ES2865180T3 - Aparato para formación de cultivo celular - Google Patents

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Philip J Lee
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Abstract

Un sistema de cultivo de microfluidos capaz de proporcionar un entorno para el crecimiento biológico y/o análisis y/o manipulación que comprende: una pluralidad de unidades de área de microcultivo, comprendiendo al menos algunas de dichas unidades: un área de cultivo, teniendo dicha área una entrada de flujo fluídico que permite la carga de células u otros objetos de cultivo; un canal fluídico de sección transversal de medio /reactivo, proporcionando dicho canal un flujo deseado de un medio de cultivo y/o reactivo y/o proporcionando acceso a productos de cultivo; y una estructura de paso microfluídico, separando dicha estructura dicha área de cultivo y dicho canal al tiempo que proporciona una conexión fluídica entre dicha área de cultivo y dicho canal sin perturbar las células u otros objetos de cultivo; en el que el canal de medio/reactivo está dispuesto de tal manera que dicho medio de cultivo y/o reactivo en el canal de medio/reactivo fluye alrededor de las unidades de área de microcultivo sin ser forzado a fluir a través de las unidades de área de microcultivo.

Description

DESCRIPCIÓN
Aparato para formación de cultivo celular
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención en realizaciones específicas se refiere en general a la preparación y/o cultivo y/o análisis de muestras moleculares y celulares y, más particularmente, a microestructuras útiles con las mismas. En realizaciones específicas adicionales, la invención implica métodos, sistemas y/o dispositivos para cultivar y/o analizar células y/u otros materiales biológica o químicamente activos usando una estructura, formación, método o cámara de cultivo novedoso. En otras realizaciones, la presente invención se refiere a métodos y/o sistema y/o aparato que permiten el cultivo celular en una configuración que permite simular tejidos vivos y/u órganos y/o tumores sólidos, tales como sistemas para un hígado, riñón artificial, páncreas, tiroides, etc. En realizaciones específicas, la invención involucra métodos y/o sistema y/o aparato que implican diversas estructuras para manipular objetos, tales como células o perlas, en un medio fluídico y opcionalmente realizar ciertos análisis u observaciones de los mismos o derivar materiales producidos a partir de cultivos biológicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La discusión de cualquier trabajo, publicación, venta o actividad en cualquier parte de esta presentación, incluidos los documentos presentados con esta solicitud, no se tomará como una admisión de que dicha obra constituye técnica anterior. La discusión de cualquier actividad, trabajo o publicación en la presente memoria no es una admisión de que dicha actividad, trabajo o publicación existiera o fuera conocida en una jurisdicción en particular.
Las preparaciones de muestras celulares y moleculares de alta calidad son la base para una validación de tecnología eficaz, así como para una investigación biológica y clínica significativa y para diversas aplicaciones clínicas y de otro tipo. Muestras in vitro que representan de cerca sus características en vivo podrían beneficiar potencialmente a una amplia gama de aplicaciones moleculares y celulares. El manejo, caracterización, cultivo y visualización de células u otros materiales biológica o químicamente activos (tales como perlas recubiertas con diversas moléculas biológicas) se ha vuelto cada vez más valorado en los campos del descubrimiento de fármacos, diagnóstico y análisis de enfermedades y una variedad de otros tratamientos y trabajo experimental.
El cultivo celular de mamíferos es un aspecto esencial de la investigación y el desarrollo médicos y biológicos y, en última instancia, del tratamiento. Sin embargo, la mayoría de las prácticas actuales requieren mucha mano de obra/recursos, no son susceptibles de control de procesos, no pueden abordar escalas de longitud celular y evitan la supervisión u observación continua en tiempo real a largo plazo. Además, las prácticas actuales de cultivo celular no han proporcionado soluciones completamente satisfactorias a los desafíos de mantener agregados sólidos eficaces de células en cultivo.
Se han logrado avances combinando microfabricación y tecnologías de microfluidos con cultivo celular durante la última década; sin embargo, todavía no existe un dispositivo compacto que proporcione efectivamente la misma funcionalidad que el cultivo celular tradicional.
Algunas publicaciones y/o documentos de patente recientes que discuten diversas estrategias relacionadas con el cultivo celular usando sistemas de microfluidos y actividades relacionadas incluyen las siguientes solicitudes de patente de EE. UU. y literatura que no es de patentes.
Una lista de estas referencias aquí no indica que las referencias constituyan técnica anterior.
Cytoplex, Inc. 6,653,124 "Microambiente basado en formaciones para cultivo celular, supervisión celular y validación de objetivos de fármacos".
Cellomics, Inc. 6,548,263 "Métodos y aparatos de formación de células miniaturizadas para el cribado basado en células".
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COMPENDIO
La presente invención se describe en las reivindicaciones 1 a 15. Se describen métodos y sistemas relacionados con estructuras microfluídicas para la preparación de muestras, cultivo y/o para realizar ensayos u otras aplicaciones clínicas. Las estructuras ejemplares proporcionadas en la presente memoria se pueden escalar para soportar cultivos celulares, ensayos basados en células, supervisión molecular y celular, supervisión, cultivo y análisis utilizando nanoperlas o estructuras similares, y procesos de selección de fármacos. Si bien una aplicación típica de las estructuras y métodos descritos en la presente memoria es el mantenimiento y/o el crecimiento de células en cultivo, la invención también se puede adaptar para manejar otros objetos a escala celular, tales como perlas recubiertas y química o biológicamente activas, etc.
En realizaciones específicas, la invención implica métodos y sistemas relacionados con sistemas de microfluidos de cultivo celular continuo. Según realizaciones específicas de la invención, las células se cultivan con transporte continuo de masa fluídica de medio y opcionalmente con control de humedad y temperatura.
En realizaciones específicas adicionales, la invención implica un dispositivo microfluídico de alta relación de resistencia fluídica para cultivar células dentro de una disposición (o formación) de microcámaras, proporcionando una herramienta para cultivo celular u otro cultivo automatizado y rentable.
En determinadas realizaciones, los materiales utilizados para fabricar componentes de cultivo celular son ópticamente transparentes, lo que permite una o más de diversas técnicas de microscopía (por ejemplo, contraste de fase, fluorescencia, confocal) sin perturbar el entorno de cultivo. Estas propiedades permiten la realización de una formación de cultivo celular microfluídico portátil que se puede utilizar en entornos estériles o no estériles para aplicaciones comerciales y de investigación.
En una realización de ejemplo, una microcámara o una sola unidad de una formación de áreas de cultivo consta de una cámara de microfluidos aproximadamente circular de aproximadamente 40 a 50 jm de altura con una estructura de paso fluídico de alta resistencia fluídica, tales como pasos de aproximadamente 1 a 4 jm de altura, proporcionando la estructura de paso fluídico una conexión fluídica a un medio y/o canal o área de reactivo.
En otras realizaciones, la estructura de paso fluídico de alta resistencia a fluidos comprende una o más de una (1) conexión rebajada de aproximadamente 1 a 4 jm , que se conecta a un canal de medio, (2) una pluralidad de canales de alta resistencia fluídica que se conectan entre un área de cultivo y un área de medio; (3) una rejilla de pasos fluídicos altos.
En otro ejemplo de realización, una microcámara o una sola unidad de la formación consta de una cámara de microfluidos de aproximadamente 40 a 50 jm con una conexión de medio fluido/canal de reactivo a microconductos de difusión y con una única abertura para las células receptoras.
En realizaciones de ejemplo adicionales, una o más áreas de microcultivo están conectadas a un medio o canal de reactivo a través de una rejilla de pasos fluídicos (o entradas o pasos de difusión), en donde la rejilla comprende una pluralidad de pasos de intersección de micro alta resistencia fluídica. En un ejemplo, los pasos en la rejilla son aproximadamente de 1 a 4 jm de altura, de 25 a 50 jm de longitud y de 5 a 10 jm de ancho, permitiendo la rejilla una difusión más uniforme entre los canales de medio o reactivo y el área de cultivo y permitiendo una fabricación más fácil y una difusión más uniforme.
Según realizaciones específicas de la invención, la alta relación de resistencia fluídica entre la microcámara y los pasos o rejilla de perfusión/difusión (por ejemplo, relaciones en el intervalo de aproximadamente 10:1, 20:1 a 30:1) ofrece muchas ventajas para el cultivo celular tal como: (1) exclusión de tamaño de células; (2) localización de células dentro de una microcámara, (3) promover un ambiente fluídico uniforme para el crecimiento celular; (4) capacidad para configurar formaciones de microcámaras o áreas de cultivo; (4) facilidad de fabricación y (5) manipulación de reactivos sin una extensa red de válvulas. La capacidad de controlar el entorno del cultivo celular a microescala genera muchas oportunidades para mejorar la investigación biomédica y biotecnológica.
En implementaciones específicas, una gran rotación del medio (por ejemplo, aproximadamente ~1/min) permite una alta densidad celular (por ejemplo,> 107 células/ml) y opcionalmente el uso de amortiguación independiente de CO2 del pH.
En realizaciones específicas, la fabricación del dispositivo se basa en el micromoldeo de uno o más elastómeros (tales como polidimetilsiloxano (PDMS)), lo que permite la producción en masa económica de formaciones desechables de múltiples cámaras o áreas de cultivo. Se pueden construir otras realizaciones a partir de superficies de silicio/polisilicio unidas o polímeros moldeados por inyección.
Para mejorar el control sobre el entorno de cultivo, la presente invención en realizaciones específicas usa un proceso de litografía de dos niveles. Esto resuelve el problema de la transferencia de masa no uniforme en los canales de microfluidos causada por el perfil de flujo laminar parabólico cuando se cultivan células directamente dentro de los canales de microfluidos. En otras realizaciones, se usa un proceso de litografía de un solo nivel, con la relación de alta resistencia fluídica deseada lograda mediante la construcción de pasos de difusión o una rejilla de difusión con una sección transversal pequeña, incluso si los pasos tienen la misma altura que el área de cultivo.
La presente invención, en otras realizaciones, implica un dispositivo o sistema integrado que comprende componentes de manipulación celular, una o más formaciones de cultivo celular, conexiones y dispositivos fluídicos y dispositivos de detección y/o formación de imágenes. En sistemas de ejemplo específicos, el diseño interseccional de cámaras de cultivo celular en una formación proporciona direccionamiento de cámara o célula independiente y/o permite variar las concentraciones de sustancias en el medio de cultivo, por ejemplo para proporcionar una gran cantidad de entornos celulares diferentes en una formación de cámara de cultivo celular muy compacta.
Según realizaciones específicas de la invención, los aspectos de la invención se pueden incorporar en uno o más sistemas integrados que proporcionan medios simples, pero elegantes, para el cultivo celular avanzado en un espacio compacto que proporciona un mecanismo ideal para el cribado de alto rendimiento, análisis de células, descubrimiento de fármacos, etc. En otras realizaciones específicas, los nuevos métodos y dispositivos de acuerdo con realizaciones específicas de la invención pueden usarse en diversos sistemas. Las aplicaciones incluyen diagnóstico en el punto de atención, ingeniería de tejidos, ensayos basados en células, etc.
Si bien los sistemas de ejemplo de acuerdo con realizaciones específicas de la presente invención se describen en la presente memoria como se usan principalmente para realizar pruebas o caracterizaciones de células biológicas, los expertos en la técnica entenderán que un sistema de cultivo de acuerdo con realizaciones específicas de la presente invención puede utilizarse en una variedad de aplicaciones en dispositivos de manipulación y cultivo con un tamaño celular aproximado (4 pm 15 pm). Estas aplicaciones incluyen, pero no se limitan a: sistemas celulares, sistemas químicos, sistemas virales, cultivo de proteínas, cultivo de ADN. En algunas de tales aplicaciones, se pueden usar técnicas conocidas para fijar sustancias de interés en microperlas o nanoperlas para facilitar dicho cultivo.
En realizaciones adicionales, la invención se puede integrar con un sistema de cultivo celular miniaturizado completo para ensayos basados en células de alto rendimiento u otras aplicaciones basadas en células o en perlas. Una formación de cultivo celular microfluídica de acuerdo con la invención ofrece una plataforma asequible para una amplia gama de aplicaciones en el cribado basado en células de alto rendimiento, bioinformática, biología sintética, biología celular cuantitativa y biología de sistemas.
Según otras realizaciones específicas de la invención, una formación de cultivo celular portátil se puede implementar en el campo o en la clínica para el diagnóstico de agentes infecciosos en el punto de atención, o para su uso en medicina personal. Por ejemplo, el cultivo celular clínicas se utiliza para la detección e identificación de virus, tal como el agente causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS). Los médicos también pueden obtener información importante sobre pacientes individuales a partir de cultivos de biopsias, tal como para optimizar los regímenes de quimioterapia.
La capacidad de realizar experimentos económicos de alto rendimiento usando métodos y dispositivos de la invención también tiene aplicaciones en la investigación biológica, donde las caracterizaciones completas de las condiciones experimentales son actualmente limitadas. Por ejemplo, la configuración de una formación de cultivo de acuerdo con realizaciones específicas de la invención permite que la invención se cargue y maneje usando sistemas diseñados para placas de microtitulación convencionales de 96 o 384 pocillos y permite proporcionar una condición de cultivo diferente en cada cámara de una formación de acuerdo con realizaciones específicas de la invención. En este ejemplo, un dispositivo de cultivo celular según realizaciones específicas de la invención puede analizar 96 o 384 condiciones diferentes en un solo chip.
En realizaciones adicionales, una formación de la invención se puede realizar en un sistema completamente miniaturizado en un dispositivo de ensayo portátil, por ejemplo mediante la integración de bombas electro-osmóticas, sensores ópticos y microfisiómetros. Una formación de cultivo celular microfluídica de acuerdo con realizaciones específicas de la invención puede estar involucrada con una amplia gama de aplicaciones en cribado basado en células de alto rendimiento, bioinformática, biología sintética, biología celular cuantitativa y biología de sistemas.
Otras características y beneficios
La invención y diversos aspectos y realizaciones específicos se entenderán mejor con referencia a los dibujos y descripciones detalladas que se proporcionan en esta presentación. Para mayor claridad, esta discusión se refiere a dispositivos, métodos y conceptos en términos de ejemplos específicos. Sin embargo, la invención y sus aspectos pueden tener aplicaciones en una variedad de tipos de dispositivos y sistemas. Por lo tanto, se pretende que la invención no esté limitada excepto por lo dispuesto en las reivindicaciones adjuntas y equivalentes.
Además, es bien conocido en la técnica que los sistemas y métodos tales como los descritos en la presente memoria pueden incluir una variedad de componentes diferentes y funciones diferentes de una manera modular. Diferentes realizaciones de la invención pueden incluir diferentes mezclas de elementos y funciones y pueden agrupar diversas funciones como partes de diversos elementos. Para mayor claridad, la invención se describe en términos de sistemas que incluyen muchos componentes innovadores diferentes y combinaciones innovadoras de componentes innovadores y componentes conocidos. No se debe hacer ninguna inferencia para limitar la invención a combinaciones que contengan todos los componentes innovadores enumerados en cualquier realización ilustrativa de esta memoria.
En algunos de los dibujos y descripciones detalladas a continuación, la presente invención se describe en términos de la realización independiente importante de un sistema de formación biológico y sus componentes. Esto no debe tomarse como una limitación de la invención, que, utilizando las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria, se puede aplicar a una serie de otras situaciones. En algunos de los dibujos y descripciones detalladas a continuación, la presente invención se describe en términos de una serie de realizaciones de ejemplo específicas que incluyen parámetros específicos relacionados con las dimensiones de estructuras, presiones o volúmenes de líquidos o valores eléctricos. Salvo que así se indique en las reivindicaciones adjuntas, estos parámetros se proporcionan como ejemplos y no limitan la invención a otros dispositivos o sistemas con diferentes dimensiones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1A es una imagen SEM de un ejemplo temprano de una sola unidad de un dispositivo antes de adherirse a una cubierta según realizaciones específicas de la invención que muestra cuatro orificios exteriores: (1) entrada de perfusión/medio, (2) salida de perfusión/medio, (3) carga y (4) salida de desechos y que muestra microcanales/pasos de perfusión que tienen una altura o aspecto sustancialmente menor que los otros canales o el área de cultivo.
La figura 1B ilustra una imagen SEM de dimensiones de canal de perfusión/difusión de ejemplo según realizaciones específicas de la invención.
La figura 2 es una fotografía de un ejemplo de formación o sistema de cultivo celular microfluídico de 10 x 10 unido a un cubreobjetos y montado en un calentador ITO transparente y mostrado conectado a fuentes de fluido externas y colocado encima de un dispositivo de formación de imágenes según realizaciones específicas de la invención.
La figura 3A-C ilustra una unidad de formación de cámaras de cultivo fabricada usando técnicas de litografía blanda a partir de un solo molde e ilustran además una cámara que presenta una barrera "C" interior según realizaciones específicas de la invención.
La figura 4A-C ilustra el funcionamiento de un dispositivo de formación de microcultivo según realizaciones específicas de la invención.
La figura 5A-C ilustra el funcionamiento de un dispositivo de formación de microcultivo según realizaciones específicas de la invención que muestran el mantenimiento del patrón a largo plazo.
La figura 6A ilustra una vista esquemática de otro ejemplo de dispositivo o elemento de formación con un orificio de carga de células y un canal de medio o reactivo conectado al mismo mediante una microestructura de transferencia de masa/difusión de alta resistencia fluídica (por ejemplo, microentradas o pasos) que tienen una resistencia fluídica sustancialmente mayor (debido a menor altura y/o menor sección transversal) que el canal de carga o área de cultivo según realizaciones específicas de la invención.
La figura 6B es un diagrama de bloques esquemático que muestra cuatro áreas de cultivo, cada una con un orificio de carga y un canal de medio/reactivo que fluye próximo a las áreas de cultivo y está conectado a las mismas mediante una microestructura de transferencia de masa/difusión de alta resistencia fluídica según realizaciones específicas de la invención.
La figura 7 ilustra el transporte de masa líquida a través del dispositivo de ejemplo, mostrando un rápido transporte convectivo a través del canal exterior (indicado por el flujo de fluido de color más claro) con un transporte de difusión más lento a través de la microestructura de alta resistencia fluídica (indicado por la lenta difusión del flujo de fluido de color más claro hacia las áreas de la cámara) según realizaciones específicas de la invención.
La figura 8 ilustra una micrografía de hepatocitos de rata de ejemplo cultivados en un dispositivo de ejemplo tal como en la figura 6 en el que la imagen de fluorescencia representa la actividad metabólica de P450 de las mismas células en un estado densamente concentrado (A) y sin contacto celular (B) que muestra que una cámara de cultivo de acuerdo con realizaciones específicas de la invención es capaz de mantener concentradas las células de tejido en cultivo, permitiendo que las células expresen una actividad metabólica más normal. La figura 9A es un gráfico que indica la viabilidad de los hepatocitos cultivados en una placa de microtitulación (■), y en un ejemplo de dispositivo de cultivo de microfluidos según realizaciones específicas de la invención sin contacto celular (▲) y en una configuración concentrada en un dispositivo de cultivo de microfluidos (□) , donde los datos representan la media y SEM de 139 unidades de cultivo en 15 chips independientes y el gráfico indica que la viabilidad de los hepatocitos se extiende en gran medida cuando se cultivan densamente concentrados en un dispositivo de la invención.
La figura 9B muestra la actividad de P450 ensayada por el metabolismo del éter dietílico de 5-clorometilfluoresceína (10 ^M, 30 minutos) en una placa de microtitulación (sombreada) y en un senoide de microfluidos de la invención (sombreado) que muestra una mejora significativa de la función del hepatocito primario (p <0,05) donde los datos representan la media y la DE la intensidad de fluorescencia de >100 células en 3 chips independientes después de 5 días en cultivo (datos normalizados para hepatocitos en placa de microtitulación).
La figura 9C compara la viabilidad del hepatocito primario de rata en un dispositivo de la invención en comparación con un método de cultivo basado en placa, lo que indica que en un cultivo basado en placa es necesario un recubrimiento biomolecular (por ejemplo, colágeno) para mantener vivas las células, mientras que en el dispositivo de microfluidos, la única configuración de la cámara de cultivo es suficiente para la viabilidad celular durante 7 días sin tal recubrimiento.
La figura 9D es un gráfico que ilustra hepatocitos humanos primarios cultivados en un dispositivo de la invención que indica que los hepatocitos cultivados de acuerdo con la invención retienen su actividad metabólica hepática. La figura 10A-C ilustra una micrografía de un ejemplo de cultivo de hepatocitos microfluídicos de alta densidad que muestra (A) imágenes de lapso de tiempo (1 a 240 segundos) de hepatocitos cargados en el senoide microfluídico bajo una presión de conducción de 10 psi y (B) un ensayo de viabilidad fluorescente en células cultivado durante 7 días en el dispositivo a alta densidad celular y (C) una baja densidad celular.
La figura 11A es una micrografía de un dispositivo de cultivo de ejemplo con una barrera de perfusión en forma de rejilla según realizaciones específicas de la invención. En este ejemplo, se muestran perlas a nanoescala (500 nm) concentradas en la cámara central a alta densidad.
La figura 11B es una micrografía de primer plano de un ejemplo de un dispositivo de cultivo con una barrera de perfusión en forma de rejilla según realizaciones específicas de la invención.
La figura 12 es una serie de micrografías que ilustran un dispositivo de ejemplo utilizado para cultivar células cancerosas humanas en una configuración concentrada similar a un tumor de alta densidad durante un período de 12 días según realizaciones específicas de la invención.
Las figuras 13 a 18 son diagramas de bloques esquemáticos que ilustran diversas configuraciones para dispositivos y/o sistemas de cultivo de acuerdo con diversas realizaciones específicas de la invención.
La figura 13 ilustra como ejemplo tres de posiblemente cientos de cámaras de cultivo en un sistema para cribado multiplexado de alta densidad celular según realizaciones específicas de la invención.
La figura 14 ilustra una variación con la adición de una región de detección óptica en línea u otra (representada con un círculo rojo) según realizaciones específicas de la invención.
La figura 15 ilustra como un ejemplo tres de posiblemente cientos de cámaras de cultivo en un sistema útil para el cribado de penetración/absorción de fármacos en el que se cultiva una masa sólida de células como se describió anteriormente, pero en comunicación con dos flujos de fluidos separados (izquierda y derecha) de acuerdo con realizaciones de la invención.
La figura 16 ilustra como ejemplo una de posiblemente cientos de cámaras de cultivo en un sistema en el que una primera región de cultivo está anidada dentro de una segunda región de cultivo según realizaciones específicas de la invención.
La figura 17 ilustra como un ejemplo tres de posiblemente cientos de áreas de perfusión de medio en un sistema útil en el cribado celular de propósito general según realizaciones específicas de la invención.
La figura 18 ilustra como un ejemplo tres de posiblemente cientos de cámaras de cultivo en un sistema útil donde múltiples áreas de cultivo están dispuestas en paralelo con una sola entrada y salida de nutrientes (los múltiples pocillos de entrada están conectados fuera del chip) de acuerdo con realizaciones específicas de la invención.
La figura 19 ilustra un dibujo CAD de un biorreactor microfluídico de PMMA de 96 unidades propuesto en el que, en este ejemplo, cada pocillo del biorreactor es de tamaño estándar SBS (3,5 mm de diámetro) y las columnas de siembra de células se colocan en el centro de la entrada del fármaco y de los pocillos de salida del perfundido; por lo tanto, el biorreactor es compatible con lectores de placas estándar.
La figura 20 muestra los resultados de fabricación de un chip de biorreactor microfluídico de 8 unidades según realizaciones específicas de la invención.
La figura 21 ilustra (a) un prototipo de colector neumático para un chip de biorreactor microfluídico de 8 unidades donde el cebado del chip y las células de carga en las estructuras microfluídicas se puede lograr mediante bombeo neumático a través de las líneas de control neumático como se ilustra y; (b) un microscopio invertido usado para supervisar durante el proceso y que muestra válvulas de solenoide para controlar la presión neumática según realizaciones específicas de la invención.
La figura 22 ilustra un flujo de fabricación para una placa de microfluidos totalmente plástica que usa moldeo por inyección y tecnología de unión adhesiva.
La figura 23A-B ilustra un diagrama de proceso de fabricación esquemático para un ejemplo de fabricación según realizaciones alternativas específicas de la invención.
La figura 24 es un diagrama de bloques que muestra un dispositivo lógico de ejemplo representativo en el que se pueden realizar diversos aspectos de la presente invención.
La figura 25 (Tabla 1) ilustra un ejemplo de enfermedades, afecciones o estados que pueden evaluarse, o para los que se pueden probar fármacos u otras terapias de acuerdo con realizaciones específicas de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ESPECÍFICAS
1. Visión de conjunto
La presente invención en realizaciones específicas está dirigida a producir una plataforma económica y miniaturizada para "cultivo celular en un chip" para hacer que los experimentos celulares de alto rendimiento sean accesibles en entornos de laboratorio, clínicos y de campo. Las tecnologías de microfabricación y microfluidos se adaptan y amplían según realizaciones específicas de la invención. Los dispositivos microfabricados de acuerdo con realizaciones específicas de la invención pueden controlar con mayor precisión el entorno del cultivo celular que los sistemas macroscópicos.
En un ejemplo, las estructuras microfluídicas se implementan dentro de un dispositivo microfluídico para proporcionar grandes diferencias de resistencias fluídicas de diferentes microcanales. Por lo tanto, el dispositivo puede proporcionar un microambiente uniforme y controlable para un cultivo celular de intercambio de medio continuo. En otro ejemplo, las microestructuras se controlan mediante microcanales presurizados para la regulación del flujo y para la preparación de muestras celulares. En otro ejemplo más, las microestructuras de alta resistencia fluídica (que en algunas realizaciones puede ser el resultado de una fabricación de alta relación de aspecto) se colocan dentro de, o adyacentes a, una microcámara o área de microcultivo como una barrera pasiva para la inmovilización celular y molecular de la muestra. El dispositivo se puede integrar además con electrodos para funciones como la supervisión del metabolismo, la generación de productos electroquímicos, la electroporación y una variedad de otras aplicaciones.
El diseño de un dispositivo de cultivo celular a microescala presenta una serie de desafíos únicos, muchos de los cuales se han discutido recientemente. Las demostraciones anteriores de cultivo celular en dispositivos microfabricados incluyen el crecimiento de hepatocitos, células pulmonares y células de insectos en sustratos de silicio y PDMS. Estos trabajos validaron la biocompatibilidad, el suministro de nutrientes y las características de crecimiento de las células dentro de los dispositivos microfabricados, pero aún no han logrado una formación de alto rendimiento que pueda replicar las principales funcionalidades del cultivo celular tradicional.
Las células primarias (las extraídas de seres humanos vivos y otros animales) representan una vía importante de investigación médica debido a su mayor relevancia para las enfermedades y los estados saludables. Sin embargo, la disponibilidad limitada de donantes de tejidos y las dificultades técnicas de mantener estas células in vitro han limitado gravemente su aplicación en la investigación biomédica. Los sistemas de microfluidos de acuerdo con diversas realizaciones de la invención pueden abordar estos desafíos técnicos al proporcionar un entorno con geometría/control fluídico a microescala que tiene ventajas particulares para mantener el crecimiento celular y/o la viabilidad celular, y también para crear más aproximadamente el entorno que ciertos tipos de células experimentarían en su estado en vivo , en particular el entorno densamente concentrado o de proximidad cercana de tejidos vivos y/o tumores sólidos u otras agregaciones de células. Además, la invención permite tales sistemas con un bajo consumo de muestras y un funcionamiento automatizado.
La presente invención, de acuerdo con diversas realizaciones específicas como se describe en la presente memoria, proporciona métodos, sistemas y dispositivos que abordan el desarrollo de una nueva formación de cultivo celular microfluídico de alta resistencia fluídica y/o alta relación de aspecto capaz de proporcionar un microambiente estable y uniforme para el crecimiento celular.
En realizaciones específicas, elementos adicionales tales como la integración heterogénea de una unidad de control de temperatura, tal como un calentador ITO, permiten que la invención proporcione una plataforma de cultivo celular automatizada y rentable sin los grandes sistemas robóticos adaptados por las prácticas actuales. En realizaciones específicas, un dispositivo de microfluidos de la invención replica los procesos principales en el cultivo celular tradicional, haciéndolo adaptable a un gran número de aplicaciones. Como ejemplo y con fines de discusión, se analizan las formaciones de 1 x 5 para la caracterización del dispositivo con el fin de disminuir la complejidad del procesamiento de datos y el tiempo de supervisión óptica. Otros ejemplos que se describen en la presente memoria y/o que se han fabricado incluyen una formación de 10 x 10, una formación de 6 x 6, una formación de 8 x 8 y una formación de 8 X 1.
Configuraciones de dispositivo de ejemplo
2. Ejemplo 1
Ejemplo de cámara experimental
La figura 1A ilustra una vista superior de un ejemplo de dispositivo de cultivo celular según realizaciones específicas de la invención. Este ejemplo tiene cuatro orificios: entrada de perfusión, salida de perfusión, carga de reactivo y desecho, con el flujo dirigido de perfusión designado de izquierda a derecha en la figura y la carga de reactivo de arriba a abajo en la figura. Como se puede ver en la figura, los canales de flujo de perfusión están separados de la cámara principal por canales de perfusión en forma de semicírculo tanto en el lado de entrada (izquierdo) como en el lado de salida (derecho). La conexión fluídica entre estos canales en forma de semicírculo y la cámara de cultivo se realiza mediante los múltiples canales de perfusión de alta relación de aspecto que se muestran en la figura, que tienen aproximadamente 1/10 a 1/50 de la profundidad de los canales principales y/o la cámara de cultivo. Para evitar que las células se eliminen durante la perfusión, aproximadamente los canales de perfusión de 2pm de altura conectan las entradas y salidas de perfusión a la cámara de cultivo. Debido a que las células (típicamente > 15 pm de diámetro) son inherentemente mucho más grandes que los canales de perfusión (típicamente <15 pm de diámetro), la mayoría de las células permanecerán dentro de la cámara de cultivo principal, que en este ejemplo es aproximadamente de 50pm de altura y aproximadamente 1 mm de diámetro. Los múltiples canales pequeños utilizados durante la perfusión también minimizan el flujo de cizallamiento sobre las células y aseguran una distribución uniforme del medio dentro de la cámara. Además, dado que los canales de perfusión estrechos crean una gran resistencia a los fluidos, la carga de células y reactivos a través de esos canales no requiere el uso de válvulas de microfluidos.
En realizaciones específicas, las microcámaras están diseñadas para tener la misma área de crecimiento celular que un pocillo típico en una placa de microtitulación de 1.536 pocillos. Los orificios izquierdo y derecho están diseñados para proporcionar una perfusión continua del medio a la cámara con el fin de mantener el crecimiento celular. Los orificios superior e inferior se utilizan para cargar células y reactivos para ensayos basados en células.
En una implementación de ejemplo más específica, cada canal de perfusión tiene aproximadamente 2 pm de altura y alrededor de 2 pm de ancho en comparación con la cámara de cultivo principal, que tiene aproximadamente 1 mm de diámetro y aproximadamente de 40 a 50 pm de altura. Esta alta relación de aspecto entre la cámara y la vía de perfusión en ella proporciona numerosas ventajas, como se describe en la presente memoria.
La figura 1B ilustra una imagen SEM de dimensiones de canal de perfusión/difusión de ejemplo según realizaciones específicas de la invención. Estas imágenes de microscopio electrónico de barrido muestran aspectos de un dispositivo de unidad única antes de la unión, mostrando la figura 1B una vista más cercana del diseño de alta relación de aspecto, respectivamente. Los canales de perfusión tienen dos propósitos principales. Primero, dado que son mucho más pequeños que el tamaño de las células (~10 pm de diámetro), evitan eficazmente que las células se eliminen o migren fuera de la cámara. En segundo lugar, los múltiples canales de perfusión proporcionan un acceso uniforme a los nutrientes dentro de la microcámara, como se discutirá más adelante.
Se entenderá que son posibles numerosas variaciones dimensionales, incluyendo cámaras que no son circulares, canales de perfusión/difusión que varían algo en dimensiones entre uno y otro, u otros parámetros dimensionales.
Formaciones
En realizaciones adicionales, la invención puede implicar una serie de regiones de cultivo, tales como los ejemplos descritos anteriormente. La figura 2 es una fotografía de un ejemplo de formación o sistema de cultivo celular microfluídico de 10 x 10 unido a un cubreobjetos y montado en un calentador ITO transparente y mostrado conectado a fuentes de fluido externas y colocado encima de un dispositivo de formación de imágenes según realizaciones específicas de la invención. Un sistema de cultivo celular microfluídicas de acuerdo con realizaciones específicas de la invención está diseñado para replicar los procesos principales aplicados en técnicas de cultivo eucariotas estándar. Un dispositivo de ejemplo es capaz de proporcionar un entorno cerrado para el crecimiento y la manipulación celular, opcionalmente sin la necesidad de una incubadora. Las cámaras de cultivo de PDMS unidas mantienen un entorno estéril al tiempo que permiten el intercambio de gases con la atmósfera. La temperatura se puede controlar con un calentador ITO transparente sin obstaculizar el control de las células vía microscopía óptica. El control de la humedad del aire circundante puede usarse para evitar la evaporación de los microcanales, sin embargo, en realizaciones específicas, se ha observado que la perfusión continua del medio es suficiente para evitar que el dispositivo se seque. Se pueden conectar tapones de acero inoxidable con tubos blandos al dispositivo y a una bomba de jeringa para control de fluidos. El crecimiento celular puede realizarse mediante un microscopio óptico u otro dispositivo de formación de imágenes.
La figura 2 también puede incluir un generador de gradiente de concentración de microfluidos opcional (tal como se analiza en Jeon y otros 2002) que está presente en la parte superior izquierda de la figura y que permite multiplexar ensayos basados en células en diferentes condiciones sin aumentar el tiempo de preparación de la muestra. Utilizando solo dos concentraciones de entrada, se genera un gradiente lineal de modo que cada columna se expone a una concentración de reactivo diferente. Se ha demostrado la generación de gradientes a través de las columnas de una formación de cultivo celular de ejemplo de acuerdo con estas realizaciones específicas. La caracterización inicial de un divisor de diez canales indicó que el flujo era uniforme dentro de cada columna, y se puede introducir una concentración de reactivo diferente en diferentes elementos de la formación. No hubo flujo cruzado entre columnas debido a la alta resistencia fluídica impuesta por las estructuras de perfusión/difusión. Además, el direccionamiento individual de cada columna y fila se puede lograr mediante la implementación de una red de válvulas microfluídicas.15 Al mejorar la eficiencia del suministro de fluidos, es posible introducir un nivel de control cuantitativo en experimentos que son tradicionalmente cualitativos. También es muy prometedor la adaptación del cultivo celular microfluídicas para la investigación en ingeniería de tejidos.16
3. Ejemplo 2
A continuación, se describe otro ejemplo de plataforma microfluídica direccionable de forma fluida a escala de nanolitros según realizaciones específicas de la invención. En un ejemplo específico, una formación direccionable de 6x6 de ocho cámaras de nanolitros es eficaz para el cultivo continuo a largo plazo de la línea celular de cáncer humano HeLa con un ensayo funcional de 36 microambientes celulares diferentes. En una construcción opcional, la litografía blanda de alta relación de aspecto se utiliza para crear canales de alto flujo fluídico, aunque estudios posteriores han demostrado que se puede lograr la misma alta resistencia fluídica utilizando estructuras de difusión con pasos de difusión que tienen la misma altura que la cámara principal y los canales de medio. En este ejemplo, para separar aún más las unidades de cultivo individuales de los canales de flujo mediante un anillo en forma de "C" con un espacio estrecho a lo largo de la base para desacoplar eficazmente las regiones de crecimiento celular del transporte impulsado por presión sin el uso de válvulas activas. Este diseño evita los problemas encontrados en algunos entornos de cultivo de nanolitros de multiplexación al permitir una carga de células uniforme, mantener la localización celular a largo plazo, eliminar los esfuerzos de cizallamiento y presión en las células cultivadas, proporcionar un control estable del direccionamiento fluídico y permitir la supervisión óptica en el chip. El dispositivo utiliza una nueva microestructura que consiste en un anillo de localización celular en forma de casi una "C" de alta resistencia fluídica y un anillo de flujo exterior de baja resistencia. El área de crecimiento central y el anillo de flujo en un ejemplo se fabricaron para tener 50 ¡um de altura, lo que permite el transporte celular a través del dispositivo. El anillo de localización celular en forma de "C" que define el área de crecimiento celular de 8 nl consistía en una barrera con una abertura de 2 um a lo largo de la base con un diámetro interior de 450 um. Este espacio permitía que el fluido fluyera a través del área de crecimiento celular, pero era lo suficientemente estrecho como para retener las células en el anillo central. Un ejemplo de una sola unidad de esta estructura se ilustra en la fotografía SEM mostrada en la figura 3A.
Las figuras 3A-C ilustran una unidad de formación de cámaras de cultivo fabricada usando técnicas de litografía blanda a partir de un solo molde e ilustran además una cámara que presenta una barrera "C" interior según realizaciones específicas de la invención. En este ejemplo, el material del dispositivo consistía en elastómero PDMS unido covalentemente a un cubreobjetos de calidad para cultivo de tejidos. La figura 3B es una imagen SEM de una unidad única de ejemplo de una formación según realizaciones específicas de la invención. Se definió un área de crecimiento central con un anillo de localización en forma de "C" de 450 um de diámetro con paredes fabricadas con una abertura de 2 um a lo largo del fondo que retuvo las células mientras permitía el transporte de nutrientes y fluidos (sección transversal A-A'). Las células se cargaron en la cámara central a través de la abertura en la boca de la forma de "C". La barra de escala representa 100 micrones. Este diseño permite formaciones de alta densidad sin necesidad de alineación. La figura 3C ilustra esquemáticamente una sección transversal del dispositivo mostrado en la figura 3B.
En estas realizaciones, la unidad de formación individual constaba de una cámara interior de alta resistencia fluídica para el crecimiento celular y un canal exterior de baja resistencia fluídica para el flujo de fluido. La diferencia de 103 veces la resistencia entre los dos compartimentos permite una carga uniforme de la formación, controlando la concentración celular y manteniendo la integridad del patrón a largo plazo mediante la eliminación selectiva de las células fuera del área de crecimiento.
En un dispositivo de ejemplo, estas capacidades se integran con aspectos de la formación de cultivo celular microfluídico descrita anteriormente para producir una microformación de células direccionables 6x6 para estudios funcionales a largo plazo. Un proceso de molde único sin tratamiento requerido de superficie utilizado para la fabricación permite que la formación se escale fácilmente a un tamaño y densidad mucho más altos. En un ejemplo, se logró una formación de análisis de células de 6x6 con cuatro trayectorias fluídicas a cada cámara mediante la fabricación de una matriz de 8x8 y sacrificando la fila exterior y la columna de unidades de cultivo debido a ligeras irregularidades de flujo cerca de los bordes.
Según realizaciones específicas de la invención, la entrada y/o salida de cada columna o fila puede comprender diferentes diseños de interfaz microfluídica, por ejemplo: (1) un multiplexor (una sola conexión para múltiples filas), (2) un generador de gradiente de concentración, o (3) conexiones direccionables individualmente. El generador de gradiente fue una versión modificada del trabajo publicado y sirvió para crear múltiples concentraciones de reactivo a partir de dos entradas fluídicas.
En realizaciones alternativas, el anillo de perfusión se puede reemplazar por un paso de alta resistencia en el anillo exterior, como se ilustra en la figura 3C. En otras realizaciones, la configuración básica que se muestra en la figura 3A-C puede usarse para cultivo y captura de células individuales, lo cual es útil en diversas aplicaciones como se entenderá en la técnica. En algunas realizaciones, el tamaño de cámara de la célula se puede reducir para una operación opcional de captura de una sola célula.
Operación de ejemplo
El prototipo de 6x6 es capaz de cultivar y analizar 36 condiciones de microambiente celular diferentes. En experimentos de prueba de concepto, se cargaron células cancerosas humanas (HeLa) en la formación y se cultivaron durante 7 días hasta aproximadamente 5 * 107 células/ml con una viabilidad superior al 97%. El direccionamiento de filas y columnas se demostró mediante la integración de un generador de gradiente de concentración de microfluidos en ambas dimensiones, lo que proporciona una condición de ensayo diferente para cada unidad de formación utilizando solo 4 reactivos de entrada. Alternativamente, el direccionamiento individual de cada fila puede usarse para permitir que se analicen muchos reactivos, tiempos de exposición al fármaco o puntos de tiempo diferentes en esta dimensión.
Después de cargar las células HeLa suspendidas en la formación hasta que se obtuvo la concentración deseada, se introdujo un medio de cultivo nuevo para eliminar las células residuales de los canales de microfluidos. Después de la carga, las células se cultivaron para obtener una alta densidad celular (~300 células/cámara). El mantenimiento selectivo se realizó cada 24 horas para garantizar la integridad del patrón. Se demostraron las capacidades de formación.
Se creó un modelo de elementos finitos para predecir el perfil de velocidad del fluido a través de esta estructura. Este análisis indicó un 103 veces la diferencia en la resistencia del fluido entre el flujo a través de la cámara interior y el canal exterior, de acuerdo con la aproximación analítica basada en el flujo de Hagen-Poiseuille. Esta predicción se verificó siguiendo el flujo de perlas de 2 jm a través del dispositivo de microfluidos.
Carga de células
En este ejemplo, la velocidad de carga de células se controló usando una bomba de jeringa programable. Para la observación del flujo de células a través de la formación de microfluidos, se utilizó un caudal de 40 nl/min/columna, lo que dio como resultado un flujo de aproximadamente 0,7 células/s/unidad. En un período de 100 segundos, se observó que 218 células fluían a través de 3 columnas de carga separadas, verificando el caudal previsto. Los datos de velocidad de flujo celular dentro del dispositivo se obtuvieron a partir del análisis de grabaciones digitales de lapso de tiempo de 131 células para el canal exterior y 53 células para el área de crecimiento interno. La uniformidad de la carga de células se cuantificó contando el número de células en cada unidad de la formación 6x6 después de un período de carga de 2 minutos a 500 nl/min/columna. La condición de control se cargó en una formación de 6x6 sin estructuras de localización celular. La uniformidad de carga se calculó como la media ± DE (desviación estándar) del número final de células en cada fila de la formación, siendo la fila 1 la más cercana al canal de entrada.
Las figuras 4A-C ilustran el funcionamiento de un dispositivo de formación de microcultivo según realizaciones específicas de la invención. Debido a la alta resistencia fluídica del flujo a través del anillo de localización de 2 jm , la mayor parte del transporte convectivo atravesó el canal exterior. Este diseño desacopló en gran medida los efectos del flujo impulsado por presión en las células cultivadas. En la figura 4A, se hizo fluir la suspensión de células HeLa a través de la unidad a 40 nl/min para cargar los anillos centrales. La célula indicada por la flecha azul se cargó en la cámara, mientras que la célula especificada por la flecha roja fluyó a través del canal exterior. En la figura 4B, después de 1 segundo, la diferencia en la resistencia al flujo fue evidente basándose en el seguimiento de las dos velocidades de célula. En la figura 4C, la estructura de microfluidos sirvió como un concentrador de células, lo que permitió sembrar una alta densidad de células en cada cámara. Dado que la presión fluídica y la tensión de cizallamiento ejercida sobre las células dentro del anillo central eran insignificantes, se observaron altas viabilidades celulares.
Con una tasa de carga de células de 40 nl/min a través de cada cámara, se observaron velocidades de célula de 440 ± 80 ym/s en el canal de flujo y 0,8 ± 0,3 ym/s en la cámara de cultivo, dando una relación de velocidades de 550. Esto indicó que la tasa de flujo a través del área central estaba en el intervalo de 50 pl/min. En estas condiciones, la escala de tiempo de difusión de moléculas pequeñas a través del área de crecimiento (1,7 minutos) fue más de 4 veces más rápida que el transporte convectivo. La transferencia de masa dominada por difusión eliminó los esfuerzos de cizallamiento causados por las técnicas tradicionales de flujo continuo mientras se mantenía un microambiente adecuado para el crecimiento de tejido. La difusión continua de productos químicos en el entorno de cultivo también puede proporcionar un modelo fisiológicamente más exacto para la reacción en vivo cinética. Además, la escala de tiempo lenta para la exposición celular a los reactivos puede amortiguar las fluctuaciones en las condiciones del ensayo para estudios a largo plazo.
La uniformidad de la carga de células en la formación de 6x6 (19% de desviación estándar con un mínimo de 47 células) mejoró significativamente en comparación con una formación de microfluidos sin las estructuras de carga en las mismas condiciones (150% de desviación con un 47% de cámaras vacías). El análisis inicial indicó que aproximadamente del 1 al 5% de las células entraron en la cámara de crecimiento. Esto fue significativamente mayor que el 0,2% previsto del flujo total, debido en gran parte a la tendencia de los grupos de células a entrar preferentemente en el anillo de localización. La abertura de 2 ym debajo del anillo de localización celular también sirvió como un concentrador celular al evitar que las células atrapadas salieran de la cámara. Al variar el caudal y el tiempo de carga, fue posible llenar completamente las cámaras de cultivo con células (~5 * 107 células/ml). Una vez que las células se localizaron en el área de crecimiento central, se desacoplaron esencialmente de las fluctuaciones de presión en el entubado adjunto, asegurando que las células se adhirieran y crecieran en las regiones deseadas.
Cultivo celular
Todos los componentes microfabricados se esterilizaron con luz ultravioleta antes de su uso. Las conexiones fluídicas se esterilizaron con etanol al 70% y se enjuagaron minuciosamente con agua desionizada filtrada antes de su uso. El dispositivo fue capaz de mantener un entorno estéril mientras se manipulaba continuamente de una manera no estéril porque todas las conexiones fluídicas estaban selladas con epoxi, aislando el dispositivo de microfluidos del entorno exterior.
Las células se cultivaron con perfusión continua de CO2 Independent Medium (Gibco, Inc.) suplementado con suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 4 mM y penicilina/estreptomicina al 1%. Durante la perfusión, el dispositivo se colocó dentro de una incubadora a 37 °C. La perfusión se controló con una bomba de jeringa programable (Cole Parmer 74900), normalmente establecida como un flujo de 0,4 y//min a través del dispositivo en formación. Las células se cultivaron durante más de dos semanas dentro de la formación de microfluidos sin pérdida de viabilidad.
Mantenimiento de patrones
A medida que las células comenzaron a dividirse dentro de la formación, fue posible mantener el patrón de localización eliminando selectivamente las células del exterior del área de crecimiento. La proteasa tripsina se introdujo en la formación para liberar las células adherentes del sustrato. La gran velocidad de flujo en los canales exteriores hizo que estas células se eliminaran del sistema mientras que las células de los anillos de crecimiento se retuvieron. Reemplazar el medio de cultivo en las cámaras hizo que estas células se volvieran a unir al sustrato y reanudaran el crecimiento. Repitiendo periódicamente este proceso, el patrón de microformaciones de células podría mantenerse durante largos períodos. En este experimento, se permitió a propósito que las células crecieran demasiado en las cámaras para demostrar los límites del mantenimiento del patrón. Incluso cuando las células habían crecido completamente en el canal exterior, la eliminación selectiva fue capaz de restaurar el patrón de tal manera que menos del 3% de las células permanecieron fuera del anillo central. La programación del tratamiento cada 24 horas aseguró que más del 99% de todas las células permanecieran dentro del anillo central. Un control más estricto de las condiciones de reacción y la programación pueden eliminar en gran medida los desechos celulares residuales en el canal exterior. La capacidad de mantener la localización celular es crucial para el desarrollo de formaciones a microescala al evitar las faltas de uniformidad en el flujo que resultan del crecimiento celular en los canales fluídicos.
Las figuras 5A-C ilustran el funcionamiento de un dispositivo de formación de microcultivo según realizaciones específicas de la invención que muestran el mantenimiento del patrón a largo plazo. En la figura 5A, después de un cultivo extendido, las células en división comenzaron a ocupar los canales fluídicos. En la figura 5B, usando la proteasa de tripsina, las células se suspendieron del sustrato y se descargaron selectivamente desde el canal exterior. Dado que la velocidad del flujo fue de órdenes de magnitud menor en la cámara central, estas células no se desplazaron y el crecimiento continuó una vez que el medio se restableció en el dispositivo. En la figura 5C se muestra que este método aseguró la localización celular a largo plazo (círculos cerrados) en comparación con una condición de control en la que no se implementó una eliminación selectiva (círculos abiertos). La degradación del patrón se definió como el porcentaje de células que crecen fuera de la cámara central.
El análisis en tiempo real de la actividad celular se logró fácilmente mediante interrogación óptica. La transparencia del dispositivo microfabricado en longitudes de onda biológicamente relevantes permitió una adaptación perfecta a las técnicas de microscopía fluorescente utilizadas en biología celular. El análisis de células individuales mediante espectroscopia Raman en nanopartículas biofuncionalizadas dentro de la microformación de cultivo celular también se puede utilizar para supervisar la actividad. Las unidades de cultivo también podrían vincularse a módulos de análisis de microfluidos posteriores, tal como uno desarrollado para el aislamiento y la detección de ácidos nucleicos de una sola célula.
4. Ejemplo 3
En una realización adicional, una cámara de cultivo tiene una única abertura para la introducción de células y un medio de cultivo de difusión o canal de reactivos que fluye alrededor de la cámara de cultivo y está conectado a la misma mediante microentradas o canales de microperfusión. La figura 6A ilustra una vista esquemática de otro ejemplo de dispositivo o elemento de formación con un orificio de carga de células y un medio o canal de reactivo conectado al mismo mediante una microestructura de transferencia de masa/difusión de alta resistencia fluídica (por ejemplo, microentradas o pasos) que tienen una resistencia fluídica sustancialmente mayor (debido a una menor altura y/o menor sección transversal) que el canal de carga o área de cultivo según realizaciones específicas de la invención. Al igual que con otras realizaciones descritas en la presente memoria, la alta resistencia fluídica entre los pasos y la microcámara permite un fácil manejo y cultivo celular. Este ejemplo de realización tiene aplicaciones particulares para crear y/o mantener una unidad de tejido artificial mejorada, tal como un hígado, páncreas, riñón, tiroides, etc. artificiales, para diversos ensayos y también como un modelo de tumor sólido mejorado.
La figura 6B es un diagrama de bloques esquemático que muestra cuatro áreas de cultivo, cada una con un orificio de carga y un canal de medio/reactivo que fluye próximo a las áreas de cultivo y conectado a las mismas mediante una microestructura de transferencia de masa/difusión de alta resistencia fluídica según realizaciones específicas de la invención. Esto debe entenderse como un ejemplo de realización básico. En realizaciones alternativas, las cámaras de cultivo pueden tener diferentes geometrías, como la cámara en forma de "U" que se ilustra a continuación. Un aspecto de esta realización es que el canal de medio/cultivo fluye alrededor de la microcámara sin ser forzado a fluir a través de la microcámara como se ilustra en algunas realizaciones de perfusión alternativas descritas anteriormente. Por tanto, la transferencia de nutrientes, desechos o reactivos en esta realización es en gran parte por difusión. Sin embargo, como se discutió anteriormente, incluso en las realizaciones de perfusión, una parte de la transferencia de masa se debe a la difusión. En otras realizaciones, todas las cámaras o varios conjuntos de cámaras pueden tener un canal de carga de células compartido como se muestra, pero canales de medio separados, lo que permite realizar varios experimentos individuales en múltiples cultivos duplicados.
Aunque este ejemplo de realización tiene varias aplicaciones, una de particular interés es su uso para facilitar un hígado artificial o una senoide de hígado artificial. En una implementación de ejemplo, los hepatocitos primarios de rata de alta densidad recibieron transporte de nutrientes a través de una membrana biomimética (o vasculatura o membrana virtual) según realizaciones específicas de la invención. Esta configuración demostró una mayor viabilidad y actividad metabólica del citocromo P450 en comparación con los cultivos que carecen de esta arquitectura multicelular.
La capacidad de mantener la función hepática específica de los hepatocitos in vitro es un área importante de la investigación médica y farmacéutica debido a su papel central en el metabolismo de los fármacos. Como ocurre con la mayoría de los tejidos, los hepatocitos pierden rápidamente la función específica del órgano una vez que se eliminan del medio ambiente en vivo. Si bien los recubrimientos de matriz extracelular, como el colágeno I, se utilizan tradicionalmente para mantener los hepatocitos primarios en cultivo, también se sabe que regulan a la baja la actividad específica del hígado. Al utilizar capacidades de ingeniería con resolución a microescala, la presente invención posibilita recrear partes de una arquitectura de hígado natural.
En un ejemplo, se fabricó un senoide artificial microfluídico usando métodos de litografía blanda como se describe en la presente memoria, y consistió en estructuras moldeadas en elastómero de silicona unidas a una superficie de cultivo de vidrio. Una unidad de cultivo básica de ejemplo contenía un 50x30x500 jm de placa hepática, 50x30 jm de recipiente de sección transversal y una "barrera endotelial" biomimética (o membrana virtual) que separa la región de cultivo de hepatocitos del recipiente de transporte de nutrientes, en el que esta barrera biomimética o membrana virtual se construye a partir de uno o más pasos de alta resistencia fluídica utilizando la fabricación como se describe en la presente memoria.
La unidad de cultivo de microfluidos imita las propiedades de la vasculatura hepática en el tejido vivo. Los hepatocitos se preparan como una masa casi sólida de células en "placas" de aproximadamente 50 jm de ancho. A ambos lados de los hepatocitos hay "senoides" de transporte de nutrientes. Los pequeños canales de sección transversal que conectan los dos compartimentos localizan las células en las áreas de crecimiento al tiempo que permiten la difusión del medio. El caudal ((5 nl/min), la velocidad del fluido (~0,5-1,5 mm/s) y el número de células (-250-500) son valores aproximados encontrados en el hígado. El diseño de alta relación de resistencia fluídica entre las columnas de siembra de células y los canales de medio permite la transferencia de masa de difusión dominante para el cultivo de tejidos. Los canales medianos pequeños también evitan que los hepatocitos crezcan hacia los canales de suministro de nutrientes. Por tanto, en realizaciones particulares, la presente invención recrea funcionalmente el microambiente que se encuentra en el hígado humano normal. En un hígado normal, una "placa de hepatocitos" es lo que los fisiólogos suelen llamar la agregación de hepatocitos ubicados entre espacios senoides (regiones vacías que permiten el flujo sanguíneo). Esta configuración maximiza el número de células funcionales sin restringir el transporte de nutrientes. En muchos órganos, los senoides (o espacios) revestidos de endotelio proporcionan el microambiente para las células que forman los tejidos de un órgano y los tejidos de estos órganos, así como otros tejidos, son particularmente adecuados para el cultivo como se describe en la presente memoria.
Volviendo al ejemplo de realización mostrado en la figura 6, unos poros estrechos dentro de la "barrera endotelial" (por ejemplo, alrededor de 1 a 2 jm de ancho por x 1 a 2 jm hasta la altura del área de cultivo alto) impidieron el paso de las células, pero permitió el transporte difusivo de desechos y nutrientes. Un análisis de la dinámica de fluidos de esta arquitectura de microfluidos indicó que la tasa de difusión de nutrientes en la región de cultivo de hepatocitos fue aproximadamente 100 veces mayor que el transporte convectivo a la tasa de flujo sanguíneo fisiológicamente relevante de 10 nl/min. Además, el endotelio artificial también se utilizó como tamiz celular para concentrar los hepatocitos de la suspensión hasta 104 veces (por ejemplo, como se muestra en la figura 8 y la figura 10) para crear una placa de hepatocitos compactada en vivo.
Para comparar la función de los senoides artificiales según realizaciones específicas de la invención con otras técnicas de cultivo celular hepáticas, se mantuvieron aislados hepatocitos de rata (Cambrex) en el medio sugerido en placas de fondo de vidrio de 384 pocillos y senoides microfluídicos en dos densidades celulares iniciales. En ausencia de recubrimiento de colágeno, los hepatocitos en la placa de microtitulación y aquellos que carecían de contactos densos de célula a célula perdieron viabilidad en 4 días. Sembrando hepatocitos a una densidad equivalente (2x105 células/cm2) en la placa de microtitulación no mejoró la viabilidad. Un ensayo de la actividad de P450 específica del hígado verificó el aumento de la funcionalidad de los hepatocitos cultivados en el senoide microfluídico (figura 9B). La actividad metabólica fue estadísticamente equivalente desde el día 1 al día 7 en el dispositivo de microfluidos (p> 0,20). La figura 8 ilustra una micrografía de hepatocitos de rata de ejemplo cultivados en un dispositivo de ejemplo, tal como en la figura 6, en el que la imagen de fluorescencia representa la actividad metabólica de P450 de las mismas células en un estado densamente concentrado (A) y sin contacto celular (B) que muestra que una cámara de cultivo de acuerdo con realizaciones específicas de la invención es capaz de mantener concentradas las células de tejido en cultivo, permitiendo que las células expresen una actividad metabólica más normal.
La figura 9A es un gráfico que indica la viabilidad de los hepatocitos cultivados en una placa de microtitulación (■), y en un ejemplo de dispositivo de cultivo de microfluidos según realizaciones específicas de la invención sin contacto celular (▲) y en una configuración concentrada en un dispositivo de cultivo de microfluidos (□) , donde los datos representan la media y SEM de 139 unidades de cultivo en 15 chips independientes y el gráfico indica que la viabilidad de los hepatocitos se extiende en gran medida cuando se cultivan densamente concentrados en un dispositivo de la invención. La figura 9B muestra la actividad de P450 ensayada por el metabolismo del éter dietílico de 5-clorometilfluoresceína (10 jM , 30 minutos) en una placa de microtitulación (sombreada) y en un senoide de microfluidos de la invención (sombreado) que muestra una mejora significativa de la función del hepatocito primario (p <0,05) donde los datos representan la media y la DE la intensidad de fluorescencia de >100 células en 3 chips independientes después de 5 días en cultivo (datos normalizados para hepatocitos en placa de microtitulación).
Estos hallazgos indican que el estrecho contacto físico de los hepatocitos en el senoide microfluídico influye sobre la función diferenciada. Esta conclusión concuerda con los hallazgos sobre el comportamiento del agregado de hepatocitos y puede deberse a la importancia de las uniones funcionales en el hígado intacto (por ejemplo, en S. A. Stoehr, H. C. Isom, Hepatology 38, 1125 (noviembre de 2003). La ingeniería de microfluidos permite el control de aspectos clave de la arquitectura multicelular y, al mismo tiempo, resuelve el problema de proporcionar una transferencia de masa adecuada a los cultivos de densidad tisular. La aplicación de los principios de ingeniería descritos aquí puede resultar útil para la investigación futura de la función de los órganos.
La figura 10A-C ilustra una micrografía de un ejemplo de cultivo de hepatocitos microfluídicos de alta densidad que muestra (A) imágenes de lapso de tiempo (1 a 240 segundos) de hepatocitos cargados en el senoide microfluídico bajo una presión de conducción de 10 psi y (B) ensayo de viabilidad fluorescente en células cultivadas durante 7 días en el dispositivo a alta densidad celular y (C) baja densidad celular. El proceso de carga es autolimitante ya que la resistencia a fluir a través de la senoide aumenta con la densidad celular. Nótese que el empaquetamiento de células cerrado se logra con una tensión mínima de la membrana. En estos experimentos, las células se tiñeron con Hoechst 33342 (azul), calceína AM (verde) y homodímero 1 de etidio (rojo). La densidad celular baja se definió como un espaciado medio de centro a centro de >23 jm y alta densidad definida como <20 jm . El diámetro medio de los hepatocitos fue de 20 ± 2 jm .
5. Ejemplo 4 Barrera de rejilla
Una realización alternativa a cualquiera de los dispositivos discutidos en la presente memoria implica una barrera de difusión o perfusión en forma de rejilla entre el canal de medio/reactivo y el área de cultivo. Esta barrera se puede construir de manera similar a las microentradas o pasos como se describió anteriormente, excepto que en lugar de entradas individuales, se usa una rejilla u otra disposición de microentradas que se cruzan para permitir el transporte de fluido de perfusión. La figura 11A es una micrografía de un dispositivo de cultivo de ejemplo con una barrera de perfusión en forma de rejilla según realizaciones específicas de la invención. En este ejemplo, se muestran perlas a nanoescala (500 nm) concentradas con alta densidad en la cámara central. Al igual que con los micropasos descritos anteriormente, los pasos de la rejilla pueden ser mucho más cortos que el área de cultivo o pueden estar cerca, o a la misma altura, según realizaciones específicas de la invención.
6. Ejemplo 5
Modelo de esferoide de tumor multicelular
Otra aplicación de la invención es el cultivo de tumores sólidos que pueden realizar una función similar a los modelos de esferoides de tumores multicelulares para el cribado de fármacos contra el cáncer. Los esferoides tumorales multicelulares (MTS) son células cancerosas densamente concentradas que crecen generalmente en suspensión en un cultivo que imitan las propiedades de los tumores dentro de un organismo vivo. Si bien se sabe que los MTS proporcionan un mejor modelo para la eficacia de los fármacos contra el cáncer que las células tumorales cultivadas en placa, en la práctica están limitados debido a la dificultad de manipulación de los esferoides y la dificultad para observar esferoides suspendidos. Utilizando el método de microfluidos que se describe aquí, se logra un método mucho mejor para producir cultivos similares a tumores de alta densidad en estructuras definidas.
Por tanto, de acuerdo con realizaciones específicas de la invención, después de un cultivo prolongado de células cancerosas en una cámara de cultivo de microfluidos, las células experimentan una transición en la morfología y asumen un comportamiento similar al encontrado en los MTS. En esta condición, se establecen contactos extensos entre células que limitan la penetración del fármaco en la masa celular, se produce una matriz extracelular y los límites de las células individuales se oscurecen. La figura 12 es una serie de micrografías que ilustran un dispositivo de ejemplo utilizado para cultivar células cancerosas humanas en una configuración concentrada similar a un tumor de alta densidad durante un período de 12 días según realizaciones específicas de la invención.
7. Otros ejemplos
Las figuras 13 a 18 son diagramas de bloques esquemáticos que ilustran diversas configuraciones para dispositivos y/o sistemas de cultivo de acuerdo con diversas realizaciones específicas de la invención. Si bien varios diagramas ilustran principalmente el elemento de formación como una cámara de cultivo en 'U' cuadrado, se entenderá que cualquiera de las otras configuraciones de la cámara de cultivo como se describe en la presente memoria podría configurarse como se ilustra a continuación de acuerdo con algunas realizaciones de la invención. En estas figuras, las conexiones fluídicas a cada cámara de cultivo se muestran por separado. Sin embargo, en diversas realizaciones, estas conexiones se pueden combinar en el chip o fuera del chip para proporcionar áreas de cultivo más grandes y efectivas, o para facilitar el mantenimiento del flujo de nutrientes o la salida de la cámara de recolección.
La figura 13 ilustra como ejemplo tres de posiblemente cientos de cámaras de cultivo en un sistema para cribado multiplexado de alta densidad celular según realizaciones específicas de la invención. En este ejemplo, las muestras de células se concentran en regiones similares a tejidos según lo definido por las barreras de microfluidos y se mantienen con un flujo continuo de reactivos en ambos lados de la muestra de células. Este diseño se puede utilizar para imitar tejidos como el senoide hepático. Esto es particularmente adecuado para estudios que implican el cultivo de muestras similares a tejidos (por ejemplo, muestras de células primarias). Usando un solo orificio de entrada de célula, se pueden llenar múltiples cámaras de célula, donde cada una puede ser tratada con una combinación diferente de fármaco/medio. El comportamiento celular se puede analizar mediante métodos de microscopía o recolectando el flujo y realizando análisis bioquímicos.
La figura 14 ilustra una variación con la adición de una región de detección óptica u otra en línea (representada con un círculo rojo). Para muchos ensayos basados en células, los puntos finales se miden a partir de la intensidad de fluorescencia de sustratos de sonda solubles. En este diseño, un microscopio o espectrómetro se enfoca en la región de detección aguas abajo para cuantificar la actividad celular. Esta configuración es especialmente atractiva para una plataforma de microfluidos, ya que los volúmenes de fluido utilizados son típicamente mínimos (1-1000 nL), lo que dificulta la medición tradicional de "volumen".
La figura 15 ilustra como un ejemplo tres de posiblemente cientos de cámaras de cultivo en un sistema útil para el cribado de penetración/absorción de fármacos en el que se cultiva una masa sólida de células como se describió anteriormente, pero en comunicación con dos flujos de fluidos separados (izquierda y derecha) de acuerdo con realizaciones de la invención. En este ejemplo, se cultiva una masa sólida de células como se describió anteriormente y en comunicación con dos conjuntos de flujos de fluidos (por ejemplo, izquierda y derecha). En esta configuración, se puede introducir una sustancia química de interés en un canal de flujo (por ejemplo, un fármaco), y el control de la presencia de la sustancia química o algún subproducto o metabolito, o resultado del mismo en el canal opuesto permite la determinación de la cinética de transporte del fármaco y/o actividad farmacológica. Este tipo de experimento es útil para calcular el grado de penetración o absorción del fármaco a través de un cultivo de tejido. Por ejemplo, muchos medicamentos contra el cáncer se vuelven ineficaces debido a su incapacidad para penetrar en el centro de los tumores sólidos. Otro ejemplo es la necesidad de que los farmacólogos determinen qué cantidad de un compuesto farmacológico (presente en la sangre o en el sistema digestivo) absorberá los tejidos corporales, tales como los vasos sanguíneos y los revestimientos intestinales. Este diseño de microfluidos permite de forma única el cribado de alto rendimiento para estas actividades.
La figura 16 ilustra como ejemplo una de posiblemente cientos de cámaras de cultivo en un sistema en el que una primera región de cultivo está anidada dentro de una segunda región de cultivo según realizaciones específicas de la invención. En este ejemplo, una región de cultivo celular está anidada dentro de una segunda región de cultivo. Esto permite la carga de dos tipos de células diferentes en ubicaciones definidas en comunicación entre ellas. Una aplicación de este diseño es para la generación de un tejido multicapa artificial, tal como una estructura de hepatocito/endotelio. Se sabe que la capacidad de cultivar múltiples tipos de células en contacto entre ellas mejora los comportamientos fisiológicos. En realizaciones adicionales, las técnicas de fabricación descritas en la presente memoria pueden usarse para crear estructuras de más de dos áreas de cultivo celular.
La figura 17 ilustra como ejemplo tres de posiblemente cientos de áreas de perfusión de medio en un sistema útil en el cribado celular de propósito general según realizaciones específicas de la invención. Esta configuración puede ser deseable para su uso en el cribado de células de propósito general. Esta configuración de dispositivo no concentra las células en una masa sólida. En cambio, de forma similar a una placa de microtitulación convencional, las células se distribuyen aleatoriamente a lo largo del canal de cultivo. Una barrera de microfluidos de alta resistencia separa la cámara de cultivo celular de un canal paralelo de nutrientes/reactivos. Esta configuración reproduce muchas de las propiedades del cribado celular convencional a macroescala, con la ventaja de un formato microfluídico. Una aplicación clave de este diseño es la realización de experimentos sobre células primarias de alto rendimiento, que pueden resultar prohibitivamente costosos debido a la gran cantidad de células necesarias por punto de datos.
La figura 18 ilustra como ejemplo tres de posiblemente cientos de cámaras de cultivo en un sistema útil donde múltiples áreas de cultivo están dispuestas en paralelo con una sola entrada y salida de nutrientes (los múltiples pocillos de entrada están conectados fuera del chip) de acuerdo con realizaciones específicas de la invención. Como una aplicación de ejemplo, esta configuración imita el tejido del órgano del hígado humano cuando se utilizan hepatocitos. Esta forma de multiplexación permite mantener muchas unidades de microescala, generando un entorno de órganos artificiales. Una aplicación de tal diseño sería crear un hígado artificial para su uso en el cribado preclínico de fármacos (metabolismo y farmacocinética de fármacos). Otra aplicación potencial es la construcción de un órgano artificial para producir un compuesto o sustancia de interés, o para realizar una función biológica o terapéutica. En este diseño de ejemplo, cada pocillo del biorreactor es de tamaño estándar SBS (3,5 mm de diámetro) y las columnas de siembra de células se colocan en el centro de los pocillos de entrada de fármaco y salida de perfusión; por lo tanto, el biorreactor es compatible con lectores de placas estándar.
Aplicaciones de célula primaria
Además de los experimentos descritos, una formación de cámaras de acuerdo con la invención es adecuada para su uso con todas las muestras de células primarias utilizadas actualmente. Las células primarias son las recolectadas de tejido animal vivo y son particularmente útiles para pruebas en las que las respuestas fisiológicas son importantes (por ejemplo, detección de fármacos). Empresas como Cambrex y AllCells están especializadas en la preparación y venta de muestras de células primarias. Debido al suministro limitado de muestras de células primarias, éstas no se integran fácilmente en tamices a gran escala. La ventaja de un formato de microfluidos controlado es que con el mismo número de células, el rendimiento de los experimentos se puede multiplicar por 100. Además, dado que es importante mantener la función celular primaria en cultivo, un sistema de microfluidos permite un mejor control de las condiciones de cultivo.
Una categoría especial de células primarias son las células madre. Estas células son capaces de diferenciarse en varios fenotipos celulares en diferentes condiciones. Por ejemplo, se sabe que las células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse en todos los tipos de células que se encuentran en el cuerpo humano adulto. Actualmente, el cultivo celular madre se practica manteniendo colonias de células madre de alta densidad en entornos bien controlados. Por lo tanto, la invención descrita aquí es ideal para aplicaciones en cultivo, mantenimiento y diferenciación controlada de células madre.
Ejemplo de sistema
En una realización de ejemplo, el funcionamiento del dispositivo de microfluidos de hígado artificial se logra usando una plataforma de interfaz con cada chip de ejemplo que contiene 8 experimentos de cultivo celular independientes, con un depósito de entrada y salida separado. La figura 20 muestra los resultados de fabricación de un chip de biorreactor microfluídico de 8 unidades según realizaciones específicas de la invención. Se desarrolló un nuevo proceso de fabricación para intercalar estructuras de microfluidos de PDMS entre PMMA y vidrio. El chip compuesto de PMMA/PDMS se unió luego a una placa de pocillos de PMMA utilizando adhesivos acrílicos. El funcionamiento del chip del biorreactor se verificó confirmando que los colorantes alimentarios fluyen desde los depósitos superiores a los depósitos inferiores a través de las estructuras de microfluidos de PDMS. En este ejemplo, las microcámaras de cultivo y las conexiones de microfluidos están ubicadas en un área central, interconectadas con un formato de pocillo estándar SBS (por ejemplo, un tamaño estándar para placas de 384 pocillos). En la figura, los tintes azul y rojo se muestran en depósitos de entrada alternados en un lado del chip, con los depósitos de salida en el otro lado del chip. Esta configuración de ejemplo permite ocho experimentos de cultivo celular independientes, teniendo cada una de las ocho regiones separadas en la parte central una o más microcámaras senoides como se describe en la presente memoria. A la derecha de la figura se muestra un colector opcional utilizado para el control de flujo en este ejemplo. Sin embargo, el flujo por gravedad también se puede utilizar como se describe en la presente memoria. El chip se inserta en el colector, lo que proporciona un control de presión neumático preciso para el flujo de medio/reactivo. El chip transparente y el colector se representan en una platina de microscopio, donde el comportamiento celular se puede supervisar fácilmente.
Por lo tanto, esta realización proporciona canales de reactivo/medio direccionables independientes que no están conectados. Por ejemplo, en una configuración como se muestra en la figura 20, cada orificio/depósito de entrada se conecta exactamente a una salida, lo que permite, por ejemplo, probar 8 productos químicos diferentes colocando 8 líquidos separados en los 8 orificios de entrada. Si bien en este ejemplo, cada una de las 8 unidades comparte la misma entrada de carga de célula, debido a la barrera de alta resistencia en cada unidad, funcionalmente no hay comunicación entre los 8 flujos de entrada/salida "independientes".
En una operación de ejemplo, la carga de la célula se realiza en las ocho cámaras simultáneamente, lo que permite un ahorro celular significativo. El dispositivo de microfluidos basado en polidimetilsiloxano (PDMS) está interconectado con un formato estandarizado de "placa de pocillos" (acrílico), lo que permite el pipeteo directo del medio de cultivo y los reactivos. La fabricación del chip permite la visualización de todos los flujos fluídicos utilizando microscopía estándar o métodos de cribado de alto contenido. Para la carga de células y el cebado inicial, se utiliza un colector de control de presión de aire construido a medida. Debido a los bajos caudales necesarios para la perfusión del medio (5 nl/min), se puede utilizar un método de flujo simple impulsado por gravedad inclinando la placa para hacer que los pozos de entrada sean más altos que los pozos de salida junto con un método de patrón de resistencia fluídica para lograr un funcionamiento fiable en algunas realizaciones, aunque también se pueden utilizar otros mecanismos de bombeo.
La naturaleza a microescala del dispositivo de cultivo permite realizar investigaciones con ahorros significativos de células/reactivos. En la operación actual, solo se necesitan 5,000 células (5 ul a 106 células/ml) para llenar completamente el dispositivo de 8 unidades. Actualmente, la carga de células se logra en menos de 5 minutos con más del 90% de las células localizadas en las regiones de crecimiento. Se espera que una mayor optimización aumente la eficiencia de carga a casi el 100% (todas las células colocadas en el pocillo terminan en la región de crecimiento de microfluidos) al estandarizar las condiciones de carga de células (densidad celular, medio de carga, caudal) para minimizar la pérdida celular en la fluídica aguas arriba. En observaciones preliminares, un caudal medio de 5 nl/min (~8 ul/día) fue suficiente para mantener las células HepG2. Por lo tanto, los depósitos de entrada y salida de 384 pocillos de microtitulación estándar (que contienen 100 ul) son suficientes para mantener el cultivo a largo plazo (con reposición ocasional). El caudal a través del dispositivo durante el cultivo se mantiene utilizando presión hidrostática impulsada por la gravedad. Esto se logra colocando el chip en una pendiente fija. Al diseñar cuidadosamente la resistencia fluídica en los canales de microfluidos y el ángulo de inclinación, las observaciones iniciales muestran que se puede mantener un 7,4 ± 1,1 nl/min durante largos períodos. Se espera que la tolerancia de este flujo (15%) sea mucho mejor (<2%) al mejorar la calidad y uniformidad de la fabricación.
El cultivo celular dentro de la formación se verificó usando la línea celular de hepatoma humano HepG2. Estas observaciones indican que no hay limitación de nutrientes incluso para cultivos de muy alta densidad después de 7 días de flujo impulsado por gravedad. Además, la viabilidad se mantuvo casi al 100% en todas las 8 unidades del chip y en 3 chips independientes, lo que indica que no hay fallos fundamentales en el diseño o la operación.
Las observaciones preliminares del cultivo primario de hepatocitos de rata (Cambrex Bioscience) en el dispositivo indicaron una morfología alterada similar que no se observa en el cultivo en disco de plástico (figura 8). Presumiblemente, el contacto célula-célula habilitado por el dispositivo de microfluidos señala la formación de agregados "similares al hígado", similares a los observados en ECM y cultivo de esferoides. Los datos preliminares indican que esta configuración de cultivo mejoró en gran medida la viabilidad celular (figura 9). Incluso en ausencia de recubrimiento superficial, el contacto célula-célula parecía capaz de mantener una alta viabilidad de los hepatocitos en el formato microfluídico.
La figura 21 ilustra (a) un prototipo de colector neumático para un chip de biorreactor microfluídico de 8 unidades donde el cebado del chip y las células de carga en las estructuras microfluídicas se puede lograr mediante bombeo neumático a través de las líneas de control neumático como se ilustra y; (b) un microscopio invertido usado para supervisar durante el proceso y que muestra válvulas de solenoide para controlar la presión neumática según realizaciones específicas de la invención. Como se describe en la presente memoria, en realizaciones específicas se desarrolló un nuevo proceso de fabricación para intercalar estructuras de microfluidos de PDMS entre PMMA y vidrio. A continuación, el chip compuesto de PMMA/PDMS se unió a una placa de pocillos de PMMA utilizando adhesivos acrílicos. El funcionamiento del chip dl biorreactor se verificó confirmando que los colorantes alimentarios fluyen desde los depósitos superiores a los depósitos inferiores a través de las estructuras de microfluidos de PDMS. En una configuración de ejemplo, después de cargar los chips, se colocaron en una incubadora de CO2 (Ferma Scientific) para control del ambiente. Se utiliza una gradilla de flujo por gravedad de diseño inclinado para experimentos de perfusión a gran escala. La resolución del caudal está en nanolitros.
8. Ejemplos de métodos de fabricación
Los sistemas y dispositivos que se describen en la presente memoria se pueden fabricar utilizando cualquier técnica o método familiar del campo de la fotolitografía, nanofabricación o fabricación microfluídica. Para completar esta descripción y para discutir aspectos novedosos adicionales e independientes de acuerdo con realizaciones específicas de la invención, se proporcionan a continuación detalles específicos de métodos de fabricación de ejemplo.
En algunas realizaciones, los microdispositivos se fabrican utilizando un proceso de molde único, lo que permite el aumento de escala directo de la formación, así como la capacidad de integración con capas de microfluidos adicionales. El desarrollo de una plataforma de análisis celular automatizada de alto rendimiento de microfluidos permite determinar u observar rápidamente múltiples parámetros celulares para aplicaciones en biología celular cuantitativa y biología de sistemas.
En realizaciones específicas alternativas, se implementa una formación de células microfluídicas escalables de alta densidad utilizando un diseño novedoso para desacoplar mecánicamente los compartimentos celulares del flujo de fluido. Esto se logra nuevamente utilizando un método de tecnología de litografía blanda de alta relación de aspecto, que consiste en modelar dos alturas de canal diferentes y/o dos anchos de canal diferentes en un solo molde de tal modo que la resistencia fluídica se pueda controlar con precisión en hasta cinco órdenes de magnitud. Al localizar el crecimiento celular en áreas predefinidas, el transporte de fluidos a través de la formación se controla y se aísla cuidadosamente de la actividad celular.
La figura 23A-B ilustra un diagrama de proceso de fabricación esquemático para un ejemplo de fabricación según realizaciones alternativas específicas de la invención. Se fabricó una formación de cultivo celular microfluídico de ejemplo de acuerdo con realizaciones específicas de la invención utilizando tecnología de litografía blanda y moldeo por réplica. Este proceso consistió en modelar un molde de polímero sobre una oblea de silicio seguido de replicación con un elastómero blando. Se usó fotorresistencia negativa SU-8 (Microchem Corportion) como material de molde. Primero, el SU-82002 fue modelado en una oblea de silicio para definir una estructura de alta resistencia fluídica (por ejemplo, canales altos de 2 ym y/o un espacio debajo o sobre una C- u otra estructura entre el canal exterior y la cámara de cultivo. A continuación, se revistió por centrifugación una capa SU-82050 de 40 a 50 u en la parte superior de los canales de perfusión. Debido a que la SU-82050 es sustancialmente más gruesa que la SU-82002, la superficie se planificó después del revestimiento por rotación. A continuación, se definieron fotolitográficamente la cámara de cultivo celular y otros canales. Se preparó PDMS (Sylgard 184, Dow Corning Corporation) con una relación de 10:1 entre la base y los agentes de curado. A continuación, se vertió el PDMS en el molde SU8 de 2 niveles. El molde se desgasificó en una cámara de vacío durante 10 min antes de curar en un horno a 70 °C durante 4 h.
A continuación, se cortaron los troqueles del dispositivo con una cuchilla de afeitar y se perforaron los orificios de conexión fluídica utilizando una aguja de punta plana de calibre 18. A continuación, el dispositivo se unió de forma irreversible a un cubreobjetos (Fisher Scientific) después del tratamiento con plasma de oxígeno (PlasmaTherm Etcher, 50 W, 2 Torr, 40 s) tanto en la parte inferior del dispositivo como en el portaobjetos de vidrio. Se utilizaron conectores de acero inoxidable de calibre 20 (Instech Laboratories) y tubos blandos (Cole Parmer Corporation) para proporcionar conexiones fluídicas a una bomba de jeringa (Cole Parmer 74900).
En realizaciones alternativas (por ejemplo, para el dispositivo de microfluidos de tejido artificial) se utilizó un método de fabricación diferente. Un ejemplo de chip de biorreactor de microfluidos de 8 unidades se fabricó integrando heterogéneamente depósitos de PMMA con dispositivos de microfluidos de PDMS. El método descrito anteriormente demuestra el uso de PDMS y tecnología de litografía blanda para una formación de cultivo celular accionada por bomba de jeringa. Para una experimentación basada en células de mayor rendimiento, se utilizó un método de fabricación alternativo para "intercalar" PDMS entre una hoja de PMMA y un portaobjetos de vidrio para facilitar la integración con materiales a base de plástico. En este ejemplo particular, el PDMS tiene un grosor de 0,5 mm, la hoja de PMMA tiene un grosor de 1,5 mm y el portaobjetos de vidrio tiene un grosor de 1 mm. El chip microfluídico compuesto de PMMA/PDMS se unió luego a otra pieza de placa de PMMA que contenía depósitos de reactivo y conexiones fluídicas. La figura 20 muestra los resultados de fabricación del chip de biorreactor de microfluidos de 8 unidades. Las características de microfluidos de PDMS se fabricaron utilizando la tecnología de litografía blanda convencional como se describe anteriormente y la placa de pocillos de PMMA se cortó con un cortador láser de CO2VersaLASER de 25 W. Luego se aplicó cemento acrílico transparente para unir adhesivamente el chip compuesto de PMMA/PDMS a la placa de pocillos de PMMA.
9. Funcionamiento de ejemplo
El funcionamiento del chip de biorreactor de microfluidos se logró mediante una plataforma de interfaz desarrollada en CellASIC. Cada chip de biorreactor proporciona actualmente 8 experimentos de cultivo independientes, cada uno con un depósito de entrada y salida independiente, y de acuerdo con realizaciones específicas de la invención, la carga de células se puede realizar simultáneamente en las ocho cámaras, ahorrando significativamente las biomasas. El formato de placa de pocillos de PMMA estándar permitió el pipeteo directo de células, medio de cultivo y reactivos. La fabricación del chip también permite la visualización de todos los flujos fluídicos utilizando microscopía estándar o métodos de cribado de alto contenido. Para la carga de células y el cebado inicial, se utiliza un colector de control de presión de aire construido a medida. Debido a los bajos índices de flujo necesarios para una perfusión del medio (~5 nl/min), es fiable un método de flujo simple impulsado por gravedad. Además, cada chip de biorreactor puede cebarse y cargarse con células por separado y luego colocarse en una incubadora para la perfusión impulsada por la gravedad en rejillas inclinadas.
Ejemplo de fabricación completa en plástico
En otras realizaciones, también se puede fabricar un dispositivo de cultivo todo de plástico. La figura 19 ilustra un dibujo CAD de un biorreactor microfluídico de PMMA de 96 unidades propuesto en el que, en este ejemplo, cada pocillo del biorreactor es de tamaño estándar SBS (3,5 mm de diámetro) y las columnas de siembra de células se colocan en el centro de los pocillos de entrada de fármaco y la salida de perfundido; por lo tanto, el biorreactor es compatible con lectores de placas estándar. En este ejemplo, se pueden realizar 96 experimentos basados en células de medio continuo en una sola placa acrílica. Dado que la placa del biorreactor es estándar SBS, es compatible con el sistema robótico de manipulación de líquidos y el lector de placas existentes; por lo tanto, la placa en sí puede ser una integración modular en los laboratorios de investigación existentes. Para facilitar la adquisición de datos de alto rendimiento, las células atrapadas de forma fluida se colocan en el medio de los pocillos de entrada de fármaco y de salida de perfundido; por lo tanto, las señales luminiscentes o fluorescentes de las células se pueden leer directamente desde un lector de placas convencional para ensayos basados en células.
Para fabricar la placa del biorreactor de microfluidos, se corta con láser (láser CO2 de 25W, VersaLASER) una hoja de PMMA de 6 mm de espesor (McMaster-Carr) o se moldea por inyección para crear una pieza superior que contenga todas las entradas de células, pocillos de entrada de fármacos y de salida de perfusión. Una plantilla maestra de polímero duro (o una plantilla maestra de silicio o plantilla maestra de electroformado) tales como las que se pueden fabricar en Berkeley Microfabrication Laboratory, se estampa en caliente (Tetrahedron Associates, SPF-8) en una hoja de PMMA de 1,5 mm de espesor (McMaster-Carr) para crear una pieza inferior con estructuras microfluídicas. Además del estampado en caliente, el moldeo por inyección también puede ser una opción. Las piezas superior e inferior se unen térmicamente (Tetrahedron Associates, SPF-8) para completar la placa de microfluidos. También es posible tener las estructuras de microfluidos, pocillos de entrada y salida en una misma pieza única. La figura 24 representa los pasos generales de fabricación.
Diversos grupos han demostrado con éxito el estampado en caliente de características de tamaño nano a micro utilizando diferentes plantillas maestras, así como la unión térmica entre dos hojas de PMMA; sin embargo, CellASIC es el primero en aplicar estos procesos para experimentos basados en células de alto rendimiento. Los parámetros clave a abordar son la temperatura, la presión y el tiempo. El mayor desafío es la deformación del PMMA durante el proceso de unión. Debido a que las características mínimas en diversos diseños de acuerdo con realizaciones específicas de la invención están a escala micrométrica, es crítico el control de la temperatura en algunos métodos de fabricación de ejemplo. Un enfoque alternativo es usar la unión adhesiva revistiendo por rotación una capa adhesiva con un espesor más delgado que cualquier característica del dispositivo de microfluidos en la placa para evitar el bloqueo de los canales de microfluidos.
10. Usos de diagnóstico y desarrollo de fármacos
Como se describió anteriormente, después de la identificación y validación de un ensayo para un proceso celular particular, en realizaciones específicas, los dispositivos y/o sistemas como se describen en la presente memoria se utilizan en entornos clínicos o de investigación, tal como para seleccionar posibles compuestos activos, categorizar predicativamente a los sujetos en clases relevantes de enfermedades, toxicidad textual de sustancias, etc. Los dispositivos de acuerdo con los métodos de la invención pueden ser utilizados para una variedad de propósitos por investigadores, médicos, trabajadores de la salud, hospitales, laboratorios, pacientes, empresas y otras instituciones. Por ejemplo, los dispositivos se pueden aplicar para: diagnosticar enfermedades; evaluar la gravedad de la enfermedad; predecir la aparición futura de enfermedades; predecir las complicaciones futuras de la enfermedad; determinar el pronóstico de la enfermedad; evaluar el riesgo del paciente; evaluar la respuesta a la farmacoterapia actual; evaluar la respuesta a la terapia no farmacológica actual; determinar la medicación o el tratamiento más apropiado para el paciente; y determinar las pruebas de diagnóstico adicionales más apropiadas para el paciente, entre otras aplicaciones relevantes desde el punto de vista clínico y epidemiológico. Esencialmente, se puede evaluar cualquier enfermedad, afección o estado para el que sea útil un cultivo biológico.
Realización del sitio web
Los métodos de esta invención se pueden implementar en un entorno de datos distribuidos o localizados. Por ejemplo, en una realización que presenta un entorno informático localizado, un dispositivo de cultivo de microcámara de acuerdo con realizaciones específicas de la presente invención se configura vinculado a un dispositivo informático equipado con características de entrada y salida de usuario. En un entorno distribuido, los métodos se pueden implementar en una sola computadora, una computadora con múltiples procesos o, alternativamente, en múltiples computadoras.
Kits
Un dispositivo según realizaciones específicas de la presente invención se proporciona opcionalmente como un kit a un usuario. Normalmente, un kit de la invención contiene uno o más dispositivos de formación de cultivo de microcámara construidos de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria. La mayoría de las veces, el kit contiene un sensor de diagnóstico concentrado en un recipiente adecuado. El kit típicamente comprende además, uno o más reactivos adicionales, por ejemplo, sustratos, tubos y/u otros accesorios, reactivos para recoger muestras de sangre, tampones, por ejemplo, tampón de lisis de eritrocitos, tampón de lisis de leucocitos, cámaras de hibridación, cubreobjetos, etc. así como un paquete de software, por ejemplo, que incluye los métodos estadísticos de la invención, por ejemplo, como se describió anteriormente, y una contraseña y/o número de cuenta para acceder a la base de datos compilada. El kit comprende además opcionalmente un conjunto de instrucciones o manual de usuario que detalla los métodos preferidos de uso de los componentes del kit para detectar una sustancia de interés.
Cuando se usa de acuerdo con las instrucciones, el kit permite al usuario identificar procesos celulares específicos de la enfermedad. El kit también puede permitir al usuario acceder a un servidor de base de datos central que recibe y proporciona información de expresión al usuario. Tal información facilita el descubrimiento de características de diagnóstico adicionales por parte del usuario. Además, o alternativamente, el kit permite al usuario, por ejemplo un médico, un laboratorio clínico o un investigador, determinar la probabilidad de que un individuo pertenezca a una clase de sujetos clínicamente relevantes (diagnósticos o de otro tipo). En HTS, un kit según realizaciones específicas de la invención puede permitir que un desarrollador de fármacos o un médico determine las respuestas celulares a uno o más tratamientos o reactivos, con fines diagnósticos o terapéuticos.
Realización en un aparato de información programada
La invención puede realizarse en su totalidad, o en parte, como una lógica u otra descripción para la construcción de los dispositivos de acuerdo con realizaciones específicas de la invención. En tal caso, la invención puede realizarse en un lenguaje descriptor comprensible por un ordenador, que puede ser utilizado para crear dispositivos fabricados que funcionen como se describe en la presente memoria.
Sistemas integrados
Los sistemas integrados para la recopilación y el análisis de datos celulares y de otro tipo, así como para la compilación, el almacenamiento y el acceso a las bases de datos de la invención, generalmente incluyen un ordenador digital con software que incluye un conjunto de instrucciones para la búsqueda y/o análisis de secuencias, y opcionalmente, uno o más de software de control de muestras de alto rendimiento, software de análisis de imágenes, software de interpretación de datos recopilados, una armadura de control robótico para transferir soluciones desde una fuente a un destino (tal como un dispositivo de detección) operativamente conectado al ordenador digital, una dispositivo de entrada (por ejemplo, un teclado de ordenador) para ingresar datos del sujeto en el ordenador digital, o para controlar operaciones de análisis o transferencia de muestras de alto rendimiento por la armadura de control robótico. Opcionalmente, el sistema integrado comprende además válvulas, gradientes de concentración, multiplexores fluídicos y/u otras estructuras microfluídicas para interconectarse con una microcámara como se describe.
Los recursos de hardware computacional fácilmente disponibles que utilizan sistemas operativos estándar se pueden emplear y modificar de acuerdo con las enseñanzas proporcionadas aquí, por ejemplo, un PC (Intel x86 o compatible el chip Pentium DOSMR, OS2MR, WINDOWSMR, WINDOWS NTMR, WINDOWS95MR, WINDOWS98MR, LINUXMR, o incluso Macintosh, Sun o PC serán suficientes) para su uso en los sistemas integrados de la invención. El arte actual en tecnología de software es adecuado para permitir la implementación de los métodos aquí enseñados en un sistema informático. Por tanto, en realizaciones específicas, la presente invención puede comprender un conjunto de instrucciones lógicas (instrucciones codificadas por software o hardware) para realizar uno o más de los métodos que se enseñan en la presente memoria. Por ejemplo, un experto en la materia puede construir software para proporcionar los datos y/o el análisis estadístico utilizando un lenguaje de programación estándar como Visual Basic, Fortran, Basic, Java o similares. Tal software también se puede construir utilizando una variedad de lenguajes de programación estadística, juegos de herramientas o bibliotecas.
La figura 24 es un diagrama de bloques que muestra un dispositivo lógico de ejemplo representativo en el que se pueden realizar diversos aspectos de la presente invención. La figura 24 muestra un aparato de información (o dispositivo digital) 700 que puede entenderse como un aparato lógico que puede leer instrucciones desde los medios 717 y/o el puerto de red 719, que opcionalmente se puede conectar al servidor 720 que tiene unos medios fijos 722. El aparato 700 puede posteriormente utilice esas instrucciones para dirigir la lógica del servidor o del cliente, como se entiende en la técnica, con el fin de incorporar aspectos de la invención. Un tipo de aparato lógico que puede incorporar la invención es un sistema informático como se ilustra en 700, que contiene una CPU 707, dispositivos de entrada opcionales 709 y 711, unidades de disco 715 y monitor opcional 705. Medios fijos 717 o medios fijos 722 sobre el puerto 719, puede usarse para programar tal sistema y puede representar un medio óptico o magnético de tipo disco, cinta magnética, memoria dinámica o estática de estado sólido, etc. En realizaciones específicas, la invención puede realizarse en su totalidad, o en parte, como software grabado en estos medios fijos. El puerto de comunicación 719 también puede usarse para recibir inicialmente instrucciones que se usan para programar tal sistema y pueden representar cualquier tipo de conexión de comunicación.
Se pueden usar diversos métodos y algoritmos de programación, incluidos algoritmos genéticos y redes neuronales, para realizar aspectos de las funciones de recopilación, correlación y almacenamiento de datos, así como otras funciones deseables, tal como se describe en la presente memoria. Además, los sistemas digitales o analógicos, tales como los sistemas informáticos digitales o analógicos, pueden controlar una variedad de otras funciones, tales como la visualización y/o el control de archivos de entrada y salida. El software para realizar los métodos de análisis eléctrico de la invención también se incluye en los sistemas informáticos de la invención.
Opcionalmente, los sistemas integrados de la invención incluyen una estación de trabajo automatizada. Por ejemplo, una estación de trabajo de este tipo puede preparar y analizar muestras realizando una secuencia de eventos que incluye: preparar muestras a partir de una muestra de tejido o sangre; colocar las muestras en una formación de microcámaras de la invención; y detectar reacciones celulares u otras reacciones mediante mediciones ópticas, eléctricas o químicas. Los datos de reacción se digitalizan y registran en la base de datos correspondiente.
Están disponibles métodos automatizados y/o semiautomatizados para la preparación y evaluación de muestras de alto rendimiento en fase sólida y líquida, y están respaldados por dispositivos disponibles comercialmente. Por ejemplo, dispositivos robóticos para la preparación de células. Alternativamente, o además, los sistemas robóticos para la manipulación de líquidos están disponibles a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo, estaciones de trabajo automatizadas como el aparato de síntesis automatizado desarrollado por Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japón) y muchos sistemas robóticos que utilizan brazos robóticos (Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Beckman Coulter, Inc. (Fullerton, CA)) que imitan las operaciones manuales realizadas por un científico. Cualquiera de los dispositivos anteriores es adecuado para su uso con la presente invención, por ejemplo, para análisis de alto rendimiento de componentes de la biblioteca o muestras objeto. La naturaleza y la implementación de las modificaciones a estos dispositivos (si las hay) para que puedan operar como se describe en la presente memoria resultarán evidentes para los expertos en la técnica relevante.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema de cultivo de microfluidos capaz de proporcionar un entorno para el crecimiento biológico y/o análisis y/o manipulación que comprende:
una pluralidad de unidades de área de microcultivo, comprendiendo al menos algunas de dichas unidades: un área de cultivo, teniendo dicha área una entrada de flujo fluídico que permite la carga de células u otros objetos de cultivo;
un canal fluídico de sección transversal de medio /reactivo, proporcionando dicho canal un flujo deseado de un medio de cultivo y/o reactivo y/o proporcionando acceso a productos de cultivo; y
una estructura de paso microfluídico, separando dicha estructura dicha área de cultivo y dicho canal al tiempo que proporciona una conexión fluídica entre dicha área de cultivo y dicho canal sin perturbar las células u otros objetos de cultivo;
en el que el canal de medio/reactivo está dispuesto de tal manera que dicho medio de cultivo y/o reactivo en el canal de medio/reactivo fluye alrededor de las unidades de área de microcultivo sin ser forzado a fluir a través de las unidades de área de microcultivo.
2. El sistema según la reivindicación 1, en el que además: dichas unidades de área de microcultivo comprenden microcámaras que tienen un diámetro o ancho de 0,2 a 4 mm y una altura de 20 a 100 gm.
3. El sistema según la reivindicación 2, que comprende además:
al menos cuatro orificios para el acceso fluido a una microcámara, dos designados izquierdo y derecho y dos designados superior e inferior;
en el que dichos orificios izquierdo y derecho están diseñados para proporcionar una perfusión continua del medio a la microcámara para mantener el crecimiento;
en el que los orificios superior e inferior se utilizan para cargar y/o eliminar una célula o células, perlas u otros objetos para cultivo.
4. El sistema según la reivindicación 3, que comprende además:
una pared de microcámara interior que rodea sustancialmente una microcámara con una abertura más grande cerca de dicho orificio de entrada y que contiene uno o más pasos fluídicos de difusión/perfusión; bloqueando sustancialmente dicha pared interior de microcámara el paso de los objetos de cultivo entre dicho orificio de entrada y dicho orificio de salida mientras permite el flujo de fluido de difusión/perfusión.
5. El sistema según la reivindicación 4, que comprende además:
dicha pared de microcámara interior que define un canal exterior alrededor de dicha pared, teniendo dicho canal exterior una conexión de flujo fluídico de baja resistencia con un orificio de salida.
6. El sistema según la reivindicación 5, que comprende además:
una pared exterior que tiene una pluralidad de micropasos de entrada en la misma que separan dicho canal exterior de dichos canales de perfusión de mayor volumen.
7. El sistema según la reivindicación 2, en el que además:
dichas microcámaras contienen células cultivadas;
dichos micropasos de entrada son mucho más pequeños que el tamaño de dichas células cultivadas y evitan de manera eficaz que dichas células cultivadas se eliminen o migren fuera de las microcámaras;
dichos micropasos de entrada proporcionan un acceso uniforme a los nutrientes dentro de la microcámara.
8. El sistema según la reivindicación 1, que comprende además:
un flujo continuo de medio suficiente para evitar que se sequen las cámaras de cultivo celular.
9. El sistema según la reivindicación 2; en el que dicha microcámara es aproximadamente circular; o
en el que dicha microcámara tiene una forma de U cuadrada o redondeada aproximadamente extendida.
10. El sistema según la reivindicación 1, en el que además
dichas microcámaras tienen la misma área de crecimiento celular que un pocillo típico en una placa de microtitulación de 1.536 pocillos.
11. El sistema según la reivindicación 1, en el que además:
dicha estructura comprende una pluralidad de micropasos, cada uno de entre 0,25 y 10 pm de ancho.
12. El sistema según la reivindicación 11, en el que:
dichos micropasos están dispuestos en una estructura a modo de rejilla, en el que dicha estructura de pasos comprende una pluralidad de micropasos que se cruzan; o
dichos pasos tienen cada uno entre 1 y 5 pm de altura y se conectan a al menos un área de flujo fluídico grande que tiene entre 20 y 200 pm de altura; o
dichos pasos se conectan a al menos un área de flujo fluídico grande que tiene entre 20 y 200 pm de altura; teniendo dichos pasos casi la misma altura que dicha gran área de flujo fluídico.
13. El sistema según la reivindicación 1, en el que además:
una estructura de paso microfluídico proporciona una conexión fluídica de alta resistencia y actúa como una membrana virtual.
14. El sistema según la reivindicación 1, en el que dicho sistema de cultivo de microfluidos es capaz de proporcionar un entorno cerrado para el crecimiento biológico.
15. El sistema según la reivindicación 1, en el que además:
dicha área de cultivo contiene células cultivadas;
dichos pasos son mucho más pequeños que el tamaño de dichas células cultivadas y evitan de manera eficaz que dichas células cultivadas se eliminen o migren fuera del área de cultivo.
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