ES2847249T3 - Nanopartículas poliméricas de envoltura delgada y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Una nanopartícula polimérica para encapsular un agente bioactivo hidrofílico, comprendiendo la nanopartícula polimérica una envoltura polimérica impermeable al agua, y uno o más núcleos acuosos encerrados por la envoltura polimérica, conteniendo cada uno de los uno o más núcleos acuosos el agente bioactivo hidrofílico, en donde la envoltura polimérica está formada de un polímero que contiene un segmento no polar y un grupo terminal polar y tiene un grosor de 8-20 nm y la nanopartícula polimérica tiene un diámetro externo de 100-600 nm.

Description

DESCRIPCIÓN

Nanopartículas poliméricas de envoltura delgada y usos de las mismas

Antecedentes

Las nanopartículas poliméricas tienen amplias aplicaciones como soportes de agentes activos, es decir, cargas, en numerosos campos, tales como el suministro de fármacos. Sin embargo, la dificultad de crear nanopartículas con grandes interiores acuosos limitan significativamente sus aplicaciones que implican la encapsulación de cargas macromoleculares hidrofílicas.

Las nanopartículas poliméricas existentes son generalmente sólidas con poco o ningún espacio en el núcleo acuoso interno para la encapsulación de cargas hidrofílicas. Se han desarrollado varias nanopartículas poliméricas huecas que consisten en envolturas poliméricas, pero tienen diversos inconvenientes, p. ej., limitación de tamaño, grosor y resistencia de la envoltura no deseados y poca eficiencia de encapsulación de carga.

El documento de la técnica anterior US 2013/209566 se refiere a una nueva composición de nanopartículas y a métodos de producir un sistema de suministro de fármacos basado en nanopartículas. Más particularmente, la presente invención se refiere a un sistema de suministro de fármacos basado en nanopartículas a base de polímeros de poli(orto ésteres) que tiene una capacidad de liberación sostenida del fármaco para el tratamiento de enfermedades intraoculares.

Existe la necesidad de desarrollar un nuevo soporte para administrar agentes bioactivos sin los inconvenientes arriba descritos.

Sumario

La presente invención, según se define en la reivindicación 1, se refiere a nanopartículas poliméricas para encapsular agentes bioactivos hidrofílicos. Inesperadamente, las nanopartículas poliméricas de esta invención demuestran una alta eficacia de encapsulación para agentes bioactivos hidrofílicos con cargas elevadas.

Un aspecto de esta invención es una nanopartícula polimérica para encapsular un agente bioactivo. La nanopartícula polimérica incluye (i) una envoltura polimérica impermeable al agua y (ii) uno o más núcleos acuosos encerrados por la envoltura polimérica y que contienen el agente bioactivo. La envoltura polimérica tiene un grosor inferior de 8-20 nm y la nanopartícula polimérica tiene un diámetro externo de 100-600 nm.

En un ejemplo, la nanopartícula polimérica tiene un diámetro externo superior a 100 nm y el núcleo acuoso tiene un diámetro superior al 70% (p. ej., > 80%) del diámetro externo de la nanopartícula polimérica.

Generalmente, la nanopartícula polimérica tiene una resistencia osmótica de 840 mOsm/kg o mayor.

La nanopartícula polimérica de esta invención se puede utilizar para encapsular diversos agentes bioactivos hidrofílicos. Ejemplos de un agente bioactivo incluyen una molécula pequeña, un péptido, una proteína, un ácido nucleico (p. ej., ARNpi o di-GMP cíclico), un agente formador de imágenes, una nanopartícula inorgánica, una nanopartícula orgánica y una combinación de los mismos. El agente bioactivo puede tener una eficiencia de encapsulación superior al 20% (p. ej., > 30% y > 40%).

También dentro del alcance de esta invención está un método para tratar una enfermedad. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesite la nanopartícula polimérica reivindicada que encapsula un agente bioactivo para tratar la enfermedad.

Además, esta invención cubre el método de preparación de la nanopartícula polimérica, tal como se describe en la reivindicación 12. El método incluye las siguientes etapas: (i) disolver un polímero en un disolvente para formar una solución polimérica, (ii) emulsionar por dispersión la solución polimérica en una primera solución acuosa que contiene un agente bioactivo para formar una emulsión, (iii) emulsionar mediante dispersión fluídica la emulsión así formada en una segunda solución acuosa para obtener una nanopartícula polimérica, y (iv) recoger la nanopartícula polimérica así obtenida. Es importante que el polímero contenga un segmento no polar y un grupo terminal polar. Además, la dispersión fluídica se lleva a cabo de manera controlada utilizando un microfluidizador.

Típicamente, el disolvente utilizado en el método de preparación anterior es un disolvente no polar. Ejemplos del disolvente no polar incluyen, pero no se limitan a diclorometano, alcohol bencílico, acetato de etilo, cloroformo y una mezcla que contenga cualquier relación molar de los disolventes arriba mencionados.

Cada una de las primera y segunda soluciones acuosas puede ser una solución polar que contenga una molécula solubilizada para modular la acidez y viscosidad de la solución, es decir, un modulador. Ejemplos del modulador incluyen, pero no se limitan a fosfato de sodio, bicarbonato de sodio, Tris-HCl, sacarosa, dextrano y una combinación de los mismos.

Los detalles de la invención se exponen en la descripción siguiente. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de los siguientes dibujos y la descripción detallada de varias realizaciones, y también de las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una descripción de la eficacia de encapsulación de nanopartículas poliméricas para un ácido nucleico y una proteína.

La Fig. 2 es una descripción de la absorción celular y la reducción de la proteína verde fluorescente (GFP) con ARNpi-GFP.

La Fig. 3 es una descripción del efecto de nanopartículas poliméricas sobre la encapsulación y liberación controlada de agonistas del estimulador de genes de interferón (STING) para la estimulación inmunológica.

La Fig. 4 es una descripción de nanopartículas cargadas con agonistas de STING para potenciar las citoquinas linfáticas al tiempo que se minimizan las citoquinas sistémicas.

La Fig. 5 es una descripción de la preparación de una vacuna de nanopartículas mediante acoplamiento antígeno/nanopartícula.

La Fig. 6 es una descripción de la evaluación de la vacuna de nanopartículas así preparada.

La Fig. 7 es una descripción de la evaluación del efecto de la vacuna de nanopartículas sobre la respuesta inmune celular.

La Fig. 8 es una representación de nanopartículas poliméricas de envoltura delgada que contienen múltiples núcleos acuosos cargados con agentes bioactivos.

Descripción detallada

En esta memoria se describe en detalle una nanopartícula polimérica para encapsular un agente bioactivo hidrofílico, p. ej., un agente terapéutico o vacuna.

La nanotecnología medicinal y de vacunas ha tenido un impacto significativo en el desarrollo de nuevas terapias y formulaciones de vacunas. En el desarrollo farmacéutico, los nanosoportes permiten el suministro preciso de fármacos que mejoran el índice terapéutico de los fármacos, reducen los efectos secundarios y fomentan la sinergia de múltiples fármacos. En el desarrollo de vacunas, las nanopartículas pueden reforzar la potencia de dianas antigénicas mejorando su transporte linfático, permitiendo la presentación de antígenos multivalentes y facilitando la asociación antígeno/adyuvante. A pesar de la extensa investigación sobre nanopartículas, sigue existiendo un desafío importante en la encapsulación de cargas hidrofílicas y macromoleculares. Esta invención se refiere a una nanopartícula polimérica capaz de encapsular un agente bioactivo, p. ej., una carga hidrofílica y macromolecular. La nanopartícula reivindicada contiene una envoltura polimérica delgada y uno o más núcleos acuosos encerrados por la envoltura polimérica.

La envoltura polimérica está formada por un polímero anfifílico que contiene un segmento no polar y un grupo terminal polar. Ejemplos del segmento no polar incluyen, pero no se limitan a, poli(ácido láctico), poli(ácido lácticoco-glicólico) (PLGA), policaprolactona y poliuretano. El PLGA puede tener cualquier relación molar de ácido láctico a ácido glicólico (p. ej., PLGA 50:50 o 75:25). El grupo terminal polar puede ser un grupo cargado negativamente, un grupo cargado positivamente, un grupo bipolar o un grupo neutro.

Ejemplos del grupo cargado negativamente incluyen un ácido carboxílico, un ácido succínico y un ácido sulfónico. Ejemplos del grupo cargado positivamente incluyen una amina y una amidina. Ejemplos del grupo de iones híbridos incluyen una carboxibetaína y una sulfobetaína. Un ejemplo de grupo neutro es un sacárido.

Una envoltura polimérica ilustrativa está formada por un polímero que contiene poli(ácido láctico-co-glicólico) como segmento no polar y un ácido carboxílico como grupo terminal polar.

La nanopartícula polimérica descrita en esta memoria puede ser una plataforma de nanopartículas huecas poliméricas con una cubierta polimérica libre de defectos que tiene un espesor de 8-20 nm. La nanopartícula polimérica hueca tiene típicamente un diámetro externo entre 100 y 600 nm.

Minimizando el grosor de la envoltura, la nanopartícula polimérica se puede formar con un gran espacio interior acuoso capaz de maximizar el cargamento de la carga. Para partículas de más de 100 nm de diámetro externo, el espacio acuoso interno puede poseer un diámetro de al menos el 80% del diámetro externo de la partícula o puede ser de múltiples compartimientos con un gran volumen colectivo. La encapsulación de alta eficiencia de colorantes hidrofílicos y ácidos nucleicos se demuestra con las nanopartículas huecas de envoltura delgada en ausencia de moléculas de unión complementarias. Se ha demostrado que las nanopartículas de envoltura delgada son resistentes al estrés osmótico, una característica atribuible para completar la envoltura polimérica, libre de defectos, que es impermeable al agua. La nanopartícula polimérica de esta invención puede utilizarse para suministrar agentes bioactivos en diversos campos, incluido el suministro de fármacos y el desarrollo de vacunas.

Nanopartículas poliméricas, en particular las que consisten en polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), han recibido una atención considerable en la investigación de la nanomedicina debido a las numerosas características del polímero que incluyen biocompatibilidad, biodegradabilidad y flexibilidad sintética. Sin embargo, debido a la hidrofobicidad inherente del polímero, las nanopartículas basadas en PLGA se han limitado al suministro de compuestos insolubles en agua en la clínica. La encapsulación de cargas hidrofílicas y macromoleculares en nanopartículas poliméricas sigue siendo un desafío, ya que los polímeros tienden a formar nanoesferas sólidas con poco o ningún espacio de núcleo acuoso para transportar cargas hidrofílicas y macromoleculares, p. ej., ARNpi.

Dado que la encapsulación macromolecular es común en nanopartículas naturales en forma de virus, se puede imaginar que un nanosoporte ideal debería poseer una envoltura delgada que encierra un gran volumen acuoso para el empaquetamiento de moléculas bioactivas. La carcasa delgada también está preferiblemente libre de defectos y es impermeable al agua para permitir una encapsulación fiable de la carga.

También está cubierto por esta invención un método de uso de la nanopartícula polimérica arriba descrita para tratar una afección médica. Ejemplos de afecciones médicas incluyen, pero no se limitan a enfermedad cardiovascular, cáncer, enfermedad autoinmune o infección.

Se describe además en detalle en esta memoria un método para preparar la nanopartícula polimérica arriba descrita. La nanopartícula hueca de envoltura delgada se prepara en base a un proceso de emulsión doble utilizando polímeros anfifílicos con alto contraste de polaridad en su extremo. Más específicamente, en primer lugar se utiliza una solución de PLGA terminado en carboxilo en diclorometano (DCM) para emulsionar una fase acuosa que contiene una carga bajo dispersión sónica para formar una emulsión. La emulsión, así formada, se emulsiona a continuación en una fase acuosa externa utilizando dispersión fluídica.

Ajustando la concentración del polímero y la fuerza de dispersión o utilizando polímeros con longitud definida y polaridad aguda en el proceso de doble emulsión, el método de preparación arriba descrito puede proporcionar nanopartículas poliméricas huecas con diámetros externos entre 100 -600 nm.

Las nanopartículas se preparan en base a un proceso de doble emulsión agua-aceite-agua, en el que polímeros disueltos en un sistema disolvente se utilizan primero para emulsionar una fase acuosa. A continuación, la emulsión se emulsiona mediante una fase acuosa secundaria. Las fases acuosas interna y externa pueden ser de cualquier solución polar, p. ej., agua, ácido acético y etanol. La fase acuosa contiene moléculas solubilizadas para modular la acidez y viscosidad de la solución, que incluyen fosfato de sodio y bicarbonato de sodio. En una realización, se utiliza agua como anti-disolvente para la preparación de nanopartículas.

El método de doble emulsión agua-aceite-agua arriba descrito para preparar la nanopartícula polimérica de esta invención tiene dos características clave; a saber, (i) la emulsión entre diferentes fases se logra a través de polímeros con un alto contraste inherente en la polaridad (PLGA con un grupo carboxilo-terminal) en lugar de utilizar un tensioactivo, p. ej., vitamina E-D-a-tocoferol, succinato de polietilenglicol y poli(alcohol vinílico), que potencia la capacidad emulsionante para minimizar el espesor de la envoltura del polímero y tiene un valor comercial más alto sin utilizar materiales tensioactivos; y (ii) dispersión fluídica controlada utilizando un microfluidizador o tratamiento con ultrasonidos para el segundo proceso de emulsión para equilibrar la homogeneización de la fase oleosa y la retención de la carga encapsulada en la fase acuosa interna.

La nanopartícula polimérica preparada mediante el método arriba descrito sirve como una tecnología de plataforma para aplicaciones de suministro de fármacos, teranóstica y de desarrollo de vacunas. Puede facilitar el suministro de una gran clase de agentes bioactivos, incluidas moléculas pequeñas, péptidos, ácidos nucleicos y proteínas, para potenciar su potencia terapéutica. Las nanopartículas huecas poliméricas de envoltura delgada se pueden utilizar para encapsular agentes bioactivos, que incluyen, pero no se limitan a moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, agentes de formación de imágenes, nanopartículas inorgánicas, nanopartículas orgánicas y cualquier combinación de los anteriores. La superficie de la plataforma se puede decorar opcionalmente con restos funcionales, que incluyen moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, agentes de formación de imágenes, nanopartículas, para diferentes aplicaciones tales como el suministro de fármacos de larga circulación, el suministro de fármacos fijados como objetivo y el suministro de antígenos.

Preparación de nanopartículas poliméricas

Las nanopartículas poliméricas de envoltura delgada se produjeron de acuerdo con un protocolo que incluye las siguientes etapas:

1. preparación de 10 mg/mL de polímeros de PLGA terminados en carboxi en DCM.

2. emulsionar 50 uL de fase acuosa interna que contiene agentes bioactivos en 500 uL de solución de PLGA/DCM para formar una primera emulsión. Sondear con ultrasonidos continuamente al 50% de amplitud de tratamiento con ultrasonidos durante 30 segundos.

3. emulsionar la primera emulsión en 5 mL de solución acuosa y dispersar la mezcla bajo cizallamiento fluídico controlado utilizando un microfluidizador para formar una segunda emulsión.

4. añadir 30 mL adicionales de solución acuosa a la segunda emulsión y evaporar el disolvente a 35°C.

5. evaporar el DCM en una campana extractora de humos durante 3 horas para obtener una solución.

6. aislar las partículas de la solución mediante una ultracentrífuga a 22 kG durante 35 min.

7. redispersar las partículas en una solución deseada.

Caracterización y encapsulación de nanopartículas poliméricas

Empleando las etapas arriba descritas, se prepararon nanopartículas poliméricas huecas con un diámetro medio de 110,9 nm. El promedio estadístico del espesor de la envoltura de las partículas se derivó sobre la base de los parámetros obtenidos mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas. Con base en el peso total del polímero, la densidad de PLGA y el número de nanopartículas resultantes, se calculó que las nanopartículas tienen un promedio estadístico de 16,5 nm de espesor de capa. Inesperadamente, determinadas nanopartículas poliméricas tenían diámetros inferiores a 40 nm.

Se encontró que las nanopartículas huecas de envoltura delgada eran osmóticamente resistentes como resultado de las envolturas poliméricas impermeables al agua. En un ensayo, se suspendieron nanopartículas huecas de 100 nm que encapsulaban un colorante alimentario rojo hidrofílico en soluciones que variaban desde agua hasta 3X PBS, la diferencia de osmolalidad (entre 0 y 850 Osmo/kg) no hizo que las nanopartículas huecas liberaran sus cargas. Después de 10 min de incubación en sus respectivas soluciones, las nanopartículas se sedimentaron bajo centrifugación a 30.000 g durante 5 min, y los sedimentos resultantes mostraron un color rojizo similar que indicaba la retención de colorante hidrofílico en las partículas. La detección del sobrenadante del tinte liberado basada en un método de absorbancia no mostró señales detectables. El estudio demuestra que a pesar de tener una envoltura polimérica delgada por debajo de 20 nm, las nanopartículas huecas tenían envolturas libres de defectos que las hacía resistentes al estrés osmótico.

Para demostrar aún más que la envoltura de las nanopartículas huecas de envoltura delgada era sólida en lugar de fluida, las nanopartículas huecas se sometieron a estrés mecánico para romper la envoltura. En una visualización crio-EM, se observó una nanopartícula hueca rota. La imagen observada de las nanopartículas huecas rotas era indicativa de una esfera hueca con una envoltura sólida, en contraste con las vesículas poliméricas que experimentan una reorganización vesicular tras la perturbación mecánica. La envoltura polimérica sólida condujo a la impermeabilidad al agua y la resistencia osmótica que no se observaron en nanoestructuras huecas conocidas. Una característica distintiva de la plataforma de nanopartículas poliméricas de envoltura delgada es su capacidad para encapsular una gran cantidad de cargas hidrofílicas con su gran espacio interior acuoso. Las nanopartículas huecas de envoltura delgada se sometieron a encapsular varios agentes bioactivos, incluido el ARNpi y un adyuvante inmunológico cíclico di-GMP. Inesperadamente, se logró una alta eficiencia de encapsulación para contenidos hidrofílicos de diversas escalas de longitud, incluidas moléculas pequeñas (p. ej., sulfo-cy5, di-GMP cíclico y cGAMP cíclico), péptidos (p. ej., péptido de ovoalbúmina OTI (SIINFEKL) u OTII (AAHAEINEA)), ácidos nucleicos (p. ej., oligodesoxinucleótidos CpG, ADN de cadena sencilla de 20 meros y ARNpi de 20 meros) y proteínas (p. ej., albúmina de suero bovino (BSA) y nucleasa CRISPR-Cas9), que se encapsularon con éxito con una eficiencia superior al 30% dentro de los límites de solubilidad de los compuestos. Por ejemplo, se encapsuló ARNpi con una eficacia del 50% con un rendimiento de carga final de aproximadamente 1 nmol por mg de nanopartículas y se encapsuló di-GMP cíclico con una eficacia de carga del 37%. Se observó el silenciamiento de un gen de proteína verde fluorescente (GFP) en células HeLa que expresan GFP utilizando nanopartículas huecas de envoltura delgada cargadas de ARNpi.

EJEMPLO 1: Encapsulación de nanopartículas poliméricas con macromoléculas hidrofílicas

Se realizó un ensayo para evaluar la eficacia de encapsulación de nanopartículas poliméricas para dos macromoléculas hidrofílicas, es decir, un ácido nucleico (ADN de cadena sencilla de 20 meros marcado con colorante) y una proteína (BSA marcada con colorante).

La Fig. 1, A-D, es una descripción de la eficiencia de encapsulación de nanopartículas poliméricas para un ácido nucleico y una proteína.

A: Observación de nanopartículas vacías (izquierda), nanopartículas cargadas con ADN marcado con colorante (centro) y nanopartículas cargadas con albúmina de suero bovino marcado con colorante (derecha) después de la granulación por ultracentrifugación. Los gránulos de colores distintivos indican una encapsulación exitosa de las proteínas de ADN y BSA.

B: Nanopartículas vacías visualizadas por cryoEM.

C: Nanopartículas cargadas de ADN visualizadas por cryoEM.

D: Nanopartículas cargadas de proteína BSA visualizadas por cryoEM. Se pudo observar una carga efectiva de ADN y proteínas a través de las texturas altamente granuladas dentro de las nanopartículas.

En este estudio, se demostró la encapsulación eficaz de un ácido nucleico y una proteína utilizando ADN de cadena sencilla de 20 meros marcado con colorante (Fig. 1A; centro) y BSA marcado con colorante (Fig. 1A; derecha). Tras la sedimentación de las nanopartículas, se encontró que los sedimentos de las partículas eran de color amarillo (indicativo de la etiqueta de colorante FAM amarillento) en oposición al sedimento blanco de las nanopartículas vacías (Fig. 1A; izquierda). La cuantificación por fluorescencia indica que las nanopartículas exhibieron inesperadamente eficiencias de encapsulación del 42% y 35% para el ácido nucleico y la proteína, respectivamente. También se visualizó la encapsulación eficaz del ácido nucleico y la proteína utilizando cryoEM. Si bien las partículas vacías mostraron una textura lisa y uniforme en su núcleo acuoso (Fig. 1B), las partículas cargadas con ADN (Fig. 1C) y las partículas cargadas con BSA (Fig. 1D) mostraron texturas muy granulosas que son características de los contenidos biológicos concentrados bajo cryoEM. Basándose en la concentración de la carga de ADN 8 mM y 50 mg/mL de BSA para las presentes realizaciones, la nanopartícula cargada con ADN contenía aproximadamente 3500 moléculas de ADN y la nanopartícula cargada con BSA contiene aproximadamente 260 proteínas. Es importante destacar que no se ha logrado previamente una carga tan alta de un ácido nucleico y una proteína. De hecho, nanoformulaciones basadas en PLGA conocidas mostraron consistentemente una encapsulación de ácidos nucleicos muy pobre, y se tuvieron que emplear polímeros policatiónicos para neutralizar las cargas negativas en los ácidos nucleicos para potenciar la carga. Por ejemplo, véase Shi et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2011, 50(31): 7027-31; y Woodrow et al., Nature Materials, 2009, 8(6): 526-533.

Estos resultados arriba descritos indican que las nanopartículas poliméricas de envoltura delgada de esta invención exhibieron inesperadamente una alta eficiencia de encapsulación, es decir, una alta eficiencia de carga, para macromoléculas hidrofílicas en su estado soluble nativo, destacando la ventaja y singularidad de las nanopartículas huecas de envoltura delgada.

EJEMPLO 2: Efecto de nanopartículas poliméricas sobre el suministro de ARNpi a las células para la interferencia de ARN

Se realizó un ensayo para evaluar el efecto de las nanopartículas poliméricas sobre el suministro de ARNpi a células para la interferencia del ARN.

La Fig. 2, A-C, es una descripción de la absorción celular y la reducción de GFP con ARNpi-GFP.

A: Captación de células Hela sulfo-Cy5 NP durante 24 h y núcleo teñido con DAPI. Las imágenes fueron tomadas por microscopio confocal.

B: señal de GFP en diferentes células tratadas. Se trataron células Hela-GFP con ARNpi-GFP-NP (100, 300 y 1000 ug/ml de PLGA) durante 24 h. Células transfectadas con lipofectamina RNAiMax y células incubadas con NP vacía sirvieron como controles.

C: Respuesta a la dosis de ARNpi-GFP-NP a las 24 h de tratamiento. El ARN se extrajo y se sometió a transcripción inversa a ADNc. El nivel de ARNm de GFP se midió mediante qRT-PCR y se normalizó a gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

En este estudio, se demostró que la plataforma de nanopartículas suministra con éxito ARNpi a las células para la interferencia del ARN. El experimento de captación celular se realizó por primera vez utilizando nanopartículas de PLGA cargadas con sulfo-Cy5 para rastrear la internalización de nanopartículas en las células. Células Hela se trataron con sulfo-Cy5 NP durante 24 h, el núcleo se tiñó con DAPI y la imagen se tomó mediante microscopio confocal. Después de 24 h de incubación, las células absorbieron NP de sulfo-Cy5 y se acumularon en el citoplasma (Fig. 2A). A continuación, se probó en células Hela-GFP si la nanopartícula cargada con ARNpi podría atenuar específicamente la expresión del gen diana. Se encapsuló ARNpi contra la secuencia de GFP en nanopartículas poliméricas de envoltura delgada y se mezcló con células durante 24 h y 72 h. Las células transfectadas con ARNpi por lipofectamina RNAiMax sirvieron como control positivo. En el momento indicado, se obtuvieron imágenes de las células mediante microscopio de fluorescencia (Fig. 2B) y luego se extrajo el ARN total con el reactivo Trizol. El ARN se sometió a transcripción inversa a ADNc y el silenciamiento de GFP se determinó mediante qRT-PCR y se normalizó a GAPDH. El nivel de ARNm de GFP se redujo al 5% después de 24 h con transfección de lipofectamina. Células tratadas con 100, 300 y 1000 ug/ml de nanopartículas mostraron una reducción dependiente de la dosis del nivel de ARNm de GFP a 70%, 30% y 4%, respectivamente (Fig. 2C). La alta concentración de nanopartículas mostró una eficiencia de atenuación similar a la del bien conocido producto comercial lipofectamina. Es importante destacar que no se observaron fenómenos de citotoxicidad en las células tratadas con ARNpi-GFP-NP incluso a la concentración más alta de 1000 ug/ml de cantidad de PLGA, lo que indica la seguridad superior de la plataforma. Estos resultados indican que las nanopartículas poliméricas exhibieron una alta eficiencia en la entrega de ARNpi a las células para la interferencia de ARN.

EJEMPLO 3: Efecto de nanopartículas poliméricas sobre la encapsulación y liberación controlada de estimulador de agonistas del estimulador de genes de interferón (STING) para la estimulación inmunológica en los ganglios linfáticos

Se realizó un ensayo para evaluar el efecto de las nanopartículas poliméricas sobre la encapsulación y liberación controlada de agonistas del STING para la estimulación inmune en los ganglios linfáticos.

La Fig. 3, A-E, es una descripción del efecto de las nanopartículas poliméricas sobre la encapsulación y la liberación controlada de agonistas del STING para la estimulación inmunológica.

A: Preparación de nanopartículas huecas de envoltura delgada cargadas con adyuvante.

B: Tamaño de nanopartículas medido mediante análisis de seguimiento de nanopartículas.

C: Encapsulación de di-GMP cíclico verificado por HPLC en gradiente.

D: Visualización CryoEM de nanopartículas huecas de envoltura delgada

E: El estudio de la liberación de carga reveló un perfil de liberación activada sensible al pH para las nanopartículas.

En este estudio, la presente plataforma se aplicó para el desarrollo de vacunas. Un desafío técnico importante en la preparación de vacunas de nanopartículas consiste en asociar de manera fiable antígenos y adyuvantes en un sustrato a nanoescala. Por ejemplo, véase Brannon-Peppas et al., Adv Drug Deliv Rev, 2004, 56(11): 1649-59; y Lima-Tenorio et al., Int J Pharm, 2015, 493(1-2): 313-27. Para superar este desafío técnico, se utilizaron nanopartículas huecas poliméricas de capa delgada para empaquetar una alta densidad de cargas funcionales utilizando un polímero biodegradable, es decir, PLGA.

Más específicamente, se prepararon partículas huecas de entre 100 y 200 nm de diámetro utilizando un proceso de emulsión doble (Figs. 3A y 3B). Estas partículas encapsularon eficientemente un adyuvante agonista del STING, di-GMP cíclico (cd-GMP), con una eficiencia de aproximadamente el 40% (Fig. 3C), que es notable, porque los ácidos nucleicos y las cargas hidrofílicas son notoriamente difíciles de encapsular en plataformas de nanopartículas. La alta eficiencia de encapsulación produjo aproximadamente 2.000 moléculas agonistas del STING por nanopartícula. No se ha informado de nanoformulaciones de agonistas del STING basadas en nanopartículas poliméricas. El examen por cryoEM reveló grandes núcleos interiores en estas nanopartículas huecas, que eran los responsables de la alta eficiencia de carga de cd-GMP (Fig. 3D). Tras el suministro intracelular, la envoltura polimérica delgada de las nanopartículas huecas fue activada mediante pH ácido para liberar rápidamente el contenido del interior (Fig. 3E). Estos resultados indican que las nanopartículas poliméricas de envoltura delgada permitieron la preparación eficaz de vacunas sintéticas.

EJEMPLO 4: Evaluación de nanopartículas cargadas con agonistas del STING para potenciar las citoquinas linfáticas al tiempo que se minimizan las citoquinas sistémicas

Se realizó un ensayo para evaluar nanopartículas cargadas con agonistas del STING para mejorar las citoquinas linfáticas al tiempo que se minimizan las citoquinas sistémicas.

La Fig. 4, A-F, es una descripción de nanopartículas cargadas con agonistas del STING que potencian las citoquinas linfáticas al tiempo que se minimizan las citoquinas sistémicas.

A: Inducción de TNF-a en una línea de células dendríticas de ratón después de la incubación con nanopartículas de cd-GMP y cd-GMP libre.

B: Inducción de IL-6 en la misma línea de células dendríticas de ratón.

C: inducción de IFN-p en la línea de células dendríticas de ratón.

D: Activación de JAWSII tras la incubación con dosis equivalentes de cd-GMP en forma de molécula libre y en formulación de nanopartículas.

E: Cuantificación de I FN-p en los ganglios linfáticos 48 horas después de la inyección en la almohadilla de la pata de cd-GMP libre o nanopartículas de cd-GMP.

F: Nivel de TNF-a sistémico después de la inyección en la almohadilla de la pata de cd-GMP libre y nanopartículas de cd-GMP.

La activación inmunitaria por las nanopartículas cargadas con cd-GMP se examinó por primera vez in vitro utilizando una línea de células dendríticas de ratón, JAWSII. Después de 24 horas de incubación con nanopartículas de cd-GMP libre o cd-GMP, se recogieron los sobrenadantes del cultivo para el análisis ELISA para cuantificar los niveles de TNF-a, IL-6 e IFN-p. En comparación con la formulación de cd-GMP libre, la formulación de nanopartículas desencadenó de manera más eficaz la producción de TNF-a, IL-6 e I FN-p (Figuras 4A, 4B y 4C). La expresión de CD80 en las células también se potenció cuando se incubó con la formulación de nanopartículas en comparación con una dosis equivalente de cd-GMP libre (Fig. 4D). Se observó que las nanopartículas mejoraron la capacidad adyuvante del agonista del STING en aproximadamente 30 veces, atribuible al suministro intracelular incrementado por el nanosoporte. Se puede inferir que el di-nucleótido cíclico libre no es fácilmente permeable a la membrana y puede que no acceda fácilmente a su diana citosólica. Tras la encapsulación de nanopartículas, la absorción celular se potencia a través de la endocitosis de partículas y la posterior liberación intracelular facilita la entrada citosólica de cd-GMP, mejorando con ello su efecto inmuno potenciador.

La potenciación inmunitaria de las nanopartículas de cd-GMP se comparó, además, con el cd-GMP libre in vivo en ratones. 48 horas después de las inyecciones en la almohadilla de la pata, se recogieron los ganglios linfáticos poplíteos de drenaje para la cuantificación de I FN-p. Se observó que la formulación de nanopartículas inducía un nivel significativamente más alto de I FN-p en el ganglio linfático (Fig. 4E), que es importante para la maduración adecuada de las células T. Además, el nivel sistémico de TNF-a, un indicador de la reactogenicidad, también se controló después de la administración en la almohadilla de las patas de nanopartículas de cd-GMP libre y cd-GMP. Se observó que las nanopartículas dieron como resultado un nivel sérico significativamente menor de TNF-a, lo que refleja la distribución de las nanopartículas en el sistema linfático. El cd-GMP libre, por otro lado, inducía un nivel elevado de TNF-a en el suero y estas pequeñas moléculas podían difundirse libremente en el torrente sanguíneo (Fig. 4F).

Estos resultados indican que las nanopartículas cargadas con agonistas del STING potenciaron eficazmente las citoquinas linfáticas para la potenciación inmunitaria que fija como objetivo a los ganglios linfáticos.

EJEMPLO 5: Preparación y evaluación de una vacuna de nanopartículas

Se realizó un ensayo para preparar una vacuna de nanopartículas mediante acoplamiento antígeno/nanopartícula y para evaluar la vacuna de nanopartículas así preparada.

La Fig. 5, A-F, es una descripción de la preparación de una vacuna de nanopartículas mediante acoplamiento de antígeno/nanopartícula.

A: Preparación de una vacuna de nanopartículas miméticas de virus mediante enlace espontáneo entre nanopartículas funcionalizadas y antígenos.

B: Cuantificación del contenido de antígeno mediante ensayo BCA.

C: Tamaño de nanopartículas antes y después de la conjugación del antígeno medido por dispersión dinámica de la luz.

D: Cuantificación de cd-GMP encapsulado en nanopartículas antes y después de la conjugación de proteínas.

E: Visualización Cryo-EM de nanopartículas después de la conjugación de antígenos.

F: La tinción con Immunogold contra el antígeno viral verifica la conjugación exitosa del antígeno en las nanopartículas.

Utilizando nanopartículas poliméricas de envoltura delgada cargadas con cdGMP, se preparó una vacuna de nanopartículas para el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) con el dominio de unión al receptor (RBD) de proteínas enriquecidas con MERS-CoV. El RBD se expresó en células de insecto Sf21 adaptadas, libres de suero, y se confirmó mediante transferencia Western utilizando anticuerpo policlonal RBD anti-MERS-CoV y anticuerpo anti-His. Puede obtenerse un producto puro de la proteína RBD de 35 kDa después de la purificación mediante una columna Histrap en una cromatografía líquida de la proteína rápida. Para permitir el acoplamiento antígeno/nanopartícula, primero se prepararon nanopartículas cargadas con cd-GMP con enlazadores de superficie terminados en maleimida, que formaron enlaces covalentes de forma espontánea con grupos tiol disponibles (Fig. 5A). Las proteínas RBD purificadas se trataron luego con un agente reductor suave (tris(2-carboxietil)fosfina), que reduce los enlaces disulfuro en tioles libres. A continuación, las proteínas RBD reducidas se mezclaron con las nanopartículas funcionalizadas con maleimida durante 4 horas con una mezcladura suave. Las nanopartículas conjugadas con RBD se aislaron a partir de proteínas libres mediante centrifugación a 30.000 x g. Tras la recogida de nanopartículas, el ensayo BCA reveló que las nanopartículas resultantes contenían aproximadamente el 20% de la entrada de antígeno, lo que corresponde a aproximadamente 20 antígenos proteicos por partícula (Fig. 5B). La dispersión dinámica de la luz demostró que las nanopartículas aumentaron de diámetro de 150 nm a 179 nm después de la conjugación de proteínas (Fig. 5C), lo que indica un acoplamiento antígeno/partícula exitoso que aumentó el tamaño hidrodinámico general de la partícula.

La Fig. 6, A-C, es una descripción de la evaluación de la vacuna de nanopartículas arriba descrita.

A: Programa de vacunación para la evaluación de la vacuna.

B: cuantificación del título de IgG anti-RBD total el día 35, 2 semanas después de la vacunación de refuerzo.

C: Cuantificación de títulos de IgG1 e IgG2a anti-RBD el día 35.

Se evaluaron las respuestas de anticuerpos IgG específicos para antígenos y se compararon con otras nanopartículas de vacuna, incluido el antígeno libre mezclado con cd-GMP libre y el antígeno libre mezclado con MF59. Los ratones se inocularon con las diferentes nanopartículas de vacuna arriba descritas el día 0 y el día 21, y se recogieron los sueros de todos los ratones inmunizados para el análisis ELISA el día 35 (Fig. 6A). Inesperadamente, las nanopartículas sintéticas indujeron niveles significativamente más altos de títulos de anticuerpos entre todos los grupos (Fig. 6B). Es de destacar que el nivel de IgG2a, un indicador de la respuesta inmune Th1, también aumentó después de la inoculación de nanopartículas (Fig. 6C).

Los resultados demuestran que la plataforma de nanopartículas permitió la preparación de una vacuna de nanopartículas que exhibió ventajas superiores en el aumento de las respuestas humorales.

EJEMPLO 6: Evaluación de nanopartículas que co-encapsulan el antígeno CD8 y el agonista del STING para inducir la respuesta de las células T CD8

Se realizó un ensayo para evaluar el efecto de nanopartículas poliméricas que co-encapsulan el antígeno CD8 (SIINFEKL) y el agonista del STING sobre la promoción de la respuesta de las células T CD8 específicas para el antígeno.

La Fig. 7, A-C, es una descripción del efecto de nanopartículas poliméricas que co-encapsulan el péptido SIINFEKL y el agonista del STING sobre el fomento de la respuesta de las células T CD8 específicas para SIINFEKL.

A: Nanopartículas co-encapsulantes de péptidos SINNFEKL y agonista del STING (cd-GMP).

B: Frecuencia de células T CD8 específicas para SIINFEKL 7 días después de la inmunización con nanopartículas.

C: Cuantificación de células T CD8+ polifuncionales (IFNg TNF+) tras la inmunización con nanopartículas que contienen diferentes dosis de cd-GMP.

Para evaluar la inmunidad celular específica para el antígeno inducida por las nanopartículas poliméricas, se inmunizaron 3 ratones C57BL/6 por vía subcutánea con nanopartículas que contienen el péptido SIINFEKL restringido a OVA257-264 H2-Kb (8 gg por ratón) y diferentes cantidades de cd-GMP (0,4, 2 o 10 gg por ratón) (Fig. 7A). Los ratones fueron sacrificados 7 días después de la inmunización y se recogieron los bazos para analizar las respuestas de las células T CD8+ mediante tinción con citoquinas intracelulares. Se observó que las nanopartículas inducían la producción de citoquinas de células T CD8+ específicas para el antígeno de una manera dependiente de la dosis de cd-GMP (Fig. 7B). Además, los ratones que recibieron mayores cantidades de cd-GMP mostraron más respuestas de células T CD8+ polifuncionales (Fig. 7C).

Estos resultados indican que las nanopartículas poliméricas de esta invención ejercieron una alta eficacia para fomentar la inmunidad de células T específicas para el antígeno. También demuestran que la encapsulación de la carga podría modularse combinando péptidos y ácidos nucleicos en cantidades variables en las nanopartículas. EJEMPLO 7: Preparación de nanopartículas poliméricas de envoltura delgada con múltiples núcleos acuosos cargados con agentes bioactivos.

Se realizó un ensayo para preparar nanopartículas poliméricas de envoltura delgada con múltiples núcleos acuosos cargados con un ADN de cadena sencilla de 20 meros.

La Fig. 8 es una representación de las nanopartículas poliméricas de envoltura delgada con múltiples núcleos acuosos encerrados por una envoltura delgada polimérica. Cada uno de los núcleos se cargó con ADN que mostraba una textura granulada densa.

Se encontró que el número de núcleos acuosos dentro de las nanopartículas poliméricas de envoltura delgada se podía modular controlando el grado de dispersión durante la formación de la primera y segunda emulsiones arriba descritas. Para preparar nanopartículas que contienen múltiples núcleos acuosos, se redujo la presión del fluido en el microfluidizador (138 bares) (2000 psi) para producir emulsiones de agua/aceite/agua más grandes con múltiples fases acuosas por gotita de emulsión única. Después de la evaporación del disolvente, la visualización por cryoEM mostró nanopartículas poliméricas de envoltura delgada que contenían múltiples núcleos acuosos (Fig. 8). Cada uno de los núcleos acuosos estaba encerrado por una envoltura delgada polimérica de menos de 20 nm de espesor. La imagen por cryoEM de las nanopartículas poliméricas encapsuladas con ADN reveló una textura granulosa densa en cada uno de los núcleos acuosos, lo que indica una encapsulación exitosa de la carga (Fig. 8).

Este resultado demuestra que las nanopartículas poliméricas de esta invención tenían múltiples núcleos acuosos, cada uno de los cuales encapsulaba un agente bioactivo.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una nanopartícula polimérica para encapsular un agente bioactivo hidrofílico, comprendiendo la nanopartícula polimérica

una envoltura polimérica impermeable al agua, y

uno o más núcleos acuosos encerrados por la envoltura polimérica, conteniendo cada uno de los uno o más núcleos acuosos el agente bioactivo hidrofílico,

en donde la envoltura polimérica está formada de un polímero que contiene un segmento no polar y un grupo terminal polar y tiene un grosor de 8-20 nm y la nanopartícula polimérica tiene un diámetro externo de 100-600 nm.

2. La nanopartícula polimérica de la reivindicación 1, en donde el núcleo acuoso tiene un diámetro superior al 70% del diámetro externo de la nanopartícula polimérica.

3. La nanopartícula polimérica de la reivindicación 2, en donde el núcleo acuoso tiene un diámetro superior al 80% del diámetro externo de la nanopartícula polimérica.

4. La nanopartícula polimérica de la reivindicación 1, en donde el segmento no polar es poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), policaprolactona o poliuretano.

5. La nanopartícula polimérica de la reivindicación 1, en donde el grupo terminal polar es i) un grupo cargado negativamente, que es un ácido carboxílico, un ácido succínico o un ácido sulfónico, ii) un grupo cargado positivamente que es una amina o una amidina, iii) un grupo de iones híbridos que es una carboxibetaína o una sulfobetaína o iv) un grupo neutro que es un sacárido.

6. La nanopartícula polimérica de la reivindicación 1, en donde el segmento no polar es poli(ácido láctico-coglicólico) y el grupo terminal polar es un ácido carboxílico.

7. La nanopartícula polimérica de la reivindicación 1, en donde la nanopartícula polimérica tiene una resistencia osmótica de 840 mOsm/kg o mayor.

8. La nanopartícula polimérica de la reivindicación 1, en donde el agente bioactivo hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un agente formador de imágenes, una nanopartícula inorgánica, una nanopartícula orgánica, y una combinación de los mismos.

9. La nanopartícula polimérica de la reivindicación 8, en donde el agente bioactivo tiene una eficiencia de encapsulación superior al 20%.

10. La nanopartícula polimérica de la reivindicación 8, en donde el agente bioactivo hidrofílico es ARNpi o di-GMP cíclico.

11. Una nanopartícula polimérica que encapsula un agente bioactivo hidrofílico según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en donde la enfermedad es enfermedad cardiovascular, cáncer, enfermedad autoinmune o infección.

12. Un método para preparar la nanopartícula polimérica de la reivindicación 1, que comprende:

disolver un polímero en un disolvente para formar una solución polimérica, emulsionar por dispersión la solución polimérica en una primera solución acuosa que contiene un agente bioactivo para formar una emulsión,

emulsionar mediante dispersión fluídica la emulsión así formada en una segunda solución acuosa para obtener una nanopartícula polimérica, y

recoger la nanopartícula polimérica así obtenida,

en donde el polímero contiene un segmento no polar y un grupo terminal polar, la dispersión fluídica se realiza de una manera controlada utilizando un microfluidizador.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el disolvente es un disolvente no polar seleccionado del grupo que consiste en diclorometano, alcohol bencílico, acetato de etilo, cloroformo, y una combinación de los mismos.

14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde cada una de las primera y segunda soluciones acuosas contiene un modulador, seleccionado del grupo que consiste en fosfato de sodio, bicarbonato de sodio, Tris-HCl, sacarosa, dextrano, y una combinación de los mismos.