ES2864721T3 - Disposición y proceso continuo de un biorreactor para la producción y captura de un biopolímero - Google Patents

Disposición y proceso continuo de un biorreactor para la producción y captura de un biopolímero Download PDF

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Abstract

Una disposición del biorreactor para producir un biopolímero expresado por una célula, en donde la disposición del biorreactor comprende un sistema del biorreactor y un sistema de cromatografía en donde el sistema del biorreactor comprende: un recipiente del cultivo celular (50) para contener un medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho en donde el recipiente del cultivo celular (50) comprende un módulo de recolección del producto (51), en donde el módulo de recolección del producto (51) tiene una salida (16) y en donde el sistema de cromatografía comprende: una primera unidad de cromatografía (2) y una segunda unidad de cromatografía (3) que comprenden el material que tiene afinidad por el biopolímero, en donde la primera unidad de cromatografía (2) tiene una entrada (12) y una salida (13) y la segunda unidad de cromatografía (3) tiene una entrada (14) y una salida (15), en donde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde un primer medio de válvula (31) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un segundo medio de válvula (32) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y un tercer medio de válvula (33) se ubica entre la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un cuarto medio de válvula (34) se ubica entre la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde el sistema de cromatografía se mantiene a una temperatura de 28-38 °C para potenciar la eliminación del ADN residual o de la proteína de la célula huésped o de ambos.

Description

DESCRIPCIÓN
Disposición y proceso continuo de un biorreactor para la producción y captura de un biopolímero
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una disposición del biorreactor y a un método continuo para producir y capturar un biopolímero mediante el uso de la disposición del biorreactor. Los métodos de la presente invención son adecuados para su uso en un proceso de fabricación para preparar una proteína o polipéptido, en particular para preparar un ingrediente farmacéutico activo para un producto farmacéutico.
Antecedentes de la invención
Tradicionalmente, las células bacterianas, de levadura y de mamífero se cultivan principalmente para, por ejemplo, la producción de las proteínas como cultivos en suspensión en los biorreactores, también denominados fermentadores. En tales biorreactores, las condiciones ambientales se pueden controlar con precisión al manipular el suministro de los nutrientes a las células y la eliminación de los materiales de desecho y un medio de agitación puede agitar el medio de cultivo dentro del reactor para proporcionar una distribución homogénea de las células.
El biorreactor puede funcionar como un sistema cerrado en un proceso por lotes o por lotes alimentados o como un sistema continuo en un proceso denominado quimiostato o perfusión.
En un funcionamiento por lotes, el medio de cultivo normalmente contiene un medio con los nutrientes necesarios, por ejemplo glucosa, vitaminas, aminoácidos y minerales. Durante la fermentación, estos se consumen para que el medio se vuelva cada vez más privado de nutrientes. Al mismo tiempo, aumenta la concentración de los productos de desecho, lo que finalmente da como resultado la inhibición del crecimiento celular. En un proceso por lotes alimentados, uno o más de los nutrientes se alimentan (suministran) al biorreactor durante el cultivo para lograr mejores condiciones de crecimiento y densidades celulares más altas.
En un sistema continuo, tal como un quimiostato, se añade continuamente medio fresco, mientras que el líquido del cultivo se elimina continuamente para mantener constante el volumen del cultivo. Al cambiar la velocidad a la que se añade el medio al biorreactor, se puede controlar la velocidad del crecimiento de las células del microorganismo. Para las células con una alta velocidad de crecimiento, tales como las células de levadura y las bacterias, el quimiostato normalmente elimina las células del medio junto con el líquido del cultivo con el fin de mantener una densidad celular deseada.
Un proceso de perfusión es un tipo especial de proceso continuo en el que un cultivo celular en suspensión se suministra continuamente con medio fresco al biorreactor mientras que el medio de cultivo gastado se cosecha continuamente. Las células se filtran continuamente o se separan de otro modo de la corriente de recolección y se devuelven al biorreactor para mantener una densidad celular uniforme. La adición constante de medio fresco y la eliminación de los productos de desecho proporciona a las células el entorno óptimo para lograr altas concentraciones de las células y, por lo tanto, una mayor productividad. Esto permite prolongar los cultivos sanos, potencialmente a alta densidad celular, así como también un corto tiempo de residencia del producto en el biorreactor. Esto es más favorable para la calidad del producto y es necesario para la producción de los polipéptidos inestables. Otra ventaja del modo de perfusión es que permite el uso de biorreactores más pequeños en comparación con los procesos por lotes alimentados, lo que proporciona beneficios, tales como una operación reducida de limpieza en el lugar y la posibilidad de usar los biorreactores desechables en lugar de los reactores de acero inoxidable debido a los volúmenes de trabajo más pequeños. Además, el producto puede recolectarse continuamente al extraer el medio (con las células y el producto) o mediante un proceso llamado purga.
Debido a la creciente demanda de los productos medicinales producidos biológicamente, tales como los polipéptidos complejos, incluidos los anticuerpos y otras proteínas recombinantes, los procesos de perfusión se están convirtiendo en una plataforma de producción mucho más común debido a la alta productividad en relación con el tamaño del biorreactor.
Como resultado de esas crecientes cantidades de los productos, el "cuello de botella" en la producción biofarmacéutica se ha desplazado de los procesos de producción anterior a los procesos de purificación posteriores. Por ejemplo, un proceso típico para el procesamiento posterior de los anticuerpos monoclonales implica una etapa de purificación por afinidad (es decir, una etapa de captura) mediante el uso de un medio de afinidad con la Proteína A. Después de la etapa de purificación con la proteína A, los anticuerpos se purifican normalmente más mediante una etapa de inactivación del virus seguida de otras etapas de cromatografía, por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico de unión-elución y/o mediante cromatografía de intercambio aniónico o de modo mixto de unión-elución o de flujo continuo multimodal y una etapa final de purificación por nanofiltración.
En tal proceso de purificación posterior típico, es comúnmente la etapa de captura cromatográfica que presenta desafíos importantes en términos de rendimiento de la instalación, ya que, debido al alto costo de producción de los polipéptidos, incluidos los anticuerpos monoclonales complejos, la resina de afinidad a menudo solo está saturada hasta el 30-50 % de su capacidad de unión real durante el etapa de captura para evitar el atravesado de los productos costosos. Además, la resina de afinidad en sí misma es normalmente también un compuesto costoso. Por lo tanto, existe un fuerte incentivo para optimizar la utilización de la resina de captura.
Por ello, los procesos de cromatografía multicolumna (también denominada cromatografía continua) se ha convertido en un objeto de creciente interés. En la cromatografía continua, varias columnas se conectan en una disposición que permite que las columnas funcionen en serie y/o en paralelo, en dependencia de los requisitos del método. Por lo tanto, todas las columnas se pueden correr en principio simultáneamente, pero ligeramente desplazadas en las etapas del método. El procedimiento se puede repetir, de modo que cada columna se cargue, eluya y regenere varias veces en el proceso. El funcionamiento de la cromatografía continua (por ejemplo, cromatografía de lecho móvil simulado (SMB)) puede resultar en una mejor utilización de la resina de la cromatografía, tiempo de procesamiento reducido y requisitos reducidos del tampón, todo lo cual beneficia la economía del proceso. Sin embargo, la cromatografía SMB todavía no es adecuada para la producción biofarmacéutica cGMP o a gran escala, principalmente porque es un método complicado de configurar y correr, que implica el control de una gran cantidad de válvulas y columnas.
El documento WO2012074481 describe una configuración cromatográfica a gran escala continua o semicontinua de dos columnas más simple que comprende al menos dos columnas de cromatografía de lecho empacado, al menos un tanque para contener la alimentación, los tampones de purificación, el eluido y las bombas y los detectores para controlar el funcionamiento del sistema donde cada columna se carga, eluye y regenera varias veces en el proceso. Sin embargo, el documento WO2012074481 no describe un sistema de cromatografía que también comprenda un biorreactor o un proceso para capturar de forma continua un biopolímero de una corriente de recolección del biorreactor.
La presente invención aborda la necesidad de producción y purificación continuas de un biopolímero producido en un biorreactor.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un biorreactor y un sistema de cromatografía y un método para producir continuamente un biopolímero, a partir de un medio que contiene el biopolímero y los productos de desecho, en un tampón de elución.
El método emplea la captura continua del biopolímero en una o más unidades cromatográficas que comprenden un material que tiene afinidad por el biopolímero y que lava y eluye el biopolímero para separar el biopolímero en un tampón de elución y, opcionalmente, reutilizar las unidades de cromatografías. Este sistema proporciona varias ventajas, una de las cuales es que el biopolímero se proporciona directa y continuamente a las columnas de captura y no se almacena en un tanque de contención, lo que resulta en un tiempo de procesamiento más rápido que reduce significativamente los efectos nocivos de los procesos de degradación del producto que tienen lugar cuando el producto se expone a las proteasas y glicosidasas en el sobrenadante crudo del cultivo celular. Otra ventaja es que no es necesario ningún contenedor de almacenamiento y/o contención, lo que reduce el equipo y hace que el proceso general sea más eficiente.
Además, al emplear dos unidades de cromatografía que funcionan solas o en serie, ambas pueden cargarse al mismo tiempo o cada una de ellas puede de manera intercambiable cargarse, eluirse y regenerarse varias veces durante el proceso de purificación. Esto permite un uso mucho más eficiente de las unidades de cromatografía, ya que el biopolímero que está presente en un flujo continuo desde la primera unidad de cromatografía se captura en la segunda unidad de cromatografía, lo que permite la saturación completa de la unidad de cromatografía con el biopolímero antes de que el biopolímero se lave y eluya de la unidad de cromatografía.
Esto se ilustra en el ejemplo de trabajo 1 que está dirigido a los experimentos de cromatografía realizados en modo normal y en modo sobrecargado para evaluar la capacidad de unión dinámica de la cromatografía con la proteína A y la calidad de la etapa de purificación en relación con la proteína y el ADN residual de la célula huésped. Se realizaron corridas de cromatografía de sobrecarga y carga normal mediante el uso de un gel a base de agarosa (MabSelect SuRe) y una resina a base de sílice (ProVance), lo que dio como resultado rendimientos y pureza similares (ver Tabla 6). Sin embargo, al correr la columna MabSelect SuRe en modo de sobrecarga resultó en una recuperación del producto del 65 al 85 % más alta que la ejecución en modo normal. Una corrida de cromatografía mediante el uso de ProVance en modo de sobrecarga dio como resultado un aumento en la capacidad de carga del producto del 23 %.
De acuerdo con la invención, en una corrida de cromatografía donde tanto la carga como la columna se colocaron en una cabina térmica a 35 °C, dio como resultado en un 50 % de reducción en la contaminación del ADN residual y en un 24 % de reducción en la proteína de la célula huésped. Otras ventajas serán evidentes a partir de la descripción más abajo.
Un aspecto de la invención se refiere a una disposición del biorreactor para producir un biopolímero expresado por una célula, en donde la disposición del biorreactor comprende un sistema del biorreactor y un sistema de cromatografía en donde el sistema del biorreactor comprende:
un recipiente del cultivo celular (50) para contener un medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho en donde el recipiente del cultivo celular (50) comprende un módulo de recolección del producto (51), en donde el módulo de recolección del producto (51) tiene una salida (16) y
en donde el sistema de cromatografía comprende:
una primera unidad de cromatografía (2) y una segunda unidad de cromatografía (3) que comprenden el material que tiene afinidad por el biopolímero, en donde la primera unidad de cromatografía (2) tiene una entrada (12) y una salida (13) y la segunda unidad de cromatografía (3) tiene una entrada (14) y una salida (15),
en donde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3),
en donde un primer medio de válvula (31) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un segundo medio de válvula (32) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3),
en donde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y un tercer medio de válvula (33) se ubica entre la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un cuarto medio de válvula (34) se ubica entre la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde el sistema de cromatografía se mantiene a una temperatura de 28-38 °C para mejorar la eliminación del ADN residual o la proteína de la célula huésped o ambos.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir un biopolímero en una disposición del biorreactor, en donde la disposición del biorreactor comprende un sistema del biorreactor y un sistema de cromatografía en donde el sistema del biorreactor comprende:
un recipiente del cultivo celular (50) para contener un medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho en donde el recipiente del cultivo celular (50) comprende un módulo de recolección del producto (51), en donde el módulo de recolección del producto (51) tiene una salida (16) y
en donde el sistema de cromatografía comprende:
una primera unidad de cromatografía (2) y una segunda unidad de cromatografía (3) que comprenden el material que tiene afinidad por el biopolímero, en donde la primera unidad de cromatografía (2) tiene una entrada (12) y una salida (13) y la segunda unidad de cromatografía (3) tiene una entrada (14) y una salida (15) ,
en donde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3),
en donde un primer medio de válvula (31) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un segundo medio de válvula (32) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3),
en donde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y un tercer medio de válvula (33) se ubica entre la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un cuarto medio de válvula (34) se ubica entre la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde el método comprende:
(a) fermentar las células que expresan el biopolímero en un medio adecuado en las condiciones adecuadas hasta que se alcanza un nivel predeterminado de las células y/o biopolímero en el recipiente del cultivo celular (50),
(b) recolectar el biopolímero al eliminar el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través del módulo de recolección del producto (51) y
(c) conducir el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través de la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) en donde el biopolímero se captura en la primera unidad de cromatografía (2) y el medio y los productos de desecho continúan a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta que se alcanza un primer nivel predeterminado de la capacidad de unión en la primera unidad de cromatografía (2), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el segundo medio de válvula (32) y en donde la conexión fluida desde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el tercer medio de válvula (33),
(d) cuando se alcanza el primer nivel predeterminado de la capacidad de unión, conducir el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través de la conexión fluida desde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la segunda unidad de cromatografía (3) para un ajuste específico para que el biopolímero no capturado por la primera unidad de cromatografía (2) se capture en la segunda unidad de cromatografía (3) y el medio y los productos de desecho continúen a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un segundo nivel predeterminado de la capacidad de unión en la primera unidad de cromatografía (2) y/o (3), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el segundo medio de válvula (32),
(e) cuando se alcanza el segundo nivel predeterminado de la capacidad de unión, conducir el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través de la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) en donde el biopolímero se captura en la segunda unidad de cromatografía (3) y el medio y los productos de desecho continúan a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un tercer nivel predeterminado de la capacidad de unión en la segunda unidad de cromatografía (3), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el primer medio de válvula (31) y en donde la conexión fluida desde la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el cuarto medio de válvula (34),
(f)
en donde durante o después de la etapa e)
(i) lavar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de lavado a través de la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un primer nivel predeterminado de lavado,
(ii) cuando se alcanza el primer nivel predeterminado de lavado, eluir el biopolímero de la primera unidad de cromatografía (2) al conducir el tampón de elución a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un primer nivel predeterminado de elución y recolectar el eluido, (g) cuando se alcanza el tercer nivel predeterminado de la capacidad de unión, conducir el medio a través de la conexión fluida desde la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la primera unidad de cromatografía (2) para un ajuste específico para que el biopolímero no capturado por la segunda unidad de cromatografía (3) se capture en la primera unidad de cromatografía (2) y el medio y los productos de desecho continúen a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta que se alcanza un cuarto nivel predeterminado de la capacidad de unión en la primera y/o segunda unidad de cromatografía (2) y/o (3), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el primer medio de válvula (31),
(h) cuando se alcanza el cuarto nivel predeterminado de la capacidad de unión, conducir el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través de la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) en donde el biopolímero se captura en la primera unidad de cromatografía (2) y el medio y los productos de desecho continúan a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un quinto nivel predeterminado de la capacidad de unión en la primera unidad de cromatografía (2), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de (i) recolección del producto (51) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el segundo medio de válvula (32),
en donde durante o después de la etapa g)
(iii) lavar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada del tampón de lavado al conducir el tampón de lavado a través de la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un segundo nivel predeterminado de lavado,
(iv) cuando se alcanza el segundo nivel predeterminado de lavado, eluir el biopolímero de la segunda unidad de cromatografía (3) al conducir el tampón de elución a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un segundo nivel predeterminado de elución y recoger el eluido, (j) opcionalmente, repetir la etapa (c) a (g) y opcionalmente, purificar el biopolímero del o los eluido(s) recogido(s).
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de un sistema de cromatografía como se describe en la presente descripción para producir un biopolímero a partir de un medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho.
Otros objetivos de la presente invención resultarán evidentes a la vista de la presente descripción, figuras, ejemplos y reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración esquemática de un sistema de disposición del biorreactor de acuerdo con la presente invención.
La Figura 2 es una ilustración esquemática de una disposición alternativa del biorreactor de acuerdo con la presente invención que emplea un sistema de dilución del medio y del tampón en línea.
Descripción detallada de la invención
La disposición del biorreactor de la presente invención comprende un sistema del biorreactor y un sistema de cromatografía en donde el sistema del biorreactor incluye un recipiente del cultivo celular que comprende un módulo de recolección del producto y al menos un contenedor del medio. Opcionalmente, el sistema del biorreactor también incluye un suministro de agua y/o tampón, un sistema de dilución del medio en línea y una salida de la purga. También puede contener componentes adicionales, tal como una unidad de filtrado de las impurezas. El sistema de cromatografía incluye dos unidades de cromatografía, una primera y una segunda unidad de cromatografía que contiene el material que tiene afinidad por el biopolímero, al menos un contenedor del tampón de lavado y al menos un contenedor del tampón de elución, en donde la primera y la segunda unidades de cromatografía tienen entradas y salidas que están en conexión fluida entre sí, el módulo de recolección del producto y los contenedores de los tampones de lavado y elución. Opcionalmente, el sistema de cromatografía también incluye los contenedores de los eluidos y de los residuos, los contenedores del tampón de limpieza y del tampón de equilibrado, un sistema de dilución del tampón en línea y un suministro de agua y/o del tampón. Las características de los componentes individuales del sistema y su función en el contexto del método de la invención para producir un biopolímero se explicarán en detalle a continuación.
Biopolímeros
Como se usa en la presente descripción, el término "biopolímero" significa un polipéptido, una proteína o una partícula viral, que puede ser nativa o biológica o sintéticamente modificada, incluidos los fragmentos, los multímeros, los agregados, los conjugados, los productos de fusión, etc. En una modalidad, el biopolímero es una proteína recombinante, tal como un anticuerpo. En otra modalidad, el biopolímero es una partícula viral o parte de la misma, por ejemplo una cubierta de proteína, para uso como vacuna.
En una modalidad preferida de la presente invención, el producto es un polipéptido o proteína. Como se usa en la presente descripción, los términos "proteína" o "polipéptido" se pueden usar indistintamente y se refieren a una cadena de aminoácidos más larga de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos. Las proteínas pueden existir como monómeros o multímeros, que comprenden dos o más cadenas polipeptídicas ensambladas, fragmentos de proteínas, polipéptidos, oligopéptidos o péptidos.
Los ejemplos de los polipéptidos de interés que pueden producirse mediante el uso de los sistemas y los métodos de la invención incluyen las proteínas terapéuticas recombinantes, tales como los anticuerpos o los fragmentos de los mismos, los factores de coagulación sanguínea, las citocinas, las enzimas, las hormonas peptídicas, etc. Los ejemplos específicos de tales proteínas incluyen la hormona del crecimiento humana, la hormona estimulante del folículo, el Factor VIII, el Factor VII, el Factor IX, eritropoyetina (EPO), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), alfagalactosidasa A, alfa-L-iduronidasa (rhIDU; laronidasa), N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (rhASB; galsulfasa), ADNsa, activador del plasminógeno tisular (TPA), glucocerebrosidasa, interferones (IF), tales como el interferón alfa, interferón beta e interferón gamma, insulina, derivados de la insulina, factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), tenecteplasa, factor antihemofílico, factor de coagulación humano y etanercept y los anticuerpos, tales como Trastuzumab, Infliximab, Basiliximab, Belimumab, Daclizumab, Adalimumab, Abciximab, Afutuzumab, Alemtuzumab, Cetuximab, Daclizumab, Denosumab, Eculizumab, Edrecolomab, Golimumab, Ibritumomab tiuxetan, Mepolizumab, Motavizumab, Natalizumab, Ofatumumab, Omalizumab, Oregovomab, Palivizumab, Pemtumomab, Pertuzumab, Ranibizumab, Rituximab, Tefibazumab y Zanolimumab.
En una modalidad particular de la presente invención, el biopolímero es un polipéptido o proteína o una proteína recombinante, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, donde un fragmento puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fv o un fragmento Fv de cadena simple (scFv), un factor de coagulación de la sangre, una citocina, una enzima o una hormona peptídica.
Los polipéptidos se expresan bajo el control de las secuencias reguladoras llamadas secuencias promotoras. Las células que expresan un polipéptido pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo (es decir, las secuencias no reguladas; esto permite la transcripción continua del gen asociado) o bajo el control de un promotor inducible (secuencias reguladoras inducidas por la presencia o ausencia de los factores bióticos o abióticos). En algunos casos, si el polipéptido de interés tiene una estabilidad limitada o presenta efectos tóxicos en la célula huésped, puede ser conveniente expresarlo bajo el control de un promotor inducible de modo que las células crezcan primero hasta una densidad celular deseada, después de lo cual la expresión del polipéptido se induce al añadir un inductor o al cambiar la temperatura y o el pH del medio. Un ejemplo de un promotor constitutivo es un promotor EF-1a de hámster chino. En una modalidad, el biopolímero se expresa bajo el control de las secuencias reguladoras de EF-1a de hámster chino.
Mediante el uso de la disposición y el método del biorreactor de la invención, es posible expresar los polipéptidos, tales como los anticuerpos con alta productividad. Por lo tanto, en una modalidad, las células expresan un polipéptido, por ejemplo, un anticuerpo y tienen una productividad de al menos 1 gramo/L/día y preferentemente mayor, tal como 2 o 3 gramos/L/día o más.
Sistema del biorreactor
Como se usa en la presente descripción, el término "sistema del biorreactor" se refiere a cualquier dispositivo o sistema que apoye un entorno biológicamente activo, por ejemplo, para el cultivo de las células para la producción de un producto biológico. Los biorreactores pueden variar en tamaño desde unos pocos litros hasta varios metros cúbicos (es decir, varios 1000 litros) y pueden ser un biorreactor convencional basado en un recipiente de cultivo de, por ejemplo, acero inoxidable o vidrio o un biorreactor de "un solo uso" basado en un material desechable, tal como una bolsa desechable.
Mientras que en el pasado los biorreactores han sido normalmente del tipo convencional, la mayoría de las veces basados en tanques de acero inoxidable, los biorreactores desechables basados en una bolsa desechable, normalmente hechos de un material de plástico multicapa, son cada vez más frecuentes. Para la agitación, algunos biorreactores de un solo uso usan agitadores similares a los de los biorreactores convencionales, pero con agitadores integrados en la bolsa de plástico, mientras que otros biorreactores de un solo uso se agitan mediante un movimiento de balanceo. Los biorreactores agitados de un solo uso pueden tener un volumen de hasta varios miles de litros, por ejemplo, de 2000 a 5000 litros, mientras que los biorreactores de balanceo de un solo uso tienen normalmente un volumen de hasta aproximadamente 1000 litros.
Los biorreactores de un solo uso tienen varias ventajas en comparación con los biorreactores convencionales, incluida la reducción de las demandas de limpieza y esterilización, junto con importantes ahorros de costos asociados. Además, se pueden simplificar los complejos procedimientos de calificación y validación para la producción farmacéutica y se reduce el riesgo de contaminación cruzada. Además, dado que los biorreactores de un solo uso contienen menos piezas en comparación con los biorreactores convencionales, los costos iniciales y de mantenimiento se reducen.
Según el modo de funcionamiento, un biorreactor puede clasificarse como por lotes, por lotes alimentados o continuo. Los ejemplos de los biorreactores continuos son un quimiostato y un biorreactor de perfusión.
En una modalidad, el sistema de biorreactor de la invención es un sistema continuo, es decir, un biorreactor de perfusión o quimiostato. Los biorreactores de perfusión se usan normalmente para el cultivo de las células de mamíferos, mientras que los biorreactores de quimiostato se usan normalmente para el cultivo de los microorganismos, tales como las bacterias o las células de levadura. En una modalidad adicional, el biopolímero se produce mediante un proceso continuo, por ejemplo, en un proceso de quimiostato o en un proceso de perfusión.
El biorreactor normalmente está equipado con al menos un módulo de recolección del producto (51) unido al biorreactor, una o más entradas (59) para suministrar el medio de cultivo a las células y con una o más salidas (16) y (52) para la recolección del producto o el vaciado del biorreactor. En una modalidad, el sistema del biorreactor comprende además al menos un contenedor del medio (53) en conexión fluida con la entrada (59) del recipiente del cultivo celular (50).
Como se usa en la presente descripción, el término "entrada" pretende abarcar cualquier medio que permita la introducción del fluido, tales como el medio, tampón o agua, en un contenedor, tanque o unidad y es una abertura que normalmente está equipada con un accesorio donde por ejemplo, se puede conectar un tubo o una válvula. Una entrada de una unidad de cromatografía es, por ejemplo, el terminal de una columna de cromatografía a la que se pueden unir la(s) conexión(es) del fluido.
Como se usa en la presente descripción, el término "salida" pretende abarcar cualquier medio que permita que el fluido, tales como el medio, tampón o agua, salga de un contenedor, tanque o unidad y es una abertura que normalmente está equipada con un accesorio donde, por ejemplo, se puede conectar un tubo o una válvula. Una salida de una unidad de cromatografía es, por ejemplo, el terminal de una columna de cromatografía a la que se pueden unir la(s) conexión(es) del fluido.
El término "fluido", como se usa en la presente descripción, pretende definir cualquier sustancia que fluya y, por lo tanto, incluye los líquidos y los gases que pueden fluir. Como se usa en la presente descripción, el término "en conexión fluida" significa que un fluido, tal como un líquido, por ejemplo, medio o tampón, puede fluir entre una entrada de un contenedor, tanque o unidad y una salida de otro contenedor, tanque o unidad. La conexión fluida puede interrumpirse por una o más válvulas y/o contenedores de contención de modo que el flujo del fluido a través de la conexión fluida pueda iniciarse y detenerse cuando se decida. Normalmente, la mayoría de las partes del sistema de cromatografía que están en conexión fluida tienen una conexión fluida que puede interrumpirse. Por ejemplo, si un contenedor del tampón está en conexión fluida con una unidad de cromatografía, esto significa que se puede realizar un flujo del tampón a la unidad de cromatografía si se decide, pero normalmente hay al menos una válvula ubicada en la conexión fluida entre el contenedor del tampón y la unidad de cromatografía, de modo que el flujo del fluido se pueda detener cuando se decida y se pueda iniciar cuando se decida.
Normalmente, las condiciones ambientales del biorreactor, tales como las velocidades del flujo de gas (es decir, aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono), temperatura, pH y niveles de oxígeno disuelto y velocidad de agitación/tasa de circulación se pueden monitorear y controlar de cerca. En una modalidad, el sistema del biorreactor comprende un suministro de agua y/o tampón (55) y un sistema de dilución del medio en línea (56). También puede contener los componentes adicionales, tal como una unidad de filtrado de las impurezas (54).
El biorreactor también puede incluir opcionalmente una entrada separada para la adición de los componentes, tales como las vitaminas o los factores de crecimiento. En este caso, tales componentes pueden añadirse al recipiente del cultivo celular además del medio diluido y pueden estar en forma concentrada o diluida.
Recipiente del cultivo celular
Un "recipiente del cultivo celular", como se usa en la presente descripción, se refiere a una parte integral de un sistema del biorreactor en el que las células se cultivan en condiciones adecuadas en un medio adecuado. El recipiente del cultivo celular puede ser un recipiente de un solo uso, por ejemplo, una bolsa desechable o un recipiente reutilizable convencional, normalmente un recipiente de acero inoxidable o vidrio, como se explicó anteriormente. Los recipientes de acero inoxidable se configuran normalmente con conjuntos de puertos predefinidos, mientras que las bolsas de un solo uso usan cámaras de cultivo de plástico preesterilizadas que se desechan después de su uso. Esto elimina las costosas instalaciones de limpieza en el lugar (CIP) y vapor en el lugar (SIP) que consumen mucho espacio al mismo tiempo se reduce los tiempos de entrega de la producción.
En una modalidad de la presente invención, el recipiente del cultivo celular (50) normalmente tiene un volumen de al menos 50 L, preferentemente al menos 100 L, más preferentemente al menos 250 L y aún más preferentemente al menos 500 L. En muchos casos, el volumen será aún mayor, por ejemplo, al menos 1000 L o al menos 2000 L.
Módulo de recolección del producto
Como se usa en la presente descripción, el término "módulo de recolección del producto" pretende abarcar cualquier dispositivo de separación capaz de, por ejemplo, separar los polipéptidos de las células, los restos celulares y las impurezas más grandes que el producto de interés. El módulo de recolección del producto puede funcionar para recolectar continuamente el producto en una corriente de recolección que se proporciona para un procesamiento posterior adicional.
El módulo de recolección del producto también puede ser un dispositivo de separación, tal como un dispositivo de contención de las células que puede separar las células de la corriente de recolección del producto de modo que las células queden retenidas en el recipiente del cultivo celular.
Hay dos clases principales de técnicas para la separación de las células del medio, principalmente por sedimentación gravitacional o centrifugación o por filtración (por ejemplo, filtración tangencial, tales como los filtros de flujo tangencial alternos, por ejemplo, filtración de rotación axial o como los filtros de giro, filtros de flujo, filtros de vórtice o filtración de flujo cruzado). En una modalidad, el módulo de recolección del producto (51) es un dispositivo de separación basado en la sedimentación gravitacional o centrífuga. En una modalidad preferida, el módulo de recolección del producto (51) es un dispositivo de separación basado en la filtración de flujo tangencial alterno.
La separación gravitacional es un método industrial para separar dos componentes, ya sea una suspensión o una mezcla granular seca en el que la separación de los componentes por gravedad es práctica. Este método puede usarse para separar los sólidos de una mezcla líquida si los sólidos no son solubles en el líquido. El experto en la técnica sabrá cómo acoplar los dispositivos de separación gravitacional adecuados a un biorreactor.
La separación centrífuga es otra técnica bien conocida para separar partículas en suspensión. Los separadores disponibles comercialmente que utilizan la fuerza centrífuga para la separación se clasifican en una de dos categorías, centrífugas rotativas o hidrociclones. Los hidrociclones funcionan al crear un vórtice físico dentro de un recipiente cilíndrico, lo que genera una fuerza centrífuga. La fase más pesada se fuerza a la parte exterior del fluido y el fluido más ligero permanece en el interior como un núcleo. A medida que el fluido continúa fluyendo, las porciones separadas se dirigen a las diferentes salidas. Los dispositivos de separación centrífuga adecuados son conocidos y están disponibles comercialmente y el uso de estos junto con un biorreactor será familiar para los expertos en la técnica.
En otra modalidad, el módulo de recolección del producto (51) es una unidad de filtrado, en cuyo caso el módulo de recolección del producto puede denominarse como un filtro del producto. A menudo se selecciona un filtro del producto con un tamaño de poro en el intervalo de un límite de peso molecular nominal (NMWC) de aproximadamente 50000 daltons (50 kDa) a aproximadamente 2 |_im, tal como de un NMWC de aproximadamente 100000 daltons (100 kDa) a un tamaño de poro de aproximadamente 1 |_im.
Como sabe el experto en la técnica, un límite adecuado del filtro del producto dependerá del tamaño del producto de interés. En una modalidad preferida, el filtro del producto tiene un tamaño de poro de NMWC de al menos aproximadamente 1,5 veces el PM del biopolímero (por ejemplo, polipéptido) de interés. Por ejemplo, si el PM de un polipéptido de interés es 100000 (100 kDa), el límite preferido del filtro del producto será un NMWC de al menos 150 000 (150 kDa). Más preferentemente, el filtro del producto tiene un tamaño de poro de NMWC de al menos 2 veces el PM del polipéptido de interés.
El experto en la técnica sabe cómo seleccionar los filtros adecuados para actuar como los filtros del producto. Un ejemplo de tal filtro adecuado son las membranas que pierden celulosa regeneradas que presentan baja unión a las proteínas, eficiencia de filtración, pureza excepcional y una amplia variedad de tamaños de poro. Los medios del filtro de celulosa regenerada son hidrófilos y ofrecen una amplia compatibilidad química. Los filtros de celulosa regenerada están disponibles en muchos diseños, incluidos los filtros de un solo uso que se descartan después de la saturación y se reemplazan con filtros nuevos o de uso múltiple que se usan, limpian y regeneran repetidamente.
Cuando las células presentes en el biorreactor alcanzan una densidad celular satisfactoria o cuando hay suficiente producto presente en el flujo de salida a través de la salida de recolección, se puede iniciar la recolección del producto. Esto puede determinarse al medir la densidad celular, por ejemplo, mediante el uso de un espectrofotómetro o al medir la cantidad del producto de interés por los medios conocidos, por ejemplo, mediante el uso de un método de ensayo adecuado de la proteína en el caso de un producto polipeptídico.
El sistema del biorreactor también puede comprender componentes adicionales, tales como uno o más contenedores del medio, una salida adicional, tal como para purgar y una unidad de filtrado de las impurezas (54) para eliminar los compuestos químicos o biológicos no deseados producidos por las células presentes en el biorreactor.
Contenedor del medio
Como se usa en la presente descripción, el término "contenedor del medio" pretende abarcar cualquier tipo de contenedor, por ejemplo, un tanque rígido de, por ejemplo, acero, vidrio o plástico o una bolsa plegable y/o desechable, que retiene el medio del cultivo celular y/o los nutrientes. En el contexto de la presente invención, el contenedor del medio se conecta a al menos una entrada del recipiente del cultivo celular y el medio del cultivo celular y/o los nutrientes se proporcionan al recipiente del cultivo celular a una velocidad de acuerdo con la necesidad de las células dentro del recipiente del cultivo celular. Normalmente, el medio y/o los nutrientes presentes en el contenedor del medio se preparan a partir de las soluciones o los polvo más concentrados.
En una modalidad de la presente invención, el contenedor del medio puede conectarse a al menos un extremo de entrada de un sistema de dilución en línea y el medio del cultivo celular y/o los nutrientes estarán normalmente presentes en el contenedor del medio en una forma más concentrada que la concentración del mismo medio o nutrientes cuando están presentes dentro del recipiente del cultivo.
En una modalidad de la invención, el sistema del biorreactor puede comprender dos o más contenedores del medio, cada uno de los cuales está en conexión fluida con una entrada del sistema de dilución en línea. El uso de dos o más contenedores del medio puede ser ventajoso con el fin de poder reducir aún más el tamaño del contenedor, los requisitos de espacio, etc., por ejemplo, mediante el uso de un contenedor para contener los componentes del medio o los nutrientes que tienen una solubilidad relativamente baja y otro contenedor para contener otros componentes del medio o los nutrientes que tienen una mayor solubilidad. Al tener los componentes de baja solubilidad en un contenedor separado, se puede reducir el volumen del contenedor que comprende los otros componentes que tienen una mayor solubilidad. Una ventaja adicional de este enfoque es que los componentes con una baja solubilidad se pueden almacenar en condiciones que contribuyan a aumentar su solubilidad, por ejemplo, mediante un ajuste de pH adecuado. El medio y los nutrientes de los dos o más contenedores del medio se pueden mezclar en cantidades adecuadas mediante el sistema de dilución del medio en línea con el fin de obtener una composición del medio de cultivo final deseada.
En una modalidad, al menos un contenedor del medio (53) en conexión fluida con el sistema de dilución en línea (56) tiene un volumen de al menos 10 L, tal como al menos 50 L, tal como al menos 100 L, por ejemplo, al menos 250 L.
En una modalidad, el medio concentrado en el o los contenedor(es) del medio (53) puede mantenerse a una temperatura reducida de, por ejemplo, 1-10 °C, tal como aproximadamente 5 °C. En este caso, el medio diluido se precalienta preferentemente antes de añadirlo al recipiente del cultivo (50). Esto se puede realizar al calentar el medio diluido como tal o al mezclar el medio concentrado con agua/tampón que se ha precalentado a la temperatura deseada. Por ejemplo, el medio diluido se puede precalentar a la misma temperatura que la temperatura del medio dentro del recipiente del cultivo.
En otra modalidad, el medio del contenedor del medio (53) se mezcla con agua/tampón del suministro de agua/tampón (55) que se ha precalentado o en donde el medio diluido se precalienta antes de añadirse al recipiente del cultivo celular.
Salida de la purga
Como se usa en la presente descripción, el término "salida de la purga" o "salida para la purga" (usado indistintamente) es una salida del recipiente del cultivo celular que permite eliminar el medio que contiene las células, los restos celulares y las impurezas del recipiente del cultivo celular. Puede construirse como una salida separada o puede construirse junto con el módulo de recolección del producto. La purga de las células ayuda a asegurar una productividad óptima en los procesos de fermentación continuos, en particular para los procesos de perfusión, ya que sirve para, por ejemplo, mejorar la viabilidad general del cultivo celular, evitar la acumulación de las células muertas y evitar la obstrucción del filtro. Para los cultivos que funcionan en modo de perfusión, es una práctica común realizar las purgas diariamente si la viabilidad de las células cae, por ejemplo, por debajo del 80 % o cuando la densidad celular alcanza un determinado nivel, por ejemplo alrededor de 30 millones de células/mL. Durante las purgas, se puede eliminar normalmente hasta el 10 % del medio en el recipiente del cultivo celular y esta cantidad puede aumentar al aumentar la densidad celular, de modo que las purgas pueden usarse para regular la densidad celular en el recipiente del cultivo celular.
Mientras que los biorreactores de perfusión contendrán normalmente una salida de la purga, los biorreactores de quimiostato usados, por ejemplo, para el cultivo de las bacterias o de las levaduras generalmente no incluyen una salida de la purga.
En una modalidad, el recipiente del cultivo celular (50) comprende una salida adicional (52), tal como para la purga.
Unidad de filtrado de las impurezas
Se han desarrollado numerosos filtros y métodos de filtración especializados para separar los materiales de acuerdo con sus propiedades químicas y físicas. Los filtros conocidos incluyen los filtros de superficie plana, los filtros plisados, los casetes de unidades múltiples y las formas tubulares, tales como las fibras huecas. Para la invención descrita en la presente descripción se puede aplicar cualquier sistema de tecnología de ultrafiltración siempre que se pueda asegurar la esterilidad.
Como se usa en la presente descripción, los términos "impurezas", "desechos" y "productos de desecho" se refieren a los compuestos químicos o biológicos no deseados producidos por las células presentes en el biorreactor o que surgen de las células que mueren o se rompen durante el proceso de fermentación. Las impurezas, los desechos y los productos de desecho se pueden usar indistintamente e incluyen, por ejemplo, alcohol etílico, alcohol butílico, ácido láctico, acetona etanol, compuestos gaseosos, péptidos, lípidos, amoníaco, compuestos aromáticos y fragmentos de ADN y ARN, así como también los componentes del medio o los productos rotos del biopolímero.
Los ejemplos de los sistemas de filtración aplicables para su uso en la producción de los polipéptidos y la eliminación de las impurezas como se describe en la presente descripción son los sistemas, tales como los sistemas de cartucho, los sistemas de placa y marco y los sistemas de fibra hueca. Los sistemas pueden hacerse funcionar al bombear líquido sobre la membrana, por vibración (por ejemplo, según lo suministra PallSep™) o por el flujo tangencial alterno (ATF) y las membranas tanto poliméricas como cerámicas son adecuadas para el proceso de filtración. Un experto en la técnica podrá seleccionar una membrana con las propiedades adecuadas.
Las membranas de fibra hueca se han empleado con éxito en una amplia variedad de industrias y tienen varios beneficios que incluyen altas densidades de empaquetamiento de la membrana, la capacidad de resistir la contrapresión del permeado, por lo tanto, permite la flexibilidad en el diseño y el funcionamiento del sistema. Los cartuchos de fibra hueca pueden funcionar desde adentro hacia afuera durante la filtración, lo que permite que el fluido del proceso (retenido) fluya a través del centro de la fibra hueca y permee para pasar a través de la pared de la fibra hacia el exterior de la fibra de la membrana. El flujo tangencial puede ayudar a limitar el ensuciamiento de la membrana. Otras técnicas de funcionamiento que pueden emplearse con los sistemas de membrana de fibra hueca incluyen el retrolavado con el flujo inverso del permeado y el retenido.
Por consiguiente, el filtro de las impurezas (54) puede estar ubicado en un módulo del filtro externo unido al biorreactor. Alternativamente, el filtro de las impurezas puede ubicarse dentro del biorreactor. La unidad de filtrado también puede contener las bombas o los sistemas para prevenir el ensuciamiento del filtro, tal como un sistema ATF o el sistema PallSep™ en el que la oscilación horizontal controlada mueve los elementos de la membrana a través del fluido de alimentación. La oscilación genera energía vibratoria en la superficie de la membrana, lo que produce un cizallamiento (más alto que el que se genera normalmente en los sistemas de filtración de flujo tangencial convencionales) que se limita a una pequeña capa límite por encima de la superficie de la membrana y que no se aplica a la mayor parte del fluido. Esto asegura que incluso en las corrientes de alimentación con alto contenido de sólidos, las membranas no se bloqueen con las especies retenidas.
El sistema puede, en dependencia de los metabolitos a eliminar y del producto en cuestión, estar equipado con las membranas con un valor límite de peso molecular de unos pocos cientos a decenas de miles. A menudo se usan las membranas con un límite de entre 1000 y 20 000 (1-20 kDa). El beneficio de usar una membrana con un límite de aproximadamente 10 000 (10 kDa) o menos, preferentemente alrededor de 5000 (5 kDa), es que los factores de crecimiento, tales como la insulina y el IGF-1 se retendrán en el biorreactor.
Durante un corrida prolongada, es posible cambiar los filtros y volver a esterilizar el sistema o si se usan los filtros desechables simplemente cambiarlos por uno nuevo, sin terminar la fermentación.
El experto en la técnica podrá seleccionar un tipo de filtro adecuado para la eliminación de las impurezas y un tamaño de poro con límite de peso molecular nominal (NMWC) de la membrana adecuado con respecto a permitir que las impurezas salgan del filtro de las impurezas y recolecten el polipéptido de interés a través de la salida de recolección del producto.
En una modalidad, la unidad de filtrado de las impurezas se selecciona de un filtro de membrana, una unidad de separación gravitacional y una unidad de separación centrífuga.
El filtro de las impurezas a menudo se selecciona con un NMWC dentro del intervalo de 1000 a 30000 (1-30 kDa), tal como en el intervalo de 2000 a 20000 (2-20 kDa) o en el intervalo de 2000 a 15000 (2-15 kDa). Sin embargo, si el producto es una célula, se puede seleccionar un filtro de las impurezas con un NMWC en el intervalo de 1000 a 500 000 (1-500 kDa), pero normalmente se prefiere que el filtro de las impurezas tenga un límite de menos de 20000 (20 kDa). Por lo tanto, en una modalidad, la unidad de filtrado de las impurezas es un filtro de membrana que tiene un tamaño de poro de NMWC de al menos 1000, tal como dentro del intervalo de 2000 a 15000.
En una modalidad preferida, la unidad de filtrado de las impurezas es un filtro de membrana que tiene un tamaño de poro con límite de peso molecular (NMWC) de un máximo del 80 % del peso molecular (MW) del producto (por ejemplo, polipéptido) de interés. Por ejemplo, si el PM del polipéptido de interés es 100000 (100 kDa), el límite máximo preferido del filtro de las impurezas será en este caso 80000 (80 kDa). Más preferentemente, el filtro de las impurezas tiene un tamaño de poro de NMWC de un máximo del 50 % del PM del polipéptido de interés. Por lo tanto, en una modalidad, el filtro de las impurezas tiene un tamaño de poro con límite de peso molecular (NMWC) de un máximo del 80 % del PM del biopolímero, tal como un máximo del 50 %.
En otra modalidad más, el recipiente del cultivo celular (50) comprende además una unidad de filtrado de las impurezas (54) en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50).
Sistema de cromatografía
Como se usa en la presente descripción, el término "sistema de cromatografía" se refiere a cualquier dispositivo o sistema para capturar un biopolímero de un medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho.
El sistema de cromatografía de la presente invención incluye dos o más unidades de cromatografía que permiten capturar el biopolímero y de este modo separar el biopolímero del medio y los productos de desecho. Como se usa en la presente descripción, el término "unidad de cromatografía" se refiere a un dispositivo de cromatografía separado, tal como una columna o una unidad de filtro que puede contener cualquier tipo de material que tenga mayor afinidad por el biopolímero que por los productos de desecho, de este modo se permite su separación.
Como se usa en la presente descripción, el término "afinidad" se refiere a la adsorción selectiva del biopolímero en un ligando de afinidad. El ligando de afinidad puede unirse a un sitio definido en el biopolímero y puede unirse a un soporte cromatográfico inerte. El ligando de afinidad también puede interactuar con el biopolímero a través de las interacciones iónicas. Cuando el medio que contiene el biopolímero pasa a través del soporte cromatográfico, el biopolímero se une al soporte sólido mediante la interacción del sitio de unión o mediante interacciones iónicas, con el ligando inmovilizado. El biopolímero unido específicamente puede recuperarse luego al cambiar las condiciones ambientales (pH, fuerza iónica, disolventes) para debilitar la interacción de unión. En otros casos, el biopolímero unido puede recuperarse luego mediante la adición de calcio y/o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o al aumentar su concentración en el tampón de elución.
En una modalidad de la presente invención, el sistema de cromatografía puede constar de 3 y 4 o más unidades de cromatografía. Sin embargo, tal sistema es un sistema muy complejo de controlar y también requiere más espacio. El uso de solo dos unidades de cromatografía crea un sistema más simple que tiene las ventajas de fácil funcionamiento y manejo. En una modalidad preferida de la presente invención, el sistema de cromatografía consta de una primera unidad de cromatografía (2) y una segunda unidad de cromatografía (3).
Un proceso típico para el procesamiento posterior de los anticuerpos monoclonales implica una etapa de purificación por afinidad (es decir, una etapa de captura) mediante el uso de un medio de afinidad de proteína A. Después de la etapa de purificación con la proteína A, los anticuerpos se purifican normalmente aún más mediante una etapa de inactivación del virus seguida de otras etapas de cromatografía, por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico de unión-elución y/o cromatografía intercambio aniónico o de unión-elución o multimodal de flujo continuo y una etapa final de purificación por nanofiltración. El sistema de cromatografía de la presente invención puede funcionar como parte de tal proceso de purificación o puede funcionar como una unidad independiente y contener los componentes adicionales, tales como los contenedores para contener el desecho y el eluido.
El ligando que se une a un sitio definido en el biopolímero diana puede unirse a un soporte cromatográfico inerte. El ligando también puede interactuar con el biopolímero a través de las interacciones iónicas. Cuando el medio que contiene el biopolímero pasa a través del soporte cromatográfico, el biopolímero se une al soporte sólido mediante la interacción del sitio de unión o mediante interacciones iónicas, con el ligando inmovilizado. El biopolímero unido específicamente puede recuperarse luego al cambiar las condiciones ambientales (pH, fuerza iónica, disolventes) para debilitar la interacción de unión.
Una ventaja de este tipo de sistema de cromatografía es el número reducido de las etapas necesarias para alcanzar la pureza deseada del biopolímero. La primera y segunda unidades de cromatografía pueden ser columnas de cromatografía adaptadas para ser empaquetadas con una resina de cromatografía en partículas, tal como una columna de cromatografía de lecho empacado. Puede ser una columna axial o radial y puede comprender un tubo de columna, un soporte del lecho poroso de entrada y un soporte del lecho poroso de salida, un distribuidor del fluido de entrada y un distribuidor del fluido de salida. Cuando se empaqueta con la resina de cromatografía, el lecho de resina puede llenar esencialmente todo el volumen entre los soportes del lecho poroso de entrada y salida. Las columnas de cromatografía de lecho empacado pueden empaquetarse con una resina que tenga afinidad por el biopolímero, tal como un ligando proteico. El ligando proteico puede derivarse de la Proteína A, Proteína G, Proteína L o un anticuerpo. Puede ser una proteína A, G, L nativa o recombinante o un anticuerpo o puede ser un mutante, fragmento o multímero de cualquiera de estas proteínas, tales como el ligando de la proteína A recombinante tolerante a álcalis, tales como MABSELECT SURE® o un ligando ProVance®. Tales ligandos pueden tener una selectividad muy alta y, por lo tanto, son adecuados para la captura de los productos biofarmacéuticos valiosos a partir de los alimentos complejos.
En algunas modalidades, la primera y segunda unidades cromatográficas también pueden basarse en absorbentes de membrana microporosa como soporte estacionario que tiene los ligandos de afinidad acoplados a una membrana activada, un hidrogel tal como nAt RIX®. En general, existen tres tipos de módulos de membrana usados para la separación de las proteínas: hoja plana, fibra hueca y flujo radial. Los materiales de membrana preferidos para las bioseparaciones son la celulosa, la poliamida, el polietileno y la polietersulfona. Para la cromatografía de membrana, existen algunas membranas disponibles comercialmente que contienen los grupos reactivos, listas para la unión del ligando. Sartobind Epoxy®, concebido por Sartorius (Alemania), es una membrana de celulosa regenerada con un tamaño de poro nominal de 0,45 |_im que posee los grupos epoxi para el acoplamiento de los ligandos que contienen los grupos -OH, -NH2 o -SH. Otro ejemplo es Ultrabind® US450 (Pall Corp., EE. UU.), que es una membrana de polisulfona con un tamaño de poro de 0,45 |_im que contiene grupos aldehído.
En una modalidad adicional de la presente invención, el material que tiene afinidad por el biopolímero es una matriz rígida de alto flujo y un ligando de la proteína A recombinante tolerante a los álcalis, tal como un MABSELECT SURE® o un ligando ProVance®.
Opcionalmente, el sistema de cromatografía también incluye uno o más contenedor(es) de residuos, uno o más contenedor(es) del eluido para recolectar el biopolímero, uno o más contenedor(es) del tampón de lavado, uno o más contenedor(es) del tampón de elución, uno o más contenedor(es) del tampón de limpieza, uno o más contenedor(es) del tampón de equilibrado, un suministro de agua y/o tampón y un sistema de dilución del tampón en línea.
Otros componentes del sistema de cromatografía son medios para conducir el fluido y medios de válvula para dirigir el fluido desde, por ejemplo, el contenedor del tampón de lavado (4) a la primera y/o segunda unidades de cromatografía (2) y/o (3) mientras se bloquea para el flujo del tampón del contenedor del tampón de elución.
Como se usa en la presente descripción, el término "medio para conducir el medio" pretende abarcar cualquier medio que pueda transportar un medio que comprende un biopolímero y los productos de desecho o un tampón desde un contenedor o el sistema de dilución del tampón en línea a través de una tubería, tubo o línea de conexión a por ejemplo, una unidad de cromatografía, un contenedor de residuos, un contenedor del tampón de elución o al sistema de dilución del tampón en línea. Dichos medios podrían estar mediados por la gravedad o la fuerza hidráulica, pero normalmente será una bomba.
Como se usa en la presente descripción, el término "un medio de válvula" pretende abarcar cualquier dispositivo mediante el cual el flujo del fluido a través de un pasaje, tal como una línea de conexión, pueda bloquearse, permitirse o regularse de otra manera por una parte móvil que se cierra, abre u obstruye parcialmente, respectivamente, el flujo del fluido, incluidas, pero no limitado a, las válvulas de 2, 3 o 4 vías. Un medio de válvula es una válvula o más válvulas, según se desee, por ejemplo, el primer medio de válvula (31) entre la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) pueden constituir una válvula o pueden ser 2, 3 o 4 válvulas, según se desee. Las válvulas pueden funcionar de forma manual, magnética, eléctrica, neumática o hidráulica si el uso de las válvulas de manguito de tubería flexible es particularmente adecuado.
En una modalidad, el sistema de cromatografía comprende además un contenedor de desechos (17) que tiene una entrada (29) en donde el contenedor de residuos (17) está en conexión fluida con la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde el tercer medio de válvula (33) se ubica entre la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada (29) del contenedor de residuos (17). En otra modalidad, el sistema de cromatografía comprende además un contenedor de residuos (17) que tiene una entrada (29) en donde el contenedor de desechos (17) está en conexión fluida con la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde el cuarto medio de válvula (34) se ubica entre la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la entrada (29) del contenedor de residuos (17). En otra modalidad más de la presente invención, la entrada (29) del contenedor de residuos (17) está en conexión fluida con la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3). Una ventaja de esto es que los desechos se pueden guardar y volver a purificar si pueden estar presentes cantidades significativas del biopolímero en la fracción de los desechos.
De acuerdo con la presente invención, el eluido se puede proporcionar directamente a los sistemas adicionales de cromatografía y/o filtración para una purificación adicional, en cuyo caso no es necesario un recipiente del eluido. El eluido también puede recolectarse y usarse tal cual o puede almacenarse para una purificación adicional del biopolímero.
En una modalidad, el sistema de cromatografía comprende además un contenedor del eluido (18) que tiene una entrada (28) en donde el contenedor del eluido (18) está en conexión fluida con la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde el tercer medio de válvula (33) se ubica entre la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada. En otra modalidad, el sistema de cromatografía comprende además un contenedor del eluido (18) que tiene una entrada (28) en donde el contenedor del eluido (18) está en conexión fluida con la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde el cuarto medio de válvula (34) se ubica entre la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la entrada (28) del contenedor del eluido (18). En una modalidad adicional de la presente invención, la entrada (28) del contenedor del eluido (18) está en conexión fluida con la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3).
Los componentes adicionales del sistema de cromatografía son los contenedores que contienen el tampón de lavado, el tampón de elución y opcionalmente también el tampón de limpieza y el tampón de equilibrado para lavar, eluir, limpiar y equilibrar la primera y la segunda unidades de cromatografía.
El término "contenedor del tampón de lavado", "contenedor del tampón de elución", "contenedor del tampón de limpieza" y "contenedor del tampón de equilibrado", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier tipo de contenedor, por ejemplo, un tanque rígido de, por ejemplo, acero, vidrio o plástico o una bolsa plegable y/o desechable, que contiene un tampón de lavado, un tampón de elución, un tampón de limpieza y un tampón de equilibrado, respectivamente.
En una modalidad, el uno o más contenedores del tampón de lavado, elución, limpieza y equilibrado pueden contener soluciones listas para usar del tampón también denominadas "tampón listo para la solución de trabajo", tal como, por ejemplo, "tampón listo de elución para la solución de trabajo".
Otros componentes adicionales del sistema de cromatografía son las bombas para conducir el fluido, el medio y/o los tampones a través del sistema.
Como se usa en la presente descripción, el término "una bomba" pretende abarcar cualquier dispositivo de bombeo adecuado para transportar un fluido, por ejemplo, un líquido. Normalmente, puede ser un dispositivo de bombeo independiente o un canal individual en un dispositivo de bombeo multicanal, tal como, por ejemplo, una bomba peristáltica multicanal. Los ejemplos de las bombas incluyen las bombas de membrana, las bombas de manguera/bombas peristálticas, las bombas sin válvula y las bombas de diafragma.
Otros componentes adicionales del sistema de cromatografía son los dispositivos desgasificadores, eliminadores de burbujas y/o trampas de burbujas, así como también los detectores para monitorear el funcionamiento del sistema, incluido el flujo del medio y/o los tampones.
Durante el funcionamiento complejo de los líquidos, pueden formarse burbujas y afectar al flujo del líquido a través de las líneas de conexión y/o a través de la primera y segunda unidades de cromatografía. Las burbujas atrapadas en las unidades de cromatografía pueden ser especialmente problemáticas para mantener el flujo correcto a través del sistema. Por lo tanto, los dispositivos desgasificadores, eliminadores de burbujas y/o trampas de burbujas pueden estar ubicados, por ejemplo, antes o después del sistema de dilución del tampón en línea o antes de la primera y/o segunda unidad de cromatografía (2) y/o (3). El experto en la técnica sabe cómo elegir los dispositivos desgasificadores, eliminadores de burbujas y/o trampas de burbujas más adecuados y dónde ubicarlos en el sistema de cromatografía.
En una modalidad de la presente invención el sistema de cromatografía comprende una trampa de burbujas ubicada antes de la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o una trampa de burbujas ubicada antes de la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3). En otra modalidad de la presente invención, el sistema de cromatografía comprende una trampa de burbujas ubicada antes de la entrada (26a) o (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9).
A las salidas de la primera unidad de cromatografía (2) y/o de la segunda unidad de cromatografía (3) se pueden conectar los detectores adecuados para controlar la concentración del biopolímero o los productos de desecho. Normalmente, los detectores incluyen los monitores UV de una o varias longitudes de onda, los detectores del índice de refracción, los detectores de dispersión de luz, los detectores de flujo, los detectores de masa y los sensores de infrarrojo cercano (NIR). El experto en la técnica sabe cómo elegir el detector más adecuado en dependencia del material de afinidad en las unidades de cromatografía y el biopolímero. En una modalidad de la presente invención se conecta un detector adecuado para monitorear la concentración del biopolímero, tal como un detector de absorción de UV, un detector del índice de refracción o un detector de dispersión de luz a la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o a la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3).
Los detectores adecuados para controlar las velocidades del flujo o la presión hacia y desde el sistema de dilución del tampón en línea se pueden conectar a las entradas (26a) y (26b) y/o a la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9). El o los detector(es) para controlar la calidad de la mezcla a partir de la dilución en línea, por ejemplo, la conductividad del pH de las soluciones mezcladas, se pueden conectar a la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9).
En una modalidad de la presente invención, el sistema de cromatografía comprende un detector adecuado para controlar la concentración de un biopolímero y/o para medir la conductividad o el pH de la solución mezclada. En otra modalidad de la presente invención el sistema de cromatografía comprende un detector adecuado para monitorear la concentración del biopolímero, tal como los monitores UV de una o múltiples longitudes de onda, los detectores del índice de refracción, los detectores de dispersión de luz, los detectores de flujo, los detectores de masa y los sensores del infrarrojo cercano (NIR). Un controlador lógico programable puede integrar el funcionamiento y el control de todos los componentes del sistema.
Las bombas pueden ser un dispositivo de bombeo independiente o un canal individual en un dispositivo de bombeo multicanal, tal como, por ejemplo, una bomba peristáltica multicanal. Las bombas peristálticas son convenientes de usar en los sistemas de bioprocesamiento desechables, ya que no añaden superficies de contacto con el fluido y están bien adaptadas para conducir los fluidos en paralelo, ya que un cabezal de bomba puede usarse con varios tubos. Es posible usar una sola bomba multicanal para todo el sistema de cromatografía, pero también es posible usar varias bombas multicanal. Si se van a usar diferentes velocidades del flujo en diferentes líneas de conexión, es posible usar tubos de diferentes diámetros en los canales de una bomba peristáltica multicanal. Además, es posible detener el flujo en una línea separada al liberar la compresión del tubo en los rodillos de la bomba.
Las bombas pueden conectarse al módulo de recolección del producto (51), al contenedor del tampón de lavado (4), al contenedor del tampón de elución (5), al contenedor del tampón de limpieza (6) o al contenedor del tampón de equilibrado (7) o a la salida del suministro de agua (8). Las bombas también se pueden conectar a las entradas o a las salidas del sistema de dilución del tampón en línea (9), al sistema de dilución del medio en línea (56) o a las entradas o a las salidas de la primera unidad de cromatografía (2) o la segunda unidad de cromatografía (3). El experto en la técnica sabe cómo elegir y colocar las bombas adecuadas para conducir el medio al recipiente del cultivo celular y los tampones a las unidades de cromatografía.
En una modalidad de la presente invención, el sistema de cromatografía comprende un medio para conducir el medio que comprende el biopolímero y el desecho, tal como una bomba. En otra modalidad de la presente invención, el sistema de cromatografía comprende además un medio para conducir el tampón de lavado, un medio para conducir el tampón de elución, un medio para conducir el tampón de limpieza, un medio para conducir el tampón de equilibrado, un medio para conducir el agua y un medio para conducir el tampón diluido, tal como una bomba. En una modalidad adicional de la presente invención, una bomba se ubica entre las salidas (21), (22), (23), (24) y (25) y la entrada (26a) y/o (26b) del sistema de dilución del tampón en línea. En otra modalidad más de la presente invención, una bomba se ubicada entre la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) y las entradas (12) y/o (14) de las unidades de cromatografía (2) y (3).
En una modalidad de la presente invención, el sistema de cromatografía comprende además, un contenedor del tampón de lavado (4), que tiene una salida (21),
un contenedor del tampón de elución (5), que tiene una salida (22),
opcionalmente un contenedor del tampón de limpieza (6), con una salida (23)
opcionalmente un contenedor del tampón de equilibrado (7), que tiene una salida (24),
en donde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde un duodécimo medio de válvula (40b) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y en donde un decimotercer medio de válvula (41b) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde un duodécimo medio de válvula (40b) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de elución (5) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y en donde un decimotercer medio de válvula (41b) se ubica entre la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), opcionalmente, en donde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde un duodécimo medio de válvula (40b) se ubica entre la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y en donde un decimotercer medio de válvula (41b) se ubica entre la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3),
opcionalmente, en donde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde un duodécimo medio de válvula (40b) se ubica entre la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y en donde un decimotercer medio de válvula (41b) se ubica entre la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3).
Dilución en línea
La dilución en línea se refiere a un sistema de mezcla de una solución concentrada y agua (o algún otro diluyente, por ejemplo, un tampón acuoso) dentro de una línea de procesamiento para producir una solución de concentración normal lista para el proceso. Los sistemas de dilución en línea (a veces denominados "sistemas de mezcla in situ") también ofrecen muchas ventajas sobre la compra de los medios del cultivo celular premezclados y diluidos y/o los tampones de lavado, elución, limpieza y equilibrado. Al usar un sistema de mezcla, un solo contenedor del medio o del tampón concentrado produce muchas veces su volumen en la solución diluida. Por lo tanto, un solo volumen de solución concentrada, usada para producir el equivalente a muchos volúmenes del medio diluido o tampón a través del sistema de dilución, reduce en gran medida los costos de las instalaciones asociados con la fabricación de tanques grandes, reduce los requisitos de espacio en el piso y reduce los costos de validación y control de calidad, así como también los costos de desperdicio y eliminación de las soluciones mezcladas que no cumplan con las normas, desactualizadas o no usadas. También se reducen considerablemente los costos asociados con la entrega y el manejo del medio y el tampón. Además, la dilución y mezcla in situ aumenta la variedad de las concentraciones y las mezclas de los medios y los tampones que están disponibles de inmediato, sin requerir un aumento correspondiente en la cantidad de diferentes tipos de tampones, medios y suplementos de nutrientes que deben comprarse, lo que reduce los costos de las instalaciones y el funcionamiento y proporciona la ventaja logística y administrativa de un inventario reducido.
Otra ventaja de la dilución del medio en línea es que si, por ejemplo, un componente de un medio se consume a un ritmo más rápido con una densidad celular alta que con una densidad celular baja, el medio se puede compensar para esto al mezclar una concentración más alta de este componente.
Como se usa en la presente descripción, el término "sistema de dilución del medio en línea" son los sistemas de mezcla que proporcionan el medio diluido al recipiente del cultivo y el "sistema de dilución del tampón en línea" son los sistemas de mezcla que proporcionan los tampones diluidos, las soluciones del tampón de lavado, elución, limpieza y equilibrado a la primera y segunda unidades de cromatografía. En una modalidad, el sistema de dilución del medio en línea y el sistema de dilución del tampón en línea pueden integrarse en un único sistema de mezcla que proporcione el medio diluido al recipiente del cultivo y los tampones diluidos, las soluciones del tampón de lavado, elución, limpieza y equilibrado a la primera y segunda unidades de cromatografía (2) y/o (3).
La dilución en línea de las soluciones del tampón de lavado, elución, limpieza y equilibrado concentradas (también llamadas soluciones tampón), los medios o las soluciones de los nutrientes con agua o tampón debe realizarse dentro de intervalos de especificación estrictos para el pH, la conductividad, la osmolalidad y la temperatura, que son parámetros críticos del proceso. Esto requiere que se pueda suministrar una mezcla precisa de la solución concentrada y agua con una mínima desviación en el tiempo. Además, la solución debe mezclarse bien antes de entregarla al recipiente del cultivo celular.
Un sistema de dilución en línea puede, en su forma más básica, ser un sistema simple de tubos o tuberías desde los cuales se suministran las soluciones concentradas y agua/tampón, respectivamente y que se conectan entre sí en un extremo antes de ser conducidos a la entrada del recipiente del cultivo celular o proporcionarse a una unidad de cromatografía. También puede ser un mezclador estático o dinámico. Existen varios tipos de mezcladores estáticos, tales como los denominados mezcladores de placa o los mezcladores, en donde los elementos de mezcla están contenidos en una carcasa cilíndrica (tubo) o cuadrada. En el diseño tipo placa, la mezcla se logra mediante una intensa turbulencia en el flujo. Los elementos alojados del mezclador fijo pueden producir simultáneamente los patrones de división del flujo y la mezcla radial. Sin embargo, más normalmente, el sistema de dilución en línea será un sistema automatizado más avanzado que permite juntar dos o más corrientes de líquidos de forma controlada para alcanzar una concentración diana de la solución diluida. Los sistemas de dilución en línea están disponibles comercialmente de diferentes proveedores, tales como Novasep, GE Healthcare o, por ejemplo, el sistema IBD™ 1K Inline Buffer Dilution System de Asahi Kasei Bioprocess (descrito en el documento US 8,271,139). Tales sistemas son capaces de hacer las mezclas de múltiples componentes de hasta 20x concentrados y producen una solución lista para usar que ofrece velocidades del flujo de la mezcla total de más de 1000 L/h.
En otra modalidad, el uno o más contenedores del tampón de lavado, limpieza, elución y equilibrado pueden contener las soluciones tampón concentradas que tienen que ser diluidas por el sistema de dilución del tampón en línea con agua y/o tampón del suministro de agua y/o tampón antes de que se proporcionen a la primera y segunda unidades de cromatografía. En una modalidad adicional, al menos uno de los contenedores del tampón de lavado, elución, limpieza o equilibrado tiene un volumen de al menos 10 L, tal como al menos 50 L, tal como al menos 100 L, por ejemplo, al menos 250 L.
Como se usa en la presente descripción, los términos "suministro de agua y/o tampón" y "suministro de agua/tampón", están destinados a abarcar cualquier suministro de agua o tampón para su uso en la dilución del medio concentrado y los nutrientes destinados al recipiente del cultivo celular y para diluir las soluciones tampón concentradas de lavado, elución, limpieza y equilibrado destinadas a las unidades de cromatografía. Esto puede incluir los contenedores que contienen agua o una solución tampón premezclada para mezclar con el medio concentrado o las soluciones tampón, así como también, por ejemplo, los sistemas de dilución en los que un tampón concentrado se mezcla con agua antes de usarlo en el sistema de dilución del medio en línea.
Como se usa en la presente descripción, el término "suministro de agua" pretende abarcar cualquier suministro de agua, tal como un tanque, un contenedor o un tubo, que contenga o lleve agua para su uso en la dilución del medio concentrado, nutrientes, tampón de lavado, tampón de elución, tampón de limpieza o tampón de equilibrado. Esto puede incluir cualquier suministro de agua adecuada, tal como agua pura, agua de alta pureza (HPW) o agua para inyección (WFI) almacenada en un tanque u otro contenedor o suministrada según sea necesario en forma purificada mediante el uso de, por ejemplo, ultrafiltración u ósmosis inversa. Debido a problemas para medir el pH del agua de alta pureza, el agua del suministro de agua se puede tamponar, por ejemplo, con un ácido, una base o una sal.
En una modalidad, el sistema del biorreactor de la presente invención comprende además un suministro de agua y/o tampón (55) en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50). En una modalidad adicional, el sistema del biorreactor comprende además un sistema de dilución del medio en línea (56) para diluir el medio concentrado del contenedor del medio (53), que tiene el sistema de dilución del medio en línea una entrada (57) y una salida (58), en donde la entrada (57) está en conexión fluida con el contenedor del medio (53) y la entrada (57) está en conexión fluida con el suministro de agua/tampón (55) y en donde la salida (58) del sistema de dilución del medio en línea (56) está en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50).
En una modalidad de la presente invención, el suministro de agua y/o tampón (55) y el suministro de agua y/o tampón (8) es el mismo suministro de agua y/o tampón que proporciona agua y/o tampón al sistema dilución del medio en línea y al sistema de dilución del tampón en línea. En otra modalidad, el suministro de agua y/o tampón (8) y (55) son suministros de agua y/o tampón independientes donde el primer suministro de agua y/o tampón (55) proporciona agua y/o tampón al sistema de dilución del medio en línea y el suministro de agua y/o tampón (8) proporciona agua y/o tampón al sistema de dilución del tampón en línea.
En otra modalidad, el sistema de cromatografía comprende además,
un contenedor del tampón de lavado (4), que tiene una salida (21),
un contenedor del tampón de elución (5), que tiene una salida (22),
opcionalmente un contenedor del tampón de limpieza (6), con una salida (23)
opcionalmente un contenedor del tampón de equilibrado (7), que tiene una salida (24),
un suministro de agua (8), que tiene una salida (25) y un sistema de dilución del tampón en línea (9) que tiene una entrada (26a) y una salida (27), en donde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un quinto medio de válvula (35) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9),
en donde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un sexto medio de válvula (36) se ubica entre la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), opcionalmente, en donde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un séptimo medio de válvula (37) se ubica entre la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9),
opcionalmente, en donde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un octavo medio de válvula (38) se ubica entre la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9),
en donde la salida (25) del suministro de agua (8) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) o está en conexión fluida con una entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un noveno medio de válvula (39) se ubica entre la salida (25) del suministro de agua (8) y la entrada (26a) o la entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde un décimo medio de válvula (40) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un undécimo medio de válvula (41) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3).
En una modalidad de la presente invención, el sistema de dilución del medio en línea (56) tiene una velocidad del flujo de la mezcla total de al menos 0,01 L/min, tal como al menos 0,1 L/min, tal como al menos 0,2 L/min, tal como al menos 0,5 L/min, tal como al menos 1 L/min, tal como al menos 2 L/min, tal como al menos 5 L/min, tal como al menos 10 L/min. En una modalidad adicional, el sistema de dilución del tampón en línea (9) tiene una velocidad del flujo de la mezcla total de al menos 0,01 L/min, tal como al menos 0,1 L/min, tal como al menos 0,2 L/min, tal como al menos 0,5 L/min, tal como al menos 1 L/min, tal como al menos 2 L/min, tal como al menos 5 L/min, tal como al menos 10 L/min.
En una modalidad adicional, la disposición del biorreactor para producir un biopolímero expresado por una célula, en donde la disposición del biorreactor comprende un sistema del biorreactor y un sistema de cromatografía en donde el sistema del biorreactor comprende:
un recipiente del cultivo celular (50) para contener un medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho en donde el recipiente del cultivo celular (50) comprende un módulo de recolección del producto (51), que tiene una salida (16), una salida adicional (52), tal como para la purga y un contenedor del medio (53) en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50), una unidad de filtrado de las impurezas (54) en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50), un suministro de agua y/o tampón (55) en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50) y un sistema de dilución del medio en línea (56) para diluir el medio concentrado del contenedor del medio (53), el sistema de dilución del medio en línea tiene una entrada (57) y una salida (58), en donde la entrada (57) está en conexión fluida con el contenedor del medio (53) y la entrada (57) está en conexión fluida con el suministro de agua/tampón (55) y en donde la salida (58) del sistema de dilución del medio en línea (56) está en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50) y en donde el sistema de cromatografía comprende:
una primera unidad de cromatografía (2) y una segunda unidad de cromatografía (3) que comprenden el material que tiene afinidad por el biopolímero, en donde la primera unidad de cromatografía (2) tiene una entrada (12) y una salida (13) y la segunda unidad de cromatografía (3) tiene una entrada (14) y una salida (15),
un contenedor del tampón de lavado (4), que tiene una salida (21),
un contenedor del tampón de elución (5), que tiene una salida (22),
opcionalmente un contenedor del tampón de limpieza (6), con una salida (23)
opcionalmente un contenedor del tampón de equilibrado (7), que tiene una salida (24),
un suministro de agua (8), que tiene una salida (25) y un sistema de dilución del tampón en línea (9) que tiene una entrada (26a) y una salida (27), en donde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3),
en donde un primer medio de válvula (31) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un segundo medio de válvula (32) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y un tercer medio de válvula (33) se ubica entre la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) están en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un cuarto medio de válvula (34) se ubica entre la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y
en donde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un quinto medio de válvula (35) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un sexto medio de válvula (36) se ubica entre la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), opcionalmente, en donde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un séptimo medio de válvula (37) se ubica entre la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9),
opcionalmente, en donde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un octavo medio de válvula (38) se ubica entre la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9),
en donde la salida (25) del suministro de agua (8) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) o está en conexión fluida con una entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un noveno medio de válvula (39) se ubica entre la salida (25) del suministro de agua (8) y la entrada (26a) o la entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde un décimo medio de válvula (40) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un undécimo medio de válvula (41) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3).
Hay varios enfoques para el funcionamiento del procedimiento de la mezcla. Por ejemplo, algunos sistemas mezclan las soluciones con base en la conductividad y/o los datos del pH proporcionados por los analizadores de los procesos de conductividad y pH, mientras que otros sistemas usan la velocidad del flujo volumétrico como medio principal de control, ya que los medidores de la conductividad y el pH en línea tienen una tendencia inherente a la deriva y una calibración incorrecta puede resultar en lecturas falsas.
El sistema de dilución del medio en línea puede construirse de modo que todos los componentes del medio y los nutrientes se mezclan previamente en una única solución concentrada diseñada para diluirse con agua o tampón, por ejemplo, con un factor de 1,5 o más, normalmente dos o más, por ejemplo un factor de tres, un factor de cuatro o un factor de cinco o incluso mayor, tal como un factor de ocho o diez, en el sistema de dilución del medio en línea y posteriormente se proporciona al recipiente del cultivo celular. En este caso, el sistema usará un único contenedor del medio.
Alternativamente, el sistema de dilución del medio en línea puede emplear dos o más contenedores del medio, por ejemplo, que contienen diferentes componentes del medio con diferentes solubilidades como se discutió anteriormente. En este caso, el sistema puede construirse de modo que los diferentes componentes de los medios y los nutrientes que tienen diferentes concentraciones sean llevados a una sola cámara de mezcla por diferentes entradas a diferentes velocidades del flujo y diluidos en la cámara de mezcla con agua o tampón hasta la concentración deseada (por ejemplo, para la concentración del medio en el recipiente del cultivo celular), donde después se proporciona la mezcla diluida al recipiente del cultivo celular. Otra opción en el caso de varios contenedores del medio es que cada contenedor del medio se conecta a una cámara de mezcla separada para diluir con agua o tampón. Las cámaras de mezcla separadas se pueden conectar además a una cámara de mezcla común, en donde el medio diluido de dos o más cámaras de mezcla separadas individuales se mezcla antes de ser conducido al recipiente del cultivo a través de una sola entrada o alternativamente, el medio diluido de las cámaras de mezcla separadas individuales puede conducirse en el recipiente del cultivo por medio de múltiples entradas, por ejemplo, una entrada para cada cámara de mezcla.
En una modalidad, el medio concentrado en el contenedor del medio (53) se diluye al menos por un factor de dos con agua o tampón del suministro de agua/tampón (55) antes de ser alimentado al recipiente del cultivo (50), por ejemplo, por un factor de al menos tres, cuatro o cinco. En otra modalidad, el medio concentrado de al menos dos contenedores del medio (53) se mezcla con agua o tampón del suministro de agua/tampón (55) antes de ser alimentado al recipiente del cultivo celular (50).
El sistema de dilución del tampón en línea también puede emplear dos o más contenedores del tampón de lavado, elución, limpieza y/o equilibrado concentrados, por ejemplo, que contienen diferentes componentes del tampón. En este caso, el sistema puede construirse de modo que los diferentes componentes del tampón que tienen diferentes concentraciones sean conducidos a una sola cámara de mezcla por diferentes entradas a diferentes velocidades del flujo y diluidos en la cámara de mezcla con agua o tampón hasta la concentración deseada, donde después la mezcla diluida se proporciona a la primera y segunda unidades de cromatografía. Otra opción, en el caso de varios contenedores del tampón, es que cada contenedor del tampón se conecte a una cámara de mezcla separada para diluir con agua o tampón. Las cámaras de mezcla separadas pueden conectarse además a una cámara de mezcla común, en donde el tampón diluido de dos o más cámaras de mezcla separadas individuales se mezcla antes de ser conducido a la primera y segunda unidades de cromatografía a través de una sola entrada o alternativamente, el tampón diluido de las cámaras de mezcla separadas individuales pueden transportarse a la primera y segunda unidades de cromatografía por medio de múltiples entradas, por ejemplo, una entrada para cada cámara de mezcla.
El uso de dos o más contenedores del tampón puede ser ventajoso con el fin de poder reducir aún más el tamaño del contenedor, los requisitos de espacio, etc., por ejemplo, mediante el uso de un contenedor para contener un componente del tampón y otro contenedor para contener otro componente del tampón. Otra posibilidad es tener un primer tampón de lavado que comprende determinados componentes en forma concentrada en un contenedor del tampón de lavado y un segundo tampón de lavado que comprende otros componentes en forma concentrada en un segundo contenedor del tampón de lavado.
De manera similar, puede ser ventajoso tener dos o más contenedores del tampón de limpieza y/o equilibrado que contengan diferentes compuestos de limpieza en diferente concentración para una limpieza y/o equilibrado eficaz de la primera y segunda unidades de cromatografía.
Dado que el tampón de elución, en algunos casos, debe prepararse dentro de intervalos de especificación muy exactos de pH, conductividad y/u osmolalidad, el tampón de elución puede estar presente en el contenedor en una forma más concentrada que la concentración que se proporciona a la primera y segunda unidades de cromatografía o puede estar presente en el contendor en la misma concentración que la concentración que se proporciona a la primera y segunda unidades de cromatografía para eluir el biopolímero (es decir, como una solución de trabajo lista). En situaciones donde el tampón de elución está presente en el contenedor como un tampón listo para la solución de trabajo, la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) puede estar en conexión fluida directa con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3). En otras palabras, la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está conectada directamente con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3). Otra opción es que la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5)) a través de una entrada independiente del sistema de dilución del tampón en línea y del sistema de dilución del tampón en línea también esté en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) a través de una salida independiente del sistema de dilución del tampón en línea.
En una modalidad de la presente invención, la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida directa con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3).
En otra modalidad de la invención, el sistema de elución puede comprender dos o más contendores del tampón de lavado, elución, limpieza y equilibrado, cada uno de los cuales está en conexión fluida con una entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea.
El tampón de elución también puede prepararse a partir de los concentrados mediante la elución en gradiente del sistema de dilución del tampón en línea o para la elución escalonada. En la elución en gradiente, el tampón de elución se cambia continuamente hacia condiciones que favorecen la disociación del ligando de afinidad. En la elución escalonada, el tampón de elución se cambia escalonadamente, en una o varias ocasiones, tal gradiente puede prepararse simplemente a partir de dos soluciones madre que tienen, por ejemplo, diferentes concentraciones de sal o pH o puede prepararse a partir de concentrados de múltiples componentes que tienen, por ejemplo, ambos diferentes concentraciones de iones metálicos, concentraciones de sal y pH.
En una modalidad de la invención, el sistema de dilución del medio en línea (56) puede conectarse a un sensor ubicado dentro o fuera del recipiente del cultivo celular que puede medir la concentración o la cantidad del medio o de los componentes o nutrientes seleccionados en el recipiente del cultivo celular. En este caso, el sistema de dilución en línea puede funcionar como un sistema automatizado, que permite que la concentración o la cantidad del medio o de los componentes o nutrientes seleccionados del medio en el recipiente del cultivo celular se mantenga constante, por ejemplo, en el caso de que se cambie la velocidad de perfusión o se produzca una purga para disminuir la densidad celular en el recipiente del cultivo celular o para que se regule de otro modo como se desee.
El sistema de dilución del medio en línea (56) y el sistema de dilución del tampón en línea (9) pueden tener un monitoreo y control en línea del proceso de dilución mediante el uso de instrumentación, tales como los medidores del flujo másico y/o los instrumentos analíticos, tal como pH, conductividad o instrumentación del infrarrojo cercano (NIR). Un controlador lógico programable puede integrar el funcionamiento y el control de todos los componentes en los sistemas.
Medio de cultivo celular
Como se usa en la presente descripción, el término "medio" se refiere a un medio de cultivo celular. Se conocen numerosos medios de cultivo celular y están disponibles comercialmente. Tales medios tienen normalmente una composición que está adaptada para el cultivo de determinados tipos de células y puede comprender las sales, los aminoácidos, las vitaminas, los lípidos, los detergentes, los tampones, los factores de crecimiento, las hormonas, las citocinas, los oligoelementos y los carbohidratos. Los ejemplos de las sales incluyen las sales de magnesio, por ejemplo MgCl2 X 6H2O y sales de hierro, por ejemplo FeSO4 X 7H2O, sales de potasio, por ejemplo KH2PO4, KCl, sales de sodio, por ejemplo NaH2PO4 o Na2HPO4 y sales de calcio, por ejemplo CaCl2 X 2H2O. Los ejemplos de los aminoácidos son los 20 aminoácidos de origen natural, por ejemplo, la histidina, la glutamina, la treonina, la serina, la metionina. Los ejemplos de las vitaminas incluyen el ascorbato, la biotina, la colina, el mioinositol, el D-pantotenato y la riboflavina. Los ejemplos de los lípidos incluyen los ácidos grasos, por ejemplo, el ácido linoleico y el ácido oleico. Los ejemplos de los detergentes incluyen el Tween® 80 y el Pluronic® F68. Un ejemplo de un tampón es HEPES. Los ejemplos de los factores de crecimiento/hormonas/citocinas incluyen IGF, hidrocortisona e insulina (recombinante). Los ejemplos de los oligoelementos incluyen Zn, Mg y Se. Los ejemplos de los carbohidratos incluyen la glucosa, la fructosa, la galactosa y el piruvato. Los ejemplos de otros componentes que pueden incluirse en el medio son la peptona de soja y la etanolamina. El experto en la técnica estará familiarizado con los medios y suplementos de medios adecuados, así como también con las condiciones adecuadas con respecto a las células de expresión específicas y los polipéptidos de interés. Pueden añadirse al medio los antiespumantes y los eliminadores de la espuma a base de silicio o los tensioactivos no iónicos, tales como los polímeros de cobloque de los monómeros de óxido de etileno/óxido de propileno durante la fermentación.
El pH, la temperatura, la concentración del oxígeno disuelto y la osmolaridad del medio del cultivo celular dependerán del tipo particular de célula y se elegirán de modo que sean óptimos para el crecimiento y la productividad de las células en cuestión. El experto en la técnica sabrá cómo determinar las condiciones óptimas, tales como pH, temperatura, concentración del oxígeno disuelto y osmolaridad para un cultivo dado. Por lo general, el pH óptimo para las células de mamíferos está entre 6,6 y 7,6, la temperatura óptima está entre 30 y 39 °C y la osmolaridad óptima está entre 260 y 400 mOsm/kg. Para los sistemas microbianos, el pH puede estar entre 3 y 8 y la temperatura entre 20 y 45 °C.
La solubilidad de los diferentes componentes del medio varía considerablemente, ya que muchos de los componentes tendrán una alta solubilidad y, por lo tanto, se disolverán fácilmente en agua mientras que otros componentes, tales como determinadas vitaminas, aminoácidos, lípidos y factores de crecimiento tienen una baja solubilidad en agua. Por esta razón, los medios de cultivo celular se preparan normalmente al mezclar todos los componentes como una composición lista para usar.
En una modalidad de la presente invención, el medio se fabrica de modo que los componentes que se disuelven fácilmente en agua se preparan juntos en un lote y los componentes con baja solubilidad y que son difíciles de disolver en agua se preparan juntos en otro lote. Los dos (o más) lotes se disuelven luego por separado en agua para producir dos (o más) fracciones concentradas de los medios que tienen las concentraciones deseadas de los componentes individuales. Las fracciones concentradas del medio pueden prepararse, por ejemplo, como soluciones en donde los componentes del medio son 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces o más, por ejemplo, hasta 10 veces, tan concentrados como los componentes en el recipiente del cultivo.
Células
Como se usa en la presente descripción, el término "célula" puede incluir tanto las células procariotas como las eucariotas.
La expresión de los biopolímeros, en particular los polipéptidos, para uso terapéutico se ha logrado mediante el uso de las bacterias, levaduras y células de mamífero y el experto en la técnica estará familiarizado con las numerosas células de expresión adecuadas para la producción de un producto dado. Las células que expresan el biopolímero (por ejemplo, el polipéptido) pueden, por lo tanto, seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en E. coli, Bacillus, levadura del género Saccharomyces, Pichia, Aspergillus, Fusarium o Kluyveromyces, células CHO (ovario de hámster chino), hibridomas, células b Hk (riñón de hámster bebé), células de mieloma, células HEK-293, células PER.C6®, amniocitos que incluyen los amniocitos humanos, tales como las líneas celulares CAP® y CAP-T®, las células linfoblastoides humanas y las células de ratón, tales como las células NSO.
En el contexto de la presente invención, las células son preferentemente las células eucariotas, en particular las células de mamífero. En una modalidad preferida, las células son células de mamífero, por ejemplo, seleccionadas del grupo que consiste en las células CHO (ovario de hámster chino), hibridomas, células BHK (riñón de hámster bebé), células de mieloma, células HEK-293, células PER.C6®, células humanas linfoblastoides, células NSO y amniocitos, tales como los amniocitos humanos. En una modalidad, la célula es una célula CHO, tal como una célula CHO DG44, por ejemplo bajo el control de las secuencias reguladoras EF-1a de hámster chino.
Dado que la invención como se describe funciona preferentemente mediante el uso de una alta densidad celular, se puede usar ventajosamente un medio de cultivo celular con una alta densidad celular a partir de una fermentación para reiniciar (es decir, sembrar) una nueva fermentación. Una alta densidad de las células viables en este contexto es normalmente una densidad de al menos 10 millones de células/mL, preferentemente al menos 20 millones de células/mL, más preferentemente al menos 30 millones de células/mL, por ejemplo, al menos 40 millones de células/mL, tal como al menos 50 millones de células/mL.
En algunos casos, puede ser conveniente cultivar las células a una densidad celular deseada en un biorreactor y luego transferir las células a un segundo biorreactor para inducir la expresión del polipéptido al añadir un inductor (para las células que están bajo el control de un promotor inducible) o al cambiar la temperatura y/o el pH del medio. En tal caso, las impurezas también pueden eliminarse a través del dispositivo de separación del primer biorreactor mediante el uso de una velocidad del flujo deseada y a través del dispositivo de separación del segundo biorreactor mediante el uso de la misma o diferente velocidad del flujo deseada.
Proceso de fermentación
Como se explica en otra parte de la presente descripción, el sistema de la invención es preferentemente un sistema continuo, es decir, la fermentación se realiza como una fermentación continua. En una modalidad preferida, el producto producido por el método es un polipéptido, tal como una proteína y la fermentación se realiza como un proceso de perfusión, es decir, un proceso en el que un cultivo de células en suspensión en un biorreactor se suministra continuamente con medio fresco mientras se recolecta continuamente el medio de cultivo gastado, las células se filtran continuamente de la corriente de recolección y se devuelven al biorreactor para mantener una densidad celular uniforme.
Salvo que se describa lo contrario en la presente descripción, el proceso de perfusión puede realizarse como se conoce generalmente en la técnica. Por lo tanto, un proceso típico puede implicar, después de la inoculación del biorreactor, por ejemplo, aproximadamente 2-3 días o más en los que las células se cultivan sin perfusión con el fin de obtener una densidad celular inicial deseada, seguido por el inicio de la perfusión (es decir, la recolección) en un bajo nivel de, por ejemplo, aproximadamente 0,5-1 volumen del reactor por día, después de lo cual la velocidad de perfusión aumenta a, por ejemplo, aproximadamente 1,5-3 volúmenes del reactor por día una vez que la densidad celular ha aumentado más. El término "volumen del reactor" en este contexto se entenderá como correspondiente al volumen del recipiente del cultivo celular de trabajo del sistema particular. El proceso se monitoriza continuamente como se conoce en la técnica y como se explica de otro modo en la presente descripción, de modo que las condiciones de crecimiento, concentración del medio, densidad celular, pH, etc. se mantienen dentro de las especificaciones deseadas. La recolección del biopolímero junto con los productos de desecho comienza cuando se logra una densidad celular deseada o cuando está presente un nivel deseado del biopolímero en el medio. Como se usa en la presente descripción, el término "nivel predeterminado de las células y/o biopolímero" se refiere a tal densidad celular deseada alcanzada o a un nivel deseado del biopolímero o tanto a la densidad celular deseada alcanzada como al nivel deseado del biopolímero está presente en el medio del cultivo celular.
En una modalidad de la presente invención, la densidad celular en el recipiente del cultivo celular durante la fermentación alcanza al menos 10 millones de células por mL de medio, por ejemplo, al menos 20 millones de células por mL de medio, tal como al menos 30 millones de células por mL de medio, tal como al menos 40 millones de células por mL de medio.
El nivel de la corriente de recolección para un proceso de perfusión dado, es decir, el nivel usado para la mayor parte de la fermentación, podrá ser determinado por un experto en la técnica al tener en cuenta las características del proceso y sistema del biorreactor individual, pero a menudo será en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 volúmenes del reactor por día, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 volúmenes del reactor por día, por ejemplo, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5 volúmenes del reactor por día. El proceso de perfusión a menudo se realiza durante aproximadamente 3-6 semanas, pero puede durar incluso más, tal como hasta aproximadamente 2 meses o más.
Los expertos en la técnica sabrán que la temperatura del medio en el recipiente del cultivo celular es un factor clave para la productividad de las células, al ser a menudo una temperatura óptima en el intervalo de aproximadamente 30­ 38 °C y que puede ser ventajoso emplear una reducción de la temperatura durante la fermentación. Tales procedimientos son bien conocidos, en particular para las células de mamíferos, tales como las células CHO y normalmente implican una fase de fermentación inicial a una primera temperatura de, por ejemplo, aproximadamente 37 °C con el fin de obtener una densidad celular deseada, seguida de una reducción de la temperatura a, por ejemplo, aproximadamente 32-35 °C durante el resto de la fermentación con el fin de aumentar la expresión del producto polipeptídico y reducir la división celular.
En una modalidad de la presente invención, el método para producir un biopolímero en una disposición del biorreactor de la presente invención comprende:
(a) fermentar las células que expresan el biopolímero en un medio adecuado en condiciones adecuadas hasta que se alcance un nivel predeterminado de las células y/o biopolímero en el recipiente del cultivo celular (50),
(b) recolectar el biopolímero al eliminar el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través del módulo de recolección del producto (51).
En otra modalidad de la presente invención, el método para producir un biopolímero en una disposición del biorreactor de la presente invención comprende además,
un contenedor del medio (53),
un suministro de agua y/o tampón (55),
un sistema de dilución del medio en línea (56) para diluir el medio concentrado del contenedor del medio, el sistema de dilución del medio en línea tiene una entrada (57) y una salida (58), en donde la entrada está en conexión fluida con el contenedor del medio (53) y el suministro de agua/tampón (55) y en donde la salida (58) está en conexión fluida con el recipiente del cultivo (50),
en donde durante la fermentación, el método comprende además:
añadir el medio concentrado del contenedor del medio (53) y agua o tampón del suministro de agua/tampón (55) a una entrada (57) del sistema de dilución del medio en línea (56) para dar como resultado un medio diluido y alimentar el medio diluido que contiene los nutrientes al recipiente del cultivo celular (50) a través de una salida (58) para reponer los nutrientes consumidos por las células y compensar el medio eliminado para la recolección del biopolímero.
Proceso de captura, lavado y elución
Durante el funcionamiento del presente sistema de cromatografía, el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho se proporciona desde el módulo de recolección del producto (51) hasta la primera y/o segunda unidad de cromatografía (2) y/o (3) y el biopolímero se captura, por ejemplo, por la resina o filtro de afinidad por el ligando, por lo que los sitios de unión para el biopolímero absorbente se ocupan y la capacidad de unión disminuye. El método de captura del biopolímero en la primera y segunda unidades de cromatografía se basa en el funcionamiento de dos unidades de cromatografía independientes o en serie, de modo que el biopolímero que escapa de la primera unidad de cromatografía se capturará en la segunda unidad de cromatografía. Cuando se carga la primera unidad de cromatografía hasta un nivel predeterminado de la capacidad de unión, se separa de la segunda unidad de cromatografía, se lava y se eluye el biopolímero. Opcionalmente, posteriormente se limpia y se equilibra antes de colocarlo frente a la segunda cromatografía. Cuando se carga la segunda cromatografía hasta un nivel predeterminado de la capacidad de unión con el biopolímero, se separa de la primera unidad de cromatografía, se lava y se eluye el biopolímero.
Como se usa en la presente descripción, el término "nivel predeterminado de la capacidad de unión" generalmente se refiere a un nivel deseado de la capacidad de unión de la primera y/o segunda unidad de cromatografía. La capacidad de unión de un ligando de afinidad puede determinarse empíricamente y depende, por ejemplo, de las condiciones de carga, por ejemplo, la velocidad del flujo y la temperatura. Como se usa en la presente descripción, el término "capacidad de unión" se refiere a la cantidad del biopolímero que el ligando (por ejemplo, perlas empaquetadas en una columna) puede unir en las condiciones de equilibrio si se utilizan todos los sitios de unión disponibles en las perlas. El prefijo "primero", "segundo", "tercero", "cuarto" y "quinto" pretende significar que los niveles predeterminados se seleccionan individualmente y pueden ser diferentes o pueden ser iguales.
Los niveles predeterminados de la capacidad de unión pueden establecerse independientemente de modo que la resina, por ejemplo, se cargue a aproximadamente 30 %-100 %, que incluye más de aproximadamente 30 %, más de aproximadamente 40 %, más de aproximadamente 50 %, más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 90 % y más de aproximadamente 98 % de su capacidad de unión. Los niveles predeterminados de la capacidad de unión también se pueden establecer de forma independiente, de modo que solo el 0,5 % como máximo, 1 % como máximo, 2 % como máximo, 5 % como máximo, 10 % como máximo, 15 % como máximo o 20 % como máximo del biopolímero en el medio pasa a través de la salida (13) o (15) de la primera y segunda unidades de cromatografía (2) o (3) a un contenedor de residuos o de contención. Normalmente, el primer, segundo, tercer, cuarto y quinto nivel predeterminado de la capacidad de unión se determinará de forma independiente y se ajustará de modo que el nivel predeterminado de la capacidad de unión se alcance después de un período de tiempo específico de carga. Dicho período de tiempo puede establecerse desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 24 horas, tal como desde aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 24 horas, tal como desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 24 horas, tal como desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 24 horas, tal como de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 24 horas, tal como de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 24 horas, tal como de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 24 horas, tal como de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 24 horas, tal como de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas, tal como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 20 horas, tal como de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 18 horas, tal como de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 16 horas, tal como de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas, tal como de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 10 horas, tal como de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 8 horas, tal como de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 6 horas.
Sin embargo, el primer nivel predeterminado de la capacidad de unión se establecerá normalmente de modo que permita suficiente tiempo para lavar, eluir y, opcionalmente, limpiar y equilibrar la primera unidad de cromatografía (2) de modo que la primera unidad de cromatografía (2) pueda conectarse a la segunda unidad de cromatografía (3), antes de que la primera unidad de cromatografía (2) se sature o sobrecargue con el biopolímero y el biopolímero escape de ser capturado en la primera unidad de cromatografía (2). En una modalidad de la presente invención, el primer nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece para evitar el biopolímero en el medio a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3). En una modalidad adicional, el primer nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que la resina se cargue hasta aproximadamente el 30 %-100 % de su capacidad de unión. En otra modalidad más, el primer nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que el 20 % como máximo del biopolímero en el medio pase a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) a un contenedor de residuos o contención.
El segundo nivel predeterminado de la capacidad de unión de la etapa (d) se puede establecer normalmente de modo que la primera unidad de cromatografía (2) se sature completamente con el biopolímero, mientras se permite suficiente capacidad de unión de la segunda unidad de cromatografía (3) de modo que la primera unidad de cromatografía (2) se puede lavar, eluir, limpiar y equilibrar antes de que el biopolímero comience a escapar de ser capturado en la segunda unidad de cromatografía (3). En una modalidad de la presente invención, el segundo nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece para evitar el biopolímero en el medio a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3). En una modalidad adicional, el segundo nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que la resina se cargue hasta aproximadamente el 30 %-100 % de su capacidad de unión. En otra modalidad más, el segundo nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que el 20 % como máximo del biopolímero en el medio pase a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) a un contenedor de residuos o de contención.
El tercer nivel predeterminado de la capacidad de unión de la etapa (e) puede establecerse normalmente de modo que permita el tiempo suficiente para lavar, eluir y, opcionalmente, limpiar y equilibrar la primera unidad de cromatografía (2) de modo que la primera unidad de cromatografía (2) pueda conectarse a la segunda unidad de cromatografía (3), antes de que la segunda unidad de cromatografía (3) se sature o sobrecargue con el biopolímero y el biopolímero escape de ser capturado en la segunda unidad de cromatografía (3). En una modalidad de la presente invención, el tercer nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece para evitar el biopolímero en el medio a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3). En una modalidad adicional, el tercer nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que la resina se cargue hasta aproximadamente el 30 %-100 % de su capacidad de unión. En otra modalidad más, el tercer nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que el 20 % como máximo del biopolímero en el medio pase a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) a un contenedor de residuos o de contención.
El cuarto nivel predeterminado de la capacidad de unión de la etapa (f) puede establecerse normalmente de modo que la segunda unidad de cromatografía (3) se sature completamente con el biopolímero, mientras se permite una capacidad de unión suficiente de la primera unidad de cromatografía (2) de modo que la segunda unidad de cromatografía (3) se puede lavar, eluir, limpiar y equilibrar antes de que el biopolímero comience a escapar de ser capturado en la primera unidad de cromatografía (2). En una modalidad de la presente invención, el cuarto nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece para evitar el biopolímero en el medio a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3). En una modalidad adicional, el cuarto nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que la resina se cargue hasta aproximadamente el 30 %-100 % de su capacidad de unión. En otra modalidad más, el cuarto nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que el 20 % como máximo del biopolímero en el medio pase a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) a un contenedor de residuos o de contención.
El quinto nivel predeterminado de la capacidad de unión de la etapa (g) puede establecerse normalmente de modo que permita el tiempo suficiente para lavar, eluir y, opcionalmente, limpiar y equilibrar la segunda unidad de cromatografía (3) de modo que la segunda unidad de cromatografía (3) pueda conectarse a la primera unidad de cromatografía (2), antes de que la primera unidad de cromatografía (2) se sature o sobrecargue con el biopolímero y el biopolímero escape de ser capturado en la segunda unidad de cromatografía (3). En una modalidad de la presente invención, el quinto nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece para evitar el biopolímero en el medio a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y/o a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3). En una modalidad adicional, el quinto nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que la resina se cargue aproximadamente al 30 %-100 % de su capacidad de unión. En otra modalidad más, el quinto nivel predeterminado de la capacidad de unión se establece de modo que el 20 % como máximo del biopolímero en el medio pase a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) a un contenedor de residuos o de contención.
Como se usa en la presente descripción, el término "ajuste especificado" pretende abarcar cualquier período de tiempo especificado necesario para que el biopolímero no capturado por la primera unidad de cromatografía se capture en la segunda unidad de cromatografía. También se pretende que abarque cualquier cantidad especificada del medio o del biopolímero que pasa sin ser capturado por la primera unidad de cromatografía para ser capturado en la segunda unidad de cromatografía. En una modalidad, el ajuste especificado se selecciona entre un tiempo especificado, un volumen especificado, una cantidad especificada del biopolímero y una concentración especificada del biopolímero. En una modalidad, el ajuste especificado es un tiempo especificado. En otra modalidad, el ajuste especificado es un volumen especificado. En una modalidad adicional, el ajuste especificado es una cantidad especificada del biopolímero, tal como una concentración especificada del biopolímero.
Una ventaja de hacer funcionar la primera y segunda unidades de cromatografía en serie de acuerdo con la presente invención es que la primera unidad de cromatografía (2) puede cargarse hasta que la mayoría o todos los sitios de unión para absorber el biopolímero estén ocupados. Cuando el biopolímero ocupa cada vez más sitios de unión, hay cada vez menos sitios de unión disponibles para los productos de desecho, es decir, las impurezas. Además, dado que el biopolímero tiene una mayor afinidad por el ligando de afinidad, por ejemplo, los productos de desecho de la resina se desplazan de la unidad de cromatografía de modo que se puede producir un biopolímero mucho más puro.
Las etapas de lavado se pueden llevar a cabo mediante el uso de un solo tampón de lavado o mediante el uso de varios tampones de lavado de diferente composición. Los niveles predeterminados de lavado pueden determinarse al controlar la cantidad de los componentes de desecho que fluyen a través de la unidad de cromatografía mediante el uso de los detectores adecuados, tales como los detectores Uv de los detectores de densidad óptica. A menudo, los niveles predeterminados de lavado se determinan en experimentos iniciales y se convierten en la cantidad del tampón de lavado necesaria para obtener el nivel predeterminado deseado de lavado. Normalmente, los tampones de lavado se usan en volúmenes de 3 a 20 veces el volumen de la unidad de cromatografía. El experto en la técnica sabe cómo seleccionar los tampones de lavado adecuados en dependencia de la unidad de cromatografía usada y del biopolímero a producir. Los ejemplos típicos de los tampones de lavado son fosfato de sodio 15-50 mM con NaCl 0,15-0,5 M a pH 6,5-7,5.
En una modalidad de la presente invención, el primer nivel predeterminado de lavado se establece de modo que al menos el 50 %, de modo que al menos el 60 %, de modo que al menos el 70 %, de modo que al menos el 80 %, de modo que al menos el 85 %, de modo que al menos el 90 %, de modo que al menos el 90 % de las impurezas presentes en la primera unidad de cromatografía (2) haya pasado a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2).
En otra modalidad, el segundo nivel predeterminado de lavado se establece de modo que al menos el 50 %, de modo que al menos el 60 %, de modo que al menos el 70 %, de modo que al menos el 80 %, de modo que al menos el 85 %, de modo que al menos el 90 %, de modo que al menos el 90 % de las impurezas presentes en la segunda unidad de cromatografía (3) haya pasado a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3).
En una modalidad de la presente invención, el tercer nivel predeterminado de lavado se establece de modo que al menos el 50 %, de modo que al menos el 60 %, de modo que al menos el 70 %, de modo que al menos el 80 %, de modo que al menos el 85 %, de modo que al menos el 90 %, de modo que al menos el 90 % de las impurezas presentes en la primera unidad de cromatografía (2) haya pasado a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2).
En otra modalidad, el cuarto nivel predeterminado de lavado se establece de modo que al menos el 50 %, de modo que al menos el 60 %, de modo que al menos el 70 %, de modo que al menos el 80 %, de modo que al menos el 85 %, de modo que al menos el 90 %, de modo que al menos el 90 % de las impurezas presentes en la segunda unidad de cromatografía (3) haya pasado a través la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3).
Las etapas de elución pueden llevarse a cabo mediante el uso de un solo tampón de elución, mediante el uso de varios tampones de elución de diferente composición o mediante el uso de un gradiente de elución. Los niveles predeterminados de elución pueden determinarse al controlar la cantidad del biopolímero que fluye a través de la unidad de cromatografía mediante el uso de los detectores adecuados y ajustarse cuando no se detecta el biopolímero o casi ningún biopolímero. A menudo, los niveles predeterminados de elución se determinan en experimentos iniciales y se convierten en la cantidad del tampón de elución necesario para obtener el nivel predeterminado deseado de lavado. Normalmente, los tampones de elución se usan en volúmenes de 3 a 20 veces el volumen de la unidad de cromatografía. El experto en la técnica sabe cómo seleccionar los tampones de elución adecuados en dependencia de la unidad de cromatografía usada y del biopolímero a producir. Los ejemplos de los tampones de elución incluyen la solución con pH bajo, la solución con concentraciones de sal bajas o altas, los tampones de glicina-HCl, los tampones que contienen los tampones de etilenglicol y citrato que tienen un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9.
En una modalidad de la presente invención, el primer nivel predeterminado de elución se establece de tal manera que al menos el 50 %, de modo que al menos el 60 %, de modo que al menos el 70 %, de modo que al menos el 80 %, de modo que al menos el 85 %, de modo que al menos el 90 %, de modo que al menos el 95 % del biopolímero presente en la primera unidad de cromatografía (2) haya pasado a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2).
En otra modalidad, el segundo nivel predeterminado de elución se establece de modo que al menos el 50 %, de modo que al menos el 60 %, de modo que al menos el 70 %, de modo que al menos el 80 %, de modo que al menos el 85 %, de modo que al menos el 90 %, de modo que al menos el 95 % del biopolímero presente en la segunda unidad de cromatografía (3) haya pasado a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3).
En una modalidad adicional, el tercer nivel predeterminado de elución se establece de modo que al menos el 50 %, de modo que al menos el 60 %, de modo que al menos el 70 %, de modo que al menos el 80 %, de modo que al menos el 85 %, de modo que al menos el 90 %, de modo que al menos el 95 % del biopolímero presente en la primera unidad de cromatografía (2) haya pasado a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2).
En una modalidad adicional, el cuarto nivel predeterminado de elución se establece de modo que al menos el 50 %, de modo que al menos el 60 %, de modo que al menos el 70 %, de modo que al menos el 80 %, de modo que al menos el 85 %, de modo que al menos el 90 %, de modo que al menos el 95 % del biopolímero presente en la segunda unidad de cromatografía (3) haya pasado a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3).
El método para producir un biopolímero de acuerdo con la presente invención se basa en cargar, lavar y eluir repetidamente el biopolímero. En consecuencia, la primera y segunda unidades de cromatografía (2) y (3) deben conectarse y desconectarse repetidamente. Sin embargo, durante la primera ronda de captura del biopolímero, la primera unidad de cromatografía (2) puede funcionar sola, es decir, donde la conexión fluida desde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el tercer medio de válvula (33) o puede funcionar conectada con la primera unidad de cromatografía (2), es decir, en donde la conexión fluida desde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) está abierta por el tercer medio de válvula (33).
En una modalidad de la presente invención, el etapa (c) se puede realizar al conducir un medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través de la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) en donde el biopolímero se captura en la primera unidad de cromatografía (2) y el medio y los productos de desecho continúan a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta que se alcanza un primer nivel predeterminado de la capacidad de unión saturada en la primera unidad de cromatografía (2), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el segundo medio de válvula (32) y en donde la conexión fluida desde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) está abierta por el tercer medio de válvula (33).
En otra modalidad de la presente invención, el sistema de cromatografía puede disponerse mediante el uso de las unidades de cromatografía desechables, también llamadas unidades de cromatografía de un solo uso que se descartan después de que el biopolímero ha sido eluido de las unidades de cromatografía y se reemplaza por nuevas unidades de cromatografía después de su uso. En una modalidad adicional de la presente invención, el sistema de cromatografía se dispone mediante el uso de las unidades de cromatografía de usos múltiples que se cargan, eluyen, limpian y regeneran repetidamente.
La limpieza de la primera y segunda unidades de cromatografía se puede llevar a cabo mediante el uso de un solo tampón de limpieza o mediante el uso de varios tampones de limpieza de diferente composición.
Los niveles predeterminados de limpieza pueden determinarse al controlar la cantidad de los productos de desecho que fluyen a través de la unidad de cromatografía mediante el uso de los detectores adecuados. A menudo, los niveles predeterminados de elución se determinan en experimentos iniciales y se convierten en la cantidad del tampón de limpieza necesaria para obtener el nivel predeterminado deseado de limpieza. Normalmente, los tampones de limpieza se usan en volúmenes de 3 a 20 veces el volumen de la unidad de cromatografía. El experto en la técnica sabe cómo seleccionar los tampones de limpieza adecuados en dependencia de la unidad de cromatografía usada y del biopolímero a producir. Los ejemplos típicos de los tampones de limpieza incluyen NaOH a 0,1-0,5 M.
Durante el funcionamiento de las unidades de cromatografía de usos múltiples para la purificación de los anticuerpos, tales como las columnas basadas en proteína A, los productos de desecho tienden a acumularse en la parte superior de las unidades de cromatografía. En tal situación, puede ser una ventaja proporcionar el tampón de limpieza a las salidas (13) y (15) de la primera unidad de cromatografía (2) y (3) que lo conduce a través de la primera unidad de cromatografía (2) y (3) y a través de las entradas (12) y (14) de la primera y segunda unidades de cromatografía, hasta, por ejemplo, un contenedor de residuos o tanque de contención, para facilitar la limpieza eficiente de la primera y segunda unidades de cromatografía.
En una modalidad de la presente invención después de la etapa (ii);
(iia) limpiar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un primer nivel de limpieza predeterminado y en donde después de la etapa (iv); (iva) limpiar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la entrada a la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un segundo nivel de limpieza predeterminado.
En otra modalidad después de la etapa (ii);
(iib) limpiar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un tercer nivel de limpieza predeterminado y, en donde después de la etapa (iv);
(ivb) limpiar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un cuarto nivel de limpieza predeterminado.
En una modalidad adicional después de la etapa (ii);
(iia) limpiar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por un sexto medio de válvula (36) y que conduce al tampón de limpieza diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un quinto nivel de limpieza predeterminado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el undécimo medio de válvula (41) y, en donde después de la etapa (iv);
(iva) limpiar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y que conduce al tampón de limpieza diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un sexto nivel de limpieza predeterminado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra mediante el décimo medio de válvula (40).
En una modalidad adicional más después de la etapa (ii);
(iib) limpiar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y que conduce al tampón de limpieza diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un séptimo nivel de limpieza predeterminado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra mediante el décimo medio de válvula (40) y, en donde después de la etapa (iv);
(ivb) limpiar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y que conduce el tampón de limpieza diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un octavo nivel de limpieza predeterminado, en donde la conexión fluida desde el la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el undécimo medio de válvula (41).
Las etapas de limpieza (iia), (iva), (iib) y (ivb) de la primera y segunda unidades de cromatografía (2) y (3) pueden ir seguidas de las etapas de equilibrado de la cromatografía para prepararlas para recibir el biopolímero. Los ejemplos típicos de los tampones de equilibrado incluyen fosfato de sodio a 5-40 mM con NaCl a 20-250 mM a pH 6,5-7,5.
En una modalidad de la presente invención después de la etapa (iia) o (iib);
(iic) equilibrar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de equilibrado a través de la conexión fluida desde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un primer nivel predeterminado de equilibrado y en donde después de la etapa (iva) o (ivb);
(ivc) equilibrar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de equilibrado a través de la conexión fluida desde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un segundo nivel de equilibrado predeterminado.
En una modalidad adicional, el sistema de cromatografía comprende además,
un suministro de agua (8) que tiene una salida (25) y un sistema de dilución del tampón en línea (9) que tiene una entrada (26a) y una salida (27), en donde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un quinto medio de válvula (35) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un sexto medio de válvula (36) se ubica entre la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), opcionalmente, en donde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un séptimo medio de válvula (37) se ubica entre la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9),
opcionalmente, en donde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un octavo medio de válvula (38) se ubica entre la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9),
en donde la salida (25) del suministro de agua (8) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) o está en conexión fluida con una entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un noveno medio de válvula (39) se ubica entre la salida (25) del suministro de agua (8) y la entrada (26a) o la entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde un décimo medio de válvula (40) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un undécimo medio de válvula (41) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3).
en donde durante o después de la etapa e)
(i) lavar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de lavado concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y que conduce el tampón de lavado diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un tercer nivel predeterminado de lavado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el undécimo medio de válvula (41),
(ii) cuando se alcanza el tercer nivel predeterminado de lavado, eluir el biopolímero de la primera unidad de cromatografía (2) al conducir:
(a1) el tampón de elución concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua del suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) o alternativamente al conducir:
(a2) un tampón de elución listo para la solución de trabajo a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y, en donde cuando se usa el tampón de elución listo para la solución de trabajo, la conexión fluida de la salida (25) del suministro de agua (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el noveno medio de válvula (39) y que conduce el tampón de elución listo para la solución de trabajo desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un tercer nivel predeterminado de elución y se recoge el eluido, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el undécimo medio de válvula (41) y en donde durante o después de la etapa g)
(iii) lavar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de lavado concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y que conduce el tampón de lavado diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un cuarto nivel de lavado predeterminado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el décimo medio de válvula (40),
(iv) cuando se alcanza el cuarto nivel predeterminado de lavado, eluir el biopolímero de la segunda unidad de cromatografía (3) al conducir:
(b1) el tampón de elución concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua del suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) o alternativamente al conducir:
(b2) un tampón de elución listo para la solución de trabajo a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y, en donde cuando se usa el tampón de elución listo para la solución de trabajo, la conexión fluida de la salida (25) del suministro de agua (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el noveno medio de válvula (39) y que conduce el tampón de elución diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un cuarto nivel predeterminado de elución y al recoger del eluido, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el décimo medio de válvula (40).
En una modalidad adicional más después de la etapa (iia) o (iib);
(iic) equilibrar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de equilibrado concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y en donde la conexión fluida desde el salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el séptimo medio de válvula (37) y que conduce el tampón de limpieza diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un tercer nivel de equilibrado predeterminado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el undécimo medio de válvula (41),
y en donde después de la etapa (iva) o (ivb);
(ivc) equilibrar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de equilibrado concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y en donde la conexión fluida desde el salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el séptimo medio de válvula (37) y que conduce el tampón de limpieza diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un cuarto nivel de equilibrado predeterminado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por los medios de válvula (41).
La temperatura del medio y del tampón de lavado, elución, limpieza y equilibrado pueden influir en la estabilidad del biopolímero y también en la unión del biopolímero a la primera y segunda unidades de cromatografía. La temperatura también puede influir en la forma en que las impurezas, como el ADN residual y las proteínas de la célula huésped, se unen al ligando de la proteína A. El experto en la técnica sabe cómo seleccionar la condición adecuada de la temperatura para funcionar el sistema de cromatografía.
En una modalidad, el medio en el módulo de recolección del producto puede mantenerse a una temperatura de, por ejemplo, 28-38 °C, tal como aproximadamente 32 °C o tal como aproximadamente 35 °C para mejorar la afinidad por la primera o segunda unidad de cromatografía o ambas. En otra modalidad, los tampones de lavado, elución, limpieza y/o equilibrado se usan a una temperatura de, por ejemplo, 28-38 °C, tal como aproximadamente 32 °C o tal como aproximadamente 35 °C. En una modalidad adicional, los tampones de lavado, elución, limpieza y/o equilibrado se usan a una temperatura en el intervalo de 1 a 10 °C. En otra modalidad, los tampones de lavado, elución, limpieza y/o equilibrado se usan a una temperatura en el intervalo de 10-30 °C. En una modalidad adicional, el medio en el módulo de recolección del producto tiene una temperatura de, por ejemplo, 28-38 °C y los tampones de lavado, elución, limpieza y/o equilibrado se usan a una temperatura en el intervalo de 1-10 °C. En otra modalidad más, los tampones de lavado, elución, limpieza y/o equilibrado se usan a una temperatura en el intervalo de 1 a 40 °C, tal como de 20 a 40 °C, tal como de 30 a 40 °C, tal como de 1 a 10 °C, tal como de 5 a 20 °C.
En una modalidad adicional, el sistema de cromatografía y el sistema de dilución del medio en línea (56) se mantienen a una temperatura de, por ejemplo, 28-38 °C, tal como aproximadamente 32 °C o tal como aproximadamente 35 °C. En una modalidad preferida de la presente invención, el sistema de cromatografía se mantiene a una temperatura de, por ejemplo, 28-38 °C, tal como aproximadamente 32 °C o tal como aproximadamente 35 °C para mejorar la eliminación del ADN residual y/o la proteína de la célula huésped.
El producto aislado (por ejemplo, polipéptido) de interés producido mediante el uso del sistema y el método de la invención puede purificarse adicionalmente para eliminar las impurezas residuales, tales como las proteínas de la célula huésped, ADN de la célula huésped, los residuos de proteína A, virus y/o los anticuerpos agregados, por los métodos conocidos en la técnica para el producto dado, formulado en una composición final comercialmente relevante de interés (por ejemplo, una composición farmacéutica) y empaquetado en un contenedor adecuado.
Descripción detallada de los dibujos
Las siguientes descripciones no limitantes de los dibujos son únicamente a modo de ejemplo y no pretenden limitar la presente invención de ningún modo.
Una disposición del biorreactor de la invención se ilustra esquemáticamente en la Figura 1 e incluye un recipiente del cultivo celular (50) con un módulo de recolección del producto (51) para eliminar el producto del biopolímero junto con las células, las impurezas y el medio que tiene una salida (16) y con líneas discontinuas, un contenedor del medio (53) , una unidad de filtrado de las impurezas (54) para separar las purezas no deseadas y una salida de la purga (52) que permite eliminar el medio que contiene las células, los restos celulares y las impurezas del recipiente del cultivo celular (50). El medio del contenedor del medio (53) está en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50) y se introduce a través de la entrada (59) del contenedor del medio (53). También unido al recipiente del cultivo celular (50) hay una salida de la purga (52) que puede construirse como una unidad separada o puede construirse como una sola unidad con el módulo de recolección del producto (51). La salida (16) del módulo de recolección del producto (51) está en conexión fluida con una primera unidad de cromatografía (2) que tiene una entrada (12) y una salida (13) y una segunda unidad de cromatografía (3) que tiene una entrada (14) y una salida (15). La salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) están en conexión fluida con un contenedor de residuos (17) que tiene una entrada (29) y un contenedor del eluido (18) que tiene una entrada (28) (mostrada con líneas discontinuas). Cada una de las entradas (12) y (14), la salida (16) o la conexión fluida tienen al menos un medio de válvula (31, 32). Además, la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) está en conexión fluida con la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) está en conexión fluida con la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) a través de las líneas de conexión que conectan la salida (13) con la entrada (14) y la salida (15) con la entrada (12) y cada una de las salidas (13) y (15) o las correspondientes conexiones fluidas tienen al menos un medio de válvula (33, 34). La salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) también está en conexión líquida con la entrada (29) del contenedor de residuos (17) (mostrado con las líneas discontinuas). También se muestra un contenedor del tampón de lavado (4) que tiene una salida (21), un contenedor del tampón de elución (5) que tiene una salida (22) y con las líneas discontinuas (que indican que esto es opcional) un contenedor del tampón de limpieza (6) que tiene una salida (23) y un contenedor del tampón de equilibrado (7) que tiene una salida (24), todos los cuales están en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada 14 de la segunda unidad de cromatografía (3) y la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3). Cada una de las entradas (12) y (14), las salidas (13, 15, 21, 22, 23, 24) o la conexión fluida tienen al menos un medio de válvula (40b, 41b).
La Figura 2 muestra una modalidad alternativa de la disposición del biorreactor ilustrada en la Figura 1. En la Figura 2, la disposición del biorreactor incluye un contenedor del medio (53) y un contenedor de agua/tampón (55), ambos en conexión fluida con una entrada (57) de un sistema de dilución del medio en línea (56). La salida (58) del sistema de dilución del medio en línea (56) está en conexión fluida con la entrada (59) del recipiente del cultivo celular (50). Además, el agua o el tampón puede conducirse opcionalmente directamente desde el contenedor de agua/tampón (55) al recipiente del cultivo celular (50) (ilustrado por la línea discontinua entre los dos). En conexión con el recipiente del cultivo celular (50) hay un módulo de recolección del producto (51) que tiene una salida (16). En un sistema de perfusión, las células que se eliminan del recipiente del cultivo celular (50) a través del módulo de recolección del producto (51) se devuelven opcionalmente al recipiente del cultivo celular (50) (línea discontinua de (51) a (50)). Conectada al recipiente del cultivo celular (50) hay opcionalmente también una unidad de filtrado de las impurezas (54) para separar las purezas no deseadas y opcionalmente una salida separada de la purga (52). Como se explicó anteriormente, la salida de la purga (52) puede construirse como una unidad separada o puede construirse junta como una sola unidad con el módulo de recolección del producto (51).
La salida (16) del módulo de recolección del producto (51) es una conexión fluida con una primera unidad de cromatografía (2) que tiene una entrada (12) y una salida (13) y una segunda unidad de cromatografía (3) que tiene una entrada (14) y una salida (15). También se muestra un contenedor del tampón de lavado (4) que tiene una salida (21), un contenedor del tampón de elución (5) que tiene una salida (22), un suministro de agua (8) que tiene una salida (25) y con las líneas discontinuas un contenedor del tampón de limpieza (6) que tiene una salida (23) y un contenedor del tampón de equilibrado (7) que tiene una salida (24), todos los cuales están en conexión fluida con un sistema de dilución del tampón en línea (9) que tiene una entrada (26a) y una salida (27), a través de las líneas de conexión que conectan las salidas (21,22, 23, 24, 25) a la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea. Cada una de las salidas (21,22, 23, 24, 25) o la(s) conexión(es) fluida(s) correspondiente(s) también tienen al menos un medio de válvula (35, 36, 37, 38, 39) para regular el flujo de cada uno de los contenedores al sistema de dilución del tampón en línea. Las líneas discontinuas que representan el contenedor del tampón de limpieza (6), el contenedor del tampón de equilibrado (7) y la conexión fluida correspondiente indican que estos componentes son las características opcionales del sistema. Además, la conexión fluida que conecta la salida (25) del suministro de agua (8) a la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea puede ser mediante el uso de la misma entrada que las líneas de conexión que conectan las salidas (21,22, 23, 23, 24) con la entrada (26a) o alternativamente, como se muestra con una línea discontinua, ser mediante el uso de una entrada separada (26b).
La salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) a través de la conexión fluida que conecta la salida (27) en donde los medios de válvula (40) y (41) se ubican entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3). La salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) también está en conexión fluida con la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3). Cada una de las entradas (12) y (14), la salida (16) o las conexiones fluidas que conectan las entradas (12) y (14) con la salida (16), tienen al menos un medio de válvula (31, 32). Además, la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) está en conexión fluida con la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) está en conexión fluida con la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) a través de las líneas de conexión que conectan la salida (13) con la entrada (14) y la salida (15) con la entrada (12) y cada una de las salidas (13) y (15) o las correspondientes conexiones fluidas tienen al menos un medio de válvula (33, 34). La salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) también está en conexión líquida con la entrada (29) del contenedor de residuos (17) y la entrada (28) del contenedor de eluido (18) a través de la conexión fluida que conecta la salida (13) con la entrada (29) y la entrada (28) con la salida (13) (mostradas con las líneas discontinuas).
Todas las referencias, incluidas las publicaciones, las solicitudes de patente y las patentes citadas en la presente descripción se incorporan aquí como referencia en la misma medida que si cada referencia se indicara individual y específicamente para ser incorporada como referencia y se estableciera en su totalidad en la presente descripción. Todos los títulos y los subtítulos se usan en la presente descripción únicamente por conveniencia y no deben interpretarse como limitantes de la invención de ninguna manera.
La invención engloba cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las posibles variaciones de los mismos, a menos que se indique lo contrario en la presente descripción o que el contexto lo contradiga claramente de otro modo.
La mención de los intervalos de los valores en la presente descripción está destinada simplemente a servir como un método breve para hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente descripción y cada valor separado se incorpora en la especificación como si se mencionara individualmente en la presente descripción. A menos que se indique lo contrario, todos los valores exactos proporcionados en la presente descripción son representativos de los valores aproximados correspondientes (por ejemplo, todos los valores ejemplares exactos proporcionados con respecto a un factor o medida en particular se puede considerar que también proporcionan una medida aproximada correspondiente, modificada por "aproximadamente", donde sea apropiado).
Todos los métodos descritos en la presente descripción se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en la presente descripción o que el contexto lo contradiga claramente de otro modo.
Los términos "un" y "una" y "el" y las referencias similares como se usan en el contexto de describir la invención deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente descripción o que el contexto lo contradiga claramente. Por los tanto, "un" y "una" y "el" pueden significar al menos uno o uno o más.
El término "y/o" como se usa en la presente descripción en relación con una selección de una lista pretende incluir a cada uno del individual. Por ejemplo, la primera unidad de cromatografía y/o la segunda unidad de cromatografía (2) y/o (3) están destinadas a incluir la primera unidad de cromatografía (2) o la segunda unidad de cromatografía (3) o tanto la primera como la segunda unidad de cromatografía.
El uso de todos y cada uno de los ejemplos o el lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente descripción, está destinado simplemente a iluminar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención a menos que se indique lo contrario. Ningún lenguaje en la especificación debe interpretarse como que indica que algún elemento es esencial para la práctica de la invención a menos que se indique explícitamente.
La mención e incorporación de los documentos de patente en la presente descripción se hace solo por conveniencia y no refleja ninguna visión de la validez, patentabilidad y/o aplicabilidad de tales documentos de patente.
La descripción de la presente descripción de cualquier aspecto o modalidad de la invención mediante el uso de los términos, tales como "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos está destinada a proporcionar apoyo para un aspecto o modalidad similar de la invención que "consiste en", "consiste esencialmente en" o "comprende sustancialmente" ese elemento o elementos en particular, a menos que se indique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente (por ejemplo, una composición descrita en la presente descripción como comprende un elemento en particular debe entenderse que también describe una composición que consta de ese elemento, a menos que se indique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente).
Esta invención incluye todas las modificaciones y los equivalentes del tema objetivo citados nuevamente en los aspectos o en las reivindicaciones presentados en la presente descripción en la máxima extensión permitida por la ley aplicable.
Las características descritas en la descripción anterior pueden, tanto por separado como en cualquier combinación de las mismas, ser material para realizar la invención en diversas formas de la misma.
Ejemplos
El ejemplo 1 está dirigido a los experimentos relacionados con la capacidad de unión dinámica de la cromatografía de la proteína A y la evaluación de la calidad de la etapa de purificación en relación con la proteína y el ADN de la célula huésped residual. El ejemplo 2 está dirigido a la dilución en línea de los tampones concentrados.
Abreviaturas y definiciones
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Tabla 4: Tampones usados para los estudios
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Ejemplo 1.
El propósito de este experimento fue purificar el material de los biorreactores mediante el uso de una columna de Cromatografía con la Proteína A en las condiciones normales y sobrecargadas. La salida cuantitativa y cualitativa se evaluó para las dos configuraciones a temperatura ambiente y a 35 °C al simular la captura del producto directamente del biorreactor.
Se probaron dos resinas con la proteína A diferentes:
• MabSelect SuRe de GE Health Care basado en un gel de agarosa. La columna CIP realizada por el hidróxido de sodio a 0,1 M.
• ProVance de Grace basado en una matriz de sílice principalmente para la cromatografía de un solo uso. La columna CIP realizada por el ácido fosfórico a 0,1 M.
Como la etapa de la Cromatografía con la Proteína A es la primera etapa de normalmente tres etapas con poder de separación, cualquier impureza restante (agregado, HCP y ADN res.) se reducirá mediante las etapas posteriores del proceso.
Descripción del proceso
El alcance general era establecer una configuración cromatográfica continua que combina dos columnas de acuerdo con la presente invención usadas para la cromatografía de sobrecarga, por ejemplo, combinadas con un biorreactor mediante el uso de la recolección continua por la tecnología de perfusión.
Las pruebas descritas en este protocolo examinaron el rendimiento de una columna por las condiciones descritas en la Tabla 1 más abajo.
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Equipo
Las corridas de Cromatografía con la Proteína A se realizaron mediante el uso del Ákta Explorer, medidor de pH, medidor de la conductividad, NanoDrop para la determinación de la concentración de proteína por OD280 y balances Métodos
Prueba de Cromatografía con la Proteína A
Los ajustes de los parámetros para los ciclos CIP de la Cromatografía con la Proteína A y las corridas de cromatografía se muestran en las tablas más abajo.
Configuración de los parámetros
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Procedimiento MabSelect SuRe CIP antes de la corrida
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Ajuste de los parámetros para
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Procedimiento cromatográfico MabSelect SuRe
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Prueba de Cromatografía con la Proteína A
La configuración del muestreo para las corridas de la Cromatografía con la Proteína A se muestra en la Tabla 5 más abajo.
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Prueba de la Cromatografía con la Proteína A MabSelect SuRe.
Se obtuvieron los perfiles cromatográficos para la Cromatografía con la Proteína A con MabSelect SuRe con sobrecarga y con carga normal (no mostrados).
Los perfiles cromatográficos (no mostrados) de las corridas de MabSelect SuRe se realizaron como se esperaba con los siguientes comentarios:
La longitud del pico de carga para las corridas de sobrecarga fue, como se esperaba, mayor que el pico de carga para la carga normal.
• La duración de la fracción de lavado se incrementó a 30 CV para asegurar un lavado suficiente del material no unido. La duración del lavado se reducirá en experimentos adicionales a la duración necesaria para lograr la reducción requerida del material no unido.
• El volumen y la altura del pico de elución fueron;
36.7 mL y 3,15 AU para la corrida con carga normal (LEP2622),
40,4 mL y 3,20 AU para la corrida de sobrecarga (LEP2802) y
39,1 mL y 3,29 AU para la corrida de sobrecarga (LEP2621) almacenamiento de la carga a 35 °C. 39.7 mL y 2,9 AU para la corrida de sobrecarga (LEP2919).
39.7 mL y 2,9 AU para la corrida de sobrecarga (LEP2920) cargado a 35 °C.
(La altura del pico no visualizaba la altura del pico real ya que los valores de AU están por encima del máximo del monitor UV).
• No se observó una diferencia significativa en el rendimiento y la pureza mediante la carga a temperatura ambiente o 35 °C, lo que simula la carga de la recolección de la perfusión directamente a la columna.
• La capacidad de unión dinámica al 10 % (DBC10 %) de capacidad fue de aprox. 48 mg/mL de resina.
Prueba de la Cromatografía con la Proteína A de ProVance.
Se obtuvieron los perfiles cromatográficos para la Cromatografía con la Proteína A con ProVance con sobrecarga y con carga normal (no mostrado). Los perfiles cromatográficos de las corridas de ProVance fueron similares a las corridas de MabSelect SuRe y se realizaron como se esperaba con los siguientes comentarios:
• La duración de la fracción de lavado se incrementó a 30 CV para asegurar un lavado suficiente del líquido del proceso no unido. La duración del lavado se reducirá a la longitud necesaria para lograr la reducción requerida del material no unido.
• El volumen y la altura del pico de elución fue;
9,4 mL y 2,96 AU para la corrida con carga normal (LEP2804),
13,6 mL y 3,05 AU para la corrida de sobrecarga (LEP2803).
La altura del pico no visualiza la altura del pico real ya que los valores de AU están por encima del máx. del monitor UV.
• La capacidad de unión dinámica al 10 % (DBC10 %) de capacidad es de aprox. 41 mg/mL de resina.
Los datos analíticos generados para la evaluación cuantitativa y cualitativa de las corridas de la Cromatografía con la Proteína A se enumeran en la Tabla 6. Los datos se comentan más abajo para cada tipo de resina:
MabSelect SuRe:
• La cantidad máxima del producto cargado en MabSelect SuRe durante las corridas de sobrecarga fue de 45 a 49 mg/mL de resina, que varía debido a la variación en el ensayo PA-HPLC. El DBC10 % fue 48 mg/mL de resina para MabSelect SuRe.
• Los rendimientos de estas corridas estuvieron entre el 85 y el 107 %; en promedio 95 % y dependió de la variación en la cuantificación de la carga por PA-HPLC y el eluido por DO280.
• La recuperación del producto para la corrida de carga normal fue de 25,8 mg/mL de resina, lo que dio como resultado un rendimiento del 101 %.
• El perfil de exclusión de tamaño de los eluidos de las corridas normal y de sobrecarga fue similar.
• El patrón para el producto y las impurezas detectadas por el SDS PAGE reducido y el SDS PAGE no reducido fueron similares.
• Las impurezas relacionadas con el proceso; el HCP relativo, el ADN residual y la Proteína A residual están todos al mismo nivel.
• No hay diferencias importantes en el rendimiento y pureza al cargar a temperatura ambiente o 35 °C. Sin embargo, se observó una reducción importante en la contaminación del ADN residual en la proteína de la célula huésped cuando se cargó a 35 °C.
ProVance:
• La recuperación del producto en ProVance durante las corridas de sobrecarga fue de 38 mg/mL de resina, que fue de aprox. 20 % menor que la capacidad de MabSelect SuRe. El DBC10 % es 41 mg/mL de resina para ProVance.
• Los rendimientos por sobrecarga, así como también por corrida normal, fueron del 95 %, que estaba en un nivel similar en comparación con las corridas con MabSelect SuRe.
• El perfil de exclusión de tamaño (monómero/HMW/LMW) de los eluidos es 94,0/3,6/2,4 % para la corrida normal y 92,6/4,8/2,5 % para la corrida de sobrecarga.
• El patrón para el producto y las impurezas detectadas por el SDS PAGE reducido y el SDS PAGE no reducido, muestra similitud (ver Apéndice 1 y Apéndice 2)
• Las impurezas relacionadas con el proceso; el HCP relativo, el ADN residual y la Proteína A residual están todos al mismo nivel.
Tabla 6: Datos analíticos generados para la evaluación cuantitativa y cualitativa de la Cromatografía con la Proteína A.
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Conclusión.
Se realizaron corridas de cromatografía de sobrecarga y carga normal mediante el uso de un gel a base de agarosa (MabSelect SuRe) y una resina a base de sílice (ProVance), lo que dio como resultado rendimientos y pureza similares (ver Tabla 6).
Sin embargo, al correr la MabSelect SuRe (LEP2622) en modo normal, la recuperación del producto fue de 26,0 mg/mL de resina y en modo de sobrecarga (LEP2621; 47,9 mg/mL de resina), (LEP2802; 43,5 mg/mL de resina), (LEP2919; 45,0 mg/mL de resina) y (LEP2920; 44,7 mg/mL de resina), respectivamente. En consecuencia, al correr la columna MabSelect SuRe en modo de sobrecarga dio como resultado una recuperación del producto del 65 al 85 % más alta que la corrida en modo normal.
Una corrida de cromatografía con el uso de ProVance en modo normal (LEP2803) dio como resultado una recuperación del producto de 31,1 mg/mL de resina y en modo de sobrecarga (LEP2804) de 38,3 mg/mL, que es un aumento en la capacidad de carga del producto del 23 %.
Además, la corrida de cromatografía (LEP2920) donde tanto la carga como la columna se colocaron en una cabina térmica a 35 °C resultó en una reducción del 50 % en la contaminación de ADN residual (735 pg/mL en comparación con 1492 pg/mL) y una reducción del 24 % en la proteína de la célula huésped 118 ng/mL en comparación con 156 ng/mL.
Ejemplo 2.
El propósito de este ejemplo fue establecer una configuración con dilución en línea de los tampones concentrados, en este caso con 10 veces la concentración del tampón original de acuerdo con la presente invención.
Las pruebas descritas en este ejemplo examinarán la preparación de los tampones concentrados y la comparación después de la dilución con el tampón original descrito en la Tabla 2.
Tabla 2: Configuración de la prueba para la preparación de los tampones concentrados.
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Tabla 3: Condiciones de prueba de los experimentos para los tampones concentrados
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Prueba de los tampones concentrados
Se prepararon tres tampones concentrados, que son fundamentales para la cromatografía, a 10 veces la concentración del tampón normal. Estos fueron los tampones B10, E10 y F10 (ver la Tabla 4 anterior) usados para la columna CIP, equilibrado y elución respectivamente. El procedimiento específico para el desarrollo de los tampones concentrados incluye:
1. Prepare el tampón original por triplicado
Mida por triplicado el pH, la conductividad y, si es relevante, otro parámetro relevante del tampón
2. Preparar el tampón concentrado
Mida el pH, la conductividad y, si es relevante, otro parámetro relevante del tampón concentrado
3. Diluir el tampón concentrado a la concentración original
Mida el pH, la conductividad y, si es relevante, otro parámetro relevante del tampón diluido
4. Compare el tampón original y diluido y determine la compensación del pH
5. Determine la compensación del pH en el tampón concentrado
6. Prepare el tampón concentrado después del ajuste para la compensación
7. Repita el punto 3. Si el pH está dentro de los criterios de aceptación, se aprueba el tampón concentrado.
De lo contrario, repita los etapas 4 a 6.
El valor del pH del tampón original es el punto de ajuste para el tampón, que se prepara en base a un tampón concentrado. El criterio de éxito para la preparación de un tampón concentrado es que el valor del pH de este tampón después de la dilución tenga el mismo valor del pH que el tampón original ± 0,2. La conductividad se usa como control de una composición correcta de los componentes del tampón, lo cual es probable cuando la conductividad está dentro del intervalo en comparación con el tampón original.
El pH del tampón concentrado se corrige si es necesario al medir la compensación en un tampón diluido y la cantidad de ácido o base usada para ajustar el pH al punto de ajuste del tampón diluido. Se añadió la misma cantidad de ácido o base usada para ajustar 1 L del tampón diluido a 100 mL del tampón concentrado. De este modo, se determinó el pH correcto del tampón concentrado y se estableció una composición del tampón que dio como resultado este valor del pH mediante el uso de una herramienta estándar del tampón.
Pruebas.
Se prepararon los tampones concentrados, a 10 veces la concentración del tampón normal para los tampones mostrados en la Tabla 7.
Tabla 7: Tampones usados como modelos para la preparación de los tampones concentrados.
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Mediante el uso del procedimiento específico para el desarrollo de los tampones concentrados discutido anteriormente, se determinó el pH de compensación de los tampones diluidos, basado en un tampón concentrado 10 veces. Los datos para la preparación de un tampón E concentrado 10 veces (tampón E10) se muestran más abajo.
1. Se prepara fosfato de sodio a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,0 tres veces, se mide el pH a 7,02; 7,03 y 7,08 respectivamente con un promedio de 7,04. La conductividad se mide a 17,41; 17,56 y 17,58 respectivamente con un promedio de 17,52 mS/cm
2. Fosfato de sodio a 200 mM, NaCl a 1,5 M, pH 7,0
Mida el pH, la conductividad y, si es relevante, otro parámetro relevante del tampón concentrado
3. Diluir el tampón concentrado a la concentración original
Mida el pH, la conductividad y, si es relevante, otro parámetro relevante del tampón diluido
4. Compare el tampón original y diluido y determine la compensación del pH
5. Determine la compensación del pH en el tampón concentrado
6. Prepare el tampón concentrado después del ajuste para la compensación
7. Repita el punto 3. Si el pH está dentro de los criterios de aceptación, se aprueba el tampón concentrado.
De lo contrario, repita los etapas 4 a 6.
El valor del pH del tampón E10 es 6,14, lo que da como resultado un valor del pH después de la dilución a 6,83 con un punto de ajuste de 7,00. Esta diferencia en el pH entre el tampón diluido y el tampón original está en el límite de los criterios de aceptación, razón por la cual se inició un ajuste del tampón concentrado. Mediante el uso del procedimiento específico para el desarrollo de los tampones concentrados discutido anteriormente, se corrigió el tampón E10 lo que resulta en los datos mostrados más abajo.
La preparación y el ajuste de los tampones B10 y F10 se llevaron a cabo siguiendo los mismos principios (resultados no mostrados).
El valor del pH del tampón F10 fue 2,84 lo que resulta en un valor del pH después de la dilución a 3,25 que tiene un punto de ajuste en 3,40. Esta diferencia en el pH entre el tampón diluido y el tampón original estaba en el límite de los criterios de aceptación, razón por la cual se inició un ajuste del tampón concentrado. Mediante el uso del procedimiento específico para el desarrollo de los tampones concentrados discutido anteriormente, se corrigió el tampón F10 lo que resulta en un valor del pH después de la dilución a 3,49, que está muy cerca del punto de ajuste en 3,40.
La conductividad del tampón B10 fue de 187,2 mS/cm lo que resulta en una conductividad después de la dilución a 22,9 mS/cm. No se estableció ningún punto de ajuste, pero la conductividad del tampón original fue de 22,13 mS/cm y, en consecuencia, la diferencia de la conductividad entre el tampón diluido y el tampón original fue muy pequeña y no se llevó a cabo ningún ajuste.
Conclusión
Se estableció un modelo para preparar los tampones concentrados 10 veces para permitir que una dilución de 10 veces alcanzara el pH y la conductividad del tampón original. Se obtuvo el procedimiento para el ajuste del pH de los tampones concentrados, lo que resulta en los tampones diluidos dentro de los criterios de aceptación y muy cerca del punto de ajuste de los tampones originales.
No se observó ningún problema de solubilidad o precipitación durante la preparación y almacenamiento de los tampones concentrados a la temperatura ambiente.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    Una disposición del biorreactor para producir un biopolímero expresado por una célula, en donde la disposición del biorreactor comprende un sistema del biorreactor y un sistema de cromatografía en donde el sistema del biorreactor comprende:
    un recipiente del cultivo celular (50) para contener un medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho en donde el recipiente del cultivo celular (50) comprende un módulo de recolección del producto (51), en donde el módulo de recolección del producto (51) tiene una salida (16) y en donde el sistema de cromatografía comprende:
    una primera unidad de cromatografía (2) y una segunda unidad de cromatografía (3) que comprenden el material que tiene afinidad por el biopolímero, en donde la primera unidad de cromatografía (2) tiene una entrada (12) y una salida (13) y la segunda unidad de cromatografía (3) tiene una entrada (14) y una salida (15), en donde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde un primer medio de válvula (31) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un segundo medio de válvula (32) se ubica entre la salida (16) del módulo de recolección del producto y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3),
    en donde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y un tercer medio de válvula (33) se ubica entre la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un cuarto medio de válvula (34) se ubica entre la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde el sistema de cromatografía se mantiene a una temperatura de 28-38 °C para potenciar la eliminación del ADN residual o de la proteína de la célula huésped o de ambos.
    La disposición del biorreactor de la reivindicación 1, en donde el sistema del biorreactor comprende además un contenedor del medio (53) en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50).
    La disposición del biorreactor de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema del biorreactor comprende además un suministro de agua y/o tampón (55) en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50).
    La disposición del biorreactor de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema del biorreactor comprende además un sistema de dilución del medio en línea (56) para diluir el medio concentrado del contenedor del medio (53), el sistema de dilución del medio en línea una entrada tiene (57) y una salida (58), en donde la entrada (57) está en conexión fluida con el contenedor del medio (53) y la entrada (57) está en conexión fluida con el suministro de agua/tampón (55) y en donde la salida (58) del sistema de dilución del medio en línea (56) está en conexión fluida con el recipiente del cultivo celular (50).
    La disposición del biorreactor de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema de cromatografía comprende además,
    un contenedor del tampón de lavado (4), que tiene una salida (21),
    un contenedor del tampón de elución (5), que tiene una salida (22),
    opcionalmente un contenedor del tampón de limpieza (6), que tiene una salida (23)
    opcionalmente un contenedor del tampón de equilibrado (7), que tiene una salida (24),
    en donde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde un duodécimo medio de válvula (40b) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y en donde un decimotercer medio de válvula (41b) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía 3), en donde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde un duodécimo medio de válvula (40b) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de elución (5) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y en donde un decimotercer medio de válvula (41b) se ubica entre la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía 3), opcionalmente, en donde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde un duodécimo medio de válvula (40b) se ubica entre la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), en donde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y en donde un decimotercer medio de válvula (41b) se ubica entre la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía 3), opcionalmente, en donde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en donde un duodécimo medio de válvula (40b) se ubica entre la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía
  2. (2), en donde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) está en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y en donde un decimotercer medio de válvula (41b) se ubica entre la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía
  3. (3).
    La disposición del biorreactor de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema de cromatografía comprende además,
    un contenedor del tampón de lavado (4), que tiene una salida (21),
    un contenedor del tampón de elución (5), que tiene una salida (22),
    opcionalmente un contenedor del tampón de limpieza (6), que tiene una salida (23)
    opcionalmente un contenedor del tampón de equilibrado (7), que tiene una salida (24),
    un suministro de agua (8), que tiene una salida (25) y un sistema de dilución del tampón en línea (9) que tiene una entrada (26a) y una salida (27), en donde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un quinto medio de válvula (35) se ubica entre la salida (21) del contenedor del tampón de lavado
  4. (4) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un sexto medio de válvula (36) se ubica entre la salida (22) del contenedor del tampón de elución
  5. (5) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), opcionalmente, en donde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un séptimo medio de válvula (37) se ubica entre la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza
  6. (6) y la entrada (26a) del sistema dilución del tampón en línea (9), opcionalmente, en donde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un octavo medio de válvula (38) se ubica entre la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado
  7. (7) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la salida (25) del suministro de agua (8) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) o está en conexión fluida con una entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un noveno medio de válvula (39) se ubica entre la salida (25) del suministro de agua
  8. (8) y la entrada (26a) o la entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9); y
    en donde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde un décimo medio de válvula (40) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un undécimo medio de válvula (41) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3).
    Un método para producir un biopolímero en una disposición del biorreactor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, el método comprende:
    (a) fermentar las células que expresan el biopolímero en un medio adecuado en condiciones adecuadas hasta que se alcanza un nivel predeterminado de las células y/o biopolímero en el recipiente del cultivo celular (50),
    (b) recolectar el biopolímero al eliminar el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través del módulo de recolección del producto (51) y
    (c) conducir el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través de la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) en donde el biopolímero se captura en la primera unidad cromatografía (2) y el medio y los productos de desecho continúan a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta que se alcanza un primer nivel predeterminado de la capacidad de unión en la primera unidad de cromatografía (2), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el segundo medio de válvula (32) y en donde la conexión fluida desde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el tercer medio de válvula (33),
    (d) cuando se alcanza el primer nivel predeterminado de la capacidad de unión, conducir el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través de la conexión fluida desde la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la segunda unidad de cromatografía (3) para un ajuste específico para que el biopolímero no capturado por la primera unidad de cromatografía (2) se capture en la segunda unidad de cromatografía (3) y el medio y los productos de desecho continúen a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un segundo nivel predeterminado de la capacidad de unión en la primera unidad de cromatografía (2) y/o (3), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el segundo medio de válvula (32),
    (e) cuando se alcanza el segundo nivel predeterminado de la capacidad de unión, conducir el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través de la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) en donde el biopolímero se captura en la segunda unidad de cromatografía (3) y el medio y los productos de desecho continúan a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un tercer nivel predeterminado de la capacidad de unión en la segunda unidad de cromatografía (3), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el primer medio de válvula (31) y en donde la conexión fluida desde la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el cuarto medio de válvula (34),
    en donde durante o después de la etapa e)
    (i) lavar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de lavado a través de la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un primer nivel de lavado predeterminado,
    (ii) cuando se alcanza el primer nivel predeterminado de lavado, eluir el biopolímero de la primera unidad de cromatografía (2) al conducir el tampón de elución a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un primer nivel predeterminado de elución y recoger el eluido, (f) cuando se alcanza el tercer nivel predeterminado de la capacidad de unión, conducir el medio a través de la conexión fluida desde la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la primera unidad de cromatografía (2) para un ajuste específico para que el biopolímero no capturado por la segunda unidad de cromatografía (3) se capture en la primera unidad de cromatografía (2) y el medio y los productos de desecho continúan a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2) hasta que se alcanza un cuarto nivel predeterminado de la capacidad de unión en la unidad de cromatografía (2) y/o (3), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el primer medio de válvula (31),
    (g) cuando se alcanza el cuarto nivel predeterminado de la capacidad de unión, conducir el medio que comprende el biopolímero y los productos de desecho a través de la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) en donde el biopolímero se captura en la primera unidad de cromatografía (2) y el medio y los productos de desecho continúan a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un quinto nivel predeterminado de la capacidad de unión en la primera unidad de cromatografía (2), en donde la conexión fluida desde la salida (16) del módulo de recolección del producto (51) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el segundo medio de válvula (32),
    en donde durante o después de la etapa g)
    (iii) lavar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada del tampón de lavado al conducir el tampón de lavado a través de la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un segundo nivel de lavado predeterminado,
    (iv) cuando se alcanza el segundo nivel predeterminado de lavado, eluir el biopolímero de la segunda unidad de cromatografía (3) al conducir el tampón de elución a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un segundo nivel predeterminado de elución y recoger el eluido, (h) opcionalmente, repetir la etapa (c) a (g) y opcionalmente, purificar el biopolímero del eluido o los eluidos recogidos.
    El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la disposición del biorreactor comprende además, un contenedor del medio (53),
    un suministro de agua y/o tampón (55),
    un sistema de dilución del medio en línea (56) para diluir el medio concentrado del contenedor del medio, el sistema de dilución del medio en línea tiene una entrada (57) y una salida (58), en donde la entrada está en conexión fluida con el contenedor del medio (53) y el suministro de agua/tampón (55) y en donde la salida (58) está en conexión fluida con el recipiente del cultivo (50),
    en donde durante la fermentación, el método comprende además:
    añadir el medio concentrado del contenedor del medio (53) y agua o tampón del suministro de agua/tampón (55) a una entrada (57) del sistema de dilución de medio en línea (56) para dar como resultado el medio diluido y alimentar el medio diluido que contiene los nutrientes al recipiente del cultivo (50) a través de una salida (58) para reponer los nutrientes consumidos por las células y compensar el medio eliminado para la recolección del biopolímero.
  9. 9. El método de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en donde el biopolímero se produce mediante un proceso continuo, es decir, en un proceso de quimiostato o en un proceso de perfusión.
  10. 10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde la densidad celular en el recipiente del cultivo celular durante la fermentación alcanza al menos 10 millones de células por mL de medio, por ejemplo, al menos 20 millones de células por mL de medio, tal como al menos 30 millones células por mL de medio, tal como al menos 40 millones de células por mL de medio.
  11. 11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en donde el biopolímero es un polipéptido o proteína o una proteína recombinante, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, donde un fragmento puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fv o un fragmento Fv de simple cadena (scFv), un factor de coagulación de la sangre, una citocina, una enzima o una hormona peptídica.
  12. 12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en donde después de la etapa (ii);
    (iib) limpiar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un tercer nivel de limpieza predeterminado y, en donde después de la etapa (iv);
    (ivb) limpiar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un cuarto nivel de limpieza predeterminado.
  13. 13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en donde el sistema de cromatografía comprende además
    un suministro de agua (8) que tiene una salida (25) y un sistema de dilución del tampón en línea (9) que tiene una entrada (26a) y una salida (27), en donde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un quinto medio de válvula (35) se ubica entre el salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un sexto medio de válvula (36) se ubica entre la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), opcionalmente, en donde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un séptimo medio de válvula (37) se ubica entre la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), opcionalmente, en donde la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un octavo medio de válvula (38) se ubica entre la salida (24) del contenedor del tampón de equilibrado (7) y la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la salida (25) del suministro de agua (8) está en conexión fluida con la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) o está en conexión fluida con una entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y en donde un noveno medio de válvula (39) se ubica entre la salida (25) del suministro de agua (8) y la entrada (26a) o la entrada separada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y
    en donde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) está en conexión fluida con la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y en conexión fluida con la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde un décimo medio de válvula (40) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) y un undécimo medio de válvula (41) se ubica entre la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), en donde durante o después de la etapa e),
    (i) lavar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de lavado concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y conducir el tampón de lavado diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un tercer nivel de lavado predeterminado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el undécimo medio de válvula (41),
    (ii) cuando se alcanza el tercer nivel predeterminado de lavado, eluir el biopolímero de la primera unidad de cromatografía (2) al conducir:
    (a1) el tampón de elución concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) o alternativamente al conducir:
    (a2) un tampón de elución listo para la solución de trabajo a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y, en donde cuando se usa el tampón de elución listo para la solución de trabajo, la conexión fluida desde la salida (25) del suministro de agua (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el noveno medio de válvula (39) y conducir el tampón de elución listo para la solución de trabajo la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que alcanza un tercer nivel predeterminado de elución y la recolección del eluido, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el undécimo medio de válvula (41) y en donde durante o después de la etapa g)
    (iii) lavar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de lavado concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y conducir el tampón de lavado diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un cuarto nivel de lavado predeterminado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el décimo medio de válvula (40),
    (iv) cuando se alcanza el cuarto nivel predeterminado de lavado, eluir el biopolímero de la segunda unidad de cromatografía (3) al conducir:
    (b1) el tampón de elución concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) o alternativamente al conducir:
    (b2) un tampón de elución listo para la solución de trabajo a través de la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9), en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y, en donde cuando se usa el tampón de elución listo para la solución de trabajo, la conexión fluida desde la salida (25) del suministro de agua (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el noveno medio de válvula (39) y conducir el tampón de elución diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un cuarto nivel predeterminado de elución y recoger el eluido, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el décimo medio de válvula (40).
  14. 14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-13, en donde después de la etapa (ii); (iib) limpiar la primera unidad de cromatografía (2) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y conducir el tampón de limpieza diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la salida (13) de la primera unidad de cromatografía (2), a través de la primera unidad de cromatografía (2) y a través de la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2), hasta que se alcanza un séptimo nivel de limpieza predeterminado, en donde la conexión fluida desde la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) hasta la entrada (12) de la primera unidad de cromatografía (2) se cierra por el décimo medio de válvula (40) y, en donde después de la etapa (iv);
    (ivb) limpiar la segunda unidad de cromatografía (3) con una concentración especificada de agua y tampón al conducir el tampón de limpieza concentrado a través de la conexión fluida desde la salida (23) del contenedor del tampón de limpieza (6) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) y al conducir el agua desde el suministro (8) a través de la conexión fluida desde la salida (25) del agua desde el suministro (8) hasta la entrada (26a) o la entrada (26b) del sistema de dilución del tampón en línea (9) en donde la conexión fluida desde la salida (21) del contenedor del tampón de lavado (4) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el quinto medio de válvula (35) y en donde la conexión fluida desde la salida (22) del contenedor del tampón de elución (5) hasta la entrada (26a) del sistema de dilución del tampón en línea (9) se cierra por el sexto medio de válvula (36) y conducir el tampón de limpieza diluido a través de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la salida (15) de la segunda unidad de cromatografía (3), a través de la segunda unidad de cromatografía (3) y a través de la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3), hasta que se alcanza un octavo nivel de limpieza predeterminado, en donde la conexión fluida de la salida (27) del sistema de dilución del tampón en línea (9) a la entrada (14) de la segunda unidad de cromatografía (3) se cierra por el undécimo medio de válvula (41).
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