ES2865259T3

ES2865259T3 - Chips, detectores y métodos para fabricarlos y utilizarlos

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Publication number: ES2865259T3
Application number: ES16828315T
Authority: ES
Inventors: Ashutosh Chilkoti; Angus Hucknall
Original assignee: Sentilus Holdco LLC
Current assignee: Sentilus Holdco LLC
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2036-07-15
Also published as: JP6962914B2; EP3325966A4; US20180217136A1; EP3325966A1; EP3325966B1; WO2017015132A1; JP2018529977A; US11169150B2; US20220120739A1; JP2021192035A; CA2993002A1

Abstract

Un chip que comprende un canal que lo atraviesa y una capa de polímero no incrustante dispuesta en al menos una superficie del canal, en donde el canal está sustancialmente incluido dentro del chip, en donde el chip comprende además al menos un agente de captura que está unido directamente, de forma no covalente, a la capa de polímero no incrustante, en donde la capa de polímero no incrustante comprende un homopolímero de metacrilato de metilo de oligoetilenglicol polimerizado (OEGMA) terminado en hidroxi, o un copolímero de OEGMA terminado en metoxi y OEGMA terminado en hidroxi, y en donde la capa de polímero no incrustante tiene un grosor de 10 a 150 nm.

Description

DESCRIPCIÓN

Chips, detectores y métodos para fabricarlos y utilizarlos

Antecedentes

El creciente impulso tecnológico hacia la detección ultrasensible en matrices biomoleculares-ADN, proteínas e hidratos de carbono-, requiere de manera similar señales de fondo extremadamente bajas para poder alcanzar una SNR (siglas del inglés, signal-to-noise ratio, relación señal/ruido) alta. Sin embargo, la mayoría de las modificaciones químicas de la superficie disponibles en el comercio tienen habitualmente una autofluorescencia alta o unión inespecífica de reactivos y analitos. Este problema es cada vez más crucial cuando el tamaño de los puntos de las micromatrices usadas habitualmente se vuelve cada vez más pequeño, incluso hasta la escala de longitud submicrométrica. Aunque algunas de las técnicas actuales de modificación de superficies funcionan bien para las micromatrices, el uso rutinario de micromatrices y nanomatrices para biomoléculas sigue planteando retos sustanciales a la hora de diseñar un sistema de detección que sea capaz de resistir la adsorción inespecífica de biomoléculas hasta el nivel de pg/cm2 y que permita la detección directa de analitos sin necesidad de técnicas de amplificación elaboradas y costosas.

Los métodos actuales de detección de enfermedades infecciosas (EI) adolecen de varias deficiencias, incluyendo coste elevado, la complejidad del ensayo, el tiempo necesario para realizar el ensayo y la sensibilidad del mismo.

Coste

La prueba más precisa basada en inmunoensayos para un solo marcador de enfermedad infecciosa se conoce como ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA, de enzyme-linked immunosorbent assay) que cuesta aproximadamente 16 USD y requiere un promedio de 6 horas de tiempo del técnico por cada marcador probado. Las recientes mejoras que permiten la multiplexación son capaces ahora de realizar pruebas para una matriz de cuatro agentes infecciosos a un coste de aproximadamente 14 USD y requieren un promedio de aproximadamente 4,5 horas de tiempo del técnico. Sin embargo, estas pruebas requieren el uso de equipos de laboratorio por un valor aproximado de 110000 a 160000 USD. Además, cada prueba requirió el uso de aproximadamente 200 pl de suero o plasma, que puede separarse de una muestra de sangre completa extraída de un paciente mediante una extracción de sangre venosa. Esta extracción de sangre generalmente se toma en el lugar de atención (POC, por sus siglas en inglés) y después se lleva a un laboratorio centralizado para realizar la prueba real.

Sigue existiendo la necesidad en la técnica de un dispositivo que reduzca significativamente los costes al optimizar los aspectos clave de la recogida, el procesamiento y el análisis de las muestras. De forma ideal, dicho dispositivo debería proporcionar: (1) la eliminación de todo el preprocesamiento analizando directamente la sangre entera sin diluir obtenida de una punción digital; (2) la miniaturización de la prueba para disminuir la cantidad de reactivos, los antígenos proteicos que se aplican puntualmente como agentes de captura y los anticuerpos de detección; y (3) el procesamiento en el sitio en una sola etapa. Además, la prueba debe poder multiplexarse y dirigirse a un panel de EI sin que el coste aumente significativamente respecto al de una prueba para una sola EI. Estas mejoras deben lograrse sin el uso de preprocesamiento de muestras o el uso de microfluidos para separar las células de las soluciones de analito.

Una prueba multiplexada tendría ventajas adicionales. Se ha dado mucha prioridad a las EI que reciben la mayor atención de los medios, tales como el VIH, lo que ha dado lugar a una falta de deseo o apremio por parte de la población en general de someterse a las pruebas de otras EI. Una solución adecuada a este problema es proporcionar una prueba para todo un panel de EI siempre que se solicite una prueba para una sola EI, lo que puede suponer solo un coste adicional en relación con una prueba dirigida a una sola EI. La miniaturización de los dispositivos puede reducir los costes debido al uso de cantidades de picolitros de los reactivos de captura y anticuerpos de detección en los dispositivos. La multiplexación también podría ayudar a paliar la incomodidad que sufren algunas personas al solicitar una prueba específica para una enfermedad estigmatizada como el VIH, ya que sería una de varias EI que se encuentran en el chip. Tener una prueba multiplexada que cubra muchas EI, incluidas las EI alimentarias y las transmitidas por el aire, permitiría a las personas sentirse menos aprensivas a la hora de solicitar las pruebas. Además, la miniaturización del dispositivo para reducir las cantidades necesarias de agente de captura, elimina eficazmente uno de los costes más significativos en las pruebas convencionales de detección de EI de laboratorio, tales como ELISA en placas. Asimismo, al emplear técnicas de impresión por inyección de tinta desarrolladas recientemente, se pueden fabricar chips sensores desechables, multiplexados, a un coste del orden de varios céntimos por chip.

Se pueden lograr reducciones de costes adicionales reduciendo la dependencia de una infraestructura de atención médica muy desarrollada. Por ejemplo, las clínicas itinerantes de los países en desarrollo tienen tiempo y personal limitados y una prueba multiplexada con procesamiento de una sola etapa, en el sitio, aumenta significativamente el rendimiento de los pacientes y el número de infecciones detectadas. Además, la creación de un ensayo multiplexado, miniaturizado, elimina enormes cantidades de materiales y reduce significativamente la carga de transporte y almacenamiento.

Simplicidad del ensayo y tiempo de lectura

Las personas que se han sometido a una prueba de EI señalan que el angustioso periodo de espera (con frecuencia de días a semanas) que precede a la notificación de los resultados es incómodo y un motivo para evitar futuras pruebas. Más del 50 % de los pacientes no regresan si se requiere una segunda visita para recibir los resultados de las pruebas. Los estudios también han mostrado que hasta el 50 % de los pacientes se irán antes de recibir los resultados de las pruebas si el tiempo de espera es de 100 minutos y aproximadamente el 20 % de los pacientes se irán si el tiempo de espera es de 50 minutos. Se necesita una prueba rápida para garantizar que tanto la prueba como el resultado se proporcionen durante una sola visita, eliminando así la necesidad de que los pacientes proporcionen información de contacto para la notificación de los resultados (proporcionar esta información puede generar preocupaciones sobre la privacidad del paciente, otra razón para evitar la prueba).

Las pruebas que requieren muestras de sangre total extraídas por venopunción requieren un esfuerzo significativo, tiempo y la disponibilidad de trabajadores altamente cualificados. Además de la extracción real de la muestra de sangre, muchos diagnósticos requieren que la sangre se separe en células y plasma. Esto requiere equipo y experiencia adicionales, mayor coste del ensayo y tiempo de lectura, y limita la capacidad de proporcionar un diagnóstico en el lugar de atención. Adicionalmente, el proceso de venopunción en sí mismo puede provocar complicaciones médicas en los pacientes, y la fuerte aversión que muchas personas sienten hacia las agujas y la venopunción. Todas estas preocupaciones se pueden reducir creando una prueba que sea capaz de detectar un panel de EI en solo algunos microlitros de sangre, que se pueden obtener fácilmente mediante una punción digital. Además, al crear una prueba con la capacidad de detectar múltiples dianas en solo algunos microlitros de sangre, es posible aumentar el acceso a las pruebas de los recién nacidos, donde la extracción de mayores cantidades de sangre es problemática y, con frecuencia, requiere una transfusión de sangre en el momento de la extracción de sangre debido a la cantidad de sangre necesaria.

Se necesita un dispositivo que elimine la necesidad de microfluidos costosos o complejos, lo que reduce el coste previo al chip y elimina una de las principales causas de fallo tan comunes en la mayoría de los diseños contemporáneos de "nanolaboratorio" (lab-on-a chip) cuando se prueban realmente sobre el terreno con muestras clínicas.

Se puede lograr un mayor rendimiento de las pruebas de EI reduciendo los materiales necesarios (p. ej., la eliminación de agujas y viales de recogida de sangre, así como la preocupación por su correcta eliminación). Además, el único artículo desechable creado en los dispositivos y métodos de la presente divulgación, aparte de la lanceta para pinchar el dedo, es un trozo pequeño de vidrio o plástico, que sirve como superficie de contacto con la sangre del ensayo. Miles de estos podrían desinfectarse con un solo litro de solución de lejía, y la eliminación de estas superficies podría hacerse en la basura normal. Adicionalmente, las pruebas en entornos con pocos recursos suelen realizarse en regiones aisladas. Aunque llevar las pruebas a estas zonas aumenta el acceso, es frecuente que no haya ningún tipo de seguimiento o que éste se produzca después de largos periodos de tiempo. Además, la comunicación presencial es, con frecuencia, la única opción, ya que otros métodos, tales como el correo, el teléfono o el correo electrónico, no están disponibles o son poco fiables. Por estos motivos, los resultados rápidos son esenciales. Como se ha mencionado anteriormente, para estas situaciones, se dispone de opciones tales como las pruebas basadas en tiras de flujo lateral, pero su sensibilidad es limitada y el potencial de las pruebas multiplexadas en este formato también es limitado.

Sensibilidad

Un dispositivo novedoso que aborde los problemas descritos anteriormente también debe proporcionar la sensibilidad que se encuentra en las pruebas de laboratorio convencionales, tales como ensayos ELISA en placas, con las ventajas de los ensayos de tiras de flujo lateral económicos, portátiles y de resultados rápidos. Preferentemente, dichos dispositivos novedosos deberían alcanzar niveles de sensibilidad antes inalcanzables debido a la eliminación del ruido de fondo en los bioensayos que surgen de la adsorción accidental de las proteínas.

Normalmente, los ensayos más sensibles requieren el apoyo de una infraestructura sanitaria tecnológicamente sofisticada y de gran capital. Con los métodos actuales, las muestras de los pacientes tomadas en el lugar de atención se pueden llevar a un laboratorio que mantenga el equipo y el personal necesarios para realizar la prueba real. Los entornos de bajos recursos sencillamente no tienen acceso a tales instalaciones, lo que impide que estas zonas tengan acceso a los diagnósticos más sensibles. Un dispositivo novedoso debería ofrecer análisis en el sitio, lo que permite utilizar el diagnóstico muy sensible en entornos donde la infraestructura de atención médica está menos desarrollada.

Incluso en países donde la infraestructura no está bien desarrollada, los teléfonos móviles son cada vez más omnipresentes. Esto supone una oportunidad de utilizar la tecnología de los teléfonos móviles para proporcionar un novedoso dispositivo de diagnóstico. Un dispositivo de diagnóstico basado en teléfonos móviles sería útil en un entorno POC por dos razones: en primer lugar, permite reutilizar el teléfono móvil como detector de imágenes de fluorescencia y, en segundo lugar, permite que los datos se comuniquen por teléfono móvil a un especialista en atención médica en un lugar remoto, tal como una clínica o un hospital. Si en el POC hay suficientes conocimientos, entonces el teléfono móvil puede usarse simplemente para obtener una imagen de los datos producidos por el dispositivo de diagnóstico y para procesar los datos, para llegar a una concentración de analito que pueda ser interpretada por el profesional para llegar a un diagnóstico. Sin embargo, en los casos en los que el paciente se autoadministre la prueba o cuando la persona que la administre no sea un profesional sanitario, los datos se pueden enviar a través del teléfono móvil a un profesional sanitario situado en otro lugar, que después pueda llegar a un diagnóstico y prescribir un tratamiento. Esto es especialmente útil para el personal militar que se encuentra en lugares remotos.

Estas y otras necesidades se satisfacen mediante la presente invención. La presente invención proporciona un chip que utiliza un cepillo único de polímero resistente a células y proteínas que permite llevar a cabo fluoroinmunoensayos de sangre completa con un límite de detección de hasta femtomolar. El cepillo de polímero proporciona un recubrimiento superficial económico capaz de eliminar la adsorción inespecífica de biomoléculas y células. Además, la propiedad estabilizadora de proteínas de la presente divulgación permite el transporte y el almacenamiento de los chips a temperatura ambiente, evitando la necesidad de un costoso almacenamiento y transporte con control climático. Los pequeños volúmenes de muestra necesarios dan lugar a un rápido rendimiento de los ensayos descritos en el presente documento, lo que permite obtener resultados en un periodo de 5 minutos. Además, los dispositivos y métodos descritos en el presente documento también tienen el potencial de tener un impacto significativo en la detección de EI de los recién nacidos, que a menudo es necesaria cuando no se dispone del historial médico de la madre (p. ej., en zonas de guerra, hambruna y conflictos), o se puede investigar la posible transmisión de una EI conocida de la madre al recién nacido. Por último, al basarse en la difusión para reunir dos conjuntos de reactivos espacialmente separados para generar una señal, los dispositivos y métodos descritos en el presente documento eliminan la necesidad de etapas de lavado o transferencia de líquidos.

Hyun et al 2006 Biomaterials 27: 1444-1451 se refieren a la creación de patrones de células en microestructuras muy deformables y analizan el efecto de la deformación plástica del sustrato sobre el fenotipo celular y la expresión génica.

El documento WO 2007/035527 analiza métodos de amplificación de señales y modificación de superficies poliméricas no incrustantes para la detección biomolecular.

El documento WO 2013/003624 analiza la captura, purificación y liberación de sustancias biológicas mediante el uso de un recubrimiento superficial.

El documento US 2013/157889 analiza dispositivos y métodos para detectar analitos en una muestra.

Breve sumario

La invención se expone en las reivindicaciones y proporciona un chip que comprende un canal que lo atraviesa y una capa de polímero no incrustante dispuesta en al menos una superficie del canal, en donde el canal está sustancialmente incluido dentro del chip, en donde el chip comprende además al menos un agente de captura que está unido directamente, de forma no covalente, a la capa de polímero no incrustante, en donde la capa de polímero no incrustante comprende un homopolímero de metacrilato de metilo de oligoetilenglicol polimerizado (OEGMA) terminado en hidroxi, o un copolímero de OEGMA terminado en metoxi y OEGMA terminado en hidroxi, y en donde la capa de polímero no incrustante tiene un grosor de 10 a 150 nm.

La invención también proporciona un detector que comprende:

el chip de la invención;

un cuerpo configurado para aceptar el chip

una tapa que, en combinación con el cuerpo, rodea sustancialmente el chip cuando el chip

está dispuesto en el cuerpo; y

una fuente de luz que se coloca para emitir una luz de una primera longitud de onda de manera que la luz entre en contacto con la capa de polímero no incrustante.

La invención proporciona además un método para fabricar el chip de la invención, que comprende depositar al menos un agente de captura en una capa de polímero no incrustante, en donde el polímero no incrustante está dispuesto en al menos una superficie del canal y en donde el canal está sustancialmente incluido dentro del chip.

Además, la invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de un analito, que comprende:

a) poner en contacto el chip de la invención con una muestra; y

b) determinar la presencia o ausencia del analito,

en donde una señal detectable del chip indica la presencia del analito, o la ausencia

de una señal detectable del chip indica la ausencia del analito.

Las realizaciones de la invención proporcionadas en este breve sumario están destinadas a ser solo ilustrativas y a proporcionar una visión general de realizaciones selectivas desveladas en el presente documento. El breve sumario, que es ilustrativo y selectivo, no limita el alcance de ninguna reivindicación, no proporciona el alcance completo de las realizaciones de la invención desveladas o contempladas en el presente documento y no debe interpretarse como una limitación o restricción del alcance de la presente divulgación o de cualquier realización de la invención reivindicada.

En el presente documento se proporciona un chip que comprende un canal a través del mismo y una capa de polímero no incrustante contenida en el canal, estando el canal sustancialmente incluido dentro del chip. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede comprender un primer sustrato y un segundo sustrato conectado al primer sustrato, con el canal desplazado entre el primer sustrato y el segundo sustrato. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede comprender además un medio para adherir el primer sustrato al segundo sustrato. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el primer sustrato o el segundo sustrato pueden estar compuestos sustancialmente de vidrio. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el primer sustrato o el segundo sustrato pueden estar compuestos sustancialmente de plástico. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede comprender además una capa de polímero de enlace situada junto a la capa de polímero no incrustante y unida a ella de forma covalente. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la capa de polímero de enlace puede ligar la capa de polímero no incrustante a un sustrato. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede ser sustancialmente transparente. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip no comprende un componente electrónico integrado en el chip. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip no comprende un pocillo individual, segregado. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip no comprende un componente de extracción de plasma. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede tener solo un canal. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede tener dos o más canales. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el canal puede ser lineal. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip se puede configurar de modo que se pueda introducir una muestra en cualquier extremo del canal. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip no contiene un medio para mover activamente una muestra a través del canal. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip no contiene un dispositivo para mover activamente una muestra a través del canal. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede tener un código de barras. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip no tiene código de barras. En la invención descrita en el presente documento, la capa de polímero no incrustante comprende un polímero en cepillo de botella que es un homopolímero de metacrilato de metilo de oligoetilenglicol polimerizado (OEGMA) terminado en hidroxi, o un copolímero de OEGMA terminado en metoxi y OEGMA terminado en hidroxi. En la invención, la capa de polímero no incrustante tiene un grosor de 10 a 150 nm.

En la invención descrita en el presente documento, la capa de polímero no incrustante comprende al menos un agente de captura que está unido directamente, de forma no covalente, a la capa de polímero no incrustante. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, se puede definir la posición de la al menos una región de captura. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de captura puede unirse preferentemente a un analito. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el analito puede ser o puede comprender un antígeno de superficie, un antígeno en solución o un antígeno unido. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el analito puede ser o puede comprender un antígeno de grupo sanguíneo B humano, un antígeno de grupo sanguíneo A humano, un antígeno de factor Rh humano o cualquier combinación de los mismos. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de captura puede ser una macromolécula. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de captura puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de captura puede ser o puede comprender un antígeno polinucleotídico, un antígeno de ARN, un antígeno de ADN, un antígeno proteico, un antígeno peptídico, un antígeno de hidrato de carbono, un antígeno de aptámero, un antígeno de anticuerpo, un fragmento de los mismos o cualquier combinación de los mismos. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede comprender, unido directamente, de forma no covalente, a la capa de polímero no incrustante, un primer agente de captura que se une a un antígeno de grupo sanguíneo A, un segundo agente de captura que se une a un antígeno de grupo sanguíneo B y un tercer agente de captura que se une a un antígeno del factor Rh. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el primer, segundo y tercer agentes de captura, pueden ocupar posiciones separadas, definidas, de la capa de polímero no incrustante. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el primer, segundo y tercer agentes de captura, pueden ser, individualmente, un anticuerpo o un fragmento del mismo. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, al menos uno del primer, segundo y tercer agentes de captura, pueden ser, individualmente, un anticuerpo de IgM, un anticuerpo de IgA o un anticuerpo de IgG. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede comprender además un anticoagulante sobre la capa de polímero no incrustante. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la capa de polímero no incrustante puede comprender un anticoagulante. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el anticoagulante puede estar unido directamente, de forma no covalente, a la capa de polímero no incrustante. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el anticoagulante puede ocupar una o más posiciones separadas, definidas, en la capa de polímero no incrustante. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el anticoagulante puede ser heparina, una heparina de bajo peso molecular o una combinación de las mismas. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede tener un límite de detección (LOD, limit of detection) de un analito de aproximadamente 100fg/ml. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la capa de polímero no incrustante puede comprender además al menos una región lábil que comprende un agente de detección. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, se puede definir la posición de la al menos una región lábil. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de detección puede no estar unido directamente, de forma no covalente, a la capa de polímero no incrustante. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el al menos un agente de detección puede disolverse al menos parcialmente o dispersarse en una muestra después del contacto con la muestra. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la muestra puede ser un líquido que contenga al menos un analito. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el líquido puede ser sangre. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el líquido puede ser plasma, suero, orina, sudor o saliva. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de detección puede ser una macromolécula. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de detección puede ser un polinucleótido, ARN, ADN, una proteína, un péptido, un aptámero, un anticuerpo, un fragmento de los mismos o cualquier combinación de los mismos. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de detección puede estar marcado. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de detección puede ser un anticuerpo marcado o fragmento del mismo. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de detección se puede marcar con un fluoróforo, un cromóforo, un radiomarcador, un polinucleótido, una pequeña molécula, una enzima, una nanopartícula, una micropartícula o un punto cuántico. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la nanopartícula puede ser una nanopartícula de metal noble. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la capa de polímero no incrustante puede comprender un excipiente. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el excipiente puede ser una sal hidrosoluble, un hidrato de carbono, un emulsionante, un polímero hidrosoluble o cualquier combinación de los mismos. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el hidrato de carbono puede ser glucosa, fructosa, xilosa, manosa, trehalosa, galactosa, sacarosa o lactosa. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el polímero hidrosoluble puede ser polietilenglicol (PEG). En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede comprender un primer agente de detección que se une a un antígeno de grupo sanguíneo A, un segundo agente de detección que se une a un antígeno de grupo sanguíneo B y un tercer agente de captura que se une a un antígeno del factor Rh. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el primer, segundo y tercer agentes de detección pueden ocupar posiciones separadas, definidas, de la capa de polímero no incrustante. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el canal se puede ubicar en la zona central dentro del chip. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el canal puede tener un volumen de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 500 pl. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, se puede ubicar un agente de detección corriente abajo de un agente de captura con relación al punto de entrada de un analito en el chip. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, un agente de captura y un agente de detección pueden unirse al mismo analito. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, un agente de captura y/o un agente de detección puede conservar al menos aproximadamente el 50 % de la actividad de unión durante al menos aproximadamente 2 meses a una temperatura de aproximadamente 25 °C, cuando el chip se almacena de manera que la capa de polímero no incrustante pueda comprender agua de hidratación, pero no agua a granel. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede tener forma cilíndrica. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la acción capilar es capaz de extraer una muestra a través del canal. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede configurarse para estar contenido y completamente rodeado por un detector. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la capa de polímero no incrustante puede extenderse a lo largo del canal. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el chip puede comprender además un dique. En el presente documento también se desvela un detector. En el presente documento también se proporciona un detector que comprende un chip de la invención. En el presente documento también se proporciona un método para fabricar un chip de la invención. En el presente documento también se proporciona un método para detectar la presencia o la ausencia de un analito.

Una divulgación proporciona un sistema para detectar un analito. Normalmente, el sistema comprenderá un chip, un detector y un teléfono móvil. Los chips para usar en los sistemas desvelados en el presente documento comprenden una capa de polímero no incrustante. Los chips comprenden además al menos uno de un agente de captura y un agente de detección dispuesto sobre la capa de polímero no incrustante. En algunas divulgaciones, el agente de captura está unido de forma no covalente a la capa de polímero no incrustante. Puede usarse un sistema para detectar cualquier analito. Los ejemplos de un analito adecuado incluyen, pero sin limitación, un analito que es o que comprende: un antígeno del grupo sanguíneo A humano; un antígeno del grupo sanguíneo B humano; un antígeno del grupo sanguíneo AB humano; un antígeno del grupo sanguíneo O humano; un antígeno del factor Rh humano; una glucoforina; un agente de peligro biológico; un antígeno de un agente infeccioso; un antígeno de cáncer; un antígeno asociado a enfermedad cardiovascular; un antígeno asociado a una enfermedad metabólica; cualquier combinación de los antígenos enumerados anteriormente; o un anticuerpo que reconozca cualquiera de los antígenos enumerados anteriormente. En algunas divulgaciones, el agente de detección comprende un fluoróforo y el detector comprende una fuente de luz que emite una longitud de onda de luz que excita el fluoróforo. Los sistemas desvelados en el presente documento incluyen cualquiera de los chips descritos en el presente documento en combinación con cualquiera de los detectores descritos en el presente documento.

En el presente documento también se desvela un método de detección de una enfermedad o de un trastorno en un sujeto. En el presente documento también se desvela un ensayo de diagnóstico para determinar una enfermedad, un trastorno o un estado biológico en un sujeto. En algunas de las divulgaciones descritas en el presente documento, un ensayo puede ser un ensayo en el lugar de atención. En el presente documento también se desvela un equipo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra el diseño de un ensayo en el lugar de atención (POC) de difusión bidimensional en un cepillo de poli metacrilato de metilo de oligo(etilenglicol) (POEGMA). En el chip recubierto con cepillo de POEGMA se imprimen dos tipos de puntos: (1) Puntos "estables" de anticuerpo de captura, que capturan el analito de la sangre y forman la mitad inferior del complejo de detección, y (2) puntos "solubles" del anticuerpo de detección que se difunden desde sus puntos impresos tras entrar en contacto con la sangre y forman la mitad marcada del complejo de detección.

La figura 2 ilustra el flujo de trabajo de una prueba (test) D4 POC (D4 POC) (D4 = distribuir, disolver, difundir, detectar). (A) Chip de micromatriz antes de la introducción de sangre. (B-E) Introducción de sangre de punción digital por capilaridad. (F) Conexión del dispositivo al teléfono. (G) Inserción del chip en el dispositivo. (H) Colocación de la tapa en el dispositivo. (I) Dispositivo listo para la captura de imágenes con la cámara del teléfono. (J) La imagen del teléfono de la micromatriz después de la adición de captura de imágenes e iluminación del reverso de la sangre elimina la interferencia óptica de la sangre. (K) Esquema en corte del diseño del detector.

La figura 3 ilustra la síntesis de cepillos de POEGMA sobre vidrio mediante SI-ATRP. Se funcionalizan portaobjetos de vidrio limpios con APTES en la etapa 1 y los grupos amina en la monocapa de silano se usan para unir un iniciador ATRP en la etapa 2. A continuación, los portaobjetos se sumergen en una solución de monómero de OEGMA y catalizador para hacer crecer los cepillos de POEGMA en el portaobjetos mediante SI-ATRP.

La figura 4 ilustra (A) Imagen de una micromatriz de IL-6 habitual con identificación de suero. (B) Curvas de respuesta a la dosis de OPG en tampón y suero en cepillo de POEGMA. (C) Curvas de respuesta a la dosis de IL-6 en suero en cepillo de POEGMA y nitrocelulosa. (D) Curva de respuesta a la dosis para una micromatriz de IL-6 con identificación de sangre completa. En B-D, la ordenada muestra la intensidad promedio de fluorescencia con fondo restado en puntos y el eje X muestra la concentración de analito en solución. Las barras de error son una desviación típica.

La figura 5 ilustra la prueba de principio de viabilidad de imprimir puntos de agentes de captura estables y puntos de agentes de detección lábiles en la misma superficie. Los puntos lábiles de Cy5-estreptavidina se disolvieron en solución y se unieron a puntos estables de Ab biotinilado después de la adición de una gota de tampón al chip.

La figura 6 ilustra un portaobjetos de vidrio con un cepillo de POEGMA estampado con una cuadrícula de cera. (A) La micromatriz de anticuerpos se aplica puntualmente en el centro de un solo corral de cera. (B) Ampliación de la matriz de anticuerpos de captura interna 4x4 rodeada de micropuntos que contienen reactivos de detección fluorescentes solubles. Las imágenes en (A) se obtuvieron con una cámara digital, mientras que (B) se obtuvo mediante un explorador de portaobjetos de micromatrices de fluorescencia.

La figura 7 ilustra un ensayo ilustrativo. (A) Distribuir sangre, (B) incubar durante 5 min; y (C) lavar con 1 ml de un frasco de Visine™.

La figura 8 ilustra los resultados de una D4 POCT ilustrativa para la IgG y la IgM humanas en sangre completa. (A) Ensayo impreso antes de la exposición al líquido. (B)-(D) Después de 10 pl de sangre humana durante 5 minutos seguido de aclarado. (B) Cy5-anti-IgG y Cy5-anti-IgM aplicados puntualmente en las filas externas de puntos de detección "lábiles". (C) Solo Cy5-anti-IgG en puntos de detección lábiles. (D) Solo Cy5-anti-IgM en puntos de detección lábiles. (E) Después de 10 ul de sangre completa de pollo. (F) Después de 10 ul de PBS.

La figura 9 ilustra los resultados de una D4 POCT multiplexada para el PSA y la IL-6 humanos añadidos a sangre completa de pollo. LOD es blanco 3DT.

La figura 10 ilustra la curva de respuesta a la dosis de una D4 POCT del BNP (péptido natriurético cerebral) después de 1 día (triángulos) y 23 días (cuadrados) de almacenamiento a TA después de la impresión. Fila superior: control, fila inferior: BNP.

La figura 11 ilustra un ejemplo de un chip D4 de segunda generación (A). La micromatriz de anticuerpos se imprime en el cubreobjetos inferior del en el centro del canal. Ilustración de cómo se carga sangre en el canal central y se retiene dentro del canal mediante acción capilar (B-D).

La figura 12 ilustra (A) Esquema en corte del diseño del detector óptico D4. El anillo magnético que se une al teléfono móvil está en la parte inferior en (A). El corte muestra la excitación óptica trasera y la lectura de la emisión de fluorescencia. (B) Acoplamiento magnético y alineación óptica del detector al teléfono móvil. (C) Imagen digital de una matriz de anticuerpos de prueba fluorescente. (D) Examen visual de la señal.

La figura 13 ilustra un formato ilustrativo de micromatriz D4 de la alfafetoproteína (AFP) humana. El gradiente de señal producido por la variación de la concentración de AFP dentro de los puntos de control+ actúa como patrón de calibración interna.

La figura 14 ilustra un formato de matriz de prueba. Se imprimen dos matrices separadas, una para puntos de captura anti-AFP y calibrador de AFP y otra para puntos de detección de anti-AFP solubles. El orden en el que estas dos matrices se exponen a la solución de analito se alterna: la sangre entra en contacto inicialmente con puntos de captura primero en el panel A y los puntos de detección primero en el panel B.

La figura 15 ilustra que cada punto de captura estable pueda estar rodeado de puntos de detección lábiles para reducir la distancia de difusión de los anticuerpos de detección.

La figura 16 ilustra una matriz D4 doble ilustrativa para AFP y AFP-L3 con patrones de calibración de control positivo.

La figura 17 ilustra una biointerfaz D4 POCT ilustrativa.

La figura 18 ilustra un formato de matriz de anticuerpos de POEGMA 1. Todos los anticuerpos impresos como se recibieron, diámetro de puntos de aproximadamente 125 micrómetros. Se muestra la imagen de la matriz real impresa dentro del corral de cera en la parte superior, con solapamiento de ubicación de anticuerpos mostrada en la parte inferior. Ubicaciones de anticuerpos en la matriz:_RBC = 33F1 anti-eritrocitos humanos; A = GAMA120 anti-A; B = GAMA110 anti-B; D1 = F8D8 anti-D; D2 = GAMA401 anti-D.

La figura 19 ilustra algunos resultados de una matriz de anticuerpos de POEGMA expuesta a sangre A+: imágenes de la matriz antes del lavado (arriba) y después del lavado y aspiración (abajo). Antes del lavado, los puntos son visibles, pero están oscurecidos por células sedimentadas por gravedad y células en solución.

La figura 20 ilustra los resultados de una matriz de anticuerpos de POEGMA expuesta a sangre A+: imágenes de la matriz después del lavado y aspiración (arriba) y morfología de puntos seleccionados (abajo). Como se esperaba para sangre A+, se produce unión a las filas anti-RBC 1 y 6, fila anti-A 2 y fila anti-D25.

La figura 21 ilustra una matriz de anticuerpos de POEGMA impresa con aditivos de tampón. Todos los anticuerpos se diluyeron a una relación de 1:1 con un tampón de impresión. Los puntos tienen aproximadamente 110 micrómetros de diámetro. Se muestra la imagen de la matriz real impresa dentro del corral de cera en la parte superior, con solapamiento de ubicación de anticuerpos en la parte inferior. Ubicaciones de anticuerpos en la matriz: RBC = 33F1 anti-eritrocitos humanos; A = GAMA120 anti-A; B = GAMA110 anti-B; D1 = F8D8 anti-D; D2 = GAMA401 anti-D.

La figura 22 ilustra los resultados de una matriz de anticuerpos de POEGMA para la detección de antígenos de grupos sanguíneos. Expuesto a sangre A+ (arriba); Expuesto a sangre B+ (centro); Expuesto a sangre O+ (abajo)'. Los resultados muestran que la matriz es específica para los grupos sanguíneos A, B, O.

La figura 23 ilustra los resultados de un anticuerpo de POEGMA para la detección de antígenos de grupos sanguíneos cuando se expone a sangre A+.

La figura 24 ilustra una matriz de anticuerpos de POEGMA para la detección de antígenos de grupos sanguíneos mediante lectura visual. La matriz presenta el grupo sanguíneo como A, B o AB, con signo positivo o negativo. O se indica por la ausencia de A o B. Ubicaciones de anticuerpos en la matriz: RBC = 33F1 anti-eritrocitos humanos; A = GAMA120 anti-A; B = GAMA110 anti-B; D1 = F8D8 anti-D; D2 = GAMA401 anti-D.

La figura 25 proporciona esquemas de una realización de un detector de la invención. La figura 25A es un esquema que muestra una vista desde arriba del detector. La figura 25B es una vista en perspectiva superior. La figura 25C es una vista lateral. La figura 25D es una vista en perspectiva inferior. La figura 25e es una vista en sección transversal a lo largo de un plano que pasa por el eje longitudinal del detector.

La figura 26 proporciona un esquema de un ensayo de unión competitiva para la detección en una sola etapa de secuencias de microARN.

Descripción detallada

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos, en las reivindicaciones y en la descripción del presente documento. Otras características, objetos y ventajas de las realizaciones de la invención desveladas y contempladas en el presente documento, pueden combinarse con cualquier otra realización a menos que se excluyan de forma explícita.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, expresiones abiertas tales como "contienen", "que contienen", "incluyen", "que incluyen", y similares, significan "que comprenden".

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, algunas realizaciones de la presente contemplan intervalos numéricos. Cuando se proporciona un intervalo numérico, el intervalo incluye los puntos finales del intervalo. Los intervalos numéricos incluyen todos los valores y subintervalos en los mismos como si estuvieran escritos de forma explícita.

El término "aproximadamente" puede referirse a más o menos 10-15 % de una indicación numérica a la que se hace referencia.

Los artículos "un", "uno/a", y "el/la" se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo.

Debe entenderse que la expresión "y/o", como se usa en el presente documento, incluye cualquier elemento individual enumerado dentro de la locución relevante, así como cualquier combinación de dos o más elementos, incluyendo todos los elementos.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y/o científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente divulgación.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, un analito es o comprende un antígeno del grupo sanguíneo A humano, un antígeno del grupo sanguíneo B humano, un antígeno del grupo sanguíneo AB humano, un antígeno del grupo sanguíneo O humano, un antígeno del factor Rh humano, un antígeno del grupo sanguíneo MNS humano, un antígeno del grupo sanguíneo P humano, un antígeno del grupo sanguíneo P1PK humano, un antígeno del grupo sanguíneo luterano humano, un antígeno del grupo sanguíneo Kell humano, un antígeno del grupo sanguíneo Lewis humano, un antígeno de grupo sanguíneo Duffy humano, un antígeno del grupo sanguíneo Kidd humano, un antígeno del grupo sanguíneo Diego humano, un antígeno del grupo sanguíneo Yt o Cartwright humano, un antígeno del grupo sanguíneo Xg humano, un antígeno del grupo sanguíneo Scianna humano, un antígeno del grupo sanguíneo Dombrock humano, un antígeno del grupo sanguíneo Colton humano, un antígeno del grupo sanguíneo Landsteiner-Wiener humano, un antígeno del grupo sanguíneo Chido/Rodgers humano, un antígeno del grupo sanguíneo H humano, un antígeno del grupo sanguíneo Hh/Bombay humano, un antígeno del grupo sanguíneo Kx humano, un antígeno del grupo sanguíneo Gerbich humano, un antígeno del grupo sanguíneo Cromer humano, un antígeno del grupo sanguíneo Knops humano, un antígeno del grupo sanguíneo indio humano, un antígeno del grupo sanguíneo Ok humano, un antígeno del grupo sanguíneo Raph humano, un antígeno del grupo sanguíneo John Milton Hagen humano, un antígeno del grupo sanguíneo I humano, un antígeno del grupo sanguíneo li humano, un antígeno del grupo sanguíneo globósido humano, un antígeno del grupo sanguíneo Gill humano, un antígeno del grupo sanguíneo de glucoproteína asociada a Rh humano, un antígeno del grupo sanguíneo Forssman humano, un antígeno del grupo sanguíneo Langereis humano, un antígeno del grupo sanguíneo Junior humano o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra" o "muestra biológica" se refiere a cualquier material que se extraiga de su estado nativo o natural, para facilitar cualquier manipulación deseable o procesamiento y/o modificación adicional. Una muestra o una muestra biológica puede comprender una célula, un tejido, un líquido (p. ej., un líquido biológico), una proteína (p. ej., anticuerpo, enzima, proteína soluble, proteína insoluble), un polinucleótido (p. ej., ARN, ADN), una preparación de membrana y similares, que opcionalmente puede aislarse y/o purificarse adicionalmente de su estado nativo o natural. Un "líquido biológico" se refiere a cualquier líquido procedente de un organismo biológico. Los líquidos biológicos ilustrativos pueden incluir, pero sin limitación, sangre, suero, plasma, líquido linfático, líquido biliar, orina, saliva, moco, esputo, lágrimas, líquido cefalorraquídeo (LCR), lavado broncoalveolar, lavado nasofaríngeo, lavado rectal, lavado vaginal, lavado colónico, lavado nasal, lavado de garganta, líquido sinovial, semen, líquido ascítico, pus, leche materna, líquido del oído, sudor y líquido amniótico. Un líquido biológico puede estar en su estado natural o en un estado modificado mediante la adición de componentes tales como reactivos o la eliminación de uno o más constituyentes naturales (p. ej., plasma sanguíneo). Una muestra o muestra biológica puede ser, por ejemplo, sangre, plasma, linfa, vírica, bacteriana, una muestra de ser humano, una muestra de ser humano enfermo, una muestra de animal, una muestra de animal enfermo, saliva, moco, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido estomacal, líquido intestinal, líquido citoplasmático u otro tipo de muestra.

Como se usa en el presente documento, el término "biomarcador" se refiere a una sustancia que está asociada a un estado biológico o a un proceso biológico, tal como una patología o un indicador de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad o trastorno (p. ej., un indicador que identifica la probabilidad de la existencia o el desarrollo posterior de una enfermedad o trastorno). La presencia o la ausencia de un biomarcador, o el aumento o la disminución de la concentración de un biomarcador, puede estar asociado a y/o ser indicativo de un estado o proceso particular. Los biomarcadores pueden incluir, pero sin limitación, células o componentes celulares (p. ej., una célula vírica, una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula cancerosa, etc.), moléculas pequeñas, lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, enzimas, antígenos y anticuerpos. Un biomarcador puede proceder de un agente infeccioso, tal como una bacteria, hongo o virus, o puede ser una molécula endógena que se encuentra en mayor o menor abundancia en un sujeto que padece una enfermedad o un trastorno en comparación con un individuo sano (p. ej., un aumento o una disminución de la expresión de un gen o producto génico).

Como se usa en el presente documento, la expresión "resto de detección" es cualquier resto o compuesto que sea detectable mediante métodos que incluyen, pero sin limitación, espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos, electroquímicos, radioactividad y otros medios físicos. Un resto de detección puede detectarse indirectamente; por ejemplo, el resto de detección puede ser un resto o un compuesto que sea miembro de un par de unión específica, en donde el segundo miembro del par de unión puede incluir un resto de detección que puede detectarse directamente. Un ejemplo conocido y no limitativo de dicho resto de detección es la biotina, que puede unirse a avidina o a estreptavidina que comprende un resto de detección tal como un fluoróforo. Los restos de detección ilustrativos pueden incluir, pero sin limitación, fluoróforos, cromóforos, radiomarcadores, polinucleótidos, moléculas pequeñas, enzimas, nanopartículas y convertidores elevadores.

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad infecciosa" (abreviada en el presente documento como EI) se refiere a las enfermedades que son provocadas por agentes infecciosos que incluyen, pero sin limitación, microbios tales como, por ejemplo, virus, bacterias, arqueas, planaria, ameba y hongos.

El término "polímero", como se usa en el presente documento, tiene su significado habitual como se usa en la técnica, es decir, una estructura molecular que presenta una o más unidades repetidas (monómeros), conectadas por enlaces covalentes. Las unidades repetidas pueden ser todas idénticas o, en algunos casos, puede haber más de un tipo de unidad repetida presente dentro del polímero. Se entiende que el término polímero abarca cualquier tipo de polímero, incluyendo homopolímeros, copolímeros (p. ej., copolímeros aleatorios, copolímeros en bloque, copolímeros de injerto, etc.), y mixturas, combinaciones y mezclas de los mismos. Los polímeros pueden ser lineales, ramificados, con forma de estrella, etc.

Como se usa en el presente documento, el término "región" se refiere a un área definida en la superficie de un material. Una región puede identificarse y delimitarse por una interfaz definida entre dos materiales que tienen composiciones diferentes.

"Par de unión específica", como se usa en el presente documento, se refiere a dos moléculas que presentan unión específica entre sí o unión aumentada entre sí en relación con otras moléculas. Un par de unión específica puede presentar actividad de unión funcional tal como, por ejemplo, un receptor y un ligando (tal como un fármaco, proteína o hidrato de carbono), un anticuerpo y un antígeno, etc.; o actividad de unión estructural tal como, por ejemplo, proteína/péptido y proteína/péptido; proteína/péptido y ácido nucleico; y nucleótido y nucleótido, etc. Normalmente, un miembro del par de unión puede actuar como agente de captura en los dispositivos descritos en el presente documento, y el agente de captura puede unirse al segundo miembro del par de unión, que puede estar presente como analito en una muestra, tal como un líquido biológico. "Analito", como se usa en el presente documento, puede ser cualquier segundo miembro de un par de unión específica, como se ha descrito anteriormente. Normalmente, el analito es un constituyente de, o se encuentra en, una muestra tal como un líquido biológico. El analito puede ser un biomarcador como se ha descrito anteriormente.

Como se usa en el presente documento, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a animales tanto humanos como no humanos. La expresión "animales no humanos" puede incluir a todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, incluyendo, pero sin limitación, primates no humanos, oveja, perro, gato, caballo, vaca, pollos, anfibios, reptiles y similares. En determinadas realizaciones, el sujeto es un paciente humano.

Como se usa en el presente documento, ARNt significa ARN de transferencia.

Como se usa en el presente documento, ARNr significa ARN ribosómico.

Como se usa en el presente documento, ARNm significa ARN mensajero.

Como se usa en el presente documento, ARNip significa ARN de interferencia pequeño.

Como se usa en el presente documento, miARN significa microARN.

Como se usa en el presente documento, un híbrido de ADN-ARN es un polinucleótido monocatenario que contiene tanto ADN como ARN. El híbrido de ADN-ARN se puede hibridar, p. ej., con una sonda polinucleotídica.

Como se usa en el presente documento, una sonda selectiva se puede unir a más de un ARN diana, pero no se une igualmente a los ARN diana.

Como se usa en el presente documento, una sonda polinucleotídica específica se une a un solo ARN diana.

En el presente documento se desvela un método para detectar un ARN diana, que comprende:

a) hibridar un ARN diana con una sonda polinucleotídica;

b) extender el ARN diana hibridado con al menos un trifosfato de desoxirribonucleótido para formar un híbrido de ARN-ADN;

c) extender el híbrido de ARN-ADN con al menos un trifosfato de desoxirribonucleótido para formar un híbrido de ARN-ADN extendido; y

d) detectar la presencia del ARN diana detectando la presencia del híbrido de ARN-ADN extendido.

El método se puede realizar sobre un soporte, que puede ser un soporte sólido. El método se puede realizar en una capa o parte del soporte sólido que está asociada con una sonda polinucleotídica.

El método se puede usar para diagnosticar una enfermedad o afección cuando se detecta la presencia de un ARN diana asociado a la enfermedad o afección. Sin ser limitativo, la enfermedad o afección puede ser, por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del herpes simple (VHS), virus del herpes simple-1 (VHS-1), virus del herpes simple-2 (VHS-2), virus del papiloma humano (VPH), virus del papiloma humano-16 (VPH-16), virus del papiloma humano-18 (VPH-18), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis A (VHA), citomegalovirus, tuberculosis, clamidia, gonorrea, sífilis, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), paperas, sarampión, cólera, fiebre tifoidea, fiebre reumática, cáncer, ictus, enfermedad isquémica, enfermedad cardiovascular, enfermedad de Lyme, rabia, gripe, Ébola, embarazo, una infección fúngica, una infección bacteriana, poliomielitis, viruela, diabetes, diabetes de tipo I, diabetes de tipo II, una infección vírica, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad neurodegenerativa y cualquier combinación de las mismas

Se puede cuantificar la cantidad de ARN diana.

El método se puede realizar en una matriz o en una micromatriz.

El método se puede realizar en un dispositivo médico, que puede comprender una matriz o una micromatriz.

Se pueden detectar múltiples ARN diana simultáneamente. Se pueden incluir controles en la matriz o en la micromatriz. Dos o más de las sondas polinucleotídicas pueden ser diferentes cuando se detectan múltiples ARN diana. El soporte sólido o dispositivo médico o la matriz o micromatriz puede contener, por ejemplo, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 5000, aproximadamente 10000, aproximadamente 20000, aproximadamente 50000 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 100000, o al menos 10, al menos 100, al menos 1000, al menos 10000, al menos 100000 sondas polinucleotídicas. Las sondas polinucleotídicas pueden estar, por ejemplo, impresas en la micromatriz de modo que las sondas polinucleotídicas ocupen posiciones definidas en la matriz o micromatriz.

En algunas de las divulgaciones descritas en el presente documento, el soporte, soporte sólido y los dispositivos médicos pueden comprender una capa de sustrato y una capa no incrustante (p. ej., que comprende polímero o polímeros de cepillo), en donde la sonda polinucleotídica está asociada a la capa no incrustante. La sonda polinucleotídica puede estar asociada de forma covalente o no covalente. En algunas de las divulgaciones descritas en el presente documento, la capa no incrustante puede estar asociada de forma no covalente o covalente a un anclaje que está asociado de forma covalente o no covalente a una fijación que está unida de forma covalente a la sonda polinucleotídica. Puede insertarse un espaciador entre la fijación y la sonda polinucleotídica. El espaciador puede ser, por ejemplo, un aminoácido. El aminoácido puede estar, por ejemplo, unido de forma covalente tanto a la fijación como a la sonda polinucleotídica. De este modo, la sonda polinucleotídica, con y sin presencia de un espaciador, se puede anclar a la capa de polímero no incrustante pero no se asocia de forma covalente a la capa no incrustante y no se asocia a ella directamente de forma no covalente. Dicha asociación puede ser, por ejemplo, una asociación indirecta, no covalente.

Los resultados de la detección de un analito se pueden capturar como datos, por ejemplo, se puede capturar una imagen y los datos se pueden transmitir a través de un medio de comunicación, por ejemplo, una línea telefónica, internet, una intranet, un fax, un mensaje de texto, un correo electrónico o una carta.

Los datos pueden ser, por ejemplo, una imagen digital que se puede capturar, por ejemplo, con una cámara digital que puede estar, por ejemplo, incorporada en un teléfono móvil, p. ej., un teléfono inteligente.

De manera sorprendente, los inventores han descubierto que un ARN diana, hibridado con una sonda polinucleotídica, puede alargarse enzimáticamente (p. ej., puede tener bases de ADN (desoxirribonucleótidos) añadidas) y que el híbrido de ADN-ARN resultante, puede detectarse. La detección puede producirse, por ejemplo, sin el uso de transcripción inversa de ARN a ADN, sin amplificación de ADN y sin secuenciación de a Dn o ARN diana.

Los desoxirribonucleótidos se pueden añadir, por ejemplo, a un extremo 3' saliente (p. ej., no hibridado) de un ARN diana, donde una parte del ARN diana se puede hibridar con una sonda polinucleotídica.

El ARN diana puede proceder u obtenerse de una muestra biológica. La muestra biológica se puede someter a lisis.

El ARN diana puede ser sintético y puede ser una secuencia que se encuentre en la naturaleza o una secuencia que no se encuentre en la naturaleza, o un fragmento de la misma.

Un marcador puede ser un colorante fluorescente. Se pueden detectar los colorantes fluorescentes en gotas en tiempo real con alta resolución y la disponibilidad de muchos colorantes fluorescentes con distintas longitudes de onda de excitación y emisión permite supervisar muchos marcadores en un experimento. Se pueden seleccionar conjuntos de colorantes fluorescentes para permitir la detección simultánea de más de un colorante en la misma reacción. Un conjunto de colorantes que se pueden detectar al mismo tiempo puede incluir, pero sin limitación, Cy3, Cy5, FAM, JOE, TAMRA, ROX, dR110, dR6G, dTAMRA, dROX o cualquier mezcla de los mismos. Cualquiera de esos colorantes se puede usar individualmente o en cualquier combinación para llevar a la práctica una realización del presente documento. Un colorante puede permitir la detección de una sola molécula. Se ha sintetizado una gran cantidad de colorantes fluorescentes y están disponibles en el comercio en diferentes formatos. Esto puede incluir colorantes fluorescentes que tienen una región conectora y un grupo hidrazina que permite el acoplamiento al ARN en una reacción con grupos dialdehído. Para obtener ejemplos de dichos compuestos, consúltese el catálogo de Invitrogen. La presente divulgación no se limita al uso de un colorante fluorescente específico, sino que se pueden aplicar colorantes diferentes con el mismo efecto. La región conectora puede consistir en una cadena principal de carbono, puede contener átomos de azufre, grupos cetona o grupos dietilenglicol, o grupos dodecaetilenglicol. La longitud del conector puede variar cuando la cadena principal es una molécula lineal de 1 a 20 átomos. Un conector puede contener grupos de átomos que permiten la eliminación selectiva del marcador en una reacción química como se desvela, por ejemplo, en la publicación de patente PCT n.° WO2003/048387.

Los ejemplos no limitantes de marcadores pueden incluir, pero sin limitación, 5-FAM (también denominado 5-carboxifluoresceína; también denominado espiro(isobenzofuran-1(3H), ácido 9'-(9H)xanteno)-5-carboxílico,3',6'-dihidroxi-3-oxo-6-carboxifluoresceína); 5-hexacloro-fluoresceína; ([ácido 4,7,2',4',5',7'-hexacloro-(3',6'-dipivaloilfluoresceinil)-6-carboxílico]); 6-hexacloro-fluoresceína; ([ácido 4,7,2',4',5',7'-hexacloro-(3',6'-dipivaloilfluoresceinil)-5-carboxílico]); 5-tetraclorofluoresceína; ([ácido 4,7,2',7'-tetra-cloro-(3',6'-dipivaloilfluoresceinil)-5-carboxílico]); 6-tetracloro-fluoresceína; ([ácido 4,7,2',7'-tetracloro-(3',6'-dipivaloilfluoresceinil)-6-carboxílico]); 5-TAMRA (5-carboxitetrametilrodamina); xantilio, 9-(2,4-dicarboxifenil)-3,6-bis(dimetil-amino); 6-TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina); 9-(2,5-dicarboxifenil)-3,6-bis(dimetilamino); EDANS (ácido 5-((2-aminoetil)amino)naftalen-1-sulfónico); 1,5-IAEDANS (ácido 5-((((2-yodoacetil)amino)etil)amino)naftalen-1-sulfónico); Cy5 (indodicarbocianina-5); Cy3 (indodicarbocianina-3); y BODIPY FL (ácido 2,6-dibromo-4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-sindaceno-3-propiónico); colorante Quasar®-670 (Biosearch Technologies); colorante naranja Cal Fluor® (Biosearch Technologies); colorantes Rox; colorantes Max (Integrated DNA Technologies), tetraclorofluoresceína (TET), 4,7,2'-tricloro-7'-fenil-6-carboxifluoresceína (VIC), HEX, Cy3, Cy 3.5, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, tetrametilrodamina, ROX y JOE así como derivados adecuados de los mismos. El marcador puede ser un colorante Alexa Fluor, tal como Alexa Fluor 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 633, 647, 660, 680, 700 y 750. El marcador puede ser Cascade Blue, Marina Blue, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Oregon Green 488, Oregon Green 488-X, Pacific Blue, Rhodamine Green, Rhodol Green, Rhodamine Green-X, Rhodamine Red-X y Texas Red-X. El marcador puede estar en el extremo 5' de una sonda, en el extremo 3' de la sonda, en los extremos tanto 5' como 3' de una sonda o en el interior de la sonda. Se puede usar un marcador único para detectar cada locus diferente en un experimento, por ejemplo, dos extremos de un polinucleótido diana, tal como ARNm.

Los ejemplos no limitantes de colorantes-hidrazidas que pueden usarse para el marcaje incluyen Alexa Fluor®-hidrazidas y sales de las mismas, ácido 1-pirenobutanoico-hidrazida, ácido 7-dietilaminocumarin-3-carboxílicohidrazida (DCCH) hidrazidas de Cascade Blue® y sales de las mismas, biocitina-hidrazida, ácido 2-acetamido-4-mercaptobutanoico-hidrazida (AMBH), BOD-IPY® FL-hidrazida, biotina-hidrazida, Texas Red®-hidrazida, biocitinahidrazida, luminol (3-aminoftalhidrazida) e hidrazida de Marina Blue®. Los ejemplos no limitantes de coloranteetilendiaminas que se pueden usar para el marcaje incluyen 5-dimetilaminonaftaleno-1-(N-(2-aminoetil))sulfonamida (dansiletilendiamina), etilendiamina de Cascade Blue® y sales de los mismos, N-(2-aminoetil)-4-amino-3,6-disulfo-1,8-naftalimida (etilendiamina de lucifer yellow) y sales de la misma, N-(biotinoil)-N'-(yodoacetil)etilendiamina, N-(2-aminoetil)biotinamida, bromhidrato (biotina etilendiamina), 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propioniletilendiamina y sales de los mismos (BODIPY® FL EDA), Lissamine™ rodamina B etilendiamina y DSB-X™ biotina etilendiamina (destiobiotina-X etilendiamina, clorhidrato).

Los ejemplos no limitantes de colorante-cadaverinas que se pueden usar para el marcaje incluyen 5-dimetilaminonaftalenel-(N-(5-aminopentil))sulfonamida (dansilcadaverina), 5-(y-6)-((N-(5 aminopentil) amino) carbonil) tetrametilrodamina (tetrametilrodamina cadaverina), N-(5-aminopentil)-4-amino-3,6-disulfo-1,8-naftalimida y sales de la misma (cadaverina de lucifer yellow), N-(5-aminopentil)biotinamida y sales de la misma (cadaverina de biotina), cadaverina de biotina-X (5-(((N-(biotinoil)amino)hexanoil)amino)pentilamina y sales de la misma, cadaverina de Texas Red® (Texas Red® C5), 5-((4-(4,4-difluoro-5-(2-tienil)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceno-3-il) fenoxi) acetil) amino) pentilamina y sales de la misma (cadaverina de BODIPY® TR), cadaverina de Oregon Green®, cadaverina Alexa Fluor® y 5-((5-aminopentil) tioureidil) fluoresceína y sales de las mismas (cadaverina de fluoresceína).

También se describe en el presente documento un uso de polimerización enzimática iniciada en la superficie (SIEP) para la detección de ARN en un formato de micromatriz. Este método puede incorporar múltiples fluoróforos en una cadena de ARN usando reacciones las reacciones secuenciales y complementarias catalizadas por, p. ej., poli(A) polimerasa (PaP) de levadura para incorporar trifosfato de desoxiadenosina (dATP) en el 3'-OH de una molécula de ARN diana, seguido de, p. ej., desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) para catalizar la adición secuencial de una mezcla de desoxinucleótidos naturales y fluorescentes (dNTP) en el 3'-OH de un híbrido de ARN-ADN (p. ej., un híbrido extendido de ARN-ADN). El extremo 3' de ARN se puede convertir eficientemente en ADN (aproximadamente 50 % de conversión) mediante la polimerización de dATP usando PaP de levadura y la hebra corta de ADN unida al extremo del ARN por PaP actúa como iniciador de la polimerización catalizada por TdT de hebras de ADN más largas de una mezcla de dNTP naturales y fluorescentes que contiene hasta -45 fluoróforos Cy3 por 1 Kb de ADN. Se obtiene un límite de detección (LOD) de -2 pM y un intervalo dinámico lineal de 3 log para la hibridación de una diana de ARN corta de 21 bases de longitud con una sonda de ácido nucleico peptídico inmovilizado, mientras que las dianas de ARNm fragmentado de cuatro transcripciones de ARNm de longitud completa diferentes produjeron un LOD de -10 pM con un intervalo dinámico similar en un formato de micromatrices.

Los desoxirribonucleótidos trifosfatos contienen una base nitrogenada que puede ser, por ejemplo, adenina, timina, guanina o citosina.

En el presente documento también se desvela un dispositivo que comprende un sustrato que comprende una superficie; una capa de polímero no incrustante en la superficie; al menos una región de captura en la capa de polímero, que comprende al menos un agente de captura; y al menos una región lábil en la capa de polímero, que comprende al menos un agente de detección y un excipiente; en donde la región de captura y la región lábil están separadas espacialmente. La divulgación también proporciona métodos, ensayos y equipos que comprenden el dispositivo. La capa de polímero no incrustante puede proporcionar la reducción de la unión inespecífica entre componentes de la muestra y el sustrato y/o la capa de polímero. La región lábil en la capa de polímero puede permitir métodos y ensayos simplificados al reducir las etapas necesarias implicadas en un ensayo habitual, tal como, por ejemplo, simplemente poner en contacto la superficie del dispositivo con una muestra y detectar posteriormente cualquier señal de la región de captura, proporcionando aún al mismo tiempo límites de detección muy sensibles. Los dispositivos y métodos asociados son muy adaptables a diversas configuraciones, incluyendo laboratorios de investigación y clínicos, así como ensayos en el lugar de atención a gran escala.

Sustratos

Se pueden usar diversos tipos de sustratos diferentes de acuerdo con la divulgación.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el sustrato puede comprender una superficie que permite la aplicación de una capa de polímero. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el sustrato puede ser un detector óptico o de masas sin marcador (p. ej., un detector de energía de resonancia de plasmón superficial, una guía de ondas ópticas, un detector de elipsometría, etc.) y la superficie del sustrato es una superficie de detección (p. ej., una parte de la superficie que estaría en contacto con un líquido biológico). Los ejemplos de dichos dispositivos pueden incluir, pero sin limitación, los descritos en las patentes de los Estados Unidos n.° 6.579.721; 6.573.107; 6.570.657; 6.423.055; 5.991.048; 5.822.073; 5.815.278; 5.625.455; 5.485.277; 5.415.842; 4.844.613; y 4.822.135.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el sustrato puede ser un biosensor, una placa de ensayo o similar. Por ejemplo, el sustrato puede ser un biosensor óptico, tal como los descritos en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.313.264, 5.846.842, 5.496.701, etc. El sustrato también puede ser un biosensor potenciométrico o electroquímico, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 5.413.690 o solicitud PCT WO98/35232. El sustrato puede ser un biosensor de película de diamante, tal como las descritas en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.777.372. En consecuencia, el sustrato puede ser orgánico o inorgánico; puede ser metálico (p. ej., cobre o plata) o no metálico; puede ser un polímero o no polimérico; puede ser conductor, semiconductor o no conductor (aislante); puede ser reflectante o no reflectante; puede ser poroso o no poroso; etc. Por ejemplo, el sustrato puede comprender polietileno, politetrafluoroetileno, poliestireno, tereftalato de polietileno, policarbonato, oro, silicio, óxido de silicio, oxinitruro de silicio, indio, óxido de tantalio, óxido de niobio, titanio, óxido de titanio, platino, iridio, óxido de indio y estaño, película de diamante o de tipo diamante, etc.

El sustrato puede ser un sustrato adecuado para técnicas de química combinatoria "basadas en chips" y "basadas en clavijas". Todos se pueden preparar de acuerdo con técnicas conocidas. Véase, p. ej., las patentes de los Estados Unidos, n.° 5.445.934, 5.288.514 y 5.624.711.

Los sustratos descritos anteriormente pueden formarse a partir de cualquier material adecuado, incluyendo pero sin limitación, un material seleccionado del grupo que consiste en metales, óxidos metálicos, aleaciones, semiconductores, polímeros (tales como polímeros orgánicos en cualquier forma adecuada, incluyendo tejidos, no tejidos, moldeados, extruidos, fundidos, etc.), silicio, óxido de silicio, cerámica, vidrio y compuestos de los mismos.

Los polímeros usados para formar sustratos como se describe en el presente documento pueden ser cualquier polímero adecuado, incluyendo pero sin limitación: poli(etileno) (PE), poli(propileno) (PP), isómeros cis y trans de poli(butadieno) (PB), isómeros cis y trans de poli(isopreno), poli(tereftalato de etileno) (PET), poliestireno (PS), policarbonato (PC), poli(épsilon-caprolactona) (PECL o PCL), poli(metacrilato de metilo) (PMMA) y sus homólogos, poli(acrilato de metilo) y sus homólogos, poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico), poliortoésteres, poli(anhídridos), nailon, poliimidas, polidimetilsiloxano (PDMS), polibutadieno (PB), alcohol polivinílico (PVA), poliacrilamida y sus homólogos tales como poli(N-isopropil acrilamida), poliacrilato fluorado (PFOA), poli(etileno-butileno) (PEB), poliestireno-acrilonitrilo) (SAN), politetrafluoroetileno (PTFE) y sus derivados, plastómeros de poliolefina, y combinaciones y copolímeros de los mismos, etc.

El sustrato puede tener, opcionalmente, una capa adicional tal como oro o una capa de óxido formada en la superficie del sustrato, por ejemplo, para facilitar la deposición de una capa de polímero o una capa de enlace, como se analiza más adelante.

Chips

Los sustratos para uso en la presente divulgación pueden estar en forma de chip. Normalmente, un chip de la divulgación definirá un canal que se extiende al menos parcialmente hacia el interior del chip. El canal puede tener una o más capas de polímero no incrustantes dispuestas en una o más de las superficies del canal. El canal puede estar abierto en uno o ambos extremos y está cubierto, en general, para formar un tubo que se extiende a través del chip. En algunas realizaciones, un chip de la invención puede depender de la capilaridad para extraer una muestra (p. ej., un líquido biológico tal como sangre) en el canal. Por tanto, un canal puede tener dimensiones que apoyan la capilaridad. En otras realizaciones, un chip de la invención puede definir un pocillo abierto. En una realización, el chip está diseñado con un canal para aceptar sangre de una punción digital a través de la capilaridad. En dichas realizaciones, el canal puede estar diseñado para contener volúmenes de varios microlitros, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 microlitros a aproximadamente 100 microlitros, de aproximadamente 0,5 microlitros a aproximadamente 75 microlitros, de aproximadamente 0,5 microlitros a aproximadamente 50 microlitros, de aproximadamente 0,5 microlitros a aproximadamente 25 microlitros, de aproximadamente 0,5 microlitros a aproximadamente 10 microlitros, de aproximadamente 0,5 microlitros a aproximadamente 5 microlitros, de aproximadamente 1 microlitros a aproximadamente 100 microlitros, de aproximadamente 1 microlitros a aproximadamente 75 microlitros, de aproximadamente 1 microlitros a aproximadamente 50 microlitros, de aproximadamente 1 microlitros a aproximadamente 25 microlitros, de aproximadamente 1 microlitros a aproximadamente 10 microlitros, de aproximadamente 1 microlitros a aproximadamente 5 microlitros, de aproximadamente 2,5 microlitros a aproximadamente 100 microlitros, de aproximadamente 2,5 microlitros a aproximadamente 75 microlitros, de aproximadamente 2,5 microlitros a aproximadamente 50 microlitros, de aproximadamente 2,5 microlitros a aproximadamente 25 microlitros, de aproximadamente 2,5 microlitros a aproximadamente 10 microlitros o de aproximadamente 2,5 microlitros a aproximadamente 5 microlitros. En una realización, un chip de la invención puede definir un canal que tiene unas dimensiones de aproximadamente 4 mm de anchura, por 9 mm de longitud, por 0,1 mm de altura (3,6 microlitros). Normalmente, una o más superficies del canal comprenderán uno o más micro o nanopuntos. Los puntos pueden comprender uno o más reactivos que se usarán en la realización de ensayos de la invención. En una realización, se pueden usar puntos que tienen aproximadamente 100 micrómetros de diámetro.

En una realización, un chip de la invención define un canal que tiene las dimensiones mencionadas anteriormente. En la superficie inferior del canal están dispuestos puntos de 100 micrómetros de diámetro. Los puntos pueden tener un espacio entre centros de 200 micrómetros. En realizaciones de este tipo, un canal de 4 mm x 9 mm podría contener aproximadamente 900 de los puntos de 100 micrómetros de diámetro. Las dimensiones del canal, el tamaño de los puntos y/o la separación de los puntos se pueden ajustar para acomodar un número deseado de puntos. Un número adecuado de puntos puede ser de aproximadamente 100 a aproximadamente 10000 puntos, de aproximadamente 100 a aproximadamente 7500 puntos, de aproximadamente 100 a aproximadamente 5000 puntos, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2500 puntos, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 puntos, de 500 a aproximadamente 10000 puntos, de aproximadamente 500 a aproximadamente 7500 puntos, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000 puntos, de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500 puntos o de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 puntos. Cada punto puede ser de un material diferente, aunque los puntos duplicados son, en general, deseables para la reproducibilidad.

En algunas realizaciones, un chip de la invención puede comprender uno o más diques. Se pueden proporcionar diques para separar uno o más puntos de uno o más puntos adicionales. Los diques pueden ser hidrosolubles y estar hechos de cualquier material conocido por los expertos en la materia. Se pueden disponer diques en el chip entre el agente de captura y un agente de detección. Los diques pueden comprender una sal hidrosoluble, azúcar hidrosoluble, un polímero hidrosoluble o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos adecuados de materiales a partir de los cuales se puede construir un dique incluyen, pero sin limitación, una sal de fosfato, una sal de citrato, trehalosa, alcohol polivinílico, polietilenglicol o cualquier combinación de los mismos.

Se puede disponer un dique en cualquier posición del canal de un chip. Por ejemplo, se puede colocar un dique en la entrada de líquido del canal, en un punto dentro del canal o al final del canal opuesto a la entrada de líquido del canal. Puede disponerse un dique a lo largo de toda o una parte del ancho del canal. En algunas realizaciones, un chip puede definir un canal que comprende una pluralidad de puntos y que también comprende un dique a lo ancho del canal.

Se puede fabricar un chip de la invención usando dos cubreobjetos de vidrio separados por cinta de doble cara para crear un espacio entre los chips definiendo de este modo un canal. En ensayos de la invención que emplean métodos de detección óptica, p. ej., detección de fluorescencia, podría usarse como sustrato cualquier material ópticamente transparente, incluyendo plásticos.

Capa de enlace

Dependiendo de la elección del sustrato y polímero, opcionalmente, se puede incluir una capa de enlace entre el sustrato y la capa de polímero. Por ejemplo, se puede formar una capa de enlace a partir de un compuesto que comprende un grupo de anclaje acoplado (p. ej., acoplado de forma covalente) a un iniciador (p. ej., acoplado directamente o acoplado a través de un grupo de enlace intermedio). La elección del grupo de anclaje puede depender del sustrato sobre el que se forma la capa de enlace y la elección del iniciador puede depender de la reacción concreta usada para formar el polímero no incrustante como se analiza con mayor detalle a continuación.

El grupo de anclaje puede acoplar de forma covalente o no covalente el compuesto o la capa de unión a la superficie del sustrato. El acoplamiento no covalente puede realizarse mediante cualquier interacción secundaria adecuada, incluyendo, pero sin limitación, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, enlaces iónicos, interacciones metal-ligando, etc.

Los ejemplos de materiales de sustrato y grupos de anclaje correspondientes pueden incluir, por ejemplo, oro, plata, cobre, cadmio, cinc, paladio, platino, mercurio, plomo, hierro, cromo, manganeso, volframio y cualquier aleación de los mismos con grupos funcionales que contienen azufre, tales como tioles, sulfuros, disulfuros (p. ej., -SR o -SSR donde R es H, alquilo, tal como alquilo inferior, o arilo) y similares; silicio impurificado o sin impurificar con silanos y clorosilanos (p. ej., -SiR²Cl en donde R es H, alquilo, tal como alquilo inferior, o arilo); óxidos metálicos tales como sílice, alúmina, cuarzo, vidrio y similares con ácidos carboxílicos como grupos de anclaje; platino y paladio con nitritos e isonitrilos; y cobre con ácidos hidroxámicos. Los grupos funcionales adecuados adicionales adecuados como grupo de anclaje pueden incluir benzofenonas, cloruros de ácido, anhídridos, epóxidos, grupos sulfonilo, grupos fosforilo, grupos hidroxilo, fosfonatos, ácidos fosfónicos, grupos de aminoácidos, amidas y similares. Véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos n.° 6.413.587.

Se puede incorporar cualquier iniciador adecuado al grupo de anclaje mediante la introducción de un enlace covalente en una ubicación que no es crítica para la actividad del iniciador. Los ejemplos de dichos iniciadores pueden incluir, pero sin limitación, bromoisobutirato, polimetilmetacrilato-Cl, poliestireno-Cl, AIBN, 2-bromoisobutirato, clorobenceno, hexabromometilbenceno, hexaclorometilbenceno, dibromoxileno, bromoproprionato de metilo. Los ejemplos adicionales de iniciadores pueden incluir los iniciadores descritos en la patente de los Estados Unidos n.° 6.413.587 (p. ej., en las columnas 10-11 de la misma) y los iniciadores descritos en la patente de los Estados Unidos n.° 6.541.580.

Como se ha indicado anteriormente, se puede insertar un grupo de enlace o "espaciador" entre el grupo de anclaje y el iniciador. El conector puede ser polar, no polar, con carga positiva, con carga negativa o sin carga, y puede ser, por ejemplo, saturado o insaturado, alquileno lineal o ramificado, heteroalquileno, aralquileno, alcarileno u otro hidrocarbileno, tales como hidrocarbileno halogenado, en particular, hidrocarbileno fluorado. Los conectores adecuados pueden ser grupos alquileno saturados de 3 a 20 átomos de carbono, es decir, -(CH²V , donde n es un número entero de 3 a 20, inclusive. Véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos n.° 6.413.587. Otra realización adecuada del conector es un oligoetilenglicol de 3 a 20 unidades, es decir, -(CH²CH²O)n- donde n es un número entero de 3 a 20, inclusive.

La capa de anclaje puede depositarse mediante cualquier técnica adecuada. Puede depositarse como una monocapa autoensamblada. Puede crearse mediante modificación del sustrato por reacción química (véase, p. ej., patente de los Estados Unidos n.° 6.444.254) o por grabado con plasma reactivo o tratamiento de descarga de corona. Puede depositarse mediante un proceso de deposición de plasma. Puede depositarse mediante recubrimiento por centrifugación o recubrimiento por inmersión. Puede depositarse mediante pintura en aerosol. También se puede depositar mediante deposición, impresión, estampado, etc. Puede depositarse como una capa continua o como una capa discontinua (p. ej., estampado).

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el sustrato puede ser vidrio, óxido de silicio u otro material inorgánico o semiconductor (p. ej., óxido de silicio, nitruro de silicio) o semiconductores compuestos (p. ej., arseniuro de galio y arseniuro de galio e indio) usados habitualmente para la producción de micromatrices. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el sustrato puede ser una placa de microtitulación (micropocillos).

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el grupo de anclaje puede ser un silano o clorosilano (p. ej., -SiR²Cl en donde R es H, alquilo, tal como alquilo inferior, o arilo).

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la capa de enlace se forma sobre el sustrato en dos etapas separadas. Por ejemplo, en una primera etapa, se puede depositar una capa de enlace de alquilsilano o alcanotiol sobre una superficie tal como dióxido de silicio o vidrio u oro, y presenta un grupo funcional reactivo terminal (p. ej., amina). Posteriormente, una molécula bifuncional, que comprende un primer grupo funcional reactivo hacia el grupo terminal presentado por la primera capa de enlace, puede hacerse reaccionar con la primera capa de enlace depositada en la primera etapa. El segundo grupo funcional de la molécula bifuncional contiene un grupo de resto que actúa como un iniciador para la polimerización de la capa de polímero, tal como un iniciador de ATRP.

Capa de polímero

Las capas de polímero de los dispositivos descritos en el presente documento presentan propiedades no incrustantes. No incrustante, como se usa en el presente documento con respecto a la capa de polímero, se refiere a la inhibición (p. ej., reducción o prevención) del crecimiento de un organismo, así como de interacciones de unión inespecíficas o adventicias entre el polímero y un organismo o biomolécula (p. ej., célula, proteína, nucleótido, etc.). La propiedad no incrustante del polímero se puede introducir mediante cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, la incorporación de un agente no incrustante (o, como alternativa, antiincrustante) o por la estructura/arquitectura del propio polímero. Los agentes no incrustantes son conocidos en la técnica y pueden ser seleccionados por un experto dependiendo del uso particular del dispositivo o de la disponibilidad del agente no incrustante. Los ejemplos no limitantes pueden incluir compuestos orgánicos e inorgánicos que tienen actividad biocida, así como compuestos que pueden incorporarse o unirse a la capa de polímero que reducen o inhiben la interacción de unión inespecífica de una biomolécula (p. ej., célula, proteína, nucleótido, hidrato de carbono/lípido) con el polímero tras el contacto.

Algunas divulgaciones proporcionan una capa de polímero que tiene una estructura o arquitectura que proporciona una propiedad no incrustante. En algunas de las divulgaciones descritas en el presente documento, el polímero puede incluir adecuadamente polímeros en cepillo, que son, en general, formados por la polimerización de grupos centrales monoméricos que tienen uno o más grupos que actúan para inhibir la unión de una biomolécula (p. ej., célula, proteína, nucleótido, hidrato de carbono/lípido) acoplada a los mismos. De forma adecuada, el grupo de núcleo monomérico se puede acoplar a un grupo de cabeza resistente a proteínas.

Las capas de polímero se pueden formar adecuadamente usando técnicas de polimerización por radicales, tales como polimerización por transferencia de cadena catalítica, polimerización mediada por iniferter (p. ej., polimerización mediada por fotoiniferter), polimerización por radicales libres, polimerización estable mediada por radicales libres (SFRP), polimerización por radicales de transferencia de átomos (ATRP) y polimerización por transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible (RAFT).

Por ejemplo, se puede llevar a cabo polimerización por radicales libres de monómeros para formar polímeros en cepillo de acuerdo con técnicas conocidas, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 6.423.465, 6.413.587 y 6.649.138, solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2003/0108879, y variaciones de las mismas que serán evidentes para los expertos en la materia.

También se puede llevar a cabo polimerización por radicales de transferencia de átomos de monómeros para formar polímeros en cepillo de acuerdo con técnicas conocidas, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos n.° 6.541.580 y 6.512.060, solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2003/0185741, y variaciones de las mismas que serán evidentes para los expertos en la materia.

Puede usarse cualquier monómero de vinilo de núcleo adecuado polimerizable mediante los procesos analizados anteriormente, incluyendo, pero sin limitación, estirenos, acrilonitrilos, acetatos, acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, alcoholes vinílicos, ácidos vinílicos y combinaciones de los mismos.

En algunas de las divulgaciones descritas en el presente documento, la capa de polímero se puede formar mediante ATRP iniciado en la superficie (SI-ATRP) de metacrilato de oligo(etilenglicol)metilo (OEGMA) para formar una película de poli(OEGMA) (POEGMA). En una divulgación, la capa de polímero es una película de POEGMA funcionalizada preparada mediante copolimerización de un metacrilato y OEGMA terminado en metoxi. De forma adecuada, el polímero POEGMA se puede formar en una sola etapa.

En general, las moléculas de cepillo formadas por los procesos descritos en el presente documento (u otros procesos conocidos en la técnica o que resultarán evidentes para los expertos en la técnica), pueden tener una longitud de 2 o 5 hasta 100 o 200 nanómetros, o más, y pueden depositarse en la parte de la superficie a una densidad de 10, 20 o 40 hasta 100, 200 o 500 miligramos por metro, o más.

Los grupos resistentes a proteínas pueden ser grupos de cabeza hidrófilos o cosmótropos. Los ejemplos pueden incluir, pero sin limitación, oligosacáridos, tri(propil sulfóxido), hidroxilo, glicerol, fosforilcolina, tri(sarcosina) (Sarc), N-acetilpiperazina, betaína, carboxibetaína, sulfobetaína, sorbitol permetilado, hexametilfosforamida, un zwiterión intramolecular (por ejemplo, -CH²N+(CH³)²CH²CH²CH²SO³') (ZW) y manitol.

Los ejemplos adicionales de grupos de cabeza resistentes a proteínas cosmotrópicas pueden incluir, pero sin limitación:

-(OCH2CH2)aOH;

-O(manitol);

-C(O)N(CH3)CH2(CH(OCH3))4CH2OCHa;

-N(CH3)3+Cl-SO3-Na+(1:1);

-N(CH3)2+CH2CH2SO3-;

-c(o)Pip(NAc) (Pip=piperazinilo)

-N(CH3)2+CH2CO2-;

-O([Glc-a(1,4)-Glc-p(1)']);

-C(O)(N(CH3)CH2C(O))3N(CH3)2;

-N(CH3)2+CH2CH2CH2SO3-;

-C(O)N(CH3)CH2CH2N(CH3)P(O)(N(CH3)2)2-; y

-(S(O)CH2CH2CH2)3S(O)CH3.

En algunas de las divulgaciones, un grupo de cabeza resistente a proteínas adecuado puede comprender poli(etilenglicol) (PEG), por ejemplo, PEG de 3 a 20 unidades monoméricas.

Antes de la deposición de componentes adicionales sobre la capa de polímero, el sustrato con la capa de enlace opcional y la capa de polímero puede estar seco o al menos macroscópicamente seco (es decir, seco al tacto o seco para inspección visual, pero retener el agua unida o el agua de hidratación en la capa de polímero). Por ejemplo, para mejorar la inmovilización de un agente de captura, la capa de polímero puede retener adecuadamente el agua unida o el agua de hidratación, pero no agua superficial a granel. Si el sustrato con la capa de enlace y la capa de polímero se ha almacenado en forma desecada, el agua unida o el agua de hidratación se puede reintroducir exponiendo rápidamente la capa de polímero al agua (p. ej., sumergiéndolo en agua) y posteriormente secando la superficie con secador (p. ej., con chorro de nitrógeno o argón). Como alternativa, el agua unida o el agua de hidratación se pueden reintroducir exponiendo la capa de polímero al aire ambiental durante un tiempo suficiente para que el agua atmosférica se una a la capa de polímero.

Región de captura

El dispositivo comprende al menos una región de captura que comprende al menos un agente de captura, que puede unirse de forma no covalente a la capa de polímero. El número de regiones de captura puede variar ampliamente y puede depender de varios factores, incluyendo el tamaño y la forma del sustrato, el uso previsto del dispositivo (p. ej., un diagnóstico en el lugar de atención, una matriz de paneles (p. ej., micromatrices para cribado de ADN, MMChips (microARN), proteína, tejido, celular, compuestos químicos, anticuerpo, hidrato de carbono, etc.) y similares. El agente de captura que comprende una región de captura es, en general, un miembro de un par de unión específica. Los ejemplos de agentes de captura adecuados pueden incluir, pero sin limitación, antígenos, anticuerpos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, aptámeros de ácido nucleico o péptido, ligandos, receptores y similares. Las realizaciones se refieren a un dispositivo que comprende una pluralidad de regiones de captura que pueden comprender una pluralidad de agentes de captura diferentes tales como, por ejemplo, una matriz de panel de diagnóstico.

En algunas realizaciones, el agente de captura puede comprender un biomarcador asociado a cualquier enfermedad, trastorno o estado biológico de interés. En consecuencia, la selección del agente de captura puede ser impulsada por el uso o la aplicación previstos del dispositivo y métodos descritos en el presente documento y puede incluir cualquier molécula que se sepa que está asociada a una enfermedad, trastorno o estado biológico de interés, o cualquier molécula que se sospeche que esté asociada a una enfermedad, trastorno o estado biológico de interés. Por tanto, la selección de un agente de captura está dentro de la capacidad de un experto en la materia, basada en el conocimiento disponible en la técnica.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de captura puede comprender un biomarcador asociado a cualquier infección microbiana de interés, algunos ejemplos de los cuales pueden incluir, pero sin limitación: carbunco, gripe aviar, botulismo, viruela del búfalo, chikungunya, cólera, coccidioidomicosis, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, dengue, fiebre hemorrágica del dengue, difteria, fiebre hemorrágica del Ébola, Eceh (E. coli 0157), encefalitis, San Luis, infección por Escherichia coli enterohemorrágica, enterovirus, enfermedad transmitida por alimentos, fiebre hemorrágica con síndrome renal, síndrome pulmonar por hantavirus, hepatitis, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), gripe, encefalitis japonesa, fiebre de Lassa, legionelosis, leishmaniosis, leptospirosis, listeriosis, tifus transmitido por piojos, malaria, fiebre hemorrágica de Marburgo, sarampión, enfermedad meningocócica, viruela del mono, Miocarditis, virus de Nipah, fiebre de O'Nyong-Nyong, tosferina, peste, poliomielitis, rabia, fiebre recurrente, fiebre del valle del Rift, síndrome respiratorio agudo grave (SRAG), shigelosis, exposición accidental a la vacuna contra la viruela, intoxicación alimentaria por estafilococos, sífilis, tularemia, fiebre tifoidea, virus del Nilo Occidental, fiebre amarilla, etc.

El agente de captura se puede depositar sobre la capa de polímero mediante cualquier técnica adecuada, tal como microimpresión o microestampado, incluyendo la impresión piezoeléctrica u otras formas de impresión sin contacto y la impresión de pluma de contacto directo. Cuando el agente de captura se imprime en la capa de polímero, se puede absorber adecuadamente en la capa de polímero de modo que permanezca unido cuando el dispositivo se expone a un líquido, tal como un líquido biológico. El polímero en cepillo también puede proporcionar un entorno protector, de modo que el agente de captura permanezca estable cuando se almacene el dispositivo. Por ejemplo, en realizaciones en las que el agente de captura es un péptido o una proteína, tal como una proteína antigénica o un anticuerpo, una capa de polímero en cepillo puede proteger el agente de captura contra la degradación, permitiendo que el dispositivo se almacene en condiciones ambientales.

Cuando se forma una matriz por la deposición de múltiples agentes de captura en ubicaciones distintas en la capa de polímero, pueden realizarse densidades de sonda de 1, 3, 5, 10, 100 o hasta 1000 ubicaciones de sonda por cm2 Se pueden usar distribuidores modernos sin contacto se pueden utilizar en la etapa de deposición para producir matrices con hasta 1000000 de ubicaciones de sonda por cm2. Por ejemplo, utilizando nanolitografía con pluma-inmersión, se pueden preparar matrices con hasta mil millones de ubicaciones de sondas distintas por cm2. Se apreciará que las especies moleculares específicas en cada punto de captura pueden ser diferentes, o algunas pueden ser iguales (p. ej., para proporcionar alguna redundancia o control), dependiendo de la aplicación particular, como se describe en el presente documento.

El agente de captura se puede imprimir sobre la capa de polímero para formar la región de captura. La o las regiones de captura pueden disponerse de cualquier manera particular y pueden comprender cualquier forma o patrón deseable tal como, por ejemplo, puntos (p. ej., de cualquier forma geométrica general), líneas u otros patrones adecuados que permitan la identificación de la región de captura en la superficie del polímero y el sustrato. En algunas realizaciones, se puede disponer de una pluralidad de agentes de captura en un patrón predeterminado de modo que la identidad del agente de captura se asocie a una ubicación específica en el sustrato.

Región lábil

El dispositivo comprende adicionalmente al menos una región lábil que comprende al menos un agente de detección y un excipiente. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, un agente de captura puede permanecer unido de forma no covalente a la capa de polímero (p. ej., cepillo de polímero) al entrar en contacto con un líquido tal como un líquido biológico, tampón o disolvente acuoso, mientras que el excipiente presente en la región lábil puede absorberse en el cepillo de polímero y bloquear la absorción del agente de detección. En consecuencia, cuando se expone a un líquido acuoso tal como, por ejemplo, una muestra que comprende un líquido biológico, el agente de detección puede solubilizarse y liberarse en el líquido y puede unirse a un analito de interés. El excipiente también puede estabilizar adicionalmente el agente de detección durante el almacenamiento.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el agente de detección puede comprender un compuesto capaz de unirse a un segundo miembro de un par de unión específica. Cuando se solubiliza y se libera en la muestra (p. ej., un líquido biológico), si el segundo miembro del par de unión específica está presente en el líquido, puede unirse al agente de detección. El segundo miembro puede después unirse al agente de captura en la región de captura del dispositivo. Como alternativa, el agente de detección puede encontrar el segundo miembro de un par de unión específica cuando ya está unido al agente de captura. Por ejemplo, si el agente de captura es una proteína antigénica y el analito es un anticuerpo generado por el paciente que puede unirse específicamente a la proteína antigénica, el agente de detección puede comprender un anticuerpo antihumano.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, la región lábil puede comprender dos agentes diferentes para formar un ensayo de tipo "sándwich". En dichas realizaciones, un primer agente puede unirse al analito mientras que el otro agente se une al primer agente para formar un "sándwich" que después puede unirse al agente de captura. Por ejemplo, el agente de detección puede comprender biotina, que puede unirse a avidina o estreptavidina que está funcionalizada con un resto de detección.

El agente de detección comprende además un resto detectable que, directa o indirectamente, proporciona una señal detectable. Los restos de detección ilustrativos pueden incluir, pero sin limitación, fluoróforos, cromóforos, radiomarcadores, polinucleótidos, moléculas pequeñas, enzimas, nanopartículas y convertidores elevadores. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el resto de detección puede ser un fluoróforo tal como una cianina (p. ej., CyDyes tales como Cy3 o Cy5), una fluoresceína, una rodamina, una cumarina, una proteína fluorescente o un fragmento funcional de la misma o puede comprender una molécula pequeña tal como biotina, o puede comprender oro, plata o partículas de látex.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el excipiente puede ser una molécula o una combinación de moléculas que se selecciona para permitir una asociación estable, pero no permanente, entre el agente de detección y el polímero. En algunas realizaciones, el excipiente puede ser parcialmente soluble, sustancialmente soluble o soluble en una solución acuosa (p. ej., tampón, agua, muestra, líquido biológico, etc.). En dichas realizaciones, el excipiente se puede seleccionar de los ejemplos no limitantes de sales, hidratos de carbono (p. ej., azúcares, tales como glucosa, fucosa, fructosa, maltosa y trehalosa), polioles (p. ej., manitol, glicerol, etilenglicol), emulsionantes, polímeros hidrosolubles y cualquier combinación de los mismos. Dichos excipientes son bien conocidos en la técnica y pueden seleccionarse basándose en la interacción entre el excipiente y el agente de detección, el excipiente y el polímero, la solubilidad del excipiente en un medio particular y cualquier combinación de dichos factores. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el excipiente puede comprender PEG.

El agente de detección y el excipiente se pueden depositar sobre la capa de polímero mediante cualquier técnica adecuada, tal como microimpresión o microestampado, incluyendo la impresión piezoeléctrica u otras formas de impresión sin contacto y la impresión de pluma de contacto directo. Se puede depositar simultáneamente una mezcla del agente de detección y el excipiente, o el excipiente se puede depositar antes que el agente de detección.

Cuando se forma una matriz por la deposición de múltiples agentes de detección en ubicaciones distintas en la capa de polímero, pueden realizarse densidades de sonda de 1, 3, 5, 10, 100 o hasta 1000 ubicaciones de sonda por cm2 Se pueden usar distribuidores modernos sin contacto se pueden utilizar en la etapa de deposición para producir matrices con hasta 1000000 de ubicaciones de sonda por cm2. Por ejemplo, utilizando nanolitografía con plumainmersión, se pueden preparar matrices con hasta mil millones de ubicaciones de sondas distintas por cm2. Se apreciará que las especies moleculares específicas en cada punto de captura pueden ser diferentes, o algunas pueden ser iguales (p. ej., para proporcionar alguna redundancia o control), dependiendo de la aplicación particular.

Otros elementos

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el dispositivo puede comprender además un agente para demarcar una región con patrón en la capa de polímero, de modo que un líquido (p. ej., un líquido biológico) permanecerá confinado a una región específica de la capa de polímero de modo que entre en contacto con la región de captura y la región lábil. Dicho agente puede ser, por ejemplo, una tinta hidrófoba impresa sobre la capa de polímero antes de la deposición del agente de captura y los componentes de la región lábil. Como alternativa, el agente puede ser una cera. En otras realizaciones, la muestra puede estar contenida o dirigida en el dispositivo mediante la selección de una geometría y/o arquitectura adecuadas para el sustrato, por ejemplo, una geometría que permite que la muestra se difunda a las regiones que comprenden el agente de captura y los componentes del punto lábil. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el sustrato puede comprender un pocillo o una serie de pocillos interconectados.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, cuando el líquido biológico es una muestra de sangre, la región lábil puede comprender un anticoagulante para evitar que la sangre se coagule. Los anticoagulantes ilustrativos pueden incluir, pero sin limitación, antagonistas de la vitamina K tales como coumadin, heparinas y heparinas de bajo peso molecular.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el dispositivo puede comprender además regiones impresas con agentes de control. Por ejemplo, cuando el agente de detección comprende un anticuerpo antihumano, las regiones de captura de control de IgG humana se pueden imprimir junto con las regiones de captura para verificar la actividad del anticuerpo de detección antihumano y para normalizar la señal del resto de detección, tal como intensidades de fluorescencia.

Almacenamiento del dispositivo

Después de la deposición del agente de captura, el agente de detección, el excipiente y otros componentes opcionales, el dispositivo se seca opcionalmente, p. ej., mediante desecación leve, soplado, liofilización o exposición al aire ambiente a temperatura ambiente, durante un tiempo suficiente para que el artículo esté seco o, al menos macroscópicamente seco, como se ha descrito anteriormente. Una vez que el dispositivo esté seco o al menos macroscópicamente seco, se puede sellar en un recipiente (p. ej., tal como un recipiente polimérico impermeable o semipermeable) en el que se puede almacenar y enviar a un usuario. Una vez sellado en un recipiente, el dispositivo puede tener, En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, una vida útil de al menos 2 a 4 meses, o hasta 6 meses o más, cuando se almacena a una temperatura de 25 °C (p. ej., sin pérdida de más del 20, 30 o 50 por ciento de la actividad de unión).

Detección

Después de la exposición de un dispositivo descrito en el presente documento a una muestra biológica (p. ej., un líquido biológico), se puede detectar una señal del agente de detección usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los métodos ilustrativos pueden incluir, pero sin limitación, detección visual, detección de fluorescencia (p. ej., microscopia fluorescente), recuento de centelleo, resonancia de plasmón superficial, elipsometría, microscopia de fuerza atómica, detección de dispositivos de ondas acústicas de superficie, autorradiografía y quimioluminiscencia. Como apreciará un experto en la materia, la elección del método de detección dependerá del agente de detección específico empleado.

Detector

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un detector para su uso en los métodos de la invención. Normalmente, un detector está configurado para contener un chip y está equipado con una o más fuentes de luz. Las fuentes de luz están configuradas para iluminar el chip. La fuente de luz puede iluminar el chip de manera que la luz pase a través del chip. La fuente de luz puede iluminar el chip de manera que la luz entre en contacto con una superficie del chip en un ángulo de aproximadamente 0 grados a aproximadamente 90 grados. En una realización, se puede colocar una fuente de luz de modo que la luz ilumine una superficie del chip y una capa de polímero no incrustante dispuesta en un canal en el otro lado de la superficie. En realizaciones de este tipo, la luz puede atravesar la superficie del chip pero no todo el chip.

Las fuentes de luz pueden ser de cualquier tipo, por ejemplo, pueden ser luces LED. Un ejemplo adecuado de una fuente de luz para usar en la presente invención es un LED370F producido por Thor Laboratories. En algunas realizaciones, un detector puede comprender más de una fuente de luz, por ejemplo, puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fuentes de luz. Las fuentes de luz pueden ser iguales o diferentes. Cada fuente de luz puede producir luz de la misma o diferente longitud de onda que la luz producida por otra fuente de luz. Cada fuente de luz puede producir luz de la misma potencia. En una realización, se usan 4 fuentes de luz cada una con una potencia óptica directa de 2 mW. Un detector de la invención también comprenderá normalmente una lente. La lente está configurada para recoger luz, p. ej., luz emitida por un fluorófono, y dirigirla a la cámara de un teléfono inteligente.

Con referencia a las figuras 25A-25E, un detector de la invención puede ser, en general, de forma cilíndrica y puede comprender una cavidad central que se puede extender a través del detector a lo largo del eje central. Como alternativa, un detector de la invención puede moldearse para que tenga una sección transversal cuadrada o rectangular cuando se biseca perpendicularmente al eje longitudinal del detector. La cavidad puede moldearse con diversas etapas de diferentes formas y tamaños para alojar el chip, filtro y lente. Un detector de la invención tiene uno o más canales 100 de LED. Dichos canales de LED tienen un tamaño para alojar las luces LED a las que se ha hecho referencia anteriormente. Un detector de la invención también puede comprender uno o más canales 105 de cableado que pueden usarse para conectar una o más fuentes de energía a una o más luces LED. Un detector de la invención puede comprender una o más ranuras 110 de chip configuradas para alojar uno o más chips de la invención. Una ranura de chip puede extenderse desde el lado del detector hacia el interior y puede extenderse o no completamente a través del detector. En la figura 25A, la ranura de chip 110 se extiende desde un lado hacia el interior pero no a través de todo el detector. Como se ha analizado anteriormente, un detector de la invención puede comprender una cavidad central que se extiende a lo largo del eje central del detector. Como se muestra en la figura 25A, la cavidad puede proporcionar una trayectoria 115 de la luz de manera que la luz emitida por el chip pueda viajar por la trayectoria de la luz hasta la cámara de un teléfono móvil para ser grabada por la cámara. La figura 25A también representa una cavidad 120 de filtro. La cavidad 120 de filtro tiene un tamaño para acomodar un filtro de luz diseñado para filtrar una longitud de onda de luz y permitir que pase otra longitud de onda de luz. Por ejemplo, un filtro puede filtrar la luz de una longitud de onda emitida por las luces LED a las que se ha hecho referencia anteriormente y dejar pasar una longitud de onda de luz emitida por un agente de detección. Normalmente, el filtro se colocará en la trayectoria de la luz central. La figura 25A también representa una cavidad 125 de lente. La cavidad de lente tiene un tamaño para alojar una lente para usar en la presente invención. Una lente para usar en la presente invención concentrará la luz emitida por un agente de detección y dirigirá la luz concentrada a la cámara de un teléfono móvil donde se puede grabar la luz. La figura 25A también representa una cavidad 130 de batería. La cavidad 130 de batería tiene un tamaño para acomodar una batería que es capaz de alimentar una o más luces LED a las que se ha hecho referencia anteriormente. Normalmente, la cavidad de batería estará en el lado de la ranura del chip opuesto al del filtro y la lente. La batería puede estar unida o puede ser una parte integral de la tapa del detector y, en dichas realizaciones, la cavidad de batería puede servir para alojar la tapa. Un detector de la invención comprende normalmente una batería conectada eléctricamente a las fuentes de luz para proporcionar energía a las fuentes de luz. La figura 25B, 25C y 25D muestran vistas de CAD de una vista en perspectiva superior, vista lateral y vista en perspectiva inferior, respectivamente, de un detector de la invención. La figura 25E muestra una vista en sección transversal del detector de la invención tomada a lo largo de un plano que pasa por el eje vertical del detector.

Un detector de la invención puede comprender una parte magnética diseñada para unir magnéticamente el detector a un teléfono móvil.

Equipos

Algunas divulgaciones del presente documento pueden incluir equipos.

Los equipos pueden incluir los soportes, soportes sólidos y dispositivos médicos del presente documento. Los equipos pueden incluir instrucciones, por ejemplo, instrucciones escritas, sobre cómo usar los materiales que contienen. El material o los materiales pueden ser, por ejemplo, cualquier sustancia, composición, polinucleótido, solución, etc., en el presente documento o en cualquier patente, publicación de solicitud de patente, referencia o artículo.

Un equipo puede incluir un dispositivo como se describe en el presente documento y, opcionalmente, componentes adicionales tales como tampones, reactivos e instrucciones para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento. La elección de tampones y reactivos dependerá de la aplicación específica, p. ej., entorno del ensayo (lugar de atención, investigación, clínica), analito o analitos que se van a analizar, el resto de detección usado, etc. Por ejemplo, si el agente de captura es un polinucleótido y el analito de interés es un polinucleótido complementario, el equipo puede incluir un tampón de lisis que se añadirá a la muestra de líquido biológico, para hacer que el polinucleótido de la muestra esté disponible para la unión.

El equipo también puede incluir material informativo, que puede ser descriptivo, instructivo, comercial u otro material que se refiera a los métodos descritos en el presente documento y/o el uso de los dispositivos para los métodos descritos en el presente documento. En algunas divulgaciones, el material informativo puede incluir información acerca de la producción del dispositivo, las propiedades físicas del dispositivo, la fecha de caducidad, información del lote o del sitio de producción, etc.

Diseño de ensayo ilustrativo

Los siguientes párrafos describen una realización no limitativa de la divulgación con más detalle.

La divulgación proporciona un chip desechable que permite ensayos multiplexados, miniaturizados, que pueden analizar un líquido biológico con respecto a una o más EI de interés. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, los ensayos se pueden realizar en una etapa. En determinadas realizaciones, los ensayos se pueden realizar sin necesidad de preprocesamiento o microfluidos. Además de puntos de captura estables para unir biomarcadores de interés, los dispositivos también pueden incluir micropuntos lábiles que permiten imprimir agentes de detección secundarios junto con agentes de captura. Al entrar en contacto con una gota de un líquido biológico, estos reactivos secundarios en los puntos lábiles pueden disolverse en solución y marcar una diana presente en la muestra.

En una realización de esta tecnología, se desarrolla en el presente documento una prueba de lugar de atención (POCT) D4 que funciona a partir de una sola gota de sangre completa (figura 2). La D4 POCT consiste en un chip de vidrio recubierto con cepillo de poli(metacrilato de oligoetilenglicol) (POEGMA) "no incrustante" resistente a células y proteínas de 30 nm de grosor (figura 2A) que contiene dos tipos de micropuntos impresos con inyección de tinta contenidos dentro de un canal central: puntos "estables" de anticuerpos de captura y puntos "solubles" de anticuerpos de detección que se imprimen con excipientes para que se disuelvan al entrar en contacto con la sangre. Se usa capilaridad para extraer sangre de una punción digital en el canal central del chip (figura 2B-E) y los analitos proteicos en la sangre se difunden a través del cepillo de POEGMA no incrustante y se unen a puntos estables de anticuerpos de captura en la superficie (véase la figura 1).

De manera simultánea, la sangre disuelve los anticuerpos de detección marcados con fluorescencia de los micropuntos solubles, que se difunden y se unen a sus respectivos puntos de anticuerpos de captura de analito, completando de este modo el complejo de detección y generando una señal de fluorescencia cuantificable a partir de los puntos del anticuerpo de captura (figura 1). Esta señal óptica se captura con la cámara de un teléfono inteligente colocando el chip en un dispositivo pequeño (figura 2K), que se conecta magnéticamente a un teléfono inteligente (figura 2F-I). La figura 2J es la imagen resultante de la cámara del teléfono inteligente de una micromatriz de prueba impresa dentro del canal central del chip en presencia de sangre completa (imagen adquirida después de la adición de sangre completa al canal). La iluminación y detección ópticas de la parte trasera elimina la interferencia óptica de la sangre, de modo que no sea necesario extraer la gota de sangre para su análisis, ni es necesario ningún tipo de lavado para el análisis (figura 2K).

En una realización de esta tecnología, un ensayo según la divulgación comprende, consiste o consiste esencialmente en un chip desechable que se ha recubierto con POEGMA y después se ha impreso con una tinta hidrófoba que delimita una región con patrón de POEGMA. La región del patrón contiene puntos de agentes de captura individuales. La naturaleza hidrófila del cepillo de POEGMA permite que una gota de sangre se difunda por toda la superficie del POEGMA mientras que la tinta hidrófoba crea un "corral" que puede confinar la gota de sangre a la región de análisis. La región con patrón de POEGMA también contiene "puntos lábiles" que pueden incluir anticuerpos de detección marcados con fluorescencia y polietilenglicol soluble.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, los agentes de captura en los puntos de captura pueden ser antígenos que son diagnósticos para una EI de interés. Cuando se aplica una muestra de líquido (p. ej., sangre) de un paciente al chip, los anticuerpos generados por el paciente en la muestra pueden unirse al antígeno. En dichas realizaciones, los puntos lábiles pueden incluir anticuerpos antihumanos marcados con fluorescencia que pueden unirse a los anticuerpos inmovilizados generados por el paciente.

En otras realizaciones, los agentes de captura en los puntos de captura pueden ser anticuerpos para antígenos que son diagnósticos para una EI de interés. Cuando se aplica una muestra de líquido (p. ej., sangre) de un paciente al chip, los antígenos generados por el paciente en la muestra pueden unirse al anticuerpo. En dichas realizaciones, los puntos lábiles pueden incluir anticuerpos marcados con fluorescencia que son específicos para un epítopo diferente en el mismo antígeno, que pueden unirse al antígeno generado por el paciente inmovilizado.

En determinadas realizaciones, las proteínas antigénicas o anticuerpos que se van a usar como agentes de captura se aplican puntualmente en la superficie de POEGMA como una fila de puntos individuales de cada antígeno, para proporcionar repeticiones independientes y, de este modo, mejorar la solidez del ensayo. Por ejemplo, una micromatriz que contiene micropuntos de diversa densidad de anticuerpos de captura puede permitir que un intervalo mucho más amplio de concentraciones de analito quede dentro del intervalo dinámico de un detector dado y, de este modo, puede eliminar la serie de diluciones de pruebas que se realizan habitualmente con una sola muestra. Se pueden detectar concentraciones bajas de analito en regiones de alta densidad de anticuerpos de captura, mientras que se pueden detectar concentraciones altas de analito en regiones de baja densidad de anticuerpos de captura.

En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, se puede dar formato a las matrices de manera que se garantice que los puntos de anticuerpos de detección se disuelvan al entrar en contacto con una muestra de sangre. Por ejemplo, se imprimen doce regiones de captura separadas como puntos, con cuatro puntos cada una de tres agentes de captura diferentes. Alrededor de los puntos de captura se imprimen regiones lábiles que incluyen anticuerpos antihumanos marcados con Cy5 como agentes de detección.

También se puede incluir PEG soluble en los puntos lábiles. El PEG soluble puede absorberse preferentemente en el cepillo de POEGMA y bloquear la adsorción del anticuerpo de detección en el cepillo. En consecuencia, los anticuerpos de detección, aunque están confinados en puntos debido a la impresión de inyección de tinta piezoeléctrica y al proceso de secado macroscópico, están de hecho en un estado "lábil" en el que pueden disolverse y liberarse fácilmente en la gota de sangre al entrar en contacto con una solución acuosa. La adición de un exceso de PEG soluble también puede estabilizar el anticuerpo de detección marcado con fluorescencia durante el almacenamiento y puede actuar como un excipiente que ayuda a resolubilizar el anticuerpo de detección cuando se introduce la gota de sangre de prueba.

Al entrar en contacto con una gota de sangre, los anticuerpos de detección marcados se disolverán en solución. En algunas de las realizaciones descritas en el presente documento, el anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo antihumano que se puede unir y, por lo tanto, marcar, a todos los anticuerpos humanos presentes en la muestra de sangre. Simultáneamente, los analitos presentes en la sangre, si están presentes, (es decir, anticuerpos generados por el paciente contra los antígenos) pueden unirse a puntos de antígenos impresos de forma estable. En otras realizaciones, el anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo específico para un antígeno de interés. Al entrar en contacto con la muestra de sangre, si el antígeno está presente en la muestra, el anticuerpo de detección puede unirse al antígeno, que a su vez puede unirse al anticuerpo agente de captura.

Como controles positivos, se pueden imprimir puntos de IgG humana junto con los puntos de antígenos. Estos servirán para verificar la actividad del anticuerpo de detección antihumano y también se pueden usar para normalizar las intensidades de fluorescencia entre los ensayos para reducir la variabilidad entre ensayos.

Para prevenir la coagulación de la sangre, la enzima heparina también se puede imprimir en el cepillo de POEGMA en los puntos lábiles. La heparina se puede mezclar con PEG antes de la impresión o se puede imprimir ella misma en una etapa separada.

En una realización, se puede administrar una punción digital al paciente y aplicar la gota de sangre resultante a la superficie del chip. La tinta hidrófoba impresa en la superficie del chip hace que la gota de sangre se extienda solo a través de la región de detección diana, donde se disuelve en agentes de detección solubles y heparina (para evitar la coagulación de la sangre) impresa dentro de la región de detección.

A medida que los anticuerpos de detección solubilizados, marcados con fluorescencia, se disuelven de sus puntos impresos por la gota de sangre, se producen tres acontecimientos en serie para generar una señal positiva. Estos acontecimientos pueden incluir lo siguiente: (1) la unión de los analitos presentes en la sangre a los puntos inmovilizados y no fluorescentes de los agentes de captura individuales crea la primera mitad del emparedado; (2) la difusión de la sangre lateralmente a través del cepillo de polímero da lugar al movimiento de anticuerpos de detección solubles desde sus puntos impresos; (3) al entrar en un complejo de agente de captura y analito (primera mitad del emparedado), los anticuerpos de detección marcados con fluorescencia se unen a sus respectivos puntos de agente de captura de analito, completando el emparedado y dando lugar a la formación de un punto fluorescente en la posición donde se había impreso el agente sin marcar.

En esta realización, el ensayo se basa en datos respaldados de que los anticuerpos de detección marcados con fluorescencia que se imprimen como "puntos lábiles" son transportados por flujo de inundación a filas adyacentes de agentes de captura impresos e inmovilizados de manera estable por difusión de la solución que contiene el analito. Por lo tanto, la visualización de la apariencia de fluorescencia de los puntos impresos con los diferentes agentes de captura proporciona una identificación inequívoca de diferentes analitos (positivos). La cuantificación de la concentración de los diferentes analitos se lleva a cabo de forma idéntica a un inmunoensayo de fluorescencia convencional calibrando previamente el dispositivo usando una serie de diluciones de los analitos añadidos a sangre completa.

El ensayo según esta realización aborda cada una de las necesidades críticas en las pruebas POC de la siguiente manera: (1) el coste de las pruebas de EI se reducirá mediante la miniaturización, multiplexación, procesamiento de una etapa en el sitio y analizando directamente en sangre completa sin diluir obtenida de una punción digital sin preprocesamiento ni microfluidos; (2) para simplificar el proceso de detección de EI, la difusión en dos dimensiones reúne los reactivos localizados espacialmente para crear un ensayo funcional y eliminar de este modo la necesidad de etapas de transferencia de líquidos, manipulación de microfluidos de muestras o reactivos y etapas de lavado; (3) esta plataforma multiplexada es capaz de detectar un panel de marcadores de EI con una sola gota de sangre sin preprocesamiento de la muestra; (4) el ensayo será rápido, lo que aliviará las dificultades asociadas con frecuencia a la comunicación del resultado de la prueba de EI; y (5) el esquema de detección real del diseño desvelado es un inmunoensayo fluorescente de tipo sándwich, que ofrece la mayor sensibilidad disponible actualmente en el campo.

Una mejora en la detección de EI de esta magnitud tiene el potencial de afectar sustancialmente a la salud de toda la población humana. Para controlar las enfermedades infecciosas, una parte del proceso es la detección regular para identificar los diversos patógenos transmitidos a través del aire, alimentos, agua o contacto físico, y se cree que el desarrollo de la plataforma de detección propuesta hará que la detección de EI regular y completa sea mucho más accesible para un porcentaje mucho mayor de la población. Por último, el diseño modular y muy adaptable también es útil en la implementación como diagnóstico para muchas otras zonas de necesidad, incluyendo la supervisión de biomarcadores en ensayos clínicos, detección de pandemias, biodefensa y verificación a gran escala de biomarcadores de nuevo descubrimiento.

Se pretende que los siguientes ejemplos no limitantes sean meramente ilustrativos y muestran experimentos específicos que se llevaron a cabo de acuerdo con la divulgación.

Ejemplos

Ejemplo 1. Se pueden hacer crecer cepillos de POEGMA sobre vidrio y plástico.

Se desarrolló un recubrimiento de poli(metacrilato de oligoetilenglicol) (POEGMA) resistente a proteínas y células con alta estabilidad química. Los cepillos de POEGMA se sintetizan mediante polimerización de radicales por transferencia de átomos iniciada en la superficie (SI-ATRP) sobre vidrio, como se muestra en la figura 3: en primer lugar, se forma una monocapa de silano terminado en amina en la superficie del vidrio mediante aminopropiltrietoxisilano (APTES) (etapa 1), seguido de la unión del iniciador de ATRP-bromuro de bromoisobutirilo a los grupos amina presentados por la monocapa de APTES (etapa 2) y posterior ATRP de una solución que contiene CuBr, bipiridina y el monómero OEGMA (etapa 3). Este procedimiento permite la síntesis conveniente de cepillos de ~100 nm de grosor que pueden ser útiles para imprimir Ab y otras proteínas para inmunoensayos. También se ha desarrollado un conjunto complementario de tecnologías que permiten el crecimiento de cepillos de POEGMA en una gama de termoplásticos transparentes que también son adecuados como materiales de sustrato para el ensayo D4 (datos no mostrados). Estos resultados muestran que se pueden usar diversos enfoques complementarios para hacer crecer cepillos de POEGMA en materiales que proporcionan sustratos útiles para inmunoensayos clínicos. Estos cepillos de POEGMA resistentes a proteínas y células pueden formar la base de la D4 POCT, ya que evitan la unión de las células al chip y la adsorción inespecífica de proteínas a la superficie.

Recubrimiento ilustrativo de portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos se tratan con APTES al 5 % (v/v) en etanol, durante una noche a temperatura ambiente. Estos portaobjetos se tratan después con bromuro de bromoisobutirilo (BIB) al 2 % en trietilamina al 2 % (v/v) en diclorometano y después se colocan en un matraz de 100 ml con N². A continuación, se mezclaron CuBr (143 mg, 1,0 mmol), bipiridina (312 mg, 2,0 mmol), diclorometano (15 ml) y OEGMA (8 g, 16,7 mmol) en un matraz de 50 ml y la solución de color rojo oscuro se burbujeó con gas N²durante 30 min. La polimerización se inició añadiendo la mezcla al matraz que contenía portaobjetos y se continuó durante una hora con purga de nitrógeno. Los portaobjetos se retiraron de la solución para detener la polimerización, se aclararon con diclorometano y metanol y se secaron bajo una corriente de gas N²durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Ejemplo 2. Los anticuerpos se pueden imprim ir directamente en cepillos de POEGMA mediante una impresora de inyección de tin ta piezoeléctrica.

Los anticuerpos de captura (Abc) se imprimieron como puntos de -150 pm de diámetro en un cepillo de POEGMA de 100 nm de grosor a temperatura y humedad ambiente usando una impresora sin contacto PerkinElmer Piezorray™ (figura 4A) y se dejaron absorber de forma no covalente en el cepillo de polímero de 100 nm de grosor. Se eligió un cepillo de POEGMA de -100 nm de grosor porque proporciona una excelente resistencia a la adsorción de proteínas en estado hidratado, pero en estado seco actúa como un depósito de tinta: la "tinta" de anticuerpo impreso piezoeléctricamente se adsorbe ávidamente en el cepillo para proporcionar una densidad de carga suficientemente alta del Abc para su uso en ensayos de micromatrices. Después de imprimir, los portaobjetos se secaron en un desecador de vacío a temperatura ambiente durante una noche para promover adicionalmente la absorción del Abc en el cepillo de polímero. Esta etapa puede ser necesaria ya que las proteínas no se adsorberán en el cepillo de polímero de la solución. Los portaobjetos de vidrio recubiertos de POEGMA se pueden almacenar en un recipiente cerrado y dejar en la mesa de trabajo durante hasta dos meses, sin ningún efecto adverso sobre el rendimiento de las matrices de anticuerpos que posteriormente se imprimieron en los cepillos de polímero. La impresión de inyección de tinta directa, sin etapas de acoplamiento covalente, puede proporcionar un método sencillos para la fabricación de matrices de anticuerpos con etapas de procesamiento mínimas, ya que las impresoras de inyección de tinta son de bajo coste y ubicuas. Esto puede proporcionar una tecnología de fabricación sencilla y amplificable para los chips D4 que se puede implementar fácilmente en un entorno de PIBM (países de ingresos bajos o medianos).

Aplicación puntual ilustrativa de micromatrices de anticuerpos: Todos los anticuerpos de captura y los anticuerpos de detección biotinilados para los siguientes analitos se obtuvieron de R&D Systems: IL-6, interleucina-lb humana (IL-1b), factor de necrosis tumoral humano (TNF-a), interleucina-8 humana (IL-8) y OPG. Todos los anticuerpos de captura (0,5 mg/ml en PBS) se aplicaron puntualmente usando un Piezorray de PerkinElmer sin contacto en cepillos de POEGMA sobre vidrio a temperatura y humedad ambiente y se dejaron absorber de manera no covalente en el cepillo de polímero de 100 nm de grosor con desecación al vacío (30 KPa) a temperatura ambiente durante una noche.

Ejemplo 3. Las matrices de anticuerpos en los cepillos de POEGMA son muy sensibles.

Una matriz de anticuerpos específica para IL-1 p, IL-6, IL-8, TNF-a y osteoprotegerina (OPG), se imprimió directamente con una impresora de inyección de tinta Piezorray en: (1) un cepillo de POEGMA de 100 nm de grosor cultivado por SI-ATRP sobre vidrio y (2) sobre sustratos de nitrocelulosa sin modificar (control positivo). Una imagen de fluorescencia de puntos de micromatrices para un ensayo de IL-6 aplicado puntualmente en POEGMA sobre vidrio, mostrada en la figura 4A, muestra el aumento de la intensidad de fluorescencia al aumentar la concentración de analito. Notablemente, los puntos se pudieron diferenciar visualmente del fondo incluso a una concentración de IL-6 de 0,1 pg/ml (5 fM). La figura 4A también muestra que la matriz de POEGMA conservó su capacidad para resistir la adsorción inespecífica de proteínas durante la fabricación de la matriz y el posterior ensayo de inmunofluorescencia de tipo sándwich, ya que la intensidad de la fluorescencia en las áreas de fondo que rodean los puntos medidos antes del ensayo no mostró ningún aumento de intensidad tras la finalización del procedimiento; de hecho, la única fluorescencia de fondo detectada en los sustratos de POEGMA se debió a la autofluorescencia del portaobjetos de vidrio. Esta señal de fondo extraordinariamente baja en POEGMA se traduce en límites de detección (LOD) femtomolares en suero para los cinco analitos que se probaron y un intervalo analítico que abarca cinco órdenes de magnitud de concentración de analito (figura 4B-D).

Las curvas de respuesta a la dosis de OPG en tampón y suero para anticuerpos específicos de OPG aplicados puntualmente en POEGMA (figura 4B), ilustran otra consecuencia importante del uso de un sustrato resistente a proteínas, ya que muestran que los LOD son prácticamente idénticos en tampón y suero. Estos resultados contrastan con la mayoría de los otros inmunoensayos de fluorescencia, donde el LOD es normalmente órdenes de magnitud mayor en soluciones fisiológicas complejas que contienen altas concentraciones de proteínas extrañas en comparación con el LOD para el mismo ensayo en tampón. Aunque la señal absoluta de las matrices aplicadas puntualmente en POEGMA fue menor que la obtenida de las matrices aplicada puntualmente en nitrocelulosa (no se muestran los datos brutos), la señal de fondo obtenida del cepillo de POEGMA (que se acercó a los niveles de autofluorescencia del sustrato de vidrio) fue significativamente menor que la de la nitrocelulosa. La respuesta de fluorescencia de una matriz de anticuerpos específicos de IL-6 aplicada puntualmente sobre nitrocelulosa y POEGMA en función de la concentración de IL-6 en suero se muestra en la figura 4C. Los LOD en suero para matrices aplicadas puntualmente en cepillos de POEGMA fueron 100 veces menores que las mismas micromatrices de anticuerpos en nitrocelulosa, lo que demostró claramente que, a pesar de la señal absoluta más baja de las matrices de anticuerpos aplicada puntualmente en el cepillo de POEGMA frente a la nitrocelulosa, la fluorescencia de fondo significativamente menor en el cepillo de POEGMA compensó con creces la señal absoluta más baja de los puntos. Se observó que los anticuerpos de IL-6 aplicados puntualmente en un cepillo de POEGMA sobre vidrio podían detectar IL-6 directamente de sangre sin diluir con un LOD de ~15 fM (figura 4D).

Estos resultados demuestran que la reducción de la adsorción inespecífica de proteínas es un método potente para disminuir el LOD al disminuir el umbral de ruido en la curva de respuesta a la dosis de estos ensayos a concentraciones en el intervalo femtomolar. Debido a que estas micromatrices se aplicaron puntualmente de forma física en POEGMA y no implicaron ningún acoplamiento covalente del anticuerpo de captura al sustrato, tienen el potencial de simplificar enormemente la fabricación del ensayo al eliminar la necesidad de activación química y desactivación de la superficie. La capacidad de estas micromatrices para resistir la adsorción de proteínas y células de la solución permite la detección de analitos directamente de la sangre completa. Estas características son fundamentales para el diseño de la D4 POCT que actúa en sangre con alta sensibilidad.

Ejemplo 4. Se pueden imprim ir m icropuntos solubles de reactivos de detección que se disuelven en contacto con el agua y proporcionan los reactivos secundarios necesarios para la detección de tipo sándwich "en el chip".

Se podrían imprimir micropuntos lábiles de anticuerpos de detección marcados con fluorescencia en la misma superficie si se mezclaran con suficiente excipiente soluble. Al entrar en contacto con una gota de sangre, estos puntos de reactivos secundarios se disolverán en la solución y marcarán la diana presente en la muestra de sangre. Simultáneamente, las dianas marcadas contenidas dentro de la muestra se unirán a los puntos de captura no lábiles, inmovilizados. Como experimento inicial de prueba de principio para ilustrar la viabilidad de este enfoque, se imprimieron cinco puntos de un Ab biotinilado sobre una superficie de POEGMA para formar los puntos inmóviles "estables" del agente de captura (figura 5); los puntos estables no se pueden ver en la parte superior del panel izquierdo de la figura 5 porque no son fluorescentes. Además, se aplicó puntualmente una solución de estreptavidina-Cy5 y PEG soluble en la parte superior de puntos preimpresos de PEG soluble para crear una matriz de 8x2 de puntos "lábiles" de reactivos de detección (fila inferior, panel izquierdo, figura 5). Después de una semana de almacenamiento, se pipetearon sobre la superficie 50 pl de PBS, un volumen similar al obtenido con una punción digital. Como se ve en la figura 5 (panel derecho), Cy5-estreptavidina de los puntos lábiles se disolvió en solución y fue capturada por los cinco puntos de Ab biotinilados para crear una señal detectable (fila superior del panel derecho, figura 5).

El desarrollo de micropuntos "lábiles" puede ser un avance crítico en el diseño de la D4 POCT ya que permite que este ensayo contenga reactivos secundarios en el chip, lo que elimina etapas de manipulación de muestras fluídicas. Por tanto, esta característica simplifica en gran medida el proceso de ensayo de tipo sándwich al eliminar las numerosas etapas de lavado y transferencia de líquido que eran necesarias en su precursor, el Femtoarray™.

Ejemplo 5. Prueba de concepto de la D4 POCT en sangre.

Se mostró una prueba de concepto de la D4 POCT en sangre en la detección de IgG e IgM humanas; estos analitos se eligieron porque se puede usar sangre de un donante sano para este fin. La figura 6 muestra la fabricación de un ensayo prototipo. En primer lugar, se hizo crecer un cepillo de POEGMA de ~30 nm de grosor en un portaobjetos de vidrio mediante SI-ATRP. A continuación, se estampó en el portaobjetos de vidrio un patrón de cuadrícula de cera usando una impresora de portaobjetos para confinar la muestra al área activa del chip (figura 6A). La impresora de portaobjetos se usó para hacer corrales hidrófobos porque estaba disponible para los inventores y es conveniente, aunque crea una cuadrícula completa de corrales. A continuación, se imprimió con chorro de tinta una matriz de anticuerpos en el centro de un solo corral de cera; cada punto tiene ~150 pm de diámetro. La matriz interna 4x4 contiene puntos de anticuerpos de captura (Abc) que comprenden los puntos de captura "estables". Las filas 1 y 4 son un Abc anti-murino (control positivo); fila 2: Abc anti-IgG humana; fila 3: Abc anti-IgM humana. A continuación, el cóctel de detección se imprimió como 3 anillos exteriores de puntos "lábiles" (figura 6B). Estos puntos contienen una mezcla de Cy-5 murino-anti-IgG humana y/o Cy-5 murino-anti-IgM humana (anticuerpos de detección con un epítopo diferente contra IgG e IgM humana que el Abc), heparina y un exceso molar de 10X de PEG5000. Las imágenes de la figura 6A se adquirieron con una cámara digital, mientras que la figura 6B se adquirió con un explorador de portaobjetos de micromatrices de fluorescencia. Por lo tanto, la matriz de anticuerpos 4x4 interna no tiene fluorescencia intrínseca y solo es apenas visible en la figura 6B debido a la dispersión de luz de los precipitados de sal formados después de que las soluciones de Abc impresas se han secado en la superficie. Los puntos externos son visibles porque contienen Abd marcado con Cy5 en una concentración lo suficientemente alta como para saturar el detector y, por lo tanto, aparecen de color blanco.

La figura 7 muestra fotografías del prototipo inicial del ensayo D4. Una gota de sangre de una punción digital (~5-10 pl) (figura 7A) se aplica directamente a la micromatriz y está contenida en el corral hidrófobo (figura 7B). Después de 5 min, la superficie se aclara con -1 ml de una botella exprimible, que desplaza las células sanguíneas y las proteínas débilmente unidas. Resulta interesante que la sangre fluye hacia los márgenes y se une a los corrales hidrófobos, como se ve por el color rojo alrededor de los márgenes (figura 7C), pero se elimina por completo de la superficie de POEGMA no incrustante.

La figura 8 muestra la salida de la D4 POCT. En la figura 8B, se imprimieron conjuntamente Abd para IgG e IgM humanas como puntos de detección lábiles (con PEG+heparina), de modo que se crea un emparedado completo tras la incubación en sangre, lo que da lugar a puntos fluorescentes que aparecen en las filas 2 y 3. Los márgenes rojos en la figura 8B-F se deben simplemente a la dispersión de la sangre (y el exceso de Abd) unida al corral hidrófobo después del desplazamiento del cepillo de POEGMA por el etapa de aclarado. En sangre completa, la concentración de IgG es de aproximadamente 5 mg/ml (33 pM) y la de IgM es de 1,5 mg/ml (1,6 pM), lo que sugiere una fácil detección de analitos de proteínas de sangre sin diluir a este nivel incluso en este experimento inicial. Las figuras 8E y 8F muestran experimentos de control negativo en los que el chip se incubó con sangre de pollo (E) o PBS (F) de modo que solo las filas de control positivo 1 y 4 generen señal, mientras que las filas 2 y 3 no muestran fluorescencia. Las figuras 8C y 8D son otros dos controles; en la figura 8C, solo el Cy5-Abd anti-IgG se imprimió en los puntos lábiles, de modo que la fila 2 se ilumina pero la fila 3 no, mientras que en el panel 4D, solo el Cy5-Abd anti-IgM se imprimió en los puntos lábiles, de modo que la fila 3 se ilumina, mientras que la fila 2 no. Obsérvese que los Cy5-Abd se imprimieron en altas concentraciones en la circunferencia exterior de los puntos lábiles y solo se disuelven parcialmente al entrar en contacto con la sangre, de modo que su fluorescencia residual todavía satura el detector.

Debido a que la IgG y la IgM tienen una concentración micromolar en sangre, a continuación se probó la sensibilidad del ensayo mediante un ensayo multiplexado para el PSA y la IL-6 humanos. Las curvas de respuesta a la dosis en la figura 9 se produjeron analizando sangre completa de pollo con adición de IL-6 y/o PSA humanos, se añadieron diez microlitros de sangre en cada concentración al chip y se incubaron durante 20 minutos, seguido de un aclarado de 1 ml. Los límites de detección (blanco 3SD) para esta D4 POCT multiplexada son 15 pg/ml para el PSA y 2 pg/ml para la IL-6. En cambio, un ELISA optimizado con estos mismos pares de anticuerpos que requiere 100 pl de suero y 5 horas para completarse, produce límites de detección de 30 pg/ml para el PSA y 0,7 pg/ml para la IL-6. El tiempo de incubación adicional después de 20 minutos mejora el LOD del ensayo de IL-6, que es capaz de detectar 0,3 pg/ml con una incubación de 4 h.

Estos resultados preliminares muestran la potencia de la D4 POCT para proporcionar sensibilidad similar a ELISA multiplexado o mejor con solo 10 pl de sangre completa en 20 minutos.

Ejemplo 6. Las matrices de anticuerpos en POEGMA son muy robustas.

Para investigar la estabilidad de almacenamiento de micromatrices impresas en POEGMA, se midió la respuesta a la dosis de una D4 POCT para la detección del péptido natriurético cerebral (BNP, siglas del inglés brain naturietic peptide), después de 1 día y después de 23 días de almacenamiento a temperatura ambiente (figura 10). Las curvas de respuesta a la dosis produjeron un LOD de 8 pg/ml. Significativamente, no hubo ninguna diferencia en el LOD o intervalo analítico del ensayo después de un almacenamiento en condiciones ambientales durante 3 semanas. Estos resultados también son coherentes con observaciones previas de otros investigadores de que el PEG puede estabilizar proteínas en condiciones ambientales. La larga vida útil en condiciones ambientales es un atributo importante para los dispositivos de lugar de atención, estos dispositivos de diagnóstico impresos no necesitarán almacenarse en un tampón a 4 °C, permitiendo el transporte, almacenamiento y uso a temperatura ambiente.

Ejemplo 7. Optimización de la D4 POCT.

El chip D4 de segunda generación consiste en un cubreobjetos en donde la región central está impresa con los puntos de captura, rodeados de puntos lábiles de los reactivos de detección, de forma similar al chip de primera generación. Se aplica adhesivo y se usa un segundo cubreobjetos para cubrir los puntos impresos de los anticuerpos de captura y detección de modo que los puntos ahora queden contenidos dentro de un canal central expuesto en ambos extremos, con el núcleo analítico del ensayo D4 contenido en el centro del canal (figura 11A). El ancho del canal se puede controlar mediante el área del chip que está cubierta con adhesivo y la cantidad de adhesivo que se aplica controla la altura del canal. Esto permite a los inventores crear canales con volúmenes que varían entre 5 y 50 pl de sangre, de forma coherente con los volúmenes que se pueden obtener con una punción digital. Las dimensiones del canal se seleccionaron cuidadosamente para proporcionar también suficiente fuerza capilar para que, cuando se sostenga una gota de sangre en uno de los dos extremos del canal, entre en el canal por capilaridad (figura 11B-C). Asimismo, la tensión interfacial de la sangre también la mantiene contenida dentro del chip (figura 11D). Este diseño de autocarga y autosellado contiene completamente la sangre dentro del chip.

Ejemplo 8. Diseño de un detector óptico compatible con teléfono móvil con respaldo visual.

El detector óptico se diseñó teniendo en cuenta estos requisitos:

(1) El detector debería ser pequeño y ligero, de modo que se pueda llevar fácilmente en el bolsillo de un usuario, desencadenando de este modo al paciente del detector. Esto está en marcado contraste con el diseño de los POCT actuales (p. ej., iSTAT y Biosite) que son significativamente más grandes y más adecuados para los cuidadores que para un paciente.

(2) El detector óptico debe ser de bajo coste y fácil de fabricar en grandes volúmenes usando tecnología de fabricación ampliamente accesible y de bajo coste

(3) El detector debe ser compatible con una variedad de teléfonos inteligentes.

(4) La óptica no debe requerir ninguna alineación o ajuste

(5) El detector debe poder cuantificar la señal de fluorescencia en presencia de sangre.

(6) El detector debe tener un respaldo visual para permitir la lectura de resultados cualitativos, si no hay un teléfono inteligente disponible.

El diseño del detector se muestra en la figura 12. La carcasa del detector se fabricó en una impresora 3D Stratasys en termoplástico ABS como dos trozos separados: una tapa y un cuerpo. La tapa contiene un inserto para la batería y tiene roscas para permitir que se atornille en el cuerpo del detector. El cuerpo tiene 4 cavidades en las que se pueden insertar LED y proporcionan iluminación en un ángulo de 45° y un marco en el que se puede insertar el filtro de paso de banda. El montaje del detector es sencillo: después de la fabricación de los dos trozos impresos, el filtro de paso de banda se inserta en su soporte y se insertan cuatro LED en sus cavidades prefabricadas y se conectan para permitir el contacto con la tapa cuando se atornille al detector. El montaje se completa después de añadir una lente de aumento 10X, se inserta una batería en la tapa y la tapa se atornilla en el cuerpo del detector. Finalmente, se pega un anillo magnético concéntrico en el borde de la lente del detector.

El uso del detector es igualmente sencillo. La tapa se desenrosca dejando al descubierto una ranura para colocar el chip cargado de sangre, de modo que el cubreobjetos con los anticuerpos impresos esté en la parte inferior (lejos de la tapa). Con el chip colocado en esta configuración, los puntos fluorescentes en la matriz D4 se iluminan desde abajo mediante los LED. Solo la fluorescencia emitida pasa a través del filtro de paso de banda colocado entre el chip y la lente del detector. La lente aumenta los puntos 10X y la cámara del teléfono inteligente captura digitalmente una imagen de la matriz. El detector y la óptica del teléfono inteligente tienen una autoalineación magnética incorporada: se pega un anillo magnético concéntrico tanto en la lente del detector como alrededor de la lente del teléfono inteligente, lo que alinea magnéticamente la óptica de los dos dispositivos.

Ejemplo 9. Detección y d iagnóstico de cáncer.

Las principales barreras para probar múltiples analitos para la detección de cáncer en un entorno de POC son: (1) coste; (2) tiempo de respuesta; y (3) extracción de sangre y manipulación de muestras. El diseño de la D4 POCT aborda estos problemas con un conjunto de tecnologías habilitadoras que forman el núcleo de la D4 POCT, de la siguiente manera: en primer lugar, el coste de las pruebas y el tiempo de respuesta se reducirán mediante la miniaturización, multiplexación y analizando directamente en sangre completa sin diluir obtenida de una punción digital (p. ej., ~10 |jl) sin preprocesamiento ni microfluidos. La miniaturización del ensayo reducirá el consumo de reactivos (y, por lo tanto, el coste) y minimizará las distancias de difusión (y, por lo tanto, el tiempo), mientras que la multiplexación (pruebas de múltiples analitos simultáneamente) ahorrará tiempo y dinero. La prueba directa de sangre completa en un único ensayo integrado permitirá el procesamiento de muestras en una etapa en el sitio. En segundo lugar, para crear un ensayo de POC sencillo y autónomo, se aprovechó la difusión en chip para reunir reactivos separados espacialmente para crear un ensayo funcional y, de este modo, eliminar la necesidad de etapas de transferencia de líquidos y manipulación de microfluidos de muestras o reactivos. En tercer lugar, el ensayo es rápido porque se integra y se realiza directamente en sangre completa en un formato miniaturizado, multiplexado, y sin etapas de lavado, con un tiempo de lectura proyectado de, p. ej., <20 minutos. En cuarto lugar, esta plataforma multiplexada será capaz de cuantificar un panel de biomarcadores con una sola gota de sangre, sin preprocesamiento de muestras. En cambio, la mayoría de los diagnósticos de POC actuales son ensayos de un único analito. En quinto lugar, el ensayo D4 se puede utilizar para cualquier micromatriz de proteínas para la que estén disponibles pares de anticuerpos disponibles y es, por lo tanto, ampliamente aplicable a todos los inmunoensayos heterogéneos.

Ejemplo 10. Diseño de la próxima generación de chips D4.

Se describen modificaciones ilustrativas del chip D4 actual, que pueden mejorar su solidez analítica y rendimiento, en los siguientes párrafos.

Se diseñará y validará un chip D4 que tiene propiedades de autocalibración. En consecuencia, se imprimirá una serie de diluciones de analito en el chip como una fila de puntos de captura de control positivo. La intensidad de los puntos del control positivo proporcionará una curva de respuesta a la dosis que actuará como calibración interna para cada chip. La generación de señales en estos puntos de control significará un ensayo viable al verificar la actividad y difusión de los reactivos de detección. Además, al variar la concentración de la diana dentro de estos puntos de control, habrá un gradiente de señal a través de los puntos que se puede usar para normalizar las intensidades de fluorescencia y reducir la variabilidad entre ensayos. Este gradiente de control también se puede comparar con la señal generada en los puntos de captura de anticuerpos, lo que ayudará en la cuantificación de los niveles diana y reducirá las variables de muestreo, tales como el volumen de sangre añadido al chip, la viscosidad de la sangre, la temperatura de incubación y el tiempo de medición. En esencia, el gradiente de intensidad de puntos de los puntos de control positivo proporcionará una señal de referencia, similar a una curva de respuesta a la dosis, que actuará como calibración interna para cada chip.

Se imprimirá una micromatriz para la detección de una diana dentro del canal central de los chips, como se muestra en la figura 13. Se utilizará AFP como diana de muestra. Esta micromatriz contendrá micropuntos "estables" de anticuerpos de captura anti-AFP y micropuntos "lábiles" de anticuerpos de detección anti-AFP marcados. Además, los micropuntos "estables" de AFP actuarán como patrón de calibración y control positivo.

Para garantizar que los puntos lábiles del anticuerpo de detección impreso (Abd) se disuelvan al entrar en contacto con la sangre, se añadirá PEG soluble a las soluciones de impresión. El PEG soluble se adsorberá preferentemente en el cepillo de POEGMA y bloqueará la adsorción e inmovilización del Abd. Aunque están confinados en puntos simplemente debido a la impresión por inyección de tinta y al proceso de secado macroscópico, estos Abd permanecerán en un estado "lábil" y pueden disolverse y liberarse fácilmente al entrar en contacto con una solución acuosa, como se muestra en los estudios preliminares. La adición de un exceso de PEG soluble al Abd es fundamental, ya que estabiliza los reactivos de detección durante el almacenamiento y, significativamente, actúa como un excipiente que ayuda a resolubilizar el Abd cuando se introduce la gota de sangre de prueba. Al entrar en contacto con una gota de sangre, estos anticuerpos marcados se disolverán en solución y se unirán, y por lo tanto, marcarán, a toda la diana presente en la muestra de sangre.

Como control positivo, se imprimirán puntos de AFP junto con los puntos de anticuerpos de captura. Estos servirán para verificar la actividad y difusión de los reactivos de detección, y la generación de señales en estos puntos de control significará un ensayo viable. Además, al variar la concentración de AFP dentro de estos puntos de control, habrá un gradiente de señal a través de los puntos que se puede usar para normalizar las intensidades de fluorescencia y reducir la variabilidad entre ensayos. Este gradiente de control también se puede comparar con la señal generada en los puntos experimentales de captura anti-AFP, lo que ayudará en la cuantificación de los niveles experimentales de AFP y debería ayudar reducirá las variables de muestreo, tales como el volumen de sangre añadido al chip, la viscosidad de la sangre, la temperatura de incubación y el tiempo de medición.

Para prevenir la coagulación de la sangre, también se imprimirán puntos lábiles de heparina. Este estudio investigará el efecto de la heparina, PEG y la concentración de Abd, así como el peso molecular de PEG, sobre la disolución de los puntos lábiles, la conservación de la actividad de Abd y las capacidades anticoagulantes de la heparina aplicada puntualmente. Las matrices con concentraciones variables de los componentes de puntos de detección se aplicarán puntualmente como se muestra en la figura 13 y se almacenarán en condiciones ambientales de laboratorio durante 1 día, 1 semana y 1 mes. Después de sacarla del almacenamiento, se añadirán 10 j l de sangre a cada chip y se incubarán hasta que se produzca la coagulación. Se usará la fluorescencia residual de los puntos de detección para cuantificar los efectos de los aditivos sobre la solubilidad de estos puntos, mientras que la fluorescencia de los puntos de control positivo de AFP se usará para determinar la conservación de la actividad de Abd. La concentración de AFP dentro de los puntos de control positivo se variará sistemáticamente para determinar el gradiente de concentración óptimo necesario para abarcar completamente el intervalo analítico del detector y delimitar el intervalo fisiológico de concentración de AFP en la sangre. La cantidad de tiempo necesario para que la sangre se coagule dentro del canal central se usará para determinar el efecto de la heparina y el estudio de evolución temporal proporcionará una medida de la vida útil de estos chips.

Un ejemplo de una formulación finalizada para imprimir puntos solubles, incluyendo la concentración y el peso molecular de los aditivos de PEG, sería imprimir en una solución al 1 % de PEG con 10000 PM. Determinación de la cantidad de heparina impresa necesaria para evitar la coagulación de la muestra de sangre en el canal, un ejemplo es que es necesario 1 ng de heparina impresa en cada chip para evitar la coagulación de la sangre. Concentración necesaria de AFP en puntos de control positivo para producir un gradiente de señal útil para la calibración del ensayo, un ejemplo serían los puntos impresos a partir de las siguientes concentraciones de AFP: 1 ug/ml, 10 ng/ml, 100 pg/ml y 1 pg/ml.

Ejemplo 11. Desarrollo de ensayo D4 capaz de detectar AFP directamente en sangre completa. Otras modificaciones ilustrativas conducirán al desarrollo de un ensayo POC cuantitativo para AFP que incorporará el concepto de reactivos de detección impresos como "puntos lábiles". Los factores de mérito (FOM, por sus siglas en inglés, figures-of-merit) de este ensayo se usarán para comparar los cambios en el formato del ensayo descrito adicionalmente en los ejemplos a continuación.

Ensayo cuantitativo D4: Las condiciones de impresión del agente de detección, según lo determinado por los experimentos descritos en el ejemplo 11, se usarán para imprimir matrices para detectar AFP (como se muestra en la figura 13). Se generarán curvas de respuesta a la dosis que abarquen concentraciones de 0 g/ml a 1 pg/ml usando tampón con adición de AFP, seguido de curvas de respuesta a la dosis usando sangre de pollo AFP negativa (elegida porque no contendrá ninguna AFP humana, pero aún reflejará con precisión la complejidad del uso de sangre completa) con adición del analito. Los datos de respuesta a la dosis de 20 diluciones separadas de respuesta a la dosis se ajustarán con una curva logística de cinco parámetros (5-PL). Se realizará estimación de parámetros mediante un algoritmo de Newton reflexivo de región de confianza a gran escala usando MATLAB. El ensayo se evaluará con respecto a su límite de blanco (LOB, por sus siglas en inglés), límite de detección (LOD), intervalo de calibración lineal (ICL), límites de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) superior e inferior y coeficiente de varianza (COV). Se utilizarán veinte repeticiones convencionales de cero para determinar el LOB, que será igual al blanco medio 1,645 (DTblanco). El LOD se basará tanto en el LOB medido como en 20 repeticiones de prueba de una concentración de analito baja que se sabe que produce una señal cercana al LOB y se calculará como LOB 1,645 (DTmuestra de concentración baja). El ICL se determinará a partir del ajuste de 5-PL y se definirá como la región de la curva de calibración dentro de la cual la pendiente permanece lineal y el coeficiente de correlación de la línea no es inferior a 0,995. Los límites superior e inferior de esta región lineal definirán el LOQ superior e inferior. El COV se determinará analizando tres muestras de concentración conocida (que representan valores bajos, medios y altos dentro del ICL) en veinte ensayos separados, con un COV determinado para cada concentración.

Evaluación comparativa frente a una prueba disponible en el comercio: Se usará un equipo de ELISA para AFP disponible en el comercio para comparar la utilidad del ensayo finalizado. Las muestras se analizarán en paralelo para comparar directamente los factores de mérito entre los resultados de ELISA comercial y D4 POCT. Esto conducirá al desarrollo de un ensayo D4 cuantitativo para la detección de AFP a partir de sangre completa con una curva de respuesta a la dosis validada que proporciona el LOD, LOQ, DR, COV y precisión entre ensayos y dentro del ensayo. Los FOM de la D4 POCT serán similares a los del equipo del ensayo ELISA disponible en el comercio o mejores que los de este.

Un ensayo cuantitativo D4 ilustrativo para AFP podría proporcionar una sensibilidad similar o mejor que la del ensayo ELISA en 20 minutos y tendría un LOD de 5 pg/ml y otros FOM equivalentes a los de un ensayo ELISA clínico.

Ejemplo 12. Diseño de un chip para maximizar la sensibilidad

Se diseñará un chip con sensibilidad maximizada colocando los puntos de captura más cerca del punto de entrada de sangre, mientras que los puntos lábiles están corriente abajo para garantizar que todos los antígenos sean capturados por los puntos de captura. Los FOM de este diseño se compararán con los del chip D4 de la generación anterior evaluados en el ejemplo 12.

En los inmunoensayos de flujo lateral tradicionales (LFA, por sus siglas en inglés), la solución de analito disuelve los reactivos de detección solubles antes de llegar a las líneas de prueba de los anticuerpos de captura. Esto es necesario porque la corriente de flujo en un LFA es solo en una dirección y, por lo tanto, los reactivos de detección se pueden disolver en la solución de analito antes de alcanzar los anticuerpos de captura. Este diseño permite que los anticuerpos de detección se unan al antígeno antes de la unión del antígeno-anticuerpo de captura y, por lo tanto, existe la posibilidad de que la unión de antígeno-anticuerpo de detección bloquee la unión de antígeno-anticuerpo de captura. El uso de un par de anticuerpos monoclonales cuidadosamente emparejados minimiza este problema, pero puede aumentar significativamente el coste.

El diseño basado en la difusión del formato propuesto no requiere la colocación corriente arriba de anticuerpos de detección. Sin quedar ligados a teoría alguna, se cree que la sensibilidad del chip aumentará si la solución del analito alcanza los puntos de captura antes de los puntos de detección y debería permitir que el antígeno se una inicialmente a los puntos de captura sin ninguna interferencia de los anticuerpos de detección, ya que los anticuerpos de detección solo llegarán a los puntos de captura por difusión que se produce después de que los puntos de captura se hayan expuesto a la solución del analito. Un ejemplo de esta disposición se muestra en la figura 14, que implica alternar la posición de dos matrices separadas dentro del canal central del chip: 1) Una matriz compuesta de puntos de captura antidiana (amarillo) y puntos de calibración de diana (azul) y 2) una matriz de puntos de detección de antidiana solubles (rojo).

Estos estudios conducirán a la determinación de cómo el orden en el que la sangre entra en contacto con los puntos de captura y detección afecta a la sensibilidad del ensayo, por ejemplo, colocar puntos de captura corriente arriba de los puntos de detección puede mejorar la sensibilidad del ensayo de 5 pg/ml a 0,5 pg/ml.

Ejemplo 13. Efecto de la distancia de difusión en el ensayo D4.

Se realizarán pruebas adicionales de la distancia de difusión en el ensayo D4. Se configurará un formato de ensayo como se muestra en la figura 15 en donde cada punto de captura estará rodeado por múltiples puntos de reactivos de detección solubles en proximidad estrecha. Sin quedar ligados a teoría alguna, se cree que el tiempo de reacción del ensayo disminuirá debido a los múltiples puntos de reactivos de detección solubles ubicados proximalmente y esta geometría podrá proporcionar concentraciones locales mayores de reactivos de detección disueltos alrededor de cada punto de captura y, de este modo, reducirá la cantidad de reactivo de detección que se puede imprimir en el chip.

Esta geometría proporciona distancias de difusión más cortas y, por lo tanto, un marcaje potencialmente más rápido del antígeno capturado que la geometría convencional usada en los estudios preliminares en los que los puntos de captura están rodeados por anillos concéntricos de anticuerpo de detección marcado. La matriz de la Figura 15 se expondrá adicionalmente a un intervalo de dosis de antígeno y los FOM del ensayo se determinarán como se ha descrito en el ejemplo 12 y se compararán con los del ensayo D4 convencional mostrados en los estudios preliminares. Suponiendo que los FOM sean equivalentes a los del ensayo D4 convencional o mejores que los de este, se utilizará un vídeo de evolución temporal para evaluar el grado en que se puede acortar el ensayo conservando al mismo tiempo las métricas de rendimiento del ensayo D4 convencional.

Aunque sería ventajoso un ensayo abreviado, también es útil determinar cómo esta geometría puede reducir potencialmente el coste del ensayo al reducir la cantidad de anticuerpo de detección impreso en el chip. En este caso, las concentraciones locales de anticuerpos de detección alrededor de cada punto de captura deben ser mayores durante la disolución de los puntos de detección. Sin quedar ligados a teoría alguna, esta concentración local más alta debido a la proximidad a los puntos debería permitir que menores cantidades de anticuerpo de detección impreso produjeran la misma concentración local alrededor de cada punto de captura que la que se logra con las cantidades mayores de anticuerpo de detección que se imprimen en el formato D4 de primera generación. Disminuyendo sistemáticamente la cantidad de reactivo de detección impreso en cada punto de detección, se determinará la cantidad mínima de reactivo de detección necesaria para producir FOM equivalentes a los del ensayo D4 convencional.

Además de las posibles ventajas analizadas anteriormente, esta geometría debe proporcionar a cada punto de captura una exposición más uniforme al anticuerpo de detección durante la disolución de los puntos de detección, ya que cada punto de captura se encuentra a la misma distancia de los puntos de detección más cercanos. Esta geometría se incorporará al diseño final que se describe en el ejemplo 15 a continuación, si se observa una reducción útil en el tiempo de ensayo, los requisitos de anticuerpos de detección y/o la variabilidad del ensayo.

Estos estudios ilustrativos conducirán a la determinación de cómo la distancia de difusión afecta el tiempo de ensayo y la cantidad de anticuerpo de detección impreso en el chip. Por ejemplo, la geometría propuesta puede reducir el tiempo necesario para lograr una sensibilidad de 5 pg/ml de 20 minutos a 15 minutos. Otro ejemplo sería que la geometría propuesta permite reducir el anticuerpo de detección total impreso en el chip de 200 picogramos a 50 picogramos.

Ejemplo 14. Integración de diseño de chips.

Todas las características y posibles cambios de geometría de impresión examinados en los ejemplos 11-14, se tendrán en cuenta y se combinarán en un solo formato de ensayo, y el chip optimizado final se probará para determinar sus FOM usando sangre de pollo con adición de analito. El límite de blanco (LOB), límite de detección (LOD), intervalo de calibración lineal (ICL), límites de cuantificación (LOQ) superior e inferior y coeficiente de varianza (COV) se determinarán como se ha descrito en el ejemplo 12 y se compararán con los resultados de un equipo de prueba de ELISA basado en placa disponible en el comercio para AFP.

Los ensayos D4 ilustrativos para la detección de AFP descritos en el presente documento tendrán mejor sensibilidad, acortamiento del tiempo de ensayo o reducción de los requisitos de anticuerpos de detección que aún mantienen una sensibilidad similar a ELISA o mejor.

Ejemplo 15. Desarrollo del ensayo de AFP-L3.

Se usarán características de diseño identificadas durante el desarrollo del ensayo de AFP en los ejemplos 10-14 para producir un ensayo D4 equivalente para la isoforma de AFP-L3. La FOM del ensayo se determinará como se ha descrito en el ejemplo 12 y se usará una comparación en paralelo con un equipo de prueba de ELISA basado en placa disponible en el comercio para comparar el ensayo de AFP-L3.

Los ensayos D4 ilustrativos para la detección de AFP-L3 descritos en el presente documento serán capaces de proporcionar una sensibilidad similar a ELISA o mejor en 20 minutos. Por ejemplo, los ensayos tendrán un LOD de 5 pg/ml y otras FOM equivalentes a las de un ELISA clínico.

Ejemplo 16. Ensayo D4 doble para AFP y AFP-L3.

Se usarán condiciones y geometrías de impresión optimizadas, según lo determinado por los experimentos descritos en los ejemplos 10-15 para imprimir matrices diseñadas para detectar tanto AFP como AFP-L3 (la matriz doble se representa en el formato de ensayo D4 original en la figura 16, aunque se puede haber elegido una nueva geometría en este punto). Se generarán curvas de respuesta a la dosis que abarquen concentraciones de 0 g/ml a 1 pg/ml usando tampón con adición de analito, seguido de curvas de respuesta a la dosis usando sangre de pollo negativa para analito con adición de analito. Cada analito se probará en la matriz doble individualmente y los FOM se compararán con los determinados en los ejemplos 15 y 16. En inmunoensayos múltiples, existe la posibilidad de que se produzca una reactividad cruzada imprevista entre los anticuerpos de captura y de detección no coincidentes o sus dianas. La exposición de matrices a sangre con adición de un solo marcador revelará cualquier posible reactividad cruzada y, si es necesario, se utilizarán rondas posteriores de selección de anticuerpos. El ensayo se evaluará con respecto a su LOB, LOD, ICL, LOQ y COV, como se ha descrito en el ejemplo 12.

Los ensayos D4 duplicados ilustrativos para la detección tanto de AFP como de AFP-L3 descritos en el presente documento, serán cuantitativos y mantendrán los FOM de las pruebas de un solo analito evaluadas en los ejemplos 15 y 16.

Ejemplo 17. Optimización del diseño de detectores.

Se optimizarán varios aspectos del detector, incluyendo el coste, longitud de onda, ancho espectral y potencia de salida de los LED, así como el ángulo de la iluminación de los LED. También existen diversas opciones de filtros ópticos, que se evaluarán con el objetivo principal de mantener el coste general lo más bajo posible. Las pruebas se realizarán mediante la captura de imágenes de un chip D4 que contiene una matriz normalizada de proteína marcada con fluorescencia con cada variación del detector, y se elegirán los componentes de menor coste capaces de suministrar una intensidad de señal suficientemente alta a la cámara del teléfono móvil.

Los detectores ilustrativos descritos en el presente documento estarán compuestos por los componentes menos costosos que aún proporcionen imágenes suficientes de las matrices de prueba. Un ejemplo sería un detector que comprenda componentes por un total de 10 $ y produzca una intensidad promedio de 1000 recuentos/píxel/segundo cuando se capturan imágenes de una matriz de prueba.

Ejemplo 18. Escribir una aplicación de teléfono móvil para cuantificar las intensidades de los puntos.

Existen dos opciones para el análisis de imágenes: 1) transmitir la imagen a un servidor central para su análisis y 2) realizar el análisis en el teléfono. La opción de realizar el análisis de imágenes en el teléfono es adecuada para las aplicaciones de los PIBM donde no se puede disponer fácilmente de una señal de datos. Por ejemplo, la biblioteca de procesamiento de imágenes JavaCV se puede adaptar para satisfacer estas necesidades. Durante el desarrollo de la aplicación, se usarán imágenes generadas por los ejemplos 10-17 para comparar el análisis por teléfono con los resultados obtenidos previamente del programa informático de análisis de imágenes incluido con los exploradores de micromatrices comerciales.

Una aplicación ilustrativa descrita en el presente documento comprenderá una herramienta de análisis de imágenes basada en JavaCV que es capaz de identificar puntos de prueba basándose en su posición y producir una medición de intensidad de píxel promedio/punto. Por ejemplo, la aplicación también debe poder hacer referencia a una curva de respuesta a la dosis de referencia y cambiar la escala de la intensidad de los puntos de prueba según el patrón de calibración en el chip.

Ejemplo 19. Evaluación comparativa del sistema completo.

Una vez finalizado el detector y la aplicación optimizados, se generarán los nuevos FOM y se compararán con los obtenidos en el ensayo doble del ejemplo 16. Se desarrollará un POCT integrado que proporcione resultados de ensayo en un teléfono inteligente en 20 minutos con métricas de rendimiento que sean comparables o mejores que un ELISA realizado en un laboratorio central.

Un sistema ilustrativo sería un POCT integrado que proporcione resultados de ensayo en un teléfono inteligente en 20 minutos con métricas de rendimiento que sean comparables o mejores que un ELISA realizado en un laboratorio central.

Ejemplo 20. Pruebas clínicas del POCT desarrollado: Pruebas con muestras de sangre simuladas

El ensayo D4 integrado se optimizará mediante ensayos que se llevarán a cabo en una escala de 4 log de concentración en sangre de pollo con adición de analito en el intervalo de 0 g/ml a 1 pg/ml. Los estudios descritos a continuación serán realizados por técnicos clínicos y no por los desarrolladores de la D4 POCT. Esta es una distinción importante porque los experimentos descritos en los ejemplos 1-20 serán realizados por personal que está profundamente involucrado en el desarrollo del ensayo D4. Debido a que, en última instancia, el ensayo lo llevará a cabo personal, normalmente técnicos clínicos en un entorno de PIBM y, posiblemente, incluso los usuarios, que no hayan tenido una exposición previa al formato del ensayo, es importante que en la transición desde el laboratorio al uso sobre el terreno, el ensayo se entregue personas que no estén íntimamente implicadas en el desarrollo del ensayo para verificar que los FOM determinados en el laboratorio coincidan en un entorno más cercano al sitio de los PIBM.

La tabla 1 resume los criterios de validación para cada tipo. Debido a que los resultados del ensayo D4 serán fundamentalmente cuantitativos (una lectura digital de la intensidad de la fluorescencia), se evaluará la precisión de estos resultados para informar la inferencia estadística. Todos los puntos de prueba se ejecutarán por triplicado a menos que se indique lo contrario. La precisión del ensayo se evaluará en primer lugar (tabla 1). El número de repeticiones se puede ajustar para pruebas posteriores en función de la precisión observada, con el objetivo final de garantizar que los parámetros de rendimiento diana se puedan resolver con 95 % de confianza. Los resultados de la comparación de métodos cuantitativos para AFP de un solo analito y AFP-L3 frente al ensayo múltiple de AFP AFP-L3 serán un conjunto de regresiones lineales con el ensayo múltiple D4 como caso de prueba y los ensayos de analito único como caso de referencia. Se calculará la pendiente, la intersección y el coeficiente de variación, con intervalos de confianza adecuados al 95 %. Como el ensayo D4 de analito único no está caracterizado, también se realizará un análisis de Bland/Altman para evitar suposiciones acerca de los datos.

Tabla 1. Parámetros analíticos para evaluar en el desarrollo de ensayos sencillos y dobles en la transición del ensa o al uso en el cam o.

Una vez que se hayan desarrollado el prototipo AFP D4 y las D4 POCT AFP AFP-L3 dobles, se realizará una validación final completa siguiendo las rutas destacadas en la tabla 1. Antes de comenzar el trabajo, se crea un plan de validación detallado, que incluye SOP, formato y formularios de datos, detalles sobre el análisis estadístico final y replicación suficiente para garantizar la potencia estadística (habilitado por los datos preliminares recopilados hasta la fecha). Los resultados de esta validación se compararán con criterios de diagnóstico aceptados en general, que pueden incluir: sensibilidad cualitativa y especificidad >95 %; pendiente de comparación del método cuantitativo 0,95 1,05, sesgo <5 %, R2 > 0,90; precisión 85-115 % de la nominal; precisión (CV) <10 %; linealidad > 0,90, entre otras medidas específicas del ensayo (LOD, LOQ, intervalo de ensayo).

Los resultados ilustrativos de utilidad clínica comprenderán una validación de los ensayos D4 descritos en el presente documento por usuarios sin experiencia que produzcan una sensibilidad y especificidad >95 %; pendiente de comparación del método cuantitativo 0,95-1,05, sesgo <5 %, R2 > 0,90; precisión 85-115 % de la nominal; precisión (CV) <10 %; linealidad > 0,90, entre otras medidas específicas del ensayo (LOD, LOQ, intervalo de ensayo) descrito en el ejemplo 21.

Ejemplo 21. Pruebas en sangre humana recién extraída.

Después de las pruebas del ensayo D4, en el sitio 1 se llevará a cabo un ensayo a pequeña escala (~20) con sangre de paciente recién extraída. Los resultados del D4 se compararán con un ELISA para AFP y AFP-L3. Se describen a continuación detalles del estudio clínico y protocolos experimentales.

Diseño de estudio clínico: Esta sección se aplica tanto a los estudios clínicos previos a la validación que se llevarán a cabo en el sitio 1 con un número limitado de muestras de sangre de pacientes, así como al ensayo clínico a mayor escala de la D4 POCT en el sitio de PIBM: Sitio 2. La mayor diferencia entre los dos estudios será el tamaño de la cohorte, que se prevé que sea de ~20 por grupo en el sitio 1 y de ~100 por grupo en el sitio clínico en PIBM (países de ingresos bajos y medios).

Población de estudio: Se obtendrá la aprobación para el estudio del comité de revisión de ética institucional en cada sitio del estudio y se obtendrá consentimiento informado de todos los participantes, incluyendo pacientes con carcinoma hepatocelular (CHC) y controles sanos.

El CHC se definirá en función de las características de ecografía, TC o IRM y bioquímica (serología de AFP y enzimas de la función hepática) y serán confirmadas por histopatología, según las pautas de la Asociación Estadounidense para el Estudio de Enfermedades Hepáticas. El estadio del tumor se definirá según el sistema de estadificación de Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC). Los tumores con estadio BCLC 0+A se clasifican como CHC en estadio temprano. El diagnóstico de infección crónica por VHB incluye la presencia de HBsAg durante los 6 meses anteriores, concentraciones de ADN del VHB superiores a 103 copias por ml y concentraciones elevadas de alanina aminotransferasa en suero, según las pautas de prevención y tratamiento de la infección crónica por VHB. El diagnóstico de cirrosis se basará en la histopatología de las muestras de biopsia hepática y en pruebas clínicas, de laboratorio y de captura de imágenes cuando sea posible, incluyendo contorno de hígado nodular, presencia de ascitis, hipertensión portal, varices, agrandamiento del lóbulo caudado, esplenomegalia y anastomosis venosas portales colaterales. Los pacientes con cirrosis que tienen concentraciones elevadas de AFP deberán someterse a captura de imágenes mediante múltiples métodos (ecografía, RC o IRM) y no tener pruebas de una masa hepática durante al menos 3 meses antes de la inscripción. Se excluirán del estudio pacientes que tengan antecedentes de otros tumores sólidos.

Los controles sanos serán donantes de sangre elegibles con bioquímica hepática normal, sin antecedentes de enfermedad hepática, sin hepatitis vírica y sin enfermedad maligna. Los grupos se emparejan en las dos cohortes por edad y sexo en la medida de lo posible.

Análisis estadístico: En la etapa de prueba, se reclutará un grupo de pacientes con CHC y un grupo de sujetos de control sanos. Los niveles de AFP se resumirán por la media, la mediana y el error típico en los dos grupos por separado. Se probará la hipótesis nula de que la mediana de los niveles de a Fp en los dos grupos es igual frente a la hipótesis alternativa de que son desiguales usando la prueba de Mann-Whitney. Para la prueba de diagnóstico, un sujeto se clasifica como "positivo" si el nivel de AFP está por encima de un punto de corte determinado y, de lo contrario, el sujeto se clasifica como "negativo" para la prueba. Diferentes puntos de corte producen diferentes características operativas de la prueba. Específicamente, la sensibilidad de la prueba es la proporción de sujetos con CHC que se clasifican correctamente como "positivos" en la prueba. La especificidad es la proporción de sujetos sin HCC que se clasifican correctamente como "negativos". Además, el valor predictivo positivo es la proporción de sujetos que son verdaderos positivos entre los que se clasifican como positivos en la prueba; y el valor predictivo negativo es la proporción de sujetos que son verdaderos negativos entre los que se clasifican como negativos. La curva de características operativas del receptor (ROC) se obtiene trazando la proporción de verdaderos positivos frente a la proporción de falsos positivos en diversos puntos de corte de la prueba. El área bajo la curva (ABC) ROC se usará para evaluar el valor diagnóstico de la prueba. Según la hipótesis nula de que la prueba no tiene valor diagnóstico, el ABC es igual a 0,5 y un valor de ABC mayor (hasta 1) indica un valor diagnóstico mayor. Con un nivel de significación de 0,05, el número de sujetos en cada uno de los dos grupos (casos y controles) necesarios para lograr el 80 % de potencia para rechazar la nula es de aproximadamente 130, 60, 30 y 20, si la verdadera ABC es 0,6, 0,65, 0,7 y 0,75, respectivamente. También se usará una curva de características operadoras del receptor para buscar un valor de corte óptimo para el diagnóstico maximizando la suma de sensibilidad y especificidad. La sensibilidad, especificidad, el valor predictivo positivo y el valor predictivo negativo de la prueba con el punto de corte óptimo se calcularán con sus intervalos de confianza al 95 %.

Se realizarán análisis estadísticos con R (versión 3.0.2) y SAS (versión 9.0). Las diferencias entre dos grupos independientes se probarán con la prueba de U de Mann-Whitney (variables continuas y análisis no paramétricos). Se construirán curvas de características operativas del receptor (ROC) para evaluar la sensibilidad, especificidad y áreas bajo las curvas (ABC) respectivas. El valor de corte óptimo para el diagnóstico se investigará maximizando la suma de sensibilidad y especificidad. Además, la sensibilidad y especificidad por debajo del valor de corte óptimo se calcularán junto con sus intervalos de confianza al 95 %. Estas cantidades y sus intervalos de confianza al 95 % se compararán con los calculados a partir de la etapa de prueba.

Los ensayos de D4 ilustrativos de sangre humana recién extraída descritos en el presente documento proporcionarán una estimación de los valores de corte óptimos para el diagnóstico con AFP y AFP-L3 maximizando la suma de sensibilidad y especificidad. Un ejemplo sería un valor de corte de 250 ng/ml de AFP y 100 ng/ml de AFP-L3 que proporciona 90 % de sensibilidad y 85 % de especificidad.

Además, los ensayos D4 descritos en el presente documento serían en un formato de POCT integrado que proporcione resultados de ensayo en un teléfono inteligente en 20 minutos con métricas de rendimiento que sean comparables o mejores que un ELISA realizado en un laboratorio central. Algunos ejemplos de ELISA disponibles en el comercio para la evaluación del rendimiento incluyen el equipo de ELISA Quantikine de la alfafetoproteína humana (DAFP00) de R&D systems, con un LOD de 46 pg/ml y un intervalo de ensayo de 312 pg/ml a 20 ng/ml, con un % de CV <10 en todo el intervalo de ensayo.

EJEMPLO 22. Matriz de anticuerpos de POEGMA para la captura de eritrocitos: Resultados iniciales

Los resultados iniciales se muestran en las figuras 18-24.

Para una morfología adecuada, el tampón de impresión desarrollado internamente se puede usar para todos los anticuerpos excepto el anticuerpo anti-D GAMA401, que debe imprimirse como se ha recibido.

La matriz parece específica para los grupos sanguíneos A, B, O.

No estaba disponible sangre D-negativa, de modo que aún no se ha demostrado la especificidad del anticuerpo anti-D GAMA401.

El anticuerpo anti-D F8D8 no produjo señal en ninguna de las tres muestras de sangre analizadas; por lo tanto, no se pudo evaluar la morfología de los puntos.

Los resultados demuestran la producción de una matriz con lectura intuitiva.

EJEMPLO 23. Detección de ADN

Se realizó polimerización enzimática iniciada en superficie (SIEP, Surface-Initiated Enzymatic Polymerization) en el portaobjetos de vidrio manchado con aplicación puntual de cebadores oligonucleotídicos marcados con Cy5 incubando cada pocillo del portaobjetos con 10 U de TdT, monómero de dATP 100 j M y Cy3-nucleótido dATP 0,5 j M, 1 j M, 2 |jM o 5 j M o un terminador de colorante, Cy3-didesoxinucleótidos (Cy3-ddATP) en 100 j l de tampón TdT. Se llevó a cabo SIEP durante 1 h a 37 °C, después de lo cual los portaobjetos se lavaron tres veces con tampón SSC que contenía Tween 20 al 0,1 % para facilitar la eliminación de cualquier reactivo unido de forma inespecífica.

Marcaje fluorescente en chip de hibridación de ARN por SIEP. Se seleccionó una secuencia de ADN del gen de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como sistema modelo para analizar el ensayo de los inventores. La sonda de PNA de 17 unidades 5'-biotinilada completamente complementaria [5'-Ac-GTCCACCACCCTGTTGC-lisinabiotina-3', 1 j M] y la sonda de PNA inespecífica derivada de la secuencia del virus de la hepatitis B (VHB) [5'-Ac-ACCTTGTCATGTACCAT-lisina-biotina-3', 1 j M] se mezclaron individualmente con estreptavidina (2,5 j M) y después se aplicaron puntualmente usando una impresora sin contacto (Piezzorray, Perkin-Elmer) en un cepillo de poli(oligo(etilenglicol)metacrilato) (POEGMA) no incrustante, 16,20 cultivado sobre un sustrato de vidrio. Los portaobjetos con aplicación puntual de las sondas se incubaron después durante una noche en una cámara de vacío y se aclararon con tampón SSC 1x que contiene Tween 20 al 0,1 %, antes de su uso. Se generó una curva de respuesta a la dosis de una diana hibridada incubando las sondas impresas con una solución del ARN diana que abarcaba un intervalo de concentración de 1 pM-0,1 j M. Cada solución diana se calentó a 95 °C durante 10 min antes de la hibridación y después se inactivó en hielo y se incubó con la sonda impresa. El ensayo se llevó a cabo usando dos dianas: (1) una diana de ARN sintético de 21 unidades [5'-rGrCrArArCrArGrGrGrUrGrGrUrGrGrAr-CrCrUrCrA-3'] que es complementaria de la sonda y una (2) ARNm de GAPDH transcrito in vitro de longitud completa (~1,4 kb, detalles hallados en SI). Cada diana se incubó durante una noche (~16 h) con agitación suave a 42 °C en el tampón de hibridación (SSC 3x, Tween 20 al 0,1 % y urea 4,95 M). El ARN sintético se usó como se recibió mientras que el ARNm de GAPDH transcrito in vitro se usó como se recibió o se fragmentó mediante incubación en el reactivo de fragmentación a 70 °C durante 15 min. Para dianas de ARN fragmentado, después del aclarado (3x) con el tampón de lavado (SCC 1x, Tween 20 al 0,1 %), el ARN diana fragmentado unido se desfosforiló enzimáticamente en el chip (0,0625 unidades/pl de fosfatasa en BSA al 0,125 % y Tween 20 al 0,1 %) a 37 °C durante 1 h para garantizar la disponibilidad del 3'-OH. El 3'-OH de la diana de ARN unida se convirtió después en ADN mediante SlEP, usando PaP para incorporar un oligo-dATP corto (6 unidades/pl de PaP y dATP 500 pM en tampón PaP 1x) a 37 °C durante 2 h, seguido de SIEP usando TdT para incorporar Cy5-dATP (0,1 unidades/pl de TdT, dATP 100 pM y Cy3-dATP 0,5 pM en tampón TdT 1x) a 37 °C durante 1 h. A continuación, los portaobjetos se aclararon en tampón SSC 1x con Tween 20 al 0,1 % durante 30 min y exploró inmediatamente en un explorador GenePix. A continuación, se representó gráficamente la intensidad de señal promedio del punto (con fondo restado) en función de la concentración de ARN diana.

EJEMPLO 24. Un ensayo de unión competitiva para la detección en una sola etapa de secuencias de microARN

Aunque esta realización es similar a un inmunoensayo competitivo, el método de suministro de la diana marcada/competidora es diferente, en este formato, la diana marcada no se añade a la solución de analito, sino que, en cambio, se hibrida directamente con la sonda antes de la aplicación puntual. Como tal, este formato se basa en micropuntos de sondas que se han hibridado con una diana marcada antes de la aplicación puntual. El diseño de la secuencia de esta diana marcada para incluir diversas bases no complementarias, provocará un desplazamiento de esta diana prehibridada, marcada parcialmente complementaria por cualquier diana presente en una solución de analito (la diana presente en la solución de analito no contiene ninguna base mal emparejada y, por lo tanto, se hibridará con mayor afinidad con la secuencia de la sonda). En este formato, se usa una disminución de la intensidad de la señal de un micropunto para cuantificar la diana en la muestra de analito. De forma ideal, este método evitaría una etapa de purificación de ARN. Sin embargo, incluso si es necesaria la purificación de ARN, este método todavía tiene el potencial de eliminar la transcripción inversa, el marcaje y/o la amplificación por PCR.

Los siguientes parámetros se optimizarán con respecto a la sensibilidad y la relación de señal con respecto a ruido. 1. Longitud de la secuencia; 2. Contenido de la secuencia (GC frente a AU frente a TA); 3. Singularidad de secuencia (¿contiene el genoma ejemplos de otras secuencias extremadamente similares?) 4. Propiedades de la solución de analito (fuerza iónica, pH, etc.); 5. Temperatura; 6. Ubicación/contenido de bases mal emparejadas (comienzo/final de la sonda frente a la mitad de la sonda, AC frente a AG frente a AA, etc.); 7. Longitud de la sonda (cuántas/qué bases solapantes aparecen entre las hebras diana y de sonda, ¿contiene la sonda salientes antes/después de la parte complementaria?); 8. Tiempo de incubación. Aunque 1-3 están en función de la secuencia diana y no se pueden modificar, 4-8 se pueden usar para adaptar la unión de sonda-diana.

En algunas realizaciones de la invención, los puntos solubles de una diana marcada se imprimirán junto con los puntos de sonda. Esta técnica se parecería más a los ensayos tradicionales basados en matrices de ADN, donde los cambios en la expresión génica se miden marcando un grupo de control con un marcador (Cy3, por ejemplo) y un grupo experimental con un marcador separado (tal como Cy5). Sin embargo, en esta realización, solo la diana de "control" está marcada, que se añade a la solución de analito a medida que se disuelven los puntos solubles de la diana marcada. El grado en que esta diana marcada se une a los puntos de sonda estará inversamente relacionada con la concentración de la secuencia diana sin marcar presente en la solución de analito.

Las secuencias adecuadas incluyen:

• diana de miARN (mir-155)

5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU

• Sonda de LNA

5'-CCTATCACGATTAGCATTAA-biotina

• dianas de miARN marcadas con complementariedad parcial (A cambiada a C, mutación en negrita subrayada)

5’ uU£AUGCUAAUCGUGAUAGGGGü Gyñ

5 - u yj c c i j g c i a a l c g i g a i j a g g g g l -Cy 5

5 ’ -U UCCUGCUCAl JCGUGAU AGGCrGlJ-Cy 5

5 M n JCCl JGCI TCC1 JCGl JGAt IA G flf if f l J-Cv5

5’ l HICCUGCUCCGCCÍLGCUAGGGGl -Cy5

51 -üU tx : y JGCIJ££t;CGV G Q uCGGGG y -Cy5

EJEMPLO 25. Matrices de células diana para inmunohistoquím ica mejorada

La inmunohistoquímica (IHQ) desempeña una función clave en el campo de la patología y su importancia está destinada a aumentar a medida que sean necesarias pruebas diagnósticas acompañantes para las nuevas terapias dirigidas. Sin embargo, la subjetividad inherente de la evaluación de un valor objetivo (la concentración de proteína in situ) sugiere que se necesitan nuevas tecnologías para alcanzar la precisión necesaria en las pruebas diagnósticas acompañantes.

La IHQ desempeña con frecuencia una función clave en la asistencia al paciente y en la determinación del desarrollo del tratamiento. Un número cada vez mayor de fármacos están diseñados para dirigirse a tipos celulares específicos y/o infrecuentes, pero, debido a los posibles efectos secundarios y al alto coste de muchos de estos fármacos, la IHQ se usa con frecuencia para predecir la respuesta al fármaco antes de la administración del fármaco. Por ejemplo, el uso de trastuzumab (Herceptin) solo está indicado en el tratamiento del 20-30 % de los cánceres de mama en los que el receptor HER2/neu está sobreexpresado y, antes de la prescripción de trastuzumab, se deben evaluar biopsias tumorales de cáncer de mama mediante IHQ y otros métodos para determinar si de hecho está presente la sobreexpresión de HER2. Sin embargo, es bastante difícil lograr resultados reproducibles mediante IHQ debido a diversas fuentes de variabilidad, que incluyen condiciones de fijación, pretratamiento de la muestra, reactivos, métodos de detección, procedimientos de lavado e interpretación de resultados. Esta falta de reproducibilidad presenta un reto importante y diversos estudios han demostrado la necesidad de mejorar las medidas de control de calidad usadas en los ensayos de IHQ. En un estudio de los resultados de las pruebas de IHQ para la sobreexpresión de HER2, se encontró una tasa de discordancia del 15 % entre las pruebas locales iniciales y las pruebas de laboratorio centrales de seguimiento.

Las células individuales se imprimirán en matrices para su análisis. La morfología natural de una muestra tisular se conserva en gran medida durante la IHQ tradicional y, aunque en algunos casos esto es necesario y útil, hay muchos casos en los que simplemente complica el análisis. Por ejemplo, si se está examinando una biopsia tisular para determinar la sobreexpresión de un receptor de superficie en particular, no es necesario que las células permanezcan incluidas en una muestra tisular para su análisis. Al organizar las células en una matriz, se simplifican en gran medida la adquisición y el análisis de imágenes, ya sea realizadas visualmente o en un formato automático.

Se usarán agentes de captura específicos para el tipo de célula diana para limitar el número de células extrañas. La IHQ tradicional implica el análisis de secciones tisulares completas que consisten en un gran número de células y, con bastante frecuencia, la mayoría de estas células no son importantes si el objetivo es caracterizar tipos celulares específicos y/o infrecuentes. Mediante el uso de agentes de captura inmovilizados en la superficie, tales como anticuerpos, para dirigirse a tipos celulares específicos, será posible seleccionar los tipos celulares específicos y/o infrecuentes de interés. Esta técnica se puede usar para limitar el número de células extrañas que se analizan y, de este modo, reducir el tiempo de análisis, los requisitos de reactivos y la posibilidad de falsos positivos como resultado.

La relación de señal con respecto a ruido y la interpretación del ensayo se pueden mejorar significativamente al eliminar el ruido creado por la adsorción inespecífica de los agentes de detección marcados al fondo del sustrato, produciendo menos falsos positivos y resultados más sensibles y cuantitativos. Además, los procedimientos de lavado pueden reducirse en gran medida o incluso eliminarse debido a la falta de adsorción inespecífica, simplificando en gran medida los procedimientos de ensayo y mejorando la fiabilidad y reproducibilidad.

A continuación se muestra un método adecuado para preparar matrices según este aspecto de la invención. Se usará polimerización por radicales por transferencia de átomos iniciada en la superficie para recubrir portaobjetos de vidrio con metacrilato de poli(oligo(etilenglicol)) (POEGMA). Recientemente, los inventores han demostrado la capacidad de este recubrimiento no incrustante para eliminar por completo el ruido de fondo provocado por la adsorción inespecífica de células y proteínas en ensayos realizados en líquidos biológicos complejos tales como la sangre y el lisado celular. Las matrices de micropuntos de anticuerpos anti-HER2/neu se imprimirán directamente sobre la superficie de POEGMA. Estos micropuntos se crearán usando un método de creación de patrones de anticuerpos sobre superficies de POEGMA desarrollado en el laboratorio de los inventores que elimina la necesidad de activación y desactivación química para lograr micropuntos de anticuerpos estables en la superficie no incrustante y simplifica en gran medida el proceso de fabricación. Además, los inventores han mostrado que los anticuerpos impresos en superficies de POEGMA mediante esta técnica tienen una vida útil excepcionalmente larga en condiciones ambientales normales, sin necesidad de refrigerar o almacenar en tampón, lo que hace que el almacenamiento y transporte de estas matrices sea mucho más sencillo. Se usarán muestras de tumores de mama, que ya han recibido una puntuación de expresión de HER2/neu de 0 a 3+, para evaluar el ensayo. Las muestras tumorales se tratarán con colagenasa D y las matrices anti-HER2/neu en POEGMA se expondrán a la suspensión celular resultante. Las células positivas para HER2/neu serán capturadas por los micropuntos anti-HER2neu (se usarán micropuntos circulares de 10 pm de diámetro de modo que haya aproximadamente 1 célula por cada micropunto) y se usará marcaje posterior con un segundo anticuerpo anti-Her2/neu para cuantificar la expresión de Her2/neu de cada célula. Los resultados se compararán con los valores de expresión de HER2/neu previamente determinados de 0 a 3+.

Esta realización hará que las pruebas de IHQ sean más fiables, más rápidas, menos costosas y más fáciles de aplicar en el lugar de atención. La expresión de HER2/neu en tumor de cáncer de mama se ensayará usando esta realización de la invención.

Si bien se han mostrado y descrito en el presente documento realizaciones preferidas de la presente invención, resultará evidente para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. A los expertos en la materia se les ocurrirán ahora numerosas variantes, cambios y sustituciones sin desviarse de la invención. Debe entenderse que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento al poner en práctica la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes estén cubiertos por ellas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un chip que comprende un canal que lo atraviesa y una capa de polímero no incrustante dispuesta en al menos una superficie del canal, en donde el canal está sustancialmente incluido dentro del chip, en donde el chip comprende además al menos un agente de captura que está unido directamente, de forma no covalente, a la capa de polímero no incrustante, en donde la capa de polímero no incrustante comprende un homopolímero de metacrilato de metilo de oligoetilenglicol polimerizado (OEGMA) terminado en hidroxi, o un copolímero de OEGMA terminado en metoxi y OEGMA terminado en hidroxi, y en donde la capa de polímero no incrustante tiene un grosor de 10 a 150 nm.

2. El chip de la reivindicación 1, en donde la capa de polímero no incrustante tiene un grosor de 30 nm.

3. El chip de la reivindicación 1, en donde el chip comprende además al menos un agente de detección y en donde el al menos un agente de detección se disuelve al entrar en contacto con un líquido biológico.

4. El chip de la reivindicación 3, en donde el líquido biológico se selecciona de la lista que consiste en sangre, suero, plasma, líquido linfático, líquido biliar, orina, saliva, moco, esputo, lágrimas, líquido cefalorraquídeo (LCR), lavado broncoalveolar, lavado nasofaríngeo, lavado rectal, lavado vaginal, lavado colónico, lavado nasal, lavado de garganta, líquido sinovial, semen, líquido ascítico, pus, leche materna, líquido del oído, sudor y líquido amniótico.

5. El chip de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el chip es capaz de analizar un líquido corporal para detectar un analito en el mismo, opcionalmente, en donde el analito es o comprende un antígeno del grupo sanguíneo A humano, un antígeno del grupo sanguíneo B humano, un antígeno del grupo sanguíneo AB humano, un antígeno del grupo sanguíneo O humano, un antígeno del factor Rh humano, una glucoforina, un agente de peligro biológico, un antígeno de un agente infeccioso, un antígeno de cáncer, un antígeno asociado a una enfermedad cardiovascular, un antígeno asociado a una enfermedad metabólica, o cualquier combinación de los mismos, o un anticuerpo que reconozca cualquiera de los anteriores.

6. El chip de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el agente de captura y el agente de detección están ubicados en extremos opuestos de la capa de polímero no incrustante.

7. El chip de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además uno o más diques, en donde el uno o más diques están ubicados entre el al menos un agente de captura y el al menos un agente de detección, opcionalmente, en donde el dique comprende una sal hidrosoluble, azúcar hidrosoluble, un polímero hidrosoluble o cualquier combinación de los mismos, opcionalmente, en donde el dique comprende una sal de fosfato, una sal de citrato, trehalosa, alcohol polivinílico, polietilenglicol o cualquier combinación de los mismos, opcionalmente, en donde el canal tiene un volumen de 0,01 a 500 pl.

8. Un detector que comprende:

el chip de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7;

un cuerpo configurado para aceptar el chip

una tapa que, en combinación con el cuerpo, rodea sustancialmente el chip cuando el chip está dispuesto en el cuerpo; y

9. El detector de la reivindicación 8, que comprende además un filtro que se coloca para filtrar la luz emitida por la capa de polímero no incrustante, que comprende además, opcionalmente, una lente que se coloca para ampliar una luz de la segunda longitud de onda que pasa a través del filtro, que comprende además, opcionalmente, una fuente de energía que proporciona energía para la fuente de luz.

10. El detector de la reivindicación 8 o 9, en donde la fuente de luz comprende uno o más diodos emisores de luz, en donde la fuente de luz ilumina la capa de polímero no incrustante del chip en un ángulo que permite la excitación del al menos un agente de detección contenido dentro del chip, en donde el al menos un agente de detección es un fluoróforo, opcionalmente, en donde el detector comprende además de una a ocho fuentes de luz.

11. El detector de una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en donde el detector tiene un volumen de aproximadamente 20-30 cm3, opcionalmente, en donde el detector tiene un volumen de 25 cm3, opcionalmente, en donde el detector es autónomo.

12. El detector de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el detector está conectado a un dispositivo de captura de imágenes, opcionalmente, en donde el dispositivo de captura de imágenes es un teléfono inteligente.

13. Un método de preparación del chip de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende depositar al menos un agente de captura en una capa de polímero no incrustante, en donde el polímero no incrustante está dispuesto en al menos una superficie del canal y en donde el canal está sustancialmente incluido dentro del chip.

14. El método de la reivindicación 13, que comprende además depositar al menos un agente de detección sobre la capa de polímero no incrustante, depositar al menos un excipiente sobre la capa de polímero no incrustante y/o depositar un dique a lo ancho de la capa de polímero no incrustante.

15. Un método para detectar la presencia o la ausencia de un analito, que comprende:

a) poner en contacto el chip de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 con una muestra; y

b) determinar la presencia o ausencia del analito,

en donde una señal detectable del chip indica la presencia del analito o la ausencia de una señal detectable del chip indica la ausencia del analito.

16. El método de la reivindicación 15, en donde el analito es o comprende un antígeno de superficie, un antígeno en solución, un antígeno unido, un agente de peligro biológico, un agente infeccioso, un antígeno de cáncer, un antígeno asociado a una enfermedad cardiovascular o un antígeno asociado a una enfermedad metabólica;

opcionalmente, en donde el analito es o comprende un antígeno del grupo sanguíneo A humano, un antígeno del grupo sanguíneo B humano, un antígeno del grupo sanguíneo AB humano, un antígeno del grupo sanguíneo O humano, un antígeno del factor Rh humano, una glucoforina o cualquier combinación de las mismas;

opcionalmente, en donde el agente de peligro biológico es o comprende carbunco, toxina de ricino, peste, tularemia, viruela, brucelosis, fiebre tifoidea, encefalitis vírica, fiebres hemorrágicas víricas, fiebre Q, melioidosis, muermo, toxina botulínica, toxina SEB o bacterias transmitidas por los alimentos, opcionalmente, en donde el analito procede de un sujeto individual.