ES2842624T3 - El pirofosfato oral para su uso en la reducción de la calcificación de tejidos - Google Patents

Abstract

Pirofosfato inorgánico (PPi) para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por calcificación de tejidos, en particular calcificación del tejido blando, o enfermedades o trastornos caracterizado por niveles bajos de PPi en plasma, en los que dicho pirofosfato inorgánico se administra en forma oral.

Description

DESCRIPCIÓN

El pirofosfato oral para su uso en la reducción de la calcificación de tejidos

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la calcificación de tejidos, más particularmente la calcificación del tejido blando, así como a otras enfermedades o trastornos caracterizados por niveles bajos de pirofosfato inorgánico en sangre.

Antecedentes de la invención

La mineralización fisiológica es esencial para el desarrollo normal de los vertebrados. Está restringido a sitios específicos del cuerpo. En los mamíferos, los biominerales consisten predominantemente en calcio y fosfato, que juntos forman la hidroxiapatita. En el plasma y varios otros fluidos corporales, el calcio y el fosfato están presentes en concentraciones que exceden con mucho su constante de solubilidad (1x10-26). Los vertebrados han desarrollado mecanismos para estabilizar esta solución sobresaturada y permitir la precipitación regulada de calcio y fosfato solo en compartimentos corporales específicos.

La calcificación (depósitos de fosfato de calcio) puede ocurrir en muchos tejidos blandos diferentes en una variedad de condiciones locales y sistémicas (en todo el cuerpo). Los cristales de fosfato de calcio tienen una tendencia notable a agregarse en grumos en forma de bola de nieve y se asocian invariablemente con colágenos particulares. Los colágenos son proteínas fibrosas insolubles que se encuentran en los tejidos conectivos, incluida la piel, los ligamentos y el cartílago. El colágeno representa aproximadamente el 30 por ciento de la proteína corporal total.

El pirofosfato (PPi) es un factor central en la prevención de la precipitación de calcio y fosfato en los tejidos periféricos blandos. El hígado es la fuente más importante de PPi circulatorio, a través de una vía que se encuentra en función de la liberación de ATP mediada por ABCC6. Fuera de los hepatocitos, pero aún dentro de la vasculatura hepática, el ATP liberado se convierte rápidamente en AMP y PPi por la ectoenzima ectonucleótido pirofosfatasa fosfodiesterasa 1 (ENPP1). El pirofosfato es un potente inhibidor de la formación de hidroxiapatita y, en condiciones normales, actúa inhibiendo la calcificación del tejido blando, por ejemplo, la calcificación vascular.

Las mutaciones inactivadoras en los genes que codifican las enzimas involucradas en la homeostasis de PPi dan como resultado trastornos de calcificación hereditarios raros. Por ejemplo, la ausencia de ABCC6 funcional da como resultado un pseudoxantoma elástico (PXE), un trastorno de calcificación ectópica de inicio tardío, con lesiones que se encuentran en la piel, los ojos y el sistema cardiovascular. Mutaciones inactivadoras bialélicas en ENPP1 causan calcificación arterial y calcificación generalizada de la infancia (GACI), una afección que puede poner en peligro la vida poco después del nacimiento debido a la calcificación masiva de las arterias grandes y medianas. Los pacientes con GACI prácticamente no tienen PPi en la sangre, lo que explica la gravedad de la enfermedad.

Dado que las concentraciones reducidas de PPi en la circulación son la base de los trastornos de calcificación ectópica PXE y GACI, un tratamiento obvio para estos trastornos, así como para otros trastornos caracterizados por concentraciones reducidas de PPi en la circulación, sería la suplementación con PPi. Debido a la necesidad de, en algunos casos, tratar a los pacientes durante toda la vida y la corta vida media de PPi, se preferiría la administración oral para tal tratamiento. Sin embargo, durante mucho tiempo se pensó, y por lo tanto es un dogma imperante, que PPi es ineficaz cuando se administra por vía oral (H. Fleisch y otros., Calc. Tiss. Res. 2, Supl. (1968) 10; Francis y otros. Ciencia (1969), 165 (3899), 1264-1266; Orriss, IR. y otros. Curr Opin Pharmacol. (2016) 28, 57-68).

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente divulgación se refiere a pirofosfato inorgánico (PPi) para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por calcificación de tejidos, particularmente calcificación del tejido blando, o enfermedades o trastornos caracterizados por niveles bajos de PPi en plasma, en el que dicho pirofosfato se administra por vía oral.

La calcificación del tejido blando puede ser una calcificación vascular, como una calcificación arterial o una calcificación de la íntima. La calcificación del tejido puede estar en un sujeto que tiene deficiencia de ENPP1, enfermedad renal crónica (ERC), enfermedad renal en etapa terminal (ESRD), calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), pseudoxantoma elástico (PXE), calcificación arterial debido a deficiencia de CD73 (ACDC), síndrome de Ehlers-Danlos, arteriosclerosis obliterante, calcificaciones venosas, trastornos por depósito de cristales, calcificación resultante de trastornos neurológicos, calcinosis universalis, calcinosis circunscripta, esclerodermia, dermatomiositis, lupus eritematoso sistémico, hiperparatiroidismo, neoplasias, síndrome de leche-álcali, hipervitaminosis D, calcinosis tumoral, raquitismo hipofosfatémico, osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna, isquemia miocárdica, calcificación articular, osificación heterotrópica del músculo traumatizado, estrías angioides, diabetes mellitustipo II, trastorno cardiovascular o ateroeclerosis.

El pirofosfato inorgánico se puede administrar ventajosamente a un sujeto humano. El pirofosfato inorgánico se puede administrar diariamente.

En un segundo aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para prevenir y/o reducir tejido, particularmente tejido blando, calcificación y/o enfermedades o trastornos caracterizados por niveles bajos de PPi en plasma que comprende el paso de: administrar a un sujeto que lo necesite un cantidad terapéuticamente eficaz de pirofosfato inorgánico, en la que dicho pirofosfato inorgánico se administra en forma oral.

La calcificación del tejido blando puede ser una calcificación vascular, como una calcificación arterial o una calcificación de la íntima.

El pirofosfato inorgánico puede ser suficiente para lograr un aumento transitorio del nivel de PPi en plasma en el sujeto.

El aumento transitorio del nivel de PPi en plasma se caracteriza por un nivel de PPi que es al menos aproximadamente el 40 % del nivel de PPi en plasma en un sujeto sano.

El aumento transitorio de la concentración de PPi en plasma puede mantenerse aproximadamente durante al menos 15 minutos.

El sujeto puede tener una enfermedad o trastorno caracterizado por niveles bajos de PPi en plasma, por ejemplo, enfermedad renal crónica (ERC), enfermedad renal en etapa terminal (ESRD), calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), pseudoxantoma elástico (PXE), calcificación arterial Debido a deficiencia de CD73 (ACDC), síndrome de Ehlers-Danlos, arteriosclerosis obliterante, calcificaciones venosas, trastornos por depósito de cristales, calcificación resultante de trastornos neurológicos, calcinosis universal, calcinosis circunscripta, esclerodermia, dermatomiositis, lupus eritematoso sistémico, hiperparatiroidismo, neoplasias, leche. síndrome alcalino, hipervitaminosis D, calcinosis tumoral, raquitismo hipofosfatémico, osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna, isquemia miocárdica, calcificación articular, osificación heterotrópica del músculo traumatizado, estrías angioides, diabetes mellitustipo II, trastorno cardiovascular o aterosclerosis.

En una realización, el sujeto tiene GACI o PXE.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se especifique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente memoria tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por aquellos con experiencia en la técnica a la que pertenece la presente invención.

Como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" incluye tanto mamíferos como no mamíferos. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, humanos, chimpancés, simios, monos, ganado, caballos, ovejas, cabras, cerdos, conejos, perros, gatos, ratas, ratones, cobayas, etc. Los ejemplos de no mamíferos incluyen, sin limitaciones a, aves, peces y similares.

Como se usa en la presente memoria, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad no tóxica de PPi que es suficiente para dar como resultado un mejor tratamiento o curación de una enfermedad o trastorno, o una disminución en la velocidad de avance de una enfermedad o trastorno.

El término "tejido blando", como se usa en la presente memoria, se refiere a los tejidos que conectan, sostienen o rodean otras estructuras y órganos del cuerpo, no siendo tejido duro como el hueso. El tejido blando incluye tendones, ligamentos, fascia, piel, tejidos fibrosos, grasa y membranas sinoviales (que son tejido conectivo) y músculos, nervios y vasos sanguíneos (que no son tejido conectivo).

El término "aproximadamente", como se usa en la presente memoria, significa variaciones de ± 20 % o ± 10 %, o ± 5 % o ± 1% del valor especificado, ya que tales variaciones aún son adecuadas para realizar los procedimientos enseñados en la presente memoria.

El término "tratar" como se usa en la presente memoria se refiere a la administración de PPi a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno caracterizado por niveles bajos de PPi en la sangre, u otro trastorno progresivo caracterizado por la acumulación de depósitos de calcio y otros minerales, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, aminorar, prevenir, mejorar o afectar la enfermedad o trastorno. El término “tratamiento” se refiere a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora de un daño, patología o afección, que incluye cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como abatimiento; remisión; disminución de los síntomas; incremento de la tolerancia al daño, patología o afección; retardo de la progresión del daño, patología o afección; retardo de la velocidad de degeneración o declive; o mejora del bienestar físico o mental del sujeto. El tratamiento puede ser terapéutico o profiláctico.

El término "prevenir y/o reducir" como se usa en la presente memoria se refiere a la prevención de la calcificación, la prevención de la calcificación adicional en tejidos (blandos) que ya contienen algún grado de calcificación así como la reversión (parcial) de la calcificación ya formada.

Procedimientos de tratamiento

La presente invención se refiere al uso de pirofosfato inorgánico administrado por vía oral para el tratamiento de la calcificación de tejidos, particularmente en la calcificación del tejido blando, por ejemplo, calcificación vascular. Sorprendentemente se descubrió que, a pesar del dogma reinante durante 50 años, de que el pirofosfato debe inyectarse, ya que es ineficaz por vía oral debido a la destrucción hidrolítica en el intestino (Orriss y otros, 2016, supra), la administración oral de PPi atenuó la calcificación en modelos de ratón de pseudoxantoma elástico (PXE) y calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI). Sorprendentemente, el efecto fue máximo en las crías de ratones GACI si se administró PPi durante el embarazo. Además, se detectó la captación de PPi en la cavidad bucal y en el estómago, lo que muestra que el PPi no solo se absorbe en el intestino, sino también en la cavidad oral y el estómago. Por tanto, los presentes inventores han demostrado que el pirofosfato inorgánico administrado por vía oral puede alcanzar la circulación sanguínea y contrarrestar la calcificación del tejido blando, haciendo factible el tratamiento a largo plazo de los trastornos y enfermedades de calcificación del tejido blando, algunos de los cuales son hereditarios y requieren un posible tratamiento de por vida.

En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de PPi, en el que el PPi debe administrarse en forma oral, para su uso como medicamento, en particular para prevenir y/o tratar enfermedades o trastornos caracterizados por calcificación del tejido, particularmente calcificación del tejido blando, y/o enfermedades o trastornos caracterizados por niveles bajos de PPi en plasma.

Por tanto, la presente invención proporciona el uso de pirofosfato inorgánico para el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por calcificación del tejido, particularmente calcificación del tejido blando, en el que dicho pirofosfato inorgánico se administra en forma oral. La invención también proporciona un procedimiento para reducir la calcificación de tejidos, que comprende la calcificación del tejido blando, que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesite pirofosfato inorgánico, en el que dicho pirofosfato inorgánico se administra en forma oral.

El riesgo de PPi oral para los pacientes probablemente sea insignificante. La OMS considera que el PPi es un metabolito fisiológico no tóxico con un alto valor máximo de ingesta diaria tolerable (IDMT). Además, se utiliza generalmente en la industria alimentaria como aditivo, y su Código de Regulación Federal de la FDA establece: "Esta sustancia se reconoce generalmente como segura cuando se usa de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación."

El sujeto a tratar puede ser un paciente humano que presente niveles bajos de pirofosfato, que padezca una enfermedad o trastorno asociado con niveles bajos de pirofosfato, o que padezca un trastorno progresivo caracterizado por la acumulación de depósitos de calcio y otros minerales (mineralización) en fibras elásticas. La mineralización puede ocurrir en el corazón, las arterias, los vasos sanguíneos, el riñón, los ligamentos de la columna, la piel, los ojos o el tracto digestivo. El sujeto puede ser de cualquier edad y sexo, y puede tener bajo PPi en plasma. El bajo PPi en plasma puede ser causado, por ejemplo, por deficiencias congénitas como se enseñó en la presente memoria anteriormente u otras que se sabe resultan en niveles bajos de PPi en plasma. El bajo PPi en plasma también se observa con frecuencia en sujetos con enfermedad renal crónica, enfermedad/insuficiencia renal en etapa terminal, diabetes mellitus y otras afecciones. En consecuencia, el sujeto que necesita terapia puede tener deficiencia de ENPP1, enfermedad renal crónica (ERC), enfermedad renal en etapa terminal (ESRD), calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), pseudoxantoma elástico (PXE), calcificación arterial debida a deficiencia de CD73 (ACDC), síndrome de Ehlers-Danlos, arteriosclerosis obliterante, calcificaciones venosas, trastornos por depósito de cristales, calcificación resultante de trastornos neurológicos, calcinosis universalis, calcinosis circunscripta, esclerodermia, dermatomiositis, lupus eritematoso sistémico, hiperparatiroidismo, neoplasias, síndrome de la lecheálcali, hipervitaminosis D, calcinosis tumoral, raquitismo hipofosfatémico, osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna, isquemia miocárdica, calcificación articular, osificación heterotrópica de músculo traumatizado, estrías angioides, diabetes mellitus tipo II, trastorno cardiovascular o aterosclerosis. El sujeto es generalmente un ser humano, pero también puede ser cualquier otro mamífero o no mamífero adecuado.

Las enfermedades o trastornos caracterizados por calcificación tisular, particularmente calcificación del tejido blando, incluyen, pero no se limitan a, calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), pseudoxantoma elástico (PXE), calcificación arterial debida a deficiencia de CD73 (ACDC), calcificación vascular en enfermedad renal crónica (VCCKD), resistencia a la insulina, raquitismo hipofosfatémico, osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna, isquemia miocárdica, calcificación articular, osificación heterotrópica del músculo traumatizado y estrías angioides. También el tratamiento de afecciones que se pueden mejorar reduciendo y/o eliminando una o más estructuras de calcificación y/o evitando que se formen estructuras de calcificación en un sujeto, están dentro del ámbito de la presente invención. Dichas afecciones incluyen, sin limitación, síndrome de Ehlers-Danlos, arteriosclerosis obliterante, calcificaciones venosas, trastornos por depósito de cristales, calcificación resultante de trastornos neurológicos, calcinosis universalis, calcinosis circunscripta, esclerodermia, dermatomiositis, lupus eritematoso sistémico, hiperparatiroidismo, neoplasias, síndrome de leche-álcali, hipervitaminosis D y calcinosis tumoral,

Generalmente, la dosis de PPi administrada a un sujeto que lo necesite variará dependiendo de la edad, la salud y el peso del sujeto, la frecuencia del tratamiento y similares. Por ejemplo, una dosis de PPi puede estar entre aproximadamente 0,1 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 1 g por kg de peso corporal, por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal, o entre aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 300 mg por kg de peso corporal, o entre aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal, o entre aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal y alrededor de 150 mg por kg de peso corporal. Un médico experto en la técnica puede determinar la dosis y la frecuencia de administración precisas. El médico experto apreciará fácilmente que ciertos factores pueden influir en la dosis requerida para tratar eficazmente a un sujeto, que incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presente en el sujeto.

La dosis de PPi puede estar en forma de dosis unitaria que comprende toda la cantidad terapéuticamente eficaz, o puede estar contenida en múltiples formas de dosificación. El PPi se puede administrar una vez al día, dos veces al día o similar. Se apreciará que la dosificación eficaz de PPi utilizada para el tratamiento enseñado en la presente memoria puede aumentar o disminuir durante el curso del tratamiento.

El PPi oral se puede administrar a un sujeto durante un período de tiempo determinado por un médico experto. En una realización, por ejemplo, para ciertos trastornos de calcificación hereditarios, el período de tiempo será el resto de la vida útil del sujeto.

En una realización, el sujeto es un bebé. El sujeto puede tener entre 1 mes y 24 meses de edad, menos de 1 año de edad, menos de 2 años de edad, menos de 3 años de edad, menos de 4 años de edad, menos de 5 años de edad o menos de 6 años de edad.

En una realización, el nivel de PPi en sangre en un sujeto antes del tratamiento es menos de aproximadamente 80 %, como por ejemplo menos de aproximadamente 70 %, menos de aproximadamente 60 %, menos de aproximadamente 50 %, menos de aproximadamente 40 %, menos de aproximadamente 30 %, menos de aproximadamente 25 %, menos de aproximadamente 20 %, menos de aproximadamente 15 %, menos de aproximadamente 10 %, menos de aproximadamente 5 %, menos de aproximadamente 3 %, menos de aproximadamente 2 % o menos de aproximadamente 1 % de niveles normales de PPi observados en un sujeto humano sano. En una realización, un sujeto no muestra un nivel medible de PPi en sangre antes del tratamiento.

En una realización, el PPi puede administrarse junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con la invención, el PPi se administra por vía oral, puede presentarse en cualquier forma adecuada para dicha administración, por ejemplo, en forma de comprimidos, cápsulas, polvos, jarabes o soluciones. En una realización, el PPi se administra en forma de una entidad farmacéutica sólida, de manera adecuada como una tableta o una cápsula. Los procedimientos para la preparación de composiciones o preparaciones farmacéuticas sólidas son bien conocidos en la técnica. Por tanto, las tabletas pueden prepararse mezclando el ingrediente activo con adyuvantes, cargas y diluyentes convencionales y comprimiendo posteriormente la mezcla en una máquina de fabricación de tabletas adecuada. Los ejemplos de adyuvantes, cargas y diluyentes comprenden almidón de maíz, lactosa, talco, estearato de magnesio, gelatina, gomas y similares. Las cargas típicas son seleccionados de entre lactosa, manitol, sorbitol, celulosa y celulosa microcristalina. También se puede utilizar cualquier otro adyuvante o aditivo como colorantes, aromas, conservantes, etc. con la condición de que sean compatibles con el ingrediente activo PPi.

En una realización, el PPi puede incluirse en un alimento o un producto complementario alimenticio, por ejemplo, un dulce o chicle, o similar.

El PPi oral se puede administrar solo o en combinación con otros agentes. El PPi se puede administrar antes, después o al mismo tiempo que dichos otros agentes o se puede coadministrar con otras terapias conocidas.

En una realización, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para prevenir y/o reducir la calcificación del tejido, particularmente la calcificación del tejido blando, y/o enfermedades o trastornos caracterizados por niveles bajos de PPi en plasma, en un sujeto que lo necesite. El procedimiento esta en base al sorprendente hallazgo de que se puede administrar PPi oral a un sujeto que tiene niveles bajos de PPi en plasma para provocar un aumento transitorio de PPi en plasma en el sujeto, que puede inhibir la calcificación del tejido, particularmente la calcificación del tejido blando, en el sujeto. Dado que el aumento del PPi en el plasma es transitorio, la terapia se adaptar para inhibir la calcificación tisular indeseable o patológica, sin inhibir la calcificación ósea o inducir osteomalacia.

En una realización, la divulgación se refiere a un procedimiento para reducir la calcificación del tejido (por ejemplo, calcificación del tejido blando) en un sujeto que lo necesita, administrando al sujeto una o más dosis de PPi. Cada dosis puede contener una cantidad de PPi que sea suficiente para lograr un aumento transitorio de PPi en plasma en el sujeto.

En una realización, el nivel de PPi en la sangre vuelve a su nivel base en aproximadamente 24 horas, como por ejemplo en 18 horas, 12 horas, 6 horas o 4 horas después de la administración de la dosis. El período de tiempo entre la administración de cada dosis puede variar. Por ejemplo, el PPi oral puede administrarse dos veces al día, diariamente, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días o similares.

En una realización, cada dosis de PPi oral que se administra al sujeto contiene una cantidad de PPi suficiente para lograr un aumento transitorio en el nivel de PPi en plasma, que puede tener un pico que esté por encima del 200 %, o que esté entre aproximadamente el 40 % y aproximadamente el 200 %, como entre aproximadamente el 50 % y el 150 %, entre aproximadamente el 60 % y aproximadamente el 125 %, entre aproximadamente el 70 % y aproximadamente el 100 %, entre aproximadamente el 80 % y aproximadamente el 90 %, del nivel de PPi en plasma observado en sujetos sanos.

En una realización, el aumento transitorio del nivel de PPi en plasma después de la administración oral de PPi se mantiene durante al menos aproximadamente 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora o similar. Además, se prefiere que el nivel de PPi en plasma vuelva a su nivel base en aproximadamente 24 horas, como en aproximadamente 18 horas, 12 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora o menos después administración de la dosis.

Los niveles bajos de PPi en plasma en un sujeto antes del tratamiento pueden ser aproximadamente 50 % o menos, 40 % o menos, 30 % o menos, 20 % o menos, o 10 % o menos, de los niveles de PPi en plasma observados en un sujeto sano.

La calcificación del tejido es un procedimiento progresivo, y los individuos que nacen con deficiencias congénitas que conducen a niveles bajos de PPi en plasma pueden no mostrar calcificación del tejido durante varios años. Para reducir o minimizar la calcificación en tales sujetos, la terapia debe iniciarse lo antes posible, preferentemente incluso antes de que se note la calcificación del tejido. Los presentes inventores encontraron que la administración de PPi a un mamífero preñado y la terapia con PPi del bebé después del nacimiento reducían o minimizaban la calcificación en el feto y/o el bebé.

En sujetos con bajos niveles PPi en plasma que no tienen deficiencias congénitas, la terapia debe comenzar tan pronto como sea posible; es decir, poco después del diagnóstico de las condiciones, como ERC o ESRD.

La invención se ejemplifica adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que están destinados únicamente a fines ilustrativos, y que no pretenden interpretarse como limitantes de la invención de ninguna manera.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra que el PPi oral atenúa la calcificación cardíaca inducida en ratones Abcc6-/-. Se proporcionó PPi en varias concentraciones (0,1-50 mM) en el agua potable para Abcc6-/- (A) o a ratones C3H/He (B) (en los que una variante de empalme alternativa en Abcc6 conduce a deficiencia de proteínas) un día antes de la criolesión y continuó durante cuatro días cuando los animales fueron sacrificados. Se determinó el contenido de calcio del tejido cardíaco. El inserto muestra calcificación del corazón de ratones Abcc6-/- cuatro días después de la criolesión.

La Figura 2 muestra que el PPi oral atenúa la calcificación espontánea de las vibrisas de la cápsula capilar en ratones Abcc6-/-. Los ratones Abcc6-/- se mantuvieron con PPi 10 mM (en agua de bebida) comenzando 3 semanas después del destete hasta las 22 semanas de edad. El grupo de control estaba bebiendo agua del grifo. Se eliminaron los bloques de tejido con las cápsulas capilares, se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con rojo de alizarina para los depósitos de calcio. El grado de calcificación se expresó como la relación del número de cápsulas calcificantes por número total de cápsulas (A). Los paneles B y C muestran secciones típicas teñidas con rojo de alizarina de un animal del grupo de control y el del grupo de PPi 10 mM, respectivamente.

La Figura 3 muestra que el tratamiento prenatal de PPi a los ratones Enpp1-/- atenúan la calcificación espontánea de la cápsula pilosa de las vibrisas y retrasa el fenotipo de caminar de puntillas. La madre y las crías se mantuvieron con agua del grifo hasta que las crías tuvieron 30 días ("control"); Grupo 1: como grupo de control, pero durante 9 días con una solución de PPi 10 mM después del destete a los 21 días. Grupo 2: las madres y las crías se mantuvieron con PPi 10 mM durante la gestación, la lactancia y durante 9 días después del destete. Grupo 3: las madres y las crías se mantuvieron con PPi 10 mM durante la lactancia y durante 9 días después del destete. Grupo 4: las madres se mantuvieron con PPi 10 mM durante el embarazo. También se muestran los controles de tipo salvaje.

Se determinó el contenido de calcio de los bloques de tejido de las cápsulas capilares (panel A). Los paneles B, C y D muestran secciones típicas teñidas con rojo de alizarina de un animal de cada grupo. Panel E: retraso del día de inicio del fenotipo de caminar de puntillas en las crías mantenidas con agua o con PPi 10 mM durante el embarazo, la lactancia y después del destete o solo durante el embarazo, o durante la lactancia y después del destete, pero no durante el embarazo.

La Figura 4 muestra la absorción de PPi del agua potable en ratones.

A : Captación de la cavidad bucal y del estómago mediante la administración continua de 50 mM PPi a ratones Abcc6-/- sin ligadura. Los ratones se anestesiaron y se colocaron almohadillas de papel en la boca; se administraron alícuotas de 30 ul de PPi 50 mM a intervalos de 10 minutos durante una hora. Se recogió sangre para el ensayo de PPi al final de la administración de PPi, a los 60 min. Se proporcionó PPi 50 mM en alícuotas de 30 ul directamente en el estómago mediante una sonda en ratones Abcc6-/- anestesiados durante 60 minutos en los intervalos descritos anteriormente y se recogió sangre para el ensayo de PPi a los 60 minutos.

B: Captación de la cavidad oral, del estómago y del intestino de los ratones C57/BI6 después de ligar el esófago y aplicar la administración oral de 100 ul de PPi 50 mM o del píloro seguido de la administración estomacal de 200 ul de PPi 50 mM y luego ligar el esófago, o inyectar 200 |jl de PPi 50 mM en el intestino después de la ligadura del píloro. En cada experimento se recogió sangre después de 15 min y se determinaron las concentraciones de PPi.

C: Concentraciones de PPi en el plasma después de la administración de 200 ul de PPi 50 mM por sonda en el estómago de ratones C57/BI6.

La Figura 5 muestra la absorción de PPi del agua potable en un voluntario humano.

Ejemplos

Animales y estudios con animales

Los ratones C57BL/6J, designados como de tipo salvaje, se derivaron de ratones comprados en The Jacksons Laboratories. Los ratones Abcc6-/- se generaron en un fondo 129/Ola y se retrocruzaron en un C57BL/6J> 10 veces1. Los ratones Ttw se obtuvieron del apareamiento Ttw+/- y cada descendencia fue genotipada. Los ratones C3H/He se adquirieron en Harlan (Países Bajos). Se emplearon ratones Abcc6-/-, Ttw, C3H/He y de tipo salvaje, tanto hembras como machos de la misma edad.

Todos los animales se alojaron en instalaciones para animales aprobadas en el Centro de Investigación de Ciencias Naturales de la Academia de Ciencias de Hungría. Los ratones se mantuvieron en condiciones de laboratorio de rutina con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con acceso a agua y comida adlibitum. El RCNS, los comités institucionales de uso y cuidado de animales de la Academia de Ciencias de Hungría, aprobaron este estudio. Los experimentos se han realizado de acuerdo con las directrices nacionales. Se realizó criolesión y se determinó el contenido de calcio tisular como se describe en Brampton y otros. ((2014) Am J Pathol. 184, 159-70). La calcificación de las vibrisas se estudió mediante histoquímica siguiendo el procedimiento que describió Klement y otros. ((2005) Mol Cell Biol. 25, 8299-310. El número de vibrisas calcificadas (cápsulas capilares) se contó de forma independiente y dos investigadores determinaron de forma ciega la aparición del fenotipo de caminar de puntillas.

Mediciones de pirofosfato

La determinación de la concentración de PPi en plasma se realizó como se describe por Jansen y otros ((2014) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1985-9). El pirofosfato de sodio tetrabásico decahidratado (calidad BioXtra) se adquirió de Sigma.

Análisis estadístico

Los datos se compararon mediante la prueba t de Student. Los valores se expresan como media /- error estándar de la media (SEM). Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los números de animales utilizados para un conjunto de datos individual variaron y se muestran en las figuras.

Resultados

Los ratones Abcc6-/- recapitulan fielmente el PXE humano, con lesiones calcificantes que se encuentran en la piel, los ojos y los vasos sanguíneos. Un inconveniente de los ratones Abcc6-/- es el inicio relativamente tardío de las primeras lesiones, lo que hace que este modelo sea menos conveniente para e cribado rápido de nuevos tratamientos. Sin embargo, la criolesión aplicada al corazón da como resultado una lesión calcificada en 3 a 6 días, un fenómeno totalmente dependiente de la ausencia de Abcc6. Como las inyecciones intraperitoneales (IP) diarias de PPi evitaron la calcificación en varios modelos de enfermedades animales, la administración IP (6 mg PPi/kg de peso corporal durante 7 días) se ensayó en ratones Abcc6-/-. De hecho, las inyecciones de PPi redujeron la calcificación cardíaca (ICC) inducida por criolesión (datos no mostrados).

Luego se probó si el PPi administrado por vía oral también inhibía la calcificación observada en el modelo ICC. Se descubrió que el PPi proporcionado a través del agua potable inhibía de forma potente la ICC. El grado de inhibición de la calcificación fue dosis-dependiente, con una inhibición máxima observada a una concentración de PPi de 10 mM (Figura 1). A continuación, se probó si la calcificación ectópica espontánea observada en los ratones Abcc6-/- también podrían atenuarse mediante la administración de PPi a través del agua de beber. Un fenotipo peculiar visto en ratones Abcc6-/- es la calcificación gradual del tejido que rodea a las vibrisas. Por lo tanto, se determinó el efecto del PPi oral sobre la calcificación de la lámina dérmica que rodea las vibrisas. Justo después del destete los ratones Abcc6-/- se pusieron con agua potable que contenía PPi (10 mM) durante un período de 19 semanas. Luego se determinó el efecto del agua potable que contiene PPi sobre el número de vibrisas calcificadas. Como puede verse en la Figura 2, el PPi proporcionado a través del agua potable también inhibió de forma potente la calcificación espontánea observada en ratones Abcc6-/-.

Los ratones con caminado de puntillas (ttw) tienen una mutación inactivante en Enppl y representan un modelo para GACI. Debido a la ausencia total de Enpp1, estos ratones tienen niveles extremadamente bajos de PPi en plasma y desarrollan calcificaciones extensas en la piel, los vasos sanguíneos y las articulaciones poco después del nacimiento. Al igual que los ratones Abcc6-/-, los ratones ttw muestran una extensa calcificación de la lámina dérmica que rodea las vibrisas, aunque en estos animales este fenotipo se manifiesta mucho antes que en los ratones que carecen Abcc6.

Se probó si la suplementación de PPi a través del agua potable también atenuó efectivamente esta calcificación ectópica en los ratones ttw.

Cuando se administró PPi por vía oral durante el embarazo y la lactancia y posteriormente se continuó con el tratamiento de las crías con PPi, la calcificación de la capa dérmica que rodeaba las vibrisas se redujo considerablemente (ver Figura 3). Para determinar cuándo el tratamiento con PPi fue más efectivo, se analizó el efecto de PPi por separado durante el embarazo, la lactancia y después del destete. Cuando solo tratamos las crías ttw después del destete, la cantidad de calcificación no fue diferente del grupo tratado de control. El PPi proporcionado durante la lactancia tampoco tuvo un impacto significativo sobre la calcificación. Sin embargo, el hallazgo más notable de estos experimentos fue que el efecto de PPi era máximo si se administraba durante el embarazo. Lo mismo ocurrió cuando se determinó el fenotipo de caminar de puntillas (por calcificación articular) (Figura 3), que se retrasó cuatro días en el grupo "PPi durante el embarazo". Una explicación de estos resultados es que ya se han formado microcristales en el grupo tratado-control antes del nacimiento. Sin desear ceñirse a la teoría, se plantea la hipótesis de que estos microcristales podrían estar en su mayoría ausentes en las crías ttw de madres que toman PPi durante el embarazo y, por lo tanto, es posible que no estén disponibles para acelerar el procedimiento de calcificación después del destete. Nuestros datos demuestran claramente que el PPi administrado por vía oral atenúa la calcificación ectópica.

Captación de PPi de la cavidad oral y del estómago en ratones

Los ratones se anestesiaron y se colocaron almohadillas de papel en la boca; Se administraron alícuotas de 30 ul de PPi 50 mM a intervalos de 10 minutos durante una hora. Se recogió sangre para el ensayo de PPi al final de la administración de PPi, a los 60 min. Alternativamente, se proporcionó PPi 50 mM en alícuotas de 30 pl directamente en el estómago mediante una sonda en ratones Abcc6-/- anestesiados durante 60 minutos en los intervalos descritos anteriormente y se recogió sangre para el ensayo de PPi a los 60 minutos. Se encontró que PPi se absorbía tanto de la cavidad bucal como del estómago (Figura 4).

Captación de PPi en plasma en humanos

Un voluntario humano bebió 300 ml de 100 mM de Na⁴PPi pH8, y las concentraciones plasmáticas de PPi se midieron en el tiempo. Se demostró que el PPi administrado por vía oral se tomó para proporcionar un aumento de los niveles de PPi en plasma (Figura 5).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Pirofosfato inorgánico (PPi) para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por calcificación de tejidos, en particular calcificación del tejido blando, o enfermedades o trastornos caracterizado por niveles bajos de PPi en plasma, en los que dicho pirofosfato inorgánico se administra en forma oral.

2. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la calcificación del tejido blando es una calcificación vascular tal como una calcificación arterial o una calcificación de la íntima.

3. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la calcificación tisular es en un sujeto que tiene deficiencia de ENPP1, enfermedad renal crónica (ERC), enfermedad renal en etapa terminal (ESRD), calcificación arterial generalizada de la infancia (GACI), pseudoxantoma elástico (PXE), calcificación arterial debida a deficiencia de CD73 (ACDC), síndrome de Ehlers-Danlos, arteriosclerosis obliterante, calcificaciones venosas, trastornos por depósito de cristales, calcificación resultante de trastornos neurológicos, calcinosis universalis, calcinosis circunscripta, esclerodermia, dermatomiositis, lupus eritematoso sistémico, hiperparatiroidismo, neoplasias, síndrome de leche-álcali, hipervitaminosis D, calcinosis tumoral, raquitismo hipofosfatémico, osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna, isquemia miocárdica, calcificación articular, osificación heterotrópica del músculo traumatizado, estrías angioides, diabetes mellitus tipo II, trastorno cardiovascular o aterosclerosis.

4. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el pirofosfato inorgánico debe administrarse a un sujeto humano.

5. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el pirofosfato inorgánico debe administrarse diariamente.

6. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pirofosfato inorgánico es suficiente para lograr un aumento transitorio del nivel de PPi en plasma en el sujeto.

7. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aumento transitorio del nivel de PPi en plasma se caracteriza por un nivel de PPi que es al menos aproximadamente el 40 % del nivel de PPi en plasma en un sujeto sano.

8. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aumento transitorio del nivel de PPi en plasma se mantiene durante al menos aproximadamente 15 minutos.

9. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, en el que el sujeto tiene GACI o PXE.

10. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en una dosis entre aproximadamente 0,1 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 1 g por kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,5 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal peso, entre aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 300 mg por kg de peso corporal, entre aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 200 mg por kg de peso corporal, o entre aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 150 mg por kg de peso corporal.

11. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en forma de dosis unitaria que comprende toda la cantidad terapéuticamente eficaz, o en forma de dosis múltiples.

12. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, administrado junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y/o en forma de comprimidos, cápsulas, polvos, jarabes o soluciones.

13. Pirofosfato inorgánico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de pirofosfato inorgánico es suficiente para lograr un aumento transitorio del nivel de PPi en plasma, que tiene un pico que está por encima del 200 %, o que está entre aproximadamente el 40 % y aproximadamente 200 %, entre aproximadamente 50 % y 150 %, entre aproximadamente 60 % y aproximadamente 125 %, entre aproximadamente 70 % y aproximadamente 100 %, o entre aproximadamente 80 % y aproximadamente 90 %, del nivel de PPi en plasma observado en sujetos sanos.