ES2866899T3 - Neurotoxinas quiméricas - Google Patents
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Abstract
Una neurotoxina quimérica que comprende un dominio LHN de una primera neurotoxina unido covalentemente a un dominio HC de una segunda neurotoxina, en donde: (a) el residuo de aminoácido C-terminal de dicho dominio LHN corresponde al primer residuo de aminoácido de la hélice 310 que separa los dominios LHN y HC en dicha primera neurotoxina; (b) el residuo de aminoácido N-terminal de dicho dominio HC corresponde al segundo residuo de aminoácido de la hélice 310 que separa los dominios LHN y HC en dicha segunda neurotoxina; y (c) dicha primera y segunda neurotoxinas son diferentes y (i) dicha primera neurotoxina es una neurotoxina botulínica (BoNT) de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una neurotoxina tetánica (TeNT); y (ii) dicha segunda neurotoxina es una BoNT de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una TeNT.
Description
DESCRIPCIÓN
Neurotoxinas quiméricas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a neurotoxinas quiméricas con propiedades mejoradas y su uso en terapia.
Antecedentes
Las bacterias del género Clostridia producen toxinas proteicas muy potentes y específicas, que pueden envenenar las neuronas y otras células a las que se administran. Los ejemplos de dichas toxinas clostridiales incluyen las neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT) y por C. botulinum (BoNT), serotipos A-G, así como las producidas por C. baratii y C. butyricum.
Entre las neurotoxinas clostridiales se encuentran algunas de las toxinas más potentes conocidas. A modo de ejemplo, las neurotoxinas botulínicas tienen valores de dosis letal media (DL50) para ratones que oscilan entre 0,5 y 5 ng/kg, dependiendo del serotipo. Tanto las toxinas tetánicas como las botulínicas actúan inhibiendo la función de las neuronas afectadas, específicamente la liberación de neurotransmisores. Mientras que la toxina botulínica actúa en la unión neuromuscular e inhibe la transmisión colinérgica en el sistema nervioso periférico, la toxina tetánica actúa en el sistema nervioso central.
En la naturaleza, las neurotoxinas clostridiales se sintetizan como un polipéptido monocatenario que se modifica después de la traducción mediante un evento de escisión proteolítica para formar dos cadenas polipeptídicas unidas por un enlace disulfuro. La escisión se produce en un sitio de escisión específico, a menudo denominado sitio de activación, que está localizado entre los residuos de cisteína que proporcionan el enlace disulfuro entre cadenas. Es esta forma bicatenaria la forma activa de la toxina. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. La cadena H comprende un componente de translocación N-terminal (dominio Hn) y un componente de direccionamiento C-terminal (dominio Hc). El sitio de escisión está localizado entre la cadena L y los componentes del dominio de translocación. Tras la unión del dominio HC a su neurona diana y la internalización de la toxina unida en la célula a través de un endosoma, el dominio Hn transloca la cadena L a través de la membrana endosomal y hacia el citosol, y la cadena L proporciona una función de proteasa (también conocida como proteasa no citotóxica).
Las proteasas no citotóxicas actúan escindiendo proteolíticamente las proteínas de transporte intracelular conocidas como proteínas SNARE (p. ej., SNAP-25, VAMP o Sintaxina) - véase, Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4a edición) John Wiley & Sons, Inc. El acrónimo SNARE deriva del término receptor de unión a NSF soluble, donde NSF significa factor sensible a N-etilmaleimida. Las proteínas SNARE son parte integral de la fusión de vesículas intracelulares y, por lo tanto, de la secreción de moléculas a través del transporte de vesículas desde una célula. La función proteasa es una actividad endopeptidasa dependiente de zinc y exhibe una alta especificidad de sustrato para las proteínas SNARE. Por consiguiente, una vez administrada a una célula diana deseada, la proteasa no citotóxica es capaz de inhibir la secreción celular desde la célula diana. Las proteasas de la cadena L de las neurotoxinas clostridiales son proteasas no citotóxicas que escinden las proteínas SNARE.
En vista de la naturaleza ubicua de las proteínas SNARE, las neurotoxinas clostridiales tales como la toxina botulínica se han empleado con éxito en una amplia gama de terapias.
A modo de ejemplo, nos referimos a William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004), que describe el uso de neurotoxinas clostridiales, tales como las neurotoxinas botulínicas (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, y la neurotoxina tetánica (TeNT), para inhibir la transmisión neuronal en una serie de aplicaciones terapéuticas y cosméticas o estéticas - por ejemplo, los productos de toxina botulínica comercializados están actualmente aprobados como terapéuticos para indicaciones que incluyen espasticidad focal, espasticidad de miembros superiores, espasticidad de miembros inferiores, distonía cervical, blefaroespasmo, espasmo hemifacial, hiperhidrosis de las axilas, migraña crónica, hiperactividad neurogénica del detrusor, líneas glabelares y líneas cantales laterales graves. Además, se describen terapias con neurotoxinas clostridiales para el tratamiento de trastornos neuromusculares (véase, US 6.872.397); para el tratamiento de trastornos uterinos (véase, US 2004/0175399); para el tratamiento de úlceras y enfermedad por reflujo gastroesofágico (véase, US 2004/0086531); para el tratamiento de la distonía (véase, US 6.319.505); para el tratamiento de trastornos oculares (véase, US 2004/0234532); para el tratamiento del blefaroespasmo (véase, US 2004/0151740); para el tratamiento del estrabismo (véase, US 2004/0126396); para el tratamiento del dolor (véase, US 6.869.610, US 6.641.820, US 6.464.986, y US 6.113.915); para el tratamiento de la fibromialgia (véase, US 6.623.742, US 2004/0062776); para el tratamiento del dolor lumbar (véase, US 2004/0037852); para el tratamiento de lesiones musculares (véase, US 6.423.319); para el tratamiento del dolor de cabeza sinusal (véase, US 6.838.434); para el tratamiento del dolor de cabeza tensional (véase, US 6.776.992); para el tratamiento del dolor de cabeza (véase, US 6.458.365); para la reducción del dolor de cabeza por migraña (véase, US 5.714.469); para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (véase, US 6.767.544); para el tratamiento de trastornos neurológicos tales como la enfermedad de Parkinson (véase, US 6.620.415, US 6.306.403); para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos (véase, US 2004/0180061, US 2003/0211121); para el tratamiento de trastornos endocrinos (véase, US 6.827.931);
para el tratamiento de trastornos de la tiroides (véase, US 6.740.321); para el tratamiento de trastornos de las glándulas sudoríparas con influencia colinérgica (véase, US 6.683.049); para el tratamiento de la diabetes (véase, US 6.337.075, US 6.416.765); para el tratamiento de un trastorno pancreático (véase, US 6.261.572, US 6.143.306); para el tratamiento de cánceres tales como los tumores óseos (véase, US 6.565.870, US 6.368.605, US 6.139.845, US 2005/0031648); para el tratamiento de trastornos óticos (véase, US 6.358.926, US 6.265.379); para el tratamiento de trastornos autonómicos tales como trastornos de los músculos gastrointestinales y otras disfunciones del músculo liso (véase, US 5.437.291); para el tratamiento de lesiones cutáneas asociadas con trastornos proliferativos de células cutáneas (véase, US 5.670.484); para la gestión de los trastornos inflamatorios neurogénicos (véase, US 6.063.768); para reducir la caída del pelo y estimular el crecimiento del pelo (véase, US 6.299.893); para el tratamiento de la boca caída (véase, US 6.358.917); para reducir el apetito (véase, US 2004/40253274); para terapias y procedimientos dentales (véase, US 2004/0115139); para el tratamiento de trastornos y afecciones neuromusculares (véase, US 2002/0010138); para el tratamiento de diversos trastornos y afecciones y el dolor asociado (véase, US 2004/0013692); para el tratamiento de afecciones que se producen por la hipersecreción de moco tales como el asma y la EPOC (véase, WO 00/10598); y para el tratamiento de afecciones no neuronales tales como inflamación, afecciones endocrinas, afecciones exocrinas, afecciones inmunológicas, afecciones cardiovasculares, afecciones óseas (véase, WO 01/21213).
Se anticipa que el uso de proteasas no citotóxicas como las neurotoxinas clostridiales (p. ej., BoNT y TeNT) en tratamientos terapéuticos y cosméticos de seres humanos y otros mamíferos se expandirá a una gama cada vez mayor de enfermedades y dolencias que pueden beneficiarse de las propiedades de estas toxinas.
Actualmente, todos las preparaciones de fármacos/cosméticos aprobadas que comprenden BoNT contienen neurotoxinas naturales purificadas de cepas clostridiales (BoNT/A en el caso de DYSPOrT®, BOTOX® o XEOMIN®, y BoNT/B en el caso de MYOBLOC®).
La tecnología recombinante ofrece la posibilidad de cambiar u optimizar las propiedades de las neurotoxinas mediante la introducción de modificaciones en su secuencia y/o estructura. En particular, se han producido neurotoxinas quiméricas en las que el dominio Hc o el subdominio Hcc se reemplaza por un dominio Hc o un subdominio Hcc de una neurotoxina diferente.
Rummel et al, 2011 (Exchange of the Hcc domain mediating double receptor recognition improves the pharmacodynamic properties of botulinum neurotoxin. FEBS Journal, 278(23), 4506-4515) generaron diversas neurotoxinas híbridas activas de longitud completa, incluyendo las quimeras AABB, AACC y BBAA (las letras representan el origen del serotipo de cada uno de los cuatro dominios: L, Hn, Hcn, Hcc). Se descubrió que la quimera AABB era más potente que BoNT/A en un ensayo de hemidiafragma del nervio frénico de ratón, mientras que la AACC solo retuvo el 10 % de la potencia de la BoNT/A. La quimera BBAA retuvo el 85 % de la potencia de BoNT/A y fue equipotente con BoNT/B.
Wang et al, 2008 (Novel chimeras of botulinum neurotoxins A and E unveil contributions from the binding, translocation, and protease domains to their functional characteristics. Journal of Biological Chemistry, 283(25), 16993-17002) generaron neurotoxinas quiméricas AE (LHn de BoNT/A y Hc de BoNT/E) y EA (LHn de BoNT/E y Hc de BoNT/A), añadiendo un conector en el caso de la quimera AE entre los dominios LHn y Hc para aumentar la flexibilidad. Ambas pudieron causar una parálisis en un ensayo de hemidiafragma del nervio frénico de ratón, así como in vivo.
Wang et al., 2012a (Longer-acting and highly potent chimaeric inhibitors of excessive exocytosis created with domains from botulinum neurotoxin A and B. Biochemical Journal, 444(1), 59-67) generaron neurotoxinas quiméricas AB (LHn de BoNT/A y Hc de BoNT/B, con un conector para mejorar el plegamiento) y BA (LHn de BoNT/B y Hc de BoNT/A). La quimera AB indujo una parálisis neuromuscular más prolongada que BoNT/A en ratones. La quimera BA pudo reducir la exocitosis de células no neuronales.
Wang et al, 2012b (Novel chimeras of botulinum and tetanus neurotoxins yield insights into their distinct sites of neuroparalysis. The Fa SEB Journal, 26(12), 5035-5048) generaron las quimeras ATx (LHn de BoNT/A y Hc de TeNT), TxA (LHn de TeNT y Hc de BoNT/A), ETx (LHn de BoNT/E y Hc de TeNT) y TxE (LHn de TeNT y Hc de BoNT/E). La información proporcionada con respecto a la secuencia de proteínas de estas neurotoxinas quiméricas de la técnica anterior se resume en la tabla 1 a continuación:
Tabla 1 - Dominios LHn y Hc en neurotoxinas quiméricas de la técnica anterior
Quimera LHn Hc
Rummel, 2011 AABB A B: 871-1304
AACC A C: 871-1296
BBAA B A: 858-1283 Wang, 2008 AE A: 1-874 (+ conector ELGGGGSEL) E: 845-1252
EA E: 1-844 (+ conector DI) A: 871-1296
Quimera LH n H c Wang, 2012 (a) AB A: 1-874 (+ conector ELGGGGSEL) B: 858-1283
BA B: 1-861 (+ conector DI) A: 871-1296 Wang, 2012 (b) ATx A: 1-877 Tx: 879-1315
TxA Tx: 1-882 (+ conector DI) A: 871-1296 ETx E: 1-844 (+ conector DI) Tx: 879-1315
TxE Tx: 1-882 (+ conector EL) E: 845-1252
Sin embargo, todavía existe la necesidad de un diseño optimizado de neurotoxinas quiméricas que permita propiedades terapéuticas mejoradas.
La presente invención resuelve el problema anterior proporcionando neurotoxinas quiméricas, como se especifica en las reivindicaciones.
Resumen de la invención
En un aspecto, la invención proporciona una neurotoxina quimérica que comprende un dominio LHn de una primera neurotoxina unido covalentemente a un dominio Hc de una segunda neurotoxina, en donde la primera y segunda neurotoxinas son diferentes, en donde el residuo de aminoácido C-terminal del dominio LHN corresponde al primer residuo de aminoácido de la hélice 310 que separa los dominios LHN y HC en la primera neurotoxina, y en donde el residuo de aminoácido N-terminal del dominio Hc corresponde al segundo residuo de aminoácido de la hélice 310 que separa los dominios LHN y HC en la segunda neurotoxina; en donde dicha primera neurotoxina es una neurotoxina botulínica (BoNT) de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una neurotoxina tetánica (TeNT); y (ii) dicha segunda neurotoxina es una BoNT de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una TeNT.
En un segundo aspecto, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina quimérica según la invención.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleótidos según la invención.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula que comprende una secuencia de nucleótidos o un vector según la invención.
En un quinto aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una neurotoxina quimérica según la invención.
En un sexto aspecto, la invención proporciona una neurotoxina quimérica según la invención para su uso en terapia.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona un uso no terapéutico de una neurotoxina quimérica según la invención para tratar una afección estética o cosmética.
Descripción detallada
En un aspecto, la invención proporciona una neurotoxina quimérica que comprende un dominio LHN de una primera neurotoxina unido covalentemente a un dominio Hc de una segunda neurotoxina, en donde la primera y segunda neurotoxinas son diferentes,
• en donde el residuo de aminoácido C-terminal del dominio LHn corresponde al primer residuo de aminoácido de la hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc en la primera neurotoxina, y
• en donde el residuo de aminoácido N-terminal del dominio Hc corresponde al segundo residuo de aminoácido de la hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc en la segunda neurotoxina.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "un", "una" y "el" pueden significar uno o más.
El término "neurotoxina", tal y como se usa en la presente memoria, significa cualquier polipéptido que entra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores. Este proceso abarca la unión de la neurotoxina a un receptor de baja o alta afinidad, la internalización de la neurotoxina, la translocación de la porción endopeptidasa de la neurotoxina en el citoplasma y la modificación enzimática del sustrato de la neurotoxina. Más específicamente, el término "neurotoxina" abarca cualquier polipéptido producido por bacterias Clostridium (neurotoxinas clostridiales) que entra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores, y dichos polipéptidos producidos por tecnologías
recombinantes o técnicas químicas. Es esta forma bicatenaria la forma activa de la toxina. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. Según la invención, la primera neurotoxina es una neurotoxina botulínica (BoNT) de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una neurotoxina tetánica (TeNT); y la segunda neurotoxina es una BoNT de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una TeNT.
Se proporciona un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/A como SEQ ID NO: 1 (número de acceso de UniProt A5HZZ9). Se proporciona un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/B como SEQ ID NO: 2 (número de acceso de UniProt B1INP5). Se proporciona un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/C como SEQ ID NO: 3 (número de acceso de UniProt P18640). Se proporciona un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/D como SEQ ID NO: 4 (número de acceso de UniProt P19321). Se proporciona un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/E como SEQ ID NO: 5 (número de acceso de UniProt Q00496). Se proporciona un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de una neurotoxina BoNT/F como SEQ ID NO: 6 (número de acceso de UniProt Q57236). Se proporciona un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de una neurotoxina de BoNT/G como SEQ ID NO: 7 (número de acceso de UniProt Q60393). Se proporciona un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de una neurotoxina TeNT como SEQ ID NO: 8 (número de acceso de UniProt P04958). Las secuencias de aminoácidos de dichas neurotoxinas se muestran en el alineamiento de la Figura 1 a continuación, junto con las secuencias de otras neurotoxinas (es decir, SEQ ID NO: 58 a 91).
El término "neurotoxina quimérica", tal y como se usa en la presente memoria, significa una neurotoxina que comprende o consiste en un dominio LHn que se origina a partir de una primera neurotoxina y un dominio Hc que se origina a partir de una segunda neurotoxina, en donde tanto la primera como la segunda neurotoxina se selecciona independientemente de una BoNT de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una TeNT. El término "dominio Hc ", tal y como se usa en la presente memoria, significa una región funcionalmente distinta de la cadena pesada de la neurotoxina con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa que permite la unión de la neurotoxina a un receptor localizado en la superficie de la célula diana. El dominio Hc consiste en dos subdominios estructuralmente distintos, el "subdominio Hc n " (parte N-terminal del dominio Hc ) y el "subdominio Hcc" (parte C-terminal del dominio Hc ), cada uno de los cuales tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa.
El término "dominio LHn ", tal y como se usa en la presente memoria, significa una neurotoxina que está desprovista del dominio Hc y consiste en un dominio endopeptidasa ("L" o "cadena ligera") y el dominio responsable de la translocación de la endopeptidasa en el citoplasma (dominio Hn de la cadena pesada).
En la presente memoria, la referencia al "primer residuo de aminoácido de la hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc en la primera neurotoxina" significa el residuo N-terminal de la hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc .
En la presente memoria, la referencia al "segundo residuo de aminoácido de la hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc en la segunda neurotoxina" significa el residuo de aminoácido que sigue al residuo N-terminal de la hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc .
Una "hélice 310" es un tipo de estructura secundaria que se encuentra en proteínas y polipéptidos, junto con hélices a, láminas p y giros inversos. Los aminoácidos en una hélice 310 están dispuestos en una estructura helicoidal a la derecha donde cada giro completo se completa con tres residuos y diez átomos que separan el enlace de hidrógeno intramolecular entre ellos. Cada aminoácido corresponde a un giro de 120° en la hélice (es decir, la hélice tiene tres residuos por giro) y una traslación de 2,0 Á (= 0,2 nm) a lo largo del eje helicoidal, y tiene 10 átomos en el anillo formado al hacer el enlace de hidrógeno. Lo más importante es que el grupo N-H de un aminoácido forma un enlace de hidrógeno con el grupo C = O del aminoácido tres residuos antes; este enlace de hidrógeno repetido i 3 ^ i define una hélice 310. Una hélice 310 es un concepto estándar en biología estructural con el que el experto en la técnica está familiarizado.
Esta hélice 310 corresponde a cuatro residuos que forman la hélice real y dos residuos de caperuza (o de transición), uno en cada extremo de estos cuatro residuos. El término "hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc ", tal y como se usa en la presente memoria, consiste en esos 6 residuos.
Mediante la realización de análisis estructurales y alineamientos de secuencia, el inventor identificó una hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc en las neurotoxinas tetánicas y botulínicas. Esta hélice 310 está rodeada por una hélice a en su extremo N-terminal (es decir, en la parte C-terminal del dominio LHn ) y por una cadena p en su extremo C-terminal (es decir, en la parte N-terminal del dominio Hc ). El primer residuo (N-terminal) (residuo de caperuza o transicional) de la hélice 310 también corresponde al residuo C-terminal de esta hélice a.
La hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc se puede determinar, por ejemplo, a partir de estructuras de cristales de neurotoxinas botulínicas disponibles públicamente, por ejemplo 3BTA (http://www.rcsb.org/pdb/explore/ explore.do?structureId=3BTA) y 1EPW (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW) para las neurotoxinas botulínicas A1 y B1, respectivamente.
Las herramientas de modelado y alineamiento in silico que están disponibles públicamente también se pueden usar para determinar la localización de la hélice 310 que separa los dominios LHn y Hc en otras neurotoxinas, por ejemplo,
los servidores de modelado de homología LOOPP (aprendizaje, observación y emisión de patrones de proteínas, http://loopp.org), PHYRE (Motor de reconocimiento de homología/analogía de proteínas, http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) y Rosetta (https://www.rosettacommons.org/), el servidor de superposición de proteínas SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/), el programa de alineamiento Clustal Omega (http://www.clustal.org/omega/), y una serie de otras herramientas/servicios enumerados en recursos de internet para biólogos moleculares y celulares (http://molbiol-tools.ca/). El inventor descubrió, en particular, que la región alrededor de la unión "HN/HCN" está muy conservada estructuralmente, lo que la convierte en una región ideal para superponer diferentes serotipos.
Por ejemplo, el inventor usó la siguiente metodología para determinar la secuencia de esta hélice 310 en otras neurotoxinas:
1. Se usó la herramienta de modelado de homología estructural LOOP (http://loopp.org) para obtener una estructura predicha de todos los serotipos de BoNT y TeNT sobre la base de la estructura de cristal de BoNT/A1 (3BTA.pdb); 2. Los archivos estructurales (pdb) así obtenidos se editaron para incluir solo el extremo N-terminal del dominio Hc n y aproximadamente de 80 residuos antes de él (que son parte del dominio Hn ), conservando así la región "Hn /Hc n " que está estructuralmente muy conservada;
3. Se usó el servidor de superposición de proteínas SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/) para superponer cada serotipo en la estructura 3BTA.pdb;
4. Se inspeccionaron los archivos pdb superpuestos para localizar la hélice 310 al comienzo del dominio He de BoNT/A1 y se identificaron entonces los residuos correspondientes en el otro serotipo.
5. Todas las secuencias de serotipos de BoNT se alinearon con Clustal Omega con el fin de comprobar que los residuos correspondientes eran correctos.
En la tabla 2, se presentan ejemplos de dominios LHn , He y de hélice 310 determinados por este método.
Tabla 2 - Dominios LHn , He y de hélice 310
Neurotoxina Número de acceso LH n H c Hélice 3 i o SEC ID NO (hélice 3 10 ) BoNT/A1 A5HZZ9 1-872 873-1296 872NIINTS877 14 BoNT/A2 X73423 1-872 873-1296 872NIVNTS877 15 BoNT/A3 DQ185900 1-872 873-1292 872NIVNTS877 16 BoNT/A4 EU341307 1-872 873-1296 872NITNAS877 17 BoNT/A5 EU679004 1-872 873-1296 872NIINTS877 18 BoNT/A6 FJ981696 1-872 873-1296 872NIINTS877 19 BoNT/A7 JQ954969 1-872 873-1296 872NIINTS877 20 BoNT/A8 KM233166 1-872 873-1297 872NITNTS877 21 BoNT/B1 B1INP5 1-859 860-1291 859EILNNI864 22 BoNT/B2 AB084152 1-859 860-1291 859EILNNI864 23 BoNT/B3 EF028400 1-859 860-1291 859EILNNI864 24 BoNT/B4 EF051570 1-859 860-1291 859EILNNI864 25 BoNT/B5 EF033130 1-859 860-1291 859DILNNI864 26 BoNT/B6 AB302852 1-859 860-1291 859EILNNI864 27 BoNT/B7 JQ354985 1-859 860-1291 859EILNNI864 28 BoNT/B8 JQ964806 1-859 860-1292 859EILNNI864 29 BoNT/C1 P18640 1-867 868-1291 867NINDSK872 30 BoNT/CD AB200360 1-867 868-1280 867SINDSK872 31 BoNT/DC AB745660 1-863 864-1276 863S INDSK868 32 BoNT/D P19321 1-863 864-1276 863S INDSK868 33 BoNT/E1 Q00496 1-846 847-1252 846RIKSSS851 34
Neurotoxina Número de acceso LH n H c Hélice 3 i o SEC ID NO (hélice 3 10 ) BoNT/E2 EF028404 1-846 847-1252 846RIKSSS851 35 BoNT/E3 EF028403 1-846 847-1252 846RIKSSS851 36 BoNT/E4 AB088207 1-846 847-1252 846RIKSSS851 37 BoNT/E5 AB037711 1-846 847-1251 846RIKSSS851 38 BoNT/E6 AM695759 1-846 847-1252 846RIKSSS851 39 BoNT/E7 JN695729 1-846 847-1252 846RIKSSS851 40 BoNT/E8 JN695730 1-846 847-1252 846RIKSSS851 41 BoNT/E9 JX424534 1-846 847-1251 846RIKSSS851 42 BoNT/ElO KF861917 1-846 847-1252 846RIKSSS851 43 BoNT/E11 KF861875 1-846 847-1252 846RIKSSS851 44 BoNT/Ei2 KM370319 1-846 847-1254 846RIKSSS851 45 BoNT/FI Q57236 1-865 866-1278 865KIKDNS870 46 BoNT/F2 GU213209 1-865 866-1280 865KIKDSS870 47 BoNT/F3 GU213227 1-865 866-1279 865KIKDSS870 48 BoNT/F4 GU213214 1-865 866-1277 865KIKDNC870 49 BoNT/F5 GU213211 1-862 863-1277 862KIKDSS867 50 BoNT/F6 M92906 1-864 865-1274 864KIKDSS869 51 BoNT/F7 GU213233 1-856 857-1268 856KIKDSS861 52 BoNT/G Q60393 1-864 865-1297 864NISSNA869 53 BoNT/H KG015617 1-860 861-1288 860ELKYNC865 54
TeNT P04958 1-880 881-1315 880ILKKST885 55
Usando análisis estructural y alineamientos de secuencia, el inventor descubrió que la cadena p que sigue a la hélice 3 i o que separa los dominios LHn y Hc es una estructura conservada en todas las neurotoxinas botulínicas y tetánicas y comienza en el 8° residuo al partir del primer residuo de la hélice 3 i o que separa los dominios LHn y Hc (p. ej., en el residuo 879 para BoNT/AI).
Según una definición alternativa, el primer aspecto de la invención proporciona una neurotoxina quimérica que comprende un dominio LHn de una primera neurotoxina unido covalentemente a un dominio Hc de una segunda neurotoxina, en donde la primera y segunda neurotoxinas son diferentes,
• en donde el residuo de aminoácido C-terminal del dominio LHn corresponde al octavo residuo de aminoácido N-terminal a la cadena p localizada al comienzo (extremo N) del dominio Hc en la primera neurotoxina, y
• en donde el residuo de aminoácido N-terminal del dominio Hc corresponde al séptimo residuo de aminoácido N-terminal a la cadena p localizada al comienzo (extremo N) del dominio Hc en la segunda neurotoxina.
Según otra definición más, el primer aspecto de la invención proporciona una neurotoxina quimérica que comprende un dominio LHN de una primera neurotoxina unido covalentemente a un dominio Hc de una segunda neurotoxina, en donde la primera y segunda neurotoxinas son diferentes,
• en donde el residuo de aminoácido C-terminal del dominio LHn corresponde al residuo de aminoácido C-terminal de la hélice a localizada al final (extremo C) del dominio LHn en la primera neurotoxina, y
• en donde el residuo de aminoácido N-terminal del dominio Hc corresponde al residuo de aminoácido inmediatamente C-terminal al residuo de aminoácido C-terminal de la hélice a localizada al final (extremo C) del dominio LHn en la segunda neurotoxina.
Según la invención, independientemente de la definición, la primera y segunda neurotoxinas se seleccionan independientemente de una BoNT de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una TeNT.
La base racional del proceso de diseño de las neurotoxinas quiméricas según la invención fue intentar asegurar que la estructura secundaria no se vea comprometida y así minimizar cualquier cambio en la estructura terciaria y en la función de cada dominio.
En algunas de las neurotoxinas quiméricas de la técnica anterior, se requiere un conector entre los dominios LHn y Hc (véase la tabla 1), presumiblemente para asegurar una expresión y purificación aceptables.
Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se plantea la hipótesis de que la estructuración de neurotoxinas quiméricas en la forma de proteínas que tienen una estructura terciaria que imita estrechamente la estructura terciaria de las neurotoxinas naturales facilitará su solubilidad.
Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se plantea además la hipótesis de que el hecho de no alterar los cuatro residuos de aminoácidos centrales de la hélice 310 en la neurotoxina quimérica asegura una conformación óptima para la neurotoxina quimérica, permitiendo así que la neurotoxina quimérica ejerza sus funciones a su máxima capacidad.
De hecho, el inventor ha descubierto sorprendentemente que retener únicamente el primer residuo de aminoácido de la hélice 310 de la primera neurotoxina y el segundo residuo de aminoácido de la hélice 310 en adelante de la segunda neurotoxina no solo permite la producción de neurotoxinas quiméricas solubles y funcionales, sino que además da lugar a propiedades mejoradas sobre otras neurotoxinas quiméricas, en particular una potencia aumentada, una relación de seguridad aumentada y/o una duración de acción más prolongada.
Los efectos no deseados de una neurotoxina (causados por la difusión de la neurotoxina fuera del sitio de la administración) se pueden evaluar experimentalmente midiendo el porcentaje de pérdida de peso corporal en un modelo animal relevante (p. ej., un ratón, donde se detecta una pérdida de peso corporal dentro de los siete días posteriores a la administración). Por el contrario, los efectos deseados sobre la diana de una neurotoxina se pueden evaluar experimentalmente mediante el ensayo de puntuación de abducción digital (DAS), una medición de la parálisis muscular. El ensayo DAS se puede realizar mediante la inyección de 20 pL de neurotoxina, formulada en tampón de fosfato de gelatina, en el complejo gastrocnemio/sóleo del ratón, seguido de la evaluación de la puntuación de abducción digital usando el método de Aoki (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001). En el ensayo DAS, los ratones se suspenden brevemente por la cola con el fin de provocar una respuesta de sobresalto característica en la que el ratón extiende sus extremidades traseras y abduce sus dedos traseros. Después de la inyección de la neurotoxina, los diversos grados de abducción de los dedos se puntúan en una escala de cinco puntos (0 = normal a 4 = reducción máxima en la abducción de los dedos y la extensión de la pierna).
La relación de seguridad de una neurotoxina puede entonces expresarse como la relación entre la cantidad de neurotoxina requerida para una caída del 10 % en el peso corporal de un ratón (medida en el efecto máximo dentro de los primeros siete días después de la dosificación en un ratón) y la cantidad de neurotoxina requerida para una puntuación DAS de 2. Por lo tanto, se desean puntuaciones de relación de seguridad altas, e indican una neurotoxina que es capaz de paralizar eficazmente un músculo diana con pocos efectos indeseados fuera de la diana.
Una relación de seguridad alta es particularmente ventajosa en terapia porque representa un aumento del índice terapéutico. En otras palabras, esto significa que pueden usarse dosificaciones reducidas en comparación con agentes terapéuticos conocidos de toxina clostridial y/o que pueden usarse dosificaciones aumentadas sin ningún efecto adicional. La posibilidad de usar dosis más altas de neurotoxina sin efectos adicionales es particularmente ventajosa, ya que dosis más altas generalmente conducen a una duración más prolongada de la acción de la neurotoxina.
La potencia de una neurotoxina puede expresarse como la dosis mínima de neurotoxina que conduce a una puntuación DAS dada cuando se administra a un complejo gastrocnemio/sóleo de ratón, por ejemplo, una puntuación DAS de 2 (dosis DE50 ) o una puntuación DAS de 4. La potencia de una neurotoxina también puede expresarse como la dosis CE50 en un ensayo celular que mide la escisión de SNARE por la neurotoxina, por ejemplo, la dosis CE50 en un ensayo celular que mide la escisión de SNAP-25 por una neurotoxina BoNT/AB quimérica.
La duración de la acción de una neurotoxina puede expresarse como el tiempo necesario para recuperar una puntuación DAS de 0 después de la administración de una dosis dada de neurotoxina, por ejemplo, la dosis mínima de neurotoxina que conduce a una puntuación DAS de 4, a un complejo gastrocnemio/sóleo de ratón.
La primera neurotoxina es una neurotoxina botulínica (BoNT) de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una neurotoxina tetánica (TeNT), y la segunda neurotoxina es una neurotoxina botulínica (BoNT) de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F o serotipo G o una neurotoxina tetánica (TeNT). En una realización preferida, la primera neurotoxina es una neurotoxina botulínica (BoNT) de serotipo A, serotipo B o serotipo C, y la segunda neurotoxina es una neurotoxina botulínica (BoNT) de serotipo A, serotipo B o serotipo C.
Se pueden distinguir los diferentes serotipos de BoNT sobre la base de la inactivación por antisueros neutralizantes específicos, correlacionándose dicha clasificación por serotipo con el porcentaje de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos. Las proteínas BoNT de un serotipo dado se dividen además en diferentes subtipos sobre la base del porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos.
Preferiblemente, la primera y segunda neurotoxinas son neurotoxinas botulínicas de diferentes serotipos. En otra realización, bien la primera o la segunda neurotoxina es una neurotoxina botulínica y la otra neurotoxina es una neurotoxina tetánica.
Usando una representación "XY" según la cual X es el dominio LHn e Y es el dominio Hc , las siguientes neurotoxinas quiméricas son realizaciones de la presente invención:
a b , a c , a d , a e , a f , AG, ATx,
b a , b c , b d , b e , b f , BG, BTx,
c a , c b , c d , c e , c f , c g , CTx,
d a , d b , d c , d e , d f , d g , DTx,
e a , e b , e c , e d , e f , e g , ETx,
f a , f b , f c , f d , f e , f g , FTx,
GA, GB, GC, GD, g e , GF, FTx,
TxA, TxB, TxC, TxD, TxE, TxF, TxG,
en donde A, B, C, D, E, F, G y Tx son respectivamente neurotoxina botulínica (BoNT) de serotipo A, serotipo B, serotipo C, serotipo D, serotipo E, serotipo F, serotipo G y neurotoxina tetánica (TeNT).
Sin embargo, usando la misma representación "XY" descrita anteriormente, las siguientes neurotoxinas quiméricas son realizaciones preferidas de la presente invención:
a b , a c ,
b a , b c ,
c a , c b ,
en donde A, B, C, son respectivamente neurotoxina botulínica (BoNT) de serotipo A, serotipo B y serotipo C.
En un aspecto de la descripción, el dominio LHn de la primera neurotoxina corresponde a:
- los residuos de aminoácidos 1 a 872 de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 1 a 859 de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 1 a 867 de la SEQ ID NO: 3, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 1 a 863 de la SEQ ID NO: 4, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 1 a 846 de la SEQ ID NO: 5, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 1 a 865 de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 1 a 864 de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma G, o
- los residuos de aminoácidos 1 a 880 de la SEQ ID NO: 8, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma.
y el dominio Hc de la segunda neurotoxina corresponde a:
- los residuos de aminoácidos 873 a 1296 de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 860 a 1291 de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 868 a 1291 de la SEQ ID NO: 3, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 864 a 1276 de la SEQ ID NO: 4, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 847 a 1251 de la SEQ ID NO: 5, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 866 a 1275 de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma,
- los residuos de aminoácidos 865 a 1297 de la SEQ ID NO: 7, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma, o
- los residuos de aminoácidos 881 a 1315 de la SEQ ID NO: 8, o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la misma.
El "porcentaje de identidad de secuencia" entre dos o más secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos es una función del número de nucleótidos/aminoácidos idénticos en posiciones idénticas compartidos por las secuencias alineadas. Por lo tanto, el % de identidad se puede calcular como el número de nucleótidos/aminoácidos idénticos en cada posición en un alineamiento dividido por el número total de nucleótidos/aminoácidos en la secuencia alineada, multiplicado por 100. Los cálculos del % de identidad de secuencia también pueden tener en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que debe introducirse para optimizar el alineamiento de dos o más secuencias. Las comparaciones de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos o más secuencias se pueden llevar a cabo usando algoritmos matemáticos específicos, en particular un algoritmo matemático de alineamiento global (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.48 (3), 443-453, 1972) tal como BLAST, que será familiar para un experto en la técnica.
La primera o la segunda neurotoxina puede ser una neurotoxina en mosaico. El término "neurotoxina en mosaico", tal y como se usa en este contexto, se refiere a una neurotoxina clostridial de origen natural que comprende al menos un dominio funcional de otro tipo de neurotoxinas clostridiales (p. ej., una neurotoxina clostridial de un serotipo diferente), dicha neurotoxina clostridial normalmente no comprende dicho al menos un dominio funcional. Los ejemplos de neurotoxinas en mosaico son BoNT/DC y BoNT/CD de origen natural. BoNT/DC comprende la cadena L y el dominio Hn del serotipo D y el dominio Hc del serotipo C, mientras que BoNT/CD consiste en la cadena L y el dominio Hn del serotipo C y el dominio Hc del serotipo D.
La primera y segunda neurotoxinas pueden ser neurotoxinas modificadas y derivados de las mismas, que incluyen, pero no se limitan a, las que se describen a continuación. Una neurotoxina modificada o derivado puede contener uno o más aminoácidos que se han modificado en comparación con la forma nativa (no modificada) de la neurotoxina, o puede contener uno o más aminoácidos insertados que no están presentes en la forma nativa (no modificada) de la toxina. A modo de ejemplo, una neurotoxina clostridial modificada puede tener secuencias de aminoácidos modificadas en uno o más dominios con respecto a la secuencia de la neurotoxina clostridial nativa (no modificada ). Dichas modificaciones pueden modificar aspectos funcionales de la neurotoxina, por ejemplo, la actividad biológica o la persistencia. Por tanto, en una realización, la primera neurotoxina y/o la segunda neurotoxina es una neurotoxina modificada o un derivado de neurotoxina modificada.
Una neurotoxina modificada retiene al menos una de las funciones de una neurotoxina, seleccionadas de la capacidad de unirse a un receptor de neurotoxina de baja o alta afinidad en una célula diana, translocar la porción endopeptidasa de la neurotoxina (cadena ligera) en el citoplasma celular y escindir una proteína SNARE. Preferiblemente, una neurotoxina modificada retiene al menos dos de estas funciones. Más preferiblemente, una neurotoxina modificada retiene estas tres funciones.
Una neurotoxina modificada puede tener una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (tal como un dominio Hc modificado), en donde dicha cadena pesada modificada se une a las células nerviosas diana con una afinidad mayor o menor que la neurotoxina nativa (no modificada). Dichas modificaciones en el dominio Hc pueden incluir la modificación de residuos en el sitio de unión del gangliósido del dominio Hc o en el sitio de unión de la proteína (SV2 o sinaptotagmina) que alteran la unión al receptor de gangliósido y/o al receptor de proteína de la célula nerviosa diana. Los ejemplos de dichas neurotoxinas modificadas se describen en WO 2006/027207 y WO 2006/114308.
Una neurotoxina modificada puede tener una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera, por ejemplo, modificaciones en la unión del sustrato o dominio catalítico que pueden alterar o modificar la especificidad de la proteína SNARE de la LC modificada. Los ejemplos de dichas neurotoxinas modificadas se describen en WO 2010/120766 y US 2011/0318385.
Una neurotoxina modificada puede comprender una o más modificaciones que aumenten o disminuyan la actividad biológica y/o la persistencia biológica de la neurotoxina modificada. Por ejemplo, una neurotoxina modificada puede
comprender un resto basado en leucina o tirosina, en donde dicho resto aumenta o disminuye la actividad biológica y/o la persistencia biológica de la neurotoxina modificada. Los restos basados en leucina adecuados incluyen xDxxxLL, xExxxLL, xExxxIL y xExxxLM (en donde x es cualquier aminoácido). Los restos basados en tirosina adecuados incluyen Y-x-x-Hy (en donde Hy es un aminoácido hidrófobo). Los ejemplos de neurotoxinas modificadas que comprenden restos basados en leucina y tirosina se describen en WO 2002/08268.
En un aspecto de la descripción, la primera o segunda neurotoxina es una BoNT/A modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
En un aspecto de la descripción, la primera o segunda neurotoxina es una BoNT/B modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2.
En un aspecto de la descripción, la primera o segunda neurotoxina es una BoNT/C modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3.
En un aspecto de la descripción, la primera o segunda neurotoxina es una BoNT/D modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4.
En un aspecto de la descripción, la primera o segunda neurotoxina es una BoNT/E modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5.
En un aspecto de la descripción, la primera o segunda neurotoxina es una BoNT/F modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6.
En un aspecto de la descripción, la primera o segunda neurotoxina es una BoNT/G modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7.
En un aspecto de la descripción, la primera o segunda neurotoxina es una TeNT modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8.
En una realización, la segunda neurotoxina es una BoNT/B. Dicha neurotoxina quimérica se denomina en la presente memoria "neurotoxina BoNT/XB".
En una realización preferida, la primera neurotoxina es una BoNT/A y la segunda neurotoxina es una BoNT/B. Dicha neurotoxina quimérica se denomina en la presente memoria "neurotoxina BoNT/AB". Más preferiblemente, la primera neurotoxina es una BoNT/A1 y la segunda neurotoxina es una BoNT/B 1. Aún más preferiblemente, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 872 de BoNT/A1 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 860 a 1291 de BoNT/B1. En una realización preferida, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 872 de la SEQ ID NO: 1 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 860 a 1291 de la SEQ ID NO: 2. En otras palabras, una neurotoxina quimérica preferida según la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.
En comparación con el serotipo de BoNT/A, la BoNT/B natural es mucho menos potente a pesar de una abundancia comparativamente mayor de su receptor en las vesículas sinápticas. Esto se debe a un cambio de aminoácido único dentro del sitio de unión de la toxina en la sinaptotagmina II humana (Syt II) en comparación con Syt II de roedor (rata/ratón) (Peng, L. et al., J Cell Sci, 125 (Pt 13): 3233-42 (2012); Rummel, A. et al, FEBS J 278: 4506-4515 (2011) .13,22. Como resultado de este cambio de residuo, Syt II humana tiene una gran disminución de la unión a la BoNT/B natural, así como a la BoNT/D-C natural y/G. Estos descubrimientos proporcionan una explicación para las observaciones clínicas de que se necesita una dosis mucho más alta de BoNT/B que de BoNT/A (que se une a un receptor diferente) para lograr los mismos niveles de efectos terapéuticos en los pacientes. En una realización preferida de una neurotoxina BoNT/XB o BoNT/AB según la invención, el dominio Hc de una neurotoxina BoNT/B comprende al menos una sustitución, adición o deleción de un residuo de aminoácido en el subdominio Hc c que tiene el efecto de aumentar la afinidad de unión de la neurotoxina BoNT/B para Syt II humana en comparación con la secuencia de BoNT/B natural.
La sustitución, adición o deleción de residuos de aminoácidos adecuada en el subdominio Hcc de BoNT/B se ha descrito en WO2013/180799 y en PCT/US2016/024211 (que se publicó como WO2016/154534).
La sustitución, adición o deleción de residuos de aminoácidos adecuada en el subdominio Hcc de BoNT/B incluye
mutaciones de sustitución seleccionadas del grupo que consiste en: V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P y combinaciones de las mismas.
La sustitución, adición o deleción de residuos de aminoácidos adecuada en el subdominio Hcc de BoNT/B incluye además combinaciones de dos mutaciones de sustitución seleccionadas del grupo que consiste en: E1191M y S1199L, E1191M y S1199Y, E1191M y S1199F, E1191Q y S1199L, E1191Q y S1199Y, E1191Q y S1199F, E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W, E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q.
La sustitución, adición o deleción de residuos de aminoácidos adecuada en el subdominio Hcc de BoNT/B también incluye una combinación de tres mutaciones de sustitución que son E1191M, S1199W y W1178Q.
En una realización preferida, la sustitución, adición o deleción de residuos de aminoácidos adecuada en el subdominio Hcc de BoNT/B incluye una combinación de dos mutaciones de sustitución que son E1191M y S1199Y. En otras palabras, una neurotoxina quimérica preferida según la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12.
En otra realización preferida, la primera neurotoxina es una BoNT/C y la segunda neurotoxina es una BoNT/B. Dicha neurotoxina quimérica se denomina en la presente memoria "neurotoxina BoNT/CB". Más preferiblemente, la primera neurotoxina es una BoNT/C1 y la segunda neurotoxina es una BoNT/B1. Más preferiblemente aún, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 867 de BoNT/C1 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 860 a 1291 de BoNT/B1. En una realización preferida, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 867 de la SEQ ID NO: 3 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 860 a 1291 de la SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, el dominio Hc de la neurotoxina BoNT/B comprende al menos una sustitución, adición o deleción de un residuo de aminoácido en el subdominio Hc c que tiene el efecto de aumentar la afinidad de unión de la neurotoxina BoNT/B para Syt II humana en comparación con la secuencia de BoNT/B natural. La sustitución, adición o deleción de residuos de aminoácidos adecuada en el subdominio Hcc de BoNT/B es como se ha descrito anteriormente.
En una realización preferida de una neurotoxina BoNT/XDC (neurotoxina quimérica en la que la segunda neurotoxina es una BoNT/DC en mosaico) según la invención, el dominio Hc de una neurotoxina BoNT/DC en mosaico comprende al menos una sustitución, adición o deleción de un residuo de aminoácido en el subdominio Hc c que tiene el efecto de aumentar la afinidad de unión de la neurotoxina BoNT/DC en mosaico para Syt II humana en comparación con la secuencia de BoNT/DC en mosaico natural.
En una realización preferida de una neurotoxina BoNT/XG según la invención, el dominio Hc de una neurotoxina BoNT/G comprende al menos una sustitución, adición o deleción de residuos de aminoácidos en el subdominio Hcc que tiene el efecto de aumentar la afinidad de unión de la neurotoxina BoNT/G para Syt II humana en comparación con la secuencia de BoNT/G natural.
Otras neurotoxinas preferidas según la invención son las siguientes.
En una realización preferida, la primera neurotoxina es una BoNT/A y la segunda neurotoxina es una BoNT/C. Dicha neurotoxina quimérica se denomina en la presente memoria "neurotoxina BoNT/AC". Más preferiblemente, la primera neurotoxina es una BoNT/A1 y la segunda neurotoxina es una BoNT/C1. Más preferiblemente aún, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 872 de BoNT/A1 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 868 a 1291 de BoNT/C1. En una realización preferida, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 872 de la SEQ ID NO: 1 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 868 a 1291 de la SEQ ID NO: 3.
En otra realización preferida, la primera neurotoxina es una BoNT/B y la segunda neurotoxina es una BoNT/A. Dicha neurotoxina quimérica se denomina en la presente memoria "neurotoxina BoNT/BA". Más preferiblemente, la primera neurotoxina es una BoNT/B1 y la segunda neurotoxina es una BoNT/A1. Más preferiblemente aún, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 859 de BoNT/B1 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 873 a 1296 de BoNT/A1. En una realización preferida, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 859 de la SEQ ID NO: 2 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 873 a 1293 de la SEQ ID NO: 1.
En otra realización preferida, la primera neurotoxina es una BoNT/B y la segunda neurotoxina es una BoNT/c. Dicha neurotoxina quimérica se denomina en la presente memoria "neurotoxina BoNT/Bc". Más preferiblemente, la primera neurotoxina es una BoNT/B1 y la segunda neurotoxina es una BoNT/C1. Más preferiblemente aún, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 859 de BoNT/B1 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 868 a 1291 de BoNT/C1. En una realización preferida, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 859 de la SEQ
ID NO: 2 y el dominio He de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 868 a 1291 de la SEQ ID NO: 3. En otras palabras, una neurotoxina quimérica preferida según la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 56.
En otra realización preferida, la primera neurotoxina es una BoNT/C y la segunda neurotoxina es una BoNT/A. Dicha neurotoxina quimérica se denomina en la presente memoria "neurotoxina BoNT/CA". Más preferiblemente, la primera neurotoxina es una BoNT/C1 y la segunda neurotoxina es una BoNT/A1. Más preferiblemente aún, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 867 de BoNT/C1 y el dominio Hc de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 873 a 1296 de BoNT/A1. En una realización preferida, el dominio LHn de una primera neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 1 a 867 de la SEQ ID NO: 3 y el dominio He de una segunda neurotoxina corresponde a los residuos de aminoácidos 873 a 1296 de la SEQ ID NO: 1.
Las neurotoxinas quiméricas de la presente invención se pueden producir usando tecnologías recombinantes. Por tanto, en una realización, una neurotoxina quimérica según la invención es una neurotoxina quimérica recombinante. Se entenderá fácilmente que, según esta realización preferida, una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina quimérica recombinante de la invención, un vector que comprende dicha secuencia de nucleótidos y una célula que comprende dicho vector, como se describe adicionalmente a continuación, pueden referirse mutatis mutandis como recombinante.
En otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una neurotoxina quimérica según la invención, por ejemplo, una secuencia de ADN o ARN. En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden preparar usando cualquier proceso adecuado conocido en la técnica. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico se pueden preparar usando técnicas de síntesis química. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden preparar usando técnicas de biología molecular.
La secuencia de ADN de la presente invención se diseña preferiblemente in silico, y después se sintetiza mediante técnicas convencionales de síntesis de ADN.
La información de la secuencia de ácido nucleico mencionada anteriormente se modifica opcionalmente para el sesgo de codones según el sistema de expresión de la célula huésped final (p. ej., E. coli) que se va a emplear.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleótidos según la invención. En una realización, la secuencia de ácido nucleico se prepara como parte de un vector de ADN que comprende un promotor y un terminador. En una realización preferida, el vector tiene un promotor seleccionado de Tac, AraBAD, T7-Lac o T5-Lac.
Un vector puede ser adecuado para la expresión in vitro y/o in vivo de la secuencia de ácido nucleico mencionada anteriormente. El vector puede ser un vector para la expresión génica transitoria y/o estable. El vector puede comprender adicionalmente elementos reguladores y/o marcadores de selección. Dicho vector puede ser de origen viral, de origen fago o de origen bacteriano. Por ejemplo, dicho vector de expresión puede ser un vector pET, pJ401, pGEX o un derivado de los mismos.
En otro aspecto, la invención proporciona una célula que comprende una secuencia de nucleótidos o un vector según la invención. El término "célula" en la presente memoria se puede usar de manera intercambiable con el término "célula huésped" o "línea celular". El tipo de célula adecuado incluye células procariotas, por ejemplo, E. coli, y células eucariotas, tales como células de levadura, células de mamífero, células de insecto, etc. Preferiblemente, la célula es E. coli.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una neurotoxina quimérica según la invención, comprendiendo dicho método la etapa de cultivar una célula como se ha descrito anteriormente, en condiciones en donde se produce dicha neurotoxina quimérica. Dichas condiciones son bien conocidas por el experto en la técnica y, por lo tanto, no es necesario que se detallen más en la presente memoria. Preferiblemente, dicho método comprende además la etapa de recuperar la neurotoxina quimérica del cultivo.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una neurotoxina quimérica según la invención. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende una neurotoxina quimérica junto con al menos un componente seleccionado de un vehículo, excipiente, adyuvante, propulsor y/o sal farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención proporciona una neurotoxina quimérica o una composición farmacéutica según la invención para su uso en terapia. Más precisamente, la invención se refiere al uso de una neurotoxina quimérica o composición farmacéutica como se describe en la presente memoria, para fabricar un medicamento. En otras palabras, la invención se refiere a un método para tratar a un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una neurotoxina quimérica o composición farmacéutica como se describe en la presente memoria, a dicho sujeto. Por "cantidad eficaz" se entiende que la neurotoxina quimérica o la composición farmacéutica se
administra en una cantidad suficiente para proporcionar el efecto para el que está indicada. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere preferiblemente a un ser humano o un animal, más preferiblemente a un ser humano.
Una neurotoxina quimérica según la invención es preferiblemente adecuada para su uso en el tratamiento de una afección asociada con una actividad neuronal no deseada en un sujeto que la necesita, por ejemplo, una afección seleccionada del grupo que consiste en disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno de los párpados, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismo, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor de cabeza, migraña y afecciones dermatológicas. Más precisamente, la invención se refiere al uso de una neurotoxina quimérica o composición farmacéutica como se describe en la presente memoria, para la fabricación de un medicamento destinado a tratar una afección asociada con una actividad neuronal no deseada, como se ha descrito anteriormente. En otras palabras, la invención se refiere a un método para tratar una afección asociada con una actividad neuronal no deseada, como se ha descrito anteriormente, en un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho método la etapa de administrar una cantidad eficaz de una neurotoxina quimérica o composición farmacéutica como se describe en la presente memoria, a dicho sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona un uso no terapéutico de una neurotoxina quimérica según la invención para tratar una afección estética o cosmética, en un sujeto que lo necesita. En otras palabras, la invención se refiere a un método para tratar una afección estética o cosmética en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una neurotoxina quimérica o composición farmacéutica como se describe en la presente memoria, a dicho sujeto. Según este aspecto de la invención, el sujeto a tratar preferiblemente no padece de una afección asociada con una actividad neuronal no deseada como se ha descrito anteriormente. Más preferiblemente, dicho sujeto es un sujeto sano, es decir, un sujeto que no padece de ninguna enfermedad.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit para su uso en un método terapéutico o no terapéutico (cosmético o estético), o para un uso terapéutico o no terapéutico (cosmético o estético), como se ha descrito anteriormente, comprendiendo dicho kit una composición farmacéutica de la invención e instrucciones para realizar dicho método o uso. Más precisamente, la invención se refiere a un kit que comprende una composición farmacéutica de la invención e instrucciones para la administración terapéutica o cosmética de dicha composición a un sujeto que lo necesita. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "instrucciones" se refiere a una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar cómo realizar un método o uso de la invención, tal como la administración terapéutica o cosmética de dicha composición a un sujeto que lo necesita. Dichas instrucciones pueden, por ejemplo, estar adheridas a un contenedor que comprende dicha composición o dicho kit.
Las neurotoxinas quiméricas preparadas por ingeniería de la presente invención pueden formularse para aplicación oral, parenteral, infusión continua, inhalación o tópica. Las composiciones adecuadas para inyección pueden estar en la forma de disoluciones, suspensiones o emulsiones, o polvos secos que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de su uso.
En el caso de una neurotoxina quimérica que se va a administrar localmente, la neurotoxina quimérica puede formularse como una crema (p. ej., para aplicación tópica) o para inyección subdérmica.
Los medios de administración local pueden incluir un aerosol u otro pulverizador (p. ej., un nebulizador). A este respecto, una formulación en aerosol de una neurotoxina quimérica permite la administración a los pulmones y/u otros conductos nasales y/o bronquiales o de las vías respiratorias.
Las neurotoxinas quiméricas de la invención pueden administrarse a un paciente mediante inyección intratecal o epidural en la columna vertebral al nivel del segmento espinal implicado en la inervación de un órgano afectado.
Una vía de administración preferida es mediante inyección laparoscópica y/o localizada, particularmente intramuscular.
Los rangos de dosificación para la administración de las neurotoxinas quiméricas de la presente invención son los que producen el efecto terapéutico deseado. Se apreciará que el rango de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa de la neurotoxina quimérica o la composición, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, extensión o severidad de la afección del paciente, contraindicaciones, en su caso, y el criterio del médico tratante. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar mediante rutinas empíricas estándar para su optimización.
Las formas de dosificación fluidas se preparan típicamente utilizando la neurotoxina quimérica y un vehículo estéril libre de pirógenos. La toxina clostridial preparada por ingeniería, dependiendo del vehículo y la concentración usada, puede disolverse o suspenderse en el vehículo. Al preparar disoluciones, la neurotoxina quimérica puede disolverse en el vehículo, haciéndose isotónica la disolución si es necesario mediante la adición de cloruro de sodio y esterilizándola por filtración a través de un filtro estéril usando técnicas asépticas antes de usarla para llenar viales o ampollas estériles adecuadas y sellarla. Alternativamente, si la estabilidad de la disolución es adecuada, la disolución
e n s u s c o n t e n e d o r e s s e l l a d o s p u e d e e s t e r i l i z a r s e e n a u t o c l a v e . V e n t a j o s a m e n t e , s e p u e d e n d i s o l v e r e n e l v e h í c u l o a d i t i v o s t a l e s c o m o a g e n t e s t a m p o n a d o r e s , s o l u b i l i z a n t e s , e s t a b i l i z a n t e s , c o n s e r v a n t e s o b a c t e r i c i d a s , d e s u s p e n s i ó n o e m u l s i o n a n t e s y / o a g e n t e s a n e s t é s i c o s l o c a l e s .
L o s p o l v o s s e c o s , q u e s e d i s u e l v e n o s u s p e n d e n e n u n v e h í c u l o a d e c u a d o a n t e s d e s u u s o , p u e d e n p r e p a r a r s e u s a n d o i n g r e d i e n t e s p r e e s t e r i l i z a d o s p a r a l l e n a r u n c o n t e n e d o r e s t é r i l u s a n d o u n a t é c n i c a a s é p t i c a e n u n á r e a e s t é r i l . A l t e r n a t i v a m e n t e , l o s i n g r e d i e n t e s s e p u e d e n d i s o l v e r e n c o n t e n e d o r e s a d e c u a d o s u s a n d o u n a t é c n i c a a s é p t i c a e n u n á r e a e s t é r i l . A c o n t i n u a c i ó n , e l p r o d u c t o s e l i o f i l i z a y l o s c o n t e n e d o r e s s e s e l l a n a s é p t i c a m e n t e .
L a s s u s p e n s i o n e s p a r e n t e r a l e s , a d e c u a d a s p a r a i n y e c c i ó n i n t r a m u s c u l a r , s u b c u t á n e a o i n t r a d é r m i c a , s e p r e p a r a n s u s t a n c i a l m e n t e d e l a m i s m a m a n e r a , e x c e p t o q u e l o s c o m p o n e n t e s e s t é r i l e s s e s u s p e n d e n e n e l v e h í c u l o e s t é r i l , e n l u g a r d e d i s o l v e r s e y l a e s t e r i l i z a c i ó n n o s e p u e d e l o g r a r p o r f i l t r a c i ó n . L o s c o m p o n e n t e s s e p u e d e n a i s l a r e n u n e s t a d o e s t é r i l o a l t e r n a t i v a m e n t e s e p u e d e n e s t e r i l i z a r d e s p u é s d e l a i s l a m i e n t o , p . e j . , p o r i r r a d i a c i ó n g a m m a .
L a a d m i n i s t r a c i ó n s e g ú n l a p r e s e n t e i n v e n c i ó n p u e d e a p r o v e c h a r u n a v a r i e d a d d e t e c n o l o g í a s d e a d m i n i s t r a c i ó n q u e i n c l u y e n e n c a p s u l a c i ó n e n m i c r o p a r t í c u l a s , s i s t e m a s d e a d m i n i s t r a c i ó n v i r a l o i m p a c t o d e a e r o s o l a a l t a p r e s i ó n .
E s t a d e s c r i p c i ó n n o e s t á l i m i t a d a p o r l o s m é t o d o s y m a t e r i a l e s e j e m p l a r e s d e s c r i t o s e n l a p r e s e n t e m e m o r i a , y c u a l q u i e r m é t o d o y m a t e r i a l s i m i l a r o e q u i v a l e n t e a l o s d e s c r i t o s e n l a p r e s e n t e m e m o r i a s e p u e d e u s a r e n l a p r á c t i c a o e n s a y o d e l a s r e a l i z a c i o n e s d e e s t a d e s c r i p c i ó n . L o s r a n g o s n u m é r i c o s i n c l u y e n l o s n ú m e r o s q u e d e f i n e n e l r a n g o . A m e n o s q u e s e i n d i q u e l o c o n t r a r i o , c u a l q u i e r s e c u e n c i a d e á c i d o n u c l e i c o s e e s c r i b e d e i z q u i e r d a a d e r e c h a e n l a o r i e n t a c i ó n 5 ' a 3 ' ; l a s s e c u e n c i a s d e a m i n o á c i d o s s e e s c r i b e n d e i z q u i e r d a a d e r e c h a e n o r i e n t a c i ó n a m i n o a c a r b o x i , r e s p e c t i v a m e n t e .
C u a n d o s e p r o p o r c i o n a u n r a n g o d e v a l o r e s , s e e n t i e n d e q u e t a m b i é n s e d e s c r i b e e s p e c í f i c a m e n t e c a d a v a l o r i n t e r m e d i o , h a s t a l a d é c i m a p a r t e d e l a u n i d a d d e l l í m i t e i n f e r i o r , a m e n o s q u e e l c o n t e x t o i n d i q u e c l a r a m e n t e l o c o n t r a r i o , e n t r e l o s l í m i t e s s u p e r i o r e i n f e r i o r d e e s e r a n g o . C a d a r a n g o m á s p e q u e ñ o e n t r e c u a l q u i e r v a l o r e s t a b l e c i d o o v a l o r i n t e r m e d i o e n u n r a n g o e s t a b l e c i d o y c u a l q u i e r o t r o v a l o r e s t a b l e c i d o o i n t e r m e d i o e n e s e r a n g o e s t a b l e c i d o e s t á i n c l u i d o e n e s t a d e s c r i p c i ó n . L o s l í m i t e s s u p e r i o r e i n f e r i o r d e e s t o s r a n g o s m á s p e q u e ñ o s p u e d e n i n c l u i r s e o e x c l u i r s e i n d e p e n d i e n t e m e n t e e n e l r a n g o , y c a d a r a n g o e n e l q u e u n o , n i n g u n o o a m b o s l í m i t e s e s t á n i n c l u i d o s e n l o s r a n g o s m á s p e q u e ñ o s t a m b i é n s e i n c l u y e d e n t r o d e e s t a d e s c r i p c i ó n , s u j e t o a c u a l q u i e r l í m i t e e s p e c í f i c a m e n t e e x c l u i d o e n e l r a n g o e s t a b l e c i d o . C u a n d o e l r a n g o e s t a b l e c i d o i n c l u y e u n o o a m b o s d e l o s l í m i t e s , l o s r a n g o s q u e e x c l u y e n u n o o a m b o s d e e s o s l í m i t e s i n c l u i d o s t a m b i é n s e i n c l u y e n e n e s t a d e s c r i p c i ó n .
D e b e i n d i c a r s e q u e , t a l y c o m o s e u s a e n l a p r e s e n t e m e m o r i a y e n l a s r e i v i n d i c a c i o n e s a d j u n t a s , l a s f o r m a s s i n g u l a r e s " u n " , " u n a " y " e l " i n c l u y e n l o s r e f e r e n t e s p l u r a l e s a m e n o s q u e e l c o n t e x t o i n d i q u e c l a r a m e n t e l o c o n t r a r i o . A s í , p o r e j e m p l o , l a r e f e r e n c i a a " u n a n e u r o t o x i n a c l o s t r i d i a l " i n c l u y e u n a p l u r a l i d a d d e d i c h o s a g e n t e s c a n d i d a t o s y l a r e f e r e n c i a a " l a n e u r o t o x i n a c l o s t r i d i a l " i n c l u y e u n a r e f e r e n c i a a u n a o m á s n e u r o t o x i n a s c l o s t r i d i a l e s y e q u i v a l e n t e s d e l a s m i s m a s c o n o c i d a s p o r l o s e x p e r t o s e n l a t é c n i c a , y a s í s u c e s i v a m e n t e .
L a i n v e n c i ó n s e d e s c r i b i r á a h o r a , s ó l o a m o d o d e e j e m p l o , c o n r e f e r e n c i a a l a s s i g u i e n t e s F i g u r a s y E j e m p l o s .
Descripción de los dibujos
Figura 1 - A l i n e a m i e n t o d e s e c u e n c i a s d e B o N T / A 1 - 8 , / B 1 - 8 , / C , / D , / E 1 - 1 2 , / F 1 - 7 , / G , / " H " y T e N T u s a n d o l a h e r r a m i e n t a d e a l i n e a m i e n t o d e s e c u e n c i a s m ú l t i p l e s C L U S T A L O m e g a ( 1 . 2 . 1 ) . L a l o c a l i z a c i ó n d e l a h é l i c e 310 p u t a t i v a q u e s e p a r a l o s d o m i n i o s L H n y H c e s t á e n c a r a c t e r e s e n n e g r i t a y s u b r a y a d o s .
Figura 2 - S D S P A G E d e l a s q u i m e r a s 1 , 2 y 3 A d e B o N T / A B r e c o m b i n a n t e s p u r i f i c a d a s ( S E Q I D N O : 9 , 1 0 y 1 1 , r e s p e c t i v a m e n t e ) . L o s c a r r i l e s e s t á n m a r c a d o s c o m o " M a r c a d o r " ( m a r c a d o r d e p e s o m o l e c u l a r ) , " - D T T " ( m u e s t r a d e q u i m e r a B o N T / A B o x i d a d a ) y " D T T " ( m u e s t r a d e q u i m e r a B o N T / A B r e d u c i d a ) .
Figura 4 - E n s a y o d e p u n t u a c i ó n d e a b d u c c i ó n d e l o s d e d o s e n r a t ó n . S e i n y e c t ó a l o s r a t o n e s e n l o s m ú s c u l o s d e l c o m p l e j o g a s t r o c n e m i o - s ó l e o d e u n a e x t r e m i d a d t r a s e r a , b a j o a n e s t e s i a g e n e r a l c o r t a ; e l d e b i l i t a m i e n t o m u s c u l a r s e m i d i ó e n u n a e s c a l a d e 0 - 4 u s a n d o l a p u n t u a c i ó n d e a b d u c c i ó n d e l o s d e d o s ( D A S ) . S e d e t e r m i n a r o n l o s v a l o r e s d e D A S m á x p a r a c a d a d o s i s y s e r e p r e s e n t a r o n f r e n t e a l a d o s i s y l o s d a t o s s e a j u s t a r o n a u n a e c u a c i ó n l o g í s t i c a d e 4 p a r á m e t r o s , s e d e t e r m i n a r o n l o s v a l o r e s d e D E 5 0 y l a d o s i s q u e d a l u g a r a D A S 4 ( d o s i s d e D A S 4 ) .
Figura 5 - S D S P A G E d e l a s q u i m e r a s 3 B y 3 C d e B o N T / A B r e c o m b i n a n t e s p u r i f i c a d a s ( S E Q I D N O : 1 2 y 1 3 , r e s p e c t i v a m e n t e ) . L o s c a r r i l e s e s t á n m a r c a d o s c o m o " M a r c a d o r " ( m a r c a d o r d e p e s o m o l e c u l a r ) , " - D T T " ( m u e s t r a d e q u i m e r a B o N T / A B o x i d a d a ) y " D T T " ( m u e s t r a d e q u i m e r a B o N T / A B r e d u c i d a ) .
Figura 6 - E s c i s i ó n d e S N A P - 2 5 p o r l a s q u i m e r a s 3 B y 3 C d e B o N T / A y B o N T / A B r e c o m b i n a n t e s ( S E Q I D N O : 1 , 1 2 y 1 3 , r e s p e c t i v a m e n t e ) e n n e u r o n a s p e r i f é r i c a s d e r i v a d a s d e c é l u l a s m a d r e p l u r i p o t e n t e s i n d u c i d a s h u m a n a s ( P E R I .4 U - A x i o g e n e s i s , A l e m a n i a ) . L a s c é l u l a s P E R I . 4 U s e e x p u s i e r o n a d i v e r s a s c o n c e n t r a c i o n e s d e B o N T / A r e c o m b i n a n t e o q u i m e r a 3 B o 3 C d e B o N T / A B d u r a n t e 2 4 h o r a s , a 3 7 ° C e n u n a a t m ó s f e r a h u m i d i f i c a d a d e C O 2 q u e c o n t e n í a u n 5 % d e C O 2 . A c o n t i n u a c i ó n , l a s c é l u l a s s e l i s a r o n c o n t a m p ó n N u P A G E 1 x s u p l e m e n t a d o c o n D T T y B e n z o n a s a . L a s m u e s t r a s s e t r a n s f i r i e r o n a t u b o s d e m i c r o c e n t r í f u g a , s e c a l e n t a r o n d u r a n t e 5 m i n a 9 0 ° C e n u n b l o q u e d e c a l o r y s e a l m a c e n a r o n a - 2 0 ° C , a n t e s d e l a n á l i s i s d e l a e s c i s i ó n d e S N A P - 2 5 m e d i a n t e t r a n s f e r e n c i a W e s t e r n . S N A P - 2 5 s e d e t e c t ó u s a n d o u n a n t i c u e r p o p o l i c l o n a l , q u e d e t e c t a t a n t o l a f o r m a d e l o n g i t u d c o m p l e t a c o m o l a e s c i n d i d a d e S N A P -2 5 ( S i g m a # S 9 6 8 4 ) . S e u s ó H R P a n t i - c o n e j o ( S i g m a # A 6 1 5 4 ) c o m o e l a n t i c u e r p o s e c u n d a r i o .
Figura 7 - D u r a c i ó n d e l d e b i l i t a m i e n t o m u s c u l a r a l o l a r g o d e l t i e m p o e n e l e n s a y o d e p u n t u a c i ó n d e a b d u c c i ó n d e d e d o s e n r a t ó n . S e i n y e c t ó a l o s r a t o n e s e n l o s m ú s c u l o s d e l c o m p l e j o g a s t r o c n e m i o - s ó l e o d e u n a e x t r e m i d a d t r a s e r a , b a j o a n e s t e s i a g e n e r a l c o r t a ; e l d e b i l i t a m i e n t o m u s c u l a r s e m i d i ó e n u n a e s c a l a d e 0 - 4 u s a n d o l a p u n t u a c i ó n d e a b d u c c i ó n d e l o s d e d o s ( D A S ) . L o s a n i m a l e s d e l g r u p o i n y e c t a d o c o n l a d o s i s m á s b a j a q u e i n d u j o d u r a n t e l o s p r i m e r o s c u a t r o d í a s d e l a i n y e c c i ó n u n a D A S d e 4 s e m o n i t o r i z a r o n h a s t a l a r e c u p e r a c i ó n c o m p l e t a d e l a d e b i l i d a d m u s c u l a r h a s t a u n a D A S d e 0 ( s i n d e b i l i d a d m u s c u l a r o b s e r v a d a ) .
Figura 8 - S D S P A G E d e B o N T / B C r e c o m b i n a n t e p u r i f i c a d a ( S E Q I D N O : 5 6 ) . L o s c a r r i l e s e s t á n m a r c a d o s c o m o " M a r c a d o r " ( m a r c a d o r d e p e s o m o l e c u l a r ) , " - D T T " ( m u e s t r a d e q u i m e r a B o N T / B C o x i d a d a ) y " D T T " ( m u e s t r a d e q u i m e r a B o N T / B C r e d u c i d a ) .
Figura 9 - E s c i s i ó n d e V A M P - 2 p o r B o N T / B n a t i v a , q u i m e r a B o N T / B C y B o N T / B r e c o m b i n a n t e i n a c t i v a ( S E Q I D N O : 2 , 5 6 y 5 7 , r e s p e c t i v a m e n t e ) e n n e u r o n a s c o r t i c a l e s d e r a t a . L a s c é l u l a s s e e x p u s i e r o n a d i v e r s a s c o n c e n t r a c i o n e s d e B o N T d u r a n t e 2 4 h o r a s , a 3 7 ° C e n u n a a t m ó s f e r a h u m i d i f i c a d a d e C O 2 q u e c o n t e n í a u n 5 % d e C O 2 . L a s c é l u l a s s e l i s a r o n c o n t a m p ó n N u P A G E 1 x s u p l e m e n t a d o c o n D T T y B e n z o n a s a , y s e c a l e n t a r o n d u r a n t e 5 m i n a 9 0 ° C a n t e s d e a l m a c e n a r l a s a - 2 0 ° C . L a s m u e s t r a s s e a n a l i z a r o n p a r a d e t e r m i n a r l a e s c i s i ó n d e V A M P - 2 m e d i a n t e t r a n s f e r e n c i a W e s t e r n u s a n d o u n a n t i c u e r p o p r i m a r i o p o l i c l o n a l a n t i - V A M P - 2 d e c o n e j o ( A b c a m a b 3 3 4 7 , 1 : 1 . 0 0 0 ) y u n a n t i c u e r p o s e c u n d a r i o a n t i - c o n e j o c o n j u g a d o c o n H R P ( S i g m a # A 6 1 5 4 ) .
Figura 10 - E s c i s i ó n d e l p é p t i d o i n f o r m a d o r V A M P - 2 p o r l a B o N T / B n a t i v a y l a q u i m e r a B o N T / B C ( S E Q I D N O : 2 y 5 6 , r e s p e c t i v a m e n t e ) u s a n d o e l k i t B o T e s t ® ( B i o S e n t i n e l ) . S e i n c u b a r o n d i v e r s a s c o n c e n t r a c i o n e s d e B o N T a 3 0 ° C d u r a n t e 1 8 h o r a s c o n u n p é p t i d o V A M P - 2 c o n u n a p a r e j a F R E T C F P - Y F P c o m o i n f o r m a d o r y l a p r o p o r c i ó n d e s u s t r a t o i n f o r m a d o r n o e s c i n d i d o : e s c i n d i d o s e m i d i ó c o m o u n a p é r d i d a d e i n t e n s i d a d d e f l u o r e s c e n c i a d e Y F P a 5 2 8 n m y g a n a n c i a d e f l u o r e s c e n c i a d e C F P a 4 8 5 n m d e s p u é s d e l a e x c i t a c i ó n a 4 4 0 n m .
Ejemplos
L o s s i g u i e n t e s E j e m p l o s s i r v e n p a r a i l u s t r a r r e a l i z a c i o n e s p a r t i c u l a r e s d e l a i n v e n c i ó n y n o l i m i t a n e l a l c a n c e d e l a i n v e n c i ó n d e f i n i d a e n l a s r e i v i n d i c a c i o n e s d e n i n g u n a m a n e r a .
E j e m p l o 1 - M a p e o d e l a h é l i c e 310 e n n e u r o t o x i n a s c l o s t r i d i a l e s
A l i d e n t i f i c a r e s t a r e g i ó n d e e q u i v a l e n c i a e s t r u c t u r a l e n t r e d i f e r e n t e s n e u r o t o x i n a s , f u e p o s i b l e i d e n t i f i c a r u n p u n t o e s p e c í f i c o e n e l q u e u n a m i t a d C - t e r m i n a l d e u n a n e u r o t o x i n a p u e d e p a s a r a u n a m i t a d N - t e r m i n a l d e o t r a n e u r o t o x i n a s i n i n t e r r u m p i r l a e s t r u c t u r a s e c u n d a r i a d e l a m o l é c u l a g e n e r a l . E s t e p u n t o f u e e l e g i d o p a r a s e r e l i n i c i o d e l a h é l i c e 310 .
L o s r e s u l t a d o s s e p r e s e n t a n e n l a t a b l a 2 a n t e r i o r .
E j e m p l o 2 - C l o n a c i ó n , e x p r e s i ó n y p u r i f i c a c i ó n d e q u i m e r a s B o N T / A B
L a s c o n s t r u c c i o n e s q u i m é r i c a s 1 , 2 , 3 A , 3 B y 3 C d e B o N T / A B ( S E Q I D N O : 9 a 1 3 ) s e c o n s t r u y e r o n a p a r t i r d e A D N q u e c o d i f i c a b a l a m o l é c u l a d e l s e r o t i p o p a r e n t a l y l o s o l i g o n u c l e ó t i d o s a p r o p i a d o s u s a n d o t é c n i c a s e s t á n d a r d e b i o l o g í a m o l e c u l a r . E s t o s s e c l o n a r o n e n t o n c e s e n e l v e c t o r d e e x p r e s i ó n p J 4 0 1 c o n o s i n u n a e t i q u e t a H i s 1 0 C - t e r m i n a l y s e
L a s c é l u l a s r e c o g i d a s s e l i s a r o n p o r u l t r a s o n i d o s y s e a c l a r a r o n p o r c e n t r i f u g a c i ó n a 4 . 5 0 0 R P M d u r a n t e 1 h a 4 ° C . L a s m o l é c u l a s q u i m é r i c a s d e B o N T / A B r e c o m b i n a n t e s s e e x t r a j e r o n e n t o n c e s e n s u l f a t o d e a m o n i o y s e p u r i f i c a r o n m e d i a n t e t é c n i c a s e s t á n d a r d e c r o m a t o g r a f í a l í q u i d a d e p r o t e í n a s r á p i d a ( F P L C ) . E s t o i m p l i c ó e l u s o d e u n a r e s i n a d e i n t e r a c c i ó n h i d r ó f o b a p a r a l a c a p t u r a y u n a r e s i n a d e i n t e r c a m b i o a n i ó n i c o p a r a l a e t a p a d e p u r i f i c a c i ó n i n t e r m e d i a . A 1 0 c o n t i n u a c i ó n , l a s m o l é c u l a s p a r c i a l m e n t e p u r i f i c a d a s s e e s c i n d i e r o n p r o t e o l í t i c a m e n t e c o n e n d o p r o t e i n a s a L y s - C p a r a r e n d i r l a b i c a d e n a a c t i v a . E s t a s e p u r i f i c ó a d i c i o n a l m e n t e c o n u n a s e g u n d a r e s i n a d e i n t e r a c c i ó n h i d r ó f o b a p a r a o b t e n e r l a q u i m e r a B o N T / A B f i n a l .
P a r a m o l é c u l a s q u i m é r i c a s d e B o N T / A B c o n u n a e t i q u e t a d e d e c a h i s t a d i n a ( H 10 ) ( q u i m e r a 1 , 2 , 3 A ) , l a e t a p a d e c a p t u r a e m p l e ó e l u s o d e u n a r e s i n a d e n í q u e l i n m o v i l i z a d a e n l u g a r d e l a r e s i n a d e i n t e r a c c i ó n h i d r ó f o b a .
1 5 L a s e c u e n c i a d e c a d a q u i m e r a s e p r e s e n t a e n l a t a b l a 3 .
T a b l a 3 - C o n s t r u c c i o n e s q u i m é r i c a s d e B o N T / A B
E j e m p l o 3 - C o m p a r a c i ó n d e l a s q u i m e r a s 1 , 2 y 3 A d e B o N T / A B
L a s q u i m e r a s 1 , 2 y 3 A d e B o N T / A B q u e t i e n e n u n a e t i q u e t a H 10 C - t e r m i n a l y l a d o b l e m u t a c i ó n E 1 1 9 1 M / S 1 1 9 9 Y s e 2 0 p u r i f i c a r o n c o m o s e d e s c r i b e e n e l E j e m p l o 1 ( F i g . 2 ) y s e e n s a y a r o n p a r a d e t e r m i n a r l a a c t i v i d a d f u n c i o n a l .
E n s a y o d e e s c i s i ó n S N A P - 2 5 e n n e u r o n a s d e l a m é d u l a e s p i n a l d e r a t a
S e p r e p a r a r o n c u l t i v o s p r i m a r i o s d e n e u r o n a s d e l a m é d u l a e s p i n a l d e r a t a ( S C N ) y c r e c i e r o n , d u r a n t e 3 s e m a n a s , e n p l a c a s d e c u l t i v o d e t e j i d o s d e 9 6 p o c i l l o s ( c o m o s e d e s c r i b e e n : M a s u y e r e t a l . , 2 0 1 1 , J . S t r u c t . B i o l . S t r u c t u r e a n d a c t i v i t y o f a f u n c t i o n a l d e r i v a t i v e o f C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m n e u r o t o x i n B ; y e n : C h a d d o c k e t a l . , 2 0 0 2 , P r o t e i n E x p r . P u r i f .
2 5 E x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f c a t a l y t i c a l l y a c t i v e , n o n - t o x i c e n d o p e p t i d a s e d e r i v a t i v e s o f C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m t o x i n t y p e A ) . S e p r e p a r a r o n d i l u c i o n e s e n s e r i e d e B o N T / A B e n m e d i o d e a l i m e n t a c i ó n S C N . E l m e d i o d e c r e c i m i e n t o d e l o s p o c i l l o s a t r a t a r s e r e c o g i ó y s e f i l t r ó ( f i l t r o d e 0 , 2 g m ) . S e v o l v i e r o n a a ñ a d i r 1 2 5 g l d e l m e d i o f i l t r a d o a c a d a p o c i l l o d e e n s a y o . A c o n t i n u a c i ó n , s e a ñ a d i e r o n a l a p l a c a 1 2 5 g l d e t o x i n a d i l u i d a ( p o c i l l o s p o r t r i p l i c a d o ) . L a s c é l u l a s t r a t a d a s s e i n c u b a r o n a 3 7 ° C , 1 0 % d e C O 2 , d u r a n t e 2 4 ± 1 h ) .
3 0 A n á l i s i s d e l a a c t i v i d a d d e B o N T u s a n d o e l e n s a y o d e e s c i s i ó n d e S N A P - 2 5
L a T a b l a 4 a c o n t i n u a c i ó n p r o p o r c i o n a l o s v a l o r e s d e p C E 5 0 d e t e r m i n a d o s p a r a l a Q u i m e r a 1 , 2 y 3 A e n e l e n s a y o d e e s c i s i ó n d e S N A P - 2 5 e n S C N d e r a t a . E s t o s r e s u l t a d o s m u e s t r a n q u e l a s t r e s q u i m e r a s d e B o N T / A B r e t u v i e r o n l a c a p a c i d a d d e e n t r a r e n n e u r o n a s d e l a m é d u l a e s p i n a l d e r a t a y e s c i n d i r s u s u s t r a t o d i a n a . S i n e m b a r g o , l a q u i m e r a 3 A f u e m á s p o t e n t e q u e l a q u i m e r a 1 y 2 e n e s t e e n s a y o ( v é a s e t a m b i é n l a F i g u r a 3 ) .
4 5
T a b l a 4
p C E 5 0 ± S E M
Q u i m e r a 1 1 2 , 4 2 ± 0 , 0 4
Q u i m e r a 2 1 2 , 5 7 ± 0 , 0 1
Q u i m e r a 3 A 1 2 , 8 9 ± 0 , 0 4
E n s a y o d e p u n t u a c i ó n d e a b d u c c i ó n d e d e d o s ( D A S )
E l m é t o d o p a r a m e d i r l a a c t i v i d a d d e l a s q u i m e r a s 1 , 2 y 3 A d e B o N T / A B e n e l e n s a y o D A S s e b a s a e n e l r e f l e j o d e 5 p r o p a g a c i ó n d e l d e d o d e l p i e d e r e s p u e s t a d e s o b r e s a l t o d e l o s r a t o n e s , c u a n d o s e s u s p e n d e n b r e v e m e n t e p o r l a c o l a . E s t e r e f l e j o s e p u n t ú a c o m o p u n t u a c i ó n d e a b d u c c i ó n d e d e d o s ( D A S ) y s e i n h i b e d e s p u é s d e l a a d m i n i s t r a c i ó n d e B o N T e n l o s m ú s c u l o s g a s t r o c n e m i o - s ó l e o d e l a p a t a t r a s e r a . L o s r a t o n e s s e s u s p e n d e n b r e v e m e n t e p o r l a c o l a p a r a p r o v o c a r u n a r e s p u e s t a d e s o b r e s a l t o c a r a c t e r í s t i c a e n l a q u e e l a n i m a l e x t i e n d e s u e x t r e m i d a d t r a s e r a y a b d u c e s u s d e d o s t r a s e r o s . ( A o k i e t a l . 1 9 9 9 , E u r . J . N e u r o l . ; 6 ( s u p l . 4 ) S 3 - S 1 0 )
1 0 E l d í a d e l a i n y e c c i ó n , l o s r a t o n e s f u e r o n a n e s t e s i a d o s e n u n a c á m a r a d e i n d u c c i ó n r e c i b i e n d o i s o f l u r a n o a l 3 % e n o x í g e n o . C a d a r a t ó n r e c i b i ó u n a i n y e c c i ó n i n t r a m u s c u l a r d e q u i m e r a B o N T / A B o v e h í c u l o ( t a m p ó n f o s f a t o q u e c o n t e n í a g e l a t i n a a l 0 , 2 % ) e n l o s m ú s c u l o s g a s t r o c n e m i o - s ó l e o d e l a p a t a t r a s e r a d e r e c h a .
D e s p u é s d e l a i n y e c c i ó n d e l a n e u r o t o x i n a , l o s d i v e r s o s g r a d o s d e a b d u c c i ó n d e l o s d e d o s s e p u n t u a r o n e n u n a e s c a l a d e c e r o a c u a t r o , d o n d e 0 = n o r m a l y 4 = r e d u c c i ó n m á x i m a e n l a a b d u c c i ó n d e l o s d e d o s y l a e x t e n s i ó n d e l a p i e r n a .
1 5 L a D E 5 0 s e d e t e r m i n ó m e d i a n t e a n á l i s i s d e a j u s t e n o l i n e a l u s a n d o e l p r o m e d i o d e l e f e c t o m á x i m o e n c a d a d o s i s . E l m o d e l o m a t e m á t i c o u s a d o f u e e l m o d e l o l o g í s t i c o d e 4 p a r á m e t r o s .
L a D A S s e r e a l i z ó c a d a 2 h o r a s d u r a n t e e l p r i m e r d í a d e s p u é s d e l a d o s i f i c a c i ó n ; a p a r t i r d e e n t o n c e s s e r e a l i z ó 3 v e c e s a l d í a d u r a n t e 4 d í a s .
L a F i g u r a 4 m u e s t r a l a s c u r v a s a j u s t a d a s p a r a l a q u i m e r a 1 , 2 y 3 A ( S E Q I D N O : 9 , 1 0 y 1 1 , r e s p e c t i v a m e n t e ) . L a 2 0 c u r v a d e l a q u i m e r a 3 A s e d e s p l a z a h a c i a l a i z q u i e r d a , l o q u e s i g n i f i c a q u e d o s i s m á s b a j a s d e l a q u i m e r a 3 A l o g r a r o n u n a r e s p u e s t a D A S s i m i l a r e n c o m p a r a c i ó n c o n l a q u i m e r a 1 y 2 , l o q u e m u e s t r a , p o r l o t a n t o , q u e l a q u i m e r a 3 A e s m á s p o t e n t e q u e l a s o t r a s e n e l e n s a y o D A S d e r a t ó n ; v é a s e t a m b i é n l a t a b l a s i g u i e n t e ( t a b l a 5 ) q u e p r o p o r c i o n a l o s v a l o r e s p a r a l a D E 5 0 c a l c u l a d a y l a d o s i s q u e c o n d u c e a D A S 4 ( p u n t u a c i ó n m á s a l t a ) p a r a c a d a q u i m e r a .
L a T a b l a 5 a c o n t i n u a c i ó n p r o p o r c i o n a l a D E 5 0 y d o s i s d e D A S 4 d e t e r m i n a d a s p a r a B o N T / A 1 r e c o m b i n a n t e ( r B o N T / A 1 ) 2 5 y l a s q u i m e r a s 1 , 2 y 3 A e n e l e n s a y o D A S d e r a t ó n . E s t o s r e s u l t a d o s m u e s t r a n q u e , d e l a s t r e s q u i m e r a s , l a q u i m e r a 3 A t i e n e l a m a y o r p o t e n c i a i n v i v o p a r a i n d u c i r e l d e b i l i t a m i e n t o m u s c u l a r . L o s e s t u d i o s q u e s e m u e s t r a n e n l a f i g u r a 4 y e n l a t a b l a 5 s e r e a l i z a r o n e n r a t o n e s o b t e n i d o s d e l o s l a b o r a t o r i o s C h a r l e s R i v e r .
T a b l a 5
D E 5 0 ( p g / r a t ó n ) D o s i s d e D A S 4 ( p g / r a t ó n )
r B o N T / A 1 1 5
Q u i m e r a 1 2 3 2 0 0
Q u i m e r a 2 8 9 > 3 0 0
Q u i m e r a 3 A 1 8 1 3 3
3 0 E j e m p l o 4 - C o m p a r a c i ó n d e l a q u i m e r a 3 B , 3 C d e B o N T / A B y B o N T / A 1
c o n t a r o n l a s c é l u l a s u s a n d o u n h e m o c i t ó m e t r o . D e s p u é s d e e s t o , s e a ñ a d i e r o n 6 m L m á s d e m e d i o d e d e s c o n g e l a c i ó n P e r i . 4 U ® a l a s u s p e n s i ó n c e l u l a r . S e o b t u v o u n s e d i m e n t o c e l u l a r m e d i a n t e c e n t r i f u g a c i ó n a 2 6 0 x g ( p . e j . , 1 . 1 0 0 R P M ) d u r a n t e 6 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e . A c o n t i n u a c i ó n , l a s c é l u l a s s e r e s u s p e n d i e r o n e n m e d i o d e c u l t i v o c o m p l e t o P e r i . 4 U ® s u m i n i s t r a d o p o r e l f a b r i c a n t e . L a s c é l u l a s s e s e m b r a r o n e n p l a c a s a u n a d e n s i d a d d e 5 0 . 0 0 0 a 1 5 0 . 0 0 0 5 c é l u l a s p o r c m 2 e n p l a c a s d e c u l t i v o c e l u l a r r e c u b i e r t a s c o n p o l i - L - o r n i t i n a y l a m i n i n a . L a s c é l u l a s s e c u l t i v a r o n a 3 7 ° C e n u n a a t m ó s f e r a h u m i d i f i c a d a c o n C O 2 , y e l m e d i o s e c a m b i ó c o m p l e t a m e n t e c a d a 2 - 3 d í a s d u r a n t e e l c u l t i v o .
P a r a e l t r a t a m i e n t o c o n t o x i n a s , s e p r e p a r a r o n d i l u c i o n e s e n s e r i e d e B o N T e n m e d i o d e c u l t i v o P e r i . 4 U ® . E l m e d i o d e l o s p o c i l l o s a t r a t a r s e r e c o g i ó y s e f i l t r ó ( f i l t r o d e 0 , 2 g m ) . S e v o l v i e r o n a a ñ a d i r 1 2 5 g L d e l m e d i o f i l t r a d o a c a d a p o c i l l o d e e n s a y o . A c o n t i n u a c i ó n , s e a ñ a d i e r o n a l a p l a c a 1 2 5 g L d e t o x i n a d i l u i d a ( p o c i l l o s p o r t r i p l i c a d o ) . L a s c é l u l a s t r a t a d a s 1 0 s e i n c u b a r o n a 3 7 ° C , 1 0 % d e C O 2 , d u r a n t e 4 8 ± 1 h ) .
A n á l i s i s d e l a a c t i v i d a d d e B o N T u s a n d o e l e n s a y o d e e s c i s i ó n d e S N A P - 2 5
L a F i g u r a 6 m u e s t r a q u e l a s q u i m e r a s 3 B y 3 C m o s t r a r o n m a y o r p o t e n c i a q u e r B o N T / A 1 e n l a e s c i s i ó n d e S N A P - 2 5 e n c é l u l a s m a d r e p l u r i p o t e n t e s h u m a n a s i n d u c i d a s , p e r o l a p r i m e r a s i g n i f i c a t i v a m e n t e m á s . E s t o p u e d e e x p l i c a r s e p o r l a d o b l e m u t a c i ó n q u e a u m e n t a l a a f i n i d a d d e l a q u i m e r a 3 B p o r e l r e c e p t o r d e l a p r o t e í n a s i n a p t o t a g m i n a II h u m a n a 2 5 p r e s e n t e e n e s t a s c é l u l a s ( F i g . 6 , t a b l a 6 ) .
T a b l a 6
p C E 5 0 ± S E M
r B o N T / A 1 1 0 , 2 1 ± 0 , 0 5
Q u i m e r a 3 B 1 2 , 3 8 ± 0 , 0 6
Q u i m e r a 3 C 1 0 , 7 2 ± 0 , 0 8
Ensayo de puntuación de abducción de dedos (DAS) - Relación de seguridad
E l m é t o d o p a r a m e d i r l a a c t i v i d a d d e l a s B o N T e n e l e n s a y o D A S s e b a s a e n e l r e f l e j o d e e x t e n s i ó n d e l o s d e d o s d e d o 3 0 d e l p i e d e r e s p u e s t a d e s o b r e s a l t o d e l o s r a t o n e s , c u a n d o s e s u s p e n d e n b r e v e m e n t e p o r l a c o l a . E s t e r e f l e j o s e p u n t ú a c o m o p u n t u a c i ó n d e a b d u c c i ó n d e d e d o s ( D A S ) y s e i n h i b e d e s p u é s d e l a a d m i n i s t r a c i ó n d e B o N T e n l o s m ú s c u l o s g a s t r o c n e m i o - s ó l e o d e l a p a t a t r a s e r a . L o s r a t o n e s s e s u s p e n d e n b r e v e m e n t e p o r l a c o l a p a r a p r o v o c a r u n a r e s p u e s t a d e s o b r e s a l t o c a r a c t e r í s t i c a e n l a q u e e l a n i m a l e x t i e n d e s u e x t r e m i d a d t r a s e r a y a b d u c e s u s d e d o s t r a s e r o s . ( A o k i e t a l . 1 9 9 9 , E u r . J . N e u r o l . ; 6 ( s u p l . 4 ) S 3 - S 1 0 )
3 5 E l d í a d e l a i n y e c c i ó n , l o s r a t o n e s f u e r o n a n e s t e s i a d o s e n u n a c á m a r a d e i n d u c c i ó n r e c i b i e n d o i s o f l u r a n o a l 3 % e n o x í g e n o . C a d a r a t ó n r e c i b i ó u n a i n y e c c i ó n i n t r a m u s c u l a r d e B o N T o v e h í c u l o ( t a m p ó n f o s f a t o q u e c o n t e n í a g e l a t i n a a l 0 , 2 % ) e n l o s m ú s c u l o s g a s t r o c n e m i o - s ó l e o d e l a p a t a t r a s e r a d e r e c h a .
D e s p u é s d e l a i n y e c c i ó n d e l a n e u r o t o x i n a , l o s d i v e r s o s g r a d o s d e a b d u c c i ó n d e l o s d e d o s s e p u n t u a r o n e n u n a e s c a l a d e c e r o a c u a t r o , d o n d e 0 = n o r m a l y 4 = r e d u c c i ó n m á x i m a e n l a a b d u c c i ó n d e l o s d e d o s y l a e x t e n s i ó n d e l a p i e r n a .
4 0 L a D E 5 0 s e d e t e r m i n ó m e d i a n t e a n á l i s i s d e a j u s t e n o l i n e a l u s a n d o e l p r o m e d i o d e l e f e c t o m á x i m o e n c a d a d o s i s . E l m o d e l o m a t e m á t i c o u s a d o f u e e l m o d e l o l o g í s t i c o d e 4 p a r á m e t r o s .
L a D A S s e r e a l i z ó c a d a 2 h o r a s d u r a n t e e l p r i m e r d í a d e s p u é s d e l a d o s i f i c a c i ó n ; a p a r t i r d e e n t o n c e s s e r e a l i z ó 3 v e c e s a l d í a d u r a n t e 4 d í a s p a r a t o d a s l a s d o s i s . L o s a n i m a l e s d e l o s g r u p o s i n y e c t a d o s c o n v e h í c u l o y l a d o s i s m á s b a j a q u e i n d u j o d u r a n t e l o s p r i m e r o s c u a t r o d í a s d e i n y e c c i ó n u n a D A S d e 4 s e m o n i t o r i z a r o n p o s t e r i o r m e n t e h a s t a l a 4 5 r e c u p e r a c i ó n c o m p l e t a d e l a d e b i l i d a d m u s c u l a r h a s t a u n a D A S d e 0 ( s i n d e b i l i d a d m u s c u l a r o b s e r v a d a ) .
P a r a e l c á l c u l o d e l a r e l a c i ó n d e s e g u r i d a d , t o d o s l o s a n i m a l e s s e p e s a r o n e l d í a a n t e s d e l a i n y e c c i ó n d e t o x i n a ( D 0 ) y p o s t e r i o r m e n t e u n a v e z a l d í a a l o l a r g o d e l a d u r a c i ó n d e l e s t u d i o . E l p e s o c o r p o r a l p r o m e d i o , s u d e s v i a c i ó n e s t á n d a r y e l e r r o r e s t á n d a r d e l a m e d i a s e c a l c u l a r o n d i a r i a m e n t e p a r a c a d a g r u p o d e d o s i s . P a r a o b t e n e r l a r e l a c i ó n d e s e g u r i d a d p a r a u n a B o N T ( - 1 0 % A B W / D E 5 0 ) , s e d i v i d i ó l a d o s i s a l a q u e e n c u a l q u i e r m o m e n t o d u r a n t e e l e s t u d i o e l 5 0 p e s o p r o m e d i o d e u n g r u p o d e d o s i s e r a i n f e r i o r a l 1 0 % d e l p e s o p r o m e d i o e n D 0 d e e s e m i s m o g r u p o d e d o s i s p o r
la DE50 para la BoNT estudiada. La dosis letal se definió como la dosis a la que murieron uno o más de los animales dentro de ese grupo de dosis.
La Figura 7 muestra la duración de la debilidad muscular a lo largo del tiempo en el ensayo de puntuación de abducción de dedos en ratón para rBoNT/A1, quimera 3B y quimera 3C (SEQ ID NO: 1, 12 y 13), mostrando que la quimera tiene una duración de acción más prolongada.
La Tabla 7 a continuación proporciona las DE50 y las dosis de DAS 4 determinadas para rBoNT/A1 y las quimeras 3B y 3C en el ensayo DAS en ratón. La tabla también proporciona la duración total de acción para la dosis de DAS 4 hasta la recuperación completa de la debilidad muscular hasta una DAS de 0 (sin debilidad muscular observada). Además, la tabla muestra la dosis letal en ratones la relación de seguridad (-10 % ABW/DE50 ), como se ha definido en el texto anterior. En comparación con rBoNT/A1, las quimeras 3B y 3C tienen una duración de acción más prolongada, una mejor relación de seguridad y una dosis letal más alta. Los estudios que se muestran en la figura 7 y en la tabla 7 se realizaron en ratones obtenidos de los laboratorios Janvier.
Tabla 7
D o s i s D E 5 0 ( D A S D o s i s d e D A S D u r a c i ó n t o t a l d e l a a c c i ó n ( d í a ) D o s i s l e t a l p a r a R e l a c i ó n d e s e g u r i d a d 2) ( p g / r a t ó n ) 4 ( p g / r a t ó n ) c o n l a d o s i s m á s b a j a d e d A s 4 r a t o n e s ( p g ) ( - 1 0 % AB W / D E 5 0 )
rBoNT/A1 0,9 2,3 29 18 4,5 Quimera 8,0 89 42 200 14,1 3B
Quimera 5,0 26 42 8,9 7,4 3C
Ejemplo 5 - Expresión y purificación de la quimera BoNT/BC y confirmación de la actividad funcional
La quimera 4 de BoNT/BC (SEQ ID NO: 56) se clonó, expresó y purificó como se describe en el Ejemplo 2, excepto por el uso de una cepa celular de expresión diferente (BL21) y escisión proteolítica con tripsina en lugar de endoproteinasa Lys-C (Figura 8).
Tabla 8 - Construcción de quimera de BoNT/BC
Esta quimera se ensayó para determinar su actividad funcional en un ensayo de escisión de VAMP-2.
Ensayo de escisión de VAMP-2 en neuronas corticales de rata
Se prepararon neuronas corticales de rata y se mantuvieron en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-L-ornitina (PLO) a una densidad de 20.000 células/pocillo en 125 pL de medio Neurobasal que contenía un suplemento de B27 al 2 %, GlutaMAX 0,5 mM, suero bovino fetal al 1 % ( FBS) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. Se añadieron 125 pL más de medio Neurobasal que contenía B27 al 2 %, GlutaMAX 0,5 mM en DIV 4. Las células se mantuvieron reemplazando la mitad del medio cada 3-4 días. En DIV 11, se añadió citosina p-D-arabinofuranósido (AraC) 1,5 pM al medio para evitar la proliferación de células no neuronales. Las neuronas corticales en DIV 19-21 se trataron con un rango de concentración de BoNT (30 fM - 3 nM) durante 24 horas a 37 °C.
Análisis de la actividad de BoNT usando el ensayo de escisión de VAMP-2
Las células se lavaron brevemente en medio de ensayo (Neurobasal sin rojo de fenol, B27 al 2 %, GlutaMAX 0,5 mM, TFB-TBOA 10 pM (ácido (3S)-3-[[3-[[4-(Trifluorometil)benzoil]amino]]fenil]metoxi]-L-aspártico, antes de la lisis en 100 pL de tampón de lisis (tampón de muestra NuPage LDS, DTT 1 mM y benzonasa 1:500) y se calentó a 90 °C durante 5 minutos. Se procesaron 15 pL de lisados en geles de Bis-Tris al 12 % a 200 V durante 50 minutos con tampón MES. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa a través de un Transblot Turbo (Biorad) usando el programa de bajo MW. Las membranas se bloquearon con leche baja en grasa al 5 % en PBST y se ensayaron entonces con anticuerpo primario anti-VAMP-2 de conejo (Abcam ab3347, 1:1.000) y después anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con HRP (Sigma #A6154). Las membranas se desarrollaron con sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Dura y se visualizaron usando un sistema Syngene PXi. Se analizó la densitometría de las bandas usando el software GeneTools (Syngene) y se determinó el porcentaje de escisión de VAMP-2 en cada concentración de BoNT en relación con los pocillos de control. Los datos se ajustaron a una ecuación
Claims (15)
1 . U n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a q u e c o m p r e n d e u n d o m i n i o L H n d e u n a p r i m e r a n e u r o t o x i n a u n i d o c o v a l e n t e m e n t e a u n d o m i n i o H c d e u n a s e g u n d a n e u r o t o x i n a , e n d o n d e :
( a ) e l r e s i d u o d e a m i n o á c i d o C - t e r m i n a l d e d i c h o d o m i n i o L H n c o r r e s p o n d e a l p r i m e r r e s i d u o d e a m i n o á c i d o d e l a 5 h é l i c e 310 q u e s e p a r a l o s d o m i n i o s L H n y H c e n d i c h a p r i m e r a n e u r o t o x i n a ;
( b ) e l r e s i d u o d e a m i n o á c i d o N - t e r m i n a l d e d i c h o d o m i n i o H c c o r r e s p o n d e a l s e g u n d o r e s i d u o d e a m i n o á c i d o d e l a h é l i c e 310 q u e s e p a r a l o s d o m i n i o s L H n y H c e n d i c h a s e g u n d a n e u r o t o x i n a ; y
( c ) d i c h a p r i m e r a y s e g u n d a n e u r o t o x i n a s s o n d i f e r e n t e s y ( i ) d i c h a p r i m e r a n e u r o t o x i n a e s u n a n e u r o t o x i n a b o t u l í n i c a ( B o N T ) d e s e r o t i p o A , s e r o t i p o B , s e r o t i p o C , s e r o t i p o D , s e r o t i p o E , s e r o t i p o F o s e r o t i p o G o u n a 0 n e u r o t o x i n a t e t á n i c a ( T e N T ) ; y ( i i ) d i c h a s e g u n d a n e u r o t o x i n a e s u n a B o N T d e s e r o t i p o A , s e r o t i p o B , s e r o t i p o C , s e r o t i p o D , s e r o t i p o E , s e r o t i p o F o s e r o t i p o G o u n a T e N T .
2 . U n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 1 , e n d o n d e :
d i c h o d o m i n i o L H n d e u n a p r i m e r a n e u r o t o x i n a c o r r e s p o n d e a :
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 7 2 d e B o N T / A 1 ,
5 - l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 5 9 d e B o N T / B 1 ,
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 6 7 d e B o N T / C 1 ,
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 6 3 d e B o N T / D ,
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 4 6 d e B 0 N T / E 1 ,
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 6 5 d e B o N T / F 1 ,
0 - l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 6 4 d e B o N T / G , o
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 8 0 d e T e N T ;
y e n d o n d e d i c h o d o m i n i o H c d e u n a s e g u n d a n e u r o t o x i n a c o r r e s p o n d e a l o s :
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 7 3 a 1 2 9 6 d e B o N T / A 1 ,
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 6 0 a 1 2 9 1 d e B o N T / B 1 ,
5 - l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 6 8 a 1 2 9 1 d e B o N T / C 1 ,
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 6 4 a 1 2 7 6 d e B o N T / D ,
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 4 7 a 1 2 5 1 d e B o N T / E 1 ,
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 6 6 a 1 2 7 5 d e B o N T / F 1 ,
- l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 6 5 a 1 2 9 7 d e B o N T / G , o
0 - l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 8 1 a 1 3 1 5 d e T e N T .
3 . U n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 1 o 2 , e n d o n d e d i c h a p r i m e r a n e u r o t o x i n a e s u n a B o N T / A y e n d o n d e d i c h a s e g u n d a n e u r o t o x i n a e s u n a B o N T / B .
4 . U n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 3 , e n d o n d e d i c h a p r i m e r a n e u r o t o x i n a e s u n a B o N T / A 1 y e n d o n d e d i c h a s e g u n d a n e u r o t o x i n a e s u n a B o N T / B 1 , e n d o n d e o p c i o n a l m e n t e d i c h o d o m i n i o L H n d e u n a p r i m e r a 5 n e u r o t o x i n a c o r r e s p o n d e a l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 7 2 d e B o N T / A 1 y e n d o n d e d i c h o d o m i n i o H c d e u n a s e g u n d a n e u r o t o x i n a c o r r e s p o n d e a l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 6 0 a 1 2 9 1 d e B o N T / B 1 .
5 . U n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 3 o 4 , e n d o n d e d i c h o d o m i n i o H c d e u n a n e u r o t o x i n a B o N T / B c o m p r e n d e a l m e n o s u n a s u s t i t u c i ó n , a d i c i ó n o d e l e c i ó n d e r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s e n e l s u b d o m i n i o H c c q u e t i e n e e l e f e c t o d e a u m e n t a r l a a f i n i d a d d e u n i ó n d e l a n e u r o t o x i n a B o N T / B p a r a e l r e c e p t o r d e S y t I I h u m a n a e n c o m p a r a c i ó n 0 c o n l a s e c u e n c i a d e B o N T / B n a t u r a l .
6 . U n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 5 , e n d o n d e d i c h a a l m e n o s u n a s u s t i t u c i ó n , a d i c i ó n o d e l e c i ó n d e r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s e n e l s u b d o m i n i o H c c c o m p r e n d e :
i ) u n a m u t a c i ó n d e s u s t i t u c i ó n s e l e c c i o n a d a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n : V 1 1 1 8 M ; Y 1 1 8 3 M ; E 1 1 9 1 M ; E 1 1 9 1 I ;
E 1 1 9 1 Q ; E 1 1 9 1 T ; S 1 1 9 9 Y ; S 1 1 9 9 F ; S 1 1 9 9 L ; S 1 2 0 1 V ; E 1 1 9 1 C , E 1 1 9 1 V , E 1 1 9 1 L , E 1 1 9 1 Y , S 1 1 9 9 W , S 1 1 9 9 E , S 1 1 9 9 H , W 1 1 7 8 Y , W 1 1 7 8 Q , W 1 1 7 8 A , W 1 1 7 8 S , Y 1 1 8 3 C , Y 1 1 8 3 P y c o m b i n a c i o n e s d e l a s m i s m a s ; o
i i ) d o s m u t a c i o n e s d e s u s t i t u c i ó n s e l e c c i o n a d a s d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n : E 1 1 9 1 M y S 1 1 9 9 L , E 1 1 9 1 M y S 1 1 9 9 Y , E 1 1 9 1 M y S 1 1 9 9 F , E 1 1 9 1 Q y S 1 1 9 9 L , E 1 1 9 1 Q y S 1 1 9 9 Y , E 1 1 9 1 Q y S 1 1 9 9 F , E 1 1 9 1 M y S 1 1 9 9 W , E 1 1 9 1 M y W 1 1 7 8 Q , E 1 1 9 1 C y S 1 1 9 9 W , E 1 1 9 1 C y S 1 1 9 9 Y , E 1 1 9 1 C y W 1 1 7 8 Q , E 1 1 9 1 Q y S 1 1 9 9 W , E 1 1 9 1 V y S 1 1 9 9 W , E 1 1 9 1 V y S 1 1 9 9 Y , o E 1 1 9 1 V y W 1 1 7 8 Q , e n d o n d e o p c i o n a l m e n t e d i c h a s d o s m u t a c i o n e s d e s u s t i t u c i ó n s o n E 1 1 9 1 M y S 1 1 9 9 Y ; o
i i i ) t r e s m u t a c i o n e s d e s u s t i t u c i ó n q u e s o n E 1 1 9 1 M , S 1 1 9 9 W y W 1 1 7 8 Q .
7 . U n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 1 ó 2 , e n d o n d e d i c h a p r i m e r a n e u r o t o x i n a e s u n a B o N T / B y e n d o n d e d i c h a s e g u n d a n e u r o t o x i n a e s u n a B o N T / C .
8 . U n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 7 , e n d o n d e d i c h a p r i m e r a n e u r o t o x i n a e s u n a B o N T / B 1 y e n d o n d e d i c h a s e g u n d a n e u r o t o x i n a e s u n a B o N T / C 1 , e n d o n d e o p c i o n a l m e n t e d i c h o d o m i n i o L H n d e u n a p r i m e r a n e u r o t o x i n a c o r r e s p o n d e a l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 1 a 8 5 9 d e B o N T / B 1 y e n d o n d e d i c h o d o m i n i o H c d e u n a s e g u n d a n e u r o t o x i n a c o r r e s p o n d e a l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s 8 6 8 a 1 2 9 1 d e B o N T / C 1 .
9 . U n a s e c u e n c i a d e n u c l e ó t i d o s q u e c o d i f i c a u n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 8 , o u n v e c t o r q u e c o m p r e n d e d i c h a s e c u e n c i a d e n u c l e ó t i d o s .
1 0 . U n a c é l u l a q u e c o m p r e n d e u n a s e c u e n c i a d e n u c l e ó t i d o s o u n v e c t o r s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 9 .
1 1 . U n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e c o m p r e n d e u n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 8 .
1 2 . U n k i t q u e c o m p r e n d e u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a d e l a r e i v i n d i c a c i ó n 11 e i n s t r u c c i o n e s p a r a l a a d m i n i s t r a c i ó n t e r a p é u t i c a o c o s m é t i c a d e d i c h a c o m p o s i c i ó n a u n s u j e t o q u e l o n e c e s i t a .
1 3 . U n m é t o d o p a r a p r o d u c i r u n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a c o m o s e d e f i n e e n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 8 , c o m p r e n d i e n d o d i c h o m é t o d o l a e t a p a d e c u l t i v a r u n a c é l u l a d e l a r e i v i n d i c a c i ó n 1 0 , e n c o n d i c i o n e s e n d o n d e s e p r o d u c e d i c h a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a .
1 4 . U n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 8 o u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 11 p a r a s u u s o e n t e r a p i a , e n d o n d e o p c i o n a l m e n t e d i c h o u s o e s e n e l t r a t a m i e n t o d e u n a a f e c c i ó n a s o c i a d a c o n u n a a c t i v i d a d n e u r o n a l n o d e s e a d a , p o r e j e m p l o , u n a a f e c c i ó n s e l e c c i o n a d a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n d i s f o n í a e s p a s m ó d i c a , t o r t í c o l i s e s p a s m ó d i c a , d i s t o n í a l a r í n g e a , d i s f o n í a o r o m a n d i b u l a r , d i s t o n í a l i n g u a l , d i s t o n í a c e r v i c a l , d i s t o n í a f o c a l d e l a m a n o , b l e f a r o e s p a s m o , e s t r a b i s m o , e s p a s m o h e m i f a c i a l , t r a s t o r n o d e l o s p á r p a d o s , p a r á l i s i s c e r e b r a l , e s p a s t i c i d a d f o c a l y o t r o s t r a s t o r n o s d e l a v o z , c o l i t i s e s p a s m ó d i c a , v e j i g a n e u r o g é n i c a , a n i s m o , e s p a s t i c i d a d d e l a s e x t r e m i d a d e s , t i c s , t e m b l o r e s , b r u x i s m o , f i s u r a a n a l , a c a l a s i a , d i s f a g i a y o t r o s t r a s t o r n o s d e l t o n o m u s c u l a r y o t r o s t r a s t o r n o s c a r a c t e r i z a d o s p o r m o v i m i e n t o s i n v o l u n t a r i o s d e g r u p o s m u s c u l a r e s , l a g r i m e o , h i p e r h i d r o s i s , s a l i v a c i ó n e x c e s i v a , s e c r e c i o n e s g a s t r o i n t e s t i n a l e s e x c e s i v a s , t r a s t o r n o s s e c r e t o r e s , d o l o r p o r e s p a s m o s m u s c u l a r e s , d o l o r d e c a b e z a , m i g r a ñ a y a f e c c i o n e s d e r m a t o l ó g i c a s .
1 5 . U s o n o t e r a p é u t i c o d e u n a n e u r o t o x i n a q u i m é r i c a s e g ú n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 8 o d e u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a s e g ú n l a r e i v i n d i c a c i ó n 1 1 , p a r a e l t r a t a m i e n t o d e u n a a f e c c i ó n e s t é t i c a o c o s m é t i c a .
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| TWI810228B (zh) * | 2017-12-20 | 2023-08-01 | 英商艾普森生物製藥有限公司 | 自主神經系統障礙之治療 |
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| WO2019195694A1 (en) * | 2018-04-06 | 2019-10-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Additive manufacturing compositions |
| US20220016221A1 (en) | 2018-12-05 | 2022-01-20 | Ipsen Biopharm Limited | Treatment of symptoms of traumatic brain injury |
| EP3753568A1 (en) | 2019-06-21 | 2020-12-23 | Fastox Pharma SA | Composition modulating botulinum neurotoxin effect |
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| GB202001353D0 (en) | 2020-01-31 | 2020-03-18 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of skin conditions |
| GB202003813D0 (en) | 2020-03-16 | 2020-04-29 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of upper facial lines |
| US20230248811A1 (en) | 2020-03-16 | 2023-08-10 | Ipsen Biopharm Limited | Treatment of Limb Spasticity |
| GB202011055D0 (en) | 2020-07-17 | 2020-09-02 | Ipsen Bioinnovation Ltd | Treatment of post-operative pain |
| GB202100566D0 (en) | 2021-01-15 | 2021-03-03 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of brain damage |
| GB202104294D0 (en) * | 2021-03-26 | 2021-05-12 | Ipsen Biopharm Ltd | Clostridial neurotoxins comprising an exogenous activation loop |
| WO2022208039A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Ipsen Biopharm Limited | Catalytically inactive clostridial neurotoxins for the treatment of pain & inflammatory disorders |
| JP2024513191A (ja) | 2021-03-30 | 2024-03-22 | イプセン バイオファーム リミテッド | 疼痛及び炎症性障害の処置 |
| AU2022348206A1 (en) | 2021-09-16 | 2024-03-28 | Ipsen Biopharm Limited | Modified bont/a for use in the treatment of cervical dystonia |
| KR20240067100A (ko) | 2021-09-23 | 2024-05-16 | 입센 바이오팜 리미티드 | 대상체의 안검 근육에 이환된 장애의 치료에 사용하기 위한 변형된 bont/a |
| GB202113602D0 (en) | 2021-09-23 | 2021-11-10 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject |
| AU2022392458A1 (en) * | 2021-11-22 | 2024-05-02 | Ipsen Biopharm Limited | Treatment of pain |
| GB202116795D0 (en) | 2021-11-22 | 2022-01-05 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of visceral pain |
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| GB202213479D0 (en) | 2022-09-14 | 2022-10-26 | Ipsen Biopharm Ltd | Cell-free clostridial neurotoxin assays |
| GB202404021D0 (en) | 2024-03-20 | 2024-05-01 | Ipsen Biopharm Ltd | Cell-based neurotoxin assay |
Family Cites Families (65)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE122009000066I2 (de) | 1993-06-10 | 2010-12-30 | Allergan Inc | Behandlung von neuromuskulären Störungen und Zuständen mit verschiedenen botulinen Serotypen |
| US5437291A (en) | 1993-08-26 | 1995-08-01 | Univ Johns Hopkins | Method for treating gastrointestinal muscle disorders and other smooth muscle dysfunction |
| US20040126396A1 (en) | 1993-12-28 | 2004-07-01 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin treatment for strabismus |
| US6974578B1 (en) | 1993-12-28 | 2005-12-13 | Allergan, Inc. | Method for treating secretions and glands using botulinum toxin |
| US5670484A (en) | 1994-05-09 | 1997-09-23 | Binder; William J. | Method for treatment of skin lesions associated with cutaneous cell-proliferative disorders |
| US5714469A (en) | 1994-09-01 | 1998-02-03 | Smithkline Beecham Corporation | Method of treating sepsis |
| US6063768A (en) | 1997-09-04 | 2000-05-16 | First; Eric R. | Application of botulinum toxin to the management of neurogenic inflammatory disorders |
| GB9818548D0 (en) | 1998-08-25 | 1998-10-21 | Microbiological Res Authority | Treatment of mucas hypersecretion |
| US6545126B1 (en) * | 1999-03-18 | 2003-04-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chimeric toxins |
| US6767544B2 (en) | 2002-04-01 | 2004-07-27 | Allergan, Inc. | Methods for treating cardiovascular diseases with botulinum toxin |
| US6358917B1 (en) | 1999-08-24 | 2002-03-19 | Jean D. A. Carruthers | Cosmetic use of botulinum toxin for treatment of downturned mouth |
| GB9922554D0 (en) | 1999-09-23 | 1999-11-24 | Microbiological Res Authority | Inhibition of secretion from non-neuronal cells |
| US6113915A (en) | 1999-10-12 | 2000-09-05 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating pain |
| US6265379B1 (en) | 1999-10-13 | 2001-07-24 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating otic disorders |
| US7838008B2 (en) | 1999-12-07 | 2010-11-23 | Allergan, Inc. | Methods for treating diverse cancers |
| US6139845A (en) | 1999-12-07 | 2000-10-31 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating cancer with a neurotoxin |
| US6261572B1 (en) | 2000-01-11 | 2001-07-17 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating a pancreatic disorder with a neurotoxin |
| US6143306A (en) | 2000-01-11 | 2000-11-07 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating pancreatic disorders |
| US6337075B1 (en) | 2000-01-11 | 2002-01-08 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating diabetes |
| US6641820B1 (en) | 2000-01-19 | 2003-11-04 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin derivatives and methods to treat pain |
| US6524580B1 (en) | 2000-02-15 | 2003-02-25 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating thyroid disorders |
| US6464986B1 (en) | 2000-04-14 | 2002-10-15 | Allegan Sales, Inc. | Method for treating pain by peripheral administration of a neurotoxin |
| US6299893B1 (en) | 2000-04-17 | 2001-10-09 | Marvin Schwartz | Method to reduce hair loss and stimulate hair regrowth |
| US6565870B1 (en) | 2000-04-28 | 2003-05-20 | Allergan, Inc. | Methods for treating bone tumors |
| US6306403B1 (en) | 2000-06-14 | 2001-10-23 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating parkinson's disease with a botulinum toxin |
| US6903187B1 (en) * | 2000-07-21 | 2005-06-07 | Allergan, Inc. | Leucine-based motif and clostridial neurotoxins |
| US6423319B1 (en) | 2000-10-04 | 2002-07-23 | Allergan Sales, Inc. | Methods for treating muscle injuries |
| US6827931B1 (en) | 2000-10-20 | 2004-12-07 | Allergan, Inc. | Method for treating endocrine disorders |
| US6623742B2 (en) | 2001-09-17 | 2003-09-23 | Allergan, Inc. | Methods for treating fibromyalgia |
| US7255866B2 (en) | 2001-09-17 | 2007-08-14 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin therapy for fibromyalgia |
| US6921538B2 (en) | 2002-05-10 | 2005-07-26 | Allergan, Inc. | Therapeutic treatments for neuropsychiatric disorders |
| US20040115139A1 (en) | 2002-10-15 | 2004-06-17 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin dental therapies and procedures |
| US7238357B2 (en) | 2002-11-05 | 2007-07-03 | Allergan, Inc. | Methods for treating ulcers and gastroesophageal reflux disease |
| US8071550B2 (en) | 2003-03-03 | 2011-12-06 | Allergan, Inc. | Methods for treating uterine disorders |
| US6838434B2 (en) | 2003-05-02 | 2005-01-04 | Allergan, Inc. | Methods for treating sinus headache |
| US7220422B2 (en) | 2003-05-20 | 2007-05-22 | Allergan, Inc. | Methods and compositions for treating eye disorders |
| US20040253274A1 (en) | 2003-06-11 | 2004-12-16 | Allergan, Inc. | Use of a clostridial toxin to reduce appetite |
| US7172764B2 (en) * | 2003-11-17 | 2007-02-06 | Allergan, Inc. | Rescue agents for treating botulinum toxin intoxications |
| US7514088B2 (en) * | 2005-03-15 | 2009-04-07 | Allergan, Inc. | Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use |
| DE102004043009A1 (de) | 2004-09-06 | 2006-03-23 | Toxogen Gmbh | Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen |
| US7465457B2 (en) * | 2005-04-14 | 2008-12-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for preparing botulinum neurotoxin type A light chain |
| DE102005019302A1 (de) | 2005-04-26 | 2006-11-16 | Toxogen Gmbh | Carrier zum Targeting von Nervenzellen |
| MX2011001823A (es) * | 2008-08-29 | 2011-03-25 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Neurotoxinas clostridiales con persistencia alterada. |
| GB0903006D0 (en) * | 2009-02-23 | 2009-04-08 | Syntaxin Ltd | Modified non-cytotoxic proteases |
| JP5764550B2 (ja) | 2009-04-14 | 2015-08-19 | エムシーダブリユー リサーチ フオンデーシヨン インコーポレーテツド | 遺伝子工学的ボツリヌス神経毒 |
| DK3106170T3 (da) * | 2010-05-20 | 2020-07-13 | Allergan Inc | Nedbrydelige clostridiumtoksiner |
| US8853360B2 (en) | 2010-06-23 | 2014-10-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Engineered botulinum neurotoxin C1 with selective substrate specificity |
| GB201108108D0 (en) * | 2011-05-16 | 2011-06-29 | Syntaxin Ltd | Therapeutic fusion proteins |
| US10451621B2 (en) * | 2011-12-31 | 2019-10-22 | Allergan, Inc. | Highly sensitive cell-based assay to detect the presence of active botulinum neurotoxin serotype-A |
| SG11201407784UA (en) * | 2012-05-30 | 2014-12-30 | Harvard College | Engineered botulinum neurotoxin |
| JP6156954B2 (ja) * | 2012-11-21 | 2017-07-05 | イプセン バイオイノベーション リミテッド | タンパク分解性にプロセシングされたポリペプチドの製造方法 |
| GB201312317D0 (en) * | 2013-07-09 | 2013-08-21 | Syntaxin Ltd | Cationic neurotoxins |
| US9216210B2 (en) * | 2013-12-23 | 2015-12-22 | Dublin City University | Multiprotease therapeutics for chronic pain |
| GB201407525D0 (en) * | 2014-04-29 | 2014-06-11 | Syntaxin Ltd | Manufacture of recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
| EP3822286A1 (en) * | 2015-01-09 | 2021-05-19 | Ipsen Bioinnovation Limited | Cationic neurotoxins |
| US11268080B2 (en) * | 2015-03-26 | 2022-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered botulinum neurotoxin |
| US11753633B2 (en) * | 2015-08-27 | 2023-09-12 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for treatment of pain |
| GB201607901D0 (en) * | 2016-05-05 | 2016-06-22 | Ipsen Biopharm Ltd | Chimeric neurotoxins |
| CN109476713A (zh) * | 2016-06-08 | 2019-03-15 | 儿童医学中心公司 | 工程改造的肉毒杆菌神经毒素 |
| PL3481852T3 (pl) * | 2016-07-08 | 2023-07-24 | Children's Medical Center Corporation | Nowa neurotoksyna botulinowa i jej pochodne |
| US11117935B2 (en) * | 2016-08-24 | 2021-09-14 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered botulinum neurotoxin |
| MX2019009860A (es) * | 2017-03-24 | 2019-10-15 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Uso mejorado de neurotoxina botulinica en el tratamiento de sialorrea. |
| US10329543B2 (en) * | 2017-10-23 | 2019-06-25 | Poseida Therapeutics, Inc. | Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same |
| KR20200115584A (ko) * | 2018-01-30 | 2020-10-07 | 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 | 바실루스 시스템을 이용한 보툴리눔 신경독소의 생산 |
| WO2019210219A1 (en) * | 2018-04-27 | 2019-10-31 | Krystal Biotech, Inc. | Recombinant nucleic acids encoding cosmetic protein(s) for aesthetic applications |
-
2016
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