ES2861478T3 - Estampación de autoensamblado que utiliza superficies hidrófobas estampadas - Google Patents

Abstract

Una superficie estampada con contornos revestidos de gel que comprende un soporte sólido, que comprende: Una superficie, superficie que comprende una capa de revestimiento hidrófobo continua; Una capa de material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido, en donde la capa de material fotorresistente comprende contornos a microescala o nanoescala; y Una capa de material en forma de gel dentro de los contornos a microescala o nanoescala, en donde el material en forma de gel es capaz de enlazarse covalentemente a oligonucleótidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Estampación de autoensamblado que utiliza superficies hidrófobas estampadas

Antecedentes

En general, la presente divulgación se refiere a los campos de los procedimientos de estampación por fotolitografía para producir superficies micro o nano-estampadas para aplicaciones de secuenciación de polinucleótidos. Más específicamente, la presente solicitud se refiere a métodos de autoensamblado para preparar superficies estampadas para celdas de flujo o dispositivos fluídicos digitales.

Sumario

Las celdas de flujo son dispositivos que permiten que un fluido fluya a través de canales o pocillos dentro de un sustrato. Las celdas de flujo estampadas que son útiles en los métodos de análisis de ácidos nucleicos incluyen pocillos discretos que tienen una superficie activa dentro de regiones intersticiales inertes.

Matrices para el análisis de ácidos nucleicos que comprenden sustratos estampados recubiertos de gel se describen, por ejemplo, en el documento WO 2014/133905 A1. Además, un procedimiento para fabricar placas de matriz para biomoléculas que tienen regiones hidrófilas e hidrófobas sin estampados recubiertos de gel pero que utilizan técnicas de fotolitografía para la formación de estampados se describe, por ejemplo, en el documento EP 1364 702 A2. La superficie de la celda de flujo se fabrica normalmente usando las siguientes etapas: (1) los pocillos se graban inicialmente en un sustrato uniforme; (2) los pocillos y las regiones intersticiales se funcionalizan con un silano y un material en forma de gel; (3) el exceso de material en forma de gel que cubre las regiones intersticiales se elimina mediante un procedimiento de pulido; y (4) el material en forma de gel en los pocillos se injerta luego con ADN cebador monocatenario para proporcionar una superficie de celda de flujo para las aplicaciones de secuenciación aguas abajo. En este caso, parte del material en forma de gel se desperdicia en la etapa de pulido del flujo de trabajo de fabricación. Además, la energía superficial de las regiones intersticiales depende en gran medida del sustrato de partida.

La presente invención proporciona una superficie estampada según la reivindicación 1. Las realizaciones se refieren a métodos de autoensamblado para preparar una superficie estampada para aplicaciones de secuenciación. La superficie estampada puede incluir, por ejemplo, una celda de flujo estampada o una superficie estampada para un dispositivo fluídico digital. En algunas realizaciones, los métodos utilizan fotolitografía para crear una superficie estampada con una pluralidad de contornos a microescala o nanoescala separados por regiones intersticiales hidrófobas a la vez que se elimina la necesidad de tratamiento de la superficie con plasma de oxígeno u otro tratamiento antes de la deposición de un material fotorresistente. Además, algunas realizaciones evitan el uso de etapas de pulido químico o mecánico después de la deposición de un material en forma de gel sobre los contornos.

La presente invención proporciona un método según la reivindicación 10 para preparar una superficie estampada con contornos revestidos de gel al: proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie, superficie que comprende una capa de revestimiento hidrófobo continua; colocar un material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido para cubrir la capa de revestimiento hidrófobo; y estampar la capa de material fotorresistente mediante fotolitografía (u otros métodos adecuados conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento) para formar contornos a microescala o nanoescala en la superficie; y depositar una capa de un material en forma de gel dentro de los contornos a microescala o nanoescala, en donde el material en forma de gel es capaz de enlazarse covalentemente a oligonucleótidos. En algunas realizaciones, los contornos a microescala o nanoescala se forman eliminando por decapado partes de la capa de revestimiento hidrófobo. En algunas realizaciones, los contornos a microescala o nanoescala están separados entre sí por regiones intersticiales hidrófobas que comprenden la capa de revestimiento hidrófobo. En algunas realizaciones, al menos una parte de los contornos a microescala o nanoescala están libres de revestimiento hidrófobo. En algunas realizaciones, los métodos no requieren un tratamiento de modificación de la superficie con un plasma (por ej., tratamiento con plasma de oxígeno o descum, tratamiento con corona, calentamiento, activación química o líquida, u otro tratamiento usado para aumentar la energía de la superficie y mejorar las características de enlace) de la superficie antes de colocar el material fotorresistente. En determinadas formas de realización, los contornos son pocillos.

Algunas realizaciones descritas en el presente documento están relacionadas con métodos para preparar una superficie estampada para aplicaciones analíticas, los métodos incluyen: proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie, superficie que comprende una capa de revestimiento hidrófobo continua; colocar un material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido para cubrir la capa de revestimiento hidrófobo; estampar la capa de material fotorresistente mediante fotolitografía (u otros métodos adecuados) para formar contornos a microescala o nanoescala en la superficie separados por regiones intersticiales hidrófobas; quitar el material fotorresistente; y aplicar una capa de material enlazante, tal como una capa de un silano, a la superficie para cubrir al menos una parte de los contornos y una parte de las regiones intersticiales hidrófobas. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además unir covalentemente un material en forma de gel a la capa de material enlazante, tal como un silano. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además unir covalentemente un oligonucleótido al material en forma de gel. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además unir de forma no covalente un material en forma de gel a la capa de material enlazante, tal como un silano. En algunas realizaciones, los métodos comprenden aplicar una capa de material en forma de gel a la capa de material enlazante o capa de silano.

Algunas realizaciones descritas en el presente documento están relacionadas con métodos para preparar una superficie estampada para aplicaciones analíticas, los métodos incluyen: proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie, superficie que comprende una capa de revestimiento hidrófobo continua; colocar un material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido para cubrir la capa de revestimiento hidrófobo; estampar la capa material fotorresistente mediante fotolitografía (u otros métodos adecuados) para formar contornos a microescala o nanoescala en la superficie separados por regiones intersticiales hidrófobas; aplicar una capa de un silano a la superficie para cubrir al menos una parte de los contornos y una parte de las regiones intersticiales hidrófobas; y unir covalentemente un material en forma de gel a la capa de material enlazante o capa de silano. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además eliminar el material fotorresistente para exponer la capa hidrófoba en regiones intersticiales hidrófobas.

En algunas realizaciones, el material enlazante fija, de forma covalente o no covalente, el material en forma de gel a la capa de revestimiento hidrófobo y/o al soporte sólido. En algunas realizaciones, el material en forma de gel está covalentemente enlazado al material enlazante, por ejemplo, un silano.

Además, la presente invención se refiere a un método según la reivindicación 15 para preparar una matriz de polinucleótidos, el método incluye proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie estampada, superficie que comprende contornos a microescala y/o nanoescala recubiertos con un material en forma de gel que es capaz de enlazarse covalentemente a oligonucleótidos, la superficie se prepara mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento; y unir covalentemente una pluralidad de primeros oligonucleótidos y una pluralidad de segundos oligonucleótidos al material en forma de gel.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama esquemático que muestra tres tipos de polímeros perfluorados (CYTOP-A, CYTOP-M y CYTOP-S) que pueden usarse para crear las regiones intersticiales hidrófobas en la superficie estampada de un sustrato. La FIG. 2A es una vista parcial en sección transversal de una superficie estampada de un sustrato de vidrio que incluye una pluralidad de pocillos y regiones intersticiales hidrófobas.

La FIG. 2B es una vista ampliada de la FIG. 2A mostrando tres capas de materiales encima de un portaobjetos de vidrio. La FIG. 2C son imágenes de fluorescencia de tres superficies de vidrio injertadas de un instrumento Typhoon.

La FIG. 3 ilustra los ángulos de contacto de la superficie de vidrio tratada con CYTOP-M y CYTOP-S en comparación con la superficie de control antes y después del tratamiento químico.

La FIG. 4 ilustra una vista en sección transversal de un flujo de trabajo típico para crear una superficie estampada. La FIG. 5 ilustra una realización de un flujo de trabajo mejorado para crear una superficie estampada.

Las FIGs. 6A y 6B son imágenes fluorescentes de la superficie de un dispositivo estampado con micropocillos de 14 pm. La FIG. 6C es una imagen fluorescente de grupos de ADN estampados en micropocillos de 700 nm de diámetro. La FIG. 7 ilustra una realización de un flujo de trabajo de estampado directo mejorado para crear una superficie estampada.

La FIG. 8A ilustra una realización de un flujo de trabajo de estampado mejorado para crear una superficie estampada usando el método de despegado.

La FIG. 8B ilustra una imagen fluorescente de grupos de PAZAM y ADN estampados en estructuras de micropocillos de 14 pm de diámetro utilizando el flujo de trabajo de despegado ejemplificado en la FIG. 8A.

La FIG. 9A ilustra un ejemplo de un procedimiento de reflujo en fase líquida.

La FIG. 9B ilustra un ejemplo de un procedimiento de reflujo en fase de vapor.

La FIG. 10A es una imagen de microscopía óptica de nanopocillos de CYTOP-S revestidos con PAZAM (diámetro de 700 nm a 1,1 pm) después de tratamiento con plasma de O².

La FIG. 10B es una imagen de microscopía óptica de nanopocillos de CYTOP-S revestidos con PAZAM en la FIG.

10A después del reflujo con disolvente en fase líquida.

La FIG. 10C es una imagen de fluorescencia de los nanopocillos de CYTOP-S revestidos de PAZAM de la FIG.

10B después de la humectación/deshumectación de una gota acuosa con un colorante fluorescente.

La FIG. 11A representa el estampado de grupos de ADN en pocillos de tamaño submicrométrico. Los puntos brillantes son grupos de ADN marcados con colorantes fluorescentes. En el área en forma de "t", el material es SiO² sin estampar, y los grupos se distribuyen aleatoriamente. La imagen se generó utilizando la topología representada en la FIG. 11B.

La FIG. 11B representa una ilustración en sección transversal del sustrato estampado. Los pocillos tienen un diámetro de 0,7 micrómetros dispuestos con un paso de 1,75 micrómetros.

La FIG. 11C muestra el ensamblaje de sustrato estampado en un formato de celda de flujo MiSeq® para facilitar el intercambio de biorreactivos. La imagen se generó utilizando la topología representada en la FIG. 11B.

Las FIGs. 12A y 12B muestran que el tamaño y la intensidad de los grupos de ADN son ajustables con diferentes tamaños de pocillos. La FIG. 12A muestra grupos teñidos con SYTOX® que crecen en pocillos de 0,7 micrómetros de diámetro y un paso de 1,75 micrómetros con las capas superficiales que se representan en la FIG. 11B. La FIG.

12B muestra grupos teñidos con SYTOX® que crecen en pocillos de 0,9 micrómetros de diámetro y 1,75 micrómetros de paso.

Las FIGs. 13A-13C muestran los resultados de la secuenciación de la superficie estampada con CYTOP (diámetro del pocillo 0,7 micrómetros; paso 1,75 micrómetros). La FIG. 13A es una imagen de la primera base que muestra canales C y T superpuestos y marcadores fiduciarios circulares que indican estampación de los grupos dentro de los nanopocillos de CYTOP, obtenidos utilizando un método de estampado sin pulir. La FIG. 13B muestra la tasa de desajuste (tasa de error) para la lectura 1 y la lectura 2 de esta ejecución, cada 150 ciclos. La tasa de error alcanzada es similar a la esperada a partir de las ejecuciones de MiSeq (aproximadamente 2% al final de 150 ciclos). Esta figura también demuestra que la rotación de los extremos emparejados es compatible con el método de estampación sin pulir. La FIG. 13C muestra la puntuación q (puntuación de calidad) de las lecturas en función del ciclo de la ejecución, a la vez que proporciona una medida de la calidad del resultado base. Se muestra que el estampado con CYTOP es compatible con la química de secuenciación y es robusto, lo que ralentiza miles de intercambios de flujo para finalizar la secuenciación de 2x150bps. Los detalles de estos experimentos se describen en el Ejemplo 3.

Descripción detallada

Las realizaciones se refieren a métodos para preparar una superficie estampada que pueda usarse en el análisis y síntesis de analitos de interés tales como componentes biológicos que incluyen, pero no se limitan a, células, componentes subcelulares y moléculas. Las moléculas biológicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, nucleótidos, aminoácidos, péptidos, proteínas, polisacáridos, azúcares, metabolitos, cofactores enzimáticos y similares. Los procedimientos analíticos particularmente útiles para los que se pueden usar las superficies estampadas incluyen, por ejemplo, aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. En una realización, la superficie estampada es parte de una celda de flujo o un dispositivo fluídico de electrohumectación. En algunas realizaciones se utilizan técnicas de nanofabricación, tales como fotoencisión, fotograbado o fotolitografía, u otros métodos de estampación tales como la litografía por haz de electrones, la litografía de nanoimpresión, el nanoestampado o la ablación directa, para crear la superficie estampada con una pluralidad de contornos a microescala o nanoescala, separados por regiones intersticiales hidrófobas. Cuando en el presente documento se mencione la fotolitografía como técnica de estampación, estos otros métodos también pueden usarse para estampar las superficies. La superficie estampada se puede fabricar sin la necesidad de un tratamiento con plasma de oxígeno de la superficie del sustrato antes de la fotolitografía. Se puede depositar un material en forma de gel sobre la superficie y se pueden aprovechar las características h id rófobas/hidrófilas diferenciales de los contornos y regiones intersticiales de la superficie para eliminar convenientemente el material en forma de gel de algunas regiones de la superficie mientras se retiene el material en forma de gel en los rasgos deseados. Por ejemplo, el material en forma de gel puede retenerse en pocillos silanizados y eliminarse de las regiones intersticiales hidrófobas alrededor de los pocillos. Tales realizaciones pueden ser particularmente ventajosas al evitar el uso de etapas agresivas de pulido químico o mecánico para eliminar el material en forma de gel de las regiones intersticiales después de la deposición del material en forma de gel sobre la superficie. En algunas realizaciones, las regiones intersticiales hidrófobas comprenden un polímero perfluorado como CYTOP-S.

Los títulos de las secciones que se utilizan en este documento son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.

Preparaciones de la superficie

Algunas realizaciones descritas en el presente documento están relacionadas con métodos para preparar una superficie estampada que está configurada para enlazar analitos, tales como moléculas de ácidos nucleicos, en posiciones predeterminadas, y están relacionadas con las superficies estampadas. Por ejemplo, la superficie estampada puede tener regiones o contornos que tengan características hidrófobas e hidrófilas diferenciales. Esto puede permitir que las químicas de superficies se apliquen de manera diferente a la superficie. Por ejemplo, los contornos, pocillos u otros rasgos formadas en una superficie pueden tratarse para que contengan silanos reactivos y/o un material en forma de gel que está ausente de las regiones intersticiales que separan los contornos, pocillos u otros rasgos entre sí. En una realización, los contornos o pocillos se revisten con un gel o material polimérico similar que es capaz de enlazarse a, o está enlazado a, analitos tales como moléculas de ácidos nucleicos. En esta realización, se puede crear la superficie estampada comenzando con un soporte sólido que comprende una superficie que tiene una capa de revestimiento hidrófobo continua. A continuación, puede depositarse una capa de material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido para cubrir la capa de revestimiento hidrófobo. La capa de material fotorresistente puede luego estamparse mediante fotolitografía usando una fotomáscara que comprende una pluralidad de estampados a microescala y/o nanoescala de modo que los estampados a microescala o nanoescala se transfieren a la superficie para formar contornos a microescala o nanoescala en la capa de revestimiento hidrófobo. A continuación, puede depositarse una capa de un material en forma de gel dentro de los contornos a microescala o nanoescala, en los que el material en forma de gel es capaz de enlazarse covalentemente a oligonucleótidos.

Durante la fotolitografía, el material fotorresistente se expone a un estampado con luz (por ejemplo, luz ultravioleta) mediante el uso de una fotomáscara estampada. La exposición a la luz provoca un cambio químico que permite que la parte de material fotorresistente que está expuesta sea eliminada mediante una solución reveladora que expone parches de la capa de revestimiento hidrófobo subyacente. Después de que se revela el material fotorresistente (por ejemplo, siguiendo una receta estándar para el producto fotorresistente específico usado en el procedimiento), se forman contornos a microescala o nanoescala separando por decapado porciones de la capa de revestimiento hidrófobo expuesta en la superficie. En algunas realizaciones, los contornos a microescala o nanoescala están separados entre sí por regiones intersticiales hidrófobas que comprenden la capa de revestimiento hidrófobo. En algunas realizaciones, al menos una parte de los contornos a microescala o nanoescala están libres de revestimiento hidrófobo. En algunas realizaciones, los contornos comprenden depresiones, tales como canales o pocillos (por ejemplo, micropocillos o nanopocillos). En otra realización, los contornos comprenden protuberancias, tales como crestas, postes o conos (por ejemplo, nanopostes o nanoconos).

En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la capa de revestimiento hidrófobo comprende un polímero fluorado, un polímero perfluorado o un polímero de silicio o una mezcla de los mismos. La cadena principal del polímero puede ser de carbono o silicio, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polímero fluorado es, por ejemplo, un fluoropolímero amorfo (opcionalmente monómeros de THF perfluorados con enlaces 2,3, opcionalmente con grupos funcionales colgantes tales como carboxilo, amida sililada o trifluorometil terminales, por ej., CYTOP-M, CYTOP- S, CYTOP-A, véase la FIG. 1), un politetrafluoroetileno (tal como teflón), parileno (por ej., los grados A, F, HT), un hidrocarburo fluorado, un copolímero fluoroacrílico (tal como Cytonix Fluoropel), un fluorosilano o un fluorocarbono depositado por plasma. En algunas realizaciones, el polímero de silicio es polidimetilsiloxano o un siloxano. En algunas realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo comprende un polímero perfluorado. En algunas realizaciones particulares, el polímero perfluorado se selecciona de CYTOP-M, CYTOP-S o CYTOP-A. En una realización, el polímero perfluorado comprende o es CYTOP-S. En otra realización, el polímero perfluorado comprende CYTOP-M. En otras realizaciones, el polímero perfluorado es una mezcla de CYTOP-S y CYTOP-A. En algunas realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo está en contacto directo con la superficie. El contacto directo puede ser a través de enlaces covalentes o no covalentes. En algunas otras realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo está en contacto con la superficie a través de una primera capa promotora de la adhesión. En un ejemplo, la primera capa promotora de la adhesión comprende un silano funcionalizado o un promotor de la adhesión; una primera capa de adhesión ejemplar comprende CYTOP-A, (3-aminopropil)trimetoxisilano (APTMS) o (3-aminopropil)trietioxisilano (APTES), o combinaciones de los mismos.

Para colocar el material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo para fotolitografía a menudo se requiere cierto grado de coincidencia en la energía superficial entre la capa de revestimiento hidrófobo y la capa de material fotorresistente que se deposita encima de ella. En algunas realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo se prepara para la aplicación del material fotorresistente usando un tratamiento con plasma de oxígeno. En algunos casos, el tratamiento con plasma de oxígeno (como el tratamiento descum) puede dañar la estructura química de la capa de revestimiento hidrófobo. Los presentes métodos eliminan o reducen la necesidad del pretratamiento de la superficie antes de la colocación del material fotorresistente ofreciendo dos procedimientos alternativos.

En una alternativa, se puede usar un material fotorresistente de manera que esté en contacto directo con la capa de revestimiento hidrófobo sin pretratamiento con plasma de oxígeno. En algunas realizaciones, el material fotorresistente es un material fotorresistente positivo. En otras realizaciones, el material fotorresistente es un material fotorresistente negativo. En algunas realizaciones, el material fotorresistente se selecciona de materiales fotorresistentes de la serie Shipley S1800™, por ejemplo, Shipley S1818 (MICROPOSIT™ S1818™) y Shipley S1805 (MICROPOSIT™ S1805™).

En otra alternativa, se puede usar una capa promotora de la adhesión para reducir el desajuste de energía superficial entre la capa de revestimiento hidrófobo y la capa material fotorresistente. En algunas realizaciones, la capa promotora de la adhesión comprende un tensioactivo fluorado. En algunas de tales realizaciones, el tensioactivo fluorado se selecciona de Surflon S-651, Novec FC-4430, Novec FC-4432, Novec FC-4434, Novec FC-5210, Zonyl FSN-100, Zonyl FS-300, Zonyl FS-500, Capstone FS-10, Capstone FS-30, Capstone FS-60, Capstone FS-61, Capstone FS-63, Capstone FS-64 o Capstone FS-65, o combinaciones de los mismos. En una realización, el tensioactivo fluorado comprende Surflon S-651.

Estampado directo con gel

Algunas realizaciones descritas en el presente documento están relacionadas con métodos para preparar una superficie estampada para aplicaciones analíticas mediante un método de estampado directo con gel. En el método de estampado directo con gel, se proporciona un soporte sólido que tiene una superficie con una capa de revestimiento hidrófobo continua. Se coloca un material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo. A continuación, la capa material fotorresistente se estampa mediante fotolitografía utilizando una fotomáscara que comprende una pluralidad de estampados a microescala o nanoescala de modo que los estampados a microescala o nanoescala se transfieren a la superficie para formar contornos a microescala o nanoescala en la superficie separada por regiones intersticiales hidrófobas. En algunas realizaciones, los contornos a microescala o nanoescala se forman eliminando por decapado porciones de la capa de revestimiento hidrófobo y los contornos a microescala o nanoescala están separados entre sí por regiones intersticiales hidrófobas que comprenden la capa de revestimiento hidrófobo. A continuación, se separa el material fotorresistente y se aplica una capa de silano a la superficie para cubrir al menos una parte de los contornos y una parte de las regiones intersticiales hidrófobas. Luego se agrega un gel a la superficie. Los ácidos nucleicos pueden unirse al gel antes, después o durante la unión del gel a la superficie. Estos métodos también se conocen como métodos de creación de estampado directo.

En los métodos de estampado directo descritos en el presente documento, el material fotorresistente restante que no está expuesto a la luz no necesita sufrir ningún cambio químico y puede permanecer en las regiones intersticiales hidrófobas después del procedimiento de revelado. El material fotorresistente restante puede eliminarse con varios reactivos, dependiendo del tipo de material fotorresistente utilizado. Por ejemplo, el material fotorresistente resistente al desprendimiento (LOR) puede ser eliminado mediante MICROCHEM Remover PG. En algunas realizaciones, el material fotorresistente restante se elimina con acetona, por ejemplo, mediante aplicación de ultrasonidos en una solución de acetona. La segunda capa promotora de la adhesión puede eliminarse con el material fotorresistente al mismo tiempo. Alternativamente, la segunda capa promotora de la adhesión se elimina después del material fotorresistente utilizando un reactivo de eliminación diferente. Después de la eliminación del material fotorresistente restante que cubre las regiones intersticiales hidrófobas, la capa de revestimiento hidrófobo que está expuesta puede someterse a una posterior deposición de silano.

En algunas realizaciones, un material en forma de gel se une covalentemente a la capa de silano. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además curar el material en forma de gel. El procedimiento de curado se puede realizar en diversas condiciones, dependiendo del tipo de material en forma de gel utilizado, como lo entenderá un experto en la técnica. En algunas realizaciones, el curado se realiza incubando el material en forma de gel depositado sobre la capa de silano en un horno. En algunas realizaciones adicionales, los métodos incluyen además eliminar el exceso de material en forma de gel de manera que las regiones intersticiales hidrófobas estén sustancialmente libres de material en forma de gel. En algunas realizaciones, la eliminación del material en forma de gel puede realizarse simplemente enjuagando con agua.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento también eliminan la necesidad de pulido químico o mecánico después de la deposición del material en forma de gel.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen además unir covalentemente un ácido nucleico (por ej., oligonucleótido) al material en forma de gel.

Estampado desprendible con gel

Algunas realizaciones adicionales descritas en el presente documento están relacionadas con métodos para preparar una superficie estampada mediante un método de estampado desprendible con gel. Este método puede incluir el uso de un soporte sólido que tenga una capa de revestimiento hidrófobo continua y la colocación de una capa de material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo. A continuación, el material fotorresistente puede estamparse mediante fotolitografía utilizando una fotomáscara que comprende una pluralidad de estampados a microescala o nanoescala, de modo que los estampados a microescala o nanoescala se transfieren a la superficie para formar contornos a microescala o nanoescala en la superficie separados por regiones intersticiales hidrófobas. En algunas realizaciones, los contornos a microescala o nanoescala se forman eliminando por decapado partes de la capa de revestimiento hidrófobo. A continuación, se puede aplicar una capa de un silano a la superficie para cubrir al menos una parte de los contornos y una parte de las regiones intersticiales hidrófobas y se puede unir covalentemente un material en forma de gel a la capa de silano. Estos métodos también se conocen como métodos de desprendimiento.

En los métodos de desprendimiento descritos, en lugar de eliminar el material fotorresistente inmediatamente después de la transferencia del estampado como se describe en el procedimiento de estampado directo, los métodos pueden aplicar directamente una capa de un silano a la superficie para cubrir al menos una parte de los contornos y una parte de las regiones intersticiales hidrófobas en presencia del material fotorresistente. Luego, se puede unir covalentemente un material en forma de gel a la capa de silano. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además curar el material en forma de gel. El procedimiento de curado se puede realizar en diversas condiciones, dependiendo del tipo de material en forma de gel utilizado, como lo entenderá un experto en la técnica. En algunas realizaciones, el curado se realiza incubando en un horno el material en forma de gel depositado sobre la capa de silano.

Después que el material en forma de gel se inmoviliza en la capa de silano, el material fotorresistente restante en las regiones intersticiales se puede eliminar o "desprender”, exponiendo así la capa de revestimiento hidrófobo subyacente. El material fotorresistente restante puede eliminarse mediante varios reactivos, dependiendo del tipo de material fotorresistente. Por ejemplo, el material fotorresistente LOR puede eliminarse con MICROCHEM Remover PG. En algunas realizaciones, el material fotorresistente restante se elimina con acetona, por ejemplo, sonicación en solución de acetona. La segunda capa promotora de la adhesión puede eliminarse con el material fotorresistente al mismo tiempo. Alternativamente, la segunda capa promotora de la adhesión se elimina después del material fotorresistente usando un reactivo de eliminación diferente. En una realización, tanto el material fotorresistente como la segunda capa promotora de la adhesión se eliminan con acetona.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen además eliminar el exceso de material en forma de gel que no está inmovilizado en la capa de silano.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen además unir covalentemente un ácido nucleico (por ej., un oligonucleótido) al material en forma de gel.

En los métodos o composiciones expuestos en este documento (por ej., métodos de preparación de superficies, de estampado directo y de desprendimiento), el silano utilizado en este documento puede comprender grupos funcionales para formar enlaces covalentes con los materiales en forma de gel. Ejemplos no limitantes de los grupos funcionales en el silano incluyen vinilo, acriloilo, alquenilo, cicloalquenilo, heterocicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, heterocicloalquinilo, nitreno, aldehído, hidrazinilo, glicidil éter, epoxi, carbeno, isocianato o maleimida, o variantes opcionalmente sustituidas o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el silano utilizado en el presente documento puede comprender un grupo amino (como APTES o APTMS). En alguna realización preferida, el silano aquí utilizado comprende un silano derivatizado con norborneno. En una realización, el silano comprende [(5-biciclo[2.2.1]hept-2-enil)etil]trimetoxisilano. El silano puede depositarse sobre la superficie del soporte sólido mediante deposición química en fase de vapor.

En los métodos o composiciones expuestos en el presente documento (por ej., métodos de preparación de superficies, estampado directo y desprendimiento), el material en forma de gel que se puede usar incluye, pero no se limita a, hidrogeles o polímeros. Los hidrogeles útiles incluyen, pero no se limitan a, un polímero de acrilamida (SFA) sin silano, poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM), polímeros de poliacrilamida formados a partir de acrilamida y un ácido acrílico o un ácido acrílico que contiene un grupo vinilo como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/31148; polímeros de poliacrilamida formados a partir de monómeros que forman reacciones de foto-cicloadición [2+2], por ejemplo, como se describe en el documento WO 01/01143 o el documento WO 03/014392; o copolímeros de poliacrilamida descritos en la Patente de EE.UU. No. 6.465.178, el documento WO 01/62982 o el documento WO 00/53812. Las variantes tratadas químicamente de estos materiales en forma de gel también son útiles, tal como un hidrogel que tiene sitios reactivos que es capaz de reaccionar con oligonucleótidos que tienen grupos reactivos correspondientes (por ejemplo, PAZAM es capaz de reaccionar con oligonucleótidos 5'- o 3'-alquinilo modificados). Otros geles útiles son los que se forman mediante un cambio de estado dependiente de la temperatura de líquido a gelatinoso. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, agar, agarosa o gelatina. En algunas realizaciones, el material en forma de gel se une covalentemente a la capa de silano.

En algunas realizaciones, un material en forma de gel que se usa incluirá sitios reactivos. El término "sitio reactivo" como se usa en este documento significa un sitio en el gel descrito en este documento que se puede usar para unir una o más moléculas al material en forma de gel, y/o para unir el material en forma de gel a la superficie, por medio de una reacción química o interacción molecular. Ejemplos no limitantes de sitios reactivos incluyen azido, amino opcionalmente sustituido, amino protegido con Boc, hidroxi, tiol, alquinilo, alquenilo, halo, epoxi, tetrazinilo o aldehído. En algunas realizaciones, el material en forma de gel comprende un polímero con grupos funcionales azido como sitios reactivos. En realizaciones particulares, el material en forma de gel comprende PAZAM. PAZAM es capaz de reaccionar con silano derivatizado con norborneno para formar enlaces covalentes mediante cicloadición sin catalizador promovida por deformación. En algunas realizaciones, los sitios reactivos del material en forma de gel también son capaces de formar enlaces covalentes con oligonucleótidos funcionalizados con el fin de injertar cebadores. En algunas realizaciones alternativas, el material en forma de gel se injerta previamente con cebadores antes de reaccionar con la capa de silano.

En algunas otras realizaciones, se puede proporcionar un material formador de gel (por ejemplo, polimerizable) en la superficie en un estado líquido y posteriormente convertirse en un gel. Los ejemplos de materiales polimerizables incluyen, sin limitación, acrilamida, metacrilamida, metacrilato de hidroxietilo, N-vinilpirrolidinona o derivados de los mismos. Tales materiales son útiles para preparar hidrogeles. En algunas realizaciones, el material polimerizable puede incluir dos o más especies diferentes de compuesto que forman un copolímero. Por ejemplo, dos o más especies diferentes de acrilamida, metacrilamida, metacrilato de hidroxietilo, N-vinilpirrolidinona o sus derivados pueden funcionar como comonómeros que polimerizan para formar un hidrogel de copolímero.

Superficies estampadas y soportes sólidos

En el presente documento se describe una superficie estampada con contornos revestidos de gel que comprende un soporte sólido que comprende:

Una superficie, superficie que comprende una capa de revestimiento hidrófobo continua;

Una capa de material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido, en donde la capa de material fotorresistente comprende contornos a microescala o nanoescala; y

Una capa de material en forma de gel dentro de los contornos a microescala o nanoescala, en donde el material en forma de gel es capaz de enlazarse covalentemente a oligonucleótidos.

En algunas realizaciones, los contornos están separados por regiones intersticiales hidrófobas y comprenden además una capa de material enlazante (tal como una capa de silano) que cubre al menos una parte de los contornos y una parte de las regiones intersticiales hidrófobas. En algunas realizaciones, al menos una parte de los contornos a microescala o nanoescala están libres del revestimiento hidrófobo. En algunas realizaciones, los contornos comprenden pocillos. En algunas realizaciones, la superficie comprende una capa de revestimiento hidrófobo, una capa de material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido, en donde la capa de material fotorresistente comprende contornos a microescala o nanoescala; una capa de material enlazante o silano que cubre al menos una parte de los contornos y al menos una parte de las regiones intersticiales hidrófobas.

En algunas realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo comprende un polímero fluorado, un polímero perfluorado o un polímero de silicio, o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo comprende un fluoropolímero amorfo, CYTOP-M, CYTOP-S, CYTOP-A, un politetrafluoroetileno, teflón, parileno, un hidrocarburo fluorado, un copolímero fluoroacrílico, Cytonix Fluoropel, un fluorosilano, un fluorocarbono depositado por plasma, un polímero de silicio, un polidimetilsiloxano o un siloxano, o una mezcla de los mismos. En otras realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo comprende un polímero perfluorado. En otras realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo comprende CYTOP-M, CYTOP-S o CYTOP-A, o una mezcla de los mismos. En otras realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo comprende CYTOP-S. En otras realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo comprende CYTOP-M. En otras realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo comprende CYTOP-S y CYTOP-A.

En algunas realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo está en contacto directo con la superficie. En otras realizaciones, la capa de revestimiento hidrófobo está en contacto con la superficie a través de una primera capa promotora de la adhesión. En algunas realizaciones, la primera capa promotora de la adhesión comprende CYTOP-A, APTMS o APTES, o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el material fotorresistente está en contacto directo con la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido. En otras realizaciones, el material fotorresistente está en contacto con la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido a través de una segunda capa promotora de la adhesión. En algunas realizaciones, la segunda capa promotora de la adhesión comprende un tensioactivo fluorado. En algunas realizaciones, el tensioactivo fluorado es Surflon S-651, Novec FC-4430, Novec FC-4432, Novec FC-4434, Novec FC-5210, Zonyl Fs N-100, Zonyl FS-300, Zonyl FS-500, Capstone FS-10, Capstone FS-30, Capstone FS-60, Capstone FS-61, Capstone FS-63, Capstone FS-64 o Capstone FS-65, o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el material fotorresistente es un material fotorresistente de la serie Shipley S1800™. En algunas realizaciones, el material fotorresistente se selecciona de Shipley S1818 (MICROPOSIT™ S1818™) y Shipley S1805 (MICROPOSIT™ S1805™).

En algunas realizaciones, el material en forma de gel comprende PAZAM. En algunas realizaciones, el material en forma de gel comprende PAZAM unido a ácidos nucleicos.

En algunas realizaciones, la superficie comprende además (a) una capa de material enlazante o (b) una capa de silano, en la que la capa de material enlazante o capa de silano comprende opcionalmente un silano derivatizado con norborneno, y en la que la capa de material enlazante o capa de silano cubre al menos una parte de los contornos y una parte de las regiones intersticiales hidrófobas.

También se describen en el presente documento métodos para preparar tales superficies estampadas.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones técnicas y científicas usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica. El uso de la expresión "que incluye(n)", así como otras formas, como "incluyen", "incluye" e "incluido(a)", no es limitante. El uso del término "que tiene(n)", así como otras formas, como "tener", "tiene" y "tenía", no es limitante. Como se usa en esta memoria descriptiva, ya sea en una frase de transición o en el cuerpo de la reivindicación, el término "comprende(n)" y la expresión "que comprende(n)" deben interpretarse como que tienen un significado abierto. Es decir, los términos anteriores deben interpretarse como sinónimos de las frases "que tiene(n) al menos" o "que incluye(n) al menos". Por ejemplo, cuando se usa en el contexto de un procedimiento, la expresión "que comprende(n)" significa que el procedimiento incluye al menos las etapas enumeradas, pero puede incluir etapas adicionales. Cuando se usa en el contexto de un compuesto, composición o dispositivo, la expresión "que comprende(n)" significa que el compuesto, composición o dispositivo incluye al menos los rasgos o componentes enumerados, pero también puede incluir rasgos o componentes adicionales.

Como se usa en este documento, las abreviaturas comunes se definen como sigue:

APTS Aminopropil-silano

APTES (3-Aminopropil)trietoxisilano

APTMS (3-Aminopropil)trimetoxisilano

aq. Acuoso(a)

Azapa N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida

°C Temperatura en grados centígrados

CA Ángulo de contacto

CVD Deposición química en fase de vapor

dATP Trifosfato de desoxiadenosina

dCTP Trifosfato de desoxicitidina

dGTP Trifosfato de desoxiguanosina

dTTP Trifosfato de desoxitimidina

g Gramo(s)

h Hora(s)

IPA Alcohol isopropílico

min Minuto(s)

mL Mililitro s)

PAZAM Poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) de cualquier proporción de acrilamida a Azapa

RT Temperatura ambiente

SFA Acrilamida libre de silano como se define en la Publicación de Patente de EE.UU. No. 2011/0059865 SBS Secuenciación por síntesis de

SHP Semi-hidrófobo(a)

ssADN ADN monocatenario

Como se usa en este documento, el término "unido(a)" se refiere al estado de dos cosas que se unen, sujetan, adhieren, conectan o enlazan entre sí. Por ejemplo, un analito, tal como un ácido nucleico, puede unirse a un material, tal como un gel o un soporte sólido, mediante un enlace covalente o no covalente. Un enlace covalente se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Un enlace no covalente es un enlace químico que no implica compartir pares de electrones y puede incluir, por ejemplo, puentes de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals, interacciones hidrófilas e interacciones hidrófobas.

Como se usa en este documento, el término "matriz" se refiere a una población de diferentes sondas (por ej., moléculas sonda) que están unidas a uno o más sustratos de manera que las diferentes sondas se pueden diferenciar entre sí según la ubicación relativa. Una matriz puede incluir diferentes sondas que están ubicadas cada una en una ubicación direccionable diferente en un sustrato. Alternativa o adicionalmente, una matriz puede incluir sustratos separados, cada uno con una sonda diferente, en donde las diferentes sondas se pueden identificar de acuerdo con las ubicaciones de los sustratos en una superficie a la que están adheridos los sustratos o de acuerdo con las ubicaciones de los sustratos en un líquido. Los ejemplos de matrices en las que se ubican sustratos separados en una superficie incluyen, sin limitación, aquellos que incluyen perlas en pocillos como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 6.355.431 B1, el documento US 2002/0102578 y la Publicación PCT No. WO 00/63437. Los formatos ejemplares que se pueden usar en la invención para distinguir perlas en una matriz líquida, por ejemplo, usando un dispositivo de microfluidos, tal como un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 6.524.793. Otros ejemplos de matrices que se pueden usar en la invención incluyen, sin limitación, los descritos en las Patentes de EE.UU. Nos.

5.429.807; 5.436.327; 5.561.071; 5.583.211; 5.658.734; 5.837.858; 5.874.219; 5.919.523; 6.136.269; 6.287.768;

6.287.776; 6.288.220; 6.297.006; 6.291.193; 6.346.413; 6.416.949; 6.482.591; 6.514.751 y 6.610.482; el documento WO 93/17126; el documento WO 95/11995; el documento WO 95/35505; el documento EP 742 287; y el documento EP 799 897.

Como se usa en el presente documento, la expresión "unido covalentemente'' o "enlazado covalentemente'' se refiere a la formación de un enlace químico que se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Por ejemplo, un hidrogel unido covalentemente se refiere a un hidrogel que forma enlaces químicos con una superficie funcionalizada de un sustrato, en comparación con la unión a la superficie a través de otros medios, por ejemplo, adhesión o interacción electrostática. Se apreciará que los polímeros que se unen covalentemente a una superficie también se pueden enlazar mediante otros medios además de la unión covalente.

Como se usa en este documento, el término "revestir", cuando se usa como un verbo, pretende significar proporcionar una capa o cubierta sobre una superficie. Al menos una parte de la superficie puede estar provista de una capa o cubierta. En algunos casos, toda la superficie puede estar provista de una capa o cubierta. En casos alternativos, solo una parte de la superficie estará provista de una capa o cubierta. El término "revestir", cuando se usa para describir la relación entre una superficie y un material, pretende significar que el material está presente como una capa o cubierta en la superficie. El material puede sellar la superficie, por ejemplo, evitando el contacto de líquido o gas con la superficie. Sin embargo, el material no necesita formar un sello. Por ejemplo, el material puede ser poroso al líquido, gas o uno o más componentes transportados en un líquido o gas. Los materiales ejemplares que pueden revestir una superficie incluyen, pero no se limitan a, un gel, polímero, polímero orgánico, líquido, metal, una segunda superficie, plástico, sílice o gas.

Como se usa en el presente documento, el término "analito" pretende incluir cualquiera de una variedad de analitos que se van a detectar, caracterizar, modificar, sintetizar o similares. Los analitos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos (por ej., ADN, ARN o análogos de los mismos), proteínas, polisacáridos, células, núcleos, orgánulos celulares, anticuerpos, epítopos, receptores, ligandos, enzimas (por ej., quinasas, fosfatasas o polimerasas), péptidos, candidatos a fármacos de moléculas pequeñas o similares. Una matriz puede incluir varias especies diferentes de una biblioteca de analitos. Por ejemplo, las especies pueden ser diferentes anticuerpos de una biblioteca de anticuerpos, ácidos nucleicos que tienen diferentes secuencias de una biblioteca de ácidos nucleicos, proteínas que tienen diferente estructura y/o función de una biblioteca de proteínas, candidatos a fármacos de una biblioteca combinatoria de moléculas pequeñas, etc.

Como se usa en el presente documento, el término "contorno" pretende significar una variación localizada en la forma de una superficie. Los contornos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, pocillos, hoyos, canales, postes, pilares y crestas. Los contornos pueden ocurrir como cualquiera de una variedad de depresiones en una superficie o proyecciones de una superficie. Todo o parte de un contorno puede servir como rasgo en una matriz. Por ejemplo, una parte de un contorno que ocurre en un plano particular de un soporte sólido puede servir como rasgo en ese plano particular. En algunas realizaciones, los contornos se proporcionan en un patrón regular o repetido en una superficie.

Cuando un material está "dentro de" un contorno, se ubica en el espacio del contorno. Por ejemplo, para un pocillo, el material está dentro del pocillo, y para un pilar o poste, el material cubre el contorno que se extiende por encima del plano de la superficie.

En algunas realizaciones, cuando se dice que una segunda capa "cubre" una primera capa, la segunda capa tiene la forma de una película delgada encima de la primera capa.

Como se usa en este documento, el término "diferente", cuando se usa en referencia a ácidos nucleicos, significa que los ácidos nucleicos tienen secuencias de nucleótidos que no son iguales entre sí. Dos o más ácidos nucleicos pueden tener secuencias de nucleótidos que son diferentes en toda su longitud. Alternativamente, dos o más ácidos nucleicos pueden tener secuencias de nucleótidos que son diferentes a lo largo de una parte sustancial de su longitud. Por ejemplo, dos o más ácidos nucleicos pueden tener porciones de secuencia de nucleótidos diana que son diferentes para las dos o más moléculas, mientras que también tienen una porción de secuencia universal que es la misma en las dos o más moléculas. El término se puede aplicar de manera similar a proteínas que se pueden distinguir como diferentes entre sí en función de las diferencias en la secuencia de aminoácidos.

Como se usa en este documento, el término "cada uno", cuando se usa en referencia a una colección de artículos, está destinado a identificar un artículo individual en la colección, pero no necesariamente se refiere a todos los artículos de la colección. Pueden ocurrir excepciones si la divulgación explícita o el contexto dicta claramente lo contrario.

Como se usa en este documento, el término "rasgo" significa una ubicación en una matriz que está configurada para unir un analito particular. Por ejemplo, un rasgo puede ser todo o parte de un contorno en una superficie. Un rasgo puede contener solo un analito o puede contener una población de varios analitos; opcionalmente, los varios analitos pueden ser de la misma especie. En algunas realizaciones, los rasgos están presentes en un soporte sólido antes de unir un analito. En otras realizaciones, el rasgo se crea mediante la unión de un analito al soporte sólido.

Como se usa en el presente documento, la expresión "celda de flujo" se pretende que signifique un recipiente que tiene una cámara donde se puede llevar a cabo una reacción, una entrada para suministrar reactivos a la cámara y una salida para eliminar reactivos de la cámara. En algunas realizaciones, la cámara está configurada para la detección de la reacción que ocurre en la cámara (por ej., en una superficie que está en contacto fluido con la cámara). Por ejemplo, la cámara puede incluir una o más superficies transparentes que permitan la detección óptica de matrices, moléculas marcadas ópticamente o similares en la cámara. Las celdas de flujo ejemplares incluyen, pero no se limitan a, las utilizadas en un aparato de secuenciación de ácidos nucleicos tales como celdas de flujo para las plataformas Genome Analyzer®, MiSeq®, NextSeq® o HiSeq® comercializadas por Illumina, Inc. (San Diego, CA); o para la plataforma de secuenciación SOLiD™ o Ion Torrent™ comercializadas por Life Technologies (Carlsbad, CA). También se describen celdas de flujo ejemplares y métodos para su fabricación y uso, por ejemplo, en el documento WO 2014/142841 A1; la Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2010/0111768 A1 y la Patente de EE.UU. No. 8.951.781.

Como se usa en este documento, la expresión "material en forma de gel" pretende significar un material semirrígido que es permeable a líquidos y gases. Normalmente, un material en forma de gel puede hincharse cuando absorbe líquido y puede contraerse cuando se elimina el líquido, por ej., por secado. Los geles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen una estructura coloidal, tal como agarosa; una estructura de malla polimérica, tal como gelatina; o una estructura de polímero reticulado, tal como poliacrilamida, acrilamida sin silano (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2011/0059865 A1), PAZAM (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 9.012.022) y polímeros descritos en la Publicación de Patente de Ee .UU. No. 2015/0005447, y la Solicitud de Patente de EE.UU. No. 14/927.252. El material en forma de gel particularmente útil se adaptará a la forma de un pocillo u otros contornos donde resida. Algunos materiales de gel útiles pueden (a) adaptarse a la forma del pocillo u otros contornos donde reside y (b) tener un volumen que no exceda sustancialmente el volumen del pocillo o de los contornos donde reside. En algunas realizaciones particulares, el material en forma de gel es un hidrogel polimérico.

Como se usa en este documento, la expresión "región intersticial" se refiere a un área en un sustrato o en una superficie que separa otras áreas del sustrato o superficie. Por ejemplo, una región intersticial puede separar un contorno o rasgo de otro contorno o rasgo en la superficie. Las dos regiones que están separadas entre sí pueden ser discretas, sin contacto entre sí. En muchas realizaciones, la región intersticial es continua mientras que los contornos o rasgos son discretos, por ejemplo, como es el caso de una matriz de pocillos en una superficie que de otro modo sería continua. La separación proporcionada por una región intersticial puede ser una separación parcial o total. Las regiones intersticiales normalmente tendrán un material superficial que difiere del material superficial de los contornos o rasgos de la superficie. Por ejemplo, los contornos de una matriz pueden tener una cantidad o concentración de material en forma de gel o analitos que exceda la cantidad o concentración presente en las regiones intersticiales. En algunas realizaciones, el material en forma de gel o los analitos pueden no estar presentes en las regiones intersticiales.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido(s) nucleico(s)" y el término "nucleótido(s)" pretenden ser coherentes con su uso en la técnica e incluir especies de origen natural o análogos funcionales de las mismas. Los análogos funcionales de ácidos nucleicos particularmente útiles son capaces de hibridar con un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o pueden usarse como plantilla para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen una cadena principal que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un enlace principal alternativo que incluye cualquiera de los conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen un azúcar tipo desoxirribosa (por ej., que se encuentra en el ácido desoxirribonucleico (ADN)) o un azúcar tipo ribosa (por ej., que se encuentra en el ácido ribonucleico (ARN)). Un ácido nucleico puede contener nucleótidos que tengan cualquiera de una variedad de análogos de estos restos de azúcar que son conocidos en la técnica. Un ácido nucleico puede incluir nucleótidos nativos o no nativos. A este respecto, un ácido desoxirribonucleico nativo puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, timina, citosina o guanina y un ácido ribonucleico puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en uracilo, adenina, citosina o guanina. Se conocen en la técnica bases no nativas útiles que pueden incluirse en un ácido nucleico o en un nucleótido. Los términos "sonda" o "diana", cuando se usan en referencia a un ácido nucleico, están pensados como identificadores semánticos del ácido nucleico en el contexto de un método o composición establecidos en este documento y no necesariamente limitan la estructura o función del ácido nucleico más allá de lo que se indica explícitamente de otro modo. Los términos "sonda" y "diana" se pueden aplicar de manera similar a otros analitos tales como proteínas, moléculas pequeñas, células o similares.

Como se usa en este documento, el término "fluorado" se refiere a una molécula que contiene al menos un átomo de flúor. Como se usa en el presente documento, el término "perfluorado" se refiere a una molécula que contiene dos o más átomos de flúor. En algunas realizaciones, las moléculas perfluoradas son moléculas que contienen hidrocarburos en las que los átomos de hidrógeno de los átomos de carbono con hibridación sp3 se reemplazan por átomos de flúor. Por ejemplo, ciertos polímeros perfluorados descritos en el presente documento contienen un grupo perfluoroalquilo o un resto perfluoroalquileno.

Como se usa en el presente documento, la expresión "material fotorresistente" y sus derivados se refiere a un material sensible a la luz usado en procedimientos tales como fotolitografía, fotoincisión o fotograbado para formar un revestimiento estampado sobre una superficie. Los materiales fotorresistentes cambian la solubilidad con respecto a una solución reveladora cuando se exponen a ciertas longitudes de onda de luz. Las capas de material fotorresistente pueden estar compuestas de material fotorresistente positivo (la región expuesta se vuelve soluble) o negativa (la región expuesta se vuelve insoluble).

Como se usa en este documento, el término "paso", cuando se usa en referencia a contornos o rasgos en una superficie, se pretende que se refiera al espacio de centro a centro para rasgos adyacentes. Un patrón de rasgos se puede caracterizar en términos de paso medio. El patrón puede ordenarse de manera que el coeficiente de variación alrededor del paso medio sea pequeño o el patrón puede ser aleatorio, en cuyo caso el coeficiente de variación puede ser relativamente grande. En cualquier caso, el paso medio puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 nm, 0,1 gm, 0,2 gm, 0,3 gm, 0,4 gm, 0,5 gm, 1 gm, 5 gm, 10 gm, 100 gm o más, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores (por ej., 10 a 100 nm, 10 a 200 nm, 200 a 400 nm, 300 a 500 nm). Alternativa o adicionalmente, el paso medio puede ser, por ejemplo, como máximo aproximadamente 100 gm, 10 gm, 5 gm, 1 gm, 0,5 gm, 0,1 gm o menos, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. Por supuesto, el paso promedio para un patrón particular de rasgos puede estar entre uno de los valores más bajos y uno de los valores superiores seleccionados de los intervalos anteriores.

Como se usa en este documento, la expresión "patrón repetido", cuando se usa en referencia a rasgos, pretende significar que las ubicaciones relativas de un subconjunto de rasgos o contornos en una región del objeto son las mismas que las ubicaciones relativas de un subconjunto de rasgos o contornos en al menos otra región del objeto. En general, la repetición ocurre en las dimensiones x e y. La una región es típicamente adyacente a esa otra región en el patrón. Las ubicaciones relativas de los rasgos en una región de un patrón repetido son generalmente predecibles a partir de las ubicaciones relativas de los contornos en otra región del patrón repetido. El subconjunto utilizado para la medida incluirá generalmente al menos 2 rasgos, pero puede incluir al menos 3, 4, 5, 6, 10 o más rasgos. De forma alternativa o adicional, el subconjunto utilizado para la medida no puede incluir más de 2, 3, 4, 5, 6 o 10 rasgos. Los patrones de repetición ejemplares incluyen celosías cuadradas, celosías rectangulares, celosías rómbicas, celosías hexagonales y celosías oblicuas. Un patrón repetido puede incluir múltiples repeticiones de un subpatrón.

Como se usa en este documento, el término "segregar", cuando se usa en referencia a un material en forma de gel en dos contornos (o en dos rasgos separados), significa separar o aislar el material en forma de gel en uno de los contornos (o en uno de los rasgos) del material en forma de gel en el otro contorno (o en el otro rasgo). Por tanto, el material en forma de gel en el primer contorno (o en el primer rasgo) no está en contacto directo con el material en forma de gel en el otro pocillo (o en el otro rasgo). En algunas realizaciones, el término "segregar" se usa en referencia a un material en forma de gel en dos pocillos, y significa separar o aislar el material en forma de gel en uno de los pocillos del material en forma de gel en el otro pocillo. En algunas realizaciones, el material en forma de gel en los dos pocillos (o en los dos rasgos) está en contacto indirecto, por ejemplo, a través de una solución que pone en contacto los dos pocillos (o rasgos). Alternativamente, el material en forma de gel en los dos pocillos (o en los dos rasgos) ni siquiera está en contacto indirecto. Una región intersticial en una superficie puede segregar el material en forma de gel en dos pocillos (o en los dos rasgos) al estar desprovista del material en forma de gel. En realizaciones particulares, un material en forma de gel puede ser discontinuo en una superficie, estando presente en rasgos, tales como pocillos, pero no presente en regiones intersticiales entre los rasgos.

Como se usa en el presente documento, el término "superficie" pretende significar una parte externa o una capa externa de un soporte sólido o material en forma de gel. La superficie puede estar en contacto con otro material, tal como un gas, líquido, gel, polímero, polímero orgánico, una segunda superficie de un material, metal o revestimiento similar o diferente. La superficie, o regiones de la misma, pueden ser sustancialmente planas o planares. La superficie puede tener contornos superficiales tales como pocillos, hoyos, canales, crestas, regiones elevadas, clavijas, postes o similares.

Como se usa en este documento, la expresión "soporte sólido" se refiere a un sustrato rígido que es insoluble en un líquido acuoso. El sustrato puede ser no poroso o poroso. El sustrato puede opcionalmente ser capaz de absorber un líquido (por ej., debido a la porosidad) pero típicamente será lo suficientemente rígido como para que el sustrato no se hinche sustancialmente al absorber el líquido y no se contraiga sustancialmente cuando el líquido se retira por secado. Un soporte sólido no poroso es generalmente impermeable a líquidos o gases. Los soportes sólidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (por ej., acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon™, olefinas cíclicas, poliimidas, etc.), nailon, cerámica, resinas, Zeonor, sílice o materiales basados en sílice que incluyen silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, haces de fibras ópticas y polímeros. Los soportes sólidos particularmente útiles para algunas realizaciones son componentes de una celda de flujo o ubicados dentro de un aparato de celda de flujo.

Como se usa en este documento, el término "pocillo" se refiere a un contorno discreto en un soporte sólido que tiene una abertura en la superficie que está completamente rodeada por una región o regiones intersticiales de la superficie. Los pocillos pueden tener una variedad de formas en sus aberturas en una superficie que incluyen, pero no se limitan a, redondas, elípticas, cuadradas, poligonales, en forma de estrella (con cualquier número de vértices), etc. La sección transversal de un pocillo tomada ortogonalmente con la superficie puede ser curva, cuadrada, poligonal, hiperbólica, cónica, angular, etc. En algunas realizaciones, el pocillo es un micropocillo o un nanopocillo.

Las realizaciones expuestas en este documento y enumeradas en las reivindicaciones pueden entenderse a la vista de las definiciones anteriores.

La FIG. 1 muestra tres tipos de fluoropolímeros que pueden usarse para crear las regiones intersticiales hidrófobas de la superficie estampada de un sustrato. CYTOP-A, CYTOP-M y CYTOP-S son polímeros perfluorados amorfos disponibles comercialmente, cada uno con la siguiente estructura de la cadena principal:

y diferentes grupos funcionales en ambos extremos de la cadena del polímero. CYTOP-A tiene un grupo funcional terminal -C(O)OH. CYTOP-M tiene un grupo funcional -C(O)NH-Si(OR)n . CYTOP-S tiene grupos funcionales -CF³ . La FIG. 1 también muestra el tipo de posibles interacciones entre cada tipo de polímero CYTOP y la superficie. Indica que CYTOP-S no tiene ninguna interacción química con la superficie del metal, la superficie con acabado de silano o la superficie de Si/SiN debido a la inactividad química del grupo funcional -CF³.

La FIG. 2A es una vista parcial en sección transversal esquemática de una superficie estampada de un sustrato de vidrio 10. Como se muestra, el sustrato de vidrio 10 tiene una superficie superior 15 y una superficie inferior 20. La superficie superior 15 tiene una pluralidad de pocillos 25a-25d formados en la superficie superior 15. Cada uno de los pocillos 25a-25d tiene un material polimérico o gel 30a-30d que reviste las paredes interiores de los pocillos. En la superficie superior 15 se muestra una serie de regiones intersticiales hidrófobas 35a-35e ubicadas entre cada uno de los pocillos 25a-25d. Como se muestra, el material polimérico o gel 30a-30d se deposita en el fondo de los pocillos 25a-25d y grupos de ADN 40a-40d están unidos covalentemente al material en forma de gel 30a-30d.

La FIG. 2B es un ejemplo esquemático más detallado de las superficies descritas en este documento. Como se ilustra, la superficie incluye tres capas de materiales en la parte superior del portaobjetos de vidrio. La capa inferior de CYTOP está en contacto directo con la superficie inferior del vidrio. Sobre el material CYTOP se deposita una capa de silano derivatizado con norborneno. Encima de la capa de norborneno hay una capa superior que comprende PAZAM. Un conjunto de cebadores oligonucleótidos P5/P7 injertados con el fluoróforo TET™ unido están enlazados a la capa de material de PAZAM. Las secuencias de los cebadores P5 y P7 están establecidas en la Patente de EE.UU. No.

8.969.258.

La FIG. 2C son imágenes de fluorescencia de tres superficies de vidrio injertadas. Se realizó una prueba de inactividad química en CYTOP-S y CYTOP-M. La superficie izquierda se utilizó como control y no se revistió con ningún polímero CYTOP. La superficie media se revistió con CYTOP-M y la superficie derecha se revistió con CYTOP-S. Luego, cada superficie se trató con un silano derivatizado con norborneno, seguido de acoplamiento de PAZAM e injerto de oligonucleótidos P5 y P7 a PAZAM. La presencia o ausencia de oligonucleótidos unidos a PAZAM se evaluó mediante hibridación de oligonucleótidos TET marcados con fluorescencia (complementarios a P5 y P7) y detección en un generador de imágenes de fluorescencia Typhoon. La falta de intensidad de oligonucleótidos t Et en la superficie tratada con CYTOP-S indica que PAZAM injertado con oligonucleótidos no se inmovilizó en la superficie tratada con CYTOP-S.

La FIG. 3 ilustra los ángulos de contacto de la superficie de vidrio tratada con CYTOP-M y CYTOP-S en comparación con la superficie de control antes y después del tratamiento químico. La superficie de vidrio tratada con CYTOP mostró un ángulo de contacto de aproximadamente 120 grados para CYTOP-M y aproximadamente 123 grados para CYTOP-S. Después de la deposición de la capa de silano norborneno, el ángulo de contacto disminuyó a 116 grados para CYTOP-M y 120 grados para CYTOP-S. Después del acoplamiento de PAZAM y el injerto de oligonucleótidos, el ángulo de contacto disminuyó sustancialmente hasta 51 grados para la superficie CYTOP-M, lo que indicó que los grupos de ADN y el polímero PAZAM hidrófilo se enlazaron a la superficie y la superficie se volvió hidrófila. Por el contrario, la superficie de CYTOP-S retuvo su hidrofobia con solo una ligera disminución en el ángulo de contacto. Debido a su inactividad química y características hidrófobas, CYTOP-S se identifica como un buen candidato para el estampado de superficies (por ej., para formar regiones intersticiales entre rasgos que portan analitos).

Un flujo de trabajo típico se ilustra en la FIG. 4 para preparar una superficie estampada utilizando CYTOP-S como revestimiento hidrófobo. Primero, la superficie se trató con CYTOP-S. Debido a que CYTOP-S carece de grupos funcionales reactivos para acoplarse a la superficie de vidrio o silicio, se puede usar una capa promotora de la adhesión para facilitar el revestimiento de CYTOP-S a la superficie. En este ejemplo, primero se aplicó una capa delgada de CYTOP-A a la superficie del vidrio. Luego, CYTOP-S se revistió uniformemente sobre la superficie. Después del curado posterior, los polímeros perfluorados en las dos capas de CYTOP se enredan aún más para formar una adhesión más fuerte. Los ejemplos no limitantes de un material que puede usarse como una capa promotora de la adhesión para superficies de vidrio o silicio también incluyen un agente de acoplamiento tipo silano basado en grupos amino, tales como APTMS, APTES, etc.

En este flujo de trabajo estándar, la superficie de CYTOP-S se trató con plasma de oxígeno para depositar un material fotorresistente estándar para fotolitografía. El tratamiento con plasma hace que el CYTOP-S sea más hidrófilo para que el material fotorresistente pueda revestirse encima. Con esta modificación de la superficie, los materiales fotorresistentes estándar tienden a separarse de la superficie. Durante el procedimiento, la superficie CYTOP-S perdió su hidrofobia e inactividad química después del tratamiento con plasma de oxígeno. Si bien la hidrofobia de la superficie de CYTOP-S se recuperó mediante una etapa de reflujo a alta temperatura a 180°C utilizando una solución de CYTOP-S, la inactividad química de la superficie no se recuperó y se observó el enlace no específico de PAZAM a la superficie intersticial de CYTOP-S.

Procedimiento de reflujo

En cualquier realización de los métodos descritos en el presente documento, los métodos pueden comprender además un procedimiento de reflujo para recuperar el daño a la superficie durante el estampado. Por ejemplo, si la superficie de CYTOP-S ha sido dañada (tal como pérdida de la inactividad o de las propiedades hidrófobas) durante el procedimiento de estampado, las propiedades de la superficie de CYTOP-S se pueden restaurar mediante un procedimiento de reflujo utilizando un disolvente que contenga CYTOP-S. El reflujo de disolvente puede realizarse como un procedimiento en fase líquida como se ejemplifica en la FIG. 9A o como un procedimiento en fase vapor como se ejemplifica en la FIG. 9B. Los ejemplos no limitantes de un reflujo en fase líquida incluyen depositar el disolvente con CYTOP-S en la superficie o revestimiento por rotación en la superficie directamente a una temperatura alta (por ejemplo, 180°C), y luego curar a una temperatura más baja (por ejemplo, 50°C). En el reflujo en fase de vapor, el sustrato se coloca en un desecador sellado al vacío con una cierta cantidad de disolvente que contiene CYTOP-S, tal como 2 mL de un disolvente fluorocarbonado perfluorado tal como CT-SOLV100E. Los disolventes que pueden usarse en el procedimiento de reflujo incluyen, pero no se limitan a, CT-SOLV180 o CT-SOLV100E. Otros disolventes de elección incluyen Fluorinert™ FC-40, Fluorinert™ FC-770, cada uno de los cuales es capaz de disolver los polímeros perfluorados.

En otra realización, la superficie de CYTOP-S estampada puede someterse al procedimiento de reflujo después del revestimiento con hidrogel para restaurar el daño de las propiedades de la superficie. El procedimiento de reflujo no tiene ningún impacto en la calidad de secuenciado del hidrogel. La FIG. 10A es una imagen de microscopía óptica de nanopocillos CYTOP-S revestidos con PAZAM (700 nm a 1,1 pm) después del tratamiento con plasma de O² . La FIG.

10B es una imagen de microscopía óptica de los nanopocillos CYTOP-S revestidos de PAZAM en la FIG. 10 A después del reflujo de disolvente en fase líquida. La FIG. 10C es una imagen de fluorescencia de los nanopocillos CYTOP-S revestidos de PAZAM de la FIG. 10B después de la humectación/deshumectación de una gota acuosa con un colorante fluorescente, lo que indica que PAZAM todavía es accesible.

Soporte sólido

Los soportes sólidos que son útiles en un aparato o método de la presente divulgación pueden ser una superficie generalmente plana (por ej., un chip o platina) o pueden tener una superficie curva (por ej., un cilindro o tambor). También puede ser bidimensionales o tridimensionales. Los materiales útiles incluyen vidrio, cuarzo, plástico (tal como poliestireno (poliestireno poco y muy reticulado), policarbonato, polipropileno o poli(metacrilato de metilo)), un copolímero acrílico, poliamida, silicio, un metal (por ej., oro derivatizado con alcanotiolato), celulosa, nailon, látex, dextrano, matriz en forma de gel (por ejemplo, gel de sílice), poliacroleína o materiales compuestos. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende vidrio.

Rasgos

Los rasgos de una matriz pueden tener una variedad de formas. En algunas realizaciones, el término "rasgo" también se refiere a "contornos" en una superficie estampada cuando todo el contorno sirve como rasgo en una matriz. Por ejemplo, cuando se observan en un plano bidimensional, tal como en la superficie de una matriz, los rasgos pueden aparecer redondeados, circulares, ovalados, rectangulares, cuadrados, simétricos, asimétricos, triangulares, poligonales o similares. Los rasgos pueden disponerse en un patrón de repetición regular que incluye, por ejemplo, una celosía cuadrada, una celosía rectangular, una celosía rómbica, una celosía hexagonal o una celosía oblicua. Se puede seleccionar un patrón para lograr el nivel de empaque deseado. Por ejemplo, los rasgos redondos se empaquetan de manera óptima en una disposición hexagonal. Por supuesto, también se pueden utilizar otras disposiciones de empaquetado para rasgos redondos y viceversa.

El tamaño de un rasgo en una matriz (u otro objeto utilizado en un método o sistema en este documento) se puede seleccionar para adaptarse a una aplicación particular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un rasgo de una matriz puede tener un tamaño que se adapte a una única molécula de ácido nucleico. Una superficie que tiene una pluralidad de rasgos en este intervalo de tamaños es útil para construir una matriz de moléculas para la detección con una resolución de una sola molécula. Los rasgos en este intervalo de tamaños también son útiles para su uso en matrices que tienen rasgos que contienen, cada uno, una colonia de moléculas de ácido nucleico. Por lo tanto, los rasgos de una matriz pueden tener cada uno un área que no es mayor que aproximadamente 1 mm2, no mayor que aproximadamente 500 pm2, no mayor que aproximadamente 100 pm2, no mayor que aproximadamente 10 pm2, no mayor que aproximadamente 1 pm2, no mayor que aproximadamente 500 nm2, o no mayor que aproximadamente 100 nm2, no mayor que aproximadamente 10 nm2, no mayor que aproximadamente 5 nm2, o no mayor que aproximadamente 1 nm2. Alternativa o adicionalmente, los rasgos de una matriz no serán menores que aproximadamente 1 mm.2, no menores que aproximadamente 500 pm2, no menores que aproximadamente 100 pm2, no menores que aproximadamente 10 pm2, no menores que aproximadamente 1 pm2, no menores que aproximadamente 500 nm2, no menores que aproximadamente 100 nm2, no menores que aproximadamente 10 nm2, no menores que aproximadamente 5 nm2, o no menores que aproximadamente 1 nm2. De hecho, un rasgo puede tener un tamaño que se encuentra en un intervalo entre un límite superior e inferior seleccionados de los ejemplificados anteriormente. Aunque se han ejemplificado varios intervalos de tamaños para los rasgos de una superficie con respecto a los ácidos nucleicos y en la escala de ácidos nucleicos, se entenderá que los rasgos en estos intervalos de tamaños pueden usarse para aplicaciones que no incluyen ácidos nucleicos. Se entenderá además que el tamaño de los rasgos no necesita limitarse necesariamente a una escala utilizada para aplicaciones de ácidos nucleicos.

Una matriz también se puede caracterizar con respecto al paso. Por ejemplo, el tamaño y/o el paso de los rasgos puede variar de manera que las matrices puedan tener la densidad deseada. Por ejemplo, el paso medio de los rasgos puede ser como máximo de 100 pm, 50 pm, 10 pm, 5 pm, 1 pm, 0,5 pm, 0,4 pm, 0,3 pm, 0,2 pm, 0,1 pm o menos. Alternativa o adicionalmente, el paso medio de los rasgos puede ser de al menos 0,1 pm, 0,2 pm, 0,3 pm, 0,4 pm, 0,5 pm, 1 pm, 5 pm, 10 pm, 50 pm, 100 pm o más. De manera similar, el paso máximo de un rasgo puede ser como máximo 100 pm, 50 pm, 10 pm, 5 pm, 1 pm, 0,5 pm 0,4 pm, 0,3 pm, 0,2 pm, 0,1 pm o menos; y/o el paso mínimo de los rasgos puede ser de al menos 0,1 gm, 0,2 gm, 0,3 gm, 0,4 gm, 0,5 gm, 1 gm, 5 gm, 10 gm, 50 gm, 100 gm o más. Los intervalos anteriores se pueden aplicar al paso promedio, máximo o mínimo entre rasgos.

La densidad de rasgos en una matriz también se puede entender en términos del número de rasgos presentes por unidad de área. Por ejemplo, la densidad promedio de rasgos para una matriz puede ser de al menos aproximadamente 1 x 103 rasgos/mm2, 1 x 104 rasgos/mm2, 1 x 105 rasgos/mm2, 1 x 106 rasgos/mm2, 1 x 107 rasgos/mm2, 1 x 108 rasgos/mm2 o 1 x 109 rasgos/mm2 o mayor. Alternativa o adicionalmente, la densidad promedio de los rasgos para una matriz puede ser como máximo de aproximadamente 1 x 109 rasgos/mm2, 1 x 108 rasgos/mm2, 1 x 107 rasgos/mm2, 1 x 106 rasgos/mm2, 1 x 105 rasgos/mm2, 1 x 104 rasgos/mm2 o 1 x 103 rasgos/mm2 o menos.

Una matriz que tiene un estampado regular de rasgos se puede ordenar con respecto a las ubicaciones relativas de los rasgos, pero al azar con respecto a una o más características de cada rasgo. Por ejemplo, en el caso de una matriz de ácidos nucleicos, los rasgos de los ácidos nucleicos se pueden ordenar con respecto a sus ubicaciones relativas, pero al azar con respecto al conocimiento que se tiene de la secuencia de las especies de ácidos nucleicos presentes en cualquier rasgo particular. Como ejemplo más específico, las matrices de ácidos nucleicos formadas sembrando un estampado repetido de rasgos con ácidos nucleicos plantilla y amplificando la plantilla en cada rasgo para formar copias de la plantilla en el rasgo (por ej., mediante amplificación de grupos o amplificación por puentes) tendrán un estampado regular de rasgos de ácidos nucleicos, determinado por la posición de los contornos que forman los rasgos, pero será aleatorio con respecto a la distribución de secuencias de ácidos nucleicos a través de la matriz. Por tanto, la detección de la presencia de material de ácido nucleico generalmente en la matriz puede producir un estampado repetitivo de rasgos, mientras que la detección específica de secuencias puede producir una distribución no repetida de señales a través de la matriz.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento forman contornos con un único estampado repetitivo. En algunas otras realizaciones, los métodos descritos en este documento forman contornos con múltiples estampados repetidos, proporcionando matrices con al menos un primer estampado repetitivo de rasgos y un segundo estampado repetido de rasgos. En algunas de tales realizaciones, el primer y segundo estampado forman un estampado intercalado a lo largo de la superficie exterior, donde los rasgos del primer estampado repetido ocurren en una primera elevación y los rasgos del segundo estampado repetitivo ocurren en una segunda elevación, y donde los rasgos incluyen puntos de unión para analitos, por lo que los rasgos del primer estampado repetitivo se configuran para unir analitos a una elevación diferente en relación con los analitos unidos a los rasgos del segundo estampado repetitivo. En la solicitud PCT No. PCT/US2017/024578, registrada el 28 de marzo de 2017 y titulada "Multi-plane Microarrays" se describen ejemplos de sustratos que tienen contornos con múltiples estampados repetidos que se pueden fabricar o usar en un método o composición puestos de manifiesto en el presente documento.

Aplicaciones analíticas

Algunas realizaciones están dirigidas a métodos para detectar un analito usando un sustrato con una superficie estampada preparada mediante los métodos descritos en este documento. En algunas realizaciones, el analito se selecciona de ácidos nucleicos, polinucleótidos, proteínas, anticuerpos, epítopos de anticuerpos, enzimas, células, núcleos, orgánulos celulares o fármacos de moléculas pequeñas. En una realización, el analito es un polinucleótido. En una realización, la detección incluye determinar una secuencia de nucleótidos del polinucleótido.

Algunas realizaciones descritas en este documento están relacionadas con métodos para preparar una matriz de polinucleótidos, los métodos incluyen proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie estampada, superficie que comprende contornos a microescala y/o nanoescala revestidos con un material en forma de gel que es capaz de enlazarse covalentemente a oligonucleótidos, la superficie se prepara mediante cualquiera de los métodos descritos en este documento; y unir covalentemente una pluralidad de primeros oligonucleótidos y una pluralidad de segundos oligonucleótidos al material en forma de gel. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además poner en contacto la pluralidad de primeros oligonucleótidos unidos al revestimiento de polímero con plantillas a amplificar, comprendiendo cada plantilla en el extremo 3’ una secuencia capaz de hibridar con los primeros oligonucleótidos y en el extremo 5' una secuencia cuyo complemento es capaz de hibridar con los segundos oligonucleótidos. En algunas realizaciones, los métodos incluyen además amplificar las plantillas usando los primeros y los segundos oligonucleótidos, generando así una matriz agrupada de polinucleótidos.

Algunas realizaciones que usan ácidos nucleicos pueden incluir una etapa de amplificación de los ácidos nucleicos en el sustrato. Se pueden usar muchas técnicas diferentes de amplificación de ADN junto con los sustratos descritos en este documento. Las técnicas ejemplares que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) o amplificación por cebado aleatorio (RPA). En realizaciones particulares, uno o más cebadores usados para la amplificación se pueden unir a un sustrato (por ej., mediante un revestimiento de gel o polímero). En las realizaciones de PCR, uno o ambos cebadores usados para la amplificación pueden unirse al sustrato. Los formatos que utilizan dos especies de cebadores unidos a menudo se denominan amplificación por puente porque los amplicones bicatenarios forman una estructura similar a un puente entre los dos cebadores unidos que flanquean la secuencia de la plantilla que se ha copiado. Los reactivos y las condiciones ejemplares que se pueden usar para la amplificación por puente se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 5.641.658; la Publicación de Patente de EE.UU.

No. 2002/0055100; la Patente de EE.UU. No. 7.115.400; la Publicación de Patente de EE.UU. No. 2004/0096853; la Publicación de Patente de EE.UU. No. 2004/0002090; la Publicación de Patente de EE.UU. No. 2007/0128624; y la Publicación de Patente de EE.UU. No. 2008/0009420.

La amplificación por PCR también se puede llevar a cabo con un cebador de amplificación unido a un sustrato y un segundo cebador en solución. Un formato ejemplar que utiliza una combinación de un cebador anclado y un cebador soluble es la PCR en emulsión como se describe, por ejemplo, en Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8817-8822 (2003), el documento WO 05/010145, o las Publicaciones de Patente de EE.UU. Nos.

2005/0130173 o 2005/0064460. La PCR en emulsión es ilustrativa del formato y se entenderá que, para los propósitos de los métodos expuestos en este documento, el uso de una emulsión es opcional y, de hecho, para varias realizaciones no se usa una emulsión. Además, los cebadores no necesitan estar directamente unidos al sustrato o a soportes sólidos como se establece en las referencias de ePCR y, en su lugar, pueden estar unidos a un revestimiento de gel o polímero como se pone de manifiesto en este documento.

En un método de la presente divulgación, las técnicas de RCA pueden modificarse para su uso. Los componentes ejemplares que se pueden usar en una reacción de RCA y los principios mediante los cuales la RCA produce amplicones se describen, por ejemplo, en Lizardi et al., Nat. Genet. 19: 225-232 (1998) y el documento US 2007/0099208 A1. Los cebadores utilizados para RCA pueden estar en solución o unidos a un revestimiento de gel o polímero.

Las técnicas de MDA pueden modificarse para su uso en un método de la presente divulgación. Algunos principios básicos y condiciones útiles para MDA se describen, por ejemplo, en Dean et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 99: 5261 -66 (2002); Lage et al., Genome Research 13: 294-307 (2003); Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; Walker et al., Nucl. Acids Res. 20: 1691-96 (1992); el documento US 5.455.166; el documento US 5.130.238; y el documento US 6.214.587. Los cebadores utilizados para MDA pueden estar en solución o adheridos a un revestimiento de gel o polímero.

En realizaciones particulares, se puede usar una combinación de las técnicas de amplificación ejemplificadas anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar RCA y MDA en una combinación en la que se usa RCA para generar un amplicón concatémero en solución (por ej., usando cebadores en fase de solución). A continuación, el amplicón se puede usar como plantilla para MDA usando cebadores que están unidos a un sustrato (por ej., mediante un revestimiento de gel o polímero). En este ejemplo, los amplicones producidos después de las etapas combinadas de RCA y MDA se unirán al sustrato.

Los sustratos de la presente divulgación que contienen matrices de ácidos nucleicos pueden usarse para cualquiera de una variedad de propósitos. Un uso particularmente deseable para los ácidos nucleicos es servir como sondas de captura que hibridan con ácidos nucleicos diana que tienen secuencias complementarias. Los ácidos nucleicos diana una vez hibridados con las sondas de captura pueden detectarse, por ejemplo, mediante un marcador reclutado para la sonda de captura. Los métodos para la detección de ácidos nucleicos diana vía hibridación a sondas de captura son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en las Patentes de EE.UU. Nos.

7.582.420; 6.890.741; 6.913.884 o 6.355.431 o las Publicaciones de Patente de EE.UU. Nos. 2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 o 2005/0181440 A1. Por ejemplo, puede reclutarse un marcador en una sonda de captura en virtud de la hibridación de la sonda de captura con una sonda diana que lleva el marcador. En otro ejemplo, se puede reclutar un marcador en una sonda de captura hibridando una sonda diana con la sonda de captura de modo que la sonda de captura se pueda extender mediante ligamento a un oligonucleótido marcado (por ej., mediante actividad ligasa) o mediante la adición de un nucleótido marcado. (por ej., a través de la actividad de la polimerasa).

En algunas realizaciones, se puede usar un sustrato descrito en el presente documento para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido. En tales realizaciones, el método puede comprender las etapas de (a) poner en contacto una polinucleótido polimerasa con grupos de polinucleótidos unidos a una superficie de un sustrato (por ej., a través de uno cualquiera de los revestimientos de polímero o gel descritos en este documento); (b) proporcionar nucleótidos a la superficie del sustrato de manera que se genere una señal detectable cuando la polinucleótido polimerasa utiliza uno o más nucleótidos; (c) detectar señales en uno o más polinucleótidos unidos (o uno o más grupos producidos a partir de los polinucleótidos unidos); y (d) repetir las etapas (b) y (c), determinando así una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido unido al sustrato.

La secuenciación de ácidos nucleicos puede usarse para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido mediante varios procedimientos conocidos en la técnica. En un método preferido, la secuenciación por síntesis (SBS) se utiliza para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido unido a una superficie de un sustrato (por ej., a través de uno cualquiera de los revestimientos poliméricos descritos en este documento). En tal procedimiento, se proporcionan uno o más nucleótidos a un polinucleótido plantilla que está asociado con una polinucleótido polimerasa. La polinucleótido polimerasa incorpora uno o más nucleótidos en una hebra de ácido nucleico recién sintetizada que es complementaria de la plantilla polinucleótida. La síntesis se inicia a partir de un cebador oligonucleótido que es complementario de una parte del polinucleótido plantilla o de una parte de un ácido nucleico universal o no variable que está covalentemente enlazado en un extremo del polinucleótido plantilla. A medida que se incorporan nucleótidos frente al polinucleótido plantilla, se genera una señal detectable que permite determinar qué nucleótido se ha incorporado durante cada etapa del procedimiento de secuenciación. De esta manera, se puede generar la secuencia de un ácido nucleico complementario de al menos una porción del polinucleótido plantilla, permitiendo así la determinación de la secuencia de nucleótidos de al menos una porción del polinucleótido plantilla.

Las celdas de flujo proporcionan un formato conveniente para albergar una matriz que se produce mediante los métodos de la presente divulgación y que se somete a secuenciación por síntesis (SBS) u otra técnica de detección que implica la administración repetida de reactivos en ciclos. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc., pueden fluir hacia/a través de una celda de flujo que alberga una matriz de ácido nucleico preparada mediante los métodos puestos de manifiesto en este documento. Pueden detectarse aquellos sitios de una matriz donde la extensión del cebador hace que se incorpore un nucleótido marcado. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que termina la extensión adicional del cebador una vez que se ha agregado un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, puede añadirse un análogo de nucleótido que tiene un resto terminador reversible a un cebador de manera que la extensión posterior no pueda ocurrir hasta que se administre un agente de desbloqueo para eliminar el resto. Por tanto, para las realizaciones que utilizan terminación reversible, se puede administrar un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Se pueden realizar lavados entre las distintas etapas de entrega. A continuación, el ciclo puede repetirse n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando así una secuencia de longitud n. Ejemplos de procedimientos SBS, sistemas fluídicos y plataformas de detección que pueden adaptarse fácilmente para su uso con una matriz producida por los métodos de la presente divulgación están, por ejemplo, descritos en Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008), los documentos WO 04/018497; US 7.057.026; Wo 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082, cada uno de los cuales se incorpora a este documento como referencia en su totalidad.

En algunas realizaciones del método descrito anteriormente, que emplean una celda de flujo, solo está presente un único tipo de nucleótido en la celda de flujo durante una única etapa de flujo. En tales realizaciones, el nucleótido se puede seleccionar del grupo que consiste en dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos. En otras realizaciones del método descrito anteriormente que emplean una celda de flujo, está presente una pluralidad de tipos diferentes de nucleótidos en la celda de flujo durante una única etapa de flujo. En tales métodos, los nucleótidos se pueden seleccionar entre dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos.

La determinación del nucleótido o nucleótidos incorporados durante cada etapa de flujo para uno o más de los polinucleótidos unidos al revestimiento de polímero sobre la superficie del sustrato presente en la celda de flujo se logra detectando una señal producida en o cerca de la plantilla de polinucleótidos. En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la señal detectable comprende una señal óptica. En otras realizaciones, la señal detectable comprende una señal no óptica. En tales realizaciones, la señal no óptica comprende un cambio en el pH en o cerca de una o más de las plantillas de polinucleótidos.

Las aplicaciones y usos de los sustratos de la presente divulgación se han ejemplificado en el presente documento con respecto a los ácidos nucleicos. Sin embargo, se entenderá que se pueden unir otros analitos a un sustrato expuesto en el presente documento y analizarse. Pueden estar presentes uno o más analitos en o sobre un sustrato de la presente divulgación. Los sustratos de la presente divulgación son particularmente útiles para la detección de analitos o para llevar a cabo reacciones sintéticas con analitos. Por tanto, cualquiera de una variedad de analitos que se van a detectar, caracterizar, modificar, sintetizar o similares puede estar presente en o sobre un sustrato que se expone en el presente documento. Los analitos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos (por ej., ADN, ARN o análogos de los mismos), proteínas, polisacáridos, células, anticuerpos, epítopos, receptores, ligandos, enzimas (por ej., quinasas, fosfatasas o polimerasas), candidatos a fármacos de moléculas pequeñas, o similares. Un sustrato puede incluir múltiples especies diferentes de una biblioteca de analitos. Por ejemplo, las especies pueden ser diferentes anticuerpos de una biblioteca de anticuerpos, ácidos nucleicos que tienen diferentes secuencias de una biblioteca de ácidos nucleicos, proteínas que tienen diferente estructura y/o función de una biblioteca de proteínas, candidatos a fármacos de una biblioteca combinatoria de moléculas pequeñas, etc.

En algunas realizaciones, los analitos se pueden distribuir en rasgos en un sustrato de manera que se puedan resolver individualmente. Por ejemplo, una sola molécula de cada analito puede estar presente en cada rasgo. Alternativamente, los analitos pueden estar presentes como colonias o poblaciones de modo que las moléculas individuales no se resuelvan necesariamente. Las colonias o poblaciones pueden ser homogéneas con respecto a contener solo una única especie de analito (aunque en múltiples copias). Tomando los ácidos nucleicos como ejemplo, cada rasgo de un sustrato puede incluir una colonia o población de ácidos nucleicos y cada ácido nucleico de la colonia o población puede tener la misma secuencia de nucleótidos (ya sea monocatenaria o bicatenaria). Dichas colonias se pueden crear mediante amplificación de grupos o amplificación por puente como se ha establecido anteriormente en el presente documento. Pueden estar presentes múltiples repeticiones de una secuencia diana en una sola molécula de ácido nucleico, tal como un concatámero creado usando un procedimiento de amplificación de círculo rodante. Por tanto, un rasgo de un sustrato puede contener múltiples copias de una única especie de analito. Alternativamente, una colonia o población de analitos que se encuentran en un rasgo puede incluir dos o más especies diferentes. Por ejemplo, uno o más pocillos en un sustrato pueden contener cada uno una colonia mixta que tenga dos o más especies de ácido nucleico diferentes (es decir, moléculas de ácido nucleico con secuencias diferentes). Las dos o más especies de ácido nucleico en una colonia mixta pueden estar presentes en cantidades no despreciables, por ejemplo, permitiendo que se detecte más que un ácido nucleico en la colonia mixta.

Ejemplos

Realizaciones adicionales se describen con más detalle en los siguientes ejemplos, que no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de las reivindicaciones.

Ejemplo 1

La FIG. 5 es un diagrama de flujo de trabajo de un procedimiento ejemplo que se llevó a cabo para preparar una superficie estampada utilizando CYTOP-S. Como se describió anteriormente, se encontró que el tratamiento con plasma de oxígeno de la superficie de CYTOP-S da como resultado la pérdida de la hidrofobia y la inactividad química de la capa de CYTOP. Se descubrió que ciertos materiales fotorresistentes, tales como los materiales fotorresistentes de la serie Shipley 18, pueden hilarse directamente sobre la superficie revestida de CYTOP-S sin requerir ningún tratamiento con plasma de oxígeno.

Preparación de la superficie: Primero, el sustrato (sustrato de vidrio o sustrato de Si revestido con dióxido de silicio) se limpió con alcohol isopropílico (IPA), agua desionizada (DI) y luego se secó haciendo pasar gas nitrógeno. Luego, el sustrato se colocó en un desecador de vacío a 60°C durante 12 horas para la silanización con APTMS. Luego, se aplicó por rotación una solución de revestimiento de CYTOP-A al 0,5% sobre la superficie del sustrato a 2000 rpm durante 20 segundos. El sustrato revestido se horneó suavemente a 50°C durante 30 min. Posteriormente, la solución de revestimiento de CYTOP-S al 5% se revistió por rotación sobre la capa de CYTOP-A a 1000 rpm durante 30 segundos. Para preparar las soluciones CYTOP-A y CYTOP-S, se utilizó un disolvente basado en fluorocarbonos como el CT-SOLV180 de AGC. El sustrato se secó a temperatura ambiente durante 30 min, y luego se horneó a 50°C durante 30 min, seguido de 80°C durante 30 min, y finalmente se horneó a 250°C durante 30 min. El revestimiento de CYTOP-A/S estaba completo y el sustrato listo para fotolitografía.

Fotolitografía: El material fotorresistente Shipley S1800 se revistió directamente por rotación sobre la capa CYTOP de la superficie del sustrato (por ej., 3000 rpm durante 30 segundos para revestir Shipley S1805 con un espesor de 0,5 pm). El sustrato se horneó suavemente a 115°C durante 60 segundos. Se pueden utilizar alineadores de contacto o dispositivos paso a paso con línea G de UV para fotolitografía con una energía de exposición de alrededor de 120 mJ/cm2. El procedimiento de revelado se llevó a cabo colocando los sustratos en el revelador Microposit MF-321 durante 60 segundos, luego enjuagando con agua desionizada y luego secando con gas nitrógeno. El sustrato estampado de material fotorresistente Shipley S18 se horneó luego en un horno a 120°C durante 30 min. Para grabar el CYTOP en el área del pocillo para exponer la superficie inferior de SiO² , el sustrato se trató con plasma de O² (Grabador de Plasma de Placas Paralelas, flujo de O²100 sccm, 150 W, grabado en seco durante 180 segundos). La superficie resultante del sustrato comprendía una superficie de SiO² expuesta y estampada separada por regiones intersticiales cubiertas por CYTOP-S, lista para las etapas de estampado de hidrogel.

Estampado de hidrogel; Se depositó un agente de acoplamiento tipo silano sobre la superficie tratada del sustrato, cubriendo tanto la superficie expuesta de SiO² como las regiones intersticiales cubiertas por CYTOP-S. A continuación, se revistió por rotación el hidrogel sobre el agente de acoplamiento tipo silano para formar un enlace covalente de modo que el hidrogel se inmovilizara en la superficie. Después del curado, el exceso de hidrogel se separó por enjuagado. La superficie estampada de hidrogel se puede utilizar directamente en el injerto de oligonucleótidos sin pulir.

Las FIGs. 6A y 6B son imágenes fluorescentes de una superficie estampada de un dispositivo que contiene micropocillos de 14 pm con un paso de 28 pm antes y después de la formación de grupos y la secuenciación de 14 ciclos. La superficie del dispositivo se preparó de acuerdo con el flujo de trabajo de material fotorresistente Shipley descrito en la FIG. 5 utilizando Shipley S1805 con un espesor total de 370 nm para la capa combinada de CYTOP-A y CYTOP-S. La FIG. 6A ilustra la imagen de una superficie estampada con PAZAM injertada con cebadores oligonucleótidos marcados con colorante TET. La FIG. 6B ilustra el crecimiento de grupos de ADN en micropocillos marcados con colorante intercalante SYTOX®. Está claro a partir de estas imágenes que no hay ningún signo de enlace no específico de cebadores o grupos de ADN en las regiones intersticiales de CYTOP-S hidrófobas entre los micropocillos.

El procedimiento se replicó en dispositivos que contenían micropocillos de 700 nm con un paso de 1,8 pm que se fabricaron utilizando el mismo flujo de trabajo de material fotorresistente Shipley 18 descrito en la FIG. 5. La FIG. 6C es una imagen fluorescente de grupos de ADN con estampados en micropocillos de 700 nm visualizados por el colorante intercalador SYTOX®. Nuevamente, la imagen mostró regiones intersticiales CYTOP-S muy limpias.

Ejemplo 2

En este ejemplo, se llevaron a cabo dos procedimientos de creación de una superficie estampada utilizando un material fotorresistente estándar sin la necesidad de un tratamiento de la superficie con plasma de oxígeno antes de la fotolitografía: un procedimiento directo de estampado y un procedimiento de desprendimiento.

La FIG. 7 ilustra un flujo de trabajo de estampado directo para crear una superficie estampada.

Preparación de la superficie: Primero, se revistieron CYTOP-A y CYTOP-S sobre una superficie de un soporte sólido siguiendo el mismo procedimiento que se describió en el Ejemplo 1. Luego, se mezcló un fluorotensioactivo, Suflon S651, con isopropanol (IPA) para formar una solución al 1% y se revistió por rotación sobre la superficie CYTOP-S a 500 rpm durante 5 segundos y luego 4000 rpm durante 50 segundos. Esta etapa redujo el desajuste en la energía superficial entre la capa de CYTOP y la capa de material fotorresistente que se deposita sobre ella. Posteriormente, el material resistente LOR de MICROCHEM se hiló directamente sobre la superficie tratada sin requerir ningún tratamiento con plasma de oxígeno. Este enfoque expande el flujo de trabajo del procedimiento para permitir el uso de una gran variedad de materiales fotorresistentes que se utilizan en las instalaciones de fabricación más allá de los materiales fotorresistentes Shipley 18. Las etapas subsiguientes en este flujo de trabajo incluyen revestimiento del material fotorresistente, horneado suave, alineación/exposición UV y revelado según sea apropiado para un producto fotorresistente dado. Para separar por decapado el polímero CYTOP en las regiones de los pocillos para exponer el área subyacente de SiO² , el sustrato se trató con plasma de O² (Grabador de Plasma de Placas Paralelas, flujo de O² de 100 sccm, 150 W, grabado en seco durante 180 segundos). La superficie resultante del sustrato comprendía una superficie de SiO² estampada expuesta separada por regiones intersticiales hidrófobas, lista para las etapas de estampado de hidrogel.

Estampado directo: En primer lugar, se eliminó el material fotorresistente que quedaba en la superficie del sustrato sometiendo a ultrasonidos el sustrato en acetona durante 10 min, seguido de enjuague con IPA, enjuague con agua y luego secado con flujo de aire. Alternativamente, el material fotorresistente LOR puede ser eliminado mediante MICROCHEM Remover PG y luego el Suflon-S651 puede ser eliminado mediante acetona. La eliminación del material fotorresistente y el fluorotensioactivo expuso el revestimiento de CYTOP-S subyacente como las regiones intersticiales. Posteriormente, el sustrato se colocó en un desecador de vacío a 60°C durante 12 horas para la silanización de norborneno. Una vez completada la silanización, se revistió el sustrato con PAZAM y se incubó en un horno a 60°C durante 1 hora. El exceso de hidrogel se enjuagó con agua desionizada (DI). A continuación, el sustrato se sometió a ultrasonidos en agua DI a 45°C durante 30 min para eliminar el exceso de hidrogel que quedaba suelto en la superficie sin enlace covalente. El sustrato resultante tendrá hidrogel revestido en el área del pocillo y área intersticial CYTOP limpia libre de hidrogel. El sustrato está listo para el siguiente injerto de cebadores y la siembra y secuenciación de ADN.

La FIG. 8A ilustra un flujo de trabajo de estampado de desprendimiento para crear una superficie estampada. El procedimiento de fabricación del sustrato fue el mismo que el descrito anteriormente en el flujo de trabajo ejemplificado en la FIG. 7. Después del revestimiento de CYTOP y Surflon y la fotolitografía, se grabó la superficie estampada para exponer la superficie de SiO² subyacente en los pocillos. Luego, el sustrato estampado con la capa de material fotorresistente restante en la superficie se puso directamente en un desecador de vacío a 60°C durante 12 horas para la silanización del norborneno. A continuación, el sustrato se revistió con PAZAM y se incubó en un horno a 60°C durante 1 hora. El exceso de hidrogel se enjuagó con DI. A continuación, el sustrato se sometió a ultrasonidos en agua DI a 45°C durante 30 min para eliminar el hidrogel que quedaba suelto en la superficie sin enlace covalente. Posteriormente, el sustrato se sometió a ultrasonidos en acetona a 45°C durante 30 min para eliminar la capa de material fotorresistente en las regiones intersticiales. El hidrogel depositado encima de la capa de material fotorresistente también se eliminó al mismo tiempo. Se expuso la superficie limpia de CYTOP en las regiones intersticiales. La superficie del sustrato resultante tiene hidrogel inmovilizado en las áreas de los pocillos y regiones intersticiales de CYTOP limpias libres de hidrogel. Entonces, el sustrato está listo para el siguiente injerto de cebadores y la siembra y secuenciación de ADN.

La FIG. 8B ilustra una imagen fluorescente de PAZAM y grupos de ADN estampados en estructuras de micropocillos de 14 pm utilizando el flujo de trabajo de desprendimiento ejemplificado en la FIG. 8A. Los grupos de ADN se tiñeron con el colorante SYTOX® Intercalator. La imagen sugiere que el resultado del estampado de hidrogel es comparable al logrado con el flujo de trabajo de estampado directo en la FIG. 7.

Además, la superficie de CYTOP-S reanudó la hidrofobia de la superficie después del estampado del hidrogel tanto en el procedimiento directo como de desprendimiento, con el método de desprendimiento reteniendo una mejor hidrofobia de la superficie en comparación con el método de estampado directo.

Ejemplo 3

Se prepararon células de flujo estampadas con una superficie CYTOP A y varios estampados de pocillos como se describe en el presente documento. La amplificación de las secuencias de ADN se realizó utilizando métodos de amplificación ExAmp y ejecución de 2 x 150 ciclos. La incubación se llevó a cabo durante 1 min, y 15 segundos para el desbloqueo, y las reacciones se realizaron en volúmenes de 65 uL. Se obtuvieron los siguientes resultados, y los resultados se muestran en las FIGs. 13A-13C.

Los resultados demuestran que el estampado de CYTOP es compatible con la química Illumina SBS, y que la superficie es robusta para permitir miles de intercambios de flujo para completar ejecuciones de secuenciación de 2x150bps.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una superficie estampada con contornos revestidos de gel que comprende un soporte sólido, que comprende:

Una superficie, superficie que comprende una capa de revestimiento hidrófobo continua;

Una capa de material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido, en donde la capa de material fotorresistente comprende contornos a microescala o nanoescala; y

Una capa de material en forma de gel dentro de los contornos a microescala o nanoescala, en donde el material en forma de gel es capaz de enlazarse covalentemente a oligonucleótidos.

2. La superficie estampada según la reivindicación 1, en la que los contornos están separados por regiones intersticiales hidrófobas, y que además comprende (a) una capa de material enlazante o (b) una capa de un silano, en donde la capa de material enlazante o la capa de silano cubre al menos una parte de la contornos y una parte de las regiones intersticiales hidrófobas, y en donde al menos una parte de los contornos a microescala o nanoescala están libres del revestimiento hidrófobo.

3. La superficie estampada según la reivindicación 2, en la que la capa de material enlazante o la capa de silano comprende un silano derivatizado con norborneno.

4. La superficie estampada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la capa de revestimiento hidrófobo comprende un polímero fluorado, un polímero perfluorado o un polímero de silicio o una mezcla de los mismos.

5. La superficie estampada según la reivindicación 4, en la que la capa de revestimiento hidrófobo comprende CYTOP-M, CYTOP-S o CYTOP-A, o una mezcla de los mismos.

6. La superficie estampada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la capa de revestimiento hidrófobo está en contacto directo con la superficie, o la capa de revestimiento hidrófobo está en contacto con la superficie a través de una primera capa promotora de la adhesión y, opcionalmente, la primera capa promotora de la adhesión comprende CYTOP-A, APTMS o APTES, o una combinación de los mismos.

7. La superficie estampada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el material fotorresistente está en contacto directo con la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido, o el material fotorresistente está en contacto con la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido a través de una segunda capa promotora de la adhesión y, opcionalmente, la segunda capa promotora de la adhesión comprende un tensioactivo fluorado seleccionado del grupo que consiste en Surflon S-651, Novec FC-4430, Novec FC-4432, Novec FC-4434, Novec FC-5210, Zonyl FSN-100, Zonyl FS-300, Zonyl FS-500, Capstone FS-10, Capstone FS-30, Capstone FS-60, Capstone FS-61, Capstone FS-63, Capstone FS-64 y Capstone FS-65, y una combinación de los mismos.

8. La superficie estampada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el material fotorresistente es un material fotorresistente de la serie Shipley S1800™, opcionalmente el material fotorresistente se selecciona de Shipley S1818 (MICROPOSIT™ S1818™) y Shipley S1805 (MICROPOSIT™ S1805™).

9. La superficie estampada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el material en forma de gel comprende PAZAM.

10. Un método para preparar una superficie estampada con contornos revestidos de gel, que comprende:

Proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie, superficie que comprende una capa de revestimiento hidrófobo continua;

Disponer una capa de material fotorresistente sobre la capa de revestimiento hidrófobo del soporte sólido; Estampar la capa de material fotorresistente para formar contornos a microescala o nanoescala en la superficie separados por regiones intersticiales hidrófobas; y

Depositar una capa de un material en forma de gel dentro de los contornos a microescala o nanoescala, en donde el material en forma de gel es capaz de enlazarse covalentemente a oligonucleótidos.

11. El método según la reivindicación 10, que además comprende:

Eliminar el material fotorresistente; y

Aplicar (a) una capa de material enlazante o (b) una capa de silano a la superficie para cubrir al menos una parte de los contornos y una parte de las regiones intersticiales hidrófobas antes de depositar el material en forma de gel.

12. El método según la reivindicación 11, en el que el material en forma de gel se une covalentemente a la capa de material enlazante o a la capa de silano.

13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que los contornos a microescala o nanoescala se forman eliminando por decapado partes de la capa de revestimiento hidrófobo.

14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, que además comprende curar el material en forma de gel.

15. Un método para preparar una matriz de polinucleótidos, que comprende:

Proporcionar un soporte sólido que comprende una superficie estampada que comprende contornos a microescala o nanoescala revestidos con un material en forma de gel capaz de enlazarse covalentemente a oligonucleótidos, la superficie estampada se prepara mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14; y

Unir covalentemente una pluralidad de primeros oligonucleótidos y una pluralidad de segundos oligonucleótidos al material en forma de gel.