantificaron como área bajo la curva (AUC) usando el software Graph Pad Prism para el cálculo (Figura 5A y B).
Elispot
La frecuencia de células T específicas de Ag se siguió con un ensayo ELISPOT de IFN-g (kit ELISPOT de IFN-g de primates no humanos; R&D Systems, Minneapolis, MN) en PBMC recién aisladas reestimuladas con tuberculina, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Brevemente, el anticuerpo de captura (R&D Systems, número de catálogo SEL961) se añadió en cada pocillo de placas de filtro Elispot MultiScreen® HTS (Merck Millipore) y se incuban una noche a 4 °C. Después de tres lavados, se añadió tampón de bloqueo y la placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Las PBMC de babuinos se extrajeron recientemente de la sangre de los babuinos mediante centrifugación en gradiente Ficoll (GE Healthcare Life Science, París, Francia). A continuación, se lisaron los glóbulos rojos y se lavaron las células antes de la reconstitución a la concentración apropiada en medio de cultivo (medio TexMacs suplementado con penicilinaestreptomicina (Gibco)) con o sin derivado proteico purificado con tuberculina. La placa se incubó a 37 °C y CO2 al 5 % durante 18-24 horas. Después de tres lavados con tampón de lavado, el anticuerpo de detección (R&D systems, número de catálogo SEL961) se añadió y se incubó a 4 °C durante 24 horas. Estreptavidina-AP (R&D systems, número de catálogo SEL002) se añadió después de tres lavados y se incubó dos horas a temperatura ambiente durante 2 horas. Se han realizado tres lavados. BCIP/NBT (R&D systems, número de catálogo SEL002) se han añadido y se han puesto en la oscuridad durante 30 minutos. Fueron necesarios varios lavados con tampón de lavado y uno con agua desionizada (Figura 5C).
Animales
Los babuinos (Papio anubis; 7-14 kg) se obtuvieron del Centre National de la Recherche Scientifique Centre de Primatologie (Rousset, Francia). Los animales se alojaron en la instalación para animales grandes de la unidad 1064 del INSERM. Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Nacional de Ética de Francia.
Resultados
En un primer experimento, se realizó una primera IDR con tuberculina en babuinos vacunados con BCG que no recibieron tratamiento en ese momento (día -30). Después de un período de lavado de un mes, se realizó una segunda IDR a las 4 h y cada mes después de la inyección i.v. de 10 mg/kg de N13B2 (barras blancas). Se realizó una última IDR después de una nueva vacunación con BCG (14 meses después de la inyección de anticuerpos). Los animales control (barras negras) recibieron un volumen similar de excipiente i.v. y fueron provocados con el mismo protocolo. Los resultados mostraron que el anticuerpo quimérico anti-IL7Ra indujo una protección a muy largo plazo (hasta 14 meses) después de una sola administración. La respuesta se recuperó solo después de una nueva vacunación. En otro experimento, se realizó una primera IDR con tuberculina en babuinos vacunados con BCG (barras discontinuas - por ejemplo, IDR1 para V915GA). Después de un período de lavado de un mes, se realizó una segunda IDR 4 h y cada mes después de la inyección i.v. de 10 mg/kg de N13B2 humanizado (barras sólidas - por ejemplo, IDR2-6 para V915GA). Se realizó una última IDR después de una nueva vacunación con BCG y Tuberculina (barras de puntos -por ejemplo, IDR7 para V915GA). Los animales control (barras negras) recibieron un volumen similar de excipiente i.v. y fueron provocados con el mismo protocolo. Los resultados mostraron que el N13B2 humanizado indujo también una protección a largo plazo después de una sola administración en 3 de los 4 babuinos evaluados. El animal "33874" fue inicialmente respondedor inmediatamente después de la inyección de anticuerpo, pero la respuesta se recuperó espontáneamente un mes después.
Se reestimularon PBMC en sangre ex vivo con tuberculina. Se realizó un primer elispot de IFNy con o sin tuberculina en babuinos vacunados con BCG (barras de puntos). Se realizó un segundo elispot de IFNy 4 días después de la inyección con 10 mg/kg de N13B2 humanizado (barras llenas). Después se realizaron nuevos ELISPOT cada mes en cada nueva IDR con tuberculina in vivo. Se realizó un último elispot de IFNy después de una nueva vacunación con BCG (barras de puntos). Los resultados mostraron que la administración de N13B2 humanizado indujo la deleción de células T de memoria específicas de antígeno en animales que respondieron a largo plazo. El babuino "33874" no mostró una reducción significativa de las células T de memoria específicas de la tuberculina en paralelo a ninguna protección a largo plazo en el modelo DTH. Después de una nueva vacunación con BCG, Los animales que respondieron a largo plazo mostraron una mayor frecuencia de células T de memoria específicas de antígeno que se recuperan al nivel basal (antes de la inyección de mAb) y esto está asociado a la recuperación de la respuesta DTH in vivo. En conjunto, estos resultados demostraron que la protección a largo plazo inducida por N13B2 humanizado está asociada a la deleción de células T de memoria específicas de antígeno, lo que explica el efecto a largo plazo del fármaco.
Ejemplo 7. Expresión de IL-7, CD127 y TSLP en pacientes con EII
Los datos de expresión de ARNm sin procesar obtenidos como se detalla en Planell et al. Gut 2013 se analizaron como se detalla en la leyenda de la Figura 6.
Ejemplo 8. Ruta de señalización de PBMC humanas estimuladas con anticuerpos anti-CD127 más IL7
Se estudiaron las rutas de señalización de IL7 a partir de lisados de PBMC humanas incubadas 30 min a 37 °C con 10 |jg/ml de anticuerpos anti-CD127 humanos solubles y se estimularon con IL7 (AbD Serotec, ref PHP046) a 5 ng/ml durante 10 min a 37 °C. Se realizaron transferencias Western en condiciones reductoras con 20 jg de proteína de lisados celulares en geles de poliacrilamida al 7,5 % y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (GeHealthcare). Las transferencias se saturaron con solución salina tampón BSA-Tris (TBS) al 5 % y se revelaron con anticuerpo Phospho-Stat5, Fosfo-PI3-quinasa p85, Fosfo-Akt y fosfo-ERK1/2 (Cell Signalling Technology) a 1/1000 en BSA-t Bs al 1 % (durante la noche a 4 °C) seguido de anticuerpo policlonal de peroxidasa de rábano picante marcado anti­ conejo de cabra (Cell Signalling Technology) a 1/2000 durante 1 h a temperatura ambiente, o con anticuerpo GAPDH (Santa Cruz) a 1/1000 en BSA-TBS al 1 % (durante la noche a 4 °C) seguido de anticuerpo policlonal de peroxidasa de rábano picante marcado anti-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch) en 1/2000 durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se revelaron por quimioluminiscencia usando el sistema de formación de imágenes LAS-3000 (Fujifilm). Por lo tanto se ensayaron los siguientes anticuerpos anti-CD127 humano: N13B2-h3 y N13B2-hVL6 (ambos anticuerpos anti-sitio 1/2b, desvelados en el presente documento); MD707-13-G4 ("anticuerpo antisitio 1", desvelado en la Sol. de Pat. Int. WO2013/056984) y 1A11 (desvelado en la patente de GSK WO2011/094259). Ejemplo 9. Efecto sobre la liberación de citocinas de células T en tejido de EII
Las biopsias de pacientes con EII pueden usarse como modelo inflamatorio de la enfermedad ex vivo y aquí se ha demostrado que liberan espontáneamente altos niveles de citocinas proinflamatorias después de 24 horas de cultivo (CU: IFNy, 130 ±19 pg/ml; IL-6, 4042 ± 529 pg/ml; IL-8, 25626 ± 1640 pg/ml - EC: IFNy, 180± 38 pg/ml; IL-6, 3653 ± 734 pg/ml; IL-8, 15540 ± 2452 pg/ml [medias ± sem para CU y EC respectivamente]).
Se aplicó mAb anti-CD 127 a 10 jg/m l en este ensayo de cultivo de órganos utilizando muestras quirúrgicas tomadas de la mucosa colónica inflamada de 20 pacientes con EII (10 con enfermedad de Crohn y 10 con colitis ulcerosa y el cultivo se realizó a 37 °C durante 24 horas en medio con 10 jg/m l de mAb control de IgG o mAb de bloqueo anti-IL-7Ra humana (véanse los detalles de las condiciones de muestreo y cultivo a continuación). Se muestreó un espécimen control emparejado de cada paciente y se cultivó en las mismas condiciones, con control de IgG en lugar de anticuerpo anti-CD 127. La concentración de citocinas se midió mediante ELISA (como se detalla a continuación) en el sobrenadante de las muestras cultivadas ex vivo.
La producción de IFNy por muestras de biopsia de CU cultivadas ex vivo se inhibió significativamente por mAb anti-IL7Ra. Se observaron resultados similares para algunas muestras de biopsia de EC que secretan una gran cantidad de IFNy.
Muestreo y cultivo de órganos ex vivo
Si se usó tejido de resección de la mucosa, se cortaron pequeños fragmentos del tamaño de una biopsia con tijeras. A continuación, las biopsias o los fragmentos del tamaño de una biopsia se colocaron en 300 j l de medio HL-1 sin suero (Lonza, Cambridge BioScience, RU) suplementado con L-Glutamina, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 jg/m l y gentamicina 50 jg/ml. Los explantes de mucosa se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5 % de CO2. El anticuerpo probado respectivo (N13B2) o el control de IgG usado a 10 jg/m l se añadió al medio al comienzo del tiempo de incubación. Finalmente, el sobrenadante y el material de biopsia se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -70 °C para análisis futuros.
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
La producción de citocinas en el sobrenadante de la biopsia se midió mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). IFN-y recombinante humana de ImmunoTools (n.° 31673539, Friesoythe, Alemania) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 10. Comparación de anticuerpos anti-IL7-Ra humana relacionados con su caracterización de epítopos: Análisis de espectrometría de masas: Perfilado de anticuerpos usando micromatrices de péptidos
Las micromatrices de péptidos PepStarTM de peptide Technologies comprenden péptidos sintéticos purificados derivados de antígenos u otras fuentes que se inmovilizan quimioselectiva y covalentemente sobre una superficie de vidrio. Se inserta un resto enlazador hidrófilo optimizado entre la superficie del vidrio y la secuencia del péptido derivado del antígeno para evitar falsos negativos provocados por impedimentos estéricos. Por razones técnicas, todos los péptidos contienen una glicina C-terminal. Se realizaron experimentos de perfilado de muestras en una biblioteca de péptidos que consistía en 52 péptidos. La lista completa de péptidos se muestra a continuación:
Tabla 5. Lista de péptidos usados en ensayos de micromatrices de péptidos
Figure imgf000030_0001
Se incubó un total de 4 muestras en portaobjetos de micromatrices usando un formato Multipocillo. Para el anticuerpo N13B2-h3VL6 y la otra muestra (MD707-13, HAL y 1A11), se aplicaron 6 concentraciones diferentes (10 pg/ml; 2 pg/ml; 1 pg/ml; 0,1 pg/ml; 0,01 pg/ml; 0,001 pg/ml). Las diluciones de muestras en serie se incubaron durante 1 hora a 30 °C en un portaobjetos de micromatrices de pocillos múltiples, que contienen 21 mini-matrices individuales (1 mini­ matriz por dilución de muestra). Posterior a la incubación de la muestra, se añadió un anticuerpo anti-IgG humana secundario a 1 pg/ml y se dejó reaccionar durante 1 hora. Se realizó una incubación control adicional aplicando el anticuerpo secundario solo en paralelo en el mismo portaobjetos de micromatrices para evaluar la unión falsa positiva a los péptidos. Después de lavar y secar, el portaobjetos se escaneó con un escáner láser de alta resolución a 635 nm para obtener perfiles de intensidad de fluorescencia. Las imágenes resultantes se cuantificaron para producir un valor de píxel medio para cada péptido. Las imágenes se cuantificaron para producir un valor de píxel medio para cada péptido. Anticuerpo secundario anti-IgG humana marcado con Cy5 a 1 pg/ml.
Tampones y soluciones El tampón usado fue tampón TBS que incluía Tween20 (JPT) al 0,05 % y tampón de ensayo T20 (Pierce, SuperBlock TBS T20, n.° 37536). La adquisición y el análisis se realizaron usando micromatrices de péptidos (JPT Peptide Technologies GmbH, Berlín, Alemania; lote n.° 2668, Cámara de incubación de múltiples pocillos, Escáner Axon Genepix 4200AL, Las micromatrices se escanearon usando un escáner de fluorescencia de alta resolución. La configuración del láser y la resolución aplicada fueron idénticas para todas las mediciones realizadas. Las imágenes resultantes se analizaron y se cuantificaron usando el software de reconocimiento de puntos GenePix (Molecular Devices). Para cada punto, se extrajo la intensidad media de la señal (entre 0 y 65535 unidades arbitrarias).
Para una evaluación adicional de los datos, se determinaron los denominados valores MMC2. El MMC2 es igual al valor medio de las tres instancias en la micromatriz, excepto cuando el coeficiente de variación (CV), la desviación estándar dividida por el valor medio, es mayor de 0,5. En este caso, la media de los dos valores más cercanos (MC2) se asigna a MMC2.
Análisis de deuterio
Usando el sistema HDX-2 (Waters SA/NV; Zellik, Bélgica), CD127 humano recombinante y 0 o 1 equivalente molar de mAb se mezclaron y se diluyeron en 99,9 % de D2O, fosfato sódico 10 mM, NaCl 100 mM, pH 6,8 a un contenido final de D2O del 90 % y una concentración de CD127 o complejo CD127/mAb de 27,5 pM. El intercambio de hidrógeno deuterio se realizó a 20,0 °C durante 30 minutos. El intercambio se inactivó mediante una dilución 1:1 (v/v) de muestras con fosfato sódico 100 mM, guanidinaHCl 4 M, TCEP 0,4 M, pH 2,3, a 1,0 °C resultando en un pH final de 2,5. Después de 2 minutos, las muestras inactivadas se cargaron en el administrador HDX para la digestión con pepsina en línea a 20,0 °C (Enzymate BEH Pepsin, 2,1 x 30 mm; 5 |jm), seguido de desalación (Acquity BEH C18 Vanguard 2,1 mm x 5 mm; 1,7 jm ) y separación de fase inversa (Acquity BEH C18 1,0 mm x 100 mm; 1,7 jM ) usando un gradiente de ácido fórmico al 5 %-40 % al 0,2 % en acetonitrilo (pH 2,5) durante 10 min a un caudal de 40 jl/m in a 0,0 °C. El análisis de espectrometría de masas se realizó en un espectrómetro de masas Waters Xevo G2-XS ESI-Q-TOF en el modo de iones positivos, con corrección de cierre de pulverizador. Las condiciones de fuente suaves (temperatura: 90 °C, voltaje capilar: 2,5 kV, cono de muestreo: 30 V, flujo de gas de desolvatación: 800 l/h, temperatura de desolvatación: 250 °C) se usaron para minimizar el intercambio inverso y garantizar una desolvatación adecuada (73). La identificación de péptidos fue asistida por disociación inducida por colisión recolectada en el modo MSE, usando PLGS 3.0.2 y UNlFl 1.8. La incorporación de deuterio se determinó en DynamX 3.0. Las figuras estructurales se prepararon usando PyMOL 1.8.2.3 (Schrodinger LLC, Cambridge, MA, EE.u U.) de PDB ID 3DI3 (19). Fosfato de sodio monobásico y dibásico, cloruro sódico, clorhidrato de guanidina, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), hidróxido sódico al 50 % y ácido fórmico se obtuvieron de Sigma Aldrich (Schnelldorf, Alemania) con la mayor pureza disponible. Los disolventes de calidad CL-EM se obtuvieron de Biosolve Chimie (Dieuze, Francia), óxido de deuterio (99,9 % D) y cloruro de deuterio al 20 % en óxido de deuterio (99,96 % D) de Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, EE.UU.), ácido clorhídrico al 37 % de VWR International (Fontenay-sous-Bois, Francia) y digestión de citocromo C bovino de Thermo Fisher Scientific (Germering, Alemania). Los filtros ultracentrífugos Amicon (0,5 ml; corte de 10 kDa) se obtuvieron de Merck Millipore (Molsheim, Francia).
Resultados
La caracterización de epítopos mediante una matriz de péptidos lineales de diferentes mAb anti-IL7Ra identificó dos tipos de mAb antagonistas: (1) mAb que se unen a la región (sitio 1) de interacción con IL-7, como se describió previamente por otros dos grupos (clon 1A11 descrito en el documento WO/2011/094259 y clon HAL descrito en el documento WO/2011/104687) e incluyendo MD707-13, y (2) un mAb, es decir, N13B2-h3VL6 de la presente invención, que se une tanto al sitio 1 como a un epítopo que se superpone al dominio predicho (sitio 2b) de heterodimerización entre IL-7R a y las subunidades y (Walsh 2012).
N13B2-h3VL6 y MD707-13 con afinidades altas y similares (el que se une al sitio-1/2b con una KD de 2,10'10 M y el que se une al sitio-1 con una KD similar de 5,10-10 M) se expresaron de forma recombinante con un isotipo Fc de IgG4 humana (que contiene la mutación de bisagra S228P para evitar el intercambio del brazo Fab) y se compararon con otro mAb de sitio 1 descrito anteriormente con afinidad similar, el clon 1A11, descrito en el documento WO/2011/094259 (KD de 6,10'10 M) y se expresó de forma recombinante con un isotipo Fc de IgG1 humana que se está desarrollando en la clínica (NCT02293161). El análisis del epítopo conformacional usando intercambio de hidrógeno y deuterio con espectrometría de masas (HDX-MS) confirmó observaciones previas y demostró que el anticuerpo de la invención, es decir, N13B2-h3VL6 (mAb sitio 1/2b), protegió de la incorporación de deuterio en varios péptidos del sitio 1, pero también de un péptido que se superpone al sitio 2b, mientras que los otros dos mAb (MD707-13 y 1A11) impiden significativamente la incorporación de deuterio solo en péptidos del sitio 1 (datos no mostrados). El anticuerpo de la invención fue el único que reconoció un epítopo conformacional localizado en el sitio 1 del Dominio 1 y un epítopo conformacional localizado en el sitio 2b de CD127 humano.
Ejemplo 11. Comparación de anticuerpos anti-IL-7Ra humana por su capacidad para ser agonistas y/o antagonistas de la ruta de IL-7.
Transferencia Western
Se incubaron PBMC humanas recién aisladas durante 30 min a 37 °C con 10 pg/ml de mAb anti-IL-7Ra humana y después se cultivaron solas o con 5 ng/ml de IL-7 humana recombinante (AbDSerotec) durante 10 min a 37 °C. Después de detener las reacciones en hielo, los lisados de células se prepararon con tampón RIPA (con cóctel de inhibidores de proteasa). Las proteínas (15 jg ) se resolvieron en condiciones reductoras en geles de poliacrilamida al 7,5 % y se inmovilizaron en membranas de nitrocelulosa (GeHealthcare) usando métodos convencionales. Las transferencias se lavaron con solución salina tampón BSA-Tris al 5 % y se incubaron con Fosfo-STAT 5, Fosfo-PI3K p55 o anticuerpos específicos de Fosfo-ERK en BSA-TBS al 1 % (durante la noche a 4 °C), seguido de un anticuerpo policlonal de cabra anti-conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (Cell Signalling Technology) durante 1 h a temperatura ambiente. Como alternativa, las transferencias se tiñeron usando un anticuerpo GAPDH (Santa Cruz) en BSA-TBS al 1 % (durante la noche a 4 °C), seguido de anticuerpo policlonal de cabra anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immunoresearch) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se revelaron por quimioluminiscencia usando un sistema de formación de imágenes LAS-3000 (Fujifilm).
Secuenciación de ARN
Se incubaron PBMC humanas recién aisladas con 10 jg/m l de mAb anti-IL-7Ra humana (30 min a 37 °C) y después se cultivaron solas o con 5 ng/ml de IL-7 humana recombinante (AbDSerotec) durante 3 horas a 37 °C. Las reacciones se detuvieron en hielo y los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón RLT (Qiagen) que contenía pmercaptoetanol al 1 % en agua libre de RNasa/DNasa y se almacenaron a -80 °C. El ARN se extrajo usando un mini kit de extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). La calidad y cantidad de ARN se evaluaron mediante espectrometría de infrarrojos (Nanodrop) y bioanalizador Agilent (Agilent r Na 6000 Pico Kit). Las bibliotecas Smart-Seq2 se prepararon por los laboratorios de Broad Technology y se secuenciaron mediante la plataforma de Broad Genomics de acuerdo con el protocolo SmartSeq2 con algunas modificaciones. Brevemente, el ARN total se purificó usando perlas de ARN-SPRI, el ARNm de poliA+ se transcribió de forma inversa a ADNc y el ADNc amplificado se sometió a fragmentación basada en transposones que usó indexación dual para codificar cada fragmento de cada transcripción convertida con una combinación de códigos de barras específicos para cada muestra. La secuenciación se llevó a cabo como 2x25 pb de extremos emparejados con 8 ciclos adicionales para cada índice. Los datos se separaron por código de barras y se alinearon utilizando Tophat versión 2.0.10 con la configuración predeterminada. Las transcripciones se cuantificaron mediante la canalización computacional de los laboratorios de Broad Technology usando Cuffquant versión 2.2.1. Brevemente, los datos se procesaron a través de CuffNorm si el 50 % de las lecturas estaban alineadas y si al menos 100.000 pares estaban alineados por muestra. La normalización usó la configuración predeterminada, incluyendo la normalización "geométrica" y la información del nivel de expresión como valores de FPKM transformados en log2 (Fragmentos por kilobase de transcripción por millón de fragmentos mapeados) se usó para análisis posteriores. Para la identificación de genes diferenciales, se realizaron modelos lineales con estimación de la relación media-varianza (limmatrend) con procedimiento estadístico empírico de Bayes usando el paquete limma en R. Genes con Benjamini y Hochberg valor p ajustado <5 % y múltiplo de variación (FC) > 1.5 se consideraron como expresado diferencialmente. Para la representación de la expresión génica, el análisis de componentes principales (PCA) y la agrupación se realizaron en R v3.3.2 usando los paquetes ade4/adegraphics y pheatmap, respectivamente. La importancia biológica de genes seleccionados se evaluó usando el paquete R clusterProfiler. Se seleccionaron categorías de ontología genética (GO) enriquecidas con una tasa de falso descubrimiento (FDR) <5 % y con al menos cinco genes representados. Puede accederse a los datos de sec-ARN con el número de registro de GEO GSE.
Resultados
Rutas de señalización STAT5, PIK3 y ERK
Los MAb anti-IL-7Ra humana (N13B2-h3VL6, MD707-13, 1A11 y HAL) se compararon después por su capacidad para activar o bloquear las rutas de señalización STAT5, PI3K y e Rk previamente asociadas a la señalización de IL-7R (Figuras 9 y 10). Como se ilustró anteriormente (véase, por ejemplo, la Figura 7), IL-7 induce una potente fosforilación de STAT5 en PBMC humanas y todos los mAb probados son potentes inhibidores de esta fosforilación de STAT5 (véase la Figura 7). En contraste, y como se ilustra en las Figuras 9 y 10, los inventores descubrieron que mientras IL-7 induce una fosforilación de PI3K variable y no induce la fosforilación de ERK, los anticuerpos de la técnica anterior (concretamente MD707-13, 1A11 y HAL) inducen significativamente la fosforilación de ERK y en menor grado la señal de PI3K incluso en ausencia de IL-7 exógena al contrario que el anticuerpo de acuerdo con la invención. Estos descubrimientos muestran que los anticuerpos anti-IL-7Ra humana de la técnica anterior tienen propiedades agonistas parciales y, por lo tanto, se consideran mAb agonistas/antagonistas duales para el IL-7R humano. Por el contrario, un anticuerpo de acuerdo con la invención, y en particular N13B2-h3VL6, solo tiene propiedad antagonista para el IL-7R humano.
Los inventores evaluaron si los anticuerpos con propiedades agonistas/antagonistas podían proporcionar una señal agonista eficaz capaz de modificar las células T humanas. Los transcriptomas de PBMC humanas incubadas durante 3.5 horas sin IL-7 humana exógena, con IL-7 humana y con IL-7 y un anticuerpo (MD707-13, 1A11 sitio-1 (IgG4 n.° 1 o IgG1 n.° 2 respectivamente) o N13B2-hVL6 sitio-1/2b (IgG4)) se han analizado mediante secuenciación de última generación basada en ARN (ARN-SEC). Un total de 481 genes se expresaron diferencialmente en PBMC humanas incubadas con mAb anti-IL-7Ra humano en comparación con las condiciones de control, mientras que un total de 334 genes se expresaron diferencialmente con estimulación con IL-7 humana sola en comparación con las condiciones de control.
Figure imgf000032_0001
ALDH16 1,23 0,021 1,45 0,001 1,32 0,003 ALDH5A 0,72 0,044 0.93 0,002 0,001 APPBP2 0,81 0,001 0,90 0,000 0,81 0,000 ARHGEF 0,85 0,001 1,05 0,000 0,88 0,000 R3GNT2 1,03 0,034 1,23 V7: 0,003 1,15 0,005 C17orf5 1,07 0,039 1,49 | 0,001 .1,27 0,004 CCDC11 0,77 0,024 0,88 0,002 0,80 0,005 CCNI 0,73 0,004 0,98 : 0,000 0,78 0,001 CDK17 0,98 0,003
Figure imgf000033_0001
1,09 I 0,000
Figure imgf000033_0002
0,94 0,001
COTL1 1,67 0,000 1,80 | 0,000 1,35 0,000 CYP1B1 -0,66 0,029 ; -0,75 .. | 0,003 ;. 0,69 0,006 DDI2 1,17 0,011 1.43 ■ 1 0,000
Figure imgf000033_0003
0,002
DEF6 1,03 0,030 1,39 1 0,001 ..: i,oo : 0,006 DNLZ 1,17 0,029 U 9 : 0,008 ;; 1,22 0,006 DUSP2 1,73 0,00? 7,18
Figure imgf000033_0005
1 0,000 3,30 0,000 ENG -0,73
Figure imgf000033_0004
0,004 -0,51 1 0,005 -0,67
Figure imgf000033_0006
0,002
EXOC8 0,69 0,043 0,62 0,033 0,63 0,026 FAM160 0,83 0,030
Figure imgf000033_0007
1,26 0,000 0,024
FEM1B 0,99 0,005 1 1.09 1 0,000 0,87 0,005 GCFC2 1,00 0,011 : o .s/ 0,011
Figure imgf000033_0008
° ' 83 0,013 GNA15 0,99 0,011 1,14 ; 0,001 1,25 0,000 GOPC 0,83 0,015 0,64 ■' 0,029 7;| :7 - -0,69 ;; ll 0,015 GRSE1 0,65 0,015 o ,8 i 0,000 0,002 HIPK3 0,67 0,025 0,79 0,002 0,69 0,006 HMHA1 0,88 0,004 1,05 0,000 0,89 0,001 HSBP1L 1,04 0,029 0,97 0,017 0,86 0,030 JUNB 0,91 0,025 1,25 0,000 1,42
Figure imgf000033_0010
0,000
KLC2 1,08 0,035 1,18 0,007 1,34 . 0,002 LYSMD2 0,78 0,015 0,72 0,010 0,70 0,009 LYZ 0,031 -0,86 0,000 -0,76 0,001 MS4A7 -0,80
Figure imgf000033_0011
0,001 -0,98 0,000 -0,59
Figure imgf000033_0012
0,006
MTA2 0,84 0,038 1,18 1 0,001 1,10 0,002 NCOA5 0,65 0,018 0,84 0,000 0,89 0,000 NSUN2 0,63 0,029 0,74 0,002 U,/5 0,D02 PITHD1 0,81 0,040 1,03 ; 0,002 0,81 0,013 PLEKHF 0,72 0,004 0,83 0,000 0,77 0,001 POLRM 1,09 0,001 1,30 0,000 1,06 0,000 PPP2CA 0,75 0,025 0,87 0,002 0,75 0,007 PREB 0,88 0,018
Figure imgf000033_0013
0,78 0,014 0,92 0,004
PRKCH 0,70 0,011 0,88 0,000 0,78 0,001
N13B2-h3VL6 MD707-13 lgG4n.°l 1A11 lgGln.<2
PSMD3 1,01 0,035 1,58 í: 0,000 1,37 0,001 PYG02 1,08 0,003 1,07 0,001 0,74 0,016 RASSF5 0,63 0,004 0,67 0,000 0,60 0,002 RBL2 0,71 0,011 0,85 0,000 0,59 0,012 RRP1
Figure imgf000033_0009
0,69 0,019
Figure imgf000033_0015
0,62 0,013
Figure imgf000033_0014
0,80 0,002 SM CHD1 0,71 0,001 1,00 0,000 ■ 0,85 0,000 SREBF2 0,83 0,009 1,13 0,000 •■■■ 0,98 0,000 TAF10 1,87
Figure imgf000034_0002
0,001 1,57 0,001 1,28 0,006 TAF4B 0,75 0,030 1,12
Figure imgf000034_0003
0,000 1,29 0,000 TM X4 1,04 0,009
Figure imgf000034_0001
1,13 0,001 0,89 0,009 TPGS1 2.55
Figure imgf000034_0004
0,008 H 'i' 0,000 2,06
Figure imgf000034_0005
0,011
TRAM 1 0,71 0,001 0,73 0,000 0,59 0,002 TRPC4AP 0,98 0,005 1,21 0,000 1,06 1 0,001 TTC13 0,76 0,034 0,90 0,003 0,68 0,022 UNC119 1,02 0,036 1,43 0,001 1,26 0,002 USP9X 0,90 0,000 0,92 0,000 0,85 0,000 VPS4A 0,74 0,042 0,95 0,002 0,75 0,012 ZNF800
Figure imgf000034_0006
0,74 0,013 1,01 0,000 0,84 0,001
ACTN4 0,55 0,005 0,60 0,000 0,65 0,000 C15orf48 ' -0,63 ; 'í : 0,029 -0,87 0,000 -0,51 0,035 C3AR1 -0,56 0,011 -0,75 0,000 -0,64
Figure imgf000034_0008
0,001
CD247 0,80 0,004 0,87 0,000 0,50 0,038 FAM 50A 0,66 0,028 0,93 0,000 0,54 0,031 HCK -0,65
Figure imgf000034_0009
0,009 0,83
Figure imgf000034_0007
0,000 -0,46 0,030
IL6ST 0,43 0,034 0,60 0,000 0,77 0,000 JAK1 0,71 0,001 0,80 0,000 0,58 0,002 KYNU -0,60
Figure imgf000034_0010
0,018 -0,94 0,000 -0,56 0,007 NCF2 -0,57 0,029 0,71
Figure imgf000034_0011
0,001 -0,70 0,001
PARP10 0,58 0,037 0,75 0,002 0,73 0,002 RAD54L 0,61 0,037 0,66 0,008 0,53 0,033 5MG5 0,54 0,033 0,80 0,000 0,75 0,001 TOR3A 0,73 0,028 0,62 0,028 0,57 0,040 ADM -Q,88 0,005 -1,01 0,000 -0,02 0,967 CCS1 -0,77 0,028 -0,78 0,008 -0,45 0,145 SLC31A2 -0,79 0,004 -0,60 0,012 -0,17 0,577 SM PDL3 -1,11 0,009 1,12 0,002 -0,56 0,149 T R E M I -0,72 0,009 -0,67 0,005 -0,28 0,287 V N N l -0,97 0,030 -1,17
Figure imgf000034_0015
0,002 -0,35 0,423 FLT1 -1.01
Figure imgf000034_0016
0,028 -0,66 0,101 -0,80
Figure imgf000034_0017
0,039
ABCG1 0,39 0,339 0,70 0,028 0,62 0,047 ANKRD3 0,88 0,342 1,42 0,049 1,73
Figure imgf000034_0018
0,012
C16orf5
Figure imgf000034_0014
0,42 0,219 0,63 0,019 0,59 0,026 C 6 o rfl20 0,31 0,536
Figure imgf000034_0012
1,03
Figure imgf000034_0019
0,003 0,84 \ 0,013 CA2 -0,33 0,450 -0,70 0,033 -0,73 | 0,022
N13B2-h3VL6 MD707-13 lgG4n.l 1A11 lgGln/2
CCNL 0,51 0,178 0,75 0,012 0,59 0,049 CD14 -0,64 0,070 -0,98
Figure imgf000034_0021
0,001 -0,89 0,002
CDK1 0,64 0,118 0,96 0,004 0,80 0,014 CHTF 0,67 0,174 0,87 0,030 1,13 : 1 0,004 CLPT
Figure imgf000034_0020
0,74 0,111
Figure imgf000034_0022
1,06 0,005
Figure imgf000034_0013
1,01 0,007
Figure imgf000035_0001
SLC43A2 0,66 0,068 0,63 0,040 0,001 SPATC1L 0,96 0,180 1,17 0,044 0,031 SPP1 -0,53 0,102 -0,85 itg 0,001 0,017 SRP68 0,68 0,096 0,77 0,024 0,003 TAZ 0,95 0,092 1,23
Figure imgf000036_0001
0,008 0,007
TCIRG1 0,79 0,069 1,15 0,001 0,002 TNFRSF1 0,51 0,208 0,72 0,026 0,009 TNFRSF4 0,23 0,751 0,97 0,034 0,009 TNKS 0,66 0,052 0,78 0,006 0,016 TSC22D2 0,47 0,137 0,65 0,011 0,014 ÜBA5 0,91 0,076 1,22 0,004 0,005 USP48 0,64 0,145 0,90 0,012 0,044 VPS51 0,50 0,145 0,82 0,003 0,005 ZFAND5 0,56 0,054 0,71 0,003 0,007 ZNF259 0,47 0,242 0,85 0,007 0,038 ZNF496 0,51 0,220 0,86 0,008 0,009 ZNF696 0,80 0,061 1,09
Figure imgf000036_0002
0,002 0,033
ANXA1 -0,43 0,034 -0,49 0,005 0,000 C12orf75 -0,45 0,041 -0,43 0,022 0,001 C18orf32 -0,56 0,040 -0,61
Figure imgf000036_0005
0,008 0,035 CHM P7 0,50 0,028 0,64 0,001 0,004 DNAJC3 -0,49 0,004 -0,62
Figure imgf000036_0006
0,000 0,013
EVI2B -0,36 0,046 -0,38 0,013 0,000 HCST -0,54 0,034 -0,45 0,042 0,003 HSBP1 -0,44 0,009 -0,64
Figure imgf000036_0008
0,000 0,002
PAPOLA 0,57 0,018 0,72 0,000 0,006 PPBP -0,55 0,018 -0,65 I I 0,001 0,010 TIM P1 -0,52 0,019 -0,65 |||| 0,001 0,002 TLR2 -0,42 0,044 -0,60
Figure imgf000036_0009
0,001 0,048
UBE2D2 0,49 0,040 0,74 0,000 0,013 AGTRAP -0,52 0,040 -0,66 0,002 0,051 CXCL16 -0,55 0,034 -0,60 0,006 0,091 P2RX4 -0,48 0,034 -0,60
Figure imgf000036_0010
0,002 0,846
P2RX7 -0,72 H 0,018 -0,54 0,039 0,258 SLAM F7 -0.44 0,011 -0,64
Figure imgf000036_0011
0,000 0,251 SLC2A6 -0,59 0,028
Figure imgf000036_0003
-0,56 0,013 0,648
SUGP2 0,64 0,005 0,50 0,012 0,114 TNFAIP6
Figure imgf000036_0004
-0,55 0,029 ; -0,90 m 0,000 0,637
TNIP3 -0,55 0,028 -0,61 m 0,004 0,385
N13B2-h3VL6 MD707-13 lgG4n.l ln.°2
CYBA -0,53 0,030 -0,39 0,065 0,002 EPG5 0,59 0,034 0,39 0,112 0,013 RNT135 -0,57 0,043 -0,33 0,209 0,006 ALDH1 -0,79 ü 0,036 -0,38 0,294 0,311 CKS2
Figure imgf000036_0012
-0,85 0,048 -0,61 0,109
Figure imgf000036_0007
0,116
Figure imgf000037_0001
USP38 0,44 0,105 0,49 0,079 0,61 0,006 XYLT2 0,27 0,329 0,60 0,005 0,57 0,006 ACTR5 0,56 0,137 0,74 0,018 0,53 0,093 ADAM -0,88 0,095 -1,24 0,004 -0,63 0,176 ARHG -0,55 0,094 -0,63
Figure imgf000038_0001
0,021 -0,51 0,060
AUH 1,01 0,101 1,14 0,026 0,67 0,223 BAG2 0,29 0,548 0,70 0,042 0,42 0,254 BAIAP -0,44 0,367 -0,82 0,031 -0,32 0,474 BLOC1 -0,54 0,180 -0,71
Figure imgf000038_0002
0,029 -0,37 0,290
C16or 0,44 0,128 0,62 0,008 0,20 0,477 C lo rf2 0,25 0,669 0,82 0,042 0,55 0,193 C2orf -0,47 0,455 -0,97
Figure imgf000038_0004
0,040 -0,44 0,407 C3orf 0,46 0,182 0,60 0,032 0,43 0,144 CAM K 0,47 0,228 0,64 0,040 0,48 0,136 CCL2 -0,33 0,522 -0,86 0,019 0,52 0,186 CCL7 -0,48 0,282
Figure imgf000038_0003
-0,90 0,010 0,36 0,355
CCRL2 -0,42 0,263 : : -0,76 0,011 0,09 0,848 CD33 -1,08 0,261 -1,61
Figure imgf000038_0005
0,039 -1,28 0,103
CD6 0,12 0,833 0,67 0,042 0,51 0,134 CD68 -0,35 0,184 0,66 0,002 -0,36 0,093 CDC4 -0,30 0,490 -0,66 0,037 0,08 0,864 CLEC4 -0,61 0,086 -0,94 0,001 -0,53 0,069 CLEC7 -0,35 0,521 -0,83 0,034 -0,51 0,223 CPNE8 -0,52 0,422
Figure imgf000038_0006
1,02
Figure imgf000038_0007
0,036 0,32 0,601
CSF3 0,03 0,959 -0,63 0,030 0,30 0,353 CTSF 0,32 0,628 2 : 1,25 . ■ ' 0,006 0,88 0,051 DAB2 -0,62 0,089 -0,67 0,029 -0,49 0,119 DFNA -0,63 0,080 -0,89 0,00? -0,33 0,311 ECI1 0,62 0,167 0,78 0,031 0,45 0,249 ELAVL 0,56 0,120 0,74 0,013 0,51 0,091 ER01L -0,52 0,086 -0,85 0,001 -0,31 0,252 EXOSC -0,51 0,130 -0,69
Figure imgf000038_0009
0,013 -0,23 0,491
FAM 1 0,50 0,080 0,76 0,001 0,44 0,064 FAM8 0,39 0,431 0,82 0,029 0,71 0,055 FCAR -0,32 0,280 -0,71 0,002 -0,31 0,211 FGR -0,41 0,067 -0,67 0,000 -0,27 0,169 FHL3 0,57 0,180 0,72 0,035 0,24 0,572 FKBP8 0,39 0,166 0,68 0,002 0,28 0,250 F
U I 0,63 0,053
Figure imgf000038_0010
1,03
Figure imgf000038_0011
0,000 0,51 0,065
FPR2 -0,36 0,529 -0,88 0,032 0,11 0,867
N13B2-h3VL6 MD707-13 lgG4n.l
Figure imgf000038_0012
1A11 IgGln.S G0S2 -0,40 0,231 -0,65 0,015 0,02 0,973 GEM I -0,13 0,855 -0,85 0,041 -0,38 0,420 GGH -0,45 0,302 -0,73
Figure imgf000038_0013
0,034 -0,59 0,091 GIM A
Figure imgf000038_0008
0,39 0,256
Figure imgf000038_0014
0,69 0,012 0,47 0,097
Figure imgf000039_0001
RALY 0,39 0,234 0,60 0,023 0,44 0,107 RANBP1 0,14 0,738 0,59 0,026 0,31 0,293 RASA3 0,38 0,120 0,66 0,001 0,34 0,102 RAVER1 0,43 0,182 0,62 0,017 0,50 0,053 RCN2 0,48 0,231 0,76 0,017 0,41 0,234 RETSAT 0,48 0,231 0,65 0,047 0,59 0,065 RSPH3 -0,13 0,841 -0,95 0,008 -0,29 0,497 SEMA4A -0,53 0,057
Figure imgf000040_0001
-0,69 0,003 -0,04 0,911
SEPHS2 0,43 0,503 1,00 0,030 0,87 0,055
: --v- „ ■ :.
SLAMF8 -0,27 0,544 -0,64 0,040 0,53 0,087 SNAPC1 -0,34 0,325 -0,64 0,016 -0,30 0,300 SUSD3 0,53 0,101 0,59 0,027 0,41 0,136 T A F IA 0,23 0,588 0,60 0,043 0,03 0,954 TBC1D17 0,37 0,330 0,65 0,029 0,38 0,227 TBC1D2 0,38 0,254 0,62 0,020 0,23 0,469 TBC1D25 0,37 0,298 0,71 0,010 0,44 0,120 TBL2 0,31 0,450 0,68 0,026 0,23 0,542 TFE3 0,23 0,552 0,61 0,027 0,41 0,159 THBS1 -0,37 0,256 -0,64 0,012 -0,49 0,053 TLR8 -0,74 0,089 0,88 0,015 -0,03 0,963 TM EM 1 -0,94 0,068 -1,03 0,016 -0,82 0,055 TPRKB -0,46 0,212 -0,88 0,003 -0,48 0,120 UBE3A 0,06 0,924 0,65 0,042 0,54 0,096 USP21 0,37 0,272 0,75 0,004 0,27 0,363 VAMP4 -0,31 0,375 -0,61 0,024 -0,40 0,163 VNN2 -0,47 0,086 -0,60 0,008 -0,41 0,074 WBP5 -0,97 0,205 -1,42
Figure imgf000040_0005
0,020 -0,70 0,298
XPOT 0,78 0,061 0,78 0,025 0,57 0,108 ZDHHC3 0,56 0,095 0,73 0,008 0,30 0,328 ZER1 0,58 0,161 0,78 0,019 0,36 0,333 ZNF589 0,27 0,504 0,/3 0,012 0,25 0,474 ZNF71 0,55 0,101 0,65 0,020 0,23 0,487 ZNF792 0,70 0,108 0,95 0,008 0,67 0,063 ABHD14 0,24 0,52/ 0,00 1,000 0,62 0,018 ACSL1 0,07 0,872 -0,08 0,823 0,62 0,014 A G 02 0,21 0,547 0,31 0,259 0,71 0,003 APOBEC 0,20 0,673 0,12 0,801 0,68 0,034 ARHGAP 0,22 0,582 0,28 0,364 0,60 0,026 ATF3 0,18 0,771 0,04 0,949 0,89 0,017 B3GNT5 0,11 0,855
Figure imgf000040_0004
-0,01 0,985 0,81 0,013
BACH2 0,26 0,352 0,25 0,296 0,71 0,001
N13B2-h3VIL6 MD707-13 lgG4n.l 1A11 lgGln/2
C19orf4 -0,57 0,055 -0,30 0,285 -0,59 0,014 C9orf69 0,34 0,319 0,40 0,153 0,64 0,012 CCL4 -0,15 0,757 -0,39 0,248 0,94 0,002 CCL8
Figure imgf000040_0002
-0,28 0,813 -0,94 0,214
Figure imgf000040_0003
2,02 0,003 -0,56 0,174 -0,32 0,412 -1,00 0,002 -0,64 0,288 -0,74 0,143
Figure imgf000041_0002
2,02
Figure imgf000041_0001
0,000 -0,28 0,494 -0,36 0,285 0,78 0,008 -0,77 0,172 -0,72 0,129 ■ ' -1,76
Figure imgf000041_0003
0,005 -0,08 0,769 -0,25 0,155 -0,61 0,000 0,02 0,974 -0,08 0,770 0,82 0,000 -0,30 0,499 -0,29 0,431 0,65 : 0,038 -0,41 0,410 -0,56 0,156 ■ 0,76 0,039 0,05 0,939 -0,05 0,913 -0,67 0,041
0,34 0,655 0,21 0,771 -1,41 0,005 -0,21 0,616 -0,45 0,133 -0,67
Figure imgf000041_0004
0,015 -0,39 0,388 -0,39 0,310 1,05 0,002 0,11 0,939 0,79 0,337 1,61 0,024 0,04 0,930 0,01 0,989
Figure imgf000041_0005
0,73 0,004 0,19 0,662 -0,24 0,493 n 0,64 0,023 -0,55 0,511 -0,36 0,648 1,58 0,007 -0,32 0,687 -0,05 0,956 1,61
Figure imgf000041_0006
0,002 0,85 0,133 0,82 0,088 0,93 0,043 0,54 0,143 0,58 0,058 0,61 0,040 -0,67 0,094 -0,45 0,210 0,35 0,008 -0,46 0,250 -0,15 0,737 -0,81 0,010 0,09 0,874 0,16 0,728 0,75 0,021 0,35 0,338 0,50 0,083 0,59 0,034 0,05 0,933 0,06 0,881 0,76 0,007 0,27 0,586 0,63 0,077 0,76 0,024 -0,16 0,647 -0,23 0,384 0,77 0,001 0,30 0,429 0,37 0,238 0,61 0,029 -0,22 0,716 -0,34 0,475 1,07 0,005 -0,19 0,820 -0,02 0,979 1,11 0,019 0,04 0,924 0,02 0,956 0,61 0,004 0,00 0,997 0,08 0,823
Figure imgf000041_0008
0,74 0,002 0,00 1,000 0,06 0,921 1,14 0,002 -0,03 0,952 -0,16 0,574 ■ -0,64
Figure imgf000041_0009
0,004 0,37 0,298 0,49 0,092 ; 0,59 0,035 -0,28 0,298 -0,29 0,194 0.61
Figure imgf000041_0010
0,003 0,05 0,916 -0,08 0,829
Figure imgf000041_0011
0,71 0,002 -0,23 0,512 -0,36 0,181 -068
Figure imgf000041_0012
0,005 0,07 0,858 -0,19 0,435 ■' 0,66 0,001 -0,29 0,391 -0,47 0,076 -0,71
Figure imgf000041_0013
0,005 0,36 0,213 0,09 0,783 0,65 0,005 N13B2-h3VL6 MD707-13 lgG4n.l 1A11 lgGln/2 0,53 0,153 0,49 0,170 0,78 0,007 0,40 0,414 0,71 0,056 0,72 0,046 0,32 0,706 -0,32 0,654 1,21 0,024
Figure imgf000041_0007
0,15 0,664 0,37 0,119
Figure imgf000041_0014
0,66 0,003 0,20 0,664 0,42 0,212 0,61 0,049
0,16 0,635 0,34 0,172 0,61 0,007 0,56 0,070 0,45 0,088 0,59 0,018 -0,08 0,885 -0,24 0,549 0,89 0,005 -0,50 0,067 -0,38 0,111 -0,59 0,008 0,55 0,092 0,49 0,079 0,67 0,010 0,01 0,996 0,13 0,727 0,68 0,013 0,36 0,256 0,41 0,113 1,03 0,000 -0,09 0,790 0,01 0,982 0,71 0,000 -0,36 0,567 -0,45 0,380 1,41 0,002 0,30 0,564 0,07 0,898 0,74 0,036 0,63 0,087 0,53 0,091 0,98 0,001 0,06 0,880 0,23 0,400 0,76 0,002 0,37 0,503 0,60 0,144 0,80 0,040 -0,05 0,911 0,19 0,527 0,66 0,006 -0,81 0,070 -0,17 0,733
Figure imgf000042_0001
-0,73
Figure imgf000042_0002
0,047 -0,26 0,656 -0,39 0,402 r 1.02 : 0,008 -0,13 0,622 -0,26 0,178 -0,82 1 0,000 -0,42 0,178 -0,49 0,052 ; -0,69 1 0,005 -0,08 0,879 -0,01 0,976
Figure imgf000042_0003
0,79 ; 0,006 0,13 0,793 0,30 0,418 0,72 0,018 -0,42 0,503 -0,39 0,469 ■ -0,93 1 0,035 0,72 0,170 0,74 0,087 0,89 0,033 -0,45 0,432 -0,83 0,055 -1,03 ¡ 0,013 -0,09 0,837 -0,38 0,125 -0,64 1 0,006 0,00 1,000 0,15 0,701 0,76 0,009 0,08 0,941 0,21 0,792 -1,17 0,034 -0,31 0,477 -0,43 0,220 -0,77
Figure imgf000042_0005
0,013 0,25 0,731 0,55 0,278 1,23 0,006 -0,27 0,557 -0,54 0,115 -0,65 0,044 0,08 0,881 0,21 0,576 0,60 0,043 0,14 0,821 0,55 0,164 0,80 0,028 0,12 0,777 0,06 0,871 0,95 0,000 -0,09 0,841 -0,25 0,373 0,75 0,002 -0,55 0,152 -0,21 0,581 -0,62 0,046 0,48 0,159 0,54 0,051 0,64 0,016 0,05 0,930 0,42 0,181 0,59 0,040 -0,08 0,853 -0,17 0,579 0,82 0,001 0,51 0,168 0,56 0,067 0,62 0,036 0,27 0,302 0,32 0,143 0,60 0,003 -0,39 0,545 -0,64 0,189 -1,00 0,026 N13B2-h3VL6 MD707-13 lgG4n.°l
Figure imgf000042_0006
1A11 lgGln/2
0,12 0,854 -0,02 0,971 0,79 0,022 -0,16 0,703 -0,21 0,550 -0,60 0,032 -0,28 0,509 -0,34 0,324 0,61 0,045
Figure imgf000042_0004
-0,16 0,809 -0,07 0,901
Figure imgf000042_0007
1,09 ; 0,004
Tabla 6. Lista de genes de manera significativa (FDR 5 %) y diferencialmente (múltiplo de variación > 1,5) exp después de la incubación de PBMC humanas (n=7) con mAb anti-IL7Ra en comparación con células no estimuladas.
El análisis del diagrama de Venn (Figura 11C) identificó 61 genes comunes expresados diferencialmente con los tres mAb sin ningún enriquecimiento de ontología del gen GoMiner en particular. A pesar de 61 genes comunes, el anticuerpo de la invención induce sólo 31 modificaciones génicas significativas sin enriquecimiento de ontología génica. En cambio, los dos anticuerpos de la técnica anterior inducen una importante modificación transcripcional del transcriptoma de PBMC humanas, con 245 genes expresados diferencialmente inducidos por el mAb IgG4 n.° 1 del sitio 1 y 237 genes expresados diferencialmente inducidos por el mAb IgG1 n.° 2 del sitio 1. 78 genes expresados diferencialmente eran comunes entre estos dos mAb de sitio 1, pero estos genes no se expresan diferencialmente cuando las PBMC se estimulan con N13B2-hVL6.
El Análisis de Componentes Principales (PCA) de la firma de IL-7 muestra que los genes expresados diferencialmente inducidos por los anticuerpos de la técnica anterior son fuertemente diferentes de los genes expresados diferencialmente inducidos por IL-7. El enriquecimiento de la ontología del gen GoMiner sugiere que ambos anticuerpos de la técnica anterior modifican las funciones biológicas de las PBMC tales como la activación de leucocitos, proliferación, migración, quimiotaxis, secreción de citocinas y respuestas inflamatorias asociadas con la ruta MAPK/ERK.
Entre los 334 genes expresados diferencialmente con IL7 en comparación con la condición de control, 93 genes se expresaron diferencialmente con un alto múltiplo de variación (> 2) y se separaron en 3 grupos distintos mediante análisis de mapa de calor (Figura 11A). El primer grupo de genes regulados negativamente evaluados por enriquecimiento de ontología genética estuvo implicado principalmente en la diferenciación de leucocitos y la apoptosis, un segundo grupo de genes altamente regulados positivamente se asoció a la adhesión, diferenciación y activación de leucocitos, y un tercer grupo de genes regulados positivamente tenía una ontología génica mixta. De manera interesante, todos los mAb probados (tanto del sitio 1 como del sitio 1/2b) mostraron efectos similares al evitar la modificación del grupo 1 y del grupo 2, pero sin impacto en el grupo 3 (Figura 11B).
En conjunto, los análisis transcripcionales confirmaron que, a pesar de que los mAbs anti-IL-7Ra humana del sitio 1 y del sitio 1/2b compartían propiedades antagonistas similares, los dos mAb de sitio 1 descritos en el estado de la técnica indujeron modificaciones transcripcionales significativas de PBMC humanas compatibles con la activación de células T y respuestas inflamatorias inducidas por la ruta MAPK/ERK.
El mAb anti-IL-7Ra humano de sitio 1/2b de la invención, es decir, N13B2-hVL6, indujo menos modificación transcripcional de PBMC humanas en comparación con los dos mAb de sitio 1 descritos en el estado de la técnica.
La falta de mAb anti-I L-7Ra específicos y "solo antagonistas" para especies más grandes ha impedido la verificación de este efecto en primates o humanos. Los inventores encontraron que las propiedades agonistas/antagonistas de mAb anti-IL-7Ra dependen del epítopo específico al que se dirige, dado que los anticuerpos del estado de la técnica que se unen al dominio de interacción IL-7 del sitio 1 parecen tener propiedades agonistas/antagonistas, mientras que el anticuerpo de la invención que se une al dominio de dimerización de IL-7Ra/Yc (sitio 2b) muestra una actividad antagonista estricta. Los inventores sugieren que el anticuerpo de la invención podría perturbar la dimerización de IL-7Ra/Yc requerida para la internalización y señalización del receptor. Los anticuerpos "solo antagonistas" contra el IL-7R previnieron la inflamación de la piel mediada por células T de memoria a largo plazo en primates, incluso después de la estimulación crónica del antígeno, sin inducir linfopenia o deficiencias funcionales o metabólicas de las células T policlonales.
Se ha demostrado que IL-7 induce señales proliferativas y antiapoptóticas a través de la señalización de IL-7R principalmente activando la ruta JAK/STAT. También se cree que la señalización de IL-7R implica la ruta PI3K/AKT, pero esto se ha observado en líneas celulares inmortalizadas transformadas o timocitos primarios y estas señales no fueron detectables en linfocitos T humanos periféricos vírgenes o de memoria (Watanabe, J. Exp. Med, 1998). Varios informes también han sugerido que la señalización de IL-7R podría amplificar la fosforilación de ERK en linfocitos T o en subconjuntos de células pro-B (Deshpande P.I. Immunol, 2013; Fleming HE y Paige CJ, Immunity, 2001). El papel de estas rutas en la señalización de IL-7R en células T maduras y humanas es menos claro. Usando PBMC humanas primarias recién aisladas (compuestas principalmente por linfocitos T y B, monocitos y células NK) de voluntarios sanos estimulados con una alta concentración de IL-7 humana recombinante (5000 pg/ml, mientras que la concentración en sueros es ~ 5 pg/ml en condiciones no linfopénicas Wong H-L, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008)), los inventores confirmaron que la IL-7 inducía la fosforilación reproducible de STAT5. La activación de la señal de PI3K fue más variable y no se observó ninguna fosforilación de ERK. Si bien todos los mAb anti-IL7Ra usados en este estudio fueron potentes inhibidores de pSTAT5 inducido por IL-7 y mostraron propiedades antagonistas transcripcionales similares, los presentes inventores descubrieron que dos mAb de sitio 1 del estado de la técnica inducían señales agonistas de PI3K/ERK e importantes modificaciones transcripcionales asociadas con la activación de células T y respuestas inflamatorias inducidas por la ruta MAPK/ERK. Estas propiedades dobles agonistas/antagonistas opuestas de algunos mAb no son únicas, ya que otras dianas tales como IL-4, IL-6R, IL-15, CD28, CD38, CD40 o HER2 demostraron actividades similares después de la endocitosis/internalización del receptor.
La heterodimerización de este sitio 2b con TSLPR también se ha confirmado recientemente y se ha demostrado que está preparada para la señalización del receptor como ya se predijo para IL-7Ra y y (Verstraete K., Nature Communications, 2017). De manera interesante, el sitio de heterodimerización predicho entre IL-7Ra/cadena y e IL-7Ra/TSLPR se superpone, lo que sugiere un mecanismo de señalización compartido mediado por heterodimerización entre ambos receptores.
Descubrimos que el ensayo de inhibición de pSTAT5 in vitro no fue predictivo de la efectividad del anticuerpo anti-IL-7R in vivo. En un informe anterior, otro mAb anti-IL7Ra evitó PSTAT5 inducida por IL-7 in vitro y ex vivo en primates, pero no protegió de la inflamación cerebral en un modelo de tití de encefalitis autoinmune experimental (EAE) (Dunham J., J. Neuroimmune.Pharmacol, 2016).
La IL-7 se ha descrito bien en el mantenimiento de la reserva de linfocitos T periféricos vírgenes y de memoria en ratones. En los primates, sin embargo, la importancia de la IL-7 en el mantenimiento de la homeostasis de las células T periféricas podría, por tanto, ser menos evidente y/o los mecanismos redundantes podrían explicar la diferencia entre las especies.
Estos datos mostraron que las propiedades antagonistas de los mAb anti-IL-7Ra y la eficacia in vivo no solo están relacionadas con la prevención de la unión de IL-7 y la inhibición de pSTAT5. Estos datos mostraron que el anticuerpo de la invención también se dirige al sitio de heterodimerización del receptor (sitio 2b), es "solo antagonista" y da como resultado una mayor efectividad de las respuestas inhibidoras de las células T in vivo.
Dirigirse a IL7R con anticuerpos "solo antagonistas" tiene el potencial de regular la supervivencia y acumulación de células T de memoria específicas de antígeno y, por lo tanto, podría promover la prevención de recaídas a largo plazo en enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD127, en particular a CD127 humano, que comprende:
- una cadena ligera de anticuerpo que comprende o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; en particular SEQ ID NO: 12; y
- un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo que consiste en la secuencia establecida en SEQ ID NO: 7.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado, en particular en donde el dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo deriva de un dominio constante de la cadena ligera kappa humana, en particular en donde el dominio constante de la cadena ligera consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 27 o 28, y en donde el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo deriva de un dominio constante de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas, en particular de un dominio constante de cadena pesada de IgG4 humana, en particular en donde el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo consiste en la secuencia con SEQ ID NO: 26.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende o el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo consiste en SEQ ID NO: 12.
4. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un antagonista de la señalización de IL-7R inducida por IL-7 y que no induce la activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa y/o de la ruta de señalización de ERK.
5. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que reconoce un epítopo que comprende una secuencia tomada del sitio 2b de CD127 y/o interrumpe la unión de CD127 a la cadena común yc de receptores de citocinas, en particular que reconoce al menos la tercera hoja beta del sitio 2b de CD 127.
6. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que no induce la internalización de CD127 y/o inhibe la internalización de CD127 inducida por IL7.
7. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que no aumenta la maduración de las células dendríticas inducida por TSLP.
8. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene un efecto duradero y/o un efecto rápido, en particular que tiene un efecto local rápido.
9. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se une específicamente a CD127 humano con una constante de afinidad KD inferior a 5E-9 M, como puede determinarse por análisis de biosensor.
10. Una combinación de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en particular una primera molécula de ácido nucleico aislada que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ iD NO: 17 y SEQ ID NO: 18; y una segunda molécula de ácido nucleico aislada que comprende o consiste en la secuencia de s Eq ID NO: 13.
11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o la combinación de moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la reivindicación 10 y un vehículo farmacéutico.
12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, que es adecuado para la administración local, en particular para la administración subcutánea local, entérica u oral, más particularmente para el suministro al colon.
13. Un kit que comprende una composición farmacéutica de la reivindicación 11 o la reivindicación 12 y un dispositivo de suministro adecuado para la administración local, en particular un dispositivo de suministro subcutáneo, entérico u oral, más particularmente dicho dispositivo que comprende una jeringa precargada o un dispositivo sin aguja.
14. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o la combinación de moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la reivindicación 10, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, para su uso como un medicamento.
15. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o la combinación de moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la reivindicación 10, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, para su uso de acuerdo con la reivindicación 14 en la prevención o el tratamiento del rechazo de trasplantes de órganos o tejidos o de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunitarias, particularmente artritis reumatoide, esclerosis sistémica, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, tiroiditis autoinmunitaria, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren primario y enfermedades inflamatorias, particularmente enfermedad inflamatoria del intestino (EII), más particularmente enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa y encefalomielitis y enfermedades alérgicas y enfermedades cancerosas y enfermedades relacionadas con trasplantes y enfermedades.
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