ES2854273T3

ES2854273T3 - Composiciones que comprenden citrato y sus aplicaciones

Info

Publication number: ES2854273T3
Application number: ES14702310T
Authority: ES
Inventors: Jian Yang
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2013-01-04
Filing date: 2014-01-02
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2034-01-02
Also published as: CA2896587A1; US20170056435A1; WO2014107501A1; CN110755447A; US20190247424A1; CN104937096A; JP6286447B2; US10076538B2; EP2941482A1; AU2014204104B2; US20180369277A1; US9492477B2; US20140193356A1; AU2014204104A1; US20220296635A1; CA2896587C; JP2016504382A; CN104937096B; EP2941482B1

Abstract

Una composición para uso en la promoción del crecimiento óseo, que comprende una composición que presenta citrato, en la que la composición que presenta citrato es un polímero u oligómero a base de citrato con un resto de citrato, liberando dicho polímero u oligómero un citrato tras la degradación a una dosis de entre 20 mM y 2000 mM, basado en el volumen de la composición que presenta citrato.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden citrato y sus aplicaciones

CAMPO

Esta invención se refiere a composiciones que presentan citrato y, en particular, a composiciones que presentan citrato para aplicaciones óseas.

ANTECEDENTES

La matriz ósea nativa es un material compuesto que comprende alrededor de 60 a 65% en peso de materiales inorgánicos embebidos dentro de una matriz de proteína de colágeno. Además, dentro de la red de colágeno hay embebida una fina capa de nanocristales de apatita. Por lo tanto, algunos biomateriales de ingeniería han combinado diversos materiales inorgánicos con polímeros sintéticos para uso en aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos. Sin embargo, algunos biomateriales existentes no logran igualar la composición nativa del hueso, no proporcionan soporte mecánico adecuado, no minimizan respuestas inflamatorias, no promueven rápidamente la regeneración ósea, y/o no se integran completamente con el tejido circundante.

Qui et al. (Biomaterials, 2006, 27(34), 5845-54) describen un material compuesto de hidroxiapatita a base de ácido cítrico para implantes ortopédicos. Djordjevic et al. (J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2010, 21(8-9), 1039-50) describen la biocompatibilidad de los osteoblastos en elastómeros de poli(citrato de octanodiol)/sebacato con humectabilidad controlada. Dey et al. (Biomaterials, 2008, 29(35), 4637-49) describen el desarrollo de elastómeros de poliéster dopado con uretano reticulado biodegradable. El documento US 2009/0093565 A1 describe un método para fabricar elastómeros de poliéster que contiene uretano reticulado biodegradable (CUPE), y un método de ingeniería de láminas de armazón para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Yokoyama et al. (Biomaterials, 2002, 23(4), 1091-101) describen el desarrollo de cemento de fosfato cálcico usando quitosano y ácido cítrico para materiales sustitutivos óseos. Webb et al. (Expert Opin. Biol. Ther., 2004, 4(6), 801-12) describen elastómeros de poliéster biodegradables en ingeniería de tejidos.

Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones y métodos que proporcionen propiedades mejoradas para diversas aplicaciones ortopédicas y óseas, incluyendo propiedades mecánicas mejoradas y/o propiedades mejoradas de crecimiento óseo.

SUMARIO

La invención se define con referencia a las reivindicaciones adjuntas. En un aspecto, se describen aquí composiciones que, en algunos casos, pueden proporcionar una o más ventajas en comparación con otras composiciones para aplicaciones óseas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición descrita aquí puede proporcionar propiedades mecánicas mejoradas, respuestas inflamatorias reducidas, biodegradabilidad mejorada, e integración superior con el tejido circundante. Además, en algunos casos, una composición descrita aquí puede promover el crecimiento óseo de una manera mejorada, incluso promoviendo la diferenciación celular o la progresión fenotípica en una población de células óseas tal como una población que comprende células madre o células osteoblásticas. Además, en algunos casos, una composición descrita aquí también puede inhibir el crecimiento del cáncer, incluyendo el cáncer de huesos.

Una composición descrita aquí, en algunas realizaciones, es una composición que presenta citrato. Por ejemplo, en algunos casos, una composición que presenta citrato descrita aquí comprende un polímero u oligómero que comprende un resto de citrato. En algunas realizaciones, una composición descrita aquí comprende un primer polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I) descrita a continuación y un segundo polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (II) descrita a continuación, en la que el primer polímero u oligómero se mezcla con el segundo polímero u oligómero. Además, en algunos casos, el primer polímero u oligómero y el segundo polímero u oligómero se reticulan entre sí para formar una red polimérica. Además, en algunos casos, la composición comprende además un material en partículas disperso en la red polimérica. El material en partículas puede ser uno o más de hidroxiapatita, fosfato tricálcico, fosfato cálcico bifásico, biovidrio, cerámica, polvo de magnesio, aleación de magnesio, y partículas de tejido óseo descelularizadas.

Además, en algunas realizaciones, una composición descrita aquí comprende además tejido óseo adherido a la red polimérica. En algunos casos, el tejido óseo rodea la red polimérica, y la red polimérica se integra en el tejido óseo.

En otro aspecto, se describen aquí métodos para promover el crecimiento óseo que, en algunos casos, pueden proporcionar una o más ventajas sobre otros métodos. En algunos casos, por ejemplo, un método descrito aquí promueve la diferenciación celular o la progresión fenotípica en una población de células óseas, comprendiendo el método proporcionar a las células óseas una composición que presenta citrato. En algunas realizaciones, la composición que presenta citrato se proporciona a las células óseas en una primera etapa del desarrollo celular seleccionada para obtener una primera diferenciación celular o progresión fenotípica. Además, en algunos casos, se proporciona además una segunda composición que presenta citrato a las células óseas en una segunda etapa del desarrollo celular seleccionada para obtener una segunda diferenciación celular o progresión fenotípica. Las células óseas tratadas según un método descrito aquí pueden ser in vitro o in vivo. En algunos casos, las células óseas comprenden células madre óseas. Además, en algunas realizaciones, un método para promover el crecimiento óseo descrito aquí comprende disponer en un entorno biológico una composición que presenta citrato. Además, en algunas realizaciones, la promoción del crecimiento óseo comprende sobrerregular la expresión del gen osterix (OSX) y/o la expresión del gen de la fosfatasa alcalina (ALP) en el entorno biológico. En algunos casos, promover el crecimiento óseo comprende mejorar la osteoconductividad y/o la osteoinductividad en el entorno biológico. En algunas realizaciones, promover el crecimiento óseo comprende promover la mineralización o la formación de depósitos de calcio en el entorno biológico. Además, en algunos casos, un método descrito aquí también es eficaz para inhibir al menos parcialmente el crecimiento y/o la proliferación de células cancerosas, incluyendo las células cancerosas de huesos. Además, en algunas realizaciones, una composición que presenta citrato proporciona uno o más de los efectos anteriores de una manera dependiente de la dosis.

Una composición que presenta citrato proporcionada a las células óseas y/o dispuesta en un entorno biológico según un método descrito aquí puede comprender cualquier composición descrita aquí anteriormente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición que presenta citrato comprende un polímero u oligómero que comprende un resto de citrato, tal como un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I) o Fórmula (II). También se pueden usar otros polímeros u oligómeros. Además, en algunas de tales realizaciones, un método descrito aquí comprende además liberar citrato del polímero u oligómero degradando el polímero u oligómero. En otros casos, la composición que presenta citrato comprende ácido cítrico o citrato acuoso. En algunas realizaciones, la composición que presenta citrato comprende medio de cultivo suplementado con ácido cítrico o citrato. Además, en algunos casos, una composición que presenta de citrato usada en un método descrito aquí proporciona una concentración de citrato entre alrededor de 20 pM y alrededor de 2000 pM, basada en el volumen de la composición. Además, en algunos casos, un método descrito aquí comprende además proporcionar un factor biológico tal como BMP-2 a las células óseas.

En todavía otro aspecto, se describen aquí artículos que comprenden composiciones que presentan citrato. En algunas realizaciones, un artículo comprende una composición que presenta citrato descrita aquí anteriormente, tal como una red polimérica reticulada formada a partir de un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I) y/o un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (II). Además, en algunos casos, un artículo descrito aquí forma un implante biológico o quirúrgico, tal como un dispositivo de fijación ortopédico, tal como un tornillo óseo.

Estas y otras realizaciones se describen con más detalle en la descripción detallada que sigue.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La FIG. 1 ilustra un esquema para formar una red compuesta según una realización descrita aquí.

La FIG. 2 ilustra una serie de termogramas de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para una serie de composiciones según algunas realizaciones descritas aquí.

La FIG. 3A ilustra el módulo de compresión de una serie de composiciones según algunas realizaciones descritas aquí.

La FIG. 3B ilustra la resistencia máxima a la compresión de una serie de composiciones según algunas realizaciones descritas aquí.

La FIG. 4 ilustra la velocidad de degradación in vitro de una serie de composiciones según algunas realizaciones descritas aquí.

La FIG. 5 ilustra imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la mineralización de una serie de materiales compuestos según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 6A ilustra imágenes de microscopio óptico de la formación de nódulos de calcio según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 6B ilustra datos de formación de nódulos de calcio según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 6C ilustra datos de formación de nódulos de calcio según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 7 ilustra la expresión de fosfatasa alcalina (ALP) según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 8A ilustra la expresión de ALP según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 8B ilustra la expresión de ALP según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 9 ilustra la expresión de osteopontina (OPN) según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 10 ilustra imágenes de microscopio óptico de los resultados de un método para promover el crecimiento óseo según algunas realizaciones descritas aquí.

La FIG. 11A ilustra imágenes de SEM de los resultados de un método para promover el crecimiento óseo según algunas realizaciones descritas aquí.

La FIG. 11B ilustra la expresión de ALP según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 11C ilustra la expresión de osterix (OSX) según algunas realizaciones de los métodos descritos aquí.

La FIG. 12A ilustra una imagen de micro-CT de los resultados de un método para promover el crecimiento óseo según una realización descrita aquí.

La FIG. 12B ilustra una imagen de micro-CT de los resultados de un método para promover el crecimiento óseo según una realización descrita aquí.

La FIG. 13 ilustra dos imágenes de micro-CT de los resultados de un método para promover el crecimiento óseo según una realización descrita aquí.

La FIG. 14 ilustra datos de proliferación celular correspondientes a una realización de un método descrito aquí. La FIG. 15 ilustra datos de proliferación celular correspondientes a una realización de un método descrito aquí. La FIG. 16 ilustra datos de proliferación celular correspondientes a una realización de un método descrito aquí. DESCRIPCIÓN DETALLADA

Las realizaciones descritas aquí pueden entenderse más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada, ejemplos y figuras. Los elementos, aparatos y métodos descritos aquí, sin embargo, no se limitan a las realizaciones específicas presentadas en la descripción detallada, ejemplos y figuras. Debe reconocerse que estas realizaciones son simplemente ilustrativas de los principios de la presente invención. Numerosas modificaciones y adaptaciones serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

Además, debe entenderse que todos los intervalos descritos aquí abarcan cualquiera y todos los subintervalos incluidos en ellos. Por ejemplo, debe considerarse que un intervalo señalado de "1,0 a 10,0” incluye todos y cada uno de los subintervalos, comenzando con un valor mínimo de 1,0 o más y terminando con un valor máximo de 10,0 o menos, por ejemplo 1,0 a 5,3, o 4,7 a 10,0, o 3,6 a 7,9.

También se debe considerar que todos los intervalos descritos aquí incluyen los puntos finales del intervalo, a menos que se indique expresamente lo contrario. Por ejemplo, generalmente se debe considerar que un intervalo de "entre 5 y 10” incluye los puntos finales 5 y 10.

Además, cuando la frase "hasta” se usa en relación con una cantidad, debe entenderse que la cantidad es al menos una cantidad detectable. Por ejemplo, un material presente en una cantidad "hasta” una cantidad especificada puede estar presente desde una cantidad detectable y hasta e incluyendo la cantidad especificada.

I. Composiciones que comprenden citrato

En un aspecto, se describen aquí composiciones que comprenden citrato o presentan citrato. En algunas realizaciones, una composición comprende un polímero u oligómero que comprende un resto de citrato. Un "resto de citrato”, con fines de referencia aquí, comprende un resto que tiene la estructura de Fórmula (III):

en la que R¹, R²y R³son independientemente -H, -CH³, -CH²CH³, M+, o un punto de unión al resto del polímero u oligómero;

R⁴es -H o un punto de unión al resto del polímero u oligómero; y

M+ es un catión tal como Na+ o K+, siempre que al menos uno de R¹, R², R³y R⁴sea un punto de unión al resto del polímero u oligómero.

Puede usarse cualquier polímero u oligómero. Por ejemplo, en algunos casos, un polímero u oligómero de una composición descrita aquí comprende el producto de reacción de (i) ácido cítrico, un citrato, o un éster de ácido cítrico, tal como citrato de trietilo, con (ii) un poliol tal como un diol. Los ejemplos no limitantes de polioles adecuados para uso en algunas realizaciones descritas aquí incluyen a ,ra-n-alcanodioles de C2-C20 o a ,ra-alquenodioles de C2-C20. En otros casos, un polímero u oligómero de una composición descrita aquí comprende el producto de reacción de (i) ácido cítrico, un citrato, o un éster de ácido cítrico, con (ii) un poliol, y (iii) una amina, una amida, o un isocianato. Una amina, en algunos casos, comprende una o más aminas primarias que tienen dos a diez átomos de carbono. En otros casos, una amina comprende una o más aminas secundarias o terciarias que tienen dos a quince átomos de carbono. Un isocianato, en algunas realizaciones, comprende un monoisocianato. En otros casos, un isocianato comprende un diisocianato, tal como un alcano diisocianato. Además, un polímero u oligómero de una composición descrita aquí también puede comprender el producto de reacción de (i) ácido cítrico, un citrato, o un éster de ácido cítrico con (ii) un poliol, y (iii) un ácido policarboxílico tal como un ácido dicarboxílico o un equivalente funcional de un ácido policarboxílico, tal como un anhídrido cíclico o un cloruro de ácido de un ácido policarboxílico. Además, el ácido policarboxílico o equivalente funcional del mismo puede estar saturado o insaturado. Por ejemplo, en algunos casos, el ácido policarboxílico o equivalente funcional del mismo comprende ácido maleico, anhídrido maleico, ácido fumárico, o cloruro de fumarilo. En todavía otras realizaciones, un polímero u oligómero de una composición descrita aquí comprende el producto de reacción de (i) ácido cítrico, un citrato, o un éster de ácido cítrico con (ii) un poliol, y (iii) un aminoácido tal como un alfa-aminoácido. Un alfa-aminoácido, en algunas realizaciones, comprende un L-aminoácido, un D-aminoácido, o un D,L-aminoácido. En algunos casos, un alfa-aminoácido comprende alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glicina, glutamina, ácido glutámico, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina, triptófano, valina, o una combinación de los mismos. Además, en algunos casos, un alfa-aminoácido comprende un alfa-aminoácido sustituido con alquilo, tal como un aminoácido sustituido con metilo derivado de cualquiera de los 22 aminoácidos “estándar” o proteinogénicos, tal como metilserina. Además, en algunos casos, un aminoácido forma un grupo colgante o un grupo lateral del polímero u oligómero de una composición descrita aquí. Además, un producto de reacción de los monómeros descritos aquí, en algunos casos, es un producto de reacción de condensación de los monómeros. En algunos casos, un polímero u oligómero de una composición descrita aquí es un polímero u oligómero descrito en la patente U.S. 8.530.611; patente U.S. 8.574.311; o patente U.S. 8.613.944.

Además, en algunas realizaciones, un polímero u oligómero de una composición descrita aquí se forma a partir de uno o más monómeros de Fórmula (A) y uno o más monómeros de Fórmula (B) o (B’):

en las que R¹, R²y R³son independientemente -H, -CH³, -CH²CH³, o M+;

R⁴es -H;

R⁵es -H, -OH, -OCH³, -OCH²CH³, -CH³, o -CH²CH³;

Re es -H, -CH³, o -CH²CH³;

M+ es un catión tal como Na+ o K+; y

n y m son independientemente números enteros que oscilan de 1 a 20.

En algunos casos, por ejemplo, R¹, R²y R³son -H, R⁵es -OH, y Re es -H.

En algunas realizaciones, un polímero u oligómero de una composición descrita aquí se forma a partir de uno o más monómeros de Fórmula (A), uno o más monómeros de Fórmula (B) o (B’), y uno o más monómeros de Fórmula (C):

en las que Ri, R²y R³son independientemente -H, -CH³, -CH²CH³, o M+;

R⁴es -H;

R⁵es -H, -OH, -OCH³, -OCH²CH³, -CH³, o -CH²CH³;

R6 es -H, -CH³, o -CH²CH³;

M+ es un catión tal como Na+ o K+;

n y m son independientemente números enteros que oscilan de 1 a 20; y

p es un número entero que oscila de 1 a 10.

Por ejemplo, en algunos casos, R¹, R²y R³son -H o -CH²CH³, R⁵es -OH, R6 es -H, n es 2 a 6, m es 2 a 8, y p es 2 a 6.

Además, en algunas realizaciones de polímeros u oligómeros descritos aquí, un monómero de Fórmula (B) o (B’) se puede reemplazar por un alcohol que no tiene la fórmula de Fórmula (B) o (B’). Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede usar un alcohol insaturado o un poliol insaturado. Además, en algunas realizaciones, un monómero u oligómero de Fórmula (C) se puede reemplazar al menos parcialmente por un aminoácido descrito aquí.

Además, un polímero u oligómero de una composición descrita aquí puede tener al menos un enlace de éster en la cadena principal del polímero u oligómero. En algunos casos, un polímero u oligómero tiene una pluralidad de enlaces de éster en la cadena principal del polímero u oligómero, tal como al menos tres enlaces de éster, al menos cuatro enlaces de éster, o al menos cinco enlaces de éster. En algunas realizaciones, un polímero u oligómero descrito aquí tiene entre dos enlaces de éster y cincuenta enlaces de éster en la cadena principal del polímero u oligómero.

Un polímero u oligómero descrito aquí puede estar presente en una composición en cualquier cantidad. En algunas realizaciones, por ejemplo, una composición descrita aquí comprende hasta alrededor de 99 por ciento en peso, hasta alrededor de 95 por ciento en peso, hasta alrededor de 90 por ciento en peso, hasta alrededor de 80 por ciento en peso, hasta alrededor de 70 por ciento en peso, hasta alrededor de 50 por ciento en peso, hasta alrededor de 40 por ciento en peso, o hasta alrededor de 30 por ciento en peso de polímero u oligómero. En algunos casos, una composición descrita aquí comprende entre alrededor de 20 y alrededor de 99 por ciento en peso, entre alrededor de 30 y alrededor de 95 por ciento en peso, entre alrededor de 30 y alrededor de 90 por ciento en peso, entre alrededor de 40 y alrededor de 90 por ciento en peso, entre alrededor de 40 y alrededor de 80 por ciento en peso, entre alrededor de 50 y alrededor de 95 por ciento en peso, entre alrededor de 50 y alrededor de 90 por ciento en peso, entre alrededor de 50 y alrededor de 80 por ciento en peso, entre alrededor de 50 y alrededor de 70 por ciento en peso, entre alrededor de 60 y alrededor de 99 por ciento en peso, o entre alrededor de 60 y alrededor de 80 por ciento en peso.

Además, una composición descrita aquí, en algunos casos, puede comprender una mezcla o combinación de dos o más polímeros u oligómeros. En algunos casos, los dos o más polímeros u oligómeros son polímeros u oligómeros que contienen citrato descritos aquí. En otros casos, al menos un polímero u oligómero de la mezcla o combinación no comprende un resto de citrato. Por ejemplo, en algunos casos, una composición descrita aquí comprende una mezcla o combinación de un polímero u oligómero que contiene citrato descrito aquí con un polímero biodegradable tal como un poliéster. En algunas realizaciones, una composición descrita aquí comprende una mezcla o combinación de un polímero u oligómero que contiene citrato descrito aquí con un poli(ácido láctico), un poli(metacrilato de metilo), un poli(metacrilato), un poli(ácido acrílico), un poli(acrilato), un policarbonato, un polisacárido tal como celulosa, o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, una composición descrita aquí comprende un primer polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I):

en la que

Ri es-H, -0C(O)NH

^Qj u w ^■

representa una cadena adicional de unidades repetidas que tienen la estructura de Fórmula (I); y m, n, p y q son independientemente números enteros que oscilan de 2 a 20; y

un segundo polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (II):

en la que

R²es -H o; representa una cadena adicional de unidades repetidas que tienen la estructura de Fórmula (II); y m, n y p son independientemente números enteros que oscilan de 2 a 20, y en la que el primer polímero u oligómero se mezcla con el segundo polímero u oligómero.

Los polímeros u oligómeros de una mezcla o combinación descritos aquí pueden estar presentes en la mezcla o combinación en cualquier cantidad. En algunos casos, la relación en peso de un primer polímero u oligómero de una mezcla o combinación de polímeros u oligómeros a un segundo polímero u oligómero de la mezcla o combinación está entre alrededor de 99:1 y alrededor de 1:99. En algunos casos, la relación en peso del primer polímero u oligómero al segundo polímero u oligómero está entre alrededor de 10:1 y alrededor de 1:10, entre alrededor de 5:1 y alrededor de 1:5, entre alrededor de 3:1 y alrededor de 1:3, o entre alrededor de 2:1 y alrededor de 1:2. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que una composición que comprende una mezcla de polímeros u oligómeros descritos aquí, en algunas realizaciones, puede usarse para formar un material compuesto que comprende cantidades mayores de materiales en partículas de lo que sería posible de otro modo. Nuevamente, sin pretender ceñirse a ninguna teoría, se cree además que una composición que comprende una mezcla de polímeros u oligómeros descritos aquí puede proporcionar una combinación deseada de propiedades proporcionadas por los polímeros u oligómeros individuales. Por ejemplo, un polímero u oligómero de Fórmula (I) puede proporcionar mayor resistencia mecánica que un polímero u oligómero de Fórmula (II), pero menos grupos hidroxilo o carboxilo para interactuar con un material en partículas tal como hidroxiapatita. De este modo, en algunos casos, la relación de polímeros u oligómeros diferentes incluidos en una composición descrita aquí se selecciona en base a una cantidad deseada de uno o más grupos funcionales o restos y/o una resistencia mecánica deseada de la composición. Por ejemplo, en algunos casos, una composición que comprende una cantidad relativamente grande de un polímero u oligómero de Fórmula (II), en comparación con la cantidad de un polímero u oligómero de Fórmula (I), puede tener una mayor cantidad de grupos carboxilo que una composición que comprende una cantidad relativamente pequeña de un polímero u oligómero de Fórmula (II).

Además, en algunas realizaciones, los polímeros u oligómeros de una mezcla o combinación de polímeros u oligómeros descritos aquí pueden reticularse entre sí para formar una red polimérica. La reticulación de un primer polímero u oligómero con un segundo polímero u oligómero se puede lograr de cualquier manera. Por ejemplo, en algunos casos, la reticulación se consigue mediante enlaces covalentes intermoleculares tales como enlaces de éster o amida entre polímeros u oligómeros, incluso mediante una reacción de condensación. En otros casos, la reticulación se puede lograr mediante el acoplamiento de restos insaturados en los polímeros u oligómeros, tales como restos etilénicamente insaturados de restos de ácido maleico.

Además, en algunas realizaciones, una composición que comprende una red polimérica puede comprender además un material en partículas disperso en la red polimérica. Puede usarse cualquier material en partículas. En algunos casos, el material en partículas comprende uno o más de hidroxiapatita, fosfato tricálcico, fosfato cálcico bifásico, biovidrio, cerámica, polvo de magnesio, aleación de magnesio, y partículas de tejido óseo descelularizadas. También se pueden usar otros materiales en partículas.

Además, un material en partículas descrito aquí puede tener cualquier tamaño de partícula y/o forma de partícula. En algunas realizaciones, por ejemplo, un material en partículas tiene un tamaño medio de partícula en al menos una dimensión de menos de alrededor de 1000 pm, menos de alrededor de 800 pm, menos de alrededor de 500 pm, menos de alrededor de 300 pm, menos de alrededor de 100 pm, menos de alrededor de 50 pm, menos de alrededor de 30 pm, o menos de alrededor de 10 pm. En algunos casos, un material en partículas tiene un tamaño de partícula promedio en al menos una dimensión de menos de alrededor de 1 pm, menos de alrededor de 500 nm, menos de alrededor de 300 nm, menos de alrededor de 100 nm, menos de alrededor de 50 nm, o menos de alrededor de 30 nm.

En algunos casos, un material en partículas tiene un tamaño de partícula promedio mencionado aquí en dos o tres dimensiones. Además, un material en partículas puede estar formado por partículas sustancialmente esféricas, partículas en forma de láminas, partículas en forma de agujas, o una combinación de las mismas. También se pueden usar materiales en partículas que tengan otras formas.

Un material en partículas puede estar presente en una composición descrita aquí en cualquier cantidad. Por ejemplo, en algunos casos, una composición comprende hasta alrededor de 70 por ciento en peso, hasta alrededor de 60 por ciento en peso, hasta alrededor de 50 por ciento en peso, hasta alrededor de 40 por ciento en peso, o hasta alrededor de 30 por ciento en peso de material en partículas, basado en el peso total de la composición. En algunos casos, una composición comprende entre alrededor de 1 y alrededor de 70 por ciento en peso, entre alrededor de 10 y alrededor de 70 por ciento en peso, entre alrededor de 15 y alrededor de 60 por ciento en peso, entre alrededor de 25 y alrededor de 65 por ciento en peso, entre alrededor de 25 y alrededor de 50 por ciento

peso, entre alrededor de 30 y alrededor de 70 por ciento en peso, entre alrededor de 30 y alrededor de 50 por ciento en peso, entre alrededor de 40 y alrededor de 70 por ciento en peso, o entre alrededor de 50 y alrededor de 70 por ciento en peso, basado en el peso total de la composición. Por ejemplo, en algunos casos, una composición que comprende una red polimérica descrita aquí comprende hasta alrededor de 65 por ciento en peso de hidroxiapatita. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la incorporación de hasta alrededor de 65 por ciento en peso de hidroxiapatita en una red polimérica descrita aquí puede mejorar la osteoconductividad y/o la osteointegración proporcionada por la red polimérica en un entorno biológico o in vitro.

Además, un material en partículas descrito aquí se puede dispersar en una red polimérica. En algunas realizaciones, por ejemplo, el material en partículas se mezcla o muele en la red polimérica. Además, un material en partículas descrito aquí, en algunos casos, puede estar quelado o unido de otro modo por uno o más grupos funcionales colgantes de la red polimérica. Por ejemplo, en algunos casos, una composición comprende partículas de hidroxiapatita dispersas en una red polimérica descrita aquí, en la que la hidroxiapatita está quelada por uno o más grupos funcionales colgantes de la red polimérica. En algunas realizaciones, uno o más restos de carboxilo o uno o más restos de citrato de la red polimérica quelan una o más porciones que contienen calcio de la hidroxiapatita. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que tal quelación puede permitir la incorporación de mayores cantidades de hidroxiapatita (u otro material inorgánico) dentro de una red polimérica descrita aquí, en comparación con algunas otras matrices poliméricas.

Un polímero u oligómero o red polimérica reticulada de una composición descrita aquí, en algunas realizaciones, puede exhibir una o más propiedades deseables para aplicaciones biomédicas o de ingeniería de tejidos. Por ejemplo, en algunos casos, un polímero u oligómero o una red polimérica reticulada de una composición descrita aquí es biodegradable. Un polímero u oligómero o red polimérica reticulada “biodegradable”, con fines de referencia aquí, se degrada in vivo a componentes no tóxicos que pueden eliminarse del cuerpo mediante procesos biológicos ordinarios.

En algunas realizaciones, un polímero u oligómero o red polimérica reticulada biodegradable descritos aquí se degradan completamente o de forma sustancialmente completa in vivo en el transcurso de alrededor de 4 semanas o menos. Además, en algunas realizaciones, un polímero u oligómero o red polimérica reticulada descritos aquí es biocompatible o citocompatible. Un polímero u oligómero o red polimérica reticulada “biocompatible o citocompatible”, con fines de referencia aquí, no es tóxico y no causa una inflamación sustancial del tejido, en la que la inflamación puede medirse por la cantidad de formación de fibrocápsulas.

Además, en algunas realizaciones, un polímero u oligómero o red polimérica reticulada de una composición descrita aquí exhibe una alta resistencia mecánica. En algunos casos, por ejemplo, un polímero u oligómero o red polimérica reticulada de una composición descrita aquí exhibe una o más propiedades descritas en la Tabla I a continuación, cuando se mide como se describe a continuación en el Ejemplo 2.

Tabla I. Propiedades mecánicas

Además, en algunas realizaciones, una composición descrita aquí puede comprender además tejido óseo. Se puede utilizar cualquier tejido óseo. En algunas realizaciones, por ejemplo, el tejido óseo comprende tejido óseo compacto. En otros casos, el tejido óseo comprende tejido óseo esponjoso. Además, en algunas realizaciones, el tejido óseo se adhiere a una red polimérica de la composición, que incluye una red polimérica descrita aquí. Además, en algunos casos, el tejido óseo rodea la red polimérica, y la red polimérica se integra en el tejido óseo. Tal composición, en algunos casos, puede exhibir un alto contacto hueso-implante (BIC), en el que el “hueso” se refiere al tejido óseo, y el “implante” se refiere a la red polimérica. En algunas realizaciones, una composición descrita aquí muestra un contacto hueso-implante de al menos alrededor de 70 por ciento, al menos alrededor de 80 por ciento, al menos alrededor de 90 por ciento, al menos alrededor de 95 por ciento, o al menos alrededor de 99 por ciento, cuando se mide como se describe aquí. En algunas realizaciones, una composición descrita aquí exhibe un contacto hueso-implante entre alrededor de 70 y alrededor de 99 por ciento, entre alrededor de 75 y alrededor de 95 por ciento, entre alrededor de 80 y alrededor de 95 por ciento, o entre alrededor de 80 y alrededor de 90 por ciento, cuando se mide como se describe aquí. Además, en algunos casos, una composición descrita aquí no presenta encapsulación de tejido fibroso o sustancialmente ninguna encapsulación de tejido fibroso después de seis semanas in vivo. “Sustancialmente ninguna encapsulación de tejido fibroso”, con fines de referencia aquí, significa que menos de alrededor de 5 por ciento en peso o menos de alrededor de 1 por ciento en peso de la composición encapsula tejido fibroso.

Debe entenderse que una composición descrita aquí puede tener cualquier combinación de propiedades o características descritas aquí. Por ejemplo, cualquier polímero u oligómero descrito aquí puede usarse en combinación con cualquier cantidad o tipo de material en partículas descrito aquí. En algunas realizaciones, por ejemplo, una composición puede comprender un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I) y/o Fórmula (II), en la que el uno o más polímeros u oligómeros están reticulados para formar una red polimérica, y un material en partículas que comprende hidroxiapatita está disperso dentro de la red polimérica. También son posibles otras combinaciones.

II. Métodos para promover el crecimiento óseo

En otro aspecto, se describen aquí métodos para promover el crecimiento óseo. En algunas realizaciones, un método para promover el crecimiento óseo comprende proporcionar a una población de células óseas una composición que presenta citrato. Además, en algunos casos, promover el crecimiento óseo comprende promover la diferenciación celular y/o la progresión fenotípica en la población de células óseas. Por ejemplo, en algunos casos, proporcionar una composición que presenta citrato a una población de células óseas promueve la progresión fenotípica de osteoblasto en la población de células óseas. Además, en algunas de estas realizaciones, la composición que presenta citrato se proporciona a las células óseas en una primera etapa del desarrollo celular seleccionada para obtener una primera diferenciación celular o progresión fenotípica. Además, en algunos casos, se puede proporcionar una segunda composición que presenta citrato a las células óseas en una segunda etapa de desarrollo celular seleccionada para obtener una segunda diferenciación celular o progresión fenotípica. En otras realizaciones, un método para promover el crecimiento óseo descrito aquí comprende disponer en un entorno biológico una composición que presenta citrato. Un “entorno biológico”, con fines de referencia aquí, comprende un entorno dentro de un organismo vivo, tal como un sitio óseo o un sitio de herida o lesión. En algunos casos, promover el crecimiento óseo comprende aumentar la expresión del gen osterix y/o la expresión del gen de la fosfatasa alcalina en el entorno biológico. Además, un método para promover el crecimiento óseo descrito aquí, en algunas realizaciones, comprende además liberar ácido cítrico o citrato libre de la composición que presenta citrato.

Volviendo ahora a las etapas de los métodos, los métodos para promover el crecimiento óseo descritos aquí comprenden proporcionar a una población de células óseas una composición que presenta citrato, y/o disponer en un entorno biológico una composición que presenta citrato. Una “composición que presenta citrato”, con fines de referencia aquí, es una composición que incluye ácido cítrico, un citrato, un éster de ácido cítrico tal como citrato de trietilo, o una especie química que comprende un resto que tiene la estructura de Fórmula (IV):

en la que R¹, R²y R³son independientemente -H, -CH³, -CH²CH³, M+, o un punto de unión al resto de la especie química;

R⁴es -H o un punto de unión al resto de la especie química; y

M+ es un catión tal como Na+ o K+. En algunas realizaciones, la especie química es un polímero u oligómero. De este modo, el “citrato” de una “composición que presenta citrato” descrita aquí puede referirse a una molécula pequeña o forma “monomérica” de ácido cítrico, tal como ácido cítrico, una sal de citrato, o un éster de ácido cítrico, como se describió aquí anteriormente.

En un método descrito aquí puede usarse cualquier composición que presente citrato. En algunas realizaciones, por ejemplo, una composición que presenta citrato comprende una disolución acuosa de ácido cítrico y/o un citrato tal como citrato de sodio o citrato de potasio. En otros casos, una composición que presenta citrato comprende un polímero u oligómero descrito aquí anteriormente en la Sección I o una mezcla o combinación de polímeros u oligómeros descritos aquí anteriormente en la Sección I. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición que presenta citrato comprende un polímero u oligómero que comprende un resto de citrato, tal como un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I) o Fórmula (II). Una composición que presenta citrato de un método descrito aquí también puede comprender una mezcla o combinación de un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I) y un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (II). También se pueden usar otros polímeros u oligómeros, como se describe aquí anteriormente.

Además, una composición que presenta citrato descrita aquí se puede proporcionar a una población de células óseas de cualquier manera. Por ejemplo, en algunos casos, una composición que presenta citrato se proporciona a las células óseas in vitro como una mezcla o disolución acuosa, incluyendo un medio de cultivo suplementado con citrato. Puede utilizarse cualquier medio de cultivo. En algunas realizaciones, por ejemplo, el medio de cultivo comprende el Medio Mínimo Esencial Alfa (a MEM), el medio mínimo esencial de Eagle (EMEM), el medio Eagle modificado de Dulbecco, el suero fetal bovino (FBS), o una mezcla de uno o más de los medios anteriores. Además, en algunos casos en los que la composición que presenta citrato comprende un medio de cultivo suplementado con citrato, el medio de cultivo está libre o sustancialmente libre de factores de crecimiento óseo adicionales distintos del citrato proporcionado por una composición que presenta citrato descrita aquí. En algunas realizaciones, el medio de cultivo está libre o sustancialmente libre de zinc. Un medio de cultivo que está “sustancialmente libre” de factores de crecimiento óseo adicionales u otros componentes, con fines de referencia aquí, comprende menos de alrededor de 10 pM o menos de alrededor de 1 pM de factor de crecimiento óseo adicional. Alternativamente, en otros casos, un medio de cultivo de una composición que presenta citrato descrita aquí comprende además uno o más factores de crecimiento óseo. Por ejemplo, en algunos casos, un medio de cultivo es un medio osteogénico. En otros casos, una composición que presenta citrato se proporciona a las células óseas in vivo como una mezcla o disolución acuosa o como un implante o dispositivo sólido, tal como un tornillo o placa para huesos. Además, debe entenderse que una composición que presenta citrato proporcionada a las células óseas según un método descrito aquí, en algunas realizaciones, puede ser exógena a las células óseas.

Además, en algunos métodos descritos aquí, una o más composiciones que presentan citrato se pueden proporcionar a las células óseas en una o más etapas de progresión fenotípica o diferenciación celular. Las composiciones que presentan citrato descritas aquí se pueden proporcionar a células óseas en cualquier etapa o combinación de etapas n. En algunos casos, por ejemplo, una composición que presenta citrato se proporciona a las células óseas en o antes de una etapa de mineralización, incluso después de que las células óseas se hayan diferenciado al menos parcialmente. Las composiciones que presentan citrato también se pueden proporcionar a las células óseas en una o más de otras etapas de progresión o diferenciación del fenotipo. Además, la misma o diferente composición que presenta citrato descrita aquí se puede proporcionar en una o más etapas.

Un método para promover el crecimiento óseo descrito aquí, en algunas realizaciones, comprende además liberar ácido cítrico o citrato libre de la composición que presenta citrato. El ácido cítrico o citrato “libre”, con fines de referencia aquí, comprende ácido cítrico o citrato que no está unido covalentemente a otra especie tal como un polímero u oligómero descrito aquí. El ácido cítrico o citrato se puede liberar a partir de una composición que presenta citrato descrita aquí. Además, el ácido cítrico o el citrato se pueden liberar en cualquier entorno deseado. Por ejemplo, en algunos casos, el ácido cítrico o citrato se puede liberar en un entorno biológico degradando un polímero u oligómero que contiene citrato dispuesto en el entorno biológico. Además, un polímero u oligómero se puede degradar de cualquier manera. En algunas realizaciones, degradar un polímero u oligómero comprende hidrolizar un enlace de éster del polímero u oligómero, tal como un enlace de éster en la cadena principal del polímero u oligómero. En otros casos, la liberación de ácido cítrico o citrato de una composición que presenta citrato no requiere hidrólisis, escisión de enlaces químicos, u otra degradación de la composición. Por ejemplo, en algunas realizaciones que comprenden el uso de disoluciones acuosas de ácido cítrico o un citrato, el ácido cítrico o citrato libre se puede liberar en un entorno deseado simplemente proporcionando al entorno la composición que presenta citrato.

Además, una composición que presenta citrato de un método descrito aquí, en algunos casos, puede proporcionar una cantidad deseada de citrato. En algunas realizaciones, por ejemplo, una composición que presenta citrato descrita aquí proporciona una concentración de citrato entre alrededor de 20 pM y alrededor de 2000 pM, basada en el volumen de la composición. Sorprendentemente, se ha descubierto que proporcionar una cantidad de citrato entre alrededor de 20 pM y alrededor de 2000 pM puede promover el crecimiento óseo de la manera descrita aquí mientras que también evita o minimiza otros efectos que pueden no desearse, como se describe más adelante aquí. También se pueden proporcionar otras cantidades o concentraciones de citrato. Por ejemplo, en algunos casos, una composición que presenta citrato descrita aquí proporciona una concentración de citrato entre alrededor de 20 pM y alrededor de 200 pM, entre alrededor de 20 pM y alrededor de 150 pM, entre alrededor de 100 pM y alrededor de 2000 pM, entre alrededor de 100 pM y alrededor de 1500 pM, entre alrededor de 200 pM y alrededor de 2000 pM, entre alrededor de 200 pM y alrededor de 1500 pM, entre alrededor de 300 pM y alrededor de 1800 pM, entre alrededor de 500 pM y alrededor de 2000 pM, entre alrededor de 500 pM y alrededor de 1500 pM, entre alrededor de 800 pM y alrededor de 2000 pM, entre alrededor de 800 pM y alrededor de 1400 pM, entre alrededor de 1000 pM y alrededor de 2000 pM, o entre alrededor de 1000 pM y alrededor de 1500 pM. En algunas realizaciones, una composición que presenta citrato descrita aquí proporciona una concentración de citrato mayor que alrededor de 800 pM, o mayor que alrededor de 2000 pM.

Además, en algunas realizaciones, un método descrito aquí proporciona un efecto biológico de una manera dependiente de la dosis, basado en la cantidad de citrato proporcionada. Por ejemplo, en algunos casos, un método descrito aquí comprende proporcionar a una población de células óseas una composición que presenta citrato para aumentar la expresión del gen ALP y/u OSX en las células de una manera dependiente de la dosis, en el que la cantidad de citrato proporcionada está entre alrededor de 20 pM y alrededor de 2000 pM.

Además, una composición que presenta citrato descrita aquí se puede proporcionar a cualquier población de células óseas. Por ejemplo, en algunos casos, las células óseas comprenden células osteoblásticas. En otros casos, las células óseas comprenden células de la médula ósea, tales como las células del estroma de la médula ósea. En algunas realizaciones, las células óseas comprenden células madre. Las células madre, en algunos casos, pueden ser células madre adultas. En algunos casos, la población de células óseas comprende células madre multipotentes, oligopotentes, o unipotentes. En algunas realizaciones, las células madre comprenden células madre mesenquimatosas tales como células C2C12 o células madre mesenquimatosas humanas (hMSC). Además, las células óseas pueden ser in vitro, in vivo, endógenas, o exógenas.

Los métodos para promover el crecimiento óseo descritos aquí, en algunas realizaciones, comprenden además proporcionar un factor biológico a una población de células óseas. Un “factor biológico”, con fines de referencia aquí, comprende una sustancia que funciona en una ruta bioquímica o proceso corporal específico, tal como un factor de crecimiento. Puede usarse cualquier factor biológico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un factor biológico comprende una proteína morfogenética ósea (BMP). Una BMP, en algunos casos, comprende una o más de BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6 y BMP-7. También pueden usarse otros factores biológicos.

Los métodos para promover el crecimiento óseo descritos aquí, en algunas realizaciones, comprenden aumentar la expresión del gen osterix (OSX) y/o la expresión del gen de la fosfatasa alcalina (ALP). En algunos casos, el aumento de la expresión génica de OSX comprende aumentar la expresión génica hasta alrededor de un 300 por ciento en comparación con un control de vidrio desnudo después de 48 horas de cultivo. En algunos casos, la cantidad de expresión del gen OSX aumenta hasta alrededor de 200 por ciento, hasta alrededor de 100 por ciento, hasta alrededor de 50 por ciento, o hasta alrededor de 40 por ciento. En algunas realizaciones, la cantidad de expresión del gen OSX aumenta entre alrededor de 30 por ciento y alrededor de 300 por ciento, entre alrededor de 35 por ciento y alrededor de 250 por ciento, entre alrededor de 35 por ciento y alrededor de 200 por ciento, o entre alrededor de 200 por ciento y alrededor de 300 por ciento, en comparación con un control de vidrio desnudo después de 48 horas de cultivo.

En algunos casos, la cantidad de expresión del gen ALP aumenta en una cantidad de hasta alrededor de 400 por ciento en comparación con un control de vidrio desnudo después de 48 horas de cultivo. En algunos casos, la cantidad de expresión del gen ALP aumenta hasta alrededor de 360 por ciento, hasta alrededor de 250 por ciento, hasta alrededor de 150 por ciento, hasta alrededor de 100 por ciento, hasta alrededor de 50 por ciento, o hasta alrededor de 40 por ciento. En algunas realizaciones, la cantidad de expresión del gen ALP aumenta entre alrededor de 30 por ciento y alrededor de 400 por ciento, entre alrededor de 35 por ciento y alrededor de 360 por ciento, entre alrededor de 35 por ciento y alrededor de 300 por ciento, entre alrededor de 35 por ciento y alrededor de 250 por ciento, entre alrededor de 300 por ciento y alrededor de 400 por ciento, o entre alrededor de 300 por ciento y alrededor de 360 por ciento, en comparación con un control de vidrio desnudo después de 48 horas de cultivo.

Además, los métodos descritos aquí, en algunas realizaciones, comprenden proporcionar una composición que presenta citrato que inhibe al menos parcialmente el crecimiento y/o la proliferación de células cancerosas, tales como células de osteosarcoma u otras células de cáncer de hueso. En algunas realizaciones, el crecimiento y/o la proliferación de las células cancerosas se inhibe o detiene completamente, tal como cuando las células cancerosas son destruidas mediante el método. En otros casos, el crecimiento y/o la proliferación de células cancerosas se inhibe hasta alrededor de 90 por ciento, hasta alrededor de 80 por ciento, hasta alrededor de 70 por ciento, hasta alrededor de 50 por ciento, hasta alrededor de 30 por ciento, o hasta alrededor de 20 por ciento, en comparación con un método de control que no incluye proporcionar a la población de células una composición que presenta citrato. Además, en algunas realizaciones, el efecto de una composición que presenta citrato descrita aquí depende de la dosis. Además, en algunos casos, inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células cancerosas comprende proporcionar citrato a las células en una concentración mayor que alrededor de 800 pM, tal como una cantidad entre alrededor de 800 pM y alrededor de 20.000 pM, o una cantidad entre alrededor de 800 pM y alrededor de 2000 pM.

Además, en algunas realizaciones, los métodos descritos aquí comprenden proporcionar una composición que presenta citrato que destruye las células cancerosas, tales como las células de cáncer de hueso. En algunos casos, todas las células cancerosas mueren. En otros casos, se extermina al menos alrededor de 90 por ciento, al menos alrededor de 80 por ciento, al menos alrededor de 70 por ciento, o al menos alrededor de 50 por ciento de las células cancerosas, en comparación con un método de control que no incluye proporcionar a la población de células una composición que presenta citrato. Además, en algunas realizaciones, el efecto anticanceroso de una composición que presenta citrato descrita aquí depende de la dosis. Además, en algunos casos, destruir las células cancerosas comprende proporcionar citrato a las células a una concentración mayor que alrededor de 2000 pM, tal como una concentración mayor que alrededor de 2000 pM y hasta alrededor de 20.000 pM.

Debe entenderse que un método para promover el crecimiento óseo descrito aquí puede comprender cualquier combinación de etapas, o usar cualquier combinación de composiciones descritas aquí. En algunas realizaciones, por ejemplo, un método para promover el crecimiento óseo descrito aquí puede comprender el uso de una composición que presenta citrato descrita aquí anteriormente en la Sección I para proporcionar una concentración de citrato descrita aquí anteriormente a una población de células óseas o a un entorno biológico descrito aquí anteriormente con el fin de promover la diferenciación celular y/o la progresión fenotípica o con el fin de aumentar la expresión del gen osterix y/o la expresión del gen de la fosfatasa alcalina.

III. Artículos que comprenden composiciones que presentan citrato

En otro aspecto, se describen aquí artículos que comprenden composiciones que presentan citrato. En algunas realizaciones, un artículo comprende o se forma a partir de una composición que presenta citrato descrita aquí anteriormente en la Sección I, tal como una red polimérica reticulada formada a partir de un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I) y/o un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (II). En algunas realizaciones, un artículo descrito aquí comprende o se forma a partir de una red polimérica reticulada descrita aquí anteriormente en la Sección I que comprende un material en partículas disperso en la red polimérica. Por ejemplo, en algunos casos, un artículo descrito aquí comprende o se forma a partir de un primer polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I) reticulado con un polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (II) para formar una red polimérica, comprendiendo además la red polimérica hasta alrededor de 70 por ciento en peso de hidroxiapatita dispersa por toda la red polimérica.

En algunas realizaciones, un artículo descrito aquí es un implante biológico o quirúrgico, tal como un dispositivo de fijación ortopédico, tal como un tornillo para huesos o una placa para huesos. Por lo tanto, en algunos casos, un artículo descrito aquí se puede utilizar para promover la curación o reparación de fracturas óseas u otras heridas o lesiones al proporcionar soporte mecánico. Además, en algunas realizaciones, un artículo descrito aquí también puede promover el crecimiento óseo en el sitio de una herida o lesión, tal como una fractura de hueso. De esta manera, un artículo descrito aquí se puede utilizar para proporcionar un tratamiento mejorado de fracturas óseas, trastornos del crecimiento óseo, y/o afecciones de degeneración ósea. Un artículo descrito aquí también puede inhibir el crecimiento del cáncer o destruir las células cancerosas en un compartimento biológico, tal como el hueso.

Un artículo descrito aquí puede tener cualquier tamaño y forma. En algunas realizaciones, un artículo descrito aquí tiene una forma cilíndrica, una forma esférica, o una forma poliédrica. En otros casos, un artículo descrito aquí tiene una forma adecuada para uso como dispositivo de fijación ortopédico, tal como una forma de tornillo o una forma de placa.

Además, un artículo descrito aquí puede exhibir una o más propiedades deseables, tales como una o más propiedades biomédicas o mecánicas deseables. En algunos casos, por ejemplo, un artículo descrito aquí exhibe o promueve un efecto biológico descrito aquí anteriormente en la Sección I o en la Sección II, tal como un efecto de expresión génica aumentado o un efecto osteoinductivo. En otros casos, un artículo descrito aquí exhibe un módulo de compresión descrito aquí anteriormente en la Sección I.

Además, un artículo descrito aquí se puede fabricar de cualquier manera. Por ejemplo, en algunos casos, un artículo descrito aquí se fabrica a partir de una composición descrita aquí usando un procedimiento de extrusión, un procedimiento de pultrusión, o un proceso de moldeo, que incluye, pero no se limita a, un procedimiento de moldeo por inyección.

Algunas realizaciones descritas aquí se ilustran adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes. A menos que se indique lo contrario, todos los experimentos descritos a continuación se realizaron por duplicado y se repitieron tres veces (n = 6), y los resultados estadísticos se basan en conjuntos de tres experimentos. Cuando sea apropiado, los datos se expresan como la media ± una desviación estándar. La significancia estadística entre dos conjuntos de datos se calculó utilizando una prueba de la t de Student de dos colas. Se consideró que las diferencias eran significativas cuando se obtuvo un valor de P < 0,05.

EJEMPLO 1

Polímeros u oligómeros POC y CUPE

Los polímeros u oligómeros que presentan citrato según algunas realizaciones descritas aquí se prepararon como sigue. Un primer polímero u oligómero se identificó como poli(citrato de octanodiol) (POC), y un segundo polímero u oligómero se identificó como poliéster dopado con uretano reticulado (CUPE).

Para sintetizar POC, se añadieron cantidades equimolares de 1,8-octanodiol (98%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) y ácido cítrico (99,5%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en un matraz de fondo redondo de 100 ml, y se expusieron a un flujo constante de gas nitrógeno. La mezcla se fundió con agitación vigorosa a 160-165°C. Una vez que los constituyentes se fundieron, se dejó que la mezcla reaccionara a 140°C durante 1 h para crear un polímero u oligómero POC sin purificar. A continuación, el polímero u oligómero no purificado se añadió gota a gota a agua desionizada, se recogió, y se liofilizó durante la noche para obtener el polímero u oligómero POC purificado.

Para sintetizar CUPE, primero se sintetizó un polímero u oligómero POC haciendo reaccionar ácido cítrico y 1,8-octanodiol en una relación molar 1:1,1, respectivamente, y procesando adicionalmente el producto de reacción como se indicó anteriormente. A continuación, se logró la extensión de la cadena del polímero u oligómero POC disolviendo el polímero u oligómero POC purificado en 1,4-dioxano para formar una disolución al 3 por ciento en peso de POC, seguido de la reacción con 1,6-diisocianato de hexametileno (HDI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en una relación molar de POC a HDI de 1:1,5 con agitación constante a 55°C. La reacción terminó cuando el análisis de infrarrojos por transformada de Fourier (FT-IR) mostró una desaparición del pico de isocianato a 2267 cm-1.

EJEMPLO 2

Mezclas CBPB y materiales compuestos de CBPBHA

Las redes poliméricas y las redes poliméricas que comprenden material en partículas dispersado dentro de la red según algunas realizaciones descritas aquí se prepararon como sigue. Las redes poliméricas incluyeron diversas mezclas de un primer polímero u oligómero y un segundo polímero u oligómero, y se denominaron mezclas de polímeros a base de citrato (CBPB). Las redes poliméricas que comprenden material en partículas se denominaron materiales compuestos de mezcla de polímero a base de citrato/hidroxiapatita (CBPBHA). Los materiales compuestos de CBPBHA se fabricaron en tres etapas. Primero, se preparó una mezcla de CUPE y POC disolviendo un polímero u oligómero POC en 1,4-dioxano o tetrahidrofurano (THF) y mezclando la disolución de POC con diversas relaciones en peso de disoluciones de polímero u oligómero CUPE en 1,4-dioxano o THF para formar una mezcla homogénea de oligómeros o polímeros a base de citrato, denominada CBPB-X, en la que X se define como la relación en peso de CUPE en la mezcla CBPB. En segundo lugar, cada CBPB se mezcló con 65 por ciento en peso de hidroxiapatita (HA, [MW: 502,32; ensayo: > 90% (como Ca3(PO4)2); tamaño de partícula: > 75 pm (0,5%), 45-75 pm (1,4%), < 45 pm (98,1%)], Fluka, St. Louis, MO, USA), basado en el peso total de la composición, y se agita en placas de teflón precalentadas hasta 50°C para ayudar en la evaporación del disolvente. Después de la evaporación del disolvente, la mezcla similar a la arcilla se insertó en moldes metálicos cilíndricos mecanizados y se comprimió en muestras en forma de varilla. Finalmente, los materiales compuestos cilíndricos resultantes se post-polimerizaron a 80°C durante 5 días, seguido de calentamiento a 120°C bajo 2 Pa de vacío durante 1 día para formar un material compuesto de CBPBHA-X reticulado, en el que X se define nuevamente como la relación en peso de CUPE en CBPB. Los resultados se muestran en la Tabla II. También se podrían preparar de la misma manera materiales compuestos que incluyan materiales en partículas distintos de HA. Este procedimiento se ilustra esquemáticamente en la FIG. 1. Como se representa en la FIG. 1, las cadenas principales del polímero u oligómero CUPE se representan dispuestas esencialmente de forma vertical, y las cadenas principales del polímero u oligómero POC se representan dispuestas esencialmente de forma horizontal. Sin embargo, esta descripción es solo para fines ilustrativos. Como entenderá un experto en la técnica, la orientación de las cadenas principales de CUPE y POC puede ser aleatoria. Además, como se representa en la FIG. 1, los círculos más grandes en la red compuesta representan partículas de HA, los círculos más pequeños representan enlaces de éster o uretano, y las líneas discontinuas indican grupos carboxilo colgantes.

Tabla II. Mezclas poliméricas CBPB y materiales compuestos de CBPBHA.

Las mezclas CBPB y los materiales compuestos de CBPBHA se caracterizaron utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC). Específicamente, las medidas se llevaron a cabo utilizando un calorímetro de barrido diferencial DSC Q2000 (TA Instruments, New Castle, DE, USA) para caracterizar las propiedades térmicas y la homogeneidad de las mezclas poliméricas CBPB (CBPB-100, CBPB-90, CBPB-50, y CBPB-0). Las muestras se escanearon inicialmente desde la temperatura ambiente hasta 150°C bajo nitrógeno a una velocidad de calentamiento de 10°C por minuto, seguido de enfriamiento a una velocidad de -40°C por minuto hasta que se alcanzó una temperatura de -75°C. A continuación, las muestras se escanearon de nuevo desde -75°C hasta 150°C a una velocidad de calentamiento de 10°C por minuto. La temperatura de transición vitrea (Tg) se determinó a partir de la mitad del cambio de etapa registrado en la capacidad calorífica del segundo ciclo de calentamiento. Para determinar la miscibilidad de los dos polímeros u oligómeros en una mezcla CBPB, la temperatura de transición vítrea de la mezcla se expresó mediante la Ecuación (2) (Ecuación de Fox):

' 1 W, 'I _ ; ' W ' T, ' <:i.

en la que Wi es la fracción en peso del componente i, y las temperaturas están en Kelvin. Los resultados se muestran en la FIG. 2. La FIG. 2 ilustra termogramas de DSC de varias mezclas CBPB. Los valores se expresan como la media ± una desviación estándar, con n = 6. Las mezclas CBPB exhibieron una única temperatura de transición vítrea que aumentó con el aumento del contenido de CUPE en las mismas condiciones de polimerización (5 días, 80°C). Se calculó que los valores de Tg para CBPB-90 y CBPB-50, basados en los valores de Tg de los componentes individuales CBPB-100 y CBPB-0, eran 0,4 FC y -9,13°C, respectivamente.

Se realizaron ensayos de compresión no confinada en los materiales compuestos de CBPBHA utilizando una máquina de ensayo universal electromecánica Q Test-150 (MTS, Eden Prairie, MN, USA). Brevemente, se comprimieron probetas con forma cilíndrica de 6 mm x 9 mm (diámetro x altura) a una velocidad de 2 mm por minuto hasta fallo. El módulo inicial se calculó midiendo el gradiente al 10% de compresión de la curva de tensión-deformación. Los resultados se muestran en la Tabla III y en las FIGS. 3A y 3B. La FIG. 3A ilustra el módulo de compresión de los materiales compuestos de CBPBHA. La FIG. 3B ilustra la resistencia máxima a la compresión de los materiales compuestos de CBPBHA. Los valores del eje x representan el porcentaje de CUPE en las mezclas CBPB.

Tabla III. Propiedades mecánicas.

La velocidad de degradación in vitro de las muestras de disco (6 mm de diámetro x 2 mm de grosor) de los materiales compuestos de CBPBHA se evaluó mediante la pérdida de peso a lo largo del tiempo. Las muestras se dispusieron en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) (pH 7,4) a 37°C durante hasta 24 semanas en condiciones estáticas. La PBS se cambió cada semana para asegurar que el pH no cayera por debajo de 7. Antes de pesar, las muestras se enjuagaron ampliamente con agua desionizada (DI) y se liofilizaron. La pérdida de peso se calculó comparando el peso inicial (W⁰) con el peso medido a las 1, 2, 4, 8, 12 y 24 semanas (Wt), como se muestra en la Ecuación (1):

Pérdida de peso = (W0-W1)/W0x100% (1).

Los resultados se muestran en la FIG. 4 como media ± una desviación estándar (n = 6).

La mineralización in vitro de materiales compuestos de CBPBHA se evaluó utilizando una disolución de fluido corporal simulado (SBF) modificada 4X que consiste en (mmoles): Na+ (142,0), K+ (5,0), Mg2+ (1,5), Ca2+ (2,5), Cl-(103), HCO³-(10,0), HPO⁴2" (1,0) y SO⁴2" (0,5), con el pH ajustado a 7,0 usando NaOH 1,0 M para obtener resultados acelerados. Brevemente, se sumergieron discos de material compuesto (6 mm de diámetro x 2 mm de altura) en 10 ml del SBF a 37°C durante hasta 15 días. El SBF se renovó cada dos días para mantener la concentración iónica y el pH durante la mineralización. Después de la incubación durante varios períodos de tiempo, las muestras se lavaron cuidadosamente con agua DI para eliminar los iones inorgánicos solubles, y se secaron al aire. A continuación, las muestras se recubrieron con plata y se observaron con un microscopio electrónico de barrido (SEM) (Hitachi, Pleasanton, CA, USA). La relación molar estequiométrica Ca/P se analizó mediante análisis de rayos X por dispersión de energía (EDX), y se determinó que era 1,39 ± 0,25. Como se ilustra en la FIG. 5, todos los materiales compuestos de CBPBHA indujeron una rápida mineralización. Las imágenes etiquetadas A-1, A-2 y A-3 en la FIG. 5 corresponden a CBPBHA-0 a los 0, 3 y 15 días, respectivamente. Se utiliza un esquema de etiquetado similar para los otros materiales compuestos en la FIG. 5.

EJEMPLO 3

Métodos para promover el crecimiento óseo

Los métodos para promover el crecimiento óseo según algunas realizaciones descritas aquí se llevaron a cabo como sigue. Células estromales de la médula ósea (BMSC) derivadas de ratas macho Sprague-Dawley de 6 semanas de edad se cultivaron en un medio de crecimiento que contenía Medio Esencial Mínimo Alfa (aMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (V/V), 0,25 pg/ml de Fungizona, y penicilina y estreptomicina al 1% (V/V), en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 x 105 células/pocillo (Día 0). El Día 3, el medio de crecimiento se cambió a un medio osteogénico que consistía en aMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, dexametasona 107 M, 50 pg/ml de ácido ascórbico (Sigma), fosfato de p-glicerol 5 mM (Sigma), 0,25 pg/ml de fungizona, penicilina y estreptomicina al 1%, y diversas concentraciones de ácido cítrico (0 pM, 2 pM, 20 pM, 200 pM, 1 mM y 5 mM). Después de 12 días de inducción osteogénica, los cultivos de BMSC se tiñeron con tinción de Von Kossa, y se obtuvieron imágenes mediante microscopía óptica. Se contó el número de nódulos de calcio por pocillo en el microscopio invertido. También se calculó el área total de los nódulos de calcio. Los resultados se muestran en las FIGS. 6A-6C. La FIG. 6A ilustra imágenes de microscopio de tinción de Von Kossa. La FIG. 6B ilustra el número de nódulos de calcio observados. La FIG. 6C ilustra el área total de los nódulos de calcio. Se encontró que todos los medios de cultivo suplementados con citrato promovían la formación de nódulos de calcio de una manera dependiente de la dosis. Una concentración de citrato de 20 pM indujo el mayor número de nódulos de calcio (en negro en la FIG. 6A) con tamaños más grandes, mientras que el medio de control no facilitó la formación de nódulos de calcio visibles.

EJEMPLO 4

Métodos para promover el crecimiento óseo

Los métodos para promover el crecimiento óseo según algunas realizaciones descritas aquí se llevaron a cabo como sigue. Se cultivaron células MG-63 (ATCC, Manassas, VA, USA) en EMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) suplementado con FBS al 10% y penicilina y estreptomicina al 1%. Las células MG-63 se sembraron al 50% de confluencia en placas de 6 pocillos, y se cultivaron con EMEM que contenía diferentes concentraciones de ácido cítrico (0 pM, 10 pM, 20 pM, 50 pM, 100 pM y 200 pM). A los 4 días, las células se lisaron y ensayaron para determinar la presencia de fosfatasa alcalina (ALP) usando un kit de sustrato de ALP (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Los niveles de ALP se normalizaron a la cantidad total de ADN presente en las muestras según lo determinado por el ensayo picogreen (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Los resultados se muestran en la FIG. 7.

En otros experimentos, se cultivaron células MG-63 o células MSC y se sembraron como se describió anteriormente con medios de cultivo que contenían ácido cítrico 0 pM, 20 pM, 100 pM, 200 pM, 1000 pM, o 2000 pM. Las células se analizaron para determinar la presencia de ALP en diversos puntos de tiempo, tales como el Día 3, el Día 7, el Día 10, el Día 14, y el Día 21. Los resultados se muestran en las FIGs .8A y 8B.

EJEMPLO 5

Métodos para promover el crecimiento óseo

Los métodos para promover el crecimiento óseo según algunas realizaciones descritas aquí se llevaron a cabo como sigue. Se cultivaron células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) (Lonza Walkersville Inc., USA) en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con FBS al 10% y penicilina y estreptomicina al 1%. Para la diferenciación, las hMSC se cambiaron a un medio osteogénico (OGM) que comprendía el medio anterior basado en DMEM suplementado adicionalmente con p-glicerofosfato 10-7 M y ácido ascórbico-2-fosfato 50 pM. Las células hMSC se sembraron a una densidad de 104 células/ml después de una confluencia del 80-90% en placas de 96 pocillos. Después de ajustar el pH a 7,4, se añadieron al medio de cultivo volúmenes calculados de citrato en forma de ácido cítrico para obtener una concentración final de citrato de 20 pM, 200 pM o 2000 pM en el medio de crecimiento. Las hMSC se incubaron con los medios suplementados con citrato a 37°C con 5% de CO². Los medios se cambiaron cada dos días. En puntos de tiempo predeterminados (7 días y 14 días después de la adición de citrato), se determinaron los niveles de la proteína osteopontina (OPN) y se compararon mediante ensayo de transferencia Western siguiendo el protocolo del fabricante (Bio-rad Laboratory, USA). Los resultados se muestran en la FIG. 9. Como se ilustra en la FIG. 9, el citrato y la expresión de OPN estaban estrechamente asociados en una relación dependiente de la dosis.

EJEMPLO 6

Métodos para promover el crecimiento óseo

Los métodos para promover el crecimiento óseo según algunas realizaciones descritas aquí se llevaron a cabo como sigue. Se cultivaron células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) (Lonza Walkersville Inc., USA) en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con FBS al 10% y penicilina y estreptomicina al 1%. Para la diferenciación, las hMSC se cambiaron a un medio osteogénico (OGM) que comprendía el medio anterior basado en DMEM suplementado adicionalmente con dexametasona 10'7 M, p-glicerofosfato 10'2 M, y ácido ascórbico-2-fosfato 50 pM. Las células hMSC se sembraron a una densidad de 104 células/ml después de una confluencia del 80-90% en placas de 96 pocillos. Después de ajustar el pH a 7,4, se añadieron al medio de cultivo volúmenes calculados de citrato en forma de ácido cítrico para obtener una concentración final de citrato de 20 pM en el medio de crecimiento. Las hMSC se incubaron con los medios suplementados con citrato a 37°C con 5% de CO². Los medios se cambiaron cada dos días. En puntos de tiempo predeterminados (7 días, 14 días y 21 días después de la adición de citrato), los cultivos se tiñeron mediante tinción de Von Kossa, y después se examinaron con microscopio ópti

de depósitos de calcio. Los resultados se muestran en la FIG. 10. Como se ilustra en la FIG. 10, el suplemento de citrato exógeno pudo promover la formación de depósitos de calcio en cultivos de hMSC diferenciados.

EJEMPLO 7

Métodos para promover el crecimiento óseo

Los métodos para promover el crecimiento óseo según algunas realizaciones descritas aquí se llevaron a cabo como sigue. Se cultivaron células C2C12 (ATCC, Manassas, VA, USA) en CBPB-100, CBPBhA-100, CBPBHA-90, y vidrio de control, en placas de 24 pocillos en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa (GIBCO, Grand Island, NY, USA) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 pg/ml de estreptomicina, en 95% de aire y 5% de CO². El ARN total de las células C2C12 se purificó usando un RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). El ARN se sometió a RT-PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando un reactivo TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). Los niveles relativos de transcrito se analizaron mediante un sistema de PCR en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). Los niveles de transcrito se normalizaron a niveles de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron tres veces. La diferenciación de osteoblastos a partir de células C2C12 se indujo mediante tratamiento con BMP-2 (R&D, Minneapolis, MN, USA). Después de alcanzar una confluencia del 60-80%, las células se trataron con 300 ng/ml de BMP-2 durante 0, 6, 12, 36, y 48 horas. Los niveles de expresión del gen osterix (OSX) y de fosfatasa alcalina (ALP) se analizaron como se describió anteriormente. Las morfologías de las células C2C12 se visualizaron mediante microscopía electrónica de barrido. Los resultados se muestran en las FIGS. 11A-C. Después de 24 horas, las células formaron una monocapa en todos los materiales compuestos de CBPBHA investigados (FIG. 11A). Además, los niveles de expresión de los genes ALP y OSX en CBPB-100 aumentaron un 35% y un 37%, respectivamente, en comparación con un control de vidrio desnudo después de 48 horas de cultivo. Con la incorporación de HA a mezclas CBPB, los niveles de expresión de los genes ALP y OSX aumentaron aún más. La expresión de los genes ALP y OSX en las placas recubiertas con material compuesto CBPBHA-90 aumentó en un 362% y 191%, respectivamente, y los niveles de expresión en las placas recubiertas con CBPBHA-100 aumentaron en un 336% y 290%, respectivamente, en comparación con un control de vidrio desnudo después de 48 horas de cultivo. En comparación con las placas recubiertas con CBPB-100 después de 48 horas, la expresión de ALP y OSX en materiales compuestos CBPBHA-90 aumentó en un 243% y 113%, respectivamente, mientras que la expresión de ALP y OSX en materiales compuestos CBPBHA-100 aumentó en un 224% y 185%, respectivamente (FIGS. 11B y 11C).

EJEMPLO 8

Métodos para promover el crecimiento óseo

Los métodos para promover el crecimiento óseo según algunas realizaciones descritas aquí se llevaron a cabo como sigue. Se utilizaron doce conejos blancos de Nueva Zelanda que pesaban entre 2,3 y 2,7 kg para evaluar la biocompatibilidad y las propiedades de osteointegración de los materiales compuestos CBPBHA-100 y CBPBHA-90. Se implantaron muestras cilíndricas en los cóndilos femorales laterales de las rodillas de los conejos. Después de 6 semanas de implantación, las imágenes de micro-CT mostraron la fusión completa de los implantes y los nuevos tejidos óseos circundantes, como se ve en las FIGS. 12A y 12B. La FIG. 12A corresponde a c Bp BHA-100, y la FIG.

12b corresponde a CBPBHA-90. Se observó hueso adicional recién formado en contacto con el implante en la cavidad de la médula ósea, en la que originalmente no había hueso. Además, no hubo evidencia de inflamación crónica (formación de fibrocápsulas) o cambios degenerativos alrededor del implante. En el examen histológico macroscópico, los implantes parecían bien integrados con el hueso circundante. No se detectó aflojamiento del implante, como se muestra en la tinción con toluidina y la tinción de von Kossa para los tejidos óseos circundantes. Los resultados de contacto hueso-implante (BIC) indicaron que el hueso-implante (osteointegración) era tan alto como 94,74%, como se observa en la FIG. 13. La FIG. 13 ilustra imágenes de micro-CT 2-D de los implantes de CBPBHA-90 con el hueso circundante del cóndilo femoral lateral a las 6 semanas después de la implantación. Además, no se observó reabsorción ósea en la interfaz del hueso no descalcificado. Además, en la interfaz de los implantes y tejidos circundantes no se encontraron macrófagos teñidos positivamente.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo según un protocolo aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Médica del Sur (Guangzhou, CHINA). Los animales se dividieron aleatoriamente en 2 grupos, y se anestesiaron con ketamina (40 mg/kg IM) y xilazina (5-7 mg/kg IM) suplementada con isoflurano (inhalación al 1-2%). A continuación, se realizó una incisión medial de 1,5 cm en la rodilla lateral para exponer el cóndilo femoral lateral. Con un obturador de mosaicoplastia (Smith & Nephew, Memphis, TN, USA), se taladró un defecto óseo de 4 x 3 mm (diámetro x profundidad) en los cóndilos femorales laterales derecho e izquierdo para los grupos de CBPBHA-100 y CBPBHA-90, respectivamente. Los implantes formados a partir de los materiales compuestos CBPBHA-100 y CBPBHA-90, y que coincidían con las dimensiones del defecto, se insertaron según la agrupación mediante ajuste a presión. Después de todos los procedimientos quirúrgicos, los conejos se mantuvieron en jaulas y se mantuvieron con una dieta de laboratorio normal. Las rodillas se recogieron 6 semanas después de la implantación y se almacenaron en formalina amortiguada neutra al 10%. El examen macroscópico se documentó con una cámara digital. El análisis de tomografía computarizada se realizó utilizando un sistema de formación de imágenes mediante micro-CT (escáner ZKKS-MCT-Sharp-III, Caskaisheng, CHINA). El sistema de escaneo se configuró en 70 kV, 30 W, y 429 uA. El volumen de interés se definió como tejido óseo alrededor de los implantes, que incluía todo el compartimento trabecular que se extendía 8 mm desde el eje longitudinal del implante. La extensión de la osteointegración del implante se refleja generalmente en su medida de contacto hueso-implante (BIC). El BIC se calculó como un porcentaje de la longitud del hueso recién formado sobre el perímetro total del implante según las imágenes de micro-CT.

Para el análisis histológico, se cortaron tejidos descalcificados embebidos en parafina en secciones de 4 pm, que entonces se desparafinaron, hidrataron y tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E). Para la tinción inmunohistoquímica, las secciones embebidas en parafina se desparafinaron e hidrataron a través de una serie graduada de alcohol. La actividad de peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 0,3% en PBS. Después, las secciones se bloquearon con seroalbúmina bovina (dilución 1:100), y se incubaron con el anticuerpo primario de CD68 y CD 163 (Auragene, Changsha, China, dilución 1:50) a 4°C durante la noche. Las secciones se lavaron con PBS tres veces, y se incubaron con IgG secundaria anti-ratón durante 1 h a 37°C. La coloración se desarrolló en disolución DAB y se contratiñó con hematoxilina. La reacción inflamatoria que rodea al implante se evaluó por dos patólogos individuales de forma enmascarada y aleatorizada a partir de secciones teñidas con H&E y tinción con IHC. La fuente del grupo de control positivo se extrajo del tejido de curación del tendón de Aquiles de la rata 1 semana después de la tenotomía, que se ha caracterizado por una respuesta inflamatoria. Se realizó tinción con IHC para CD 163 y CD68 para detectar macrófagos. Los macrófagos aparecieron de color marrón en las células con núcleos teñidos con hematoxilina.

EJEMPLO 9

Métodos para inhibir el crecimiento del cáncer

Los métodos para inhibir el crecimiento del cáncer según algunas realizaciones descritas aquí se llevaron a cabo como sigue. Primero, se investigó el efecto del citrato sobre la proliferación celular. Se cultivaron células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) (Lonza Walkersville Inc., USA) en medio de crecimiento compuesto de Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%, y entonces se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 104 células/ml después de 80-90% de confluencia. Después de ajustar el pH a 7,4, se añadieron volúmenes calculados de citrato en forma de ácido cítrico al medio de cultivo para obtener una concentración final de citrato de 20 pM, 200 pM, 400 pM, 800 pM, 1000 pM, 2000 pM, 10.000 pM, o 20.000 pM en el medio de crecimiento. Las hMSC se incubaron con los medios suplementados con citrato a 37°C con 5% de CO². Los medios se cambiaron cada dos días. En puntos de tiempo predeterminados (1 día, 4 días y 7 días después de la adición de citrato), la proliferación de las hMSC se determinó mediante el ensayo de MTT (bromuro de metiltiazolildifenil-tetrazolio) siguiendo el protocolo del fabricante (Sigma, USA). Después de incubar a 37°C durante 4 horas en disolución de trabajo de MTT, las hMSC en las placas de 96 pocillos se sumergieron en dimetilsulfóxido (DMSO) durante 15 minutos en un agitador orbital en condiciones de oscuridad. Las placas de 96 pocillos se colocaron entonces en un lector de microplacas para obtener valores de absorbancia a 595 nm. Además, la tinción live/dead se llevó a cabo en puntos de tiempo predeterminados (1 día, 4 días y 7 días). Las hMSC se tiñeron con disolución de trabajo live/dead (Life Technologies Inc., USA) durante 30 minutos, y después se observaron con un microscopio de fluorescencia invertido Nikon para determinar la viabilidad celular. Los resultados se muestran en las FIGS. 14 y 15. Como se indica en las FIGS. 14 y 15, se encontró que el citrato no afectaba a la proliferación de hMSC en la ventana de concentración de 20-2000 pM, pero suprimía la proliferación de hMSC a concentraciones más altas (por encima de 2000 pM y hasta 20.000 pM).

En otro experimento, se cultivaron hMSC y células de osteosarcoma (células Saos-2) (ATCC Inc., USA) en presencia de citrato. Las hMSC se cultivaron como se describió anteriormente. Las células Saos-2 se cultivaron en medio 5A de McCoy (Lonza Walkersville Inc., USA) suplementado con FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%. Tanto las hMSC como las células Saos-2 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 104 células/ml después de 80-90% de confluencia. Después de ajustar el pH a 7,4, se añadieron volúmenes calculados de citrato en forma de ácido cítrico al medio de cultivo para obtener una concentración final de citrato de 20 pM, 200 pM, 400 pM, 800 pM, 1000 pM, 2000 pM, 10.000 pM, o 20.000 pM en el medio de crecimiento. Las hMSC y las células Saos-2 se incubaron con los medios suplementados con citrato a 37°C con 5% de CO². Los medios se cambiaron cada dos días. En puntos de tiempo predeterminados (1 día y 4 días después de la adición de citrato), se determinaron las proliferaciones de las hMSC y las células Saos-2 como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en las FIGS. 15 y 16. Como se indica en las FIGS. 15 y 16, se encontró que el citrato inhibe la proliferación de células Saos-2 a concentraciones por encima de 800 pM. Además, a concentraciones por encima de 2000 pM, la mayoría de las células Saos-2 murieron.

Se han descrito diversas realizaciones de la presente invención en cumplimiento de los diversos objetivos de la invención. Debe reconocerse que estas realizaciones son simplemente ilustrativas de los principios de la presente invención. Numerosas modificaciones y adaptaciones de los mismos resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

medio osteogénico (OGM) que comprendía el medio anterior basado en DMEM suplementado adicionalmente con dexametasona 10'7 M, p-glicerofosfato 10'2 M, y ácido ascórbico-2-fosfato 50 pM. Las células hMSC se sembraron a una densidad de 104 células/ml después de una confluencia del 80-90% en placas de 96 pocillos. Después de ajustar el pH a 7,4, se añadieron al medio de cultivo volúmenes calculados de citrato en forma de ácido cítrico para obtener una concentración final de citrato de 20 pM en el medio de crecimiento. Las hMSC se incubaron con los medios suplementados con citrato a 37°C con 5% de CO². Los medios se cambiaron cada dos días. En puntos de tiempo predeterminados (7 días, 14 días y 21 días después de la adición de citrato), los cultivos se tiñeron mediante tinción de Von Kossa, y después se examinaron con microscopio ópti

Los resultados se muestran en la FIG. 10. Como se ilustra en la FIG. 10, el suplemento de citrato exógeno pudo promover la formación de depósitos de calcio en cultivos de hMSC diferenciados.

EJEMPLO 7

Métodos para promover el crecimiento óseo

EJEMPLO 8

Métodos para promover el crecimiento óseo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo según un protocolo aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Médica del Sur (Guangzhou, CHINA). Los animales se dividieron aleatoriamente en 2 grupos, y se anestesiaron con ketamina (40 mg/kg IM) y xilazina (5-7 mg/kg IM) suplementada con isoflurano (inhalación al 1-2%). A continuación, se realizó una incisión medial de 1,5 cm en la rodilla lateral para exponer el cóndilo femoral lateral. Con un obturador de mosaicoplastia (Smith & Nephew, Memphis, TN, USA), se taladró un defecto óseo de 4 x 3 mm (diámetro x profundidad) en los cóndilos femorales laterales derecho e izquierdo para los grupos de CBPBHA-100 y CBPBHA-90, respectivamente. Los implantes formados a partir de los materiales compuestos CBPBHA-100 y CBPBHA-90, y que coincidían con las dimensiones del defecto, se insertaron según la agrupación mediante ajuste a presión. Después de todos los procedimientos quirúrgicos, los conejos se mantuvieron en jaulas y se mantuvieron con una dieta de laboratorio normal. Las rodillas se recogieron 6 semanas después de la implantación y se almacenaron en formalina amortiguada neutra al 10%. El examen macroscópico se documentó con una cámara digital. El análisis de tomografía computarizada se realizó utilizando un sistema de formación de imágenes mediante micro-CT (escáner ZKKS-MCT-Sharp-III, Caskaisheng, CHINA). El sistema de escaneo se configuró en 70 kV, 30 W, y 429 pA. El volumen de interés se definió como tejido óseo alrededor de los implantes, que incluía todo el compartimento trabecular que se extendía 8 mm desde el eje longitudinal del implante. La extensión de la osteointegración del implante se refleja generalmente en su medida de contacto hueso-implante (BIC). El BIC se calculó como un porcentaje de la longitud del hueso recién formado sobre el perímetro total del implante según las imágenes de micro-CT.

Para el análisis histológico, se cortaron tejidos descalcificados embebidos en parafina en secciones de 4 pm, que entonces se desparafinaron, hidrataron y tiñeron con hematoxilina-eosina (H&E). Para la tinción inmunohistoquímica, las secciones embebidas en parafina se desparafinaron e hidrataron a través de una serie graduada de alcohol. La actividad de peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 0,3% en PBS. Después, las secciones se bloquearon con seroalbúmina bovina (dilución 1:100), y se incubaron con el anticuerpo primario de CD68 y CD163 (Auragene, Changsha, China, dilución 1:50) a 4°C durante la noche. Las secciones se lavaron con PBS tres veces, y se incubaron con IgG secundaria anti-ratón durante 1 h a 37°C. La coloración se desarrolló en disolución DAB y se contratiñó con hematoxilina. La reacción inflamatoria que rodea al implante se evaluó por dos patólogos individuales de forma enmascarada y aleatorizada a partir de secciones teñidas con H&E y tinción con IHC. La fuente del grupo de control positivo se extrajo del tejido de curación del tendón de Aquiles de la rata 1 semana después de la tenotomía, que se ha caracterizado por una respuesta inflamatoria. Se realizó tinción con IHC para CD163 y CD68 para detectar macrófagos. Los macrófagos aparecieron de color marrón en las células con núcleos teñidos con hematoxilina.

EJEMPLO 9

Métodos para inhibir el crecimiento del cáncer

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para uso en la promoción del crecimiento óseo, que comprende una composición que presenta citrato, en la que la composición que presenta citrato es un polímero u oligómero a base de citrato con un resto de citrato, liberando dicho polímero u oligómero un citrato tras la degradación a una dosis de entre 20 pM y 2000 pM, basado en el volumen de la composición que presenta citrato.

2. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que la composición que presenta citrato promueve la diferenciación celular y/o la progresión fenotípica en la población de células óseas; y en la que la composición que presenta citrato se proporciona a las células óseas en una primera etapa del desarrollo celular seleccionada para obtener una primera diferenciación celular o progresión fenotípica.

3. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que se proporciona además una segunda composición que presenta citrato a las células óseas en una segunda etapa del desarrollo celular seleccionada para obtener una segunda diferenciación celular o progresión fenotípica.

4. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que la composición que presenta citrato promueve la progresión fenotípica del osteoblasto en la población de células óseas, o inhibe al menos parcialmente el crecimiento de células cancerosas presentes entre la población de células óseas.

5. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que las células óseas comprenden células madre.

6. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que la degradación comprende la hidrólisis de un enlace de éster del polímero u oligómero a base de citrato.

7. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que la composición que presenta citrato:

(a) comprende un polímero u oligómero que tiene:

(i) la estructura de la Fórmula (I):

en la que

Ri es -H, -0C(O)NH *AAA/' o *AAA/' ;

*AAA/' representa una cadena adicional de unidades repetidas que tienen la estructura de Fórmula (I); y m, n, p y q son independientemente números enteros que oscilan de 2 a 20; o

(ii) la estructura de Fórmula (II):

en la que

*AAA/' representa una cadena adicional de unidades repetidas que tienen la estructura de Fórmula (II); y m, n y p son independientemente números enteros que oscilan de 2 a 20; o

(b) comprende un primer polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I):

en la que

*nAA/' representa una cadena adicional de unidades repetidas que tienen la estructura de Fórmula (I); y m, n, p y q son independientemente números enteros que oscilan de 2 a 20; y

un segundo polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (II):

en la que

R2 es -H o t /v w ' ;

*A /W ' representa una cadena adicional de unidades repetidas que tienen la estructura de Fórmula (II); y m, n y p son independientemente números enteros que oscilan de 2 a 20, y

en la que el primer polímero u oligómero se mezcla con el segundo polímero u oligómero.

8. La composición para uso según la reivindicación 1, que comprende además una proteína morfogenética ósea.

9. La composición para uso según la reivindicación 1, que comprende:

un primer polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (I):

*AAA/' representa una cadena adicional de unidades repetidas que tienen la estructura de Fórmula (I); y

m, n, p y q son independientemente números enteros que oscilan de 2 a 20; y

un segundo polímero u oligómero que tiene la estructura de Fórmula (II):

en la que

R²es -H o j y w ;

j w */* representa una cadena adicional de unidades repetidas que tienen la estructura de Fórmula (II); y

m, n y p son independientemente números enteros que oscilan de 2 a 20, y

10. La composición para uso según la reivindicación 9, en la que la relación en peso del primer polímero u oligómero al segundo polímero u oligómero está entre 10:1 y 1:10.

11. La composición para uso según la reivindicación 9, en la que el primer polímero u oligómero y el segundo polímero u oligómero se reticulan entre sí para formar una red polimérica, y opcionalmente, que comprende además un material en partículas dispersado en la red polimérica, material en partículas que comprende uno o más de hidroxiapatita, fosfato tricálcico, fosfato cálcico bifásico, biovidrio, cerámica, polvo de magnesio, aleación de magnesio, y partículas de tejido óseo descelularizadas.

12. La composición para uso según la reivindicación 11, en la que la composición comprende hasta 65 por ciento en peso de hidroxiapatita, y opcionalmente, la hidroxiapatita está quelada por uno o más grupos funcionales colgantes de la red polimérica.

13. La composición para uso según la reivindicación 11, que comprende además tejido óseo adherido a la red polimérica, y opcionalmente, el tejido óseo rodea la red polimérica, y la red polimérica está integrada en el tejido óseo.

14. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en la que la promoción del crecimiento óseo comprende aumentar la expresión del gen osterix y/o la expresión del gen de la fosfatasa alcalina.