ES2859775T3 - Nanopartículas de lantánido luminiscentes ultrabrillantes que comprenden terbio, con una mayor vida útil de estado excitado - Google Patents
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Abstract
Nanopartícula de lantánido luminiscente, que tiene al mismo tiempo un brillo mejorado y una vida útil aumentada del estado excitado, que comprende una nanopartícula de iones de lantánido que incluyen terbio y varias moléculas de ligando cromóforo que están unidas a la superficie de la nanopartícula de iones de lantánido, caracterizado por que: - dicha nanopartícula de iones de lantánido comprende iones terbio e iones de al menos un segundo lantánido seleccionado del grupo que consiste en: cerio, praseodimio, neodimio, samario, europio, disprosio, holmio, erbio, tulio e iterbio; - dicho ligando es una molécula orgánica que comprende al menos un radical cromóforo de fórmula I o de fórmula II: **(Ver fórmula)** en donde R se selecciona entre H, grupo CN o grupo COOH.
Description
DESCRIPCIÓN
Nanopartículas de lantánido luminiscentes ultrabrillantes que comprenden terbio, con una mayor vida útil de estado excitado
Campo técnico
La presente invención se refiere a nuevas nanopartículas de lantánidos luminiscentes con un brillo importante y una vida útil muy larga del estado excitado.
Más particularmente, se refiere a nanopartículas de iones de terbio co-dopadas con iones de un segundo lantánido, incluidos ligandos cromóforos que recubren la superficie de las mismas, que dan como resultado tanto un brillo mejorado como una vida útil aumentada del estado excitado.
Estas nanopartículas luminiscentes se pueden utilizar ventajosamente en los campos técnicos del análisis biológico, en particular para el análisis fluoro-inmunológico, la obtención de imágenes médicas y la microscopía.
Antecedentes de la invención
En el campo del análisis biológico, existe una necesidad importante de compuestos "marcadores" que puedan unirse específicamente a una biomolécula y sean fácilmente observables.
Gracias a estos compuestos marcadores, se puede detectar y cuantificar ventajosamente la presencia de analitos particulares, como por ejemplo ácidos nucleicos, enzimas, péptidos, productos farmacéuticos (p.ej., narcóticos, venenos, fármacos...), hormonas, metabolitos, microorganismos patógenos, virus o anticuerpos, y especialmente aquellos implicados en estados patológicos, con fines de investigación o diagnóstico.
Los marcadores preferidos deberían ser económicos, seguros, estables y capaces de unirse a una amplia variedad de materiales químicos, bioquímicos y biológicos. Rara vez, y más bien nunca, deberían encontrarse en la naturaleza. Además, deberían dar una señal muy característica, fácilmente detectable en sistemas acuosos, preferiblemente de forma rápida, sensible y reproducible.
En la técnica anterior se ha desarrollado una amplia variedad de marcadores. Por ejemplo, a veces se utilizan marcadores radiactivos. Pero dichos marcadores presentan desventajas, porque son caros, peligrosos, requieren equipos sofisticados y personal capacitado y necesitan un tratamiento de residuos específico.
En ese contexto, son de particular interés los marcadores que son detectables directamente usando espectroscopía de fluorescencia o métodos de detección de luminiscencia. En la técnica anterior se han descrito un gran número de tales marcadores, desarrollados por su fácil unión a otras moléculas, y algunos están disponibles comercialmente. Dichos marcadores deberían poseer idealmente un buen brillo, definido como el producto del coeficiente de extinción molar por el rendimiento cuántico de luminiscencia, bandas de emisión estrechas y una vida útil prolongada del estado excitado, lo que permite técnicas de detección resueltas en el tiempo.
Los nanocristales semiconductores, también llamados puntos cuánticos, por ejemplo los descritos por Medintz et al, Nature Materials, junio de 2005, 4, 435 poseen un buen brillo pero tienen una vida útil de luminiscencia muy corta (menos de un microsegundo) y picos de emisión amplios.
Los iones de lantánido poseen propiedades espectroscópicas muy particulares y son candidatos interesantes para ser utilizados en tales marcadores luminiscentes, como se describe por Bünzli, J.C. G. Chem. Rev. 2010, 110, 2729. De hecho, sus líneas de emisión son muy estrechas y sus vidas de estados excitados son largas y pueden alcanzar unos pocos milisegundos. Por tanto, es posible la discriminación, tanto espectral como temporal, de su señal luminiscente con una relación señal/ruido razonable.
Sin embargo, los correspondientes coeficientes de extinción molar son muy pequeños, lo que genera un brillo muy bajo. Para superar este inconveniente, se han utilizado ligandos fotosensibilizantes para absorber la luz y transferir la energía absorbida hacia los iones de lantánido, gracias a un mecanismo denominado efecto antena.
Los marcadores luminiscentes basados en complejos mononucleares de iones de lantánido capaces de unirse a material biológico existen en la técnica anterior y algunos están disponibles comercialmente (con los nombres comerciales Lumi4 o Lanthascreen, por ejemplo). Las solicitudes de patente WO 00/48990 y WO 00/48991 describen ejemplos de tales marcadores luminiscentes fabricados a partir de un quelato de iones de lantánido que comprenden un ion de lantánido y un agente complejante.
Sin embargo, los marcadores basados en lantánidos mejor conocidos siguen mostrando un brillo modesto, debido a la naturaleza molecular de estos complejos. Los complejos moleculares más eficientes, por ejemplo, descritos en WO 2013/011236; Delbianco, M. y col., Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 54, 10718; WO 2006/001835 o Xu, J. y col., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 199900, presentan un brillo del orden de 104 M-1 cm-1 y una vida útil de luminiscencia modesta que nunca supera los 3 ms.
El documento US2008290318 A1 describe nanopartículas luminiscentes dopadas con lantánidos que comprenden ligandos de citrato. Para mejorar este aspecto, los presentes inventores estaban interesados en nanopartículas de iones de lantánido en lugar de complejos moleculares de iones de lantánido.
Las nanopartículas son objetos pequeños, que tienen un tamaño entre 1 nm y 500 nm según una definición habitual, y están compuestas por numerosos átomos, cuyo interés se debe a la gran cantidad de átomos disponibles en la superficie. Con las recientes innovaciones en el campo, la síntesis de nanopartículas se puede controlar en términos de tamaño, composición elemental y propiedades.
Las nanopartículas de lantánidos son muy prometedoras como marcadores biológicos, ya que ofrecen grandes desplazamientos de Stoke y una fuerte fotoestabilidad. Pero, incluso si están constituidas por varios cientos o miles de cationes de lantánido, las nanopartículas de iones de lantánido también tienen coeficientes de absorción bajos. Sin embargo, los inventores han estudiado la fotosensibilización de nanopartículas de iones de lantánido, en particular de nanopartículas de iones de lantánido que contienen terbio, y han logrado elevar su brillo por encima de 106 M-1 -cm-1, es decir, dos órdenes de magnitud por encima del brillo de complejos moleculares eficientes, recubriéndolos con ligandos cromóforos adecuados que realizan un efecto de antena con iones terbio superficiales. De esta forma, han obtenido nuevas nanopartículas de terbio luminiscentes ultrabrillantes que pueden ser marcadas mediante vectores (moléculas portadoras) de interés analítico para su uso como marcadores.
Además, para mejorar la sensibilidad en los análisis en comparación con los realizados con los complejos mononucleares de iones de lantánido descritos en la técnica anterior, es muy deseable extender la vida útil del estado excitado de los marcadores.
De hecho, con una vida útil más prolongada del estado excitado, es posible realizar mediciones de resolución temporal con una adquisición de señal retardada. Después de una excitación pulsada, se impone un retraso antes de registrar la intensidad emitida. Esta adquisición retardada elimina los fenómenos fluorescentes más cortos y desaparece la señal de todas las demás moléculas fluorescentes. Solo la señal fosforescente de los compuestos de mayor vida útil en estado excitado se mantiene todavía presente para ser medida. Por tanto, el ruido de fondo se reduce significativamente y la relación señal/ruido aumenta sustancialmente. Esta es una ventaja considerable en medios biológicos donde los compuestos fluorescentes son numerosos en el entorno.
Las nuevas nanopartículas luminiscentes que contienen terbio proporcionadas por la invención, además de un brillo importante y la capacidad de unirse a vectores de interés analítico que permiten su utilización como marcadores, tienen una vida útil más larga en estado excitado que los compuestos de la técnica anterior.
Al mejorar la sensibilidad y la resolución de la señal de las mediciones, dicha vida útil muy larga en estado excitado y dicho brillo excepcional en disolución acuosa de las nanopartículas de la invención permiten resultados excepcionales en análisis biológicos y en campos de microscopía.
Descripción de la invención
Para resolver el problema técnico, la invención proporciona una nanopartícula de lantánido luminiscente, que tiene al mismo tiempo un brillo mejorado y una vida útil aumentada del estado excitado, y que comprende una nanopartícula de iones de lantánido que incluye terbio, y varias moléculas de ligando cromóforo que están unidas a la superficie de la nanopartícula de iones de lantánido.
Según la invención, dicha nanopartícula de iones de lantánido comprende iones terbio e iones de al menos un segundo lantánido seleccionado del grupo que consiste en: cerio, praseodimio, neodimio, samario, europio, disprosio, holmio, erbio, tulio e iterbio.
Además, dicho ligando es una molécula orgánica que comprende al menos un radical cromóforo de fórmula I o de fórmula II:
en donde R se selecciona entre H, grupo CN o grupo COOH.
Por tanto, el ligando es una molécula orgánica que incluye un grupo o motivo con la fórmula I o II como se ha descrito anteriormente, y cualquier estructura química adecuada unida a dicho grupo o motivo. Esta estructura química de cualquier tipo, situada después del truncamiento representado, puede ser por ejemplo un grupo OH, una cadena de
carbono ramificada, lineal o cíclica con o sin heteroátomos, una función de anclaje, uno o varios grupos cromóforos adicionales opcionalmente unidos entre sí por un grupo espaciador de cualquier tipo adecuado, o cualquier otra estructura química adecuada.
Gracias a la invención, las nanopartículas obtenidas tienen un brillo y una vida útil en estado excitado que son simultáneamente superiores a 3 ms y a 104 M-1-cm-1, respectivamente, preferentemente simultáneamente superiores a 5 ms y a 105 M-1 -cm-1, respectivamente, y aún más preferentemente simultáneamente superiores a 7 ms y a 106 M-1-cm_1, respectivamente, cuando se miden como se describe en la parte de Ejemplo incluida a continuación, en la sección denominada: "Métodos de medición experimentales de espectroscopia de luminiscencia".
Según una realización de la invención, el segundo lantánido se selecciona entre europio, samario, disprosio e iterbio, y preferentemente es europio.
Dependiendo de las realizaciones, la nanopartícula de ion de lantánido puede contener entre 10 y 99,9 %mol, preferentemente entre 50 y 99,9 %mol, y aún más preferentemente entre 75 y 99,9 %mol de iones terbio, y entre 0,1 y 90 %mol, preferentemente entre 0,1 y 50 %mol, y aún más preferentemente entre 0,1 y 25 %mol de iones del segundo lantánido.
Según una realización preferida de la invención, la nanopartícula de iones de lantánido comprende además iones de un tercer lantánido seleccionado entre lantano, lutecio y gadolinio, y que son preferentemente lantano.
En este caso y dependiendo de las realizaciones, dicha nanopartícula de iones de lantánido puede contener entre 1 y 98,9 %mol, preferentemente entre 10 y 98 %mol, y aún más preferentemente entre 40 y 98 %mol de iones terbio, entre 0,1 y 20 %mol, preferentemente entre 0,5 y 10 %mol, y aún más preferentemente entre 1 y 5 %mol de iones del segundo lantánido, y entre 1 y 90,9 %mol, preferentemente entre 10 y 80 %mol, y aún más preferentemente entre 10 y 20 %mol de iones del tercer lantánido.
Según una realización de la invención, el ligando comprende n radicales cromóforos y un grupo espaciador, en donde el grupo espaciador es una cadena de carbono que contiene heteroátomos que une los radicales cromóforos y en donde n es un número entero de 1 a 10, preferentemente de 2 a 6 y más preferentemente de 2 a 3.
Según una realización preferida de la invención, el ligando comprende además una función de anclaje capaz de unirse covalentemente a una molécula portadora de interés analítico.
Según esta realización, la nanopartícula luminiscente puede comprender además una molécula portadora de interés analítico unida covalentemente a al menos una molécula de ligando.
La molécula portadora de interés analítico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en: péptidos, proteínas, anticuerpos, restos de anticuerpos y moléculas pequeñas de peso molecular inferior a 2000 g-mol-1. Puede ser, por ejemplo, biotina, destiobiotina, estreptavidina o el anticuerpo Matuzumab.
Según una realización preferida de la invención, el ligando se selecciona entre moléculas que tienen una estructura según la fórmula L1, L2, L3, L4 y L5:
Breve descripción de las figuras
Otras características y ventajas de la invención se revelarán leyendo la descripción detallada que sigue, haciendo referencia a las ilustraciones adjuntas, en las que:
- Las Figuras 1 a 3 son, respectivamente, una imagen de microscopía electrónica de transmisión, un gráfico que ilustra la dispersión dinámica de luz en agua ultrapura y un gráfico que muestra el patrón de difracción de rayos X de nanopartículas sólidas, correspondientes a nanopartículas de lantánidos según el ejemplo N ° 5;
- Las Figuras 4 a 6 son respectivamente una imagen de microscopía electrónica de transmisión, un gráfico que ilustra la dispersión dinámica de luz en agua ultrapura y un gráfico que muestra el patrón de difracción de rayos X de partículas sólidas, correspondientes a nanopartículas de lantánidos según el ejemplo N ° 6;
- La Figura 7 es una representación esquemática de dos formas diferentes de obtener nanopartículas luminiscentes biofuncionalizadas según la invención;
- Las Figuras 8 y 10 son gráficos que ilustran la valoración de las nanopartículas de lantánidos según el ejemplo N° 6 por ligando L5, seguida, respectivamente, de absorción UV/visible y de espectroscopía de emisión de fluorescencia;
- La Figura 9 es un gráfico relativo a la valoración de la Figura 8 que muestra la evolución de la absorción a 314 nm en función de la concentración de ligando L5 añadido;
- La Figura 11 es una ampliación de la parte rodeada del gráfico de la Figura 10 que muestra más particularmente el área del espectro correspondiente a la emisión de terbio y europio;
- La Figura 12 es un gráfico relativo a la valoración de la Figura 10 que muestra la evolución de la emisión de intensidad a diferentes longitudes de onda en función de la concentración de ligando L5 añadido; y
- La Figura 13 es un gráfico que muestra los espectros de emisión de nanopartículas de La0.99Eu0.01F3 (curva b’’’) y de La0.9Eu0.1F3 (curva a’’’) recubiertas con ligando L5 en una disolución tampón.
Descripción detallada de la invención
Las nanopartículas luminiscentes según la invención se describirán ahora en detalle haciendo referencia a las figuras 1 a 13.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado entendido habitualmente por el especialista en la técnica a la que pertenece la invención.
La nanopartícula luminiscente según la invención está hecha de una nanopartícula de iones de lantánido que comprende iones terbio e iones de al menos un segundo lantánido seleccionado entre cerio, praseodimio, neodimio, samario, europio, disprosio, holmio, erbio, tulio e iterbio.
Preferiblemente, dicha nanopartícula de iones de lantánido también puede contener iones de un tercer lantánido, que actúa como una matriz hospedante espectroscópicamente silenciosa en las regiones del visible y el infrarrojo cercano, pero que disminuye de forma ventajosa la auto-extinción entre los iones espectroscópicamente activos.
Dichos terceros iones de lantánido pueden ser de forma ventajosa iones de lantano o iones de lutecio que pueden ser dopados fácilmente con iones de terbio e iones de otro lantánido (segundos iones de lantánido) para obtener la nanopartícula de iones de lantánido co-dopada de la invención.
Si se desean propiedades magnéticas, además de las propiedades espectroscópicas, también pueden usarse de forma ventajosa iones gadolinio como terceros iones lantánidos.
Una persona especialista en la técnica puede sintetizar fácilmente las nanopartículas de iones de lantánido en medio acuoso usando los métodos clásicos disponibles. Se pueden preparar, por ejemplo, en agua usando un horno microondas o mediante síntesis hidrotermal en un autoclave, como se explica en detalle en la parte de Ejemplo incluida a continuación.
Cuando se sintetizan de este modo, los diferentes iones lantánidos se sitúan aleatoriamente, algunos en la superficie y otros en el núcleo de la nanopartícula obtenida.
Los inventores sintetizaron y caracterizaron muchas nanopartículas de iones de lantánido de conformidad con la invención, con diferentes niveles de dopaje en terbio y otros iones de lantánido. Varios ejemplos de los mismos se recogen en la Tabla 1 de la parte del Ejemplo incluida a continuación.
Las nanopartículas de iones de lantánido correspondientes a los ejemplos N°5 y N°6 fueron caracterizadas mediante microscopía electrónica de transmisión, dispersión dinámica de luz en agua ultrapura y difracción de rayos X. Los resultados obtenidos se ilustran en las Figuras 1 a 6.
Como se explicó anteriormente, las nanopartículas luminiscentes de la invención están fotosensibilizadas por ligandos cromóforos. Estos ligandos cromóforos absorben energía luminosa y la transfieren a los iones de lantánido presentes en la superficie de la nanopartícula por efecto antena.
La elección de la naturaleza de estos ligandos es importante para tener una excelente coordinación para asegurar la solubilidad y la estabilidad de la nanopartícula, y para obtener las notables propiedades espectroscópicas deseadas.
Los ligandos según la invención se eligen con uno o varios radicales cromóforos que fotosensibilizan específicamente los iones terbio, pudiendo estos radicales cromóforos transferir una cantidad de energía correspondiente al menos al gap energético de la transición 7F6 a 5D4 del terbio.
Por ello, se han elegido radicales cromóforos basados en fluoróforos de ácido dipicolínico o ácido 2-hidroxiisoftálico para sensibilizar los iones Tb(III) de la nanopartícula según la invención. De hecho, el estado triplete de estos radicales (respectivamente 26600 cm-1 y aproximadamente 23000 cm-1) está cerca del estado excitado de los iones Tb(III) (20500 cm-1) lo que permite optimizar la transferencia de energía y conseguir una excelente fotosensibilización.
Las fórmulas de ácido dipicolínico (a la izquierda) y ácido 2-hidroxi-isoftálico (a la derecha) se muestran a continuación:
A partir de estas observaciones, se han sintetizado dos series de ligandos con diferentes enlazadores y sustituyentes. Sin embargo, en contradicción con los ligandos habituales utilizados para la coordinación de iones de lantánido que están muy pre-organizados, los ligandos de la invención se dirigen preferentemente a una coordinación plana para asegurar la estabilización de las nanopartículas, a la vez que se evita la lixiviación de los cationes de lantánido.
Por consiguiente, la presente invención proporciona ligandos ventajosos que comprenden uno o varios radicales cromóforos de fórmula I o de fórmula II:
En donde R se selecciona entre H, grupo CN o grupo COOH.
Estos radicales cromóforos tienen varios átomos de oxígeno y nitrógeno que sirven como puntos de anclaje que aseguran la unión del ligando a la superficie de la nanopartícula de lantánido, y una parte aromática capaz de absorber fuertemente la energía luminosa y posteriormente transferirla a los iones terbio de la superficie de la nanopartícula de lantánido donde están adheridos.
Un ejemplo de ligando de acuerdo con la invención es en particular la molécula que se representa a continuación denominada L5:
A continuación, se muestran otros cuatro ejemplos preferenciales de ligandos, denominados L1, L2, L3 y L4:
Los métodos de síntesis de los ejemplos de ligandos L1 a L5 se describen a continuación en la parte del Ejemplo. Cuando el ligando comprende varios radicales cromóforos, estos radicales se unen preferentemente entre sí dentro del ligando, mediante una cadena carbonada, denominada grupo espaciador, que tiene una longitud que aumenta con el número de radicales cromóforos del ligando.
Como puede observarse en L1 a L4, el grupo espaciador es preferentemente una cadena de carbono ramificada que contiene uno o varios heteroátomos, por ejemplo átomos de nitrógeno, con al menos tantos brazos como radicales cromóforos para enlazar.
De forma ventajosa, el ligando según la invención puede comprender además una función de anclaje capaz de unirse covalentemente a una molécula portadora de interés analítico. En este caso, esta función de anclaje también está ligada al resto de la molécula por el grupo espaciador.
En el caso de la realización descrita anteriormente, el grupo espaciador puede tener un brazo suplementario para unirse a la función de anclaje.
La naturaleza de la función de anclaje viene determinada en función de la naturaleza del vector o molécula portadora a unir. Su estructura química está elaborada para poder unirse de forma específica y covalente a la estructura química de la molécula portadora deseada. Por tanto, esta estructura de anclaje puede ser adaptada por un especialista en la técnica para que corresponda exactamente a la aplicación deseada.
Las moléculas portadoras deseadas pueden ser diversas, dependiendo de la etiqueta o marcador que se desee obtener. Se han previsto varios de dichos vectores y son compatibles con la invención, incluidos, por ejemplo, péptidos, proteínas, anticuerpos, restos de anticuerpos o moléculas pequeñas de peso molecular inferior a 2000 g-mol_1 tales como biotina o destiobiotina, por ejemplo.
Tras la fijación de los ligandos alrededor de la nanopartícula de iones de lantánido y de la unión covalente de una molécula portadora de interés analítico a los ligandos, gracias a la invención, se obtienen nanopartículas luminiscentes ultrabrillantes biofuncionalizadas.
Como se representa esquemáticamente en la Figura 7, son posibles dos formas diferentes de obtener tales nanopartículas luminiscentes biofuncionalizadas, dependiendo del orden en que se realicen los pasos.
Según la primera forma, representada anteriormente, las moléculas de ligando 1, cada una de las cuales comprende un radical cromóforo 2, un grupo espaciador 3 y una función de anclaje 4, se mezclan primero con biomoléculas 5 (moléculas portadoras o vectores), que pueden ser por ejemplo péptidos o anticuerpos. Estas biomoléculas 5 se unen a las moléculas de ligando 1 a través de su función de anclaje 4 y se obtienen moléculas de ligando 6 biofuncionalizadas.
En un segundo paso, las nanopartículas de lantánido 7 se mezclan con las moléculas de ligando biofuncionalizadas 6 que recubren la superficie de las nanopartículas de lantánido 7 mediante sus radicales cromóforos 2.
Según la segunda forma, representada a continuación, las moléculas de ligando 1 se ponen inmediatamente en contacto con las nanopartículas de lantánido 7. Los radicales cromóforos 2 de las moléculas de ligando 1 se unen a la superficie de las nanopartículas de lantánido 7 formando así nanopartículas recubiertas 8.
Estas nanopartículas 8 recubiertas se mezclan con biomoléculas 5 en un segundo paso. Estas biomoléculas 5 se unen covalentemente a la función de anclaje 4 de las moléculas de ligando 1 ya unidas a las nanopartículas de lantánido 7.
Ambas formas descritas dan como resultado la obtención de nanopartículas 9 luminiscentes biofuncionalizadas según la invención. Debido al impedimento estérico originado por las biomoléculas 5, difieren en el número de ligandos de recubrimiento fijos (más importantes en la segunda forma) y en la cantidad de biomoléculas fijas (más importantes en la primera forma) y, por lo tanto, pueden ser elegidos alternativamente por el especialista en la técnica dependiendo de la aplicación final.
En consecuencia, los ligandos L1 a L4 descritos anteriormente pueden fijar ventajosamente moléculas portadoras de interés analítico, mediante la reacción de las funciones hidroxilo, amina o tiol de las moléculas portadoras, por ejemplo, con las funciones de anclaje de los ligandos L1 a L4, con el fin de producir ligandos biofuncionalizados.
Los presentes inventores han sintetizado y probado dos ejemplos particulares de ligandos biofuncionalizados obtenidos a partir del ligando L1. Estos ejemplos, en relación con la biofuncionalización del ligando L1 por estreptavidina y por el anticuerpo Matuzumab, se describen en detalle en la parte de Ejemplo posterior.
Además de biofuncionalizar ventajosamente nanopartículas luminiscentes, la invención proporciona nanopartículas luminiscentes con propiedades espectroscópicas excepcionales.
Como se ha explicado anteriormente, el recubrimiento de las nanopartículas de iones de lantánido con ligandos que contienen cromóforos adecuados mejora el brillo de las nanopartículas resultantes gracias a la transferencia de energía a través del efecto antena de los cromóforos a los iones terbio situados en la superficie de la nanopartícula. Sin embargo, dichos iones terbio de superficie están sujetos a una extinción vibratoria por acción de las moléculas de agua del entorno acuoso que los rodea en un medio biológico, lo que reduce desventajosamente su vida útil en estado excitado y disminuye su rendimiento cuántico y, por lo tanto, posteriormente su brillo.
Para resolver este problema técnico, la invención proporciona nanopartículas de lantánidos que comprenden, además de iones terbio, iones de un segundo lantánido adecuado diferente del terbio.
El objetivo de esta adición de un segundo ion de lantánido es promover la luminiscencia de los iones de lantánido situados en el núcleo de la nanopartícula.
De hecho, los iones de lantánido situados en el núcleo de la nanopartícula tienen una vida útil más prolongada y un rendimiento cuántico intrínseco mejorado respecto a los iones de superficie, ya que están protegidos de la extinción vibratoria debida a las moléculas de agua del medio. Sin embargo, están lejos de la superficie y no pueden ser sensibilizados de manera eficiente por los ligandos cromóforos que actúan como una antena.
Introduciendo iones de un segundo lantánido, apropiadamente seleccionado entre cerio, praseodimio, neodimio, samario, europio, disprosio, holmio, erbio, tulio e iterbio para poder cooperar con los iones terbio, se obtiene de forma ventajosa la participación luminiscente de dichos iones centrales.
De hecho, se promueve una transferencia de energía de los iones de terbio Tb3+ situados en la superficie de las nanopartículas a los iones del segundo lantánido Ln3+, presentes en el núcleo de las nanopartículas, mediante el efecto embudo.
Gracias a esta eficiente transferencia de energía, los iones terbio de la superficie actúan como un relé para acceder y fotosensibilizar los iones de lantánido del núcleo. En consecuencia, se mejoran las propiedades espectroscópicas de las nanopartículas. Se mejora el brillo de las nanopartículas y simultáneamente aumenta su vida útil en estado excitado en medio acuoso.
Tales efectos ventajosos se han demostrado en las Figuras 8 a 13 relativas a estudios realizados sobre nanopartículas luminiscentes según la invención y que comprenden nanopartículas de lantánidos según el ejemplo N°6 recubiertas con moléculas de ligando L5.
Estos estudios se han realizado para comprender el comportamiento de las nanopartículas de lantánidos del ejemplo N°6 en presencia del ligando L5. Mediante valoraciones de L5, se han monitorizado los espectros de absorción, excitación y emisión de las nanopartículas. El objetivo de estas pruebas fue demostrar que la sensibilización de los iones Tb(III) por parte de L5 mejora las propiedades espectroscópicas en agua de los iones Eu(III) de la nanopartícula utilizando la transferencia de energía entre Tb y Eu.
En la Figura 8, se ha valorado una disolución tampón (TRIS/HCl, 0,01 M, pH = 7) que contiene nanopartículas de La0.14Tb0.85Eu0.01F3 ([c] = 13,5 pM) con el ligando L5. Dicha operación ha consistido en agregar volúmenes crecientes de una disolución acuosa de L5 ([c] = 5x10-4 M) y monitorizar la absorción de la disolución resultante mediante espectroscopia de absorción UV/visible.
Cada curva, de a a 1, corresponde a un volumen V añadido creciente diferente de la disolución de ligando L5.
La curva a corresponde a la disolución de nanopartículas sola, sin ligandos L5, es decir, a un volumen añadido de Va = 0 |uL de disolución de ligando L5.
Las curvas b a 1 corresponden respectivamente a un volumen añadido de disolución de ligando L5 de Vb = 20 pL para la curva b, Vc = 40 pL para la curva c, Vd = 60 pL para la curva d, Ve = 80 pL para la curva e, Vf = 100 pL para la curva f, Vg = 120 pL para la curva g, Vh = 140 pL para la curva h, Vi = 200 pL para la curva i, Vj = 400 pL para la curva j, Vk = 650 pL para curva k y V i = 900 pL para la curva 1.
Como se puede observar en la Figura 8, la absorción de la disolución aumenta de la misma forma que el volumen de ligando añadido.
Si la absorción a 314 nm, correspondiente al máximo de la banda de absorción del ligando L5, se estudia específicamente como se representa en la Figura 9, se puede observar que el aumento de la banda de absorción a 314 nm es lineal en función de la concentración de ligando añadido.
Al mismo tiempo, los espectros de emisión de las nanopartículas de La0.14Tb0.85Eu0.01 F3 también se midieron mediante espectroscopia de fluorescencia (con Aexc = 330 nm) para cada adición de L5 y se representan en las Figuras 10 y 11, correspondiendo cada curva a’ a 1’ a un volumen añadido creciente diferente de disolución de ligando L5.
Como anteriormente, la curva a’ corresponde a la disolución de nanopartículas sola, sin ligandos L5, es decir, a un volumen agregado de Va’ = 0 pL de disolución de ligando L5, y las curvas b’ a 1’ corresponden respectivamente a un volumen agregado de disolución de ligando L5, de Vb' = 20 pL para la curva b’, Vc’ = 40 pL para la curva c’, Vd’ = 60 pL para la curva d’, Ve’ = 80 pL para la curva e’, Vf’ = 100 pL para la curva f ’, Vg’ = 120 pL para la curva g’, Vh’ = 140 pL para la curva h’, Vi’ = 200 pL para la curva i’, Vj’ = 400 pL para la curva j ’, Vk’ = 650 pL para la curva k’ y Vi’ = 900 pL para la curva l’.
La longitud de onda de excitación elegida, Aexc = 330 nm, corresponde a una longitud de onda de absorción del ligando L5.
La curva a’ correspondiente a la disolución de nanopartículas sin ligandos L5 muestra que cuando se excitan a 330 nm, las emisiones de Tb y Eu de las nanopartículas son extremadamente débiles. La curva a’ casi coincide con el eje de abscisas.
La primera adición del ligando correspondiente a la curva b’ permite sensibilizar los iones Tb y Eu para obtener un espectro de emisión que contiene las cuatro bandas de emisión típicas del terbio a 485, 545, 584 y 621 nm y la señal del europio con bandas estrechas a 579 nm, 583-603 nm, 604-630 nm, 650 nm y 679-707 nm con el máximo de emisión a 592 nm.
La importancia de estas bandas de emisión aumenta de la misma manera que aumenta la cantidad añadida de ligandos, desde la curva b’ a la curva l’).
Las bandas de emisión correspondientes al terbio y al europio se pueden observar más fácilmente en la ampliación de la Figura 11.
Aparece otra banda de emisión en el área de 415 nm y aumenta cuando se agregan grandes cantidades de ligando. Esta banda se debe a la fluorescencia del ligando en disolución.
Como se puede observar en la Figura 12, la evolución de la intensidad de diferentes picos del espectro en función del ligando añadido presenta diferentes comportamientos durante la valoración con el ligando L5.
La curva a’’ muestra la evolución de la intensidad de emisión a 415 nm, que corresponde a la banda de emisión del ligando L5. Como era de esperar, la curva a’’ es casi lineal en función de la concentración de ligandos añadidos. La pendiente de la curva a’’ aumenta ligeramente después del volumen equivalente (como se explica a continuación) debido a la proliferación de moléculas de ligando L5 no coordinadas en la disolución.
La curva b’’ muestra la evolución de la intensidad de emisión para la banda principal de terbio a 545 nm. La intensidad de emisión de terbio aumenta gradualmente en la primera parte de la curva b’’, a medida que aumenta el número de moléculas de ligando L5 unidas en la superficie de las nanopartículas de lantánidos. Entonces, se alcanza un máximo cuando la superficie de las nanopartículas de lantánidos está totalmente recubierta por moléculas de ligando L5. Esta emisión de fuerte intensidad se debe a la fotosensibilización de los iones terbio de la superficie de las nanopartículas por las moléculas del ligando L5.
El punto de intersección P de las dos rectas relacionadas con la región de crecimiento y con la región del máximo, permite definir el volumen equivalente de la valoración, que corresponde al volumen mínimo de disolución de ligando necesario para recubrir completamente la superficie de la nanopartícula. En el caso representado, el volumen equivalente se situó en 423 pL (correspondiente a una concentración de 8,8 x 10-5 m olL-1).
Se ha observado la evolución de la emisión de europio en dos bandas a 614 nm y 700 nm correspondientes respectivamente a las curvas c’’ y d’’. Desde la primera adición de disolución de ligando L5, aparece una fuerte emisión que alcanza una intensidad máxima para las dos bandas. Esta emisión permanece constante con las siguientes adiciones de disolución de L5.
La fuerte emisión de iones europio mostrada por las curvas c’’ y d’’ demuestra que la fotosensibilización de los iones terbio en la superficie por el ligando L5 viene seguida de forma ventajosa por una transferencia cuantitativa de la energía a los iones europio del interior del núcleo de las nanopartículas, como se esperaba en la invención. Esta importante emisión no puede ser causada por una fotosensibilización directa de los iones europio presentes en la superficie por el ligando L5, ya que las moléculas del ligando L5 apenas los fotosensibilizan como se ilustra en la Figura 13.
De hecho, en la Figura 13, se han monitorizado los espectros de emisión de dos nanopartículas de lantánidos que contienen iones europio pero no iones terbio, respectivamente Lao.9Euo.1 F3 con una concentración de 1,29 nM para la curva a’’’ y La0.99Eu0.01F3 con una concentración de 246 pM para la curva b’’’, en presencia de disolución de ligando L5 ([L5] = 1,22 x 10-5 M) en una disolución tampón (TRIS/HCl 0,01 M, pH 7,0) después de una excitación a una longitud de onda de Aexc = 330 nm correspondiente a la absorción del ligando L5. En estos espectros, la banda de emisión de las moléculas del ligando L5 es el único pico de emisión visible importante y casi no se observa ninguna banda de emisión de europio.
EJEMPLO:
Síntesis de nanopartículas de iones de lantánido:
Se han utilizado dos métodos experimentales para la síntesis de nanopartículas de iones de lantánido.
El primer método utiliza irradiación de microondas. Se ha realizado en agua usando un horno microondas.
Según dicho primer método, se han preparado disoluciones de NH4 F, TbCh, LnCh y opcionalmente LaCh en agua milliQ. Ln corresponde al segundo lantánido de la nanopartícula de la invención y es alternativamente cerio, praseodimio, neodimio, samario, europio, disprosio, holmio, erbio, tulio o iterbio.
La primera etapa de la síntesis ha consistido en mezclar TbCh, LnCl3 y opcionalmente LaCl3, en cantidades correspondientes al co-dopaje deseado para las nanopartículas.
En una segunda etapa, se ha añadido la disolución de NH4 F a temperatura ambiente. Este volumen agregado de NH4 F correspondió a tres equivalentes por 1 equivalente de lantánidos.
La tercera etapa fue luego calentar la mezcla a 150°C en un horno microondas durante 12 min. La síntesis en horno microondas permitió obtener un calentamiento homogéneo con un aumento de temperatura rápido y preciso, una síntesis rápida a temperatura media y, por lo tanto, se esperaba que produjera nanopartículas con una distribución de tamaño estrecha.
Después de centrifugar durante 25 minutos a 9000 tr/min, se eliminó el sobrenadante y se dispersó el sólido blanco en agua milliQ utilizando ultrasonidos durante 1 h a 60°C para obtener una suspensión acuosa de las nanopartículas. El segundo método es una síntesis hidrotermal en autoclave a 150°C en agua.
Salvo la tercera etapa correspondiente al calentamiento, el procedimiento fue exactamente el mismo. En la tercera etapa de este método, la mezcla se ha encapsulado en un reactor de acero y se ha calentado en un horno durante 2h a 150°C.
Después de centrifugar, eliminar el sobrenadante y dispersar mediante ultrasonidos, se obtuvo una disolución acuosa de las nanopartículas con un rendimiento similar al del primer método.
En consecuencia, se han sintetizado diferentes ejemplos de nanopartículas de iones de lantánido, que se muestran a continuación en la tabla 1:
Tabla 1:
Síntesis de los ligandos L1, L2 y L3:
Los ligandos reivindicados L1, L2 y L3 se prepararon siguiendo las etapas de síntesis mostradas a continuación y con los compuestos intermedios 1 a 7 indicados a continuación:
El compuesto 1 se obtuvo en dos etapas por oxidación de 2,6-dimetil anisol con KMnO4 en presencia de NaOH a 110°C durante una noche, seguido de acidificación del medio y esterificación en presencia de EtOH. El rendimiento global fue del 79% para las dos etapas.
TLC: Rf = 0,84 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 51,36 (t, J = 7,0 Hz, 6 H, CH3), 3,90 (s, 3H, CH3), 4,35 (q, J = 7,1 Hz, 4 H, CH2), 7,16 (t, J = 7,8 Hz, 1 H, Har), 7,87 (d, J = 7,8 Hz, 2 H, Har). RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) 514 (CH3), 61 (CH2), 64 (CH3), 123 (CH), 127 (Cquat), 135 (CH), 159 (Cquat), 166 (Cquat). ESI/MS (modo positivo): m/z = 253,11 ([M+H]+, 100%), 254,11 ([M+H]+, 13%), 255,11 ([M+H]+, 2%), 527,19 ([2M+Na+], 48%). Análisis elemental calculado para C13H16O5.1 /3 H2O: C, 60,46, H, 6,50. Encontrado: C, 60,63, H, 6,29.
El compuesto 2 se obtuvo mediante una saponificación controlada del compuesto 1 con KOH en EtOH con un rendimiento del 76%.
TLC: Rf = 0,70 (SiOH, DCM/MeOH: 9/1). RMN de 1H (400 MHz, CDCla) 5 1,42 (t, J = 7,1 Hz, 3 H, CHa), 4,05 (s, 3H, CHa), 4,43 (q, J = 7,1 Hz, 2H, CH2), 7,3 (t, J = 7,8 Hz, 1 H, Har), 8,08 (dd, J = 7,8 Hz, 1,9 Hz, 1H, Har), 8,30 (dd, J = 7,8 Hz, 1,8 Hz, 1 H, Har).
El compuesto 3 se obtuvo mediante acoplamiento peptídico del compuesto 2 con 1,3-diamino-2-propanol usando EDCI y HOBt en acetonitrilo y en presencia de trietilamina con un rendimiento del 74%.
TLC: Rf = 0,51 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 5 1,42 (t, J = 7,1 Hz, 6 H, CH3), 3,53 - 3,60 (m, 2H, CH2), 3,69 - 3,76 (m, 2H, CH2), 4,00 (s, 6H, CH3), 4,02 - 4,06 (m, 1H, CH), 4,25 (d, J = 4,1 Hz, 1H, OH), 4,41 (q, J = 7,1 Hz, 4 H, CH2), 7,27 (t, J = 7,7 Hz, 2 H, Har), 7,93 (dd, J = 7,7 Hz, 1,9 Hz, 2 H, Har), 8,23 (dd, J = 7,9 Hz, 1,9 Hz, 2 H, Har), 8,36 (t, J = 5,9 Hz, 2 H, NH). RMN de 13C (100 MHz, CDCh) 5 14 (CH3), 44 (CH2), 62 (CH2), 64 (CH3), 72 (CH), 124 (CH), 126 (Cquat), 127 (Cquat), 135 (CH), 136 (CH), 158 (Cquat), 166 (Cquat), 166 (Cquat). IR (cm-1, ATR) v 3376, 2940, 1723, 1642, 1525, 1417, 1255, 1131. ESI/MS (modo positivo): m/z = 503,20 ([M+H]+, 100%), 504,20 ([M+H]+, 21%), 505,20 ([M+H]+, 3%), 1027,33 ([2M+Na+], 27%). Análisis elemental calculado para C25H30N2Og, 1 H2O: C, 57,69, H, 6,20, N, 5,38. Encontrado: C, 57,88, H, 5,89, N, 5,85.
El compuesto 4 se obtuvo mediante una sustitución nucleofílica de tipo Williamson utilizando el compuesto 3, tbutanoato de potasio y bromoacetato de t-butilo en THF a 78°C durante una hora con un rendimiento del 51% después de la purificación.
TLC: Rf = 0,66 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 51,42 (t, J = 7,2 Hz, 6 H, CH3), 1,47 (s, 9H, CH3), 3,46 - 3,52 (m, 2H, CH2), 3,77 - 3,82 (m, 1H, CH), 3,84 - 3,92 (m, 2H, CH2), 3,98 (s, 6H, CH3), 4,16 (s, 2H, CH2), 4,41 (q, J = 7,2 Hz, 4 H, CH2), 7,25 (t, J = 7,8 Hz, 2H, NH), 7,91 (dd, J = 7,4 Hz, 1,9 Hz, 2 H, Har), 8,20 (dd, J = 8,0 Hz, 1.6 Hz, 2 H, Har), 8,40 (t, J = 5,8 Hz, 2 H, Har). RMN de 13C (100 MHz, CDCh) 514 (CH3), 28 (CH3), 40 (CH2), 61 (CH2), 64 (CH3), 68 (CH), 78 (CH2), 82 (Cquat), 124 (CH), 126 (Cquat), 128 (Cquat), 135 (CH), 136 (CH), 158 (Cquat), 165 (Cquat), 166 (Cquat), 170 (Cquat). IR (cm-1, ATR) v 3376, 2980, 1725, 1653, 1518, 1417, 1255, 1125, 994. ESI/MS (modo positivo): m/z = 617,27 ([M+H+], 100%), 618,27 ([M+H+], 35%), 619,27 ([M+H+], 9%), 620,28 ([M+H+], 1%). Análisis elemental calculado para C31H40N2O11: C, 60,38, H, 6,54, N, 4,83. Encontrado: C, 60,69, H, 6,53, N, 4,83.
El compuesto 5 se obtuvo por desprotección del grupo t-butil éster usando ácido trifluoroacético en diclorometano a 50°C con un rendimiento del 70%.
TLC: Rf = 0,37 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 5 1,37 (t, J = 7,1 Hz, 6 H, CH3), 3,50 - 3,54 (m, 2H, CH2), 3,78 - 3,82 (m, 3H, CH; CH2), 3,91 (s, 6H, CH3), 4,27 (s, 2H, CH2), 4,36 (q, J = 7,2 Hz, 4 H, CH2), 7,21 (t, J = 7,7 Hz, 2 H, Har), 7.88 (dd, J = 7,7 Hz, 1,6 Hz, 2 H, Har), 8,14 (dd, J = 7.8 Hz, 1.6 Hz, 2H, Har), 8,49 (t, J = 5,5 Hz, 2 H, NH). RMN de 13C (100 MHz, CDCh) 5 14 (CH3), 40 (CH2), 62 (CH2), 64 (CH3), 67 (CH), 78 (CH2), 124 (CH), 126 (Cquat), 128 (Cquat), 135 (CH), 136 (CH), 158 (Cquat), 165 (Cquat), 166 (Cquat), 173 (Cquat, C15). IR (cm-1, ATR) v 3370, 2982, 2941, 1722, 1646, 1525, 1417, 1257, 1130, 992. ESI/MS (modo positivo): m/z = 561,21 ([M+H+], 100%), 562,21 ([M+H+], 27%), 563,21 ([M+H+], 7%), 564,21 ([M+H+], 1%), 1143,39 ([2M+Na+], 97%). Análisis elemental calculado para C27H32N2O11.CH3OH: C, 56,75, H, 6,12, N, 4,73. Encontrado: C, 57,09, H, 5,93, N, 5,13.
El compuesto 6 se obtuvo mediante un acoplamiento peptídico entre 5 y t-butil-6-aminohexilcarbamato usando EDCI y HOBt en acetonitrilo a 0°C con un rendimiento del 61%.
TLC: Rf = 0,69 (SiOH, DCM/MeOH: 9/1). RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 51,29-1,30 (m, 4H, CH2), 1,40 - 1,42 (m, 17H, CH3 ; CH2 ; CH3), 1,47 - 1,53 (m, 2H, CH2), 3,06 (q, J = 3,06 Hz, 2H, CH2), 3,25 (q, J = 6,7 Hz, 2 H, CH2), 3,68 - 3,74 (m, 5H, CH; CH2 ; CH2), 3,95 (s, 6H, CH3), 4,11 (s, 2H, CH2), 4,40 (q, J = 7,1 Hz, 4 H, CH2), 4,58 (s, 1 H, NH), 7,07 (t, J = 5,6 Hz, 1H, NH), 7,27 (t, J = 7,8 Hz, 2 H, Har), 7,93 (dd, J = 7,7 Hz, 1,7 Hz, 2 H, Har), 8,20 - 8,22 (m, 2H, Har), 8,26 (t, J = 6,0 Hz, 2 H, NH). RMN de 13C (100 MHz, CDCh) 514 (CH3), 26 (CH2), 27 (CH2), 29 (CH3), 30 (CH2), 30 (CH2), 39 (CH2), 40 (CH2), 40 (CH2), 62 (CH2), 64 (CH3), 70 (CH), 79 (CH2), 124 (CH), 126 (Cquat), 128 (Cquat), 135 (CH), 136 (CH), 156 (Cquat), 158 (Cquat), 166 (Cquat), 166 (Cquat), 169 (Cquat). IR (cm-1, ATR) v 3334, 2977, 2934, 2859, 1710, 1650, 1521, 1461, 1254, 1131,995. ESI/MS (modo positivo): m/z = 781,36 ([M+Na+], 100%), 782,37 ([M+Na+], 45%), 783,37 ([M+Na+], 11%), 784,37 ([M+Na+], 2%), 1539,73 ([2M+Na+], 29%). Análisis elemental calculado para C38H54N4O12: C, 60,14, H, 7,17, N, 7,38. Encontrado: C, 59,79, H, 7,36, N, 7,62.
El compuesto 7 se obtuvo mediante la desprotección de los grupos protectores del compuesto 6 usando BBr3 en diclorometano a -78°C, seguido de saponificación con NaOH en EtOH, con un rendimiento del 80% para las dos etapas.
TLC: Rf = 0,68 (C18, H2O (TFA al 0,1%/ACN (TFA al 0,1%): 8/2). RMN de 1H (400 MHz, D2O) 5 1,05 - 1,15 (m, 4H, CH2), 1,27 (m, J = 7,2 Hz, 4 H; CH2), 2,51 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2), 3,07 (t, J = 7,1 Hz, 2H, CH2), 3,63 (dd, J = 14,4 Hz, 6.6 Hz, 2H, CH2), 3,75 (dd, J = 14,2 Hz, 4,2 Hz, 2H, CH2), 3,91 - 3,95 (m, 1H, CH), 4,22 (s, 2H, CH2), 6,63 (t, J = 7,6 Hz, 2 H, Har), 7,46 - 7,48 (m, 2H, Har), 7.85 (dd, J = 7,8 Hz, 1,9 Hz, 2 H, Har). RMN de 13C (100 MHz, D2O) 526 (CH2), 26 (CH2), 28 (CH2), 31 (CH2), 39 (CH2), 40 (CH2), 40 (CH2), 68 (CH2), 78 (CH), 115 (CH), 119 (Cquat), 127 (Cquat), 132 (CH), 133 (CH), 164 (Cquat), 170 (Cquat), 172 (Cquat), 177 (Cquat). IR (cm-1, ATR) v 2940, 2857, 1660, 1592, 1540, 1433,
1256, 1190, 1157, 1130, 756. ESI/MS (modo positivo): m/z = 575,23 ([M+H+], 100%), 576,24 ([M+H+], 81%), 577,24 ([M+H+], 30%), 578,24 ([M+H+], 7%), 579,24 ([M+H+], 2%). Análisis elemental calculado para C27H34N4O10.TFA.2 H2O: C, 51,77, H, 5,66, N, 8,63, Encontrado: C, 51,40, H, 5,49, N, 8,34.
El ligando L1 se obtuvo con un rendimiento del 88% mediante la reacción del compuesto 7 con p-fenil-bisisotiocianato. TLC: Rf = 0,63 (C18, H2O (TFA al 0,1%/ACN)/(TFA al 0,1%): 6/4). RMN de 1H (400 MHz, DMSO) 51,20 - 1,27 (m, 4H, CH2), 1,37 (m, J = 6,9 Hz, 2 H; CH2), 1,48 (m, J = 7,0 Hz, 2 H, CH2), 3,06 (q, J = 6,5 Hz, 2H, CH2), 3,42 - 3,48 (m, 4H, CH2), 3,56 - 3,62 (m, 2H, CH2), 3,71 (m, J = 5,2 Hz, 1H, CH), 4,04 (s, 2H, CH2), 6,99 (t, J = 7,8 Hz, 2 H, Har), 7,35 -7,37 (m, 2H, Har), 7,55 - 7,57 (m, 2H, Har), 7,69 (t, J = 5,9 Hz, 1H, NH), 7,94 (dd, J = 7,8 Hz, 1,8 Hz, 2 H, Har), 8,04 (dd, J = 7,8 Hz, 1,8 Hz, 2 H, Har), 8,76 - 8,78 (m, 2H, NH), 9,76 (s, 1H, NH). RMN de 13C (100 MHz, DMSO) 527 (CH2), 29 (CH2), 30 (CH2), 39 (CH2), 41 (CH2), 44 (CH2), 46 (CH2), 69 (CH2), 79 (CH), 116 (Cquat), 119 (CH), 121 (Cquat), 123 (CH), 125 (Cquat), 127 (CH), 133 (Cquat), 134 (CH), 136 (CH), 140 (Cquat), 161 (Cquat), 166 (Cquat), 170 (Cquat), 172 (Cquat), 181 (Cquat). IR (cm-1, ATR) v 3308, 2932, 2099, 1643, 1598, 1538, 1504, 1436, 1263, 1191, 1155, 759. HR-ESI/MS (modo positivo): m/z = 767,2177 ([M+H+], 100%), 768,2203 ([M+H+], 44%), 769,2246 ([M+H+], 16%), 770,2179 ([M+H+], 4%), 771,2116 ([M+H+], 1%). Análisis elemental calculado para: C35H38N6O10S2.H2O: C, 53,56, H, 5,14, N, 10,71, S, 8,17. Encontrado: C, 53,33, H, 5,05, N, 10,42, S, 8,15.
El ligando L2 se obtuvo con un rendimiento del 57% mediante la reacción del compuesto 7 con 2,5-dioxopirrolidin-1-il-2-yodoacetato en DMF en presencia de trietilamina.
El ligando L3 se obtuvo mediante la reacción de 2,5-dioxopirrolidin-1 -il-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il) propanoato y el compuesto 7 en DMF que contenía N-metilmorfolina a temperatura ambiente con un rendimiento del 53%.
Síntesis del ligando L4:
El ligando reivindicado L4 se preparó siguiendo siguientes los pasos de síntesis y con los compuestos intermedios 1, 2, 10 y 11 indicados a continuación:
El compuesto 1 se obtuvo por esterificación del compuesto 9 usando SOCl2 seguido de la evaporación del exceso de cloruro de tionilo y la reacción con EtOH en presencia de Et3N con un rendimiento global del 68%.
El compuesto 10 se obtuvo mediante acoplamiento peptídico del compuesto 2 y (2-(bis(2-aminoetil)amino)etil) carbamato de í-butilo usando EDCI y HOBt en acetonitrilo que contenía trietilamina con un rendimiento del 84%. TLC: Rf = 0,40 (SiOH, DCM/MeOH: 95/5). RMN de 1H (300 MHz, CDCh) 51,33 (s, 9H, CH3), 1,37 (t, J = 7,2 Hz, 6 H, CH3), 2,69 (t, J = 6 Hz, 2H, CH2), 2,77 (t, J = 6,2 Hz, 4H, CH2), 3,18 (td, 2H, J = 5,0 y 6,2 Hz, CH2), 3,54 (q, J = 6 Hz, 4H, CH2), 3,85 (s, 6H, CH3), 4,38 (q, J = 7,2 Hz, 4 H, CH2), 7,19 (t, J = 7,8 Hz, 2 H, Har), 7,86 (dd, J = 1,9 y 7,8 Hz, 2H, Har), 7,93 (t, J = 5,0 Hz, 1H, NH), 8,09 (dd, J = 1,9 y 7,8 Hz, 2H, Har). RMN de 13C (100 MHz, CDCh) 5 14 (CH3), 28 (CH3), 37 (CH2), 38 (CH2), 53 (CH2), 61 (CH2), 63 (CH2), 78 (Cquat), 124 (Cquat), 125 (Cquat), 128 (CH), 134 (CH), 135 (CH), 155 (Cquat), 157 (Cquat), 164 (Cquat), 165 (Cquat). ESI/MS (modo positivo): m/z = 659,33 ([M+H+], 100%), 660,33 ([M+2H+], 40%), 661,33 ([m 3H+], 12%), 662,34 ([M+4H+], 4%). Análisis elemental calculado para C33H46N4O10.H2O: C, 58,56, H, 7,15, N, 8,28. Encontrado: C, 58,80, H, 6,89, N, 5,91.
El compuesto 11 se obtuvo en dos etapas usando BBr3 en CH2Cl2 a -78°C seguido de evaporación y saponificación con NaOH en una mezcla de agua/metanol con un rendimiento total del 60%.
TLC: Rf = 0,30 (C18, H2O (TFA al 0,1%)/ACN (TFA al 0,1%): 8/2. RMN de 1H (400 MHz, D2O) 52,59 (m, 4H, CH2), 2,72 (t, J = 5,0 Hz, 4 H, CH2), 3,42 (t, J = 5,0 Hz, 4 H, CH2), 6,43 (t, J = 7,7 Hz, 2 H, Har), 7,25 (dd, J = 1,8 y 7,7 Hz, 2H, Har), 7,69 (dd, J = 1,8 y 7,7 Hz, 2H, Har). RMN de 13C (100 MHz, D2O) 537 (CH2), 38 (CH2), 51 (CH2), 54 (CH2), 117 (Cquat), 118 (Cquat), 119 (CH), 133 (CH), 134 (CH), 159 (Cquat), 167 (Cquat), 174 (Cquat). ESI/MS (modo positivo): m/z = 475,18 ([M+H+], 100%), 476,18 ([M+2H+], 28%), 477,18 ([M+3H+], 6%), 949,36 ([2M], 6%).
El ligando L4 se obtuvo por reacción del compuesto 11 con N-succinimidil 3-maleimidopropionato en DMF que contenía Et3N a 0°C, con un rendimiento del 20%.
TLC: Rf = 0,30 (C18, H2O (TFA al 0,1%)/ACN (TFA al 0,1%): 7/3. RMN de 1H (400 MHz, D2O) 52,35 (t, J = 5,8 Hz, 2H, CH2), 2,74 (t, J = 6,5 Hz, 2H, CH2), 2,83 (t, J = 7,0 Hz, 4 H, CH2), 3,30 (t, J = 5,8 Hz, 2H, CH2), 3,35 (t, J = 6,5 Hz, 2H, CH2), 3,50 (t, J = 7,0 Hz, 4 H, CH2), 5,97 (s, 2H, CH=CH), 6,48 (t, J = 7,2 Hz, 2 H, Har), 7,30 (d, J = 7,2 Hz, 2 H, Har), 7,75 (d, J = 7,2 Hz, 2 H, Har). RMN de 13C (100 MHz, CDCta) 522 (CH2), 23 (CH2), 23,5 (CH2), 24 (CH2), 39 (CH2), 40 (CH2), 99 (Cquat), 106 (Cquat), 111 (CH), 117 (CH), 119 (CH), 123 (CH = CH), 154 (Cquat), 158 (Cquat), 161 (Cquat), 162 (Cquat), 166 (Cquat).
Síntesis del ligando L5
El ligando L5 se preparó siguiendo las siguientes etapas de síntesis:
La síntesis del ligando L5 se inició, en la etapa a, con la protección de la función alcohol del 2,4,6-trimetilfenol correspondiente al compuesto 12 mediante una sustitución nucleofílica SN2 en presencia de yoduro de metilo (MeI) y carbonato de potasio (K2CO3), con un rendimiento del 97%.
La segunda etapa b fue la oxidación de los tres grupos metilo del compuesto 13 obtenido en el paso a, con KMnO4 y KOH en H2O. El rendimiento de la etapa b fue del 62%.
La última etapa c de la síntesis fue la desprotección de la función fenolato del compuesto 14 por O-desmetilación en presencia de una solución de HBr/AcOH (50/50). El ligando L5 se obtuvo mediante precipitación y centrifugación con un rendimiento del 60%.
Bio-funcionalización del ligando L1 con estreptavidina:
La estreptavidina es una proteína tetramérica que tiene una afinidad muy fuerte con la biotina. Esta fuerte interacción, a menudo utilizada en biotecnología, representa un ejemplo típico de fuerte interacción biológica, tanto como lo pueden ser las interacciones entre antígeno y anticuerpo.
En este ejemplo, se utilizó el ligando L1 para marcar la estreptavidina, con el objetivo de producir nanopartículas luminiscentes ultrabrillantes capaces de fijar biotina.
La estreptavidina se marcó a temperatura ambiente en una disolución acuosa tamponada en presencia de 10 equivalentes del compuesto L1. La estreptavidina marcada se purificó mediante centrifugación en un filtro de exclusión por tamaño (de Millipore, corte de 10 kDa). La velocidad de marcaje de estreptavidina (número de ligandos L1 por estreptavidina) se determinó mediante absorción UV-visible donde el espectro de estreptavidina marcada se deconvolucionó como una combinación lineal del espectro de estreptavidina sola y del ligando L1. Se obtuvo una tasa de marcaje de 2,1 ligandos por estreptavidina.
Bio-funcionalización del ligando L1 con el anticuerpo Matuzumab:
El anticuerpo Matuzumab es un anticuerpo monoclonal humano que reconoce específicamente los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) sobreexpresados en algunos cánceres (pulmón, esófago, estómago...). Las nanopartículas luminiscentes marcadas con Matuzumab podrían usarse para obtener imágenes de microscopía de luminiscencia de los receptores del factor de crecimiento epidérmico o para la detección de los mismos en disolución mediante fluoro-inmunología.
En este ejemplo, se utilizó el ligando L1 para marcar el anticuerpo Matuzumab, con el objetivo de producir nanopartículas luminiscentes ultrabrillantes capaces de fijar los receptores del factor de crecimiento epidérmico.
Se añadieron 13,2 pL de una disolución 3,23 mM de ligando L1 en DMSO a 10,4 pL de una disolución que contenía Matuzumab a 1 mg-mL-1 (128 pM) y 176 pL de tampón carbonato pH 9,0 (relación L1/Matuzumab = 32/1). La muestra se mezcló, se dispuso en una hoja de aluminio, luego se incubó 4h30 a temperatura ambiente con agitación normal. Después de purificación por ultracentrifugación, elución y lavado con un tampón TRIS/HCl pH 8,04, se obtuvo una disolución final con un volumen de 80 pL. La disolución final se diluyó cinco veces con el tampón TRIS/HCl.
Las concentraciones de anticuerpo y ligando se determinaron mediante espectroscopía de absorción UV-visible. Se obtuvo una concentración de anticuerpos de 1,49 pM y una relación de marcaje de 2,9-3,0 ligandos por anticuerpo.
Métodos experimentales de medición de espectroscopia de luminiscencia:
Los espectros de absorción UV-Vis se registraron en células suprasil de cuarzo con un paso óptico de 1 cm (Hellma), usando un espectrómetro PerkinElmer lambda 950 o un espectrómetro Specord de Jena Analytics.
Los espectros de luminiscencia se registraron en un espectrofotómetro FLP920 Edinburgh Instrument usando una lámpara de Xe de 450 W y un fotomultiplicador rojo Hamamatzu R928. Todos los espectros se corrigieron utilizando funciones instrumentales proporcionadas por el proveedor. Cuando fue necesario, se utilizó un filtro de paso alto de 399 nm para eliminar los artefactos de segundo orden.
Los rendimientos cuánticos de luminiscencia se midieron de acuerdo con los procedimientos convencionales descritos en Molecular Fluorescence: Principies and Applications, 2a ed.; Valeur, B., Berberan-Santos, M. N., Eds .; Wiley-VCH: Weinheim, 2013, con disoluciones ópticamente diluidas (densidad óptica < 0,05), utilizando [Ru (bipy)3Ch] en agua (O = 0,04, Ishida, H. y col., Coord. Chem. Rev. 2010, 254 (21), 2449-2458J como referencia para las nanopartículas que contienen Eu, un complejo de bipiridina Tb, [TbL(H2Ü)] en agua (O = 0,31, Weibel, N. y col., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126 (15), 4888-4896) como referencia para las nanopartículas que contienen Tb.
Los errores estimados en los rendimientos cuánticos son ±15%.
Los brillos se calculan como el producto del coeficiente de absorción molar (calculado aplicando la ley de Beer-Lambert a los espectros de absorción) a la longitud de onda de excitación por el rendimiento cuántico de luminiscencia.
La vida útil de la luminiscencia se registró en el mismo instrumento en el modo MCS utilizando una lámpara de flash de Xe de 100 W que funcionaba a 10 Hz, siendo la ventana temporal al menos cinco veces más larga que la vida útil más larga del estado excitado medido. Las ranuras de excitación y emisión se establecieron típicamente en aberturas de 5 y 3 nm. La longitud de onda de excitación se eligió en función del ligando en el máximo de los espectros de excitación de las nanopartículas en presencia del ligando. La adquisición se detuvo cuando la intensidad máxima alcanzó los 10000 conteos.
Los errores estimados sobre la vida útil son ±10%.
En todos los experimentos, se diluyeron 16 pL de una disolución madre de nanopartículas con 1984 pL de tampón TRIS/HCl 0,1 M a pH 7,0. Las disoluciones diluidas de las nanopartículas se valoraron luego mediante la adición de cantidades crecientes de disoluciones 5 x 10-4 M de los ligandos en el mismo tampón.
Resultados experimentales:
Como ya se ha indicado previamente, la invención proporciona resultados excepcionales en términos de vida útil en estado excitado.
Estos resultados ventajosos se han demostrado mediante mediciones experimentales realizadas en varios ejemplos de nanopartículas según la invención, siguiendo el método de medición descrito en detalle anteriormente.
Se midieron las vidas útiles en estado excitado en medio acuoso t de esos compuestos para la emisión de iones europio a 695 nm, después de una excitación a una longitud de onda de Aexc = 330 nm correspondiente a la absorción del ligando L5.
Los resultados obtenidos se han recogido en la siguiente tabla 2:
Tabla 2:
Para cada compuesto de ejemplo medido, la vida útil en estado excitado más larga medida (T2 o T3) corresponde a la emisión de los iones europio presentes en el núcleo de la nanopartícula que son los más numerosos, mientras que el más corto (t i) corresponde a la emisión de los iones europio menos numerosos presentes en la superficie del núcleo de la nanopartícula.
Como se puede observar, la vida útil más larga medida en estado excitado (T2 o T3) siempre está considerablemente por encima del valor anunciado de 3 ms o 5 ms, e incluso es superior al valor preferido de 7 ms. Por lo tanto, está considerablemente por encima de la vida útil del estado excitado descrita en la técnica anterior.
Además, y algo nunca obtenido en la técnica anterior, estos valores medidos de vida útil en estado excitado excepcionalmente largos están muy cerca del valor teórico de vida útil radiativa del europio, que es un valor teórico, calculado para cada elemento, que constituye el valor máximo alcanzable para la vida útil en estado excitado de dicho elemento.
Para los iones acuosos de europio, dicho valor teórico de vida útil radiativa corresponde a 9,7 ms, como se describe en la técnica anterior por Bünzli, J. C. G. Chem. Rev. 2010, 110, 2731.
Además, esta vida útil excepcionalmente larga en estado excitado de las nanopartículas según la invención no se obtiene a expensas del brillo de las nanopartículas. De hecho, también se midieron valores importantes de brillo para los compuestos según la invención, siguiendo el método de medición descrito en detalle anteriormente.
Los resultados de brillo medidos se han recopilado en la siguiente tabla 3:
Tabla 3:
Nuevamente, los valores medidos muestran que las nanopartículas según la invención tienen un brillo que está considerablemente por encima del valor anunciado de 104 M-1 -cm-1 (en al menos 3 órdenes de magnitud) o de 105 M' 1cm_1, y es incluso superior al valor preferido de 106 M-1cm-1, siendo, por tanto, mucho mejor que el brillo de los marcadores basados en lantánidos descritos en la técnica anterior.
Como se ha demostrado anteriormente, las nanopartículas de lantánidos luminiscentes según la invención proporcionan una solución muy eficaz al problema técnico, mucho más allá de las propuestas en la técnica anterior.
Obviamente, la invención no se limita a las realizaciones preferidas descritas anteriormente y mostradas en las diversas figuras, una persona especialista en la técnica podrá realizar numerosas modificaciones e imaginar otras realizaciones sin ir más allá del marco y el alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Claims (11)
1. Nanopartícula de lantánido luminiscente, que tiene al mismo tiempo un brillo mejorado y una vida útil aumentada del estado excitado, que comprende una nanopartícula de iones de lantánido que incluyen terbio y varias moléculas de ligando cromóforo que están unidas a la superficie de la nanopartícula de iones de lantánido, caracterizado por que:
- dicha nanopartícula de iones de lantánido comprende iones terbio e iones de al menos un segundo lantánido seleccionado del grupo que consiste en: cerio, praseodimio, neodimio, samario, europio, disprosio, holmio, erbio, tulio e iterbio;
- dicho ligando es una molécula orgánica que comprende al menos un radical cromóforo de fórmula I o de fórmula II:
en donde R se selecciona entre H, grupo CN o grupo COOH.
2. Nanopartícula luminiscente según la reivindicación 1, caracterizado por que el segundo lantánido se selecciona entre europio, samario, disprosio e iterbio, y es preferentemente europio.
3. Nanopartícula luminiscente según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que dicha nanopartícula de iones de lantánido comprende además iones de un tercer lantánido seleccionado entre lantano, lutecio y gadolinio, y que son preferentemente lantano.
4. Nanopartícula luminiscente según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que dicha nanopartícula de iones de lantánido contiene entre 10 y 99,9 %mol, preferentemente entre 50 y 99,9 %mol, y aún más preferentemente entre 75 y 99,9 %mol de iones terbio, y entre 0,1 y 90 %mol, preferentemente entre 0,1 y 50 %mol, y aún más preferentemente entre 0,1 y 25 %mol de iones del segundo lantánido.
5. Nanopartícula luminiscente según la reivindicación 3, caracterizado por que dicha nanopartícula de iones de lantánido contiene entre 1 y 98,9 %mol, preferentemente entre 10 y 98 %mol, y aún más preferentemente entre 40 y 98 %mol de iones terbio, entre 0,1 y 20 %mol, preferentemente entre 0,5 y 10 %mol, y aún más preferentemente entre 1 y 5 %mol de iones del segundo lantánido, y entre 1 y 90,9 %mol, preferentemente entre 10 y 80 %mol, y aún más preferentemente entre 10 y 20 %mol de iones del tercer lantánido.
6. Nanopartícula luminiscente según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que dicho ligando comprende n radicales cromóforos y un grupo espaciador, en donde el grupo espaciador es un heteroátomo que contiene una cadena de carbono que une los radicales cromóforos y en donde n es un número entero de 1 a 10, preferentemente de 2 a 6 y más preferentemente de 2 a 3.
7. Nanopartícula luminiscente según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que dicho ligando comprende además una función de anclaje capaz de unirse covalentemente a una molécula portadora de interés analítico.
8. Nanopartícula luminiscente según la reivindicación 7, caracterizado por que la nanopartícula luminiscente comprende además una molécula portadora de interés analítico unida covalentemente a al menos una molécula de ligando.
9. Nanopartícula luminiscente según la reivindicación 7 u 8, caracterizado por que la molécula portadora de interés analítico se selecciona del grupo que consta de: péptidos, proteínas, anticuerpos, restos de anticuerpos, moléculas pequeñas de peso molecular inferior a 2000 g-mol-1, biotina, destiobiotina, estreptavidina y anticuerpo Matuzumab.
11. Nanopartícula luminiscente según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho ligando es L5:
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