ES2862405T3 - Inhibidores de glutaminil ciclasas bacterianas y uso de los mismos en el tratamiento de periodontitis - Google Patents

Abstract

Compuesto según la siguiente fórmula I, **(Ver fórmula)** sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el compuesto es un inhibidor de glutaminil ciclasa de tipo II bacteriana; en la que L se selecciona del grupo que consiste en un enlace sencillo, -CR5(R6)-, -CR5(R6)-CR7(R8)- y -C(R5)=C(R6)-; en el que R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OH, alquilo opcionalmente sustituido y heteroalquilo opcionalmente sustituido; en el que, dentro de cada par de grupos R3/R4, R5/R6 y R7/R8, los dos grupos pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico, u opcionalmente pueden representar =O, en el que: (i) cada uno de R1 y R2 es H; cada uno de R3 y R4 es H, o R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-6 opcionalmente sustituido y heteroalquilo C1-6 opcionalmente sustituido; y Ar se selecciona del grupo que consiste en arilo, alcoxiarilo opcionalmente sustituido, carboxiarilo opcionalmente sustituido, cianoarilo opcionalmente sustituido, haloarilo, hidroxiarilo opcionalmente sustituido, alcoxiheteroarilo opcionalmente sustituido, cianoheteroarilo opcionalmente sustituido, haloheteroarilo opcionalmente sustituido, heteroarilarilo opcionalmente sustituido, hidroxiheteroarilo opcionalmente sustituido y carboxiheteroarilo opcionalmente sustituido; o (ii) R1 y R2 representan juntos =O; y Ar es arilo opcionalmente sustituido seleccionado del grupo que consiste en carboxiarilo, cianoarilo, hidroxiarilo, heteroarilarilo, 2,3-diclorofenilo, 2,3-dihidro-1,4- benzodioxin-6-ilo, 3-cloro-5-metoxifenilo, 3,4,5-trifluorofenilo, 3,5-diclorofenilo, 4-(benciloxi)fenilo, 4-[2-(morfolin-4-il)etoxi]fen-1-ilo, 4-butoxifenilo, 4-fluoro-3-metoxifenilo y naftalen-2-ilo, o es heteroarilo opcionalmente sustituido seleccionado del grupo que consiste en alcoxiheteroarilo, cianoheteroarilo, haloheteroarilo, hidroxiheteroarilo y carboxiheteroarilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de glutaminil ciclasas bacterianas y uso de los mismos en el tratamiento de periodontitis

Campo de la invención

La presente invención se refiere a inhibidores de glutaminil ciclasas bacterianas, a composiciones farmacéuticas que comprenden tales inhibidores y a tales inhibidores/composiciones para su uso en métodos de tratamiento mediante terapia, métodos para la terapia y/o profilaxis de infecciones bacterianas y en métodos para el tratamiento de periodontitis y estados relacionados.

Técnica anterior

Las periodontopatías son altamente prevalentes, viéndose afectada aproximadamente el 30% de la población humana en todo el mundo, tienen un impacto considerable sobre los individuos y la sociedad y son costosas de tratar. El coste del cuidado dental es el cuarto más alto de todas las enfermedades y consume entre el 5 y el 10% de todos los recursos sanitarios (Batchelor, P. British Dental Journal 2014, 217, 405-409). Estudios poblacionales representativos muestran que las periodontopatías están muy extendidas y su prevalencia ha ido aumentando desde 1997 (Micheelis, W. et al. Vierte Deutsche Mundgesundheitsstudie (DMS IV), Deutscher Árzte-Verlag, Colonia, 2006). Entre la población adulta en Alemania, se encontró que el 52,7% estaban afectados por formas de periodontitis moderadamente graves y el 20,5% por formas graves. El gasto de seguros médicos en Alemania para el tratamiento directo de periodontitis representa aproximadamente 1.100 millones de euros (Statistisches Bundesamt, 2008), sin incluir los costes incurridos por enfermedades secundarias.

La periodontitis es un término general que describe el estado de inflamación del aparato periodóncico que está provocado por inducción multibacteriana y tiene fuertes relaciones con diversas enfermedades sistémicas, tales como enfermedades cardiovasculares, artritis reumatoide, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad de Alzheimer.

La terapia de periodontitis establecida en la actualidad, según las recomendaciones de la Sociedad Alemana de Ciencias Odontológicas, Orales y Craneomandibulares, se realiza generalmente mediante desbridamiento supragingival y subgingival manual (retirada de las placas bacterianas) junto con la aplicación de sustancias antisépticas (desinfección diaria mediante colutorios), que disgrega toda la biopelícula oral y proporciona una oportunidad para la recolonización por potenciales patógenos. Además, se aplica terapia sistémica adyuvante con antibióticos de amplio espectro en formas avanzadas de la enfermedad. Esto último también conduce a una destrucción no selectiva de la biopelícula y debe administrarse en altas dosis y a lo largo de un periodo de tiempo prolongado con el fin de alcanzar niveles terapéuticos suficientes en el sitio de acción particular, es decir, la bolsa gingival. La terapia adyuvante convencional de la periodontitis implica, por ejemplo, la administración sistémica de doxiciclina (por vía oral) 1 x 200 mg/día durante 1 día y 2 x 100 mg/día durante 18 días adicionales (Wissenschaftliche Stellungnahme: Adjuvante Antibiotika in der Parodontitistherapie, Deutsche Gesellschaft für Zahn-Mund- und Kieferheilkunde, DZZ 2003). Como resultado, se observa el desarrollo de resistencia en los patógenos orales. Además, se destruye el microbioma en el intestino del paciente, lo que conduce a una pérdida de apoyo metabólico, modulación inmunitaria y permite la recolonización por potenciales patógenos.

La presencia de bacterias periodontopatógenas varía entre pacientes con periodontitis. No obstante, se ha encontrado que la aparición de determinadas especies bacterianas en las placas subgingivales está estrechamente asociada con la etiología de las periodontopatías (Socransky et al., Journal of Clinical Periodontology, 1998, 25, 134-144).

Por tanto, existe una alta demanda para el desarrollo de un nuevo tratamiento para la periodontitis y estados relacionados que sea capaz de seleccionar como diana patógenos que inducen una periodontopatía, a la vez que, preferiblemente, conserva sustancialmente la parte restante de la biopelícula que se produce de manera natural. Tal tratamiento proporcionaría una mejora significativa a los pacientes y a los sistemas sanitarios.

El documento WO0063208A1 describe una clase de compuestos de imidazol sustituidos, composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos y el uso de las mismas en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades y trastornos relacionados con el receptor de histamina H3. El documento WO2014152604A1 se refiere a compuestos adecuados como moduladores de P2X7. El documento WO2013070657A1 se refiere a moduladores del receptor Mas acoplado a proteínas G y al tratamiento de trastornos relacionados con el mismo. El documento WO2009073534A2 describe compuestos adecuados como inhibidores de PPAT (fosfopanteteína adenil transferasa), y son útiles en el tratamiento y la prevención de enfermedades provocadas por bacterias, particularmente bacterias dependientes de PPAT. El documento WO2013184202A1 describe compuestos de benzatina y relacionados y su uso como inhibidores de FBXO-3. Los compuestos con n.os de registro de la base de datos 1787475-02-8, 1791318-99-4, 1790653-72-3, 1359598-40-5, 1358191-18-0, 1358167-90-4, 1790883-82-7, 1790477-24-5, 1359578-66-7, 1791114­ 23-2, 1357979-51-1, 1357753-89-9, 1791319-49-7, 1791319-43-1, 1359599-75-9, 1358196-83-4 se encuentran en la base de datos de registro CAS/STN.

Problemas que van a resolverse mediante la invención

En vista de lo anterior, la presente divulgación tiene como objeto la identificación, la purificación y el aislamiento de una nueva proteína diana terapéutica que puede usarse para identificar inhibidores capaces de seleccionar como diana patógenos que inducen una periodontopatía; o proporcionar un anticuerpo que reconoce dicha proteína diana terapéutica; o proporcionar un método para identificar un inhibidor de dicha proteína diana terapéutica.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un inhibidor de dicha proteína diana terapéutica y una composición farmacéutica que comprende tal inhibidor. Dicho inhibidor debe ser preferiblemente un inhibidor selectivo, es decir, que destruye selectivamente o inhibe selectivamente el crecimiento de un(os) patógeno(s) bacteriano(s) diana a la vez que es sustancialmente inactivo frente a otras dianas de proteínas bacterianas y/o humanas.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un compuesto o una composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un compuesto o una composición farmacéutica para su uso en un método para la terapia o profilaxis de una infección bacteriana y/o, preferiblemente, destruyendo selectivamente o inhibiendo selectivamente el crecimiento de las especies bacterianas patógenas.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un compuesto o una composición farmacéutica para su uso en un método para la terapia o profilaxis de una periodontopatía aguda, crónica o recurrente.

En los métodos para el tratamiento según los objetos anteriores, la vía de administración debe ser preferiblemente administración tópica o administración sistémica, y los métodos son preferiblemente métodos no quirúrgicos.

Sumario de la invención

Como una solución a los problemas formulados anteriormente, en el presente documento se divulga una glutaminil ciclasa bacteriana (bacQC), en la que la bacQC es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, s Eq Id NO: 2, SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o más con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

Además, en el presente documento se divulga un método para identificar un inhibidor de la bacQC tal como se definió anteriormente, comprendiendo el método:

(a) proporcionar una composición que comprende un sustrato de la bacQC y la bacQC;

(b) proporcionar un compuesto candidato;

(c) poner en contacto el compuesto candidato con la composición;

(d) monitorizar la actividad catalítica de la bacQC;

(e) clasificar el compuesto candidato como un inhibidor de la bacQC basándose en el efecto del compuesto candidato sobre la actividad catalítica de la bacQC, en el que un compuesto candidato que reduce la actividad catalítica de la bacQC se clasifica como un inhibidor de bacQC.

La presente invención proporciona además un compuesto según la siguiente fórmula I,

sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

en el que Ar, L, R1, R2, R3 y R4 se definen según las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el compuesto tal como se definió anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona además un inhibidor de bacQC, es decir, un compuesto identificado mediante el método anterior para identificar un inhibidor de la bacQC y/o un compuesto según la fórmula I, y/o una composición farmacéutica tal como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal; para su uso en un método para la terapia y/o profilaxis de una infección bacteriana; y para su uso en un método para la terapia y/o profilaxis de una periodontopatía aguda, crónica o recurrente.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de QC humana (hQC, SEQ ID NO: 4) y supuesta QC bacteriana de P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (A) y una alineación de secuencias de aminoácidos de supuestas QC adicionales de P. intermedia (PiQC, SEQ ID n O: 2) y T. forsythia (TfQC, SEQ ID NO: 3)) y P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (B).

La figura 2 muestra un SDS-PAGE de supuestas QC bacterianas recombinantes purificadas expresadas en E. coli Rosetta(DE3)pLysS.

La figura 3 muestra gráficos de Lineweaver-Burk para la ciclización catalizada por PgQC (A), PiQC (B) y TfQC (C) de H-Gln-AMC.

La figura 4 muestra gráficos de características v/S, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee a modo de ejemplo para la ciclización catalizada por PgQC de H-Gln-AMC en presencia del compuesto MWT-S-00431.

La figura 5 muestra la dependencia del pH de la actividad de PgQC (A), actividad de PiQC (B) y actividad de TfQC (C).

La figura 6 muestra la influencia de la fuerza iónica sobre la actividad de QC bacterianas.

La figura 7 muestra la inhibición de la actividad de QC bacterianas por diferentes quelantes metálicos: EDTA (A), ácido dipicolínico (B) y 1,10-fenantrolina (C).

La figura 8 muestra espectros de UV de QC bacterianas recombinantes.

La figura 9 muestra un análisis espectroscópico mediante DC de QC bacterianas recombinantes.

La figura 10 muestra la estabilidad térmica de QC bacterianas recombinantes: PgQC (A), PiQC (B) y TfQC (C). La figura 11 muestra la actividad PhoA en células pGP1-2 de E. coli CC118 permeabilizadas que expresan proteínas de fusión ^segPgQC-'PhoA.

La figura 12 muestra la especificidad de antisuero policlonal contra (A) PgQC y (B) TfQC y PiQC.

Descripción detallada de la invención

Socransky et al. (Journal of Clinical Periodontology, 1998, 25 134-144) describieron que la aparición en las placas subgingivales del denominado “complejo rojo”, que consiste en el grupo estrechamente relacionado Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis y Treponema denticola, se relaciona fuertemente con mediciones clínicas de periodontopatía y, en particular, con la profundidad de la bolsa y hemorragia al sondaje.

Un complejo relacionado adicional (el denominado “complejo naranja”) incluye miembros de Fusobacterium subespecies nucleatum/periodonticum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens y Peptostreptococcus micros. Se encontró que la colonización de sitios periodóncicos sanos por miembros del “complejo naranja” se correlacionaba con la aparición de gingivitis. Además, las bacterias del “complejo naranja” fomentan la colonización por bacterias del “complejo rojo”, que a su vez están asociadas con bolsas profundas y periodontitis crónica.

Las bacterias del “complejo rojo” y del “complejo naranja” secretan una variedad de factores de virulencia. Por ejemplo, se encontró que P. gingivalis secreta cisteína proteasas tales como gingipaína, P. intermedia secreta proteasas IgA salivales y T. forsythia secreta glicosidasas.

Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que aproximadamente el 80% de las proteínas secretadas que portaban un péptido señal en el secretoma de los patógenos orales P. gingivalis, T. forsythia y P. intermedia se escinden en un enlace peptídico Xaa-Gln mediante una peptidasa señal. Los extremos N-terminales de las proteínas liberadas contienen un residuo pGlu. Esto implica la existencia de glutaminil ciclasas que parecen ser esenciales para la translocación de proteínas del crecimiento a través de la membrana externa y el crecimiento de dichos patógenos periodóncicos.

Las glutaminil ciclasas (QC) (EC 2.3.2.5) son aciltransferasas que catalizan la ciclización de residuos glutaminilo N-terminales de proteínas para dar piroglutamato (pGlu) bajo la liberación de NH3, modificando de ese modo el extremo N-terminal de los péptidos:

Hasta la fecha se han definido dos tipos de QC (tipo I y tipo II). Las QC de tipo I se encontraron en plantas y en varias bacterias patógenas y parásitos humanos (Huang et al., J. Mol. Biol. 2010, 401, 374-388). La QC de la papaya (pQC) es la QC de tipo I mejor conocida. Esta enzima se descubrió por primera vez en el látex de la planta tropical Carica papaya (Messer, M. Nature 1963, 197, 1299). La enzima muestra actividad catalítica a lo largo de un amplio intervalo de pH (pH 3,5-11). Los análisis cristalográficos mediante rayos X revelaron que la pQC es una molécula con forma de sombrerera, que consiste en un propulsor p de cinco laminas atravesado por un canal central (Wintjens, R., Belrhali, H., Clantin, B., Azarkan, M., Bompard, C., Baeyens-Volant, D., Looze, Y., y Villeret, V. J. Mol. Biol. 2006, 357, 457­ 470). La pQC contiene un ion de zinc pero que no se inhibe en absoluto por quelantes heterocíclicos (Zerhouni et al,. Biochim. Biophys. Acta 1998, 1387, 275-290) y, por tanto, se asume que el zinc sólo tiene una función estructural y estabilizante. La pQC es altamente resistente a las desnaturalizaciones proteolíticas, químicas y térmicas (Wintjens et al., Zerhouni et al.)

Las QC de tipo II se identificaron principalmente en los tejidos neuroendocrinos de mamíferos. Entre las QC de tipo II, la QC humana (hQC) es la más extensamente estudiada, que se sabe que es importante en la maduración de numerosos neuropéptidos y citocinas en sus rutas secretoras. A diferencia de las QC de tipo I, la hQC es bastante susceptible a la desnaturalización química y térmica. Schilling et al., 2003 (J. Biol. Chem. 2003, 278, 49773-49779) han demostrado que la hQC era significativamente inestable por encima de pH 8,5 y por debajo de pH 6,0. La hQC adopta una topología a/p (Huang et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 2005, 102, 13117-13122) y se identificó como una metaloenzima, tal como se sugiere por la inhibición dependiente del tiempo por los quelantes heterocíclicos. La enzima inactivada puede restaurarse por completo mediante la adición de Zn2+ en presencia de concentraciones equimolares de EDTA (Schilling et al., 2003). Por tanto, las QC de tipo II son transferasas dependientes de metal, lo que sugiere que el metal unido al sitio activo (Zn2+) es esencial para la actividad catalítica, a diferencia de las QC de tipo I, en las que el zinc sólo tiene una función estructural y estabilizante.

En resumen, las QC de tipo I se encuentran generalmente en plantas, varias bacterias y protozoos; muestran estructuras de propulsor P; alta resistencia contra la proteólisis, el calor y el ácido; la actividad catalítica óptima es a pH 3,5-11; y poseen un ion Ca2+/Zn2+ estructural.

En cambio, las QC de tipo II se encuentran principalmente en vertebrados; muestran topologías a/p; baja resistencia contra la proteólisis, el calor y el ácido; la actividad catalítica óptima es a pH 6,0-8,0; y hay un ion Zn2+ catalíticamente esencial. Por tanto, las glutaminil ciclasas de tipo II son aciltransferasas dependientes de zinc.

Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que las QC de tipo II (en lo siguiente: “bacQC”) se expresan en los patógenos orales P. gingivalis, T. forsythia y P. intermedia.

La estructura primaria de la proteína QC de P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) tiene una identidad del 25% con respecto a la Qc humana (hQC, SEQ ID NO: 4). Además, se identificaron las QC de P. intermedia (PiQC, SEQ ID NO: 2) y de T. forsythia (TfQC, SEQ ID NO: 3), que comparten una identidad con respecto a PgQC del 42% y el 49%, respectivamente. Evidencias experimentales adicionales muestran que estas enzimas, de hecho, pertenecen a la familia de QC de tipo II, tal como se confirma, entre otros, por la dependencia del pH y de la fuerza iónica de la actividad de bacQC (ejemplo 4), la inhibición de la actividad de QC mediante quelantes metálicos (ejemplo 5), los patrones de plegamiento de las tres proteínas que sugieren una topología a/p tal como se indica por el análisis espectroscópico mediante DC (ejemplo 6) y su estabilidad térmica (ejemplo 7).

Los presentes inventores encontraron que las bacQC se expresan en y son esenciales para el crecimiento de 2 de las 3 especies bacterianas que provocan periodontitis del “complejo rojo”, así como al menos una especie bacteriana del “complejo naranja” y, por tanto, son de crucial importancia como diana para el desarrollo de un inhibidor terapéutico con propiedades antibióticas para el tratamiento de enfermedades y estados de periodontitis.

Proteínas diana terapéuticas (bacQC)

En el presente documento se divulga una glutaminil ciclasa bacteriana (bacQC), en la que la bacQC es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o más con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Las bacQC divulgadas en el presente documento pueden identificarse, aislarse y purificarse tal como se describe en el ejemplo 1, y pueden usarse para identificar inhibidores capaces de seleccionar como diana selectivamente patógenos que inducen periodontitis tal como se describe adicionalmente en los ejemplos 2 y 3.

Con el fin de comparar dos o más secuencias de aminoácidos, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (porcentaje de “identidad de secuencia”) puede determinarse mediante métodos convencionales, por ejemplo, por medio de algoritmos de alineamiento de secuencias convencionales conocidos en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo, BLAST (Altschul S.F. et al. J Mol Biol. 1990, 215(3), 403-10).

Anticuerpos

Además, en el presente documento se divulga un anticuerpo que reconoce una glutaminil ciclasa de tipo II bacteriana (bacQC). La bacQC reconocida por el anticuerpo divulgado en el presente documento es preferiblemente un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o más con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo puede mostrar alta afinidad y especificidad por PgQC (SEQ ID NO: 1) en comparación con una cualquiera de PiQC (Se Q ID NO: 2), TfQC (SEQ ID NO: 3) y/o hQC (SEQ ID NO: 4). El anticuerpo puede mostrar alta afinidad y especificidad por PgQC (SEQ ID NO: 1) en comparación con una cualquiera de PiQC (SEQ ID NO: 2), TfQC (SEQ iD NO: 3) y/o hQC (SEQ ID NO: 4).

El anticuerpo puede mostrar alta afinidad y especificidad por PiQC (SEQ ID NO: 2) en comparación con una cualquiera de PgQC (SEQ ID NO: 1), TfQC (SEQ ID NO: 3) y/o hQC (SEQ ID NO: 4).

El anticuerpo puede mostrar alta afinidad y especificidad por TfQC (SEQ ID NO: 3) en comparación con una cualquiera de PgQC (SEQ ID NO: 1), PiQC (SEQ ID NO: 2) y/o hQC (SEQ ID NO: 4).

El anticuerpo puede ser preferiblemente un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

Método para identificar un inhibidor

Además, en el presente documento se divulga un método para identificar un inhibidor de la bacQC, que comprende las siguientes etapas a)-e):

a) proporcionar una composición que comprende un sustrato de la bacQC y la bacQC;

b) proporcionar un compuesto candidato;

c) poner en contacto el compuesto candidato con la composición;

d) monitorizar la actividad catalítica de la bacQC;

e) clasificar el compuesto candidato como un inhibidor de la bacQC basándose en el efecto del compuesto candidato sobre la actividad catalítica de bacQC, en el que un compuesto candidato que reduce la actividad catalítica de la bacQC se clasifica como un inhibidor de bacQC.

Dicha composición puede ser una disolución acuosa, que comprende preferiblemente un tampón y/o componentes salinos adecuados. Dicho sustrato es preferiblemente un péptido o derivado de péptido que comprende un residuo de glutamina en su extremo N-terminal. Dicho sustrato está preferiblemente marcado, más preferiblemente marcado de manera isotópica, lo más preferiblemente es un sustrato fluorógeno. El sustrato fluorógeno experimenta preferiblemente un cambio en la intensidad de fluorescencia después de convertirse en el transcurso de una reacción catalizada por una bacQC.

Un sustrato fluorógeno adecuado para monitorizar la actividad de bacQC es H-Gln-AMC, tal como se describe en Schilling, S., Hoffmann, T., Wermann, M., Heiser, U., Wasternack, C., y Demuth, H.-U. Anal. Biochem. 2002, 303, 49­ 56 (Schilling et al., 2002):

bacQC pGAP

H-GIn-R------------ ► pGlu-R NH3 ------------ > pGlu Rf

R = 7-amino-4-metilcumarina pGAP = piroglutamil aminopeptidasa

El compuesto candidato puede ponerse en contacto antes de, simultáneamente con o después de la adición de los componentes restantes de la composición de la etapa a). El compuesto candidato se proporciona preferiblemente en disolución, más preferiblemente como una disolución en DMSO.

La conversión del sustrato se monitoriza a lo largo del tiempo, por ejemplo, monitorizando la emisión del fluoróforo generado mediante la escisión de un sustrato fluorógeno. La actividad de bacQC puede determinarse a partir de una curva estándar del AMC en las condiciones de ensayo.

La actividad catalítica de bacQC puede determinarse usando una concentración diferente de sustrato, bacQC y/o compuesto candidato. Las mediciones adecuadas para la actividad catalítica de bacQC son, por ejemplo, constantes de inhibición (Ki), actividad residual al 50% (AR) en presencia de una concentración dada de un compuesto candidato y/o valores de CI50.

Inhibidores de bacQC

La presente invención proporciona además un inhibidor de bacQC, que es un compuesto identificado mediante el método para identificar un inhibidor de la bacQC según la presente divulgación y/o un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

La expresión “alquilo”, tal como se usa en el presente documento, a menos que se limite específicamente, indica un grupo alquilo C1-12, de manera adecuada un grupo alquilo C1-8, por ejemplo, grupo alquilo C1-6, por ejemplo, grupo alquilo C1-4. Los grupos alquilo puede ser de cadena lineal o ramificados. Los grupos alquilo adecuados incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, propilo (por ejemplo, n-propilo e isopropilo), butilo (por ejemplo, n-butilo, iso-butilo sec-butilo y terc-butilo), pentilo (por ejemplo, n-pentilo), hexilo (por ejemplo, n-hexilo), heptilo (por ejemplo, n-heptilo) y octilo (por ejemplo, n-octilo). El término “alquilo” también comprende grupos cicloalquilo. La expresión “cicloalquilo”, a menos que se limite específicamente, indica un grupo cicloalquilo C3-10 (es decir, de 3 a 10 átomos de carbono de anillo), de manera más adecuada un grupo cicloalquilo C3-8, por ejemplo, un grupo cicloalquilo C3-6. Los grupos cicloalquilo a modo de ejemplo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. El número más adecuado de átomos de carbono de anillo es de tres a seis.

La expresión “heteroalquilo”, a menos que se limite específicamente, se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más átomos de carbono, preferiblemente 1, 2 ó 3, están reemplazados por heteroátomos seleccionados de N, S y O.

Las expresiones “carbociclilo” y “carbocíclico”, a menos que se limite específicamente, indican cualquier sistema de anillo en el que todos los átomos de anillo son carbono y que contiene entre tres y doce átomos de carbono de anillo, de manera adecuada entre tres y diez átomos de carbono y de manera más adecuada entre tres y ocho átomos de carbono. Los grupos carbociclilo pueden estar saturados o parcialmente insaturados, pero no incluyen anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos carbociclilo incluyen sistemas de anillo monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos, en particular sistemas de anillo monocíclicos y bicíclicos. Otros grupos carbociclilo incluyen sistemas de anillo en puente (por ejemplo, biciclo[2.2.1]heptenilo). Un ejemplo específico de un grupo carbociclilo es un grupo cicloalquilo. Un ejemplo adicional de un grupo carbociclilo es un grupo cicloalquenilo.

La expresión “arilo”, a menos que se limite específicamente, indica un grupo arilo C6-12, de manera adecuada un grupo arilo C6-10, de manera más adecuada un grupo arilo C6-8. Los grupos arilo contendrán al menos un anillo aromático (por ejemplo, uno, dos o tres anillos). Un ejemplo de un grupo arilo típico con un anillo aromático es fenilo. Un ejemplo de un grupo arilo típico con dos anillos aromáticos es naftilo.

Las expresiones “heterociclilo” y “heterocíclico”, a menos que se limite específicamente, se refieren a un grupo carbociclilo en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2 ó 3) átomos de anillo están reemplazados por heteroátomos seleccionados de N, S y O. Un ejemplo específico de un grupo heterociclilo es un grupo cicloalquilo (por ejemplo, ciclopentilo o más particularmente ciclohexilo) en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2 ó 3, particularmente 1 ó 2, especialmente 1) átomos de anillo están reemplazados por heteroátomos seleccionados de N, S u O. Los grupos heterociclilo a modo de ejemplo que contienen un heteroátomo incluyen pirrolidina, tetrahidrofurano y piperidina, y los grupos heterociclilo a modo de ejemplo que contienen dos heteroátomos incluyen morfolina y piperazina. Un ejemplo específico adicional de un grupo heterociclilo es un grupo cicloalquenilo (por ejemplo, un grupo ciclohexenilo) en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2 ó 3, particularmente 1 ó 2, especialmente 1) átomos de anillo están reemplazados por heteroátomos seleccionados de N, S y O. Un ejemplo de un grupo de este tipo es dihidropiranilo (por ejemplo, 3,4-dihidro-2H-piran-2-ilo).

La expresión “heteroarilo”, a menos que se limite específicamente, indica un residuo arilo, en el que uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4, de manera adecuada 1, 2 ó 3) átomos de anillo están reemplazados por heteroátomos seleccionados de N, S y O, o bien un anillo aromático de 5 miembros que contiene uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4, de manera adecuada 1, 2 ó 3) átomos de anillo seleccionados de N, S y O. Los grupos heteroarilo monocíclicos a modo de ejemplo que tienen un heteroátomo incluyen: anillos de cinco miembros (por ejemplo, pirrol, furano, tiofeno); y anillos de seis miembros (por ejemplo, piridina, tal como piridin-2-ilo, piridin-3-ilo y piridin-4-ilo). Los grupos heteroarilo monocíclicos a modo de ejemplo que tienen dos heteroátomos incluyen: anillos de cinco miembros (por ejemplo, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, imidazol, tal como imidazol-1-ilo, imidazol-2-ilo imidazol-4-ilo); anillos de seis miembros (por ejemplo, piridazina, pirimidina, pirazina). Los grupos heteroarilo monocíclicos a modo de ejemplo que tienen tres heteroátomos incluyen: 1,2,3-triazol y 1,2,4-triazol. Los grupos heteroarilo monocíclicos a modo de ejemplo que tienen cuatro heteroátomos incluyen tetrazol. Los grupos heteroarilo bicíclicos a modo de ejemplo incluyen: indol (por ejemplo, indol-6-ilo), benzofurano, benztiofeno, quinolina, isoquinolina, indazol, bencimidazol, benzotiazol, quinazolina y purina.

Las expresiones “alcoxiarilo”, “carboxiarilo”, “cianoarilo”, “haloarilo”, “hidroxiarilo” y “heteroarilarilo”, a menos que se limite específicamente, indican un residuo arilo que está sustituido por al menos un grupo alcoxilo, carboxilo, ciano, halo, hidroxilo y heteroarilo, respectivamente.

Las expresiones “alcoxiheteroarilo”, “carboxiheteroarilo”, “cianoheteroarilo”, “haloheteroarilo” e “hidroxiheteroarilo”, a menos que se limite específicamente, indican un residuo heteroarilo que está sustituido por al menos un grupo alcoxilo, carboxilo, ciano, halo e hidroxilo, respectivamente.

La expresión “alc/alq”, por ejemplo, en las expresiones “alcoxilo”, “haloalquilo”, debe interpretarse según la definición de “alquilo”. Los grupos alcoxilo a modo de ejemplo incluyen metoxilo, etoxilo, propoxilo (por ejemplo, n-propoxilo), butoxilo (por ejemplo, n-butoxilo), pentoxilo (por ejemplo, n-pentoxilo), hexoxilo (por ejemplo, n-hexoxilo), heptoxilo (por ejemplo, n-heptoxilo) y octoxilo (por ejemplo, n-octoxilo). Los grupos haloalquilo a modo de ejemplo incluyen fluoroalquilo, por ejemplo, CF3; los grupos haloalcoxilo a modo de ejemplo incluyen fluoroalquilo, por ejemplo, OCF3.

El término “halógeno” o “halo” comprende flúor (F), cloro (CI), bromo (Br) y yodo (I).

El término “opcionalmente sustituido” se refiere a una sustitución opcional por uno o varios grupos independientemente seleccionados de grupo alquilo C1-6, heteroalquilo C1-6, carbociclilo C1-6, heterociclilo C1-5 y heteroarilo C1-5, cada uno de los cuales puede estar sustituido por uno o varios átomos de halógeno y/o grupos hidroxilo; un átomo de halógeno, grupo ciano y grupo hidroxilo.

Estereoisómeros

Todos los posibles estereoisómeros de los compuestos reivindicados se incluyen en la presente invención.

Cuando los compuestos según esta invención tienen al menos un centro quiral, pueden existir, por consiguiente, como enantiómeros. Cuando los compuestos poseen dos o más centros quirales, pueden existir adicionalmente como diastereómeros. Debe entenderse que todos de tales isómeros y mezclas de los mismos están abarcados dentro del alcance de la presente invención.

Cuando los procedimientos para la preparación de los compuestos según la invención dan lugar a una mezcla de estereoisómeros, estos isómeros pueden separarse mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía preparativa. Los compuestos pueden prepararse en forma racémica, o pueden prepararse enantiómeros individuales o bien mediante síntesis enantioespecífica o bien mediante resolución. Los compuestos pueden resolverse, por ejemplo, en sus enantiómeros componentes mediante técnicas convencionales, tales como la formación de pares diastereoméricos mediante formación de sales con un ácido ópticamente activo, tal como ácido (-)-di-p-toluoil-dtartárico y/o ácido (+)-di-p-toluoil-l-tartárico seguido por cristalización fraccionada y regeneración de la base libre, o mediante formación de sales con una base ópticamente activa, tal como quinina, quinidina, quinotoxina, cincotoxina, (S)-feniletilamina, (1R,2S)-efedrina, (R)-fenilglicinol, (S)-2-aminobutanol, seguido por cristalización fraccionada y regeneración del ácido libre. Los compuestos también pueden resolverse mediante la formación de amidas o ésteres diastereoméricos, seguido por separación cromatográfica y retirada de la sustancia auxiliar quiral. Alternativamente, los compuestos pueden resolverse usando una columna de HPLC quiral.

Formas cristalinas polimorfas, solvatos, hidratos

Además, algunas de las formas cristalinas individuales de los compuestos pueden existir como polimorfos y, como tal, se pretende que estén incluidas en la presente invención. Además, algunos de los compuestos pueden formar solvatos con agua (es decir, hidratos) o disolventes orgánicos comunes, y también se pretende que tales solvatos estén abarcados dentro del alcance de esta invención. Los compuestos, incluyendo sus sales, también pueden obtenerse en forma de sus hidratos, o incluir otros disolventes usados para su cristalización. En vista de la íntima relación entre los compuestos libres y los compuestos en forma de sus sales, hidratos o solvatos, cuando se haga referencia a un compuesto en este contexto, también se pretende una sal, un solvato o polimorfo correspondiente, siempre que sea posible o apropiado en las circunstancias.

Tautómeros

Tal como se usa en el presente documento, el término “tautómero” se refiere a la migración de protones entre enlaces sencillos y dobles adyacentes. El proceso de tautomerización es reversible. Los compuestos descritos en el presente documento pueden experimentar cualquier tautomerización posible que esté dentro de las características físicas del compuesto.

Sales farmacéuticamente aceptables

Tal como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” abarca tanto uso humano como veterinario. Por ejemplo, el término “farmacéuticamente aceptable” abarca un compuesto veterinariamente aceptable o un compuesto aceptable en medicina y atención sanitaria humanas.

Las sales, los hidratos y solvatos de los compuestos de fórmula I y derivados fisiológicamente funcionales de los mismos que son adecuados para su uso en medicina son aquellos en los que el contraión o disolvente asociado es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, las sales, los hidratos y solvatos que tienen contraiones o disolventes asociados no farmacéuticamente aceptables se encuentran dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo, para su uso como productos intermedios en la preparación de otros compuestos y sus sales, hidratos y solvatos farmacéuticamente aceptable.

Las sales adecuadas según la invención incluyen aquellas formadas con ácidos o bases o bien orgánicos o bien inorgánicos. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas a partir de los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, cítrico, tartárico, fosfórico, láctico, pirúvico, acético, trifluoroacético, trifenilacético, sulfámico, sulfanílico, succínico, oxálico, fumárico, maleico, málico, mandélico, glutámico, aspártico, oxaloacético, metanosulfónico, etanosulfónico, arilsulfónico (por ejemplo, p-toluenosulfónico, bencenosulfónico, naftalenosulfónico o naftalenodisulfónico), salicílico, glutárico, glucónico, tricarbalílico, cinámico, cinámico sustituido (por ejemplo, cinámico sustituido con fenilo, metilo, metoxilo o halo, incluyendo ácido 4-metil y 4-metoxicinámico), ascórbico, oleico, naftoico, hidroxinaftoico (por ejemplo, 1- o 3-hidroxi-2-naftoico), naftalenoacrílico (por ejemplo, naftalenos-acrílico), benzoico, 4-metoxibenzoico, 2- o 4-hidroxibenzoico, 4-clorobenzoico, 4-fenilbenzoico, bencenoacrílico (por ejemplo, 1,4-bencenodiacrílico), isetiónico, perclórico, propiónico, glicólico, hidroxietanosulfónico, pamoico, ciclohexanosulfámico, salicílico, sacarínico y trifluoroacético. Las sales de base farmacéuticamente aceptables incluyen sales de amonio, sales de metal alcalino tales como aquellas de sodio y potasio, sales de metal alcalinotérreo tales como aquellas de calcio y magnesio, y sales con bases orgánicas tales como diciclohexilamina y W-metil-D-glucamina.

Se pretende que todas las formas de sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención estén abarcadas por el alcance de la presente invención.

Composiciones farmacéuticas

La composición farmacéutica según la presente invención comprende un compuesto tal como se describió anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como se define en la reivindicación 9.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término “composición farmacéutica” abarque un producto que comprende los compuestos reivindicados en las cantidades terapéuticamente eficaces, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de combinaciones de los compuestos reivindicados. Tal como se usa en el presente documento, el término “excipiente” se refiere a un portador, un aglutinante, un disgregante y/o un aditivo adecuado adicional para formulaciones galénicas, por ejemplo, para preparaciones orales líquidas, tales como suspensiones, elixires y disoluciones; y/o para preparaciones orales sólidas, tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas, cápsulas de gelatina y comprimidos. Los portadores, que pueden añadirse a la mezcla incluyen excipientes farmacéuticos necesarios e inertes, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes de suspensión, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes, conservantes, recubrimientos, agentes de granulación, tintes y agentes colorantes adecuados.

Aplicaciones terapéuticas

La presente invención proporciona un compuesto inhibidor de bacQC o una composición farmacéutica para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, tal como se define en la reivindicación 10.

La presente invención proporciona además un compuesto inhibidor de bacQC o una composición farmacéutica para su uso en un método para la terapia o profilaxis de una infección bacteriana, tal como se define en la reivindicación 14. La presente invención proporciona además un compuesto inhibidor de bacQC o una composición farmacéutica para su uso en un método para la terapia o profilaxis de una infección bacteriana, en el que la infección bacteriana está provocada preferiblemente por una bacteria que expresa una glutaminil ciclasa bacteriana de tipo II (bacQC); más preferiblemente, la infección bacteriana está provocada por una bacteria seleccionada del grupo que consiste en los géneros Porphyromonas, Prevotella y Tannerella, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en las especies Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Tannerella forsythia.

Preferiblemente, el compuesto inhibidor de bacQC o la composición farmacéutica usados en los métodos según la presente invención destruye selectivamente o inhibe selectivamente el crecimiento de una bacteria seleccionada del grupo que consiste en los géneros Porphyromonas, Prevotella y Tannerella, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en las especies Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Tannerella forsythia, dentro de una biopelícula, tal como se define en la reivindicación 11, mientras que, preferiblemente, las bacterias restantes dentro de la biopelícula permanecen esencialmente no afectadas (es decir, se destruyen o se inhibe su crecimiento a un grado significativamente menor). Dicha biopelícula es preferiblemente una biopelícula compleja, más preferiblemente una biopelícula que se produce de manera natural e incluso más preferiblemente una biopelícula oral que se produce de manera natural.

La presente invención proporciona además un compuesto inhibidor de bacQC o una composición farmacéutica para su uso en un método para la terapia o profilaxis de un estado periodóncico o una periodontopatía aguda, crónica o recurrente, tal como se define en la reivindicación 12 ó 13. Las principales categorías de estados periodóncicos y periodontopatías se clasifican en los grupos de enfermedades gingivales inducidas por la placa dental, periodontitis crónica, periodontitis agresiva, periodontitis como una manifestación de enfermedades sistémicas, periodontopatías necrosantes, abscesos del periodonto, periodontitis asociada con lesiones endodóncicas, mucositis periimplantantaria, periimplantitis e infecciones endodóncicas. En la presente invención, la periodontopatía aguda, crónica o recurrente se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en enfermedades gingivales inducidas por la placa dental, periodontitis crónica, periodontitis agresiva, periodontitis como una manifestación de enfermedades sistémicas, periodontopatías necrosantes, abscesos del periodonto, periodontitis asociada con lesiones endodóncicas, mucositis periimplantantaria, periimplantitis e infecciones endodóncicas. La presente divulgación también proporciona un método para la terapia o profilaxis de una periodontopatía aguda, crónica o recurrente que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en enfermedades gingivales inducidas por la placa dental, periodontitis crónica, periodontitis agresiva, periodontitis como una manifestación de enfermedades sistémicas, periodontopatías necrosantes, abscesos del periodonto, periodontitis asociada con lesiones endodóncicas, mucositis periimplantantaria, periimplantitis e infecciones endodóncicas, en el que el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de bacQC o una composición farmacéutica según la presente invención a un sujeto que lo necesita. Las periodontopatías agudas, crónicas o recurrentes se describen, por ejemplo, en Armitage, A. Ann Periodontol 1999, 4, 1-6.

En una realización de la presente invención, el compuesto inhibidor o la composición farmacéutica se usa preferiblemente en cualquiera de los métodos descritos anteriormente, en los que la vía de administración es administración tópica y/o en los que el método es un método no quirúrgico; o el compuesto inhibidor o la composición farmacéutica según la presente invención se usa preferiblemente en cualquiera de los métodos descritos anteriormente, en los que la vía de administración es administración sistémica y/o en los que el método es un método no quirúrgico, tal como se define en la reivindicación 15.

El término “sujeto”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un animal, preferiblemente un mamífero, lo más preferiblemente un humano, que es o ha sido el objeto de tratamiento, terapia, profilaxis, observación o experimento.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz”, tal como se usa en el presente documento, significa aquella cantidad de compuesto activo o agente farmacéutico que provoca la respuesta biológica o medicinal en un sistema de tejidos, animal o ser humano buscada por un investigador, veterinario, médico u otro facultativo, que incluye el alivio de los síntomas de la enfermedad o el trastorno que está tratándose.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación y preparación de supuestas glutaminil ciclasas bacterianas (bacQC)

a) Identificación

El análisis bioinformático del secretoma de los patógenos orales P. gingivalis, T. forsythia y P. intermedia (http://www.oralgen.lanl.gov/) mostró que aproximadamente el 80% de las proteínas secretadas que portaban un péptido señal se escinden en el enlace peptídico Xaa-Gln mediante la peptidasa señal. Los extremos N-terminales de las proteínas liberadas contienen un residuo pGlu. Esto implica la existencia de glutaminil ciclasas que parecen ser esenciales para la translocación de proteínas del crecimiento a través de la membrana externa y el crecimiento de patógenos periodóncicos.

La figura 1 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de QC humana (hQC, SEQ ID NO: 4) y supuesta QC bacteriana de P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (A), y una alineación de secuencias de aminoácidos de supuestas QC adicionales de P. intermedia (PiQC, SEQ ID NO: 2) y T. forsythia (TfQC, SEQ ID NO: 3) y P. gingivalis (PgQC, SEQ ID NO: 1) (B). La supuesta PgQC posee una identidad del 25% con respecto a la QC humana. Además, la supuesta TfQC muestra una identidad del 49% con respecto a PgQC y la QC de P. intermedia posee una identidad del 42% con respecto a PgQC. Los residuos de cisteína subrayados en gris reflejan puentes disulfuro en la hQC que están ausentes en PgQC. Las secuencias en negrita en la QC humana reflejan residuos altamente conservados de QC de tipo II. Las secuencias en gris describen supuestas secuencias señal de PgQC y hQC. Además, el motivo de unión a metales Asp-Glu-His típico se presenta con letras en negrita y subrayadas. También se identificó un supuesto motivo de unión a metales en TfQC y PiQC (B, letras en negrita). Las alineaciones se prepararon usando el programa Clustal Omega en EMBL-EBInet; (*) indica las posiciones que tienen un único residuo completamente conservado, (:) indica conservación entre grupos de propiedades fuertemente similares, (.) indica conservación entre grupos de propiedades débilmente similares (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

El análisis mediante BLAST reveló un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para una supuesta proteína QC en P. gingivalis (WP_005874301). La estructura primaria de esta supuesta proteína Qc muestra una identidad del 25% con respecto a la QC humana. Además, también se identificaron supuestas proteínas QC en el genoma de los patógenos orales P. intermedia (WP_014709208) y T. forsythia (WP_014225037), que comparten una identidad del 42% o el 49% con respecto a la supuesta QC de P. gingivalis (figura 1). Tal como se muestra mediante la alineación de aminoácidos, los residuos conservados de la QC humana parecen ser diferentes en las QC bacterianas de aquellos residuos de cisteína conservados que forman un enlace disulfuro en ser humano y se supone que otras QC de tipo II no están presentes en las tres supuestas QC bacterianas. Sin embargo, el motivo de unión a metales altamente conservado Asp144, Glu184 (Asp) e His322 de la QC de tipo II (Wintjens et al., 2006) parece estar presente en la supuesta QC bacteriana, que podría representar el centro catalítico. Las estructuras primarias de estas proteínas pueden proporcionar una indicación de que estas proteínas son QC reales.

b) Preparación

La figura 2 muestra un SDS-PAGE de supuestas QC bacterianas recombinantes purificadas expresadas en E. coli Rosetta(DE3)pLysS y purificadas tal como se describe con detalle a continuación. Por tanto, se cargaron 30 |ig de proteína purificada en SDS-PAGE al 12% y se visualizaron mediante tinción de Coomassie, carril 1, PageRuler Broad Range sin teñir (Thermofisher Scientific), carril 2, HisPgQC, carril 3, HisPiQC y carril 5, HisTfQC. Las tres supuestas QC bacterianas poseen una masa molecular teórica de “ 37 KDa.

Cepas huésped y medios

Se usaron las cepas de E. coli DH5a o XL-1 blue (Stratagene) para los procedimientos de clonación. Se usó E. coli Rosetta(DE3)pLysS (Novagene) para la expresión de proteínas. Se realizó un ensayo de actividad fosfatasa alcalina en pGP1-2 de la cepa CC118 (Tabor, S. y Richardson, C. C. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82, 1074-1078; Manoil, C., J. J. Mekalanos y Beckwith, J. J. Bacteriol. 1990, 172(2), 515-518). Se hicieron crecer todas las cepas de E. coli en medio Luria-Bertani tal como se indica a 20°C, 30°C o 37°C. Se añadieron antibióticos (ampicilina [de 50 a 125 mg/litro], cloranfenicol [de 15 a 30 mg/litro] y kanamicina [25 mg/litro]), según fuera apropiado. Para la preparación de medios sólidos, se añadió agar al 1,5% (Roth) al caldo correspondiente.

Clonación molecular de vectores plasmídicos que codifican para las QC bacterianas

Todos los procedimientos de clonación se realizaron aplicando técnicas convencionales de biología molecular. Para la expresión de proteínas, se amplificaron marcos de lectura abiertos (ORF) de PgQC (SEQ ID NO: 1, supuesta QC de P. gingivalis), PiQC (SEQ ID NO: 2, supuesta QC de P. intermedia) y TfQC (SEQ ID NO: 3, supuesta QC de T. forsythia) usando secuencias de ADN sintetizadas adquiridas de Eurofins Genomics como moldes en una PCR para introducir un sitio de restricción NheI/NdeI esencial para la clonación directa en el vector pET28a(+) (Novagen). Para la construcción de una proteína de fusión PgQC-'PhoA, se subclonó una supuesta pgQC con secuencia señal predicha en pET26b(+) a través de un sitio de restricción NheI/XhoI usando el par de cebadores seqpgQC NdeI (directo) y seqpgQC XhoI inverso. Además, se amplificó pgQC con secuencia señal nativa que incluía un sitio de unión al ribosoma de un vector pET26b(+) usando el par de cebadores seqpgQC RBS NotI (directo) y seqpgQC XbaI (inverso) para clonar en el vector de expresión de phoA pECD637. Todos los cebadores para la clonación se adquirieron de Metabion y se describen en la tabla 1.

Tabla 1: oligonucleótidos usados para la clonación de constructos de bacQC

SEQ ID NO: Cebador Secuencia ( 5 '^ 3')

5 pgQC NdeI (directo) AAA CAT ATG AAC GGC AAT AAC ACA AGT GAA

6 pgQC NheI (inverso) TTT GCT AGC TCA GTG TGA AGC GGC TTT

7 piQC NdeI (directo) TTT CAT ATG AAA GGA AAA TCG TCT AAC

8 piQC Nhel (inverso) ATG CTA GCT TAC ATG CTG TAA AGC AC

9 tfQC Ndel (directo) TCA CAT ATG GGT CAG AAA AAT ACG ACA

10 tfQC Nhel (inverso) ATG CTA GCT TAT TTC TCA TTA TAA ATC AC

11 seqpgQC Ndel (directo) AAA CAT ATG AAA AGA CTG ATA ACA ACA GGA GCA GCC TTT CTA CTG GCT GCT ACA CTC TCT GCC TGC AAC GGC AAT AAC ACA AGT GAA ACG

12 seqpgQC Xhol (inverso) TTT CTC GAG GTG TGA AGC GGC TTT CAC

13 seqpgQC RBS Notl (directo) TGG CGG CCG CTA AGA AGG AGA

14 seqpgQC Xbal (inverso) TTT TCT AGA GTG TGA AGC GGC TTT CAC

Expresión de QC bacteriana como proteína de fusión HisTag o como proteína de fusión 'PhoA

Se transformó el vector de expresión pET28a(+)::pgQC en E. coli Rosetta(DE3)pLysS. Se hicieron crecer las bacterias en medio Luria-Bertani que contenía kanamicina (25 |ig/ml) y cloranfenicol (15 |ig/ml) a 37°C hasta que la densidad celular alcanzó una DO 600 ~ 0,6. Se indujeron los cultivos con isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido 0,4 mM y se añadió un volumen de etanol al 2% (v/v) seguido por un tiempo de incubación durante 16 h a 20°C. Se recogieron los cultivos mediante centrifugación a 4°C y 3900 g durante 30 min y se almacenaron los sedimentos celulares a -20°C.

Para la expresión de la proteína de fusión ^seqPgQC-'PhoA, se transformó un vector pECD637::seqpgQC recombinante en CC118 (que carece, por ejemplo, del gen phoA) junto con plásmido auxiliar pGP1-2. Se inocularon los cultivos a 30°C durante la noche. Además, se diluyeron los cultivos durante la noche en medio Luria-Bertani nuevo hasta una densidad óptica final (DO600) ~0,4 seguido por una incubación a 42°C durante 20 min para inducir la expresión de proteínas de fusión ^seqPgQC-'PhoA. Luego se inocularon los cultivos durante 2 h adicionales a 30°C. Finalmente, se determinó la densidad óptica DO600 usando un espectrofotómetro (BioRad) y se recogieron 200 |il de los cultivos mediante centrifugación a 4°C y 16000 g durante 15 min para la determinación de la actividad PhoA.

Purificación de QC bacterianas

Se resuspendió el sedimento celular de un cultivo de 500 ml en 20 ml de tampón que consistía en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 8,0, ADNasa 10 |ig/ml y mezcla de cóctel de inhibidores de proteasas (minicomprimidos completos, libres de EDTA, Roche). Se rompieron las células haciéndolas pasar a través de una prensa francesa (Thermo Scientific, Waltman, MA, EE.UU.) 3-4 veces. Se retiró el residuo celular mediante centrifugación a 4°C y 30000 g durante 30 min. Se diluyó 1:2 el sobrenadante con tampón de equilibrado y se cargó en una columna HisTrap de 5 ml (GE Healthcare). Se equilibró la columna con Tris-HCI 50 mM que contenía NaCl 150 mM pH 8,0. Después de lavar con varios volúmenes de columna de tampón de equilibrado y al menos con imidazol 20 mM, se eluyeron las proteínas usando gradientes de múltiples etapas, alcanzando una concentración final de imidazol 250 mM, mientras que la mayor parte de la proteína pura ya se había eluido con imidazol aproximadamente 100 mM. Se combinaron todas las fracciones que contenían bacQC, se concentraron con Vivaspin 20 (Sartorius AG) y se aplicaron a una columna de desalación HiPrep 26/10 (GE, Healthcare), que se equilibró con Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 8,0. Se analizó la purificación mediante SDS-PAGE y se determinó el contenido de proteínas mediante absorción a 280 nm usando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) o según los métodos de Bradford o Gill y von Hippel (Bradford, M. M. 1976 Anal Biochem 72, 248-254; Gill, S.C. y von Hippel, P.H. 1989 Anal Biochem 182, 319-326). Finalmente, se congelaron por choque las proteínas bacQC de fusión recombinantes purificadas en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C o se añadió glicerol hasta una concentración final del 50% y almacenamiento a -20°C. Se retiraron HisTag de las proteínas de fusión N-terminales usando 1 unidad de trombina por 1 mg de proteína de fusión (kit de captura de escisión de trombina, Novagen) en presencia de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl22,5 mM a pH 8,0 seguido por una incubación durante 16 h a 4°C. Se retiró la trombina a través de la unión a estreptavidinaagarosa (kit de captura de escisión de trombina, Novagen) y se recuperaron las proteínas bacQC sin HisTag mediante filtración por centrifugación. Después de una etapa de desalado adicional usando HiPrep (26/10), se combinaron las fracciones de bacQC y se concentraron con Vivaspin 20 (Sartorius AG). Finalmente, se congeló por choque la bacQC recombinante en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM pH 8,0 en nitrógeno líquido y almacenamiento a -80°C o se añadió glicerol hasta una concentración final del 50% y almacenamiento a -20°C. Se expresó y purificó PiQC del mismo modo que PgQC. Se expresó TfQC del mismo modo que PgQC y se purificó usando una columna HiTrap Talon (GE, Healthcare).

Conclusiones: todas las supuestas QC bacterianas se expresaron en E. coli Rosetta(DE3)pLysS sin secuencia señal como proteínas de fusión con HisTag N-terminal y se purificaron hasta homogeneidad mediante cromatografía de afinidad. Se aislaron 16 - 40 mg de proteínas de fusión His-Tag puras recombinantes a partir de aproximadamente 500 ml de cultivos de E. coli inducidos. Posteriormente, se escindió la His-tag de las proteínas de fusión mediante trombina seguido por la caracterización enzimática de estas supuestas QC bacterianas.

Ejemplo 2: Ensayo fluorométrico para determinar la actividad de glutaminil ciclasas

Se evaluó la actividad de QC usando H-Gln-AMC como sustrato (tal como se describió previamente en Schilling et al., 2002).

El ensayo consiste en una concentración variable del sustrato fluorógeno y 0,5 U de piroglutaminil aminopeptidasa en Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM a pH 8,0. Después de un tiempo de incubación de 10 minutos a 30°C, se inició la reacción mediante la adición de bacQC hasta un volumen final de 125 |il de mezcla de reacción. La longitud de onda de excitación/emisión fue de 380/460 nm. Se determinó la actividad de bacQC a partir de una curva estándar del fluoróforo AMC en las condiciones de ensayo. Todas las determinaciones se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos (Fisher Scientific) a 30°C usando el dispositivo FluoStar Optima (BMG Labtech). Los datos cinéticos se evaluaron usando el software GraFit (versión 7, Erithacus software Ltd., Horley, R.U.).

La figura 3 muestra gráficos de Lineweaver-Burk para la ciclización catalizada por PgQC (A), PiQC (B) y TfQC (C) de H-Gln-AMC. El recuadro muestra un gráfico secundario de las pendientes obtenidas de la evaluación de Lineweaver-Burk. La medición de la actividad de bacQC se llevó a cabo en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y Tris-HCl 50 mM a 30°C. Los datos cinéticos se evaluaron usando el software GraFit (versión 7, Erithacus softWare Ltd., Horley, R.U.). Se determinaron los parámetros enzimáticos de la QC bacteriana (tabla 2), que difieren de aquellos de hQC (Schilling, S., Manhart, S., Hoffmann, T., Ludwig, H.-H., Wasternack, C., y Demuth, H.-U. Biol. Chem. 2003, 384, 1583-1592).

Tabla 2: parámetros cinéticos para la conversión de H-Gln-AMC por QC bacteriana. La determinación de los parámetros cinéticos se llevó a cabo en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y NaCl 50 mM a 30°C.

Km íuMl kcat [s-1l kcat/Km [mM-1 s-1l PgQC 510,94 ± 13,3 4,71 ± 0,22 9,24 ± 0,28 PiQC 645,33 ± 7,4 8,51 ± 0,37 13,18 ± 0,05 TfQC 1091,67 ± 34,36 4,49 ± 0,22 4,1 ± 0,14

Conclusiones: se sometieron a prueba proteínas recombinantes purificadas para determinar la actividad enzimática usando un ensayo fluorométrico con H-Gln-AMC como sustrato. Estas proteínas bacterianas convirtieron H-Gln-AMC como sustrato, lo que dio como resultado un aumento de las UFR y, por tanto, una velocidad de reacción creciente (figura 3). La afinidad por H-Gln-AMC como sustrato es, en el caso de PgQC y PiQC, aproximadamente diez veces menor que la de hQC por este sustrato. El valor de Km de TfQC es en realidad 20 veces mayor que el valor de Km de hQC. Además, la eficiencia de las proteínas bacterianas parece ser similar a la de hQC, mientras que PiQC posee un número de conversión dos veces mayor en comparación con PgQC o TfQC.

Ejemplo 3: Ensayo de inhibición para la actividad de glutaminil ciclasas

Para las pruebas de inhibición, la composición de la muestra fue la misma que la descrita anteriormente, excepto por la adición del supuesto compuesto inhibidor. Esto dio como resultado la presencia de DMSO al 1% o el 2% (v/v) en la mezcla de reacción. Se determinaron las constantes de inhibición usando una concentración diferente de H-Gln-AMC que variaba entre 1/4 Km y 2 Km. La concentración final de la QC bacteriana estaba en un intervalo entre 25 nM y 50 nM. Se evaluó la constante de inhibición ajustando el conjunto de curvas de progreso a la ecuación general para la inhibición competitiva usando el software GraFit (versión 7, Erithacus software Ltd., Horley, R.U.).

La figura 4 muestra gráficos de características v/S, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee a modo de ejemplo para la ciclización catalizada por PgQC de H-Gln-AMC (A) en presencia de (•) 1 |iM, (□) 0,5 |iM, (■) 0,25 |iM, (A) 0,125 |iM y (▲) 0,063 |iM de MWT-S-00431. (o) representa la reacción sin inhibidor. Las determinaciones se llevaron a cabo en Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM pH 8,0 y DMSO al 1% (v/v) a 30°C. Se obtuvieron los parámetros cinéticos mostrados en la tabla 3.

Conclusiones: PgQC se inhibe por el compuesto MWT-S-00431. La sustancia muestra una Ki de 103,7 ± 3,31 nM.

Tabla 3: parámetros cinéticos para la inhibición de la conversión de H-Gln-AMC por PgQC en presencia de MWT-S-00431.

Parámetro Valor Error estándar Vmáx íuM min-1l 4,41161 1,0569-10'1

Km [Ml 6,45485-10'4 3,14087-10'5

Ki [Ml 1,03698-10'7 3,31239-10'9

Además, se sintetizaron los siguientes compuestos tal como se describe en el ejemplo 10 a continuación. Se midieron la actividad residual (AR) promedio y los valores de Ki promedio para la inhibición de PgQC (aislada y purificada tal como se describió en el ejemplo 1) usando el ensayo de inhibición anterior y se muestran en la tabla 4. Ar se refiere a la actividad de QC residual promedio de PgQC medida en presencia de una concentración c del compuesto respectivo. Ki se refiere a los valores de Ki promedio medidos tal como se describió anteriormente y D.E.(Ki) se refiere a la desviación estándar de Ki.

Tabla 4: Inhibición de PgQC por inhibidores de bacQC.

Ejemplo 4: Dependencia del pH y de la fuerza iónica de la actividad de QC bacterianas

Se sometió a ensayo de manera fluorométrica la actividad de QC a diferentes intervalos de pH y, además, a diferentes concentraciones de cloruro de sodio tal como se describió anteriormente. Para las investigaciones de la dependencia del pH, se usó un tampón de 3 componentes que consistía en ácido acético 0,05 M, MES 0,05 M, Tris 0,1 M y NaCl 0,05 M a intervalos de pH de desde 6,0 hasta 8,5. Este tampón proporciona una fuerza iónica constante a lo largo de un amplio intervalo de pH. Todas las determinaciones de la actividad de bacQC se llevaron a cabo en condiciones de la ley de velocidad de primer orden, es decir, a concentraciones de sustrato a 1/10 Km. Por tanto, los resultados representan la dependencia del pH de la constante de especificidad kcat/Km. Debido a la estabilidad reducida de la enzima auxiliar piroglutaminil aminopeptidasa en condiciones ácidas o básicas, la dependencia del pH de las bacQC no puede determinarse por debajo de pH 6 o por encima de pH 9. Se evaluaron los datos cinéticos resultantes aplicando un modelo matemático de tres puntos de inflexión (curva con forma de campana) usando el software GraFit (versión 7, Erithacus software Ltd., Horley, R.U.). Para las investigaciones de la dependencia de la fuerza iónica sobre la actividad de bacQC, se aplicaron diferentes concentraciones de cloruro de sodio en un intervalo de desde 0 hasta 500 mM en un ensayo de actividad y se determinó la actividad de bacQC residual en las condiciones de ensayo.

La figura 5 muestra la dependencia del pH de la actividad de PgQC (A), actividad de PiQC (B) y actividad de TfQC (C). Se determinaron las constantes específicas kcat/Km de PgQC (A), PiQC (B) y TfQC (C) para la conversión de H-Gln-AMC en condiciones de la ley de velocidad de primer orden, mientras que las concentraciones de sustrato fueron 1/10 Km y, por tanto, [S] << Km. Todas las determinaciones se llevaron a cabo a 30°C en tampón que consistía en Tris-HCl 0,1 M, MES 0,05 M, ácido acético 0,05 mM y NaCl 0,05 mM.

Tabla 5: determinación de los valores de pKa de QC bacterianas en condiciones de la ley de velocidad de primer orden

pKa1 pKa2 pH óptimo PgQC 6,50 ±0,035 8,93 ±0,014 7,71 ±0,007 PiQC 6,97 ±0,099 7,82 ±0,057 7,36 ±0,07 TfQC 7,05 ±0,016 7,81 ±0,037 7,43 ±0,003

Conclusiones: se determinaron las actividades enzimáticas de QC bacterianas a diferentes intervalos de pH. Los perfiles de velocidad obtenidos se ajustan a curvas con forma de campana clásicas en cada caso (figura 5). PgQC (A) muestra una actividad máxima en el intervalo ligeramente alcalino, con pKa1 = 6,5 ± 0,035 y pKa2 = 8,93 ± 0,014 (tabla 5). Las bacQC de P. intermedia (B) y T. forsythia (T) muestran una actividad máxima a alrededor de pH neutro con pKa1 = 6,97 ± 0,99 y pKa2 = 7,92 ± 0,057 para PiQC y con pKa1 = 7,05 ± 0,016 y pKa2 = 7,81 ± 0,037 para TfQC (tabla 5). PgQC poseen una alta actividad enzimática a lo largo de un intervalo de pH más amplio que PiQC y TfQC, que se indica por una distancia aumentada entre los valores de pKa1 y pKa2.

La figura 6 muestra la influencia de la fuerza iónica sobre la actividad de QC bacterianas. Se determinó la actividad de bacQC en presencia de diferentes concentraciones de cloruro de sodio. Las mediciones se realizaron en Tris-HCl 50 mM y cloruro de potasio hasta 500 |iM. Todas las reacciones se llevaron a cabo a 30°C tal como se describió anteriormente. (■) indica la actividad residual de PgQC, (A ) indica la actividad residual de PiQC y (♦) indica la actividad residual de TfQC.

Conclusiones: a diferencia de PgQC, la actividad enzimática de PiQC y TfQC disminuye al aumentar las concentraciones de cloruro de potasio; cloruro de sodio 500 |iM dio como resultado una actividad residual de aproximadamente el 50% (figura 6). Este es un aspecto importante para la realización del ensayo de actividad según las circunstancias fisiológicas en la saliva. En condiciones fisiológicas, el cloruro de sodio está presente en la saliva y, por tanto, el ensayo de actividad para las QC bacterianas siempre se realizó en presencia de cloruro de sodio 50 |iM.

Ejemplo 5: Inhibición de QC bacterianas por quelantes metálicos

La conversión dependiente del tiempo de H-Gln-AMC 1/2 Km en presencia de diferentes concentraciones de 1,10-fenantrolina, ácido dipicolínico o EDTA a bajas concentraciones de bacQC (4 nM) debe proporcionar una indicación de la catálisis dependiente de metales de la QC bacteriana. Se llevó a cabo el ensayo de actividad de manera fluorométrica tal como se describió anteriormente, excepto por la presencia de DMSO al 1% (v/v) en el caso de 1,10-fenantrolina o ácido dipicolínico. Finalmente, se determinó la actividad de bacQC residual en estado de equilibrio, mientras que bacQC sin quelantes y /- DMSO al 1% sirvió como control positivo.

La figura 7 muestra la inhibición de la actividad de QC bacterianas por diferentes quelantes metálicos: (A) EDTA, (B) ácido dipicolínico y (C) 1,10-fenantrolina. Se usaron 250 |iM de H-Gln-AMC y concentraciones crecientes de quelantes para investigar el efecto de inhibición sobre la actividad de bacQC. Se inició la reacción mediante la adición de aproximadamente 5 nM de bacQC. Las barras negras indican la actividad residual de PgQC, las barras a rayas representan la actividad residual de PiQC y las barras blancas presentan la actividad residual de TfQC. Todas las determinaciones se llevaron a cabo a 30°C tal como se describió anteriormente.

Conclusiones: las alineaciones de aminoácidos con QC humana revelaron supuestos sitios de unión a metales en el centro activo de las QC bacterianas. Esto sugirió que la QC bacteriana actúa como enzimas dependientes de metales tal como se describió previamente para la QC humana (Schilling et al., 2002). Por tanto, la actividad de QC bacterianas debe determinarse en presencia de diferentes quelantes metálicos para investigar una catálisis dependiente de metales. Tal como se muestra en la figura 7A, el EDTA incluso a altas concentraciones no influye en la actividad de bacQC, a diferencia del ácido dipicolínico (B) o la fenantrolina (C) que muestra una fuerte actividad de inhibición frente a las tres QC bacterianas. La fenantrolina inhibió la actividad de QC ya al intervalo de mM bajo, y especialmente PiQC parece ser sensible a la fenantrolina. En resumen, la actividad de QC se inhibe mediante la reducción de metales provocada por quelantes metálicos, lo que sugiere que las QC bacterianas son metaloenzimas.

Ejemplo 6: Análisis espectroscópico mediante DC de QC bacterianas

La figura 8 muestra espectros de UV de QC bacterianas recombinantes. Se sometieron a diálisis las QC bacterianas recombinantes frente a NaH2PO410 mM, NaCl 50 mM pH 8,0. Se midió el espectro de UV entre 240 nm y 340 nm con el espectrómetro de UV Specord 210 plus (Analytic Jena). El grosor de la muestra fue de 1 cm. La línea negra representa el espectro de UV de PgQC 0,525 mg/ml, la línea de puntos presenta el espectro de UV de PiQC 0,209 mg/ml y la línea discontinua presenta el espectro de UV de TfQC 0,142 mg/ml.

La figura 9 muestra un análisis espectroscópico mediante DC de QC bacterianas recombinantes. Se sometieron a diálisis bacQC purificadas sin HisTag frente a NaH2PO4 10 mM, NaCl 50 mM pH 8,0 y se diluyeron hasta una concentración final de aproximadamente 0,05 mg/ml. Se midieron los análisis espectrales de las bacQC recombinantes a 20°C con un espectropolarímetro Jasco J-710 (Jasco GmbH, Grop-Umstadt) entre 190 y 260 nm usando cubetas de cuarzo de longitud de paso de 0,1 cm, con 20 acumulaciones y 1 s de integración. Se corrigieron los espectros restando los espectros del tampón. Se calculó el porcentaje de los elementos de la estructura secundaria usando el programa de estimación de estructuras secundarias de Jasco basándose en el método de Yang et al. (Yang, J. T., Wu, C. S., y Martinez, H. M. Methods Enzymol. 1986, 130, 208-269).

Conclusión: se realizó la caracterización adicional de QC bacterianas recombinantes aplicando espectroscopía de DC (figura 9). Los espectros de DC de todas las QC bacterianas eran prácticamente idénticos, respaldando esto la fuerte similitud entre los dominios globulares de PgQC, PiQC y TfQC. El espectro de proteínas con alto contenido de hélice a muestra dos mínimos típicos a 208 nm y 222 nm en sus estructuras secundarias que también se observaron para PgQC, PiQC y TfQC. Además, el cálculo de las cantidades de hélice a, lámina p, bobina y estructura al azar según el método de Yang et al. indica unos patrones de plegamiento similares de las tres proteínas y sugiere una topología a/p.

Ejemplo 7: Estabilidad térmica de QC bacterianas

La figura 10 muestra la estabilidad térmica de QC bacterianas recombinantes: PgQC (A), PiQC (B) y TfQC (C). Se sometieron a diálisis las bacQC purificadas sin HisTag frente a NaH2PO4 10 mM, NaCl 50 mM pH 8,0 y se diluyeron hasta una concentración final de aproximadamente 0,05 mg/ml. Se midió el espectro de DC a una temperatura de desde 20°C hasta 80°C con un espectropolarímetro Jasco J-710 entre 200 y 260 nm. Las mediciones se llevaron a cabo en intervalos de 5°C, 10 acumulaciones con velocidad de calentamiento de 30 K/h, 1 s de integración y un grosor de la muestra de 1 mm. Se equilibró la temperatura 180 s antes de cada medición. Las líneas de rayas y de puntos indican transiciones de temperatura para PgQC (A) y TfQC (C) a 40°C y 45°C y para PiQC (B) a 45°C y 50°C. Las líneas negras indican una temperatura desde 20°C hasta 35°C para PgQC (A) y TfQC (C) y, para PiQC (B), una temperatura desde 20°C hasta 40°C. Las líneas grises representan, en el caso de PgQC (A) y TfQC (C), una temperatura desde 50°C hasta 80°C y, para PiQC (B), una temperatura desde 55°C hasta 80°C

Conclusión: los espectros de DC pueden usarse para analizar la estructura secundaria alterada en dependencia de diferentes condiciones ambientales. Por tanto, se observaron cambios en la estructura secundaria de proteínas recombinantes usando DC con una temperatura creciente de desde 20°C hasta 80°C. Tal como se muestra en la figuras 10A y C, los espectros de PgQC y TfQC cambiaron partiendo de una temperatura de 40°C, lo que indica un punto de partida de la desnaturalización. El espectro de PiQC (figura 10B) cambió partiendo de una temperatura de 45°C. Las tres proteínas se desnaturalizaron por completo a 50°C. Esto indica una estabilidad térmica hasta 40°C para PgQC y TfQC y hasta 45°C para PiQC.

Ejemplo 8: Determinación de la actividad de seqQC-'PhoA

La figura 11 muestra la actividad PhoA en células pGP1-2 de E. coli CC118 permeabilizadas que expresan proteínas de fusión ^segPgQC-'PhoA. Se clonó PgQC con una supuesta secuencia señal nativa en pECD637 para crear una proteína de fusión ^segPgQC-'PhoA. Se transformó el vector resultante en pGP1-2 de la cepa CC118 de E. coli. Se inició la expresión de la proteína de fusión mediante la incubación del cultivo a 42°C durante 20 min. Se determinó la actividad PhoA del cultivo inducido tal como se describió previamente (Pribyl, T., Topologie des CzcCBA-Efflux-Komplexes aus Ralstonia metallidurans CH34. Tesis doctoral, 2001, Martin-Luther-University Halle-Wittenberg). La barra negra representa la actividad PhoA de células de E. coli que expresan ^segPgQC-'PhoA, la barra a rayas presenta la actividad PhoA de células que expresan 'BlaM-'PhoA y sirvió como control positivo y se usaron células que expresan vector sin inserto como control negativo (barra blanca).

Se determinó la actividad PhoA a partir de cultivos que se hicieron crecer tal como se describió anteriormente usando un sustrato cromógeno, fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) (Pribyl, 2001). Por tanto, se recogieron 200 |il de suspensión celular con DO600 conocida a 13000 rpm a 4°C durante 10 min. Se lavó el sedimento celular en 0,5 ml de Tris-HCl 10 mM pH 8,0, MgSO410 mM y yodoacetamida 1 mM. Se resuspendió el sedimento celular resultante en 1 ml de Tris-HCI 1 M pH 8,0, ZnCl20,1 mM y yodoacetamida 1 mM. Luego se añadieron 50 |il de SDS al 0,1% (p/v) y 50 |il de cloroformo a la mezcla seguido por un tiempo de incubación durante 5 min a 37°C. Luego se inició la reacción mediante la adición de 100 |il de disolución de sustrato (Tris-HCl 1 M pH 8,0, PNPP al 0,4% (p/v)). Se incubó adicionalmente la mezcla de reacción a 37°C hasta que la disolución se volvió de color amarillo. Luego se detuvo la reacción mediante la adición de 120 |il KH2PO4 1 M, EDTA 0,5 M pH 8,0. El tiempo necesario para desarrollar una coloración amarilla definió la actividad PhoA enzimática específica. Se retiró el residuo celular mediante centrifugación (13000 rpm, 20 min) y se determinó la densidad óptica a 420 nm del sobrenadante. Se determinó la actividad PhoA según la ley de Lambert-Beer. Los cultivos de pGP1-2 de E. coli CC118 que portaban el vector vacío pECD637 sirvieron como control negativo, mientras que pGP1-2 de E. coli CC118 con pECD619 (Pribyl, 2001) sirvieron como control positivo. Este plásmido codifica para una forma corta de secuencia señal inclusiva de p-lactamasa ( ’blaM) en el sentido de 3' del dominio ’phoA.

Conclusión: los análisis in silico de marcos de lectura abiertos de PgQC revelaron una supuesta secuencia señal. Esto indica una localización de PgQC fuera del citoplasma en P. gingivalis. Se construyeron fusiones C-terminales de secuencias señal “nativas” inclusivas de PgQC con fosfatasa alcalina (PhoA) para investigar la localización “natural” de PgQC. Las fusiones con fosfatasas alcalinas son exclusivamente activas cuando se localizan en el periplasma. La expresión de ^segPgQC-'PhoA dio como resultado una alta actividad fosfatasa de 638,5 U/I ± 50,9 (figura 11). Esto indica que PgQC se localiza en el periplasma.

Ejemplo 9: Anticuerpos contra PgQC, TfQC y PiQC

Se generaron anticuerpos policlonales mediante un procedimiento de inmunización de 5 etapas de conejos usando la proteína completa, expresada y purificada, de PgQC, TfQC y PiQC, respectivamente (sin HisTag) y la posterior purificación del antisuero.

La figura 12 muestra la especificidad de un antisuero policlonal contra (A) PgQC y (B) TfQC y PiQC. (A): se usó un antisuero policlonal de PgQC en una dilución 1:10000 para la detección en el carril 1 de extracto en bruto de células de E. coli que expresan PgQC; carril 2, 5 |ig de HisPgQC purificada, carril 3, 0,5 |ig de HisPgQC y carril 4, 0,05 |ig de PgQC purificada en inmunotransferencia de tipo Western. (B): además, se sometió a prueba un anticuerpo policlonal contra PgQC para la detección de 5 |ig de PiQC (carril 2) y 5 |ig de HisTfQC (carril 3). 5 |ig de HisPgQC (carril 1) sirvió como control positivo. PageRuler Plus teñido previamente (Fermentas) sirvió como patrón molecular.

Conclusión: se generaron anticuerpos policlonales contra PgQC que muestran una alta afinidad y especificidad por PgQC. También se detectaron PiQC y TfQC con una afinidad comparativamente menor por este anticuerpo policlonal. Ejemplo 10: Descripción detallada de métodos de síntesis

Esquema 1

4,5,6,7-Tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina

Se disolvieron diclorhidrato de histamina (3,68 g; 20 mmol; 1 eq) y paraformaldehído (1,20 g; 40 mmol; 2 eq) en agua (30 ml). Se calentó la mezcla hasta reflujo durante 4 horas. Se evaporaron las sustancias volátiles y se secó el residuo a vacío. Se usó el compuesto sin purificación adicional. Rendimiento: cuantitativo; ESI-EM m/z: 124,1 [M+H]+; HPLC (gradiente C): tr de 1,25 min (100%), 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-da: 82,95-2,98, 3,42 (t, 2H, 3J=5,9 Hz), 4,28 (s, 2H), 9.02 (s, 1H), 10,13 (s a, 2H), 14,83 (s a, 1H).

Método B:

Se trató una suspensión de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g; 1 mmol; 1 eq) en acetonitrilo (10 ml) con trietilamina (416 |il; 3 mmol; 3 eq) y la mezcla estuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió el haluro respectivo, preferiblemente un bromuro de alquilo (1 mmol; 1 eq) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 12 horas adicionales. Se evaporaron las sustancias volátiles y se recogió el residuo en agua. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 20 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron sobre Na2SO4y se evaporaron. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice usando un gradiente de CHCl3-MeOH.

Ejemplos

(E)-4-(3,4,6,7-Tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)but-2-enoato de metilo (MWT-S-00138)

Se sintetizó el compuesto mediante el método B tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y 4-bromocrotonato de metilo (0,179 g). Rendimiento: 62 mg (28%); ESI-EM: m/z 222.2 [M+H]+; HPLC (gradiente 1): 3,49 min (99,4%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,56 (t, 2H, 3J=5,5 Hz), 2,70 (t, 2H, 3J=5,5 Hz), 3,34 (dd, 2H, 3J=5,8 Hz, 4J=1,8 Hz), 3,41 (s, 2H), 3,677 (s, 3H), 6,07 (td, 1H, 3J=15,8 Hz, 4J=1,8 Hz), 6,90 (td, 1H, 3J=15,7 Hz, 3J= 5,9 Hz), 7,43 (s, 1H), 11,70 (s, 1H)

5-Bencil-3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00139)

Se sintetizó el compuesto mediante el método B tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y bromuro de fenetilo (137 |il). Rendimiento: 82 mg (38%); ESI-EM: m/z 214,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 1): 8,56 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,56 (t, 2H, 3J=5,5 Hz), 2,71 (t, 2H, 3J=5,7 Hz), 3,34 (s, 2H), 3,67 (s, 2H), 7,24-7,30 (m, 1H), 7,33-7,36 (m, 4H), 7,40 (s, 1H), 11,65 (s a, 1H)

5-(2-Feniletil)-3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00145)

Se sintetizó el compuesto mediante el método B tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y bromuro de bencilo (119 |il). Rendimiento: 10 mg (4%); ESI-EM: m/z 228,2 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 5,41 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,58 (t, 2H, 3J=5,7 Hz), 2,77-2,86 (m, 6H), 3,53 (s, 2H), 7,16-7,21 (m, 1H), 7,24-7,31 (m, 4H), 7,46 (s, 1H)

Método C:

Se trató una suspensión de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g; 1 mmol; 1 eq) en dimetoxietano (10 ml) con trietilamina (485 |il; 3,5 mmol; 3,5 eq) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se enfrió la disolución hasta 0°C y se añadió gota a gota el haluro de acilo respectivo, preferiblemente un cloruro de acilo (1 mmol; 1 eq). Después de completar la adición, se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 12 horas. Se evaporaron las sustancias volátiles y se recogió el residuo en agua. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 20 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se evaporó. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice usando un gradiente de CHCl3-MeOH.

Ejemplos

(E)-3-Fenil-1-(3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)prop-2-en-1-ona (MWT-S-00146)

Se sintetizó el compuesto mediante el método C tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y cloruro de cinamoílo (167 mg). Rendimiento: 17 mg (6,7%); ESI-EM: m/z 254,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 8,56 min (97,3%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 8 2,68-2,72 (m, 2H), 3,92 (t, 2H, 3J=5,5 Hz), 4,62 (s, 2H), 7,22-7,30 (m, 1H), 7,37-7,44 (m, 3H), 7,47-7,54 (m, 2H), 7,67-7,75 (m, 2H), 11,67 (s a, 1H) 3-Fenil-1-(3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)propan-1-ona (MWT-S-00147)

Se sintetizó el compuesto mediante el método C tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y cloruro de fenilacetilo (132 |il). Rendimiento: 68 mg (26,6%); ESI-EM: m/z 256,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,65 min (94,5%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,56-2,62 (m, 2H), 2,68-2,75 (m, 2H), 2,84-2,92 (m, 2H), 3,65-3,81 (m, 2H), 4,44 (s, 2H), 7,16-7,21 (m, 1H), 7,24-7,30 (m, 4H), 7,44 (s, 1H), 11,63 (s a, 1H) 2-Fenil-1-(3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)etanona (MWT-S-00148)

Se sintetizó el compuesto mediante el método C tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y cloruro de hidrocinamoílo (148 |il). Rendimiento: 23 mg (9,5%); ESI-EM: m/z 242.1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,04 min (95,9%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 83,71-3,86 (m, 4H), 4,48 (s, 2H), 7,18-7,35 (m, 5H), 7,44 (s, 1H), 11,64 (s a, 1H)

Fenil-(3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00149)

Se sintetizó el compuesto mediante el método C tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y cloruro de benzoílo (116 |il). Rendimiento: 34 mg (15%); ESI-EM: m/z 228,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 6,11 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,62-2,71 (m, 2H), 3,60-3,85 (m, 2H), 4,49 (s, 2H), 7,41-7,50 (m, 6H), 11,72 (s a, 1H)

(4-Fluorofenil)-(3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00156)

Se sintetizó el compuesto mediante el método C tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y cloruro de 4-fluorobenzoílo (118 |il). Rendimiento: 43 mg (17,5%); ESI-EM: m/z 246.1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 6,72 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,57-2,72 (m, 2H), 3,43-3,70 (m, 1,4H), 3,76-3,99 (m, 0,6H), 4,25-4,66 (m, 2H), 7,25-7,32 (m, 2H), 7,45-7,57 (m, 3H), 11,91 (s a, 1H)

(4-Metoxifenil)-(3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00157)

Se sintetizó el compuesto mediante el método C tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y cloruro de 4-metoxibenzoilo de (135 |il) y se purificó adicionalmente mediante HPLC semipreparativa. Rendimiento: 14 mg (3,8%); ESI-EM: m/z 258,1 [M+h ]+; HPLC (gradiente 2): 6,88 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,79 (t, 2H, 3J=5,5Hz), 3,69-3,81 (m, 2H), 3,81 (s, 3H), 4,59-4,76 (m, 2H), 6,98-7,05 (m, 2H), 7,44-7,49 (m, 2H), 8,90 (s, 1H), 14,27 (s a, 1H)

(3-Metoxifenil)-(3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00158)

Se sintetizó el compuesto mediante el método C tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y cloruro de 3-metoxibenzoílo (141 |il) y se purificó adicionalmente mediante HPLC semipreparativa. Rendimiento: 19 mg (5%); ESI-EM: m/z 258,1 [M+H]+; Hp Lc (gradiente 2): 6,91 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-da: 82,69-2,83 (m, 2H), 3,61-3,68 (m, 1,4H), 3,79 (s, 3H), 3,85-4,01 (m, 0,6H), 4,42-4,81 (m, 2H), 6,99-7,04 (m, 2H), 7,07 (ddd, 1H, 3J=8,3, 4J=2,6, 4J=0,9), 7,4 (t, 1H, 3J=7,9), 8,75-8,96 (m, 1H), 14,22 (s a, 1H) (3,4-Diclorofenil)-(3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00159)

Se sintetizó el compuesto mediante el método C tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y cloruro de 3,4-diclorobenzoílo (209 mg) y se purificó adicionalmente mediante HPLC semipreparativa. Rendimiento: 57 mg (18,9%); ESI-EM: m/z 296,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 9,52 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,71-2,84 (m, 2H), 3,56-3,70 (m, 1,4H), 3,84-3,99 (m, 0,6H), 4,44-4,79 (m, 2H), 7,44-7,50 (m, 1H), 7,71-7,80 (m, 2H), 8,74-8,94 (m, 1H), 14,12 (s a, 1H)

(4-Clorofenil)-(3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00160)

Se sintetizó el compuesto mediante el método C tal como se describió anteriormente, partiendo de 4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (0,196 g) y cloruro de 4-clorobenzoílo (128 |il).Rendimiento: 89 mg (34%); ESI-EM: m/z 262,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 8,03 min (96,4%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,56-2,71 (m, 2H), 3,45-3,58 (m, 1H), 3,85-3,99 (m, 1H), 4,22-4,61 (m, 2H), 7,46-7,58 (m, 5H), 11,96 (s a, 1H)

(3-Clorofenil)(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00425)

ESI-EM: m/z 262,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 8,00 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,59-2,73 (m, 2H), 3,49-3,59 (m, 1H), 3,87-3,97 (m, 1H), 4,29-4,39 (m, 1H), 4,58 (s a, 1H); 7,39-7,41 (m, 1H), 7,49-7,58 (m, 4H); 11,90 (s a, 1H)

(3,4-Dimetoxifenil)(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00426)

ESI-EM: m/z 288,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 5,89/6,37 min (100%; doble pico); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 8 2,65-2,68 (m, 2H), 3,79-3,83 (m, 8H), 4,49 (s a, 2H); 7,01-7,03 (m, 3H), 7,53 (s a, 1H); 11,88 (s a, 1H) Benzo[d][1,3]dioxol-5-il(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00427)

ESI-EM: m/z 272,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 6,53 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,65 (s a, 2H); 3,52­ 3,90 (m, 2H); 4,47 (s a, 2H); 6,09 (s, 2H); 6,94-7,01 (m, 3H); 7,51 (s, 1H); 11,88 (s a, 1H)

[1,1'-Bifenil]-4-il(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00428)

ESI-EM: m/z 304,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 10,61 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,68 (s, 2H); 3,63 (s a, 1H); 3,94 (s a; 1H); 4,42-4,60 (m, 2H); 7,40-7,43 (m, 1H); 7,49-7,55 (m, 5H); 7,72-7,78 (m, 4H); 11,91 (s a, 1H) (3,5-Dimetoxifenil)(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00429)

ESI-EM: m/z 288,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,71 min (92,9%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,58-2,68 (m, 2H); 3,54 (s a, 1H); 3,78 (s, 6H); 3,90 (s a, 1H); 4,34 (s a, 1H); 4,56 (s a, 1H); 6,54 (s, 2H); 6,58-6,59 (m, 1H); 7,48-7,53 (m, 1H); 11,88 (s a; 1H)

(3-Fluorofenil)(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00430)

ESI-EM: m/z 245,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 6,64 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,59-2,73 (m, 2H); 3,53 (s a, 1H); 3,92 (s a, 1H); 4,33 (s a, 1H); 4,58 (s, 1H); 7,27-7,36 (m, 3H); 7,48-7,55 (m, 2H); 11,89 (s a, 1H) (3,5-Diclorofenil)(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00431)

APCI-EM: m/z 295,9 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 9,23 min (98,3%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,61-2,68 (m, 2H); 3,53 (s a, 1H); 3,91 (s a, 1H); 4,33 (s, 1H); 4,58 (s, 1H); 7,52-7,56 (m, 3H); 7,74-7,75 (m, 1H); 11,95 (s a, 1H) (3-Propoxifenil)(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00432)

APCI-EM: m/z 286,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 9,23 min (86,6%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 8 0,98 (t, 3H, 3J=7,3 Hz); 1,74 (sext, 2H, 3J=6,8 Hz); 2,60-2,71 (m, 2H); 3,54 (s a, 1H); 3,86-3,98 (m, 3H); 4,34 (s a, 1H); 4,57 (s a, 1H); 6,94-7,08 (m, 3H); 7,35-7,39 (m, 1H); 7,50-7,56 (m, 1H); 11,94 (s a, 1H)

[1,1'-Bifenil]-3-il(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00433)

APCI-EM: m/z 304,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 10,22 min (99,5%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-da: 82,60-2,76 (m, 2H); 3,61 (s a, 1H); 3,95 (s a, 1H); 4,41 (s a, 1H); 4,62 (s, 1H); 7,39-7,59 (m, 6H); 7,70-7,73 (m, 3H); 7,78-7,80 (m, 1H); 11,91 (s a, 1H)

(2,3-Dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo-[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00434) APCI-EM: m/z 286,0 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 6,52 min (99,6%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,63-2,66 (m, 2H); 3,58-3,91 (m, 2H); 4,28-4,30 (m, 4H); 4,47 (s a; 2H); 6,92-6,94 (m, 3H); 7,51 (s, 1H); 11,87 (s a, 1H) (1,4,6,7-Tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)(3,4,5-trifluoro-fenil)metanona (MWT-S-00435)

APCI-EM: m/z 282,0 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,65 min (96,9%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,66 (s a, 2H); 3,49-3,59 (m, 1H); 3,89 (s a, 1H); 4,36 (s, 1H); 4,57 (s, 1H); 7,45-7,57 (m, 3H); 11,96 (s a, 1H)

(4-Fluoro-3-metoxifenil)(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00436)

APCI-EM: m/z 276,0 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,10 min (99,7%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,63-2,72 (m, 2H); 3,57 (s a, 1H); 3,88-3,95 (m, 4H); 4,38 (s a, 1H); 4,56 (s a, 1H); 7,00-7,04 (m, 1H); 7,23 (dd, 2H, 4J=1,5 Hz, 3J=8,3 Hz); 7,27-7,32 (m, 1H); 7,50-7,58 (m, 1H); 11,89 (s a; 1H)

Naftalen-2-il(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00440)

ESI-EM: m/z 278,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 9,20 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,70 (s a, 2H); 3,61 (s a, 1H); 3,98 (s a, 1H); 4,43 (s a, 1H); 4,63 (s a, 1H); 7,44-7,64 (m, 4H); 7,98-8,04 (m, 4H); 11,89 (s a, 1H) (3-Cloro-5-metoxifenil)(1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)metanona (MWT-S-00441)

APCI-EM: m/z 292,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 8,80 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,62-2,71 (m, 2H); 3,53 (s a, 1H); 3,82 (s, 3H); 3,90 (s a, 1H); 4,32 (s a, 1H); 4,57 (s a, 1H); 6,95 (s a, 1H); 7,05 (s, 1H); 7,14 (s, 1H); 7,49­ 7,54 (m, 1H); 11,87 (s a, 1H)

Esquema 2

Se disolvió histamina (1 eq) en metanol (30 ml). Se añadió el aldehído respectivo (1 eq) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añadió en porciones borohidruro de sodio (1,5 eq) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 3 horas adicionales. Se evaporaron las sustancias volátiles y se recogió el residuo en agua. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 50 ml). Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre Na2SO4 y se evaporaron. Se usó el producto sin purificación adicional. Si fuera necesario, se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice usando un gradiente de CHCl3-MeOH.

Método E:

Se disolvió el derivado de N-bencilhistamina obtenido mediante el método D (1 mmol; 1 eq) en metanol o etanol (0,3 - 0,5 M). Se añadieron el aldehído respectivo (1,2 mmol; 1,2 eq) y trimetilamina (1 mmol; 1 eq) y se calentó la mezcla hasta reflujo durante la noche. Se evaporaron las sustancias volátiles y se recogió el residuo en agua y una pequeña cantidad de NaHCO3 acuoso saturado. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 20 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice usando un gradiente de CHCh-MeOH.

Método F:

Se disolvió el derivado de N-bencilhistamina obtenido mediante el método D (1 eq) en etanol (2 ml). Se añadieron paraformaldehído (2 eq) e hidróxido de potasio (1 eq) y se calentó la mezcla en un microondas (100°C, 5 min). Se evaporaron las sustancias volátiles y se recogió el residuo en agua y una pequeña cantidad de NaHCO3 acuoso saturado. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc (3 x 20 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice usando un gradiente de CHCh-MeOH.

Ejemplos

5-Bencilespiro[6,7-dihidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-4,3'-oxetano] (MWT-S-00260)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y E tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (1111 mg; 10 mmol; 1 eq), benzaldehído (1,02 ml; 10 mmol; 1 eq), NaBH4 (568 mg; 15 mmol; 1,5 eq); oxetan-3-ona (59 |il; 1 mmol; 1 eq) y trietilamina (139 |il; 1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 133 mg (52%); ESI-EM: m/z 256,2 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,93 min (97,2%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-da: 82,46 (t, 2H, 3J=5,0 Hz), 2,67 (t, 2H, 3J=5,7 Hz), 3,89 (s, 2H), 4,74-4,86 (m, 4H), 7,24-7,29 (m, 1H), 7,33-7,38 (m, 2H), 7,42-7,47 (m, 2H), 7,56 (s, 1H), 11,84 (s a, 1H)

4- Fenil-5-[(3,4,5-trifluorofenil)metil]-3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00261)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y E tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (1111 mg; 10mmol; 1 eq), 3,4,5-trifluorobenzaldehído (1,6 g; 10 mmol; 1 eq), NaBH4 (568 mg; 15mmol; 1,5 eq); benzaldehído (122 |il; 1,2 mmol; 1,2 eq) y trietilamina (139 |il; 1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 150 mg (43,7%); ESI-EM: m/z 344,3 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 12,71 min (98,3%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,58-2,68 (m, 3H), 2,86-2,93 (m, 1H), 3,52 (d, 1H, J=14,5 Hz), 3,61 (d, 1H, J=14,5 Hz), 4,58 (s, 1H), 7,22-7,29 (m, 3H), 7,31-7,34 (m, 4H), 7,54 (s, 1H), 12,09 (s a, 1H)

5- Bencil-4-metil-3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00265)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y E tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (1111 mg; 10mmol; 1 eq), 3,4,5-trifluorobenzaldehído (1,6 g; 10 mmol; 1 eq), NaBH4 (568 mg; 15mmol; 1,5 eq); acetaldehído (112 |il; 2 mmol; 2 eq) y trietilamina (139 |il; 1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Se llevó a cabo la reacción en un recipiente sellado. Rendimiento (segunda etapa): 60 mg (26,4%); ESI-EM: m/z 228,2 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 3,79 min (95,3%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 81,29 (d, 3H, 3J=6,1 Hz), 2,35-2,48 (m, 2H), 2,53-2,61 (m, 1H), 2,83-2,96 (m, 1H), 3,49-3,59 (m, 3H), 3,85 (d, 1H, J=13,2 Hz), 7,22-7,27 (m, 1H), 7,29-7,38 (m, 4H), 7,42 (s, 1H), 11,66 (s a, 1H)

5-[(3,4,5-Trifluorofenil)metil]espiro[6,7-dihidro-3H-imidazo[4,5-c]piridin-4,3'-oxetano] (MWT-S-00266)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y E tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (1111 mg; 10mmol; 1 eq), 3,4,5-trifluorobenzaldehído (1,6 g; 10 mmol; 1 eq), NaBH4 (568 mg; 15mmol; 1,5 eq); oxetanona (70 |il; 1,2 mmol; 1,2 eq) y trietilamina (139 |il; 1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 236 mg (76,3%); ESI-EM: m/z 310,3 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 10,66 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,68 (t, 2H, J=5,7 Hz), 3,90 (s, 2H), 4,68-4,72 (m, 2H), 4,79-4,84 (m, 2H), 7,36-7,42 (m, 2H), 7,56 (s, 1H), 11,86 (s a, 1H)

4-Metil-5-[(3,4,5-trifluorofenil)metil]-3,4,6,7-tetrahidro-imidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00267)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y E tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (1111 mg; 10mmol; 1 eq), 3,4,5-trifluorobenzaldehído (1,6 g; 10 mmol; 1 eq), NaBH4 (568 mg; 15mmol; 1,5 eq); acetaldehído (112 |il; 2 mmol; 2 eq) y trietilamina (139 |il; 1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 227 mg (80,7%); ESI-EM: m/z 282,2 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 6,95 min (98,5%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-da: 81,28 (d, 3H, J=6,6 Hz), 2,41-2,49 (m, 1H), 2,52-2,63 (m, 2H), 2,88-2,96 (m, 1H), 3,54-3,60 (m, 2H), 3,81 (d, 1H, J=14,9 Hz), 7,27-7,34 (m, 2H), 7,44 (s, 1H), 11,71 (s a, 1H)

5-Bencil-4-fenil-3,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-268)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y E tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (1111 mg; 10 mmol; 1 eq), benzaldehído (1,02 ml; 10 mmol; 1 eq), NaBH4 (568 mg; 15 mmol; 1,5 eq); benzaldehído (122 |il; 1,2 mmol; 1,2 eq) y trietilamina (139 |il; 1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 194 mg (67%); ESIMS: m/z 290,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 9,68 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,54­ 2,63 (m, 3H), 2,89-2,96 (m, 1H), 3,43 (d, 1H, J=13,6 Hz), 3,66 (d, 1H, J=13,6 Hz), 4,51 (s, 1H), 7,21-7,26 (m, 2H), 7,30­ 7,34 (m, 8H), 7,39 (s, 1H), 11,65 (s a, 1H)

4,4-Dimetil-5-[(3,4,5-trifluorofenil)metil]-6,7-dihidro-3H-imidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00275)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y E tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (1111 mg; 10mmol; 1 eq), 3,4,5-trifluorobenzaldehído (1,6 g; 10 mmol; 1 eq), NaBH4 (568 mg; 15mmol; 1,5 eq); acetona (735 |il; 10 mmol; 10 eq) y trietilamina (139 |il; 1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 88 mg (29,8%); ESIMS: m/z 296,3 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,89 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 81,32 (s, 6H), 2,43 (t, 2H, 3J=5,5 Hz), 2,62 (t, 2H, 3J=5,7 Hz), 3,64 (s, 2H), 7,27-7,35 (m, 2H), 7,42 (s, 1H), 11,69 (s a, 1H)

5-[[4-(1-Piperidil)fenil]metil]-1,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00320)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 4-(1-piperidinil)benzaldehído (379 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (76 mg; 2,5 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (71 mg; 1,3 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 130 mg (34,9%); ESI-EM: m/z 297,5 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 1,44/3,6 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 81,48-1,57 (m, 2H), 1,57-1,65 (m, 4H), 2,52-2,57 (m, 2H), 2-65-2,71 (m, 2H), 3,05-3,13 (m, 4H), 3,28-3,32 (m, 2H), 3,55 (s, 2H), 6,85-6,90 (m, 2H), 7,12-7,18 (m, 2H), 7,39 (s, 1H), 11,63 (s a, 1H) 4- [2-[4-(1,4,6,7-Tetrahidroimidazo[4,5-c]piridin-5-ilmetil)fenoxi]etil]morfolina (MWT-S-00330)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 4-(2-morfolinoetoxi)benzaldehído (471 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (24 mg; 0,8 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (22 mg; 0,4 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 21 mg (15,5%); ESI-EM: m/z 343,4 [M+H]+; HPLC (gradiente 1): 1,18 min (77%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,43-2,49 (m, 4H), 2,65-2,71 (m, 4H), 3,55-3,60 (m, 6H), 4,03-4,09 (m, 2H), 6,88-6,92 (m, 2H), 7,22-7,26 (m, 2H), 7,40 (s, 1H), 11,65 (s a, 1H)

5- [(4-Butoxifenil)metil]-1,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00331)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 4-butoxibenzaldehído (357 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (54 mg; 1,8 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (50 mg; 0,9 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 170 mg (67,3%); ESI-EM: m/z 286,3 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 8,88 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 80,95 (t, 3H, 3J=7,4 Hz), 1,40-1,50 (m, 2H), 1,67-1,75 (m, 2H), 2,91-2,97 (m, 2H), 3,40­ 3,48 (m, 2H), 4,00 (t, 2H, 3J=6,5 Hz), 4,13-4,18 (m, 2H), 4,31-4,36 (m, 2H), 7,00-7,05 (m, 2H), 7,40-7,45 (m, 2H), 8,66 (s, 1H)

5-[(3-Metoxifenil)metil]-1,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00343)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 3-metoxi-benzaldehído (272 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (69 mg; 2,3 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (64 mg; 1,1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 42 mg (15,1%); ESI-EM: m/z 244,3 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 4,89 min (97,6%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,53-2,58 (m, 2H), 2,67-2,72 (m, 2H), 3,65 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 6,81-6,86 (m, 1H), 6,90-6,94 (m, 2H), 7,22-7,28 (m, 1H), 7,41 (s, 1H), 11,64 (s a, 1H)

5-[(2,2-Difluoro-1,3-benzodioxol-5-il)metil]-1,4,6,7-tetrahidro-imidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00344)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 2,2-difluoro-1,3-benzodioxol-5-carboxaldehído (372 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (49 mg; 1,6 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (46 mg; 0,8 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 53 mg (22,0%); ESI-EM: m/z 294,2 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,94 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-da: 82,53-2,59 (m, 2H), 2,7 (t, 2H, J=5,7 Hz), 3,35-3,38 (m, 2H), 3,69 (s, 2H), 7,19 (dd, 1H, 4J=1,3 Hz, 3J=8,3 Hz), 7,35 (d, 1H, 3J=8,3 Hz), 7,38 (d, 1H, 4J=1,3 Hz), 7,42 (s, 1H), 11,68 (s a, 1H)

5-[(4-Benciloxifenil)metil]-1,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00359)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 4-benciloxi-benzaldehído (425 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (57 mg; 1,9 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (53 mg; 0,94 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 61 mg (20,2%); ESI-EM: m/z 320,2 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 9,37 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,53-2,57 (m, 2H), 2,69-2,72 (m, 2H), 3,6 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 6,96-7,01 (m, 2H), 7,23­ 7,29 (m, 2H), 7,31-7,48 (m, 6H)

5-[(3-Pirrolidin-1-ilfenil)metil]-1,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00361)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 3-pirrolidin-1-ilbenzaldehído (351 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (37 mg; 1,2 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (35 mg; 0,61 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 39 mg (22,4%); ESI-EM: m/z 283,4 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,15 min (96,5%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 81,93-1,97 (m, 4H), 2,53-2,58 (m, 2H), 2,69-2,74 (m, 2H), 3,19-3,23 (m, 4H), 3,60 (s, 2H), 6,42-6,46 (m, 1H), 6,51-6,59 (m, 2H), 7,08-7,14 (m, 1H), 7,43 (s, 1H)

5-(2,3-Dihidro-1,4-benzodioxin-6-ilmetil)-1,4,6,7-tetrahidro-imidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00380)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 1,4-benzodioxan-6-carboxaldehído (328 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (66 mg; 2,2 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (62 mg; 1,1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Se purificó adicionalmente el producto mediante HPLC semipreparativa. Rendimiento (segunda etapa): 72 mg (13,1%); ESI-EM: m/z 272,2 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 3,74 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,88-2,95 (m, 2H), 4,11 (s a, 2H), 4,24 (s a, 2H), 4,27 (s, 4H), 6,92-6,98 (m, 2H), 7,04 (s, 1H), 8,62 (s a, 1H)

5-(p-Tolilmetil)-1,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00420)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), p-tolilaldehído (240 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (34 mg; 1,1 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (32 mg; 0,6 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 10 mg (7,7%); ESI-EM: m/z 228,2 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 5,61 min (98,1%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,34 (s, 3H), 2,89-2,94 (m, 2H), 3,35-3,44 (m, 2H), 4,08-4,13 (m, 2H), 4,27-4,33 (m, 2H), 7,26-7,3 (m, 2H), 7,37­ 7,41 (m, 2H), 8,66 (s, 1H)

5-[(4-Clorofenil)metil]-1,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00421)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 4-clorobenzaldehído (281 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (74 mg; 2,5 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (69 mg; 1,2 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 38 mg (12,5%); ESI-EM: m/z 248,1 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 6,28 min (94,4%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,82-2,89 (m, 2H), 3,18-3,28 (m, 2H), 3,90-3,96 (m, 2H), 4,12-4,20 (m, 2H), 7,47-7,54 (m, 4H), 8,73 (s, 1H)

5-[(3,4-Diclorofenil)metil]-1,4,6,7-tetrahidroimidazo[4,5-c]piridina (MWT-S-00423)

Se sintetizó el compuesto mediante los métodos D y F tal como se describieron anteriormente, partiendo de histamina (222 mg; 2 mmol; 1 eq), 3,4-dicloro-benzaldehído (350 mg; 2 mmol; 1 eq), NaBH4 (114 mg; 3 mmol; 1,5 eq); paraformaldehído (58 mg; 1,9 mmol; 2 eq) e hidróxido de potasio (54 mg; 1 mmol; 1 eq) para la segunda etapa. Rendimiento (segunda etapa): 50 mg (18,3%); ESI-EM: m/z 282,0 [M+H]+; HPLC (gradiente 2): 7,47 min (100%); 1H-RMN, 400 MHz, DMSO-d6: 82,78-2,84 (m, 2H), 3,08-3,15 (m, 2H), 3,83-3,87 (m, 2H), 4,03-4,1 (m, 2H), 7,44 (dd, 1H, 3J=8,3 Hz, 4J=2,0 Hz), 7,67-7,74 (m, 2H), 8,79 (s, 1H)

Métodos analíticos

HPLC: el sistema analítico de HPLC consistía en un dispositivo Merck-Hitachi (modelo LaChrom) que utiliza una columna analítica LUNA RP 18 (5 |im) (longitud: 125 mm, diámetro: 4 mm) y un detector de red de diodos (DAD) con X = 214 nm como longitud de onda de notificación. Se analizaron los compuestos usando un gradiente a una velocidad de flujo de 1 ml/min; mediante lo cual el eluyente (A) era acetonitrilo, el eluyente (B) era agua, conteniendo ambos el 0,04% (v/v) de ácido trifluoroacético, aplicando uno de los siguientes gradientes:

Gradiente 1: 0 min - 5 min -> 5% (A), 5 min -17 min -> 5 -15% (A), 17 min - 27 min -> 15 - 95% (A), 27 min - 30 min -> 95% (A)

Gradiente 2: 0 min - 5 min -> 5% (A), 5 min -15 min -> 5 - 60% (A), 15 min - 20 min -> 60 - 95% (A), 20 min - 30 min -> 95% (A)

Se determinaron las purezas de todos los compuestos notificados mediante el porcentaje del área de pico a 214 nm.

Espectrometría de masas: se obtuvieron los espectros de masas ESI y APCI con un espectrómetro SCIEX API 1200 (Perkin Elmer) o un dispositivo expression CMS (Advion).

Espectroscopía de RMN: se registraron los espectros de 1H-RMN en un espectrómetro Agilent DD2 de 400 MHz. Los desplazamientos químicos se expresan como partes por millón (ppm) a campo bajo con respecto a tetrametilsilano. Los patrones de desdoblamiento se han denominado de la siguiente manera: s (singlete), d (doblete), dd (doblete de dobletes), t (triplete), m (multiplete) y s a (señal ancha).

Ejemplo 11: selección como diana de bacterias que expresan PgQC, TfQC y PiQC

Se cultivaron bacterias que expresan PgQC, TfQC y PiQC, concretamente, P. gingivalis ATCC 33277, P. gingivalis M5-1-2, T. forsythia ATc C 42077 y P. intermedia At Cc 25611, en presencia de los compuestos MWT-S-00275, MWT-S-00431, MWT-S-00441 y doxiciclina en series de dilución doble. En la siguiente tabla 6, MIC indica la concentración más baja de compuesto sin crecimiento visible (turbidez) y MBC indica la concentración de compuesto a la que no se observa crecimiento de subcultivo o se observa al menos una reducción en un 99,9% (tres unidades en log-10). Tabla 6: concentraciones inhibidoras MIC y MBC para los compuestos MWT-S-00275, MWT-S-00431, MWT-S-00441 en comparación con doxiciclina. P.g. = Porphyromonas gingivalis, T.f. = Tannerella forsythia, P.i. = Prevotella intermedia; Doxy = doxiciclina (antibiótico de amplio espectro).

Los resultados en la tabla 6 muestran que los compuestos MWT-S-00275, MWT-S-00431, MWT-S-00441 son capaces de destruir o inhibir el crecimiento de bacterias que expresan PgQC, TfQC y PiQC ya a concentraciones significativamente menores en comparación con el antibiótico de amplio espectro doxiciclina, que se usa en la actualidad como terapia adyuvante convencional con antibióticos de la periodontitis.

Conclusiones: los compuestos según la presente invención son capaces de seleccionar como diana patógenos que inducen una periodontopatía a una concentración mucho menor que un antibiótico de amplio espectro inespecífico.

Aplicabilidad industrial

Las glutaminil ciclasas bacterianas (bacQC) según la presente invención representan proteínas diana terapéuticas que pueden usarse específica y sustancialmente para identificar inhibidores capaces de seleccionar como diana selectivamente un patógeno que induce periodontitis. Por tanto, son relevantes para el tratamiento de un enfermedad particular, por ejemplo, periodontitis, y, por consiguiente, susceptibles de aplicabilidad industrial.

El método para identificar un inhibidor de la bacQC según la presente divulgación es aplicable a nivel industrial en vista de la relevancia farmacéutica de las enzimas bacQC con respecto a la aparición de periodontitis y su esencialidad para el crecimiento de patógenos periodóncicos demostradas en el presente documento.

Los inhibidores de bacQC según la presente invención, incluyendo los inhibidores identificados mediante el método para identificar un inhibidor de la bacQC según la presente invención, y la composición farmacéutica según la presente invención también son susceptibles de aplicabilidad industrial, porque estos pueden usarse en métodos para el

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   i . Compuesto según la siguiente fórmula I,

   

   sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

   en el que el compuesto es un inhibidor de glutaminil ciclasa de tipo II bacteriana;

   en la que L se selecciona del grupo que consiste en un enlace sencillo, -CR5(R6)-, -CR5(R6)-CR7(R8)-y -C(R5)=C(R6)-;

   en el que R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OH, alquilo opcionalmente sustituido y heteroalquilo opcionalmente sustituido;

   en el que, dentro de cada par de grupos R3/R4, R5/R6 y R7/R8, los dos grupos pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico, u opcionalmente pueden representar =O, en el que:

   (i) cada uno de R1 y R2 es H; cada uno de R3 y R4 es H, o R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-6 opcionalmente sustituido y heteroalquilo C1-6 opcionalmente sustituido; y Ar se selecciona del grupo que consiste en arilo, alcoxiarilo opcionalmente sustituido, carboxiarilo opcionalmente sustituido, cianoarilo opcionalmente sustituido, haloarilo, hidroxiarilo opcionalmente sustituido, alcoxiheteroarilo opcionalmente sustituido, cianoheteroarilo opcionalmente sustituido, haloheteroarilo opcionalmente sustituido, heteroarilarilo opcionalmente sustituido, hidroxiheteroarilo opcionalmente sustituido y carboxiheteroarilo opcionalmente sustituido; o

   (ii) R1 y R2 representan juntos =O; y Ar es arilo opcionalmente sustituido seleccionado del grupo que consiste en carboxiarilo, cianoarilo, hidroxiarilo, heteroarilarilo, 2,3-diclorofenilo, 2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-ilo, 3-cloro-5-metoxifenilo, 3,4,5-trifluorofenilo, 3,5-diclorofenilo, 4-(benciloxi)fenilo, 4-[2-(morfolin-4-il)etoxi]fen-1-ilo, 4-butoxifenilo, 4-fluoro-3-metoxifenilo y naftalen-2-ilo, o es heteroarilo opcionalmente sustituido seleccionado del grupo que consiste en alcoxiheteroarilo, cianoheteroarilo, haloheteroarilo, hidroxiheteroarilo y carboxiheteroarilo.
2. 2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R1 y R2 representan juntos =O; y R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido y heteroalquilo C1-6 opcionalmente sustituido.
3. 3. Compuesto según la reivindicación 2, en el que R3 es metilo y/o en el que R4 se selecciona del grupo que consiste en H y metilo.
4. 4. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada uno de R3 y R4 es metilo; o en el que cada uno de R3 y R4 es H.
5. 5. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R3 y R4:

   (i) están unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico; o

   (ii) están unidos entre sí para formar un grupo heterocíclico representado por la siguiente fórmula II:

   

   Fórmula II.
6. 6. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que L se selecciona del grupo que consiste en un enlace sencillo, -CR5(R6)-, -C(R5)=C(R6)- y -CR5(R6)-CR7(R8)-.
7. 7. Compuesto según la reivindicación 6, en el que R5, R6, R7 y R8 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido y heteroalquilo C1-6 opcionalmente sustituido; o en el que cada uno de R5, R6, R7 y R8 es H.
8. 8. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que cada uno de R1 y R2 es H; y Ar se selecciona del grupo que consiste en: 1,3-benzodioxol-5-ilo, 2,3-diclorofenilo, 2,3-dihidro-1,4-benzodioxin-6-ilo, 3-cloro-5-metoxifenilo, 3,4,5-trifluorofenilo, 3,5-diclorofenilo, 4-(benciloxi)fenilo, 4-[2-(morfolin-4-il)etoxi]fen-1-ilo, 4-butoxifenilo, 4-fluoro-3-metoxifenilo y naftalen-2-ilo.
9. 9. Composición farmacéutica que comprende el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. 10. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto y un excipiente farmacéuticamente aceptable,

    para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
11. 11. Compuesto según la siguiente fórmula I,

    

    sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

    en el que el compuesto es un inhibidor de glutaminil ciclasa de tipo II bacteriana;

    en el que Ar se selecciona del grupo que consiste en arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido;

    en el que L se selecciona del grupo que consiste en un enlace sencillo, -CR5(R6)-, -CR5(R6)-CR7(R8)-y -C(R5)=C(R6)-;

    en el que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OH, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido;

    en el que, dentro de cada par de grupos R1/R2, R3/R4, R5/R6 y R7/R8, los dos grupos pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico, u opcionalmente pueden representar =O,

    o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método para la terapia y/o profilaxis de una infección bacteriana provocada por: (i) una bacteria que expresa una glutaminil ciclasa bacteriana (bacQC), en el que la bacQC es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Se Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o más con respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3; o

    (ii) una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Tannerella forsythia; o

    (iii) una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Tannerella forsythia, en el que el compuesto o la composición inhibe selectivamente el crecimiento de dicha bacteria dentro de una biopelícula.

    Compuesto según la siguiente fórmula I,

    

    sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

    en el que el compuesto es un inhibidor de glutaminil ciclasa de tipo II bacteriana;

    en el que Ar se selecciona del grupo que consiste en arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido;

    en el que L se selecciona del grupo que consiste en un enlace sencillo, -CR5(R6)-, -CR5(R6)-CR7(R8)-y -C(R5)=C(R6)-;

    en el que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OH, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido;

    en el que, dentro de cada par de grupos R1/R2, R3/R4, R5/R6 y R7/R8, los dos grupos pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico, u opcionalmente pueden representar =O,

    o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto y un excipiente farmacéuticamente aceptable,

    para su uso en un método para la terapia o profilaxis de una periodontopatía aguda, crónica o recurrente.

    Compuesto según la reivindicación 12, para su uso según la reivindicación 12, en el que la periodontopatía aguda, crónica o recurrente se selecciona del grupo que consiste en: enfermedades gingivales inducidas por la placa dental, periodontitis crónica, periodontitis agresiva, periodontitis como una manifestación de enfermedades sistémicas, periodontopatías necrosantes, abscesos del periodonto, periodontitis asociada con lesiones endodóncicas, mucositis periimplantantaria, periimplantitis e infecciones endodóncicas.

    Compuesto según la siguiente fórmula I,

    

    sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales, sus hidratos, sus solvatos, sus formas cristalinas, sus tautómeros individuales o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

    en el que el compuesto es un inhibidor de glutaminil ciclasa de tipo II bacteriana;

    en el que Ar se selecciona del grupo que consiste en arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido;

    en el que L se selecciona del grupo que consiste en un enlace sencillo, -CR5(R6)-, -CR5(R6)-CR7(R8)-y -C(R5)=C(R6)-;

    en el que R1 y R2 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OH, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; y R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, F, Cl, Br, I, OH, alquilo opcionalmente sustituido y heteroalquilo opcionalmente sustituido;

    en el que, dentro de cada par de grupos R1/R2, R3/R4, R5/R6 y R7/R8, los dos grupos pueden estar opcionalmente unidos entre sí para formar un anillo carbocíclico o heterocíclico, u opcionalmente pueden representar =O,

    o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método para la terapia y/o profilaxis de una infección bacteriana.

    Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en el método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14,

    en el que la vía de administración es administración tópica y/o en el que el método es un método no quirúrgico; o

    en el que la vía de administración es administración sistémica y/o en el que el método es un método no quirúrgico.