ES2834657T3 - Procedimiento para la determinación de la luminosidad de una partícula luminiscente - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinacion de una luminosidad absoluta de una particula luminiscente, que comprende: - poner a disposicion un volumen de muestra, el cual comprende un conjunto de particulas luminiscentes; - determinar un rendimiento cuantico de fotoluminiscencia absoluto o uno relativo del conjunto de particulas en el volumen de muestra; - determinar una seccion transversal del efecto de absorcion o la eficiencia de absorcion de las particulas en el volumen de muestra; - determinar la luminosidad absoluta de una unica particula basandose en el rendimiento cuantico de fotoluminiscencia absoluto, en la seccion transversal del efecto de absorcion o la eficiencia de absorcion y un numero de particulas en el volumen de muestra determinados, expresandose la luminosidad absoluta a traves de un producto de la seccion transversal del efecto de absorcion de una particula σa [cm2] y el rendimiento cuantico Φf medido en una dispersion de particulas; estando seleccionadas las particulas luminiscentes de entre particulas suspendidas o dispersas en el volumen de muestra en el intervalo de tamano de 5 nm a 5000 μm, y donde el rendimiento cuantico de fotoluminiscencia absoluto y/o la seccion transversal del efecto de absorcion se determinan mediante una medicion con resolucion de longitud de onda de una emision, de una transmision y de una reflexion.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la determinación de la luminosidad de una partícula luminiscente

La invención se refiere a un procedimiento para la determinación de la luminosidad absoluta de partículas luminiscentes y su uso para mediciones ópticas, en particular en el ámbito de la calibración de los sistemas de medición adecuados para ello.

En lo sucesivo se denominan partículas suspendidas, dispersadas o agregadas, combinaciones de dichas partículas, agregados de partículas, conjuntos de partículas, partículas marcadas con agente colorante, conjugados de partículas de anticuerpos marcados con agente colorante, partículas de conjugados de enzimas o conjugados de partículas de anticuerpos marcadas con enzimas, y cualesquiera otras combinaciones de partículas luminiscentes con otros agentes colorantes, marcadores, núcleos, enzimas y/o anticuerpos unidos, adsorbidos, incluidos o asociados fijamente con éstas, como sistemas y las partículas de todos estos tipos de sistemas independientemente de su respectiva forma a modo de simplificación, como partículas, sin limitarse a formas de partículas determinadas. El procedimiento propuesto también se refiere a la estandarización y a la referencia de métodos ópticos, los cuales usan partículas luminiscentes como plataformas de análisis, así como la cuantificación (relativa) a partir de mediciones de fluorescencia. El procedimiento que se propone en este caso se refiere en particular a la composición de una escala de intensidad, que puede atribuirse a magnitudes de medición físicas reales y que es importante para el desarrollo y el uso de estándares de partículas en los más diversos ámbitos de uso. Los ámbitos de uso de este tipo de estándares de partículas son cualesquiera ensayos basados en luminiscencia basados en partículas, como están establecidos por ejemplo en la bioanalítica y análisis ambiental y el diagnóstico médico, la investigación farmacéutica, el control de terapias o la analítica de residuos y de trazas. En correspondencia con ello el procedimiento es de interés para productores y usuarios de agentes de contraste ópticos, para productores de partículas luminiscentes, en particular fluorescentes, de fósforos o nanoemulsiones, así como para productores y usuarios de estándares de partículas y kits de ensayo.

Con estándares de partículas se entienden en lo sucesivo: estándares para procedimientos de medición de fluorescencia basados en partículas,en solución o en flujo; estándares, los cuales se componen de llamadas partículas o gotitas o que las contienen, como por ejemplo estándares de matriz basados en gotitas, por ejemplo para la tecnología de micromatrices o estándares usados para otros procedimientos de imagen, por ejemplo para la caracterización de tejido, secciones de tejido, frotis, o estratos de gel.

Hasta el momento se han caracterizado partículas luminiscentes o con capacidad de luminiscencia y de dispersión en el intervalo espectral visible, en lo que se refiere a sus propiedades ópticas, como polvo o suspensión, no habiéndose determinado sin embargo, valores de luminosidad, sino solo por ejemplo para rendimiento cuántico de fluorescencia.

Los valores de luminosidad relativos de partículas suspendidas se han determinado en partículas individuales por ejemplo mediante citometría de flujo o mediante otros procedimientos microscópicos de fluorescencia. A este respecto no se obtienen valores independientes de aparatos, sino que se llevaron a cabo típicamente solo mediciones de comparación directas entre diferentes sistemas de partículas.

Würth C., Grabolle M., Pauli J., Spieles M. y Resch-Genger U. describen en Analytical Chemistry (2011) 83: 3431­ 3439 una comparación de métodos y de la respectivamente alcanzable indeterminación de la medición relativa y absoluta de rendimientos cuánticos de fluorescencia. Würth C., Hoffmann K., Behnke T., Ohnesorge M. y Resch-Genger U. describen en Journal of Fluorescence (2011) 21:953-961 estándares de fluorescencia basados en polímeros y vidrio para el intervalo espectral de infrarrojo cercano (NIR). El documento DE 10 2009 006 364 A1 divulga un instrumento y un procedimiento para la medición cuantitativa de la molecularidad de una muestra basándose en una cantidad de luz con correlación con la molecularidad.

La medición de partículas individuales y las características obtenidas a este respecto no se adecuan ya solo por motivos de las propiedades de partículas no homogéneas de un conjunto, para la composición de una escala de intensidad casi absoluta real, que, tal como se ha explicado, se requiere por ejemplo para el desarrollo de estándares de partículas y para una capacidad de comparación de diferentes partículas.

Además de ello se usa en la citometría de flujo para la calibración del eje de intensidad, el llamado sistema de MESF (MESF: measurable fluorescence of equivalent soluble fluorophore, moléculas de fluorocromo soluble equivalente). En correspondencia con ello se usan partículas con respectivamente los valores MESF asignados a las partículas para el fin de la cuantificación relativa. En la microscopía de fluorescencia se usan también gotitas de calibración con "valores MESF asignados". En el caso del sistema de clasificación MESF, que representa un sistema de calibración relativo, se relacionan las intensidades de fluorescencia relativas de las partículas dotadas respectivamente con fluoróforos, por ejemplo fluoróforos encapsulados o encerrados en la matriz de las partículas, o partículas con fluoróforos presentes de forma ligada en la superficie de partícula, por ejemplo partículas con fluoróforo conjugado o ligado asociativamente en la superficie de partícula, con las intensidades de fluorescencia de las gotitas de calibración resultantes para el mismo fluoróforo en una solución de concentración conocida.

Una medición directa de la fluorescencia resultante por molécula de fluoróforo o para una determinada concentración de fluoróforo en la partícula se evita debido a que cambian, condicionado por la sensibilidad del entorno de las propiedades de absorción y de la fluorescencia del fluoróforo, así como en dependencia de la concentración de carga de agente colorante y las propiedades del agente colorante mismo (es decir, su tendencia a la configuración de agregados y asociados moleculares (tendencia al agregado), el correspondiente solapamiento espectral de longitudes de onda de absorción y de emisión en la correspondiente matriz) también por interacción de agente colorante-agente colorante, las propiedades espectroscópicas de determinación de la señal, como por ejemplo el coeficiente de extinción en la respectiva longitud de onda de excitación, la correspondiente posición espectral de la banda de emisión o el rendimiento cuántico de fluorescencia de los agentes colorantes al incorporarse o unirse en las partículas.

La contribución dependiente de matriz (diferencia de índice de refracción agente disolvente de la suspensión - matriz de la partícula) y del tamaño de la dispersión, a la señal de absorción, no se detecta en los procedimientos enumerados. Por otra parte se evita la calibración de un citómetro de flujo con soluciones de agente colorante que pueden prepararse de por sí de forma fácilmente reproducible, debido a que un citómetro de flujo puede medir únicamente objetos más grandes de al menos varios 10 nanómetros de diámetro, más bien más, no sin embargo moléculas de agente colorante individuales.

Las intensidades de señal medidas en general de forma integral con el citómetro de flujo, de las muestras, se determinan por lo tanto en relación con gotitas de calibración; estas intensidades de señal comprenden típicamente también contribuciones dependientes de longitud de onda de componentes ópticos y optoelectrónicos específicas de aparato. Típicamente las muestras accesibles a la citometría de flujo representan células marcadas con fluoróforo o en el caso de ensayos de fluorescencia, partículas funcionalizadas en superficie con analitos.

A este respecto han de determinarse no obstante para cada sistema de fluoróforo de gotitas de calibración, también en dependencia de la matriz de partículas respectivamente usada y del agente disolvente respectivamente usado, respectivamente valores MESF nuevos. Tal como puede verse, se trata de un proceso muy laborioso, el cual ofrece además de ello una escala de intensidad muy relativa. Esto puede simplificarse mediante el planteamiento de medición directa presentado en este caso y la presencia de estándares de partícula adecuados con propiedades que puedan atribuirse a magnitudes de medición físicas/espectroscópicas.

Tal como se expone, con el sistema MESF usado hasta ahora son posibles únicamente declaraciones comparativas para un mismo agente colorante, y esto a menudo también únicamente con una inseguridad de medición relativamente grande, dado que no se detectan modificaciones de las propiedades ópticas relevantes de señal del fluoróforo en partículas en comparación con la solución. Esto se refiere en particular al coeficiente de extinción molecular (decimal) en la correspondientemente usada longitud de onda de excitación de los fluoróforos incorporados o ligados y al valor del rendimiento cuántico de fluorescencia. Se producen además de ello frecuentemente solo mediciones de fluorescencia integrales, y no se tienen en consideración o corrigen contribuciones dependientes de longitud de onda de componentes ópticos y optoelectrónicos específicos de aparato. Una asignación real de valores de luminosidad a fluoróforos encapsulados (y naturalmente también a fluoróforos presentes de forma ligada) y la transmisión de estos valores de luminosidad a herramientas de calibración, que se compusieron a partir de este tipo de sistemas o contienen los mismos (por ejemplo gotitas en solución y gotitas, las cuales se presentan incorporadas en matrices fijas, espectros basados en gotitas para procedimientos de representación de imágenes, sistemas de 2D o 3D a partir de gotitas en una matriz, matrices de gotitas, sistemas de capas basados en gotitas, etc.) o donde estas gotitas se usan como sondas o como marcadores (por ejemplo uso de este tipo de partículas o de estándares con otras formas para la mejor capacidad de comparación de análisis en el tejido en una reproducción de imagen) o como plataformas de análisis o para otros procedimientos de análisis, los cuales trabajan con este tipo de sistemas y requieren cuantificaciones, de este modo hasta el momento no es posible.

Otros principios hasta el momento para la determinación de valores de luminosidad en partículas parten de la suposición de que la luminosidad resulta como producto del rendimiento cuántico del fluoróforo y de su coeficiente de extinción en la matriz y del número de fluoróforo medio por partícula. A este respecto no se detectan ni efectos de apantallamiento ni de amplificación, de modo que estos principios (dependientes del índice de refracción de la matriz de partículas, del agente disolvente y del tamaño de partícula) no son adecuados.

Estos principios son sin embargo incluso para partículas, las cuales tienen un tamaño de únicamente unos pocos nanómetros, correctos solo de manera condicionada. La influencia dependerá en particular de la influencia de efectos de amplificación de campo, los cuales dependen tanto del correspondiente tamaño de partícula, como también de la correspondiente matriz de partícula, así como de la influencia de interacciones de agente colorante y agente colorante dependientes de la concentración y de la matriz, no consideradas y desatendidas hasta el momento.

Con estos antecedentes existe la necesidad de partículas fluorescentes, con luminosidades conocidas, atribuibles a magnitudes de medición físicas, que puedan usarse como estándar. Existe además de ello la necesidad de un procedimiento para la determinación de la luminosidad absoluta de las partículas fluorescentes, para permitir una comparación.

En este contexto se propone de acuerdo con la reivindicación 1 un procedimiento, en cuyo caso la luminosidad, y con ello la intensidad de luminiscencia de una partícula, se atribuya a parámetros físicos básicos, como el rendimiento cuántico y la sección transversal del efecto de absorción. Otras formas de realización, modificaciones y mejoras resultan de la siguiente descripción y de las reivindicaciones que acompañan.

De acuerdo con la invención se propone un procedimiento para la determinación de la luminosidad absoluta o relativa de una partícula luminiscente. El procedimiento comprende la puesta a disposición de un volumen de muestra, el cual comprende un conjunto de partículas luminiscentes, por ejemplo una suspensión de partículas; la determinación de un rendimiento cuántico de fotoluminiscencia absoluto de la suspensión de partículas en el volumen de muestra; la determinación de una sección transversal del efecto de absorción de las partículas en el volumen de muestra; y la determinación de la luminosidad absoluta de una única partícula basándose en el rendimiento cuántico de fotoluminiscencia absoluto determinado, la sección transversal de efecto de absorción y el número de partículas en el volumen de muestra.

El procedimiento que se describe en este caso se basa en la medición en un conjunto de partículas suspendido, determinándose su rendimiento cuántico de fotoluminiscencia y sección transversal del efecto de absorción. Basándose en estas magnitudes y en el conocimiento del número de partículas, puede determinarse un valor de luminosidad por partícula y asignarse a cada partícula. La luminosidad de una partícula fluorescente se atribuye de este modo a magnitudes básicas físicas y accesibles mediante técnica de medición.

La determinación del valor de luminosidad absoluto por partícula puede producirse por ejemplo mediante el uso de la ecuación de transporte de radiación, la cual se soluciona de forma adecuada. Para ello se encuentran a disposición una pluralidad de principios adecuados, por ejemplo simulaciones de Montecarlo.

De acuerdo con la invención se determina el rendimiento cuántico de fotoluminiscencia y/o la sección transversal del efecto de absorción mediante medición de resolución de longitud de onda de la emisión, transmisión y reflexión de las suspensiones de partículas en el volumen de muestra. Para ello pueden medirse el rendimiento cuántico de fotoluminiscencia y/o la sección transversal del efecto de absorción de acuerdo con una forma de realización mediante una esfera integradora. Esto puede producirse en dependencia de longitudes de onda, por ejemplo mediante espectroscopia de esfera integradora. Es posible también usar otros procedimientos alternativos. La medición del rendimiento cuántico de fotoluminiscencia absoluto y/o de la sección transversal del efecto de absorción puede producirse también mediante fotoacústica.

De acuerdo con una forma de realización se determina la luminosidad absoluta en caso de longitudes de onda de excitación y de emisión en el intervalo UV/vis/NIR (250 a 1500 nm). La excitación se produce en particular en el intervalo de 300 nm a 850 nm, puede producirse no obstante también con onda larga. La detección se produce en particular en el caso de longitudes de onda de emisión en el intervalo vis/NIR de 350 a 1000 nm, típicamente en el intervalo de 450 nm a 850 nm, y en particular en el intervalo de longitud de onda de 500 a 800 nm. Son concebibles no obstante también mediciones en el intervalo espectral de hasta aproximadamente 1600 nm, por ejemplo para partículas cargadas de puntos cuánticos.

De acuerdo con una forma de realización se pone a disposición para la determinación de la luminosidad absoluta de una partícula luminiscente una composición de medición, que está adaptada para la determinación del redimiento cuántico y/o del coeficiente de absorción de una suspensión de partículas luminiscentes. Una composición de lugar de medición adecuado se describe por ejemplo en el documento EP 2357465A1, cuyo contenido de divulgación en relación con la composición del lugar de medición se recoge de este modo por completo.

De acuerdo con una forma de realización se determina el coeficiente de absorción ^ de la suspensión de partículas en el volumen de muestra.

De acuerdo con una forma de realización el cálculo de la sección transversal del efecto de absorción Oa de la partícula luminiscente se produce de acuerdo con la fórmula oa = — , y siendo Oa la sección transversal del efecto de absorción de la partícula [cm2]; â el coeficiente de absorción [1/cm] y N el número de las partículas por unidad de volumen.

De acuerdo con la invención se determina la luminosidad absoluta de una partícula como producto del rendimiento cuántico medido y la sección transversal de efecto de absorción Oa [cm2] de una partícula, asignándose el producto formado a una partícula luminiscente.

De acuerdo con una forma de realización se determina la magnitud y/o la distribución de magnitudes de las partículas luminiscentes presentes de forma dispersa en la suspensión.

De acuerdo con una forma de realización la determinación de la magnitud o de la distribución de magnitudes se produce mediante un método de medición seleccionado de entre: dispersión de luz dinámica (DLS); microscopía de electrones, en particular microscopía de electrones de transmisión (TEM) y/o microscopía de electrones de barrido (REM); dispersión de rayos X por ángulo pequeño (SAX); centrifugado, ultracentrifugado, microscopía óptica o medición de difracción láser o difractometría láser.

De acuerdo con una forma de realización se determina la constante dieléctrica del material de las partículas y/o la densidad del material de las partículas.

De acuerdo con la invención las partículas luminiscentes mono o polidispersas están en el intervalo de magnitud de 5 nm a 5000 mm

De acuerdo con la invención se propone el uso de al menos una partícula luminiscente como estándar de referencia o como reactivo de marcado para una prueba basada en partículas, habiéndose asignado a las partículas una luminosidad absoluta y estando seleccionada la prueba basada en partículas de entre: inmunoensayo enzimático (EIA), ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA); un procedimiento de análisis citométrico, en particular un procedimiento de análisis usando un citómetro de flujo; una prueba basada en partículas en el ámbito de la analítica del entorno; una prueba basada en partículas en el ámbito de la bioanalítica; una prueba basada en partículas en el ámbito del diagnóstico médico; una prueba basada en partículas en el ámbito de la investigación farmacéutica; una prueba basada en partículas para el control de terapias; un uso de partículas como agente de contraste; un uso de estructuras de puntos cuánticos como núcleo de fluorescencias y/o como agente de contraste; un uso de fósforos y de nanofósforos y/o el uso de una emulsión de partículas.

Las formas de realización descritas anteriormente pueden combinarse entre sí a elección.

Las figuras 1 a 6 que acompañan ilustran formas de realización y sirven junto con la descripción para la explicación de los principios de la invención. Los elementos de las figuras son relativos entre sí no necesariamente a escala. Las mismas referencias indican correspondientemente partes parecidas.

La Fig. 1A muestra la relación de los valores de fluorescencia de partículas de calibración (partículas de calibrado) y el objeto de medición real a caracterizar (célula) con el ejemplo del procedimiento de MESF (measurable fluorescence of equivalent soluble fluorophore) para el fluoróforo usado más a menudo en la citometría de flujo (en este caso denominado como "muestra") fluoresceína, o FITC.

La Fig. 1B muestra el uso de una línea de calibración obtenida con gotitas clasificadas mediante MESF para la calibración del eje de intensidad de un citómetro de flujo.

La Fig. 2 muestra una composición de esfera integradora para la determinación de rendimientos cuánticos absolutos, que se adecua para el procedimiento que se describe en este caso.

La Fig. 3 muestra rendimientos cuánticos absolutos de partículas de diferente tamaño (familia de curvas) y diferentes fluoróforos usados para el marcado (partes izquierda y derecha de la Fig. 3).

La Fig. 4 muestra posibilidades de las diferentes guías de haz en la composición de esfera integradora para la medición de transmisión total (a), transmisión difusa (b) y reflexión difusa (c).

La Fig. 5 muestra la sección transversal del efecto de absorción de 1 |jm de partículas de poliestireno (PSP), que están cargadas con diferentes fluoróforos con diferente concentración molar.

La Fig. 6 muestra los valores de luminosidad de partículas de diferente tamaño, que se cargaron con diferentes agentes colorantes.

De acuerdo con el procedimiento propuesto la determinación de la luminosidad por partícula se produce con mediciones de conjunto en el intervalo espectral UV/vis/NIR/IR en partículas en suspensiones, en partículas, las cuales se presentan dispersas en diferentes matrices sólidas, y en partículas en polvos.

A este respecto se produce la determinación de la luminosidad por partícula basándose en la caracterización absoluta del rendimiento cuántico de luminiscencia o eficiencia de luminiscencia de esas partículas y la determinación de secciones transversales del efecto de absorción por partícula con el lugar de medición de esfera integradora mostrada en la Fig. 2, pudiendo medir el lugar de medición de esfera integradora con resolución espectral la emisión, la transmisión y la reflexión de sistemas transparentes y de dispersión (compárese la Fig. 4). En el caso de suspensiones de partículas es en principio también posible una determinación relativa del rendimiento cuántico como base para la determinación de los valores de luminosidad con el método presentado en este caso, pero va unida a inseguridades claramente mayores, en particular en caso de dispersión en aumento.

Para la determinación de los valores de luminosidad se recurre como magnitudes de medición adicionales al número de partículas o a la concentración de partículas, al tamaño de partículas y al índice de refracción de las partículas. A este respecto se mide el rendimiento cuántico típicamente de forma absoluta, la sección transversal del efecto de absorción por partícula se calcula entonces a partir de los resultados de mediciones de reflexión y transmisión usándose un estándar de reflexión. Como estándar de reflexión sirve un estándar blanco con reflectividad conocida. El número de partículas por su parte resulta o bien mediante cálculo a partir de la teoría de Mie o de mediciones gravimétricas, o puede calcularse en caso de tamaño de partícula y densidad de material conocidos a partir de la pesada usada respectivamente para la medición.

El tamaño de partícula puede determinarse de diferentes modos. Por ejemplo mediante mediciones mediante DLS (Dynamischer Lichtstreuung, dispersión de luz dinámica), TEM (Transmissions-Elektronenmikroskopie, microscopía electrónica de transmisión), REM (Rasterelektronenmikroskopie, microscopía electrónica de barrido), SAXS (Kleinwinkel-Róntgenbeugung,dispersión de rayos X por ángulo pequeño), mediante centrifugación, microscopía o mediante mediciones de difracción láser.

Para partículas con dimensiones en el intervalo de la longitud de onda de luz puede producirse la magnitud de las partículas en principio no obstante también con la ayuda de mediciones de cuerpo de integración, por ejemplo con una disposición de medición de esfera integradora (medición de esfera integradora).

El índice de refracción dependiente de la longitud de onda para diferentes matrices relevantes en la práctica se conoce o bien de los datos bibliográficos o puede determinarse a partir de correspondientes bases de datos.

Teniéndose en consideración estos datos a los que se tiene acceso o bien mediante medición y/o cálculo o tablas, pueden atribuirse de acuerdo con la invención los valores de luminosidad medidos en una muestra que comprende partículas dispersas o disueltas, a magnitudes básicas espectroscópicas y físicas. De ello resulta la ventaja básica, de que para todos los procedimientos de fluorescencia basados en partículas, puede componerse una escala de intensidad atribuible, la cual se adecua por ejemplo para la atribución de mediciones de fluorescencia o intensidades de fluorescencia a magnitudes moleculares y escalas radiométricas.

Con mediciones de fluorescencia se entienden a este respecto en particular: sistemas de 3D y de 2D, todos los métodos de fluorescencia, los cuales usan partículas como plataformas y/o que se usan para llevar a cabo ensayos de fluorescencia, comenzando por ejemplo en la citometría de flujo, pasando por la microscopía de fluorescencia hasta llegar a la fluorometría basada en placas de microtitulación, incluida la tecnología de micromatrices, sensores de fluorescencia, así como procedimientos de fluorescencia de imágenes basadas en partículas (por ejemplo, tomografía de fluorescencia, FRI), por ejemplo para análisis en tejido, secciones de tejido, en suspensiones celulares, frotis o en geles, por ejemplo en capas de gel de agarosa o poliacrilamida.

Pueden compararse de este modo diferentes partículas directamente entre sí, así como a través de partículas ya caracterizadas en lo que se refiere a su luminosidad, también asignarse valores de luminosidad a otros estándares de fluorescencia, que se basan en estas partículas.

A menudo se denominan este tipo de partículas en las correspondientes pruebas como "gotitas". En lo sucesivo se entienden también este tipo de gotitas bajo el concepto explicado arriba, partículas, o con "gotitas" se entienden las partículas mencionadas anteriormente. De este modo los conceptos gotita/gotitas, y el concepto partículas, deberían tratarse en lo sucesivo como conceptos equivalentes.

La Fig. 1A ilustra el procedimiento MESF descrito inicialmente como ejemplo de un sistema de clasificación relativo de intensidades de fluorescencia de agente colorante de referencia (SRM), partículas marcadas con agente colorante (partículas) y objeto de medición célula en el ejemplo de fluoresceína (muestra), que presenta una determinada intensidad de fluorescencia (FI). En particular se muestra la asignación esquemática de intensidades de fluorescencia (FI) de un correspondiente material de referencia estándar (SRM), comprendiendo el fluoróforo fluoresceína. El fluoróforo fluoresceína está disponible como Standard Reference Material (SRM) (material de referencia estándar) 1932 de National Institute for Standards and Technology (NIST, EE.UU) con pureza certificada.

A partir de la comparación de las respectivamente medidas intensidades de fluorescencia se logra una asignación relativa de diferentes intensidades a una escala de referencia. Esto se muestra en la Fig. 1B para un uso a modo de ejemplo para la detección de células marcadas de forma fluorescente específicamente, que portan un antígeno de superficie (CD4) típico para leucemia linfocítica crónica (LLC). El fluoróforo fluoresceína (FITC) usado más a menudo en la citometría de flujo proporcionó las intensidades de fluorescencia detectadas en el canal de medición FL1, que pueden asignarse a dos picos claramente reconocibles.

Para poder asignar una intensidad de fluorescencia de interés al correspondiente valor MESF, se usa la recta de calibración determinada anteriormente. Esto se indica mediante la flecha dirigida hacia la ordenada. De este modo puede calibrarse el eje de intensidad de un citómetro de flujo con gotitas clasificadas mediante MESF para los fluoróforos respectivamente usados, cuando para el respectivo fluoróforo existe un material de referencia estándar. La Fig. 2 muestra una composición de esfera integradora que puede usarse para el procedimiento que se propone en este caso, para la determinación de rendimientos cuánticos absolutos. La luz de un monocromador usado para la excitación se guía desde la ranura de salida 10 hacia un divisor de haz 12. Una parte predeterminada de ella accede a un detector de referencia14. La otra parte se dirige a través de la disposición de espejo parabólico 20 mostrada, comprendiendo espejos parabólicos 22, 23 y espejos planos 21, 24, hacia una esfera integradora 30, la cual dispone en posiciones adecuadas de pantallas 31. La señal a detectar por una sonda se guía a continuación a través de una fibra óptica 35 a un espectrógrafo 40, allí se somete a espectroscopia y se registra mediante una cámara CCD 42. El espejo parabólico 25 sirve para una iluminación indirecta de la muestra. También a partir de una disposición de medición de este tipo puede determinarse un rendimiento cuántico. En el caso de una medición de reflexión, esta disposición sirve para la compensación de la reflectividad de esfera integradora modificada (medición de referencia), véase más abajo y el documento EP 2 357 465A1, cuyo contenido de divulgación se recoge de este modo por completo.

Mediante esta composición de esfera integradora se determinan los rendimientos cuánticos de luminiscencia absolutos y/o las luminosidades del sistema de partículas de interés, llevándose a cabo así mismo mediciones de reflexión y de transmisión. La solución de la ecuación de transporte de radiación proporciona coeficientes de absorción y de dispersión. Mediante la teoría de dispersión general de acuerdo con Mie pueden calcularse con presuposiciones los parámetros de material básicos como el índice de refracción o el número y el tamaño de partículas para la determinación de la sección trasversal del efecto de absorción.

Usándose el índice de refracción específico para la correspondiente matriz de partículas puede determinarse igualmente un índice de polidispersidad de la muestra. En caso de conocerse el índice de polidispersidad pueden calcularse secciones transversales efectivas aproximadas de las partículas para dispersión y absorción, de modo que el uso del procedimiento descrito en este caso no está limitado solo a muestras de partículas monodispersas. Pueden caracterizarse igualmente distribuciones de tamaño de partícula de banda estrecha o muestras de partículas polidispersas. El procedimiento tampoco está limitado únicamente a partículas esféricas, sino que puede usarse también en dispersiones de bastoncitos (rods), o dispersiones de otras formas de partículas, por ejemplo en dispersiones de poliedros en el intervalo de los nanómetros hasta los micrómetros.

El rendimiento cuántico representa la proporción del número de los fotones emitidos con respecto al número de los fotones absorbidos. La llamada luminosidad (o brightness) de fluoróforos se ha descrito hasta el momento a través del producto de rendimiento cuántico absoluto 0 f y coeficientes de absorción decimales moleculares £[L/(mol cm)]. La transmisión de una solución de moléculas de agente colorante sigue la ley de Lambert:

T p = - = e~cd = e~No(Tal = e~NA° aCl (Ec. 0),

¡0

representando 0 la intensidad de luz al entrar en la muestra, I la intensidad de la luz, la cual sale de muestra, T^f la transmisión de la solución de agente colorante, No la densidad de partículas moleculares, a el coeficiente de absorción molar, N^a el número de Avogadro, c la concentración molar del agente colorante (fluoróforo), l el grosor de la capa de muestra medida y Oa la sección transversal del efecto de absorción. La sección transversal del efecto de absorción presenta una superficie hipotética, con la cual la molécula de agente colorante absorbe un fotón.

A diferencia de las teorías y modelos habituales usados únicamente en escalas de tamaño molecular, proponemos, expresar los valores de luminosidad de partículas a través del producto de la sección transversal del efecto de absorción de una partícula Oa [cm2] y del rendimiento cuántico medido en una dispersión de partículas 0f. Esto abre una posibilidad, de acuerdo con nuestro conocimiento, completamente nueva para la descripción y con ello normalización de partículas luminiscentes. En lugar de la sección transversal del efecto de absorción puede usarse de acuerdo con Hulst, H.C. van d. (Light scattering by small particles. Dover Publications, 1981 ISBN 0-486-64228-3) también la eficiencia de absorción Qabs. De acuerdo con esta publicación (compárense las páginas 13 y 14) la eficiencia de absorción Qabs es el cociente de sección transversal del efecto de absorción y sección transversal geométrica G=na2, siendo a el radio de la partícula. Su uso amplía adicionalmente la capacidad de uso del procedimiento por nosotros propuesto para la determinación de la luminosidad de una partícula y permite una normalización.

Mediante la normalización propuesta se logra una capacidad de comparación de diferentes tamaños de partícula. Esto se muestra a modo de ejemplo en la Fig. 3. La parte izquierda de la Fig. 3 muestra en particular valores de medición del rendimiento cuántico absoluto de partículas de diferente tamaño, que están cargadas con el fluoróforo rojo nilo. La parte derecha de la Fig. 3 muestra valores de medición del rendimiento cuántico absoluto de partículas de respectivamente diferente tamaño, que están cargadas con el fluoróforo F006. A este respecto N^fb representa el rendimiento cuántico absoluto, indicado en moles por 3 mg de partículas de poliestireno (PSP).

De este modo la combinación del rendimiento cuántico de fotoluminiscencia absoluto con las secciones transversales de eficiencia de absorción o del efecto de absorción determinadas experimentales por partícula con respecto a un factor de eficiencia de partículas o con respecto a un valor de luminosidad por partícula, representa un componente presencial del procedimiento que se describe en este caso.

En particular el rendimiento cuántico 0 f de medios de dispersión, por ejemplo de una solución con conjuntos de partículas marcadas de forma fluorescente que se presentan suspendidas en ella, o una superficie, la cual porta partículas luminiscentes, o también una capa transparente, en la cual se presentan incorporadas partículas luminiscentes, puede determinarse mediante el uso de un lugar de medición de esfera integrada de acuerdo con las Figs. 2 y 4 o también mediante espectroscopia fotoacústica, y resulta como:

Nem

(Ec. 1),

N abs

representando Nem el número de las partículas emisoras y Nabs el número de las partículas absorbentes. Del mismo modo pueden determinarse coeficientes de absorción de las muestras descritas anteriormente usando la espectroscopia de esfera integradora. En el caso de una composición adecuada, por ejemplo la mostrada en las Figs. 2 y 4, pueden determinarse rendimiento cuántico y coeficiente de absorción con la misma estructura.

Pueden determinarse por ejemplo a partir de mediciones de reflexión y de transmisión de acuerdo con la guía de haz mostrada en la Fig. 4, los coeficientes de absorción pa de una muestra con por ejemplo una simulación de Montecarlo inversa o mediante otros procedimientos para la solución de la ecuación de transporte de radiación. Con conocimiento del número de partículas N, que puede determinarse con conocimiento del tamaño de partícula mediante por ejemplo, pesaje de una parte alícuota de una muestra, se calcula la sección transversal del efecto de absorción Oa de una única partícula a partir de:

(Ec. 2)

siendo pa el coeficiente de absorción del conjunto de partículas y N el número de partículas.

En la Fig. 5 la sección transversal del efecto de absorción de 1 |jm de partículas de poliestireno, que están cargadas con los fluoróforos rojo nilo (círculos abiertos), F006 (círculos completos) y C153 (cuadrados abiertos), está aplicada a través de la cantidad de agente colorante incorporada en las partículas. A este respecto N^fb significa rendimiento cuántico absoluto, indicado en [moles por 3 mg de PSP], representando PSP partículas de poliestireno y poliestirol. En caso de ser el tamaño de partícula desconocido, entonces puede determinarse por ejemplo mediante procedimientos ópticos (difracción láser, DLS), mediante (ultra)centrifugación o por ejemplo mediante microscopia de electrones o con la ayuda de técnicas de microscopía electrónica.

La Fig. 6 muestra los valores de luminosidad de partículas de diferente tamaño, que se cargaron con diferentes agentes colorantes. Los valores de luminosidad están aplicados respectivamente a través de la cantidad de agente colorante usado para la preparación, indicados en milimoles. Los diámetros de partículas fueron de 1 jm (símbolos completos) y 100 nm (símbolos vacíos). Los fluoróforos usados son rojo nilo (círculos), F006 (cuadrados), C153 (triángulos).

Tal como se ha explicado anteriormente, mientras que también los rendimientos cuánticos hasta ahora generalmente se han determinado en relación con un estándar, lo cual conduce por naturaleza a inseguridades demasiado altas y es realizable solo para sistemas transparentes, el procedimiento que se propone y se describe en este caso representa un procedimiento en gran medida libre de estas inseguridades también para sistemas de partículas no transparentes.

Con el procedimiento descrito anteriormente se pone a disposición de este modo un método general para la determinación de valores de luminosidad por partícula, que se basa en mediciones de conjunto, por ejemplo en mediciones en suspensiones de partículas, en mediciones en superficies decoradas con partículas, dispersiones de partículas y partículas que se presentan como polvo basándose en la caracterización absoluta de la eficiencia de luminiscencia de partículas en el intervalo espectral UV/vis/NIR, en particular en el intervalo espectral de 300 nm a 1000 nm.

La determinación de las secciones transversales del efecto de absorción por partícula se produce o bien ópticamente con un lugar de medición, que pueda medir con resolución emisión, transmisión y reflexión de sistemas transparentes y/o de dispersión, por ejemplo con un cuerpo de integración adaptado de forma adecuada, por ejemplo un lugar de medición de esfera integradora de acuerdo con el documento EP 2357465A1. Alternativamente la determinación de las secciones transversales del efecto de absorción por partícula puede llevarse a cabo por ejemplo mediante mediciones fotoacústicas.

Se pone a disposición además de ello un método general para la caracterización y la clasificación de partículas, que se adecua por ejemplo para la caracterización de partículas en el ámbito de la analítica del entorno y bioanalítica, en el diagnóstico médico etc., y para todos los métodos, los cuales usan ensayos y matrices basados en partículas. De este modo puede componerse un sistema de referencia sencillo, atribuible a magnitudes de medición espectroscópicas y físicas básicas para mediciones de fluorescencia. El sistema de referencia que aquí se propone es adecuado por ejemplo para la estandarización de mediciones de fluorescencia y para su cuantificación mejorada y sobre todo para una comparable universalmente.

Este planteamiento se adecua en principio para todos los sistemas de partículas, independientemente de su tamaño y forma geométrica (por ejemplo también otras formas geométricas definidas, como bastoncitos o dispersiones o suspensiones de poliedros a nanoescala o microescala). Este planteamiento se adecua también para la caracterización de partículas, cuyos valores de luminosidad son dependientes de la matriz que las rodea, solo que entonces ya no es posible directamente una transferencia sencilla de estas indicaciones a otras matrices u otros sistemas, construidos a partir de estas partículas. El experto conoce los métodos para la transmisión de las presentes indicaciones a otras combinaciones de materiales, por ejemplo usando índices de refracción de estos materiales.

El procedimiento propuesto se corresponde en gran medida con las condiciones a esperar en una situación de medición real y puede usarse sobre casi cualesquiera materiales de partículas o matrices transparentes o de dispersión y absorbentes y no absorbentes.

Las afirmaciones obtenidas siguen siendo independientes de la forma y del tamaño de las partículas en la zona indicada, alcanzando el intervalo de tamaños preferente de las partículas desde la escala de los nanómetros hasta el intervalo de los micrómetros, en particular preferentemente de 5 nm a 5000 |jm. Las partículas (gotitas) pueden usarse como marcadores con tamaños de aproximadamente 2 nm hasta varios 100 nm, como plataformas de análisis en general de 1000 nm hasta varios 1000 nm (citometría de flujo por ejemplo 1000 nm hasta como máximo 10.000 nm, más bien 5000 nm).

Otra ventaja del procedimiento propuesto consiste en que se posibilita la determinación de valores de luminosidad casi absolutos, que representa una magnitud sin unidad normalizada. De este modo de logra una capacidad de comparación de diferentes tipos de partículas independientemente de sus propiedades de material y tamaño.

A través de la suposición de que mediante el encapsulamiento de los fluoróforos no cambian en la partícula las propiedades ópticas del sistema de partículas de fluoróforo, éstos valores de luminosidad pueden transmitirse en principio a sistemas, los cuales comprenden este tipo de partículas o que están compuestos de estas partículas o que pueden componerse a partir de este tipo de partículas luminiscentes. Requisito para ello son entre otros, la ausencia de interacciones entre partículas y partículas, así como estructuras geométricas adecuadas. En todo caso es posible una atribución directa a los sistemas de partículas. Con el conocimiento de los valores de luminosidad pueden predecirse en principio las propiedades ópticas de sistemas mediante métodos matemáticos, los cuales comprenden estas partículas o que están compuestos de estas partículas o que pueden componerse a partir de este tipo de partículas luminiscentes.

En relación con la estandarización de este tipo de partículas, para la estandarización de procedimientos de análisis y de verificación basados en partículas, así como para la estandarización de los aparatos de medición ópticos usados para llevar a cabo las mediciones ópticas de luminiscencia, el procedimiento propuesto pone a disposición un método para atribuir los datos respectivamente recogidos a una escala de luminosidad absoluta y apoyada en magnitudes espectroscópicas y físicas básicas.

Mientras que la influencia de efectos de amplificación de campo, que dependen tanto del respectivo tamaño de partícula, como también de la matriz de partículas, así como la influencia de interacciones de agente colorante y agente colorante dependientes de concentración y matriz, hasta el momento se han dejado completamente de lado y se han desatendido, el método propuesto mediante la presente ofrece valores de referencia fiables y de uso universal.

Con estos antecedentes el procedimiento propuesto ofrece una posibilidad fundada y fiable para la atribución de datos de luminiscencia de gran importancia práctica y uso universal.

Aunque se hayan representado y descrito en el presente documento formas de realización específicas, queda dentro del marco de la presente invención, modificar de forma adecuada las formas de realización descritas, sin desviarse del alcance de protección de la presente invención, que se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la determinación de una luminosidad absoluta de una partícula luminiscente, que comprende: - poner a disposición un volumen de muestra, el cual comprende un conjunto de partículas luminiscentes;

- determinar un rendimiento cuántico de fotoluminiscencia absoluto o uno relativo del conjunto de partículas en el volumen de muestra;

- determinar una sección transversal del efecto de absorción o la eficiencia de absorción de las partículas en el volumen de muestra;

- determinar la luminosidad absoluta de una única partícula basándose en el rendimiento cuántico de fotoluminiscencia absoluto, en la sección transversal del efecto de absorción o la eficiencia de absorción y un número de partículas en el volumen de muestra determinados, expresándose la luminosidad absoluta a través de un producto de la sección transversal del efecto de absorción de una partícula Oa [cm2] y el rendimiento cuántico 0 f medido en una dispersión de partículas;

estando seleccionadas las partículas luminiscentes de entre partículas suspendidas o dispersas en el volumen de muestra en el intervalo de tamaño de 5 nm a 5000 |jm, y donde el rendimiento cuántico de fotoluminiscencia absoluto y/o la sección transversal del efecto de absorción se determinan mediante una medición con resolución de longitud de onda de una emisión, de una transmisión y de una reflexión.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, usándose para determinar el rendimiento cuántico de fotoluminiscencia absoluto y/o la sección transversal del efecto de absorción una esfera integradora.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, produciéndose la determinación del rendimiento cuántico de fotoluminiscencia absoluto y/o de la sección transversal del efecto de absorción mediante fotoacústica.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, produciéndose la determinación del rendimiento cuántico de fotoluminiscencia relativo y/o de la sección transversal del efecto de absorción en relación con un estándar.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, produciéndose la determinación del rendimiento cuántico de fotoluminiscencia y/o de la sección transversal del efecto de absorción con longitudes de onda de excitación en el intervalo UV, vis o NIR, en particular en el intervalo de 250 a 1500 nm, en particular en el intervalo de 300 nm a 850 nm.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, produciéndose la determinación del rendimiento cuántico de fotoluminiscencia y/o de la sección transversal del efecto de absorción con longitudes de onda de emisión en el intervalo vis o NlR de 400 a 1000 nm, típicamente en el intervalo de 300 nm a 1600 nm, en particular en el intervalo de longitud de onda de 350 a 1000 nm.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, determinándose una sección transversal del efecto de absorción Oa de una partícula luminiscente de acuerdo con la fórmula oa = — , donde

Oa es la sección transversal del efecto de absorción de la partícula [cm2];

pa el coeficiente de absorción [1/cm] del conjunto de partículas en el volumen de muestra; y

N el número de las partículas por unidad de volumen, donde

el coeficiente de absorción pa del conjunto de partículas se determina basándose en la emisión, la transmisión y la reflexión del conjunto de partículas en el volumen de muestra.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, definiéndose la luminosidad absoluta de una partícula individual como producto a partir del rendimiento cuántico de fotoluminiscencia y sección transversal del efecto de absorción Oa [cm2] de una partícula, y asignándose la luminosidad absoluta a una partícula luminiscente o a una pluralidad de partículas luminiscentes.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo además de ello

- determinar un tamaño y/o una distribución de tamaños de las partículas luminiscentes que se presentan dispersas en la suspensión.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, llevándose a cabo la determinación con un método de medición seleccionado de entre: dispersión de luz dinámica (DLS); microscopía de electrones, en particular microscopía de electrones de transmisión (TEM) y/o microscopía de electrones de barrido (REM); dispersión de rayos X por ángulo pequeño (SAX); ultracentrifugado o medición de difracción láser o difractometría láser.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo además de ello

- determinar una constante dieléctrica del material de las partículas y/o determinar una densidad del material de las partículas.

12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, siendo el conjunto de partículas una suspensión de partículas, la cual llena el volumen de muestra.

13. Uso de al menos una partícula luminiscente como estándar de referencia o como un reactivo de detección para una prueba basada en partículas, habiendo asignada a las partículas luminiscentes una luminosidad absoluta, la cual se determina según el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, y donde la prueba basada en partículas está seleccionada de entre: inmunoensayo enzimático (EIA), ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA); un procedimiento de análisis citométrico; un procedimiento de análisis citométrico de flujo; una prueba basada en partículas en el ámbito de la analítica del entorno; una prueba basada en partículas en el ámbito de la bioanalítica; una prueba basada en partículas en el ámbito del diagnóstico médico; una prueba basada en partículas en el ámbito de la investigación farmacéutica; una prueba basada en partículas para el control de terapias; un uso de partículas como agente de contraste; un uso de estructuras de puntos cuánticos como núcleo de fluorescencias y/o como agente de contraste; un uso de fósforos y de nanofósforos y/o el uso de una emulsión de partículas.

14. Procedimiento para la preparación de un conjunto estándar de partículas luminiscentes, poniéndose a disposición partículas luminiscentes, determinándose la luminosidad absoluta de las partículas luminiscentes según el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, y asignándose a las partículas la luminosidad absoluta determinada de este modo.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, poniéndose a disposición un conjunto de diferentes partículas, diferenciándose las partículas en el fluoróforo y/o en la concentración del fluoróforo y/o en el tamaño de partícula.